JPH06509063A - 診断薬および分析方法における核酸類縁体の使用・用途 - Google Patents

診断薬および分析方法における核酸類縁体の使用・用途

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JPH06509063A JP4510139A JP51013992A JPH06509063A JP H06509063 A JPH06509063 A JP H06509063A JP 4510139 A JP4510139 A JP 4510139A JP 51013992 A JP51013992 A JP 51013992A JP H06509063 A JPH06509063 A JP H06509063A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 但し上式において： Ｘは、０、Ｓ、　Ｓｅ、　ＮＲ’、　ＣＨ，またはＣ（ＣＨｓ）！である；Ｙは 、−重結合、０、ＳまたはＮＲ’である；ｐおよびｑのそれぞれは、１から５ま での整数であり、ｐ＋ｑの和は、１０以下である； ｒおよびＳのそれぞれは、ゼロまたは１から５までの整数であり、ｒ＋８の和は 、ＩＯ以下である： Ｒ’およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシもしくルコキシもしくは アルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ１−アルキル、ヒドロキシ、アルコキ シ、アルキルチオ、アミノおハロゲンから構成される群から選択される；またＲ １およびＲ４のそれぞれは独立して、水素、（Ｃ，−Ｃ，）アルキヒドロキシも しくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ，−Ｃ４）アルキル、 ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノから構成される群から選択 される：Ｂ’　−Ｂ’のそれぞれは、ＮまたはＲ”Ｎ”であり、ここにおいてＲ ３は上記において定義された通りである； ｃ’−ｃ″′のそれぞれは、ＣＲ’　Ｒ’、ＣＨＲ’　ＣＨＲ’またはＣＲ’　 Ｒ’　ＣＨ，であり、ここにおいてＲ６は水素でありまたＲ７は、天然のアルフ ァアミノ酸の側鎖から構成される群から選択され、またはＲ６およびＲ７ハ独立 して、水素、（Ｃ，−Ｃ，）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール 、ヒドロキシ、（Ｃ，−Ｃ，）アルコキシ、（Ｃ，−Ｃｓ）アルキルチオ、Ｎ　 Ｒ”　Ｒ’およびＳＲ’から構成される群から選択されるが、ここにおいてＲ３ およびＲ４は、上記において定義された通り’？’アｌ）、Ｒ６は水素、（ＣＩ −ｃｌｌ）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシもしくはアルキルチオで置換され た（Ｃ，−Ｃ，）アルキルであ′またはＲ＠およびＲ７とは一緒になって、指環 系または異項環系酸する。
Ｄ’　−Ｄ”のそれぞれは、ＣＲ’　Ｒ’、ＣＨ２Ｒ’　ＣＨＲ’またはＣＨＲ ’　Ｃであり、ここにおいてＲ８およびＲ７は、上記において定義され−１−３ ＯＮＲ”−または−３ＯａＮＲ”４って、ナオココニオイテＲｓは、上記におい て定義した通りである；Ｑは、−ＣＯ，Ｈ，−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−５Ｏ，Ｈもし くは一５ｏ！ＮＲ７Ｒ’ｔ　ｆ：　バー　ＣＯ，Ｈもしくは一３Ｏ，Ｈの活性化 誘導体である。またｌは、−ＮＨＲ”　’Ｒ”　”またバーＮＲ”Ｃ（０）　Ｒ ””　ｔ’あり、１．−１＋においてＲｏ、Ｒｏ、Ｒｏ”およびＲ１は独立して 、水素、アルキル、アミノ保護基、リポータリガンド、挿入基、キレート化剤、 ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌクレオチドなら びに可溶および不溶のポリマーである。
３、以下の一般式を有する、請求の範囲第２項において請求されたペプチド核酸 ： なお本式において： Ｌはそれぞれ独立して、水素、フェニル、例えば一つ、二つまたは三つのリング の異項環、天然の核酸塩基および非天然の核酸塩基から成る群から選択される： Ｒ７はそれぞれ独立して、水素および天然のアルファアミノ酸の側鎖から成る群 から選択される； ｎは、１から６０までの整数である； に、ｌおよびｍのそれぞれは独立して、ゼロまたは■から５までの整数である、 好ましくは、ｋとｍとの和は１または２であり、最も好ましくはｌである： Ｒｈは、ＯＨ，ＮＨ，または−Ｎ　ＨＬ　ｙ　ｓ　Ｎ　Ｈｚである；およびＲ１ はＨまたはＣ０ＣＨ，である。
４、以下の一般式を有する、請求の範囲第３項において請求された核酸類縁体： なお本式において。
Ｌはそれぞれ独立して、核酸塩基であるチミン、アデニン、シトシン、グアニン およびウラシルから成る群から選択される；Ｒ７′はそれぞれ、水素である：お よびｎは、１から３０までの整数である。
５、検出可能な標識を導入したまたは検出可能な標識に接合された、請求の範囲 第１項から第４項までの内の何れか一項において請求された核酸類縁体。
６前記標識が、放射性同位元素標識、酵素標識、ビオチン、発蛍光団、化学発光 標識、抗原、抗体またはスピン標識である、請求の範囲第５項において請求され た標識された核酸類縁体。
７、一つまたはそれ以上の化学的または微生物的個体単位についてその捕捉、認 識、検出、同定または定量化を行うために、請求の範囲第１項から第６項までの 内の何れか一項において定義された核酸類縁体を使用すること。
８、核酸を捕捉するに際して、固体支持体に固定化した、請求の範囲第１項から 第６項までの内の何れか一項において請求された核酸類縁体にハイブリッド形成 条件下において前記核酸を接触させることから成る、核酸を捕捉する方法。
９、捕捉された前記核酸が、前記固定化された核酸類縁体に結合された状態にあ る核酸認識薬剤で処理することによって検出され、認識され、定量化されまたは 同定される、請求の範囲第８項において請求された方法。
ｌＯ捕捉された該核酸が、前記固定化された核酸類縁体にハイブリッドされた第 一の領域およびそのようにハイブリッドされて以いない第二の領域であって、該 第二の領域の少なくとも一部にハイブリッドする様に適合せしめられている標識 核酸または核酸類縁体で処理された第二の領域を有しており、かつ前記標識が検 出される、請求の範囲第９項において請求された方法。
１１前記固定化された核酸類縁体が、加水分解してｍＲＮＡのボＩＪ　Ａ尾部を 生じ、その結果前記ｍＲＮＡを捕捉することが可能である逐次リガンドから成る 、請求の範囲第９項において請求された、ｍＲＮＡを捕捉する方法。
１２、ｚｅｎｋｉ逐次リガンドがチミンである、請求の範囲第１１項において請 求された方法。
１３、一旦捕捉された前記核酸が、前記固定化された核酸類縁体と捕捉された核 酸とを脱ハイブリッド化する条件に供することによって該固定化核酸類縁体から 開放・放出される、請求の範囲第８項、１１項また第１２項の内の何れか一項に おいて請求された方法。
１４、固体支持体に固定化された、請求の範囲第１項から第６項までの内の何れ か一項において請求された核酸類縁体。
１５、アフィニティ捕捉カラムに導入された、請求の範囲第１４項において請求 された固定化された核酸類縁体。
１６、ハイブリッド化する条件下においてハイブリッドするに充分に相補的な配 列を有する、請求の範囲第５項または第６項で請求された標識した核酸類縁体に 標的をハイブリッドさせ、かつ前記標的にハイブリッドさせた該核酸類縁体の前 記標識を検出するかまたは定量化することから成る、標的核酸を認識、検出また は定量化する方法。
１７、前記標的核酸が前記ハイブリダイゼーションに先だって支持体に固定化さ れる、請求の範囲第１６項において請求された方法。
１８、前記標的核酸が、前記支持体に固定化されるに際して、その第一の領域を 、捕捉された核酸または核酸類縁体であって、ハイブリッドするに充分に前記第 一の領域に相補的である配列を有しかつそれ自体が前記支持体に固定化されてい る該捕捉核酸または核酸類縁体にハイブリダイゼーションさせ、かつ前記標識さ れた核酸類縁体が前記標的の第二の領域にハイブリッドする、請求の範囲第１７ 項において請求された方法。
１９、核酸二重らせんから一本鎖を置換する方法において、前記二重らせんに対 して、前記核酸のもう一方の鎖に対するアフィニティーが前記一本鎖を置換する ことが可能である程に充分であるような核酸類類縁体をハイブリッドさせること から成る前記置換方法。
２０、二本鎖標的核酸を検出し、同定しまたは定量化する方法において、置換さ れない鎖が置換核酸類縁体に相補的な配列を有する二本鎖標的から一本鎖を置換 することができる置換核酸類縁体を該標的核酸にハイブリッドさせるに際して、 前記置換核酸類縁体の配列が、自らにハイブリッドするに充分に相補的あって、 その結果、一本鎖の形態において前記標的の一本鎖を置換するものであって、か つその後に前記置換された一本鎖を存在を検出するかまたは定量化することから 成る、前記検出、同定または定量化する方法。
２１、置換された鎖をフラグメントに切断しかつ前記フラグメントの存在を特徴 する請求の範囲第２０項において請求された方法。
２２前記置換された鎖がヌクレアーゼの攻撃によって切断される、請求の範囲第 ２１項において請求された方法。
２３請求の範囲５項または第６項ににおいて請求された少なくとも一つの標識さ れた核酸類縁体および前記標識された核酸類縁体を検出する少なくとも一つの検 出試薬とから構成される、診断方法において使用されるキット。
２４請求の範囲第１項から第４項までの内の何れか一項において請求された核酸 類縁体を更に固体支持体に固定化されて成る、請求の範囲第２３項において請求 されたキット。
２５請求の範囲第１項から第４項までの内の何れか一項において請求された固定 化された核酸類縁体と、前記核酸類縁体によって捕捉された核酸の存在を検出す る少なくとも一つの核酸認識薬剤とを組合せて成るキット。
２６前記核酸認識薬剤が、標識された核酸または標識された核酸類縁体である、 請求の範囲第２５項において請求されたキット。
明細書 診断薬および分析方法における核酸類縁体の使用・用途本発明は、診断薬の分野 において、例えば一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位につい てその捕捉、認識、検出、同定または定量化などを行うために幾つかの核酸類縁 体を使用することに関する。
オリゴジオキシリボヌクレオチド（オリゴ−ＤＮＡ類）は、診断薬の手法におい てますます頻繁に用いられおり、例えば、特異的な微生物の確認を行う試験、例 えば疾病など一般的な素因を確認するための試験、法医学分野および微生物学全 般などにおいて用いられている。このような分野におけるオリゴ−ＤＮＡ類の用 途は、当然のことながら、かかるオリゴ−ＤＮＡ類が相補的核酸の塩基配列とバ イブリドを形成することができる能力に依拠している。例として挙げれば、標識 したオリゴ−ＤＮＡプローブは、固定化した標的ＤＮＡ類を探索して特異的な塩 基配列の存在を確認するためのハイブリダイゼーション測定法に用いられている 。増幅操作法においては、オリゴ−ＤＮＡ類の有するこのようなハイブリダイゼ ーション特性を利用して、増幅するべき鋳型分子にオリゴ−ＤＮＡプライマーを ハイブリッドさせでいるのである。
長さが１００塩基対に達するオリゴ−ＤＮＡ類は現在、固体支持体法を用いて合 成されており、完全自動合成装置が幾つか市販されている。しかしながら、これ まで注目が払われてきたのは、塩基配列に特異的に天然ＤＮＡとバイブリド形成 しながら、なおりＮＡそれ自体とは有利に異なる化学的特性を有する能力がある 合成りＮＡ類縁体を構築・構成することが出来るか否かということであった。
このような研究は大半は、”アンチセンス”治療薬にこのような化合物が用いる 可能性があるのではないかという動機の基づいているのであるが、この場合従来 のオリゴ−ＤＮＡ類を使用すると幾つかの困難が伴うのである。その理由は、こ のような非修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼが天然に存在するため生体 内（インビボ）で半減期が短く、また量の多少を問わず製造コストが高くしかも 細胞膜透過性能が劣るからである。
例えば、国際特許出願（ＰＣＴ）　ＷＯ３６１０５１８号において、おそらくは 天然の核酸と塩基配列に特異的にハイブリダイゼーションする能力を有するリガ ンドの、典型的にはヌクレオチド塩基の配列を有する主鎖を持ったＤＮＡ類縁体 が開示されており、また主ず、請求されている化合物のＤＮＡに対する親和性を 示すデータも体から成る診断薬試薬および診断薬システムを特許請求している料 たる種々の構成単位に基づいたオリゴヌクレオチド類縁体が記施例は全くなく、 従ってこのような類縁体の有する性能についてを若干低下させたハイブリッドを 得るために、このような修飾は薬または分析に使用することに関する。
本発明は、一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位についてその 捕捉、認識、検出、同定または定量化を行うために使用する核酸類縁体であって 、かかる類縁体が以下であるも（ＰＮＡ）において、前記リガンドがそれぞれ独 立して天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基または核酸塩基結合基であり、前記リ ガンドは各々前記主鎖の窒素原子に直接または間接に結合せしめられ、かつ前記 リガンドが４つから８つまでの介在する原子によって前記主鎖のなかで相互に分 離された窒素原子を有するものである、性に対する安定性がより高いハイブリッ ドを形成する能力を有す記した間隔においてカウントしない。
但し上式において。
結合基である； Ａ’　−Ａ’のそれぞれは、−重結合、メチレン基または式（Ｉｌａ）まｐおよ びｑのそれぞれは、■から５までの整数であり、ｐ＋ｑのにおいでＲ′、Ｒ”、 Ｒ′”およびＲ１は独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、リポータリガン ド、挿入基、キレート化剤、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイ ド、オリゴヌクレオチドならびに可溶および不溶のポリマーである。または、Ｃ およびＤは、ＣＨＲ’　（ＣＨ２）、ＣＨＲ’−ｃあッテもよいが１．：：、： 　テＳ　ｌｅｔ、ｏから２までであ第１ばよい。
好ましいペプチド核酸は、以下の一般式（ＩＩＩ）を有する：なお本式において Ｉ、はそれぞれ独立して、水素、フェニル、例えば一つ、二つまたは三つのリン グの異項環、天然の核酸塩基および非天然の核酸塩基から成る群から選択される ； Ｒ７はそれぞれ独立して、水素および天然のアルファアミノ酸の側鎖から成る群 から選択される： ｎは、１から６０までの整数である： ｋ、１およびｍのそれぞれは独立して、ゼロまたは１から５までの整数である： 好ましくは、ｋとｍとの和は１または２であり、最も好ましくは１である； Ｒ’は、０Ｈ１Ｎ　Ｈ，または−Ｎ　ＨＬ　ｙ　ｓ　Ｎ　Ｈ，である：およびＲ １はＩ］または（：　ｏ　ＣＨｌである。
特に好ましいのは、式（ＩＩＩ）においてＬが独立して、核酸塩基であるチミン （Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ ）とから成る群から選択され、特にチミンであり、またｎが１から３０　までの 整数であり、特に４から２０までの整数である化合物である。このような化合物 の一例は第１図に示しであるが、この図によれば、かかる化合物と一本鎖ＤＮＡ との間の構造上の類似性が明らかである。
本発明のペプチド核酸類は、溶液中または固相上の何れかで標準ペプチド合成方 法を採用して合成してもよい。用いたこれらのシントンは、特別に設計したモノ マーアミノ酸またはそれらの活性化誘導体であって、標準的な保護基で保護され たものであればよい。このようなオリゴヌクレオチド類縁体はまた、相当する二 酸とジアミンを用いることによって合成することもできる。
即ち、本発明に使用する化合物を得るために用いたモノマーシントンは、以下の 一般式で表されるアミノ酸、二酸およびジアミンから成る群から選択されてもよ い。
（ＩＶ）　（Ｖ）　（Ｖｌ） 本式においてり、　Ａ、　Ｂ、　ＣおよびＤは、上記のいて定義した通りである 。但し、本式におけるアミノ基は全て、アミノ保護基によって保護されていても よい；Ｅは、Ｃ００Ｈ１Ｃ３ＯＨ，５ＯＯＨ。
ＳＯ，ＯＨまたはこれらの活性化された誘導体であればよい；およびＦは、ＮＨ Ｒ”またはＮＰｇＲ’であり、ここにおいてＲ３は上記において定義された通り であり、Ｐｇはアミノ保護基である。
好ましいモノマーシントンは、以下の式（Ｖｌｌ）を有するアミノ酸である： またはアミノ−保護酸および／またはこれらの末端活性化誘導体であるが、ここ においてＬは、水素、フェニル、異項環、天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基お よびこれらの保護された誘導体から成る群から選択される：およびＲ１は独立し て、水素および天然のアルファアミノ酸の側鎖から成る群から選択される。特に 好ましいのは、式（４）においてＲｒが水素でありかつＬは核酸塩基であるチミ ン（Ｔ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（ Ｕ）ならびに来れれあの保護された誘導体から成る群から選択されるシントンで ある。
本発明に従えば、一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位につい てその捕捉、認識、検出、同定または定量化などを行うために上記において定義 された核酸類縁体を使用することが包含される。検出されるかかる固体単位とし ては先ず第一に、核酸でありかつ前記固体単位はハイブリダイゼーションによっ てその特異的な核酸塩基配列を経由して検出されることが、通常は意図される。
前記において定義された核酸類縁体は、固体支持体に固定化された本発明におい て用いられる核酸類縁体にハイブリッド形成条件下で核酸に接触せしめることか ら成る核酸を捕捉する方法において、該固定化核酸類縁体が、補足されるべき前 記核酸または核酸類縁体とハイブリッド形成に適したりガントの配列を有してい る前記核酸捕捉方法に使用してもよい。
該固体支持体は、親和性捕捉に使用する従来公知のオリゴヌクレオチドを固定化 することに関連して公知である種々の形態を取ってもよい。固体支持体は例えば 、プレート、フィルター、マルチウｓ、　／レプレートまたはディツプスティッ クであればよく、またヒーズのような個別の粒子の形状を取ってもよく、かかる 粒子はカラムに保持し、次いで核酸を含有する溶液をこのカラムに流して所望の 種を溶液から捕捉させればよい。
捕捉された核酸は、極めて多くの方法によって認識され、検出され、同定されま たは定量化されることが出来る。洗浄後はかかる捕捉された核酸は系内に残留す る唯一の核酸であり得るので、捕捉された配列に特異的か否かを問わず、核酸の 存在を証明するのＩご適した試薬系であれば如何なるものによっても検出され得 る。即ち、例として挙げれば、捕捉された核酸がＤＮＡでありかつ比較的短いＰ ＮＡによって一本鎖の形態で捕捉された場合、懸垂状態の一重鎖ＤＮＡは、ヌク レアーゼによって消化してもよく、かつこのような消化物は通常の方法に依って 検出すればよい。このＤＮＡが二本鎖でありかつ該ＰＮＡが再び比較的短い場合 は、該ＤＮＡのうち当初の二本鎖の形態で残留している（即ち、ＰＮＡによって 変位・置換されていない）部分は、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重らせんには結合しない通 常のり、ＮＡ挿入基によって検出することが出来る。核酸を認識する抗体を、固 定化した核酸類縁体に結合せしめた核酸（ＲＮＡ、ｄｓＤＮＡまたは５ｓＤＮＡ ）を検出するために使用してもよい。
同体支持体に固定化した通常のオリゴヌクレオチドを用いて核酸種のアフィニテ ィー（親和性）捕捉を行うに際しては、標的核酸を生成することが通常は必要で ある。試料中に含まれてもよいヌクレアーゼは、固定化した核酸を攻撃する傾向 がある。実際においては、非特異性が極めて高い結合を用いると、特定な結合は 殆ど得られない。更には、当該捕捉が生起しないうちに、かかるＤＮＡを一本鎖 にまで編変性ゼることが必要である。
上記式Ｉの核酸類縁体は、ヌクレアーゼの攻撃を受けにクク、典型的には相補的 配列の核酸に対する親和性が高いため、固定化した種として通常のオリゴヌクレ オチドを用いて得た場合よりもより高度の特異的結合を与えるのである。更には 、本発明に従って使用された核酸類縁体は定型的には、相補的配列の核酸とハイ ブリッドを形成する能力を有しているが、かかる核酸を先ず一本鎖に変性せしめ ることはない。一旦標的核酸が捕捉されると、固定化された核酸類縁体および捕 捉された核酸を例えば加熱とジメチルホルムアミドなどのような脱ハイブリダイ ゼーションの条件に供することによって、固定化された核酸類縁体から開放・放 出させればよい。
例として挙げれば、かかる固定化した核酸類縁体は、ｍＲＮＡのポリ八尾部とハ イブリッド形成可能であってかくして当該ｍＲＮＡを捕捉する、例えばチミンな ど連続リガンドから構成されていればよい。
本発明は、上記したような固定化した核酸類縁体から構成される親和性捕捉カラ ムを包含する。
すなわち、本発明はまた、固相生化学（例えば、”５ｏｌｉｄ　−ＰｈａｓｅＢ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ａｎｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ 　Ａｓｐｅｃｔｓ”、Ｗ、Ｈ，５ｃｏｕｔｅｎ編著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆ 　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。
１９８３を参照）、特に固相バイオシステム、特にバイオアッセイまたは種々の 固相技法であって、診断的検出／定量化または相補的核酸の親和性生成に関する もの（例えば、”Ａｆｆｎｉｔｙ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Δ　Ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ″、Ｐ、Ｄ、Ｇ、　ＤｅａｎＳＷ、Ｓ、Ｊｏｈ ｎｓｏｎａｎｄ　Ｆ、Ａ、　Ｍｉｄｄｌｅ編著、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、 、０ｘｆｏｒｄ　１９８６　；　”Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉ ｚａｔｉｏｎ　−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ’ｓＢ、Ｄ、　Ｈ ａｒｎｅｓ　ａｎｄ　Ｓ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ、、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔ ｄ、、０ｘｆｏｒｄ１９８７を参照）に係ることが、理解可能であろう。かかる バイオアッセイまたは精製法を実行する今日的方法は、セルロース、気孔率をコ ントロールしたものを含むガラスピーズ（ＭｉｚｕｔａｎｉＳｅｔａｔ、。Ｊ、 　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、１９８６．３５６．２０２）ビードにした固体支持 体、”５ｅｐｈａｄｅｘ”、”５ｅｐｈａｒｏｓｅ”、アガロース、ポリアクリ ルアミド、多孔性粒状アルミナ、メタアクリル酸ヒドロキシアルキルエステルの ゲル、ジオール結合シリカ、多孔性セラミック、またはナイロンやニトロセルロ ースのフィルターディスクなどの連続材料に物理的に吸着させたかまたは実質的 に永久的な共有結合によるアンカリング結合を介して結合させた”通常の“また は若干修飾したオリゴヌクレオチドを用いるのが殆ど専らである。一つの例にお いて、ｍＲＮＡを含むポリＡテイルを親和性単離するためのセルロースビーズ上 でオリゴ−ｄＴを化学的に合成することを用いている（’Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”におけるＧ１１ｈａｒｌ、Ｌ、　Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ およびに、　Ｍｏｌｄａｖｅ編著、２１巻、ｐａｒｔ　Ｄ、ベージ１９１、Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＳＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎ。
法には、固定化した分子の内のいくつかがハイブリダイゼーションまたは親和性 過程において洗い流され得る（脱着される）という欠点があるからである。すな わち、支持体材料の表面に吸着された種は、支持体が当該バイオアッセイ／精製 方法の過程においめである（Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、 　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、１９８１．２２．１８５９　；　Ｃａ ｒｕｔｈｅｒｓ、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８５．２３２．２８１）。
またこのようなことには、表面／ローディング性能が高い固体支持体に適してい る別のフォスファイトトリエステル法を用いることによって（Ｌｅｔｓｉｎｇｅ ｒ　ａｎｄ　ＭａｈａｄｅｖａｎｌＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、のようなＰ ＮＡ種はまた、大量に固体支持体にロードすることが可塩基を認識する試薬は、 ヒトゲノムにおける独自配列の長さに相当するので、特に興味の対象となる。
このようなハイブリダイゼーション反応を溶液中で行うと、該る能力については 、上記において記載した通りである。本発明は、核酸の二重らせんから一本鎖を 置換する方法において、前記二重ラセンから一本鎖を置換することができる程充 分な、前記二重らせんの内のもう一方の鎖に対する親和性を有する上記において 定義した核酸類縁体を前記二重らせんにハイブリッドさせることから成る前記置 換方法を包含する。
本発明は、前記において定義した置換核酸類縁体に相補的な配列を一方の鎖が有 する二本鎖標的から他の一本鎖を置換する能力がある前記核酸類縁体を二本鎖標 的にハイブリッドさせるに際して、前記置換核酸類縁体が、ハイブリダイゼーシ ョンさせるに完成る、二本鎖標的核酸を検出し、同定しまたは定量化する方法を 包含する。
このように置換された一本鎖を断片に破断し、次いで前記斑だ標識を検出するの に使用する検出試薬を少なくとも一種とを含んン緩衝液として溶液状で提供され る。このようなキットは通常は、る物質、例えばアビジンとの間の抱合体を含有 して成るものであってもよい。
該核酸類縁体を直接的または間接的に酵素で標識化した場合は、該キットは、該 酵素によって仲介されるモニター可能な反応を行うに適している該酵素の基質を 包含して成るものであってもよい。
本発明をさらに詳細に記載し、添付した図面を参照して具体的に説明する。なお 、該図面において： 第１図は、天然のデオキシリボヌクレオチド（Ａ）および本発明のペプチド核酸 （ＰＮＡ）　（Ｂ）を示す。
第２図は、ＤＮＡ認識のための天然および非天然の核酸塩基およびリポータ−基 を示す。
第３図は、以下の概略図を示したものである：すなわち、（ａ）　Ａｃｒ’−（ Ｔａｅｇ）＋ｏ　−Ｌｙｓ　−ＮＨ２（ＡｃｒＴ、、Ｌｙｓ　−ＮＨ，）による 光開裂；Ａｃｒ’　、−（Ｔａｅｇ）ｌｏ　Ｌｙｓ　−ＮＨＩのジアゾ−結合ア クリジンによるフォトフットプリントおよび好ましいＫ　Ｍ　ｎ　０４−開裂； および（Ｃ）Ｓｌ−ヌクレアーゼで増進せしめられた開裂と（ｄ）　Ａｃｒ’　 −（Ｔａｅｇ）＋。
−−１−、ｙ　ｓ　Ｎ　Ｈ２結合部位のミクロコツカスヌクレアーゼによる開裂 。
第４図は、ＰＮＡモノマーシントンのいくつかの例を示す。
第５図は、Ａｃｒ’リガンドおよび一つのＰＮＡであるＡｃｒ’　−（Ｔａｅｇ ）＋。
−Ｉ、ｙｓ−ＮＨｚを示す。
第６図は、モノマーシントンを調製する一般的な概略図である。
第７図は、Ａｃｒ’リガンドを調製する一般的概略図である。
第８図は、線状の美穂ごＰＮＡアミドの調製を図示する固相ＰＮＡ合成の一般的 概略図である。
第９図は、以下の分析ＨＰ　Ｌ　Ｃクロマトグラムを示すものである＝（Δ）Ｈ Ｆ−量刑後の粗製Ｈ［Ｔａｅｇ］＋ｓ　ＮＨｔ　（凍結乾燥前）　；　（Ｂ）Ｈ Ｆ開裂後の粗製Ａｃｒ’−［Ｔａｅｇ］＋ｓ　−ＮＨｚ　（凍結乾燥前）；およ び（Ｃ）精製Ａｃｒ’−［ＴａｅｇＪ、６−　ＮＨ２・緩衝液Ａ、５％ＣＨ，Ｃ Ｎ／９５９６　Ｈ，０１０，０４４５％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ、６０％ＣＨ３ＣＮ／ ４０％ｉ（，０１０，０３９０％ＴＦΔ、直線勾配、３０分でＢが０−１００％ 、流量、１　、２　ｍ　ｌ　、／分：カラム、Ｖｙｄａｃ　Ｃ＋＋＋　（５μｍ 、　０．４６　ｘ　２５ｃｍ）。
第１０図は、以下の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す：すなわち、（Ａ）精製 Ｈ−［ＴａｅｇＪ、、　−Ｌｙｓ−ＮＨ，および（Ｂ）　Ｈ［ＴａＰｇｌｓ−Ｃ ａｅｇ−［ＴａｅｇＪ、　−Ｌｙｓ　−ＮＨ，−第９図におけると同一条件を使 用。
第１１ａ図および第１１ｂ図は、ＡｃｒＴ、、　−ＬｙｓのｄＡ、、・５′−” Ｐで標識したオリゴヌクレオチドへの結合を示す；（１）（５°−ＧＡＴＣＣＡ 、。
Ｇ）をＡｃｒＴ＋。−Ｌｙｓの存在下または不存在下およびオリゴヌクレオチド の存在下または不存在下で培養した。（２）（５’　−ＧＡＴＣＣＡ、。
Ｇ）および試料を”自然の条件”下（第１１ａ図）または”変性条件”下（第１ １ｂ図）でポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびオートラジオ グラフィーによって分析した。
