DE69632324T2

DE69632324T2 - Pna-dna-chimäre und pna-synthone zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69632324T2
Application number: DE69632324T
Authority: DE
Inventors: D. Brian GILDEA; M. James COULL
Original assignee: PerSeptive Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-29
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2016-05-30
Also published as: EP0840741A1; WO1996040709A1; DE69632324D1; US6265559B1; EP0840741B1; US6063569A; JP2001518054A

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Synthese von Peptid-Nuclein-Säure (PNA). Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf PNA-Synthone, die für die Synthese und Schutzentfernung von PNA-DNA-Chimären geeignet sind.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Peptid-Nuclein-Säuren (PNAs) sind synthetische Polyamide, die aussichtsreiche Kandidaten für die sequenzspezifische Regulierung einer DNA-Expression und für die Herstellung von Gentargetmedikamenten sind. Siehe die europäischen Patentanmeldungen EP 92/01219 und 92/01220. PNAs sind Biopolymerhybride, die eine peptidartige Hauptverbindung besitzen, mit der die Nucleobasen der DNA verbunden sind. Speziell sind PNAs synthetische Polyamide, die aus Grundmolekülen von Aminosäure, N-(2-Aminoethyl)-Glycin bestehen, mit denen die Nucleobasen Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil durch eine Methylencarbonylgruppe verbunden sind. Andere natürliche und unnatürliche Nucleobasen, wie etwa Pseudoisocytosin, 5-Methylcytosin, Pseudouracil, Isocytosin, Hypoxanthin und 2,6-Diaminopurin, können u.a. ebenfalls in PNA-Synthone eingearbeitet werden (siehe 8).
PNAs werden heute serienmäßig aus Monomeren (PNA-Synthone) synthetisch hergestellt, die nach der t-Boc/Benzyl-Schutzstrategie geschützt werden, wobei die Hauptaminogruppe des wachsenden Polymers mit der t-Butyloxycarbonyl(t-Boc)-Gruppe geschützt wird, und die exozyklischen Aminogruppen der Nucleobasen, falls vorhanden, mit der Benzyloxycarbonyl (Benzyl)-Gruppe geschützt werden. PNA-Synthone, die unter Verwendung der t-Boc-Benzylstrategie geschützt sind, sind heute im Handel erhältlich, aber unpraktisch im Gebrauch, weil, neben anderen Gründen, strenge Säurebedingungen zum Eliminieren dieser Schutzgruppen erforderlich sind.
Die t-Boc/Benzyl-Schutzstrategie erfordert sehr starke Säuren zum Eliminieren sämtlicher Benzylseitenketten-Nucleobasen-Schutzgruppen. Üblicherweise werden PNA-Oligomere einer Flußsäure oder Trifluormethan-Sulfonsäure über Zeitspannen ausgesetzt, die häufig eine Stunde überschreiten, um die Benzyl-Seitenketten-Schutzgruppen vollständig zu eliminieren. Durch diese strenge Säurebehandlung, die für eine endgültige Schutzentfernung notwendig ist, werden häufig, neben anderen säureempfindlichen Komponenten, Nucleinsäuren und Kohlenhydrate abgebaut, die mit dem Nucleinsäureoligomer verbunden sein können. Des weiteren wird die Verwendung gefährlicher Säuren wie etwa Flußsäure oder Trifluormethan-Sulfonsäure gewerbsmäßig angesichts von Sicherheitsbedenken für das Bedienungspersonal und der Korrosionswirkung auf die Automationseinrichtungen und Leitungen nicht geschätzt. Die oben beschriebenen strengen Bedingungen sind insbesondere für die Synthese von Nucleinsäuren ungeeignet, da die starken Säureschutzbedingungen zumindest teilweise zu einem Abbau von Nucleinsäuren führen.
Außerdem ist die t-Boc/Benzyl-Schutzstrategie nicht orthogonal, sondern differential. Eine differentiale Strategie wird als ein System von Schutzgruppen definiert, bei dem die Schutzgruppen im wesentlichen durch die gleiche Art von Reagenz oder Zustand eliminiert werden, jedoch auf der Grundlage der unterschiedlichen relativen Reaktionsraten zur Eliminierung der einen Gruppe gegenüber der anderen. Zum Beispiel sind bei der t-Boc/Benzyl-Schutzstrategie beide Schutzgruppen säureunbeständig, wobei die Benzylgruppen eine stärkere Säure für eine effiziente Eliminierung erfordern. Wenn Säure zum vollständigen Eliminieren der säureunbeständigeren t-Boc-Schutzgruppen verwendet wird, besteht die Möglichkeit, daß ein Prozentsatz der Benzylgruppen gleichzeitig ebenfalls eliminiert wird. Speziell muß die t-Boc-Schutzgruppe aus der Aminogruppenhauptverbindung während jedes Synthesezyklus eliminiert werden, damit das nächste Monomer mit der Hauptverbindung an der freien Aminostelle verbunden werden kann, wodurch die Polymerkette wachsen kann. Die Schutzentfernung der t-Boc-geschützten Hauptverbindung wird unter Verwendung einer starken Säure wie etwa Trifluoressigsäure durchgeführt. Während dieser Schutzentfernung und der nachfolgenden Konstruktion des PNA-Oligomers ist die Eliminierung der Nucleobasenseitenketten-Schutzgruppen, d.h. der Benzyle, unerwünscht. Jedoch ist die Trifluoressigsäure potentiell so stark, daß vorzeitig ein Prozentsatz der Seitenkettenbenzylgruppen den Schutz verliert, wodurch die Möglichkeit einer Polymerverzweigung eingeführt und das Gesamtergebnis des gewünschten Produkts verringert wird.
Bei einer orthogonalen Strategie werden anderseits die Schutzgruppen unter sich gegenseitig ausschließenden Bedingungen eliminiert, z.B. wird eine Gruppe mit Säure eliminiert, während die andere Gruppe mit einer Base eliminiert wird. Breipohl u.a. beschreiben ein orthogonal geschütztes PNA-Synthon unter Verwendung von 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc) als Hauptverbindungsschutzgruppe und einer Triphenylmethyl-(Trityl)-Gruppe als Seitenkettennucleobasen-Schutzgruppe. Breipohl u.a., erste australische Peptid-Konferenz, Great Barrier Reef, Australien, 16. bis 21. Oktober 1994. Diese Schutzmethode ist jedoch mit der Standard-Nucleinsäuresynthesemethode nicht kompatibel.
Christensen u.a. beschreiben orthogonale PNA-Synthone, wobei die t-Boc-Aminohauptverbindungsschutzgruppe in starker Säure eliminiert und dann neugeschützt wird mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), einer basenunbeständigen Schutzgruppe. Christensen, L. u.a. "Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis and Complementary Technologies-Biological and Biomedical Applications", drittes SPS-Oxford Symposium (1994). Obgleich diese Schutzstrategie die Möglichkeit einer vorzeitigen Schutzentfernung für die exozyklische Aminogruppe der Seitenkettennucleobase vermeidet, fallen zusätzliche Schritte bei der Herstellung dieses Monomeren an. Außerdem werden noch starke Säuren wie Flußsäure oder Trifluormethan-Sulfonsäure zum Eliminieren der Benzylseitenkettenschutzgruppen benötigt.
Nucleinsäuren (DNA und RNA) werden heute serienmäßig unter Verwendung von automatisiertem Gerät, zahlreichen Syntheseträgern und verschiedenen chemischen Schutzverfahren synthetisch hergestellt. Die folgenden US-Patente umfassen einen großen Bereich von verschiedenen Trägern und chemischen Schutzverfahren: US- Patent-Nrn. 5 262 530, 4 415 732, 4 458 066, 4 725 677 (RE 34.069) und 4 923 901. Automateneinrichtungen und Reagenzien sind im Handel erhältlich von PerSeptive Biosystems, Perkin Elmer (Applied Biosystems Division) und Pharmacia. Spezielle 5'-Aminosynthone sind beschrieben bei Smith u.a., Nucleic Acids Res. (1985) 13:2399 und bei Sproat u.a., Nucleic Acids Res. (1987) 15:6181. Spezielle 5'-Thiosynthone sind beschrieben bei Sproat u.a. Nucleic Asids Res. (1987) 15:4837. Die in den oben erwähnten Literaturstellen beschriebenen Reagenzien sind geeignet zur Verwendung bei Standard-DNA-Synthesemedien.
Die bevorzugte kommerzielle Methode für eine Nucleinsäuresynthese verwendet die obigen Reagenzien und Methoden, wie sie allgemein beschrieben werden von Koester u.a. im US-Patent Nr. 4 725 677 (RE 34.069). Demgemäß sind die bevorzugten Synthone β-Cyanoethylphosphoramidite mit säureunbeständigem Schutz der Hauptverbindungs-5'-Hydroxylgruppe und basenunbeständigem Acyltypschutz der exozyklischen Aminogruppen der Nucleobasen.
Die bevorzugte säurenunbeständige Hauptverbindungsschutzgruppe ist 4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl (DMT). DMT wird üblicherweise gewählt, weil es recht schnell (1 bis 3 Minuten) während jedes Synthesezyklus mit Lösungen eliminiert werden kann, die 1 bis 4% Dichloroessigsäure oder Trichloroessigsäure in Dichloromethan enthalten. Schutzgruppen mit erhöhter Säureunbeständigkeit im Vergleich zu DMT sind empfänglich für eine vorzeitige Schutzentfernung während der säurekatalysierten Kupplungsreaktionen (die Säurespezies ist üblicherweise Tetrazol). Schutzgruppen mit verringerter Säureunbeständigkeit im Vergleich zu DMT erfordern längere Reaktionszeiten und/oder strengere Reaktionsbedingungen für eine vollständige Eliminierung. Im allgemeinen werden strengere Bedingungen der Säureschutzentfernung vermieden, da die Purinnucleobasen besonders empfänglich für eine Zersetzung in Säure sind. Obgleich die oben erwähnten Probleme mit Schutzgruppen und den Synthesebedingungen während jedes Synthesezyklus minimal sein können, kann der kumulative Effekt signifikante Verunreinigungen bei der Oligonucleotidsynthese hervorrufen. Demgemäß nimmt mit der wachsenden Länge des Oligonucleotids seine Reinheit tendenziell ab.
Im allgemeinen werden basenunbeständige Schutzgruppen für den Schutz der exozyklischen Aminogruppen der Nucleobasen verwendet, so daß sich ein orthogonal geschütztes Nucleinsäuresynthon ergibt. Die basenunbeständigen Schutzgruppen behalten typischerweise einen Teil der wachsenden Nucleinsäurekette und werden dann gleichzeitig mit dem Abtrennen synthetisierter Nucleinsäure von dem Feststoffträger eliminiert. Häufig wird eine konzentrierte Ammoniumhydroxidlösung für den "Schutzentfernungs- und Abtrennschritt" verwendet. Koester u.a. verwendeten basenunbeständige Schutzgruppen vom Acyltyp, die für gewöhnlich über 6 bis 24 Stunden bei einer erhöhten Temperatur (etwa 55° C) für eine vollständige Eliminierung dieser Nucleobasen-Schutzgruppen behandelt wurden. Es wurden andere Schutzgruppen entwickelt, die unter den gleichen Bedingungen, jedoch in kürzerer Zeit (von etwa 15 bis 60 Minuten) eliminiert wurden. Beispiele dieser verbesserten Schutzgruppen beinhalten Phenoxyacetyl, t-Butylphenoxyacetyl und Schutzgruppen vom Amindintyp. Obschon diese Schutzgruppen eine erhöhte Basenunbeständigkeit aufweisen, wird typischerweise nur die für die Eliminierung notwendige Zeit verringert.
Aus der obigen Diskussion folgt, daß PNA-Synthone, die für den Aufbau verschiedenartiger Nucleinsäureoligomere geeignet sind, mit den geläufigen DNA-Synthesemethoden kompatibel sein sollten, so daß die vorhandenen Techniken und Ausrüstungen benutzt werden können. Speziell ist es notwendig, daß eine in geeigneter Weise säureunbeständige Schutzgruppe für den Hauptverbindungsschutz und eine zweckmäßige basenunbeständige Schutzgruppe für den Nucleobasenschutz in die Gestaltung eines PNA-Synthons einbezogen wird. Die Fähigkeit, PNA-Synthone in der Weise synthetisch herzustellen, daß die obigen Anforderungen erfüllt werden, würde es ermöglichen, daß verschiedenartige Kombinationen von Nucleinsäuren serienmäßig hergestellt werden, und die Ausweitung wissenschaftlicher Untersuchungen auf die Nützlichkeit dieser Komplexmoleküle ermöglichen.
Eine weitere gegenwärtige Beschränkung bei der Synthese von PNA-Synthonen ist die Bildung der Seitenkettennucleobasen-Schutzgruppe. Im allgemeinen werden die exozyklischen Aminogruppen der Nucleobasen, z.B. Cytosin, Adenin und Guanin, als Carbamate über eine Reaktion mit aktivierten Carbonaten oder Chlorformiaten geschützt. Dieses Verfahren der Carbamatbildung leidet unter dem Nachteil, daß viele Chlorformiate unstabil sind oder daß die Chlorformiate nicht nennenswert reaktionsfähig mit den schwach nucleophilen exozyklischen Aminogruppen der Nucleobasen sind. Andere Verfahren der Carbamatbildung, die für Nucleobasen verwendet werden, beinhalten die Verwendung von Imidazoliden und Alkylimidazoliumsalzen als Acylierungsagenzien. Siehe Watkins u.a., J. Org. Chem., (1982) 47:4471-77 und Watkins u.a., J. Am. Chem. Soc., (1982) 104:5702-08. Obgleich Imidazolide und alkalysierte Imidazolide einige der Schwierigkeiten zu überwinden scheinen, die mit der Carbamatbildung verbunden sind, ist über ihre weitverbreitete Verwendung mit Nucleobasen noch zu berichten. In jüngster Zeit wurde die 4-Methoxy-Triphenylmethyl-(MMT)-Gruppe als eine weitere exozyklische Aminoschutzgruppe für PNA-Synthon-Seitenkettennucleobasen vorgestellt. Breipohl u.a., erste australische Peptidkonferenz, Great Barrier Reef, Australien, 16. bis 21. Oktober 1994. Die MMT-Gruppe ist jedoch nicht eine Carbamatschutzgruppe.
Zusätzlich zu obigem ist die Synthese eines selektiv geschützten Guanin-PNA-Synthons schwer zu erlangen. Die berichteten Guanin-PNA-Synthone sind als O-6-Benzylether geschützt, besitzen jedoch wahlweise einen Benzylschutz der exozyklischen 2-Aminogruppe. Siehe europäische Patentanmeldung EP 92/01219 und US-Patentanmeldung PCT/US92/10219. Bei der relativen Reaktionsfähigkeit der C6-Carbonylgruppe (Enolform) und der reaktionsfähigeren exozyklischen 2-Aminogruppe gibt es keinen zwingenden Grund zum Schutz der C6-Carbonylgruppe während der PNA-Synthese, während der Schutz der reaktionsfähigeren 2-Aminogruppe vorzuziehen ist. Es gibt derzeit kein bekanntes Verfahren zur synthetischen Herstellung eines Guanin-PNA-Synthons mit einem selektiven Benzylschutz (oder einem anderen Carbamatschutz) der exozyklischen 2-Aminogruppe des Heterozyklus.
Die Benzyloxycarbonylgruppe wird bei der DNA-Synthese zum Schutz der exozyklischen Aminogruppen der Nucleobasen Cytosin, Adenin und Guanin verwendet. Siehe Watkins u.a., J. Org. Chem., (1982) 47:4471-77 und Watkins u.a., J. Am. Chem. Soc., (1982) 104:5702-08. Nichtsdestoweniger war das Guaninsynthon schwierig herzustellen, weil die exozyklische 2-Aminogruppe des Guanins nicht reaktionsfähig gegenüber Reagenzien war, die routinemäßig zur Einführung der Benzylgruppe verwendet werden, wie etwa Benzylchlorformiat, Benzyloxycarbonylimidazolid und N- alkyliertes Benzyloxycarbonylimidazol. Demgemäß wurde ein nicht-herkömmliches, mehrstufiges Verfahren beschrieben, bei dem die Behandlung mit Phenylchlorthioformiat gleichzeitig sowohl die C6-Carbonylgruppe als auch die exozyklische 2-Aminogruppe schützte. Danach wurde das Addukt in eine carbamatgeschützte Guaninverbindung umgewandelt, wodurch die C6-Carbonylschutzgruppe in der Folge eliminiert wurde. Nichtsdestoweniger ist dieses indirekte Verfahren arbeitsaufwendig, weil es die Bildung einer Carbamatschutzgruppe aus dem anfänglichen Addukt und die anschließende Schutzentfernung der C6-Carbonylgruppe erfordert.
In geeigneter Weise geschützte Derivate von 2-Amino-6-Chloropurin können in Guaninverbindungen durch Ersetzung der 6-Chloro-Gruppe mit Sauerstoffnucleophilen umgewandelt werden. Siehe Robins u.a., J. Am. Chem. Soc. (1965) 87:4934, Reese u.a., Nucl. Acids Res., (1981) 9:4611 und Hodge u.a., J. Org. Chem, (1990) 56:1553. Tatsächlich sind in geeigneter Weise geschützte Derivate des 2-Amino-6-Chloropurins die Startmaterialien, die gegenwärtig für die Herstellung der berichteten Guanin-PNA-Synthone beschrieben werden. Siehe europäische Patentanmeldung EP 92/01219 und US-Patentanmeldung PCT/US92/10921.
Die PNA-Erfinder beschreiben ein Guaninsynthon, das keinen Schutz der exozyklischen 2-Aminogruppe aufweist, jedoch die C6-Carbonylgruppe als Benzylether geschützt hat. Siehe europäische Patentanmeldung EP 92/01219. Diese Schutzstrategie ist überraschend, weil die reaktionsfähigere 2-Aminogruppe wahrscheinlich (zumindest marginal) mit der aktivierten Carboxylsäurengruppe der anderen PNA-Monomere reagiert und dadurch eine Verzweigung des synthetisierten Polymers hervorruft. Umgekehrt ist das Enol, das vorhanden ist, wenn die C6-Carbonylgruppe ungeschützt bleibt, nicht so reaktionsfähig, um zu einer Polymerverzweigung zu führen, und erforderte von daher keinen Schutz. Konsequenterweise, jedoch wegen einer Unfähigkeit, die exozyklische 2-Aminogruppe von Guanin zu schützen, wählten die Erfinder einen Weg, der nicht im Einklang steht mit der t-Boc/Benzyl-Schutzstrategie, die sie für die anderen PNA-Synthone verwendeten.
In einer Patentanmeldung aus jüngerer Zeit hat das Guanin-PNA-Synthon sowohl einen Benzylschutz der exozyklischen 2-Aminogruppe als auch eine als Benzylether geschützte C6-Carbonylgruppe. Siehe US-Patentanmeldung PCT/US92/10921. Wie oben besprochen, gibt es keine rationale Grundlage dafür, die C6-Carbonylgruppe des Guanin-PNA-Synthons zu schützen. Jedoch ermöglicht der Schutz der C6-Carbonylgruppe eine selektive Ionisation der exozyklischen 2-Aminogruppe des Guaninheterozyklus, wodurch die Reaktion der ionisierten 2-Aminogruppe mit herkömmlichen Benzylschutzreagenzien (z.B. Benzyloxycarbonylimidazol) begünstigt wird. Nichtsdestoweniger erfolgt ein Schutz der exozyklischen 2-Aminogruppe an einem Guaninderivat mit zusätzlichem Schutz an der C6-Carbonylgruppe der Nucleobase. Somit hat das resultierende Synthon Schutz sowohl der exozyklischen 2-Aminogruppe als auch der C6-Carbonylgruppe. Somit verbleibt keine berichtete zweckmäßige hochergiebige Synthese eines Guanin-PNA-Synthons mit selektivem Carbamatschutz der exozyklischen 2-Aminogruppe, wobei die C6-Carbonylgruppe ungeschützt bleibt.
Die Verfahrenstechnik der Feststoffphasen-Peptidsynthese ist auf die Synthese von PNA-Oligomeren anwendbar, erfordert jedoch häufig die Verwendung strenger Reaktionsbedingungen, die ungeeignet sind für eine DNA-Synthese und folglich auch für eine PNA-DNA-Chimärensynthese. Bei dem oben erwähnten t-Boc/Benzylschutzschema wird die endgültige Schutzentfernung der Seitenketten und die Freigabe des PNA-Moleküls vom Feststoffträger am häufigsten unter Verwendung starker Säuren aufgeführt, wie etwa wasserfreier Flußsäure (HF) (Sakakibara u.a., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1965, 38, 4921), Bortris (Trifluoracetat) (Pless u.a., Helv., Chim., Acta, 1973, 46, 1609) und Sulfonsäuren, wie etwa Trifluormethansulfonsäure und Methansulfonsäure (Yajima u.a., J. Chem. Soc., Chem. Comm., 1974, 107). Dieses herkömmliche Schutzentfernungsverfahren mit starker Säure (z.B. wasserfreier HF) erzeugt sehr reaktionsstarke Carbokationen, die zu einer Alkylierung und Acylierung empfindlicher Reste der PNA-Kette führen können. Solche Nebenreaktionen werden nur zum Teil durch die Gegenwart von Radikalfängern, wie etwa Anisol, Phenol, Dimethylsulfid und Mercaptoethanol, vermieden. Somit wird die sulfidgestützte acidolytische S_N2-Schutzentfernungsmethode (Tam u.a., J. Am. Chem. Soc., 1983, 105, 6442 und J. Am. Chem. Soc., 1986, 108, 5242), die sogenannte "niedrige" Methode, die die Vorläufer schädlicher Carbokationen zur Bildung inerter Sulfoniumsalze eliminiert, häufig bei der Peptid- und PNA-Synthese entweder allein oder in Kombination mit "hohen" Methoden verwendet. Weniger häufig sind in speziellen Fällen andere für die Schutzentfernung und/oder endgültige Abtrennung der PNA-Feststoffträgerbindung verwendete Verfahren, z.B. solche Verfahren wie eine Basenkatalysator-Alkoholyse (Barton u.a., J. Am. Chem. Soc., 1973, 95, 4501) und Ammonolyse wie auch Hydrazinolyse (Bodanszky u.a., Chem., Ind., 1964, 1423), Hydrogenolyse (Jones, Tetrahedron Lett., 1977, 2853 und Schlatter u.a., Tetrahedron Lett., 1977, 2861) und Fotolyse (Rich and Gurwara, J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 1575)).
Auf der Grundlage der Erkenntnis, daß die meisten Operationen in den Synthesezyklen der Feststoffphasen-Peptidsynthese identisch sind (wie es auch der Fall ist für Feststoffphasen-PNA), wurde eine neue Matrix, PEPS, in jüngerer Zeit eingeführt (Berg u.a., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 8024 und internationale Patentanmeldung WO 90/02749), um die Herstellung von großen Anzahlen von Peptiden zu begünstigen. Diese Matrix besteht aus einer Folie aus Polyethylen (PE) mit Grafts aus langkettigem Hängepolystyrol (PS) (Moleculargewicht in der Größenordnung von 10⁶). Das Belastungsvermögen der Folie ist so hoch wie dasjenige einer Matrix mit Kügelchen, jedoch hat PEPS die zusätzliche Flexibilität, gleichzeitig für mehrfache Synthesen geeignet zu sein.
Zwei weitere, für die gleichzeitige Synthese von großen Anzahlen von Peptiden vorgeschlagene Verfahren finden auch für die Herstellung multipler, unterschiedlicher PNA-Moleküle Anwendung. Das erste dieser Verfahren (Geysen u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3998) verwendet acrylsäuregestützte Polyethylenstäbe und 96-Mikrotiter-Mulden zur Immobilisierung der wachsenden Peptidketten und zur Ausführung der kompartimentierten Synthese. Obgleich hoch wirksam, ist dieses Verfahren nur im Mikrogrammbereich anwendbar. Das zweite Verfahren (Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 82, 5131) verwendet einen "Teebeutel", der herkömmlich genutzte Polymerkügelchen enthält. Andere relevante Vorschläge für eine mehrfache Peptid- oder PNA-Synthese beinhalten die gleichzeitige Verwendung zweier unterschiedlicher Träger mit unterschiedlichen Dichten (Tregear, in "Chemistry and Biology of Peptides", J. Meienhofer, Herausgeber, Ann Arbor Sci., Publ., Ann Arbor, 1972, Seiten 175 – 178), die Kombination von Reaktionsgefäßen über einen Verteiler (Gordman, Anal. Biochem., 1984, 136, 397), Mehrsäulen-Fest phasensynthese (z.B. Krchnak u.a., Int. J. Peptide Protein Res., 1989, 33, 209) und Holm und Meldal in "Proceedings of the 20th European Peptide Symposium", G. Jung und E. Bayer, Herausgeber, Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1989, Seiten 208 – 210) und die Verwendung von Zellstoffpapier (Eichler u.a., Collect. Czech. Chem. Commun., 1989, 54, 1746).
Während die herkömmliche quervernetzte Styrol/Divinylbenzol-Copolymermatrix und die PEPS-Träger derzeit im Zusammenhang mit der Festphasen-PNA-Synthese bevorzugt werden, umfaßt eine Liste von Beispielen von Feststoffträgern, die relevant sein können: (1) Partikel auf der Basis von Copolymeren von Dimethylacrylamid vernetzt mit N,N'-Bisacryloylethylendiamin einschließlich einer bekannten Menge von N-Tertbutoxycarbonyl-Beta-Alanyl-N'-Acryloylhexamethylendiamin. Mehrere Spacermoleküle werden üblicherweise über die Beta-Alanylgruppe zugegeben, danach gefolgt von den Aminosäurenrestkomponenten. Auch kann das beta-alanylhaltige Monomer durch ein Acryloylsarcosinmonomer während der Polymerisierung zur Bildung von Harzkügelchen ersetzt werden. Auf die Polymerisierung folgt die Reaktion der Kügelchen mit Ethylendiamin zur Bildung von Harzpartikeln, die primäre Amine als covalent verbundene Funktionalität enthalten. Die Träger auf Polyacrylamidbasis sind relativ hydrophiler als die Träger auf Polystyrolbasis und werden üblicherweise mit polaren aprotischen Lösungsmitteln einschließlich Dimethylformamid, Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon und dergleichen verwendet (siehe Atherton u.a., J. Am. Chem. Soc., 1975, 97, 6584, Bioorg. Chem. 1979, 8, 351) und J.C.S. Perkin I 538 (1981)). (2) Eine zweite Gruppe von Feststoffträgern basiert auf siliciumdioxidhaltigen Partikeln wie etwa porösen Glaskügelchen und Siliciumdioxidgel. Ein Beispiel ist das Reaktionsprodukt von Trichloro-[3-(4-Chlormethyl)Phenyl]- Propylsilan und porösen Glaskügelchen (siehe Parr und Grohmann, Angew. Chem. Internal. Ausgabe 1972, 11, 314) vertrieben unter der Handelsmarke "PORASIL E" von Waters Associates, Framingham, MA, USA. In gleicher Weise wurde ein Monoester von 1,4-Dihydroxymethylbenzol und Siliciumdioxid (vertrieben unter der Handelsmarke "BIOPAK" von Waters Associates) als vorteilhaft beschrieben (siehe Bayer und Jung, Tetrahedron Lett., 1970, 4503). (3) Eine dritte Grundart brauchbarer Feststoffträger kann als Verbundstoffe bezeichnet werden, insofern, als sie zwei Hauptbestandteile enthalten: Ein Harz und ein weiteres Material, das ebenfalls im wesentlichen inert gegenüber den angewandten Bedingungen der organischen Synthesereaktion ist. Ein bevorzugter Träger dieser Art ist im US-Patent Nr. 5 235 028 beschrieben, das durch diesen Hinweis hier einbezogen ist. Ein beispielhafter Verbundstoff (siehe Scott u.a., J. Chrom. Sci., 1971,9,577) verwendet Glaspartikel, die mit einem hydrophoben, quervernetzten Styrolpolymer überzogen sind, das reaktionsfähige Chlormethylgruppen enthält, geliefert von Northgate Laboratories, Inc., of Hamden, CT, USA. Ein weiterer beispielhafter Verbundstoff enthält einen Kern aus einem fluorinierten Ethylenpolymer, auf das Polystyrol aufgepfropft ist (siehe Kent und Merrifield, Israel J. Chem. 1978, 17, 243) und van Rietschoten in "Peptides 1974", Y. Wolman, Herausgeber, Wiley and Sons, New York, 1975, Seiten 113 – 116). (4) Andere fortlaufende Feststoffträger als PEPS, wie etwa Baumwollbögen (Lebl und Eichler, Peptide Res. 1989, 2, 232) und hydroxypropylacrylatbeschichtete Polypropylenmembranen (Daniels u.a., Tetrahedron Lett., 1989, 4345), sind ihrerseits für eine PNA-Synthese geeignet.
