KR101757473B1 - ｈＣＴＯ를 이용하는 ＰＴＯ 절단 및 연장 분석에 의한 고상에서의 타겟 핵산 서열 검출 - Google Patents

ｈＣＴＯ를 이용하는 ＰＴＯ 절단 및 연장 분석에 의한 고상에서의 타겟 핵산 서열 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 고상에서 검출하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 연장이합체가 타겟-의존적 방식으로 액상에서 형성되고, 이어서 그의 존재가 고상에서 검출된다. hCTO는 고상에 고정되어 있지 않으므로, 상기 연장이합체는 액상에서 보다 효율적으로 형성된다.

Description

ｈＣＴＯ를 이용하는 ＰＴＯ 절단 및 연장 분석에 의한 고상에서의 타겟 핵산 서열 검출{Detection of Target Nucleic Acid Sequence on Solid Phase by PTO Cleavage and Extension using hCTO Assay}
관련출원에 대한 교차참조
본 특허출원은 2013년 10월 18일에 대한민국 특허청에 출원된 대한민국 특허출원 제2013-0124589호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
기술분야
본 발명은 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장 (PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의한 고상에서의 타겟 핵산 서열 검출에 관한 것이다.
DNA 혼성화(hybridization)는 분자 생물학의 기본적인 과정이며, 이온 강도, 염기 조성, 감소된 핵산 단편의 길이, 미스매칭 정도 및 변성화제의 존재에 의해 영향을 받는다. DNA 혼성화-기반 기술은 특정 핵산 서열 결정에 매우 유용한 도구이며, 임상 진단, 유전자 연구 및 법의학적인 실험 분석에 명확하게 도움이 될 것이다.
그러나, 혼성화에만 주로 의존하는 종래 방법 및 과정에서는 프로브와 비-타겟 서열 간의 비-특이적인 혼성화로 인한 위양성 결과가 발생할 가능성이 높다. 따라서, 종래 방법 및 과정은 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 남아있다.
프로브 혼성화 과정 이외에도 추가적으로 효소 반응을 이용한 몇몇 접근법들, 예컨대, TaqManTM 프로브 방법이 제시되었다.
TaqManTM 프로브 방법에서, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 표지 프로브는 업스트림 프라이머-의존적 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되어, 타겟 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생시킨다(미국 특허 제5,210,015호, 제5,538,848호 및 제6,326,145호). TaqManTM 프로브 방법은 시그널 발생을 위한 두 가지 접근법을 제시한다: 중합-의존적 절단(polymerization-dependent cleavage) 및 중합-독립적 절단(polymerization-independent cleavage). 중합-의존적 절단에서, 업스트림 프라이머의 연장은 반드시 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하기 전에 발생되어야 한다. 연장반응이 진행되면서, 중합효소는 표지 프로브의 5’-말단을 점점 절단한다. 중합-독립적 절단에서, 업스트림 프라이머 및 표지 프로브는 매우 근접하여 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 업스트림 프라이머의 3’-말단과 핵산 중합효소의 결합은 상기 핵산 중합효소를 표지 프로브의 5’-말단에 접촉시켜 표지를 방출한다. 또한, TaqManTM 프로브 방법은, 그의 5’-말단에 타겟 서열과 혼성화되지 않는 5’-테일 영역을 갖는 표지 프로브가 절단되어 5’-테일 영역을 포함하는 단편이 형성되는 것을 개시하고 있다.
타겟 서열에 비-상보적인 5’-테일 영역을 갖는 프로브가 5’뉴클레아제에 의하여 절단되어 5’-테일 영역을 포함하는 단편이 방출되는 몇 가지 방법들이 보고되었다.
예를 들어, 미국 특허 제5,691,142호는 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되는 절단구조를 개시하고 있다. 템플레이트(template)에 비-상보적인 5’부위 및 템플레이트에 상보적인 3’부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 템플레이트에 혼성화되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 매우 근접하여 템플레이트에 혼성화되는 절단구조가 예시되어 있다. 상기 절단구조는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 감소된 합성 활성을 갖는 변형 DNA 중합효소에 의하여 절단되어 템플레이트에 비-상보적인 5’부위가 방출된다. 그 후 상기 방출된 5’부위는 헤어핀 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화되어 절단구조를 형성하고, 이에 의해 점진적인 절단반응이 유도되어 타겟 서열이 검출된다.
미국 특허 제7,381,532호는, 3’-말단이 블록킹된 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 갖는 절단구조가 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제에 의하여 절단되어 비-상보적인 5’플랩(flap) 영역이 방출되고, 상기 방출된 5’플랩 영역이 크기 분석 또는 상호작용적 이중 표지에 의하여 검출되는 과정을 개시하고 있다. 미국 특허 제6,893,819호는, 검출가능한 방출된 플랩이 핵산 합성 의존적인, 플랩-매개 연속적 증폭 방법에 의하여 생성됨을 개시하고 있다. 이 방법에서는, 제1절단구조로부터 방출된 플랩이 핵산 합성 의존적인 방식으로 제2절단구조를 절단하여 제2절단구조로부터 플랩을 방출시키고, 상기 방출된 플랩이 검출된다.
액상에서의 형광-표지 프로브의 혼성화에 의하여, 한 종류의 형광 표지를 이용하는 경우에도 멜팅 커브 분석에 의하여 다수의 타겟 핵산 서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 그러나, 상호작용적-이중 표지 프로브의 5’뉴클레아제-매개 절단에 의하여 타겟 서열을 검출하는 종래 기술은, 멀티플렉스 타겟 검출에서 서로 상이한 타겟 서열에 대하여 서로 상이한 종류의 형광 표지를 필요로 하며, 이러한 형광 표지 종류 수의 한계 때문에 검출되는 타겟 서열의 수는 제한된다.
미국 출원 공개번호 제2008-0241838호는 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 5’-부위를 갖는 프로브의 절단 및 캡처(capture) 프로브의 혼성화를 이용한 타겟 검출 방법을 개시하고 있다. 표지는 비-상보적인 5’부위에 위치한다. 타겟 서열에 혼성화된 표지 프로브는 절단되어 단편을 방출하며, 이후 단편은 캡처 프로브에 혼성화되어 타겟 서열의 존재가 검출된다. 이 방법에서, 비절단된/온전한(uncleaved/intact) 프로브는 캡처 프로브에 혼성화되지 않는 것이 필수적이다. 이를 위해서는, 짧은 길이를 갖는 캡처 프로브가 고상 기질 상에 고정되어야 한다. 그러나, 이러한 제한은 고상 기질에서의 혼성화의 효율성을 낮추고, 또한 반응 조건의 최적화도 어렵게 한다.
따라서, 당업계에서는 보다 편리하고, 신뢰성 및 재현성 있는 혼성화 방식으로, 혼성화 뿐만 아니라 5’뉴클레오절단반응(5’nucleolytic reaction)과 같은 효소 반응에 의하여 고상에서 타겟 서열, 특히, 복수의 타겟 서열을 향상된 정확성으로 검출하기 위한 신규한 접근법에 대한 개발 요구가 대두되고 있다. 또한, 당업계에서는 표지(특히, 형광 표지) 종류의 수에 제한받지 않고 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 접근법에 대한 개발 요구가 대두되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준을 보다 명확하게 설명하기 위하여 이러한 특허들 및 문헌들의 공개는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히, 멀티플렉스 방식으로 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이러한 타겟 검출은 프로브 혼성화, 5’핵산절단반응을 포함하는 효소 반응, 연장이합체를 형성하기 위한 연장 및 고상에서의 연장이합체의 검출에 의해 달성된다. 본 발명의 프로토콜은 고상에서 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고 복수의 타겟 서열을 검출할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 고상에서 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 고상에서 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 발명은 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 타겟 핵산 서열을 고상에서 검출하기 위한 신규한 방법 및 키트를 제공한다.
본 발명은 혼성화 반응뿐만 아니라 타겟-의존적 효소 반응도 포함한다.
Ⅰ. PCE - hCTO를 이용한 타겟 검출
본 발명의 일 양태에서, 다음의 단계를 포함하는 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장 (PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 고상에서 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편을 혼성화-캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(hybridizing-Capturing and Templating Oligonucleotide; hCTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 hCTO는 (i) 3’→5’방향으로 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 CTO 및 (ii) 고상 기질 상에 고정된 고정화 올리고뉴클레오타이드(immobilized oligonucleotide; IO)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 상기 CTO의 3’- 또는 5’-말단에 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장이합체를 형성하며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 hCTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 hCTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위는 단일 가닥 상태를 유지하며,
(e) 상기 단일 가닥 상태인 hCTO의 IO-혼성화 부위를 상기 IO와 혼성화시키는 단계로서; 상기 고상 기질 상에 고정된 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위와 혼성화하여 IO 이합체를 형성하고; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 상기 단편에 연결된 표지 또는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 IO에 연결된 표지에 의해 타겟 시그널을 제공하며; 및
(f) 상기 연장이합체 및 상기 IO 이합체 모두가 이중-가닥 상태를 유지하는 지정된 온도에서 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 고상에서 상기 연장이합체를 검출하는 단계로서; 상기 연장이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
본 발명자들은 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고, 특히, 멀티플렉스 방식으로 타겟 서열을 검출하는 신규한 접근법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 프로토콜을 정립하였으며, 이러한 타겟 검출은 프로브 혼성화, 5’핵산절단반응을 포함하는 효소 반응, 연장이합체를 형성하기 위한 연장 및 고상에서의 연장이합체의 검출에 의해 달성된다. 본 발명의 프로토콜은 고상에서 보다 개선된 정확성 및 편의성을 가지고 복수의 타겟 서열을 검출할 수 있다.
본 발명자들은 이미 WO2012/096523에서 다음과 같이 연속적인 단계를 포함하는 PTOCE 분석이라 불리는 신규한 접근법을 제안하였다: 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO)의 절단, 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO) 상에서의 연장; 연장이합체의 타겟-의존적인 형성 및 연장이합체의 검출. 상기 PTOCE 분석에서, 고상에서의 타겟 검출을 위하여 상기 CTO는 고상에 고정되고, 그 후 연장이합체의 형성이 검출된다.
본 발명자들은 고상에 고정된 CTO 상에서의 연장에서 연장 반응에 영향을 미치는 제한들, 예컨대, 고상 기질과 본질적으로 관련된 공간적 제한을 해결하면서, 고상에서 멀티플렉스 방식으로 타겟을 검출하는 신규한 방법을 개발하고자 예의 연구하였다.
PTOCE 분석에서 연장이합체 중 한 가닥을 고상에 고정된 올리고뉴클레오타이드에 혼성화시키는 경우, 상기 혼성화가 연장이합체 중 다른 가닥의 존재에 의해 방해될 수 있다. 또한, 연장이합체가 예를 들어, 바이오틴-아비딘/스트렙타비딘 시스템을 이용하여 고상에 고정되는 경우, 특정 연장이합체를 고상의 원하는 위치에 고정하는 것은 불가능하다.
본 발명은 다음의 기술적 특징들을 조합함으로써, 상술한 단점들을 해결할 수 있다: (i) 연장이합체의 타겟-의존적 형성, (ii) 액상에서 연장이합체의 형성, (iii) 연장이합체에서 단일 가닥 부위를 가질 수 있게 하는 hCTO의 사용, (iv) 고상에서 hCTO의 IO-혼성화 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 고정화 올리고뉴클레오타이드의 사용.
상기 기술적 특징을 고려하여, 본 발명은 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장 (PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석으로 명명된다.
본 발명의 방법은 본 발명자들의 PTO 및 CTO를 이용하는 이전 방법을 기반으로 하지만, 본 발명자들의 이전 방법의 고상 적용과 관련된 문제점을 해결하고 보다 효율적으로 고상에서 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
본 발명에서, 연장이합체는 조절가능한 Tm 값을 가지며, 이는 복수의 타겟 검출 및 비-타겟 시그널과 타겟 시그널의 구별에 있어서 중요한 역할을 한다. 또한, IO 및 hCTO의 IO-혼성화 부위 간의 혼성화물(hybrid)의 Tm 값도 조절가능하므로, IO 및 hCTO의 IO 혼성화 부위 간의 혼성화물의 형성을 유지하기에 충분한 다양한 조건하에서 타겟 서열이 검출될 수 있다.
본 발명은 보다 상세하게 다음과 같이 설명될 수 있다:
단계 (a): 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 타겟 핵산 서열과의 혼성화
본 발명에 따르면, 타겟 핵산 서열을 먼저 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO)와 혼성화시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산 서열” 또는 “타겟 서열”은 검출하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 이는 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건하에서 프로브 또는 프라이머와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머(primer)”는 핵산 가닥(템플레이트)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건하에서, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재시, 그리고 적합한 온도와 pH에서, 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
특정 구현예에서, 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 많은 인자에 따라 달라질 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 템플레이트 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 템플레이트 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매칭되거나 일부 미스매치로 실질적으로 매칭되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.
타겟 핵산 서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분, 및 이들의 pH 및 이온세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO)의 길이와 GC 함량 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격 조건을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 문헌[Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)]에서 확인할 수 있다.
용어 “어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용되어 사용될 것이다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO는 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “상보적(complementary)”은 지정된 어닐링 조건 또는 엄격 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화될 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 용어 “실질적으로 상보적(substantially complementary)” 및 “완전히 상보적(perfectly complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 예를 들면, 완전히 상보적인 것을 의미한다.
PTO의 5’-태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)의 템플레이팅 부위는 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비-상보적(non-complementary)”은 지정된 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, 용어 “실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적(perfectly noncomplementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 예를 들면, 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO)”는 (i) 프로브의 역할을 하는 3’-타겟팅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열과 혼성화된 후 PTO로부터 핵산절단(nucleolytically) 방식으로 방출되는, 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. PTO에서 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위는 5’→ 3’순서로 위치해야 한다. PTO는 도 1에 도식적으로 예시되어 있다.
일 구현예에서, 상기 단계 (a)에서 혼성화는 상기 3’-타겟팅 부위가 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위가 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않는 엄격 조건하에서 실시된다.
PTO는 특정 길이를 요구하지 않는다. 예를 들어, PTO의 길이는 15-150 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-150 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 30-150 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드, 30-50 뉴클레오타이드, 35-100 뉴클레오타이드, 35-80 뉴클레오타이드, 35-60 뉴클레오타이드 또는 35-50 뉴클레오타이드일 수 있다. PTO의 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 3’-타겟팅 부위는 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이일 수 있다. 5’-태깅 부위는 CTO의 캡처링 부위에 특이적으로 혼성화된 후 연장되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, PTO의 5’-태깅 부위는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이일 수 있다.
PTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널(terminal)을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, PTO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹(blocking)된다.
블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올과 같은 화학적 모이어티(moiety)를 부가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이데옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
택일적으로, PTO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인될 수 있다.
PTO의 5’-태깅 부위와 타겟 핵산 서열 간의 비-혼성화는 특정 혼성화 조건하에서 그들 사이에 안정한 이중-가닥이 형성되지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열과의 혼성화에 관여하지 않는 PTO의 5’-태깅 부위는 단일-가닥을 형성한다. PTO의 5’-태깅 부위가 자체적으로 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 경우, PTO의 5’-태깅 부위는 타겟 핵산 서열과의 혼성화에 관여하지 않고 헤어핀 구조를 형성한다. 이러한 경우, 5’-태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 대해 단일 가닥을 형성하는 것으로 간주된다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 업스트림에 위치한다.
