ES2733434T3

ES2733434T3 - Anticuerpos anti-ROBO4

Info

Publication number: ES2733434T3
Application number: ES13730645T
Authority: ES
Inventors: Yoshitaka Isumi; Toshiyuki Sato; Jun Hasegawa; Tatsuya Inoue
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2033-04-26
Also published as: US20160108120A1; KR20150008074A; MX2014012351A; US20150098945A1; CO7111295A2; KR101950898B1; AU2013254313A1; ZA201406235B; NZ629291A; SG11201405718QA; CA2868074A1; PH12014502382B1; US9562096B2; TWI606065B; RU2014147616A; IN2014DN07799A; AU2013254313B2; EP2841457B1; JP2016175893A; WO2013160879A1

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que tiene las propiedades descritas en los siguientes apartados (I) a (III): (I) unión con la proteína ROBO4 con un valor KD de 1 x 10-8 M o inferior según lo determinado por resonancia de plasmón superficial; (II) supresión o inhibición de la migración de células endoteliales vasculares en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento in vitro; y (III) supresión o inhibición de la angiogénesis in vivo, en donde el anticuerpo consta de una cadena pesada que comprende una CDRH1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44 (figura 25), una CDRH2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46 (figura 26) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46 por la sustitución de un aminoácido, y una CDRH3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 48 (figura 27), y una cadena ligera que comprende una CDRL1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 50 (figura 28) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50 por la sustitución de uno a tres aminoácidos, una CDRL2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 52 (figura 29) y una CDRL3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 54 (figura 30).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-ROBO4

[Campo técnico]

La presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene una actividad antiangiogénica. De manera más específica, la presente invención se refiere a un anticuerpo contra ROBO4 y a una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo.

[Antecedentes de la técnica]

El homólogo 4 circular (Roundabout) (ROBO4), una proteína con un peso molecular de 110 kDa, tiene una estructura transmembrana de un solo paso (bibliografía no de patente 1] y se sabe que suprime la angiogénesis a través de la unión con un supresor de la angiogénesis conocido, el homólogo 2 de hendidura (Slit) (Slit2) (bibliografía de patente 1 y bibliografía no de patente 2). Se ha informado que Slit2 suprime la migración de HUVEC (siglas del inglés Human Umbilical Vein Endothelial Cells, células endoteliales de vena de cordón umbilical humano) promovida por un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, siglas del inglés vascular endothelial growth factor) y también se ha informado que suprime la promoción de la migración celular por VEGF o bFGF de células endoteliales vasculares transfectadas con el gen ROBO4 (de aquí en adelante, a las células endoteliales vasculares también se las denominará "CE") en comparación con las CE transfectadas con un vector vacío (bibliografía de patente 1 y bibliografía no de patente 2 a 4).

Por otra parte, se ha informado que en CE derivadas de un ratón de tipo silvestre o en CE transfectadas con ARNip de control, se observa el efecto supresor de Slit2 sobre la promoción de la migración celular, la promoción de la formación de lumen, o el aumento de la permeabilidad por VEGF, pero no se observa en CE derivadas de un ratón con el gen ROBO4 inactivado (knockout) o en CE transfectadas con ARNip para atenuar (knock-down) el gen ROBO4 (bibliografía de patente 2 y bibliografía no de patente 4 a 6). Asimismo, se ha informado que Slit2 suprime, a través de ROBO4, la angiogénesis o aumenta la permeabilidad vascular en modelos de ratón con neovascularización coroidea inducida por láser o retinopatía inducida por oxígeno, que son modelos de enfermedad animal con degeneración macular exudativa relacionada con la edad o retinopatía diabética (bibliografía de patente 2 y bibliografía no de patente 4).

A pesar de estos hallazgos, también hay informes que muestran que ROBO4 no se une a Slit2 (bibliografía no de patente 9 y bibliografía de patente 5). En cuanto a sus funciones, también se ha informado que ROBO4 participa en la promoción de la angiogénesis en lugar de en la supresión de la angiogénesis, debido a que se inhibe la migración o la formación de lumen de CE con el gen ROBO4 inactivado, (bibliografía no de patente 10 y 11).

En la práctica clínica, se ha informado que ROBO4 se expresa a un nivel muy alto en vasos intratumorales en metástasis hepáticas de cáncer de colon, ganglioglioma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, melanoma metastásico, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, cáncer de hígado o cáncer de colon (bibliografía de patente 3 y bibliografía no de patente 1, 3 y 7). Por otra parte, se ha informado que ROBO4 también se expresa en vasos sanguíneos de las membranas fibrovasculares de pacientes con retinopatía diabética proliferativa (bibliografía no de patente 8). Como tal, ROBO4 se expresa en células endoteliales vasculares, particularmente, células endoteliales en vasos sanguíneos recién formados en un proceso patológico. Esto puede sugerir una angiogénesis patológica resultante de la alta expresión de ROBO4, pero también puede sugerir la expresión compensatoria de ROBO4 para suprimir la angiogénesis patológica.

Como se ha descrito anteriormente, ROBO4 está implicado en un efecto antiangiogénico. Por tanto, un anticuerpo contra ROBO4 y un fragmento funcional del mismo, son supuestamente útiles en el tratamiento de una enfermedad que implique angiogénesis. Sin embargo, no se sabe si un anticuerpo agonista o antagonista contra ROBO4 suprime o promueve la angiogénesis.

Los anticuerpos descritos en la patente EP N.° 1565491 (bibliografía de patente 4) y en el documento WO2008/100805 (bibliografía de patente 5), se conocen como anticuerpos contra ROBO4 (de aquí en adelante, denominados "anticuerpos anti-ROBO4"). Pero ninguno de estos anticuerpos muestra un efecto supresor o inhibidor sobre la angiogénesis in vivo.

[Lista de citas]

[Bibliografía de patente]

[Bibliografía de patente 1] documento WO2004/003163

[Bibliografía de patente 2] documento WO2008/073441

[Bibliografía de patente 3] documento WO2002/036771

[Bibliografía de patente 4] patente europea N.° 1565491

[Bibliografía de patente 5] documento WO2008/100805

[Bibliografía no de patente]

[Bibliografía no de patente 1] Genomics, 2002, vol. 79, págs. 547-552

[Bibliografía no de patente 2] Developmental Biology, 2003, vol. 261, págs. 251-267

[Bibliografía no de patente 3] Biochemical and Biophysical Research Communications, 2005, vol. 332, págs. 533 541

[Bibliografía no de patente 4] Nature Medicine, 2008, N.° 14, págs. 448-453

[Bibliografía no de patente 5] Science Translational Medicine, 2010, vol. 2, p. 23ra19

[Bibliografía no de patente 6] Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, vol. 107, págs. 10520-10525 [Bibliografía no de patente 7] Oncology Reports, 2006, vol. 15, págs. 1437-1443

[Bibliografía no de patente 8] Molecular Vision, 2009, vol. 15, págs. 1057-1069

[Bibliografía no de patente 9] The FASEB Journal, 2005, vol. 19, págs. 121-123

[Bibliografía no de patente 10] BMC Cell Biology, 2008, vol. 9, págs. 61-72

[Bibliografía no de patente 11] The FASEB Journal, 2009, vol. 23, págs. 513-522

[Sumario de la invención]

[Problemas a resolver por la invención]

Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo contra ROBO4.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-ROBO4 que tiene un efecto antiangiogénico, etc.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para producir el anticuerpo.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para suprimir la angiogénesis utilizando el anticuerpo, etc.

[Medios de resolución de los problemas]

Los presentes inventores han realizado estudios activos para lograr los objetos y, en consecuencia, han construido con éxito un sistema de reconocimiento que detecta la activación de la señal de ROBO4 en sentido descendente. Por otra parte, los presentes inventores han utilizado el sistema de reconocimiento para obtener con éxito un nuevo anticuerpo monoclonal anti-ROBO4 que activa la señal de ROBO4 en sentido descendente, que tiene una actividad supresora contra la migración celular inducida por diversos factores angiogénicos, tales como VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB y SDF-1 en CE que expresan ROBO4, y que presenta un efecto antiangiogénico incluso en modelos in vivo. De esta manera, se ha completado la presente invención.

La invención es como se define en las reivindicaciones.

Una realización de la invención es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que tiene las propiedades descritas en los siguientes apartados (I) a (III): (I) unión con la proteína ROB04 con un valor K^dde 1 x 10'8 M o inferior según lo determinado por resonancia de plasmón superficial; (II) supresión o inhibición de la migración de células endoteliales vasculares en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento in vitro; y (III) supresión o inhibición de la angiogénesis in vivo, en donde el anticuerpo consta de una cadena pesada que comprende una CDRH1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44 (Figura 25), una CDRH2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46 (Figura 26) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46 por la sustitución de un aminoácido, y una CDRH3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la s Eq ID NO: 48 (Figura 27), y una cadena ligera que comprende una CDRL1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 50 (Figura 28) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50 por la sustitución de uno a tres aminoácidos, una CDRL2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 52 (Figura 29) y una CDRL3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 54 (Figura 30).

Una realización adicional de la invención es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consta de los siguientes apartados (I) a (III): (I) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo según la invención, (II) una secuencia de nucleótidos que consta de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo según la invención, y (III) una secuencia de nucleótidos que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo según la invención.

Una realización adicional de la invención es un vector recombinante que contiene un inserto de una secuencia de nucleótidos según la invención.

Una realización adicional de la invención es una célula recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos según la invención o un vector recombinante según la invención introducido en la misma.

Una realización adicional de la invención es una célula que produce un anticuerpo según la invención.

Una realización adicional de la invención es un método para producir un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según la invención, que comprende las siguientes etapas (I) y (II): (I) cultivar una célula según la invención; y (II) recuperar del cultivo obtenido en la etapa (I), el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según la invención.

Una realización adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende, como principio activo, un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según la invención.

Una realización adicional de la invención es una composición farmacéutica según la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad angiogénica seleccionada del grupo que consta de degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia y obesidad.

Una realización adicional de la invención es un inhibidor de angiogénesis que, como principio activo, comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según la invención.

Además se divulga:

(1) un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, que tiene las propiedades descritas en los siguientes apartados (I) a (III):

(I) unión con la proteína ROBO4, preferentemente con un valor K^dde 1 x 10-8 o inferior, prefiriéndose específicamente un valor de 5 x 10-9 o inferior;

(II) supresión o inhibición de la migración de células endoteliales vasculares en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento in vitro; y

(III) supresión o inhibición de la angiogénesis in vivo; 2345678

(2) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según el apartado (1), en donde la proteína ROBO4 es la proteína ROBO4 humana;

(3) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según el apartado (1), en donde la proteína ROBO4 es una proteína que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 1 a 1007 de la SEQ ID NO: 2; (4) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según el apartado (1), en donde la proteína ROBO4 es una proteína que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 46 a 1007 de la SEQ ID NO: 2; (5) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según los apartados (3) o (4), en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se une a un sitio que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 132 a 209 de la SEQ ID NO: 2;

(6) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según el apartado (1), en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo;

(7) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (6), en donde el anticuerpo consta de una cadena pesada que comprende una CDRH1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44 (Figura 25), una CDRH2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46 (Figura 26) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46 por la sustitución de un aminoácido, y una CDRH3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 48 (Figura 27), y una cadena ligera que comprende una CDRL1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 50 (Figura 28) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50 por la sustitución de uno a tres aminoácidos, una CDRL2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 52 (Figura 29) y una CDRL3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la s Eq ID NO: 54 (Figura 30); (8) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (7), en donde el anticuerpo consta de una cadena pesada que comprende una CDRH1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44 (Figura 25), una CDRH2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46 (Figura 26) o la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68 (Figura 44) y una CDRH3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 48 (Figura 27), y una cadena ligera que comprende una CDRL1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 50 (Figura 28) o la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70 (Figura 46), una CDRL2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 52 (Figura 29) y una CDRL3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la s Eq ID NO: 54 (Figura 30); (9) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (7), en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31 (Figura 16), y una región variable de cadena ligera que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33 (Figura 18);

(10) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (8), en donde el anticuerpo comprende una cualquiera de la región variable de cadena pesada seleccionada de los siguientes apartados a) a d) y una región variable de cadena ligera seleccionada de los apartados e) y f):

a) una región variable de cadena pesada (de tipo hMAb1-H1) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 56 (Figura 32),

b) una región variable de cadena pesada (de tipo hMAb1-H2) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 58 (Figura 34),

c) una región variable de cadena pesada (de tipo hMAb1-H3) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 60 (Figura 36), y

d) una región variable de cadena pesada (de tipo hMAb1-H4) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 62 (Figura 38); y

e) una región variable de cadena ligera (de tipo hMAb1-L1) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (Figura 40), y

f) una región variable de cadena ligera (tipo hMAb1-L2) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 66 (Figura 42);

(11) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo uno cualquiera de los apartados (1) a (8), en donde el anticuerpo comprende una cualquiera de las siguientes combinaciones 1) a 6) de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera:

1) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 58 (figura 34) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40),

2) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la s Eq ID NO: 58 (figura 34) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42),

3) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 62 (figura 38) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42);

4) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la s Eq ID NO: 62 (figura 38) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40),

5) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 56 (figura 32) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40), y

6) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la s Eq ID NO: 60 (figura 36) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40),

(12) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (11), en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo quimérico o un fragmento funcional del mismo; (13) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (11), en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo; (14) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (13), en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de IgG1 humana o IgG2 humana;

(15) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (6), en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se une a un sitio en un antígeno reconocido por uno cualquiera de los anticuerpos según los apartados (7) a (14);

(16) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (6), en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo compite por la unión a la proteína ROBO4 con uno cualquiera de los anticuerpos según los apartados (7) a (14);

(17) el anticuerpo según uno cualquiera de los apartados (1) a (8), en donde el anticuerpo comprende una cualquiera de las siguientes combinaciones 1) a 6) de una cadena pesada y una cadena ligera:

1) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID n O: 64 (Figura 40) (H-1140),

2) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la s Eq ID NO: 58 (Figura 34) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID n O: 66 (Figura 42) (H-1143),

3) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la s Eq ID NO: 62 (Figura 38) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID n O: 66 (Figura 42) (H-2143);

4) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 62 (Figura 38) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID n O: 64 (Figura 40) (H-2140),

5) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 56 (Figura 32) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID n O: 64 (Figura 40) (H-1040), y

6) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 60 (Figura 36) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID n O: 64 (Figura 40) (H-2040),

(18) un anticuerpo que comprende una forma modificada de la cadena pesada de uno cualquiera de los anticuerpos según el apartado (17), en donde dicha forma modificada carece de uno a varios aminoácidos carboxilo terminal de dicha cadena pesada, preferentemente de uno a ocho aminoácidos carboxilo terminal de dicha cadena pesada, más preferentemente de uno a dos aminoácidos carboxilo terminal de dicha cadena pesada;

(19) el anticuerpo según uno cualquiera de los apartados (1) a (6), en donde, en la secuencia de aminoácidos, el anticuerpo tiene una identidad del 95 % o mayor con uno cualquiera de los anticuerpos según el apartado (17); tiene un valor K^dde 1 x 10-8 o inferior por una ROBO4 humana; suprime o inhibe la migración de células endoteliales vasculares en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento in vitro; y suprime o inhibe la angiogénesis in vivo;

(20) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según el apartado (15), en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo humano o un fragmento funcional del mismo;

(21) una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consta de los siguientes apartados (I) a (III):

(I) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos parcial o completa de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20);

(II) una secuencia de nucleótidos que consta de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos parcial o completa de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20); y

(III) una secuencia de nucleótidos que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos parcial o completa de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20);

(22) un vector recombinante que contiene un inserto de una secuencia de nucleótidos según el apartado (21); (23) una célula recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos según el apartado (21) o un vector recombinante según el apartado (22) introducido en la misma;

(24) una célula que produce un anticuerpo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20), en donde la célula es preferentemente una célula de mamífero, más preferentemente una célula CHO e incluso más preferentemente una células CHOK1SV;

(25) un método para producir un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20), que comprende las siguientes etapas (I) y (II):

(I) cultivar una célula según los apartados (23) o (24); y

(II) recuperar del cultivo obtenido en la etapa (I), el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20);

(26) un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo producido por un método de producción según el apartado (25);

(27) una forma modificada de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20) y (26);

(28) una composición farmacéutica que comprende, como principio activo; un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20) y (26) o una forma modificada según el apartado (27); (29) la composición farmacéutica según el apartado (28), en donde la composición farmacéutica es un agente para tratar o prevenir una enfermedad angiogénica;

(30) la composición farmacéutica según el apartado (28), en donde la enfermedad angiogénica es degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia u obesidad;

(31) la composición farmacéutica de acuerdo con el apartado (28), en la que la enfermedad angiogénica es degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular o rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea;

(32) un inhibidor de angiogénesis que, como principio activo, comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20) y (26) o una forma modificada según el apartado (27); (33) un método para tratar o prevenir una enfermedad angiogénica que comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según uno cualquiera de los apartados (1) a (20) y (26) o una forma modificada según el apartado (27), o la composición según uno cualquiera de los apartados (28) a (31), preferentemente en donde la enfermedad angiogénica es la enfermedad angiogénica en un individuo que tiene la proteína ROBO4 expresada; y

(34) la composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en donde dicha composición se utiliza en combinación con un agente terapéutico o profiláctico adicional, preferentemente, en donde dicho agente es un fármaco antiangiogénico, un fármaco antiinflamatorio y/o un fármaco contra el cáncer.