第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ　−ＡｃｒＴｌｏ　−Ｌｙｓ　−ＮＨｚ錯体につ いての化学的、光化学的および酵素的ブロービングを示す。ｄｓＤＮＡ−Ａｃｒ Ｔｌｏ　−Ｌｙｓ　−ＮＨ２とｄ　Ａｇｏ　／　ｄ　Ｔ１ｏ標識配列を含む”Ｐ 　−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティー光開裂（ 第１２ａ図、レーンｌ−３；第１２ｂ図、レーン１−３）、過マンガン酸塩ブロ ービング（第１２ｂ図、レーン４−６）または５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌ クレアーゼによるプロービング（第１２ｂ図、レーン８−１０）もしくはヌクレ アーゼＳｌによるプロービング（第１２ｃ図）によってプローブした。Ａ鎖（第 １２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプローブした。
第１３図は、保護ＰＮＡシントンを合成する手法を示す。
第１４図は、保護アデニンモノマーシントンを合成する手法を示す。
第１５図は、保護グアニンモノマーンントンを合成する手法を示す。
第１６図は、ＰＮＡ主鎖改変のい（つかの例を示す。
第１７図は、通常のアミノ酸に相当する側鎖を有するチミンモノマーシントンを 合成する手法を示す。
第１８ａ図および第１８図すはそれぞれ、チミンモノマーシントンのアミノプロ ピル類縁体およびプロピオニル類縁体を合成する手法を示す。
第１９図は、チミンモノマーシントンのアミノエチル−β−アラニン類縁体を合 成する手法を示す。
第２０図は、Ｐ　Ｎ　Ａ　ｓ　Ｔ＋ｏ、−Ｔ、Ｃおよび一’Ｌ（４が、高い配列 特異性をもって二本鎖ＤＮＡに結合することを実証するＰＡＧＥライオオートグ ラフを示す。
第２１図は、Ａ１゜／Ｔ、。二本鎖ＤＮＡ標的に結合した長さの異なるＰＮＡ類 の熱安定性を示すＰＡＧＥオートラジオグラフのデンシトメーター走査に基づく グラフである。
第２３図は、ＤＮＡにだ対する制限酵素活性が、ＰＮＡを制限酵素認識部位の近 位に結合させた場合抑制されることを実証する電気泳動ゲル染色を示す。
第２４図は、＋２１１１で標識したＰＮＡ　Ｔ＋。が相補的ｄＡ、、オリゴヌク レオヂドに結合することを実証するＰＡＧＥオートラジオグラフを示す。
第２５ａ図から第２５ｃ図は、固定化したＰＮＡとマツチするまたは塩基一つが ミスマツチしたオリゴ−ＤＮＡ類との間で異なる温度において実現される結合の 百分率を示す。
第２６図は、転写された鎖へのＴＩＯによるＲＮＡポリメラーゼ転写抑制を示す オートラジオグラフである。
第２７図は、標識化プラスミドｄｓＤＮＡ類の一つに相補的である固定化された ＤＮＡに捕捉されかつ異なる温度において洗浄された標識化プラスミドｄｓＤＮ Ａ類の混合物のオートラジオグラフである。
第２８図は、ＰＮＡによる鎖置換を用いたプラスミドｄｓＤＮＡの定量を実証す る臭化エチジウムゲルとそのオートラジオグラフとを組合せたものである。
式■で表されるＰＮＡ類およびその製造に用いたモノマーシントンにおいＣ１リ ガンドＬは主として、自然界において見出される位置、すなわちアデニンまたは グアニンについては９位の位置またアミノまたはントシンについては１位の位置 に結合させた天然の核酸塩基である。その代わりに、これらリガンドＬの内のい くつかはそれぞれ、非天然の核酸塩基（核酸塩基類縁体）、他の塩基結合性原子 部、芳香族原子部、（Ｃ＋−Ｃ４）アルカノイル、ヒドロキシまたは水素であっ てもよい。いくつかの典型的な核酸塩基リガンドおよび具体的な合成リガンドは 、第２図に示しである。更には、Ｌは、Ｉ）ＮＡ挿入基、例えば発蛍光団、ラジ オ標識、スピン標識、ハプテンなどのリポータ−リガンド、またはビオチンなど のタンパク質認職リガントであり得る。
モノマー７ノトンにおいては、■７には、保護基を設けていてもよい。このこと は、第４図に図示しであるが、本図においてＰｇｌは、酸、塩基または例えばｔ −ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍ ｏｃ）まｔこは２−ニトロベンジル（２Ｎｂ）などの水素分解性もしくは光化学 的に開裂可能な保護基である。
結合基Δは、例えば−ＣＲ’Ｒ２Ｃ０−１−ＣＲ’Ｒ”Ｃ３，ＣＲ’Ｒ２ＣＳｅ −１−ＣＲ’Ｒ２ＣＮＨＲ’−１−ＣＲ’Ｒ２Ｃ＝　ＣＨや−ＣＲ’Ｒ”Ｃ＝　 Ｃ（ＣＨｓ）ｓ−１−なおＲ１、Ｒ２およびＲ３は上記において定義した通りで あるーなどの種々の基であり得る。Ａは、メチレンカルボニル（−ＣＨ，Ｃｏ　 −’）である。また、Ａは、プロパノイル、ブタノイルまたはペンタノイルなど のより長鎖の原子部またはそれに相当する誘導体であって、その酸素原子がその 他のＸで表される原子で置換されるかまたはその原子鎖がＲ’　Ｒ”で置換され るかＹを含む不均一であるものであってもよい。さらに、Ａは、（Ｃ２Ｃｓ）ア ルキレン鎖、Ｒ’Ｒ”で置換された（Ｃ，−Ｃ，）アルキレン鎖であってもよく 、またはＹを含む不均一なものであってもよい。場合によっては、Ａは単に一重 結合であればよい。
本発明の好ましい形態においては、Ｂは窒素原子であり、かくしてアキラル主鎖 の可能性が生じる。ＢはまたＲ”Ｎ”一本式においてＲ３は上記において定義し た通りである−であってもよい。
本発明の好ましい形態においては、Ｃは−ＣＲ’　Ｒ’−であるが、また二つの 炭素単位、すなわち−ＣＨＲ’　ＣＨＲ’−または−ＣＲ’　ＣＲ’　ＣＨ。
−一本式において、Ｒ６およびＲ７は上記において定義された通りである−であ ってもよい。Ｒ６およびＲ７はまた、例えばピローロリル、フリル、チオニル、 イミダゾリル、ピリジル、ピリミジニル、インドリルなどのヘテロアリール基で あってもよく、または両者は共同して例えば１．２−シクロブタンジイル、１， ２−シクロペンタンジイルまたは１，２−シクロヘキサンディルなどの指環系を 形成してもよい。
本発明の好ましい形態においては、モノマーシントンにおけるＥはＣ０ＯＨまた はその活性化された誘導体であり、またオリゴマーにおけるＧは、−ＣＯＮＨ２ −である。（好ましくは、式Ｉにおける一Ｒ”　Ｎ　ＯＣの方向において）。上 記において定義したように、Ｅはまた、Ｃ３ＯＨ１ＳＯＯＨ，５Ｏ２０Ｈ，また はそれらの活性化された誘導体であってもよく、またこの時オリゴマーにおける Ｇは、−Ｃ３ＮＲ’−１−３ＯＮＲ’−および−８Ｏ，ＮＲ３−とナル。カカル 活性化は、例えば酸無水物または活性エステル誘導体を用いて行えばよく、この 際Ｅで表される基における水素は、成長する主鎖を精製させるために適した解離 する基によって置換されている。
かかる主鎖を形成するアミノ酸は、同じでもまたは異なっていてもよい。本発明 者らは、２−アミノエチルグリシンに基づいたものが本発明の目的に特に適して いることを見出したのである。
場合によっては、何れかの端末（Ｑ、　Ｉ）においてリガンドを結ＤＮＡ挿入基 または例えばリシンまたはポリリシンなどの、静電的たスチレンをパール重合さ せることによって形成させられたものである。架橋密度・程度として１−２％が 通常は用いられ、かかるマトリックスも、本発明に従って固相ＰＮＡ合成に使用 することがａｎｄ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７９、カン酸、たとえばＢｏｃ−アミノアシル−４− （オキシメチル）フェニル酢酸などのＢｏｃ−アミノアシル−４−（オキシメチ ル）アリール−低級アルカノン酸、たとえばＮ　−Ｂｏｃ　−ｐ−グルタロイル ベンゾヒドリルアミンなどのＮ　−Ｂｏｃ　−ｐ−アシルベンゾヒドリルアミン 、たとえばＮ　−Ｂｏａ　−４’−メチル−ｐ−グルタロイルベンゾヒドリルア ミンなどのＮ　−Ｂｏｃ　−４’−低級アルキル−ｐ−アシルベンゾヒドリルア ミン、たとえばＮ　−Ｂｏｃ　−４°−メトキシ４〜ヒドロキシメチルフエノキ シ酢酸が挙げられる。本発明の文脈の範囲内において特に該当するスペーサー基 の一種類は、フェニルアセトアミドメチル（Ｐａｍ）　ハンドル（Ｍｉｔｃｈｅ ｌｌ　ａｎｄ　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ。
離の反応性末端にカップリング・結合させることが出来るかまたはスペーサー形 成試薬と反応させることが出来る。スペーサー形ｄｅｔａｃｈａｂｌｅ）”樹脂 （Ｔａｍら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、１９７９．４９３５および Ｊ、Ａｍ　＞　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９８０．１０２．６１１　；　Ｔａｍ。
Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、１９８５．５０５２９１））であり、この樹脂は、一 つ以上の放出・解離型式が可能であり、かくして合成デザインにおいて一層の柔 軟性をもたらすものである。
Ｎ−保護のための適当な選択束としては、通常は側鎖の保護のためのベンジルに 関連した基と組合せて用いる第三級−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基（Ｃ ａｒｐｉｎｏ、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９５７．７９．４４２７； ＭｃＫａｙら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９５７．７９．４６８６　。
Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９５７．７９．６１８ ０）および１９７２．３７．３４０４）である。尤も、通常の固相ペプチド合成 において公知であるその他の多くの可能性がある。すなわち、種々の（Ｓｉｅｂ ｅｒＳＨｅｌｖ、Ｃｈｅｍ、Ａｃｔａ、、１９６８．５１．６１４）、Ｍｃｂ　 ＣＢｒａｄｙら、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、１９７７．４２．１４３）、Ｂｉｃ 　（Ｋｅｐｍら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ。
１９７５．４６２４）、ｏ−ニドＯフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）　（Ｚｅｒ ｖｅｓのが有用である：（１）温和な酸に対する安定性（カルボキシル基によっ て有意に攻撃されない）　；　（２）温和な酸または核試薬に対する安定性（問 題となるアミン基によって有意に攻撃されない）；（３）アセチル化に対する抵 抗性（活性化されたアミノ基によって有意に攻撃されない）：さらに（４）該保 護基は、重大な副反応を伴うことなく定量的な除去可能性に近いものでなくては ならない；および（５）導入されるアミノ酸の光学的完全さが、好ましくはカッ プリングに際して高度に保存されるべきである。最後に、側鎖保護基の選択は一 般的に、側鎖官能性の保護は繰り返されるアミノ脱保護サイクルの条件に耐える ものでなくてはならないので、アミノ保護基の選択に依存して異なる。ＰＮＡを 化学的に構築する全般的な戦略が、たとえばアミノと側鎖保護基の特異的な酸安 定性に依拠しようとも（たとんば」−記した”Ｂｏｃ−ベンジル”の手法）、ま たは直交的な、すなわち化学選択的な保護スキームを用いようとも（たとえば、 」−記した”Ｆｍｏｃ　−ｔＢｕ”手法の当てはまる）、このことは真実である 。
第一のアミノ酸をカップリングさせた後、固相合成の次ぎの工程は、所望するＰ ＮＡ鎖を系統的に合成することである。このような合成は、繰り返し行う脱保護 ／カップリングサイクルを包含する。たとえばＢｏｃやＦｍｏｃ基などの、最後 にカップリングしたアミノ酸の暫定的な保護基は、たとえばＢｏｃの場合はトリ フルオロ酢酸を用いた酸分解、Ｆｍｏｃの場合はピペリジンを用いた塩基処理な どの適当な処理に依って定量的に除去し、かくしてＮ−末端アミン機能を遊離せ しめるのである。
所望−事前のＮ−保護されたアミノ酸は次いで、最後にカップリングさせたアミ ノ酸のＮ−末端にカップリングさせる。アミノ酸のＣ−末端に最後にカップリン グさせたアミノ酸のＮ−末端をこのようにカップリングさせることは、いくつか の方法で行い得る。たとえば、２．４．５−トリクロロフェニルエステル（Ｐｌ ｅｓｓら、Ｈｅ１ｖ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、１９６３．４６．１６０９）、フタ ルイミドエステル（Ｎｅｆｋｅｎｓら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｃｏ、、１９６ １．８３．１２６３）、ベンタクｏｏフェニルエステル（Ｋｕｐｒｙｓｚｅｗｓ ｋｉ、、Ｒｏｃｚ、Ｃｈｅｍ、、１９６１．３５．５９５）、ペンタフロロフェ ニルエステル（Ｋｏｖａｃｓら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｅ、、　１９６３． ８５．１８３）、ｏ−ニトロフェールエステル（ＢｏｄａｎｚｓｋｙＳＮａｔｕ ｒｅ、　１９５５．１７５．６８５）、イミダゾールニス引ル（Ｌ　ｉら、Ｊ、 Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９７０．９２．７６０８９および３−ヒドロキシ −４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン（Ｄｈｂｔ−ＯＨ）−ｕステル（Ｋ ｏｎｉｇら、Ｃｈｅｍ、Ｂｅｒ、、１９７３．１０３．２０２４および２０３４ ）などの活性エステル誘導体を当初に形成させること、またはたとえば対称無水 物などの無水物を当初に形成させることを含む、いくつかの方法の何れを用いで ある形態の導入アミノ酸にカルボキシル基を付与する事によって結合させること が出来る。その代わりに、導入するアミノ酸のカルボキシル基には直接的に、た とえばジシクロへキシルカルボジイミド（Ｓｅｅｈａｎら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ 、Ｓｏｃ、、１９５５．７７．１０７６）またはその誘導体などの縮合試薬を用 いて最後にカップリングしたアミノ酸のＮ一端末と反応させることが出来る。ベ ンゾトリアゾリルＮ−オキシトリス−ジメチルアミノホスホニウム　へキサフル オロホスフェート（ＢＯＰ）、すなわち“カスドロの試薬″（たとえば、Ｒｉｖ ａｉｌｌｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　１９８０．３６．３４１３）が、第 二級アミノ基を含むＰＮＡ分子を構築する場合勧められる。最後に、最近報告さ れたアミノ酸弗化物（Ｃａｒｐｉｎｏ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９９ ０．１１２．９６５１）　に類似した　活性化ＰＮＡモノマーも、ＰＮＡ合成に おいても使用できる相当な見込みがある。
保護基を含む所望のＰＮＡ鎖を構築した後、次ぎの工程は、通常はＰＮＡ鎖のア ミノ酸部位の脱保護と合成したＰＮＡを固体支持体から開裂させることであろう 。これらのプロセスは、実質的に同時に生起させて、その結果所望の形状で遊離 のＰＮＡ分子を得ることが可能である。その代わりに、これら二つの別々に合成 されたＰＮＡ鎖を縮合させねばならない場合は、合成のスタート時に適当なスペ ーサー基を選択して、かくして所望のＰＮＡ鎮をそれぞれの固体支持体から開裂 させ（両方のペプチド鎖ともなおそれぞれ側鎖保護基を含んでいる）、次いで最 後に、たとえば二つの側鎖保護されたペプチド鎖をカップリングさせた後側鎖保 護基を除去して、かくしてより長いＰＮＡ鎮を形成せしめることによって、この ような反応は可能である。
上記した”Ｂｏｃ−ベンジル“保護スキームにおいて、側鎖の最終的な脱保護お よびＰＮＡ分子の固体支持体からの開放は、たとえば無水ＨＦ　（Ｓａｋａｋｉ ｂａｒａら、Ｂｕｌｌ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｊｐｎ、、１９６５．３８．４９２ １）、トリス（トリフルオロ酢酸）ホウ素（Ｐｒｅｓｓら、Ｈｅ１ｖ。
Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、　１９７３．４６．１６０９）およびトリフルオロメタン スルホン酸やメタンスルホン酸（Ｙａｊｉｍａら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ 、、Ｃｈ　ｅ　ｍ　、　Ｃｏ　ｍ　ｍ　、、１９７４．１０７）などのスルホン 酸類などの強酸を使用することに依って実施されるのがもっとも多い。このよう な通常の強酸（たとえば、無水ＨＦ）による脱保護方法は、極めて反応性の強い カルボカチオンを生成し、それによってＰＮＡ鎖の中における敏感な残基のアル キル化やアシル化が起きる可能性がある。
このような副反応は、アニソール、フェノール、ジメチルサルファイド・やメル カプトエタノールなどのスカベンジャー（捕捉剤）を存在させることによっては 部分的にしか回避出来ないので、従ってザルファイドを用いた酸加水分解的３． ２脱保護法（Ｔａｍら、Ｊ。
Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｅ、、　１９８３．１０５．６４４２およびＪ、Ａｍ、Ｃ ｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９８６．１０８．５２４２）、所謂°°低い”方法は、有 害なカルボカチオンの前駆体を除いて、不活性なスルフオニウム塩を形成させる のであるが、ペプチドやＰＮＡ合成においては単独でまたは”高い”方法と組合 せて頻繁に用いられる。それ程頻繁ではないが、特別の場合には、脱保護するこ とおよび／またはＰＮＡ−固体支持体との結合を最終的に開裂させるために用い られる方法としては、たとえば、塩基接触アルコール分解（Ｂａｒｔｏｎら、Ｊ 、Ａ　ｍ、ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、、１９７３．９５．４５０Ｆ）やアンモニア分解 ならびにヒドラジン分解（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら、Ｃｈｅｍ、Ｉｎｄ、、１９６ ４．１４２３）、水素分解（Ｊｏｎｅｓ、　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔ、ｔ 、、　１９７７．２８５３および５ｅｈｌａｔｔｅｒら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ ｎ　Ｌｅｔｔ、、１９７７．２８６１）および光分解（Ｒｉｃｈ　ａｎｄ　Ｇｕ ｒｗａｒａ、　Ｊ、Ａｍ。
Ｃｈｅｍ、Ｓｃｏ、１９７５．９７．１５７５）などの方法が挙げられる。
最後に、“通常の“ペプチドの化学的合成と異なって、たとえばアミノエチルグ リシル主鎖単位に基づいたＰＮＡ類などのアキラル１’ＮＡ類の段階的鎖構築は 、かかるカップリング反応はラセミ化を伴わないので、Ｎ一端末またはＣ一端末 の何れかから出発することが出来る。
大半の走査は、固相ペプチド合成の合成サイクルにおけるのと同一である（同相 ＰＮＡ合成についても当てはまるように）事実を認識することに基づいて、新規 のマトリックス、すなわちＰＥＰＳが多数のペプチド類の合成を容易にするため に最近導入された（Ｂｅｒｇら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１９８９．１１ １．８０２４および国際特許出願Ｗ０　９０１０２７４９号）。このようなマト リックスは、長鎖のポリスチレン（ＰＳ）グラフト（１０６のオーダーの分子量 ）をぶら下げたポリエチレン（ＰＥ）フィルムから構成される。このフィルムの ［コーディングの能力は、ヒーズマトリックスと同じ程度に高いが、ＰＥＰＳに は、多段合成に同時に適合させる別の柔軟性がある。すなわち、新規な固相ペプ チド合成方法においては、かかるＰＥＰＳフィルムは、不連続の標識されたシー トに加工されるが、それぞれのシートは、個別の分画部として機能する。このよ うな合成サイクルの同一の工程の全てにおいて、これらのシートは、単一の反応 容器の中において一体に保持され、かくして通常の方法による単一ペプチドの合 成と近似した速度で複数のペプチド合成を同時に実施ゼしめることが可能である 。このＰＥＰＳフィルム支持体は、該当する特殊化学に適合せしめられた結合基 またはスペーサー基を含んで成り、複数のＰＮＡ分子の合成において特に有用で 貴重であるはずと推定された。それというのも、四つの”プソイド−ヌクレオチ ド”単位のそれぞれに対して一つずつ、僅かに四つの異なる反応分画部しか通常 は必要とされないので、概念上合成が簡単であるからである。すなわち、ＰＥＰ Ｓフィルム支持体は、平行したかつ実質的に同時の態様でかす多くのＰＮＡ合成 において試験されて、何れも成功している。ＰＥＰＳから得られた製品の収率と 品質は、伝統的なポリスチレンビーズ支持体を使用することによって得られた収 率と品質に比肩し得るものであった。また、たとえば不織フェルト、編みネット 、スティックまたはマイクロウェルプレートなどその他の外観形状のＰＥＰＳポ リマーを用いた実験の意結果では、合成効率に何等の制限もないことが判ってい る。
多数のペプチドを同時に合成するために提案された他の二つの方法もやはり、多 数の異なるＰＮＡ分子を調製製造するために適用され得る。これらの方法の最初 の方法は（Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｏｒｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９８４．８４．３９９８）、アクリル酸グラフ トポリエチレン製ロンドおよび９６個のマイクロリットルウェルのを用いて、成 長するペプチド鎖を固定化しかつ分画化した合成を実施するものである。この方 法は、極めて効率がよいものの、マイクログラムのスケールでのみ適用可能であ るに過ぎない。第二の方法は（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９８５．８２．５１３１）、伝統的に使用されてき たポリマービーズを用いるものである。その他多重ペプチドまたはＰＮＡ合成の ために提案された方法で、本発明の文脈の範囲内に入る方法には、密度の異なる 二つの相異なる支持体を同時に用いる方法（Ｔｒｅｇａｅｒ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”、Ｊ、Ｍｅｉｅｒｈｏｆ ｅｒ編著、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ　Ｓｃｉ、Ｐｕｂｌ、、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、１ ９７２　ｐｐ、１７５−１７８）、マニホルドを介して異なる反応容器を組み合 わせる方法（Ｇｏｒｍａｎ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９８４．１３６ ．３９７）、マルチカラム固相合成法（たとえば、Ｋｒ５ｃｎａｋら、Ｉｎｔ、 Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、、１９８９．３３．２０９およ びＨｏ１ｍ　ａｎｄ　Ｍｅｌｄａｌ、”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ 　２０ｔｈ　ＥｕｒｏｐｅａｎＰｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｍｐｏｄｉｕｍ”、Ｇ、Ｊ ｕｎｇおよびＥ、Ｂａｙｅｒ編著、Ｗａｌｔｅｒｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ　＆　Ｃ ｏ、、Ｂｅｒｌｉｎ、　１９８９　ｐｐ２０８−２１０）およびセルロースベー パーを使用する方法（Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｃｏ１１ｅｃｔ、Ｃｚｅｃｈ。
Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１９８９．５４．１７４６）がある。
従来からある架橋スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーマトリックスおよびＰ ＥＰＳ支持体が目下とのところ固相ＰＮＡ合成の文脈において好ましいのである が、該当し得る固体支持体の例として、これに限定されないリストには以下のも のが含まれる：すなわち（１）既知量のＮ−第三級−ブトキシカルボニル−ベー ターアラニル−Ｎ゛−へキサメチレンジアミンを含むＮ、　Ｎ’−ビサクリロイ ルエチレンジアミンで架橋されたジメチルアクリルアミドのコポリマーを用いた 粒子。いくつかのスペーサー分子は、典型的にはベータアラニル基を介して、次 いでアミノ酸残基によって付加される。また、このベータアラニル含有モノマー は、重合過程においてアクロイルサルコシンモノマーで置換して、樹脂ビーズを 形成するのである。かかる重合を行なったあとで、ビーズにエチレジアミンを反 応させて、共有結合で結合させた官能基として一級アミンを含有する樹脂粒子を 形成する。このポリアクリルアミドを用いた支持体は、相対的にポリスチレンを 用いた支持体よりも親水性が高（、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミ ド、Ｎ−メチルピロリドンなどを含む極性の高い、非水性の溶媒とともに通常は 使用される（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９７５． ９７．６５８４、引ｏｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、１９７９．８．３５１およびＪ、Ｃ ，Ｓ、、ＰｅｒｋｉｎＩ、５３８　（１９８１）を参照）　；　（２）第二の固 体支持体のグループは、たとえば、多孔質のガラスピーズやシリカゲルなどのシ リカ含有粒子を用いるものである。一つの例は、Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓｓｏｃｉａ ｔｅｓｌＦｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡがＰＯＲＡＳＩＬ”なる商標で市 販されているトリクロロ−［３−（−クロロメチル）−フェニル］プロピルンラ ンおよび多孔質のガラスピーズとの反応生成物（Ｐａｒｒａｎｄ　Ｇｒｏｈｍａ ｎｎ、　Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔｅｒｎａｌ、Ｅｄ、、１９７２．１１． ３１４を参照）である。同様に、１，４−ジヒドロキシメチルベンゼンとシリカ とのモノエステル（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓによって”ＢＩＯＰＡ Ｋ’なる商標で販売されている）が、有用であると報告されている（Ｂａｙｅｒ ａｎｄ　ＪｕｎｇｌＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、１９７０．４５０３ ）　；　（３）有用な固体支持体の三番目の種類は、二種の主要成分を含有して いるという意味で複合物と称することが出来る：すなわち、樹脂および使用した 有機合成反応条件に対して実質的にに不活性であるたの材料である。一つの複合 物の例は（Ｓｃｏｔｔら、Ｊ、Ｃｈｒｏｍ、Ｓｃｉ、１９７１．９．５７７を参 照）、疎水性の架橋処理したクロロメチル基を含むスチレンポリマーで被覆した ガラス粒子を用いたものであり、ＨａｍｄｅｎＳＣＴＳＵＳＡのＮｏｒｔｈｇａ ｔｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、によって製造販売されていたもの である。もう一つの複合物の例は、ポリスチレンがグラフトされているフッ素化 エチレンポリマーのコアーを含有するものである（Ｋｅｎｔ　ａｎｄ　Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ、　ｌ５ｒａｅｌＪ、Ｃｈｅｍ、、１９７８．１７．２４３および ｖａｎ　Ｒｒｅｔｓｃｈｏｔｅｎ、’Ｐｅｐｔｒｄｅｓ１９７４”、Ｙ、Ｗｏ１ ｍａｎ編著、Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　ＳｏｎｓＳＮｅｗ　Ｙｏｒｋ。
１９７５、ｐｐ、１１３−１１６を参照”）　；　（４）たとえばコドンシート などのＰＥＰＳ以外の同一種に属する固体支持体（Ｌｅｂｌ　ａｎｄ　Ｅｉｃｈ ｌｅｒ。
Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｒｅｓ、、１９８９．２．２３２）およびヒドロキシプロピル アクリレートでコートされたポリプロピレン膜（Ｄａｎｉｅｌｓら、Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、、１９８９．４３４５）もＰＮＡ合成に適している。
操作が手動または自動であれ、本発明の文脈における固相ＰＮＡ合或は、通常は バッチ法で行われる。しかしながら、このような合成の大半は、支持体をカラム に充填して（Ｂａｙｅｒら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、、１９７０．４ ５０３および５ｃｏｔｔら、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、Ｓｃｉ、、１９７１． ９．５７７）連続フローの型式で同様に実施してもよい。連続フロー固相合成に 関して、硬質のポリ（ジメチルアクリルアミド）−珪藻土（Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈ ｒ）支持体（Ａｔｈｅｒｔｏｎら、Ｊ、Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、Ｃｂｅｍ、Ｃｏｍｍｕ、、１９８１．１１５１）が、特に成功している ように見えるが、もう一つの有用で貴重な方法は、標準的なコポリ（スチレン− １％−ジビニルベンゼン）支持体のために工夫されたものに関するものである（ Ｋｒｃｈｎａｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、１９８７．４４６９ ）。