또한, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 PTO 절단의 유도는 두 가지 방식으로 달성될 수 있다: (ⅰ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도; 및 (ⅱ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-의존적 절단 유도.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO에 근접하게 위치하는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 상기 효소가 연장반응 없이 PTO를 절단한다. 반면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO와 이격되어 위치하는 경우, 중합효소 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존적 중합효소)가 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)의 연장을 촉매하고, 연장산물에 결합된 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 PTO를 절단한다.
따라서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 두 가지 방식으로 PTO에 대하여 상대적으로 위치할 수 있다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-독립적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO에 근접하게 위치할 수 있다. 택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO와 이격되어 위치할 수 있다.
본 명세서에서 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어“근접(adjacent)”은 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위에 근접하게 위치하여 닉(nick)을 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위로부터 1-30 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드 또는 1-15 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 지점 또는 위치를 언급하면서 사용되는 용어 “이격(distant)”은 연장반응이 일어나는데 충분한 어떠한 위치 또는 지점을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO와 이격되어 위치한다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다. 업스트림 프라이머는 연장-독립적 절단 유도 또는 연장-의존적 절단에 적합하며, 업스트림 프로브는 연장-독립적 절단 유도에 적합하다.
택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 겹치는 서열은 1-10 뉴클레오타이드, 1-5 뉴클레오타이드 또는 1-3 뉴클레오타이드 길이이다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부와 부분적으로 겹치는 서열을 갖는 경우, 단계 (b)의 절단반응에서 3’-타겟팅 부위는 5’-태깅 부위와 함께 부분적으로 절단된다. 또한, 겹치는 서열은 3’-타겟팅 부위의 원하는 사이트(site)가 절단되도록 한다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO의 절단을 유도하여 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편이 방출되는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단반응에 관한 종래 기술들이 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호가 본 발명에 적용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재하에서 실시된다. 다운스트림 프라이머는 PTO와 혼성화하는 타겟 핵산 서열을 추가적으로 생성하여 타겟 검출의 민감도를 향상시킨다. 예를 들어, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 업스트림 프라이머이고 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소가 DNA 중합효소인 경우, 다운스트림 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 PTO가 혼성화될 수 있는 타겟 핵산 서열을 추가적으로 생성시키며, 이에 단편들이 더 많이 방출되며, 결국 타겟 검출에 대한 민감도가 향상된다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 이용하는 경우, 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소가 추가적으로 사용된다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브), 다운스트림 프라이머 및/또는 PTO의 5’-태깅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(dual priming oligonucleotide; DPO) 구조를 갖는다. 상기 DPO 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 종래 프라이머 및 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
일 구현예에 따르면, PTO의 3’-타겟팅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(modified dual specificity oligonucleotide; mDSO) 구조를 갖는다. 상기 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조는 종래 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2011/028041).
단계 (b): PTO 절단으로부터 단편의 방출
이어, PTO의 절단을 위한 조건하에서 상기 단계 (a)의 결과물을 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 접촉시킨다. 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단되어 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “PTO의 절단을 위한 조건”은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO가 절단되는데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온세기, 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5’뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
PTO가 타겟 핵산 서열에 혼성화되는 경우, 그의 3’-타겟팅 부위는 혼성화에 관여하고, 5’-태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않고 단일-가닥을 형성한다(참조 도 2). 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 다양한 기술에 의해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 절단될 수 있다.
상기 PTO의 절단 사이트는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 종류, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 사이트 및 절단 조건에 따라 달라진다(참조 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호).
5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하는 PTO의 절단반응을 위하여 다수의 종래 기술이 이용될 수 있다.
간략하게, 단계 (b)에서 세 가지 절단 사이트가 존재할 수 있다. 첫 번째 절단 사이트는 PTO의 혼성화 부위(3’-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 간의 정션 사이트(junction site)이다. 두 번째 절단 사이트는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 몇 개의 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치하는 사이트이다. 상기 두 번째 절단 사이트는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치한다. 세 번째 절단 사이트는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 5’-방향으로 몇 개의 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치하는 사이트이다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머의 연장시 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소에 의한 PTO의 절단을 위한 초기 사이트(initial site)는 PTO 및 타겟 핵산 서열 간의 이중가닥의 시작점(starting point) 또는 그 시작점으로부터 1-3 뉴클레오타이드만큼 이격된 위치이다.
이러한 관점에서, 본 명세서에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO의 절단과 관련하여 사용되는 용어 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 (i) 5’-태깅 부위, (ii) 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 (iii) 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에서 “PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 “단편” 또는 “PTO 단편”으로 표현될 수 있다.
일 구현예에 따르면, PTO는 블록커로서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 절단에 대해 내성을 갖는 최소 1개의 뉴클레오타이드를 포함하는 블록커 부위를 갖고, 상기 블록커 부위는 초기 절단 사이트 및/또는 연속적인 절단을 조절하기 위해 사용된다. 예를 들어, 상기 PTO의 혼성화 부위(3’-타겟팅 부위) 및 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 간의 정션 사이트에서 절단을 유도하기 위하여, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 블록커로 블록킹될 수 있다. 상기 블록커 부위에 포함되는 블록커의 개수는 제한되지 않으며, 1-10, 2-10, 3-8, 또는 3-6 블록커를 포함한다. PTO에 존재하는 블록커는 연속적 또는 불연속적인 방식으로 존재할 수 있으며, 바람직하게는 연속적인 방식이다. 블록커로서 5’→ 3’뉴클레아제 활성에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드는 당업계에 알려진 어떠한 것도 포함한다. 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드는 다양한 포스포로티오에이트 연결, 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2’-카보하이드레이트 변형을 포함한다. 일 구현예에 따르면, 5’→ 3’뉴클레아제 활성에 대하여 내성을 갖는 백본을 포함하는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로셀레네이트 연결, 2’-O-아미노프로필 변형, 2’-O-알킬 변형, 2’-O-알릴 변형, 2’-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 1-(4’-티오-β-D-리보퓨라노실) 변형을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 블록커로서 뉴클레오타이드는 잠금 핵산(locked nucleic acid; LNA)을 포함한다.
PTO의 5’-태깅 부위의 일부, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부와 같이 PTO 또는 CTO와 관련하여 사용되는 용어 “일부(part)”는 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 뉴클레오타이드, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이며, 바람직하게는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다.
본 발명에서 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 적합한 DNA 중합효소는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus, Thermococcus literalis , Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens, Thermus scotoductus , Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosipho africanus , Thermococcus litoralis , Thermococcus barossi , Thermococcus gorgonarius , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana , Thermosiphoafricanus , Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii , Pyrococcus abyssi , Pyrodictium occultum , Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함하는, 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이다. 특정 구현예에서, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
택일적으로, 본 발명은 감소된 중합효소 활성을 갖도록 변형된, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 사용되는 FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5’플랩-특이적 뉴클레아제(5’flap-specific nuclease)이다.
본 발명에서 적합한 FEN 뉴클레아제는 Sulfolobus solfataricus , Pyrobaculum aerophilum , Thermococcus litoralis , Archaeaglobus veneficus , Archaeaglobus profundus , Acidianus brierlyi , Acidianus ambivalens , Desulfurococcus amylolyticus , Desulfurococcus mobilis , Pyrodictium brockii , Thermococcus gorgonarius , Thermococcus zilligii , Methanopyrus kandleri , Methanococcus igneus , Pyrococcus horikoshii , Aeropyrum pernix 및 Archaeaglobus veneficus를 포함하는, 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 FEN 뉴클레아제를 포함한다.
상기 단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하는 경우, PTO의 절단을 위한 조건은 업스트림 프라이머의 연장반응을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)에서 업스트림 프라이머가 사용되고, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소가 사용되며, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일하다.
택일적으로, 상기 단계 (a)에서 업스트림 프라이머가 사용되고, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소가 사용되며, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 상이하다.
단계 (c): PTO로부터 방출된 단편과 hCTO의 혼성화
상기 PTO로부터 방출된 단편은 혼성화-캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(hybridizing-capturing and templating oligonucleotide; hCTO)와 혼성화 된다.
상기 hCTO는 (i) 3’→5’방향으로 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 CTO 및 (ii) 고상 기질 상에 고정된 고정화 올리고뉴클레오타이드(immobilized oligonucleotide; IO)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 상기 CTO의 3’또는 5’-말단에 포함한다. 상기 IO-혼성화 부위는 hCTO의 3’또는 5’-말단에 위치한다.
hCTO에서 기본 구조가 되는 CTO는 다음과 같은 부위 및 기능을 갖는다:
상기 CTO는 상기 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 템플레이트로서의 역할을 한다. 프라이머로서의 작용하는 상기 단편은 상기 CTO에 혼성화되고, 연장되어 연장이합체를 형성한다.
상기 템플레이팅 부위는 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 상기 템플레이팅 부위는 PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 템플레이트로서의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, 절단 반응에 의해 PTO의 5’-태깅 부위를 갖는 단편이 방출되는 경우, 상기 CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, 상기 CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다. PTO의 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편이 방출되는 경우, 상기 CTO의 캡처링 부위는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인될 수 있다.
더욱이, PTO의 절단 사이트를 예상함으로써 CTO의 캡처링 부위를 디자인할 수 있다. 예를 들어, CTO의 캡처링 부위가 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인되는 경우, 5’-태깅 부위의 일부를 갖는 단편 또는 5’-태깅 부위를 갖는 단편은 캡처링 부위와 혼성화되어 연장될 수 있다. 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, 상기 단편은 5’-태깅 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 디자인된 CTO의 캡처링 부위에 혼성화될 수 있으며, 상기 단편의 3’-말단 부위에 미스매치 뉴클레오타이드가 존재함에도 불구하고, 성공적으로 연장될 수 있다. 이것은 프라이머의 3’-말단이 일부 미스매치 뉴클레오타이드(예컨대, 1-3 미스매치 뉴클레오타이드)를 포함함에도 불구하고, 프라이머가 반응 조건에 따라 연장될 수 있기 때문이다.
5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 단편이 방출되는 경우, CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부(참조 도 1)는 상기 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 디자인될 수 있으며, 미스매치 뉴클레오타이드와 관련된 문제를 해결할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위 상의 예상되는 절단 사이트에 따라 선택될 수 있다. 상기 절단된 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 상보적인 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 1-10 뉴클레오타이드, 1-5 뉴클레오타이드 또는 1-3 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
상기 CTO의 3’-말단은 상기 단편과의 혼성화에 관여하지 않는 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 단편과 안정적으로 혼성화되는 한, CTO의 캡처링 부위는 상기 단편의 일부(예컨대, 단편의 3’-말단 부위를 포함하는 단편의 일부)에만 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위”는 상술한 바와 같이 CTO의 캡처링 부위의 다양한 디자인 및 조성을 포함하는 것으로 본원에 기재된다.
상기 CTO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인될 수 있다.
상기 CTO의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO는 6-1000 뉴클레오타이드, 6-500 뉴클레오타이드, 6-300 뉴클레오타이드, 6-100 뉴클레오타이드, 6-80 뉴클레오타이드, 6-60 뉴클레오타이드, 6-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드의 길이이다. 상기 CTO의 캡처링 부위는 PTO로부터 방출된 단편에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO의 캡처링 부위는 5-100 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이이다. 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 PTO로부터 방출된 단편의 연장에서 템플레이트로서의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 1-900 뉴클레오타이드, 1-400 뉴클레오타이드, 1-300 뉴클레오타이드, 1-100 뉴클레오타이드, 1-80 뉴클레오타이드, 1-60 뉴클레오타이드, 1-40 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 2-900 뉴클레오타이드, 2-400 뉴클레오타이드, 2-300 뉴클레오타이드, 2-100 뉴클레오타이드, 2-80 뉴클레오타이드, 2-60 뉴클레오타이드, 2-40 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 5-900 뉴클레오타이드, 5-400 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-900 뉴클레오타이드, 10-400 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 15-900 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이이다.
상기 CTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널을 가질 수 있다. 구체적으로, CTO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다. CTO의 비-연장 블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, 블록킹은 CTO의 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올과 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이데옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
상기 PTO로부터 방출된 단편은 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되어, 단편의 연장에 적합한 형태를 제공한다. 또한, 비절단 PTO가 그의 5’-태깅 부위를 통하여 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되더라도, PTO의 3’-타겟팅 부위는 CTO와 혼성화되지 않아, 연장이합체의 형성이 방지된다.
상기 단계 (c)에서의 혼성화는 상기 단계 (a)에서의 설명을 참조하여 상세하게 설명될 수 있다.
상기 hCTO는 고상 기질 상에 고정된 고정화 올리고뉴클레오타이드(IO)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 포함한다.
상기 hCTO 상에서 단편의 연장이 발생하는 경우에도 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위는 단일 가닥 상태를 유지하는 부위이다.
일 구현예에 따르면, 상기 IO-혼성화 부위는 CTO의 3’-말단에 연결된다. 이러한 경우, 상기 hCTO는 3’→5’방향으로 IO-혼성화 부위, 캡처링 부위 및 템플레이팅 부위를 포함한다. PTO 단편은 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되므로, IO-혼성화 부위는 단일 가닥 상태를 유지한다.
일 구현예에 따르면, 상기 IO-혼성화 부위는 CTO의 5’-말단에 연결된다. 이러한 경우, hCTO는 3’→5’방향으로 캡처링 부위, 템플레이팅 부위 및 IO-혼성화 부위를 포함한다. 이러한 구현예에서는, 캡처링 부위와 혼성화된 PTO 단편이 연장시 상기 IO-혼성화 부위가 이중 가닥에 포함될 수 있다. 일 구현예에 따르면, IO-혼성화 부위가 CTO의 5’-말단에 위치하는 경우, 상기 hCTO는 CTO와 IO-혼성화 부위 사이에 상기 단편의 연장 반응을 방지하는 블록커 부위를 추가적으로 포함한다.
템플레이팅 부위의 5’-말단을 IO-혼성화 부위의 5’-말단에 연결하여 상기 hCTO가 제조된 경우, 상기 블록커를 사용하지 않을 수 있다.
IO-혼성화 부위는 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, IO-혼성화 부위는 5-1000 뉴클레오타이드, 5-500 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 10-1000 뉴클레오타이드, 10-500 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드의 길이이다.
상기 CTO와 상기 IO-혼성화 부위 사이에 위치하며 맞은 편 가닥의 합성에 대한 주형-의존적 핵산 중합효소의 작용을 방지할 수 있는 블록커는, 주형-의존적 핵산 중합효소의 이러한 작용을 방지하는데 적합한 어떠한 블록커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 블록커는 알킬렌기, 리보퓨라노실 나프탈렌, 데옥시리보퓨라노실 나프탈렌, 메타포스페이트, 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결 또는 아릴 포스포로아미데이트 연결을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 블록커로서 카본 스페이서가 사용될 수 있다.
상기 hCTO의 IO-혼성화 부위는 고상 기질 상에 고정된 고정화 올리고뉴클레오타이드(IO)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 IO-혼성화 부위는 그의 단일 가닥 상태를 유지하므로, 상기 hCTO는 매우 효율적으로 고상 기질 상에 고정된 IO에 혼성화될 수 있다.
상기 hCTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, hCTO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 “블록킹”된다.
