CN104470950B - 抗cxadr抗体 - Google Patents

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Abstract

为了发现对癌的治疗等有效的靶分子、提供与该分子特异性地结合的抗体、以及以该抗体作为有效成分的抗癌剂等，通过SST‑REX来进行***癌细胞株之间(LNCaP‑CR细胞与LNCaP细胞之间)的比较，作为参与肿瘤发生等的分子鉴定了CXADR。然后，制作针对CXADR的单克隆抗体，研究抗癌活性、ADCC活性和CDC活性等，结果发现，与存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位结合的抗体对***癌细胞、胰癌细胞和大肠癌细胞发挥抗癌活性。进而，还弄清楚了该抗体具有ADCC活性和CDC活性。另外，成功地确定了该抗体的轻链和重链的可变区的结构。

Description

抗CXADR抗体
技术领域
本发明涉及抗CXADR抗体，更详细地，涉及与存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位结合的抗体、以及以该抗体作为有效成分的药物组合物和检查药。另外，本发明涉及以CXADR蛋白质存在或不存在作为指标，判定患者中所述抗体对癌治疗的有效性的方法、对通过该方法判定为有效性高的患者施与所述抗体的癌的治疗方法、以及以施与所述患者的所述抗体作为有效成分的癌的治疗剂。
背景技术
癌与冠状动脉疾病同样地是先进国中的主要死因，其比例也趋于逐年增加。另外，在癌中，肺癌、***癌、胰癌、乳癌、结肠癌和卵巢癌是癌死因的代表。从世界范围来看，特别***癌是在男性中蔓延至第4位的癌，在欧美约2成的男性确认了其发病。并且，***癌占日本的癌死亡患者的约3.5％，其比例近年也趋于激增。
另外，针对***癌等，外科切除、放射线疗法、激素疗法和化学疗法作为主要治疗方法被使用，但这些处置对多数人来说效果小，因而现状是针对癌尚未确立有效的治疗方法。
由于这样的现状，近年来作为抗癌剂的抗体的利用受到关注，作为各种病状(癌型)的治疗的途径，其重要性渐渐被认识到。例如，如果是以肿瘤特异性抗原为靶的抗体，则推定施与的抗体聚集于肿瘤，因而可以期待通过补体依赖性细胞毒(CDC)活性和/或抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性而介由免疫***来攻击癌细胞。另外，通过在抗体上预先结合放射性核素、细胞毒性物质等药剂，可以将所结合的药剂效率良好地送达肿瘤部位。由此，可以减少向其他组织的药剂到达量，进而可以预见副作用的减轻。在肿瘤特异性抗原有诱导细胞死亡的活性的情况下，通过施与具有激动活性的抗体，另外在肿瘤特异性抗原参与细胞的增殖和生存的情况下，通过施与具有中和活性的抗体，从而可以通过肿瘤特异性抗体的聚集和抗体的活性来期待肿瘤的增殖停止或退缩。由这样的特性，认为抗体适合作为抗癌剂应用。
作为到目前为止上市的抗体药物，以白血病·淋巴瘤作为对象，开发了以CD20作为靶的利妥昔单抗(rituximab)(商品名：美罗华(Rituxan))、Inotuzumab ozogamicin(商品名：泽娃灵(Zevailn))、以CD33作为靶的吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)(商品名：麦罗塔(Mylotarg))等。另外，作为以上皮性实体癌作为对象的抗体药物，对乳癌开发了Her2/neu作为靶的曲妥珠单抗(Trastuzumab)(商品名：赫赛汀(Herceptin))、以VEGF作为靶的贝伐珠单抗(bevacizumab)(商品名：阿瓦斯汀(Avastin))等。
然而，到2008年为止被认可的抗体药物在美国有20种左右，在日本有10种左右，特别是关于实体癌被认为有效的抗体药物尚少。因此，期望开发更有效的抗体药物，特别是强烈期望鉴定对抗体药物的有效性影响大的靶分子(抗原、表位)。
此外，作为参与柯萨奇病毒等的感染的蛋白质，已知柯萨奇病毒-腺病毒受体(COXSACKIEVIRUS AND ADENOVIRUS RECEPTOR；CXADR)。另外，关于该蛋白质，被报告了在卵巢癌和皮肤基底细胞癌中表达亢进(专利文献1)。另一方面，在胆管癌中确认了CXADR的纯合子缺失，启示了CXADR作为癌抑制基因发挥功能(专利文献2)。
这样，虽然有关于CXADR与癌的关联的报告，但是现状是CXADR是贡献于癌的发病、恶性化等，还是对癌发挥抑制作用尚未确定。因此，关于针对CXADR的抗体是否具有抗癌活性也尚不明。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2009/100159号
专利文献2：日本特开2005-304497号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于上述现有技术中存在的课题而做出的，其目的是，发现对癌的治疗等有效的靶分子，提供与该分子特异性地结合的抗体、以及以该抗体作为有效成分的药物组合物。
用于解决课题的方法
雄激素依赖性的人***癌细胞株LNCaP在免疫缺陷小鼠中的肿瘤发生性低，难以应用于动物实验中的异种移植。另一方面，本发明者们所建立的LNCaP细胞亚株：LNCaP-CR在免疫缺陷小鼠中的肿瘤发生性极高，作为雄激素依赖性的人***癌细胞的异种移植模型是有用的(参照“Kawada，M.等，Cancer Lett.，2006年，242卷，46～52页”，“Kawada，M.等，Cancer Sci.、2007年、98卷、350～356页”)。
因此，本发明者们考虑，能够通过将在LNCaP-CR细胞中表达的膜蛋白质和/或分泌蛋白质、与在作为亲本株的LNCaP细胞中表达的膜蛋白质和/或分泌蛋白质进行比较，来发现参与癌的恶性化的因子，从而实施了作为特异性地分离鉴定膜蛋白质和分泌蛋白质技术的信号序列捕获(SST-REX)法。其结果作为在LNCaP细胞中不表达、在LNCaP-CR细胞中表达的蛋白质，成功地鉴定出CXADR。
接着，本发明者们制作了针对该蛋白质的单克隆抗体，研究了对各种癌细胞株的结合性、体外和体内的抗癌活性、ADCC活性和CDC活性。其结果发现，与存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位结合的抗体在移植了LNCaP-CR细胞的小鼠、特别是在作为相同位置的***移植了LNCaP-CR细胞的小鼠中具有优异的抗癌活性。另外发现，所述抗体不仅对***癌发挥抗癌活性，对胰癌和大肠癌也发挥抗癌活性。进而确认了，该体内的癌抑制效果通过所述抗体与CXADR结合而发挥，即对CXADR蛋白质表达的癌，所述抗体能够发挥癌抑制效果。另外还明确了，所述抗体具有ADCC活性和CDC活性。进而，本发明者们成功地确定了所述抗体的轻链和重链的可变区的结构，最终完成了本发明。
即，本发明涉及与存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位结合的抗体、以及以该抗体作为有效成分的药物组合物等，更详细地，提供以下(1)～(7)。
(1)抗体，与存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位结合。
(2)根据(1)所述的抗体，具有下述(a)～(d)所述的任一特征，
(a)具有：包含序列号1～3所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或***了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含序列号6～8所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或***了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的重链可变区，
(b)具有：包含序列号5所记载的氨基酸序列或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列、或在这些氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或***了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含序列号10所记载的氨基酸序列或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列、或在这些氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或***了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的重链可变区，
(c)具有：包含序列号11～13所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或***了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含序列号16～18所记载的氨基酸序列或在该氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或***了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的重链可变区，
(d)具有：包含序列号15所记载的氨基酸序列或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列、或在这些氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或***了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含序列号20所记载的氨基酸序列或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列、或在这些氨基酸序列的至少任一者中替换、缺失、添加和/或***了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的重链可变区。
(3)药物组合物，以(1)或(2)所述的抗体作为有效成分。
(4)用于检查与CXADR蛋白质相关的疾病的药剂，以(1)或(2)所述的抗体作为有效成分。
(5)癌治疗的有效性的判定方法，
该方法包括检测从患者分离的样品中CXADR蛋白质存在或不存在的工序，如果通过所述工序检测出CXADR蛋白质存在，则判定对于所述患者，通过以(1)或(2)所述的抗体作为有效成分的癌的治疗剂进行癌治疗的有效性高。
(6)癌的治疗剂，以(1)或(2)所述的抗体作为有效成分，用于对通过(5)所述的方法判定为所述有效性高的患者进行施与。
(7)癌的治疗方法，对通过(5)所述的方法判定为所述有效性高的患者施与以(1)或(2)所述的抗体作为有效成分的癌的治疗剂。
发明的效果
通过本发明，提供与源自人的CXADR蛋白质结合、在体内具有优异的抗癌活性等的抗体。通过本发明的抗体，能够实现与CXADR蛋白质相关的疾病的治疗、预防和检查。特别地，本发明的抗体对癌(***癌、胰癌、大肠癌等)是有效的。
附图说明
