ES2620359T3 - Células que producen unas composiciones de anticuerpo - Google Patents

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ES2620359T3 ES01974718.7T ES01974718T ES2620359T3 ES 2620359 T3 ES2620359 T3 ES 2620359T3 ES 01974718 T ES01974718 T ES 01974718T ES 2620359 T3 ES2620359 T3 ES 2620359T3
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Yutaka Kanda
Mitsuo Satoh
Kazuyasu Nakamura
Kazuhisa Uchida
Toyohide Shinkawa
Naoko Yamane
Emi Hosaka
Kazuya Yamano
Motoo Yamasaki
Nobuo Hanai
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Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
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Abstract

Célula en la que (i) la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de GDP-fucosa es suprimida, o (ii) la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de GDP-fucosa y la actividad de la α-1,6- fucosiltransferasa son suprimidas, mediante una técnica de ingeniería genética, en la que dicho enzima relacionado con la síntesis de GDP-fucosa es un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste en los (a), (b) y (c) siguientes: (a) GMD (GDP-manosa 4,6-deshidratasa), (b) Fx (GDP-ceto-6-desoximanosa 3,5-epimerasa, 4-reductasa); (c) GFPP (GDP-beta-L-fucosa pirofosforilasa), y en la que la técnica de ingeniería genética es una técnica seleccionada de entre el grupo que consiste en los (A), (B), (C) y (D) siguientes: (A) una técnica de disrupción génica que dianiza un gen que codifica el enzima; (B) una técnica para introducir un mutante negativo dominante de un gen que codifica el enzima; (C) una técnica para introducir una mutación en el enzima; (D) una técnica para inhibir la transcripción y/o la traducción de un gen que codifica el enzima.

Description

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(b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que han sido delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos 1 a 20 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 72 y que presenta actividad Fx,
5
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID nº 72 y presenta actividad Fx.
[8]. La célula según [1] o el animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo según [2] o [3], en la que GFPP es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b) a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 51,
15 (b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 51 bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GFPP.
[9]. La célula según [1] o el animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según [2] o [3], en la que la GFPP es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73,
(b)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que 1 a 20 aminoácidos han sido
25 delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73 y que presenta actividad de GFPP,
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73 y presenta actividad de GFPP.
[10]. La célula animal o vegetal no humana transgénica o la progenie de la misma según cualquiera de entre [1] y [3], en la que la α1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c) y (d), a continuación:
35
(a)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 1,
(b)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 2,
(c)
un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 1, bajo condiciones restrictivas, y codifica una proteína que presenta actividad de α1,6fucosiltransferasa,
(d)
un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID
nº 2, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de α1,645 fucosiltransferasa.
[11]. La célula animal o vegetal no humana transgénica o la progenie de la misma según cualquiera de entre [1] y [3], en la que la α1,6-fucosiltransferasa es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d), (e) y (f), a continuación:
(a)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23,
(b)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24,
(c)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que 1 a 20 aminoácidos han sido
55 delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α1,6-fucosiltransferasa,
(d)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que 1 a 20 aminoácidos han sido delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y que presenta actividad de α1,6-fucosiltransferasa,
(e)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α1,6-fucosiltransferasa,
65
(f) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo
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25
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45
55
65
menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y que presenta actividad de α1,6-fucosiltransferasa.
[12]. La célula según cualquiera de entre [1] y [4] a [11], que es resistente a por lo menos una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
[13]. La célula según cualquiera de entre [1] y [4] a [12], que es una célula seleccionada de entre el grupo que consiste en (a) a (i), a continuación:
(a)
una célula CHO derivada de tejido de ovario de hámster chino,
(b)
una estirpe celular de mieloma de rata, célula YB2/3HL.P2.G11.16.AG.20,
(c)
una estirpe celular de mieloma de ratón, células NS0,
(d)
una estirpe celular de mieloma de ratón, célula SP2/0-Ag14,
(e)
una célula BHK derivada de tejido de riñón de hámster chino,
(f)
una célula de hibridoma productor de anticuerpos,
(g)
una célula Namalwa de estirpe celular de leucemia humana,
(h)
una célula madre embrionaria no humana,
(i)
una célula de huevo fertilizado no humano.
[14]. La célula según cualquiera de entre [1] o [4] a [13] en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo.
[15]. La célula según [14], en la que la molécula de anticuerpo pertenece a una clase de IgG.