단계 (d): 단일 가닥 부위를 포함하는 연장이합체를 형성하기 위한 상기 단편의 연장
상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시한다. 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 상기 hCTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 형성하고, 이에 의해 연장이합체를 형성한다. 상기 IO-혼성화 부위는 단일 가닥 상태로 유지된다. 결과적으로, 단일 가닥 부위를 포함하는 연장이합체가 형성된다.
반면, 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 비절단 PTO는 연장되지 않아 연장이합체도 형성되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “연장이합체(extended duplex)”는 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 단편이 주형-의존적 핵산 중합효소와 hCTO의 템플레이팅 부위를 템플레이트로 이용하여 연장되는 연장반응에 의하여 형성된 이합체를 의미한다.
본 명세서에서 단편과 함께 사용되는 용어 “연장가닥(extended strand)”은 단편 및 단편의 연장서열로 구성된 서열을 의미한다.
본 명세서에서 단편과 함께 사용되는 용어 “연장서열(extended sequence)”은 연장가닥에서 단편을 제외한 새롭게 합성된 서열만을 의미한다.
상기 hCTO를 템플레이트로 이용하여 형성된 연장이합체는 "hCTO-연장이합체” 또는 “연장이합체 hCTO”로 표현될 수 있다.
상기 hCTO-연장이합체 또는 연장이합체 hCTO는 hCTO 및 연장가닥의 혼성화 결과물이다.
상기 연장이합체는 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물의 Tm 값과 상이한 Tm 값을 갖도록 할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 연장이합체는 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물의 Tm 값보다 높은 Tm 값을 갖는다.
연장이합체의 Tm 값은 (i) 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) hCTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 단편의 서열 및/또는 길이와 hCTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능하다. 특히, 연장이합체의 Tm 값은 hCTO의 기본 구조인 CTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능하다.
연장이합체의 조절가능한 Tm 값을 사용하여 연장이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 것은 본 발명의 기술적 특징이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “Tm”은 이중가닥 핵산 분자의 집단(population)의 절반이 단일-가닥 분자로 해리되는 멜팅 온도를 의미한다. Tm 값은 혼성화된 뉴클레오타이드의 길이 및 G/C 함량에 의해 결정된다. Tm 값은 Wallace rule(R.B. Wallace 등, Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) 및 nearest-neighbor 방법(SantaLucia J. Jr. 등, Biochemistry, 35:3555-3562(1996)); Sugimoto N. 등, Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996))과 같은 종래 방법에 의하여 계산할 수 있다.
일 구현예에 따르면, Tm 값은 실제 사용하는 반응 조건하에서의 실제 Tm 값을 의미한다.
단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 어떠한 핵산 중합효소, 예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 중합효소는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함하는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 보다 구체적으로는, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq 중합효소이다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소와 동일하다. 특히, 상기 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 업스트림 프라이이머의 연장을 위하여 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 서로 동일하다.
상기 단계 (d)는 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편이 연장되어 상기 hCTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장가닥을 생성하고, 연장이합체가 형성되는 조건하에서 실시된다.
단계 (e): 연장이합체 및 고정화 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화
이어, 단계 (d)의 결과물은 고상 기질 상의 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilized Oligonucleotide; IO)와 혼성화된다.
상기 IO는 고상 기질 상에 고정되어 있으며, hCTO의 IO-혼성화 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위와 혼성화되어 IO 이합체를 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “IO 이합체(IO duplex)”는 IO 및 hCTO의 IO-혼성화 부위 간의 혼성화에 의해 형성된 이합체를 의미한다.
상기 IO 이합체는 IO 및 연장이합체(즉, hCTO-연장이합체)를 형성하는 hCTO 간의 혼성화물뿐만 아니라 IO 및 연장이합체를 형성하지 않는 hCTO 간의 혼성화물도 포함한다.
분석되는 핵산 시료 내에 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 연장이합체가 템플레이트로 작용하는 hCTO 상에 형성되며, 연장이합체에서의 hCTO의 IO-혼성화 부위를 통하여 상기 연장이합체는 IO에 혼성화된다. 상기 연장이합체가 hCTO 상에 형성되더라도, 상기 IO-혼성화 부위는 단일 가닥 상태를 유지하며, 연장이합체 및 IO 간의 효율적인 혼성화를 가능하게 한다.
핵산 시료 내에 타겟 핵산 서열이 존재하지 않는 경우, 연장이합체는 형성되지 않으며, 상기 IO는 연장이합체를 형성하지 않은 상태의 hCTO에 혼성화된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 연장가닥과 hCTO-연장이합체를 형성하는 hCTO는 IO에 혼성화된다.
택일적으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면, hCTO 연장이합체가 IO에 혼성화되기 전, hCTO-연장이합체를 hCTO 및 연장가닥으로 해리시키고, hCTO를 IO에 혼성화시킨 다음 연장가닥을 IO에 혼성화된 hCTO에 혼성화시키는 단계를 실시하여 hCTO-연장이합체 및 IO 간의 혼성화물을 얻는다.
상기 IO는 hCTO의 IO-혼성화 부위에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 IO는 5-1000 뉴클레오타이드, 5-500 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 10-1000 뉴클레오타이드, 10-500 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드의 길이이다.
IO와 hCTO의 IO-혼성화 부위의 서열 및 길이는, 고상에서 연장이합체의 존재를 검출하기 위한 조건하에서 IO 및 hCTO의 IO-혼성화 부위 간의 이합체가 유지되도록 미리 결정될 수 있다.
IO의 3’-말단은 3’-OH 터미널을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, IO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다.
IO의 존재하에서 hCTO 상의 PTO 단편의 연장이 실시되는 경우, 연장이합체가 형성되기 전에 일부 hCTO가 IO와 혼성화될 수 있으며, 이로 인해 일부 연장 반응이 고상에서 일어날 수 있다. 다만, 액상에 존재하는 hCTO 상의 연장 반응이 고상 연장보다 효율적이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 연장이합체의 형성 전에는 hCTO가 IO에 혼성화되지 않지만 hCTO 상에서 PTO 단편의 연장 반응 후에는 연장 결과물이 IO에 혼성화되도록 반응 조건을 조절하면서 실시된다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 서열 또는 반응 조건(예컨대, 온도)은 PTO 단편의 혼성화 및 연장이 IO 및 IO-혼성화 부위 간의 혼성화물을 위한 조건보다 엄격한 조건하에서 실시될 수 있도록 선택되거나 또는 조절된다.
특정 구현예에서, 연장이합체의 형성 및 IO와의 혼성화는 각각 다른 튜브(tube)에서 실시되어, 연장 반응 전의 고상의 IO와 hCTO와의 혼성화를 방지한다.
연장이합체에 관여하는 hCTO가 IO에 혼성화되었는지 아니면 연장이합체에 관여하지 않는 hCTO가 IO에 혼성화되었는지 여부는 고상에서 제공되는 시그널을 검출함으로써 결정될 수 있다.
상기 연장이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 상기 단편에 연결된 표지 또는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 IO에 연결된 표지에 의해 타겟 시그널을 제공한다.
상기 연장이합체는 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우에만 형성되기 때문에 연장이합체의 존재는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 시그널”은 연장이합체의 존재를 나타낼 수 있는 모든 시그널을 의미한다. 예를 들어, 타겟 시그널은 표지로부터의 시그널(시그널 발생 또는 소멸) 및 표지로부터의 시그널 변화(시그널 증가 또는 감소)를 포함한다.
타겟 시그널을 제공하는 표지 시스템 중 일부는 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물 형성시 타겟 시그널과 동일한 특성의 시그널을 제공할 수 있다. 상기 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물 형성시 발생되는 시그널은 “비-타겟 시그널”로 표현된다. 상기 비-타겟 시그널은 연장이합체와 비절단 PTO 및 hCTO의 혼성화물 간의 Tm 차이를 이용하여 제거될 수 있다(참조 WO2012/096523). 연장이합체의 Tm 값은 임의적으로 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 연장이합체의 Tm 값은 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물 Tm 값보다 높도록 조절될 수 있다. 연장이합체가 이중 가닥 상태인 미리 지정된 온도에서 타겟 시그널이 검출되는 것을 고려하면, 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물의 Tm 값은 상기 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물이 미리 지정된 온도에서 해리되도록 조절될 수 있으며, 이로 인해 비-타겟 시그널이 제거된다. 특정 구현예에서, 타겟 서열을 포함하지 않는 음성 대조군으로부터의 시그널을 참조로 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(ⅰ) 단편 및/또는 hCTO에 연결된 최소 하나의 표지
특정 구현예에서, 상기 타겟 시그널은 단편 및/또는 hCTO에 연결된 최소 하나의 표지에 의해 제공된다. 연장이합체는 PTO 단편 및 hCTO 간에 형성되며, 단편 및/또는 hCTO에 연결된 표지는 연장이합체에 존재하여 타겟 시그널을 제공한다.
표지는 상호작용적 이중 표지 및 단일 표지를 포함한다.
(ⅰ-1) 상호작용적 이중 표지
상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 발색단(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성, 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다. 상기 공여체 분자 및 수용체 분자는 본 발명에서 각각 리포터 분자 및 퀀처 분자로서 표현될 수 있다. 상호작용적 표지 시스템은 “접촉-매개 퀀칭(contact-mediated quenching)”에 기반한 검출가능한 시그널을 제공하는 표지 쌍을 포함한다(Salvatore 등, Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 및 Johansson 등, J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 본 발명에서, 상호작용적 표지 시스템은 최소 2개 분자들(예컨대, 염료) 간의 상호작용에 의해 시그널 변화를 유도하는 어떠한 표지 시스템도 포함한다.
상호작용적 이중 표지 시스템의 일 구현예에서, hCTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 상기 단계 (d)에서 상기 단편의 연장은 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공한다. 일 구현예에서, hCTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 상기 단계 (d)에서 상기 단편의 연장에 의해 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화가 유도되는 사이트에 위치한다. 일 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 hCTO의 템플레이팅 부위에 위치한다. 리포터 분자 및 퀀처 분자가 hCTO의 템플레이팅 부위에 위치하고 템플레이팅 부위가 단일 가닥 상태인 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 구조적으로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 상기 단계 (d)에서 연장이합체가 형성되면, hCTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고 타겟 시그널을 제공한다. 고상에 고정된 IO에 혼성화된 연장이합체로부터 제공되는 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 “리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 근접한다”는 것은 랜덤 코일(coli) 및 헤어핀 구조와 같은 표지가 결합되어 있는 가닥(예컨대, 단편 또는 hCTO)의 형태적 구조에 의하여 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 서로 근접하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 표현 “리포터 분자 및 퀀처 분자가 구조적으로 이격된다”는 것은 이중 가닥의 형성시 표지가 결합되어 있는 가닥(예컨대, 단편 또는 hCTO)의 형태적 구조의 변화에 의하여 리포터 분자 및 퀀처 분자가 3차원적으로 이격되는 것을 의미한다.
상호작용적 이중 표지 시스템의 다른 구현예에서, hCTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 상기 단계 (c)에서의 단편 및 hCTO의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 상기 연장이합체는 타겟 시그널을 유지한다. 일 구현예에서, hCTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 상기 단계 (c)에서의 단편 및 hCTO의 혼성화에 의해 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화가 유도되는 사이트에 위치한다. 일 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 hCTO의 캡처링 부위에 위치한다. 리포터 분자 및 퀀처 분자가 hCTO의 캡처링 부위에 위치하고, hCTO의 캡처링 부위가 단일 가닥 상태인 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 구조적으로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 단편이 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, hCTO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하고 타겟 시그널이 제공된다. 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지한다. 고상에 고정된 IO에 혼성화된 연장이합체로부터 제공되는 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다. 이러한 구현예에서는, 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물이 비-타겟 시그널을 제공할 수 있다. 상기 비-타겟 시그널은 비절단 PTO 및 hCTO의 혼성화물과 연장이합체 간의 Tm 차이를 이용하여 검출 온도를 조절함으로써 제거될 수 있다.
상호작용적 이중 표지 시스템의 다른 구현예에서, 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 상기 단계 (c)에서 단편 및 hCTO의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지한다. 일 구현예에서, PTO 단편 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 상기 단계 (c)에서 단편 및 hCTO의 혼성화에 의해 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화가 유도되는 사이트에 위치한다. 일 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 PTO 단편의 5’-태깅 부위에 위치한다. 리포터 분자 및 퀀처 분자가 PTO 단편에 위치하고, PTO 단편(또는 5’-태깅 부위)이 단일 가닥 상태인 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 구조적으로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. PTO 단편이 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, PTO 단편은 이중 가닥에 관여하고, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 타겟 시그널을 제공한다. 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지한다. 고상에 고정된 IO에 혼성화된 연장이합체로부터 제공되는 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다. 이러한 구현예에서는, 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물이 비-타겟 시그널을 제공할 수 있다. 상기 비-타겟 시그널은 비절단 PTO 및 hCTO의 혼성화물과 연장이합체 간의 Tm 차이를 이용하여 검출 온도를 조절함으로써 제거될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 동일한 가닥 상에 상호작용적 이중 표지가 존재하는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 최소 4 뉴클레오타이드, 최소 7 뉴클레오타이드, 최소 10 뉴클레오타이드, 최소 15 뉴클레오타이드 또는 최소 20 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치한다.
상호작용적 이중 표지 시스템의 다른 구현예에서, 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 가지며 hCTO는 상기 상호작용적 이중 표지 중 다른 하나를 가지고; 상기 단계 (c)에서 단편 및 hCTO의 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지한다. 이러한 구현예에서, 상기 상호작용적 이중 표지 중 하나는 PTO의 5’-말단에 위치하고, 다른 하나는 hCTO의 캡처링 부위의 3’-말단에 위치한다. 상호작용적 이중 표지 중 하나가 PTO의 5’-말단에 위치하고, 다른 하나가 hCTO의 캡처링 부위의 3’-말단에 위치하는 경우, 단편 및 hCTO 간의 혼성화 이전에 리포터 분자 및 퀀처 분자가 이격되어 있어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하지 않는다. 상기 단계 (c)에서 단편이 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되는 경우, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 근접하게 되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하고, 이에 의해 타겟 시그널이 제공된다. 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지한다. 고상에 고정된 IO에 혼성화된 연장이합체로부터 제공되는 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다. 이러한 구현예에서는, 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물이 비-타겟 시그널을 제공할 수 있다. 상기 비-타겟 시그널은 연장이합체와 비절단 PTO 및 hCTO의 혼성화물 간의 Tm 차이를 이용하여 검출 온도를 조절함으로써 제거될 수 있다.
본 발명에서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™(525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y(580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™(670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호 안의 숫자는 나노미터 단위의 최대 발광 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같이 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
다양한 범위의 파장 또는 특정한 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 퀀처 분자(예컨대, 다크 퀀처 분자)가 본 발명에서 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 비-형광 퀀처 분자의 예는 BHQ 및 DABCYL이다.
상호작용적 이중 표지 시스템 유형에 따라, 리포터 분자 또는 퀀처 분자로부터의 시그널이 검출될 수 있다.