Während die Feststoffphasentechnik derzeit im Kontext der PNA-Synthese vorgezogen wird, sind andere Methodiken oder deren Kombinationen, z.B. in Kombination mit der Feststoffphasentechnik, ihrerseits geeignet: (1) Die klassische Lösungsphasenmethoden für die Peptidsynthese (z.B. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Berlin-New York 1984) entweder durch schrittweisen Ansatz oder durch Segment/Fragment-Kondensierung, sind von besonderer Bedeutung, wenn Produktionen in besonders großem Maßstab (Gramm, Kilogramm und sogar Tonnen) von PNA-Verbindungen in Betracht kommen. (2) Die sogenannte "Flüssigphase"-Strategie, die lösliche Polymerträger verwendet, wie etwa lineares Polystyrol (Shemyakin u.a., Tetrahedron Lett., 1965, 2323) und Polyethylenglycol (PEG) (Mutter und Bayer, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 1974, 13, 88), ist zweckmäßig. (3) Statistische Polymerisierung (siehe z.B. Odian, "Principles of Polymerization", McGraw-Hill, New York (1970) mit dem Ergebnis von Mischungen mit zahlreichen Molikulargewichten ("polydisperse") bei Peptid- oder PNA-Molekülen sind besonders beachtlich für solche Zwecke wie Abfilterung für Antiviruseffekte. (4) Eine Technik auf der Basis der Verwendung von polymergestützten aktiven Aminosäureestern (Fridkin u.a., J. Am. Chem. Soc., 1965, 87, 4646), gelegentlich bezeichnet als "umgekehrte Merrifield-Synthese" oder "Polymerreagenzsynthese", bietet den Vorteil der Vereinzelung und Reinigung von Zwischenprodukten und kann somit eine besonders geeignete Methode für die Synthese von mittelgroßen, wahlweise geschützten PNA-Molekülen sein, die nachfolgend für eine Fragmentkondensierung zu größeren PNA-Molekülen verwendet werden können. (5) Es ist ins Auge gefaßt, daß PNA-Moleküle enzymatisch durch Enzyme wie Proteasen oder deren Derivate mit neuen Spezifitäten (z.B. erhalten durch künstliche Mittel wie etwa eine Proteinkonstruktion) zusammengesetzt werden, und man kann ebenso die Entwicklung von "PNA-Ligasen" für die Kondensierung einer Anzahl von PNA-Fragmenten zu sehr großen PNA-Molekülen ins Auge fassen: (6) Da Antikörper zu praktisch jedem in Betracht kommenden Molekül erzeugt werden können, müssen auch die kürzlich entwickelten katalytischen Antikörper (Abzyme), die gleichzeitig von den Gruppen von Lerner (Tramantano u.a., Science, 1986, 234, 1566) und Schultz (Pollack u.a., Science, 1986, 234, 1570) entdeckt wurden, ebenfalls als potentielle Kandidaten für das Zusammensetzen von PNA-Molekülen berücksichtigt werden. Es gab beträchtliche Erfolge in der Produktion von Acyltransferreaktionen katalysierenden Abzymen (siehe z.B. Shokat u.a., Nature, 1989, 338, 269 und dortige Verweise). Schließlich können vollständig künstliche Enzyme, die in allerjüngster Zeit bahnbrechend von der Stewart's-Gruppe (Hahn u.a., Science, 1990, 248, 1544) aufgezeigt wurden, für eine Eignung für die PNA-Synthese entwickelt werden. Die Ausbildung von allgemein anwendbaren Enzymen, Ligasen und katalytischen Antikörpern, die in der Lage sind, spezifische Kupplungsreaktionen zu vermitteln, sollte leichter für die PNA-Synthese erreicht werden als für "normale" Peptidsynthesen, da die PNA-Moleküle häufig nur aus vier verschiedenen Aminosäuren (eine für jede der vier nativen Nucleobasen) bestehen, im Vergleich zu den zwanzig natürlich vorkommenden (Proteinogenen) Aminosäuren, die Peptide bilden. Zusammengefaßt mag keine einzelne Strategie für die Synthese eines spezifischen PNA-Moleküls insgesamt geeignet sein, und von daher kann bisweilen eine Kombination verschiedener Methoden die besten Ergebnisse erbringen.
WO-A-95/14706 beschreibt Makromoleküle, die eine erhöhte Nucleaseresistenz, mit Erhöhung der Bindungsaffinität zu einem Ergänzungsstrang, aufweisen und die das RNase-H-Enzym aktivieren. Die Makromoleküle haben die Struktur PNA-DNA-PNA, wobei der DNA-Teil zusammengesetzt ist aus Untereinheiten von 2'-Deoxy-Erythro-Pentofuranosyl-Nucleotiden und die PNA-Teile zusammengesetzt sind aus Unter einheiten von Peptidnucleinsäuren. Solche Makromoleküle sind vorteilhaft für Zwecke der Diagnostik und andere Forschungen, für die Proteinmodulierung in Organismen und für die Diagnose, Erkennung und Behandlung weiterer einer Therapie zugänglicher Zustände.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen zweckmäßigen, hochergiebigen Syntheseweg für neuartige PNA-Synthone zu schaffen, Synthone, die mit synthetischen DNA-Reagenzien und Instrumentierungen kompatibel und daher für eine Synthese von PNA-DNA-Chimären geeignet sind. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, PNA-DNA-Chimären zu schaffen. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine neuartige Syntheseroute für eine säureunbeständige geschützte Aminohauptverbindung, die beim Aufbau der obigen PNA-Synthone verwendet wird, zu schaffen.
Die vorliegende Erfindung liegt in einem Verfahren für eine zweckmäßige, hochergiebige Synthese einer neuartigen PNA, die für die Synthese von PNA-DNA-Chimären geeignet ist. Während die Erfindung auf PNA-DNA-Chimären gerichtet ist, versteht sich, daß eine PNA-RNA-Chimäre und andere verschiedenartige Kombinationen in gleicher Weise unter Verwendung der PNA-Synthone und der Methodik nach der vorliegenden Erfindung erreichbar sind. Eine PNA-DNA-Chimäre ist ein Oligomer, das sich aus zumindest einem PNA-Anteil und zumindest einem DNA-Anteil zusammensetzt. Für die Synthese einer PNA-DNA-Chimäre geeignete PNA-Synthone haben vorzugsweise einen orthogonalen Schutz, der mit der DNA-Synthese kompatibel ist, d.h. einen säureunbeständigen Schutz der Reaktionsgruppe an der Hauptverbindung und einen basenunbeständigen Schutz der Seitenketten- Nucleobasengruppen. Zusätzlich haben die PNA-Synthone Schutzgruppen mit gleichartiger Unbeständigkeit zu den in der DNA-Synthese verwendeten Schutzgruppen, um die Verwendung rigoroser chemischer Bedingungen, die die DNA zersetzen, zu vermeiden. Als Teil der vorliegenden Erfindung wird ein neuer synthetischer Prozeß für die Synthese einer vergrößerten säureunbeständigen geschützten Aminohauptverbindung in Verwendung beim Aufbau der PNA-Synthone beschrieben.
Zusätzliche Merkmale und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung dargelegt und ergeben sich zum Teil aus der Beschreibung, den Zeichnungen und Ansprüchen oder können durch die Praktizierung der vorliegenden Erfindung erkannt werden.
Durch das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wird eine PNA-DNA-Chimäre mit der allgemeinen Formel KLQMN synthetisch hergestellt. Die Buchstaben K und N stellen chemische Bindungen, wie etwa covalente Bindungen, dar, und der Buchstabe Q stellt einen Linker oder eine chemische Bindung dar. Von L und M ist das eine eine Nucleotidkomponente mit der Formel:
Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die durch G dargestellt ist, ist ein sekundäres Stickstoffatom, ein tertiäres Stickstoffatom mit einem Alkylsubstituenten, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom. Die durch B dargestellte Gruppe ist eine geschützte natürliche oder unnatürliche Nucleobase, wie in Anspruch 1 angegeben. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die durch D dargestellt ist, ist ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Methoxylgruppe oder eine Hydroxylgruppe, die von einer Schutzgruppe geschützt ist.
Das andere von L und M ist eine PNA-Komponente mit der Formel:
Die durch G und B wiedergegebenen Gruppen haben die oben angegebene Definition. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die durch R⁷ dargestellt ist, ist ein Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlich vorkommenden α-Aminosäure. Von j, g und h ist jedes gleich oder verschieden und unabhängig Null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf.
Die PNA-DNA-Chimären werden typischerweise von Nucleotidkomponenten mit der Formel:
gebildet, und die PNA-Komponenten haben die Formel:
wobei G, B, D, R⁷, j, g und h die obige Definition besitzen. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch Pn bzw. Pa dargestellt ist, ist ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe, wobei einer der Stoffe Pn und Pa ein Wasserstoffatom ist. Die durch R⁶ dargestellte Gruppe ist eine Schutzgruppe, die eliminiert werden kann, nachdem die Oligomersynthese vollständig ist. Die Einheit L¹ ist eine austretende Gruppe oder chemische Bindung. Die Einheit L² ist eine Hydroxylgruppe, eine austretende Gruppe oder eine chemische Bindung.
Vorzugsweise ist R⁶ eine Gruppe mit der Formel:
Von V₁-V₃ ist jedes gleich oder verschieden und unabhängig ausgewählt von Wasserstoff, Methyl oder Ethyl. Die durch W dargestellte Gruppe ist eine Elektronenabziehgruppe. Bevorzugte Elektronenabziehgruppen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Cyano, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Phenyl und substituiertes Phenyl, wie etwa p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl und p-Alkylsulfonylphenyl.
Vorzugsweise ist L¹ ein Halogen, CN, SCN oder eine sekundäre Aminogruppe mit der Formel: -NR⁸R⁹ wobei R⁸ und R⁹ jeweils gleich oder verschieden und unabhängig ausgewählt sind aus primären, sekundären oder tertiären Alkylgruppen mit 1 – 10 Kohlenstoffatomen oder zusammen ausgewählt sind aus Cycloalkylgruppen mit 5 – 7 Kohlenstoffatomen, die ein oder zwei Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome als Heteroatome enthalten können.
Die Einheit L² kann, falls eine austretende Gruppe, ein aktivierter Ester sein, andere austretende Gruppen wie etwa Imidazol, Triazol, Tetrazol, 3-Nitro-1,2,4-Triazol, Thiazol, Pyrrol, Benzotriazol, Benzohydroxytriazol. Die Cycloalkylgruppen beinhalten auch Imdidazol substituiert in der Phenylkomponente, Triazol substituiert in der Phenylkomponente, Tetrazol substituiert in der Phenylkomponente, 3-Nitro-1,2,4-Triazol substituiert in der Phenylkomponente, Thiazol substituiert in der Phenylkomponente, Pyrrol substituiert in der Phenylkomponente, Benzotriazol substituiert in der Phenylkomponente oder Benzohydroxytriazol substituiert in der Phenylkomponente.
Beispiele von Nucleobasenverbindungen, die durch B dargestellt sind, sind in 8 gezeigt. Die bevorzugten Nucleobasen umfassen Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, Pseudoisocytosin, 5-Methylcytosin, Hypoxanthin, Isocytosin, Pseudouracil und 2,6-Diaminopurin. Im allgemeinen haben Nucleobasen exozyklische Aminogruppen, die während der Synthese des Nucleinsäureoligomers durch eliminierbare Schutzgruppen geschützt sind (diese geschützten Nucleobasen sind eine Untergruppe von B und unabhängig durch Ba dargestellt). Die allgemein akzeptierte or thogonale Strategie für die DNA-Synthese schreibt vor, daß die exozyklischen Aminogruppen durch basenunbeständige Schutzgruppen geschützt werden.
Basenunbeständige Schutzgruppen können basenunbeständige Carbamatschutzgruppen beinhalten, wie etwa eine Ethoxycarbonylgruppe mit der Formel:
Die durch W dargestellte Gruppe ist eine Elektronenabziehgruppe. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch R²-R⁴ dargestellt ist, ist gleich oder verschieden und unabhängig ausgewählt von Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl oder t-Butyl. Bevorzugte Elektronenabziehgruppen umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Cyano, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Phenyl und substituiertes Phenyl, wie etwa p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl und p-Alkylsulfonylphenyl.
Bei der synthetischen Herstellung eines Oligomers, häufig mit einem mit einem Feststoffträger verbundenen Ende der oligomeren Kette, wird die Anzahl der Nucleotid- oder PNA-Komponenten in der Oligomerkette eine nach der anderen erhöht, bis die gewünschte Sequenz erreicht ist. Nachfolgende Nucleotid- oder PNA-Komponenten mit einer Hauptverbindungsschutzgruppe werden mit der zuvor hinzugefügten Komponente an der wachsenden Kette gekoppelt. Nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Hauptverbindungsschutzgruppe in der orthogonalen Strategie eine säureunbeständige Schutzgruppe, während die Nucleobase durch eine basenunbeständige Schutzgruppe geschützt ist. Somit kann im Falle der vorliegen den Erfindung der Buchstabe K eine covalente Bildung darstellen, die das Nucleinsäureoligomer mit der nächsten Nucleotid- oder PNA-Komponente mit einer Hauptverbindungsschutzgruppe verbindet, um so eine Reaktion an nur einer Stelle zu ermöglichen.
Die Synthese der Chimäre ist unterschiedlich in Abhängigkeit davon, ob Q eine covalente Bindung oder ein Linker in der Verwendung zur Verbindung der PNA- und Nucleotidkomponenten ist. Wenn ein Linker benutzt wird, wird der Linker zuerst mit der endständigen PNA- oder Nucleotidkomponente verbunden, gefolgt von einem typischen Kopplungszyklus. Ein Linker kann verwendet werden, um stabilere Verbindungen herbeizuführen, einen Spacer zur Optimierung der Hybridisierung der Eigenschaften der Chimäre zu schaffen und der Chimäre eine spezielle Eigenschaft zu vermitteln, wie etwa die Polarität umzukehren, oder lediglich aus Zweckmäßigkeitsgründen.
Ungeachtet dessen, ob ein Linker verwendet wird, beinhaltet die Zusammensetzung der Chimäre im allgemeinen Synthesezyklen eines Schutzentfernungsschrittes, gefolgt von einem Kopplungsschritt. Wenn Nucleotidkomponenten beteiligt sind, ist die Oxidierung des Phosphoratoms ein zusätzlich erforderlicher Schritt im Zyklus. Darüber hinaus ist, bei einer Kopplung von Nucleotidkomponenten mit einem Heteroatom, vorzuziehen, ein Stickstoff-Heteroatom zu vermeiden, weil die resultierende Stickstoff-Phosphor-Bindung säureempfindlich ist. Da die Linker üblicherweise eine leicht zugängliche funktionale Gruppe und eine zweite geschützte Reaktionsgruppe aufweisen, wird häufig der gleiche Synthesezyklus benutzt. Jedoch sind zahlreiche Manipulationen von DNA- und polypeptidartigen Komponenten allgemein bekannt und geeignet zur Einführung spezifischer reaktionsfunktionaler Gruppen in ein Oligomer, ohne an dem oben ausgeführten Synthesezyklus zu haften.
Im allgemeinen bedeutet, wenn Q eine covalente Bindung ist, der Synthesezyklus die Schaffung einer PNA- oder Nucleotidkomponente, wo L¹ oder L² eine covalente Bindung ist, Eliminierung der Pa- oder Pn-Schutzgruppe zur Erzeugung eines Wasserstoffatoms am Heteroatom G, Schaffung einer PNA- oder Nucleotidkomponente mit einer Pn- oder Pa-Schutzgruppe verschieden von der soeben eliminierten Gruppe und Kopplung dieser letzteren Komponente mit dem schutzentfernten Heteroatom G der PNA- oder Nucleotidkomponente, wo L¹ oder L² eine covalente Bindung ist.
Andererseits beinhaltet, wenn Q ein Linker ist, der Synthesezyklus die Schaffung einer PNA- oder Nucleotidkomponente, wo L¹ oder L² eine covalente Bindung ist, Eliminierung der Pa- oder Pn-Schutzgruppe zur Erzeugung eines Wasserstoffatoms am Heteroatom G, Erzeugung eines Linkers, der ein Reaktionsheteroatom durch Reaktion mit dem Heteroatom G enthält, Schaffung einer PNA- oder Nucleotidkomponente mit einer Pn- oder Pa-Schutzgruppe, verschieden von der soeben entfernten Gruppe und Kopplung dieser letzteren Komponente mit dem Heteroatom des Linkers.
Typischerweise erfolgt am Ende der Synthese, wenn das gewünschte Oligomer erreicht ist, die Eliminierung sämtlicher Schutzgruppen, d.h. die Eliminierung dessen, was immer von Pn oder Pa nicht Wasserstoff ist, und die Eliminierung der basenunbeständigen Schutzgruppen der Nucleobasen. Falls das Oligomer unter Verwen dung eines Feststoffträgers synthetisiert wurde, tritt auch eine Abtrennung des Oligomers vom Feststoffträger ein. Da eine Feststoffphasensynthese bevorzugt wird, bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf einen mit PNA-DNA-Chimären verbundenen Träger.
PNA-DNA-Chimären nach der vorliegenden Erfindung können eine nachweisbare Komponente enthalten. Beispiele nachweisbarer Komponenten enthalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Enzyme, Antigene, radioaktive Markierungen, Affinitätsmarkierungen, fluoreszierende Markierungen, ultraviolette Markierungen, infrarote Markierungen und Spinmarkierungen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf PNA-Synthone mit der Formel:
gerichtet, wobei G, R⁷, j, g und h oben definiert sind. Die durch Pg dargestellte Gruppe ist eine säureunbeständige Schutzgruppe. Die durch Ba dargestellte Gruppe ist eine natürliche oder unnatürliche Nucleobase mit einer exozyklischen Aminogruppe geschützt durch eine basenunbeständige Aminoschutzgruppe. Beispiele von Ba umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Adenin, Cytosin, Guanin, Pseudoisocytosin, 5-Methylcytosin, Isocytosin und 2,6-Diaminopurin. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist G ein sekundäres Stickstoffatom. Bei anderen bevor zugten Ausführungsformen sind Pg und die basenunbeständige Aminoschutzgruppe unabhängig Carbamatschutzgruppen.
Nach einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf PNA-Synthone mit der Formel:
gerichtet, wobei Pg und Ba die obige Definition haben.
Bevorzugte Ausführungsformen der Verbindung treten ein, wenn Pg eine Carbamatschutzgruppe ist und speziell die Carbamatschutzgruppe mit der Formel:
Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch A₁-A₁₀ dargestellt ist, ist gleich oder verschieden und unabhängig Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Hydroxy-, Methoxy-, Ethoxy-, Amid- oder Estergruppen. Die Estergruppe beinhaltet einen aktivierten Ester. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die dargestellt ist durch R⁴, ist Wasserstoff, Methyl oder Ethyl. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform ergibt sich, wenn Pg 4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl ist.
Bevorzugte Ausführungsformen der obigen Verbindungen ergeben sich, wenn Ba Adenin, Cytosin, Guanin, Pseudoisocytosin, 5-Methylcytosin, Isocytosin oder 2,6-Diaminopurin ist. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich auch, wenn Ba geschützt ist durch eine basenunbeständige Carbamatschutzgruppe mit der Formel:
wobei W und R²-R⁴ die obige Definition haben.
Die basenunbeständige Carbamatschutzgruppe kann auch 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl oder eine 1-Cyanoethoxycarbonylgruppe sein mit der Formel:
wobei R²-R⁴ die obige Definition aufweisen. Eine bevorzugte Ausführungsform ergibt sich, wenn R² ein Wasserstoffatom ist und R³ und R⁴ jeweils Methylgruppen sind. Bei einer weiteren Ausführungsform kann die basenunbeständige Carbamatschutzgruppe eine Sulfoethoxycarbonylgruppe sein mit der Formel:
wobei R²-R⁴ die obige Definition aufweisen. Der Buchstabe n ist die ganze Zahl eins oder zwei. Die durch R⁵ dargestellte Gruppe ist ausgewählt von Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl oder einer substituierten oder unsubstituierten Phenylgruppe. Die substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppe hat die Formel:
wobei das Atom oder die Gruppe, das bzw. die durch jeweils a–e dargestellt ist, gleich oder verschieden und unabhängig ausgewählt ist von F, Cl, Br, I, Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Propyl, n-Butyl, t-Butyl, Phenyl, Methoxy, Ethoxy, -NO₂, -CN, -SO₃H, -SCH₃ oder -(O)SCH₃. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich, wenn R⁵ Methyl ist, n zwei ist und R²-R⁴ jeweils Wasserstoff sind, und wenn R5 ein unsubstituiertes Phenyl ist, n zwei ist und R²-R⁴ jeweils Wasserstoff sind.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Adenin-PNA-Synthon mit der Formel:
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Cytosin-PNA-Synthon mit
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Guanin-PNA-Synthon mit der Formel:
wobei n eins oder zwei ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Guanin-PNA-Synthon mit der Formel:
wobei n eins oder zwei ist.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Thymin-PNA-Synthon mit der Formel:
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Pseudoisocytosin-PNA-Synthon mit der Formel:
Nach einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf PNA-Oligomere mit der allgemeinen Formel: KLQMN gerichtet, wobei K, Q und N die obige Definition aufweisen. L und M sind jeweils PNA-Komponenten mit der Formel:
wobei G, B, R⁷, g, h und j die obige Definition aufweisen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist auf eine säureunbeständige geschützte Hauptverbindung gerichtet mit der allgemeinen Formel:
Die durch Pg dargestellte Gruppe ist eine säureunbeständige Schutzgruppe. Das durch G dargestellte Atom ist ein sekundäres Stickstoffatom, ein tertiäres Stickstoffatom mit einem Alkylsubstituenten, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom. Die Einheit R⁷ ist ein Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer natürlicherweise vorkommenden α-Aminosäure. Die Buchstaben g und h sind gleich oder verschieden und unabhängig Null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf.
Eine bevorzugte säureunbeständige geschützte Hauptverbindung ist eine säureunbeständige geschützte Aminohauptverbindung mit der allgemeinen Formel:
Die durch R⁷ dargestellte Gruppe ist Wasserstoff oder eine Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlicherweise vorkommenden α-Aminosäure. Jeder der Buchstaben g und h ist gleich oder verschieden und unabhängig Null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf. Vorzugsweise ist die durch Pg dargestellte Gruppe eine säureunbeständige Schutzgruppe mit der Formel:
A₁-A₁₀ sind jeweils gleich oder verschieden und unabhängig Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Hydroxy-, Methoxy-, Ethoxy-, Amid-, Ester- oder aktivierte Ester-Gruppen. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die durch R⁴ dargestellt ist, ist Wasserstoff, Methyl oder Ethyl. Die bevorzugte Ausführungsform ergibt sich, wenn R⁴ ein Wasserstoffatom ist, A₃ und A₈ jeweils Methylgruppen sind, A₁, A₂, A₄-A₇, A₉ und A₁₀ jeweils Wasserstoffatome sind, g eins ist, h null ist und R⁷ Wasserstoff ist.
Im allgemeinen beinhaltet das Verfahren der synthetischen Herstellung der bevorzugten säureunbeständigen aminogeschützten Hauptverbindung die Kopplung eines Alkohols, z.B. eines Benzhydrolderivats, mit einem Diamin unter Verwendung eines Carbonyläquivalents, wodurch eine Carbamatschutzgruppe an einer der Aminogruppen gebildet wird. Nach Bildung der Carbamatschutzgruppe wird eine nicht reagierte primäre Aminogruppe des Diamins in ein Acetamidderivat umgewandelt, das nachfolgend in eine Alkylcarboxygruppe umgebildet wird. Andere Ausführungsformen der säureunbeständigen geschützten Hauptverbindung, die ein Schwefelatom oder Sauerstoffatom als Heteroatom G enthalten, können unter Verwendung der obigen Synthesemethodik hergestellt werden.
Nach einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf die Endverwendung der PNA-DNA-Chimären gerichtet. PNA's zeigen eine stärkere Bindungsaffinität mit DNA unter definierten Bedingungen, die für zahlreiche Zwecke ausgenutzt werden können. In gleicher Weise haben PNA-DNA-Chimären das Potential, eine größere Bindungsaffinität mit DNA zu zeigen, die die potentiellen Verwendungen dieses einzigartigen synthetischen Polymers vergrößert. Beispiele der Nutzanwendung von PNA-DNA-Chimären beinhalten therapeutische oder antisensorische Mittel, Primer in Polymerasereaktionen und Sonden für die Erfassung von genetischen Materialien oder Sequenzen.