[16]. Un procedimiento para producir una composición de anticuerpo, que comprende cultivar la célula según [14]
o [15] en un medio para producir y acumular la composición de anticuerpo en el cultivo y recuperar la composición de anticuerpo a partir del cultivo.
[17]. El procedimiento según [16], que produce una composición de anticuerpo que presenta una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos más elevada que una composición de anticuerpo obtenida a partir de su estirpe celular parental.
[18]. La célula animal o vegetal no humana transgénica o la progenie de la misma según cualquiera de entre [2] y [11], en la que el animal no humano transgénico es un animal seleccionado de entre el grupo que consiste en vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono y conejo.
[19]. Un procedimiento para producir una composición de anticuerpo, que comprende recuperar una composición de anticuerpo a partir de tejido o líquido corporal, que comprende el anticuerpo, en el que el tejido o líquido corporal ha sido aislado a partir de un animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo según cualquiera de entre [2] y [11] y [18], en el que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo.
[20]. El procedimiento según [19], en el que la molécula de anticuerpo pertenece a una clase de IgG.
[21]. El procedimiento según [19] o [20], que produce una composición de anticuerpo que presenta una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos más elevada que una composición de anticuerpo obtenida de un animal no humano o planta o la progenie del mismo el genoma del cual no ha sido modificado.
[22]. La célula según cualquiera de entre [1] o [4] a [15] o el animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según cualquiera de entre [2] y [11] o [18], en la que dicha técnica según (D) presenta como diana un gen de un enzima relacionado con la síntesis de la GDP-fucosa o un gen de α1,6fucosiltransferasa con un constructo génico de ARNi, en el que dicho enzima relacionado con la síntesis de GDP-fucosa es un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c) a continuación:
(a)
GMD (GDP-manosa 4,6-deshidratasa),
(b)
Fx (GDP-ceto-6-desoximanosa 3,5-epimerasa, 4-reductasa),
(c)
GFPP (GDP-beta-L-fucosa pirofosforilasa).
En la presente memoria se da a conocer además (1) a (61), a continuación:
(1) una célula CHO obtenida de tejido de ovario de hámster chino en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo, que comprende una composición de anticuerpo que comprende una molécula de anticuerpo que presenta cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido
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nº 48, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de Fx.
(28)
La célula según (24), en la que Fx es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 72,
(b)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 72 y que presenta actividad de Fx,
(c)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 72 y que presenta actividad de Fx.
(29)
La célula según (24), en la que GFPP es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 51,
(b)
un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 51, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GFPP.
(30)
La célula según (24), en la que GFPP es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a),
(b) y (c), a continuación:
(a)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73,
(b)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73 y que presenta actividad de GFPP,
(c)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 73 y presenta actividad de GFPP.
(31)
La célula según (23), en la que el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es una α-1,6fucosiltransferasa.
(32)
La célula según (31), en la que la α-1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c) y (d), a continuación:
(a)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 1,
(b)
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 2,
(c)
un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 1, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de α1,6fucosiltransferasa,
(d)
un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID nº 2, bajo condiciones restrictivas y que codifica una proteína que presenta actividad de α1,6fucosiltransferasa.
(33)
La célula según (31), en la que la α-1,6-fucosiltransferasa es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d), (e) y (f):
(a)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23,
(b)
una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24,
(c)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,
(d)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha
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sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,
(e)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 23 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa,
(f)
una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº 24 y que presenta actividad de α-1,6-fucosiltransferasa.
(34)
La célula según cualquiera de entre (23) y (33), en la que la técnica de ingeniería genética es una técnica seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c) y (d), a continuación:
(a)
una técnica de disrupción génica con diana en un gen codificante del enzima,
(b)
una técnica para introducir un mutante negativo dominante de un gen codificante del enzima,
(c)
una técnica para introducir una mutación en el enzima,
(d)
una técnica para inhibir la transcripción o la traducción de un gen codificante del enzima.
(35)
La célula según cualquiera de entre (23) y (34), que es resistente a por lo menos una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida mediante Nglucósido.