[Efectos ventajosos de la Invención]

según la presente invención, puede obtenerse un agente terapéutico o similar para una enfermedad angiogénica que contiene un anticuerpo que se une a ROBO4 y que tiene un efecto antiangiogénico.

[Breve descripción de las figuras]

La Figura 1 es un diagrama que muestra la presencia o la ausencia de cambios en la actividad indicadora contra NF-kB, GAS, ISRE, el promotor de IL-8 o TCF como elementos de respuesta en la expresión transitoria de la ROBO4 humana en células HEK293. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 3). La Figura 2 es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de cambios en la actividad del promotor de IL-8 en la expresión transitoria de la ROBO4 humana de longitud completa o en una variante de deleción de la región intracelular de la ROBO4 humana en células HEK293. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 5 o 10).

La Figura 3 es un diagrama que muestra cambios en la actividad del promotor de IL-8 en células HEK293 transfectadas con ROBO4 humana, causados por un anticuerpo MAb1 anti-ROBO4. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 3).

La Figura 4 es un diagrama que muestra cambios en la actividad del promotor de IL-8 en células HEK293 transfectadas con ROBO4 humana, causados por un anticuerpo MAb2, MAb3 o MAb4 anti-ROBO4. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 3).

La Figura 5 es un diagrama que muestra cambios en la capacidad migratoria de HUVEC en presencia de VEGF o bFGF causados por el anticuerpo MAb1 anti-ROBO4. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 3 o 4).

La Figura 6 es un diagrama que muestra cambios en la capacidad migratoria de HUVEC en presencia de bFGF, causados por el anticuerpo MAb2, MAb3 o MAb4 anti-ROBO4. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 4).

La Figura 7 es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de la actividad de unión del anticuerpo MAb1 anti-ROBO4 contra ROBO4 humana, ROBO4 de ratón, ROBO4 de rata o ROBO4 de mono cinomolgo.

La Figura 8 es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de la actividad de unión del anticuerpo MAb1 anti-ROBO4 contra ROBO1 humana, ROBO2 humana o ROBO3 humana. Las casillas superiores muestran los resultados sobre MAb1, y las casillas inferiores muestran los resultados sobre un anticuerpo de control positivo con el que se confirmó la expresión de estas proteínas en la superficie celular.

La figura 9 es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de la actividad de unión del anticuerpo MAb1 anti-ROBO4 contra una variante por deleción de la región/dominio extracelular de ROBO4 humano. Las casillas superiores muestran los resultados sobre MAb1, y las casillas inferiores muestran los resultados sobre un anticuerpo anti-FLAG con el que se confirmó la expresión de estas proteínas en la superficie celular.

La Figura 10 es un diagrama que muestra cambios en la angiogénesis en modelos de neovascularización coroidea inducida por láser causados por el anticuerpo MAb1 anti-ROBO4. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 4 ojos), y los símbolos ■ o □ muestran los resultados de cada ojo.

La Figura 11 es un diagrama que muestra cambios en la actividad del promotor de IL-8 en células HEK293 transfectadas con ROBO4 humana causados por un anticuerpo quimérico, cMAb1-1 o cMAb1-2, anti-ROBO4. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 3).

La figura 12 es un diagrama que muestra cambios en la capacidad migratoria de HUVEC en presencia de bFGF causados por el anticuerpo quimérico, cMAb1-1 o cMAb1-2, anti-ROBO4. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 4).

La figura 13 muestra ADNc que codifica la ROBO4 humana de longitud completa (SEQ ID NO: 1).

La figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la ROBO4 humana (SEQ ID NO: 2). La figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada de MAb1 (SEQ ID NO: 30).

La figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de MAb1 (SEQ ID NO: 31).

La figura 17 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera de MAb1 (SEQ ID NO: 32).

La figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de MAb1 (SEQ ID NO: 33).

La Figura 19 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la cadena ligera de cMAb1 (SEQ ID NO: 37).

La figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cMAb1 (SEQ ID NO: 38).

La figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la cadena pesada de cMAb1-1 (SEQ ID NO: 39). La figura 22 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de cMAb1-1 (SEQ ID NO: 40). La figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la cadena pesada de cMAb1-2 (SEQ ID NO: 41).

La figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de cMAb1-2 (SEQ ID NO: 42).

La figura 25 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDRH1 de MAb1 (SEQ ID NO: 44). La figura 26 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDRH2 de MAb1 (SEQ ID NO: 46). La figura 27 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDRH3 de MAb1 (SEQ ID NO: 48). La figura 28 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDRL1 de MAb1 (SEQ ID NO: 50).

La figura 29 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDRL2 de MAb1 (SEQ ID NO: 52).

La figura 30 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDRL3 de MAb1 (SEQ ID NO: 54).

La figura 31 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica una cadena pesada de tipo hMAb1-H1 (SEQ ID NO: 55).

La figura 32 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H1 (SEQ ID NO: 56). La figura 33 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica una cadena pesada de tipo hMAb1-H2 (SEQ ID NO: 57).

La figura 34 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H2 (SEQ ID NO: 58). La figura 35 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica una cadena pesada de tipo hMAb1-H3 (SEQ ID NO: 59).

La figura 36 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H3 (SEQ ID NO: 60). La figura 37 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica una cadena pesada de tipo hMAb1-H4 (SEQ ID NO: 61).

La figura 38 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H4 (SEQ ID NO: 62). La figura 39 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica una cadena ligera de tipo hMAb1-L1 (SEQ ID NO: 63).

La figura 40 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hMAb1-L1 (SEQ ID NO: 64). La figura 41 muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica una cadena ligera de tipo hMAb1-L2 (SEQ ID NO: 65).

La figura 42 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hMAb1-L2 (SEQ ID NO: 66). La figura 43 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH1 de la cadena pesada de tipo hMAb1-H2 o hMAb1-H4 (SEQ ID NO: 67).

La figura 44 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de la cadena pesada de tipo hMAb1-H2 o hMAb1-H4 (SEQ ID NO: 68).

La figura 45 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de la cadena pesada de tipo hMAb1-H2 o hMAb1-H4 (SEQ ID NO: 69).

La figura 46 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL1 de la cadena ligera de tipo hMAb1-L2 (SEQ ID NO: 70) .

La figura 47 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de la cadena ligera de tipo hMAb1-L2 (SEQ ID NO: 71) .

La figura 48 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de la cadena ligera de tipo hMAb1-L2 (SEQ ID NO: 72) .

La figura 49 es un diagrama que muestra cambios en la actividad del promotor de IL-8 en células HEK293 transfectadas con ROBO4 humana causados por H-1040, H-1143, H-1140, H-2040, H-2143 o H-2140.

La figura 50 es un diagrama que muestra cambios en la capacidad migratoria de HUVEC en presencia de bFGF causada por H-1143, H-2140 o H-2143. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 4).

La figura 51 es un diagrama que muestra la reactividad cruzada entre especies de H-1143.

La figura 52 es un diagrama que muestra la reactividad cruzada entre especies de H-2140.

La figura 53 es un diagrama que muestra la reactividad cruzada entre especies de H-2143.

La figura 54 es un diagrama que muestra la especificidad de unión de H-1143, H-2140 o H-2143.

La figura 55 es un diagrama que muestra cambios en la angiogénesis en modelos de neovascularización coroidea inducida por láser causados por H-2143. En el diagrama, la barra de error representa la desviación estándar (n = 3-4 ojos).

[Modo de llevar a cabo la invención]

1. Definiciones

En la presente invención, "gen" significa nucleótido(s) o secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos de una proteína, o su cadena complementaria. El "gen" pretende incluir, por ejemplo, un polinucleótido, un oligonucleótido, ADN, ARNm, ADNc y ARNc como la secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los aminoácidos de una proteína, o su cadena complementaria. Dicho gen es una secuencia de nucleótidos de una sola cadena, de doble o triple cadena, o de más cadenas, y el "gen" también pretende incluir una asociación de cadenas de ADN y ARN, una mezcla de ribonucleótidos (ARN) y desoxirribonucleótidos (ADN) en una cadena de nucleótidos, y una secuencia de nucleótidos de doble o triple cadena, o de más cadenas, que comprende dicha cadena de nucleótidos. Como ejemplos del "gen ROBO4" de la presente invención pueden incluirse a Dn , ARNm, ADNc y ARNc que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína ROBO4.

En la presente invención, el término "nucleótido(s)" o la expresión "secuencia de nucleótidos", tienen el mismo significado que en un "ácido nucleico" y también pretenden incluir, por ejemplo, ADN, RNA, una sonda, un oligonucleótido, un polinucleótido y un cebador. Dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos de una sola cadena, de doble o triple cadena, o de más cadenas, y el "nucleótido" también pretende incluir una asociación de cadenas de ADN y ARN, una mezcla de ribonucleótidos (ARN) y desoxirribonucleótidos (ADN) en una cadena de nucleótidos, y una asociación de dos o tres o más cadenas que comprenden dicha cadena de nucleótidos.

En la presente invención, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína", tienen el mismo significado.

En la presente invención, el "antígeno" también se utiliza en el sentido de un "inmunógeno".

En la presente invención, la "célula" también incluye varias células derivadas de animales, células subcultivadas, células primarias cultivadas, líneas celulares, células recombinantes, y similares.

En la presente invención, un anticuerpo que reconoce la proteína ROBO4 también se conoce como un "anticuerpo anti-ROBO4". El "anticuerpo anti-ROBO4" incluye un anticuerpo quimérico anti-ROBO4, un anticuerpo humanizado anti-ROBO4, un anticuerpo humano anti-ROBO4, y similares.

En la presente invención, el "fragmento funcional del anticuerpo" significa un fragmento de anticuerpo que ejerce al menos una de las funciones, por ejemplo, la afinidad de unión (valor K^d), del anticuerpo original. Como ejemplos del "fragmento funcional del anticuerpo" pueden incluirse, pero sin limitación, Fab, F(ab')2, scFv, Fab', inmunoglobulina de una sola cadena, y similares. Dicho fragmento funcional del anticuerpo puede obtenerse mediante el tratamiento de una molécula de longitud completa de la proteína del anticuerpo con una enzima, tal como papaína o pepsina, o puede ser una proteína recombinante producida en una célula hospedadora apropiada utilizando un gen recombinante. Los "fragmentos funcionales" preferidos también tienen al menos una de las actividades biológicas del anticuerpo original.

Además, en el contexto de la presente invención, una secuencia de nucleótidos que codifica "la secuencia parcial de aminoácidos" de la cadena pesada o ligera, es o incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un "fragmento funcional del anticuerpo" como se define anteriormente en el presente documento.

En la presente invención, el "sitio" al que se une un anticuerpo, es decir, el "sitio" reconocido por un anticuerpo, se refiere a un péptido parcial o conformación parcial en un antígeno unido o reconocido por el anticuerpo. En la presente invención, dicho sitio también se denomina epítopo o sitio de unión al anticuerpo. Como ejemplos del sitio en la proteína ROBO4 unida o reconocida por el anticuerpo anti-ROBO4 de la presente invención, pueden incluirse un péptido parcial 0 una conformación parcial en la proteína ROBO4.

Se sabe que cada una de las cadenas pesada y ligera de una molécula de anticuerpo tiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés complementarity determining regions). Las regiones determinantes de la complementariedad también se denominan dominios hipervariables. Se ubican en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Estos sitios tienen una estructura primaria particularmente muy variable y normalmente se separan en tres posiciones en las estructuras primarias respectivas de las cadenas de polipéptidos de cadena pesada y ligera. En la presente invención, las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo se denominan CDRH1, CDRH2 y CDRH3 desde el extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada en cuanto a las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 desde el extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera en cuanto a las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera. Estos sitios están próximos entre sí en la estructura tridimensional y determinan la especificidad de unión con el antígeno.

En la presente invención, el "anticuerpo mutante" significa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original por la sustitución, deleción, adición y/o inserción (de aquí en adelante, denominada conjuntamente "mutación") de uno o más aminoácidos y que se une a la proteína ROBO4 de la presente invención. El número de aminoácidos mutados en dicho anticuerpo mutante es de 1 a 2, de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 1 a 6, de 1 a 7, de 1 a 8, de 1 a 9, de 1 a 10, de 1 a 12, de 1 a 15, de 1 a 20, de 1 a 25, de 1 a 30, de 1 a 40 o de 1 a 50. Dicho anticuerpo mutante también se incluye en la definición de "anticuerpo" de la presente invención.

En la presente invención, el término "varios" en "de 1 a varios", se refiere a de 2 a 10, preferentemente de 2 a 8, más preferentemente 2.

Como ejemplos de actividades o propiedades ejercidas por el anticuerpo de la presente invención pueden incluirse actividades biológicas o propiedades fisicoquímicas y pueden incluirse específicamente varias actividades biológicas, una actividad de unión contra un antígeno o un epítopo, estabilidad durante la producción o conservación y estabilidad térmica.

En la presente invención, la frase "hibridación en condiciones rigurosas" significa una hibridación en condiciones que implican la hibridación a una temperatura de 65 °C en una solución que contiene 5 x SSC, seguido de lavado a una temperatura de 65 °C durante 20 minutos en una solución acuosa que contiene 2 x SSC-SDS al 0,1 %, a una temperatura de 65 °C durante 20 minutos en una solución acuosa que contiene 0,5 x SSC-SDS al 0,1 %, y a una temperatura de 65 °C durante 20 minutos en una solución acuosa que contiene 0,2 x SSC-SDS al 0,1 %, o una hibridación en condiciones equivalentes a estas. SSC significa una solución acuosa de NaCl 150 mM-citrato de sodio 15 mM y n x SSC significa s Sc con una concentración de n veces.

2. Proteína ROBO4

En la presente memoria descriptiva, el término "ROBO4" y la expresión "proteína ROBO4" se utilizan con el mismo significado.