Es versteht sich, daß sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die nachfolgende detaillierte Beschreibung ein Beispiel sind und der Erläuterung dienen mit dem Ziel einer weiteren Erklärung der beanspruchten Erfindung. Das Verständnis der Erfindung ergibt sich des weiteren aus den nachfolgenden Zeichnungen, die hier einbezogen sind und einen Teil der vorliegenden Spezifikation darstellen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der Synthese der bevorzugten säureunbeständigen geschützten Amino-Hauptverbindung des Aminosäure-N-(2-Aminoethyl)-Glycins nach der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine schematische Darstellung der Synthese der bevorzugten geschützten Carbamat-Cytosin-Seitenketten-Komponente nach der vorliegenden Erfindung.
3 ist eine schematische Darstellung der Synthese der bevorzugten geschützten Carbamat-Adenin-Seitenketten-Komponente nach der vorliegenden Erfindung.
4 ist eine schematische Darstellung der Synthese der bevorzugten geschützten Carbamat-Guanin-Seitenketten-Komponente nach der vorliegenden Erfindung.
5 ist eine schematische Darstellung der Synthese eines bevorzugten Reagenz nach der vorliegenden Erfindung für die Bildung einer Carbamat-Schutzgruppe.
6 ist eine schematische Darstellung der Kopplung der bevorzugten säureunbeständigen geschützten Amino-Hauptverbindung des Aminosäure-N-(2-Aminoethyl)-Glycins mit den bevorzugten Nucleobasen-Seitenkettenkomponenten zur Bildung der bevorzugten PNA-Synthone nach der vorliegenden Erfindung. Es sind die Nucleobasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin gezeigt.
7 ist eine schematische Darstellung der Oxidation des bevorzugten Guanin-PNA-Synthons unter Schaffung des bevorzugten orthogonal geschützten Guanin-PNA-Synthons nach der vorliegenden Erfindung, das für eine PNA-DNA-Chimären-Synthese geeignet ist.
8 ist ein Schaubild, das die strukturellen Darstellungen von bei der vorliegenden Erfindung verwendbaren natürlichen und unnatürlichen Nucleobasen veranschaulicht.
9 ist eine hochdruckflüssigchromatographische Aufzeichnung der PNA-Oligomersequenz H₂N-CTTCTCC-CONH₂.
10 ist eine hochdruckflüssigchromatographische Aufzeichnung der PNA-Oligomersequenz H₂N-CGCTATACCC-CONH₂.
11 ist eine hochdruckflüssigchromatographische Aufzeichnung der ungereinigten PNA-DNA-Chimären-Sequenz DMBhoc-HN-CACAC-CONH-Linker-5'-CCAGT-3'-OH. Der unterstrichene Bereich der Sequenz stellt die PNA-Sequenz und der fettgedruckte Bereich der Sequenz die DNA-Sequenz dar. DMBhoc ist 4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl.
12 ist eine hochdruckflüssigchromatographische Aufzeichnung der gereinigten PNA-DNA-Chimären-Sequenz DMBhoc-HN-CACAC-CONH-Linker-5'-CCAGT-3'-OH. Der unterstrichene Bereich der Sequenz stellt die PNA-Sequenz und der fettgedruckte Bereich der Sequenz die DNA-Sequenz dar. DMBhoc ist 4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl.
13 ist eine hochdruckflüssigchromatographische Aufzeichnung der PNA-DNA-Chimären-Sequenz (nur Gradient) DMBhoc-HN-CACAC-CONH-Linker-5'-CCAGT-3'-OH. Der unterstrichene Bereich der Sequenz stellt die PNA-Sequenz und der fettge druckte Bereich der Sequenz die DNA-Sequenz dar. DMBhoc ist 4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Anmelder hat ein geeignetes hochergiebiges Verfahren zur Herstellung neuartiger PNA-Synthone entwickelt, die für die Synthese von PNA-DNA-Chimären geeignet sind, welche Oligomere sind, die aus zumindest einer PNA-Komponente und zumindest einer DNA-Komponente zusammengesetzt sind. Im allgemeinen haben die PNA-Synthone einen orthogonalen Schutz, der mit der DNA-Synthese kompatibel ist, d.h. Schutzgruppen, die unter milden Bedingungen eliminiert werden können, die die DNA nicht wesentlich zersetzen und einen basenunbeständigen Schutz der Nucleobase und einen säureunbeständigen Schutz der Hauptverbindungskomponente aufweisen.
Zuerst wird die säureunbeständige geschützte Hauptverbindung des PNA-Synthons synthetisch hergestellt. Vorzugsweise sollte die säureunbeständige Schutzgruppe eine gleichartige Unbeständigkeit zu der gebräuchlichsten DNA-Hauptverbindungsschutzgruppe, Dimethoxytrityl (DMT), aufweisen, wobei die Anmelder einen neuen Syntheseweg für eine bevorzugte säureempfindliche Hauptverbindung entwickelt haben.
Als zweites wird die Nucleobasen-Seitenkettenkomponente mit dem basenunbeständigen Schutz der exozyklischen Aminogruppen synthetisiert. Es können entwe der natürliche oder unnatürliche Nucleobasen in die PNA-Synthone eingearbeitet werden.
Als drittes wird die säureunbeständige geschützte Hauptverbindung mit der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente gekoppelt, die einen basenunbeständigen Schutz der exozyklischen Aminogruppe, falls vorhanden, hat. Die Kopplungsreaktion führt zu PNA-Synthonen, die geeignet sind für die Synthese von PNA-DNA-Chimären sowie PNA-RNA-Chimären und verschiedenartigen anderen Kombinationen. Die PNA-Synthone nach der vorliegenden Erfindung können auch für die Synthese von PNA-Oligomeren unter sehr milden Bedingungen, anders als die derzeit verwendeten, benutzt werden.
Schließlich werden die PNA-Synthone nach der vorliegenden Erfindung bei der Synthese von PNA-DNA-Chimären unter Darstellung ihrer Nutzanwendung mit handelsüblich erhältlichen DNA-Nucleotiden verwendet. Während die Beschreibung auf PNA-DNA-Chimären fokussiert ist, versteht sich, daß die PNA-Synthone und Methodiken nach der vorliegenden Erfindung in gleicher Weise auf PNA-RNA-Chimären und verschiedenartige andere Kombinationen anwendbar sind.
Synthese der säureunbeständigen geschützten Hauptverbindung
Nach einer Ausführungsform beruht die Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung einer säureunbeständigen geschützten Hauptverbindung eines PNA-Synthons. Die bevorzugte Hauptverbindung ist eine säureunbeständige aminogeschützte Hauptverbindung (siehe 1). Die säureunbeständige Schutzgruppe ist unter milden Bedingungen eliminierungsfähig, die die DNA-Komponenten nicht wesentlich zersetzen. Wenn daher die säureunbeständige Hauptverbindung mit der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente verbunden wird, ist das resultierende PNA-Synthon geeignet für eine PNA-DNA-Chimären-Synthese.
Die säureunbeständige geschützte Hauptverbindung hat die allgemeine Formel:
Die durch Pg wiedergegebene Gruppe ist eine säureunbeständige Schutzgruppe. Das durch G dargestellte Atom ist ein sekundäres Stickstoffatom, ein tertiäres Stickstoffatom mit einem Alkylsubstituenten, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom. Die Einheit R⁷ ist ein Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlich vorkommenden α-Aminosäure. Die Buchstaben g und h sind gleich oder verschieden und unabhängig Null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf.
Eine bevorzugte säureunbeständige geschützte Hauptverbindung ist eine säureunbeständige aminogeschützte Hauptverbindung mit der Formel:
Die durch Pg, R⁷, g und h dargestellten Einheiten weisen die obige Definition auf. Obschon nachfolgend die Synthese der bevorzugten säureunbeständigen aminogeschützten Hauptverbindung besprochen wird, sind andere Ausführungsformen der säureunbeständigen geschützten Hauptverbindung, die, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Sauerstoffatom oder Schwefelatom als G aufweisen, in gleicher Weise gemäß der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen allgemeinen Synthesemethodik zugänglich.
Schritt 1
Der erste Schritt bei der Synthese der säureunbeständigen geschützten Hauptverbindung ist die Auswahl des geeigneten Alkohols, der in die Schutzgruppe eingearbeitet wird. Der Alkohol kann im Handel erhältlich sein oder synthetisch hergestellt werden. Die Beständigkeit der Schutzgruppe hängt ab von der Stabilität und Leichtigkeit der Bildung des Kations des dehydrierten Alkohols in einer sauren Lösung. Diese Aussage ist für viele Alkohole allgemein bekannt und steht dem Fachmann ohne weiteres zur Verfügung. Siehe Sieber u.a., Helv. Chemica Acta (1968) 51:614-22.
Beispiele von Alkoholen, die die geforderte Säureunbeständigkeit liefern, sind, unter anderem, Benzhydrolderivate mit der Formel:
A₁ – A₁₀ ist jeweils gleich oder verschieden und unabhängig Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Hydroxy-, Methoxy-, Ethoxy-, Amid-, Ester- oder aktivierte Estergruppen. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die durch R⁴ dargestellt ist, ist Wasserstoff, Methyl oder Ethyl. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die durch R⁴ dargestellt ist, ist Wasserstoff, Methyl oder Ethyl. Alkylgruppen beinhalten, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl und t-Butyl. Alkoxygruppen beinhalten, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Methoxy und Ethoxy. Die bevorzugte Ausführungsform ergibt sich, wenn R⁴ ein Wasserstoffatom ist, A₃ und A₈ jeweils Methylgruppen sind und A₁, A₂, A₄-A₇, A₉ und A₁₀ jeweils Wasserstoffatome sind.
Es sei nun auf 1 verwiesen, wonach der bevorzugte Alkohol über eine Grignard-Reaktion synthetisiert wird. Zuerst wird das Magnesiumsalz von 4-Bromtoluol, dem Grignard-Reagenz, in einem wasserfreien nicht-nucleophilen Lösungsmittel auf Etherbasis hergestellt. Bespiele geeigneter Lösungsmittel beinhalten, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Diethylether, Diisopropylether, Dioxan und Tetrahydrofuran. Das bevorzugte Lösungsmittel ist Tetrahydrofuran. Nach Herstellung des Grignard-Reagenz wurde Paratolualdehyd der bei Raumtemperatur gehaltenen Lösung des Magnesiumsalzes mit einer solchen Geschwindigkeit zugesetzt, daß ein Rückfluß erzeugt wurde. Es wurde ausreichend Zeit für den Zusatz des Grignard-Reagenz zum Aldehydderivat gegeben, sodann wurde die Reaktion mit einer Protonenquelle gelöscht. Nach der Aufarbeitung des Reaktionsgemisches wird 4,4'-Dimethylbenzhydrol isoliert (Verbindung I).
Schritt 2
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der zweckmäßig ausgewählte Alkohol in ein entsprechendes säureunbeständiges aminogeschütztes Diamin umgewandelt, das die allgemeine Formel hat:
Die durch Pg dargestellte Gruppe ist eine säureunbeständige Schutzgruppe. Der Buchstabe g ist die ganze Zahl Null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf. Nach der nachstehend beschriebenen Synthesemethodik ist Pg notwendigerweise eine Carbamat-Schutzgruppe.
Im allgemeinen wird der Alkohol mit einem Carbonyläquivalent zur Reaktion gebracht, gefolgt von einer Reaktion mit einem Diamin mit der Formel:
Der Buchstabe g ist Null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf. Beispiele von Carbonyläquivalenten beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Phosgen, Phosgenderivate, Carbonyldiimidazol und Di-N-Succinimidylcarbonat.
Nach 1 ist das bevorzugte Carbonyläquivalent Carbonyldiimadizol (CDI). Das bevorzugte Diamin ergibt sich, wenn g eins ist, d.h. Ethylendiamin ist. Somit wird 4,4'-Dimethylbenzhydrol einer Lösung von CDI in einem wasserfreien nicht-nucleophilen Lösungsmittel bei etwa 0° C zugesetzt. Beispiele von wasserfreien nicht-nucleophilen Lösungsmitteln sind Diethylether, Diisopropylether, Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril, Dichlormethan, Chloroform, Carbontetrachlorid, Benzol und Toluol. Das bevorzugte Lösungsmittel ist Dichlormethan. Nachdem man die Reaktion eine ausreichenden Zeit stattfinden läßt, was durch eine Dünnschichtchromatography (dsc) überwacht werden kann, wird das Reaktionsgemisch mit Wasser gewaschen, getrocknet und das Dichlormethan verdampft, um einen Feststoff zu ergeben.
Der Feststoff wird erneut in einem wasserfreien nicht-nucleophilen Lösungsmittel, wie oben beschrieben, gelöst. Dichlormethan ist das bevorzugte Lösungsmittel. Die Dichlormethanlösung des Feststoffes wird der Amino-Hauptverbindungskomponente, Ethylendiamin, unter Rühren bei etwa 0° C zugesetzt. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird das Reaktionsgemisch mit Wasser gewaschen, getrocknet und N-(4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl)-Ethylendiamin wird isoliert (Verbindung II). Somit hat das bevorzugte säureunbeständige aminogeschützte Diamin die Formel:
Schritt 3
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird nach der Bildung des säureunbeständigen aminogeschützten Diamins die verbleibende primäre Aminogruppe des Diamins in ein Acetamidderivat umgewandelt, wodurch eine vollgeschützte Diaminverbindung mit der allgemeinen Formel:
produziert wird. Die Einheiten Pg und g haben die obige Definition. Das durch X dargestellte Atom ist ein (e) elektronegative(s) Atom oder Gruppe. Beispiele von elektronegativen Atomen beinhalten, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Halogenatome wie etwa Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Im allgemeinen wird das säureunbeständige aminogeschützte Diamin mit einem Alkyltrihaloacetat zur Reaktion gebracht, um die vollgeschützte Diaminverbindung zu produzieren. Vorzugsweise wird eine nicht-nucleophile Base zugesetzt, um etwaige durch die Zersetzung des Alkyltrihaloacetats gebildete Säure zu neutralisieren. Beispiele nicht-nucleophiler Basen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Triethylamin, Diisopropylamin, N-Methylmorpholin und N-Ethylmorpholin. Die bevorzugte nicht-nucleophile Base ist Triethylamin. Unter den verschiedenartigen Beispielen von Alkyltrihaloacetatderivaten, die, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Methyl- und Ethylester beinhalten können, wird Ethyltrifluoracetat bevorzugt. Demgemäß ist das durch X dargestellte bevorzugte Atom Fluor.
Daher wird das bevorzugte vollgeschützte Diamin durch eine Reaktion der Verbindung II mit Ethyltrifluoracetat in Dichlormethan bei etwa 0° C in Gegenwart von Triethylamin (siehe 1) hergestellt. Das aus dieser Reaktion isolierte Produkt ist N-[N'-4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2'-Aminoethyl)]Glycin, das die Formel
Schritt 4
Der letzte Schritt bei der Herstellung der säureunbeständigen aminogeschützten Hauptverbindung ist die Umwandlung der Acetamid-Funktionalität in eine Alkylcarboxygruppe. Da die Acetamid-Funktionalität den Elektronenabzieh-Trihalosubstituenten enthält, ist das in der Acetamid-Funktionalität enthaltene sekundäre Stickstoffproton einer Eliminierung durch eine Base zugänglich, um ein nucleophiles Stickstoffanion zu produzieren. Beispiele von Basen, die für diese Umwandlung benutzt werden können, beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Lithiumhydrid, Natriumhydrid und Kaliumhydrid. Die bevorzugte Base ist Natriumhydrid.
Nach der Eliminierung des sekundären Stickstoffprotons wird ein Alkylhaloalkylat zugesetzt, wobei das Reaktionsgemisch gerührt werden kann, bis die Reaktion vollständig ist. Beispiele von Alkylhaloalkylaten sind, unter anderem, Methylchloracetat, Ethylchloracetat, Methylbromacetat, Ethylbromacetat, Methyliodacetat, Ethyliodace tat, Methy-3-Chlorpropionat, Ethyl-3-Chlorpropionat, Methyl-3-Brompropionat, Ethyl-3-Brompropionat, Methyl-3-Iodpropionat und Ethyl-3-Iodpropionat. Die bevorzugte Verbindung ist Ethylbromacetat. Zusätzlich kann das Alkylhaloalkylat an dem Halo enthaltenden Kohlenstoffatom mit einer Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlich vorkommenden α-Aminosäure ersetzt werden.
Ein Rohzwischenprodukt wird isoliert und dann mit einer Hydroxidionenquelle behandelt. Beispiele von Hydroxidionenquellen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid. Die bevorzugte Hydroxidionenquelle ist Lithiumhydroxid. Nach der Aufarbeitung wird eine säureunbeständige aminogeschützte Hauptverbindung isoliert, die die allgemeine Formel hat:
Die Einheiten Pg und g haben die obige Definition. Der Buchstabe h ist 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 und R⁷ ist Wasserstoff oder eine Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlich vorkommenden α-Aminosäure. Nach 1 hat die bevorzugte säureunbeständige aminogeschützte Hauptverbindung die Formel:
Synthese der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente
In einer weiteren Ausgestaltung ist die Erfindung auf die Synthese von Nucleobasen-Seitenkettenkomponenten zur Kopplung mit der säureunbeständigen aminogeschützten Hauptverbindung gerichtet (siehe 2 bis 5).
Da die PNA-Synthone nach der vorliegenden Erfindung orthogonal geschützt sind, sind die exozyklischen Aminogruppen der Nucleobasen-Seitenkettenkomponenten notwendigerweise nicht mit säureunbeständigen Schutzgruppen geschützt. Beispiele möglicher Schutzgruppen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, diejenigen, die durch basische Bedingungen, photolytische Bedingungen oder Hydrogenolyse-Bedingungen abgetrennt werden. Die bevorzugten Nucleobasen-Schutzgruppen sind basenunbeständig. Im allgemeinen haben die neuartigen Nucleobasen-Seitenkettenkomponenten die allgemeine Formel:
Der Buchstabe j ist Null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf. Die Einheit Ba ist eine natürliche oder unnatürliche Nucleobase mit einer exozyklischen Aminogruppe geschützt durch eine basenunbeständige Schutzgruppe (wie oben beschrieben, ist Ba eine Untergruppe von B). Beispiele von natürlichen Nucleobasen mit einer exozyklischen Aminogruppe sind Adenin, Cytosin und Guanin. Beispiele von unnatürlichen Nucleobasen mit einer exozyklischen Aminogruppe beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Pseudoisocytosin, 5-Methylcytosin, Isocytosin und 2,6-Diaminopurin.
Beispiele von basenunbeständigen Aminoschutzgruppen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)- und Ethoxycarbonylgruppen mit der allgemeinen Formel:
Die durch W dargestellte Gruppe ist eine Elektronenabziehgruppe. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch R²-R⁴ dargestellt ist, ist gleich oder verschieden und unabhängig Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl oder t-Butyl.
Die neuartigen Nucleobasen-Seitenkettenkomponenten nach der vorliegenden Erfindung können über ein neuartiges Isocyanatverfahren synthetisch hergestellt werden, wie es in einer gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung mit dem Titel "Improved Synthons for the Synthesis and Deprotection of Peptide Nucleic Acids Under Mild Conditions", US-Anmeldung Nr. 08/487 666, eingereicht am 7. Juni 1995, jetzt US-Patent Nr. 6 133 444, beschrieben ist, welches hier speziell durch den Hinweis in seiner Gesamtheit einbezogen gilt. Statt dessen können die Nucleobasen-Seitenkettenkomponenten durch herkömmliche Verfahren synthetisch hergestellt werden, die einen Schutz der exozyklischen Aminogruppen der Nucleobase mit Imidazoliden oder Alkylimidazolium-Salzen beinhalten.
Schritt 1
Bei den beiden obigen Syntheseschemata wird zuerst eine Nucleobase in eine teilweise geschützte Nucleobasenverbindung mit einem Alkylformatsubstituenten, einem Alkylacetatsubstituenten oder einem Alkylestersubstituenten wie etwa einem Alkylpropionat, einem Alkylbutanoat, einem Alkylpentanoat oder einem Alkylhexanoat umgewandelt. Somit hat die teilweise geschützte Nucleobasenverbindung die Formel:
Der Buchstabe j ist Null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf. Die Einheit B ist die Nucleobase mit einer exozyklischen Aminogruppe. Die durch R¹⁰ dargestellte Gruppe ist Methyl, Ethyl, 2,2,2-Trichlorethyl, 2-(Trimethylsilyl)-Ethyl, 2-(Phenylthio)-Ethyl, Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Allyl, 1-Isopropylallyl, Cinamyl, 4-Nitrocinamyl oder ein substituiertes oder unsubstituiertes Benzyl.
Im allgemeinen erzeugt eine nachfolgende Behandlung der Nucleobase mit einer Base wie etwa Kaliumcarbonat oder Kalium-t-Butoxid und einem Alkylhaloalkylat die teilweise geschützte Nucleobasenverbindung. Ein Alkyl- oder Benzylbromacetat erzeugt die bevorzugten teilweise geschützten Nucleobasenverbindungen.
Nach 2 hat die bevorzugte teilweise geschützte Cytosinverbindung die Formel:
Nach 3 hat die bevorzugte teilweise geschützte Adeninverbindung die Formel:
Nach 4 hat die bevorzugte teilweise geschützte Guanin-Vorläuferverbindung die Formel:
Schritt 2
Die teilweise geschützte Nucleobasenverbindung wird in eine vollgeschützte Nucleobasenverbindung dadurch umgewandelt, daß die exozyklische Aminogruppe der Nucleobase mit einer basenunbeständigen Schutzgruppe geschützt wird. Die vollgeschützte basenunbeständige geschützte Verbindung hat die allgemeine Formel:
Der Buchstabe j hat die früher gegebene Definition. Die durch Ba und R¹⁰ dargestellten Gruppen entsprechen der früheren Definition. Die basenunbeständige Schutzgruppe kann entweder durch die Isocyanatmethode, wie oben angeführt, z.B. wie bei der teilweise geschützten Guaninverbindung, oder durch herkömmliche Methoden, z.B. wie bei den teilweise geschützten Adenin- und Cytosinverbindungen, gebildet werden.
Beispiele von basenunbeständigen Aminoschutzgruppen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)- und Ethoxycarbonylgruppen mit der allgemeinen Formel:
Die durch W dargestellte Gruppe ist eine Elektronenabziehgruppe. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch R²-R⁴ dargestellt ist, ist gleich oder verschieden und unabhängig Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl oder t-Butyl.
Beispiele für Elektronenabziehgruppen sind, unter anderem, Cyano, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Phenyl und substituiertes Phenyl wie etwa p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl und p-Alkylsulfonylphenyl. Mit CN als Elektronenabziehgruppe hat die basenunbeständige Schutzgruppe die Formel:
Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch R²-R⁴ dargestellt ist, ist gleich oder verschieden und unabhängig Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl oder t-Butyl.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der 1-Cyanoethoxycarbonylgruppe erfolgt durch Reaktion des entsprechenden 1-Cyanoethanolderivats mit Carbonyldimidazol zur Bildung des Imidazolidsalzes. Das bevorzugte 1-Cyanoethanolderivat ist 2-Hydroxy-2-Methyl-Butyronitril. Somit erzeugt, gemäß 5a, die Reaktion von 2-Hydroxy-2-Methyl-Butyronitril mit Carbonyldiimidazol die Verbindung XIV, 2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-Imidazol.
Zur Verstärkung der Acylierungswirkung dieses bevorzugten Reagenz wird 2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-Imidazol mit Methyl-Trifluormethansulfonat zur Erzeugung der Verbindung XV (siehe 5b) zur Reaktion gebracht. Vorzugsweise wird das Reagenz in situ unmittelbar vor der Reaktion mit der teilweise geschützten Nucleobasenverbindung erzeugt.
Somit hat nach 2 die bevorzugte vollgeschützte Cytosinverbindung die Formel:
Nach 3 hat die bevorzugte vollgeschützte Adeninverbindung die Formel:
Mit einem Sulfoxid oder Sulfon als Elektronenabziehgruppe wird die vollgeschützte Nucleobasenverbindung typischerweise über die Isocyanatmethode gebildet und hat
Der Buchstabe n ist eins oder zwei. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch R²-R⁴ dargestellt ist, ist gleich oder verschieden und unabhängig Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl oder t-Butyl. Die durch R⁵ dargestellte Gruppe ist Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl oder ein substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl mit der Formel:
Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch a–e dargestellt ist, ist gleich oder verschieden und unabhängig F, Cl, Br, I, Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Phenyl, Methoxy, Ethoxy, -NO₂, -CN, -SO₃H, -SCH₃ oder -(O)SCH₃.
Speziell wird, im Falle von Guanin, die exozyklische Aminogruppe von 2-Amino-6-Chlorpurin zuerst als Thioethergruppe, d.h. ein unoxidierter Schwefel, geschützt (siehe 4, Verbindung XII). Obgleich keine basenunbeständige Schutzgruppe, verhindert die Thioethergruppe eine vorzeitige Baseneliminierung der schwefelhaltigen Schutzgruppe, da die Herstellung der geschützten Carbamat-Guanin-Seitenkettenkomponente (Verbindung XIII) eine Behandlung mit einer starken Base verlangt. Erst nach der Kopplung mit der säureunbeständigen aminogeschützten Hauptverbindung wird das Schwefelatom zur Bildung der basenunbeständigen Schutzgruppe oxidiert.
Somit hat, nach 4, die bevorzugte vollgeschützte Guaninvorläuferverbindung die Formel:
Schritt 3