固相方法は目下のところＰＮＡ合成の文脈において好ましいのであるが、その他 の方法論またはたとえばそれらとこのような固相法との組合せも適用される：す なわち、（１）ペプチドの古典的な溶液相法（たとえば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、 ”Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ’″、Ｓｐ ｒｉｎｇｅｒ　−ＶｅｒｌａｇＳＢｅｒｌｉｎ　−Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｌ　９８４ 　）であって段階的な構築法によるかまたはセグメント／フラグメント縮合法に よるものが、ＰＮＡ化合物の特に大規模な製造（グラム。キログラムまたはトン までも）を考慮する場合に特別に該当する：（２）所謂”液相”戦略であって、 たとえば線状ポリスチレンなどの溶解性ポリマー支持体（Ｓｈｅｍｙａｋｉｎら 、ＴｅｔｒａｈｄｒｏｎＬｅｔｔ、、１９６５．２３２３）やポリエチレングリ コール（ＰＥＧ）　（Ｍｕｔｔｅｒａｎｄ　Ｂａｙｅｒ、Ａｎｇｅｗ、Ｃｈｅｍ 、、Ｉｎｔ、Ｅｄ、Ｅｎｇｌ、、１９７４．１３．８８）を用いるものが有用で ある：（３）種々の分子量の（”ｐｏｌｙ　−ｄｉｓｐｅｒｓｅ”）ペプチドま たはＰＮＡ分子を生成するランダム重合（たとえば、０ｉｄａｎごＰｒ１ｎｃｉ ｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−１ＭｃＧｒａｗ　−Ｈｉｌｌ 、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７０）を参照）抗ウイルス効果のスクリーニングの 目的のために特に該当する；（４）ポリマーに支持されたアミノ酸の活性エステ ル（Ｆｒｉｄｋｉｎら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、１９６５．８７．４６４６）を使用した方法であって、”逆Ｍｅｒｒｉ ｆｉｅｌｄ合成法′または”ポリメリック試薬合成法“とも称される方法には、 中間物の単離および精製ができるという利点があり、従って、中間の大きさの任 意に保護されたＰＮＡ分子で、後刻引き続いてフラグメント縮合してより大きい サイズのＰＮＡ分子に変換することが出来るＰＮＡ　ｂｕｎｓｉを合成するため の特に適した方法を提供し得るものである；（５）ＰＮＡ分子をたとえばプロテ アーゼまたは新規な特異性を有するその誘導体（たとえばタンパク質工学などの 人工的手段によって得られる）を用いて酵素的に構築することが見込まれる。ま た、数多くのＰＮＡフラグメントを縮合して極めて大きなＰＮＡ分子に変えるた めの“ＰＮＡリガーゼを開発することも見込むことが出来る。（６）抗体は、興 味の対象とする実質的に如何なる分子としても生成させることが出来るので、Ｌ ｅｒｎｅｒ　（Ｔｒａｍａｎｔａｎ。
ら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８６．２３４．１５６６）と５ｃｈｕｌｔｚ　（Ｐｏ ｌｌａｃｋら、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８６．２３４．１５７０）　）のグループ によって同時に発見された、最近開発された接触抗体（ａｂｚｙｍｅｓ）も、Ｐ ＮＡ分子を構築するための潜在的な候補として考慮されるべきであろう。すなわ ち、アシル−トランスファー反応を接触・触媒するａｂｚｙｍｅｓを産生させる のに顕著な成功が成されている（たとえば、５ｈｏｋａｔら、Ｎａｔｕｒｅ、１ ９８９．３３８．２６９およびそれに引用されている文献を参照）、ｓａｉｇｏ ｎｉ、対細菌ＳｔｅｗａｒＬのグループ（Ｈａｎら、５ｃｉｅｎｃｅ、］９９０ ．２４８．１５４４）によって開拓された完全に人工的な酵素を、ＰＮＡ合成に 適するように開発することも出来るであろう。一般的に適用可能な酵素、リガー ゼおよび接触抗体など、特異的なカップリング反応を仲介することが可能なもの の設計は、”通常の′ペプチド合成よりもＰＮＡ合成のための方がより容易に実 施されるはずである。その理由は、ＰＮＡ分子は、ペプチドを構成する二十個の 天然の（タンパク質生成性−ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ　−）アミノ酸と比較 して、僅か四つの異なるアミノ酸（四つの天然の塩基のそれぞれの一つに対応す るもの）から構成されている場合が多いからである。結論として、特異的なＰＮ Ａ分子を合成するためには単一の戦略では如何なるものも適合することはなく、 従って時にはい（つかの方法の組合せが最善に機能することがあり得るであろう 。
（ａ）モノマー　１のム これらのモノマーは好ましくは、第８図において概略を示した一般的スキームに よって合成される。この合成は、実施例２１−２３において記載した保ｆＩ／脱 保護方法を用いて（Ｂｏｃアミノエチル）グリシンのメチルまたはエチルエステ ルの何れかの製造を包含して成る。チミンモノマーの合成は、実施例２４−２５ において記載されており、また保護されたシトシンモノマーの合成は実施例２６ において記載されている。
保護されたアデニンモノマーの合成（第１４図）は、臭化酢酸エチルによるアル キル化（実施例２７）およびＸ線結晶学を用いた置換位置の確認−所望とする９ 位−を包含して成るものであった。次いでＮ＠−アミノ基をＮ−エチル−ベンジ ルオキシカルボニルイミダゾール　テトラフルオロ硼酸エステル試薬を用いてベ ンジルオキシカルボニル基で保護した（実施例２８）。このエステル生成物を単 に加水分解すると、Ｎ６−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルア デニンが得られ、これを次ぎに標準方法に用いた（実施例１０−１１、第８図） 。このアデニンモノマーを構築して、二つの異なるＰＮＡ−オリゴマーとした（ 実施例３０および３１）。
保護されたＧ−モノマーの合成を、第１５図において概略を示しである。この出 発物質である２−アミノ−６−クロロプリンを臭化酢酸でアルキル化しく実施例 ３２）、次いでこの塩素原子をペンジルオキシ基で置換した（実施例３６）。得 られた酸を試薬ＰｙＢｒｏｐ“を用いて（Ｂｏｃアミノエチル）グリシンメチル エステル（実施例３６）とカップリングさせ、次いで得られれたエステルを加水 分解した（実施例２３）。この０６−ベンジル基をＰＮＡ−オリゴマーの合成に おいて最終のＨＦ−開裂工程で除去した。開裂は、縮合剤としてジイソプロピル カルボジイミドを用いてＰ−ＮＡ−オリゴマーに組み込んだ場合、最終のｌ）Ｎ Ａ−オリゴマーの予期した量を測定することによって確認した（実施例５２）。
以下に記載する略記号を実験実施例において使用する：ＤＭＦ。
Ｎ５Ｎ−ジメチルホルムアミド、ＤＣＣ，Ｎ５Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイ ミド、ＤＣＵＳＮ、Ｎ−ジシクロヘキシル尿素、ＴＨＦ、テトラヒドロフラン； ａｅｇＳＮ−アセチル（２′−アミノエチル）グリツジ；　ｐｆｐ、ペンタフル オロフェニル；　Ｂｏｃ、第三級−ブトキシカルボニル：Ｚ１ベンジルオキシカ ルボニル、ＮＭＲ，核磁気共鳴。
Ｓ、−重項、ｄ、二重項１ｔ、三重項、ｑ１四重項２ｍ、多重項；ｂ１ブロード 、δ、化学ンフト。
ＮＭＲスペクトルは、テトラメヂルシランを内部標準として用いてＪＥＯＬ　Ｆ Ｘ　９０Ｑ　分光計またはＢ　ｒ　ｕ　ｋ　ｅ　ｒ　２５０　Ｍ　Ｈｚで記録し た。質量分光測定は、ＶＧ　ＦＡＢ源およびプローブを備えたＭａｓｓＬａｂＶ Ｇ　１２−２５０四極子装置で行った。融点は、Ｂｕｃ旧融旧劇点測定装置録し 、補正は行わなかった。Ｎ５Ｎ−ジメチルホルムアミドは、４人モレキュラーシ ーブで乾燥し、蒸留し次いで４人モレキュラー７−ブ上で保存した。ピリジン（ ＨＰＬＣグレード）は、４人モレキュラーシーブ」−で乾燥し、保存した。その 他の溶媒は、入手”Ｔ能な最高級品質のものかまたは使用前に蒸留した。ジオキ サンは、使用前に塩基性アルミナを通した。Ｂｏｃ無水物、４−ニトロフェノー ル、臭化酢酸メチル、塩化ベンジルオキシカルボニル、ペンタフルオロフェノー ル を介して入手した。アミノ、ノドシン、アデニンは全て、Ｓｉｇｍａを介して入 手した。
薄層クロマトグラフィー（Ｔｉｃ）は、以下の溶媒系を用いて行った・（１）ク ロロホルム、トリエチルアミン：メタノール、７：１：２　；　（２）塩化メチ レン・メタノール、９　：　１　；　（３）クロロホルム：メタノール　酢酸８ ５　：　１０　：　５。スポットは、ＵＶ　（２５４ｎｍ）によってまたは／お よび１２０℃において５分間加熱後ニンヒドリン溶液（１００ｍｌの１−ブタノ ールおよび３０ｍｌ酢酸中に３ｇニンヒドリン）を噴霧し次いで噴霧後再度加熱 することによって可視化さゼた。
鎖１Ｊ【レムーＬ鎮 グループＡ，ＣおよびＤ（第１６図）の変化は、モノマー構成単位を合成し、Ｐ ＮＡ−オリゴマーに組み入れることによって証明される。
一つの例において、グループＣはＣＨ（Ｃｌ−Ｉｓ）基である。相応するモノマ ーの合成は、第１７図において概略を示すが、Ｂｏｃ−保護された１−アミノ− ２、３−プロパンジオール（実施例３５）の製造を包含して成り、このものは、 過ヨウ素酸塩で開裂してｂｏｃアミノアセトアルデヒドとし、このものを直接法 の反応に用いる。このｂｏｃアミノアセトアルデヒドを種々のアミンと縮合させ ることが出来る，実施例３６において、アラニンエチルエステルを使用した。実 施例１７　−　１９において、相当するチミンモノマー類を調製した。このよう なモノマーは、ＤＣＣ−カップリングプロトコールによって８＝量体に組み入れ た（実施例３０および３１）。
別の例において、第一グループは（ＣＩ（２）Ｓである。相当するモノマーの合 成は、第１８ａ図において概略を示し、かつ実施例４０および４６において記載 しである。
また別の例において、Ｃグループは、（ＣＨ．）、ＣＯ基である。チミンおよび 保護されたシトシンモノマーの合成は、第１９図および実施例４６から５１にま でにおいて概略を示しである。一つのユニットを包含するＰＮＡ−才リゴマ−を 用いたハイブリダイゼーション実験は、実施例６１に記載しており、これによれ ば、親和性が著しく低下しているが特異性は保持されていることが示される。
夾施胴」 ４−ニトロフェニル′″　：　−ブチルエステル炭酸ナトリウム（２９．１４ｇ 　；　０．２７５ｍｏｌ）および４−ニトロフェノール（１２．７５ｇ　：　９ １．６ｍｏ＋）をジオキサン（２５０ｍｌ）と混合した。Ｂｏｃ−無水物（２０ ．０ｇ　：　９１．６ｍｏｌ）をジオキサン（５０ｍｌ）　ｔとともにこの混合 物に移した。この混合物を１時間還流し、０℃にまで冷却し、ろ過し、１／３に まで濃縮し、次いで０℃において水（３５０ｍｌ）に注いだ。１／２時間攪拌し た後、この生成物を濾取し、水で洗浄し、次いで真空下でｓｉｃａｐｅｎｔ上で 乾燥した。収率、２１。
３ｇ　（９７％）。ｍ．ｐ．７３．０　−　７４．５℃（ｌｉｔｔ．７８．５　 −　７９．５℃）。元素分析、Ｃ．、　Ｈ，、　Ｎ　Ｏ．、実験値（理論値）　 Ｃ　：　５５．２０　（５５．２３）　Ｈ　：５、６１　（５．４８）　Ｎ　： 　５．８２　（５．８５）夾施上」 Ｎ’　−　Ｂｏｃ　−　２’−アミノエチル　グリシン　２）表題化合物をＨｅ ｉｍｅｒらによる方法の変法によって調製した。Ｎ−（２−７ミノエチル）グリ シン（１、３．ＯＯｇ　；　２５．４ｍｏｌ）を水（５０ｍｌ）に溶解し、ジオ キサン（５０ｍｌ）を加え、次いでｐＨを２Ｎ水酸化ナトリウムで１１２に調節 した。第三級−ブチル−４−ニトロフェノール炭酸エステル（７．２９ｇ　；　 ３０．５　ｍｍｏｌ）をジオキサン（４０ｍｌ）に溶解し、２時間かけて滴下し たが、この間においてｐＨは２Ｎ水酸化ナトリウムで１１．２に維持した。ｐＩ Ｉは、３時間以上的的に１１。
２に調節し、次いで溶液を一夜放置した。溶液を０℃にまで冷却し、１）　Ｈを 注意深＜　０．５Ｍ塩酸で３．５に調節した。この水溶液を０．５Ｍクロロホル ム（３　ｘ　２００ｍｌ）で洗浄し、ｐ　Ｈを２Ｎ水酸化ナトリウムで９５に調 節し、この溶液を真空下で（１４ｍｍＨｇ）蒸発転用した。残渣をＤＭＦ　（２ ５　＋２ｘｌＯｍｌ）で抽出し、抽出液をろ過して、過剰の塩を除去した。こう することによって、表題化合物の溶液が収率６０％かつｔｌｃ　（溶媒系１、ニ ンヒドリンで可視化した、Ｒｆ＝０．３）による純度が９５９６以上で得られる 。この溶液をこれ以上精製することなく以後のＢｏｃ−ａｅｇの製造に使用した 。
火施上Ｊ Ｎ二１−カルボキシメチルチミン　４）この方法は、文献奇さの方法とは異なる が、より容易簡単であり、高い収率が得られ、製品中に未反応のチミンが残留し ない。ＤＭＦ（９００ｍｌ）中にチミン（３、４０．０ｇ　；　０．３１７ｍｏ ｌ）および炭酸カリウム（８７．７ｇ　；　０．６３４ｍｍｏｌ）を分散させた 分散液に、臭化酢酸メチルエステル（３０．ＯＯｍｌ　：　０．３１７ｍｍｏｌ ）を加えた。この混合物を窒素雰囲気下で一夜激しく攪拌した。この混合物をろ 過し、真空下で蒸発転用した。固形の残渣を水（３００ｍｌ）および４Ｎ塩酸（ １２ｍｌ）で処理し、０℃において１５分間攪拌し、ろ過し、水（２／７５ｍｌ ）で洗浄した。沈殿物を水（１２０ｍｌ）および２Ｎ水酸化ナトリウム（　６　 ０　ｍ　ｌ　）で処理し、１０分間沸騰させた。この混合物を０℃に冷却し、ろ 過し、次いで純粋の表題化合物を４Ｎ塩酸（７０ｍｌ）を添加Ｖることによって 沈殿さゼた。ｓｉｃａｐｅｎｔ上で真空上乾燥させた後での収率、３７．１ｇ　 （６４％）。’Ｈ−　ＮＭＲ　（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄｓ）：１１、３３　 ｐｐｍ　（ｓ．ＩＨ　、ＮＨ）　；　７．４９　（ｄ，Ｊ　＝　０．９２Ｈｚ， ＩＨ．ＡｒＨ）　；Ｌ３８　（ｓ．２Ｈ，ＣＨ　；　１．７６　（ｄ，Ｊ　＝　 ０．９２Ｈｚ，Ｔ　−　ＣＨ，）。
夾施漕」 Ｎ−１−カルボキシメチルチミン　ペンタフルオロフェニル　エステル（５） Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（４、１０．０ｇ　；　５４．３ｍｍｏｌ）お よびペンタフルオロフェノール（１０．０ｇ　；　５４．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ （１００ｍｌ）中に溶解し、氷水で０℃にまで冷却した。ＤＣＣ　（１３．４５ ｇ　；６５、２ｍｍｏｌ）を次ぎに添加した。温度が５℃以下になったとき、水 浴を取り除き、混合物を常温で３時間攪拌した。沈殿したＤＣＵをろ過して除去 し、ＤＭＦ　（２　ｘ　１０ｍｌ）で二度洗浄した。濾液を合わせてエーテル（ １４００ｍｌ）に注ぎ、０℃にまで冷却した。姓きゅエーテル（１４００ｍｌ） を添加し、混合物を一夜放置した。表題化合物をろ過して単離し、石油エーテル で完全に洗浄した。収率：１４、８ｇ　（７８％）。この製品は、次ぎの反応を 実施する出来るほど純粋であったが、分析用サンプルを２−プロパツールから再 結晶して得た。ｍ．ｐ．２００．５　−　２０６℃。元素分析、Ｃ，ｓ　Ｈｔ　 Ｆ８　Ｎ！　Ｏイ実験値（理論値）　Ｃ：４４．７９　（４４．５９）　Ｈ：２ ．１４　（２．０１）　Ｎ：８．１３　ｃｓ。
００）。ＦＡＢ−ＭＳ　：　４４３　（Ｍ　＋　１＋グリセリン）、３５１　（ Ｍ＋　１）。
Ｈ−ＮＭＲ　（９０ＭＨｚ　；　ＤＭＳＯ　−　ｄｌｌ）　：　１１．５２ｐｐ ｍ　（ｓ，ＩＨ，ＮＨ）　；７、６４　（ｓ，ＬＨ，ＡｒＨ）　；　４．９９　 （ｓ，２Ｈ，ＣＨＸ）　；　１．７６　（ｓ，３Ｈ，Ｃｊｊａ）。
夾１あ」 １−Ｂｏｃ−ｓｅ　チミン　６ ＤＭＦ−溶液に上から、トリエチルアミン（７１０８ｍｌ　；　５０．８ｍｍｏ ｌ）を加え、次いでＮ−１−カルボキシメチルチミン　ペンタフルオロフェニル エステル（５、４．４５ｇ　；　１２．７ｍｍｏｌ）を加えた。生じた溶液は、 １時間攪拌し、０℃に冷却しカチオン交換物質（”Ｄ　ｏ　ｗ　ｅ　ｘ５０ＷＸ −８”、４０ｇ）で２０分間処理した。このカチオン交換物質をろ過して除去し 、ジクロロメタン（２　ｘ　１５ｍｌ）で洗浄し、ジクロロメタン（１５０ｍり を加えた。生じた溶液を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウム上 で乾燥し、真空下で蒸発転用したが、先ず水アスピレータで、次いでオイルポン プで行った。残渣を水（５０ｍｌ）で振盪し、蒸発転用した。この方法をもう一 度繰り返した。残渣を次いでメタノール（７５ｍｌ）に溶解し、エーテル（６０ ０ｍ）と石油エーテル（１．４Ｌ）に注いだ。−夜攪拌した後で、白色固体をろ 過して単離し、石油エーテルで洗浄した。真空下でｓｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥し て、３．５０ｇ　（７１．７％）が得られた。
ｍ．ｐ．１４２−１４７℃。元素分析、Ｃ．、　Ｈ．、　Ｎ．０，、実験値（理 論値）Ｃ：４９、５９　（５０．００）　Ｈ　：　６．４３　（６．２９）　Ｎ 　：　１４．５８　（１４．５８）。’Ｈ−ＮＭＲ　（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ −ｄａ）。二級アミド結合の周囲の回転が限定されているため、シグナルのいく つかが、２：ｌの比率で二重化した（リストにおいて大きい方はｍｊでまた小さ い方はｍｉで示しである）。１２．７３ｐｐｍ　（ｂ，ＩＨ，　−　ＣＯＯＨ） 　；　１１．２７ｐｐｍ　（ｓ，ｍＬ。
イミ　ド）；　１１．２５ｐｐｍ　（ｓ、ｍｉ、、イミ　ド）；　７．３０ｐｐ ｍ　（ｓ、ｍｊ、、ＡｒＨ）；（ｔ、２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ，ＣＨ−）；３．８ ７ｐｐｍ　（’ｑ”、２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨｓＣＨａ−）；　１．４４　（ｓ、 ９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。ＦＡＢ　−ＭＳ　：　５５１　（１０；　Ｍ　＋　１）：４ ９５　（１０；Ｍ＋１−ｔＢｕ）；４５１　（８０；　−Ｂｏａ）。
実施１１ Ｎ４−ベンジルオキシカルボニルシトシン　９はぼ１時間かけて、塩化ベンジル オキシカルボニル（５２ｍｌ　；　０゜３６ｍｏ＋）を、乾燥ピリジン（１００ ０ｍｌ）にシトシン（８，２０，０ｇ　。
０．１８ｍｏｌ）を分散させた分散液に０℃において、オーブンで乾燥させた装 置の中で窒素雰囲気中にて滴下した。この溶液を一夜攪拌し、その後このピリジ ン分散液を真空下で蒸発転属させた。水（２００ｍｌ）と４Ｎ塩酸を添加して、 ｐＨ〜１にした。生じた白色沈殿をろ過して除き、水で洗浄し、空気をサクショ ンして部分的に乾燥した。まだ湿潤している沈殿を無水アルコール（５００ｍｌ ）と−緒に１０分間沸騰させ、０℃にまで冷却し、ろ過し、エーテルデで　完全 に洗浄し、真空下で乾燥した。収率、２４゜７ｇ　（５４％）。ｍ。
ｐ、　＞　２５０℃。元素分析、ＣＩ２　Ｈｌｌ　Ｎｘ　Ｏｓ、実験値（理論値 ”）　Ｃ：５８゜５９　（５８，７７）　Ｈ：　４．５５　（４，５２）　Ｎ　 ：　１７．１７　（１７，１３）。ＮＭＲスペクトルは、本製品を溶解出来なか ったため一切記録しなかっｊこ。
実施立」 Ｎ４−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ＋−カルポキシメチルシトシベンジルオキ シ力ルポニル／トシン（９，２１，０ｇ　；　８２．６ｍｍｏ＋）ととを加え、 混合物を０℃で１５分間攪拌し、ろ過し、水（２ｘ　７５ｍ１）し、メタノール （１０００ｍｌ）から再結晶し、よくエーテルで洗浄が判り、淡赤色を呈してい た。ｍ、ｐ、２６６−２７４℃。元素分析、Ｃｌ４５３２）　Ｎ　：　１４．０ ４　（１３，８６）。。’Ｈ−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ、）　：　８ ．Ｏ２ｐｐｍ　（ｄ、Ｊ　＝　７．３２Ｈｚ、ＩＨ，Ｈ−６）　；　７．３９　 （ｓ、５Ｈ，Ｐｈ）　；７．０１　（ｄ、Ｊ　＝　７．３２Ｈｚ、ＩＨ，Ｈ−５ ）　；　５．１９　（ｓ、２Ｈ，ＰｈＣＨ−）　；　４゜５２　（ｓ、２Ｈ）。
ＦＡＢ　−ＭＳ　：　４７０　（Ｍ　＋　１）。
下で蒸発転属したが、先ず最初は水アスピレーター１次ぎにオイ（ｓ、９Ｈ，ｔ Ｂｕ）。ＦＡＢ−ＭＳ：５０４　（Ｍ＋１）　；４４Ｂ　（Ｍ＋１−ｔＢｕ）。
ＦＡＢ−ＭＳ・４７０　（Ｍ　＋　１）。
ン　フルオロフェノールエステル　１３ＦＡＢ　−ＭＳ　＋　４７０　（Ｍ　＋ 　１）。
Ｎ４−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ　−ａｅｇ−シトシン（１２、４ ）　本質的の七記酸のスペクトルを示したが、該エステルが加水分解したことに 起因するのが最も可能性が高い。ＦＡＢ−ＭＳ　：　６７０（Ｍ＋１）；６１４ 　（Ｍ＋１−ｔＢｕ）支施ｊけλ （：クロロカノしずキン−９−クロロアクリジン４−カルボキシアクリジン（６ ，２５ｇ　；　２６．１ｍｍｏｌ）、塩化ヂオニ□ル（２５ｍｌ）および４滴の ＤＭＦを、固体の物質が全て溶解するまで窒素を流しながら緩やかに加熱した。
次いでこの溶液を４０分間還流し、過剰の塩化チオニルを真空下で除去した。塩 化チオニルの最後の痕跡量を乾燥ベンゼン（Ｎａ−Ｐｂで乾燥）と−緒に二度蒸 発させて除去した。残留する黄色の粉末を直接次ぎの反応にそまま用いた。
犬施り刀 ６−アミノヘキサノン酸メチル塩酸塩（４，７０ｇ　；　２５．９ｍｍｏｌ）を 塩化メチレン（９０ｍｌ）に溶解し、０℃にまで冷却し、トリエチルアミン（１ ５ｍｌ）を加え、生じた溶液を直ちに酸の塩化物に上から加えた。この酸塩化物 を入れた丸底のフラスコを水浴中で０℃にまで冷却］、た。この混合物を０℃で ３０分間また室温で３時間激しく攪拌し、この混合物をろ過して残留する固形物 除去したが、この固形物を塩化メチレン（２０ｍｌ）で洗浄した。この赤−茶色 の塩化メチレンろ液を飽和重炭酸ナトリウムで二度洗浄しまた飽和塩化すＩ−リ ウムで一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸発転用した。得られ た油状の物質に、乾燥ベンゼン（３５ｍｌ）およびリグロイン（６０−８０℃、 Ｎａ−Ｐｂで乾燥）を加えた。この混合物を還流するまで加熱した。活性炭およ びセライトを加えて、この混合物を３分間還流した。ろ過した後で、表題化合物 は、磁気攪拌下で冷却すると結晶化した。このものをろ過して単離し、石油エー テルで洗浄した。本品は、固形の水酸化カリウム上で保存した。収率　５．Ｏｇ 　（５０９６）。
実施デュＡ ４−（５−−メ）・キンカルボニルペンチル　アミドカルボニル　−匹二」恒二 ニエ〔−ニトロベンズアミド　へキンルアミノ　−二ノアクリジン ４−（５−−メトキン力ルポニルベンチルアミトカルポニル）−〇−クロロアク リジン（１，３０ｇ　；　３．３８ｍｍｏｌ）およびフェノール（５ｇ）を、窒 素気流下で３０分間で８０℃にまで加熱し、その後６−（４゜−ニトロベンズア ミド）−１−ヘキシルアミン（８９７ｍｇ　；　３，３８ｍｍｏｌ）を加えた。
温度は２時間で１２０”Ｃまで上昇した。反応混合物を冷却し、塩化メチレン（ ８０ｍｌ）を加えた。生じた溶液は２Ｎ水酸化大トリウム（６０ｍｌ）で三度ま た水で一度洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸発転用した。得た赤 色オイル（１，８ｇ）を塩化メチレン（４０ｍｌ）に溶解し、０℃にまで冷却し た。エーテル（１２０ｍｌ）を加え、出た溶液を一夜攪拌した。こうすることに よって、固形物質とオイルの混合物が得られた。この固形ブッヲろ過して単離し た。固形物とオイルとを塩化メチレン（８０ｍｌ）に再度溶解し、冷エーテル（ １５０ｍｌ）に滴下した。２０分間攪拌したあと、表題化合物をろ過してオレン ジ色の結晶として単離した。本品をエーテル出洗浄し、水酸化カリウム」二で真 空にて乾燥した。収率：１．６０ｇ　（７７％）。ｍ、ｐ、１４５−１４７℃。
尖１」口上 ４−（５−カルボキシペンチル　アミドカルボニル　−９−６′−４”　−二］ ・ロベンズアミド）へキシルアミノ　−アミノアクリニ ４−（５−メトキシカルボニルペンチル）アミドカルボニル）−９−［６°−（ ４”−ニトロベンズアミド）へキシルアミノ］−アミノアクリジン（５０３ｍｇ 　；　０．８２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ　（３０ｍｌ）に溶解し、２Ｎ水酸化ナトリ ウム（３０ｍｌ）を添加した。１５分間攪拌した後、２Ｎ塩酸（３５ｍｌ）およ び水（５０ｍｌ）を０℃で加えた。３０分間攪拌したあとで、溶液をデカントし たところ、オイル状の物質が得られ、これを沸騰メタノール（１５０ｍｌ）に溶 解し、ろ過し、１／３の容積にまで濃縮した。このメタノール溶液に、エーテル （１２５ｍｌ）およびエタノールに溶かした塩酸５−６滴を加えた。この溶液を ０℃において１時間攪拌した後でデカントした。オイル状の物質を再びメタノー ル（２５ｍｌ）に溶解し、エーテル（１５０ｍｌ）で沈殿させた。−夜攪拌した 後で表題化合物が黄色結晶として単離された。
収率：４１７ｍｇ　（８０％）。ｍ、ｐ、１７３℃（分解）。
火１」口Ｊ （ａ）４−５−ペンタフルオロフェニルメオシカルポニルペンチル　アミドカル ボニル　−９−６’−（４”　−二トロベンズアＬド）へキシルアミノ　−アミ ノアクリジン　Ａｃｒ１０ｆ上記の酸（３００ｍｇ　；　０．．４８０ｍｍｏり をＤＭＦ　（２ｍｌ）と塩化メチレン（８ｍｌ）に溶解し、ペンタフルオロフェ ノール（９７ｍｇ　；　０゜５３　ｍ　ｍ　ｏ　ｌ　）を２　ｘ　２ｍｌの塩化 メチレンと共に移して添加した。
生じた溶液を０℃まで冷却し、この後ＤＣＣ（１２４ｍｇ　；　０．６０ｍｍｏ ｌ）を加えた。水浴を５分後に取り除き、混合物を一夜攪拌しつつ放置１７た。
沈殿したＤＣＵを遠心分離して除去し、遠心分離液を真空下で蒸発乾個しｊ−が 、先ず水アスピレータで次いでオイルポンプで蒸発転用（７た。残渣を塩化メチ レン（２０ｍｌ）中に溶解し、ろ過し、真空にて蒸発転用した。残渣を再び塩化 メチレンと石油エーテル（１５０ｍｌ）に溶解しｊ−０ｊ−−チル中の５Ｎ塩酸 １ｍｌを添加し、０℃で３０分間攪拌（７た後、溶媒をデカンテーションで除去 した。残留するオイル状物質を塩化メチ１ノン（１００ｍｌ）に溶解し、石油エ ーテルを加え、混合物を一夜攪拌しつつ放置した。翌日、黄色の沈殿結晶物をろ 過しては離し、大量の石油エーテルで洗浄した。収率　３００ｍｇ　（７８％） 、乾燥後。ｍ　、　ｐ　、　９７　、５℃（分解）。全ての試料は、満足するべ き元素分析結果、′Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲおよび質量スペクトルを示した。
（ｂ）ＰＮＡ化合物の合成実験、第８図を参照。
材料・Ｂｏｃ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）、ベンゾヒドリルアミン−、コポリ（スチ レン−１％−ンビニルヘンゼン）樹脂（ＢＨＡ樹脂）およびｐ−メチルへンゾヒ トリルアミンーコボリ（スチレン−１％−ジビニルヘンゼン）樹脂（Ｍ　Ｂ　Ｈ Ａ樹脂）をＰｎｅｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。その 他の試薬および溶媒は、それぞれ以下がら購入した・即ち、Ｂｉｏｇｒａｄｅの トリフルオロ酢酸は、ＨａｌｏｃａｒｂｏｎＰｒｏｄｕｃｔｓ社から、ジイソプ ロピルエチルアミン（９９％；これ以−Ｌ蒸留しなかった）およびＮ−アセデル イミダゾール（９８％）は、Ａｌｄｒｉｃｈ社から；Ｈ２Ｏは、二度蒸留した； 無水ＨＦは、ＵｎｉｏｎＣａｒｂｉｄｅ社から９合成グレードのＮ、Ｎ−ジメチ ルホルムアミドおよび分析グレードの塩化メチレン（これ以上蒸留しながった） は、Ｍ　ｅ　ｒ　ｃ　ｋ社から、ＨＩ）Ｉ−Ｃグレードのアセトニトリルは、Ｌ ａｂ　−５ｃａｎン土から；　ｐｕｒｕｍグレー川・のア用ソール、Ｎ、Ｎ−シ ンクロへキシルカルボジイミドおよびｐｕｒｉｓｓ、グレードの２．２．２−ト リフルオロエタノールは、Ｆｌｕｋａ社から購入した。
（ｂ）一般的方法および注記 別設に特記しない限り、以下を適用する。ＰＮＡ化合物はご一時的な”Ｎ−保護 のためにＴＦＡ−反応活性な第三級−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を用 い（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、、１９６４．８ ６．３０４）また”永久的な“側鎖保護のためにもっと酸に安定なベンジルオキ シカルボニル（Ｚ）および２−クロロベンジルオキシカルボニル（ＣＩＺ）を用 いて段階的固相方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ。
Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｅ、、１９６３．８５．２１４９）によって合成した 。Ｃ−末端アミドを得るために、ＰＮＡ類は、ＨＦ−反応活性なりＨＡまたはＭ ＢＨＡ樹脂（このＭＢＨＡ樹脂は、未置換ＢＨＡ樹脂を基準として最終ＨＦ開裂 を受け易い（Ｍａｔｓｕｅｄａら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　１９８Ｌ２．４５）） の上において構築した。全ての反応は（ＨＦ反応を除いて）、粗いガラスフリッ トを備えた、手動操作する標準固相反応容器において行った（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９８２．２１．５０２０）。元来”通 常の”アミノ酸を包含するペプチドのためにＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄおよびその共 同研究者（Ｓａｒｉｎら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９８１．１１７．１ ４７）によって開発された定量的なニンヒドリン反応が、全ての樹脂に対して” 通常”用いられてきた有効吸光係数ε＝　１５０００Ｍ−’ｃｍ−’を用いると 、うまく適用され、個別のカップリングの完結度ならびに成長するペプチド鎖の 数を測定出来た。カップリング時の残留基ｎの理論的置換度Ｓ。−３は（合成サ イクルの過程において脱保護とカップリングが完璧でありがっＰＮＡの鎖終了も その逸失も一切ないことを前提とする）、以下の式から算定される；３、＝３． −、　ｘ　（１＋　（Ｓ＝−＋　ｘΔＭＷ　ｘ　１０−”　ｍｍｏｌ／ｍｏｌ） ）−’なお本式において、ΔＭＷは、分子量の増大分（［ΔＭＷ］＝ｇ／ｍｏｌ ）であり、またＳ。−１は、先行する残留基ｎ−１のカップリング時の理論的置 換度である（［Ｓ］　＝　ｍｍｏｌ／ｇ）。個別のカップリングの程度の推定値 （％）は、測定した置換度を基準として算出され（Ｓが決定されない限り）かつ 先立つサイクルのあとの残留する遊離アミノ酸基の数について補正はしていない 。ＨＦＨＮＮは、Ｔｏｈ。