图1是显示通过流式细胞仪来分析由杂交瘤(克隆名：1G11B9E、7F8A、6G10A、3E8B、6C3A)产生的抗CXADR抗体、与CXADR表达细胞的反应性的分析结果的图。各流式细胞仪数据的全面涂抹直方图部分显示与由各个杂交瘤产生的抗CXADR抗体的反应，白的直方图部分显示与作为阴性对照的小鼠IgG(同种型对照抗体的混合物)的反应(在图2中也同样)。
图2是显示通过流式细胞仪来分析由杂交瘤(克隆名：8B11B、8D6、2A8A、2A8B、8F11)产生的抗CXADR抗体、与CXADR表达细胞的反应性的分析结果的图。此外，以下，杂交瘤的克隆名“6G10A”、“7F8A”等不仅作为各个杂交瘤的名称，还作为由杂交瘤产生的抗体自身的名称使用。
图3是显示抗CXADR未纯化抗体对细胞增殖的影响的分析结果的图。图中，纵轴显示将LNCaP-CR细胞在各抗CXADR未纯化抗体存在下培养3天后，通过MTT法测定的细胞数(570nm的吸光度)。另外，图中的各条所示的值表示2次连续的测定值的平均值，标准误差(SE)为10％以下。
图4是显示抗CXADR未纯化抗体对血管生成素(angiogenin)产生的影响的分析结果的图。图中，纵轴显示将LNCaP-CR细胞在各抗CXADR未纯化抗体存在下培养3天后，通过ELISA法测定的培养上清中的血管生成素产生量(450-540nm的吸光度)。另外，图中的各条所示值表示2次连续的测定值的平均值，标准误差(SE)为10％以下。
图5是显示抗CXADR未纯化抗体(6G10A或7F8A)对LNCaP-CR肿瘤的影响的分析结果的图。将LNCaP-CR细胞接种于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，从第二天开始的11天、每天尾静脉内施与未纯化抗体100μl或作为阴性对照的生理盐水100μl。然后，测定从细胞接种21天后的小鼠分离的肿瘤的重量。图中的各条所示的重量的值是1组5只的平均值±标准偏差(SD)。另外，“＊”表示“P＜0.05”，“＊＊”表示“P＜0.01”。
图6是显示抗CXADR纯化抗体(6G10A或7F8A)对LNCaP-CR肿瘤的影响的分析结果的图。将LNCaP-CR细胞接种于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与纯化抗体250μg或作为阴性对照的生理盐水。然后，测定从规定的时间后的小鼠分离的肿瘤的直径，计算出体积。图中的各折线所示的体积的值是1组5只的平均值±SD。另外，“＊＊”表示“P＜0.01”。
图7是显示抗CXADR纯化抗体(6G10A或7F8A)施与对小鼠的影响的分析结果的图。将LNCaP-CR细胞接种于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与纯化抗体250μg或作为阴性对照的生理盐水。然后，测定规定的时间后的小鼠的体重。图中的各折线所示的体重的值是1组5只的平均值±SD。
图8是显示抗CXADR纯化抗体(6G10A或7F8A)对LNCaP-CR肿瘤的影响的分析结果的图和照片。将LNCaP-CR细胞接种于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与纯化抗体250μg或作为阴性对照的生理盐水。然后，拍摄从细胞接种21天后的小鼠分离的肿瘤，测定这些肿瘤的重量。图的各条所示的值是1组5只的平均值±SD，“＊＊”表示“P＜0.01”。另外，照片中的比例尺表示1cm。
图9是显示抗CXADR纯化抗体6G10A对LNCaP-CR肿瘤的效果的分析结果的图。将LNCaP-CR细胞接种于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与纯化抗体62.5、125、250μg或作为阴性对照的生理盐水(纯化抗体0μg)。然后，测定从规定的时间后的小鼠分离的肿瘤的直径，计算出体积。图中的各折线所示的体积的值是1组5只的平均值±SD。另外，“＊”表示“P＜0.05”。
图10是显示抗CXADR纯化抗体6G10A施与对小鼠的影响的分析结果的图。将LNCaP-CR细胞接种于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与纯化抗体62.5、125、250μg或作为阴性对照的生理盐水(纯化抗体0μg)。然后，测定规定的时间后的小鼠的体重。图中的各折线所示的体重的值是1组5只的平均值±SD。
图11是显示抗CXADR纯化抗体6G10A对LNCaP-CR肿瘤的效果的分析结果的图。将LNCaP-CR细胞移植于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与纯化抗体62.5、125、250μg或作为阴性对照的生理盐水(纯化抗体0μg)。然后，在细胞接种21天后使小鼠牺牲死，切除肿瘤，测定重量。图中的各条所示的值是1组5只的平均值±SD，“＊”表示“P＜0.05”。
图12是显示抗CXADR抗体6G10A对LNCaP-CR肿瘤的效果的分析结果的图。将LNCaP-CR细胞移植于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后3次(早期施与)尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg、或生理盐水。在细胞接种21天后使小鼠牺牲死，切除肿瘤，测定重量。图中的各条所示的值是1组5只的平均值±SD，“＊”表示“P＜0.05”。
图13是显示抗CXADR抗体6G10A对LNCaP-CR肿瘤的效果的分析结果的图。将LNCaP-CR细胞移植于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种14天后，21天后，28天后3次(后期施与)尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。在细胞接种35天后使小鼠牺牲死，切除肿瘤，测定重量。图中的各条所示的值是1组5只的平均值±SD，“＊”表示“P＜0.05”。
图14是显示抗CXADR抗体6G10A对LNCaP-CR相同位置移植肿瘤的效果的分析结果的图和照片。将LNCaP-CR细胞移植于裸小鼠(雄、n＝5)的***，尾静脉内施与6G10A 250μg或生理盐水。然后，拍摄从细胞接种21天后的小鼠分离的肿瘤，测定这些肿瘤的重量。图的各条所示的值是1组5只的平均值±SD，“＊”表示“P＜0.05”。另外，照片中的比例尺表示1cm。
图15是显示对LNCaP-CR相同位置移植肿瘤施与抗CXADR抗体6G10A的代表性施与例(LNCaP-CR移植后第21天)的照片。图中，三角表示“LNCaP-CR肿瘤”。
图16是显示抗CXADR抗体6G10A对DU-145肿瘤的效果的分析结果的图。将DU-145细胞移植于裸小鼠(雄、n＝3)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，测定从规定的时间后的小鼠分离的肿瘤的直径，计算出体积。图中的各折线所示的体积的值是1组3只的平均值±SD。另外，“＊”表示“P＜0.05”。
图17是显示抗CXADR纯化抗体6G10A施与对小鼠的影响的分析结果的图。将DU-145细胞接种于裸小鼠(雄、n＝3)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，测定规定的时间后的小鼠的体重。图中的各折线所示的体重的值是1组3只的平均值±SD。
图18是显示抗CXADR抗体6G10A对DU-145肿瘤的效果的分析结果的图。将DU-145细胞移植于裸小鼠(雄、n＝3)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，在细胞接种21天后使小鼠牺牲死，切除肿瘤，测定重量。图中的各条所示的值是1组3只的平均值±SD。另外，“＊”表示“P＜0.05”。
图19是显示抗CXADR抗体6G10A的BxPC3肿瘤的效果的分析结果的图。将BxPC3细胞移植于裸小鼠(雄、n＝4)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，测定从规定的时间后的小鼠分离的肿瘤的直径，计算出体积。图中的各折线所示的体积的值是1组4只的平均值±SD。另外，“＊”表示“P＜0.05”。
图20是显示抗CXADR纯化抗体6G10A施与对小鼠的影响的分析结果的图。将BxPC3细胞接种于裸小鼠(雄、n＝4)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，测定规定的时间后的小鼠的体重。图中的各折线所示的体重的值是1组4只的平均值±SD。
图21是显示抗CXADR抗体6G10A对BxPC3肿瘤的效果的分析结果的图。将BxPC3细胞移植于裸小鼠(雄、n＝4)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，在细胞接种21天后使小鼠牺牲死，切除肿瘤，测定重量。图中的各条所示的值是1组4只的平均值±SD。另外，“＊”表示“P＜0.05”。
图22是显示抗CXADR抗体6G10A对DLD-1肿瘤的效果的分析结果的图。将DLD-1细胞移植于裸小鼠(雄、n＝3)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，测定从规定的时间后的小鼠分离的肿瘤的直径，计算出体积。图中的各折线所示的体积的值是1组3只的平均值±SD。另外，“＊＊”表示“P＜0.001”。
图23是显示抗CXADR抗体6G10A对DLD-1肿瘤的效果的分析结果的图。将DLD-1细胞移植于裸小鼠(雄、n＝3)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，在细胞接种21天后使小鼠牺牲死，切除肿瘤，测定重量。图中的各条所示的值是1组3只的平均值±SD。另外，“＊＊”表示“P＜0.001”。
图24是显示抗CXADR纯化抗体6G10A施与对小鼠的影响的分析结果的图。将DLD-1细胞接种于裸小鼠(雄、n＝3)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，测定规定的时间后的小鼠的体重。图中的各折线所示的体重的值是1组3只的平均值±SD。
图25是显示通过蛋白质印迹(Western blot)，来确认通过在DU-145细胞中导入shRNA而制作CXADR的表达减少了的细胞的结果的照片。图中，“sh CXADR”表示导入了针对CXADR的sh RNA的DU-145细胞中的CXADR蛋白质的表达的检测结果，“对照载体”表示导入了对照sh RNA的DU-145细胞中的CXADR蛋白质的表达的检测结果。
图26是显示抗CXADR抗体6G10A对DU-145肿瘤的效果的分析结果的图。将导入了针对CXADR的sh RNA或对照sh RNA的DU-145细胞移植于裸小鼠(雄、n＝3)的皮下，在接种1天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。然后，在细胞接种21天后使小鼠牺牲死，切除肿瘤，测定重量。图中的各条所示的值是1组3只的平均值±SD。另外，“＊＊”表示“P＜0.001”。另外“sh CXADR”显示接种了导入了针对CXADR的sh RNA的DU-145细胞的小鼠的结果，“对照载体”显示接种了导入了对照sh RNA的DU-145细胞的小鼠的结果。