Im allgemeinen wird die Acetatestergruppe der vollgeschützten Nucleobasenverbindung mit Säure zur Herstellung der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente hydrolisiert. Im Falle der vollgeschützten Guaninverbindung erfolgt die Hydrolyse gleichzeitig mit der Bildung der C6-Carbonylgruppe, wie beschrieben in "Improved Synthons for the Synthesis and Deprotection of Peptide Nucleic Acids Under Mild Conditions" (Anwaltsakte Nr. SYP-091; US-Anmeldung Nr. __________, eingereicht am 7. Juni 1995) (siehe 4 der vorliegenden Anmeldung).
Gemäß 2 hat die bevorzugte Cytosin-Seitenkettenkomponente die Formel:
Gemäß 3 hat die bevorzugte Adenin-Seitenkettenkomponente die Formel:
Gemäß 4 hat die bevorzugte Guanin-Seitenkettenkomponente die Formel:
Weitere Nucleobasen-Seitenkettenkomponenten beinhalten eine Thymin-Seitenkettenkomponente und eine Uracil-Seitenkettenkomponente. Diesen beiden Nucleobasen fehlen exozyklische Aminogruppen und verlangen daher nicht die zusätzlichen Schutzschritte. Jedoch können die Thymin-Seitenkettenkomponente und die Uracil-Seitenkettenkomponente mit der säureunbeständigen aminogeschützten Hauptverbindung zur Bildung neuer PNA-Synthone gekoppelt werden.
PNA-Synthon-Synthese ("Der Kopplungsschritt")
Nach einer weiteren Ausgestaltung liegt die Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung von PNA-Synthonen, die für die Synthese von PNA-DNA-Chimären geeignet sind (siehe 6). Die Herstellung eines Guanin-PNA-Synthons mit einer Thioethergruppe, die die exozyklische Aminogruppe des Guanins schützt, beinhaltet die Oxidierung der Thioethergruppe zu einem Sulfoxid- oder Sulfonderivat (siehe 7). Das resultierende Sulfoxid oder Sulfon wandelt die Thioetherschutzgruppe in eine basenunbeständige Schutzgruppe um, so daß ein orthogonal geschütztes Guanin-PNA-Synthon geschaffen wird.
Die Kopplung der säureunbeständigen geschützten Hauptverbindung mit der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente erzeugt ein PNA-Synthon mit der Formel:
Die Einheiten Pg, Ba, R⁷, g, h und j entsprechen der früheren Definition. Die durch G dargestellte Gruppe ist ein sekundäres Stickstoffatom, ein tertiäres Stickstoffatom mit einem Alkylsubstituenten, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom.
Da das PNA-Synthon orthogonal geschützt ist, d.h. typischerweise eine säureunbeständige Schutzgruppe und eine basenunbeständige Schutzgruppe, minimiert das Verfahren der Kopplung der beiden Komponenten vorzugsweise die Bedingungen, die zur Eliminierung einer der beiden Schutzgruppen führen. Früher beschriebene Kopplungsverfahren verwendeten häufig den Carboxylester einer geschützten Hauptverbindung, worauf der Ester mit einer Hydroxidionenquelle hydrolysiert wurde. Die basischen Hydrolysebedingungen sind für die PNA-Synthone nach der vorliegenden Erfindung ungeeignet, da die basenunbeständige Schutzgruppe der Nucleobasen zumindest teilweise eliminiert würde. Daher beinhaltet das bevorzugte Verfahren der Kopplung der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente mit der säureunbeständigen geschützten Hauptverbindung einen "Übergangs"-Schutz der Carboxylsäurefunktionalität der geschützten Hauptverbindung.
Im allgemeinen beinhaltet das Kopplungsverfahren den Zusatz einer silylcarboxylsäuregeschützten, säureunbeständigen geschützten Hauptverbindung zu einer Lösung eines vorgeformten gemischten Anhydrids der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente. Nach der Kopplung der Hauptverbindung und der Seitenkettenkomponente wird die Silylschutzgruppe zur Erzeugung des PNA-Synthons eliminiert.
Speziell wird das Mischanhydrid der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente durch Behandlung der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente mit einer nicht-nucleophilen Base unter Umgebungstemperatur, gefolgt von einer Reaktion mit einem Alkylsäurechlorid, gebildet. Nicht-nucleophile Basen, die bei diesem Schritt der Reaktionssequenz brauchbar sind, beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Triethylamin, Diisopropylethylamin, N-Methylmorpholin und N-Ethylmorpholin. Die bevorzugte nicht-nucleophile Base ist N-Methylmorpholin. Typischerweise wird beim Reaktionsvorgang unterhalb der Umgebungstemperatur, vorzugsweise bei etwa 0° C, eine ausreichende Zeit gerührt, damit sich das Mischanhydrid bilden kann, was durch DSC überwacht werden kann.
Nach der Bildung des Mischanhydrids wird eine Lösung der säureunbeständigen geschützten Hauptverbindung in Gegenwart einer nicht-nucleophilen Base und ein sterisch gehindertes Silylchlorid der gekühlten Mischanhydridlösung zugesetzt. Typischerweise liegt die Lösung der säureunbeständigen aminogeschützten Hauptverbindung ebenfalls unterhalb der Umgebungstemperatur, vorzugsweise bei etwa 0° C. Beispiele nicht-nucleophiler Basen sind diejenigen, die zuvor beschrieben wurden. Ein bevorzugtes sterisch gehindertes Silylchlorid ist Triisopropylsilylchlorid, jedoch können auch andere Silylchloride benutzt werden. Nachdem nach der Um wandlung für eine ausreichende Zeit zur Ermöglichung der Kopplung gerührt worden ist, wird die Reaktion gelöscht, getrocknet und dann einer Behandlung mit einer Silyleliminierungsgruppe in Gegenwart einer nicht-nucleophilen Base unterzogen. Wiederum sind Beispiele nicht-nucleophiler Basen diejenigen, die zuvor beschrieben wurden. Beispiele silyleliminierender Gruppen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Wasserstoff, Fluorid, Tetra-n-Butyl-Aminiumfluorid und Triethylamintrihydrofluorid. Die bevorzugte Silyleliminierungsgruppe ist Triethylamintrihydrofluorid, weil der pH-Wert der Lösung eingestellt werden kann, wodurch eine vorzeitige Eliminierung anderer Schutzgruppen minimiert werden kann. Nach der Eliminierung der Silylschutzgruppe und Aufarbeitung der Reaktion wird das gewünschte PNA-Synthon isoliert.
Daher hat, nach einer Ausführungsform, ein bevorzugtes PNA-Synthon die Formel:
Die Gruppen Pg und Ba haben die zuvor gegebene Definition.
Nach einer weiteren Ausführungsform hat ein bevorzugtes PNA-Synthon die Formel:
Die durch B wiedergegebene Gruppe hat die zuvor gegebene Definition. Die durch Pg dargestellte Gruppe ist eine säureunbeständige Schutzgruppe der Formel:
Hiervon ist A₁-A₁₀ jeweils gleich oder verschieden und unabhängig Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Hydroxy-, Methoxy-, Ethoxy-, Amid- oder Estergruppen. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die durch R⁴ dargestellt ist, ist Wasserstoff, Methyl oder Ethyl.
Nach einer weiteren Ausführungsform hat das bevorzugte Cytosin-PNA-Synthon die Formel:
Nach einer weiteren Ausführungsform hat das bevorzugte Adenin-PNA-Synthon die Formel:
Nach einer weiteren Ausführungsform hat ein bevorzugtes Guanin-PNA-Synthon die Formel:
Die durch R⁵ dargestellte Gruppe ist Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl oder eine substituierte oder unsubstituierte Phenylgruppe mit der Formel:
wobei das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch a–e dargestellt ist, gleich oder verschieden ist und unabhängig F, Cl, Br, I, Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Propyl, n-Butyl, t-Butyl, Phenyl, Methoxy, Ethoxy, -NO₂, -CN, -SO₃H, -SCH₃ oder -(O)SCH₃ ist. Es ist zu vermerken, daß das Guanin-PNA-Synthon zur Erzeugung der basenunbeständigen Schutzgruppe vor oder nach der Einbeziehung in ein Oligomer oxidiert werden kann.
Nach einer weiteren Ausführungsform hat das bevorzugte Thymin-PNA-Synthon die Formel:
Nach einer weiteren Ausführungsform hat das bevorzugte Pseudoisocytosin-PNA-Synthon die Formel:
Zur Vervollständigung der Synthese eines bevorzugten Guanin-PNA-Synthons mit einer thioetherhaltigen Schutzgruppe verbleibt die Oxidation der Thioethergruppe. Verfahren zum Oxidieren eines Schwefelatoms zu einem Sulfoxid oder einem volloxidierten Sulfon sind dem Fachmann bekannt. Tesser u.a., Int. J. Peptide Protein Res. (1975) 7:295-305. Zum Beispiel beinhaltet ein bevorzugtes Verfahren die sequenzielle Behandlung des Guaninsynthons (Verbindung XVIII) in einem wässrigen Lösungsmittel mit einer nicht-nucleophilen Base, Natriumwolframat und Wasserstoffperoxid (siehe 7). Typischerweise wir die Reaktion auf Vollständigkeit durch DSC oder Hochleistungsflüssigchromatographie (HLFC) überwacht. Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird durch die Aufarbeitung und Isolierung des Produkts das bevorzugte Guanin-PNA-Synthon mit der Formel:
erzeugt.
Daher hat, nach einer Ausführungsform, ein bevorzugtes Guanin-PNA-Synthon die Formel:
Der Buchstabe n ist eins oder zwei.
Nach einer weiteren Ausführungsform hat ein bevorzugtes Guanin-PNA-Synthon die Formel:
Der Buchstabe n ist eins oder zwei.
PNA-DNA-Chimären- oder PNA-Oligomer-Synthese
Nach einer weiteren Ausgestaltung liegt die Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung einer PNA-DNA-Chimäre oder eines PNA-Oligomers. Typischerweise sind für die effiziente Synthese dieser nucleiden Säurepolymere milde Reaktionsbedingungen erforderlich, und es wird eine orthogonale Schutzgruppenstrategie benutzt. Von daher sind die PNA-Synthone nach der vorliegenden Erfindung besonders vorteilhaft, weil ihre Schutzgruppen unter milden Bedingungen eliminiert werden und orthogonal sind, wenn zwei Schutzgruppen gefordert sind. Darüber hinaus ist die Schutzmethodik kompatibel mit der kommerziellen DNA-Synthese-Technologie.
Im allgemeinen hat die PNA-DNA-Chimäre (oder eine PNA-RNA-Chimäre und verschiedenartige Kombinationen davon) die Formel: KLQMN
Die Buchstaben K und N stellen chemische Bindungen dar. Der Buchstabe Q ist eine chemische Bindung oder ein Linker. Von L und M ist eines eine Nucleotidkomponente mit der Formel:
Das durch G dargestellte Atom ist ein sekundäres Stickstoffatom, eine tertiäres Stickstoffatom mit einem Alkylsubstituenten, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom. Die Einheit B ist eine geschützte oder ungeschützte, natürliche oder unnatürliche Nucleobase. Das Atom oder die Gruppe, das bzw. die durch D dargestellt ist, ist ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Methoxylgruppe oder eine Hydroxylgruppe, die durch eine Schutzgruppe geschützt ist.
Die andere Komponente von L und M ist eine PNA-Komponente mit der Formel:
Die Einheiten G und B haben die obige Definition. Die Einheit R⁷ ist ein Wasserstoffatom oder eine Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlich vorkommenden α-Aminosäure. Gleich oder verschieden und unabhängig Null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf sind jeweils j, g und h.
Die durch K und N definierte chemische Bindung kann eine covalente Bindung oder eine ionische Bindung sein. Die chemische Bindung kann eine PNA-Komponente oder eine Nucleotidkomponente mit einer weiteren PNA-Komponente oder Nucleotidkomponente, entweder als einzelne Spezies oder als Teil einer Polymerkette, verbinden. Die chemischen Bindungen können auch Linker, mit einem festen Träger gekoppelte Linker oder andere chemische Einheiten verbinden. Beispiele chemischer Einheiten beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Schutzgruppen, Wasserstoffatome, Alkylgruppen und Arylgruppen als nur einige wenige Beispiele. Beispiele für feste Träger beinhalten, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, kontrolliertes Porenglas, Membranen, Polystyrol als Kügelchen, Siliciumdioxid, Papierfilter und Frittglas. Ein Fachmann ist in der Lage, die Möglichkeiten weiterer chemi scher Einheiten, Träger und Bindungen, die bei der vorliegenden Erfindung zweckmäßig und vorteilhaft sind, weiter zu erkennen und auszuweiten.
Wo Q eine chemische Bindung darstellt, ist eine covalente Bindung beabsichtigt. Wie bei K und N kann die chemische Bindung eine PNA-Komponente oder eine Nucleotidkomponente mit einer anderen PNA-Komponente oder Nucleotidkomponente, entweder als einzelne Spezies oder als Teil einer Polymerkette verbinden. Die Einheit Q kann auch einen Linker darstellen, der die PNA-Komponente und die Nucleotidkomponente verbindet.
Linker sind auf dem Gebiet der DNA- und Peptid-Synthese allgemein bekannt. Für eine detaillierte Erörterung siehe US-Patent Nr. 5 410 068, das durch den Hinweis hier einbezogen gilt, und Gati, M.J., Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach IRL Press Inc., Oxford, England. Wie hier verwendet, ist ein Linker eine Zusammensetzung, die zur Verbindung einer Komponente mit einem Biopolymer verwendet werden kann. Die Komponente kann ein Träger, ein Biomolekül wie etwa eine Aminosäure oder ein Nucleotid oder eine Markierung wie etwa ein fluoreszierender Farbstoff sein. Wie hier verwendet, wird der Linker Q zur Modifizierung des Heteroatoms G der PNA- oder Nucleotidkomponente verwendet.
Eine Art von Linker umfaßt einen Phosphoramiditlinker, der typischerweise verwendet wird, um den Endpunkt eines synthetischen Oligonucleotids zu markieren. Der Linker umfaßt eine Reaktions-Phosphoramiditgruppe als Spacer und zumindest ein geschütztes Heteroatom. Beispiele solcher vorgeformter DNA-Linker beinhalten diejenigen, die in den folgenden Literaturquellen beschrieben sind: Nelson u.a., Nucleic Axid Research, (1989) 17, 7170; Misiura u.a., Nucleic Acids Research (1990) 18, 4345; Conelly, B., Nucleic Acids Research (1987) 15, 3131; Coull u.a., Tetrathedron Letters (1986) 27, 3991. Der Spacer ist im allgemeinen ein Alkylspacer mit 1–12 Kohlenstoffatomen. Die Schutzgruppe des Heteroatoms wird so gewählt, daß sie mit der DNA-Synthese kompatibel ist. Linker dieser Art sind im allgemeinen im Handel von Lieferanten von DNA-Synthese-Reagenzien erhältlich.
Der 5'-Endpunkt eines Oligonucleotids kann gleichfalls durch bekannte Verfahren modifiziert werden. Dieses Verfahren ist in gleicher Weise für die Modifizierung des Endpunktes einer PNA geeignet. Siehe Wachter u.a., Nucleic Acids Res. (1986) 14:7985. Im allgemeinen wird das Heteroatom des Endpunktes sequentiell mit Carbonyldiimidazol und dann mit einer aminhaltigen Verbindung nach Wahl zur Reaktion gebracht. Die aminhaltige Verbindung für die Zwecke der Chimären-Synthese beinhaltet vorzugsweise Alkyldiamine, Aminoalkanthiole und Aminoalkylalkohole mit 1–12 Kohlenstoffatomen. Geeignete Reagenzien sind von Aldrich Chemical erhältlich. Unter Verwendung der oben angegebenen Reagenzien und Verfahren kann man den Endpunkt eines Nucleotids oder anderen Heteroatoms verändern, um dadurch eine funktionelle Verknüpfung mit dem ursprünglichen Heteroatom, einem Alkylspacer und Endpunkt-Heteroatom nach Wahl einzuführen, mit der Verwendungsmöglichkeit zum Koppeln des nächsten Synthons des PNA-Oligomers oder der PNA- oder Nucleotidkomponente der PNA/DNA-Chimäre.
Schließlich wird ein neuer Linker zur reversiblen Markierung von Biopolymeren beschrieben. Siehe US-Patent Nr. 5 410 068, das hier durch den Hinweis als einbezogen gilt. Obschon in erster Linie auf DNA-Anwendungsfälle gerichtet, können die Lehren des obigen Patents zum Verknüpfen von PNA- und DNA-Monomeruntereinheiten verwendet werden. Dieser Linker hat einen aktiven Ester und ein stereoselektives Alkylhalid-Reaktionszentrum. Der Durchschnittsfachmann erkennt, daß ein solches versatiles Reagenz in zahlreichen Formen zur gegenseitigen Verknüpfung der Monomeruntereinheiten verwendet werden kann.
Bei einer Ausführungsform reagiert der Hydroxyl- oder Thiol-Endpunkt der Endpunktuntereinheit vorzugsweise mit dem stereoselektivem Alkylhalidzentrum. Der aktive Ester wird dann vorzugsweise mit einer aminhaltigen Verbindung, wie oben beschrieben, zur Reaktion gebracht, um ein neues Endpunkt-Heteroatom zu erzeugen, das zum Koppeln des nächsten Synthons des PNA-Oligomers, der PNA-Komponente oder des DNA-Nucleotids der PNA/DNA-Chimäre verwendet werden kann. Alternativ reagiert vorzugsweise eine endständige Aminogruppe mit dem aktiven Ester. Sodann kann das stereoselektive Alkylhalid-Reaktionszentrum vorzugsweise mit einem Alkyldiamin, Alkyldiol oder Alkyldithiol zur Reaktion gebracht werden, um dadurch ein endständiges Heteroatom einzuführen, das zur Kopplung des nächsten Synthons des PNA-Oligomers oder der PNA-Komponente oder der Nucleotidkomponente der PNA/DNA-Chimäre geeignet ist.
Die Verwendung des oben beschriebenen Linkers ist auch vorteilhaft, weil zusätzlich zu den oben beschriebenen Reagenzien (z.B. Alkyldiamin, Alkyldiol oder Alkyldithiol) die Verbindung auch eine PNA-Komponente oder Nucleotidkomponente sein kann, bei der Pn oder Pa ein Wasserstoffatom ist. Bei dieser Ausführungsform ist man in der Lage, die Polarität der beiden Untereinheiten umzukehren. Dieses kann vorteilhaft sein, da es bekannt ist, daß die PNA eine Bindung mit der DNA sowohl in paral lelen als auch antiparallelen Mustern eingehen kann. Siehe Egholm u.a., Nature (1993) 365, 566–568.
Andere Linker sind bei der Peptidsynthese verwendet worden. Im allgemeinen werden diese Linker bei einer Verwendung in der Behandlung der geeigneten Heteroatom-Funktionsgruppen bei Biomolekülen, Trägern und Markierungsreagenzien erwähnt, haben jedoch auch auf anderen Gebieten ihre Nutzanwendung. Eine Erörterung dieser Linker, soweit sie sich auf die Peptidsynthese beziehen, ist in den folgenden US-Patenten zu finden, die hier durch den Hinweis als einbezogen gelten: US-Patent Nr. 5 117 009, 5 306 562, 5 196 566 und 5 187 625. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Oligonucleotid-Synthese, Peptid-Synthese und PNA-Synthese erkennt, daß diese Linker geeignet sind für die gegenseitige Verknüpfung von Untereinheiten von PNAs oder alternativ für die Verknüpfung von PNA-Untereinheiten mit DNA und umgekehrt die Verknüpfung von DNA-Untereinheiten mit PNA.
Geschützte oder ungeschützte, natürliche oder unnatürliche Nucleobasen sind typischerweise diejenigen, die zuvor beschrieben wurden bzw. in 8 dargestellt sind. Im allgemeinen haben die Nucleobasen eine exozyklische Aminogruppe, die beim Aufbau der PNA-DNA-Chimäre geschützt und danach entfernt wird, nachdem die bevorzugte Sequenz erreicht ist. Andererseits fehlt den natürlichen Nucleobasen Thymin und Uracil eine exozyklische Aminogruppe, so daß sie üblicherweise nicht geschützt werden. Der Schutz der exozyklischen Aminogruppe der Nucleobase, falls notwendig, eliminiert eine potentielle Reaktionsstelle während der Oligomersynthese und verhindert eine unerwünschte Verzweigung der wachsenden Polymerkette. Da her können, wie bei jedem effizienten Syntheseschema, PNA-DNA-Chimären in kontrollierter Form mit nur einem wahrscheinlichen Produkt aus jedem Syntheseschritt verbunden werden.
Typischerweise sind die Nucleobasen-Schutzgruppen Carbamat-Schutzgruppen. Da die Hauptverbindung der PNA-Synthone und der Nucleotiden säureunbeständig sind, bestimmt eine orthogonale Strategie, daß die Nucleobasen-Schutzgruppen notwendigerweise durch unterschiedliche Mittel entfernbar sind. Wie oben bei der Synthese der Nucleobasen-Seitenkettenkomponente beschrieben, sind die bevorzugten Carbamat-Schutzgruppen für die Nucleobasen basenunbeständig.
Häufig weisen die PNA-DNA-Chimären nachweisbare Komponenten auf. Die nachweisbaren Komponenten können ein Eigenteil der Chimäre sein oder auf verschiedene Art und Weise, häufig durch die Verwendung eines Linkers, wie zuvor beschrieben, verbunden werden. Beispiele nachweisbarer Komponenten beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Enzyme, Antigene, radioaktive Markierungen, Affinitätsmarkierungen, fluoreszierende Markierungen, ultraviolette Markierungen, infrarote Markierungen und Spinmarkierungen. Die nachweisbare Komponente kann, neben anderen Aufgaben, die Funktion haben, die Syntheseverbindung der Chimäre oder die Bindung der Chimäre mit einer anderen Einheit, wie etwa einer DNA oder RNA, zu überwachen.
Die Verwendung markierter Biomoleküle ist allgemein bekannt und in der oben angeführten Literatur in Bezug auf Linker besprochen. Markierte DNA-Oligomere sind besonders vorteilhaft für eine DNA-Sequenzierung und andere Nachweisanalysen von Nucleinsäuren, bei denen die sequenzspezifischen Wechselwirkungen, d.h. die Hybridisierung, der DNA eintritt. Siehe US-Patent Nr. 5,149,625, in dem markierte DNA und ihre Nutzanwendung bei Anwendungen der DNA-Sequenzierung besprochen werden und das durch diesen Hinweis hier einbezogen ist. Markierungen erhöhen im allgemeinen die Sensibilität der Untersuchung, wenn sie in geeigneter Weise mit dem Biopolymer verbunden sind. Es ist bekannt, daß antisensorische DNA und RNA die Genexpressionen wegen dieser sequenzspezifischen Wechselwirkungen modulieren kann. Da die PNA stärkere sequenzspezifische Wechselwirkungen mit Nucleinsäuren unter bestimmten Bedingungen zeigt, sind PNA-DNA-Chimären interessante Kandidaten für weitere Untersuchungen als Alternativen bei der DNA-Sequenzierung, bei Nachweisuntersuchungen und als therapeutische Mittel.
Neben anderen Methoden können PNA-DNA-Chimären unter Verwendung von Techniken für die Synthese von DNA-Sequenzen ausgebildet werden. DNA-Synthesemethoden und -Instrumentierungen sind in der Industrie allgemein bekannt und stehen weithin zur Verfügung. Daher ermöglicht die spezifische Ausbildung der PNA-Synthone nach der vorliegenden Erfindung die Nutzung von im Handel erhältlichen DNA-Vorläufern und -Instrumentierungen für die unmittelbare Zusammenstellung von PNA-DNA-Chimären.
Im allgemeinen haben Nucleotiden, die gewöhnlich bei der DNA-Synthese benutzt werden und für eine PNA-DNA-Chimären-Synthese anwendbar sind, die Formel:
Die Einheiten G und B sind wie oben beschrieben. Die Einheit D ist ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Methoxylgruppe oder eine Hydroxylgruppe, die durch eine Schutzgruppe geschützt ist. Die Einheit Pn ist ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe. Die Gruppe R⁶ ist eine Schutzgruppe, die entfernt werden kann. Die Phosphorverbindung wird typischerweise nach jedem Kopplungsschritt oxidiert, um die Verbindung zu stabilisieren. Die Einheit L¹ ist eine austretende Gruppe oder eine chemische Bindung. Ein Beispiel einer Nucleotidkomponente mit der obigen Formel ist u.a. ein Phosphoramadit.
Neben Nucleotiden mit der obigen Struktur können andere Nucleotidanaloga, die mit einem DNA-Synthesestoff kompatibel sind, zur Bildung von PNA-DNA-Chimären verwendet werden. Für Beispiele von DNA-Synthonen siehe US-Patent-Nummern 4,458,066 und 4,725,677 (RE 34,069) und Smith u.a., Nucleic Acids Res. (1985) 13:2399, Sproat u.a., Nucleic Acids Res. (1987) 15:6181 und Sproat u.a., Nucleic Acids Res. (1987) 15:4837.
Die Wahl von D bestimmt, ob die Nucleotidkomponente eine DNA- oder eine RNA-Komponente ist. Wenn D ein Wasserstoffatom ist, ist das Nucleotid eine DNA-Komponente. Wenn D eine Hydroxylgruppe oder ein geschütztes Derivat von dieser ist, ist das Nucleotid eine RNA-Komponente. Eine Methoxylgruppe ist ein üblicher Substituent, der bei der Oligomersynthese verwendet wird. Eine Anzahl anderer Schutzgruppen einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Silylschutzgruppen wird zum Schutz der Hydroxylgruppe bei der Oligomersynthese verwendet.
Ob Pn ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe ist, bestimmt sich durch die Rolle der Nucleotidkomponente in diesem bestimmten Syntheseschritt. Wird die oligomere Kette jeweils mit einer Komponente (oder einem Monomeren) zusammengesetzt, hat jede neue Komponente, die an die wachsende Kette angefügt wird, das durch G dargestellte Atom geschützt, wodurch G als Reaktionsstelle nicht zur Verfügung steht. Daher ist, wenn die Nucleotidkomponente das nächste an das Oligomer anzufügende Monomer ist, Pn eine Schutzgruppe. (Pn ist auch eine Schutzgruppe, wenn das Nucleotidmonomer die erste Komponente ist, die mit einem anderen Monomer oder einem Feststoffträgerharz zu verbinden ist.) Umgekehrt ist, wenn die Nucleotidkomponente bereits ein Teil einer oligomeren Kette ist, d.h. die Komponente ist, die als die nucleophile Spezies in der Kopplungsreaktion wirkt, Pn ein Wasserstoffatom.
Geeignete R⁶-Substituenten sind in den US-Patenten Nummer 4,458,066 und 4,725,677 beschrieben, die durch diesen Hinweis hier einbezogen sind. Die Gruppe R⁶ ist typischerweise, neben anderen Möglichkeiten, eine Gruppe mit der Formel:
Die durch W dargestellte Gruppe ist eine Elektronenabziehgruppe. Die Atome oder Gruppen, die jeweils durch V₁-V₃ dargestellt sind, sind gleich oder verschieden und, unabhängig Wasserstoff, Methyl und Ethyl. Bevorzugte Elektronenabziehgruppen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Cyano, Alkyl, Sulfonyl, Aryl- Sulfonyl, Phenyl und substituiertes Phenyl, wie etwa p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl und p-Alkyl-Sulfonylphenyl.
Die durch L¹ dargestellte Gruppe kann eine chemische Bindung sein, wenn beispielsweise die Nucleotidkomponente bereits in eine polymere Kette eingebaut oder mit einem Feststoffträger durch einen Linker verbunden ist. Die durch L¹ dargestellte Gruppe kann auch eine austretende Gruppe sein. Die Reaktion der vorausgehenden PNA- oder Nucleotidkomponente mit der Nucleotidkomponente mit Pn als Schutzgruppe verschiebt die austretende Gruppe, wodurch die beiden Komponenten gekoppelt werden. Geeignete austretende Gruppen beinhalten aktive Ester, wie in den US-Patenten Nr. 5,233,044 und 5,410,068 beschrieben, die durch den Hinweis hier einbezogen sind. Andere Beispiele von austretenden Gruppen beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Halogene und sekundäre Aminogruppen.
Die sekundären Aminogruppen können die Formel -NR⁸R⁹ aufweisen. Die durch R⁸ und R⁹ dargestellten Gruppen sind gleich oder verschieden und unabhängig primäre, sekundäre oder tertiäre Alkylgruppen mit 1–10 Kohlenstoffatomen oder sind zusammen ausgewählt aus der Gruppe von Cycloakylgruppen mit 5–7 Kohlenstoffatomen, die ein oder zwei Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome als Heteroatome enthalten können.
PNA-Komponenten, die bei der Ausbildung von PNA-DNA-Chimären verwendet werden, haben die Formel:
Die Einheiten G, B, R⁷, j, g und h sind wie oben beschrieben. Die Einheit Pa ist ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe. Die Einheit L² ist eine Hydroxylgruppe, eine austretende Gruppe oder eine chemische Bindung.
Typischerweise ist, wie bei der Nucleotidkomponente, die Einheit Pa ein Wasserstoffatom, wenn die PNA-Komponente als die nucleophile Spezies in der Kopplungsreaktion wirkt. Andererseits ist, wenn die PNA-Komponente das mit einer nucleophilen Spezies zu koppelnde Monomer ist, Pa eine Schutzgruppe, die G als Reaktionsstelle ungeeignet macht.
In gleicher Weise ist auch die Identität von L² abhängig von der Rolle der PNA-Komponente in der Synthesesequenz. Wenn die PNA-Komponente mit einem Oligomer oder einem Linker oder einem Feststoffträger verbunden ist, ist L² eine chemische Bindung. Falls jedoch die PNA-Komponente ein Monomer ist, das mit einem Linker oder einer PNA oder Nucleotidkomponente zu verbinden ist, ist L² eine Hydroxylgruppe oder eine austretende Gruppe. Wie oben für die Nucleotidkomponente beschrieben, verschiebt der nucleophile Angriff die austretende Gruppe oder aktivierte Hydroxylgruppe, was die Kopplung der PNA-Komponente mit der nucleophilen Spe zies fördert. Typischerweise beinhaltet der Kopplungsschritt die Erzeugung des aktivierten Synthons, d.h. die Umwandlung der Hydroxylgruppe in eine austretende Gruppe. Die Aktivierung wird üblicherweise in situ ausgeführt. Die geeigneten chemischen Aktivierungsmittel sind auf dem Gebiet der Peptidchemie allgemein bekannt. Die in USSN O_/952,025, eingereicht am 28. September 1993, beschriebenen Reagenzien sind besonders vorteilhaft.
Die Einheit L² kann auch vorzugsweise ein aktiver Ester wie diejenigen sein, die in den US-Patenten Nr. 5,410,068 und 5,233,044 beschrieben sind. Vorzugsweise ist L² auch 1-Hydroxy-7-Azabenzotriazol (HOAT).
Weitere Beispiele von geeigneten L²-Gruppen sind dem Fachmann ohne weiteres bekannt und beinhalten vorzugsweise neben anderen Imidazol, Triazol, Tetrazol, 3-Nitro-1,2,4-Thazol, Thiazol, Pyrrol, Benzotriazol und Benzohydroxytriazol. Diese cycloalkylgruppen beinhalten auch Imidazol substituiert in der Phenylkomponente, Triazol substituiert in der Phenylkomponente, Tetrazol substituiert in der Phenylkomponente, 3-Nitro-1,2,4-Triazol substituiert in der Phenylkomponente, Thiazol substituiert in der Phenylkomponente, Pyrrol substituiert in der Phenylkomponente, Benzotriazol substituiert in der Phenylkomponente und Benzohydroxytriazol substituiert in der Phenylkomponente.
PNA-DNA-Chimären können nach vielfältigen Methoden zusammengesetzt werden. Wahrscheinlich verwendet die effizienteste Methode die gegenwärtig verfügbaren Techniken und Instrumentierungen, die, wie zuvor beschrieben, für die DNA-Synthese zur Verfügung stehen. Insbesondere werden jetzt Nucleinsäuren (DNA und RNA) routinemäßig unter Verwendung von Maschinenautomaten, zahlreichen Syntheseträgern und verschiedenen chemischen Schutzmaßnahmen synthetisch hergestellt. Die folgenden US-Patente umfassen einen großen Bereich unterschiedlicher Träger und chemischer Schutzmaßnahmen und sind durch den Hinweis hier einbezogen. Siehe US-Patente Nr. 5 262 530, 4 415 732, 4 458 066, 4 725 677 (RE 34,069) und 4 923 901. Automatisierte Einrichtungen und Reagenzien sind im Handel erhältlich von PerSeptive Biosystems, Perkin Elmer (Applied Biosystems Division) und Pharmacia. Spezielle 5'-Aminosynthone sind beschrieben bei Smith u.a., Nucleic Acids Res. (1985) 13:2399 und bei Sproat u.a., Nucleic Acids Res. (1987) 15:6181. Spezielle 5'-Thiosynthone sind beschrieben bei Sproat u.a., Nucleic Acids Res. (1987) 15:4837. Die in den obigen Literaturstellen beschriebenen Reagenzien sind geeignet für eine Verwendung bei Standardgeräten für die DNA-Synthese.
Das bevorzugte kommerzielle Verfahren für die Synthese von Nucleinsäure verwendet die obigen Reagenzien und Verfahren, wie sie grundsätzlich von Koester u.a. im US-Patent Nr. 4,725,677 (RE 34,069) beschrieben sind. Demgemäß sind die bevorzugten Synthone β-Cyanoethyl-Phosphoramidite mit säureunbeständigem Schutz der 5'-Hydroxylgruppe der Hauptverbindung und basenunbeständigem Acyl-Typ-Schutz der exozyklischen Aminogruppen der Nucleobasen.
Die bevorzugte säureunbeständige Hauptverbindungsschutzgruppe ist 4,4'-Dimethoxytriphenylmethyl (DMT). DMT wird typischerweise gewählt, weil es recht schnell (1–3 Minuten) bei jedem Synthesezyklus mit Lösungen entfernt werden kann, die 1-4% Dichloressigsäure oder Trichloressigsäure in Dichlormethan enthalten. Schutzgruppen mit erhöhter Säureunbeständigkeit im Vergleich zu DMT unterliegen einer vorzeitigen Schutzentfernung bei den säurekatalysierten Kopplungsreaktionen (Tetrazol ist typischerweise die Säurespezies).Schutzgruppen mit verringerter Säureunbeständigkeit im Vergleich zu DMT verlangen längere Reaktionszeiten und/oder strengere Reaktionsbedingungen für eine vollständige Entfernung. Im allgemeinen werden strengere Bedingungen zur Säureschutzentfernung vermieden, da die Purin-Nucleobasen besonders anfällig für eine Zersetzung in Säure sind. Obgleich die oben angeführten Probleme mit Schutzgruppen und Synthesebedingungen bei jedem Synthesezyklus minimal sein können, kann die kumulative Wirkung signifikante Verunreinigungen bei der Oligonucleotidsynthese hervorrufen. Demgemäß hat in dem Maße, wie die Länge des Oligonucleotids größer wird, seine Reinheit die Tendenz, geringer zu werden.
Im allgemeinen werden basenunbeständige Schutzgruppen für den Schutz der exozyklischen Aminogruppen der Nucleobasen verwendet, so daß ein orthogonal geschütztes Nucleinsäuresynthon entsteht. Die basenunbeständigen Schutzgruppen bleiben typischerweise ein Teil der wachsenden Nucleinsäurekette und werden dann gleichzeitig mit der Abtrennung der synthetisierten Nucleinsäure vom Feststoffträger entfernt. Eine konzentrierte Ammonium-Hydroxid-Lösung wird häufig für den "Schutzentfernungs- und Abtrennschritt" verwendet. Koester u.a. verwendeten basenunbeständige Acyl-Typ-Schutzgruppen, die für gewöhnlich 6–24 Stunden bei einer erhöhten Temperatur (etwa 55º C) für eine vollständige Entfernung dieser Nucleobasen-Schutzgruppen behandelt wurden. Es wurden weitere Schutzgruppen entwickelt, die unter den gleichen Bedingungen, jedoch in kürzerer Zeit (von etwa 15–60 Minuten) entfernt werden. Beispiele dieser verbesserten Schutzgruppen beinhalten Phenoxyacetyl, t-Butylphenoxyacetyl und Schutzgruppen vom Amindin-Typ. Während diese Schutzgruppen eine erhöhte Basenunbeständigkeit aufweisen, wird typischerweise nur die Zeit verringert, die für die Entfernung notwendig ist.
Zusätzlich können die PNA-Synthone miteinander zur Bildung eines PNA-Oligomers (PNA) gekoppelt werden. Da die Chemie der PNA-Synthone mit den im Handel erhältlichen Synthesemitteln kompatibel ist, werden die Synthone bereitwillig in polymere Ketten von verschiedenen Längen und Sequenzen umgewandelt.
Im allgemeinen hat das PNA-Oligomer, vor der Entfernung der Nucleobasen-Schutzgruppen, die Formel: KLQMN
Die Buchstaben K und N stellen chemische Bindungen dar. Der Buchstabe Q ist eine chemische Bindung oder ein Linker, wie zuvor beschrieben. L und M sind jeweils gleich oder verschieden und unabhängig eine PNA-Komponente mit der Formel:
Die Einheiten G, Ba, R⁷, g, h und j sind wie oben beschrieben.
Das Oligomer kann unter Verwendung von Standardverfahren zur Peptidkopplung zusammengesetzt werden. Nach der Vervollständigung der gewünschten PNA- Sequenz wird durch Entfernung aller Schutzgruppen und gegebenenfalls Abtrennung vom Feststoffträger das PNA-Molekül erzeugt. Die richtige Wahl des Trägers ist wichtig, um strenge Säurebehandlungen zu vermeiden, und ermöglicht es vorzugsweise, daß die Abtrennung und Schutzentfernung in basischen Lösungen erfolgt. Verfahren zur Herstellung geeigneter Membranträger finden sich im US-Patent Nr. 4,923,901. Zusätzlich wird der Träger vorzugsweise mit Hydroxylgruppen funktionalisiert, mit denen die ersten PNA-Synthone als Ester verbunden werden.
Verschiedenartige Methoden, die bereits in der chemischen Literatur für die Peptidsynthese beschrieben sind, sind im allgemeinen für die PNA-Oligomersynthese geeignet. Diese Methoden beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die Feststoffphasen-Peptidsynthese und Lösungssynthese. Zum Beispiel ist bei der Feststoffphasensynthese, nach der Kopplung der ersten Aminosäure, der nächste Schritt die systematische Ausarbeitung der gewünschten PNA-Kette. Diese Ausarbeitung beinhaltet wiederholte Schutzentfernungs/Kopplungszyklen. Die zeitweilige Hauptverbindungsschutzgruppe an der zuletzt gekoppelten Aminosäure, wie etwa Fmoc, wird quantitativ durch eine geeignete Behandlung entfernt, zum Beispiel durch eine Basenbehandlung mit Piperidin, um so die N-endständige Aminfunktion freizugeben.
Die nächste gewünschte N-geschützte Aminosäure wird dann mit dem N-Terminal der zuletzt gekoppelten Aminosäure gekoppelt. Diese Kopplung des C-Terminals einer Aminosäure mit dem N-Terminal der zuletzt gekoppelten Aminosäure kann auf mehreren Wegen erreicht werden. Zum Beispiel kann die Carboxylgruppe der eingehenden Aminosäure direkt mit dem N-Terminal der zuletzt gekoppelten Aminosäu re mit Hilfe eines Kondensationsreagenz zur Reaktion gebracht werden, wie etwa zum Beispiel Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (Sheehan & Hess u.a., J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 1067) und Diisopropylycarbodiimid (DIC) (Sraantakis u.a., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, 73, 336) oder deren Derivaten. Statt dessen kann eine Bindung dadurch erfolgen, daß die eingehende Aminosäure in einer Form mit der Carboxylgruppe, aktiviert durch eine von mehreren Methoden, versehen wird, einschließlich der anfänglichen Bildung eines aktiven Esterderivats wie etwa eines 2,4,5-Trichlorophenyl Esters (Pless u.a., Helv. Chim. Acta, 1963, 46, 1609), eines Phthalimidoesters (Nefkens, u.a., J. Am. Chem. Soc., 1961, 83, 1263), eines Pentachlorophenylesters (Kupryszewski, Rocz. Chem, 1961, 35, 595), eines Pentafluorphenylesters (Kovacs, u.a., J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 183), eines o-Nitrophenylesters (Bodanzsky, Nature, 1955, 175, 685), eines Imidazolesters (Li u.a., J. Am. Chem. Soc., 1970, 92, 7608) und eines 3-Hydroxy-4-Oxo-3,4-Dihydroquinazolin-(Dhbt-OH)-Esters (Konig u.a., Chem. Ber., 1973, 103, 2024 und 2034) oder die anfängliche Bindung eines Anhydrids wie etwa eines symmetrischen Anhydrids (Wieland u.a., Angew. Chem, Int. Ed. Engl., 1971, 10, 336). Benzotriazolyl-N-Oxytrisdimethylaminophosphonium-Hexafluorphosphat (BOP), "Castro's reagent" (sh z.B. Rivaille u.a., Tetrahedron 1980, 36, 3413) wird beim Zusammensetzen von sekundäre Aminogruppen enthaltenden PNA-Molekülen empfohlen. Bevorzugte Reagenzien für die Aktivität der Carboxylsäuregruppen beinhalten 1-Hydroxy-7-Azabenzotriazol (HOAT) und dessen Phosphonium- und Uroniumsalze. Siehe Carpino, L.J. Am. Chem. Soc., (1993) 115, 4397. Schließlich sind aktivierte PNA-Monomere analog den jüngst beschriebenen Aminosäurefluoriden (Carpino, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 9651) ihrerseits vielversprechend für eine Verwendung bei der PNA-Synthese.
Nach dem Zusammensetzen der gewünschten PNA-Kette, einschließlich der Schutzgruppen, ist der nächste Schritt normalerweise die Schutzentfernung der Aminosäurenkomponenten der PNA-Kette und die Abtrennung der synthetisierten PNA vom Feststoffträger. Diese Prozesse können im wesentlichen gleichzeitig stattfinden, wobei das freie PNA-Molekül in der gewünschten Form geschaffen wird. Alternativ ist es in Fällen, in denen eine Kondensierung zweier getrennt synthetisierter PNA-Ketten auszuführen ist, durch Wahl einer geeigneten Spacer-Gruppe am Anfang der Synthese möglich, die gewünschten PNA-Ketten von ihren jeweiligen Feststoffträgern (wobei beide Peptidketten noch ihre Seitenkettenschutzgruppen eingebaut haben) abzutrennen und schließlich die Seitenkettenschutzgruppen nach zum Beispiel Kopplung der beiden seitenkettengeschützten Peptidketten zur Bildung einer längeren PNA-Kette zu entfernen.
Nachdem die PNA-DNA-Chimäre synthetisiert und isoliert worden ist, sind zahlreiche potentielle Verwendungen der verschiedenartigen Sequenzkombinationen gegeben. Eine derartige Verwendung ist die als therapeutisches oder antisensorisches Mittel. PNA-DNA-Chimären können dem Organismus auf verschiedenen Wegen und in verschiedenen Formen, die in der Industrie bekannt sind, verabreicht werden, wodurch die Erhaltung eines gesunden Organismus unterstützt oder dabei geholfen wird, die Geschwindigkeit der Erholung von einem schlechten Gesundheitszustand zu erhöhen.
PNA-DNA-Chimären können als Primer bei einer Polymerasereaktion brauchbar sein. Die PNA-DNA-Chimäre wird mit einem Nucleinsäurepolymer in Berührung ge bracht, das die Chimäre erkennt und an das sie sich bindet, wodurch die Polymerasereaktion beginnt.
PNA-DNA-Chimären sind auch brauchbar als Sonden für die Erkennung einer genetischen Sequenz.
Die Erfindung, die oben allgemein beschrieben ist, wird nun speziell anhand der folgenden Beispiele erläutert, die die Erfindung nicht beschränken sollen, sofern nicht anders angegeben.
Beispiele
Beispiel 1
Synthese von 4,4'-Dimethylbenzhydrol (I)
An 4,73 mol Magnesiumchips wurde tropfenweise mit einer solchen Geschwindigkeit, daß ein kräftiger Rückfluß nach Einleitung der Reaktion aufrechterhalten wurde, eine Lösung mit 4,4 mol 4-Bromtoluol zugegeben, die auf insgesamt 3 Liter (l) mit trockenem Tetrahydrofuran (THF) verdünnt war. Nach Vervollständigung der Zugabe erfolgte die Reaktion unter Rühren, bis eine abgekühlte Temperatur nahe der Raumtemperatur (etwa eine Stunde) vorlag. Dem hergestellten Grignardreagenz wurde tropfenweise 4,3 mol p-Tolualdehyd mit einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, daß die Reaktion zum Rückfluß gebracht wurde. Nach Vervollständigung der Zugabe erfolgte die Reaktion unter Rühren, bis eine abgekühlte Temperatur nahe der Raumtemperatur (etwa 30 Minuten) erreicht war. Die Reaktion wurde dann auf etwa das halbe Volumen konzentriert und in eine heterogene Lösung (heftiges Rühren) mit 2,5 Liter Dichlormethan und eine Lösung mit 4,8 mol Kaliumhydrogensulfat, verdünnt auf 4,5 Liter mit Wasser, gegossen. Nach der Zugabe wurde eine Lösung mit 3N HCl zugegeben, bis sich sämtliche Salze gelöst hatten (Dichlormethanschicht obenauf). Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde einmal mit verdünnter Natriumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 5) gewaschen. Das Produkt wurde getrocknet, gefiltert und verdampft. Ertrag: 970 Gramm grünes Öll. Das Produkt wurde rekristallisiert aus 1,6 Liter Hexan/Ethylacetat (9:1). Ertrag: 660,1 Gramm (g) weißer Feststoff (72%). Ein zweites Ergebnis erhielt man von der Stammlösung durch Rekristallisierung aus 500 ml Ethylacetat/Hexan (9:1). Ertrag: 108,0 g weißer Feststoff (11,8 %). Gesamtertrag: 768,1 g, 3,62 mol (84%).
¹H-NMR-Deutero-Chloroform (CDCl₃):δ = 7,3–7,0 (dd,8H), 5,7 (s, 1H), 2,3 (s, 6H), 2,2 (s, 1H)
Beispiel 2
Synthese von N-(4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl)-Ethylendiamin II
An 130 Millimol (mmol) Carbonyldiimidazol (CDI), suspendiert in 100 ml Dichlormethan (DCM) und unter Rühren bei 0° C, wurde tropfenweise eine Lösung von 125 mmol 4,4'-Dimethylbenzhydrol, gelöst in 60 ml Dichlormethan, zugegeben. Die Reaktion erfolgte unter Rühren für 30 Minuten, nachdem die Zugabe vollständig war. Eine Analyse nach der Dünnschichtchromatographie (dsc) nach 30 Minuten zeigte eine vollständige Reaktion an. Das Produkt wurde an einen Trenntrichter übergeben und zweimal mit 70 ml Wasser gewaschen. Die Dichlormethanschicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und verdampft. Ertrag: 40 g weißer Feststoff.
An 1 mol Ethylendiamin wurde unter Rühren bei 0° C tropfenweise eine Lösung mit den 40 g des isolierten Produkts, gelöst in 150 ml Dichlormethan, zugegeben. Die Reaktion erfolgte sodann unter Rühren während 30 Minuten, nachdem die Zugabe vollständig war. Die Lösung wurde dann an einen Trenntrichter übergeben und viermal mit 100 ml Wasser extrahiert. (Letzte Waschung enthielt eine kleine Menge Kochsalzlösung zur Minimierung einer Emulsionsbildung.) Die Dichlormethanschicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und verdampft. Ertrag: 37,8 g klares Gelböl (101 %)
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 7,3–7,0 (dd,8H), 6,7 (s,1H), 5,5 (m, 1H), 3,2–3,1 (dd, 2H), 2,8-2,7 (t, 2H), 2,3 (s, 6H), 1,1 (s, 2H)
Beispiel 3
Synthese von N-(4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl)-N'-Trifluoracetyl-Ethylendiamin (III)
An die 37,8 g N-(4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl)-Ethylendiamin, isoliert in Beispiel 2, wurden 200 ml Dichlormethan und 50 mmol Triethylamin zugegeben. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und dann wurden 150 mmol Ethyl-Trifluoracetat tropfenweise zugegeben. Es kristallisierte ein weißes Feststoffprodukt über die nächste Zeit von einer Stunde und wurde dann durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Das Filtrat wurde über Nacht gerührt und dann an einen Trenntrichter übergeben. Nach der Übergabe wurde die Lösung zweimal mit Natriumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 6) gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und ver dampft. Der Rückstand wurde aus 250 ml Hexan/Ethylacetat (3:2) rekristallisiert. Ertrag: 16,6 g weißer Feststoff (34%). Das anfangs durch Vakuumfiltrierung gesammelte Produkt wog 21,05 g (42%). Der Gesamtertrag beträgt 37,65 g (76%).
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 7,6 (m, 1H), 7,3–7,0 (dd, 8H), 6,7 (s, 1H), 5,4 (m, 1H), 3,4–3,2 (m, 4H), 2,3 (s, 6H).
Beispiel 4
Synthese von N-[N'-4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2'-Aminoethyl)]-Glycin (IV)
An 40 mmol N-(4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl)-N'-Trifluoracetyl-Ethylendiamin wurde bei Rühren in 160 ml trockenem Tetrahydrofuran (THF) bei 0° C 44 mmol Natriumhydrid zugegeben. Die Reaktion erfolgte unter Rühren in einem Eisbad, bis jegliche Gasentwicklung aufgehört hatte und die tiefblaue Farbe verschwand. Der Reaktion wurden sodann 48 mmol Ethylbromacetat zugegeben. Die Reaktion wurde dann über Nacht gerührt, während einer Erwärmung auf Raumtemperatur. Am Morgen wurde das Lösemittel verdampft und der Rest mit 100 ml Ethylacetat und 100 ml einer Natriumphosphat-Pufferlösung (pH-Wert 6) neu verteilt. Die organische Schicht wurde dann einmal mit Wasser gewaschen und dann mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und verdampft. Ertrag: 19,72 g orangefarbiges Öl (90 %).
Der Rückstand wurde in 240 ml Ethanol/Acetonitril (1:1) gelöst und dann wurden 60 ml Wasser zugegeben. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt und dann wurden 160 ml wässrigen Lithium-Hydroxids zugegeben. Die Reaktion erfolgte unter Rühren für eine Stunde (h) und dann wurde 3 N HCl tropfenweise sehr langsam zugegeben, bis der pH-Wert 8–9 nach Papierprobe betrug. Der Lösung wurden sodann 15 ml 1M NaH₂PO₄ zugegeben, um den pH-Wert auf 7 einzustellen. Es wurde dann ein weisses Precipitat gebildet, und die Lösung wurde dann auf einem Rotoverdampfer konzentriert, bis etwa 150 ml des Lösemittels entfernt waren. Der Rückstand wurde dann mit 3X 100 ml Ethylacetat extrahiert. Sämtliche Ethylacetatschichten wurden verbunden und einmal mit 1M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7) zurückextrahiert. Die Ethylacetatschichten wurden in Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und verdampft. Ertrag: 14,3 g gelber Schaum. Rekristallisiert aus 400 ml Acetonitril. Ertrag: 8,35 g (59%). Wieder rekristallisiert aus 100 ml ACN. Ertrag: 7,63 g (54%).
¹H-NMR-Deuteromethylsulfoxid (d₆DMSO): δ = 7,7 (m, 1H), 7,3–7,0 (dd, 8H), 6,6 (s, 1H), 3,3–3,1 (m, 4H), 2,9 (m, 2H), 2,3 (s, 6H)
Beispiel 5
Synthese von 2-(1'-Thyminyl)-Essigsäure
An 300 Gramm Thymin wurden 750 ml Hexamethyldisilazan und 15 Gramm Ammoniumsulfat zugegeben. Die Reaktion unter Rühren wurde erwärmt bei Rückfluß, bis kein Gas mehr entwickelt wurde. Die Reaktion wurde dann auf 80° C gekühlt, und dann wurden 160 ml Ethylbromacetat zugegeben. Eine milde Erwärmung der Reaktion wurde fortgesetzt, bis die dsc-Analyse anzeigte, daß 95 % des Ausgangsmaterials verbraucht waren. Die Reaktion wurde dann auf 20° C in einem Eisbad gekühlt, und dann wurden 150 ml Methanol tropfenweise unter Rühren im Eisbad zugegeben. Sobald die Zugabe von Methanol vollständig war, wurden 2,5 Liter 3N NaOH sorgfältig zugegeben. Das Eisbad wurde dann entfernt und über die Reaktion wurde sodann schnell Gas geleitet, um überschüssige Silane zu verdampfen.
Sodann wurden 80 Gramm Natriumhydroxid zugegeben, und die Reaktion erfolgte unter Rühren über Nacht. Am Morgen wurde 1 l 6N HCl der Reaktion zugegeben, um das Produkt zur Kristallisierung zu bringen. Das Produkt wurde dann durch Vakuumfiltrierung gesammelt und mit verdünnter wässriger Salzsäure gewaschen. Das gesammelte Produkt wurde dann in 1,5 l Acetonitril suspendiert und die Lösung unter Rühren zum Rückfluß gebracht. Nach Kühlung über Nacht wurde der Feststoff wiederum durch Vakuumfiltrierung gesammelt und mit Acetonitril, Dichlormethan und Acetonitril gewaschen. Ertrag: 327 Gramm (75%).
¹H-NMR (d₆DMSO): δ = 12,06 (s,1H), 11,31 (s, 1H), 7,48 (s, 1H), 4,35 (s, 2H), 1,74 (s, 3H)
Beispiel 6
Synthese von 2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-Imidazol (XIV)
An 250 mmol Carbonyldiimidazol, suspendiert in 100 ml Dichlormethan, wurden 260 mmol 2-Hydroxy-2-Methyl-Butyronitril zugegeben. Die Reaktion wurde über etwa 20 Stunden gerührt und dann an einen Trenntrichter übergeben. Zusätzliche 250 ml Dichlormethan wurden zugegeben, und die Lösung wurde dreimal mit 100 ml Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und dann auf etwa 50 ml konzentriert. Unmittelbar danach wurden 200 ml Äther unter heftigem Rühren zugegeben, und dann wurde die Lösung in einem Eisbad für 30 Minuten gekühlt. Das weiße Feststoffprodukt wurde dann durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Ertrag: 29,6 Gramm (61 %).
¹H-NMR (d₆DMSO): δ = 8,1 (m, 1H), 7,4 (m, 1H), 7,1 (m, 1H), 3,1 (s, 2H), 1,8 (s, 6H)
Beispiel 7
Synthese von t-Butyl-2-(1'-Cytorsyl)-Acetat (V)