(2-1) Propiedades

La proteína ROBO4 de la presente invención tiene las siguientes propiedades:

(i) ROBO4 tiene un peso molecular de aproximadamente 110 kDa y una estructura transmembrana de un solo paso y es una proteína receptora de la proteína SLIT2 implicada en la angiogénesis. Cualquier proteína ROBO4 de la presente invención puede encontrarse en una forma liberada de una membrana, tal como una membrana celular, y puede estar en una forma unida a una membrana, tal como una membrana celular. En este contexto, el peso molecular significa un peso molecular aparente en las condiciones no reductoras de SDS-PAGE. La región extracelular N-terminal de ROBO4 contiene dos dominios similares a la inmunoglobulina (de aquí en adelante, denominados "dominios similares a Ig") y dos dominios de fibronectina de tipo III, mientras que su región intracelular C-terminal contiene una región rica en proteínas. En la presente memoria descriptiva, estos dos dominios similares a inmunoglobulina se denominan dominio 1 similar a Ig y dominio 2 similar a Ig, respectivamente, desde el término amino terminal. La proteína ROBO4 humana consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 28 a 1007 de la SEQ ID NO: 2. Los aminoácidos N.° 1 a 27 de la SEQ ID NO: 2 representan una señal secretora; los aminoácidos N.° 28 a 467 de la misma representan una región extracelular; los aminoácidos N.° 46 a 131 de la misma representan el dominio 1 similar a Ig; los aminoácidos N.° 137 a 224 de la misma representan el dominio 2 similar a Ig; los aminoácidos N.° 252 a 340 de la misma representan el dominio 1 de fibronectina de tipo III; los aminoácidos N.° 347 a 438 de la misma representan el dominio 2 de fibronectina de tipo III; los aminoácidos N.° 468 a 490 de la misma representan una región en la membrana celular; y los aminoácidos N.° 491 a 1007 de la misma representan una región intracelular.

(ii) ROBO4 tiene un efecto antiangiogénico. En la presente invención, el término "antiangiogénesis" significa que la propia molécula suprime y/o inhibe directa o indirectamente la angiogénesis, en colaboración con otro factor, o como una asociación con otro factor. El efecto antiangiogénico puede evaluarse, por ejemplo, con un efecto supresor sobre un aumento de la permeabilidad vascular, actividad de promoción de la migración celular o actividad de formación de lumen por VEGF como un indicador.

(iii) ROBO4 comprende una secuencia de aminoácidos descrita en uno cualquiera de los siguientes apartados (a) a (e) (de aquí en adelante, denominada "secuencia de aminoácidos de ROBO4"), consta de una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de ROBO4, o consta de la secuencia de aminoácidos de ROBO4:

(a) la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 (Figura 14);

(b) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que presenta un 80 % o más, 82 % o más, 84 % o más, 86 % o más, 88 % o más, 90 % o más, 92 % o más, 94 % o más, 96 % o más, un 98 % o más o un 99% o más, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 (figura 14) y presenta un efecto antiangiogénico;

(c) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 (figura 14) que tiene una sustitución, deleción, adición o inserción de 1 a 50, 1 a 45, 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 o 2 o 1 aminoácidos y suprime la angiogénesis;

(d) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que tiene la deleción de aminoácidos N.° 1 a 45 o 1 a 131 y suprime la angiogénesis; y

(e) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que está codificada por la secuencia de nucleótidos de un nucleótido que se híbrida en condiciones rigurosas con un nucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 (figura 14) y suprime la angiogénesis.

La proteína ROBO4 puede estar presente como la totalidad o una parte de un homo o hetero oligo asociado constituido por dos o más subunidades.

Puede que la secuencia de aminoácidos y/u otras propiedades de la proteína ROBO4 no sean ni iguales ni homogéneas en un individuo, un tejido, un fluido corporal, una célula, una fracción que contenga la proteína ROBO4, una preparación de proteína ROBO4 purificada o parcialmente purificada, o similar, o entre una pluralidad de individuos, tejidos, células, fracciones que contengan la proteína ROBO4 o preparaciones de proteína ROBO4. Un individuo, tejido, fluido corporal, célula, fracción que contenga la proteína ROBO4, preparación de la proteína ROBO4 purificada o parcialmente purificada, o similar, puede contener varios tipos de proteínas ROBO4 que difieran en la secuencia de aminoácidos y/o en las propiedades. Como alternativa, una pluralidad de individuos, tejidos, células, fracciones que contengan la proteína ROBO4 o preparaciones de proteína ROBO4, pueden diferir en la secuencia de aminoácidos y/u otras propiedades de la proteína ROBO4. Incluso todas estas proteínas que difieren entre sí en la secuencia de aminoácidos y/o propiedades, quedan incluidas en la "proteína ROBO4" de la presente invención, siempre que posean las propiedades descritas anteriormente en los apartados (i) a (iii). (iv) La proteína ROBO4 de la presente invención puede obtenerse del tejido de un vertebrado, preferentemente un mamífero, más preferentemente un roedor, tal como un ratón o una rata o un ser humano, incluso más preferentemente tejidos de un ser humano o un ratón, células derivadas de dicho tejido, cultivos de dichas células, y similares. Dicho tejido y células no están particularmente limitados siempre que contengan la proteína ROBO4. Como ejemplos de los mismos pueden incluirse tejidos de articulaciones, sangre, linfa, timo, bazo, y células derivadas de cualquiera de ellos. Los tejidos y células preferibles son tejidos y células derivados de animales o pacientes que tienen angiogénesis. Sin embargo, el origen de la proteína ROBO4 de la presente invención no se limita a los descritos anteriormente, y la proteína ROBO4 de la presente invención también pretende incluir incluso proteínas ROBO4 derivadas de otras especies animales, otros tejidos, otras células, o similares, siempre que posean las propiedades descritas anteriormente en los apartados (i) a (iii).

La proteína ROBO4 de la presente invención puede ser cualquiera de las proteínas nativas y recombinantes. La proteína ROBO4 también pretende incluir productos de fusión con otro péptido o proteína tal como un transportador o una etiqueta. La proteína ROBO4 también pretende incluir formas provistas de modificación química que incluye la adición de un polímero tal como PEG y/o modificación biológica que incluye una modificación de la cadena de azúcar. Por otra parte, La proteína ROBO4 de la presente invención pretende incluir un fragmento de proteína ROBO4. Un fragmento de proteína ROBO4 que posee la propiedad descrita anteriormente en el apartado (ii) se denomina fragmento funcional de la proteína ROBO4.

(2-2) Gen ROBO4

El gen ROBO4 de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos descrita en uno cualquiera de los siguientes apartados (a) a (c) (de aquí en adelante, denominada "secuencia del gen ROBO4"), consta de una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia del gen ROBO4, o consta de la secuencia del gen ROBO4:

(a) la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 (figura 13);

(b) una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con un nucleótido que consta de una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 (figura 13) y codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que suprime la angiogénesis; y

(c) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 1 (figura 13) que tiene una sustitución, deleción, adición o inserción de 1 a 150, 1 a 140, 1 a 130, 1 a 120, 1 a 110, 1 a 100, 1 a 90, 1 a 80, 1 a 70, 1 a 60, 1 a 50, 1 a 45, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, 1 o 2 o 1 bases y codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que suprime la angiogénesis.

El gen ROBO4 está sobreexpresado en vasos sanguíneos en membranas fibrovasculares o vasos intratumorales de pacientes con una enfermedad acompañada de angiogénesis, por ejemplo, retinopatía diabética proliferativa. Además, el gen ROBO4 parece estar sobreexpresado en tejidos o fracciones de sangre derivadas de pacientes afectados con una enfermedad que se considera que implica angiogénesis, tal como degeneración macular relacionada con la edad, edema macular, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia u obesidad, o de animales modelo de estas enfermedades.

La expresión y el nivel de expresión del gen ROBO4 pueden ensayarse con cualquiera de un producto de transcripción del gen ROBO4 y la proteína ROBO4 como un indicador y pueden determinarse mediante RT-PCR, hibridación por transferencia Northern, o similar, para el indicador superior y por inmunoensayo (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas; de aquí en adelante, denominado "ELISA") o similar, para el último indicador.

(2-3) Preparación de proteínas

La proteína ROBO4 de la presente invención puede purificarse o aislarse de tejidos animales (incluidos fluidos corporales), de células derivadas de los tejidos, o cultivos de las células y prepararse por recombinación de genes, traducción in vitro, síntesis química, etc.

(2-3-1) Purificación o aislamiento de ROBO4 nativa

La proteína ROBO4 nativa puede purificarse o aislarse, por ejemplo, de tejidos (incluyendo fluidos corporales, células, etc.) derivados de pacientes o de animales no humanos afectados con una enfermedad angiogénica, tal como degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia u obesidad, de células derivadas de los tejidos, o cultivos de las células. Dichos animales no humanos también incluyen animales modelo de estas enfermedades. Los animales sometidos a la preparación de modelos no están particularmente limitados siempre que sean vertebrados. Preferentemente, los animales son mamíferos, más preferentemente roedores, tales como ratones o ratas, incluso más preferentemente ratones o ratas. Los tejidos y células de dichos pacientes o animales modelo no están particularmente limitados siempre que contengan la proteína ROBO4. Como ejemplos de los mismos pueden incluirse tejidos de articulaciones, sangre, linfa, timo, bazo, y células derivadas de cualquiera de ellos. Los tejidos y células preferidos derivan de pacientes o animales modelo que tienen angiogénesis o que muestran síntomas similares. Sin embargo, el origen de la proteína ROBO4 de la presente invención no se limita a los descritos anteriormente, y la proteína ROBO4 de la presente invención puede derivar de otras especies animales, otros tejidos, otras células, o similares.

La purificación o el aislamiento de dichos tejidos, células, cultivos celulares, o similares, puede realizarse combinando estrategias bien conocidas por los expertos en la materia, tales como fraccionamiento y cromatografía. Dichas estrategias incluyen, pero sin limitación, desalinización, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase normal o fase inversa, y similares. Puede prepararse un gel de afinidad entrecruzado con un anticuerpo monoclonal anti-ROBO4 y cargarse en una columna para preparar así una columna de cromatografía de afinidad. A dicha columna se la añade una fracción cruda o parcialmente purificada que contiene la proteína ROBO4. Posteriormente, la materia inespecífica adsorbida se elimina con solución salina tamponada con fosfato (PBS, siglas de phosphate-buffered satine) esterilizada, y después puede añadirse a la misma una solución tampón para la elución para recoger selectivamente la proteína ROBO4. La solución que contiene la proteína ROBO4 puede someterse a filtración en gel o a un reemplazo de tampón y/o de concentración utilizando un concentrador tal como Centriprep.

(2-3-2) Preparación de proteína ROBO4 recombinante

La proteína ROBO4 de la presente invención también puede prepararse en una forma recombinante. Específicamente, con un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína ROBO4 o un fragmento de la proteína ROBO4, se transfectan células hospedadoras, y la proteína ROBO4 puede recuperarse de los cultivos de las células. Por ejemplo, el gen ROBO4 o su fragmento se inserta en un vector de expresión. Posteriormente, con el vector recombinante resultante se transfectan células hospedadoras procariotas o eucariotas y las células recombinantes obtenidas pueden incubarse para expresar de este modo la proteína ROBO4. Puede utilizarse un patrón de expresión conocido en la técnica, tal como expresión por secreción, expresión intracelular de formas solubles, o un método de cuerpos de inclusión. Asimismo, la proteína ROBO4 no solo puede expresarse como una molécula que tiene el mismo extremo amino (extremo N) y/o extremo carboxilo (extremo C) que la proteína nativa, sino también como una proteína de fusión con una señal secretora, una señal de localización intracelular, una etiqueta de purificación por afinidad, o un péptido asociado. La proteína ROBO4 puede purificarse o aislarse de dichos cultivos celulares recombinantes mediante la combinación adecuada de operaciones tales como el fraccionamiento y la cromatografía descritos en el apartado (2-3-1) Purificación o aislamiento de la proteína ROBO4 nativa.

El gen ROBO4 o su fragmento puede prepararse mediante un método bien conocido por los expertos en la materia.

Como ejemplos de estos métodos pueden incluirse: reacción en cadena de la polimerasa (de aquí en adelante, denominada "PCR"; Saiki, R. K., et al., Science 1988, 239, págs. 487-489) con una biblioteca de expresión de ADNc de ROBO4 utilizando como molde un conjunto de cebadores capaces de amplificar específicamente la secuencia; PCR de transcripción inversa (de aquí en adelante, denominada "RT-PCR") con una fracción de ARNm para la expresión de ROBO4 utilizando como un molde un cebador capaz de retrotranscribir la secuencia y un conjunto de cebadores capaces de amplificar específicamente la secuencia; clonación de expresión utilizando inmunoensayo; y la clonación de ADNc utilizando la secuencia parcial de aminoácidos de una proteína ROBO4 purificada.

(2-3-3) Traducción in vitro

La proteína ROBO4 de la presente invención también puede prepararse por traducción in vitro. Dicho método de traducción no está particularmente limitado siempre que sea un método que utilice un sistema de traducción acelular que implique enzimas necesarias para la transcripción y traducción, sustratos, y sustancias energéticas. Como un ejemplo del mismo puede incluirse un método que utilice el Sistema de T raducción Rápida (STR) fabricado por Roche Diagnostics.

(2-3-4) Síntesis química

La proteína ROBO4 de la presente invención también puede prepararse mediante síntesis química. Como ejemplos de métodos de síntesis química pueden incluirse métodos de síntesis de péptidos en fase sólida, tal como síntesis de Fmoc y métodos de síntesis de Boc.

3. Anticuerpos anti-ROBO4

(3-1) Tipos de anticuerpos anti-ROBO4

El anticuerpo de la presente divulgación puede ser cualquiera de anticuerpos monoclonales y policlonales. Como ejemplos de anticuerpos monoclonales de la presente divulgación, pueden incluirse un anticuerpo derivado de un animal no humano (anticuerpo de animal no humano), un anticuerpo derivado de un ser humano (anticuerpo humano), un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado, preferentemente un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo derivado de ser humano (anticuerpo humano), más preferentemente un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo derivado de ser humano (anticuerpo humano).

Como ejemplos de anticuerpos de animales no humanos pueden incluirse anticuerpos derivados de vertebrados, tales como mamíferos y aves. Como ejemplos de anticuerpos derivados de un mamífero pueden incluirse anticuerpos derivados de roedores, tales como anticuerpos de ratón y de rata. Como ejemplos de anticuerpos derivados de aves pueden incluirse anticuerpos de pollo.

Como ejemplos de anticuerpos quiméricos pueden incluirse, pero sin limitación, un anticuerpo que comprende regiones variables derivadas de anticuerpos de animales no humanos unidas con regiones constantes (inmunoglobulina humana) de anticuerpos humanos. Como ejemplos de las regiones variables derivadas de anticuerpos de animales no humanos pueden incluirse regiones variables de cadena pesada y ligera derivadas de MAb1 descritas más adelante.

Como ejemplos de anticuerpos humanizados pueden incluirse, pero sin limitación, un anticuerpo humano (regiones variables de inmunoglobulina humana) injertado con las CDR en las regiones variables de un anticuerpo de animal no humano, un anticuerpo humano injertado con las CDR, así como con secuencias parciales de regiones marco de un anticuerpo de animal no humano, y un anticuerpo que tiene uno o más aminoácidos de anticuerpo humano reemplazados por uno o dos o más aminoácidos derivados de anticuerpo de animal no humano en cualquiera de estos anticuerpos humanizados. Como ejemplos de las CDR en las regiones variables de un anticuerpo de animal no humano pueden incluirse CDRH1 a 3 en la región variable de la cadena pesada y CDRL1 a 3 en la región variable de la cadena ligera derivada del MAb1 descrito más adelante.

El anticuerpo humano de la divulgación no está particularmente limitado siempre que sea un anticuerpo que reconozca el antígeno de la presente invención. Como ejemplos de los mismos puede incluirse una unión de anticuerpo humano al mismo sitio que la unida por un anticuerpo que tiene las CDR de anticuerpos de la presente invención, y una unión de anticuerpo humano al mismo sitio en ROBO4 que la unida por MAb1 descrita anteriormente.

El anticuerpo según la presente divulgación puede ser un anticuerpo constituido por sitios derivados de una pluralidad de anticuerpos diferentes. Como ejemplos de los mismos puede incluirse un anticuerpo que comprenda cadenas pesadas y/o ligeras intercambiadas entre una pluralidad de anticuerpos diferentes, un anticuerpo que comprenda cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa intercambiadas entre sí, un anticuerpo que comprenda regiones variables o constantes intercambiadas entre sí, y un anticuerpo que comprenda todas o algunas CDR intercambiadas entre sí. Las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo quimérico pueden derivar de diferentes anticuerpos de la presente invención. La CDRH1 a 3 y la CDRL1 a 3 en las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo humanizado pueden derivar de dos o más anticuerpos diferentes de la presente invención. La CDRH1 a 3 y la CDRL1 a 3 en las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo humano puede ser la combinación de las CDR que llevan dos o más anticuerpos diferentes de la presente invención.