图27是显示抗CXADR抗体6G10A对细胞增殖的影响的分析结果的图。图中，纵轴表示将LNCaP-CR细胞在6G10A存在下培养3天后，通过MTT法测定的细胞数(570nm的吸光度)。另外，图中的各条所示的值显示2次连续的测定值的平均值，标准误差(SE)为10％以下。
图28是显示抗CXADR抗体6G10A对血管生成素产生的影响的分析结果的图。图中，纵轴显示将LNCaP-CR细胞在6G10A存在下培养3天后，通过ELISA法测定的培养上清中的血管生成素产生量(450-540nm的吸光度)。另外，图中的各条所示的值显示2次连续的测定值的平均值，标准误差(SE)为10％以下。
图29是显示抗CXADR抗体6G10A对细胞增殖的影响的分析结果的图。图中，纵轴显示将DU-145细胞在6G10A存在下培养3天后，通过MTT法测定的细胞数(570nm的吸光度)。另外，图中的各条所示的值是3次连续的测定值的平均值±SD。
图30是显示抗CXADR抗体6G10A的ADCC活性的分析结果的图。关于ADCC活性，将裸小鼠(雄)的脾细胞(效应器细胞)与用钙黄绿素AM标记的DU-145细胞(靶细胞)在6G10A或同种型对照抗体100μg/ml、或生理盐水存在下培养4小时。然后，测定培养上清中的钙黄绿素AM的荧光强度，计算出对DU-145细胞的细胞毒活性(溶解活性)。图中的各折线所示的细胞毒活性的值是3次连续的测定值的平均值±SD。另外“＊”表示“P＜0.05”，“＊＊”表示“P＜0.01”。
图31是显示抗CXADR抗体6G10A的CDC活性的分析结果的图。关于CDC活性，将用钙黄绿素AM标记的DU-145细胞、与6G10A或同种型对照抗体在10％补体存在下培养4小时。然后，测定培养上清中的钙黄绿素AM的荧光强度，计算出对DU-145细胞的细胞毒活性(溶解活性)。图中的各折线所示的细胞毒活性的值是3次连续的测定值的平均值±SD，“＊＊”表示“P＜0.01”。
图32是显示抗Asialo GM1抗体对抗CXADR抗体6G10A的抗癌活性的影响的分析结果的图。将DU-145细胞移植于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种0天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。抗Asialo GM1抗体(抗GM1)在细胞接种前一天、6天后、13天后尾静脉内施与100μg。然后，测定从规定的时间后的小鼠分离的肿瘤的直径，计算出体积。图中的各折线所示的体积的值是1组5只的平均值±SD。另外，“＊＊”表示“P＜0.01”，“＊＊＊”表示“P＜0.001”。
图33是显示抗CXADR抗体6G10A和抗Asialo GM1施与对小鼠的影响的分析结果的图。将DU-145细胞移植于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种0天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。抗Asialo GM1抗体(抗GM1)在细胞接种前一天、6天后、13天后尾静脉内施与100μg。然后，测定规定的时间后的小鼠的体重。图中的各折线所示的体重的值是1组5只的平均值±SD。
图34是显示抗Asialo GM1抗体对抗CXADR抗体6G10A的抗癌活性的影响的分析结果的图。将DU-145细胞移植于裸小鼠(雄、n＝5)的皮下，在接种0天后、7天后、14天后尾静脉内施与6G10A或同种型对照抗体250μg。抗Asialo GM1抗体(抗GM1)在细胞接种前一天、6天后、13天后尾静脉内施与100μg。然后，在细胞接种21天后使小鼠牺牲死，切除肿瘤，测定重量。图中的各条所示的值是1组5只的平均值±SD。另外，“＊＊”表示“P＜0.01”。
图35是显示由杂交瘤(克隆名：6G10A)产生的抗CXADR抗体的重链可变区的碱基序列和氨基酸序列的图。图中，带下划线的氨基酸序列分别显示预测的信号序列和CDR1～3的氨基酸序列。
图36是显示由杂交瘤(克隆名：6G10A)产生的抗CXADR抗体的轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列的图。图中，带下划线的氨基酸序列分别显示预测的信号序列和CDR1～3的氨基酸序列。
图37是显示由杂交瘤(克隆名：7F8A)产生的抗CXADR抗体的重链可变区的碱基序列和氨基酸序列的图。图中，带下划线的氨基酸序列分别显示预测的信号序列和CDR1～3的氨基酸序列。
图38是显示由杂交瘤(克隆名：7F8A)产生的抗CXADR抗体的轻链可变区的碱基序列和氨基酸序列的图。图中，带下划线的氨基酸序列分别显示预测的信号序列和CDR1～3的氨基酸序列。
图39是显示通过流式细胞仪来分析由杂交瘤(克隆名：1G11B9E、7F8A、6G10A、2A8A，2A8B或8F11)产生的抗CXADR抗体、与CXADR的细胞外区域(从N末端起83个氨基酸、从N末端起133个氨基酸、从N末端起181个氨基酸、从N末端起230个氨基酸或从N末端起237个氨基酸(CXADR的细胞外区域的全长))的反应性的分析结果的图。各流式细胞仪数据的全面涂抹直方图部分显示与由各个杂交瘤产生的抗CXADR抗体的反应，白的直方图部分显示与作为阴性对照的小鼠IgG(同种型对照抗体的混合物)的反应。
图40是显示通过流式细胞仪来分析抗CXADR抗体6G10A或7F8A、与人血管内皮细胞(HUVEC)的反应性的分析结果的图。各流式细胞仪数据的全面涂抹直方图部分显示与抗CXADR抗体的反应，白的直方图部分显示与作为阴性对照的小鼠IgG2a或IgG2b(同种型对照抗体)的反应。
图41是显示通过细胞免疫染色来分析抗CXADR抗体6G10A或7F8A、与HUVEC的反应性的结果的显微镜照片。
图42是显示通过流式细胞仪来分析抗CXADR抗体6G10或7F8A、与各种癌细胞(LNCaP-CR、DU-145或PC-3)的反应性的结果的图。各流式细胞仪数据的全面涂抹直方图部分显示与抗CXADR抗体的反应，白的直方图部分显示与作为阴性对照的小鼠IgG2a或IgG2b(同种型对照抗体)的反应。
图43是显示通过蛋白质印迹(Western blotting)来分析各种癌细胞(LNCaP-CR、LNCaP、DU-145或PC-3)中的CXADR蛋白质的表达的结果的照片。
具体实施方式
如后述的实施例所示，弄清楚了与源自人的CXADR蛋白质的特定部位(181～230位)结合的抗体具有ADCC(抗体依赖性细胞毒)活性等，发挥优异的抗癌活性。因此，本发明提供与存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位结合的抗体。
本发明中的“抗体”包含免疫球蛋白的全部类和亚类。“抗体”是包含多克隆抗体、单克隆抗体、另外还包含抗体的功能性片段的方式的含义。“多克隆抗体”是包含针对不同表位的不同抗体的抗体调制物。另外，“单克隆抗体”是指由实质上均一的抗体的集团得到的抗体(包含抗体片段)。与多克隆抗体相对照地，单克隆抗体是识别抗原上的单一的决定基的。本发明的抗体优选为单克隆抗体。本发明的抗体是从自然环境的成分中分离和/或回收(即，分离)的抗体。
本发明中，“CXADR”是也称为柯萨奇病毒-腺病毒受体(COXSACKIEVIRUS ANDADENOVIRUS RECEPTOR)”、“CAR”、“CVB3结合蛋白质(CVB3BINDING PROTEIN)”或“柯萨奇病毒B受体(COXSACKIEVIRUS B RECEPTOR)”的蛋白质。源自人的CXADR蛋白质，典型地是由RefSeq ID：NP_001329所特定的蛋白质(由RefSeq ID：NM_001338所特定的碱基序列所编码的蛋白质)。因此，“源自人的CXADR蛋白质的181～230位”，典型地是由RefSeq ID：NP_001329所特定的蛋白质的181位(丝氨酸残基)～230位(缬氨酸残基)所记载的氨基酸序列。
另外，“源自人的CXADR蛋白质的181～230位”除了具有这样的典型的氨基酸序列的以外，还存在天然中氨基酸发生了突变的。因此，本发明的“源自人的CXADR蛋白质的181～230位”优选为由RefSeq ID：NP_001329所特定的蛋白质的181位～230位所记载的氨基酸序列，但除此以外，还包含含有在由RefSeq ID：NP_001329所特定的蛋白质的181位～230位所记载的氨基酸序列中替换、缺失、***或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列的。氨基酸序列的替换、缺失、***或添加一般是10个氨基酸以内(例如，5个氨基酸以内、3个氨基酸以内、1个氨基酸)。
本发明中，“表位”是指存在于抗原中的抗原决定基、即抗体中的抗原结合结构域所结合的抗原上的部位。因此，本发明中的表位可以是包含在氨基酸的一级序列中连续的多个氨基酸的多肽(线性表位)，也可以是在氨基酸的一级序列中不邻接的氨基酸通过肽或蛋白质的折叠等三维结构而靠近从而形成的多肽(不连续表位、构象性表位)。另外，作为该表位，典型地包含至少3个氨基酸，以及最普通包含至少5个(例如8～10个、6～20个)氨基酸。
本发明中，“抗癌活性”是指抑制癌细胞的增殖的活性、和/或诱导癌细胞的死亡的活性。抗癌活性，例如，通过使用了后述的实施例所记载的荷癌模型(癌细胞移植小鼠等)的分析来评价。本发明的抗体的优选方式是，通过后述的实施例4或5所记载的、使用在不同位置(皮下)移植了雄激素依赖性人***癌细胞株：LNCaP-CR的小鼠的分析，在癌细胞株移植21天后，摘出肿瘤重量与对照相比减少20％以上(例如，25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上)的抗体。本发明的抗体的其他优选方式是，通过使用在相同位置(***内)移植了LNCaP-CR的小鼠的分析，在癌细胞株移植21天后，摘出肿瘤重量与对照相比减少70％以上(例如，75％以上、80％以上、85％以上、90％以上)的抗体。本发明的抗体的其他优选方式是，通过使用在不同位置(皮下)移植了雄激素非依赖性人***癌细胞株：DU-145的小鼠的分析，在癌细胞株移植21天后，摘出肿瘤重量与对照相比减少20％以上(例如，25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上)的抗体。本发明的抗体的其他优选方式是，通过使用在不同位置(皮下)移植了胰癌细胞株：BxPC-3的小鼠的分析，在癌细胞株移植21天后，摘出肿瘤重量与对照相比减少10％以上(例如，15％以上、20％以上、25％以上)的抗体。本发明的抗体的其他优选方式是，通过使用在不同位置(皮下)移植了大肠癌细胞株：DLD-1的小鼠的分析，在癌细胞株移植21天后，摘出肿瘤重量与对照相比减少10％以上(例如，15％以上、20％以上、25％以上)的抗体。本发明的抗体的其他优选方式是，对癌细胞发挥ADCC活性和/或CDC活性的抗体。
另外，在作为抗癌剂使用时，这些抗体进一步优选具有不使施与对象的体重减少这样的特性。另外，为了与静脉施与等施与方式对应，这些抗体进一步还优选具有不与血管内皮细胞结合这样的特性。本发明的抗体特别优选兼具多种上述活性。
本发明的抗体的其他优选方式是，
具有包含轻链CDR1～CDR3(序列号1～3所记载的氨基酸序列)的轻链可变区、以及包含重链CDR1～CDR3(序列号6～8所记载的氨基酸序列)的重链可变区的抗体，和
具有包含轻链CDR1～CDR3(序列号11～13所记载的氨基酸序列)的轻链可变区、以及包含重链CDR1～CDR3(序列号16～18所记载的氨基酸序列)的重链可变区的抗体。