An 200 mmol Cytosin wurden 250 ml DMF und 215 mmol Kalium-t-Butoxid zugegeben. Die Reaktion wurde dann auf 60° C unter heftigem Rühren erwärmt und dann unmittelbar auf 0° C gekühlt. Der eiskalten Lösung wurden dann tropfenweise 250 mmol t-Butyl-Bromacetat zugegeben. Die Reaktion wurde eine Stunde bei 0° C gerührt, und dann wurde sie konzentriert. Der Rückstand wurde in 500 ml Wasser mit 30 mmol 3N Salzsäure gegossen. Die Lösung wurde für 20 Minuten gerührt und dann wurde das weiße Feststoffprodukt durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Ertrag: 32,08 g (71 %).
¹H-NMR (d₆DMSO): δ = 7,5 (d, 1H), 7,1 (s, 2H), 5,7 (d, 1H), 4,3 (s, 2H), 1,4 (s, 9H)
Beispiel 8
Synthese von t-Butyl 2-[N'⁴-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(1'-Cytosyl)]-Acetat (VI)
An 52 mmol 2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-Imidazol in 150 ml Dichlormethan (bei 0°C) wurden 50 mmol Methyltrifluormethansulfonat zugegeben (tropfenweise). Die Reaktion wurde für 30 Minuten gerührt, und dann wurden 35 mmol t-Butyl-2-(1'-Cytosyl)-Acetat zugegeben. Die Reaktion wurde gerührt, bis sie gemäß der dsc-Analyse vollständig war (24 Stunden). Das Produkt wurde an einen Trenntrichter übergeben und einmal mit 50 ml eines 5%igen Kaliumbisulfats und einmal mit 5%igem Natriumbicarbonat extrahiert. Die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und verdampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat rekristallisiert. Ertrag: 7,35 g (60 %)
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 7,5 (d, 1H), 7,1 (d, 1H), 4,5 (s, 2H), 2,9 (s, 2H), 1,7 (s, 6H) 1,5 (s, 9H)
Beispiel 9
Synthese von 2-[N'⁴-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(1'-Cytosyl)]-Essigsäure (VII)
An 25 mmol t-Butyl-2-[N'⁴-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(1'-Cytosyl)]-Acetat wurden 25 ml Dichlormethan und 50 ml Trifluor-Essigsäure (TFA) zugegeben. Die Reaktion wurde gerührt, bis der Ester vollständig hydrolysiert war (4 Stunden). Die Lösung wurde dann konzentriert und in 50 ml Dichlormethan neu gelöst. Das Produkt wurde durch tropfenweise Zugabe dieser Lösung zu 350 ml heftig gerührten eiskalten Ethyläthers ausgeschieden. Das Produkt wurde dann durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Ertrag: 7,60 g weißer Feststoff (103%). [Scheint nicht als TFA-Salz zu existieren.]
¹H-NMR (d₆DMSO): δ = 8,0 (d, 1H), 6,9 (d, 1H), 4,5 (s, 2H), 3,2 (s, 2H), 1,5 (6H)
Beispiel 10
Synthese von t-Butyl-2-(9'-Adenyl)-Acetat (VII)
An 200 mmol Adenin wurden 400 ml getrocknetes Dimethylformamid (DMF) zugegeben. Zu der gerührten Suspension wurden dann 230 mmol Natriumhydrid zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann in einem Eisbad für 30 Minuten gekühlt. Danach wurden 220 mmol t-Butyl-Bromacetat tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde dann 30 Minuten gerührt und dann auf etwa 50 ml unter verringertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde dann in 1,5 l Wasser gegossen, das 20 ml eines 10%igen Natriumcarbonats enthielt. Nach einem Rühren über 30 Minuten wurde das weiße Feststoffprodukt, das ausgeschieden wurde, durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Das nasse Produkt wurde dann aus 300 ml Acetonitril/Wasser (9:1) rekristallisiert. Die Produktkristalle wurden durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Ertrag: 25,94 Gramm (52%).
¹H-NMR (d₆DMSO): δ = 8,13 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 7,24 (s, 2H), 4,9 (s, 2H), 1,4 (s, 9H)
Beispiel 11
Synthese von t-Butyl-2-[N'⁶-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(9'-Adenyl)]-Acetat (IX)
An 2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-Imidazol wurden 100 ml Dichlormethan zugegeben. Die Lösung wurde in einem Eisbad für 30 Minuten gekühlt und dann wurden 50 mmol Methyl-Trifluormethansulfonat tropfenweise zugegeben. Die Reaktion wurde 30 Minuten in einem Eisbad gerührt und dann wurden 35 mmol t-Butyl-2-(9'-Adenyl)-Acetat zugegeben, und die Reaktion wurde gerührt, bis sie nach der dsc-Analyse vollständig war (vier Tage). Die Lösung wurde dann an einen Trenntrichter übergeben, einmal mit 70 ml eines 5 %igen Kaliumhydrogensulfats, einmal mit 5 %igem Natriumbicarbonat und einmal mit einer verdünnten Natriumchloridlösung extrahiert. Die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat ge trocknet, gefiltert und verdampft. Das weiße Feststoffprodukt wurde aus 130 ml Ethylacetat kristallisiert. Ertrag: 10,17 Gramm (77 %).
¹H-NMR (d₆DMSO): δ = 10,5 (s, 1H), 8,6 (s, 1H), 8,4 (s, 1H), 5,1 (s, 2H), 3,2 (s, 2H), 1,6 (s, 6H), 1,4 (s, 9H)
Beispiel 12
Synthese von 2-[N'⁶-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(9'-Adenyl)]-Essigsäure (X)
An 28 mmol t-Butyl-2-[N'⁶-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(9'-Adenyl)]-Acetat wurden 25 ml Dichlormethan und 50 ml Trichloressigsäure (TFA) zugegeben. Die Reaktion wurde gerührt, bis der gesamte Ester gemäß Angabe durch die dsc-Analyse hydrolysiert war (4 Stunden). Die Lösung wurde dann zu einem Öl konzentriert und der Rückstand in 10 ml Dichlormethan neu gelöst. Das Produkt wurde dann durch tropfenweise Zugabe dieser Lösung an heftig gerührtem eiskaltem Ethylether abgeschieden. Das Produkt wurde dann als weißer Feststoff durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Ertrag: 11,5 g schmutzig-weißer Feststoff (95 %). [Es wird angenommen, daß das Produkt als TFA-Salz existiert.]
¹H-NMR (d₆DMSO): δ =8,6 (s, 1H), 8,5 (s, 1H), 5,1 (s, 2H), 3,2 (s, 2H), 1,6 (s, 6H)
Beispiel 13
Synthese von Benzyl-2-[6'-Chlor-(9'-Purinyl)]-Acetat (XI)
An 6-Chloro-2-Aminopurin (300 g, 1,77 mol; Pharma-Waldorf GmbH, Deutschland, P/N 471720) und Kaliumcarbonat (366 g; 2,65 mol, Aldrich Chemical, Milwaukee, WI (im nachstehenden Aldrich) P/N 34,782-5) wurde Dimethylformamid (DMF, 3 l) zugegeben, und die Lösung wurde erwärmt, bis das gesamte 2-Amino-6-Chlorpurin gelöst war (84°C). Das Gemisch wurde dann in einem Eisbad gekühlt und Benzyl-2-Bromacetat (299 ml, 1,89 mol; Aldrich P/N 24,563-1) wurde tropfenweise im Verlauf von eineinhalb Stunden zugegeben. Das Gemisch wurde für zusätzliche drei Stunden bei 0° C gerührt und dann über Nacht bei Umgebungstemperatur. Am folgenden Tag wurde das Reaktionsgemisch gefiltert, und das Filtrat wurde dann in eine Lösung mit 7 Litern Wasser und 150 ml konzentrierter Salzsäure (HCl) gegossen. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang gerührt, und dann wurde das Produkt durch Filtrierung isoliert. Das Produkt wurde gründlich mit Wasser gewaschen und nachfolgend durch portionsweise Zugabe des Feststoffes zu siedendem Acetonitril (3 l) rekristallisiert. Die sehr rote Lösung wurde dann über Nacht stehen gelassen und am nächsten Tag gefiltert. Das Produkt wurde gründlich mit Methanol und dann mit Diethylether gewaschen. Ertrag: 386 g (69 %)
¹H-NMR (d₆DMSO): δ =8,14 (1H, s), 7,4–7,3 (5 H, m), 7,02 (2H, s), 5,21 (2H, s), 5,08 (2H, s).
Beispiel 14
Synthese von Benzyl-2-[N'²-2-(Methylthio)-Ethoxycarbonyl-6'-Chlor-(9'-Purinyl)]-Acetat (XII)
An 50 mmol Benzyl-2-[6'-Chlor-(9'-Purinyl)]-Acetat wurden etwa 200 ml frisch destilliertes Tetrahydrofuran zugegeben. Die Reaktion wurde über 20 Minuten in einem Eisbad gekühlt, und dann wurden 20 mmol Triphosgen zugegeben. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 0° C gerührt, und dann wurde 130 mmol Diisopropylethylamin tropfenweise zugegeben. Nach einem Rühren über 20 Minuten bei 0° C wurden 70 mmol 2-(Methylthio)-Ethanol zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht unter Erwärmung auf Raumtemperatur gerührt. Am Morgen wurde die Reaktion auf etwa das halbe Volumen konzentriert und dann in eine Rührlösung mit 500 ml Wasser und 30 mmol HCL gegossen. Dieses Gemisch wurde 30 Minuten gerührt, und dann wurde das Produkt durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Das Produkt wurde aus Ethanol rekristallisiert. Ertrag 74 %.
¹HNMR (d₆DMSO):δ = 10,8 (1H, s), 8,5 (1H, s), 7,35 (5H, m), 5,22 (4H, m), 4,25 (2H, t), 2,75 (2H, t), 2,15 (3H, s)
Beispiel 15
Synthese von 2-[N'²-2-(Methylthio)-Ethoxycarbonyl-(9'-Guanyl)]-Essigsäure (XIII)
An 75 mmol von 95 % Natriumhydrid wurden etwa 100 ml frisch destilliertes Tetrahydrofuran zugegeben. Die Lösung wurde in einem Eisbad über 20 Minuten gekühlt, und dann wurden 75 mmol 3-Hydroxypropionitril zugegeben. Die Reaktion wurde bei 0° C über 2 Stunden gerührt, und dann wurden 15 mmol Benzyl-2-[N'²-2- (Methylthio)-Ethoxycarbonyl-6'-Chlor-(9'-Purinyl)]-Acetat zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht unter Erwärmung auf Raumtemperatur erwärmt. Am Morgen wurde das Lösemittel vollständig verdampft, und dann wurde eine Lösung mit 200 ml Wasser, 54 Gramm Natriumchlorid und 8 Gramm K₂S₂O₂ zugegeben. Die Lösung wurde heftig über 15 Minuten gerührt und dann das Feststoffprodukt abgefiltert. Das Produkt wurde durch Sieden in Acetonitril gereinigt. Ertrag 83 %.
¹HNMR (d₆DMSO):δ =11,52 (1H, s), 11,37 (1H, s), 7,93 (1H, s), 4,9 (2H, s), 4,35 (2H, t), 2,785 (2H, t), 2,15 (3H, s)
Beispiel 16
Synthese von N-[N"-4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2"-Aminoethyl)]-N-[2-(1'-Thyminyl)-Acetyl]-Glycin (XIX)
An 3 mmol N-[N'-,4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2'-Aminoethyl)]-Glycin wurden 15 ml Acetonitril (ACN) und 12 mmol N-Methylmorpholine (NMM) zugegeben. Die Lösung wurde in einem Eisbad abgekühlt, und dann wurden 6 mmol Triisopropylsilylchlorid zugegeben. Die Lösung wurde über zwei Stunden bei 0° C gerührt, und dann wurde sie dem Produkt der folgenden Reaktion, wie unten beschrieben, zugegeben.
An 3,3 mmol 2-(1'-Thyminyl)-Essigsäure wurden 15 ml Acetonitril und 12 mmol N-Methylmorpholin zugegeben. Die Lösung wurde unter Abkühlung auf 0° C gerührt, und dann wurden 3,7 mmol Trimethylacetylchlorid der Lösung zugegeben. Nach einem Rühren über 15 Minuten wurden Teilmengen der Reaktion entfernt und mit Diethylamin zur Reaktion gebracht, um zu bestimmen, ob eine vollständige Anhy dridbildung stattgefunden hat. Nachdem die dsc-Analyse eine vollständige Bildung des Anhydrids angezeigt hatte, wurde die oben beschriebene Reaktion tropfenweise dem Produkt dieser Reaktion zugegeben, und dieses Gemisch wurde dann 30 Minuten lang gerührt. Das Produkt wurde dann verdampft und der Rückstand mit 30 ml Ethylether und 30 ml einer Lösung mit 3 % N-Methylmorpholin in Wasser portioniert.
Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde einmal mit 30 ml einer Lösung mit 3 % N-Methylmorpholin in Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und in ein zweites Gefäß gefiltert. Das Gesamtvolumen der Lösung wurde auf 75 ml durch Zugabe von mehr Ethylether eingestellt. Dieser Lösung wurden 12 mmol N-Methylmorpholin und 3 mmol Triethylamin-Trihydrofluorid (Et₃N . 3HF) zugegeben. Der Lösung wurden 30 ml Wasser nach 5 Minuten (pH-Wert 7 – 8 nach Papierprobe) zugegeben. Der Lösung wurden zusätzlicher Ethylether und 30 ml einer Lösung mit 3 % N-Methylmorpholin in Wasser zugegeben. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde verdampft. Der Rückstand wurde dann mit 30 ml Dichlormethan und 40 ml einer pH-3,5-Pufferlösung portioniert. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert, und 6 mmol N-Methylmorpholin wurden dem Filtrat zugegeben. Das Filtrat wurde dann verdampft und der Rückstand in einer Kleinstmenge von Dichlormethan gelöst. Das Produkt wurde dann durch Fallenlassen dieser Lösung in heftig gerührten eiskalten Ethylether abgeschieden. Das Produkt wurde durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Ertrag: 0,872 g (48%).
¹H-NMR (d₆DMSO):δ = 11,3 (m, 1H,), 7,7–7,4 (mm, 1H), 7,3–7,0 (m, 9H), 6,6 (m, 1H), 4,8 (s, mj, 2H), 4,4 (2, mi, 2H), 4,0 (s, mi, 2H), 3,9 (s, mj, 2H), 3,6 (t,½ NMM), 3,6 (t, ½ NMM), 3,5–3,0 (m, 4H), 2,4 (t, ½ NMM), 2,25 (s, 6H), 2,2 (s, ½ NMM), 1,7 (s, 3H).
Die hergestellten PNA-Synthone erzeugten Rotomere aufgrund einer verhinderten Rotation um die Amidbindung. Wenn Signale für jede Rotomerform erscheinen, werden sie mit mj für das Hauptsignal (das größere Signal) und mi für das kleinere Signal bezeichnet. Die Anzahl bezeichneter Protonen stellt die Gesamtzahl für die kombinierten Signale dar. Für dieses Monomer ist die Rotomerabundanz etwa gleich, und daher wird die Bezeichnung lediglich zugunsten des Leser eingesetzt.
Beispiel 17
Synthese von N-[N"-4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2"-Aminoethyl)]-N-[2-(N'⁴-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(1'-Cytosyl)]-Acetyl-Glycin (XVI)
An 3 mmol N-[N'-,4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2'-Aminoethyl)-Glycin wurden 15 ml Acetonitril und 9 mmol N-Methylmorpholin zugegeben. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, und dann wurden 6 mmol Triisopropylsilylchlorid zugegeben. Die Lösung wurde zwei Stunden lang bei 0° C gerührt, und dann wurde sie dem Produkt der folgenden Reaktion, wie unten beschrieben, zugegeben.
An 3,3 mmol 2-[N'⁴-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(1'-Cytosyl)]-Essigsäure wurden 15 ml Acetonitril und 9 mmol N-Methylmorpholin zugegeben. Die Lösung wurde unter Abkühlung auf 0° C gerührt, und dann wurden 3,7 mmol Trimethylacetylchlorid der Lösung zugegeben. Nach einem Rühren über 15 Minuten wurden Teilmengen der Reaktion entnommen und mit Diethylamin zur Reaktion gebracht, um zu bestimmen, ob eine vollständige Anhydridbildung stattgefunden hatte. Nachdem die dsc-Analyse die vollständige Bildung des Anhydrids angezeigt hatte, wurde die oben beschriebene Reaktion tropfenweise dem Produkt dieser Reaktion zugegeben, und dieses Gemisch wurde dann 30 Minuten lang gerührt.
Das Produkt wurde dann verdampft und der Rückstand mit 30 ml Ether und 30 ml einer Lösung aus 3 % N-Methylmorpholin in Wasser portioniert. Die Schichten wurden dann getrennt, und die organische Schicht wurde einmal mit 30 ml einer Lösung aus 3 % N-Methylmorpholin in Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und in ein zweites Gefäß eingefiltert. An diese Lösung wurden 9 mmol N-Methylmorpholin und 2,2 mmol Triethylamin-Trihydrofluorid zugegeben. Da der pH-Wert als sehr hoch bestimmt wurde, wurde Überschuß-Triethyamin-Trihydrofluorid zugegeben, um den pH-Wert auf 7–8 gemäß Papierprobe einzustellen. An die Lösung wurde zusätzlicher Ethylether und 30 ml einer Lösung aus 3 % N-Methylmorpholin in Wasser zugegeben. Die Schichten wurden getrennt und das Produkt als in der wässrigen Schicht liegend ermittelt. Die organische Schicht wurde einmal mit 30 ml 3 % N-Methylmorpholin in Wasser gewaschen. Die Wasserschichten wurden verbunden und dann zu einem weißen Gel verdampft. Das Gel wurde zweimal mitverdampft aus Wasser und einmal aus trockenem Tetrahydrofuran (THF). Der Rückstand wurde dann mit 25 ml Dichlormethan und 30 ml einer pH-3,5-Pufferlösung portioniert. Das Produkt wurde als in der Dichlormethanschicht liegend ermittelt. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde einmal mit verdünnter Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde dann in Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und verdampft. Ertrag: 1,61 Gramm gelber Schaum (73 %). Der Schaum wurde in einer Kleinstmenge Dichlormethan gelöst und das Produkt durch Fallenlassen dieser Lösung in eine Rührlösung aus eiskaltem Ethylether abgeschieden. Ertrag: 1,06 g (48 %).
¹H-NMR (d₆DMSO):δ = 7,9–7,7 (m, 1H), 7,6 (m, mj, 1H), 7,4 (m, mi, 1H), 7,3–7,0 (m, 9H), 7,0–6,8 (m, 1H), 6,6 (m, 1H), 4,8 (s, mj, 2H), 4,6 (s, mi, 2H), 4,2 (s, mi, 2H), 4,0 (s, mj, 2H), 3,6 (t, ½ NMM), 3,5–3,0 (m, 4H), 2,4 (t, ½ NMM), 2,25 (s, 6H), 2,2 (s,½ NMM), 1,5 (s, 6H)
Beispiel 18
Synthese von N-[N"-4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2"-Aminoethyl)]-N-[2-(N'⁶-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(9'-Adenyl)-Acetyl]-Glycin (XVII)
An 6 mmol N-[N'-,4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2'-Aminoethyl)]-Glycin wurden 35 ml Acetonitril und 24 mmol N-Methylmorpholin zugegeben. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, und dann wurden 6 mmol Triisopropylsilylchlorid zugegeben. Zusätzliche 3 mmol Triisopropylsilylchlorid wurden zugegeben, weil die dsc-Analyse der Esterbildung eine unvollständige Reaktion anzeigte. Die Lösung wurde über eine gesamte Zeit von 1,5 Stunden bei 0° C gerührt und dann dem Produkt der folgenden Reaktion, wie unten beschrieben, zugegeben.
An 7 mmol 2-[N'⁶-2,2-Dimethyl-1-Cyanoethoxycarbonyl-(9'-Adenyl)]-Essigsäure wurden 30 ml Acetonitril und 28 mmol N-Methylmorpholin zugegeben. Die Lösung wurde unter Abkühlung auf 0° C gerührt, und dann wurden 7,7 mmol Trimethylacetylchlorid der Lösung zugegeben. Nach einem Rühren über 20 Minuten wurden Teilmen gen der Reaktion entnommen und mit Diethylamin zur Reaktion gebracht, um zu bestimmen, ob eine vollständige Anhydridbildung stattgefunden hatte. Da sich das Anhydrid nicht vollständig zu bilden schien, wurden zusätzliche 0,7 mmol Trimethylacetylchlorid zugegeben, und die Reaktion wurde für weitere 10 min gerührt. Nachdem die dsc-Analyse eine vollständige Bildung des Anhydrids angezeigt hatte, wurde die oben beschriebene Reaktion tropfenweise dem Anhydridprodukt dieser Reaktion zugegeben, und dieses Gemisch wurde dann 30 Minuten gerührt.
Das Produkt wurde dann verdampft und der Rückstand mit 60 ml Ethylether und 60 ml einer Lösung aus 3 % N-Methylmorpholin in Wasser portioniert. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht einmal mit 30 ml einer Lösung aus 3 N-Methylmorpholin in Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und in ein zweites Gefäß eingefiltert. An diese Lösung wurden 24 mmol N-Methylmorpholin und 6 mmol Triethylamin-Trihydrofluorid zugegeben. An die Lösung wurden 60 ml Wasser zugegeben, und dann wurden die Lösungen gerührt, bis alles gelöst war (pH-Wert bei etwa 8 nach Papierprobe). Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht verdampft. Der Rückstand wurde dann mit 60 ml Dichlormethan und 80 ml einer pH-3,5*-Pufferlösung portioniert. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und 12 mmol N-Methylmorpholin wurden dem Filtrat zugegeben. Das Filtrat wurde dann verdampft und der Rückstand in einer Kleinstmenge Dichlormethan gelöst. Das Produkt wurde dann durch Fallenlassen dieser Lösung in heftig gerührten eiskalten Ethylether abgeschieden. Das Produkt wurde durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Ertrag: 2,58 g (57 %).
¹H-NMR (d₆DMSO):δ = 10,5 (s, 1H), 8,5 (d, 1H), 8,3 (d, 1H), 7,7 (m, mj, 1H), 7,4 (m, mi, 1H) 7,3–7,0 (m, 8H), 6,6 (m, 1H), 5,2 (s, mj, 2H), 5,1 (s, mi, 2H) 4,2 (s, mi, 2H), 4,0 (s, mj, 2H), 3,6 (t, ½ NMM) 3,5–3,0 (m, 4H), 2,4 (t, ½ NMM), 2,25 (s, 6H), 2,2 (s, ½ NMM), 1,6 (s, 6H)
Beispiel 19
Synthese von N-[N"-4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2"-Aminoethyl)]-N-[2-[N'²-2-(Methylthio)-Ethoxycarbonyl-(9'-Guanyl)]-Acetyl]-Glycin (XVIII)
An 5 mmol N-[N'-,4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2'-Aminoethyl)]-Glycin wurden 25 ml Acetonitril und 20 mmol N-Methylmorpholin zugegeben. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, und dann wurden 10 mmol Triisopropylsilylchlorid zugegeben. Die Lösung wurde 1,5 Stunden bei 0° C gerührt und dann dem Produkt der folgenden Reaktion, wie unten beschrieben, zugegeben.
An 6 mmol 2-[N'²-2-(Methylthio)-Ethoxycarbonyl-(9'-Guanyl)]-Essigsäure, die zweimal aus 10 ml von trockenem DMF mitverdampft wurde, wurden 25 ml Acetonitril zugegeben. Die Lösung wurde unter Kühlung auf 0° C über 20 Minuten gerührt. Danach wurden 7 mmol Trimethylacetylchlorid zugegeben. Als nächstes wurden 20 mmol N-Methylmorpholin tropfenweise zugegeben, und die Lösung wurde 20 Minuten lang gerührt. (Wie üblich, wurden Teilmengen der Reaktion entnommen und mit Diethylamin zur Reaktion gebracht, um zu bestimmen, ob eine vollständige Anhydridbildung stattgefunden hatte.)
Nachdem die dsc-Analyse eine vollständige Bildung des Anhydrids angezeigt hatte, wurde die oben beschriebene Reaktion tropfenweise dem Produkt dieser Reaktion zugegeben, und dieses Gemisch wurde dann eine Stunde lang gerührt. Das Produkt wurde dann verdampft (nicht auf Trockenheit) und der Rückstand mit 50 ml Ethylether und 50 ml einer Lösung aus 3 % N-Methylmorpholin in Wasser portioniert. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde im Volumen durch 20 ml (Ether zugegeben) vergrößert, und dann wurde sie einmal mit 30 ml einer Lösung aus 3 % N-Methylmorpholin in Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde mit Natriumsulfat getrocknet und in ein zweites Gefäß eingefiltert. An diese Lösung wurden 20 mmol N-Methylmorpholin und 5 mmol Triethylamin-Trihydrofluorid zugegeben. An die Lösung wurden 50 ml einer Lösung aus 3 % N-Methylmorpholin in Wasser (pH-Wert bei etwa 8 nach Papierprobe) zugegeben. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde auf 5 bis 10 ml konzentriert. Diese wurde an einen Trenntrichter übergeben, und 50 ml Ethylacetat und 75 ml einer pH-3,5*-Pufferlösung wurde zugegeben. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde dann mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und 10 mmol N-Methylmorpholin wurde dem Filtrat zugegeben. Das Filtrat wurde dann verdampft und der Rückstand in einer Kleinstmenge von Dichlormethan gelöst. Das Produkt wurde dann durch Fallenlassen dieser Lösung in 200 ml eiskalten Ethylether abgeschieden. Das Produkt wurde durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Ertrag: 1,65 g (43%).
¹H-NMR (d₆DMSO):δ = 11,4 (s, 1H), 7,8 (d, 1H), 7,6 (m, mj, 1H), 7,5 (m, mi, 1H), 7,3-6,9 (m, 9H), 6,6 (m, 1H), 5,0 (s, mj, 2H), 4,9 (s, mi, 2H), 4,4–4,2 (m, 2H), 4,16 (s, mi, 2H), 4,0 (s, mj, 2H), 3,6 (t, ½ NMM), 3,55–3,0 (m, 4H), 2,8–2,6 (m, 2H), 2,4 (t, ½ NMM), 2,25 (m, 6H), 2,2 (s, ½ NMM), 2,1 (s, 3H)
Beispiel 20
Synthese von N-[N"-4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2"-Aminoethyl)]-N-[2-[N'²-2-(Methylsulfonyl)-Ethoxycarbonyl-(9'-Guanyl)]-Acetyl]-Glycin
An 1 mmol N-[N"-4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl-(2"-Aminoethyl)]-N-[2-[N'²-2-(Methylthio)-Ethoxycarbonyl-(9'-Guanyl)]-Acetyl]-Glycin wurden 6 ml Wasser und 1 ml N-Methylmorpholin zugegeben. Die Lösung wurde gerührt, bis der gesamte Feststoff gelöst war. Nach erfolgter Lösung wurde 1 mmol Natriumwolframat der im Rühren befindlichen Lösung zugegeben. Dann wurden 2,5 mmol Hydrogenperoxid (3 % Hydrogenperoxid in Wasser) zugegeben. Die Reaktion wurde gerührt und durch eine HLFC-Analyse überwacht. Nach einer Stunde des Rührens wurde die Reaktion auf 50º C erwärmt, um die Oxidationsgeschwindigkeit zu erhöhen. Da sich die Oxidation nicht merklich erhöhte, wurde die Reaktion sodann gekühlt, und zusätzliche 2 ml von 3 % Hydrogenperoxid in Wasser wurden zugegeben. Danach wurden 250 Mikroliter (μl) der Lösung von 3 % Hydrogenperoxid alle fünf Minuten zugegeben, bis die HLFC-Analyse anzeigte, daß nur etwa 5 % nicht oxidierten Materials verblieben. Die Reaktion wurde weitere 30 Minuten gerührt und dann an einen Trenntrichter übergeben. Da sich eine Emulsion bildete, wurden der Lösung 10 ml Kochsalzlösung zugegeben, und man ließ diese Lösung bis zur Trennung stehen. Die organische Schicht wurde gesammelt, mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert, und 100 μl N-Methylmorpholin wurde der gefilterten Lösung zugegeben. Da das zusätzliche N-Methylmorpholin eine heterogene Lösung ergab, wurde die gesamte Lösung an den Trenntrichter zurückgegeben, und 10 ml Wasser, 10 ml Kochsalzlösung und 10 ml Dichlormethan wurden zugegeben. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde gesammelt, mit Natriumsulfat getrocknet, gefiltert, und 200 ml N-Methylmorpholin wurden dem gefilterten Produkt zugegeben. Die Lösung wurde verdampft und der Rückstand in einer Kleinstmenge Dichlormethan gelöst. Das Produkt wurde dann durch tropfenweise Zugabe dieser Lösung an heftig gerührten eiskalten Ethylether abgeschieden. Das weiße Feststoffprodukt wurde durch Vakuumfiltrierung gesammelt. Ertrag: 0,561 g gelber Feststoff (75 %).
¹H-NMR (d₆DMSO):δ = 11,4 (s, 1H), 7,8 (d, 1H), 7,7–7,5 (m, 1H), 7,3–6,9 (m, 9H), 6,6 (m, 1H), 5,0 (s, mi, 2H), 4,9 (s, mj, 2H), 4,6–4,4 (m, 2H), 4,0 (s, mi, 2H), 3,9 (s, mj, 2H), 3,6 (t, ½ NMM), 3,55–3,2 (m, 6H), 3,2 (s, 3H), 2,4 (t, ½ NMM), 2,25 (m, 6H), 2,2 (s, ½ NMM)
Beispiel 21
Synthese der PNA-Sequenz: H₂N-CTTCTCC-CONH₂
Syntheseharz: 50 Milligramm Boc-BHA-PEG-PS von PerSeptive Biosystems (P/N GEN063050) mit Aminogruppenanteil von 0,145 mmol/Gramm.