Ｋａｓｅｉ　（Ｏｓａｋａ、　Ｊａｐａｎ）製のＤｉａｆｌｏｎＨＦ装置で実施 した。ＶｙｄａｃＣ，、（５ミクロン、０．４６　ｘ　２５ｃｍおよび５ミクロ ン。１　ｘ　２５ｃｍ）逆相カラムは、それぞれ５Ｐ８０００計器において分析 用および半一合成用ＨＰＬＣに用いた。緩衝液液Ａは、１リツトル当たり４４５ マイクロリツトルのトリフルオロ酢酸を含む６０容量％のアセトニトリル／水溶 液であり、また緩衝液Ｂは、１リツトル当たり３９０マイクロリツトルのトリフ ルオロ酢酸を含む６ｏ容量％のアセトニトリル／水溶液である。直線勾配は、３ ０分で０−１００％の緩衝液Ｂで、流速は１．２ｍｌ／分（分析用）と５ｍｌ／ 分（半製造用）であった。溶出液は２１５ｎｍ　（分析用）と２３０ｎｍ　（半 製造用）においてモニターした。ＰＮＡ類の分子量は、最も多い同位元素の平均 値から瀉Ｃｆプラズマ脱着の飛行時間分光測定法によって決定した。
（定量的ニンヒドリン反応によって０．５７ｍｍｏｌ／ＮＨｘ／ｇ含有する旨決 定された）、３．２等量のＢｏｃＴａｅｇ　−０Ｐｆｐをほぼ３３％のＤＭＦ／ ＣＨ，ＣＩ、中で用いて開始した。個別のカップリング反応は、手動操作する、 ６ｍｌの標準固相反応容器内で少なくとも１２時間振盪することによって実施し 、未反応の７ミノ基は、合成の選択された段階でアセチル化することによってブ ロックした。鎖延長の過程は、定量的ニンヒドリン反応によっていくつかの段階 でモニターそれぞれ５．１０および１５の残基を構築した後で取り出した。
Ｉ　ＢｏｃＴａｅｇ　ＮＤ　Ｏ，５０１，３０＜９９．７２　ＢｏｃＴａｅｇ　 ＮＤ　Ｏ，４４１，４３＜９９．９３　ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，２９０，３９３， ３３９９，３４ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，２７０，３５＋３．３０　９６．３５　Ｂ ｏｃＴａｅｇ　Ｏ，２６０，３２８，３３＞９９．９６　ＢｏｃＴａｅｇ　ＮＤ 　Ｏ，３０７，７８＞９９．９７　ＢｏｃＴａｅｇ　ＮＤ　Ｏ，２８１３，８１ ７，２２＜９９．９８　ＢｏｃＴａｅｇ　ＮＤ　Ｏ，２６１４，００＜９９．９ ９　ＢｏｃＴａｅｇ　ＮＤ　Ｏ，２４３０，３３９３，２１０ＢｏｃＴａｅｇ　 Ｏ，１６０，２１＋１．６７　２．６７　＞９９．９１１　ＢｏｃＴａｅｇ　Ｎ Ｄ　Ｏ，２１４，５８＞９９．９＋２　ＢｏｃＴａｅｇ　ＮＤ　Ｏ，２０４，８ ７＜９９．４１３　ＢｏｃＴａｅｇ　ＮＤ　Ｏ，１９１，６７＞９９．９＋４　 ＢｏｃＴａｅｇ　ＮＤ　Ｏ，１８１４，０２＜９３．１＋５　ＢｏｃＴａｅｇ　 Ｏ，０７０，１７４，２０３，３３＞９９．９（ｂ）　Ａｃｒ’　−［Ｔａｅｇ Ｌｓ　ＢＨＡ樹脂の合成残留ＢＯＣ−［ＴＢｅｇｌ＋ｓ　−ＢＨＡ樹脂（推定乾 燥重量はほぼ３０ｍｇ　；０．００２ｍｍｏ１成長＃Ｊ１）の脱保護を行ったあ と、３ｍｌの固相反応容器において、Ｈ−［Ｔａｅｇ］ｕ　ＢＨＡ樹脂を６６％ はぼＤ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨ。
ＣＨｚ　Ｉ　ｍ　Ｉ中はぼ５０当量（８０ｍｇ　；　０．１１ｍｍｏｌ）のＡｃ ｒ’　−０Ｐｆｐ（即ち、ペンタフルオロフェノール０．１１Ｍ溶液）に反応さ せた。定量的ニンヒドリン反応によって判定されたように、アクリジン部のカッ プリングはほぼ定量的に近似していた。
（ｃ）　Ｈ［ＴａｅｇＬｇ　ＮＨｔの開裂、精製および同定保護されたＢｏｃ　 −［Ｔａｅｇ］、　−ＢＨＡ樹脂の一部を、塩化メチレン中５０％のトリフルオ ロ酢酸と反応させて、ＨＦ開裂に先だってＮ−末端Ｂｏｃ　（これは、潜在的に 有害な三級−ブチルの前駆体である）を除去した。中和しかつ洗浄しく”合成実 験記録”工程２−４の方法と同様の方法で）次いで真空で２時間乾燥した後、生 じた６７．１ｍｇ　（乾燥重量）のＨ−［ＴａｅｇＬｇ　−ＢＨＡ樹脂を０℃に おいて６０分間攪拌しつつ５ｍｌのＨＦ：アニソールで開裂させた。ＨＦを除去 した後、残渣を乾燥ジエチルエーテル（４ｘ　１５ｍＬそれぞれ１５分間）とと もに攪拌して、アニソールを除去し、フリット処理したガラス漏とで重力ろ過し 、乾燥させた。ＰＮＡを次ぎに６０ｍ１（４ｘ　１５ｍ１．それぞれ１５分間攪 拌）の酢酸水溶液に抽出した。
この溶液のい（つかのアリコートを分析用逆相ＨＰＬＣによって分析して、この 粗製ＰＮＡの純度を測定した。１３．０分における主ピークは、前吸光率のほぼ ９３％を占めていた。残りの溶液は、凍らむ五つのバッチから精製した。この主 ピークは、半合成用逆相カラムを用いて集めた。アセトニトリルをスピードＶａ Ｃで除き、残留溶液を凍結しくドライアイス）、その後凍結乾燥させると、９９ ％以上の純度のＨ［Ｔ　ａ　ｅ　ｇ　］　６　Ｎ　Ｈ２が１３．１ｍｇ得られた 。このＰＮＡ分子は、直ちに水に溶解し、質量分光分析による測定に基づいて正 確な分子量を有していた。（Ｍ　＋　Ｈ）”について、計算したｍ　／　ｚ値は １３４９．３でありまた測定したｍ　／　ｚ値は１３４７．８でありた。
（ｄ）　Ｈ−［Ｔａｅｇ］＋ｏ　ＮＨｔの開裂、精製および同定保護したＢｏｃ −［Ｔａｅｇ］ｔｏ　−ＢＨＡの一部を上記ＣＣ）項において記載したように処 理し、１８．９ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］、、　−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂する と１１．０ｍｇの粗製物が得られた。１５．５分における主ピークは、全吸光度 のほぼ５３％を占めていた。はぼ１ｍｇ％を占めるもう少しブロードのティル部 は、繰り返し精製しても除去出来なかった（若干減少しただけ）。質量スペクト ルは正確な分子量のＨ−［Ｔａｅｇ］＋。−ＮＨ２の存在を確認するものであっ たが、そのスペクトルから判定して、このようなテイル現象は、多少とも充分に 定義された、いくつかの凝集／配座状態にある標的分子にＹＰるものである。従 って、この粗製物は、標的分子を上記した５３％以上は含有している可能性があ る。Ｈ［Ｔａｅｇ］＋ｏ　ＮＨ２は、水に容易に溶解する。（Ｍ　＋　Ｈ）’に ついては、計算ｍ　／　ｚ値は２６７９゜６でありかつ測定ｍ／ｚ値は２６８１ ．５であった。
（ｅ）　Ｈ［Ｔａｅｇｌ＋ｓ　ＮＨｔの開裂、精製および同定保護したＢｏｃ　 −［Ｔａｅｇ）、、−ＢＨＡ樹脂の一部を＜ｃ＞項において記載したと同様に処 理して、１３．９ｍｇの乾燥Ｂｏｃ　−［Ｔａｅｇｌ＋ａ−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開 裂して３．２ｍｇの粗製物を得た。２２．６分における主ピークは、ブロードな 膨れ部に位置し、全吸光度のほぼ６０％を占めていた（第１２ａ図）。再び（前 項を参照）、この膨れ部は、の物質を得た。（Ｍ　＋　Ｈ）゛については、計算 ｍ　／　ｚ値は４０３３．９でありかつ測定ｍ　／　ｚ値は４０３２．９であっ た。
（ｆ）　Ａｃｒ’　−［Ｔａｅｇ］、、　−ＮＨ，の開裂、精製および同定保護 されたＡｃｒ’　−［Ｔａｅｇ］＋ｓ　−ＢＨＡ樹脂の一部を（ｂ）項において 記載したように処理して２９．７ｍｇの乾燥Ａｃｒ’　［ＴａｅｇＬｇ−ＢＨＡ 樹脂をＨＦ開裂して１４．３ｍｇの粗製物を得た。全て合わせると、２３．７に 分における主ピークおよび２９．２分における“ダイマー”（下記を参照）は、 全吸光度のほぼ４０％を占めていた（第１２ｂ図）。この粗製物を繰り返し精製 して、恐らくは９９％以上の純度のΔｃｒ’　−［Ｔａｅｇコ＋ａ　ＮＨ２２７ ，４分、２９．２分および最後に１００％緩衝液Ｂで溶出する大きく、ブロード な膨れ部として溶出するすると（数時間）成長し、最後に定量的に下降するとい う観察結果と一致する。（Ｍ　十Ｈ）’については、計算ｍ　／　ｚ値は４５９ ３．６でありかつ測定ｍ／ｚ値は４５８８．７であった。
（ｇ）合成実験記録１ （１）　ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ、　（１：　１、ｖ　／　ｖ　）によるＢｏｃ−脱 保護、３ｍｌ、ａｘ１分および１×１０分；　（２）　ＣＨ，Ｃ１，による洗浄 、３ｍｌ、Ｂｘ１分：（３）　ＤＩＥΔ／ＣＨ，Ｃ１２（１：　１９、ｖ／ｖ） による中和、３ｍｌ、３ｘ２分；（４）　ＣＨ，Ｃ１，による洗浄、３ｍｌ、ａ ｘ１分、および１分間のドレーン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り 出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定する＋（６） １ｍｌのＣＨ。
Ｃ１，に溶解した３、２当量の（０，１８ｍｍｏｌ　；　１００ｍｇ）　Ｂｏｃ Ｔａｅｇ　−０Ｐｆｐを添加し、次いで０．５ｍｌのＤＭＦ　（最終のペンタフ ルオロフェノール濃度−０，１２Ｍ））を添加する；（７）ＤＭＦによる洗浄、 ３ｍｌ、１ｘ２分；　（８）　ＣＨ，Ｃ１，による洗浄、３ｍｌ、Ｊｘ１分；　 （９）　ＤＩＥＡ／ＣＨ，Ｃ１，（１：　１９、ｖ／ｖ）による中和、３ｍＬ　 ２ｘ２分；　（１０）　ＣＨ。
Ｃ１，による洗浄、３ｍｌ、６ｘ１分；　（１１）　２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹 脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に供し、さらに２−５ｍｇをよく 乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、カップリング度を測定する（サイクル ７、ＩＯおよび１５の後で、未反応アミノ基を塩化メチレン中でＮ−アセチルイ ミダゾールによるアセチル化を行いブロックした）。
樹脂（０，５７ｍｍｏｌＮＨｚ／ｇ）　１００ｍｇに定量的にローディング（純 ＣＨ，Ｃ１，中での標準的ＤＣＣによるｉｎ　−５ｉｔｕカツプリング）するこ とによって開始した。この保護したＰＮＡ樹脂鎮をさらに延長するために、はぼ ３３％ＤＭＦ／ＣＨ，Ｃ１，中３．２当量のＢｏｃＴａｅｇ　−０Ｐｆｐを用い て、サイクル１から５までおよび１０から１５までについて単一カッブリング（ ”合成実験記録２“）を用いた。サイクル５から１０までは、はぼ３３％Ｓ　Ｍ 　Ｆ　／　ＣＨ２ＣＩ、中遊離の酸ＢｏｃＴａｅｇ　−ＯＨをまた別のストレー トＤＣＣ（即ち、ｉｎ　５ｉｔｕ）カップリングさせる方法を用いた。全てのア カツブリング反応を手動操作式の６ｍｌ標準固相反応容器中において少なくとも １２時間振盪することによって実施した。未反応のアミノ基を、実施例１７にお いて行ったと同様に、この合成の同じ段階においてアエチル化することによって ブロックした。保護したＢｏｃ　−［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　− Ｂ　ＨＡ樹脂およびＢＯＣ−［Ｔａｅｇｌ＋。−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ 樹脂を一部ずつ、５およびｌ０ＰＮＡ残基を組み立てた後で取り出した。Ｂｏｃ −［Ｔａｅｇ］＋ｏ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂の分析用ＨＰＬＣク ロマトグラムから判定して（（ｅ）項を参照）、ＰＮＡ残基５から１０までにさ らに”遊離酸゛カップリングさせても、実施例１７における完全単一　カップリ ングした残基と比較して、合成収率は改善されることはなかった。
（ｂ）　Ａｅｒ’−［Ｔａｅｇ］＋ｏ−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨΔ樹脂の合 成りｏｃ　−［Ｔａｅｇ］＋ｏ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂の一部を 脱保護した後で（推定乾燥重量はほぼ９０ｍｇ；−０，０１ｍｍｏｌの成長鎖） 、このＨ−［Ｔａｅｇコ、８−ＢＨＡ樹脂に３ｍｌの固相反応容器のおいてほぼ ６６％ＤＭＦ／’ＣＨ，Ｃ１，中はぼ２０当凰の（１４１ｍｇ　；　０．１９ｍ ｍｏｌ）のＡｃｒ’　−０Ｐｆｐを反応させた。定量的ニンヒドリン反応から判 定して、アクリジン部のカップリングは、定量的に近かった。
（ｃ）　Ａｃｒ’　−［Ｔａｅｇ］＋ｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂 の合成残留Ｂｏｃ　−［Ｔａｅｇ］＋ｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂 （推定乾燥重量はほぼ７０ｍｇ　；　”　０．００５ｍｍｏｌ成長鎖）を脱保護 したあとで、このＨ−［Ｔａｅｇ］＋ａ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂 に３ｍｌの固相反応容器のおいてほぼ６６％Ｄ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨ，Ｃ１，中は ぼ２５当量の（９１ｍｇ　；０　、１２　ｍ　ｍ　ｏ　Ｉ　）のＡｃｒ’　−０ Ｐｆｐを反応さぜた。定量的ニンヒドリン反応から判定しで、アクリジン部のカ ップリングは、定量的に近かった。
（ｄ）　Ｈ［Ｔａｅｇｌｓ　ＮＨｚの開裂、精製および同定保護したＢｏｃ　− ［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂の一部を実施例１７ｃに おいて記載したように処理し、１９．０ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙ ｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂すると８．９ｍｇの粗製物が得られた 。１２．２分における主ピークは（１０％酢酸溶液の代わりに水溶液から注入す ると１４，２分において溶出）、全吸光度のほぼ９０％を占めていた。はぼ２． ２ｍｇの粗製物を精製すると、９９％純度のＨ−［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙｓ　− ＮＩＬがほぼ１．５ｍｇ得られた。
（ｅ）　Ｈ−［Ｔａｅｇコ＋６　１．ｙ　ｓ　Ｎ　Ｈ２の開裂、精製および同定 保護したＢｏｃ　−［ＴａｅｇＬｏ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂の一 部を実施例１７ｃにおいて記載したように処理し、７．０ｍｇの乾燥Ｈ−［Ｔａ ｅｇＬｏ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂をＨＦ開裂すると１　、７　ｍ 　ｇの粗製物が得られた。１５．１分における主ピークは（１０％酢酸溶液の代 わりに水溶液から注入すると１７．０分において溶出）、全吸光度のほぼ５０％ を占めていた。はぼ１．２ｍｇの粗製物を精製すると、９５％以上の純度のＨ− ［Ｔａｅｇ］＋ｏ　−Ｌｙｓ　−ＮＨｘがほぼ０．２ｍｇ得られた。（Ｍ　＋　 Ｈ）’については、計算ｍ／ｚ値は２８０７．８でありかつ測定ｍ／ｚ値は２８ ０８．２であった。
（ｆ）　Ａｃｒ’−［Ｔａｅｇコ＋ｏ　−Ｌｙｓ　−ＮＨ，の開裂、精製および 同定保護したＢｏｃ　−［ＴａｅｇＬｏ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂 の９９．１ｍｇ（乾燥重量）を実施例１７ｃにおいて記載したように処理し、４ ２．２ｍｇの粗製物を得た。２５．３分における主ピークは（１０％酢酸溶液の 代わりに水溶液から注入する２３．５分において溶出）、全吸光度のほぼ４５％ を占めていた。８．８７ｍｇの粗製物を精製すると、９７％以上の純度のＨ［Ｔ ａｅｇＬｏ　Ｌｙｓ　ＮＨｘがほぼ５．３ｍｇ得られた。
（Ｍ　＋　Ｈ）”については、計算ｍ　／　ｚ値は２８５０．８でありかつ測定 ｍＺＺ値は２８４９．８であった。
（ｇ）　Ａｃｒ’−［Ｔａｅｇ］、、　−Ｌｙｓ　−ＮＨ，の開裂、精製および 同定保護したＡｃｒ’−［Ｔａｅｇ］＋ｏ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹 脂の７８゜７ｍｇ（乾燥重量）を実施例１（ｃ）項において記載したように開裂 させ、３４．８ｍｇの粗製物を得た。２３．５分における主ピーク（１０％酢酸 溶液の代わりに水溶液から注入しても同じ溶出時刻において溶出）および２８． ２分における“ダイマー”は、全吸光度のほぼ３５％を占めていた。はぼ４．５ ｍｇの粗製物を精製すると、９５％以上の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］、０−　Ｌｙ ｓ−ＮＨｘがほぼ１．６ｍｇ得られた。この化合物は、“ダイマー”ピークを無 くすことは出来ず、酢酸水溶液中に放置すると増大した。
（１１）合成実験記録２ （１）　ＴＦＡ／ＣＨ，Ｃ１２（１：　１、ｖ／ｖ）によるＢＯＣ−脱保護、３ ｍｌ、ａｘ１分およびｌＸ３０分；　（２）　ＣＨ２Ｃｌ２による洗浄、３ｍＬ 　６！１分；（３）　ＤＩＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ！　（１：　１９、ｖ　／　ｖ　） による中和、３ｍｌ、３！２分；（４）　ＣＨ，ＣＩ２による洗浄、３ｍｌ、６ ！１分、および１分間のドレーン；（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試料を取り 出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供する；（６）サイクル１から５ までおよびサイケる１０から１５までに就いては、カップリング反応は、１ｍｌ のＣＨｚ　ＣＩｇに溶解した３、２当量の（０，１８ｍｍｏｌ　；　１００ｍｇ ）　ＢｏｃＴａｅｇ−０Ｐｆｐを添加し、次いで０．５ｍｌのＤＭＦ　（最終の ペンタフルオロフェノール濃度−０，１２Ｍ））を添加することによって実施し た；このカップリング反応は、振盪しつつ全体として１２−２４時時間待さゼた 。サイクル５から１０までは、１．５ｍｌのＤＭＦ／ＣＨ，Ｃ１，（１：２、ｖ 　／　ｖ　）中で０．１２ＭＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨをさらに０．１２ＭＤＣＣで カップリングさせた；　（７）ｏＭｘｒによる洗浄、３ｍｌ、１！２分；（８） ＣＨ，ＣＩ２による洗浄、３ｍｌ、４！１分；　（９）　ＤＩＥＡ／ＣＨ，Ｃ１ ，（１：　１９、ｖ　／　ｖ　）による中和、３ｍｌ、　２！２分；　（１０） 　ＣＨ，Ｃ１，による洗浄、３ｍｌ、［３！１分；　（１１）　２−５ｍｇの保 護ＰＮＡ樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に供し、さらに２−５ ｍｇをよく乾燥してニンヒドリン定量分析に供してる（サイクル７．１０および １５の後で、未反応アミノ基を塩化メチレン中でＮ−アセチルイミダゾールによ るアセチル化を行いブロックした）。
火１１０．旦 １二」工ａｅ　−Ｌ’ｓ　」Ｈの　された　ム保護されたＰＮＡをＭＢＨＡ４１ ４脂の上で、前記実施例において使用したＢＨＡ樹脂のローディングのほぼ半分 を用いて構築した。更には、一つのサイクルを除いて全てのサイクルは、カップ リングしないアミン基をアセチル化することによってこれに従った。以下にこの 合成法を詳細に記述する。
（ａ）当初置換度が０．３ｍｍｏｌ／ｇのＢｏｃ　−１，ｙｓ　（ＣＩＺ）　− ＮＨ−ＣＨ（ｐ　−ＣＨ，−Ｃ，Ｈ４）　−Ｃ，Ｈ，樹脂（Ｍ　Ｂ　ＨＡ樹脂） の製造Ｂｏｃ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂の所望の置換度は０．２ ５−０゜３０ｍｍｏｌ／ｇであった。この数値を得るために、１．５ｍｍｏｌの ＢｏｃＬｙｓ　（ＣＴＺ）を、６０ｍ１のＣＨ，Ｃ１，中車−ｉｎ　−５ｉｔｕ カツプリング（１，５ｍｍｏｌのＤＣＣ）剤を用いて、中和し、事前に膨潤させ たＭ　Ｂ　ＨΔ樹脂（定量ニンヒドリン反応によって０．６４ｍｍｏｌＮＨｚ／ 　ｇを含有することが測定された）　５．０ｇにカップリングさせた。この反応 は、手動操作式の２２５ｍ１標準固相反応容器の中において３時間振盪すること によって実施した。未反応のアミノ基を無水酢酸。
ピリジン／　ＣＨ２Ｃｌ２　（１：　１　：　２、Ｖ／Ｖ／　Ｖ）　（７）混合 物を用いて１８時間アセチル化してブロックした。中和した樹脂の上での定量的 ニンヒドリン反応を行ったところ、僅か０．０００９３ｍｍｏｌ／　Ｈの遊離ア ミンが残留すること（第１表を参照）、即ち原初のアミノ基の０゜１５が残留し ていることが判った。置換度は、脱保護しニンヒドリン分析して決定したが、中 和したＨ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂について０．３２ｍｍｏ１／ ｇであることが判った。０．３０ｍｍｏｌＢｏｃＬ−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）　／ｇ樹 脂なる定量的カップリングに対する最大値０　、２８　ｍ　ｍ　ｏ　１！ｇと充 分に比肩できるものである（第１！表を参照）。
（ｂ）　Ｂｏｃ　−［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂の 段階的構築 （ａ）項で製造したＨ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂の全バッチをそ のまま（同じ反応容器中において）用いて、２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ−０Ｐ ｆｐを純ＣＨ，ＣＩ、中において用いて単一カッブリング（″合成実験記録３” ）によってＢｏｃ　−［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂 を構築した。定量的ニンヒドリン反応を、この合成全体にわたって適用した（第 Ｕ表を参照）。
（ｃ）　Ｂｏｃ　−［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂の 段階的合成 湿潤Ｂｏｃ　−［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂はぼ４ ．５ｇ（０，３６ｍｍｏｌｏの成長鎖；（ｂ）項において製造した全部で−１９ ｇの湿潤樹脂から取り出した）を、５５ｍ１の５ｐｐｓ反応容器のなかに入れた 。Ｂｏｃ　−［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂を、はぼ ３０％Ｄ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨ２ＣＩ、中において２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ　 −０Ｐｆｐを用いて単一カップリングじ合成実験記録４”）で構築した。合成の 進行は、全ての段階において定量的ニンヒドリン反応によってモニターした（第 １Ｉ表を参照）。
（ｄ）　Ｂｏｃ　［Ｔａｅｇ］ｔｏ　Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　ＭＢＨＡ樹脂の段階 的構築 湿潤Ｂｏｃ　−［Ｔａｅｇ１３−　Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂はぼＩ ｇ（−０、０９ｍ　ｍ　ｏ　ｌ　ｏの成長鎖；（Ｃ）項におい手製造した全部で 一４ｇの湿潤樹脂から取り出した）を、２０ｍ１の５ＰＰＳ反応容器のなかに入 れた。ＢｏＣ−［Ｔａｅｇｌ＋ｏ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂を、 はぼ３０％ＤＭＦ／ＣＨ，ＣＩ、中において２．５当量のＢｏｃＴａｅｇ　−０ Ｐｆｐを用いて前記した項において使用した単一カッブリング合成実験記録によ って構築した。反応容量は３ｍｌであった（激しく振盪）。合成は、定量的ニン ヒドリン反応によってモニターした（第１１表を参照）。
合成　カップル　脱保護後の置換　残留アミノ基　推定カッた　ｍｏｌ　ｍｏｌ 　プル　％ 測定値　理論値　単一カップル　アセチル化”Ｏ’　ＢｏｃＬｙｓ　Ｏ，３２０ ，２８０，９３（ＣＩＺ） Ｉ　ＢｏｃＴａｅｇｏ、２３　０．２６　０．９７　０．５４　＜９９．９２　 ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，２１０，２４０，９２０，４６９９，８３ＢｏｃＴａｅｇ 　Ｏ，１９０，２３１，０００，５７９９，７４ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，＋８　０ ．２１　１．８５　９９．３５　ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，１７０，２０２，０１０ ，１９９９，９６ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，１５０，１９、１，６９０，１０９９， ０７ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，１１０，１８１，１１０，６６９９，１８ＢｏｃＴａ ｅｇ　Ｏ，＋２　０．１７　１．８２　０．４４　９９．９９　ＢｏｃＴａｅｇ 　Ｏ，１００，１７５，６３０，５６９４，８１０ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，１１０ ，１６１，５４０，６７９９，１での９０．１％と用く合致している。７．２ｍ ｇの粗製物を二つのバッチから半合成用逆相カラムを用いて精製した（主ピーク をドライアイス／２−イソプロパツールで冷却したビーカーに集める）。それぞ れは、Ｈ，０１ｍ１中に３．６ｍｇを含有していた。凍結した溶液をそのまま凍 結乾燥して（ｓｐｅｅｄ　ｖａｃにおいてアセトニトリルを予め除去することな り）８２％純度のＨ−［Ｔａｅｇ］、。−Ｌｙｓ　−ＮＨｗがほぼ４．２ｍｇ得 られた。
（ｇ）　Ａｃ　−［Ｔａｅｇコ、。−Ｌｙｓ−ＮＨ，の開裂、精製および同定保 護したＡｃ　−［Ｔａｅｇ］＋ｏ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂の４０ ０゜０ｍｇ　（乾燥重量）を実施例１７ｃにおいて記載したように開裂させたが 、ＴＦＡ処理を行うことはせずに、１１．９ｍｇの粗製物を得た。
１５．８分における主ピークは、全吸光度のほぼ７５％を占めていた。
４．８ｍｇの粗製物を精製すると、９５％以上の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］＋。
−Ｌｙｓ　−ＮＨ，がほぼ３．５ｍｇ得られた。（Ｍ　＋　Ｈ）”については、 計算ｍ　／　ｚ値は２８４９．８でありかつ測定ｍ　／　ｚ値は２８４８．８で あった。
（ｈ）合成実験記録３ （１）　ＴＦＡ／ＣＨ，Ｃ１，（１：　Ｌ　ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、３ ｍｌ、ａｘ１分および１ｘ３０分；　（２）　ＣＨ，Ｃ１，による洗浄、１００ ｍ１．６ｘ１分；　（３）　ＤＩＥＡ／ＣＨ，Ｃ１，（１：　１９、ｖ　／　ｖ 　）による中和、１００ｍ１゜３ｘ２分；　（４）　ＣＨ，ＣＩ、による洗浄、 １００ｍ１、ｅｘ１分、および１分間のドレーン；　（５）２−５ｍｇのＰＮＡ −樹脂試料を取り出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、置換度 を測定する；（６）３５ｍｌのＣＨ，Ｃ１，に溶解した２、５当量の（３，７５ ｍｍａｌ　；　２．０６４ｇ）ＢｏｃＴａｅｇ　−０Ｐｆｐを添加（最終ペンタ フルオロフェノールの濃度は〜０．ＩＭ）；カップリング反応は、振盪しつつ合 わせて２０−２４時間進行させた；（７）ＤＭＦによる洗浄、１００ｍ１．１ｘ ２分（ＢｏｃＴａｅｇ−ＯＨの沈殿を除去するため）；　（８）　ＣＨ，Ｃ１１ による洗浄、１００ｍ１、Ｊｘ１分；　（９）　ＤＩＥＡ／ＣＨ，Ｃ１，（１： 　１９、ｖ　／　ｖ　）による中和、１００ｍ１゜２ｘ２分；　（１０）　ＣＨ ，Ｃ１１による洗浄、１００ｍ１．６ｘ１分；　（１１）　２−５ｍｇの保護Ｐ ＮＡ樹脂試料を取り出し、迅速ニンヒドリン定量試験に供し、さらに２−５ｍｇ をよく乾燥してニンヒドリン定量分析に供してカップリング度を測定；　（１２ ）無水酢酸／ピリジン／ＣＨ。
Ｃ１，（１：１：１、ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）の混合液１００ｍ１を用いて２時 間アセチル化を行って未反応アミノ基をブロックする；　（１３）　ＣＨ，Ｃ１ ，による洗浄、１００ｍ１．６ｘ１分；（１４）　２　ｘ　２−５ｍｇの保護Ｐ ＮＡ樹脂試料を取り出し、ＤＩＥＡ／　ＣＨｚＣＩ＊　（１：　１９、ｖ／ｖ） で中和し次いでＣＨｆ　ＣＩｇで洗浄してニンヒドリン定性および定量分析に供 する。
（ｉ）合成実験記録４ （１）　ＴＦＡ／ＣＨ１Ｃ１，（１：　１、ｖ　／　ｖ　）によるＢｏＣ−脱保 護、２５ｍ１゜３ｘ１分および１ｘ３０分；　（２）　ＣＨ，ＣＩ、による洗浄 、２５ｍ１．６ｘ１分；（３）　ＤＩＥＡ／ＣＨ２Ｃｌ、　（１：　１９、ｖ／ ｖ）による中和、２５ｍ１．３ｘ２燥してニンヒドリン定量分析に供して、置換 度を測定する；　（６）　６ｍｌのＣＨ，ＣＩ、に溶解した２、５当量の（０， ９２ｍｍｏｌ　；　０．５０６ｇ）　ＢｏｃＴａｅｇ中和し次いでＣＨｆ　Ｃ１ ，で洗浄してニンヒドリン定量分析に供する。
て行った。この合成の進行は、定量的ニンヒドリン反応によって全ての段階でモ ニターした（第１ＩＩ表）。
合成　カップル　脱保護後の置換　残留アミノ基　推定カフした　ｍｍｏｌ　ｍ ｏｌ　プル　％ 測定値　理論値　カップリング　アセチル化−ロ　ニロ ３　０．１９　０．２３　＋、００　０．５７４　ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，１７０ ，２１４，８８９７，３９７，３５ＢｏｃＣ（Ｚ）０．＋１　０．２０　７０． ２０２７．９８　１．３３　７８．４ａｅｇ　（４８） ６　ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，１００，１９２４，７９４，５８２，４０９５，４７ 　ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，０９０，＋８　８．５５　１．６１　０．２２　＞９９ ．９８　ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，０８０，１７６，５３０，８００，４５９９，０ ９　ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，０７０，１６９，２６３，６６０，６１９４，８１０ 　ＢｏｃＴａｅｇ　Ｏ，０７０，１５５，３２ｆ、４８　０．６０　９８．８（ ｂ）　Ｈ−［Ｔａｅｇ］、−Ｃａｅｇ　−［Ｔａｅｇ］、−Ｌｙｓ−ＮＨｗの開 裂、精製および同定 保護したＢｏｃ　−［Ｔａｅｇ］ｓ　−Ｃａｅｇ　−［ＴａｅｇＬ　−Ｌｙｓ　 （ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂の一部を実施例１の第０項において記載したように処理 し、６６．９ｍｇの乾燥したＨ　−［Ｔａｅｇ］、　−Ｃａｅｇ　−［Ｔａｅｇ ］、　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂をＨＦで開裂させて１４．４ｍｇの 粗製物を得た。１４．５分における主ピークは、全吸光度のほぼ５０％を占めて いた。１００ｍｇの粗製物を精製すると（８バッチ；それぞれ１ｍｌのＨ，Ｏに 溶解）、９６％の純度のＨ−［Ｔａｅｇ］ｓ　−Ｃａｅｇ　−［ＴａｅｇＬ−Ｌ ｙｓ−ＮＨｘがほぼ９．１ｍｇ得られた。（Ｍ　＋　Ｈ）’については、計算ｍ 　／　ｚ値は２７９３．８でありかつ測定ｍ　／　ｚ値は２７９０．６であった 。