FRET 표지에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예를 들어, 플루오레세인 염료(fluorescein dye)는 리포터로 이용되며, 로다민 염료(rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
(ⅰ-2) 단일 표지
단일 표지의 일 구현예에서, hCTO는 단일 표지를 가지며, 상기 단계 (d)에서 단편의 연장은 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공한다. 일 구현예에서, hCTO 상의 단일 표지는 상기 단계 (d)에서 단편의 연장에 의해 단일 표지로부터의 시그널의 변화가 유도되는 사이트에 위치한다. 일 구현예에서, 단일 표지는 hCTO의 템플레이팅 부위에 위치한다. 일 구현예에서, 본 발명은 hCTO가 IO와 혼성화하는 것을 포함하므로, 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있는 단일 표지가 본 발명에서 유용하다. 상기와 같은 특성을 갖는 한, 어떠한 단일 표지도 사용될 수 있다. 상기 특성의 단일 형광 표지의 예는 단일 형광 표지의 종류 및 바람직한 결합 위치를 기술하는 문헌 [미국 특허 번호 제7,537,886호 및 제7,348,141호]에 개시되어 있다. 일 구현예에서, 상기 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 일 구현예에서, 표지되는 뉴클레오타이드 잔기는 5’-말단 또는 3’-말단보다는 올리고뉴클레오타이드 내의 내부 뉴클레오타이드 잔기에 위치할 수 있다.
이러한 단일 형광 표지가 hCTO의 템플레이팅 부위에 위치하고, 상기 단계 (d)에서 연장이합체가 형성되는 경우, hCTO의 템플레이팅 부위는 이중 가닥 상태가 되고 상기 단일 표지로부터의 형광 시그널 세기는 단일 가닥 상태에서 단일 표지로부터의 형광 시그널 세기와 비교하여 증가하게 된다. 따라서, 단일 표지를 사용하는 구현예에서, 고상에서의 시그널 증가의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다.
단일 표지의 다른 구현예에서, hCTO는 단일 표지를 가지며, 상기 단계 (c)에서 단편 및 hCTO의 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공하고, 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지한다. 일 구현예에서, hCTO 상의 단일 표지는 상기 단계 (c)에서 단편 및 hCTO의 혼성화에 의해 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화가 유도되는 사이트에 위치한다. 일 구현예에서, 단일 표지는 hCTO의 캡처링 부위에 위치한다. 연장이합체는 타겟 시그널을 유지한다. 따라서, 단일 표지를 사용하는 구현예에서, 고상에서의 시그널 증가의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다.
일 구현예에서, 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있는 단일 표지가 사용된다. 이러한 단일 형광 표지가 hCTO의 캡처링 부위에 위치하고, 상기 단계 (c)에서 단편이 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되는 경우, hCTO의 캡처링 부위는 이중 가닥 상태가 되며, 단일 표지로부터의 형광 시그널 세기는 단일 가닥 상태에서 단일 표지로부터의 형광 시그널 세기와 비교하여 증가하게 된다. 따라서, 단일 표지를 사용하는 구현예에서, 고상에서의 시그널 증가의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다. 일 구현예에서, 비절단 PTO 및 hCTO의 혼성화물에 의해 비-타겟 시그널이 제공될 수 있으며, 이는 비절단 PTO 및 hCTO의 혼성화물과 연장이합체 간의 Tm 차이를 이용하여 검출 온도를 조절함으로써 제거될 수 있다.
단일 표지의 또 다른 구현예에서, 단편은 단일 표지를 가지며, 상기 단계 (c)에서 단편 및 hCTO 간의 혼성화는 타겟 시그널을 제공하고, 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지한다.
단편에 연결된 단일 표지는 고상에서 연장이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공할 수 있는 어떠한 표지, 예를 들어, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지, 금속 표지, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴) 및 효소적 표지(예컨대, 알카라인 포스파타아제, 퍼록시다제, β-갈락토시다제 및 β- 글루코시다제)를 포함한다. 본 발명에서 유용한 단일 형광 표지는 상기 서술한 바와 같이 리포터 및 퀀처 분자에 대한 설명을 참조하여 설명할 수 있다.
도 2는 단일 표지를 갖는 PTO 단편을 이용하는 일 구현예를 도식적으로 보여준다.
형광 단일 표지가 PTO 단편 상에 위치하고, 상기 단계(c)에서 PTO 단편이 hCTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 경우, PTO 단편에 연결된 단일 표지는 타겟 시그널을 제공하고, 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지한다. 고상에 고정된 IO에 혼성화된 연장이합체로부터 제공되는 상기 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다. 일 구현예에서, 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물에 의해 비-타겟 시그널이 제공될 수 있으며, 이는 비절단 PTO 및 hCTO의 혼성화물과 연장이합체 간의 Tm 차이를 이용하여 검출 온도를 조절함으로써 제거될 수 있다.
(ⅱ) 연장이합체 내에 삽입된 표지
본 발명은 연장이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하기 위하여, 연장이합체 내에 삽입된 표지를 이용할 수 있다.
연장 반응 동안 삽입되는 표지를 이용하는 일 구현예에서, 타겟 시그널은 연장 반응 동안 연장이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의해 제공되며, 삽입된 단일 표지는 연장 반응 동안 삽입되는 뉴클레오타이드에 연결되어 있다.
특정 구현예에서, 복수의 동일한 단일 표지가 삽입될 수 있다. 단일 표지는 고상에서 연장이합체의 존재를 나타내는 시그널을 제공할 수 있는 한, 어떠한 표지도 포함할 수 있다.
도 3은 연장 반응 동안 삽입되는 표지를 이용하는 일 구현예를 도식적으로 보여준다. PTO 단편이 hCTO 상에서 연장되는 경우, 표지를 갖는 뉴클레오타이드가 삽입된다. 연장이합체 내에 삽입된 표지는 타겟 시그널을 제공한다. 고상에 고정된 IO에 혼성화된 상기 연장이합체로부터의 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다.
일 구현예에서, 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, hCTO는 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다. 일 구현예에서, 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 hCTO의 템플레이팅 부위의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 비-자연 염기는 특정 사이트 내에 표지를 삽입하기 위하여 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “비-자연 염기(non-natural base)”는 수소-결합 염기 쌍을 형성할 수 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연 염기의 유도체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비-자연 염기”는 모화합물(mother compound)로서 자연 염기와 상이한 염기 쌍 패턴을 갖는 염기를 포함하며, 예컨대, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호 및 제6,037,120호에 기재되어 있다. 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 자연 염기와 마찬가지로 둘 또는 세 개의 수소결합을 포함한다. 또한, 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 특정한 방식으로도 형성된다. 비-자연 염기의 특정한 예는 염기 쌍 조합에서 다음과 같은 염기들을 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J 및 M/N (참조 미국 특허 제7,422,850호).
도 3은 특정 사이트 내에 표지를 삽입하기 위하여 비-자연 염기를 이용하는 구현예를 도식적으로 보여준다. 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 hCTO에 단편이 혼성화된다. 형광 단일 표지와 함께 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에서 연장 반응이 실시되어, 연장이합체를 형성한다. 연장 반응에서, 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 사이트 내에 삽입된다. 고상에 고정된 IO에 혼성화된 상기 연장이합체로부터 제공되는 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다.
사용되는 단일 표지의 종류 및 특징은 상술한 “단편 및 hCTO에 연결된 표지”에 대한 표지 시스템의 설명을 참조하여 설명될 수 있다.
(ⅲ) 연장이합체 내에 삽입된 표지와 단편 및/또는 hCTO에 연결된 표지의 조합
연장 반응 동안 연장이합체 내에 삽입된 표지와 단편 및/또는 hCTO에 연결된 표지를 이용하는 일 구현예에서, 타겟 시그널은 연장 반응 동안 연장이합체 내에 삽입된 표지와 단편 및/또는 hCTO에 연결된 표지에 의해 제공되고; 상기 삽입된 표지는 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있으며; 상기 두 개의 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자의 상호작용적 이중 표지이고; 상기 단계 (d)에서의 단편의 연장은 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널을 제공한다.
일 구현예에서, 삽입된 표지와 단편 및/또는 hCTO에 연결된 표지는 상기 단계 (d)에서 단편의 연장에 의해 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화가 유도되는 사이트에 위치한다.
특정 구현예에서, 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, hCTO는 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
일 구현예에서, 상기 비-자연 염기는 특정 사이트 내에 표지를 삽입하기 위하여 사용된다.
일 구현예에서, 단편은 (i) 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드 및 (ii) 리포터를 템플레이팅 부위의 5’-말단에 포함하는 hCTO에 혼성화된다. 퀀처 분자와 함께 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에서 연장 반응이 실시되어, 연장이합체가 형성되며 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의해 퀀칭된다. 즉, 상기 단계 (d)에서 단편의 연장은 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 타겟 시그널이 제공된다. 연장 반응에서, 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 맞은편 사이트에 삽입된다. 고상에 고정된 IO에 혼성화된 상기 연장이합체로부터의 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다.
특정 구현예에서, 퀀처 분자는 hCTO에 연결되어 있으며, 리포터 분자는 연장 반응 동안 삽입된다.
다른 구현예에서, 리포터를 포함하는 단편은 제1 비-자연 염기(예컨대, iso-dG)에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기(예컨대, iso-dC)를 갖는 뉴클레오타이드를 템플레이트 부위에 포함하는 hCTO에 혼성화된다. 퀀처 분자와 함께 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에서 연장 반응이 실시되어, 연장이합체가 형성되며 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의해 퀀칭된다. 즉, 단편의 연장은 상호작용적 이중 표지의 시그널 변화를 유도하여 연장이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공한다. 퀀처 분자가 삽입되는 위치는 연장이합체에서 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭하는 어떠한 위치도 포함한다.
특정 구현예에서, 퀀처 분자는 단편에 연결되어 있고, 리포터 분자는 연장 반응 동안 삽입된다.
고상에 고정된 IO에 혼성화된 연장이합체로부터의 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다.
(ⅳ) 단편에 연결된 표지 또는 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 IO에 연결된 표지의 조합
단편에 연결된 표지 또는 연장 반응 동안 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 IO에 연결된 표지를 이용하는 일 구현예에서, 타겟 시그널은 단편에 연결된 표지 또는 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 IO에 연결된 표지에 의해 제공되고; 상기 단편에 연결된 표지 또는 상기 연장 반응 동안 연장이합체 내에 삽입된 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고, 상기 IO는 상기 상호작용적 이중 표지 중 다른 하나를 가지며; 상기 단계 (e)에서 상기 연장이합체와 IO와의 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공한다.
상기 타겟 시그널은 연장이합체가 IO에 혼성화되는 경우에만 제공된다.
일 구현예에서, 단편에 연결된 표지 또는 연장 반응 동안 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 IO에 연결된 표지는 상기 단계 (e)에서 연장이합체와 IO와의 혼성화에 의해 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화가 유도되는 사이트에 위치한다.
일 구현예에서, hCTO의 IO-혼성화 부위는 hCTO의 기본 구조인 CTO의 3’-말단에 위치하고, IO는 그의 5’-말단을 통하여 고상에 고정되어 있으며, 퀀처 분자는 PTO 단편의 5’-말단에 연결되어 있고, 리포터 분자는 IO의 3’-말단에 연결되어 있다. 5’-말단에 퀀처 분자를 갖는 PTO 단편이 hCTO에 혼성화되는 경우, 연장이합체가 형성되고, 상기 연장이합체는 IO에 혼성화되며, 연장이합체 상의 퀀처 분자 및 IO 상의 리포터 분자는 서로 근접하게 되어, 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도한다.
특정 구현예에서, 리포터 분자는 PTO 단편에 연결되어 있고, 퀀처 분자는 IO에 연결되어 있다.
고상에 고정된 IO에 혼성화된 연장이합체로부터 제공되는 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다.
일 구현예에서, IO 및 비절단 PTO/hCTO의 혼성화물 간의 혼성화시에 비-타겟 시그널이 제공될 수 있다. 상기 비-타겟 시그널은 hCTO 및 IO 간의 혼성화가 유지되면서 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화는 해리되는 검출 온도를 조절함으로써 제거될 수 있다.
다른 구현예에서, hCTO의 IO-혼성화 부위는 블록커를 통해 기본 구조인 CTO의 5’-말단에 위치하고, IO는 그의 3’-말단을 통해 고상에 고정된다. 퀀처 분자는 연장 반응 동안 PTO 단편의 연장 가닥의 3’-말단 부위 내에 삽입되고, 리포터 분자는 IO의 5’-말단에 연결된다. 상기 연장 가닥의 3’-말단에 삽입된 퀀처를 포함하는 연장이합체가 형성되고, 상기 연장이합체가 IO에 혼성화되는 경우, 상기 연장이합체 상의 퀀처 분자 및 상기 IO 상의 리포터 분자는 서로 근접하게 되어, 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도한다.
특정 구현예에서, 리포터 분자는 연장 반응 동안 삽입되고, 퀀처 분자는 IO에 연결된다.
고상에 고정된 IO에 혼성화된 연장이합체로부터 제공되는 타겟 시그널의 검출은 연장이합체의 존재를 결정할 수 있게 한다.
일 구현예에서, 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, hCTO는 상기 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는다.
일 구현예에서, 상기 비-자연 염기는 특정 사이트에 표지를 삽입하기 위하여 사용된다.
상기 IO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 직접적 또는 간접적으로 고정된다. 일 구현예에서, IO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정된다. 구체적으로, IO는 그의 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정된다.
IO는 공유 또는 비공유결합 방식으로 고상 기질의 표면 상에 고정될 수 있다. 고정된 IO가 고상 기질의 표면 상에 간접적으로 고정되는 경우, 적합한 링커가 사용된다. 본 발명에서 유용한 링커는 고상 기질의 표면 상에서의 프로브 고정화에 이용되는 어떠한 링커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 아민 관능성을 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올 관능성을 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 IO 고정화를 위한 링커로 사용될 수 있다. 또한, poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일이 링커로 사용될 수 있다. 상기 링커로서 poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일은 IO의 서열로 고려되지 않는다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 고상 기질은 마이크로어레이이다. 본 발명의 반응 환경을 제공하는 마이크로어레이는 당업자에게 공지된 어떠한 것도 포함할 수 있다. 본 발명의 모든 과정, 즉, 타겟 핵산 서열과의 혼성화, 절단, 연장, 멜팅 및 형광 검출은 마이크로어레이 상에서 실시된다. 마이크로어레이 상에 고정된 IO는 혼성화가능한 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 고상 기질은 딥스틱, 플레이트, 입자(예컨대, 비드), 친화성 컬럼 및 막(membrane)의 형태일 수 있다. 본 발명의 다수의 고정된 IO는, 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 영역 또는 둘 이상의 어드레서블 영역에 고정될 수 있으며, 고상 기질은 2-1,000,000개의 어드레서블 영역을 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사방법과 같은 종래 제작 기술에 의해, 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정된 IO가 제작될 수 있다.
고정된 IO가 물리적으로 분리될 수 있기 때문에, 고상에서 실시하는 본 발명은 한 종류의 표지를 이용하더라도 다수의 타겟 핵산서열을 동시에 검출할 수 있다. 이러한 점에서, 고상에서 본 발명에 의하여 검출되는 타겟 핵산 서열의 수는 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 본 방법은 고상(고상 기질)을 세척(washing)하는 단계를 추가로 포함한다. 고상 기질을 세척하는 것을 실시하지 않는 경우에도, 고상 기질 상에서 시그널이 검출될 수 있다. 예를 들어, 공초점 현미경을 이용하여, 액상에서의 표지들로부터의 시그널에 영향을 받지 않고 고상 기질 상의 시그널만을 검출할 수 있다.