(36)
La célula según cualquiera de entre (23) y (35), que es una célula seleccionada de entre el grupo que consiste en (a) a (i), a continuación:
(a)
una célula CHO derivada de tejido de ovario de hámster chino,
(b)
una estirpe celular de mieloma de rata, célula YB2/3HL.P2.G11.16.Ag.20,
(c)
una estirpe celular de mieloma de ratón, células NS0,
(d)
una estirpe celular de mieloma de ratón, célula SP2/0-Ag14,
(e)
una célula BHK derivada de tejido de riñón de hámster chino,
(f)
una célula de hibridoma productor de anticuerpos,
(g)
una célula Namalwa de estirpe celular de leucemia humana,
(h)
una célula madre embrionaria,
(i)
una célula de huevo fertilizado.
(37)
La célula según cualquiera de entre (23) y (36) en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo.
(38)
La célula según (37), en la que la molécula de anticuerpo pertenece a una clase de IgG.
(39)
Un procedimiento para producir una composición de anticuerpo, que comprende cultivar la célula según
(37) o (38) en un medio para producir y acumular la composición de anticuerpo en el cultivo y recuperar la composición de anticuerpo a partir del cultivo.
(40)
El procedimiento según (39), que produce una composición de anticuerpo que presenta una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos más elevada que una composición de anticuerpo obtenida a partir de su estirpe celular parental.
(41)
Una composición de anticuerpo que se produce utilizando el procedimiento según (39) o (40).
(42)
Un animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo, que comprende un genoma que se encuentra modificado de manera que la actividad del enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa y/o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida mediante Nglucósido se encuentra reducida.
(43)
Un animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo según (42), en el que el gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o un gen codificante del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido se encuentra anulado.
(44)
El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (42) o (43), en el que el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, es un enzima seleccionado de
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anticuerpos humanos y una planta transgénica productora de anticuerpos humanos, que se preparan basándose en los avances recientes en las técnicas de ingeniería genética, de ingeniería celular y de ingeniería del desarrollo.
Con respecto al anticuerpo existente en el cuerpo humano, puede cultivarse un linfocito capaz de producir el anticuerpo mediante el aislamiento de un linfocito de sangre periférica humano, inmortalizándolo mediante su infección por virus EB o similar y después clonándolo, y el anticuerpo puede purificarse a partir del cultivo.
La biblioteca fágica de anticuerpos humanos es una biblioteca en la que se expresan fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, anticuerpos de cadena sencilla y similares, sobre la superficie fágica mediante la inserción de un gen codificante de un anticuerpo preparado a partir de una célula B humana en un gen fágico. Un fago que expresa un fragmento de anticuerpo que presenta la actividad de unión de antígeno deseada puede recuperarse a partir de la biblioteca, utilizando su actividad para unirse a un sustrato inmovilizado con antígeno a modo de marcador. El fragmento de anticuerpo puede convertirse además en una molécula de anticuerpo humano que comprende dos cadenas H completas y dos cadenas L completas mediante técnicas de ingeniería genética.
Un animal transgénico no humano productor de anticuerpos humanos es un animal en el que se ha introducido un gen de anticuerpo humano en las células. Específicamente, un animal transgénico productor de anticuerpos humanos puede prepararse mediante la introducción de un gen de anticuerpo humano en una célula ES de un ratón, trasplantando la célula ES en un embrión de estadio temprano de otro ratón y seguidamente desarrollándolo. Mediante la introducción de un gen humano de anticuerpo híbrido en un huevo fertilizado y desarrollándolo, también puede prepararse el animal transgénico. Con respecto al método de preparación de un anticuerpo humano a partir del animal transgénico productor de anticuerpos humanos, puede producirse el anticuerpo humano y acumularse en un cultivo mediante la obtención de un hibridoma productor de anticuerpos humanos mediante un método de preparación de hibridomas habitualmente llevado a cabo en mamíferos diferentes del ser humano y después cultivándolo.
Entre los ejemplos del animal no humano transgénico se incluyen vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono, conejo y similares.
Además, en la presente invención, resulta preferente que el anticuerpo sea un anticuerpo que reconozca un antígeno de tipo tumoral, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con alergia o inflamación, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una enfermedad de órgano circulatorio, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con enfermedad autoinmunológica o un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con infección vírica o bacteriana, y resulta preferente un anticuerpo humano que pertenece a la clase IgG.
Un fragmento de anticuerpo es un fragmento que comprende la región Fc de un anticuerpo. Entre los ejemplos del fragmento de anticuerpo se incluyen un monómero de cadena H, un dímero de cadenas H y similares.