例如，轻链可变区包含序列号5所记载的氨基酸序列(或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列)、重链可变区包含序列号10所记载的氨基酸序列(或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列)的抗体，和
轻链可变区包含序列号15所记载的氨基酸序列(或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列)，重链可变区包含序列号20所记载的氨基酸序列(或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列)的抗体。
另外，这些之中，从具有更高的抗癌活性、具有不与血管内皮细胞结合这样的特性的观点考虑，具有包含轻链CDR1～CDR3(序列号1～3所记载的氨基酸序列)的轻链可变区、以及包含重链CDR1～CDR3(序列号6～8所记载的氨基酸序列)的重链可变区的抗体作为本发明的抗体更优选，轻链可变区包含序列号5所记载的氨基酸序列(或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列)、重链可变区包含序列号10所记载的氨基酸序列(或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列)的抗体作为本发明的抗体特别优选。
在一旦得到了包含上述轻链可变区和重链可变区的抗体的情况下，只要是本领域技术人员，就能特定该抗体所识别的源自人的CXADR蛋白质的181～230位上的肽区域(表位)，制作与该区域结合、且显示抗癌活性的各种抗体。抗体的表位，可以通过调查与从源自人的CXADR蛋白质的氨基酸序列得到的重叠的合成寡肽的结合等的周知的方法来确定(例如，Ed Harlow and D.Lane，Using Antibodies，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，美国专利4708871号)。还可以将利用噬菌体展示的肽文库用于表位作图。二个抗体是否与同一或立体地重合的表位结合，可以通过竞争分析法来确定。
本发明的抗体包含小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和这些抗体的功能性片段。在将本发明的抗体作为药物施与人的情况下，从降低副作用的观点考虑，优选为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
本发明中“嵌合抗体”是某种抗体的可变区和与其异种的抗体的恒定区连接而成的抗体。嵌合抗体例如，可以将抗原免疫小鼠，从该小鼠单克隆抗体的基因切下与抗原结合的抗体可变部位(可变区)，与源自人骨髓的抗体恒定部位(恒定区)基因结合，将其***表达载体并导入宿主中使其产生，从而获得(例如，日本特开平8-280387号公报、美国专利第4816397号公报、美国专利第4816567号公报、美国专利第5807715号公报)。另外，本发明中“人源化抗体”是将非人来源的抗体的抗原结合部位(CDR)的基因序列移植(CDR移植)到人抗体基因中而得的抗体，其制作方法是公知的(例如，参照EP239400、EP125023、WO90/07861、WO96/02576)。本发明中，“人抗体”是全部区域源自人的抗体。在人抗体的制作中，可以利用以下方法：从人B细胞筛选有活性的抗体的产生的方法、噬菌体展示法、施用通过免疫而能够产生人抗体谱(antibody-repertoire)的转基因动物(例如小鼠)的方法等。人抗体的制作方法是公知的(例如，Nature，362：255-258(1993)、Intern.Rev.Immunol，13：65-93(1995)、J.Mol.Biol，222：581-597(1991)、Nature Genetics，15：146-156(1997)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：722-727(2000)、日本特开平10-146194号公报、日本特开平10-155492号公报、日本特许2938569号公报、日本特开平11-206387号公报、日本特表平8-509612号公报、日本特表平11-505107号公报)。
本发明中，抗体的“功能性片段”是抗体的一部分(部分片段)，是指特异性地识别存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位的抗体片段。具体可列举Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键Fv、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、双特异性抗体、多特异性抗体、和它们的聚合体等。
这里，“Fab”是指包含1个轻链和重链的一部分的免疫球蛋白的一价的抗原结合片段。可以通过抗体的木瓜蛋白酶消化来得到，另外可以通过重组方法来得到。“Fab’”包含抗体的铰链区的1个或多于1个半胱氨酸，由于重链CH1结构域的羧基末端的几个残基的添加而与Fab不同。“F(ab’)2”是指包含两条轻链和两条重链的部分的免疫球蛋白的二价的抗原结合片段。
“可变区片段(Fv)”是具有完全的抗原识别和结合部位的最小的抗体片段。Fv是重链可变区和轻链可变区通过非共价键强地连接而成的二聚体。“单链Fv(scFv)”包含抗体的重链可变区和轻链可变区，这些区域存在于单一的多肽链。“sc(Fv)2”是将2个重链可变区和2个轻链可变区用接头(linker)等结合而制成单链而得的片段。“双特异性抗体”是具有二个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段在同一多肽链的中包含与轻链可变区结合的重链可变区，各区域与其他链的互补区配对。“多特异性抗体”是对至少2种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。例如，可以通过同时表达二条重链具有不同特异性的二组免疫球蛋白重链/轻链对来调制。
本发明中，提供包含含有本发明中鉴定的CDR的抗体的轻链或重链、或它们的可变区的肽。优选的肽是，
包含含有序列号1～3所记载的氨基酸序列的本发明的抗体的轻链或包含其可变区的肽、
包含含有序列号11～13所记载的氨基酸序列的本发明的抗体的轻链或其可变区的肽、
包含序列号5所记载的氨基酸序列或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列的肽、和
包含序列号15所记载的氨基酸序列或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列的肽。
其他优选肽是包含含有序列号6～8所记载的氨基酸序列的本发明的抗体的重链或其可变区的肽、
包含含有序列号16～18所记载的氨基酸序列的本发明的抗体的重链或其可变区的肽、
包含序列号10所记载的氨基酸序列或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列的肽、和
包含序列号20所记载的氨基酸序列或从该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列的肽。
另外，可以将这些肽通过例如接头(linker)等连接，从而制作功能性抗体。
本发明的抗体包含在不减少所期望的活性(对抗原的结合活性、抗癌活性、和/或其他生物学特性)的条件下其氨基酸序列被修饰的抗体。本发明的抗体的氨基酸序列突变体可以通过对编码本发明的抗体链的DNA导入突变、或通过肽合成来制作。这样的修饰包含例如，本发明的抗体的氨基酸序列内的残基的替换、缺失、添加和/或***。抗体的氨基酸序列改变的部位只要与改变前的抗体具有同等的活性，则可以是抗体的重链或轻链的恒定区，还可以是可变区(框架区和CDR)。认为除了CDR以外的氨基酸的改变对于抗原的结合亲和性的影响相对少，但现在改变CDR的氨基酸而筛选对抗原的亲和性提高了的抗体的方法是公知的(PNAS，102：8466-8471(2005)、Protein Engineering，Design&Selection，21：485-493(2008)、国际公开第2002/051870号、J.Biol.Chem.，280：24880-24887(2005)、Protein Engineering，Design&Selection，21：345-351(2008))。另外，现在，还可以通过利用综合计算化学***等(例如，Molecular Operating Enviroment、カナダCCG社制)来模拟对抗原的亲和性提高了的抗体(例如，http：//www.rsi.co.jp/kagaku/cs/ccg/products/application/protein.html参照)。
改变的氨基酸数优选为10个氨基酸以内，更优选为5个氨基酸以内，最优选为3个氨基酸以内(例如，2个氨基酸以内、1个氨基酸)。氨基酸的改变优选为保守的替换。本发明中，“保守的替换”是指用具有化学上同样的侧链的其他氨基酸残基替换。具有化学上同样的氨基酸侧链的氨基酸残基的组是在本发明所属的技术领域公知的。例如，可以用酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸·精氨酸·组氨酸)、在中性氨基酸中具有烃链的氨基酸(甘氨酸·丙氨酸·缬氨酸·亮氨酸·异亮氨酸·脯氨酸)、具有羟基的氨基酸(丝氨酸·苏氨酸)、含硫氨基酸(半胱氨酸·蛋氨酸)、具有酰胺基的氨基酸(天冬酰胺·谷氨酰胺)、具有亚氨基的氨基酸(脯氨酸)、具有芳香族基的氨基酸(苯丙氨酸·酪氨酸·色氨酸)来分类。另外，“具有同等的活性”是指对抗原的结合活性或抗癌活性与对象抗体(代表地为抗CXADR抗体6G10A、抗CXADR抗体7F8A)同等(例如，70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上)。对抗原的结合活性，例如可以通过制作表达抗原的Ba/F3细胞，用流式细胞仪分析与抗体样品的反应性来评价(实施例2)。另外，抗癌活性如上所述，例如，可以通过使用荷癌模型的分析来评价(实施例4等)。
另外，本发明的抗体的改变也可以是例如，改变糖基化部位的数或位置等的抗体的翻译后加工的改变。由此，例如，可以提高抗体的ADCC活性。抗体的糖基化典型地是N-连接或O-连接。抗体的糖基化较大地依赖于用于表达抗体的宿主细胞。糖基化图谱的改变可以通过与糖生产相关的特定的酶的导入或缺失等公知的方法来进行(日本特开2008-113663号公报、美国专利第5047335号、美国专利第5510261号、美国专利第5278299号、国际公开第99/54342号)。进而，在本发明中，还可以为了增加抗体的稳定性等而通过将被脱酰胺化的氨基酸或与被脱酰胺化的氨基酸邻接的氨基酸替换成其他氨基酸来抑制脱酰胺化。另外，还可以将谷氨酸替换成其他氨基酸，来增加抗体的稳定性。本发明还提供这样被稳定化的抗体。
本发明的抗体如果是多克隆抗体，则可以用抗原(包含源自人的CXADR蛋白质的181～230位的氨基酸序列的多肽、其部分肽、或表达这些肽的细胞等)对免疫动物进行免疫，从其抗血清通过现有的方法(例如，盐析、离心分离、透析、柱色谱等)进行纯化而获得。另外，单克隆抗体可以通过杂交瘤法和/或重组DNA法来制作。