단계 (f): 타겟 시그널의 검출
최종적으로, 연장이합체는 타겟 시그널을 측정함으로써 고상에서 검출되며, 상기 연장이합체의 존재는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
타겟 시그널은 연장이합체가 유지되는 경우에만 제공되므로, 시그널 검출시 연장이합체는 해리되지 않고 이중 가닥 상태를 유지하는 것이 요구된다. 연장이합체는 hCTO의 IO-혼성화 부위를 통하여 IO에 결합되므로, 시그널 검출시 IO와 IO-혼성화 부위 역시 이중 가닥 상태를 유지하는 것이 요구된다.
따라서, 타겟 시그널을 고상에서 검출하는 경우, 연장이합체 및 IO 이합체 모두 이중 가닥 상태인 미리 지정된 온도가 적용된다.
시그널링 시스템의 유형에 따라, 비절단 PTO의 5’-태깅 부위 및 hCTO 간의 혼성화에 의해 비-타겟 시그널이 제공될 수 있다(참고 도 2). 이러한 경우, 비-타겟 시그널은 혼성화 조건을 조절하여 제거할 수 있다.
일 예로서, 상기 연장이합체 및 IO 이합체 모두 이중 가닥 상태를 유지하면서 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물은 실질적으로 해리되는, 미리 지정된 온도에서 시그널이 검출된다.
본 명세서에서 연장이합체의 검출 온도와 관련하여 본 발명에서 사용되는 표현 “비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물이 실질적으로 해리되는 온도”는 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물이 전부 또는 일부 해리되는 온도를 포함한다.
일 구현예에서, 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물이 일부 해리되는 온도에서도 본 발명은 실시될 수 있다. 이러한 경우, 분석되는 시료로부터의 시그널이 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는지 여부를 확인하기 위해 타겟 서열을 포함하지 않는 음성 대조군으로부터의 시그널을 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 타겟 검출을 위한 온도는 연장이합체, IO 이합체 및/또는 비절단 PTO의 5’-태깅 부위 및 hCTO 간의 혼성화물의 Tm 값을 고려하여 결정된다.
일 구현예에서, 연장이합체 및 IO 이합체의 Tm 값은 비절단 PTO의 5’-태깅 부위 및 hCTO 간의 혼성화물의 Tm 값보다 높도록(예컨대, 5℃ 이상, 10℃ 이상, 15℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상 또는 30℃ 이상 높도록) 조절될 수 있다.
일 구현예에서, 미리 지정된 온도는 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물의 Tm 값에서 10℃ 또는 5℃ 뺀 Tm 값보다 높다. 미리 지정된 온도는 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물의 Tm 값보다 높을 수 있다. 미리 지정된 온도는 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물의 Tm 값에서 5℃ 더한 Tm 값보다 높을 수 있다.
연장이합체의 Tm 값은 (i) 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) hCTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 단편의 서열 및/또는 길이와 hCTO의 서열 및/또는 길이에 의해 다양하게 조절될 수 있다. 또한, IO 및 hCTO의 IO-혼성화 부위 간의 혼성화에 의해 형성된 IO 이합체의 Tm 값도 다양하게 조절될 수 있다. 이러한 Tm 값의 조절을 고려하면, 비절단 PTO 및 hCTO의 혼성화물을 해리시키는데 적합한 온도는 용이하게 결정될 수 있다.
프라이머, PTO, hCTO 및 IO는 자연(naturally occurring) dNMPs 및/또는 NMPs를 포함할 수 있다. 택일적으로, 프라이머, PTO, hCTO 및 IO는 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, PCT 출원공개 제WO 92/20702호 참조) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, PCT 출원공개 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호 참조)를 포함할 수 있다. 프라이머, PTO, hCTO 및 IO는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2’-데옥시-베타-D-리보퓨라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 “유니버설 염기(universal base)”는 각각의 자연 DNA/RNA 염기들과 거의 구별 없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
상술한 바와 같이, PTO는 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 이격되어 위치하는 하나의 사이트에서 절단될 수 있다. 상기 절단 사이트는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치할 수 있다. PTO 단편이 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부를 포함하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부와 혼성화되는 hCTO의 사이트는 유니버설 염기, 축퇴성 서열(degenerate sequence) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 하나의 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치하는 사이트에서 절단되는 경우, 상기 뉴클레오타이드와의 혼성화를 위하여 hCTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 만일, PTO가 PTO의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 2개의 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치하는 사이트에서 절단되는 경우, hCTO의 캡처링 부위의 5’-말단은 축퇴성 서열을 포함하고 그의 3’-방향으로 인접한 뉴클레오타이드는 유니버설 염기를 포함하는 것이 유리하다. 이와 같이, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 다양한 사이트에서 PTO의 절단이 일어나는 경우, hCTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 것이 유용하다. 또한, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도하에서, 동일한 5’-태깅 부위를 갖는 PTO들을 복수의 타겟 핵산 서열 스크리닝에 이용하는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상이한 PTO 단편들이 생성될 수 있다. 이러한 경우, 유니버설 염기 및 축퇴성 서열은 hCTO에 유용하게 사용된다. hCTO에 유니버설 염기 및 축퇴성 서열을 이용하는 전략은 복수의 타겟 핵산 서열의 스크리닝을 위해서 한 종류의 hCTO 또는 최소한의 종류의 hCTO를 사용할 수 있게 해준다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(f)의 전부 또는 일부(예컨대, (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(e))를 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다. 이러한 반복은 타겟 핵산 서열 및/또는 타겟 시그널을 증폭할 수 있게 한다.
상기 변성은 가열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법 (예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하는 종래의 기술에 의해 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 변성은 80-105℃의 온도 범위에서 가열하여 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 문헌[Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)]에 개시되어 있다.
특정 구현예에서, 상기 반복 사이클 수는 PTO가 충분히 절단되고 과량의 연장가닥이 생성되도록 조절된다.
일 구현예에 따르면, 단계 (a)-(f)는 하나의 반응 용기 또는 개별 반응 용기에서 실시된다. 예를 들어, 단계 (a)-(b), (c)-(d) 및 (e)-(f)는 서로 다른 반응 용기에서 실시된다.
특정 구현예에서, 단계 (a)-(b) 및 (c)-(f)는 하나의 반응 용기 또는 개별 반응 용기에서 실시된다. 상기 단계 (a)-(b) 및 (c)-(f)는 하나의 반응용기에서도 서로 다른 방식으로 실시될 수 있다. 예를 들어, PTO의 3’-타겟팅 부위 및 타겟 핵산 서열 간의 혼성화가 단편 및 hCTO 간의 혼성화에 대해 불리한 보다 엄격한 조건하에서 일어날 수 있는 경우, 단계 (a)-(b)의 반복은 단계 (c)-(f) 과정의 수반 없이 진행될 수 있고, 단계 (c)-(f)는 단계 (a)-(b)의 완료 후에 진행될 수 있다.
특정 구현예에서, 단계 (a)-(d) 및 (e)-(f)는 서로 다른 두 개의 반응 용기에서 실시된다.
일부 단계의 반복, 반복 내에 변성의 개입, 일부 단계들의 분리 및 검출 시점이 본 발명의 사상 내에서 다양하게 변형될 수 있음이 본 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다.
특정 구현예에서, 반복 사이클 사이에 변성을 포함하는 반복이 업스트림 프라이머를 포함하는 단계 (a)의 반응 혼합물을 이용하여 실시되는 경우, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재하에서, 예컨대, PCR 방법에 의해 실시된다.
특정 구현예에서, 반복 사이클 사이에 변성을 포함하는 반복이 업스트림 프로브를 포함하는 단계 (a)의 반응 혼합물을 이용하여 실시되는 경우, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재하에서 실시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “핵산 시료(nucleic acid sample)”는 핵산 분자를 포함하는 비-생물학적 시료(예컨대, 식품, 물, 공기, 토양 및 폐수) 또는 생물학적 시료를 의미한다. 생물학적 시료는 동물, 식물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스로부터 유래될 수 있다. 생물학적 시료는 생물학적 공급원으로부터의 세포, 조직 또는 유체, 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 우유, 소변, 분변, 안구액, 타액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 충수, 비장 및 편도 조직 추출물일 수 있다.
본 발명은 검출 및/또는 증폭하고자 하는 타겟 핵산 서열이 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가질 것을 요구하지 않으며, 상기 타겟 핵산 서열은 모든 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포함한다. 타겟 핵산 서열은 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다.
mRNA를 출발 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 문헌[Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)]에 개시되어 있다. 역전사를 위해, 랜덤 헥사머, mRNA의 poly A 테일에 혼성화 가능한 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머 또는 타겟 특이적 프라이머가 이용될 수 있다.
타겟 핵산 서열은 모든 자연 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 또한 상기 핵산 분자는 재조합에 의해 생산된 또는 생산될 수 있는 어떠한 핵산 분자 또는 화학적으로 합성된 또는 합성될 수 있는 어떠한 핵산 분자일 수 있다. 따라서, 상기 핵산 서열은 자연에서 발견되거나 또는 발견되지 않을 수 있다. 상기 타겟 핵산 서열은 알려진 또는 알려지지 않은 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 뉴클레오타이드 변이의 검출에 유용하다. 특정 구현예에서, 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 연속적 DNA 세그먼트들 중 특정 위치의 DNA 서열에서의 어떤 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 세그먼트들은 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈 내의 다양한 변이(예컨대, 메틸렌사수소 엽산 환원효소(methylenetetrahydrofolate reductase; MTHFR) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 종양 형성-유발 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 뉴클레오타이드 변이는 핵산 서열의 특정 위치에서의 모든 변이를 포함한다. 즉, 용어 뉴클레오타이드 변이는 핵산 서열의 특정 위치에서의 야생형 및 그의 모든 돌연변이형을 포함한다.
타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위한 본 발명에 있어서, 이용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산 서열은 본 명세서에서 매칭 템플레이트(matching template)로 표현된다. 이용되는 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 비-상보적인 서열을 갖는 경우, 상기 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 타겟 핵산 서열은 본 명세서에서 미스매칭 템플레이트(mismatching template)로 표현된다.
뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이 사이트의 맞은 편에 있도록 디자인될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머의 3’-말단은 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는다. 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는 업스트림 프라이머의 3’-말단은 매칭 템플레이트에 어닐링되고 연장되어 PTO의 절단을 유도한다. 그 결과 형성된 PTO 단편은 hCTO에 혼성화되고, 연장되어 연장이합체를 형성하며, hCTO의 IO-혼성화 부위는 IO에 혼성화되어 고상 기질 상에서 타겟 시그널을 제공한다. 반대로, 업스트림 프라이머의 3’-말단이 미스매칭 템플레이트의 뉴클레오타이드 변이에 미스매치되는 경우, 연장을 위하여 프라이머의 3’-말단의 어닐링이 필수인 조건하에서는 업스트림 프라이머가 미스매칭 템플레이트와 혼성화되는 경우에도 업스트림 프라이머의 3’-말단은 연장되지 않으며, 이에 의해, 연장이합체가 형성되지 않는다.
택일적으로, 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는 PTO의 혼성화에 의존적인 PTO 절단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 조절된 조건하에서, 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는 PTO는 매칭 템플레이트에 혼성화되고 이어 절단된다. 그 결과 형성된 PTO 단편은 hCTO에 혼성화되고 연장되며, IO에 혼성화되어 타겟 시그널을 제공한다. 반면, 조절된 조건하에서, 상기 PTO는 뉴클레오타이드 변이 위치에 비-상보적인 서열을 갖는 미스매칭 템플레이트에는 혼성화되지 않고 절단되지 않는다. 특히, 이러한 경우, PTO의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열은 PTO의 3’-타겟팅 부위의 중간에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 인위적인 미스매치 뉴클레오타이드의 사용은 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 구별 가능성을 향상시킨다.
택일적으로, 본 발명은 특정 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 선택성을 위하여, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치한 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트(nucleotide variation discrimination site)를 갖는 PTO를 사용한다. 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위하여, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 위치하며, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는다.
PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산 서열(즉, 매치 템플레이트)에 혼성화되는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 매치 템플레이트와 이중가닥을 형성하지만, PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산 서열(즉, 미스매치 템플레이트)에 혼성화되는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 미스매치 템플레이트와 이중가닥을 형성하지 않는다.
본 명세서에서 PTO를 언급하면서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이 구별 사이트(nucleotide variation discrimination site)”는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 상에 존재하는, 타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열이다.
일 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 PTO의 3’타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 8 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 6 뉴클레오타이드, 더욱 더 바람직하게는 4 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드 또는 1 뉴클레오타이드 이내로 이격되어 위치한다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단에 위치한다.
프로브의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트 또는 타겟 서열 상의 뉴클레오타이드 변이 사이트에서 언급되는 용어 “사이트(site)”는 본 명세서에서 단일 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 다수의 뉴클레오타이드도 포함하는 의미로 사용된다.
관심있는 뉴클레오타이드 변이에서의 이러한 구별되는 혼성화 패턴은 PTO의 초기 절단 사이트의 차이를 제공하며, 이에 의해 2종의 PTO 단편이 생성되어 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재 여부에 따라 시그널 차이가 발생한다는 것은 주목할 만하다.
상기 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 존재하에서, PTO 및 매칭 템플레이트 간의 혼성화물의 절단에 의해 제1 단편이 생성되고, 관심있는 뉴클레오타이드 변이의 부존재하에서, PTO 및 미스매칭 템플레이트 간의 혼성화물의 절단에 의해 제2 단편이 생성된다. 상기 제2 단편은 상기 제2 단편을 상기 제1 단편과 다르게 하는 추가적인 3’-말단 부위를 포함한다.
단일 뉴클레오타이드 변이의 검출을 위한 일 구현예에서, 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단은 타겟 핵산 서열의 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는다. 상술한 바와 같이, 매칭 템플레이트와 혼성화된 PTO의 절단은 예컨대, 업스트림 프라이머 연장-의존적 절단 유도하에서, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단에 3’-방향으로 바로 근접한 사이트에서 유도될 수 있다. PTO 단편의 3’-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. PTO 단편은, 뉴클레오타이드 변이에 해당하는 서열을 포함하는 캡처링 부위를 갖는 hCTO와 혼성화된 후 연장되어 연장이합체를 형성한다. 상기 연장이합체는 IO에 혼성화되어 타겟 시그널을 제공한다. 만일, 동일한 PTO가 단일 뉴클레오타이드 변이를 제외하고는 매칭 템플레이트와 동일한 서열을 갖는 미스매칭 템플레이트에 혼성화되는 경우, PTO의 절단은 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 3’-방향으로 2개의 뉴클레오타이드만큼 이격된 사이트에서 발생할 수 있다. PTO 단편의 3’-말단은 단일 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드 이외에 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드를 갖는다. 상기 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드에 혼성화된 hCTO의 사이트가 상기 추가적으로 절단된 뉴클레오타이드에 비-상보적인 서열을 갖도록 디자인된 경우, PTO 단편의 3’-말단은 hCTO에 혼성화되지 않으며, 그 결과 조절된 조건하에서 PTO 단편은 연장되지 않는다.
일 구현예에 따르면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 존재하는 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 서열을 갖는 PTO의 절단 사이트는, 매칭 템플레이트 또는 미스매칭 템플레이트와의 혼성화에 따라 상이하며, 이에 의해 상기 어느 하나의 혼성화 반응으로부터 방출되는 PTO 단편은, 예컨대, 그의 3’-말단 일부 또는 그의 3’-말단에서 상이한 서열을 갖는다.