実施例２１ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｎ−（ｂｏｃアミノエチル）グリシン アミノエチルグリジン（５２，８６ｇ　；　０．４４７ｍｏｌ）を水（９００ｍ ｌ）に溶解し、ジオキサン（９００ｍｌ）を加えた。このｐＨを２Ｎ　−ＮａＯ ＨでＪｌ、２に調節したａｌ）Ｈを１１２に保持しつつ、三級−ブチル−ｐ−ニ トロフェニル炭酸エステル（１２８，４ｇ　；　０．５３７ｍｏｌ）をジオキづ ン（７２０ｍｌ）に溶解し、２時間かけて滴下した。このｐＨを少なくともさら に３時間保持し、次いで攪拌しつつ一夜放置した。黄色の溶液を０℃に冷却し、 次いでｐＨを２Ｎ−ＨＣＩで３．５に調節した。
混合物をクロロホルム（４ｘ　１００ｍ１）で洗浄し、水相のｐＨを０℃で２Ｎ 　−ＮａＯＨで再び９，５に調節した。塩化ベンジルオキシカルボニル（７３， ５ｍｌ　；　０．５１５ｍ１）を、ｐＨを２Ｎ−ＮａＯＨで９．５に保持し１つ 半時間かけて添加した。このｐＨをこの後４時間頻繁に調節し、この溶液を攪拌 しつつ一夜放置した。翌日、この溶液をエーテル（３ｘ　６００ｍ１）で洗浄し 、そのｐＨを０℃において２Ｎ−、ＨＣＡで１５に調節り、た。表題化合物を酢 酸エチル（５ｘ　１００１００Ｏで抽出して単離した。この酢酸エチル溶液を硫 酸マグネシウムで乾燥］１、真空において蒸発転属した。こうして１３８ｇが得 られたが、こののちをニーデル（３００ｍｌ）に溶解し、石油エーテル（１８０ ０ｍｌ）を加えて沈殿させた。収率・１２４．７ｇ　（７９％）。ｍ、ｐ、６４ ．５−８５℃、’　ＣｎＨｕＮ、０．の元素分析、測定値（理論値）　Ｃ二５８ ．４０　（５７，９４）　；Ｈ：　７．０２　（６，８６）　＋　Ｎ・７．９４ 　（７，９５）。’ｉ（−ＮＭＲ（２５０Ｍｉ４ｚ、　ＣＤＣ１，）７．３３　 ＆　７．３２　（５Ｈ，Ｐｈ）　；５．１５　＆　５．１２　（２Ｈ，ＰｈＣ山 ）　；　４．０３＆　４．０１　（２Ｈ，ＮＣＨＣＯＨ）；３．４６　（ｂ、２ Ｈ，ＢＯＣＮＩ−（Ｃ１，ＣＨ）；３゜２８　（ｂ、２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨＣＨ ，）　；　１．４３　＆　１．４０　（９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。ＨＰＬＣ（２６０ｎ ｍ）　２０．７１ｍ１ｎ、（８０，２％）および２１．５７ｍ１ｎ、（１９，８ ％）。
Ｌ、Ｊ　Ｖ−スペクトル（２００ｎｍ−３００ｎｍ）は同一であり、小さいピー クはＢ１５−Ｚ　−ＡＥＧから成ることが明かとな２．ている。
夫１」銭 Ｎ’　−Ｂｏｃ−７Ｅ　／　ｉｆルグリシネチルエ−Ｆｉ＋／Ｎ−ヘンンルオキ シ力ルボニルーＮ’　−（ｂｏｃアミノエチル）グリシン（６０，０ｇ；　０． １７０ｍｏｌ）およびＮ、Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（６，００ｇ）を 無水エタノール（５００ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却して、その後にＤＣＣ（４ ２，２ｇ　；　０．２０４ｍｏｌ）を添加した。
５分後に水浴を取り除いて、攪拌をさらに２時間継続した。沈殿したＤＣＵ　（ 乾燥して３２．５ｇ）をろ過して除去し、エーテル（３ｘｌｏｏｍｌ）で洗浄し た。濾液を併せて、希硫酸水素ナトリウム液（２ｘ　４００ｍ１）、希炭酸水素 ナトリウム液（２ｘ　４００ｍ１　および飽和塩化ナトリウム液（１ｘ　４００ ｍ１）で次々に洗浄し　。有機相をろ過し、次いで硫酸マグネシウムで乾燥し、 真空において蒸発転属し、その結果ＤＣＵを含有するオイル状物質６６．１ｇが 得られた。
この油状物を無水エタノール（６００ｍｌ）に溶解し、パラジムカーボン（６， ６ｇ）を加えた。この溶液を大気圧で水素添加したが、この際保存容器は２Ｎ− 水酸化ナトリウムで満たした。４時間後、４．２Ｌの理論値に比較して、３．３ ■、が費消された。この反応混合物をセライトでろ過し、真空において蒸発転属 したところ、油状物質が３９．５ｇ　（９４％）が得られた。この油状物質１３ ｇ　をシリカゲル（６００ｇ　５ｉＯ２）クロマトグラフィーで精製した。塩化 メチレン中２０％の石油エーテル３００ｍ１で溶出した後で、表題化合物を塩化 メチ１２９５％メタノール１７００ｍ１で溶出させた。溶媒を満足するべき純度 のフラクションから真空において揮散させた。収率は８．４９ｇであった。その 代わりに、粗製物１０ｇをＫｕｇｅｌ　Ｒｏｈｒ蒸留で精製した。’ＨＮＭＲ（ ２５０ＭＨｚ、　ＣＤ５ＯＤ）　４．７７　（ｂ、５ＮＨ）　；４　、１８　（ ｑ　、　２　Ｈ、Ｍ　ｅ　Ｃ山）　；　３　、３８　（ｓ　、　２　Ｈ、Ｎ　Ｃ Ｈｚ　ＣＯａ　Ｅ　ｔ　）　；　３　、１６@（ｔ　。
２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨｘＣＨｚ）　：　２．６８　（ｔ、２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ ，ＣＨ，）　；　１．４３　（ｓ。
９Ｈ，ｔＢｕ）および１．２６　（ｔ、３Ｈ，ＣＨ，）、”Ｃ−ＮＭＲ１７１， ４（ＣＯＥｔ）　；１５６．６　（Ｃｏ）　；　７８．３　（（ＣＨ３）　Ｃ） 　；　５９．９　（Ｃｕｔ）　；　４９．０　（ＣＨ，）　；３９．０　（ＣＨ ，）　；　２６．９　（ＣＨ，）および１２．６　（ＣＨＩ）。
夾１を題」 Ｎ’　−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチルエーテルメタノールをエタノール の代わりに変えて、上記した方法を用いた。最終製品は、カラム精製法で精製し た。
実１」口」 １−　（Ｂｏｃ　−ａｅ　チミンエチルエステルＮ’−ＢｏＣ−アミノエチルグ リシンエチルエーテル（１３，５ｇ　；　５４゜８ｍｍｏり、ＤｈｂｔＯＨ（９ ，８４ｇ　；　６０．３ｍｍｏ＋）および１−カルボキシメチルチミン（１１， １ｇ　；　６０，３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ　（２１０ｍｌ）に溶解した。塩化メチ レン（２１０ｍｌ）を次に加えた。この溶液をエタノール／氷浴で０℃にまで冷 却し、ＤＣＣ（１３，６ｇ　；　６５．８ｍｍｏｌ）を加えた。水浴を１時間後 に取り除き、攪拌をさらに常温で２時間続行した。沈殿したＤＣＵをろ過して除 き、塩化メチレン（２ｘ７５　ｍ　ｌ　）で二度洗浄した。濾液を合わせて、こ れにさらに塩化メチレン（６５０ｍｌ）を加えた。この溶液を稀重炭酸ナトリウ ム液（３ｘ　５００ｍ１）、希硫酸水素ナトリウム液（２ｘ　５００ｍ１）およ び飽和塩化ナトリウム液（１ｘ　５００ｍ１）で連続して洗浄した。若干の沈殿 をろ過して有機相から除去し、有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空におい て蒸発転属した。オイル状の残渣を塩化メチレン（１５０ｍｌ）に溶解し、ろ過 し、表題化合物を０℃において石油ニーチル（３００ｍｌ）を加えで沈殿させた 。この塩化メチレン／石油エーテルの方法をもう一度繰り返し、これによって物 質１６゜０ｇ　（７１％）が得られたが、これは、ＨＰＬＣによって９９％以上 の純度であった。
犬施ｌＬ剥 １−Ｂｏｃ−ａｅ　チ匠 上記で得た物質をＴＨＦ　（１９４ｍ１．０．２Ｍ溶液が得られる）中に溶解し 、ＩＭの水酸化リチウム水溶液（１１６ｍｌ）を加えた。この混合物を常温で４ ５分間攪拌し、次いでろ過して残留ＤＣＵを除去した。水（４０ｍｌ）をこの溶 液に加え、次に塩化メチレン（３００ｍｌ）で洗浄した。さらに追加の水（３０ ｍｌ）を加え、このアルカリ性の溶液をさらにもう一度塩化メチレン（１５０ｍ ｌ）で洗浄した。この水溶液を０℃にまで冷却し、ｐ　Ｉ−（をＩＮ−ＭＣＩ（ はぼ１１０ｍ１）を滴下して２に調節した。表題化合物を酢酸エチル（９ｘ　２ ００ｍ１）で抽出し、抽出液を併せて、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中にお いて蒸発転属した。残渣をもう一度メタノールから蒸発させて、−夜乾燥させる と、無色のガラス様の固体が得られた。収率：９．５７ｇ　（６４％）。Ｈ１’ ＬＣ＞　９８％Ｒｔ　＝　１４．８ｍ１ｎ、元素分析、ｃｉｓ）−（、、Ｎ、Ｏ ，・０　、２５　Ｈ２０、実験値（理論値）　Ｃ：　４９．２９　（４９，４２ ）　Ｈ：６．５２　（６，３５）、Ｎ　：　１４．１１　（１４，４１）。二級 アミド結合の周囲の回転が限定されているため、シグナルのいくつかが２：１の 比率で二重化した（リストにおいて大きい方はｍ」でまた小さい方はｍｉで示し である）。、’Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、　ＤＭＳＯ−ｄｓ）　：　１２．７ ５（ｂ、ｓ、ｌＨ，ＣＯ，Ｈ）；　１１．２８　（ｓ、−ＩＨ”１ｍｊ、、１ｍ １ｄｅＮＨ）　；　１１．２６　（ｂ。
ｓ、、ＩＨ，ｃｏ２Ｎ）　；　７．３０　（ｓ、−ＩＨ”、ｍｊ、、Ｔ　Ｈ−６ ）　；　７．２６　（ｓ、”ＩＨ”。
ｍｉ、、Ｔ　Ｉ　−６）　；　６．９２　（ｈ、ｔ、、”ＩＨ−、ｍｊ、、Ｂｏ ｃＮＨ））　；　６．７３　（ｂ。
ｔ、、”ＩＨ”、ｍｉ、、ＢｅｏＮＨ）　）；４．６４　（ｓ、−２Ｈ−１ｍｊ 、、ＣＨｚＣＯＮ）；４゜４６　（ｓ、−２Ｈ”、ｍｊ、、ＣＨｚＣＯＮ）　； 　４．１９　（ｓ、”２Ｈ”、ｍｉ、、ＣＩＩｚＣＯｘＨ）　：３．９７　（ｓ 、”２）（”、ｍｊ、、ＣＩＬＣＯ２Ｈ）　；　３．６３−３．０１　（分解さ れないｍ、水を含む、ＣＨ２ＣＨ，）　；　１．７５　（ｓ、３Ｈ，ＣＩＪａ） および（ｓ、９Ｈ，ｔＢｕ）。
火施」ｇ歪 Ｎ４−ベンジルオキシカルボニル−１−Ｂｏｃ−ａｅ　シトシンＮ’−Ｂｏａ− アミノエチルグリシンエチルエステル（５，００ｇ　；　２０゜３ｍｍｏｌ）、 ＤｈｂｔＯＨ（３，６４ｇ　；　２２．３ｍｍｏｌ）およびＮ４−ベンジルオキ シカルボニル−１−カルボキシメチルシトシン（６，７７ｇ　；　２２３ｍｍｏ ｌ）をＤＭＦ　（１００ｍｌ）に分散させた。塩化メチレン（１００ｍｌ）を次 に加え、この溶液を０℃にまで冷却し、ＤＣＣ（５，０３ｇ　；　２４．４ｍｍ ｏ＋）を添加した。２時間後に氷浴をを取り除き、攪拌を常温でさらに１時間継 続した。この反応混合物を真空において蒸発転属し、残渣をエーテル（１００ｍ ｌ）中に分散させ、３０分間激しく攪拌した。固形物をろ過して単離し、エーテ ル洗浄処理方法を二度繰り返した。
金型炭酸ナトリウム液（はぼ４％溶液、１００ｍ１）とともに１５分間激しく攪 拌し、ろ過して、水で洗浄した。この方法をもう一度繰り返し、乾燥後、放置す ると淡黄色の固体物質が１７．９ｇ得られた。
この固体をジオキサン（２００ｒｎｌ）とともに煮沸し、熱時ろ過した。
冷却後、水（２００ｍｌ）を加えた。沈殿した物質をろ過して単離し、水で洗浄 して、乾燥した。ＨＰＬＣ（２６０ｎｍにおいて観察）によれば、この物質は、 ＤＣＵの他に純度として９９％であった。このエステルをＴＨＦ　（１００ｍｌ ）中に分散させ、０℃にまで冷却して、ｌＮ−ＬｉＯＨ（６１ｍｌ）を加えた。
１５分間攪拌した後で、混合物をろ過し、濾液を塩化メチレン（２ｘ　１５０ｍ １）で洗浄した。このアルカリ性の溶液を０℃にまで冷却し、ｐＨｗｏｌＮ−Ｈ ＣＩで２．０に調節した。表題化合物をろ過して単離して、水で一度洗浄すると 、乾燥後に白色の粉体が１１．３ｇが得られた。この物質を塩化メチレン（３０ ０ｍ　ｌ　）中に懸濁させ、石油エーテル（３００ｍｌ）を加えた。
ろ過し、次いで洗浄すると、乾燥後で７．１ｇ　（６９％）が得られた。
ＨＰ　Ｌ　Ｃの結果、ＲＴ＝１９．５分で純度が９９％でありまた１２．６分に おいて、恐らくはＺ−ｄｅ保護されたモノマーである不純物（はぼ１％）がある ことが判った。元素分析、Ｃ，Ｈ，Ｎ、Ｏ，、実験値（理論値）　Ｃ：５４．１ ６（５４，８７）　Ｈ：５．７６（５，８１）；　Ｎ：１３．６５（１３゜９１ ）。Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、　ＤＭＳＯ−ｄ、）　＋　１０．７８　（ｂ、 ｓ、ＩＨ，ＣＯ。
■）　、　７．８８　（二つのオーバーラツプする二重線、”ＩＨ”、ＣｙｔＨ −５）　；７．４１−７．３２　（ｍ、５Ｈ，Ｐｈ）　；　７．０１　（二つの オーバーラツプする二重線、−ＩＨ”、ＣｙｔＨ−５）　；　６．９４　＆　６ ．７８　（ｕｎｒｅｓ、三重線、ＩＨ。
ＢｏｃＮＩｊ）；５．１９　（ｓ、２Ｈ，ＰｂＣｌ２））　；　４．８１　＆　 ４．６２　（ｓ、２Ｈ，Ｃ１ｊｚＣＯＮ）　＋　４．１７　＆　３．９８　（ｓ 、２Ｈ，ＣＨｚＣＯ＝Ｈ）　；　３．４２　３．０３　（ｍ、水を含有、　ｃ　 Ｈ，Ｃ）（２）および１．３８　＆　１．３７　（ｓ、９Ｈ，ｔＢｕ）、”Ｃ− ＮＭＲ。
１５０．８８　；　１２８．５２　、１２８．１８　；　１２７．９６　；　９ ３．９０　、６６．５３　、４９．５８および２８２２゜■Ｒ：周波数、ｃｍ’ （強度）。３４２３　（２６，４，３０３５（５３，２）、２９７８　（４１， ４））、１７３６　（１７，３）、１６５８　（３，８）、１５６３（２３，０ ）、１５０１　（６゜８）および１４５６　（２６，２）大１！μＵ ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステルアデニン（１０，０ｇ　；　７４ ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１０，２９ｇ。
７４．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦに懸濁させ、臭化酢酸エチル（８，２４ｍ１　；　 ７４ｍｍｏｌ）を加えた。この懸濁液を室温で窒素雰囲気下で２．５時間攪拌し 、次いでろ過した。固形の残渣をＤＭＦ　（１０ｍｌ）三酸度洗浄した。濾液を 併せて、真空において蒸発乾個し、黄−オレンジ色の固形物質を水（２００ｍｌ ）に注ぎ、４Ｎ−ＨＣＩをｐＨ〜６になるように加えた。０℃で１０分間攪拌し た後で、固形物をろ過して除き、水で洗浄し、９６％エタノールから再結晶した 。表題化合物をろ過して単離し、エーテルでよく洗浄した。収率：３゜４ｇ　（ ２０％）。ｍ、ｐ、　２１５゜−２２０℃。元素分析、ＱＨ＋＋　ＮｇＯｔ、実 験値（理論値）　Ｃ：　４８．８６　（４８゜６５）　Ｈ：　５．０１　（４， ９１）　；　Ｎ　：　３１．６６　（３１，４２）、　Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨ ｚ。
ＤＭＳＯｄ＝）　＋　（ｓ、２Ｈ，Ｈ２＆　Ｈ８）　ニア、２５　（ｂ、ｓ、、 ２Ｈ，ＮＨｔ）　；５．０６　（ｓ、２Ｈ，ＮＣＲ，））　；　４．１７　（ｑ 、２Ｈ，Ｊ　＝　７．１１Ｈ２，ＯＣＨりおよび１．２１　（ｔ、３Ｈ，Ｊ＝７ ．１３Ｈｚ、ＮＣＨｔ）。”ＣＮＭＲ１１１５２，７０，１４１゜３０．６１． ４１．４３．９７および１４．０？。ＦＡＢ　−ＭＳ、２２２　（ＭＨ＋）。
１２７周波数、Ｃｍ”　（強度）。３８５５　（５４，３）、３２７４　（１０ ，４）、３２４６（１４，０））、３１１７　（５，３）、２９８９　（２２， ３）、２９４０　（３３，９）、２８７６（４３，４）、２７５３　（４９，０ ）、２３４６　（５６，１）、２１０６　（５７，１）、１８９９　（５５゜７ ）、１７６２　（１４，２）、１７４２　（１４，２）、１７４２　（１，０） 、１６７１　（１，８）、１６４４（１０，９）、１６０６　（０，６）、１５ ８２　（７，１）、１５２２　（４３，８）、１４７７　（７，２）。
１４４５　（３５，８）および１４２２　（８，６）。アルキル化の位置は、９ ６％エタノールから再結晶して得た結晶についてのＸ−線結晶学によフて確認し た。
を乾燥ＤＭＦ　（５０ｍｌ）に緩やかに加熱して溶解させて、２０　℃にまで冷 却し塩化メチレン（５０ｍｌ）にＮ−エチルベンジルオキシカルボニルイミダゾ ールＮ−エチル　テトラフルオロ硼酸エステル液で連続して洗浄した。この溶液 を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空において蒸発乾個したところ、油状物１１ｇ が得られた。この物質を塩化メチレン（２５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却し、石 油エーテル（５０ｍｌ）で沈殿させた。この方法をもう一度繰り返して、表題化 合物３．４５ｇ　（６３％）が得られた。ｍ、ｐ、１３２−３５℃。元素分析、 ＣＩｙ　Ｈ＋ｙ　Ｎｓ　Ｏい実験値（理論値）　Ｃ：５６．９５　（５７，４６ ）　Ｈ：４．７１　（４゜８２）　；　Ｎ　：　１９．３５　（１９，７１）。
ＨＮ　Ｍ　Ｒ（２５０Ｍ　Ｈｚ　−ＣＤ　ＣＩｓ　）　：８．７７　（ｓ、ＬＨ ，Ｈ−２＆　Ｈ−８）　；７．９９　（ｓ、、ＬＨ，Ｈ−２またはＨ−８）　； 　７．４５−７．２６　（ｍ、５Ｈ，Ｐｈ）　；　５．３］　（ｓ、２Ｈ，ＮＣ Ｈｇ））　：　４．９６（ｓ、２Ｈ，Ｐｈ　−ＣＨ，）　；　４．２７　（ｑ、 ２Ｈｊ　＝　７．１５Ｈｚ、Ｃ１５ＣＨＪ）および１　、３０　（ｔ　、　３　 Ｈ、Ｊ　＝　７　、１５　Ｈｚ　、　ＣＨｚ　Ｃ）ｊ　）　、”　ＣＮ　Ｍ　Ｒ −１５３、０９；　１４３　。
１１　；　６７．８４　、６２．５１　；　４４．２４および１４．０９゜ＦＡ Ｂ　−ＭＳ　＋　３５６　（ＭＨ＋）および３１２　（ＭＨ＋　−Ｃｏ、）。１ ２７周波数、ｃｍ−’　（強度）。３４２３（５２，１）　；　３１８２　（５ ２，８）　；　３１１５　（５２，４））　；　３０３１　（４７，９）　；　 ２９８１（３８，６）　；　１７４７　（１，１）　；　１６１７　（４，８） 、１５８７　（８，４）　；　１５５２　（２５゜２）　；　１５１１　（４５ ，２）　；　１４９２　（３７，９）　；　１６４５　（１４，０）および１４ １３ｙ−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニン Ｎ６−ペンジルオキジカルポニルー９−カルボキシメチルアデニンエチルエステ ル（３，２０ｇ　；　９．０１ｍｍｏｌ）をメタノール（５０ｍｌ）と混合し、 ０℃に冷却した。水酸化ナトリウム溶液（５０ｍｌ；２Ｎ）を加えたところ、こ の物質が急速に溶解した。０℃において３０分経過して、このアルカリ性溶液を 塩化メチレン（２ｘ　５０ｍ１）で洗浄し、０℃において４Ｎ−Ｉ（ＣＩでｐＨ １，０に調節したところ、表題化合物が沈殿した。ろ過し、水で洗浄しかつ乾燥 後の収率は、３゜０８ｇ　（１０４％）であった。この製品は塩を含有しており 、元素分析にこのことが反映されていた。元素分析、ＣＩｓＨ＋５ＮｓＯい実験 値（理論値）　Ｃ：４６．３２（５５，０５）　Ｈ：４．２４（４，００）；　 Ｎ：１８．１０（２１゜４０）およびＣ／Ｎ　：　２．５７　（２，５６）、’ Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、　ＤＭＳＯ−ｄａ）　：８．７０　（ｓＪＨ，Ｈ− ２＆　Ｈ−８）　；７．５０−７．３５　（ｍ、５Ｈ。
Ｐｈ）　；　５．２７　（ｓ、２Ｈ，ＮＣＨｔ）および５．１５　（ｓ、２Ｈ， Ｐｈ　ＣＨ））。”Ｃ−ＮＭＲ０１６８，７７、１５２，５４、１５１，３６、 １４８，７５、１４５，１３；　１２８゜５１　、１２８．１７　、１２７．９ ８　：　６６．６７および４４．６７゜１８５周波数、（ＫＢｒ）。
３４８４　（１８，３）　；　３１０９　（１５，９）　；　３０８７　（１５ ，０））　；　２９６６　（１７，１）　。
２９２７　（１９，９）；　２３８３　（５３，８）；　１９６０　（６２，７ ）、１７３９　（２，５）；　１６８８（５，２）；　１６５５　（０，９）； 　１５９４　（１１，７）；　１５６０　（１２，３）；　１５３０　（２６゜ ３）；　１４９９　（３０，５）；　１４７５　（１０，４）；　１４５５　（ １４，０）、１４２９　（２４゜５）および１４１１　（２３，６）。ＦＡＢ　 −ＭＳ　：　３２Ｂ　（ＭＨ＋）および２８４（ＭＨ＋　−Ｃ０ｔ）。ＨＰＬＣ （２１５％ｍ、２６０％ｍ）、溶媒系１　：　１５．１８分、マイナーな不純物 は全てで２％以下。
１２ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（１，４６ｇ　；　８．９３ｍｍｏｌ）およびＮ ６−ベンジルオキシカルボニル−９−カルボキシメチルアデニン８２．９２ｇ　 ；８．９３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ　（１５ｍｌ）に溶解した。塩化メチレン（１５ ｍｌ）（１５ｍｌ）で一度、塩化メチレン（２ｘ　１５ｍ１）で二環洗浄した。
２Ｈ，０ＣＨＩＣＨ３）；　３．６７　３．２９　（ｍ、４Ｈ，Ｃ１ｌ＊Ｃ１ｉ ＊）；　１．４２　（ｓ、９Ｈ。
ｔＢｕ）および１．２７　（ｔ、３Ｈ，ＯＣＨ，ＣＨ，）。スペクトルの結果、 痕跡量のエタノールおよびＤＣＵの存在が明となった。
エチルエステル（１，４８ｇ　；　２．６６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ　（１３ｍｌ） 中に懸濁させ、混合物を０℃に冷却した。水酸化リチウム（８ｍｌ；　ＩＮ）を 添加し、１５分間攪拌した後で反応混合物をろ過し、さらに水（２５ｍｌ）を添 加し、この溶液を塩化メチレン（２ｘ　２５ｍ１）で洗浄した。
この水溶液のｐＨを１．Ｎ　−ＨＣＩでｐＨ２，０に調節した。沈殿をろ過して 単離して、水で洗浄し、乾燥して、０．８２ｇ　（５８％）が得られた。水晶を 塩化メチレン／石油エーテルで二環再度沈殿させ、乾燥後０．７７ｇ　（５５％ ）が得られた。ｍ、ｐ、１１９℃（分解）。元素分析、Ｃｕ　Ｈａ　Ｎｔ　Ｏ− ・Ｈ，Ｏ１実験値（理論値）　Ｃ：　５６３．３２　（５２，８４）　Ｈ：５． ７１　（５，７３）　、Ｎ　：　１７．６Ｂ　（１７，９７）。ＦＡＢ　−ＭＳ ０５２８．５　（ＭＨ＋）、’Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、　ＤＭＳＯ−ｄ、） 　：　１２．７５　（ｖｅｒｙ　ｂ、ＩＨ。
ＣＯ，Ｈ）　；　１０．６５　（ｂ、ｓ、ＩＨ，ＺＮＨ）　；　８．５９　（ｄ 、ＬＨ，Ｊ　＝　２．１４Ｈｚ、ＡｄｅＨ−２）　；８．３１　（ｓ、ＩＨ，Ａ ｄｅ　Ｈ−８）　；７．４９−７．３１　（ｍ、５Ｈ，Ｐｈ）　；７．０３＆６ ．７５　（ｕｎｒｅｓｏｌｖ、ｔ、ＩＨ，ＢｏｃＮＨ）　；　５．３３　＆　５ ．１６　（ｓ。
２Ｈ，ＣＨ，Ｃ０Ｎ）　；　５．２２　（ｓ、２Ｈ，ＰｈＣ１ｊ２））　；　４ ．３４−３．９９　（ｓ、２Ｈ。
ＣＨｙＣＯｔＨ）　；　３．５４　３．０３　（ｍ’ｓ、水を含有、ｃ　Ｈ，Ｃ ＩＪｚ　）および１゜３９　＆　１．３７　（ｓ、９Ｈ，ｔＢｕ）、”Ｃ−ＮＭ Ｒ０１７０，４；　１６６．６　；　１５２゜３　、１５１．５　、１４９．５ 　、１４５．２　、１２８．５　、１２８．０　、１２７．９　；　６６．３２ 　；４７．６３　、４７．０３　、４３．８７および２８．２４゜を２０時間窒 素雰囲気下で激しく攪拌し、水（１５０ｍｌ）を添加し、ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ ＝）　：　ｄ　＝　４．８８ｐｐｍ　（ｓ、２Ｈ）　；　６．９５　（ｓ、２Ｈ ）　；８．１．０　（ｓ、ＬＨ）。
夾１ｔμ竪 ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリンナトリム（２， ０ｇ　；　８７．Ｏｍｍｏｌ）をベンジルアルコール（２０ｍｌ）に溶解し、１ ３０℃で２時間加熱した。０℃にまで冷却したあとで、２−アミノ−６−クロロ −９−カルボキシメチルプリン（４，０５ｇ　；１８、Ｏｍｍｏｌ）をＤ　Ｍ　 Ｆ　（８５ｍ　ｌ　）中に溶かした溶液をゆっくりと添加し、生じた懸濁液を２ ０℃において一夜攪拌した。水酸化ナトリウム溶液（ＩＮ、１００　ｍ　）を加 え５、透明な溶液を酢酸エチル（３ｘ　１００ｍ１）で洗浄した。水相を４Ｎ塩 酸でｐＨ３に酸性化した。沈殿物を酢酸エチル（２００ｍｌ）にとり、水相を酢 酸エチル（２ｘｌｏｏｍｌ）で抽出した。有機層を併せて、飽和塩化ナトリウム 液（２ｘ　７５ｍ１）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で蒸発転 用させた。残渣をエタノールから再結晶化させた。真空下での５ｉｃａｐｅｎｔ 上での乾燥後の収率：　２，７６ｇ　（５２％）。ｍ、ｐ、１５９−６５℃。元 素分析、実験値（理論値）Ｃ：（５６，１８；５５．９７）　Ｈ（４゜３８　＋ 　４．３２）、Ｎ　（２３，４；　２３．１０）、’Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ 、　ＤＭＳＯ−ｄ、）　：　４．８２ｐｐｍ　（ｓ、２Ｈ）　；　５．５１　（ ｓ、２Ｈ）　；　６．４５　（２，２Ｈ）　；　７゜４５　（ｍ、５Ｈ）　；　 ７．８２　（ｓ、ＩＨ）。
Ｋｌ硼旦 Ｎ−２−アミノ−６−ベンジルオキシ−プリン−９イル　−アセチル　−Ｎ−２ −Ｂｏｃ−アミノエチル　−　リシン　ＢｏｃＧａｅ二を上」Ｌムヱ：ユ ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリン（０，０５０ｇ 　；　１．６７ｍｍｏｌ）、メチル−Ｎ（２−［第三級−ブトキシ力ルポニルア ミノ］エチル）−グリシンエステル（０，６５ｇ　；　２．８０ｍｍｏｌ）、ジ イソプロピルエチルアミン（０，５４ｇ　；　４．１９ｍｍｏｌ）およびプロモ ートリス−ピロリジノ−ホスホニウム−へキサフロロホスフェート（ＰｙＢｒｏ Ｐ■）　（０，７９８ｇ　；　１．７１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ　（２ｍｌ）中で４ 時間攪拌した。透明な溶液を重炭酸ナトリウムの水冷液（３ｘ　４０　ｍｌ）に 注ぎ、酢酸エチル（３ｘ　４０ｍ１）で抽出した。有機相を硫酸水素カリウム溶 液（ＩＮ；２　ｘ　４０　ｍｌ）、重炭酸ナトリウム溶液（ＩＮ　；　１　ｘ　 ４０ｍ１）および飽和塩化ナトリウム溶液（６０ｍｌ）で洗浄した。無水硫酸ナ トリウムで乾燥し、真空下で蒸発したあとで、固形残渣を酢酸エチル／ヘキサン （２０ｍｌ　（２：　１））から再結晶化して、収率６３％でメチルエステルを 得た（ＭＳ−ＦＡＢ５１４　（Ｍ　＋１）。このエステルを濃水酸化ナトリウム 液（１ｍｌ）を含むエタノール／水（３０ｍｌ　（１：　２））に溶解すること によって加水分解を行った。２時間攪拌した後で、この溶液をろ過し、４Ｎ−塩 酸を酸化してｐＨ３に酸性化した。表題化合物を、ろ過して得た。
収率：　３７０ｍｇ　（加水分解に対して７２％）。ＨＰＬＣによる純度は、９ ９％以上であった。二級アミドの回転が制限されていたために、シグナルのいく つかは、２：１の比率で二重化した（リストにおいては、主要ピークについてｍ ｊ、でまた小さいピークはｍｉ、で表しである）。。’Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨ ｚＳＤＭＳＯ−ｄｓ）：ｄ＝１．４ｐｐｍ、（ｓ。
９Ｈ）　；　３．２　（ｍ、２Ｈ）　；　３．６　（ｍ、２Ｈ）　；　４．１　 （ｓ、ｍｊ、、Ｃ０ＮＲＣＨ，Ｃ００Ｈ）　；４．４　（ｓ、ｍｉ、、Ｃ０ＮＲ ＣＨ，Ｃ００Ｈ）　；　５．０　（ｓ、ｍｊ、、Ｇｕａ　−ＣＨ，ＣＯ−）　； ５．２　（ｓ、ｍｊ、、Ｇｕａ　−ＣＨ，ＣＯ）　；　５．６　（ｓ、２Ｈ）　 ；　６．５　（ｓ、２Ｈ）　；　６．９（ｍ、ｍｉ、、ＢｏｃＮＨ）；７．１　 （ｍ、ｍｊ、、ＢｏｃＮＨ）；７．５　（ｍ、、３Ｈ）；７゜８　（ｓ、ＩＨ） 　；　１２．８　（ｓ、ＩＨ）、”Ｃ−ＮＭＲ，１７０，９５；　１７０．５２ 　；　１６７゜２９　；　１６６．８５　、１６０．０３　、１５９．７８　、 １５５．８４　、１５４．８７　、１４０．６３　；１３６．７６　、１２８． ４９　、１２８．’１０　、１１３．０４　、７８．１９　、７７．８６　、６ ６．９５　。
４９．２２　、４７．７０　、４６．９４　、４５．９６　、４３．６２　、４ ３．３１および２８．２５゜火１」ド咀 ３−　Ｂｏｃ−アミノ−１２−プロパンジオール３−アミノ−１，２−プロパン ジオール（４０，００ｇ　；　０．４４０ｍｏｌ、１、Ｏｅｑ、）を水（１００ ０ｍ１．）に溶解し、０℃にまで冷却した。ジー三級−ブチル炭酸エステル（１ １５，０ｇ、　０．５２６ｍｏ、１，２ｅｑ、）を一度に加えた。この反応混合 物を攪拌しつつ水浴上で室温にまで加温した。ｐＨを水（１２０ｍ、ｌ）に溶か した水酸化ナトリウム（１７，５６ｇ１０．４４０ｍｏｌ、　１．Ｏｅｑ、）で １０．５に維持した。水酸化ナトリウム溶液を添加し終えたとき、反応混合物を 室温で一夜攪拌した。その後、酢酸エチル（７５０ｍ１．）を反応混合物に加え 、次に０℃に冷却した。ｐＨを激しく攪拌しつつ４Ｎ−硫酸で２．５に調節した 。二つの相を分離し、水相を別の酢酸エチル（６ｘ　３５０ｍ１）で洗浄した。
有機相の容量を減圧下で蒸発させて９００ｍ１にまで減少させた。
有機相を飽和硫酸水素カリウム溶液を二倍量に希釈したもの（１ｘ　１００１０ ０Ｏおよび飽和塩化ナトリウム溶液（１ｘ　５００ｍ１）で洗浄した。有機相を 乾燥させ（ＭｇＳＯ，）、減圧下で蒸発させて、表題化合物を５０．１２ｇ　（ ６０％）を得た。このものは、塩化メチレンから蒸発させ次いで凍結させて、固 化させることが出来た。’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１，／ＴＭＳ）　：　ｄ　＝　１ ．４３　（ｓ、９Ｈ，Ｍ、ｅＣ）、３　、２５　（ｍ　、　２　Ｈ、ＣＨ２）、 ３．５７　（ｍ、２Ｈ，ＣＨ，’）、３　、７３　（ｍ　、　Ｉ　Ｈ、Ｃ１４） 　、”　ＣＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤ　ＣＩｓ　／ＴＭＳ）：　ｄ　＝　２８．２　（Ｍ ｅｓＣ）、４２　、６　（ＣＨｓ　）、６３．５．７１．１　（ＣＨ，ＯＨ。
ＣＨＯＨ）、７９　、５　（Ｍ　ｅｓ　Ｃ）、１５７　（Ｃ＝　Ｏ）。