作为杂交瘤法，代表性地可列举Kohler和Milstein的方法(Kohler&Milstein，Nature，256：495(1975)。该方法中的细胞融合工序中使用的产生抗体的细胞是用抗原(包含源自人的CXADR蛋白质的181～230位的氨基酸序列的多肽、其部分肽、或表达这些肽的细胞等)免疫后的动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴、山羊)的脾细胞、淋巴细胞、末梢血白细胞等。也可以使用使抗原在培养基中与从未免疫的动物预先分离的上述细胞或淋巴细胞等作用而得的产生抗体的细胞。作为骨髓瘤细胞可以使用公知的各种细胞株。产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞只要是它们能融合，则也可以是不同动物种起源的，但优选为同一动物种起源的。杂交瘤例如由用抗原免疫后的小鼠得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞之间的细胞融合而产生，然后通过筛选，可以获得产生对源自人的CXADR蛋白质为特异性的单克隆抗体的杂交瘤。针对源自人的CXADR蛋白质的单克隆抗体可以通过培养杂交瘤来获得，另外，可以从施与了杂交瘤的哺乳动物的腹水获得。
重组DNA法，是从杂交瘤和/或B细胞等中克隆编码上述本发明的抗体或肽的DNA，***适当的载体中，将其导入宿主细胞(例如哺乳类细胞株、大肠菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等)，使本发明的抗体作为重组抗体而产生的方法(例如，P.J.Delves，AntibodyProduction：Essential Techniques，1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean MonoclonalAntibodies，2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS、Vandamme A.M.et al.，Eur.J.Biochem.192：767-775(1990))。在编码本发明的抗体的DNA的表达中，可以将编码重链或轻链的DNA分别***表达载体中转化宿主细胞，也可以将编码重链和轻链的DNA***单一的表达载体中转化宿主细胞(参照国际公开第94/11523号公报)。本发明的抗体可以培养上述宿主细胞，从宿主细胞内或培养液分离·纯化，以实质上纯粹且均一的方式获得。抗体的分离·纯化可以使用通常的多肽纯化中使用的方法。如果使用转基因动物制作技术制作***了抗体基因的转基因动物(牛、山羊、绵羊、猪等)，则可以从该转基因动物的乳中大量获得来源于抗体基因的单克隆抗体。
本发明还提供编码上述本发明的抗体或肽的DNA、包含该DNA的载体、保持该DNA的宿主细胞、和包括培养该宿主细胞而回收抗体的工序的抗体的生产方法。
本发明的抗体如后述的实施例所示，通过阻碍CXADR蛋白质的功能来发挥抗癌活性等，因而可以在与CXADR蛋白质相关的疾病的治疗或预防中利用。因此，本发明还提供以本发明的抗体作为有效成分的药物组合物(例如，以本发明的抗体作为有效成分的癌的治疗剂)，以及包括将本发明的抗体的治疗上或预防上的有效量施与包括人的哺乳类的工序的、与CXADR蛋白质相关的疾病(例如，癌)的治疗或预防方法。本发明的治疗或预防方法除了人以外，还可以在包括例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等的各种哺乳动物中应用。
与作为本发明的抗体的靶的CXADR蛋白质相关的疾病只要是CXADR蛋白质参与其发病、症状的进行、恶化等的疾病即可，可列举例如，癌、感染症(柯萨奇病毒感染症、腺病毒感染症等)，期望是癌。
另外，作为成为本发明的抗体的靶的癌，只要是本发明的抗体能发挥抗癌活性就不特别限制，如后述的实施例所示，因为本发明的抗体强烈地抑制***癌细胞、胰癌细胞、大肠癌细胞的增殖，所以特别优选为***癌、胰癌、大肠癌。
以本发明的抗体作为有效成分的药物组合物可以以含有本发明的抗体和任意的成分、例如生理盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液等的组合物的方式使用。本发明的药物组合物根据需要可以以液体或冻结干燥的方式制剂化，还可以任意含有药学上容许的担载体或介质、例如稳定剂、防腐剂、等渗剂等。
作为药学上容许的担载体，在冻结干燥的制剂的情况下，可列举甘露醇、乳糖、蔗糖、人白蛋白等作为例子，在液状制剂的情况下，可列举生理盐水、注射用水、磷酸盐缓冲液、氢氧化铝等作为例子，但不限于这些。
药物组合物的施与方法根据施与对象的年龄、体重、性别、健康状态等不同而不同，可以通过非经口施与(例如，静脉施与、动脉施与、局部施与)、经口施与的任一施与途径施与。优选的施与方法是非经口施与。药物组合物的施与量可以根据患者的年龄、体重、性别、健康状态、症状的进行的程度和施与的药物组合物的成分而变动，一般在静脉内施与的情况下，成人每1kg体重1天0.1～1000mg、优选为1～100mg。
本发明的抗体不仅可以应用于与CXADR蛋白质相关的疾病的治疗和/或预防，还可以应用于该疾病的检查。特别是由于本发明的抗体的表位所存在的源自人的CXADR蛋白质的181～230位是CXADR蛋白质的细胞外区域，因而能够在细胞免疫染色和/或流式细胞仪等中简便且效率良好地检测表达CXADR蛋白质的细胞。特别是关于癌，如基因表达图谱数据库(BioGPS、http://biogps.org/#goto＝welcome)所示，CXADR基因的表达量在非癌细胞(非癌组织)全部较低，在各种癌细胞株中较高。进而，在LNCaP-CR细胞与LNCaP细胞的比较中，CXADR蛋白质可能参与癌的恶性化，因而还考虑本发明的抗体在以CXADR蛋白质的表达为指标的癌的恶性度的检查中利用。因此，本发明提供以上述本发明的抗体作为有效成分的、用于检查与CXADR蛋白质相关的疾病(例如，癌)的药剂。
在将本发明的抗体用于与CXADR蛋白质相关的疾病的检查的情况或用于该疾病的治疗中的疾病部位(例如，癌的治疗中的肿瘤部位)的检测的情况下，本发明的抗体可以是标记后的抗体。作为标记，可以使用例如，放射性物质、荧光色素、化学发光物质、酶、辅酶，具体可列举放射性同位素、萤光素、罗丹明、丹磺酰氯、萤光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、生物素/亲和素等。为了将本发明的抗体作为检查药而进行调剂，可以采用适合目的的任意方法以任意剂型获得。例如，对于纯化的抗体，可以测定其抗体价，适当用PBS(磷酸盐缓冲液，Phosphate buffer saline，包含生理盐的磷酸缓冲液)等稀释后，加入0.1％叠氮化钠等作为防腐剂。另外，例如，对于使本发明的抗体吸附于胶乳等而得的物质，可以求出抗体价，适当地稀释，添加防腐剂。
另外，在本发明中，判明了与存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位结合的抗体具有抗癌活性，因而还能够将包含源自人的CXADR蛋白质的181～230位的氨基酸序列的多肽或其部分肽作为癌疫苗，施与包括人的哺乳动物(例如，参照日本特开2007-277251号公报、日本特开2006-052216号公报)。本发明还提供用于这样的癌疫苗用途的、含有包含源自人的CXADR蛋白质的181～230位的氨基酸序列的多肽或其部分肽的癌疫苗组合物。在制剂化的情况下，与上述本发明的抗癌剂同样地，可以含有药学上容许的担载体或介质例如稳定剂、防腐剂、等渗剂等。
另外，如后述的实施例9和14所示，弄清楚了，本发明的抗CXADR抗体的抗癌活性通过该抗体与CXADR结合来实现，即对CXADR蛋白质表达的癌细胞，本发明的抗体能够发挥抗癌活性。进而如前所示，CXADR基因的表达量在非癌细胞(非癌组织)中全部较低，在各种癌细胞株中较高。
因此，本发明提供癌治疗的有效性的判定方法，
该方法包括检测从患者分离的样品中的CXADR蛋白质存在或不存在的工序，如果通过所述工序检测出CXADR蛋白质存在，则判定对于所述患者，通过以本发明的抗体作为有效成分的癌的治疗剂进行癌治疗的有效性高。
另外，本发明提供以本发明的抗体作为有效成分的癌的治疗剂，用于对通过所述方法判定癌治疗的有效性高的患者进行施与。
进而，本发明是对通过所述方法判定癌治疗的有效性高的患者施与以本发明的抗体作为有效成分的癌的治疗剂的癌的治疗方法。
本发明中“患者”不仅是罹患癌的人，还可以是怀疑罹患癌的人。另外，从这样的患者分离的“样品”不仅包含活体样品(例如，细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞·支气管洗出液、尿、粪便)，还包含由这些活体样品得到的蛋白质提取物和/或核酸提取物(从mRNA提取物、由mRNA提取物调制的cDNA调制物和/或cRNA调制物等)。另外，所述样品可以是进行了***固定处理、醇固定处理、冻结处理或石蜡包埋处理的样品。另外，蛋白质、mRNA、cDNA等只要是本领域技术人员，就能够考虑所述样品的种类和状态等，选择与其适合的公知的方法来调制。
在本发明中的“CXADR蛋白质存在或不存在的检测”中，可以直接检测CXADR蛋白质，另外也可以介由编码该蛋白质的mRNA、cDNA等的检测来间接地检测。
这样的检测可以使用公知的方法。作为该公知的方法，在以“CXADR蛋白质”自身为对象的情况下，可列举例如，使用针对CXADR蛋白质的抗体的免疫学方法(蛋白质印迹(Western blot)法、ELISA法、流式细胞仪、免疫组织化学的染色法、成像细胞仪、放射免疫分析、免疫沉淀法、使用抗体阵列的分析法等)。在以“编码CXADR蛋白质的mRNA、cDNA等”为对象的情况下，可列举例如，RT-PCR法、RNA印迹(Northern blot)法、斑点印迹(dot blot)法、使用了cDNA微阵列的分析法。
在通过本发明的方法在从患者分离的样品中检测到CXADR蛋白质存在的情况下，判定对于该患者通过以本发明的抗体作为有效成分的癌的治疗剂进行癌治疗的有效性高，另一方面，在检测不到该蛋白质存在的情况下，判定对于该患者该治疗剂的癌治疗的有效性低。
另外，关于本发明的“癌的治疗剂”以及“癌的治疗方法”，对判定为本发明的癌的治疗剂的所述有效性高的患者的施与如前所述，根据施与对象的年龄、体重、性别、健康状态等不同而不同，可以采用非经口施与(例如，静脉施与、动脉施与、局部施与)、经口施与的任一种施与方式来进行。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下的实施例。另外，本实施例使用下述细胞和抗体等，按照下述方法进行。
＜细胞和抗体等＞
人***癌细胞LNCaP、人***癌细胞DU-145、人***癌细胞PC-3、人胰癌细胞BxPC-3、人大肠癌细胞DLD-1从ATCC购入。LNCaP-CR细胞由本发明者们建立。细胞用在DMEM中添加了10％FBS(GIBCO社制)、青霉素G 100单位/ml和链霉素100μg/ml的培养基在37℃、5％CO2下培养。
兔抗Asialo GM1抗体从和光纯药株式会社购入，小鼠IgG2a同种型对照抗体从Sigma社或Cell Lab社购入，小鼠IgG2b同种型对照抗体从Cell Lab社购入，钙黄绿素(calcein)AM从Molecular Probes社购入，Low-Tox(注册商标)-M兔补体从Cedarlane社购入。
＜SST-REX＞