Schicht: 7,25 Mikromol (μM), Schichtsynthese

Andere Äquivalente:

5 Äquivalente Synthon 36 μM

4 Äquivalente HATU 11 Milligramm (mg) pro Kopplung

10 Äquivalente N-Methylmorpholin 8 μl pro Kopplung
Das Monomer wurde unmittelbar vor jedem Kopplungsschritt hergestellt. Dem trockenen Pulver in einer Zentrifugenröhre von 1 ml wurden 180 μl einer Lösung von 0,4 M N-Methylmorpholin in Dimethylformamid (DMF)/Dichlormethan (DCM) (1:1) zum lösen zugegeben. Der Lösung wurden dann 180 μl von 0,16 M HATU, aufgelöst in DMF, zugegeben. Die Lösung wurde dann gemischt und unmittelbar für Kopplungsreaktionen verwendet. (Die endgültige Monomerkonzentration betrug etwa 0,1 M)
Synthesezyklus
Abtrennung:
7,2 Milligramm (mg) Harz abgenommen. Dem Harz wurden in einem Ultrafree-Gerät (Millipore P/N SE3P230J3) 100 μl Tetrahydrofuran und 300 μl konzentrierte Ammoniumhydroxidlösung zugegeben. Die Röhre wurde verschlossen und die Lösung bei 55ºC über Nacht erwärmt. Die Lösung wurde von den Kügelchen durch sorgfältiges Pipettieren der Kügelchen zu einem Ultrafree-Gerät (Millipore P/N SE3P230J3) entnommen, gefolgt von einer Zentrifugierung. Die Harzkügelchen wurden dann viermal durch die Zugabe von getrocknetem THF gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugierung. Schließlich wurde das Harz im Vakuum getrocknet.
Das Harz wurde wieder an ein Ultrafree-Gerät (Millipore P/N SE3P230J3) übertragen und dann einer starken Abtrennsäure für 1,5 Stunden ausgesetzt. Die saure Abtrennlösung wurde dann durch Zentrifugieren entfernt, und das Harz wurde zweimal mit weiterer Lösung aus starker Abtrennsäure gewaschen. Der gesammelten sauren Lösung wurde dann 1 ml Ether zugegeben, und die Zentrifugenröhre wurde in Betrieb gesetzt, bis das PNA-Oligomer abgeschieden war. Der Ether wurde dekantiert und das PNA-Pellet zweimal mit Ether durch Suspension des Pellets gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugierung zur Neuerzeugung eines Pellets. Den Restether ließ man vom Pellet vollständig verdampfen, und dann wurde das Pellet in 1 ml einer Lösung von 0,1 % TFA in Wasser gelöst. Die Umkehrphasen-HLFC-Analyse des erhaltenen Rohprodukts ist in 9 dargestellt. Des weiteren wurde das Produkt durch Massenspektrometrie, matrixgestützte Laserdesoption-Ionisierung-Laufzeit (MALDI-TOF) mit einem Prototyp-Massenspektrometer analysiert. Das berechnete Molekulargewicht betrug (M+H) 1822 amu, gefundene Masse 1823 amu (innerhalb des Fehlerbereichs des Massenspektrometriegerätes).
Beispiel 22
Synthese von H₂N-CGCTATACCC-CONH₂
Syntheseharz: 80 Milligramm Boc-BHA-PEG-PS von PerSeptive Biosystems (P/N GEN063050) mit Aminogruppenanteil von 0,145 mmol/Gramm.