Una proteína de fusión que comprende una región Fc es una composición en la que un anticuerpo que comprende la región Fc de un anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se fusiona con una proteína, tal como un enzima, una citoquina o similar.
En la presente invención, entre los ejemplos de la cadena de azúcar que se une a la región Fc de una molécula de anticuerpo se incluyen una cadena de azúcar unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos de la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido se incluyen un tipo complejo en el que el lado de extremo no reductor de la estructura nuclear presenta una o una pluralidad de ramas paralelas de galactosa-N-acetilglucosamina (en adelante denominadas "Gal-GlcNAc") y el lado de extremo no reductor de Gal-GlcNAc presenta una estructura, tal como ácido siálico, N-acetilglucosamina bisectante o similar.
En un anticuerpo, la región Fc presenta posiciones a las que se une una cadena de azúcar unida mediante Nglucósido que se describirá a continuación. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se unen dos cadenas de azúcar por cada molécula de anticuerpo. Debido a que la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido que se une a un anticuerpo incluye cualquier cadena de azúcar que presenta la estructura nuclear representada por la fórmula estructural (I), pueden resultar posibles varias combinaciones de cadenas de azúcar para las dos cadenas de azúcar unidas mediante N-glucósido que se unen al anticuerpo. De acuerdo con lo anterior, puede considerarse la identidad de las sustancias desde el punto de vista de la estructura sacárida unida a la región Fc.
En la presente invención, la composición que comprende una molécula de anticuerpo que presenta cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido en la región Fc puede comprender un anticuerpo que presenta la misma estructura de cadena de azúcar o un anticuerpo que presenta diferentes estructuras de cadena de azúcar, con la condición de que se obtenga el efecto de la presente invención a partir de la composición.
En la presente invención, la proporción de una cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la Nacetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar de entre el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido a la región Fc contenida en la composición de anticuerpo es la proporción del número
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lo menos 2 veces, preferentemente en 3 veces, y más preferentemente en 5 veces o más, que la estirpe celular parental con significancia estadística. Además, también puede obtenerse mediante el cultivo de una estirpe celular en un medio que comprende lectina, seguido de la selección de una estirpe celular que puede cultivarse a una determinada tasa de supervivencia, por ejemplo una tasa de supervivencia de 80%, a una concentración de lectina de por lo menos 2 veces, preferentemente de 5 veces, más preferentemente de 10 veces, y todavía más preferentemente de 20 veces o más, que la estirpe celular parental.
Como lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido, puede utilizarse cualquier lectina puede reconocer la estructura de cadena de azúcar. Entre los ejemplos se incluyen una lectina de Lens culinaris LCA (aglutinina de lenteja obtenida de Lens culinaris), una lectina de guisante PSA (lectina de guisante obtenida de Pisum sativum), una lectina de haba VFA (aglutinina obtenida de Vicia faba), una lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina obtenida de Aleuria aurantia) y similares.
La célula CHO de la presente invención puede producir una composición de anticuerpo que presenta una actividad de ADCC más elevada que la de una composición de anticuerpo producida por la célula CHO parental antes de aplicar la técnica para reducir o eliminar la actividad enzimática de interés.
Además, la célula CHO de la presente invención puede producir una composición de anticuerpo que presenta una actividad de ADCC más alta que la de una composición de anticuerpo en la que, del total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc contenidas en la composición de anticuerpo, la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es inferior a 20%.
Un ejemplo de la estirpe celular parental que debe utilizarse en la presente invención es una célula en la que la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido no se encuentra reducida. Específicamente, se utiliza una célula que no ha sido tratada para reducir o anular la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar, en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
En la presente invención, la actividad de ADCC es una actividad citotóxica en la que un anticuerpo unido a un antígeno de superficie celular sobre una célula tumoral en el cuerpo vivo activa una célula efectora mediante un receptor de Fc existente sobre la región de Fc de anticuerpo y la superficie de la célula efectora, obstruyendo de esta manera la célula tumoral y similares [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., capítulo 2.1, 1955]. Entre los ejemplos de la célula efectora se incluyen una célula asesina, una célula asesina natural, un macrófago activado y similares.
La presente exposición se refiere además a una célula en la que la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se reduce mediante una técnica de ingeniería genética. La célula hospedadora de la presente invención resulta útil como célula hospedadora para producir una composición de anticuerpo que presenta una actividad de ADCC elevada.