일 구현예에 따르면, PTO 단편의 3’-말단 일부에서의 차이를 고려한 hCTO의 뉴클레오타이드 서열의 선택은 매칭 템플레이트를 미스매칭 템플레이트와 구별할 수 있게 해준다.
일 구현예에 따르면, 각각의 PTO 단편의 생성은 hCTO의 연장 반응에 의해 구별하여 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제2 단편이 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화될 때, 상기 제2 단편이 연장되는 것을 방지하기 위해, 상기 hCTO가 상기 제2 단편의 추가적인 3’-말단 부위와 혼성화되지 않도록 선택된 서열을 상기 hCTO가 갖는다.
상술한 바와 같이, 상기 제1 단편의 연장은 IO와 hCTO-연장이합체의 혼성화에 의해 검출된다.
일 구현예에 따르면, PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 상기 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 1-10 뉴클레오타이드(또는 1-5 뉴클레오타이드) 이내로 이격되어 위치하는 비-염기 쌍 형성 모이어티(moiety)를 포함한다.
PTO가 변이 구별 사이트에 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산 서열에 혼성화될 때, 상기 비-염기 쌍 형성 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하는 것을 방지한다. 비-염기 쌍 형성 모이어티(예컨대, 인위적 미스매치 뉴클레오타이드)의 사용은 뉴클레오타이드 변이에 대한 PTO의 구별 가능성을 향상시킨다.
일 구현예에 따르면, PTO가 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산 서열과 혼성화될 때, 상기 비-염기 쌍 형성 모이어티는 PTO의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 타겟 핵산 서열 간의 이중 가닥의 형성을 억제하지 않는다.
일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 형성 모이어티는 PTO 및 매칭 템플레이트의 혼성화물 상의 초기 절단 사이트와 PTO 및 미스매칭 템플레이트의 혼성화물 상의 초기 절단 사이트 사이의 거리를 확대시킨다.
일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 형성 모이어티 서열의 도입은, 초기 절단 사이트, 특히, PTO 및 미스매칭 템플레이트 간의 혼성화물 상의 초기 절단 사이트를 조절할 수 있게 한다.
일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 형성 모이어티는 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트의 다운스트림에 위치한다.
비-염기 쌍 형성 모이어티는 타겟 핵산 서열 간에 염기 쌍을 형성하지 않는 어떠한 모이어티도 포함한다. 비-염기 쌍 형성 모이어티는 (ⅰ) 인위적인 미스매치 염기, 염기 쌍을 형성할 수 없는 자연/비-자연 염기, 염기 쌍을 형성할 수 없도록 변형된 염기, 또는 유니버설 염기를 포함하는 뉴클레오타이드, (ⅱ) 염기 쌍을 형성할 수 없도록 변형된 비-염기 쌍 형성 뉴클레오타이드, 또는 (ⅲ) 비-염기 쌍 형성 화합물(non-base pairing chemical compound)일 수 있다.
예를 들어, 비-염기 쌍 형성 모이어티는 알킬렌 기, 리보퓨라노실 나프탈렌, 데옥시 리보퓨라노실 나프탈렌, 메타포스페이트, 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결 및 아릴 포스포로아미데이트 연결을 포함한다. 종래 카본 스페이서 또한 비-염기 쌍 형성 모이어티로 이용된다. 비-염기 쌍 형성 모이어티로서의 유니버설 염기는 PTO의 절단 사이트를 조절하는데 유용하다.
데옥시이노신, 1-(2’-데옥시-베타-D-리보퓨라노실)-3-니트로피롤 및 5’-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함하는 염기 쌍은 자연 염기들 간의 결합 세기보다 낮은 결합 세기를 가지므로, 유니버설 염기는 특정 혼성화 조건하에서 비-염기 쌍 형성 모이어티로서 이용될 수 있다.
5’-말단 일부에 도입된 비-염기 쌍 형성 모이어티는 1-10, 1-5 또는 1-2개의 모이어티를 포함한다. 5’-말단 일부 내의 다수의 비-염기 쌍 형성 모이어티는 연속적 또는 불연속적 방식으로 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 비-염기 쌍 형성 모이어티는 2-5개의 연속적인 모이어티를 포함한다.
특정 구현예에서, 비-염기 쌍 형성 모이어티는 비-염기 쌍 형성 화합물이다.
일 구현예에 따르면, PTO의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트 및 비-염기 쌍 형성 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드, 8 뉴클레오타이드, 7 뉴클레오타이드, 6 뉴클레오타이드, 5 뉴클레오타이드, 4 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드 또는 1 뉴클레오타이드 이내로 이격되어 위치한다.
5’-말단에 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 테일 및 5’-말단 부위에 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 모두 포함하는 프로브가, 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트의 뉴클레오타이드에 대한 미스매치 템플레이트에 혼성화되는 경우, 상기 5’-말단 부위는 단일 가닥을 형성할 수 있고, 나머지 부위는 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성할 수 있다. 프로브 디자인 관점에서 이러한 프로브는 PTO와 상이하지만, 상기 프로브가 미스매칭 템플레이트에 혼성화되면, PTO 구조를 갖는 프로브로 간주될 수 있다. 따라서, PTO를 이용하는 본 발명의 분석 방법에 의해 시그널이 발생될 수 있다. 상기 응용은 프로브의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 비-상보적인 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산 서열을 검출하는데 유용할 수 있다.
증폭 블록커(amplification blocker)를 이용한 선택적 증폭(preferential amplification) 방법과 함께 PCE-hCTO 분석은 효율적으로 소량의 뉴클레오타이드 변이를 검출할 수 있다.
보통 임상 시료는 다량의 야생형 대립 유전자(wild-type allele) 및 소량의 돌연변이 대립 유전자(mutant allele)를 포함한다. 증폭 단계에서, 다량의 야생형 대립 유전자의 증폭은 대부분의 증폭 시약을 소모할 가능성이 높고, 따라서, 돌연변이 대립 유전자는 증폭되지 않아 시그널 발생이 저해된다. 이러한 문제를 극복하기 위하여, 야생형 대립 유전자의 증폭은 방지하면서 돌연변이 대립 유전자를 선택적으로 증폭하기 위한 방법들이 제시되었다.
대표적으로, 증폭 블록커로서 PNA 또는 LNA를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 방법이 보고되었다(US 2004/0014105, US 7,803,543, US 8,206,929, H. Orum., Nucleic Acids Research 21:5332-5336(1993) A. Senescau 등, Journal of Clinical Microbiology, 3304-3308(2005), Y. Nagai 등, Cancer Res 65:7276-7282(2005), Henrik 등, Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993) 및 Luo 등, Nucleic Acid Research Vol. 34, No 2 e12 (2006)). 상기 방법들은 “클램핑 방법(clamping method)”으로 불린다.
일반적으로, 클램핑을 위한 증폭 블록커는 동일 조건하에서, 오직 증폭 블록커에 완전히 상보적인 서열을 갖는 템플레이트에만 혼성화되며, 단일 미스매치를 갖는 템플레이트에는 혼성화되지 않도록 디자인된다. 프라이머 어닐링 또는 사슬 연장(chain elongation)을 억제하는 증폭 블록커에 혼성화된 템플레이트는 증폭되지 않고 증폭 블록커에 혼성화되지 않은 템플레이트만 증폭된다. PNA 및 LNA와 같은 핵산 유사체는 단일 염기 차이만으로도 상당한 Tm 차이를 나타낸다는 점에서, 증폭 블록커로서 유용하다.
사용되는 중합효소가 뉴클레아제 활성을 갖는 경우, 증폭 블록커는 상기 뉴클레아제 활성에 대한 내성을 가질 것이 요구된다.
타겟 핵산 서열의 뉴클레오타이드 변이 영역에 서로 상이한 서열을 갖는 두 개의 변이체(variant) 유형이 하나의 시료에 존재하는 경우, 증폭 블록커는 관심있는 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산 서열은 증폭시키고, 다른 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산 서열은 증폭시키지 않음으로써, 보다 효율적인 방식으로 관심있는 타겟 뉴클레오타이드 변이를 검출할 수 있다. 특히, 증폭 블록커의 사용은 다량의 야생형 대립 유전자 및 소량의 돌연변이 대립 유전자를 포함하는 임상 시료로부터 소량의 돌연변이 대립 유전자를 검출하는데 매우 유용하다.
증폭 블록커를 사용하더라도, 야생형 대립 유전자의 증폭이 완전히 방지되지 않을 수 있다. 하지만, 뉴클레오타이드 변이에 대한 뛰어난 구별 가능성을 가진 PTO를 이용하는 PCE-hCTO 분석은 종래 기술에 의해 거의 검출되지 않는 소량의 돌연변이 대립 유전자를 검출할 수 있다.
특정 구현예에서, 프라이머의 다운스트림에 위치하는 증폭 블록커는 프라이머의 연장을 블록킹한다.
특정 구현예에서, 상기 증폭 블록커는 자연(natural) 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 유사체 또는 이들의 조합으로 만들어진 올리고뉴클레오타이드이다.
특정 구현예에서, 상기 증폭 블록커는 5’뉴클레아제 활성에 내성이 있는 백본을 갖는 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드를 포함한다. 5’뉴클레아제 활성에 내성이 있는 백본을 갖는 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드는 본 기술분야의 당업자에게 알려져 있는 어떠한 것도 포함한다. 예를 들어, 상기 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드는 다양한 포스포로티오에이트 연결, 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2’-카보하이드레이트 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 5’뉴클레아제에 내성이 있는 백본을 갖는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로셀레네이트 연결, 2’-O-아미노프로필 변형, 2’-O-알킬 변형, 2’-O-알릴 변형, 2’-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 1-(4’-티오-β-D-리보퓨라노실) 변형을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 증폭 블록커는 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 모포리노(morpholino), 글리콜 핵산(GNA), 트레오스 핵산(TNA), 브릿지 핵산(BNA), N3′-P5′포스포르아미데이트(NP) 올리고머, 좁은 홈 결합물질(minor groove binder)이 연결된 올리고뉴클레오타이드(MGB-linked oligonucleotide), 포스포로티오에이트(PS) 올리고머, C1-C4 알킬포스포네이트 올리고머, 포스포르아미데이트, ß-포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드, α-포스포디에스테르 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 증폭 블록커는 5’ 뉴클레아제 활성에 내성을 가지고, 혼성화에서 그의 Tm 값은 하나의 미스매치에 의해서도 크게 영향을 받는다. 상기 언급된 특성을 갖는 대표적인 예는 PNA 또는 LNA를 포함하는 증폭 블록커이다.
상기 증폭 블록커는 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 증폭 블록커는 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이이다.
특정 구현예에서, 상기 증폭 블록커는 그의 연장이 방지되도록 그의 3'-말단이 블록킹된다.
타겟 핵산 서열 상의 뉴클레오타이드 변이 영역의 맞은 편에 위치하는 증폭 블록커의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는, 상기 증폭 블록커가 비-타겟 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산 서열의 증폭은 억제하지만 타겟 뉴클레오타이드 변이를 갖는 타겟 핵산 서열의 증폭은 억제하지 않는 한, 증폭 블록커의 어느 사이트에도 위치할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 증폭 블록커의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 비-타겟 뉴클레오타이드 변이에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 증폭 블록커의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 그의 5’-말단 부위, 중간 부위 또는 3’-말단 부위에 위치할 수 있다.
상기 증폭 블록커는 증폭 블록커의 업스트림에 위치하는 프라이머로부터 200 뉴클레오타이드 초과, 100 뉴클레오타이드 초과, 50 뉴클레오타이드 초과, 30 뉴클레오타이드 초과, 20 뉴클레오타이드 초과, 10 뉴클레오타이드 초과, 5 뉴클레오타이드 초과, 2 뉴클레오타이드 초과, 또는 1 뉴클레오타이드 초과로 이격될 수 있다. 상기 증폭 블록커는 상기 프라이머에 바로 인접할 수 있다.
증폭 블록커와 함께 PCE-hCTO 분석을 뉴클레오타이드 변이를 검출하기 위하여 이용하는 경우, PTO 및 증폭 블록커는 타겟 핵산 서열의 이중 가닥 중 동일 가닥 또는 서로 다른 가닥에 위치하도록 디자인될 수 있다. 동일 가닥에 위치하도록 디자인되는 경우, 타겟 핵산 서열과의 혼성화에서 PTO 및 증폭 블록커는 상호 간에 영향을 줄 수 있으며, 반응 조건 또는 서열의 조절이 요구될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 타겟 핵산 서열은 증폭 프라이머에 의해 전-증폭된(pre-amplified) 핵산 서열이다.
본 발명의 이점은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 동시에 (멀티플렉스) 검출한다는 점에서 더욱 부각될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 실시되고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 hCTO는 최소 2종의 hCTO를 포함하고, 상기 IO는 최소 2종의 IO를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 PTO에 대한 최소 2종의 다운스트림 프라이머를 이용하여 실시된다.
본 발명에 의하여 검출될 수 있는 타겟 핵산 서열은 다양한 핵산 서열, 예컨대, 지놈 내 서열, 인위적으로 분리되거나 단편화된 서열 및 합성 서열(예를 들어, cDNA 서열 및 바코드 서열)을 포함한다. 예를 들어, 타겟 핵산 서열은 Immuno-PCR(IPCR)을 위한 핵산 마커 서열을 포함한다. IPCR은 PCR과 함께 핵산 마커 서열 및 항체 간의 콘쥬게이트를 사용하며, 이는 단백질을 포함한 다양한 종류의 타겟들을 검출하는데 폭넓게 적용된다(참조 Sano 등, Science 258 pp:120-122(1992), 미국 특허 제5,665,539호, Niemeyer 등, Trends in Biotechnology 23 pp:208-216(2005), 미국 출원 공개 제2005/0239108호 및 Ye 등, Journal of Environmental Science 22 pp:796-800(2010)). 본 발명의 타겟 핵산 분자는 IPCR 방법에서 사용되는 핵산 마커를 포함하고, 본 발명은 IPCR 방법에서 핵산 마커를 검출하는데 적용될 수 있다.
Ⅱ. 타겟 핵산 서열의 증폭을 포함하는 일 구현예
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 고상에서 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 각각은 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며; 상기 PTO는 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 사이에 위치하며; 상기 PTO는 그의 연장이 방지되도록 그의 3’-말단이 블록킹되어 있고;
(b) 상기 프라이머의 연장 및 상기 PTO의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO가 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되면, 상기 업스트림 프라이머는 연장되고 상기 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편을 혼성화-캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(hybridizing-Capturing and Templating Oligonucleotide; hCTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 hCTO는 (i) 3’→5’방향으로 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 CTO 및 (ii) 고상 기질 상에 고정된 고정화 올리고뉴클레오타이드(immobilized oligonucleotide; IO)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 상기 CTO의 3’- 또는 5’-말단에 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장이합체를 형성하며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 hCTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 hCTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위는 단일 가닥 상태를 유지하며;
(e) 상기 단일 가닥 상태인 hCTO의 IO-혼성화 부위를 상기 IO와 혼성화시키는 단계로서; 상기 고상 기질 상에 고정된 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위와 혼성화하여 IO 이합체를 형성하고; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 상기 단편에 연결된 표지 또는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 IO에 연결된 표지에 의해 타겟 시그널을 제공하며; 및
(f) 상기 연장이합체 및 상기 IO 이합체 모두가 이중 가닥 상태를 유지하는 지정된 온도에서 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 고상 기질 상에서 상기 연장이합체를 검출하는 단계로서; 상기 연장이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
증폭 반응이 수반된 PCE-hCTO 분석의 구현예는 상기 단계 (a)에서 프라이머 쌍을 이용하는 것을 제외하고는, 상술한 PCE-hCTO 분석을 따르므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 단계 (a)-(f)의 전부 또는 일부(예컨대, 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(e))를 최소 2번 이상 반복하는 것을 추가적으로 포함한다. 상기 반응의 반복은 최소 5, 10, 20 또는 30회 이상이며, 최대 70, 60, 50 또는 40회 이하이다.