実施！μ団 ２−　ＢＯＣ−アミノ　エチル−Ｌ−アラニンメチルエステル３−　Ｂｏｃ−ア ミノ−１，２−プロパンジオール（２０，７６ｇ　；　Ｏ，１０９０ｍｏ１１０ ９Ｏ，）を水（１５０ｍｌ）に溶解した。ｍ−過ヨウ素酸カリウム（２４゜９７ ｇ；　０．１９０ｍｏｌ、ｌｅｑ、）を加え、反応混合物を窒素雰囲気中で室温 で２時間攪拌した。反応混合物をろ過し、水相をクロロホルム（６ｘ　２５０ｍ １）で抽出した。有機相を乾燥しくＭｇ５Ｏ，）、蒸発させると無色の油状物と してＢｏａ−アミノアセトアルデヒドが殆ど定量的な収率で得られ、このものを 精製することなく次の処理法に用いた。
パラジウム−カーボン（１０％、０．８ｇ）を窒素雰囲気中で冷却しく０℃）か つ激しく攪拌しつつＭｅＯＨ（２５０ｍｌ）に加え、無水酢酸ナトリウム（４， ４９ｇ　；　５４．７ｍｍｏｌ、　２ｅｑ、）およびＬ−アラニンメチルエステ ル塩酸塩（３，８２ｇ　；　２７．４ｍｍｏＬ　ｌｅｑ、）を加えた。
Ｂｏｃ−アミノアセトアルデヒド（４，７９ｇ　；　３０．１ｍｍｏｌ、　１． １ｅｑ、）をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）に溶かし、反応混合物に加えた。反応混合 物を常圧、常温で、水素吸収が止むまで水素添加した。反応混合物をセライトを 通してろ過させたが、セライトをさらにＭ　ｅ　ＯＨで洗浄した。このＭ　ｅ　 ＯＨを減圧下で除去し、残渣を水（１５０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを激しく攪拌し つつ０．５Ｎ−ＮａＯＨを滴下することによって８．０に調節した。水相を塩化 メチレン（４ｘ　２５０ｍ１）で抽出し、有機相を乾燥しくＭｇ５Ｏ）、セライ トでろ過し、減圧下で蒸発させて透明で、若干黄色の油状物として表題化合物が ６．３６ｇ　（９４％）得られた。ＭＳ　（ＦＡＢ−ＭＳ）：ｍ／ｚ　（％）＝ ２４７　（１００，Ｍ＋　１．１９１　（９０）、１４７　（１８）。’ＨＮＭ Ｒ（２５０ＭＨｚ、　ＣＤＣ１３）　：　１゜１８　（ｄ、Ｊ　＝　７．０Ｈｚ 、３Ｈ，Ｍｅ）、１．３６　（ｓ、９Ｈ，ＭｅｓＣ）、１．８９　（ｂ、ＬＨ。
Ｎ［（）、２．５１　（ｍ、ＩＨ，ＣＨ２）、２　、６６　（ｍ　、　Ｉ　Ｈ、 ＣＨ２）、３．１０　（ｍ、２Ｈ。
ＣＨ２）、３．２７　（、Ｊ　＝　７．０Ｈｚ、Ｈ（、ＣＨ）、３．６４　（ｓ 、３Ｈ，ＯＭｅ）、５゜０６　（ｂ、１１１．カルバメートＮ　Ｈ）。”Ｃ−Ｎ ＭＲｄ　＝　１８．８　（Ｍｅ）、２８．２　（Ｍｅ、Ｃ）、４０．Ｌ　４７． ０　（ＣＨ２）、５１．６１１ｅｏ）、５６．０　（ＣＨ）。
１５５．８　（カルバメートＣ＝０）、１７５．８　（エステルＣ＝０）。
火［■ Ｎ−＜Ｔ３ｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニルアセチル　−し一アラニ ンメチルエステル Ｂｏａ−アミノエチル−（Ｌ）−アラニンメチルエステル（１，２３ｇ。
５、Ｏｍｍｏｌ）をＤＭＦ　（ｌｏｍｌ）に溶かした溶液に、Ｄｈｂｔ　−ＯＨ （０゜／９０ｇ、５．５２ｍｍｏ１）および１−チミニル酢酸（１，０１ｇ、５ ．４８ｍｍｏｌ）を添加した。１−チミＮＹＬＳ空く酸が溶解した時に、クロロ メタン（１０ｍｌ）を加え、溶液を水浴で冷却した。この反応混合物が０に達し た時に、ＤＣＣ（１，２４ｇ、６０１ｍｍｏｌ）を加え、添加後５分でＤＣＵの 沈殿が認められた。二時間後に、ＴＬＣ分析の結果、反応が完結したのを確認し た。この混合物をろ過し、沈殿をジクロロメタン（１９９ｍｌ）で洗浄した。得 た溶液を５％重炭酸ナトリウム（１５０ｍｌ）で二環、また飽和硫酸水素カリウ ム液（２５ｍｌ）を水（１００ｍ）に溶かした液で二環洗浄した。飽和塩化ナト リウム液で最終的に抽出した後、溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させる と、白色発泡物を得た。この発泡物を、メタノール傾斜のジクロロメタンを溶出 溶媒として用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。これ によって、純品を得た（ＨＰＬＣで９９％以上）　（１，０８ｇ、５２．８％） 。ＦＡＢ　−ＭＳ　＊　４１３　（Ｍ　＋　１）および４３１（Ｍ＋１＋水）。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１，）　：　４．５２　（ｓ、２Ｈ，ＣＨ’ｔ）　；　３ ゜７３　（ｓ、３Ｈ，ＯＭｅ）　；　３．２−３．６　（ｍ、４Ｈ，エチルＣＩ （２８）、１．９０　（ｓ。
３Ｈ，ＴにおけるＭｅ）　；　１．４９　（ｄ、３Ｈ，ＡｌａにおけるＭｅ）　 ；　１．４４　（ｓ。
Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル　ＯＮ−１−チミニルアセチル　−し一アラニン 表題化合物のメチルエステル（２，０７ｇ、５．０２ｒｒ＋ｍｏｌ）をメタノー ル（１００ｍｌ）に溶解し、水浴で冷却し、２Ｎ水酸化ナトリウム（１００ｒｎ ｌ）を加えた。１０分間攪拌した後で、混合物のｐＨを４Ｍ−塩化水素で３に調 節した。その後この溶液を酢酸エチル（３ｘ　１００ｍ１）で抽出し、有機抽出 液を併せて、硫酸マグネシウムで乾燥した。蒸発後、得た発泡物を酢酸エチル（ ４００ｍｌ）と数ｍｌのメタノールに溶かして、この固形物を溶解した。石油エ ーテルを沈殿物が生成し始めるまで加え、−２０℃で一夜放置した後、沈殿物を ろ過して除いた。こうすることによって、純品を１．０１ｇ　（５０，５％）得 た（ＨＰＬＣで９９％以上）。この化合物を２−プロパツールから再結晶した。
ＦＡＢ−ＭＳ・３９９　（Ｍ　＋　１）。’Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄａ）　： １１．３５　（ｓ、ＩＨ，Ｃｏｏ）　；　７．４２　（ｓ、ＩＨ，Ｈ’、）　； 　４．６９　（ｓ、２Ｈ，ＣＨ’ｘ）　；１．８３　（ｓ、３Ｈ，ＴにおけるＭ ｅ）　；　１．５０−１．４０　（Ｍ、　１２ＨＳＡｌａ＋　ＢｏｃにおけるＭ 　ｅ　）。
火１」ドけ ａ　Ｎ　−Ｂｏａ−アミノエチル　−Ｎ−１−チミニルアセチルー〇−アラニン メチルエステル Ｂｏｃ−アミノエチルアラニンメチルエステル（２，４８ｇ　；　１０．１ｍｍ ｏｌ）をＤＭＦ　（２０ｍｌ）に溶かした溶液にＤｈｈｂｔ　−ＯＨ（１，８０ ｇ　；　１１゜Ｏｍｍｏｌ）およびチミニル酢酸（２，１４ｇ　；　１１．６ｍ ｍｏｌ）を添加した。１−チミニル酢酸が溶解した後で、塩化メチレン（２０ｍ ）　を加え、この溶液を水浴で冷却した。反応混合物が０℃に達した時に、ＤＣ Ｃ（２，８８ｇ　；　１４．Ｏｍｍｏｌ）を加えた。添加後５分でＤＣＵの沈殿 が認められた。３５分後に、水浴を取り除き、３．５時間後に反応混合物をろ過 し、沈殿を塩化メチレン（２００ｍｌ）で洗浄した。得た溶液を５％重炭酸ナト リウム液（２００ｍｌ）で二環、また飽和流酸水素カリウム水溶液（１，００ｍ １）で二環抽出し、飽和塩化ナトリウム液（２５０ｍｌ）で最終的に抽出した後 で、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させると油状物を得た。この油状物をメタ ノール傾斜の塩化メチレンを溶出溶媒として用いて、短いカラムシリカゲルクロ マトグラフィーで精製した。こうすることによって、石油エーテルで沈殿させた 後でＨＰ　Ｌ　Ｃによる純度が９６％の化合物が得られた（１．０５ｇ　；　２ ５．３％）。ＦＡＢ　−ＭＳ　＊　４１３　（Ｍ　＋　１）。。’Ｈ−ＮＭＲ（ ＣＤＣ１，）　：　５．６４　（ｔ、ＩＨ，ＢｏｃＮＨ，Ｊ　＝　５．８９Ｈｚ ）　；　４．５６　（ｄ。
２Ｈ，ＣＨ’、）　：　４．３５　（ｑ、１．Ｈ，ＣＨｍ、ＡｌａにおけるＣＨ ，Ｊ　＝　７．２５）　；３．７４　（ｓ、３Ｈ，ＯＭｅ）　；　３．６４−３ ．２７　（ｍ、４Ｈ，エチルのＨ’）　；　１．９０（ｓ、３Ｈ，ＴにおけるＭ ｅ）　；　１．５２−１．４４　（ｔ、１２Ｈ，ＡｌａにけるＢｏｃ＋Ｍｅ）。
ｂ　Ｎ−ＢＯＣ−アミノエチル）−Ｎ−１−チミニルアセチル表題化合物のメチ ルエステル（１，５７ｇ、３．８１ｍｍｏｌ）　ラメ９　／　−ル（１００ｍｌ ）に溶解し、水浴で冷却し、水酸化ナトリウム（１００ｍｌ　；２Ｍ）を加えた 。１０分間攪拌した後で、混合物のｐＨを４Ｍ−塩化水素で３に調節した。その 後この溶液を酢酸エチル（３ｘ　１００ｍ１）で抽出し、有機抽出液を併せて、 硫酸マグネシウムで乾燥した。蒸発後、得た油状物を酢酸エチル（２００ｍｌ） に溶かし、石油エーテルを沈殿物が生成し始めるまで加え、−２０℃で一夜放置 した後、沈殿物をろ過して除いた。こうすることによって、表題化合物を１．０ ２ｇ　（６７，３％）得たが、純度はＨＰＬＣで９９％以上であった。
ＦＡＢ　−ＭＳ　：　３９９　（Ｍ　＋　１）、’Ｈ−ＮＭＲ：１１．３４　（ ｓ、ＩＨ，Ｃ００Ｈ）　；７．４２　（ｓ、ＬＨ，Ｈ’−）　；　４．６９　（ ｓ、２Ｈ，ＣＨ’＊）　；　４．４０　（ｑ、ＩＨ，ＡｌａにおけるＣＨ，Ｊ＝ ７゜２０Ｈｚ）　；　１．８３　（ｓ、３Ｈ，ＴにおけるＭｅ）　；　１．５２ −１．４０　（ｍ、１２ＨＳＡｌａにおけるＢｏｃ　＋Ｍｅ）。
夾１」目Ａ Ｎ　−Ｎ’　−Ｂｏａ−３’−アミノエチル　−Ｎ−１−チミニルアセチル　グ ーシンメチルエステル Ｎ　（Ｎ’　−Ｂｏｃ−３°−アミノプロピル）グリシンメチルエステル（２， ８４ｇ　；　０．０１１５ｍｏｌ）をＤＭＦ　（３５ｍｌ）に溶解し、その後Ｄ ｈｂｔＯＨ（２，０７ｇ　；　０．０１２７ｍｏｌ）と１−チミニル酢酸（２， ３４ｇ　；０．０１２７ｍｏｌ）を加えた。塩化メチレン（３５ｍｌ）を加えて 、混合物を水浴で０℃に冷却した。ＤＣＣ（２，８５ｇ　：　０．０１３８ｍｏ ｌ）を加えし、更に追加量の塩化メチレン（１５０ｍｌ）を濾液に加えた。有機 相を重炭酸す）　ＩＪウム（飽和液を当量の水で希釈、６　ｘ　２５０ｍ１）で 抽出し、硫酸カリウム（飽和液を４倍量の水で希釈、３　ｘ　２５０ｍ１）固体 として得た（３．０５ｇ、６４％）。ｍ、ｐ、７６−７９℃（分解）。元素分析 ＣゆＨ，Ｎ、０．、実験値（理論値）　Ｃ：　５２．０３　（５２，４２）　Ｈ ：６．９０　（６，８４）　；　Ｎ　：　１３．２１　（１３，５８）。この化 合物は、満足すべき１Ｈおよび”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
０℃において２に調節した。本製品をろ過して白色結晶として単離し、水（３ｘ 　１０ｍ１）で洗浄し、真空下で５ｉｃａｐｅｎｔで乾燥した。
収率・２．１９　（７５％）。元素分析、Ｃ，、Ｈ，Ｎ、０．・Ｈ２Ｏ、実験値 （理論値’）　Ｃ：４９．９５　（４９，０３）　Ｈ：６．４７　（６，２９） 　；　Ｎ　：　１３．４３　（１３゜４５）。この化合物は、満足すべき’Ｈ− および”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
夾１」目ノ ３−（１−チミニル　−プロパン　メチルエステルチミン（１４，０ｇ　；　０ ．１１ｍｏｌ）をメタノールに懸濁させ、メタアクリル酸メチル（３９，６ｍｌ 　；　０．４４ｍｏｌ）を触媒量の水酸化ナトリウムとともに加えた。この溶液 を４５時間暗所で還流させ、真空下において蒸発乾個させ、残渣を加熱しつつメ タノール（８ｍｌ）に溶解させた。水浴で冷却した後、生成物をエーテル（２０ ｍｌ）を加えて沈殿させ、ろ過して単離し、エーテル（２０ｍｌ）で洗浄し、真 の化合物は、満足すべきＩＨ−および”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
夾１１目」 し、硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で蒸発乾個させると、表題化合物が白色 固体として得られた（０．６６ｇ　；　７１％）。ｍ、ｐ、１１８−１２１℃。
元素分析、Ｃ，Ｈ，。Ｎ、α、実験値（理論値）　Ｃ：　４８．３８　（４８゜ ４９）Ｈ・５．０９　（５，０９）　：　Ｎ　：　１３．９８　（１４，１４） 。この化合物は、満足すべき１Ｈ−および”Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示した。
０．００４１　ｍｏｌ）をＤＭＦ　（１２ｍｌ）に溶解し、その後ＤｈｂｔＯＨ （０，７３ｇ　；　０．００４５ｍｏｌ）と１−チミニルプロパン酸（０，８９ ｇ　；　０．００４５ｍｏｌ）を加えた。塩化メチレン（１２ｍｌ）を加えて、 混合物を水浴で０℃に冷却した。ＤＣＣ（１，０１ｇ　；　０．００４９ｍｏ＋ ）を加えた後、混合物を２時間０℃で攪拌し、その後室温で１時間攪拌した。沈 殿したＤＣＵをろ過して除去し、塩化メチレン（２５ｍｌ）で洗浄し、更に追加 量の塩化メチレン（５０ｍｌ）を濾液に加えた。有機相を重炭酸ナトリウム（飽 和液を当量の水で希釈、６　ｘ　１００ｍ１）で抽出し、硫酸カリウム（飽和液 を４倍量の水で希釈、３　ｘ　１００ｍ１）次いで飽和塩化ナトリウム（１ｘ　 １００ｍ１）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し真空下で蒸発乾個した。固体 の残渣を塩化メチレン（１５ｍｌ）に懸濁させて、１時間攪拌した。沈殿したＤ ＣＵは、ろ過して除去し、塩化メチレン（２５ｍｌ）で洗浄した。濾液を真空下 で蒸発乾個して、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで、メタノ−１２ ，７６（１３，１３）。この化合物は、満足すべきＨおよびＣ−ＮＭＲスペクト ルを示した。
プロパノイルコグリシンエチルエステル＜０．８３ｇ　；　０．００１９５ｍｏ １）ＷＯメタノール（２５ｍｌ）に溶解した。水酸化ナトリウム（２５ｍｌ　； ２Ｍ）を加え、この溶液を１時間攪拌した。メタノールを真空下で下で５ｊｃａ ｐｅｎｔの上で乾燥させた。収率：　０．７６９ｇ　（９９％）。ｍ。
ｐ、２１３℃（分解） 夾１１目玉 後、ｐＨを４Ｍ−塩酸で３．５に調節した。この溶液をろ過し、クロロホルム（ ３ｘ　２５０ｍ１）で抽出した。このｐＨを２Ｍ−水酸化ナトリウムで０℃にお いて１２に調節し、水溶液を塩化メチレン（３ｘ　３００ｍ１）で抽出した。飽 和塩化ナトリウム水溶液で（２５０ｍｌ）処理した後で、塩化メチレン溶液を硫 酸マグネシウム上で乾燥し、ろ過して、生じた溶液を真空下で蒸発乾個して、本 島（油状物）９４゜２２ｇが得られた。’Ｈ−ＮＭＲ：δ１．４４　（ｓ、９Ｈ ）　；　２．８７　（ｔ、２Ｈ）　；３．１　（ｑ、２Ｈ）　；　５．６２　（ ｓ、ｂｒｏａｄ）。
夾１ノ目１ Ｎ　−Ｂｏｃ　−３°−アミノエチル　−　−アラニンメチルエステ上塩量玉 モノーＢｏｃ−エチレンジアミン（２）　（１６，２８ｇ　；　０．１０２ｍｏ ｌ）をアセトニトリル（４４０ｍｌ）に溶解し、アクリル酸メチル（９１，５０ ｍ１　；１．０２ｍｏｌ）をアセトニトリル（２００ｍｌ）と−緒にこの混合物 に移した。この溶液を暗所で窒素雰囲気下で一夜還流して、アクリル酸メチルの 重合を回避した。真空下で蒸発乾個した後で、水とエーテルの混合物（２００＋ 　２００ｍ１）を加え、生じた溶液をろ過して、激しく攪拌した。水相をもう一 度エーテルで抽出し、次いで凍結乾燥して、黄色の固体を得た。酢酸エチルから 再結晶して、表題化合物を１３．０９ｇを得た。ｍ、ｐ、１３８−１４０℃。元 素分析ＣＩＩＨ＝ＩＮ、Ｏ，ＣＩ、実験値（理論値）　Ｃ：　４６．４９　（４ ６，７２）　Ｈ：　８．３８　（８゜２０）　；　Ｎ　：　９．８３　（９，９ １）　；　Ｃ１：　１２．４５　（１２，５４）、’Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯｄａ ）：δ１．３９ｓ、９Ｈ）　；　２．９　（ｍ、８Ｈ）　；　３．６４　（ｓ、 ３Ｈ）。
実施例４８ Ｎ−１−チミニル）アセチル　−Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−−アラニンメチ ルエステル （Ｎ　−Ｂｏｃ−アミノ−エチル）−β−アラニンメチルエステル・塩酸塩（３ ）　（２，０ｇ　；　０．００７１ｍｏｌ））および１−チミニル酢酸ペンタフ ルオロフェニルエステル（５）　（２，８２８ｇ　；　０．００８１２ｍｏｌ） をＤＭＦ　（５０ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（１，１２ｍ１　；　０ ．００８１２ｍｏｌ）を加え、混合物を一夜攪拌した。塩化メチレン（２００ｍ ｌ）を添加後、有機層を重炭酸ナトリウム水溶液（３ｘ　２５０ｍ１）、半飽和 流酸水素カリウム水溶液（３ｘ　２５０ｍ１）と飽和塩化ナトリウム水溶液（２ ５０ｍｌ）で抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過し、次いで真空下で蒸 発乾個すると、２．９ｇ　（９９％）の収量で生成物が得られた（油状物）。’ Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ　；　ＣＤＣｌ３　：二級アミドの周囲の回転が制限 されるため、信号のいくつかが二重化した。６１．４３　（ｓ、９Ｈ）　；　１ ．８８　（ｓ、３Ｈ）　；　２．６３　（ｔ、ＩＨ）　；　２．７４　（ｔ、Ｉ Ｈ）　；３．２５−３．５５　（４ｘｔ、８Ｈ）　；　３．６５　（２ｘｔ、２ Ｈ）　；　３．６６　（ｓＪ、５）　；　３゜７２　（ｓ、１．５）　；　４． ６１　（ｓ、ＩＨ）　；　５．７２　（ｓ、２Ｈ）　；　５．５９　（’ｓ、０ ．５Ｈ）　；５．９６　（ｓ、０．５Ｈ）　；　７．１１　（ｓ、ＩＨ）　；　 １０．３３　（ｓ、ＩＨ）。
夾１１目上 Ｎ−１−チミニル　アセチル　−Ｎ’　−Ｂｏｃ−アミノエチル二り二二二三上 Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］　−Ｎ’　−Ｂｏｃ−アミノエチル−β−ア ラニンメチルエステル（３，０ｇ　；　０．００７３ｍｏｌ）を２Ｍ−水酸化ナ トリウム（３０ｍｌ）に溶解し、ｐＨを４Ｍ−塩酸で０℃において２に調節し、 溶液を２時間攪拌した。沈殿をろ過して単離し、冷水で三度洗浄し、真空下にお いて５ｉｃａｐｅｎｔ上で乾燥した。収率、２．２３ｇ　（７７％）。ｍ、ｐ、 １７０−１７６℃。元素分析Ｃ，，Ｈ，Ｎ、　Ｏ，・Ｈ，Ｏ１実験値（理論値” ）　Ｃ：４９．４９（４９，０３）　Ｈ：６．３１（６，７８）；Ｎ　：　１３ ．８４　（１３，４５）　；　Ｃ１゜’Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−市）：６１．３ ８　（ｓ、９Ｈ）　；　１．７６　（ｓ、３Ｈ）　；　２．４４および３．２９ 　（ｍ、８Ｈ）　；　４．５５　（ｓ。
２Ｈ）　；　７．３　（ｓ、ＬＨ）　；　１１．２３　（ｓ、ＩＨ）。ＦＡＢ　 −ＭＳ　：　３９９　（Ｍ　＋爽直乱四 Ｎ−１−Ｎ’−Ｚ　−シトシル　アセチル　−Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−− アラニンメチルエステル（Ｎ　−Ｂｏｃ−アミノ−エチル）−β−アラニンメチ ルエステル・塩酸塩（３）　（２，０ｇ　；　０．００７１ｍｏｌ）および１− 　（Ｎ−４−Ｚ＞　−シトシル酢酸ペンタフルオロフェニルエステル（５）　（ ３，３１９ｇ　；　０゜００７１ｍｏｌ）をＤＭＦ　（５０ｍｌ）に溶解した。
トリエチルアミン（０゜９９ｍ１　；　０．００７１ｍｏｌ）　ｗｏ加え、混合 物を一夜攪拌した。塩化メチレン（２００，１）を添加した後で、有機層を重炭 酸ナトリウム水溶液（３ｘ　２５０ｍ１）、半艶和硫酸水素カリウム水溶液（３ ｘ　２５０ｍ１）および飽和塩化ナトリウム水溶液で抽出し、硫酸マグネシウム で乾燥した。ろ過して、真空下で蒸発乾個して、３．３６ｇの固体の化合物が得 られたが、このものをメタノールから再結晶した。収率：２．４２ｇ　（６４％ ）。ｍ、ｐ、１５８−１６１℃。元素分析Ｃ−Ｈ，ｓ　Ｎｓ　ｏｓ、実験値（理 論値）　Ｃ：５５．１９（５６，４９）　Ｈ：６．１９（６，２６）；　Ｎ：１ ２８６　（１３，１８）、’ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ　；　ＣＤＣｌ５）　：二 級アミドの周囲の回転が制限されるため、信号のいくつかが二重化した；δ１゜ ４３　（ｓ、９Ｈ）　；　２．５７　（ｔ、ＬＨ）　；　３．６０−３．２３　 （ｍ’ｓ、６Ｈ）　；　３．６０　（ｓ。
１．５Ｈ）　＋　３．６６　（ｓ、１．５Ｈ）　；　４．８０　（ｓ、ＩＨ）　 ；　４．８８　（ｓ、ＩＨ）　：　５．２０（ｓ、２Ｈ）；　７．８０−７．２ ５　（ｍ’ｓ、７Ｈ）。ＦＡＢ−ＭＳ　＋　５３２　（Ｍ＋　１）実１ノ日Ｕ Ｎ−１−Ｎ’−Ｚ　−シトシル　アセチル　−Ｎ’−Ｂｏｃ−アミノエチル−− アラニン Ｎ−［（１−（Ｎ”Ｚ）−シトシル）アセチル］　Ｎ’　−Ｂｏｃ−アミノエチ ル−β−アラニンメチルエステル（０，６２１ｇ　；　Ｏ，ＯＯ１２ｍｏｌ）を ２Ｍ−水酸化ナトリウム（８，５ｍ１）に溶解して２時間攪拌した。
その後に、ｐＨを４Ｍ−塩酸で０℃において２に調節し、この溶液を２時間攪拌 した。沈殿をろ過して単離して、冷水で三度洗浄し、真空下で５ｉｃａｐｅｎｔ 上で乾燥した。収率：　０．３２６ｇ　（５４％）。この白色固体を２−プロパ ツールから再結晶し、石油エーテルで洗浄した。ｍ、ｐ、１６３第（分解）。元 素分析Ｃ２，Ｈ，、Ｎ、Ｏ，、実験値（理論値）ＣＩ　４９．４９　（４９，０ ３）　Ｈ：　６．３１　（６，７８）　；　Ｎ　：　１３．８４　（１３，４５ ）。１Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ　；　ＣＤＣ１，）　：二級アミドの周囲の回 転が制限されるため、信号のいくつかが二重化した；δ１．４０　（ｓ、９Ｈ） 　；　２゜５７　（ｔ、ＩＨ）　；　２．６５　（ｔ、ＩＨ）　；　３．６０− ３．３２　（ｍ’ｓ、６Ｈ）　；　４．８５　（ｓ。
ＩＨ）：　４．９８　（ｓ、ＬＨ）　＋　５．２１　（ｓ、２Ｈ）　；　５．７ １　（ｓ、ＬＨ，ｂｒｏａｄ）　；　７゜９９−７．２５　（ｍ’ｓ、７Ｈ）。
ＦＡＢ　−ＭＳ　＋　５１８　（Ｍ　＋　１）夾１１巳４ グアニン　るＰＮＡ−才リゴマ−の （ａ　Ｈ−Ｔａｅ　−Ｇａｅ　−Ｔａｅ　−Ｌ　５−ＮＨの批丘１ 保護されたＰＮＡを、置換度がほぼ０１５であるＢｏｃ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ） で修飾したＭ　Ｂ　ＨＡ樹脂の上で構築した（定量的ニンヒドリン反応で測定） 。カップルしていないアミノ基のキャッピングは、ＢｏｃＢａｅｇ−Ｏ■（モノ マーを導入する前に初めて行った。
合成は、予備膨潤（Ｄ　ＣＭ中で一夜）させかつ中和したＢｏａ　−Ｌｙｓ（Ｃ ＩＺ）−ＭＢＨＡ樹脂１０２ｍｇ　（乾燥重量）において開始した。実施した工 程は以下の通りである　（１）　ＴＦＡ／ＣＨ２Ｃｌ２　（１：　１、Ｖ／Ｖ） によるＢｏｃ−脱保護、１Ｍ２分および１　ｘ　ｌ　／　２時間、３ｍｌ　；　 （２）１）　Ｃ％ｉによる洗浄、４ｘ２０秒、３ｍｌ；ＤＭＦによる洗浄、２Ｍ ２０秒、：３ｍｌ；ＤＣＭによる洗浄、２Ｍ２０秒、３ｍｌ、および３０秒間の ドレーン；　（３）　ＤＩＥＡ／ＤＣＭ　（１：　１９、ｖ　／　ｖ　）による 中和、２Ｍ３分、３ｍｌ；　（４）ＤＣＭによる洗浄、４ｘ２０秒、３ｍｌおよ び１分間のドレーン；（５）４当量のジイソプロピルカルボジイミド（０，０６ ｍｍｏｌ　；９．７　ｔｔ　］）および４当量（０，０６ｍｍｏｌ　；　２４ｍ ｇ）のＢｏｃＴａｅｇ　−ＯＨまたは（０，０６ｍｍｏｌ　；　３０ｍｇ）のＢ ｏｃＧａｅｇ　−ＯＨを０．６ｍｌのＤＣＭ／ＤＭＦ　（１：　１、Ｖ　／　Ｖ 　）に溶解して添加、このカップリング反応は、室温で振盪させなから１ｘ２時 間進行させた；（６）サクションを２０秒間適用した。（７）ＤＭＦによる洗浄 、２Ｍ２０秒及び１Ｍ２分、３ｍｌ　；　（８）Ｄ４ＥＡ／ＤＣＭ　（１：　１ ９、ｖ　／　ｖ　）による中和、２Ｍ３分、３ｍｌ；　（９）ＤＣＭによる洗浄 、４ｘ２０秒、３ｍｌおよび１分間のドレーン；　（１０）定性的Ｋａｉｓｅｒ 試験；　（１１）未反応アミノ基をＡｃ、０／ピリジン／ＤＣＭ（１：１：２、 ｖ　／　ｖ　）。ｌｘｌ／２時間、３ｍｌ　；および（１２）ＤＣＭによる洗浄 、４ｘ２０秒、２Ｍ２分；　２Ｍ２０秒。工程１−１２は、所望の配列が得られ るまで繰り返した。定性的Ｋａｉｓｅｒ試験は全て、マイナスであり（わら様の 黄色、ビーズには一切着色しない）、カップリング収率はほぼ１００％であるこ とを示していた。ＰＮＡ−オリゴマーを開裂させ、通常の方法で精製した。ＦＡ Ｂ−ＭＳ　：　２８３２．１１　［Ｍ　＊　＋　１］　（計算値２８３２．１５ ）。
叉１ノ己４ Ｈ−Ｔａｅ　−Ａａｅ　−Ｔａｅ　−Ｌ　５−ＮＨの　Δａ　Ｂｏｃ−Ｔａｅ　 −Ａ　Ｚ　ａｅ　−Ｔａｅ　−Ｌ　ｓ　ＣＩＺ　−性」シ穎１批主風 湿潤Ｂｏｃ−［Ｔａｅｇ］、−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨ樹脂はぼ０．３ｇ を３ｍｌの５ｐｐｓ反応容器に入れた。　Ｂｏｃ　−Ｔａｅｇ　−Ａ　（Ｚ）　 ａｅｇ　−［Ｔａｅｇｌｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂を、２５ｍ １の５０％ＤＭＦ／　ＣＨ２ＣＩ２中０．１５Ｍ−ＤＣＣと共に０．１９ＭのＢ ｏｃ　（Ａ）　（Ｚ）　ａｅｇ−ＯＨを用いたｉｎ　５ｉｔｕＤＣＣカツプリン グ（単一）および純ＣＨ。
Ｃ１，中において０．１５ＭのＢｏｃＴａｅｇ　−０Ｐｆｐとの単一カッブリン グによって組み立て・構築した（”合成実験記録５″）。この合成は、定量的ニ ンヒドリン反応によってモニターしたが、これによってＡ　（Ｚ）　ａｅｇの導 入率はほぼ５０％でありまたＴａｅｇの導入率はほぼ９６％であることが明らか になった。
（ｂ）Ｈ−Ｔａｅ　−Ａｅ　−Ｔａｅ　−Ｌ　５−ＮＨの扛圭グ皿亙 保護されたＢｏｃ−Ｔａｅｇ−Ａ　（Ｚ）　ａｅｇ　−［Ｔａｅｇｌｓ−Ｌｙｓ 　（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂を実施例４０ｃにおいて記載したように処理して、乾 燥Ｈ−Ｔａｅｇ−Ａ　（Ｚ）　ａｅｇ　−［Ｔａｅｇｌ５−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ） 　−ＢＨＡ樹脂５３．１ｍｇをＨＦ開裂すると粗製物質がほぼ１５．６ｍｇが得 られた。
１４．４分における主ピークは、全吸光度の５０％以下を占めていた。
この粗製物０．５ｍｇを精製して、Ｈ−Ｔａｅｇ　−Ａａｅｇ　−［Ｔａｅｇｌ 。
−Ｌｙｓ　−ＮＨ，が０．１ｍｇ得られた。（ＭＨ＋）’について、計算ｍ／２ 値は、２８１６．１６でありかつ測定ｍ　／　ｚ値は２８１６．２８゜Ｃム　Ｉ ５ （１）　ＴＦＡ／ＣＨｔＣ１２（１：　１、ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、２ ．５ｍｌ。
Ｏｘ１分および１ｘ３０分；　（２）　ＣＨ，ＣＩ、による洗浄、２．５ｍｌ、 ６ｘ１分：（３）　ＤＩＥＡ／ＣＨ，Ｃ１，（１：　１９、ｖ　／　ｖ　）によ る中和、２．５ｍｌ、３ｘ２分；　（４）　ＣＨ，Ｃｌ、による洗浄、２．５ｍ ｌ、６ｘ１分、および１分間のトレー７；　（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試 料を取り出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定する 。（６）１゜２５ｍ１のＤＭＦに溶解した０、４７ｍｍｏｌ　（０，２５ｇ）の ＢｏｃＴａｅｇ　−ＯＨを添加し、次いで１．２５ｍ１のＣＨ，Ｃ１，に溶かし た０、４７ｍｍｏｌ　（Ｉｇ＞のＤＣＣまたは２．５ｍｌのＣＨ，ＣＩ、に溶か した０、３６ｍｍｏｌ　（０，２０ｇ）のＢｏｃＴａｅｇ　−０Ｐｆｐを添加す る。カップリング反応は、振盪しつつ全部で２０−２４時時間待させた；（７） ＤＭＦによる洗浄、２゜５ｍＬ　１ｘ２分；　（８）　ＣＨ２Ｃｌ、による洗浄 、２．５ｍｌ、　４ｘ１分；　（９）　ＤＩＥＡ／ＣＨ，ＣＩ、　（１：　１９ 、ｖ　／　ｖ　）による中和、２．５ｍｌ、２ｘ２分；　（１０）ＣＨ，Ｃ１， による洗浄、２．５ｍｌ、　６ｘ１分；　（１１）　２−５ｍｇの保＋Ｉ　ＰＮ Ａ樹脂試料を取り出し、よく乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、カップリ ング度を測定する。（１２）未反応アミノ基を無水酢酸／ピリジン／Ｃ１，ＣＩ 、　（］暑、２、ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）の混合物２５ｍ１用いて２時間アセチ ル化することによってブロックする（最後のサイクルを除＜）、および（１３） 　ＣＨ，ＣＩ、による洗浄、２．５ｍｌ、６ｘ１分；（１４）保護されたＰＮＡ −樹脂の２ｘ２−５ｍｇ試料を取り出し、ＤＩＥＡ／ＣＨ，Ｃ１，（１：　１９ 、ｖ／ｖ）による中和し、ＣＨ，Ｃ１，で洗浄してニンヒドリン分析を行った。
央ｍ Ｈ−Ｔａｅ　−Ａａｅ　−Ｔａｅ　−Ｌ　５−ＮＨの　ムａ　Ｂｏｃ　−Ｔａｅ 　−Ａ（Ｚ　ａｅ　−Ｔａｅ　−Ｌ　ｓ　ＣＩＺ−ＭＢＨＡ　の　・４ 湿潤ＢＯＣ−［Ｔａｅｇ］ｓ　−Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂はぼ０． ５ｇを５ｍｌの５ＰＰＳ反応容器に入れた。Ｂｏａ　−［Ｔａｅｇｌ２−　Ａ　 （Ｚ）　ａｅｇ−［Ｔａｅｇｌ−−Ｌｙｓ　（（ｊＺ）　−ＭＢＨＡ樹脂を、２ ｍｌの／　ＣＨａ　ＣＩｇ中の当量のＤＣＣと共に０．１５Ｍから０．２０Ｍの 保護されたＰＮＡモノマー（遊離酸）を用いたＡ　（Ｚ）　ａｅｇとＴａｅｇ残 基とのｉｎ　５ｉｔｕＤＣＣカツプリングを行うことによって組み立て・構築し た（”合成実験記録６″）。この合成は、定量的ニンヒドリン反応によってモニ ターしたが、これによってミロのカップリングを行った後でＡ　（Ｚ）ａｅｇの 導入率はほぼ８２％であり（−回目のカップリングでは、導入率はほぼ５０％で あった：５０％Ｄ　Ｍ　Ｆ　／　ＣＨ，ＣＩ、中での四回目のＨＯＢｔ仲介カッ プリングでは、全カップリング収率は有意には増大しなかった）またＴａｅｇ残 基の導入率は定量的であることが明らかになった。
ｂ　Ｈ−Ｔａｅ　−Ａｅ　−Ｔａｅ　−Ｌ　５−ＮＨの亘ｌユロ」定 保護されたＢｏｃ　−［Ｔａｅｇ］ｇ　−Ａ　（Ｚ）　ａｅｇ　−［Ｔａｅｇｌ 、　−Ｌｙｓ（ＣＩＺ）　−ＢＨＡ樹脂を実施例４０ｃにおいて記載したように 処理して、乾燥Ｈ−［Ｔａｅｇ］＊−Ａ　（Ｚ）　ａｅｇ　−［Ｔａｅｇ］ｅ− Ｌｙｓ　（ＣＩＺ）−ＢＨＡ樹脂１０２．５ｍｇをＨＦ開裂すると粗製物質がほ ぼ１６．２ｍｇが得られた。この粗製物の一部を精製した。（ＭＨ＋）”につい て、計算ｍ／ｚ値は、２０５０．８５でありかつ測定ｍ　／　ｚ値は２０５０． ９０であった。