将***癌株化细胞LNCaP细胞和LNCaP-CR细胞各2×107个悬浮于Trizol(invitrogen社制、#15596-026)1ml中，放置5分钟后，添加氯仿200μl悬浮15秒。然后以12000g离心15分钟，获得上清。将上清与500μl的异丙醇混合后，以12000g离心10分钟。所得的颗粒用80％乙醇洗涤，得到总RNA 200μg。将其全部用100μl的水溶解，使用FastTrack2.0mRNA分离试剂盒(FastTrack2.0mRNA Isolation kit、invitrogen社制、#K1593-02)按照说明书进行操作，得到mRNA 3μg。利用所得的mRNA全部，使用SuperScript选择***(SuperScript Choice System、invitorgen社制、#18090-019)按照说明书进行操作，从而制作cDNA。使用LigationHigh(TOYOBO社制、#LGK-201)经过16小时使所得的cDNA与BstXI接头(Adapter)(invitorgen社制、#N408-18)9μg连接。然后，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，切下500～4000bp部位的部分，使用Wizard(注册商标)SV Gel和PCR Clean-Up***(Wizard(R)SV Gel and PCR Clean-Up System、promega社制、#A9282)按照说明书进行操作，从而纯化。对于pMX-SST载体，使用BstXI酶(Takara社制、#1027A)处理，用1％琼脂糖凝胶进行电泳，切下载体的部位，使用Wizard(注册商标)SV Gel和PCRClean-Up***按照说明书进行操作，从而纯化。使用T4DNA连接酶经过3小时使进行了切下纯化的带BstX I接头生物cDNA的一半量与进行了切下纯化的BstXI处理的pMX-SST载体50ng连接。进行乙醇沉淀而纯化，溶于10μl而将其中的2μl与感受态细胞(invitrogen社制、#18920-015)23μl混合，在1.8kV的条件进行电穿孔，立即悬浮于1ml的SOC中。将该操作进行2次后，在37℃振荡培养90分钟。然后，在LB500ml中添加氨苄青霉素振荡培养16小时。收集菌体，使用10NucleoBond(注册商标)AX500柱(10NucleoBond AX 500columns、日本ジェネティクス社制、#740574)纯化质粒，构建cDNA文库。
为了产生病毒，将包装细胞Plat-E 2×106个在4ml的DMEM(Wako社制、#044-29765)中悬浮，注入在6cm盘，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。将100μl的opti-MEM(GIBCO社制、#31985070)与9μl的Fugene(roche社制、#1814443)混合，室温放置5分钟后，添加3μg的cDNA文库，室温放置15分钟后，滴加到准备好的Plat-E中。然后，在24小时后更换上清。进而将24小时后的上清通过0.45μm的过滤器进行过滤。在RPMI-1640(コージンバイオ社制)9.5ml中加入将4×106个Ba/F3细胞，准备在10cm盘中，加入获得的过滤上清0.5ml。添加10μg的凝聚胺(polybrene)(CHEMICON社制、#TR-1003-G)，进一步添加IL-310ng。24小时后，将细胞用RPMI-1640洗涤3次，悬浮于200ml中，在20枚96孔板中均等分量地接种。从10天后到20天后将增殖出的细胞培养至细胞充满孔，将一半分量放大培养，贮存。另外，从剩余一半提取基因组。使用LA Taq DNA聚合酶(Takara社制、#RR002)或PrimeStarMax DNA聚合酶(TaKaRa社制、#R045A)按照说明书进行PCR。PCR引物使用SST3’-T75’-TAATACGACTCACTATAGGGCGCGCAGCTGTAAACG GTAG-3’(序列号21)和SST5’-T3 5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGTGGACCATCCTCTA-3’(序列号22)。将PCR产物使用Wizard(注册商标)SV Gel和PCRClean-Up***等按照说明书进行操作，从而纯化。施用BigDyeTerminator v3.1Cycle sequencing(ABI社制、#4337456)按照说明书操作，从而进行测序。测序的引物使用SST5’-T35’-ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGTGGACCATCCTCTA-3’(序列号22)。测序数据使用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/和http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/进行分析。
＜抗CXADR抗体的制作＞
免疫动物使用小鼠Balb/c。在免疫开始日的前一天，施与将TiterMaxGold(AlexisBiochemicals社制、ALX-510-002-L010)与等量的PBS混和并乳化而得的物质50μl。然后，在小鼠的腹腔中每隔2天注射具有CXADR基因的SST克隆细胞各5×106～1×107个细胞，注射4次，从而进行免疫。将免疫后取出的次级淋巴组织拆解，得到包含产生抗体的细胞的细胞集团。将这些细胞与融合伴侣细胞混合，通过使用了聚乙二醇(MERCK社制、1.09727.0100)的细胞融合来制作杂交瘤。融合伴侣细胞使用小鼠骨髓瘤P3U1(P3-X63-Ag8.U1)细胞。
将杂交瘤在HAT(SIGMA社制、H0262)、含有T-24细胞的培养上清30ml的15％FBS、包含终浓度100单位/ml的青霉素/链霉素(GIBCO BRL社制、15140-122)的DMEM(SIGMA社制、D6046)选择培养基中培养10～14天。接着，通过流式细胞仪选择与CXADR表达细胞反应、与不表达CXADR的阴性对照细胞不反应的杂交瘤。流式细胞仪对各细胞5×104～1×105细胞/样品用50μl的培养上清进行染色，二抗使用PE标记抗小鼠抗体(ベックマンコールター社制、IM-0855)来实施。
对于产生对CXADR表达细胞特异性地显示反应的培养上清的杂交瘤，通过有限稀释而单克隆化，通过流式细胞仪确认反应，获得抗CXADR抗体。
将单克隆化后的产生抗CXADR抗体的克隆在包含终浓度100单位/ml的青霉素/链霉素(GIBCO BRL社制、15140-122)的无血清培养基(杂交瘤-SFM：GIBCO社制、12045-076)中驯化，并进行放大培养，获得用于纯化的培养上清。将所得的培养上清中的IgG使用蛋白A-Sepharose(GEヘルスケア社制、17-1279-03)柱、MAPS-II结合缓冲液(BIO-RAD社制、153-6161)、MAPS-II溶出缓冲液(BIO-RAD社制、153-6162)进行纯化。将溶出的IgG用PBS进行透析，获得纯化抗体级分。抗体的同种型使用IsoStrip试剂盒(Roche社制、1493027)来确定。
＜体外(in vitro)细胞增殖＞
使细胞在包含10％FBS的DMEM中以5×104个/ml分散，在96孔板中以各0.1ml/孔接种，加入规定的浓度的抗体，在37℃、5％CO2下培养3天。细胞增殖通过MTT法(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；Sigma社制)测定(参照Fukazawa，H.等，Anal.Biochem.、1995年、228卷、83～90页)。将MTT溶液(5mg/ml PBS)10μl加入各孔中培养4小时，对于产生的甲产物，将包含10mM HCl的20％SDS溶液100μl添加于各孔中溶解，测定570nm的吸光度。
＜CXADR敲低细胞的制作＞
将以人CXADR基因作为靶的shRNA的表达质粒或对照shRNA的表达质粒(都是作为选择用标志物基因具有嘌呤霉素耐性基因的SureSilencing shRNA Plasmids、QIAGEN社制)使用基因导入试剂(Promega社制、FuGeneHD)导入人***癌DU-145细胞中。然后，用包含最终浓度0.75μg/ml的嘌呤霉素的10％FBS/DMEM培养3周，得到多个嘌呤霉素耐性克隆。对于所得的克隆制作细胞粗提取液，进行利用抗CXADR抗体(Sigma社制)的蛋白质印迹(Western blot)，研究CXADR蛋白量。对于确认了CXADR蛋白量降低的克隆使用RNeasy pluskit(QIAGEN社制)提取总RNA，使用Reverse Transcription System(Promega社制)进行逆转录反应。以合成的cDNA作为模板使用SYBR Premix Ex Taq II(タカラバイオ社制)进行实时PCR，将能确认CXADR mRNA量降低的克隆作为CXADR持续性敲低细胞株。
＜血管生成素(Angiogenin)产生＞
用10％FBS DMEM使细胞分散至5×104个/ml，在96孔板中以各0.1ml/孔接种，加入规定的浓度的抗体，在37℃、5％CO2下培养3天，回收培养上清。使用R&D Systems社制的ELISA试剂盒测定培养上清中的血管生成素量。
＜体内(in vivo)抗癌活性＞
BALB/c nu/nu(雄、7周龄)裸小鼠从チャールズリバー购入，在SPF条件下按照微生物化学研究所的指南饲育。将培养的细胞进行胰蛋白酶处理，将从培养盘剥下的细胞(8×106个)分散在含0.3ml的10％FBS的DMEM中，与0.5ml的成长因子减少基质胶(growthfactor-reduced Matrigel、BDバイオサイエンス社制)混合。将该细胞液0.1ml(1×106个)在小鼠的左鼠胫部进行皮下接种。从第二天开始以规定的期间在静脉内施与抗体，切下在皮下长出的肿瘤，测定其重量。另外肿瘤体积由以下式计算出。
肿瘤体积(mm3)＝(长径×短径2)/2
(参照Kawada，M.等，Cancer Res.、2006年、66卷、4419～4425页)。
在小鼠的***中进行相同位置移植的情况下，将从培养盘剥下的细胞(20×106个)分散在含0.15ml的10％FBS的DMEM中，与0.25ml的成长因子减少基质胶)混合。将BALB/cnu/nu(雄、7周龄)裸小鼠小鼠在戊巴比妥钠麻醉下切开腹部，将细胞液20μl用30G注射针接种于小鼠的***，将腹部切开部缝合。规定的期间后，切下在***长出的癌，测定重量。
＜CDC(补体依赖性细胞毒)活性＞
将成为靶的癌细胞用RPMI1640分散至2×105个/ml，加入钙黄绿素AM 10μg/ml在37℃标记30分钟。将标记的细胞用含10％FBS的RPMI1640培养基离心洗涤3次后，再次分散在含10％FBS的RPMI1640培养基中，在37℃放置1小时。再次用含10％FBS的RPMI1640培养基将细胞离心洗涤3次后，用含10％FBS的RPMI1640培养基再分散至5×105个/ml，将所得的细胞液以各0.1ml接种于96孔板。在其中加入规定的浓度的抗体，在37℃培养1小时后，在各孔中加入规定的浓度的用含10％FBS的RPMI1640培养基稀释后的0.1ml的补体溶液，在37℃进一步培养4小时。将96孔板离心后，回收培养上清0.1ml，在485nm的激发波长、528nm的荧光波长下测定培养上清中所含的钙黄绿素AM的荧光强度。CDC细胞活性(细胞毒活性)通过以下的式计算出。