Schicht: 11,6 Mikromol (μM), Schichtsynthese

Andere Äquivalente:

5 Äquivalente Synthon 58 μM

4 Äquivalente HATU 18 mg pro Kopplung

10 Äquivalente N-Methylmorpholin 8 μl pro Kopplung
Das Monomer wurde unmittelbar vor jedem Kopplungsschritt hergestellt. Dem trockenen Pulver in einer Zentrifugenröhre von 1 ml wurden 145 μl einer Lösung aus 0,8 M N-Methylmorpholin in DMF/DCM (2:1) zum Lösen zugegeben. Der Lösung wurden dann 145 μl 0,32 M HATU, gelöst in DMF, zugegeben. Die Lösung wurde dann gemischt und unmittelbar für Kopplungsreaktionen verwendet. (Die endgültige Monomerkonzentration betrug etwa 0,2 M)
Synthesezyklus
Anmerkungen: Der Kaiser-Test war leicht positiv bei Kopplung #8 (Cytosinsynthon). Kaiser war sehr positiv bei Kopplung #9 (Guaninsynthon). Die Kopplung bei Schritt 9 war zu verdoppeln. Die Kopplungsreaktion bei Kopplung #10 (Cytosinsynthon) wurde 15 Minuten durchgeführt. Kaiser noch positiv. Doppelte Kopplung durchgeführt bei Kopplung #10. Nach endgültiger Waschung wurde das Harz unter Vakuum getrocknet. Gesamtgewicht: 0,1087 g (Gewichtszunahme 28,7 mg)
Abtrennung:
Es wurden 7,2–7,5 Milligramm (mg) Harz genommen. Dem Harz wurden, in einem Ultrafree-Gerät (Millipore P/N SE3P230J3), 100 μl Tetrahydrofuran und 300 μl konzentrierter Amoniumhydroxidlösung zugegeben. Die Röhre wurde verschlossen und die Lösung bei 56ºC für 2 Stunden erwärmt. Die Lösung wurde von den Kügelchen entfernt durch sorgfältiges Pipettieren der Kügelchen zu einem Ultrafree-Gerät (Millipore P/N SE3P230J3), gefolgt von einer Zentrifugierung. Die Harzkügelchen wurden dann viermal durch die Zugabe von trockenem THF gewaschen, gefolgt von einer Zentrifugierung. Schließlich wurde das Harz unter Vakuum getrocknet.
Das Harz wurde dann wieder an ein Ultrafree-Gerät (Millipore P/N SE3P230J3) übergeben und dann einer hochwirksamen Abtrennsäure für eine Stunde ausgesetzt. Die saure Abtrennlösung wurde dann durch Zentrifugieren entfernt und das Harz wieder mit hochwirksamer Abtrennsäure für eine Stunde behandelt. Die saure Abtrennlösung wurde dann durch Zentrifugieren entfernt, wobei die beiden sauren Abtrennlösungen im Boden der Zentrifugenröhre des Ultrafree-Gerätes verbunden wurden. Der gesammelten sauren Lösung wurde dann 1 ml Ether zugegeben und die Zentrifuge in Betrieb genommen, bis das PNA-Oligomer abgeschieden war. Der Ether wurde dekantiert und das PNA-Pellet zwei weitere Male mit Ether durch Suspension des Pellets gefolgt von einer Zentrifugierung, zur Neuerzeugung eines Pellets gewaschen. Den Restether ließ man von dem Pellet vollständig verdampfen, und dann wurde das Pellet in 1 ml einer Lösung von 0,1 % TFA in Wasser gelöst. Die Umkehrphasenanalyse des Roholigomers ist in 10 dargestellt. Des weiteren wurde das Produkt durch Massenspektrometrie, matrixgestützte Laserdesorption-Ionisation-Laufzeit (MALD-TOF), mit einem Prototyp-Massenspektrometer analysiert. Das errechnete Molekulargewicht betrug 2648,5 amu, die gefundene Masse betrug (M+H) 2650 amu (innerhalb des Fehlerbereichs des Massenspektrometriegerätes).
Beispiel 23
Synthese der PNA/DNA-Chimäre:
Synthetisierte Chimärensequenz: DMBhoc-HN-CACAC-CONH-Linker-5'-CCAGT-3'-OH, wobei die unterstrichene Sequenz die PNA-Sequenz und die fettgedruckte Sequenz die DNA-Sequenz darstellt.
Verfahren:
Ein trägergebundenes 5'-amin-modifiziertes DNA-Oligomer mit der Sequenz MMT-Aminohexyl-CCAGT wurde synthetisiert unter Verwendung eines im Handel erhältlichen EXPEDITE^®-DNA-Synthesemittels (PerSeptive Biosystems) nach einem Standardprotokoll für eine Schichtsynthese von 0,2 μM. Der Syntheseträger war ein 0,2-μM-MEMSYN^®-Synthesegerät (P/N GEN050034), und die Synthone waren Standardphosphoramidite mit exozyklischen Aminoschutzgruppen Acyl (Benzoyl, Isbutryrl). Die endgültige Kopplung wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen MMT-Aminohexyl-Phosphoramidits durchgeführt, wie beschrieben durch den Hersteller (PerSeptive Biosystems P/N GEN080020). Die Momomethoxytrityl-(MMT)-Gruppe wurde entfernt, indem zwei Standard-Entsperrungszyklen mit dem DNA-Synthesemittel durchgeführt wurden.
Das MEMSYN^®-Gerät wurde dann an ein Prototyp-PNA-Synthesemittel übergeben. Die verbleibenden PNA-Kopplungszyklen wurden mit dem Prototyp-Synthesemittel mit einem für die Lieferung von Reagenzien an die Kolonne optimierten Zyklus durchgeführt. Im allgemeinen war der Kopplungszyklus folgender:
Die endgültige DMBhoc-Gruppe wurde nach der Synthese nicht entfernt. Es ist wesentlich, daß die endständige Aminogruppe geschützt bleibt bis nach der Ammoniumhydroxid-Schutzentfernung der Seitenkettenschutzgruppen. Eine vorzeitige Entfernung führt zu einem teilweisen Abbau des PNA-Protions des Oligomers.
Abtrennung:
Das MEMSYN^®-Gerät wurde auseinandergebaut, und die beiden Membransyntheseträger wurden entfernt. Eine der Membranen wurde in Viertelteile geschnitten. Einem Viertel wurden 2–3 Tropfen TFA zugegeben. Die stark gelbe Farbe zeigte das Vorhandensein des Kations von DMBhoc an. Dieses Membranstück wurde dann mit DCM gewaschen und mit Ninhydrin behandelt. Die Purpurfarbe zeigte, wie erwartet, das Vorhandensein endständiger Aminogruppen an.
Die verbleibende Synthesemembran wurde einer verschließbaren Zentrifugenröhre zugegeben. Der Röhre wurde 1 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid zugegeben. Die Röhre wurde dicht verschlossen und auf 55ºC für 6 Stunden erwärmt. Die Ammoniumhydroxidlösung wurde entfernt und auf Trockenheit mit einem Geschwindigkeitsvakuumverdampfer konzentriert. Der Rückstand wurde wieder in 200 μl 50-Millimol-Ammoniumacetat-Pufferlösung mit pH-Wert 7 gelöst.
Die Umkehrphasen-HLFC-Analyse des Roholigomers ist in 11 dargestellt. Das festgestellte Hauptprodukt wurde gereinigt durch Sammeln des Höchstwertes bei der Elution vom HLFC-Detektor. Die Reinheit der isolierten Fraktion wurde bestätigt durch Nachanalyse des isolierten Produktes durch HLFC. Das Chromatogramm des Produktes ist in 12 dargestellt. Die im Nachanalysechromatogramm beobachteten Verunreinigungsspitzenwerte erwiesen sich als Pufferverunreinigungen aufgrund des laufenden Gradienten ohne Probeninjektion (siehe 13). Ferner wurde das isolierte Produkt durch Massenspektrometrie, matrixgestützte Laser-Desorption-Ionisation-Laufzeit (MALDI-TOF), mit einem Prototyp-Massenspektrometer analysiert. Das errechnete Molekulargewicht betrug 3184,7 amu, und die gefundene Masse betrug (M–H) 3183,7 amu (innerhalb des Fehlerbereichs des Massenspektrometriegerätes).

Claims

PNA-DNA-Chimäre, bestehend aus KLQMN wobei K und N chemische Bindungen sind, und zumindest eine eine covalente Bindung ist; Q ein Linker oder eine chemische Bindung ist; das eine von L und M eine Nucleotidkomponente ist mit der Formel:
und das andere von L und M eine PNA-Komponente ist mit der Formel:
wobei G ein sekundäres Stickstoffatom, ein tertiäres Stickstoffatom mit einem Alkylsubstituenten, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom ist; B unabhängig entweder eine natürliche oder eine unnatürliche Nucleobase ist, bestehend aus einer exocyklischen Aminogruppe, wobei die exocyklische Aminogruppe mit einer Nucleobasenschutzgruppe geschützt ist, die eine gleichartige Unbeständigkeit mit den in der DNA-Synthese verwendeten Schutzgruppen hat; D ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Methoxylgruppe oder eine Hydroxylgruppe ist, die von einer Schutzgruppe geschützt ist; R⁷ ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff und einer Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlich vorkommenden α-Aminosäure bestehenden Gruppe; und j, g und h jeweils unabhängig null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei zumindest eine der Nukleobasenschutzgruppen eine Ethoxycarbonylgruppe ist mit der Formel:
wobei W Cyano, Alkyl, Sulfonyl, Arylsulfonyl, Phenyl, p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl oder p-Alkylsulfonylphenyl ist; und das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch R²-R⁴ repräsentiert ist, unabhängig ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl und t-Butyl bestehenden Gruppe.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei K eine covalente Bindung ist, die L mit zumindest einer von entweder einer Nucleotidkomponente mit einer Hauptschutzgruppe oder einer PNA-Komponente mit einer Hauptschutzgruppe verbindet, wobei die Hauptschutzgruppe eine orthogonale, säureunbeständige Schutzgruppe ist.
Verbindung nach Anspruch 1, bestehend aus einer nachweisbaren Komponente, die aus der aus Enzymen, Antigenen, radioaktiven Markierungen, Affinitätsmarkierungen, fluoreszierenden Markierungen, ultravioletten Markierungen und infraroten Markierungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
PNA-Synthon, mit der Formel:
wobei Pg eine Carbamatschutzgruppe ist mit der folgenden Formel:
wobei A₁-A₁₀ jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Amid und Estergruppen bestehenden Gruppe; und R⁴ ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff, Methyl und Ethyl bestehenden Gruppe; G ein sekundäres Stickstoffatom, ein tertiäres Stickstoffatom mit einem Alkylsubstituenten, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom ist; Ba eine natürliche oder unnatürliche Nucleobase ist, wobei, falls die Nucleobase eine exocyclische Aminogruppe hat, die exocyclische Aminogruppe dann geschützt ist durch eine basenunbeständige Aminoschutzgruppe mit der folgenden Formel
wobei W Cyano, Alkyl, Sulfonyl, Arylsulfonyl, Phenyl, p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl oder p-Alkylsulfonylphenyl ist; und das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch R²-R⁴ repräsentiert ist, unabhängig ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl und t-Butyl bestehenden Gruppe; R⁷ ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff und einer Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlich vorkommenden α-Aminosäure bestehenden Gruppe; und j, g und h jeweils unabhängig null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf ist.
Verbindung nach Anspruch 5 mit der Formel:
Verbindung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei Pg 4,4'-Dimethylbenzhydroloxycarbonyl ist.
Verbindung nach Anspruch 5, 6 oder 14, wo bei Ba ausgewählt ist aus der aus Adenin, Cytosin, Guanin, Pseudoisocytosin, 5-Methylcytosin, Isocytosin, Thymin, Uracil, Hypoxanthin, Pseudouracil, 5-Bromo-Uracil, 6-Thioguanin, 7-Deazaguanin, 7-Deaza-8-azaguanin und 2,6-Diaminopurin bestehenden Gruppe.
Verbindung nach Anspruch 5 oder 6, wobei R⁴ Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 2, 5, 6 oder 14, wobei W -CN ist.
Verbindung nach Anspruch 2, 5, 6 oder 14, wobei W R⁵-SO_n- ist, wobei n eins oder zwei ist; und R⁵ ausgewählt ist aus der aus Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl bestehenden Gruppe und einer substituierten oder unsubstituierten Phenylgruppe mit der Formel:
wobei das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch a–e repräsentiert ist, jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der aus F, Cl, Br, I, Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Propyl, n-Butyl, t-Butyl, Phenyl, Methoxy, Ethoxy, -NO₂, -CN, -SO₃H, -SCH₃ und -(O)SCH₃ bestehenden Gruppe.
Verbindung nach Anspruch 1, 2, 5, 6 oder 14, wobei B oder Ba eine natürliche oder unnatürliche Nucleobase mit einer exocyclischen Aminogruppe ist, geschützt durch einen beliebigen der Stoffe 2,2-Dimethyl-1-cyanoethoxycarbonyl, 2-(Methylsulfonyl)ethoxycarbonyl oder 2-(Phenylsulfonyl)ethoxycarbonyl.
PNA-Synthon nach Anspruch 6 mit einer der Formeln (a) bis (f):

wobei n eins oder zwei ist;
wobei n eins oder zwei ist;
PNA-Oligomer, bestehend aus KLQMN wobei K und N chemische Bindungen sind; Q ein Linker oder eine chemische Bindung ist; und L und M jeweils unabhängig eine PNA-Komponente ist mit der Formel:
wobei G ein sekundäres Stickstoffatom, ein tertiäres Stickstoffatom mit einem Alkylsubstituenten, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom ist; Ba eine natürliche oder unnatürliche Nucleobase ist und zumindest eine der Nucleobasen eine exocyclische Aminogruppe aufweist, geschützt durch eine Ethoxycarbonylgruppe mit der Formel:
wobei W Cyano, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Phenyl, p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl oder p-Alkylsulfonylphenyl ist; und das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch R²-R⁴ repräsentiert ist, unabhängig ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl und t-Butyl bestehenden Gruppe; R⁷ ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff und einer Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlich vorkommenden α-Aminosäure bestehenden Gruppe; und j, g und h jeweils unabhängig null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf ist.
Verfahren zum Synthetisieren einer PNA-DNA-Chimäre, mit den Schritten, daß (a) ein Paar von Verbindungen Y und Z bereitgestellt wird, wobei eine der Y- und Z-Verbindungen eine Nucleotidkomponente ist mit einem dreiwertigen Phosphor mit der Formel:
und die andere der Y- und Z-Verbindungen eine PNA-Komponente ist mit der Formel:
wobei Pn ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe ist; G ein sekundäres Stickstoffatom, ein tertiäres Stickstoffatom mit einem Alkylsubstituenten, ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom ist; B unabhängig entweder eine natürliche oder eine unnatürliche Nukleobase ist, wobei zumindest eine Nukleobase eine exocyclische Aminogruppe umfaßt, geschützt mit einer Nukleobasenschutzgruppe mit der Formel:
wobei W Cyano, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl, Phenyl, p-Nitrophenyl, o-Nitrophenyl oder p-Alkylsulfonylphenyl ist, und das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch R²-R⁴ repräsentiert ist, unabhängig ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl und t-Butyl bestehenden Gruppe; D ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe, eine Methoxylgruppe oder eine Hydroxylgruppe ist, die durch eine Schutzgruppe geschützt ist; R⁶ eine Schutzgruppe ist, die eliminiert werden kann; L¹ eine austretende Gruppe oder chemische Bindung ist; Pa ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe ist; R⁷ ausgewählt ist aus der aus Wasserstoff und einer Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten natürlich vorkommenden α-Aminosäure bestehenden Gruppe; L² eine Hydroxylgruppe, eine austretende Gruppe oder eine chemische Bindung ist; und j, g und h jeweils unabhängig null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf ist; wobei einer der Stoffe Pn und Pa ein Wasserstoffatom und der andere der Stoffe Pn und Pa eine Hauptschutzgruppe ist, die orthogonal ist zu den Nukleobasenschutzgruppen; (b) Y mit Z gekoppelt wird; und (c) der dreiwertige Phosphor oxidiert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem R⁶ eine Gruppe ist mit der Formel:
wobei die jeweils durch V₁-V₃ repräsentierten Atome oder Gruppen unabhängig ausgewählt sind von der aus Wasserstoff, Methyl und Ethyl bestehenden Gruppe; und W eine Elektronenabziehgruppe ist; und wobei L¹ ausgewählt ist aus der Gruppe von F, Cl, Br, I und einer sekundären Aminogruppe mit der Formel: -NR⁸R⁹ wobei die jeweils von R⁸ und R⁹ repräsentierten Gruppe n unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe von primären, sekundären oder tertiären Alkylgruppen mit 1–10 Kohlenstoffatomen oder zusammen ausgewählt sind aus der Gruppe von Cycloalkylgruppen mit 5–7 Kohlenstoffatomen, die ein oder zwei Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome als Heteroatome enthalten können.
Verfahren nach Anspruch 15 mit den zusätzlichen Schritten, daß (d) von Pn und Pa. dasjenige eliminiert wird, was nicht das Wasserstoffatom ist; und (e) die Nukleobasenschutzgruppe entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Molekül mit einem Trägermaterial verbunden wird und das Verfahren die zusätzlichen Schritte umfaßt, daß (d) von Pn und Pa dasjenige eliminiert wird, was nicht das Wasserstoffatom ist, eine Kopplungsstelle schaffend; und (e) zumindest eine Komponente von entweder einer Nucleotidkomponente mit einer Hauptschutzgruppe oder einer PNA-Komponente mit einer Hauptschutzgruppe mit der Kopplungsstelle verbunden wird.
Verfahren nach Anspruch 18, ferner mit den zusätzlichen Schritten: (f) Eliminieren der Hauptschutzgruppe, eine weitere Kopplungsstelle schaffend; und (g) Verbinden von zumindest einem Stoff von entweder einem Nukleotid mit einer Hauptschutzgruppe oder einer PNA-Komponente mit einer Hauptschutzgruppe mit der weiteren Kopplungsstelle, und wobei zum Beispiel die Schritte (f) und (g) mehrere Male ausgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 19, ferner mit den zusätzlichen Schritten: (h) Eliminieren der Nukleobasenschutzgruppen; (e) Abtrennen des Moleküls von dem Trägermaterial und (j) Eliminieren der Hauptschutzgruppe.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem W ist eines von (a) R⁵-SO_n-, wobei n eins oder zwei ist und R⁵ ausgewählt aus der Gruppe von Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl und einer substituierten oder unsubstituierten Phenylgruppe mit der Formel:
wobei das Atom oder die Gruppe, das bzw. die jeweils durch a–e repräsentiert ist, unabhängig ausgewählt wird aus der Gruppe von F, Cl, Br, I, Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Propyl, n-Butyl, t-Butyl, Phenyl, Methoxy, Ethoxy, -NO₂, -CN, -SO₃H, -SCH₃ und -(O)SCH₃; und (b) -CN.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die PNA-Komponente die Formel hat:
wobei Pa ein Wasserstoff oder eine Hauptschutzgruppe ist und die Nucleobase B ausgewählt wird aus der Gruppe von Adenin, Cytosin, Guanin, Pseudoisocytosin, 5-Methylcytosin, Isocytosin, 6-Thioguanin, Thymin, Uracil, Hypoxanthin, Pseudouracil, 5-Bromo-Uracil, 6-Thioguanin, 7-Deazaguanin, 7-Deaza-8-azaguanin und 2,6-Diaminopurin.
Verfahren zum Synthetisieren einer säureunbeständigen aminogeschützten Hauptverbindung mit den Schritten: (a) Bereitstellen eines Alkohols mit der Formel:
wobei A₁-A₁₀ unabhängig aus der Gruppe von Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Amid und Estergruppen ausgewählt wird und R⁴ aus der Gruppe von Wasserstoff, Methyl und Ethyl ausgewählt wird; (b) zur Reaktion Bringen des Alkohols und einer Aminogruppe von Ethylendiamin oder Methylendiamin mit einem Carbonylequivalent zur Bildung eines Carbamats mit der Formel
wobei A₁-A₁₀ und R⁴ der obigen Definition entsprechen und g null oder 1 ist; (c) zur Reaktion Bringen der aus dem Schritt (b) resultierenden Verbindung mit einer Acylgruppe zur Bildung eines Acetamidderivats mit der Formel
wobei A₁-A₁₀, R⁴ und g der obigen Definition entsprechen und X ein Halogen ist; und (d) zur Reaktion Bringen des Acetamidderivats mit (i) einer Base, (ii) einem Alkylhaloalkylat und (iii) einer Hydroxidionenquelle zur Bildung der aminogeschützten Hauptverbindung mit der Formel
wobei A₁-A₁₀, R⁴ und g der obigen Definition entsprechen und h null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
Säureunbeständige aminogeschützte Hauptverbindung mit der Formel:
wobei Pg eine säureunbeständige Schutzgruppe ist mit der Formel:
wobei A₁-A₁₀ jeweils unabhängig aus der Gruppe von Wasserstoff, Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, t-Butyl, Hydroxy, Methoxy, Ethoxy, Amino und Alkylaminogruppen ausgewählt wird; und R⁴ aus der Gruppe von Wasserstoff, Methyl und Ethyl ausgewählt wird; R⁷ aus der Gruppe von Wasserstoff und Seitenketten von geschützter oder ungeschützter natürlich vorkommender α-Aminosäure ausgewählt wird; und g und h jeweils unabhängig null oder eine ganze Zahl von eins bis fünf ist.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines therapeutischen oder antisensorischen Mittels.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 als Primer in einer Polymerasereaktion mit dem Schritt des Kontaktierens der Verbindung mit einem Nucleinsäurepolymer.
Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 als Sonde zum Nachweis eines genetischen Materials, mit dem Schritt des Kontaktierens der Verbindung mit einem Nucleinsäurepolymer.