Ｃム　言６ （１）　ＴＦＡ／ＣＨ，ＣＩ２　（１：　ｌ、ｖ／ｖ）によるＢｏｃ−脱保護、 ２ｍｌ、３ｘ１分およびｌ’ｘ　３０分；　（２）　ＣＨ２ｃｌｆｆによる洗浄 、２ｍｌ、　ｅｘ１分；（３）　ＤＩＥＡ／ＣＨ，Ｃｌ２（１：　１９、ｖ／ｖ ）による中和、２ｍｌ、３ｘ２分；（４）　ＣＨ，ＣＩ２による洗浄、２．５ｍ ｌ、Ｏｘ１分、および１分間のドレーン：　（５）２−５ｍｇのＰＮＡ−樹脂試 料を取り出し、完全に乾燥してニンヒドリン定量分析に供して置換度を測定する ；　（６）　１．５ｍｌのＣＨ，Ｃ１，に溶解した０、４４ｍｍｏｌ　（０，２ ３ｇ）のＢｏｃＡ　（Ｚ）　ａｅｇ　−ＯＨを添加し、次いで０．５ｍｌのＣＨ ，Ｃｔｔに溶かした０、４７ｍｍｏｌ　（Ｉｇ）のＤＣＣまたは１．５ｍｌのＣ Ｈ，Ｃ１，に溶かした０、３３ｍｍｏｌ　（０，１３ｇ）のＢｏｃＴａｅｇ　− ＯＨを添加する；カップリング反応は、振盪しつつ全部で２０−２４時時間待さ せた＋（７）ＤＭＦによる洗浄、２ｍｌ、１ｘ２分；　（８）　ＣＨ，Ｃ１，に よる洗浄、２ｍｌ、Ｊｘ１分；　（９）　ＤＩＥＡ／ＣＨ，ＣＩ！（１：　１９ 、ｖ　／　ｖ　）による中和、２ｍｌ、２ｘ２分；　（１０）　ＣＨ，ＣＩ、に よる洗浄、２ｍｌ、６ｘ１分、　（１１）　２−５ｍｇの保護ＰＮＡ樹脂試料を 取り出し、よく乾燥してニンヒドリン定量分析に供して、カップリング度を測定 する；　（１２）未反応アミン基を無水酢酸／ピリジン／ＣＨ，Ｃ１，（１：　 １　：　２、ｖ　／　ｖ　／　ｖ　）の混合物２５ｍ１用いて２時間アセチル化 することによってブロックする（最後のサイクルを除り）：（１３）　ＣＨ，Ｃ Ｉ、による洗浄、２ｍｌ、６ｘ１分：および（１４）保護されたＰＮＡ−樹脂の ２ｘ２−５ｍｇ試料を取り出し、ＤＩＥＡ／ＣＨ，Ｃ１，（１：１９、ｖ　／　 ｖ　）による中和し、ＣＨ，Ｃ１，で洗浄してニンヒドリン分析を行った。
夾１ノロ浸 ”ゼロ塩基”置換の試料。
即ち、Ｌ＝Ｈ Ｈ−Ｔ、　（Ａｃ）　Ｔ＋ｔ　−ＬｙｓＮＨ２（ｄＡ）＋。　４９℃ＨＴ＝　（ Ａｃ）　Ｔｓ　ＬｙｓＮＨ，（ｄＡ）−（ｄＧ）　（ｄＡ）ｓ　３７℃Ｈ−Ｔ、 （Ａｃ）Ｔ、−ＬｙｓＮＨｔ　（ｄＡ）−（ｄＣ）（ｄＡ）ｓ　４１℃Ｈ−Ｔ、 　（Ａｃ）　Ｔｓ　−ＬＹＳＮＨ２（ｄＡ）４（ｄＴ）（ｄＡ）、４１℃ＨＴ＝ 　（Ａｃ）Ｔｓ　ＬｙｓＮＨ２（ｄＡ）ｉ　（ｄＧ）（ｄＡ）４３６℃Ｈ−Ｔ、 （Ａｃ）Ｔｏ−ＬｙｓＮＨｔ　（ｄＡ）、（ｄＣ）（ｄＡ）、４０℃ＨＩ４（Ａ ｃ）Ｔａ　ＬｙｓＮＨ２（ｄＡ）ａ　（ｄＴ）（ｄＡ）４４０℃即ち、Ｈ−Ｔｌ ｏ　−ＬｙｓＮＨ，と比べて、一つのチミンリガンドをＨで置換すると、Ｉ６が ７３℃から４８℃まで低下することが判る。また単一塩基ミスマツチを導入する 効果も示しである。
ＰＮＡオリゴマーのいくつかの生化学的／生物学的性質を、以下の実験によって 説明する。
のＢａｍＨＩ、　５ａｌｌまたはＰＳＴＩにクローンした認識配列ん。、Ａ、Ｇ 　Ａ。
三つのＰＮＡは、以下の相対的な効率でそれぞれの認識配列に結合することが判 った：　ＰＮＡ　Ｔ＋ｏ　：ん。＞ＡｎＧ＞んＧ２、ＰＮＡ　−Ｔ、Ｃ：Ａ、Ｇ 　＞　Ａ、。＞　Ａｓ　Ｇｚ、Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｔｓ　Ｑ　：　Ａｓ　Ｇ２≧Ａ＊Ｇ ＞ん。。即ち、３７℃において、１０につきｌのミスマツチがあると、効率が減 少しく５−１０倍と推定）、他方では二つのミスマツチは受け入れられない。
２、ＰＮＡｓＴ　Ｔ　ＣＴ　Ｃのハイブリ　イゼーシ　ンに　ｄｓ　−ＤＮＡか らの　−　ＤＮＡの　２０　−　６３３、ＰＮＡ　−Ｔ　−ｄｓＤＮＡの　ム　 ノ　の貼ユｍ■ 複合体形成は、ＰＮＡと”Ｐ　−ｅｎｄ標識ｄｓＤＮＡフラグメントを混合した 後個となる時点でＳ、−ヌクレアーゼによってプローブした（第２１図）。
４、ＰＮＡ　−ｄｓＤＮＡΔの。
ＰＮＡ−Ｔ、、と”Ｐ　−ＤＳＤＮＡ　（ＡＩ。／　Ｔ＋。）標識との複合体を 形成させた（６０分、３７℃）。これらの複合体は、過剰のオリゴ−ｄん。の存 在下所望の温度において培養し、室温に冷却しＫ　Ｍ　ｎ　０４でプローブした 。その結果（第２２図）、ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体の熱安定性はＰＮＡオリゴ ヌクレオチド複合体の熱安定性を”Ｔ、、′とういう点で反映していることが判 る。
５、ＰＮＡによる　の　６４２３ プラスミド構成、ｐＴＩＯは、ｐＵｃ１９中のＢａｍＨＩ部位にクローンしたｄ Ａ、。／ｄＴ、。ｔｒａｃｔを含有している。即ち、ＢａｍＨＩおよびＰｖｕｌ ＴによるＰＴＩＯの開裂を行うと、２１１とｌ１ｌｂｐなる二つの小さいＤＮＡ フラグメントが生じる。ＰＮＡ　−Ｔ、。の存在下では、３３６ｂｐフラグメン トが得られるが、これはＰｖｕｌｌのみに因る開裂に相当する（第２３図）。即 ち、ＢあＭｌｌによる開裂は、制限酵素部位に近接して結合したＰＮＡによって 抑制される。このような結果も、ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体を１００％収率で形 成させることが出来ることを示している。
６、”Ｉ−、したＰＮＡのオリゴヌクレチドへの　八６３１に■Ｌ Ｔｙｒ　−ＰＮＡ　−Ｔ、。−Ｌｙｓ　−ＮＨｙをＮａ’町およびタロラミン− Ｔを用いで町で標識し、ＨＰＬＣで精製した。この”Ｉ　−ＰＮＡ　−Ｔ、。
は、ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによってオリゴニｄＡ、。
に結合することが判った。このような結合は、過剰の変成した子牛胸腺ＤＮＡに よって拮抗させることが出来た。
上記（１）項に戻って論じると、ｄｓＤＮＡの配列特異的認識は、１０のチミン 置換２−アミノエチルグリシル単位から成るＰＮＡ−そのＣ−終末はりシンアミ ドでありまたＮ−終末は複合９−アミノアクリジンリガンド（９−Ａｃｒ’　（ ｔａｅｇ）＋ｏ　Ｌｙｓ　ＮＨｉ、第１１ａおよびｌｌｂ図）である−がｄＡ＋ 。／ｄＴ、。標的配列に結合することよりて説明される。この標的は、２４８　 ｂｐ”Ｐ−ｅｎｄ（末端）−標識ＤＮＡ−フラグメントに含まれる。
１）この９−Ａｃｒ’は（第５図）、照射時のＤＮＡの開裂を確実にするため４ −ニトロベンズアミドを付しており、その結合部位に極めて近接してＤＮＡを開 裂させることが予期されるに過ぎない。上記２４８　ｂｐ　ＤＮＡフラグメント とともにＰＮＡを照射すると、ｄＡ、。
／　ｄ　Ｔ、、配列における選択的開裂が認められる（第３ａ図）。
２）所謂ホトフットプリンティング検定において、合成ジアゾ結合アクリジンは 紫外線照射下において、ＤＮＡと相互作用した場合にＤＮＡを開裂させる（但し 、ＤＮＡが前記結合性物質で保護されている場合は除く）。
このような実験は、上記した２４８ｂｐｄｓＤＮＡを用いて行ったが、その結果 ＰＮＡ結合部位の光開裂に対する保護が明らかとなった（第３ｂ図）。
３）様様な種類の実験において、ＤＮＡ−開裂性酵素であるＭｉｃｒｏｃｏｃｃ ｕｓヌクレアーゼは、矢張り大抵のＤＮＡ−結合性試薬によってその作用が阻害 されるが、Ｔ１゜−標識における開裂を増大させた（第３ｃ図）。
４）また別の種類の実験におい手、−重鎖チミンリガンドは（二本鎖チミンリガ ンドとは異なりｔｅ）過マンガン酸カリウムによる酸化を極めて受け易いのであ るが、この性質を利用した。この試薬の存在下で２４８ｂｐを酸化したところ、 標的のＴｌ０−鎖の酸化のみが起こることが判った（第３ｂ図）。
５）同種の証明実験において、Ｓ１ヌクレアーゼが持つ一本鎖特異性によって、 標的のＴ、。−鎖のみが攻撃されたことが判った（第３ｄ図）。
（Ｔａｅｇ）＋ｏ、（Ｔａｅｇ）＋ｏ　Ｌｙｓ　ＮＨｇおよびＡｃｒ’　−（ｔ ａｅｇ）、、　−Ｌｙｓ　−ＮＨ２（第５図）が相当するｄん。に極めて効率よ く結合することは、以下の二つの方法で説明・証明された：１、以下の実施例５ ６　におい手示す様に、ＰＮＡ−オリゴヌクレオチット複合体は、ポリアクリル アミドゲル中での電気泳動を行うと一木調オリゴヌクレオチソドよりも泳動速度 が遅いはずである。
従って、このような実験は、Ａｃｒ’　−（Ｔａｅｇ）＋。−Ｌｙｓ−ＮＨ，お よび”Ｐ　−ｅｎｄで標識したｄＴ、。につぃて行った。この結果、通常のｄＡ 、。
、／　ｄ　Ｔｏｏ二重らせんが安定である条件においてはまたこのような二重ら せんが不安定である（変成性ゲル）条件下においても泳動が　−遅延することが 判った。対照実験を、Ａｃｒ’　−（ｔａｅｇ）＋ｏ　−１，ｙｓ−ＮＨ，と” Ｐ　−ｅｎｄで標識したｄＴ、。との混合物で行ったが、その結果上記した条件 下では全く遅延しないことが判った。
２、一本鎖ＤＮＡからＤＮＡ二重らせん（ｄｓＤＮＡ）を形成させると、吸光度 係数は減少する（淡色効果）。即ち、ＤＮＡの変性は、吸光率の変化をたとえば 、二重らせんの５０％が消失して一本鎖を生じる温度であるＴ、を函数として測 定することにｙｏって追跡することができる。
二重らせんは、−木調オリゴデオキシリプヌクレオチドと以下に列挙するＰＮＡ 類とから形成した。典型的には、Ｔ−リッチ鎖の０．３０Ｄカを１当量の他の鎖 と、９０”Ｃにおいて５分間加熱し、次いで室温にまで冷却することにょハイブ リダイゼーションさせ、次いで３０分間保持し、最後に５℃の冷蔵庫に少なくと も３０分間保存した。使用した緩衝液は全て、りん酸が１０ｍＭかっＥＤＴＡが １ｍＫであった。低塩緩衝液は塩化ナトリウムを一切含有しておらず、一方中塩 緩衝液は、１４０ｍＭのＮａＣ１を含有しまた高温緩衝液は５００ｍＭのＮａＣ ｌを含有していた。これら緩衝液の全ては、ｐＨが７．２であった。ハイブリッ ドの融点は、Ｇ１１ｆｏｒｄ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ装置で測定した。以下に記載す る吸光度係数を用いた：通常のオリゴヌクレオチットおよびＰＮＡの双方とも、 Ａ　：　１５．４ｍｌ／　μｍｏｌ　−ｃｍ　；　Ｔ　：８．８　、　Ｇ　：　 １１．７およびＣ７，３とした。融解曲線を０．５℃／分刻みで記録した。Ｔ、 は、Ａヶと温度との曲線の一次微分係数も最大値からめた。
オリゴデオキシリボヌクレオチド　のリスト；１．５’　−ＡＡＡ　−ＡＡＡ　 −ＡＡ２．５°−ＡＡＡ−ＡＡＡ−ＡＡＡ−Ａ３．５°−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ Ｔ−Ｔ４．５’　−ＡＡＡ　−ＡＡＧ　−ＡＡＡ　−Ａ５．５°−ＡＡＧ−ＡＡ Ｇ−ＡＡＡ−Ａ６．５’　−ＡＡＡ　−ＡＧＡ　−ＡＡＡ　−Ａ７．５°−ＡＡ Ａ−ＡＧＡ−ＡＧＡ−Ａ８．５’　−ＴＴＴ　−ＴＣＴ　−ＴＴＴ　−Ｔ９．５ ’　−ＴＴＴ−ＴＣＴ−ＴＣＴ−Ｔ１０．５’−ＴＴＴ　−ＴＴＣ−ＴＴＴ　− Ｔ１１．５’　−ＴＴＴ　−ＴＴＣ−ＴＴＣ−Ｔ１２５°　−ＴＴＣ−ＴＴＣ− ＴＴＴ　−Ｔ１３．５°　−ＴＴＴ　−ＴＴＴ　−ＴＴＴ　−ＴＴＴ　−ＴＴＴ １４．５’　−ＡＡＡ　−ＡＡＡ−ＡＡＡ　−ＡＡＡ　−ＡＡＡＰＮＡ類のリス ト ａ、ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ２ｂ、ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴ− Ｌｙｓ−ＮＨ２ｃ、ＴＴＴ　ＴＴＣＴＴＴ　Ｔ　Ｌｙｓ　ＮＨ２ｄ、ＴＴＣＴＴ ＣＴＴＴ　Ｔ　Ｌｙｓ　ＮＨ２ｅ、Ａｃｒ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙ ｓ−ＮＨ。
ｆ、Ａｃ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ２０１ｉｏ／ＰＮＡ　ｔ １　＋　ｂ　５６．０　５１．５　５０．０２　＋　ａ　７３．０　７２．５　 ７３．０２　＋　ｃ　４１．５　＆　５２．０　＊２→ｅ　８４．５　８６．０ 　＝　９０２　＋　ｆ　７４ ４４−　ａ　６０．０　５９．０　６１．５４　＋　ｃ　７４．５　７２．０　 ７２．５１３　＋　１４　３９．０ 注記　＊、明確な融点が二つ認められるが、変性が終了する前に局所的な融解が 起こったこを示している。
ＲＮＡ−Ａ（ポリｒＡ）とＰＮＡ−Ｔ、、−Ｌｙｓ−ＮＨ２との間ツバイブリッ トは、測定出来ないほどの高温で融解する（〉９０℃）。しかし、特異的なハイ ブリダイゼーションは、ＲＮＡ−Ａ−但しＧｌＣおよびＵではない−と混合した 時のＡ！、が大幅に低下することによって証明される。実験は、ＰＮＡ溶液溶液 １占ｌＮＡ溶液１ｍ１−何れもＡカニ０．６−とを混合し、次いで２６０ｎｍに おける吸光度を測定することによって行う。その後、試料を９０℃に５分間加熱 し、室温にまで冷却し、この温度に３０分間保持子、最後に５℃において３０分 間保存する。
混合前　混合後　混合及び加熱 ＲＮＡ　ＰＮＡ　の　の　の ＲＮＡ−Ａ　ＰＮＡ−Ｔ、、−Ｌｙｓ−ＮＩｉｓ　Ｏ，６０００，３８９０，３ ６０ＲＮＡ−Ｕ　ＰＮＡ−Ｔ、、−Ｌｙｓ−ＮＨｓ　Ｏ，６０００，５３８０， ５２８ＲＮＡ−Ｇ　ＰＮＡ−Ｔ、、−Ｌｙｓ−ＮＨＪＯ，６０００，５１４０， ５１７ＲＮＡ−ＣＰＮＡ−Ｔ、、−Ｌｙｓ−ＮＨｓ　Ｏ，６０００，５４００， ５３２上記の測定値から、以下の結論を下すことが出来る。融解曲線が認められ るので、塩基スタッキングがある。ＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの方が、通常の ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりも安定性が高く、而もＰＮＡ−ＲＮＡはさらに これよりも安定である。ミスマツチによって、誤対合した塩基がＤＮＡ鎖にある かまたはＰＮＡ鎖にあるかに拘らず、Ｔ□が大幅に低下する。このＴ１値は、通 常のオリゴヌクレオチドとは異なりイオン強度にわずかしか依存していない。
犬１１ｇ」 Ａｃｒ’　−Ｔａｅ　−Ｌ　５−ＮＨのｄＡ　ＩＯへの　ム　ｌｌａ胆 Ａｃｒ’　−（Ｔａｅｇ）＋ｏ　−Ｌｙｓ　（１００ｎｇ）を２０μＩのＴＥ緩 衝液（１０ｍＭトリスＨＣＩ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）中において５０ｃ ｐｓの５°−［”Ｐ］−ｅｎｄ−で標識したオリゴヌクレオチットと一緒に室温 で工５分間培養した。試料を氷で冷却しく１５分間）、ポリアクリルアミド中で のゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で分析した。試料の１０μｌに、２μｍの５０％ のグリセリン、５　μｌのＴＢＥ　（ＴＢＥ＝９０ｍＭ　トリス硼酸塩、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）を加え、試料を４℃においてＴＢＥ緩衝液中でのＰＡＧ Ｅ　（１５％アクリルアミド、０．５％ビスアクリルアミド）によって分析した 。この試料１０μｌを凍結乾燥して、１０μｌの８０％ホルムアミド、ＩＴＢＥ に再度溶解し、９０℃に加熱（５分間）し、尿素／ＴＢＥ緩衝液中でのＰＡＧＥ 　（１５％アクリルアミド、０．５％ビスアクリルアミド）によって分析した。
［”Ｐ］−含有ＤＮＡバンドを増幅スクリーンおよび一８０℃において２時間露 光したアグファクリックス（Ａｇｆａ　Ｃｕｒｉｘ）　ＲＰＩＸ−線フィルムを 用いて、オートラジオグラフィーで可視化した。
オリゴヌクレオチットを、γ［”円−ＡＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　５０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とポリヌクレオチドキナーゼで標識したＢｉｏｓｅｒａｃｈ７ ５００ＤＮＡ合成装置で合成し、標準技法を用いてＰＡＧＥで精製した（Ｍａｎ ｉａｔｉｓら、（１９８５）：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ ｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
第１１ａ図および第１１ｂ図において、５゛−Ｐで標識したオリゴヌクレオチド １は、５′−ＧＡＳＴＣＣＡ、、Ｇであり、Ａｃｒ　−Ｔｌｏ　Ｌ　ｙ　５−Ｎ Ｈ，の不存在下（レーン１および４）または存在下（レーン２および５．２５ｐ ｍｏｌ　；レーン３および６．７５ｐｍｏｌ））で培養し、また５°−ＧＡＴＣ ＣＴ、、Ｇである”オリゴ−どの不存在化（レーン１から３まで）または存在化 （レーン４から６まで）で培養した。５′−Ｐで標識したオリゴ２は、同じＰＮ Ａの不存在下（レーン７）または存在下（レーン８．２５ｐｍｏｌ　；レーン９ ．７５ｐｍｏｌ）で培養し、上記において詳細に記載したようなＰＡＧＥで分析 した。
第１１ａ図に示した結果によれば、ＰＮＡでハイブリダイゼーションしたと同様 に（レーン１から３まで）ｓｓＤＮＡの遅延化が明らかであり、ＰＮＡが、標識 した相補オリゴヌクレオチド（レーン４から６まで）に対してＤＮＡオリゴヌク レオチドと競合・拮抗する能力を有していることが判る。ｄｓＤＮＡに起因する バンドの強度は、ＰＮＡ濃度を上げるに応じてより急速に増大し、泳動速度が遅 いＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを表すバンドで置換される。レーン７から９まで は、このＰＮＡは、相補的でないＴ、。オリゴＤＮＡには影響を及ぼさないこと を示す。
第１１ｂ図においては、ＤＮＡ変成条件で行ったものであるが、ＰＮＡ−ＤＮＡ 二重らせんが未変成のままである。
Ｋ１乱旺 ムの− プラスミドＤＮＡに含有されるｄん。０−ｄＴ、。標的配列を、標準的方法に従 い（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８６）　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｊ ＭＩＯ１株を用いて二つのオリゴヌクレオチド（ｄ　（ＧＡＴＣＣＡ＋ｏＧ）　 ＋　ｄ　（ＧＡＴＣＣＴ＋。
Ｇ）））をｐＵｃ１９のＢａｍＨＩ制限酵素部位にクローンすることによって構 成した。所望のプラスミド（ｐＴｌｏと称する）を得られたクローンの一つから 単離し、アルカリ性抽出法およびＣｓＣ１遠心分離法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１ ９８６）によって精製した。ｄＡ、。／　ｄ　Ｔ、、標的配列を含む２４８ｂｐ の３°　［”Ｐ］　−ｅｎｄ　（末端）で標識したＤＮＡフラグメントを、この ｐＴｌｏＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕｌｌで開裂し、次にＥ、ｃｏ ｌｉＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のＫｌｅ ｎｏｗフラグメントを用いてこの開裂したＤＮＡをα［”Ｐ］　−ｄＡＴＰ　（ ４０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）で標識し、２４８ｂｐＤＮＡフ ラグメントをＰＡＥＧ　（１５％アクリルアミド、０．５％ビスアクリルアミド 、ＴＢＥ緩衝液）によって精製して得た。このＤＮＡフラグメントは、ＥｃｏＲ Ｉで開裂したｐＴｉｏプラスミドをバクテリア性アルカリ性ホスファターゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理し、このプラスミドＤＮＡを低 融点アガロースでのゲル電気泳動法で精製し、次いでγ［Ｐ］　ＡＴＰとポリヌ クレオチドキナーゼで標識することによりて、５°−ｅｎｄにおける［”Ｐ］標 識を付して得た。
Ｐｖｕｌｌで処理した後、２４８ｐｂＤＮＡを上記のように精製した。
Ａｃｒ’　−（Ｔａｅｇ）＋ｏ　Ｌｙｓ　ＮＨｔと２４８ｂｐＤＮＡフラグメン トとの複合体を、Ａｃｒ’　−（Ｔａｅｇ）＋。　Ｌ　ｙ　ｓ　Ｎ　Ｈｚ　５０ 　ｎ　ｇを５００ｃｐｓのＰ−標識した２４８　ｂｐフラグメントと０．５μ− ｇの子牛胸腺ＤＮＡとともに、下記においてさらに詳細に述べるように、１００ μｍの２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭＭｇＣ１ｇ、０．１ｍＭＣａＣ１，、 ｐＨ７，４中において３７℃において６０分間培養することによって形成させた 。
火１九Ｉ ｐ　いた　Δ　のプロービン （ａ）スタフィロコッカスヌクレアーゼ（第１２ｂ　レーン８から１０）。
鎖置換複合体を上記したように生成させた。この複合体を２０℃において５分間 ７５０　Ｕ／ｍｌのスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ヌク レアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理し、この反応をＥ ＤＴＡを２５ｍＭまで添加することによって停止させた。このＤＮＡを２容量の エタノール−２％酢酸カリウム−で沈殿させ、８０％ホルムアミド、ＴＨＥに再 溶解させ、９０℃に加熱しく５分間）、高分解ＰＡＧＥ　（１０％アクリルアミ ド、０．３％ビスアクリルアミド、７Ｍ尿素）とオートラジオグラフィーによっ て分析した。レーン８は、ＰＮＡを含有せず、レーン９は４０ｐｍｏｌまたレー ン１０は１２０μｍｏｌのＰＮＡを含有している。ＰＮＡが含有されているので 、フットプリントの生成が認められ、この結果スタフィロコッカスヌクレアーゼ によって消化を受け易くなることおよび従ってｄｓＤＮＡから５ｓＤＮＡの置換 が増大することが判る。
（ｂ）アフィニティー光開裂（第１２因子第１２ｂ図；何れの　合もレーン１か ら３まで 複合体をＴＥ緩衝液中で生成させた。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れた試料に３０ ０μｍにおいて（Ｐｈｉｌｉｐｓ　ＴＬ）　２０Ｗ／１２蛍光灯、２４３Ｊｍ− ’／５）３０分間ＵＶ照射した。ＤＮＡは、上記したように沈殿させ、１Ｍピペ リジンに取り、９０℃にまで２０分間加熱した。凍結乾燥した後で、ＤＮＡは、 上記したＰＡＧＥによって分析した。もう一度、それぞれの場合において、レー ン１は、ＰＮＡは一切含有せず、レーン２および３は、それぞれ４０ｐｍｏｌと １２０μｍｏｌのＰＮＡを含有する。ＰＮＡに結合したＤＮＡ鎖（Ａ＋。鎖）は 、アクリジンエステルの位置において（第１２ａ図のレーンｌから３まで）開裂 して、新しいバンドを与えるが、またＰＮＡによって置換された鎖は（Ｔ、。鎮 ）ランダムに開裂子、フットプリントを与える。
（Ｃ）過マンガン酸カリウム（第１２Ｂ図レーン４から６まで）複合体を１００ μ、ＩのＴＥ中で生成させ、２０　ｍ　Ｍ　Ｋ　Ｍ　ｎ　Ｏ，を５μｍ添加した 。２０℃において１５秒経過後、１．５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７゜０．１Ｍ２ −メルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。ＤＮＡを沈殿させ、ピペ リジンで処理して、上記した様に分析した。レーン４から６までにおいては、レ ーン１から３までと同様のＰＮＡ濃度を用いた。かくして再び、過マンガン酸塩 により置換された５ｓＤＮＡの開裂を示すフットプリントの生成を認める。
（ｄ）光フットプリンティング（第１２ａ図レーン５から６まで）複合体を１０ ０μＩＴＥにおいて生成させ、ジアゾ−結合アクリジン（０，１１１ｇ／　ｔｔ 　Ｉ）　（ＤＨＡＳＮｉｅｌｓｅｎら（１９８８）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅ ｓ、１６．３８７７−８８）を添加した。試料を３６５μｍ　（Ｐｈｉｌｉｐｓ ＴＬ　２０Ｗ１０９Ｎ、　２２Ｊｍ−”／ｓ）で３０分間照射し、上記した様に 処理して、”アフィニティー光開裂”に供した。ＰＮＡの存在下において、（レ ーン６）このＤＮＡは、保護されておりかつ保護された領域において開裂に相当 するバンドは消滅する。
（ｅ）Ｓ、−ヌクレアーゼ（第１２ｃ図レーン１から３）複合体を５０ｍＭ酢酸 ナトリウム、２０ｍＭＮａｃｌ、０．５％グリセリン、１ｍＭＺｎＣＩａ、ｐＨ ４，５において生成させ、０．５０／ｍｌにおいてヌクレアーゼＳ、　（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で２０℃において５分間処理した。反応を 停止させ、さらに上記″スタフィロコッカスヌクレアーゼ項において記載した様 に処理した。使用したＰＮＡの量は、ゼロ（レーン１から３まで）または１２０ μｍｏｌ　（レーン４から６まで）であり、レーン７がサイズの標準を示す。か くして再び、ＰＮＡで置換されたＴ１゜ＤＮＡ鎮の開裂が認められる。
爽ｍ １　０　２　Ｈおよび　３　ミスマーチに・　ハイブリダイゼーシ　ンの ＰＮＡオリゴ７−　Ｈ−Ｔ４Ｃ２ＴＣＴＣ−ＬｙｓＮＨ，を合成実験記録６によ って製造し、逆相ＨＰＬＣによって精製し、ＦＡＢ−ｍａｓｓ分光分析法によっ て同定した；実験値（理論値）　：　２７４６．８　（２４４７゜１５）。この 配列を用いたハイブリダイゼーション実験によって、実際のところ非対照である ので、配向の問題が解決される。このような実験によって、Ｔ、の温度依存性や 生成した複合体の化学量論の問題も解決される。
ＰＮＡ−オリゴ７−Ｈ−Ｔ４Ｃ２ＴＣＴＣ−ＬｙｓＮＨｍを用いたハイブリダイ ゼーション実験を以下のように行った：′−ハイブリ・・ド／　の　ＨＴｍ９ １５°−（ｄＡ）、　（ｄｃ）ｙ　（ｄＡ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　 ７．２５５．５２　：　１２５゛〜（ｄＡ）、　（ｄＧ）ｌ　（ｄＡ）　（ｄＧ ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　９．０２６．０２　：　１３５’　−（ｄＡ）、　（ ｄＧ）、　（ｄＡ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　５．０８８．５２　：　 １４５’　−（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）ｙ　（ｄＡ） 、７．２３８．０２　：　１５５°−（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　（ｄＡ） 　（ｄＧ）ｊ　（ｄＡ）４９．０３１．５　−６５°−（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）、　（ｄＡ）、５．０５２．５　−６１．０ ７５°−（ｄＡ）、　（ｄＧ）（ｄＴ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄ Ｇ）　７，２３９．０　−８５°−（ｄＡ）、（ｄＧ）（ｄＴ）（ｄＡ）（ｄＧ ）（ｄＡ）（ｄＧ）９．０　＜２０−９５°−（ｄＡ）、　（ｄＧ）（ｄＴ）　 （ｄＡ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　５．０５＋、５−１０５’　−（ｄ Ａ）、（ｄＧ）（ｄＴ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　７．２３１．５−１ ＋５°−（ｄＡ）ｌ　（ｄＧ）＋　（ｄＴ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　 ５．０５０．５　−１２５’　−（ｄＧ）（ｄＡ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄ Ｔ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）、　７．２２４．５１３５’　−（ｄＧ）（ｄＡ）　 （ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＴ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）、　９．０　＜２０１４５ ’　−（ｄＧ）（ｄＡ）　（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＴ）　（ｄＧ）　（ｄＡ） 、　５．０５７．０１５５°−（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ）　（ｄＴ）　（ｄ Ｇ）、　（ｄＡ）、　７．２２５．０１６５’　−（ｄＧ）　（ｄＡ）　（ｄＧ ）　（ｄＴ）　（ｄＧ）、　（ｄＡ）、　５．０３９．５５２．０ ！Ｉ＝ＵＶ−混合曲線によって決定された化学量論−＝決定せず これらの結果から、真に混合された配列が明確な輪郭の融解曲線をもたらしたこ とが明らかとなった。ＰＮＡ−オリゴマーは実際に両方の配向において結合する ことが可能である（第１列と第４列を比較のこと）。尤もＮ−末端１５゛−配向 に対する優先性が認められる。ｔまたはＣに対向する単一ミスマツチを導入した 結果、ｐＨ７，２において１６℃以上もＴゆが低下することになった。ｐＨ５， ０においては、このＴヨ値は、２７℃以上も低下した。このことは、極めて高度 の配列選択性があることを示している。
上記したように、Ｔ１値には極めて強度のｐＨ依存性が認められ、Ｈｏｏｇｓｔ ｅｎの塩基対合がハイブリッドを形成する上で重要であることを示している。従 って、化学量論が２：１であることが判明したことは、驚くに当たらない。
配列に対称性がないことおよびミスマツチが存在した場合Ｔ、が極めて大きく低 下することは、相補的ＤＮＡに結合した場合Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ鎖および Ｈｏｏｇｓｔｅｎ鎖が平行することを示している。このことは、双方の配向・方 向、即ち５゛／Ｎ−末端および３’／Ｎ−末端についても当てはまるのである。
ｍ四 ハイブリダイゼーシ　ンにお番る　ｌ ＨＴ８ＧＴ４　ＬｙｓＮＨ，を用いたデオキシオリゴヌクレオチドに対するハイ ブリダイゼーション実験結果を以下に示す：デオキシオリゴヌクレオチド　Ｔ １５°−（ｄＡ）５　（ｄＡ）（ｄＡ）４−３°　５５．０２５°−（ｄＡ）５ 　（ｄＧ）（ｄＡ）４−３°　４７．０３　５’　−（ｄＡ）５　（ｄＣ）（ｄ Ａ）４−３°　５６．５４５°−（ｄＡ）　５　（ｄＴ）　（ｄＡ）　４−３’ 　４６．５５　５’　−（ｄＡ）　４　（ｄＧ）　（ｄＡ）　５−３’　４８． ５６　５’　−（ｄＡ）　４　（ｄＣ）　（ｄＡ）　５−３’　５５．５７　５ ’−（ｄＡ）　４　（ｄＴ）　（ｄＡ）　５−３’　４７．０第１．３および６ 列を第２．４．５および７列を比較すると明らかなように、Ｇは、このような態 様においてＤＮＡ−鎖におけるＣ／ＡとＧ／Ｔとを識別することが可能であり、 即ち配列識別が認められる。第３列における複合体は更には、ＵＶ−混合曲線か ら２ＰＮＡ　：ｌＤＮＡ複合体であることが決定された。