细胞毒活性(％)＝(E-S)/(M-S)×100
(E是各实验条件下的荧光强度；S是加入0.1ml的含10％FBS的RPMI1640培养基代替补体溶液而自发获得的荧光强度；M加入0.1ml的细胞溶解液(0.5％TritonX-100、10mMTris-HCl(pH7.4)、10mM EDTA)代替补体溶液时的最大荧光强度)。
＜ADCC(抗体依赖性细胞毒)活性＞
从裸小鼠摘出脾脏，用注射器使脾细胞分散，通过用冰冷水处理10秒而使红血球溶血。将残余的脾细胞用RPMI1640培养基离心洗涤后，用含10％FBS的RPMI1640调整为2.5×107个/ml。将成为靶的癌细胞用RPMI1640分散至5×105个/ml，加入钙黄绿素AM 10μg/ml在37℃标记30分钟。将标记后的细胞用含10％FBS的RPMI1640培养基离心洗涤3次后，再次分散在含10％FBS的RPMI1640培养基中，在37℃放置1小时。再次用含10％FBS的RPMI1640培养基将细胞离心洗涤3次后，将用含10％FBS的RPMI1640培养基再分散至5×105个/ml的细胞液以各0.1ml接种于96孔板。这里以成为规定的比率的方式将0.1ml的脾细胞液加入各孔中，在37℃培养4小时。将96孔板离心后，回收培养上清0.1ml，以485nm的激发波长、528nm的荧光波长测定培养上清中所含的钙黄绿素AM的荧光强度。NK细胞活性(细胞毒活性)通过以下式计算出。
细胞毒活性(％)＝(E-S)/(M-S)×100(E是各实验条件下的荧光强度；S是加入0.1ml的含10％FBS的RPMI1640培养基代替脾细胞液而自发获得的荧光强度；M是加入0.1ml的细胞溶解液(0.5％TritonX-100、10mM Tris-HCl(pH7.4)、10mM EDTA)代替脾细胞液时的最大荧光强度)
(参照Kawada，M.等，Int.Immunopharmacol.、2003年、3卷、179～188页)。
在除去小鼠的NK细胞时，在尾静脉以规定的期间施与100μg的抗Asialo GM1抗体(参照相同文献)。
＜统计分析＞
全部数据是得到同样的结果的2或3次的独立实验的代表数据。统计分析使用学生t检验。
＜抗体可变区的确定＞
将产生抗体的细胞2×106个悬浮于Trizol 1ml中放置5分钟后，添加氯仿200μl悬浮15秒。然后以12000×g离心15分钟，获得上清。将上清与500μl的异丙醇混合后，以12000×g离心10分钟。将所得的颗粒用80％乙醇洗涤，得到总RNA 40μg。将其全部用20μl的水溶解。使用其中5μg制作双链cDNA。制作方法使用SuperScript选择***按照说明书进行。乙醇沉淀后，使用LigationHigh经过16小时使其连接。以其中1μl作为模板进行PCR。引物使用在重链和轻链的恒定区设计的各自的引物。引物的序列分别使用
重链5’gtccacgaggtgctgcacaat(序列号23)
重链3’gtcactggctcagggaaataacc(序列号24)
轻链5’aagatggatacagttggtgc(序列号25)
轻链3’tgtcaagagcttcaacagga(序列号26)。
将PCR产物用1.5％凝结进行电泳后，进行切下纯化。使用纯化的DNA进行测序。轻链在将纯化的DNA克隆后，进行测序。
＜表位的分析＞
为了特定ACT196-514_6G10A抗体的表位，制作表达数种链长的CXADR肽的Ba/F3细胞，评价抗体的反应性。以细胞外区域83aa(从N末端，以下同样)、133aa、181aa、237aa(细胞外全长)作为分析对象的肽。使用LNCaP-CR的实施了信号序列捕捉法的cDNA文库作为模板，使用下述序列的DNA作为引物，使用PrimeStarMax DNA聚合酶(TaKaRa社制、#R045A)按照说明书来实施。此外，下述引物中，正向引物(以下以“F”这样的简称来称呼)在各基因的扩增中共通地利用。另外，反向引物的标号中，添加于R的数值表示由扩增产物编码的肽的链长。
F：ccggaattcccacggcacggcagccaccatgg(序列号27)
R237：ttttccttttgcggccgctccagctttatttgaaggagggac(序列号28)
R230：ttttccttttgcggccgcggacaacgtttagacgcaacag(序列号29)
R181：ttttccttttgcggccgctgagtcagacaatttttgccactc(序列号30)
R134：ttttccttttgcggccgcaatcttcttatttgcaacaccagg(序列号31)
R83：ttttccttttgcggccgcgtagtcatcataaattttgtctcc(序列号32)。
将PCR产物用1％凝胶进行电泳。进行切下纯化，用EcoRI和NotI进行限制性酶处理。pMX-SST也用EcoRII和NotI进行限制性酶处理，并切下纯化。将它们用LigationHigh按照说明书进行处理。将处理物通过总量热激法对大肠菌进行转化。在含氨苄青霉素的LB琼脂糖平板上进行涂板，在37℃培养1夜。由所得的菌落以含有***物部分的方式进行PCR，通过测序来确认是否是包含所希望的序列的pMX-SST载体。使用的PCR引物使用SST3’-T75’-TAATACGACTCACTATAGGGCGCGCAGCTGTAAACGGTAG-3’(序列号21)和SST5’-T3 5’-ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGTGGACCATCCTCTA-3’(序列号22)。
对确认了目的的***物的***的菌落进行培养，使用10NucleoBond(注册商标)AX500柱纯化质粒。为了产生病毒，将包装细胞Plat-E 2×106个悬浮于4ml的DMEM(Wako社制、#044-29765)中，注入6cm盘，在37℃5％CO2的条件下培养24小时。将100μl的opti-MEM与9μl的Fugene混合，室温放置5分钟后，添加3μg的具有目的序列的pMX-SST载体，室温放置15分钟后，滴加于准备好的Plat-E上。然后，24小时后更换上清。进一步使24小时后的上清通过0.45μm的过滤器进行过滤。在RPMI-1640(コージンバイオ社制)9.5ml中加入4×106个Ba/F3细胞，准备在10cm盘中，加入获得的过滤上清0.5ml。添加10μg的凝聚胺(polybrene)(CHEMICON社制、#TR-1003-G)，再添加IL-310ng。24小时后，将细胞用RPMI-1640洗涤3次，悬浮于10ml的RPMI-1640中并添加于10cm盘中，在37℃5％CO2的条件下培养10天。从增殖而得的细胞提取基因组。使用LA Taq DNA聚合酶或PrimeStarMaxDNA聚合酶按照说明书进行PCR。PCR引物使用SST3’-T75’-TAATACGACTCACTATAGGGCGCGCAGCTGTAAACGGTAG-3’(序列号21)和SST5’-T35’-ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGTGGACCATCCTCTA-3’(序列号22)。
将PCR产物使用Wizard(注册商标)SV Gel和PCRClean-Up***)等按照说明书进行操作，从而纯化。使用BigDye Terminatorv3.1Cycle sequencing按照说明书操作，从而进行测序。测序的引物使用SST5’-T35’-ATTAACCCTCACTAAAGGGAGGGGGTGGACCATCCTCTA-3’(序列号22)。测序数据使用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/进行分析。然后，将这样获得的目的因子的区域表达的细胞供于表位的分析。
＜人血管内皮细胞(HUVEC细胞)的染色试验＞
为了验证抗体对人血管内皮细胞的反应性，确认对HUVEC的反应性。将HUVEC(5×103/孔)接种于黑色96-孔板(BD Falcon社制、353219)中，培养2夜。培养液使用EGM-2BulletKit培养基(Lonza社制)。培养后，除去培养基，使用染色缓冲液(0.5％BSA/PBS)洗涤1次后，作为一抗添加6G10A和7F8A纯化抗体10μg/mL溶液50μL，在室温反应使其30分钟。作为阴性对照，使小鼠IgG2a-UNLB(克隆：HOPC-1、Cell Lab社制、731589)、小鼠IgG2b-UNLB(克隆：A-1、Cell Lab社制、731597)以10μg/mL的浓度溶解于染色缓冲液中，添加50μl，在室温使其反应30分钟。反应后，除去一次反应溶液，用染色缓冲液洗涤1次。洗涤后，添加将山羊抗小鼠IgG，F(ab’)2-PE(BeckmanCoulter社制、IM0855)用染色缓冲液稀释200倍后的溶液40μL，在室温遮光条件使其反应20分钟。进而添加将10mg/mL的Hoechst 33342(Invitrogen社制、H1399)稀释2000倍而得的溶液30μl，在室温遮光条件进一步使其反应20分钟。然后用染色缓冲液洗涤2次，添加100mL的洗涤缓冲液后，使用荧光显微镜(オリンパス社制)观察细胞染色。
＜人血管内皮细胞(HUVEC细胞)和癌细胞的流式细胞仪试验＞
为了验证抗体对人血管内皮细胞的反应性，使用流式细胞仪法确认对HUVEC的反应性。使用EGM-2 BulletKit培养基培养HUVEC。癌细胞使用包含灭活的10％FCS(Equitech社制)和1％青霉素/链霉素溶液(GIBCO社制、Penicillin-streptomycin liquid、15140122)的培养基(RPMI1640：和光纯药社制或DMEM：SIGMA社制)进行培养。在变为80％汇合的时刻使用细胞解离缓冲液(Cell Dissociation Buffer、GIBCO社制、13151-014)从培养平板剥下而回收，用FCM缓冲液(0.5％BSA/1mM EDTA/PBS)洗涤1次。将各细胞以5×104/孔分注在96-孔板(BD Falcon社制、353911)中，作为一抗添加6G10A和7F8A纯化抗体5μg/mL溶液50μl/孔，在室温使其反应30分钟。作为阴性对照，使小鼠IgG2a-UNLB(克隆：HOPC-1、Cell Lab社制、731589)、小鼠IgG2b-UNLB(克隆：A-1、Cell Lab社制、731597)以5μg/mL的浓度溶解于FCM缓冲液中，添加50μl，在室温使其反应30分钟。反应后以700xg离心2分钟而除去一次反应溶液，用FCM缓冲液洗涤1次。洗涤后，添加将山羊抗小鼠IgG，F(ab’)2-PE(BeckmanCoulter社制、IM0855)用FCM缓冲液稀释200倍而得的溶液40μl，在室温遮光条件下使其反应30分钟。反应后以700xg离心2分钟，用FCM缓冲液洗涤2次，用适当量的FCM缓冲液悬浮细胞，用流式细胞仪(BeckmanCoulter社制、FC500MPL)进行分析。
(实施例1)
[SST-REX分析]
对LNCaP-CR细胞通过SST-REX分析207个克隆的结果，获得了67个因子。另外，对LNCaP细胞通过SST-REX分析150个克隆的结果，获得了50个因子。由LNCaP-CR的结果和LNCaP细胞的结果，作为抗癌活性的靶，筛选出了10种仅在LNCaP-CR中特异性地确认了表达的因子。从中选择了CXADR基因。
(实施例2)
[抗CXADR抗体的制作]