El isotipo del anticuerpo monoclonal de la presente invención no está particularmente limitado, y como ejemplos del mismo puede incluirse IgG tal como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgM, IgA tal como IgA1 e IgA2, IgD e IgE y pueden incluir preferentemente IgG e IgM, más preferentemente IgG2. El isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal pueden determinarse, por ejemplo, mediante un ensayo de Ouchterlony, un ELISA, un radioinmunoensayo (de aquí en adelante, denominado "RIA"). Para la identificación puede utilizarse un kit disponible en el comercio (Kit Mouse Typer, fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc., RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT fabricado por AbD Serotec, etc.).

(3-2) Especificidad de unión del anticuerpo anti-ROBO4

El anticuerpo de la presente invención reconoce la proteína ROBO4. En otras palabras, el anticuerpo de la presente invención se une a la proteína ROBO4. Dicho anticuerpo se denomina "anticuerpo anti-ROBO4". Por otra parte, el anticuerpo preferible de la presente invención reconoce específicamente la proteína ROBO4. En otras palabras, el anticuerpo preferible de la presente invención se une específicamente a la proteína ROBO4. Asimismo, el anticuerpo más preferible de la presente invención se une específicamente a un dominio similar a Ig transportado por la proteína ROBO4. Como ejemplos de dicho dominio similar a Ig pueden incluirse el dominio 1 similar a Ig y el dominio 2 similar a Ig. El anticuerpo más preferible de la presente invención reconoce una región que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 132 a 209 de la SEQ ID NO: 2. El anticuerpo de la presente invención se une a una proteína ROBO4 humana, a una proteína ROBO4 de mono, preferentemente mono cinomolgo y a una proteína ROBO4 de conejo, pero no se une a proteínas ROBO4 de ratón y rata (reactividad cruzada entre especies en el Ejemplo 4)-3 y en el Ejemplo 11)-4).

En la presente invención, el "reconocimiento específico", es decir, "unión específica", significa unión que no es adsorción inespecífica. Como ejemplos de criterios para determinar si la unión es específica o no, pueden incluirse una constante de disociación (de aquí en adelante, denominada "K^d"). El anticuerpo preferible de la presente divulgación tiene un valor K^dde 1 x 10'5 o inferior, 5 x 10'6 o inferior, 2 x 10'6 o inferior o 1 x 10'6 o inferior, más preferentemente de 5 x 10'7 o inferior, 2 x 10'7 o inferior o 1 x 10'7 o inferior, incluso más preferentemente de 5 x 10'8 o inferior, 2 x 10'8 o inferior o 1 x 10'8 o inferior, aún más preferentemente de 5 x 10'9 o inferior, 2 x 10'9 o inferior o 1 x 10'9 o inferior, más preferentemente de 5 x 10'10 o inferior, 2 x 10'10 o inferior o 1 x 10'10 o inferior para la proteína ROBO4. De manera más específica, el anticuerpo preferible de la presente invención tiene un valor K^dde 1 x 10'8 o inferior, aún más preferentemente de 5x 10'9 o inferior para la proteína ROBO4.

En la presente divulgación, la unión del anticuerpo con el antígeno puede ensayarse o determinarse mediante análisis de tipo ELISA, RIA, resonancia de plasmón superficial (de aquí en adelante, denominada "RPS"), o similares. Como ejemplos de equipos utilizados en el análisis de RPS pueden incluirse BIAcore (TM) (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Crop), ProteOn(TM) (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.), RPS-Navi(TM) (fabricado por BioNavis Oy Ltd.), Spreeta(TM) (fabricado por Texas Instruments Inc.), RPSi-PlexII(TM) (fabricado por Horiba, Ltd ), y Autolab RPS(TM) (fabricado por Metrohm). La unión del anticuerpo con el antígeno expresado en la superficie celular puede ensayarse mediante citometría de flujo o similar.

(3-3) Actividad antiangiogénica in vitro del anticuerpo anti-ROBO4

El anticuerpo de la presente invención tiene una actividad antiangiogénica en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento in vitro. Se sabe que ciertos anticuerpos no exhiben una actividad farmacológica en ausencia del anticuerpo de entrecruzamiento in vitro, pero exhiben una actividad farmacológica en ausencia del anticuerpo de entrecruzamiento in vivo (Cancer Cell (2011), 19, págs. 101-113. Probablemente esto se debe a que se encuentran leucocitos in vivo que expresan el receptor de Fcy que tienen las mismas funciones que las del anticuerpo de entrecruzamiento (Nature (2008), 8, págs. 34-47); por tanto, los anticuerpos presentan una actividad farmacológica a través entrecruzamiento en presencia de leucocitos incluso sin el anticuerpo de entrecruzamiento. Sin embargo, en organismos actuales, el número de leucocitos en lesiones difiere entre los individuos (Cancer Res (2011), 71,5670 5677), presumiblemente dando como resultado, entre individuos, los diferentes efectos de los anticuerpos que presentan una actividad farmacológica dependiente del entrecruzamiento inducido por leucocitos. El anticuerpo de la presente invención presenta una excelente actividad antiangiogénica incluso en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento in vitro. Por tanto, el anticuerpo de la presente invención también puede tener un efecto antiangiogénico independiente del número de leucocitos in vivo y por tanto es farmacéuticamente adecuado.

La actividad antiangiogénica significa la actividad de suprimir el crecimiento de células endoteliales vasculares, la migración, la formación de lumen, etc. La actividad antiangiogénica in vitro puede evaluarse mediante un ensayo de permeabilidad vascular, de migración de células endoteliales vasculares o de formación de lumen.

Por ejemplo, para dicha evaluación, el ensayo de permeabilidad vascular puede implicar la inoculación de una célula endotelial de vena de cordón umbilical humano (HUVEC) en la capa superior de una Cámara de Boyden que tiene un tamaño de poro de 1 pm para formar una sola capa y después medir la cantidad de dextrano o similar marcado con FITC que se filtra a través de la capa celular. La cantidad de dextrano marcado con FITC que se filtra a través de la capa celular puede medirse utilizando, por ejemplo, el ensayo de permeabilidad vascular in vitro (Cat. ECM640, fabricado por Millipore Corp.). Cuando el anticuerpo añadido a una concentración de 5 pg/ml o inferior presenta el efecto de suprimir la cantidad de dextrano marcado con FITC que se filtra a través de la capa celular, este anticuerpo puede evaluarse como que tiene un efecto supresor sobre la permeabilidad vascular y una actividad antiangiogénica. El anticuerpo de la presente invención presenta una actividad supresora contra la permeabilidad vascular a una concentración de, preferentemente, 5 pg/ml o inferior, más preferentementel pg/ml o inferior, de manera particularmente preferente 0,5 pg/ml o inferior, en las condiciones de medición descritas anteriormente.

Para dicha evaluación, el ensayo de migración celular puede implicar la inoculación de HUVEC en la capa superior de una Cámara de Boyden que tiene un tamaño de poro de 3 a 8 pm, la adición un medio que contenga un potenciador de migración de células endoteliales, tal como VEGF, a la capa inferior, y la medición del número de células que migran a la capa inferior. Cuando el anticuerpo presenta el efecto de disminuir el número de células HUVEC que migran, este anticuerpo puede evaluarse como que tiene un efecto supresor sobre la migración de células endoteliales vasculares y una actividad antiangiogénica. El número de células que migran puede medirse utilizando, por ejemplo, el sistema de ensayo de migración de células endoteliales vasculares (Cat. 354143, Fabricado por BD Biosciences). El anticuerpo de la presente invención presenta una actividad supresora contra la migración celular a una concentración de, preferentemente, 5 pg/ml o inferior, más preferentementel pg/ml o inferior, de manera particularmente preferente 0,5 pg/ml o inferior, en las condiciones de medición descritas anteriormente.

Para dicha evaluación, el ensayo de formación de lumen puede implicar la inoculación de HUVEC en un recipiente de cultivo celular recubierto con Matrigel y la medición del número de puntos de ramificación, de la longitud del tubo, o similar, de una estructura de lumen formada por HUVEC sobre el Matrigel. Cuando el anticuerpo presenta el efecto de disminuir el número de puntos de ramificación o la longitud del tubo de la estructura de lumen, este anticuerpo puede evaluarse como que tiene un efecto supresor sobre la formación de lumen y una actividad antiangiogénica. El número de puntos de ramificación o la longitud del tubo de la estructura de lumen puede medir utilizando, por ejemplo, el sistema de ensayo de formación de tubos de células endoteliales vasculares (Cat. 354149, Fabricado por BD Biosciences). El anticuerpo de la presente invención presenta una actividad supresora contra la formación de lumen a una concentración de, preferentemente, 5 pg/ml o inferior, más preferentementel pg/ml o inferior, de manera particularmente preferente 0,5 pg/ml o inferior, en las condiciones de medición descritas anteriormente.

Sin embargo, dicho sistema de ensayo, no se limita a estos ensayos siempre que sea capaz de ensayar la angiogénesis y su supresión inducida por la proteína ROBO4.

El anticuerpo de entrecruzamiento se refiere a un anticuerpo que se une a la región Fc del anticuerpo de la presente invención y actúa entrecruzando dos o más moléculas de anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, cuando la región Fc del anticuerpo de la presente invención deriva de un ratón, el anticuerpo de entrecruzamiento se refiere a un anticuerpo que se une a la región Fc de ratón y que se asocia con dos o más moléculas de anticuerpo de la presente invención a través de la unión de estas dos moléculas de anticuerpo de la presente invención en dos sitios de unión, respectivamente, del anticuerpo de entrecruzamiento.

La frase "tiene una actividad antiangiogénica en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento" significa que el anticuerpo presenta un efecto antiangiogénico en un sistema de evaluación relacionado con la supresión de la angiogénesis, por ejemplo, el sistema de evaluación descrito anteriormente, incluso sin coexistir con un anticuerpo de entrecruzamiento.

La frase "tiene una actividad antiangiogénica en presencia de un anticuerpo de entrecruzamiento" significa que el anticuerpo no presenta actividad antiangiogénica en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento en un sistema de evaluación relacionado con la angiogénesis, por ejemplo, el sistema de evaluación de actividad antiangiogénica descrito anteriormente, pero presenta la actividad antiangiogénica cuando coexiste con una o más moléculas de anticuerpo de entrecruzamiento, preferentemente dos o más moléculas de anticuerpo de entrecruzamiento, con respecto a una molécula de anticuerpo de la presente invención.

(3-4) Actividad supresora o inhibitoria in vivo del anticuerpo anti-ROBO4 contra la angiogénesis

El anticuerpo de la presente invención suprime o inhibe la angiogénesis in vivo. La actividad supresora o inhibidora in vivo contra la angiogénesis puede evaluarse con modelos de enfermedades animales según un método estándar. Por ejemplo, los modelos de neovascularización coroidea inducidos por láser descritos más adelante en el ejemplo 4)-6 se utilizan mucho como modelos de enfermedad de angiogénesis y pueden utilizarse en la evaluación siendo la cantidad de vasos sanguíneos recién formados una puntuación. También en el caso de pacientes, por ejemplo, las muestras de tumores se recogen mediante biopsia de pacientes con tumores antes y después de la administración del anticuerpo de la presente invención, y las densidades vasculares de sus vasos intratumorales pueden medirse mediante análisis inmunohistoquímico (IHQ) para puntuar la cantidad de vasos sanguíneos recién formados.

(3-5) Activación de señales en sentido descendente por el anticuerpo anti-ROBO4

El anticuerpo anti-ROBO4 de la presente invención puede someterse a un sistema de evaluación utilizando una línea celular o células primarias cultivadas que presentan alguna respuesta inducida contra la proteína ROBO4. Como ejemplos de dicha línea celular puede incluirse una línea celular endotelial vascular de ratón (ATCC NO. CRL-2779). Como ejemplos de dichas células primarias cultivadas pueden incluirse células endoteliales vasculares de ratón y células endoteliales vasculares humanas.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo agonista contra ROBO4. Específicamente, el anticuerpo de la presente invención se une a ROBO4 y activa la señal de ROBO4 en sentido descendente. Por tanto, el efecto antiangiogénico del anticuerpo de la presente invención puede evaluarse siendo la activación de la señal de ROBO4 en sentido descendente un indicador. Como ejemplos de la señal de ROBO4 en sentido descendente puede incluirse una actividad del promotor de IL-8. La actividad del promotor de IL-8 aumentó drásticamente en células que expresaban ROBO4 humana de longitud completa en comparación con células que no expresaban ROBO4 humana y apenas se observó en células que expresaban ROBO4 humana con dominio intracelular delecionado. Por tanto, el aumento en la actividad del promotor de IL-8 demostró que se detectó la activación de la señal de ROBO4 (Ejemplo 3). La actividad del promotor IL-8 puede evaluarse, por ejemplo, mediante la adición del anticuerpo anti-ROBO4 o la adición conjunta del anticuerpo anti-ROBO4 y un anticuerpo de entrecruzamiento a células transfectadas con un vector indicador que tiene un inserto de secuencia del promotor de IL-8 y un plásmido de expresión de ROBO4 humana, seguido de la determinación de la actividad indicadora.

(3-6) Anticuerpo monoclonal anti-ROBO4 de ratón y el anticuerpo quimérico

MAb1 es un anticuerpo monoclonal anti-ROBO4 de ratón obtenido mediante un método descrito en el Ejemplo 2.

La secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada de MAb1 se muestra en la SEQ ID NO: 30 (figura 15), y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 31 (Figura 16). La secuencia de aminoácidos de CDRH1 se muestra en la SEQ ID NO: 44 (figura 25); la secuencia de aminoácidos de CDRH2 se muestra en la SEQ ID NO: 46 (figura 26); y la secuencia de aminoácidos de CDRH3 se muestra en la SEQ ID NO: 48 (figura 27). La secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera de MAb1 se muestra en la SEQ ID NO: 32 (figura 17), y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 33 (figura 18). La secuencia de aminoácidos de CDRL1 se muestra en la SEQ ID NO: 50 (figura 28); la secuencia de aminoácidos de CDRL2 se muestra en la SEQ ID NO: 52 (figura 29); y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 se muestra en la SEQ ID NO: 54 (figura 30).

Preferentemente, el anticuerpo mutante de la presente divulgación, presenta sensibilidad reducida a la degradación u oxidación de proteínas, una actividad biológica mejorada, una capacidad mejorada para unirse con el antígeno, o propiedades fisicoquímicas o funcionales impartidas al mismo, o similares. Como ejemplos de dicho mutante de anticuerpo pueden incluirse un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original por sustitución de aminoácidos conservativa. La sustitución de aminoácidos conservativa es una sustitución que se produce en un grupo de aminoácidos relacionado con las cadenas laterales de los aminoácidos.

Los grupos de aminoácidos preferibles son los siguientes: un grupo ácido que implica ácido aspártico y ácido glutámico; un grupo básico que implica lisina, arginina e histidina; un grupo no polar que implica alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano; y una familia polar sin carga que implica glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos preferibles son los siguientes: un grupo hidroxi alifático que implica serina y treonina; un grupo que contiene amida que implica asparagina y glutamina; un grupo alifático que implica alanina, valina, leucina e isoleucina; y un grupo aromático que implica fenilalanina, triptófano y tirosina. Dicha sustitución de aminoácidos en el anticuerpo mutante se realiza preferentemente sin reducir la actividad de unión al antígeno del anticuerpo original.

Un anticuerpo mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de MAb1 de la presente invención por sustitución de aminoácidos conservativa, así como un anticuerpo de ratón, anticuerpo de rata, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, o similar, que comprende una secuencia de aminoácidos de la CDR derivada de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de la CDRH1 a 3 y CDRL1 a 3 derivada de MAb1 por mutación de aminoácidos conservativa, también se incluye en la presente divulgación.