実ｍ された　いたハイブリダイゼーションにおする竺且ユ 延長された主鎖（β−アラニン修飾）を有する単一ユニットのＰＮＡ−オリゴマ ーに対するハイブリダイゼーションデータは、以下の通りである： 巳すＬ−一一一一一一一一一一一一因ソし一一一一一一一−ＬＨ−Ｔ、ｏ　−Ｌ ｙｓＮＨｚ　（ｄＡ）＋。　７３℃Ｈ−Ｔ４（ｄＴ）　Ｔｓ　ＬｙｓＮＨｔ　（ ｄＡ）＋。　５７℃Ｈ−Ｔ、（ｄＴ）Ｔ、−ＬｙｓＮＨｔ　（ｄＡ）ｓ　（ｄＧ ）（ｄＡ）ｓ　４７ｍｇ　−Ｔ、　（ｄＴ）Ｔｓ　ＬｙｓＮＨ−（ｄＡ）＝　（ ｄＣ）（ｄＡ）ｓ　４９℃Ｈ−Ｔ、（ｄＴ）Ｔｅ　ＬｙｓＮＨ，（ｄＡ）ｎ　（ ｄＴ）（ｄＡ）ｓ　４７℃融点が低下するにつれて、これらのデータから、塩基 特異的認識が保持されていることが明らかである。
Ｔｙｒ　ＰＮＡ　Ｔｌｏ　Ｌｙｓ　ＮＨ＊の５μｇを１００ｍＭりん酸ナトリウ ム、ｐＨ７，０の４０μｍ中に溶解し、１ｍＣ１のＮ　ａ”　Ｉと２μｍのクラ ミンーＴ　（ＣＨ，ＣＮ中５０　ｍ　Ｍ　）を添加する。この溶液を２０℃に１ ０分間放置し、次いで０．５　＋　５ｃｍのセファデックスＧＩＯカラムに通す 。放射能を含む最初の二つのフラクシヨン（それぞれ１００　ｔｔ　Ｉ）を集め 、ＨＰＬＣｒ精製する：即ち、１％のｃ４ＦＣＯＯＨ水溶液中０−６０％Ｃ礼Ｃ Ｎ勾配を用いた逆相Ｃ−１８である。１″Ｉ　−ＰＮＡは、ＰＮＡピークの直後 に溶出する。溶媒は減圧下で除去する。
夫五九録 二　ＤＮＡ　−Ａ　ＡＧ　ＡＧに・　るＰＮＡｓ　−Ｔ　Ｔ　ＣＴＣのム　２０ 表示したプラスミドの二本鎖、Ｐで標識したＥｃｏＲＩ　−ＰｖｕＩＩフラグメ ント（ＥｃｏＲ１部位の３°−末端で標識した大きいフラグメント）　２００ｃ ｐｓ、キャリアー子牛胸腺ＤＮＡ０．５　μｇおよび１ｏｏμｌ緩衝液（２００ ｍＭＮａＣ１，５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５，１ｍＭＺｎ５Ｏ，）中の 表示したＰＮＡ３００ｎｇから成る混合物を３７℃において１２０分間培養した 。ヌクレアーゼＳｌを５０単位を加え、２０℃において５分間培養した。０．５ ＭＥＤＴＡ３μＩを添加することによって反応を停止させ、エタノール中２％の 酢酸カリウム液２５０μｌを加えることによってＤＮＡを沈殿させた。このＤＮ Ａを１０％ポリアクリルアミド配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析し 、放射能標識したＤＮＡバンドをオートラジオグラフィーで可視化した。得られ た完全なバンドパターンから、鎖置換によって一本鎖ＤＮＡが生成していること が明らかとなっているが、このものは、ヌクレアーゼによって攻撃され、より短 鎖のオリゴヌクレオチドの混合物が得られる。それぞれの場合に使用した三種の ＰＮＡについて得られた結果を比較した結果、得られるそれぞれの標的に対する 選択性があることが明らかとなっている。
ｐＵｃ１９に適当なオリゴヌクレオチドをクローンすることによって標的プラス ミドを調製した。標的Ａ１゜：ＢａｍＨ１部位（ｐＴｌｏと称するプラスミド） にクローンしたオリゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＡ、。
Ｇ　＆　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＣＴｏｏ　Ｇ　０標的Ａｓ　Ｇ　Ａ４：　Ｓ　ａ　Ｉ　 １部位（プラスミドｐ７９Ｃ）にクローンしたオリゴヌクレオチドＴ　ＣＧ　Ａ 　ＣＴ４　ＣＴ３　Ｇ　＆　Ｔ　ＣＧ　Ａ　ＣＡｓＧΔ４Ｇ６標的Ａ４ＧＡ、Ｇ Ａ４　：　Ｐｓｔ１ｓ位（プラスミドｐＴ８Ｃ２）にクローンＩ、タオ’）ゴヌ クレオチドＧＡ２ＧＡ２ＧＡ、ＴＧＣＡ＆ＧＴ、ＣＴ２ＣＴ２ＣＴＧＣＡ。
ゲル中におけるこれらの標的の位置は、左方へのバーによって示される。Ａ／Ｇ は、標的ＰＩＯのへ十Ｇ配列ラダーである。
火ｌ九Ｂ １　、Ｆ’ノＰＮＡｊ、：ヨル２３ プラスミドｐＴＴ１０の２μｇを２０μｍのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ ＣＩ、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７，４）中のｐＮＡ　’Ｌｏの表示量と混合し、３ ７℃において１２０分間培養した。２μｌｘ濃縮緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ ＣＬ　ｐＨ７，５，１０ｍ　Ｍ　、　Ｍ　ｇ　Ｃ＋２．５０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　 ＣＩ、１　ｍ　Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　）およびＰｖｕｌＩ　（２単位）とＢａｍＨＩ 　（２単位）を添加し、培養を６０分間継続した。このＤＮＡを５％ポリアクリ ルアミド中でのゲル電気泳動法によって分析し、このＤＮＡを臭化エチジウム染 色法によって可視化した。
有意比率のＰＮＡの存在下では（０，２，０，６）、酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩの開 裂パターンは、変化せず、この酵素は開裂部位に添ってＰＮＡの存在によって抑 制阻害されることが判る。
支１九録 ＰＮＡ　−Ｔ　−ｄｓＤＮＡ盲　Δ　≦　の　螢　、、２１　・・ｐＴｌｏの二 本鎖、３２Ｐで標識したＥｃｏＲＩ　−ＰｖｕＩＩフラグメント（ＥｃｏＲ１部 位の３”−末端で標識した大きいフラグメント）　２００ｃｐｓ、キャリアー子 牛胸腺ＤＮＡ０．５　μｇおよび１００μｌ緩衝液（２００ｍＭＮａＣ１，５０ ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５，１ｍＭＺｎ５Ｏ４）中の表示したＰＮＡ−Ｔ 、、−ＬｙｓＮＨ２３００ｎｇから成る混合物を３７℃において１２０分間培養 した。表示した時間において、ヌクレアーゼＳ１を５０単位を７つの試料のそれ ぞれに加え、２０℃において５分間培養した。鎖置換によって生成した一本鎖Ｄ ＮＡをこのヌクレアーゼによって消化した。エタノール中２％の酢酸カリウム液 ２５０μｍを加えることによってＤＮＡを沈殿させ、１０％ポリアクリルアミド 配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析した。鎖置換複合体の量を、標的 配列におけるＳｌ−配列の強度をオートラジオグラフをデンシトメーターで走査 して測定し、これに基づいて任意の単位で算定した。時間の経過とともにこの複 合体の生成が認められる。
火１１目］ ＰＮＡ　−ｄｓＤＮＡ　Δ　の　２２ ２００ｃｐｓの″Ｐ−ｐＴｔｏフラグメント（実施例６５旧おけると同様のもの ）、子牛胸腺ＤＮＡ０．５μｇおよび３００μｇの所望のＰＮＡ（Ｔｌｏ　Ｌｙ ｓＮＨ２、Ｔ、−ＬＹＳＮＨ，またはＴ、−ＬＹＳＮＨ，）とから成る混合物を 、１００μの２００ｍＭＮａＣ１，５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４゜５、Ｉ　 ｍ　Ｍ　Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏｓ中中子７℃おいて６０分間培養した。オリゴヌクレオ チドＧＡＴＣＣＡ、、Ｇを２μｇを加え、標識オリゴヌクレオチドに対するＰＮ Ａと拮抗させ、各試料を表示した温度において１ｏ分間加熱し、氷で１０分間冷 却し、次いで２０℃に加温した。ｓｌヌクレアーゼを５０単位加え、単一ヌクレ オチドとして放出遊離された放射能の量を測定した。
Ｔ１゜ＤＮＡ二重らせんに対する予期Ｔｍ値は、２０’Ｃであり、またＴ、につ いては１６℃であり、Ｔ６については１２℃であった。相当するＰＮＡ／ＤＮＡ 値は、Ｔ１０〉７０℃であり、Ｔ８については６０℃であり、またＴ＠について は３７℃であった。
良敷九［ ぶちし主ｌ定囮 ＰＮＡ−セファロースを製造するために、臭化ジンアンで活性化したセファ０− ス（Ｓｉｇｍａ）１０ｍｇを１０μｇのＰＮＡとともに５０ｍＭりん酸ナトリウ ム、ｐＨ７，５において３７℃で６０分間培養した。このセファロースは、遠心 分離によって単離し、５０ｍＭりん酸ナトリウム、ｐＨ７，５の２５０μｍでミ ロ洗浄した。
実施例６８ １００μのＴＥ中１ｍｇのＰＮＡ−セファロース（実施例６７）を”Ｐで標識し たオリゴヌクレオチドの５０ｃｐｓ　（−１０１００ｎと共に２０℃において１ ６時間培養した。このセファロースを遠心分離して淡離ｓｉ、５００μｌのＴＥ で二回洗浄した。結合したオリゴヌクレオチドを、”Ｃｅｒｅｎｋｏｖ”方法を 用いて液体シンチレーションカウンティングによってめた。三種の異なるＰＮＡ −セファロースと４種のオリゴ−ＤＮＡについて、得られた結果を下記の表に示 す。この固定化したＰＮＡによる捕捉の特異性が明確にめられるが、なお塩基対 ミスマツチは一つだけ許容される。
ＰＮＡ−セフ　ロースへの”Ｐ−オリゴの　ム・　％固体支持体（ＣＮＢｒ−セ ファロース）でのＰＮＡＴＩＯＴ９ＣＴ８Ｃ２なし ＮＡ ＡＩＯ５１４５１５８ Ａ９Ｇ　１１　５０　５２　８ Ａ８Ｇ２　１１　４５　４２　４ ｍ１ｘ　１１　１３　１４　１５ この表において、ＡＩＯは、５’　−ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧであり 、Ａ９Ｇは、５’−ＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧであり、Ａ３Ｇ２は、５ °−ＧＡＡＧＡＡＧ ＡＡＡＣＴＧＡＣであり、またｍｉｘは、５′−ＧＡＴＣＡＣＧＣＧＴＡＴＡＣ ＧＣＧＴある。ＰＮＡ類は、以下の通り：Ｔ１０＋Ｈ−Ｔ、。ＬｙｓＮＨｚ、Ｔ ９Ｃ：　ＨＴＢ　ＣＴ＜　Ｌ　ｙ　ｓ　Ｎ　Ｈｚ、Ｔ８Ｃ２：　Ｈ−ＴＩＣ”Ｌ ＣＴ４−　ＬｙｓＮＨｔ、なし：カウンティングによって測定し、セファロース を再び５００μｍにとら曲線間における変位は、ミスマツチが一つ生じた場合オ リゴヌクレオチド結合安定性が低下したことを示す。
夫度九匹 ＰＮＡによる　の　・　２６ １００ｎＨのプラスミドＤＮＡ　（制限酵素ＰｖｕＩＩ　（以下を参照）で開裂 した）と１０ｍＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ、１ｍＭＥＤＴＡＳｐＨ７，４の１５μｍ 中での１１００ｎのＰＮＡとを３７℃において６０分間培養した。次いで、４μ １５ｘ濃縮緩衝液（０，２ＭＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、４０ｍＭＭ ｇＣｌ＊、１０ｍＭスペルミジン、１２５ｍＭＮａＣＩ）を１μｍのＮＴＰ　− ｍｉｘ　（１０ｍＭＡＴＰ１１０ｍＭ　ＣＴＰ、１０ｍＭ　ＧＴＰ、１ｍＭ　Ｕ ＴＰ、０．１ｔｔｃ：／ｕｌ″Ｐ−ＵＴＰ、５ｍＭ　ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌ　ｔ ＲＮＡ、１μＧ／ｍｌヘパリン）および３単位のＲＮＡポリメラーゼと混合した 。培養を３７℃において１０分間継続した。このＲＮＡを一２０℃において９６ ％エタノール中の２％酢酸カリウム液６０μｍを添加して沈殿させ、８％ポリア クリルアミド配列決定ゲルにおける電気泳動法によって分析した。ＲＮＡ転写物 をオートラジオグラフィーで可視化した。
使用したプラスミドは以下の通りであった：レーン１から５まで；ｐＡｌｏＫｓ 　（Ａ＋。標的は、転写された鎖の上に位置する）。レーン６から１０まで：ｐ Ｔ１０Ｋｓ　（ん。標的は、転写されていない鎖の上に位置する）。このプラス ミドは、実験に先だって以下の制限酵素で処理した：レーン１，４．６および９ ：ハ＋ｕｌＩ　；レーン２．５．７および１０：Ｘｈａｌ；レーン３および８　 ：　Ｂａｍ１ｌ。レーン４．５．９および１０の試料は、ＰＮＡを含有していた が、その他は、含有していなかった。ＰＮＡＴ、、をプラスミドの転写された鎖 に結合した場合、ＲＮＡの転写は、ＰＮＡ結合部位において阻止されることが、 ゲルから認めることが出来る。このＰＮＡをプラスミドの転写されていない鎖に 結合すると、転写は阻止されないのである。
爽１乱■ アフ　ニティＰＮＡ−セフ　ロース　２７）１００μｌのＴＥ中のＰＮＡ　−Ｔ 、。セファロース（実施例６７を参照）１ｍｇを以下のり一５′−末端標識した オリゴヌクレオチドの”　５０ｃｐｓと共に２０℃において１６時間培養した： １：５°−ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＴＡＣＧＧＣＡ ＴＡ　ＡＣＧ　ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＣＧＴ　ＣＴＴ　ＴＡＣＧＧＣＴＴＡＴＣＧ　 ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＣＧＧ　ＣＡＴ　ＴＴＣＧＧＣＡＡＴ　ＴＣＧ。
２：５’　−ＧＡＴ　ＣＣＧ　ＧＣＴ　ＴΔＡ　ＣＧＧ　ＣＡＡ　ＴＴＣＧＣＴ ＴＡＴ　ＡＣＧ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＣＧＧ　ＣＴＡ　ＡＴＣＧＧＣＡＴＴＡＣＧ 　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＣＧＧ　Ｇ。
３：５°−ＧＡＣＡＡＡ　ＣＡＴ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡＣ ＣＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　Ａ。
４：５″−ＡＣＴ　ＧＡＣＴＡＣＣＴＡ　ＧＧＴ　ＴＴＡ　ＣＣＧ　ＴＧＣＣＡ Ｇ　ＴＣＡ ５：５’　−ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＧＡＴ　ＡＧＣＴＧＣＡこのセファロースを遠心 分離して単離し、ＴＥでミロ洗浄した。
オリゴヌクレオチドを次に温度を上げつつ５００μｌのＴＥで洗浄し幅スクリー ン）で検出した。結果を第２６図に示す。
レーン１：セファアデックスに結合していないオリゴヌクレオチド レーン２；４０℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチドレーン３：６０℃で洗浄除 去したオリゴヌクレオチドレーン４：８０℃で洗浄除去したオリゴヌクレオチド プラスミド３のみが、このＰＮＡに相補的である。８０℃までの一つのオリゴヌ クレオチドを抽出出来ることが証明される。
使用したプラスミドは、以下の通りであつＩこ：レーン１から３まで：１）ＴＩ 。＋　ＨａｅｌＩＩレーン４から６まで：　ｐＴ＋ｏ　＋Ｈｉｎｆｌレーン７か ら９まで：ｐＴｌ。−ニ１■。
それぞれの試料中のＰＮＡ　−Ｔ、。−Ｔｙｒの全量は、以下の通りであった： レーン１．４および？ニー１０ｎｇ； レーン２．５および８　：　２５ｎｇ　；レーン３．６および９　：　２５０ｎ ｇ　；臭化エチジウムゲル（ａ）は、生成したＤＮＡフラグメント（ＤＮＡ−Ｐ ＮＡハイブリッドを含む）の大きさを示す。オートラジオグラフ（ｂ）は、ゲル （ａ）中の何れのバンドがＰＮＡを含有しているかを示す。鎖置換複合体の存在 は、レーンｌにおいて認めることが出来るが、レーン２および３において冷ＰＮ Ａの比率を増大させることによってこのバンドの強度に及ぼす影響を認めること が出来る。同様の結果がレーン４から６までおよびレーン７から９までにおいて 他の二つのプラスミドのそれぞれについて認められる。それぞれの場合における ＰＮＡ−ＤＮＡバンドの位置は、プラスミドを同定するために用いられ、またそ の強度は、存在するプラスミドの量を定量化するために用いることが出来る。
当業者は、本発明の好ましい実施態様について多くの変更および修正を行い得る ことおよびかかる変更および修正は、本発明の精神から逸脱することなく行い得 ることを理解するであろう。従って、添付する請求の範囲は、本発明の真の精神 および範囲に含まれる全ての等価の変更を包含することが意図される。
ジアゾアクリジン ５　’　−ＧＦＩＴＣＣＦ１１’ｌｆ’１Ｆｌｆ’１ＦＩＦＩＦＩＦＩＦＩＧＧ ＦＩＴＣＦＩＧ　ｌ。
ＦＩＧ、　５ ↓ ＭＩＮＵＴＥＳ ＦＩＧ　９ ＭＩＮＵＴＥＳ ＦＩＧ、　７０ ＦＩＧ、　７１ａ ３２Ｐ−ｏｌｉｇｏ　ｔ　ｔ　ｔ　１　ｔ　１　２　２　２ｏ１ｉｇｏ　２　“ 　−−＋＋＋−” ｐＮＡ４　−　＋　＋＋　−＋　＋＋　−＋　＋＋３２Ｐ−ｏｌｉｇｏ　１　ｔ 　ｔ　１　１　１　２　２　２ｏ１ｉｇｏ　２　°　−−＋−１−＋−−。
ＰＮＡ−１°　＋　＋＋−＋　＋＋−＋＋＋ＦＩＧ、　７２ａ ＦＩＧ、　１２ｂ ＦＩＧ、１２ｃ ＦＩＧ、　７３ ＦＩＧ、　７５ アミンエチルグリシン　ベータ　アラニンｐ−％　＼ ＦＩＧ、　７９ ＦＩＧ、　２０ ＰＮＡ　１：　Ｔ１０　ＰＮＡ　２：　’ｒ、ｃ’ｒ４ＰＮＡ　３：　ＴｚｃＴ Ｚｃ’ｒ４解離屋度 ＦＩＧ　２２ ＰＮＡ／ＤＮＡ　０　０．００６０．０２０．０６０．２０．６５”−−−−− −ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＣＣ−−−−−−−３”−−−−−−ＣＣＴＡＧＧＴＴ ＴＴＴＴＴ’ｒＴＴＣＣＴＡＧＧ−−−−一−−［Ｔ−ＤＮＡ１０１ｉｇｏ　Ｏ ０，３１３１０３０１００３００ＰＮＡ　−−−＋　＋　−−−＋　＋ ｒ’ＸＢＰＸＰＸＢＰＸ ［ＩＱｍ　ｌ−１１Ｘｂａ　Ｉ　Ｐｖｕ　ＩＩフロントページの続き （５１月旺ｃｉ、　ｓ　識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　７／１０　８３１８ −４Ｈ （３１）優先権主張番号　０５１０／９２（３２）優先臼　１９９２年４月１５ 日（３３）優先権主張国　デンマーク（ＤＫ）Ｌ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＰ、ＢＪ、 ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ 、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。
ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，Ｌ・　Ｋ、　Ｌ Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ 、ＵＳ （７１）出願人　ベルク、ロルフ・ヘンリクデンマーク国、２０００　フレデリ クスベルク、ランゲラントスベイ　２０番べ一１３テーバ− ＦＩ （７２）発明者　ブカルト、オーレ デンマーク国、３５００フエルレーセ、センダーガルトスベイ　７３番 （７２）発明者　ニゲホルム、ミカエルデンマーク国、２０００　フレデリクス ベルク、シントシュビレベイ　５番、３　テーパー （７２）発明者　ニールセン、ピータ−・アイギルデンマーク国、２９８０　コ ッケダール、ヒョルテベンゲト　５０９番 （７２）発明者　ベルク、ロルフ・ヘンリクデンマーク国、２０００　フレデリ クスベルク、ランゲラントスベイ　２０番ベー、３テーハ−

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．一つまたはそれ以上の化学的または微生物的個体単位についてその捕捉、認 識、検出、同定または定量化を行うために使用する核酸類縁体であって、かかる 類縁体が以下であるもの：即ち、（ａ）主鎖に沿ったそれぞれ空間を置いた異な る位置において複数のリガンドを有するポリアミド主鎖から構成されるペプチド 核酸（ＰＮＡ）において、前記リガンドがそれぞれ独立して天然の核酸塩基、非 天然の核酸塩基または核酸塩基結合基であり、前記リガンドは各々前記主鎖の窒 素原子に直接または間接に結合せしめられ、かつ前記リガンドが４つから８つま での介在する原子によって前記主鎖のなかで相互に分離された窒素原子を有する ものである、前記ペプチド核酸（ＰＮＡ）、 （ｂ）核酸類縁体であって、相補的配列の核酸とハイブリッド形成して、前記類 縁体に相当する従来公知のデオキシリボヌクレオチドと前記核酸との間で形成さ れたハイブリッドよりも熱による変性に対する安定性がより高いハイブリッドを 形成する能力を有する前記核酸類縁体；または （ｃ）核酸類縁体であって、一本鎖が前記縁体に相補的である配列を有する二重 鎖核酸とハイブリッド形成して、かくして前記一本鎖からもう一方の鎖を置換せ しめる能力を有する前記核酸類縁体。 ２．以下の一般式を有する、請求の範囲第１項において請求された核酸類縁体： ▲数式、化学式、表等があります▼ 但し上式において： ｎは、少なくとも２である、 Ｌ１−Ｌｎのそれぞれは独立して、水素、ヒドロキシ、（Ｃ１−Ｃ４）アルカノ イル、天然の核酸塩基類、非天然の核酸塩基類、芳香族原子部、ＤＮＡ挿入基、 核酸塩基結合基およびリポータリガンドから構成される群から選択されるが、Ｌ １−Ｌｎの内の少なくとも一つは、天然の核酸塩基、非天然の核酸塩基、ＤＮＡ 挿入基または核酸塩基結合基である； Ａ１−Ａｎのそれぞれは、一重結合、メチレン基または式（ＩＩａ）または式で 表される基である： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼但 し上式において： Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ３、ＣＨ２またはＣ（ＣＨ３）２である；Ｙは、一重 結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ４である；　ｐおよびｑのそれぞれは、１から５までの 整数であり、ｐ＋ｑの和は、１０以下である； ｒおよびｓのそれぞれは、ゼロまたは１から５までの整数であり、ｒ＋ｓの和は 、１０以下である； Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシもしくはアルコキシもし くはアルキルチオで置換されていてもよい（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、ヒドロキシ 、アルコキシ、アルキルチオ、アミノおよびハロゲンから構成される群から選択 される；またＲ３およびＲ４のそれぞれは独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ４）アル キル、ヒドロキシもしくはアルコキシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ１ −Ｃ４）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオおよびアミノから構 成される群から選択される；Ｂ１−Ｂｎのそれぞれは、ＮまたはＲ３Ｎ＋であり 、ここにおいてＲ３は上記において定義された通りである； Ｃ１−Ｃｎのそれぞれは、ＣＲ６Ｒ７、ＣＨＲ６ＣＨＲ７またはＣＲ６Ｒ７ＣＨ ２であり、ここにおいてＲ５は水素でありまたＲ７は、天然のアルファアミノ酸 の側鎖から構成される群から選択され、またはＲ６およびＲ７は独立して、水素 、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキ シ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルチオ、ＮＲ３Ｒ４およ びＳＲ５から構成される群から選択されるが、ここにおいてＲ３およびＲ４は、 上記において定義された通りであり、Ｒ５は水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ヒ ドロキシ、アルコキシもしくはアルキルチオで置換された（Ｃ１−Ｃ６）アルキ ルであり、またはＲ６およびＲ７とは一緒になって、脂環系または異項環系を形 成する； Ｄ１−Ｄｎのそれぞれは、ＣＲ６Ｒ７、ＣＨ２Ｒ６ＣＨＲ７またはＣＨＲ６ＣＨ Ｒ７であり、ここにおいてＲ６およびＲ７は、上記において定義された通りであ る； Ｇ１−Ｇｎ−１はそれぞれ、いずれかの方向での−ＣＯＮＲ３−、ＣＳＮＲ３− 、−ＳＯＮＲ３−または−ＳＯ２ＮＲ３−でって、なおここにおいてＲ３は、上 記において定義した通りである；Ｑは、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯＮＲ′Ｒ′′、−Ｓ Ｏ２Ｈもしくは−ＳＯ２ＮＲ７Ｒ′′または−ＣＯ２Ｈもしくは−ＳＯ３Ｈの活 性化誘導体である；また１は、−ＮＨＲ′′′Ｒ′′′′−または−ＮＲ′′′ Ｃ（Ｏ）Ｒ′′′′であり、ここにおいてＲ′、Ｒ′′、Ｒ′′′およびＲ′′ ′′は独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、リポータリガンド、挿入基、 キレート化剤、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ステロイド、オリゴヌ クレオチドならびに可溶および不溶のポリマーである。 ３．以下の一般式を有する、請求の範囲第２項において請求されたペプチド核酸 ： ▲数式、化学式、表等があります▼ なお本式において： Ｌはそれぞれ独立して、水素、フェニル、例えば一つ、二つまたは三つのリング の異項環、天然の核酸塩基および非天然の核酸塩基から成る群から選択される； Ｒｒはそれぞれ独立して、水素および天然のアルファアミノ酸の側鎖から成る群 から選択される； ｎは、１から６０までの整数である； ｋ、１およびｍのそれぞれは独立して、ゼロまたは１から５までの整数である； 好ましくは、ｋとｍとの和は１または２であり、最も好ましくは１である； Ｒｎは、ＯＨ、ＮＨ２または−ＮＨＬｙｓＮＨ２である；およびＲ１はＨまたは ＣＯＣＨ３である。 ４．以下の一般式を有する、請求の範囲第３項において請求された核酸類縁体： ▲数式、化学式、表等があります▼なお本式において：Ｌはそれぞれ独立して、 核酸塩基であるチミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから成る 群から選択される；Ｒｒはそれぞれ、水素である；および ｎは、１から３０までの整数である。 ５、検出可能な標識を導入したまたは検出可能な標識に接合された、請求の範囲 第１項から第４項までの内の何れか一項において請求された核酸類縁体。 ６．前記標識が、放射性同位元素標識、酵素標識、ビオチン、発蛍光団、化学発 光標識、抗原、抗体またはスピン標識である、請求の範囲第５項において請求さ れた標識された核酸類縁体。 ７．一つまたはそれ以上の化学的または微生物的個体単位についてその捕捉、認 識、検出、同定または定量化を行うために、請求の範囲第１項から第６項までの 内の何れか一項において定義された核酸類縁体を使用すること。 ８．核酸を捕捉するに際して、固体支持体に固定化した、請求の範囲第１項から 第６項までの内の何れか一項において請求された核酸類縁体にハイブリッド形成 条件下において前記核酸を接触させることから成る、核酸を捕捉する方法。 ９．捕捉された前記核酸が、前記固定化された核酸類縁体に結合された状態にあ る核酸認識薬剤で処理することによって検出され、認識され、定量化されまたは 同定される、請求の範囲第８項において請求された方法。 １０．捕捉された該核酸が、前記固定化された核酸類縁体にハイブリッドされた 第一の領域およびそのようにハイブリッドされて以いない第二の領域であって、 該第二の領域の少なくとも一部にハイブリッドする様に適合せしめられている標 識核酸または核酸類縁体で処理された第二の領域を有しており、かつ前記標識が 検出される、請求の範囲第９項において請求された方法。 １１．前記固定化された核酸類縁体が、加水分解してｍＲＮＡのポリＡ尾部を生 じ、その結果前記ｍＲＮＡを捕捉することが可能である逐次リガンドから成る、 請求の範囲第９項において請求された、ｍＲＮＡを捕捉する方法。 １２．ｚｅｎｋｉ逐次リガンドがチミンである、請求の範囲第１１項において請 求された方法。 １３．−旦捕捉された前記核酸か、前記固定化された核酸類縁体と捕捉された核 酸とを脱ハイブリッド化する条件に供することによって該固定化核酸類縁体から 開放・放出される、請求の範囲第８項、１１項また第１２項の内の何れか一項に おいて請求された方法。 １４．固体支持体に固定化された、請求の範囲第１項から第６項までの内の何れ か一項において請求された核酸類縁体。 １５．アフィニティ捕捉カラムに導入された、請求の範囲第１４項において請求 された固定化された核酸類縁体。 １６．ハイブリッド化する条件下においてハイブリッドするに充分に相補的な配 列を有する、請求の範囲第５項または第６項で請求された標識した核酸類縁体に 標的をハイブリッドさせ、かつ前記標的にハイブリッドさせた該核酸類縁体の前 記標識を検出するかまたは定量化することから成る、標的核酸を認識、検出また は定量化する方法。 １７．前記標的核酸が前記ハイブリダイゼーションに先だって支持体に固定化さ れる、請求の範囲第１６項において請求された方法。 １８．前記標的核酸が、前記支持体に固定化されるに際して、その第一の領域を 、捕捉された核酸または核酸類縁体であって、ハイブリッドするに充分に前記第 一の領域に相補的である配列を有しかつそれ自体が前記支持体に固定化されてい る該捕捉核酸または核酸類縁体にハイブリダイゼーションさせ、かつ前記標識さ れた核酸類縁体が前記標的の第二の領域にハイブリッドする、請求の範囲第１７ 項において請求された方法。 １９．核酸二重らせんから一本鎖を置換する方法において、前記二重らせんに対 して、前記核酸のもう一方の鎖に対するアフィニティーが前記一本鎖を置換する ことが可能である程に充分であるような核酸類類縁体をハイブリッドさせること から成る前記置換方法。 ２０．二本鎖標的核酸を検出し、同定しまたは定量化する方法において、置換さ れない鎖が置換核酸類縁体に相補的な配列を有する二本鎖標的から一本鎖を置換 することができる置換核酸類縁体を該標的核酸にハイブリッドさせるに際して、 前記置換核酸類縁体の配列が、自らにハイブリッドするに充分に相補的あって、 その結果、一本鎖の形態において前記標的の一本鎖を置換するものであって、か つその後に前記置換された一本鎖を存在を検出するかまたは定量化することから 成る、前記検出、同定または定量化する方法。 ２１．置換された鎖をフラグメントに切断しかつ前記フラグメントの存在を検出 する、請求の範囲第２０項において請求された方法。 ２２．前記置換された鎖がヌクレアーゼの攻撃によって切断される、請求の範囲 第２１項において請求された方法。 ２３．請求の範囲５項または第６項ににおいて請求された少なくとも一つの標識 された核酸類縁体および前記標識された核酸類縁体を検出する少なくとも一つの 検出試薬とから構成される、診断方法において使用されるキット。 ２４．請求の範囲第１項から第４項までの内の何れか一項において請求された核 酸類縁体を更に固体支持体に固定化されて成る、請求の範囲第２３項において請 求されたキット。 ２５．請求の範囲第１項から第４項までの内の何れか一項において請求された固 定化された核酸類縁体と、前記核酸類縁体によって捕捉された核酸の存在を検出 する少なくとも一つの核酸認識薬剤とを組合せて成るキット。 ２６．前記核酸認識薬剤が、標識された核酸または標識された核酸類縁体である 、請求の範囲第２５項において請求されたキット。
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