以表达CXADR蛋白质的Ba/F3细胞作为免疫原免疫小鼠，用流式细胞仪筛选的结果，如图1和2所示，得到了与表达CXADR蛋白质的细胞特异性地显示反应的10个克隆。使用所得的10个克隆，通过功能试验筛选等来筛选候选抗体，最终获得了6G10A和7F8A的2个有用的克隆。另外，类校验的结果显示两者均为IgG类，关于亚类，6G10A为IgG2a/k、7F8A为IgG2b/k。
(实施例3)
[未纯化抗CXADR抗体的体外癌抑制效果等]
对于针对CXADR制作的未纯化抗体9个克隆，调查了体外对LNCaP-CR细胞的增殖和血管新生个因子：血管生成素的产生的影响。所得的结果示于图3和4。
如由图3和4所示的结果而明确的那样，任一抗体克隆均不影响体外LNCaP-CR细胞的增殖和血管生成素的产生。
(实施例4)
[未纯化抗CXADR抗体的体内癌抑制效果]
在裸小鼠的皮下移植LNCaP-CR细胞，将抗体克隆连续11天进行静脉内施与，调查对LNCaP-CR肿瘤的增殖的影响。所得的结果示于图5。
如由图5所示的结果而明确的那样，可知在肿瘤接种后第21天，6G10A克隆抑制约60％的肿瘤重量，7F8A克隆抑制约30％的肿瘤重量。另外，虽未图示，但其他抗体克隆并未发现显著的抗癌活性。
(实施例5)
[纯化抗CXADR抗体的体内癌抑制效果1]
在裸小鼠的皮下移植LNCaP-CR细胞，将纯化的抗体以250μg/小鼠每周1次、共计施与3次，调查该抗体的抗癌活性。所得的结果示于图6～8。
如图6～8所示，明确了对于第21天的LNCaP-CR的肿瘤的重量，6G10A克隆有意义地抑制了约60％，7F8A克隆有意义地抑制了约45％。另外，该期间，并未发现抗体克隆的施与造成体重减少等对小鼠的毒性(参照图7)。进而，如由图9～11所示的结果而明确的那样，6G10A克隆依赖于施与量地显示抗癌活性，250μg的施与量最有意义地抑制肿瘤的增殖。
另外，对于效果强的6G10A克隆，调查是否对变大的肿瘤也发挥抗癌活性。所得的结果示于图12和13。
如图12和13所示，弄清楚了即使从肿瘤接种后经过14天后开始施与6G10A克隆，也抑制肿瘤的增殖。
(实施例6)
[纯化抗CXADR抗体的体内癌抑制效果2]
接着，在将LNCaP-CR细胞移植到小鼠的***而得的相同位置移植模型中研究抗癌活性。所得的结果示于图14和15。
如图14和15所示，通过以250μg/小鼠每周1次、共计3次的静脉施与，以约90％有意义地抑制小鼠***的LNCaP-CR***癌的增殖。
(实施例7)
[纯化抗CXADR抗体的体内癌抑制效果3]
接着，调查对雄激素非依赖性的人***癌DU-145细胞和人胰癌细胞BxPC3的抗癌活性。所得的结果示于图16～21。
如图16～21所示，对于移植到小鼠的皮下的DU-145细胞和BxPC3细胞的肿瘤增殖，6G10A克隆通过250μg/小鼠、每周1次、共计3次的静脉内施与，分别有意义地抑制约60％和约25％。
(实施例8)
[纯化抗CXADR抗体的体内癌抑制效果4]
在裸小鼠的皮下移植人大肠癌细胞DLD-1，将纯化后的抗体以250μg/小鼠、每周1次、共计3次进行静脉内施与，调查该抗体的抗癌活性。所得的结果示于图22～24。
如图22所示，对于移植到小鼠的皮下的DLD-1细胞的肿瘤增殖，6G10A克隆通过250μg/小鼠、每周1次、共计3次的静脉内施与而有意义地抑制。进而，如图23所示，对于第21天的DLD-1的肿瘤的重量，6G10A克隆能够有意义地抑制约70％。另外，该期间，未发现抗体克隆的施与造成体重减少等对小鼠的毒性(参照图24)。
(实施例9)
[抗CXADR抗体的抗癌作用机理的分析1]
导入表达以人CXADR基因作为靶的shRNA的载体，制作DU-145细胞的CXADR表达减少了的细胞(CXADR shRNA导入细胞)。另外，还制作导入了对照载体的DU-145细胞(参照图25)。然后，将这些细胞移植到各个裸小鼠中，将纯化抗CXADR抗体(6G10A克隆)以250μg/小鼠、每周1次、共计3次进行静脉内施与，调查该抗体的抗癌活性。所得的结果示于图26。
如由图26的结果而明确的那样，导入了对照载体的细胞的肿瘤被6G10A有意义地阻碍而约70％减少，但对CXADR表达减少了的细胞，6G10A不显示显著的抗癌活性。
因此确认了，在实施例7等中弄清楚的、本发明的抗CXADR抗体的体内癌抑制效果，通过该抗体与CXADR而实现，即对CXADR蛋白质表达的癌，本发明的抗体能够发挥癌抑制效果。
(实施例10)
[抗CXADR抗体的抗癌作用机理的分析2]
调查在小鼠异种移植模型中发现了抗癌活性的纯化抗体克隆对体外LNCaP-CR细胞的增殖和血管生成素的产生的影响，但完全未发现变化(参照图27和28)。
抗体的体内抗癌活性一般通过靶分子的中和和/或功能阻碍、ADCC活性或CDC活性来发挥。由于对体外的细胞增殖和/或蛋白质的产生等不显示效果，因而对于ADCC活性和CDC活性进行了验证。此外，虽未图示，但LNCaP-CR细胞不适合ADCC活性和CDC活性的分析，因而使用了雄激素非依赖性的人***癌细胞：DU-145细胞。所得的结果示于图30和31。
与LNCaP-CR细胞同样地，6G10A完全不影响体外的DU-145细胞的增殖(参照图29)。但是，如图30和31所示，弄清楚了6G10A对DU-145细胞显示ADCC活性和CDC活性。
因此，为了确认是否CDC活性和ADCC活性也实际上参与体内的抗癌活性，使用施与了抗Asialo GM1抗体、除去了ADCC活性的实行中心NK细胞的小鼠进行验证。所得的结果示于图32～34。
如图32～34所示，弄清楚了通过抗Asialo GM1抗体的施与，6G10A的抗癌活性有意义地减弱。由于通过NK细胞的除去抗癌活性并未完全丧失，所以考虑6G10A在ADCC活性和CDC活性的双方的作用下发挥抗癌活性。
(实施例11)
[抗体可变区的确定]
对于通过实施例1～8确认了具有抗癌活性等功能的6G10A和7F8A抗体，确定重链和轻链的序列，从而确定可变区和CDR。所得的结果关于6G10A的序列示于图35和36，关于7F8A的序列示于图37和38。
另外，抗CXADR抗体6G10A的确定的轻链的可变区的碱基序列示于序列号4，氨基酸序列示于序列号5，重链的可变区的碱基序列示于序列号9，氨基酸序列示于序列号10。进而，抗CXADR抗体6G10A的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列示于序列号1～3，重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列示于序列号6～8。
另外，抗CXADR抗体7F8A的确定的轻链的可变区的碱基序列示于序列号14，氨基酸序列示于序列号15，重链的可变区的碱基序列示于序列号19，氨基酸序列示于序列号20。进而，抗CXADR抗体7F8A的轻链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列示于序列号11～13，重链的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列示于序列号16～18。
(实施例12)
[表位的分析]
构建表达CXADR蛋白质的细胞外区域的从N末端侧开始83个氨基酸、133个氨基酸、181个氨基酸、230个氨基酸、237个氨基酸(细胞外区域全长)的各个片段的细胞，通过验证哪个区域缺失的细胞中与抗体(6G10A、7F8A)的反应消失，来确定表位。所得的结果示于图39。
如图39所示，明确了6G10A和7F8A都识别从181个氨基酸到230个氨基酸的区域作为表位。另外，对于稳定地具有活性、在体内试验中不具有功能的另外4种克隆的抗体(1G11B9E、2A8A、2A8B和8F11)也同样地分析了表位。其结果明确了，克隆1G11B9E识别从134个氨基酸到180个氨基酸的区域作为表位。克隆2A8A、2A8B和8F11识别从231个氨基酸到237个氨基酸的区域作为表位。因此，由这些结果明确了，以由6G10A、7F8A所识别的从181个氨基酸到230个氨基酸作为表位，是具有抗癌作用的重要部位。
(实施例13)
[对HUVEC的反应性]
假定通过静脉注射的抗体药物品施与，通过流式细胞仪法以及细胞染色法来调查对人血管内皮细胞的反应性。作为人血管内皮细胞使用HUVEC。所得的结果示于图40和41。
如图40和41所示，明确了6G10A对HUVEC不显示反应，7F8A对HUVEC显示反应。如果从对HUVEC的反应性来考虑，则认为6G10A作为抗体药物种更加有用。
(实施例14)
[本发明的抗CXADR抗体对癌细胞的反应性]
通过流式细胞仪法来调查本发明的抗CXADR抗体对***癌细胞的反应性。所得的结果示于图42。此外，***癌细胞中的CXADR的表达通过使用了抗CXADR抗体(Sigma社制、HPA003342)的蛋白质印迹(Western blotting)法来分析。所得的结果示于图43。
如图42和43所示，明确了在***癌中，对体内发现了抗癌活性的LNCaP-CR细胞和Du145细胞，本发明的抗CXADR抗体发生反应。另一方面，还明确了体内未发现抗癌活性的PC-3中CXADR不表达，以及PC-3与本发明的抗CXADR抗体不反应。
产业可利用性
如以上所说明的那样，本发明的抗体通过与存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位结合，能够在体内发挥优异的抗癌活性等。因此，本发明的抗体在与CXADR蛋白质相关的疾病的治疗、预防和检查等、特别癌的治疗、预防和检查等中是有用的。
序列表自由文本
序列号1
＜223＞6G10A轻链可变区CDR1
序列号2
＜223＞6G10A轻链可变区CDR2
序列号3
＜223＞6G10A轻链可变区CDR3
序列号4
＜223＞6G10A轻链可变区cDNA
序列号6
＜223＞6G10A重链可变区CDR1
序列号7
＜223＞6G10A重链可变区CDR2
序列号8
＜223＞6G10A重链可变区CDR3
序列号9
＜223＞6G10A重链可变区cDNA
序列号11
＜223＞7F8A轻链可变区CDR1
序列号12
＜223＞7F8A轻链可变区CDR2
序列号13
＜223＞7F8A轻链可变区CDR3
序列号14
＜223＞7F8A轻链可变区cDNA
序列号16
＜223＞7F8A重链可变区CDR1
序列号17
＜223＞7F8A重链可变区CDR2
序列号18
＜223＞7F8A重链可变区CDR3
序列号19
＜223＞7F8A重链可变区cDNA
序列号21～32
＜223＞人工合成的引物的序列

Claims (4)

1.抗体，与存在于源自人的CXADR蛋白质的181～230位的表位结合，且具有下述(a)～(b)所述的任一特征，
(a)具有：包含序列号1～3所记载的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含序列号6～8所记载的氨基酸序列的重链可变区，
(b)具有：包含序列号5所记载的氨基酸序列的轻链可变区，以及包含序列号10所记载的氨基酸序列的重链可变区。
2.药物组合物，以权利要求1所述的抗体作为有效成分。
3.用于检查与CXADR蛋白质相关的疾病的药剂，以权利要求1所述的抗体作为有效成分。
4.癌的治疗剂，以权利要求1所述的抗体作为有效成分，用于对患者进行施与，所述患者是通过检测从该患者分离的样品中CXADR蛋白质存在或不存在，当检测出CXADR蛋白质存在，则判定为以权利要求1所述的抗体作为有效成分的癌的治疗剂进行癌治疗的有效性高的患者。
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