La célula hospedadora de la presente invención puede ser cualquier huésped, con la condición de que pueda expresar una molécula de anticuerpo según la presente invención. Entre los ejemplos se incluyen una célula de levadura, una célula animal, una célula de insecto, una célula vegetal y similares. Entre los ejemplos de las células se incluyen aquellas que a continuación se proporcionan en el ítem 3. Entre las células animales entre los ejemplos preferentes se incluyen una célula CHO obtenida de un tejido de ovario de hámster chino, una estirpe celular de mieloma de rata YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, una estirpe celular de mieloma de rata NS0, un mieloma de ratón SP2/0-Ag14, una célula BHK derivada de un tejido renal de hámster sirio, una célula de hibridoma productor de anticuerpos, una célula Namalwa de la estirpe celular de leucemia humana, una célula madre embrionaria, una célula de huevo fertilizado y similares.
A continuación se describe en detalle la presente invención.
1. Preparación de la célula hospedadora de la presente invención
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante las técnicas a continuación.
(1) Técnica de disrupción génica con diana en un gen codificante de un enzima
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la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID nº 3.
Además, la célula hospedadora de la presente invención también puede obtenerse sin utilizar un vector de expresión, mediante la introducción directa de un oligonucleótido antisentido o ribozima en una célula hospedadora, que se diseña basándose en la secuencia de nucleótidos codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
El oligonucleótido antisentido o ribozima puede prepararse mediante el método habitual o utilizando un sintetizador de ADN. Específicamente, puede prepararse basándose en la información de secuencia de un oligonucleótido que presenta una secuencia correspondiente continua de 5 a 150 bases, preferentemente de 5 a 60 bases, y más preferentemente de 10 a 40 bases, entre secuencias de nucleótidos de un ADNc y un ADN genómico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante Nglucósido, mediante la síntesis de un oligonucleótido que corresponde a una secuencia complementaria al oligonucleótido (oligonucleótido antisentido) o un ribozima que comprende la secuencia oligonucleótida.
Entre los ejemplos del oligonucleótido se incluyen el oligo de ARN y derivados del oligonucleótido (en adelante denominado "derivados de oligonucleótido").
Entre los ejemplos de los derivados de oligonucleótido se incluyen derivados de oligonucleótido en los que un enlace fosfodiéster en el oligonucleótido se convierte en un enlace fosforotioato, un derivado de oligonucleótido en el que un enlace fosfodiéster en el que el oligonucleótido se convierte en un enlace fosfoamidato N3'-P5', un derivado de oligonucleótido en el que la ribosa y un enlace fosfodiéster en el oligonucleótido se convierten en un enlace péptidoácido nucleico, un derivado de oligonucleótido en el que el uracilo en el oligonucleótido se sustituye con C-5 propiniluracilo, un derivado de oligonucleótido en el que el uracilo en el oligonucleótido se sustituye con tiazol-uracilo C-5, un derivado de oligonucleótido en el que la citosina en el oligonucleótido se sustituye con propinilcitosina C-5, un derivado de oligonucleótido en el que la citosina en el oligonucleótido se sustituye con citosina modificada con fenoxazina, un derivado de oligonucleótido en el que la ribosa en el oligonucleótido se sustituye con 2'-O-propilribosa y un derivado de oligonucleótido en el que la ribosa en el oligonucleótido se sustituye con 2'-metoxietoxiribosa [Cell Technology 16:1463, 1997].
(b) Preparación de la célula hospedadora de la presente invención mediante recombinación homóloga
La célula hospedadora de la presente invención puede producirse mediante la modificación de un gen diana en el cromosoma mediante una técnica de recombinación homóloga, utilizando un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
El gen diana en el cromosoma puede modificarse mediante la utilización de un método descrito en Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 (en adelante denominado "Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual"); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995) (en adelante denominado "Preparation of Mutant Mice using ES Cells"), o similar, por ejemplo de la manera siguiente.
Se preparó un ADN genómico codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Basándose en la secuencia de nucleótidos del ADN genómico, se preparó un vector diana para la recombinación homóloga de un gen diana que debe modificarse (por ejemplo un gen estructural del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace α en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, o un gen promotor.
La célula hospedadora de la presente invención puede producirse mediante la introducción del vector diana preparada en una célula hospedadora y la selección de una célula en la que se produce recombinación homóloga
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