Ⅲ. 업스트림 올리고뉴클레오타이드 -독립적 5’뉴클레아제 활성에 기초한 PCE - hCTO 분석
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산서열을 고상에서 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산서열에 혼성화되지 않으며;
(b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO는 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 PTO는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 절단되며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하며;
(c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편을 혼성화-캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(hybridizing-Capturing and Templating Oligonucleotide; hCTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 hCTO는 (i) 3’→5’방향으로 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 CTO 및 (ii) 고상 기질 상에 고정된 고정화 올리고뉴클레오타이드(immobilized oligonucleotide; IO)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 상기 CTO의 3’- 또는 5’-말단에 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장이합체를 형성하며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 hCTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 hCTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위는 단일 가닥 상태를 유지하며;
(e) 상기 단일 가닥 상태인 hCTO의 IO-혼성화 부위를 상기 IO와 혼성화시키는 단계로서; 상기 고상 기질 상에 고정된 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위와 혼성화하여 IO 이합체를 형성하고; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 상기 단편에 연결된 표지 또는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 IO에 연결된 표지에 의해 타겟 시그널을 제공하며; 및
(f) 상기 연장이합체 및 상기 IO 이합체 모두가 이중 가닥 상태를 유지하는 지정된 온도에서 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 고상 기질 상에서 상기 연장이합체를 검출하는 단계로서; 상기 연장이합체의 존재는 상기 타겟 핵산서열의 존재를 나타낸다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성에 기초로 하는 본 방법은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 이용하지 않는 것을 제외하고는, 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 PCE-hCTO 분석에 의한 방법과 동일하므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
흥미롭게도, 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 기초로 하는 본 방법은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 사용하지 않고도 PCE-hCTO 분석에 의해 타겟 시그널을 실제로 제공한다.
본 방법을 위하여, 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 종래의 효소가 이용될 수 있다. 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소들 중에서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 몇몇 효소들이 있으며, 예컨대 Taq DNA 중합효소가 있다.
타겟 핵산 서열의 증폭 및 PTO의 절단 효율을 고려하면, 본 발명의 PCE-hCTO 분석은 바람직하게는 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 실시된다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 단계 (a)-(f)의 전부 또는 일부(예컨대, 단계 (a)-(b), (a)-(d) 또는 (a)-(e))를 최소 2번 이상 반복하는 것을 추가적으로 포함한다. 상기 반응의 반복은 최소 5, 10, 20 또는 30회 이상이며, 최대 70, 60, 50 또는 40회 이하이다.
Ⅳ. 타겟 검출용 키트
본 발명의 추가적인 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 고상에서 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드;
(b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
(c) 혼성화-캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(hybridizing-Capturing and Templating Oligonucleotide; hCTO); 상기 hCTO는 (i) 3’→5’방향으로 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 CTO 및 (ii) 고상 기질 상에 고정된 고정화 올리고뉴클레오타이드 (immobilized oligonucleotide; IO)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 상기 CTO의 3’- 또는 5’-말단에 포함하며; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장이합체를 형성하며; 및
(d) 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 고상 기질 상에 고정된 IO; 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위와 혼성화되어 IO 이합체를 형성한다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위해 제작되므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
특정 구현예에서, IO-혼성화 부위가 CTO의 5’-말단에 위치하는 경우, 상기 hCTO는 CTO와 IO-혼성화 부위 사이에 상기 단편의 연장 반응을 방지하는 블록커 부위를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 키트는 5’-뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 키트는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 키트는 5’-뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 단편 및/또는 상기 hCTO는 최소 하나의 표지를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 표지는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지이다.
일 구현예에서, 상기 키트는 연장 반응 동안 연장이합체 내에 삽입되는 표지를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 키트는 연장 반응 동안 연장이합체 내에 삽입되는 표지를 추가적으로 포함하고, 상기 단편 및/또는 상기 hCTO는 최소 하나의 표지를 갖는다.
일 구현예에서, 상기 단편은 표지를 갖거나 또는 상기 키트는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입되는 표지를 추가적으로 포함하고, 상기 IO는 표지를 갖는다.
일 구현예에서, 상기 PTO, hCTO 및/또는 IO는 그의 연장이 방지되도록 3’-말단이 블록킹된다.
일 구현예에서, 상기 키트는 최소 2종의 타겟 핵산서열을 검출하기 위하여 이용되며, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 hCTO는 최소 2종의 hCTO를 포함하고, 상기 IO는 최소 2종의 IO를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 IO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정된다.
상술한 본 발명의 모든 키트는 버퍼, DNA 중합효소 보조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약들을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은 본 개시사항의 이점을 알고 있는 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 별도의 포장 또는 구획 내에 전술한 구성성분들을 포함하도록 채택된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 먼저 PTO를 타겟 핵산 서열과 혼성화시키고, 인위적으로 선택한 서열을 갖는 hCTO를 템플레이트로 사용함으로써 타겟-의존적인 방식으로 연장이합체를 형성시키고, 마지막으로 상기 연장가닥을 고상에 고정된 IO와 혼성화시킨다. 즉, 본 발명은 PTO 혼성화 및 절단, hCTO 혼성화 및 연장 및 IO 혼성화를 포함하는 일련의 반응을 이용하여, 본 발명의 특이성을 매우 향상시킨다.
(b) 고상은 제한된 반응 환경을 제공할 수 있기 때문에, 고상 기질 상에 고정된 올리고뉴클레오타이드 상에서 연장 반응을 실시하는 종래 접근법은 효율적으로 반응 결과물을 생성하지 못할 수 있다.
본 발명에 따르면, 연장이합체는 타겟-의존적 방식으로 액상에서 생성되고, 이어 그의 존재가 고상에서 검출된다. hCTO는 고상에 고정되어 있지 않기 때문에, 상기 연장이합체는 액상에서 보다 효율적으로 형성된다.
(c) 연장이합체의 존재 또는 부존재는 연장이합체 및 고상에 고정된 IO 간의 혼성화를 이용하여 고상에서 검출된다. 따라서, 본 발명은 단일 유형의 시그널링 시스템을 이용하더라도 복수의 타겟 핵산 서열을 동시에 검출할 수 있다.
(d) 연장이합체의 어느 한 가닥에 상보적인 서열을 포함하는 IO를 이용하는 경우, IO 및 연장이합체 간의 혼성화는 상기 연장이합체의 다른 가닥의 존재에 의해 방해될 수 있다. 본 발명의 방법은 연장이합체에서 단일 가닥 부위를 가질 수 있는 hCTO를 이용함으로써 이러한 문제점을 완전히 극복하여, 보다 효율적으로 IO 및 연장이합체 간의 혼성화를 가능하게 한다.
(e) 본 발명에서, 연장이합체와 IO와의 혼성화 또는 오직 hCTO와 IO와의 혼성화는, 고상에 제공되는 시그널의 생성, 소멸 또는 변화(감소 또는 증가)를 측정함으로써 결정된다. 상기 시그널은 단편, hCTO 또는 IO에 연결된 표지 및/또는 연장-의존적 삽입 표지에 의해 제공될 수 있다.
(f) 본 발명은 (i) 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) hCTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 단편의 서열 및/또는 길이와 hCTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능한 미리 지정된 Tm 값을 갖는 타겟-의존적 연장이합체를 제공한다. 또한, IO 및 hCTO의 IO-혼성화 부위 간의 혼성화에 의해 형성된 IO 이합체의 Tm 값은 다양하게 조절될 수 있다.
(g) PTO의 5’-태깅 부위의 서열, hCTO의 서열 및 IO의 서열이 타겟 핵산 서열을 고려하지 않고 선택될 수 있다는 것은 주목할 만하다. 이는 PTO의 5’-태킹 부위, hCTO 및 IO를 위한 서열 풀(pool)을 미리-디자인하는 것을 가능하게 한다. PTO의 3’-타겟팅 부위는 반드시 타겟 핵산 서열을 고려하여 준비되어야 하지만, hCTO 및 IO는 타겟 핵산 서열에 대한 고려나 지식 없이 미리-제작된 방식으로 준비될 수 있다.
도 1a - 도1b는 PCE-hCTO 분석에서 이용되는 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO), 혼성화-캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing-Capturing and Templating Oligonucleotide; hCTO) 및 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilized Oligonucleotide; IO)의 도식적인 구조를 보여준다. 특히, PTO, hCTO 및 IO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블로킹된다.
도 2는 PTO의 5’-말단에 연결된 단일 표지를 이용하는 PCE-hCTO 분석의 일 구현예를 도식적으로 보여준다. IO-혼성화 부위는 hCTO의 5’-말단 부위에 위치한다. 고상 기질 상에 그의 3’-말단을 통해 고정된 IO는 hCTO의 IO-혼성화 부위에 상보적인 서열을 포함한다.
도 3은 그의 템플레이팅 부위에 iso-dC 잔기를 갖는 hCTO 및 리포터-iso dGTP를 이용하여, 연장 반응 동안 연장이합체 내에 삽입되는 표지를 이용하는 PCE-hCTO 분석의 일 구현예를 도식적으로 보여준다. IO-혼성화 부위는 hCTO의 5’-말단 부위에 위치하고, 고상 기질 상에 그의 3’-말단을 통해 고정된 IO는 IO-혼성화 부위에 상보적인 서열을 포함한다.
도 4는 Neisseria gonorrhoeae 지놈 DNA의 존재를 분석하기 위한, 그의 5’-말단 부위에 IO-혼성화 부위를 갖는 hCTO를 이용하는 PCE-hCTO 분석의 검출 결과를 나타낸다.
실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: 5’-말단 부위에 IO-혼성화 부위를 갖는 hCTO를 이용하는 PCE-hCTO 분석의 평가
본 발명자들은 마이크로어레이 상에서 단일 표지된 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO), 혼성화 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Hybridizing Capturing and Templating Oligonucleotide; hCTO) 및 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilized Oligonucleotide; IO)를 이용한 PCE-hCTO 분석이 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는지 실험하였다.
업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. Neisseria gonorrhoeae (NG)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로 사용하였다.
그의 5’-말단에 형광 분자(Quasar570)를 갖는 PTO는 그의 3’-말단이 카본 스페이서로 블록킹되어 있다. 그의 5’-말단 부위에 IO-혼성화 부위를 갖는 hCTO는 그의 3’-말단 및 IO-혼성화 부위와 템플레이팅 부위 사이에 모두 블록커를 갖는다. IO는 링커 암(linker arm)으로서 폴리 (T)10을 가지며, 이를 그의 3’-말단의 아미노기(AminoC7)를 이용하여 유리 슬라이드의 표면 상에 고정하였다. 그의 5’-말단에 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는 마커 프로브를 그의 3’-말단의 아미노기(AminoC7)를 이용하여 유리 슬라이드의 표면 상에 고정하였다.
본 실시예에서, 만약 NG가 존재하는 경우, NG에 특이적으로 혼성화된 PTO는 절단되고 형광 리포터가 표지된 PTO 단편이 생성된다. 상기 PTO 단편은 hCTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, IO-혼성화 부위와 템플레이팅 부위 사이에 위치하는 블록커의 맞은편 위치 전까지 상기 hCTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어, 단일-가닥 IO-혼성화 부위를 갖는 형광 리포터가 표지된 hCTO-연장이합체를 형성한다. 상기 hCTO-연장이합체는 마이크로어레이 상에서 그의 단일-가닥 IO-혼성화 부위를 이용하여 IO에 혼성화되어, 스팟 상에서 형광 시그널을 생성한다. 그러나, 만약 NG가 존재하지 않는 경우, hCTO는 형광 리포터가 표지된 hCTO-연장이합체를 형성하지 않고, 마이크로어레이 상에서 hCTO가 IO에 혼성화되는 경우에도, 스팟 상에서 hCTO는 형광 시그널을 생성하지 않는다.
따라서, 스팟 상에서 형광 시그널의 존재 또는 부존재의 평가는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정할 수 있다. PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장, IO에 hCTO-연장이합체의 혼성화를 마이크로어레이 상에서 동시에 수행하였다. 반응 이후, IO를 갖는 형광 리포터가 표지된 hCTO 이합체의 존재 또는 부존재를 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, hCTO, IO 및 마커의 서열은 다음과 같다:
NG_F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(서열번호: 1)
NG_R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(서열번호: 2)
PTO 5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’(서열번호: 3)
hCTO-1 5’-TCCTGCTCGTCCTCGTGCTCTTAGGT[Spacer 18]AGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[C3 spacer]-3’(서열번호: 4)
IO-1 5’-ACCTAAGAGCACGAGGACGAGCAGGATTTTTTTTTT[AminoC7]-3’(서열번호: 5)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3’(서열번호: 6)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO-NV의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
NSB9 NHS 슬라이드(NSBPOSTECH, Korea)를 IO 및 마커 (서열번호: 5 및 6)의 제작에 이용하였다. NSB 스팟팅 버퍼(NSB spotting buffer)에 최종 농도 50 μM이 되도록 용해시킨 IO 및 마커를 PersonalArrayer™16 Microarray Spotter(CapitalBio, China)를 이용하여 NSB9 NHS 슬라이드 상에 프린팅 하였다. 상기 IO 및 마커를 3x1 포맷(triplicate spots)으로 나란히 스팟팅(spotting)하였고, 이렇게 하여 제작된 마이크로어레이를 약 85% 습도로 유지되는 챔버에 하룻밤 인큐베이팅하였다. 그리고 나서, 상기 슬라이드를 2xSSPE(0.3 M 소듐 클로라이드, 0.02 M 소듐 하이드로겐 포스페이트 및 2.0 mM EDTA), pH 7.4 및 7.0 mM SDS를 함유한 버퍼 용액에서 37℃에서 30분 동안 세척하여 비-특이적으로 결합된 IO 및 마커를 제거하고 증류수로 세척하였다. 그 후, 슬라이드 원심분리기를 이용하여 상기 DNA-기능화된(DNA-functionalized) 슬라이드를 건조시키고 사용 전까지 4℃ 암실에서 보관하였다.
NG의 지놈 DNA 100 pg, 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 10 pmole, 다운스트림 프라이머(서열번호: 2) 10 pmole, PTO(서열번호: 3) 5 pmole, hCTO(서열번호: 4) 0.5 pmole 및 2X 마스터 믹스(2.5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 및 2.4 unit의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea) 15 ㎕를 함유한 30 ㎕의 최종 부피로 PCE-hCTO 반응을 실시하였고, IO(서열번호: 5)가 교차결합(cross-linked)된 NSB 유리 슬라이드의 표면 상에 조립된 챔버에 상기 전체 혼합물을 적용하였다. 상기 슬라이드를 열순환기(GenePro B4I, China) 내의 인 시추(in situ) 블록 상에 위치시켰다. PCE-hCTO 반응을 다음과 같이 실시하였다: 95℃에서 15분 변성시키고 95℃에서 30초 및 55℃에서 60초 반응과정을 40 사이클 반복 후, 55℃에서 30분 혼성화시켰다.