Las regiones constantes del anticuerpo de la presente invención no están particularmente limitadas. Preferentemente, en el anticuerpo de la presente invención se utilizan las que derivan de un anticuerpo humano para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un ser humano. Como ejemplos de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo humano pueden incluirse Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, C|j, C8, Ca1, Ca2 y Ce. Como ejemplos de la región constante de la cadena ligera del anticuerpo humano pueden incluirse Ck y CA.

En las SEQ ID NO: 37, 38, 39 y 40 (figuras 19, 20, 21 y 22), respectivamente, se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera que contiene la señal secretora de cMAb1-1 ilustrado como anticuerpo quimérico de ratón-humano de tipo IgG1 de la presente invención y su secuencia de aminoácidos, así como una secuencia de nucleótidos que codifica su cadena pesada y su secuencia de aminoácidos. Del mismo modo, en las SEQ ID NO: 37, 38, 41 y 42 (figuras 19, 20, 23 y 24), respectivamente, se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera que contiene la señal secretora de cMAb1-2 ilustrado como anticuerpo quimérico de ratón-humano de tipo IgG 2 de la presente invención y su secuencia de aminoácidos, así como una secuencia de nucleótidos que codifica su cadena pesada y su secuencia de aminoácidos.

(3-7) Fragmento funcional del anticuerpo anti-ROBO4

Según un aspecto, La presente invención proporciona un fragmento funcional del anticuerpo anti-ROBO4 de la presente invención. El fragmento funcional del anticuerpo significa un fragmento que mantiene al menos una parte de las funciones del anticuerpo, o una forma modificada del mismo que se describe más adelante en (3-10). Como ejemplos de dichas funciones del anticuerpo pueden incluirse generalmente una actividad de unión a antígeno, una actividad reguladora de la actividad antigénica, una actividad citotóxica dependiente de anticuerpos y una actividad citotóxica dependiente del complemento. El anticuerpo anti-ROBO4 y un fragmento funcional del mismo de la presente invención, tiene las siguientes funciones: (I) unión con la proteína ROBO4 con un valor K^dde 1 x 10'8 M o inferior según lo determinado por resonancia de plasmón superficial; (II) supresión o inhibición de la migración de células endoteliales vasculares en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento in vitro; y (III) supresión o inhibición de la angiogénesis in vivo. Los fragmentos funcionales pueden incluir, pero sin limitación, Fab, F(ab')2, Fv, Fv de una sola cadena (scFv, single chain Fv) que comprende los Fv de cadena pesada y ligera conectados a través de un enlazador apropiado, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos poliespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo y Fab', que es un fragmento monovalente de regiones variables de anticuerpo obtenido por el tratamiento de F(ab') 2 en condiciones reductoras. Una molécula que contiene una porción diferente del fragmento del anticuerpo de la presente invención, como en scFv que lleva la porción enlazadora, también se incluye en el significado del fragmento funcional del anticuerpo de la presente invención.

Una molécula que deriva de la proteína de anticuerpo mediante la deleción de 1 a varios o más aminoácidos en su extremo amino y/o extremo carboxilo y que conserva al menos una parte de las funciones del anticuerpo, también se incluye en el significado del fragmento funcional del anticuerpo de la presente invención.

El anticuerpo de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, puede ser un anticuerpo poliespecífico que tiene especificidad por al menos 2 tipos de antígenos diferentes. El anticuerpo poliespecífico no se limita a un anticuerpo biespecífico, que se une a 2 tipos de antígenos diferentes, y un anticuerpo que tiene especificidad por 3 o más tipos de antígenos diferentes también se incluye en el significado del "anticuerpo poliespecífico" de la presente invención.

El anticuerpo poliespecífico de la presente invención puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento funcional del mismo (por ejemplo, anticuerpo F(ab')2 biespecífico). El anticuerpo biespecífico también puede prepararse uniendo las cadenas pesada y ligera (pares HL) de dos tipos de anticuerpos. El anticuerpo biespecífico también puede obtenerse mediante la fusión de dos o más tipos de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales para preparar células de fusión productoras de anticuerpos biespecíficos (Millstein et al., Nature (1983) 305, págs. 537-539. El anticuerpo poliespecífico también puede prepararse de la misma manera que la indicada anteriormente.

Según un aspecto, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de una sola cadena (Fv de una sola cadena; de aquí en adelante, denominado "scFv"). El scFv se obtiene uniendo las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo a través de un enlazador polipeptídico (Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113, ed Rosenburg y Moore, Springer Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, págs.1126-1136). Por otra parte, el bi-scFv, que comprende dos scFv unidos a través de un enlazador polipeptídico, puede utilizarse como un anticuerpo biespecífico. Asimismo, el multi-scFv, que comprende tres o más scFv, también puede utilizarse como un anticuerpo poliespecífico.

La presente invención incluye una inmunoglobulina de una sola cadena que comprende secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa del anticuerpo unidas a través de un enlazador apropiado (Lee, HS, et. al., Molecular Immunology (1999) 36, págs. 61-71; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p. 1-4). Dicha inmunoglobulina de una sola cadena puede dimerizar para conservar así una estructura y actividades similares a las del anticuerpo, que originalmente es un tetrámero. Asimismo, el anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo que tiene una sola región variable de cadena pesada y que no tiene secuencia de cadena ligera. Dicho anticuerpo se denomina anticuerpo de un solo dominio (sdAb, por las siglas del inglés single domain anticuerpo) o nanocuerpo y se ha informado que conserva la capacidad de unirse al antígeno (Muyldemans S. et al., Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). Estos anticuerpos también se incluyen en el significado del fragmento funcional del anticuerpo según la presente invención.

(3-8) Anticuerpo humanizado anti-ROBO4 humana (de aquí en adelante "anticuerpo humanizado anti-ROBO4")

Según un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo.

El anticuerpo humanizado anti-ROBO4 de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, tiene una actividad antiangiogénica in vivo. Preferentemente, el anticuerpo humanizado o el fragmento funcional del mismo, se une específicamente a la proteína ROBO4. Por otra parte, el anticuerpo humanizado o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo agonista contra ROBO4 y activa su señal en sentido descendente. Asimismo, el anticuerpo humanizado o el fragmento funcional del mismo, suprime o inhibe in vitro la migración de células endoteliales vasculares en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento.

Como ejemplos del anticuerpo humanizado de la presente divulgación pueden incluirse un anticuerpo derivado de ser humano que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de MAb1 reemplazadas por las CDR de un anticuerpo animal no humano (véase Nature (1986) 321, págs. 522-525), y un anticuerpo humano injertado con las secuencias de CDR y con algunos restos de aminoácidos de regiones marco mediante un método de injerto de CDR (publicación internacional N.° WO90/07861). Asimismo, una variante derivada del anticuerpo humanizado por la sustitución de 1 a 3 restos de aminoácidos en cada CDR con otros restos de aminoácidos también se incluye en el anticuerpo de la presente divulgación siempre que la variante tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5).

Los ejemplos preferidos del anticuerpo humanizado anti-ROBO4 de la presente invención o del fragmento funcional del mismo, pueden incluir un anticuerpo que consta de una cadena pesada que tiene una región variable que comprende la CDRH1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44 (figura 25), la CDRH2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46 (figura 26) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46 por la sustitución de un aminoácido y la CDRH3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 48 (figura 27), y una cadena ligera que tiene una región variable que comprende la CDRL1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 50 (figura 28) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50 por la sustitución de 1 a 3 aminoácidos, la CDRL2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 52 (figura 29) y la CDRL3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 54 (figura 30) y que reconoce la proteína ROBO4 de la presente invención, y una fracción del anticuerpo que conserva la actividad de unión del anticuerpo con la proteína ROBO4.

Como ejemplos de la sustitución de aminoácidos en la CDRH2 pueden incluirse la sustitución del aminoácido representado por el aminoácido N.° 4 de la SEQ ID NO: 46 en la CDRH2. Específicamente, una asparagina, el aminoácido N.° 4 de la SEQ ID NO: 46, puede reemplazarse por una glutamina. El aminoácido a sustituir por estos no está limitado siempre que el anticuerpo resultante tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5) presentadas por el anticuerpo contra ROBO4 de la presente invención.

Como ejemplos de sustitución de aminoácidos en la CDRL1 pueden incluirse la sustitución de cualquiera de 1 a 3, preferentemente, 3, de los aminoácidos representados por los aminoácidos N.° 9, 11 y 13 de la SEQ Id NO: 50 en la CDRL1. Específicamente, una serina (aminoácido N.° 9), una glicina (aminoácido N.° 11) y una treonina (aminoácido N.° 13) de la SEQ ID NO: 50, pueden reemplazarse por un aminoácido seleccionado de un ácido glutámico, una lisina y una leucina, preferentemente por un ácido glutámico, una lisina y una leucina respectivamente. El aminoácido, o aminoácidos, a sustituir por estos, no está limitado siempre que el anticuerpo resultante tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5) presentadas por el anticuerpo contra ROBO4 de la presente invención.

Se informa que, en algunas condiciones, en péptidos o en una proteína, la asparagina se desamida fácilmente (Gerger et al: The Journal of Biological Chemistry Vol.262 No.2, 785-794, 1987), por lo tanto, el reemplazo de aminoácidos en las CDR descritas anteriormente, puede aumentar la estabilidad de los anticuerpos humanizados de la presente invención.

Como ejemplos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado más preferido que tienen estas CDRH, pueden incluirse una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 56 (figura 32), en donde las CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se representan por los aminoácidos N.° 50 a 54, 69 a 85 y 118 a 126 de la SEQ ID NO: 56 (figura 32), respectivamente, una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 58 (figura 34), en donde las CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se representan por los aminoácidos N ° 50 a 54, 69 a 85 y 118 a 126 de la SEC. ID NO: 58 (figura 34), respectivamente, una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 60 (figura 36), en donde las CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se representan por los aminoácidos N.° 50 a 54, 69 a 85 y 118 a 126 de la SEC. ID NO: 60 (figura 36), respectivamente, y una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID n O: 62 (figura 38), en donde las CDRH1, CDRH2 y CDr H3 se representan por los aminoácidos N.° 50 a 54, 69 a 85 y 118 a 126 de la SEQ ID NO: 60 (figura 38). Como ejemplos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado más preferido que tiene estas CDRL pueden incluirse una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40), en donde las CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se representan por los aminoácidos N.° 44 a 59, 75 a 81 y 114 a 122 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40), respectivamente, y una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42), en donde las CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se representan por los aminoácidos N.° 44 a 59, 75 a 81 y 114 a 122 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42), respectivamente.

Como ejemplos de combinaciones más preferibles de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera de los anticuerpos humanizados más preferidos pueden incluirse: un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 58 (figura 34) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40); un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 58 (figura 34) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42); un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 62 (figura 38) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42); un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 62 (figura 38) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40); un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 56 (figura 32) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40); y un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 60 (figura 36) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO 64 (figura 40).

Incluso como ejemplos más preferidos del anticuerpo humanizado de longitud completa que comprende la combinación más preferida de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera pueden incluirse: un anticuerpo humanizado (H-1140) que comprende una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 58 (figura 34) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO 64 (figura 40); un anticuerpo humanizado (H-1143) que comprende una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 58 (figura 34) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO 66 (figura 42); un anticuerpo humanizado (H-2143) que comprende una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 62 (figura 38) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO 66 (figura 42); un anticuerpo humanizado (H-2140) que comprende una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 62 (figura 38) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO 64 (figura 40); un anticuerpo humanizado (H-1040) que comprende una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 56 (figura 32) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO 64 (figura 40); y un anticuerpo humanizado (H-2040) que comprende una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 60 (figura 36) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40).

Los anticuerpos más preferidos de la presente invención son H-1140, H-1143, H-2140 y H-2143.

El anticuerpo H-1140 tiene las siguientes propiedades 1) unión específica con la proteína ROBO4 humana y no con la ROBO1, ROBO2 y ROBO3 humana, 2) tiene un valor K^dde 3,9 nM para la Ro Bo 4 humana, 3) conserva la afinidad por la ROBO4 humana a 40 °C durante 4 semanas, 4) inhibe la migración de HUVEC inducida por uno o más factores angiogénicos seleccionados de VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB y SDF-1, específicamente VEGF o bFGF, 5) inhibe la angiogénesis in vivo y 6) baja inmunogenicidad en el reconocimiento de inmunogenicidad basado en el sitio web ISPRI (EpiVax, Inc).

El anticuerpo H-1143 tiene las siguientes propiedades 1) unión específica con la proteína ROBO4 humana y no con la ROBO1, ROBO2 y ROBO3 humana, 2) tiene un valor K^dde 3,5 nM para la Ro Bo 4 humana, 3) conserva la afinidad por la ROBO4 humana a una temperatura de 40 °C durante 4 semanas, 4) inhibe la migración de HUVEC inducida por uno o más factores angiogénicos seleccionados de VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB y SDF-1, específicamente VEGF y bFGF, 5) inhibe la angiogénesis in vivo y 6) baja inmunogenicidad en ensayos de inmunogenicidad EpiScreen™ (Antitope Ltd.)

El anticuerpo H-2140 tiene las siguientes propiedades 1) unión específica con la proteína ROBO4 humana y no con la ROBO1, ROBO2 y ROBO3, 2) tiene un valor K^dde 1,8 nM por la ROBO4 humana, 3) conserva la afinidad por la ROBO4 humana a 40 °C durante 4 semanas, 4) inhibe la migración de HUVEC inducida por diversos factores angiogénicos tales como VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB y SDF-1, específicamente VEGF y bFGF, 5) inhibe la angiogénesis in vivo, 6) baja inmunogenicidad en ensayos de inmunogenicidad EpiScreen™ (Antitope Ltd.) El anticuerpo H-2143 tiene las siguientes propiedades 1) unión específica con la proteína ROBO4 humana y no con la ROBO1, ROBO2 y ROBO3, 2) tiene un valor KD de 1,7 nM por la ROBO4 humana, 3) conserva la afinidad por la ROBO4 humana a 40 °C durante 4 semanas, 4) inhibe la migración de HUVEC inducida por diversos factores angiogénicos tales como VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB y SDF-1, específicamente VEGF y bFGF, 5) inhibe la angiogénesis in vivo, 6) baja inmunogenicidad en ensayos de inmunogenicidad EpiScreen™ (Antitope Ltd.) y 7) no muestra cambios importantes en cuanto al cuadro clínico, peso corporal, consumo de alimento, hematología, análisis bioquímico de la sangre, patología, electrorretinografía después de una sola inyección intravítrea (2,75 mg/ojo) en un mono cinomolgo.

En el anticuerpo de la presente divulgación también se incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 95 % o mayor, preferentemente 97 % o mayor, más preferentemente 99 % o mayor, con la secuencia de aminoácidos de anticuerpos tales como H-1140, H-1143, H-2143, H-2140, H-1040 y H-2040, siempre que el anticuerpo tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5). Por otra parte, un anticuerpo que, en la secuencia de aminoácidos, tiene CDR idénticas a las CDR del anticuerpo que comprende la combinación de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera o el anticuerpo que comprende la combinación de la cadena pesada y la cadena ligera, y que tiene una secuencia de aminoácidos distinta de la secuencia de aminoácidos de la CDR que tiene una identidad de 95 % o mayor, preferentemente 97 % o mayor, más preferentemente 99 % o mayor con esta, también se incluye en el anticuerpo de la presente divulgación, siempre que el anticuerpo tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5).

(3-9) Anticuerpo que se une al mismo sitio

En el anticuerpo de la presente divulgación también se incluye un "anticuerpo que se une al mismo sitio" al que se une el anticuerpo proporcionado por la presente invención. El "anticuerpo que se une al mismo sitio" al que se une un determinado anticuerpo, significa otro anticuerpo que se une a un sitio en una molécula de antígeno reconocida por el anticuerpo. Si un segundo anticuerpo se une a un péptido parcial o a una estructura tridimensional parcial en una molécula de antígeno unida por un primer anticuerpo, puede determinarse que el primer y segundo anticuerpo se unen al mismo sitio. Por otra parte, puede determinarse que el primer y segundo anticuerpo se unen al mismo sitio confirmando que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por la unión con el antígeno, es decir, el segundo anticuerpo interfiere con la unión del primer anticuerpo con el antígeno, incluso si la secuencia peptídica o la estructura tridimensional del sitio de unión específica no está determinada. Asimismo, cuando el primer y segundo anticuerpo se unen al mismo sitio y el primer anticuerpo tiene un efecto característico de un aspecto del anticuerpo de la presente invención, tal como una actividad antiangiogénica, el segundo anticuerpo también tiene una probabilidad extremadamente alta de tener esta misma actividad. Por tanto, si un segundo anticuerpo anti-ROBO4 se une al sitio al que se une un primer anticuerpo anti-ROBO4, puede determinarse que el primer y segundo anticuerpo se unen al mismo sitio en la proteína ROBO4. Por otra parte, puede determinarse que el primer y segundo anticuerpo son anticuerpos que se unen al mismo sitio en la proteína ROBO4 confirmando que el segundo anticuerpo anti-ROBO4 compite con el primer anticuerpo anti-ROBO4 por la unión con la proteína ROBO4.