상기 반응 이후, 상기 슬라이드를 60℃에서 1분간 증류수로 세척하였다. 본 발명자들은 세척에 의해 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물이 제거되는 온도를 선택하였다. 상기 이미지 획득은 공초점 레이저 스캐너 Axon GenePix4300A(Molecular Device, USA)를 이용하여 5-㎛ 픽셀 해상도로 스캐닝하여 실시하였다. 형광 강도를 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어인 GenePix pro7.0 소프트웨어(Molecular Device, USA)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도를 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값으로 표현하였다. 재현성을 시험하기 위하여, 스팟을 3개씩 스팟팅하였다. 형광 강도는 3개의 스팟의 평균 값으로 나타냈다.
도 4에 나타난 바와 같이, 형광 강도는 타겟이 존재하지 않는 경우와 비교하여 타겟이 존재하는 경우 확실하게 증가하였다. 이러한 결과는 마이크로어레이 상에서 단일-표지 PTO, hCTO 및 IO를 이용하는 PCE-hCTO 분석이 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 보여준다.
실시예 2: 3’-말단 부위에 IO-혼성화 부위를 갖는 hCTO를 이용하는 PCE-hCTO 분석 평가
본 발명자들은 마이크로어레이 상에서 단일 표지된 PTO, 3’-말단에 IO-혼성화 부위를 갖는 hCTO 및 IO를 이용한 PCE-hCTO 분석이 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는지 실험하였다.
업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. Neisseria gonorrhoeae (NG)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로 사용하였다.
그의 5’-말단에 형광 분자(Quasar570)를 갖는 PTO는 그의 3’-말단이 카본 스페이서로 블록킹되어 있다. hCTO 및 IO는 그의 3’-말단에 블록커를 갖는다. IO는 링커 암(linker arm)으로서 폴리 (T)10을 가지며, 이를 그의 5’-말단의 아미노기(AminoC6)를 이용하여 유리 슬라이드의 표면 상에 고정하였다. 그의 5’-말단에 형광 리포터 분자(Quasar570)를 갖는 마커 프로브를 그의 3’-말단의 아미노기(AminoC7)를 이용하여 유리 슬라이드의 표면 상에 고정하였다.
본 실시예에서, 만약 NG가 존재하는 경우, NG에 특이적으로 혼성화된 PTO는 절단되고 형광 리포터가 표지된 PTO 단편이 생성된다. 상기 PTO 단편은 hCTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, 상기 hCTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어, 단일-가닥 IO-혼성화 부위를 갖는 형광 리포터가 표지된 hCTO 이합체를 형성한다. 상기 hCTO 이합체는 마이크로어레이 상에서 단일-가닥 IO-혼성화 부위를 이용하여 IO에 혼성화되어, 스팟 상에서 형광 시그널을 생성한다. 그러나, 만약 NG가 존재하지 않는 경우, hCTO는 형광 리포터가 표지된 hCTO 이합체를 형성하지 않고, 마이크로어레이 상에서 hCTO가 IO에 혼성화하는 경우에도, 스팟 상에서 hCTO는 형광 시그널을 생성하지 않는다.
따라서, 스팟 상에서 형광 시그널의 존재 또는 부존재의 평가는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정할 수 있다. PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장, IO에 hCTO 이합체의 혼성화를 마이크로어레이 상에서 동시에 수행하였다. 반응 이후, IO와 함께 형광 리포터가 표지된 hCTO 이합체의 존재 또는 부존재를 분석하였다.
본 실시예에서 사용한 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, hCTO, IO 및 마커의 서열은 다음과 같다:
NG_F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(서열번호: 1)
NG_R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(서열번호: 2)
PTO 5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3’(서열번호: 3)
hCTO-2 5’-AGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGTTTTTCCTGCTCGTCCTCGTGCTCTTAGGT[C3 spacer]-3’(서열번호: 7)
IO-2 5’-[AminoC6]TTTTTTTTTTACCTAAGAGCACGAGGACGAGCAGGA[C3 spacer]-3’(서열번호: 8)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3’(서열번호: 6)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO-NV의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
NSB9 NHS 슬라이드(NSBPOSTECH, Korea)를 IO 및 마커 (서열번호: 6 및 8)의 제작에 이용하였다. NSB 스팟팅 버퍼(NSB spotting buffer)에 최종 농도 50 μM이 되도록 용해시킨 IO 및 마커를 PersonalArrayer™16 Microarray Spotter(CapitalBio, China)를 이용하여 NSB9 NHS 슬라이드 상에 프린팅하였다. 상기 IO 및 마커를 3x1 포맷으로 나란히 스팟팅하였고, 이렇게 하여 제작된 마이크로어레이를 약 85% 습도로 유지되는 챔버에 하룻밤 인큐베이팅하였다. 그리고 나서, 상기 슬라이드를 2xSSPE(0.3 M 소듐 클로라이드, 0.02 M 소듐 하이드로겐 포스페이트 및 2.0 mM EDTA), pH 7.4 및 7.0 mM SDS를 함유한 버퍼 용액에서 37℃에서 30분 동안 세척하여 비-특이적으로 결합된 IO 및 마커를 제거하고 증류수로 세척하였다. 그 후, 슬라이드 원심분리기를 이용하여 상기 DNA-기능화된(DNA-functionalized) 슬라이드를 건조시키고 사용 전까지 4℃ 암실에서 보관하였다.
NG의 지놈 DNA 100 pg, 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 10 pmole, 다운스트림 프라이머(서열번호: 2) 10 pmole, PTO(서열번호: 3) 5 pmole, hCTO(서열번호: 7) 0.5 pmole 및 2X 마스터 믹스(2.5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 및 2.4 unit의 H-Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea) 15 ㎕를 함유한 30 ㎕의 최종 부피로 PCE-hCTO 반응을 실시하였고, IO(서열번호: 8)가 교차결합(cross-linked)된 NSB 유리 슬라이드의 표면 상에 조립된 챔버에 상기 전체 혼합물을 적용하였다. 상기 슬라이드를 열순환기(GenePro B4I, China) 내의 인 시추(in situ) 블록 상에 위치시켰다. PCE-hCTO 반응을 다음과 같이 실시하였다: 95℃에서 15분 변성시키고 95℃에서 30초 및 55℃에서 60초 반응과정을 40 사이클 반복 후, 55℃에서 30분 혼성화시켰다.
상기 반응 이후, 상기 슬라이드를 60℃에서 1분간 증류수로 세척하였다. 본 발명자들은 세척에 의해 비절단 PTO 및 hCTO 간의 혼성화물이 제거되는 온도를 선택하였다. 상기 이미지 획득은 공초점 레이저 스캐너 Axon GenePix4300A(Molecular Device, USA)를 이용하여 5-㎛ 픽셀 해상도로 스캐닝하여 실시하였다. 형광 강도를 정량적인 마이크로어레이 분석 소프트웨어인 GenePix pro7.0 소프트웨어(Molecular Device, USA)를 이용하여 분석하였다. 형광 강도를 주변 백그라운드를 제거한 후 스팟-중앙값으로 표현하였다. 재현성을 시험하기 위하여, 스팟을 3개씩 스팟팅하였다. 형광 강도는 3개의 스팟의 평균 값으로 나타냈다.
형광 강도는 타겟이 존재하지 않는 경우와 비교하여 타겟이 존재하는 경우 확실하게 증가하였다. 이러한 결과는 마이크로어레이 상에서 단일-표지 PTO, hCTO 및 IO를 이용하는 PCE-hCTO 분석이 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 보여준다.
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였는바, 본 발명의 원리를 따르는 변형 및 수정이 가능함은 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> SEEGENE, INC. <120> DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCE ON SOLID PHASE BY PTO CLEAVAGE AND EXTENSION USING HCTO ASSAY <130> PI160001 <150> KR 10-2013-0124589 <151> 2013-10-18 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 1 tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 2 caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTO <400> 3 acgacggctt ggctgcccct cattggcgtg tttcg 35 <210> 4 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCTO-1 <400> 4 tcctgctcgt cctcgtgctc ttaggtaggg tatccagcgc tcagccaagc cgtcgt 56 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IO-1 <400> 5 acctaagagc acgaggacga gcaggatttt tttttt 36 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Marker <400> 6 atatatatat 10 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCTO-2 <400> 7 agggtatcca gcgctcagcc aagccgtcgt ttttcctgct cgtcctcgtg ctcttaggt 59 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IO-2 <400> 8 tttttttttt acctaagagc acgaggacga gcagga 36

Claims (38)

  1. 다음의 단계를 포함하는 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장 (PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 고상에서 검출하는 방법:
    (a) 상기 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고;
    (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편을 혼성화-캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(hybridizing-Capturing and Templating Oligonucleotide; hCTO)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 hCTO는 (i) 3’→5’방향으로 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 CTO 및 (ii) 고상 기질 상에 고정된 고정화 올리고뉴클레오타이드(immobilized oligonucleotide; IO)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 상기 CTO의 3’- 또는 5’-말단에 포함하며; 상기 IO-혼성화 부위가 상기 CTO의 5’-말단에 위치하는 경우, 상기 hCTO는 상기 CTO와 상기 IO-혼성화 부위 사이에 상기 단편의 연장 반응을 방지하는 블록커 부위를 추가적으로 포함하고; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되며;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장이합체를 형성하며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 hCTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 hCTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위는 단일 가닥 상태를 유지하며;
    (e) 상기 단일 가닥 상태인 hCTO의 IO-혼성화 부위를 상기 IO와 혼성화시키는 단계로서; 상기 고상 기질 상에 고정된 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위와 혼성화하여 IO 이합체를 형성하고; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지와, 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 표지 또는 (ⅳ) 상기 단편에 연결된 표지 또는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지와, 상기 IO에 연결된 표지에 의해 타겟 시그널을 제공하며; 및
    (f) 상기 연장이합체 및 상기 IO 이합체 모두가 이중 가닥 상태를 유지하는 지정된 온도에서 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 고상에서 상기 연장이합체를 검출하는 단계로서; 상기 연장이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 최소 하나의 표지에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 hCTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 상기 단계 (d)에서 상기 단편의 연장은 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 hCTO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 상기 단계 (c)에서 상기 hCTO와 상기 단편의 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하며, 상기 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지를 가지며; 상기 단계 (c)에서 상기 hCTO와 상기 단편의 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하며, 상기 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 단편은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고, 상기 hCTO는 상기 상호작용적 이중 표지 중 다른 하나를 가지며; 상기 단계 (c)에서 상기 hCTO와 상기 단편의 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하며, 상기 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 3 항에 있어서, 상기 hCTO는 단일 표지를 가지며, 상기 단계 (d)에서 상기 단편의 연장은 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 상기 hCTO는 단일 표지를 가지며, 상기 단계 (c)에서 상기 hCTO와 상기 단편의 혼성화는 상기 단일 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하며, 상기 연장이합체는 상기 타겟 시그널을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 3 항에 있어서, 상기 단편은 단일 표지를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 단일 표지에 의해 제공되며; 상기 삽입된 단일 표지는 상기 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 연장 반응 동안 삽입된 상기 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기(non-natural base)를 가지며, 상기 hCTO는 상기 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지와, 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 표지에 의해 제공되고; 상기 삽입된 표지는 상기 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드에 연결되어 있으며; 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지와, 상기 단편 및/또는 상기 hCTO에 연결된 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자의 상호작용적 이중 표지이고; 상기 단계 (d)에서 상기 단편의 연장은 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 연장 반응 동안 삽입된 상기 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, 상기 hCTO는 상기 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 시그널은 상기 단편에 연결된 표지 또는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 및 상기 IO에 연결된 표지에 의해 제공되고; 상기 단편에 연결된 표지 또는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 갖고, 상기 IO는 상기 상호작용적 이중 표지 중 다른 하나를 가지며; 상기 단계 (e)에서 상기 연장이합체와 상기 IO의 혼성화는 상기 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 상기 타겟 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 연장 반응 동안 삽입된 상기 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가지며, 상기 hCTO는 상기 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 PTO, hCTO 및/또는 IO는 그의 연장이 방지되도록 3’-말단이 블록킹되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도할 정도로 상기 PTO에 근접하게 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통해 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(f)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(f)는 하나의 반응 용기 또는 개별 반응 용기에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위하여 실시되며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 hCTO는 최소 2종의 hCTO를 포함하고, 상기 IO는 최소 2종의 IO를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 상기 단계 (b)는 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 다음을 포함하는 hCTO를 이용하는 PTO 절단 및 연장(PTO Cleavage and Extension using hCTO; PCE-hCTO) 분석에 의해 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 타겟 핵산 서열을 고상에서 검출하는 키트:
    (a) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 업스트림 올리고뉴클레오타이드;
    (b) 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO); 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위; 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함하며; 상기 PTO의 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO의 업스트림에 위치하고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고;
    (c) 혼성화-캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(hybridizing-Capturing and Templating Oligonucleotide; hCTO); 상기 hCTO는 (i) 3’→5’방향으로 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하는 CTO 및 (ii) 고상 기질 상에 고정된 고정화 올리고뉴클레오타이드 (immobilized oligonucleotide; IO)에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 IO-혼성화 부위를 상기 CTO의 3’- 또는 5’-말단에 포함하며; 상기 IO-혼성화 부위가 상기 CTO의 5’-말단에 위치하는 경우, 상기 hCTO는 상기 CTO와 상기 IO-혼성화 부위 사이에 상기 단편의 연장 반응을 방지하는 블록커 부위를 추가적으로 포함하고; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화되며; 상기 hCTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 주형-의존적 핵산 중합효소에 의해 연장되어 연장이합체를 형성하고; 및
    (d) 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 고상 기질 상에 고정된 IO; 상기 IO는 상기 hCTO의 IO-혼성화 부위와 혼성화되어 IO 이합체를 형성한다.
  27. 삭제
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 키트는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  29. 제 26 항에 있어서, 상기 키트는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  30. 제 26 항에 있어서, 상기 키트는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  31. 제 26 항에 있어서, 상기 단편 및/또는 상기 hCTO는 최소 하나의 표지를 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 표지는 단일 표지 또는 상호작용적 이중 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
  33. 제 26 항에 있어서, 상기 키트는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입되는 표지를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제 26 항에 있어서, 상기 키트는 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입되는 표지를 추가적으로 포함하고, 상기 단편 및/또는 상기 hCTO는 최소 하나의 표지를 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 제 26 항에 있어서, 상기 단편이 표지를 갖거나 또는 상기 키트가 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입되는 표지를 추가적으로 포함하고, 상기 IO는 표지를 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  36. 제 26 항에 있어서, 상기 PTO, hCTO 및/또는 IO는 그의 연장이 방지되도록 3’-말단이 블록킹되는 것을 특징으로 하는 키트.
  37. 제 26 항에 있어서, 상기 키트는 최소 2종의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위하여 이용되며, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO는 최소 2종의 PTO를 포함하며, 상기 hCTO는 최소 2종의 hCTO를 포함하고, 상기 IO는 최소 2종의 IO를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제 26 항 및 제 28 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 다운스트림 프라이머를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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