En la presente divulgación, también se incluye un anticuerpo que, en la proteína ROBO4, se une a un sitio que reconoce el MAb1 de la presente invención.

El sitio de unión del anticuerpo puede determinarse mediante un método, tal como inmunoensayo, muy conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, mediante un truncamiento apropiado en el C-terminal o N-terminal de la secuencia de aminoácidos del antígeno, se prepara una serie de péptidos y se estudia la reactividad del anticuerpo para determinar a grandes rasgos un sitio de reconocimiento. Después, se sintetizan péptidos más cortos y la reactividad del anticuerpo contra estos péptidos puede estudiarse para determinar de este modo el sitio de unión. Los péptidos del fragmento de antígeno pueden prepararse utilizando una técnica tal como la recombinación de genes o la síntesis de péptidos.

Cuando el anticuerpo se une o reconoce la conformación parcial del antígeno, el sitio de unión para el anticuerpo puede determinarse identificando restos de aminoácidos en el antígeno adyacente al anticuerpo utilizando un análisis estructural de rayos X.

(3-10) Forma modificada del anticuerpo anti-ROBO4 o del fragmento funcional del mismo

La presente invención proporciona una forma modificada del anticuerpo o del fragmento funcional del mismo. La forma modificada del anticuerpo de la presente invención o del fragmento funcional del mismo, significa un anticuerpo de la presente invención o un fragmento funcional del mismo que comprende una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consta de glucosilación ligada a N, glucosilación ligada a O, procesamiento N-terminal, procesamiento C-terminal, desamidación, isomerización de ácido aspártico, oxidación de metionina y la deleción de 1 o 2 aminoácidos en el extremo C de la cadena pesada y amidación de un resto de prolina recientemente localizado en el extremo C de la cadena pesada. Dicha forma modificada del anticuerpo de la presente invención o del fragmento funcional del mismo, es útil para mejorar la estabilidad o retención sanguínea del anticuerpo original de la presente invención o del fragmento funcional del mismo, la reducción de la antigenicidad, la detección o el aislamiento del anticuerpo o del antígeno, etc.

Dicha modificación puede realizarse en una posición arbitraria o en la posición deseada en el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo. Como alternativa, pueden hacerse las misma modificaciones o dos o más modificaciones diferentes en una o dos o más posiciones.

En la presente invención, la "forma modificada del fragmento de anticuerpo" también pretende incluir incluso un "fragmento de la forma modificada del anticuerpo".

Por ejemplo, ocasionalmente, se sabe que un anticuerpo producido por células de mamífero cultivadas, carece de un resto de lisina carboxilo-terminal en su cadena pesada (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)). También se sabe que, ocasionalmente, faltan 2 restos de aminoácidos carboxilo-terminal (es decir, glicina y lisina) de una cadena pesada y que un resto de prolina recientemente localizado en el extremo carboxilo está amidado (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007 )). Sin embargo, dicha falta o modificación en estas secuencias de cadena pesada, no afecta a la capacidad del anticuerpo para unirse a su antígeno ni a las funciones efectoras (activación del complemento, citotoxicidad dependiente de anticuerpo, etc.) del anticuerpo. Por tanto, en el anticuerpo de la presente invención también se incluye un anticuerpo y un fragmento funcional del anticuerpo que tiene la modificación. Como ejemplos de dicho anticuerpo pueden incluirse un mutante por deleción derivado del anticuerpo de la presente invención por la deleción o falta de 1 o 2 aminoácidos en el término carboxilo de la cadena pesada y el mutante por deleción que tiene un resto amidado (por ejemplo, un resto de prolina amidado en el sitio carboxilo-terminal de la cadena pesada). Dos cadenas pesadas que constituyen el anticuerpo según la presente invención pueden estar compuestas por uno cualquiera de los tipos de cadena pesada seleccionados del grupo que consta de las cadenas pesadas de longitud completa y las cadenas pesadas del mutante por deleción o pueden estar compuestas por la combinación de cualquiera de estos dos tipos seleccionados. La relación cuantitativa de la(s) cadena(s) pesada(s) de la variante por deleción es susceptible, por ejemplo, al tipo de células de mamífero cultivadas que producen el anticuerpo según la presente invención, y a las condiciones de cultivo de las células. Como ejemplos de dichas cadenas pesadas con variantes por deleción, como componentes principales del anticuerpo según la presente invención, pueden incluirse dos cadenas pesadas, ambas de las cuales carecen de un resto de aminoácido carboxiloterminal. Todas estas variantes de deleción están incluidas en la variante de anticuerpo, el fragmento funcional del anticuerpo, o la forma modificada del mismo, según la presente invención.

4. Método para producir anticuerpos

(4-1) Método utilizando hibridoma

Para preparar el anticuerpo anti-ROBO4 de la presente invención, células productoras de anticuerpos anti-ROBO4 se aíslan de los bazos de animales inmunizados con la proteína ROBO4, según el método de Kohler y Milstein (Kohler y Milstein, Nature (1975) 256, págs. 495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, págs. 365-367, Prenum Press, N. Y. (1980)). Las células se fusionan con células de mieloma para establecer así hibridomas, y a partir de cultivos de estos hibridomas, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales.

(4-1-1) Preparación de antígenos

Para la preparación del anticuerpo anti-ROBO4, el antígeno puede obtenerse, por ejemplo, según un método de preparación de la proteína ROBO4 nativa o recombinante descrito en otros párrafos de la presente memoria descriptiva. Como ejemplos del antígeno que puede prepararse de este modo, pueden incluirse la proteína ROBO4 o un fragmento de la proteína ROBO4 que comprende una secuencia parcial con al menos 6 aminoácidos consecutivos de la misma, y sus derivados que además comprenden una secuencia de aminoácidos arbitraria o un transportador añadido a la misma (de aquí en adelante, denominado conjuntamente "antígeno ROBO4").

El antígeno ROBO4 recombinante puede prepararse transfectando células hospedadoras con un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del antígeno ROBO4 y recuperando el antígeno de los cultivos celulares. El antígeno ROBO4 nativo puede purificarse o aislarse, por ejemplo, de tejidos de seres humanos o de roedores con angiogénesis, de células derivadas de los tejidos, o cultivos de las células. En el "antígeno ROBO4" de la presente invención, también se incluye un antígeno ROBO4 obtenido en un sistema de traducción in vitro acelular de un gen que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del antígeno ROBO4.

(4-1-2) Producción del anticuerpo monoclonal anti-ROBO4

El anticuerpo monoclonal se produce normalmente mediante las siguientes etapas:

(a) preparar un antígeno,

(b) preparar células productoras de anticuerpos,

(c) preparar células de mieloma (de aquí en adelante, "mielomas"),

(d) fusionar las células productoras de anticuerpos con los mielomas,

(e) reconocer un grupo de hibridoma que produzca el anticuerpo de interés, y

(f) obtener clones de célula individuales (clonación).

Este método de producción implica además, una etapa (g) de cultivo de los hibridomas, una etapa de suscitar animales trasplantados con hibridoma, etc., una etapa (h) para evaluar o determinar la actividad biológica del anticuerpo monoclonal, etc., si fuera necesario.

De aquí en adelante, el método para preparar el anticuerpo monoclonal se describirá en detalle con referencia a estas etapas. Sin embargo, el método para preparar el anticuerpo no se limita a estas, y, por ejemplo, pueden utilizarse células productoras de anticuerpos que no sean esplenocitos ni mielomas.

(a) Etapa de preparación del antígeno

Se puede preparar un antígeno según el método de preparación de la proteína ROBO4 descrito anteriormente en el apartado (2-3).

(b) Etapa de preparación de células productoras de anticuerpos

El antígeno obtenido en la etapa (a) se mezcla con un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund o sulfato de potasio y aluminio, y los animales de laboratorio se inmunizan con el inmunógeno resultante. Cualquier animal de laboratorio utilizado en un método de preparación de hibridoma conocido en la técnica puede utilizarse sin limitaciones. Específicamente, puede utilizarse, por ejemplo, ratones, ratas, cabras, ovejas, ganado vacuno o caballos. Desde el punto de vista de ser más fácil de obtener células de mieloma fusionadas con células productoras de anticuerpos aisladas, etc., los animales a inmunizar son preferentemente ratones o ratas.

Las cepas de ratón y de rata utilizadas actualmente no están particularmente limitadas. En el caso de ratones, puede utilizarse, por ejemplo, ratones A, AKR, BALB/c, BALB/cAnNCrj, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R IN, SJL, SWR, WB, 129. En el caso de ratas, puede utilizarse, por ejemplo, ratas Wistar, Low, Lewis, Sprague-Dawley, ACI, BN o Fischer.

Estos ratones y ratas pueden obtenerse de criadores/distribuidores de animales de laboratorio, por ejemplo, CLEA Japón, Inc. o Charles River Laboratories Japón Inc.

Entre ellos, una cepa de ratón BALB/c o cepas de rata Wistar y Low son particularmente preferibles como animales para inmunizar teniendo en cuenta la compatibilidad de fusión con las células de mieloma descritas más adelante.

Teniendo en cuenta también la homología entre antígenos humanos y de ratón, también se utilizan preferentemente ratones cuyo mecanismo biológico para eliminar autoanticuerpos se ha reducido, es decir, ratones con enfermedad autoinmunitaria.

En este contexto, estos ratones o ratas tienen preferentemente de 5 a 12 semanas de vida, más preferentemente de 6 a 8 semanas de vida, en el momento de la inmunización.

Los animales pueden inmunizarse con la proteína ROBO4 utilizando, por ejemplo, el método de Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, EA y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964).

Como ejemplos de métodos de determinación de títulos de anticuerpos pueden incluirse, pero sin limitación, inmunoensayos tales como RIA y ELISA.

Las células productoras de anticuerpos derivadas de esplenocitos o linfocitos separados de los animales inmunizados, pueden prepararse según un método conocido en la técnica, por ejemplo, el método de Kohler et al., Nature (1975) 256, pág. 495; Kohler et al., Eur. J. Immnol. (1977) 6, pág. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, pág. 550; Walsh, Nature, (1977) 266, pág. 495).

En el caso de esplenocitos, puede adoptarse un método general, que implica trocear los bazos, filtrar las células a través de una malla de acero inoxidable, y después mantener a flote las células resultantes en un medio esencial mínimo (MEM) de Eagle o similar, para separar las células productoras de anticuerpos.

(c) Etapa de preparación de mielomas

Las células de mieloma utilizadas en la fusión celular no están particularmente limitadas y pueden seleccionarse de manera apropiada para su uso a partir de líneas celulares conocidas en la técnica. Preferentemente, teniendo en cuenta la conveniencia en cuanto a la selección de hibridomas a partir de células de fusión, se utiliza una línea con déficit de HGPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa), es decir, X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.1, o similar, derivada de ratón, o 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) o similar, derivada de rata, o U266AR (SKO-007) GM1500-GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41), o similar, derivada de ser humano, cuyos procedimientos de reconocimiento ya se han establecido. Estas líneas con déficit en HGPRT pueden estar disponibles, por ejemplo, en la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo)(ATCC).

Estas líneas celulares se subcultivan en un medio apropiado, por ejemplo, un medio de 8-azaguanina [medio de RPMI-1640 complementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, y suero fetal de ternera (de aquí en adelante, denominado "FCS" (por las siglas en inglés de fetal calf serum")) y complementado adicionalmente con 8-azaguanina], un medio de Dulbecco modificado por Iscove (de aquí en adelante, denominado "IMDM" (por las siglas Iscove’s modified Dulbecco’s médium)), o un medio de Eagle modificado por Dulbecco (de aquí en adelante, denominado "DMEM" (por las siglas Dulbecco’s modified Eagle medium)) y se subcultivan de 3 a 4 días antes de la fusión celular en un medio normal [por ejemplo, medio ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Inc.) que contiene FCS al 10 %] para garantizar que, el día de la fusión celular, el número de células sea igual a, o mayor que, 2x107 células.

(d) Etapa de fusión de las células productoras de anticuerpos con las células de mieloma

Las células productoras de anticuerpos pueden fusionarse con las células de mieloma en condiciones que impidan que la viabilidad celular se reduzca excesivamente, según un método conocido en la materia (Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, EA y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) etc.). Por ejemplo, puede utilizarse un método químico que implica mezclar células productoras de anticuerpos con células de mieloma en una solución de alta concentración de un polímero, tal como polietilenglicol, o un método físico con estimulación eléctrica.

(e) Etapa de reconocimiento de un grupo de hibridoma que produce el anticuerpo de interés

Para los hibridomas obtenidos por fusión celular, no hay limitación en particular en cuanto al método de selección, y normalmente se utiliza el método de selección con hAt (hipoxantina-aminopterina-timidina) (Kohler et al., Nature (1975) 256, pág. 495); Milstein et al., Nature (1977 ) 266, pág. 550). Este método es eficaz para obtener hibridomas utilizando una línea celular de mieloma con déficit de HGPRt , que no puede sobrevivir en presencia de aminopterina. Específicamente, las células no fusionadas y los hibridomas pueden cultivarse en un medio HAT para permitir así que solo los hibridomas resistentes a la aminopterina permanezcan y crezcan selectivamente.

(f) Etapa de obtención de clones de células individuales (clonación)

Los hibridomas pueden clonarse utilizando un método conocido en la técnica, por ejemplo, con metilcelulosa, agarosa blanda, o con un método de dilución limitante (véase, por ejemplo, Barbara, B. M. y Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). El método de dilución limitante es preferible.

(g) Etapa de cultivo de hibridomas y etapa de suscitar animales trasplantados con hibridoma

Los hibridomas seleccionados pueden cultivarse para producir así anticuerpos monoclonales. Preferentemente, los hibridomas deseados se clonan y después se someten a la producción de anticuerpos.

El anticuerpo monoclonal producido por este hibridoma puede recuperarse de los cultivos del hibridoma. Por otra parte, también puede recuperarse un anticuerpo recombinante de cultivos de células transfectadas con el gen del anticuerpo monoclonal. Asimismo, los hibridomas pueden inyectarse por vía intraperitoneal a ratones de la misma cepa (por ejemplo, la cepa BALB/cAnNCrj descrita anteriormente) o a ratones Nu/Nu y dejar que crezcan. Después, el anticuerpo monoclonal también puede recuperarse de sus ascitis.

(h) Etapa de ensayo o determinación de la actividad biológica del anticuerpo monoclonal

Pueden seleccionarse varios ensayos biológicos y aplicarlos según su finalidad.

(4-2) Método de inmunización celular

Como inmunógenos para preparar de este modo un anticuerpo anti-ROBO4 mediante el método de hibridoma descrito anteriormente, pueden utilizarse células que expresan la proteína ROBO4 nativa, células que expresan la proteína ROBO4 recombinante o su fragmento, o similares.

Como ejemplos de células que expresan la proteína ROBO4 nativa pueden incluirse células derivadas de pacientes afectados con una enfermedad angiogénica, tal como retinopatía diabética proliferativa o tumor, y células derivadas de los tejidos de estos pacientes. Dichas células son, preferentemente, sin limitación, células endoteliales vasculares. Estas células que expresan proteína ROBO4 se utilizan en una cantidad de 1 x 105 a 1 x 109 células, preferentemente de 1 x 106 a 1 x 108 células, más preferentemente de 0,5 a 2 x 107 células, aún más preferentemente 1 x 107 células, en una inmunización. El número de células sometidas a inmunización puede cambiar según el nivel de expresión de la proteína ROBO4. Los inmunógenos se administran generalmente por vía intraperitoneal y pueden administrarse por vía intradérmica o similar. El método descrito en el apartado (4-1-2) puede aplicarse a la estrategia de preparación de hibridomas.

(4-3) Recombinación génica y células hospedadoras

Para preparar el anticuerpo de la presente invención, las células hospedadoras se transfectan con un nucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de su cadena pesada (nucleótido de cadena pesada) y un nucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de su cadena ligera (nucleótido de cadena ligera), o con un vector que contiene un inserto del nucleótido de cadena pesada y un vector que contiene un inserto del nucleótido de cadena ligera, y después se cultivan, y el anticuerpo puede recuperarse de los cultivos. Los nucleótidos de cadena pesada y ligera pueden insertarse en un vector.

Como células hospedadoras puede utilizarse células procariotas o eucariotas. Cuando se utilizan células eucariotas como hospedadores, pueden utilizarse células animales, células vegetales, o microbios eucariotas.

Como ejemplos de células animales pueden incluirse células derivadas de mamíferos, es decir, células COS derivadas de monos (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, pág. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos de ratón NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658), líneas celulares NS0 de ratón (ECACC), células de ovario de hámster chino (células CHO, ATCC CCL-61), líneas de las mismas con déficit de dihidrofolato reductasa (CHOdhfr-: Urlaub, G. y Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. (1980) 77, págs. 4126-4220), CHOK1SV desarrollada por Lonza Biologics, células derivadas de aves tales como pollos, y células derivadas de insectos.

Asimismo, las células hospedadoras de la presente invención incluyen células que pueden producir una proteína de anticuerpo, en donde se modifica la estructura de una cadena de azúcar unida a la proteína del anticuerpo, en donde, con la modificación, se potencia una actividad biológica del anticuerpo preferentemente en comparación con el anticuerpo sin la modificación. Como ejemplo de dichas células hospedadoras de la presente invención, se incluye células CHO que pueden producir una proteína de anticuerpo que tiene cadenas complejas de azúcares unidas a N-glucósidos unidas a la región Fc del anticuerpo, en las que entre las cadenas complejas totales de azúcares unidas a N-glucósidos unidas a la región Fc del anticuerpo, la relación de una cadena de azúcar en donde la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar, es del 20 % o mayor (documentos WO2000/61739, WO2002/31140).

Como ejemplos de microbios eucariotas pueden incluirse levaduras. Como ejemplos de células procariotas pueden incluirse E. coli y Bacillus subtilis.

Como células hospedadoras para producir los anticuerpos anti-ROBO4 de la presente invención, se utilizan, preferentemente, células derivadas de mamíferos, utilizándose más preferentemente células CHO y aún más preferentemente CHOK1SV.

Para la secreción del anticuerpo de la presente invención (anticuerpos monoclonales derivados de diversas especies animales, anticuerpos de rata, anticuerpos de ratón, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, etc.) un péptido señal no se limita a la señal secretora de un anticuerpo de la misma especie, del mismo tipo y del mismo subtipo que el anticuerpo o la señal secretora del propio anticuerpo. Puede seleccionarse y utilizarse cualquier señal secretora de un anticuerpo de diferente tipo o subtipo de la misma o cualquier señal secretora de una proteína derivada de una especie eucariota diferente de la misma o una especie procariota.

(4-4) Métodos para diseñar y preparar un anticuerpo humanizado

Como ejemplos de anticuerpos humanizados pueden incluirse, pero sin limitación, un anticuerpo derivado de ser humano que tiene las CDR reemplazadas por las CDR de un anticuerpo animal no humano (véase Nature (1986) 321, págs. 522-525), un anticuerpo humano injertado con las secuencias de CDR y con algunos restos de aminoácidos de regiones marco mediante un método de injerto de CDR (véanse los documentos WO90/07861 y US6972323), y un anticuerpo que tiene uno o más aminoácidos de anticuerpo humano reemplazado con uno o dos o más aminoácidos derivados de anticuerpos de animales no humanos en cualquiera de estos anticuerpos humanizados.

(4-5) Método para preparar un anticuerpo humano

Otros ejemplos del anticuerpo de la presente invención pueden incluir un anticuerpo humano. El anticuerpo humano anti-ROBO4 significa un anticuerpo anti-ROBO4 que consta de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo derivado de ser humano. El anticuerpo humano anti-ROBO4 puede obtenerse mediante un método que utiliza ratones productores de anticuerpos humanos que llevan un fragmento de ADN genómico humano que comprende los genes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, págs. 133-143; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, págs. 3447-3448; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, págs. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. y Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, págs. 722-727 etc.).

Específicamente, dichos animales productores de anticuerpos humanos pueden prepararse alterando los locus génicos de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina endógena de mamíferos no humanos y, en su lugar, introduciendo los locus génicos de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina humana a través de vectores de cromosomas artificiales de levadura (YAC, yeast artificial chromosome) o similares. Como alternativa, las células eucariotas se transforman con los ADNc que codifican cadenas pesadas y cadenas ligeras de dicho anticuerpo humano, preferentemente con vectores que comprenden cada uno de los ADNc, mediante una técnica de recombinación de genes, y las células transformadas que producen un anticuerpo monoclonal humano recombinante se cultivan. Este anticuerpo puede obtenerse del sobrenadante del cultivo.

En este contexto, por ejemplo, como hospedadores pueden utilizarse células eucariotas, preferentemente células de mamífero, tales como células CHO, linfocitos o mielomas.

Asimismo, se conoce un método para obtener un anticuerpo humano derivado de presentación de fagos seleccionado de una biblioteca de anticuerpos humanos (véase Wormstone, M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), págs. 2301-2308; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), págs. 189-203; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology (2002) 109 (3), págs. 427-431 etc.).

Por ejemplo, puede utilizarse un método de presentación de fagos (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), págs. 1105 1116), que implica permitir que las regiones variables de un anticuerpo humano se expresen como un anticuerpo de una sola cadena (scFv) en la superficie del fago y seleccionar una unión del fago con el antígeno.

El fago seleccionado, basándose en su unión con el antígeno, puede someterse a análisis genético para determinar de este modo las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de la unión del anticuerpo humano con el antígeno.

Si se determina la secuencia de ADN de la unión de scFv con el antígeno, se prepara un vector de expresión que tiene esta secuencia y se pueden transfectar hospedadores apropiados con el vector de expresión y se deja que expresen el anticuerpo humano (documentos WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, págs. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), págs.

1105-1116.

(4-6) Método para preparar fragmentos funcionales de un anticuerpo

El método para preparar un anticuerpo de una sola cadena es muy conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.946.778, 5.260.203, 5.091.513 y 5.455.030). En este scFv, una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera están unidas a través de un enlazador que impide que formen un conjugado, preferentemente un enlazador polipeptídico (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, págs. 5879-5883. La región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera en scFv pueden derivar del mismo anticuerpo o pueden derivar de diferentes anticuerpos.

Por ejemplo, como enlazador polipeptídico que une estas regiones variables, se utiliza un péptido arbitrario de una sola cadena que consta de 12 a 19 restos.

Para obtener ADN que codifica scFv, de las secuencias de ADN que codifican la cadena pesada o la región variable de la cadena pesada del anticuerpo y el ADN que codifica la cadena ligera o la región variable de la cadena ligera del mismo, cada parte de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos completa o deseada, se utiliza usa como molde y se amplifica por PCR utilizando un par de cebadores que flanquean ambos extremos del molde. Posteriormente, el ADN que codifica la porción enlazadora polipeptídica se amplifica en combinación con un par de cebadores que flanquean ambos extremos del mismo para enlazarlos a las cadenas pesada y ligera, respectivamente.

El ADN que codifica a scFv puede utilizarse para preparar de este modo, según un método habitual, un vector de expresión que contiene el ADN y las células hospedadoras transformadas con el vector de expresión. Además, las células hospedadoras se cultivan y el scFv puede recuperarse de los cultivos según un método habitual.

Asimismo, para obtener otros fragmentos funcionales del anticuerpo, se obtiene un gen que codifica cada fragmento funcional según el método descrito anteriormente, y las células se transfectan con el gen. El fragmento funcional de interés puede recuperarse de cultivos de las células.

El anticuerpo de la presente invención puede multimerizarse para potenciar así su afinidad por el antígeno. Los anticuerpos que se van a multimerizar pueden ser anticuerpos de un tipo o pueden ser una pluralidad de anticuerpos que reconocen una pluralidad de epítopos, respectivamente, o el mismo antígeno. Como ejemplos de métodos de multimerización de anticuerpos pueden incluirse la unión de dos scFv con un dominio CH3 de IgG, la unión del mismo con estreptavidina, y la introducción de un motivo de hélice-giro-hélice.

El anticuerpo de la presente invención puede ser una mezcla de varios tipos de anticuerpos anti-ROBO4 que difieren en la secuencia de aminoácidos, es decir, un anticuerpo policlonal. Como ejemplos del anticuerpo policlonal pueden incluirse una mezcla de varios tipos de anticuerpos que difieren en una parte o en la totalidad del conjunto de CDR. Dicho anticuerpo policlonal puede recuperarse de cultivos de células mixtas, cultivadas productoras de diferentes anticuerpos (documento WO2004/061104). Por otra parte, pueden mezclarse anticuerpos preparados por separado. Asimismo, el antisuero, que es un aspecto del anticuerpo policlonal, puede prepararse inmunizando animales con el antígeno deseado y recuperando suero de los animales según un método estándar.

Los anticuerpos conjugados con diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG) también pueden utilizarse como formas modificadas del anticuerpo.

El anticuerpo de la presente invención puede ser además cualquiera de los conjugados formados por estos anticuerpos con otros fármacos (inmunoconjugados). Como ejemplos de dicho anticuerpo pueden incluirse el anticuerpo conjugado con un material radioactivo o un compuesto que tenga un efecto farmacológico (Nature Biotechnology (2005) 23, págs.

1137-1146.

(4-7) Purificación de anticuerpos

El anticuerpo obtenido puede purificarse en un nivel homogéneo. Para la separación y purificación del anticuerpo pueden utilizarse métodos habituales de separación y purificación de proteínas.

El anticuerpo puede separarse y purificarse mediante estrategias seleccionadas o combinadas, por ejemplo, columnas de cromatografía, filtros, ultrafiltración, desalinización, diálisis, electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida y/o isoelectroenfoque (Strategies for Protein Purification and Charcterization: A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) pero sin limitarse a estas.

Como ejemplos de cromatografía se incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción.

Estas estrategias cromatográficas pueden realizarse utilizando cromatografía en fase líquida, tal como HPLC o FPLC.

Como ejemplos de columnas utilizadas en la cromatografía de afinidad pueden incluirse columnas de proteína A, de proteína G y de antígeno.

Como ejemplos de la columna de proteína A se incluyen Hyper D (fabricado por Pall Corp.), POROS (fabricado por Applied Biosystems, Inc.) y Sepharose F.F. fabricada por g E Healthcare Bio-Sciences Crop.).

Asimismo, el anticuerpo puede purificarse en función de su actividad de unión contra el antígeno utilizando un vehículo de antígeno inmovilizado.

La presente invención proporciona incluso un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo, un vector recombinante que contiene un inserto del gen, una célula transfectada con el gen o el vector, y una célula que produce el anticuerpo de la presente invención.

En la presente invención puede incluirse un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se produzca por cualquiera de los métodos (4-1) a (4-6).

5. Composición farmacéutica

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-ROBO4 o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo.

La composición farmacéutica de la presente invención es útil en el tratamiento o prevención de una enfermedad que muestra la angiogénesis como uno de los hallazgos patológicos durante el ciclo de aparición, progresión y/o exacerbación y puede mejorarse mediante la supresión de esta angiogénesis o permeabilidad vascular (de aquí en adelante, por conveniencia, a esta enfermedad se la denominará "enfermedad angiogénica"). Como ejemplos de la enfermedad angiogénica pueden incluirse degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia y obesidad. La composición farmacéutica de la presente invención es útil como un agente en el tratamiento o prevención de una enfermedad angiogénica, preferentemente útil en el tratamiento o prevención de la degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular y rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea, más preferentemente útil en el tratamiento o prevención de la degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa y glaucoma neovascular.

En la presente invención, el tratamiento y/o tratamiento de una enfermedad incluye, pero sin limitación, la prevención de la aparición de la enfermedad, preferentemente la enfermedad en un individuo que tiene la proteína ROBO4 expresada, la supresión o inhibición de la exacerbación o progresión de la misma, el alivio de uno o dos o más síntomas presentados por un individuo afectado con la enfermedad, la supresión o remisión de la exacerbación o progresión de la misma, el tratamiento o prevención de una enfermedad secundaria, y similares.

La composición farmacéutica de la presente invención puede contener una cantidad terapéutica o preventivamente eficaz del anticuerpo anti-ROBO4 o del fragmento funcional del anticuerpo y un diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, conservante y/o aditivo farmacéuticamente aceptable.

La "cantidad terapéutica o preventivamente eficaz" significa una cantidad que ejerce efectos terapéuticos o preventivos sobre una enfermedad particular mediante una forma de dosificación y una vía de administración particular.

La composición farmacéutica de la presente invención puede contener materiales para cambiar, conservar, o retener el pH, la presión osmótica, la viscosidad, transparencia, el color, la tonicidad, la esterilidad o estabilidad, la solubilidad, la liberación sostenida, la capacidad de absorción, la permeabilidad, la forma farmacéutica, la dosificación, las propiedades, la forma, etc., de la composición o del anticuerpo contenido en ella (de aquí en adelante denominados "materiales farmacéuticos"). Los materiales farmacéuticos no están particularmente limitados siempre que sean materiales farmacológicamente aceptables. Por ejemplo, no tener ninguna o baja toxicidad es una propiedad que poseen preferentemente estos materiales farmacéuticos.

Como ejemplos de los materiales farmacéuticos pueden incluirse, pero sin limitación, los siguientes: aminoácidos tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, histidina, arginina y lisina; agentes antimicrobianos; antioxidantes tales como ácido ascórbico, sulfato de sodio y bisulfito de sodio; tampones, tales como tampones de fosfato, citrato o borato, soluciones de bicarbonato de sodio y Tris-HCl; cargas tales como manitol y glicina; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA); agentes complejantes tales como cafeína, polivinilpirrolidina, p-ciclodextrina e hidroxipropil-p-ciclodextrina; agentes formadores de volumen, tales como glucosa, manosa y dextrina; Otros hidrocarburos tales como monosacáridos, disacáridos, glucosa, manosa y dextrina; agentes colorantes; correctores; diluyentes; emulsionantes; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal; antisépticos tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y peróxido de hidrógeno; disolventes tales como glicerina, propilenglicol y polietilenglicol; alcoholes de azúcar, tales como manitol o sorbitol; agentes de suspensión; tensioactivos tales como PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20 y polisorbato 80, tritón, trometamina, lecitina y colesterol; potenciadores de la estabilidad tales como sacarosa y sorbitol; potenciadores de la elasticidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, manitol y sorbitol; agentes transportadores; diluyentes; excipientes; y/o aditivos farmacéuticos.

La cantidad añadida de estos materiales farmacéuticos es de 0,001 a 1000 veces, preferentemente de 0,01 a 100 veces, más preferentemente de 0,1 a 10 veces, el peso del anticuerpo anti-ROBO4 o del fragmento funcional del mismo, o de la forma modificada del mismo.

En la composición farmacéutica de la presente invención también se incluye una composición farmacéutica que contiene un inmunoliposoma que comprende el anticuerpo anti-ROBO4 o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo, encapsulado en un liposoma o en una forma de anticuerpo modificada que comprende el anticuerpo conjugado con un liposoma (Patente de Estados Unidos N.° 6214388, etc.).

Los excipientes o vehículos no están particularmente limitados siempre y cuando sean materiales líquidos o sólidos habitualmente utilizados en agua para inyectables, solución salina, líquidos cefalorraquídeos artificiales y otras preparaciones para administración oral o parenteral. Como ejemplos de la solución salina pueden incluirse solución salina neutra y solución salina que contiene seroalbúmina.

Como ejemplos de los tampones pueden incluirse tampones de T ris ajustados para llevar el pH final de la composición farmacéutica a un valor de 7,0 a 8,5, tampones de acetato ajustados para llevar el pH final a un valor de 4,0 a 5,5, tampones de citrato ajustados para llevar el pH final de la composición farmacéutica a un valor de 5,0 a 8,0, y tampones de histidina ajustados para llevar el pH final de la composición farmacéutica a un valor de 5,0 a 8,0.

La composición farmacéutica de la presente invención es un sólido, un líquido, una suspensión, o similar. Otro ejemplo de la composición farmacéutica de la presente invención puede incluir preparaciones liofilizadas. Las preparaciones liofilizadas pueden formarse utilizando un excipiente tal como sacarosa.

La vía de administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede ser cualquiera de administración enteral, administración local y administración parenteral y, preferentemente, puede seleccionarse según la enfermedad específica. Como ejemplos de administración específicos pueden incluirse la administración intravenosa, administración intraarterial, administración intramuscular, administración intradérmica, administración hipodérmica, administración intraperitoneal, administración transdérmica, administración intraósea y administración intraarticular. Asimismo, la administración intraocular puede utilizarse preferentemente para una enfermedad angiogénica oftálmica, tal como degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular o rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea.

La receta de la composición farmacéutica puede determinarse según el método de administración, la afinidad de unión del anticuerpo por la proteína ROBO4, etc. El anticuerpo anti-ROBO4 de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo, que tiene mayor afinidad (valor de K^dmás bajo) por la proteína ROBO4, puede ejercer su eficacia farmacológica a una dosis más baja.

La dosis del anticuerpo anti-ROBO4 de la presente invención puede determinarse de manera apropiada según la especie de un individuo, el tipo de enfermedad, los síntomas, el sexo, la edad, las afecciones preexistentes, la afinidad de unión del anticuerpo por la proteína ROBO4 o su actividad biológica, y otros factores. Una dosis normalmente de 0,01 a 1000 mg/kg, preferentemente de 0,1 a 100 mg/kg, puede administrarse una vez al día hasta 180 días o dos o tres o más veces al día.

Como ejemplos de la forma de la composición farmacéutica pueden incluirse inyecciones (incluidas las preparaciones liofilizadas y gotas), supositorios, preparaciones de absorción transnasal, preparaciones de absorción transdérmica, formulaciones sublinguales, cápsulas, comprimidos, pomadas, gránulos, aerosoles, píldoras, polvos, suspensiones, emulsiones, colirios y formulaciones biológicas de implantes.

La composición farmacéutica que, como principio activo, comprende el anticuerpo anti-ROBO4 de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo, puede utilizarse en combinación con un agente terapéutico o profiláctico adicional. Como ejemplos de dicho agente se incluyen un fármaco antiangiogénico, un fármaco antiinflamatorio y/o un fármaco contra el cáncer. Por ejemplo, a un sujeto se le administra el fármaco antiangiogénico, el fármaco antiinflamatorio y/o el fármaco contra el cáncer, y después, como principio activo, se le administra la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-ROBO4 o el fragmento funcional del anticuerpo. Como alternativa, a un sujeto se le administra la composición farmacéutica y después, se le administra el fármaco antiangiogénico, el fármaco antiinflamatorio y/o el fármaco contra el cáncer. Como alternativa, la composición farmacéutica puede administrarse a un sujeto de manera simultánea junto con el fármaco antiangiogénico, fármaco antiinflamatorio y/o fármaco contra el cáncer. Como ejemplo de fármaco antiangiogénico puede incluirse ranibizumab.

La presente invención proporciona incluso un método para tratar o prevenir una enfermedad angiogénica, tal como degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia u obesidad, el uso del anticuerpo de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de la enfermedad angiogénica, y el uso del anticuerpo de la presente invención para el tratamiento o la prevención de la enfermedad angiogénica. En la presente invención también se incluye un kit que comprende el anticuerpo de la presente invención para el tratamiento o la prevención.

6. Composición para diagnóstico

La presente invención proporciona una composición para realizar una exploración o un diagnóstico que comprende el anticuerpo anti-ROBO4 de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo (de aquí en adelante, denominada conjuntamente "composición para diagnóstico").

La composición para diagnóstico de la presente invención es útil en la exploración o diagnóstico de una enfermedad angiogénica tal como degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia u obesidad. La composición para diagnóstico de la presente invención también es útil en la exploración o diagnóstico de síntomas angiogénicos o preangiogénicos tempranos, que no cumplan los criterios de diagnóstico convencionales, síntomas no diagnosticados que evolucionan a angiogénesis, etc. En la presente invención, la exploración o diagnóstico incluye, por ejemplo, la determinación o ensayo de un riesgo de adquirir una enfermedad, la determinación de la presencia o ausencia de una enfermedad, ensayar el grado de progresión o exacerbación, ensayar o determinar el efecto de la terapia farmacológica utilizando la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-ROBO4 o similar, ensayar o determinar el efecto de la terapia que no sea farmacoterapia, ensayar un riesgo de recidiva y determinar la presencia o ausencia de recidiva. Sin embargo, la exploración o el diagnóstico según la presente invención no se limita a estos, siempre y cuando sea una exploración o un diagnóstico habitual.

Cuando la proteína ROBO4 se detecta en una cantidad de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces o en mayor cantidad, preferentemente una cantidad de 10 veces o en mayor cantidad, en una muestra derivada de un sujeto de ensayo en comparación con una muestra derivada de un individuo sano, al sujeto de ensayo se le puede diagnosticar una enfermedad angiogénica o que tiene un alto riesgo de contraerla. Por otra parte, cuando la concentración sérica de la proteína ROBO4 supera un valor de referencia particular, al sujeto de ensayo se le diagnosticar una enfermedad angiogénica o se le puede diagnosticar que tiene un alto riesgo de contraerla. El valor de referencia normalmente es de 0,01 a 10 ng/ml, preferentemente de 0,1 a 1 ng/ml, más preferentemente de 0,1 a 0,3 ng/ml.

Dicha composición para diagnóstico puede contener un tampón de pH, un osmoregulador, sales, un estabilizante, un antiséptico, un revelador de color, un sensibilizante, un inhibidor de agregación, y similares.

La presente invención proporciona incluso un método para examinar o diagnosticar una enfermedad angiogénica tal como degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia u obesidad, el uso del anticuerpo de la presente invención para la preparación de una composición para el diagnóstico de la enfermedad angiogénica, y el uso del anticuerpo de la presente invención para la exploración o diagnóstico de la enfermedad angiogénica. En la presente invención también se incluye un kit para la exploración o diagnóstico, que comprende el anticuerpo de la presente invención.

El método de exploración o diagnóstico que implica el anticuerpo de la presente invención es preferentemente un ELISA de tipo sándwich. Puede utilizarse un método de detección habitual que utilice anticuerpos, tal como el ensayo ELISA, RIA, ELISPOT (del inglés Enzyme-Linked ImmunoSpot, inmunoadsorción ligada a enzimas), transferencia por puntos, un ensayo de Ouchterlony o de CIE (contrainmunoelectroforesis). Los anticuerpos aplicados al sistema de ensayo ELISA de tipo sándwich, pueden ser cualquier combinación de dos anticuerpos que reconozcan a ROBO4, pero que no compitan entre sí. Además de la biotina, un método de marcaje que puede llevarse a cabo en el análisis bioquímico, tal como HRP, fosfatasa alcalina, o FITC, puede utilizarse como un método de marcaje para los anticuerpos. En la detección con marcaje enzimático puede utilizarse un sustrato cromogénico tal como TMB (3, 3', 5, 5'-tetrametilbencidina), BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato), p-NPP (p-nitrofenil fosfato), OPD (o-fenilendiamina), ABTS (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico), substrato quimioluminiscente SuperSignal ELISA Pico (Thermo Fisher Scientific Inc.), un sustrato fluorescente, tal como sustrato de peroxidasa fluorogénica QuantaBlu(TM) (Thermo Fisher Scientific Inc.) y un sustrato quimioluminiscente. Las muestras derivadas de animales humanos o no humanos, así como las muestras tratadas artificialmente, tales como proteínas recombinantes, pueden someterse a este ensayo. Como ejemplos de muestras de ensayo derivadas de organismos individuales pueden incluirse, pero sin limitación, sangre, líquido sinovial, ascitis, linfa, líquidos cefalorraquídeos y sobrenadantes de homogeneizados tisulares.

El kit ELISA de tipo sándwich para la exploración o diagnóstico que comprende el anticuerpo de la presente invención, puede contener una solución de patrones de proteína ROBO4, un reactivo colorante, una solución tampón para la dilución, un anticuerpo para la fase sólida, anticuerpo para la detección, y una solución de lavado, y similares. La cantidad de anticuerpo unida al antígeno puede medirse utilizando preferentemente un método tal como absorbancia, fluorescencia, luminiscencia, o método RI (radioisótopo). En la medición se utiliza preferentemente un lector de placas de absorbancia, un lector de placas de fluorescencia, un lector de placas de luminiscencia, un contador de centelleo líquido RI, o similar.

[Ejemplos]

De aquí en adelante, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, la presente invención no pretende limitarse a estos ejemplos.

En los siguientes ejemplos, cada operación de ingeniería genética se realizó mediante los métodos descritos en "Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o mediante los métodos descritos en otros manuales experimentales utilizados por los expertos en la técnica o realizados según las instrucciones de los reactivos o kits disponibles en el comercio, a menos que se especifique otra cosa.

(Ejemplo 1) Preparación del vector de expresión

1)-1 Preparación del vector de expresión de ROBO4 humano

1)-1-1 Preparación del vector de expresión de ROBO4 humano de longitud completa

Para preparar un vector de expresión de ROBO4 humano de longitud completa (de aquí en adelante, denominado "pCI-hROBO4"), ADNc de ROBO4 humano se escindió con EcoRV y NotI de un plásmido (fabricado por Open Biosystems) que comprendía ADNc de ROBO4 humano (N. ° de registro BC039602) y se incorporó entre EcoRV y NotI de un vector pCI (fabricado por Promega Corp.). En la SEQ ID NO: 1 se muestra la secuencia del gen ROBO4 humano clonado en este vector. Asimismo, en la SEQ ID NO: 2 se muestra la secuencia de aminoácidos de ROBO4 humano.

1)-1-2 Preparación del vector de expresión de la región extracelular de ROBO4 humano

ADNc que codifica un polipéptido de la región extracelular de ROBO4 humano (que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 1 a 461 de la SEQ ID NO: 2; de aquí en adelante, abreviado como "ROBO4 humano-ECD"), se amplificó mediante reacción de PCR utilizando un conjunto de cebadores:

cebador 1F (directo): 5'-aaaggtaccaccatgggctctggaggagacagcctcctg-3' y

cebador 1R (directo): 5'-aaagatatcctgctccagggtccagggaccatgctcact-3'

El producto de PCR obtenido se clonó en un vector pEF6/V5-His-TOPO (fabricado por Life Technologies Corp.) (de aquí en adelante, el vector resultante se abrevia como "pEF6-ROBO4-ECD"; de aquí en adelante, una proteína recombinante expresada por "pEF6-ROBO4-ECD" se denomina "rROBO4-ECD").

1)-1-3 Preparación de vectores de expresión de la variante por deleción de la región/dominio extracelular de ROBO4 humano de longitud completa y de ROBO4 humano con etiqueta FLAG en el extremo N terminal

Para construir vectores para la expresión de una proteína que comprende una región que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 28 a 1007 de la SEQ ID NO: 2 de ROBO4 humano (en el diagrama, esta región se denomina "hROBO4-28 "), una región que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 46 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROBO4-46"), una región que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 132 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROBO4-132"), una región que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 210 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROBO4-210"), una región que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N ° 225 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROBO4-225"), o una región que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 341 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROBO4-341") con el extremo N etiquetado con FLAG, se realizó una reacción de PCR con pCI-hROBO4 utilizando como molde cada conjunto de cebadores:

conjunto de cebadores para la amplificación de hROBO4-28:

cebador 2F: 5'-ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcctcggcggcagaggttccctgcctctgctgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaagg atgacgacgataagcaggactccccgccccagatcctagtccac-3' y cebador 2R: 5'-gctagcggagtaatctacaggagaagcaccagccttg-3',

conjunto de cebadores para la amplificación de hROBO4-46:

cebador 3F: 5'-ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcctcggcggcagaggttccctgcctctgctgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatga cgacgataagcctggccctgccaggatgagctgccaag-3' y el cebador 2R conjunto de cebadores para la amplificación de hROBO4-132:

cebador 4F: 5'-ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcctcggcggcagaggttccctgcctctgctgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatga cgacgataaggtggctgtcctccgggaggatttccagatc-3' y el cebador 2R, conjunto de cebadores para la amplificación de hROBO4-210:

cebador 5F: 5'-ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcctcggcggcagaggttccctgcctctgctgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatga cgacgataagaccaacagcgcaggacatagggagagcc-3' y el cebador 2R, conjunto de cebadores para la amplificación de hROBO4-225:

cebador 6F (directo): 5'-ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcctcggcggcagaggttccctgcctctgctgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatga cgacgataagatccaggagccccaggactacacggagcc-3' y el cebador 2R, conjunto de cebadores para la amplificación de hROBO4-341:

cebador 7F: 5'-ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcctcggcggcagaggttccctgcctctgctgctcctgctcatcatgggag gcatggctgattacaaggatgacgacgataagaggctgccggaaaaagtgcccagtgcccca-3' y el cebador 2R. El producto de PCR obtenido se incorporó en un vector pCR4Blunt-TOPO (fabricado por Life Technologies Corp.) para preparar un vector de clonación. De cada vector de clonación, el ADNc correspondiente se escindió con KpnI y NheI y se incorporó entre KpnI y NheI de un vector pCI para preparar un vector de expresión de ROBO4 humano de longitud completa con etiqueta FLAG en el extremo N terminal y cuatro vectores de expresión de variantes por deleción de la región/dominio extracelular de ROBO4 humano. El vector ROBO4 humano de longitud completa con etiqueta FLAG en el extremo N terminal consta de un nucleótido que codifica la secuencia señal de ROBO4 (aminoácidos N.° 1 a 27 de la SEQ ID NO: 2) secuencia FLAG (DYKDDDDK) ROBO4 (aminoácidos de los aminoácidos N.° 28 a 1007 de la SEQ ID NO: 2) desde el extremo N terminal. De aquí en adelante, el vector para la expresión de ROBO4 humano de longitud completa con etiqueta FLAG en el extremo N terminal se denomina "pCI-FLAG-hROBO4-28". De los vectores de expresión de la variante por deleción de la región/dominio extracelular de ROBO4 humano, por ejemplo, el vector para la expresión de ROBO4 que consta de los aminoácidos N.° 46 a 1007 de la SEQ ID NO: 2 consta de un nucleótido que codifica la secuencia señal de ROBO4 (aminoácidos del aminoácido N.° 1 a 27 de la SEQ ID NO: 2) Secuencia FLAG (DYKDDDDK) ROBO4 con deleción de la región extracelular (aminoácidos del aminoácido N.° 46 a 1007 de la SEQ ID NO: 2). Este vector se denomina "pCI-hROBO4-46". Del mismo modo, los vectores que codifican ROBO4 que tienen una deleción parcial en la región extracelular de ROBO4 se denominan "pCI-hROBO4-132", "pCI-hROBO4-210", "pCI-hROBO4-225" y "pCI-hROBO4-341", respectivamente.

En las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11 o 13, se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de ROBO4 humano de longitud completa con etiqueta FLAG o cada variante por deleción de la región/dominio extracelular de ROBO4 humano clonado en el vector. Asimismo, en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12 o 14, se muestra la secuencia de aminoácidos de ROBO4 humano de longitud completa con etiqueta FLAG correspondiente o la variante por deleción de la región/dominio extracelular de ROBO4 humano.

1)-1-4 Preparación del vector de expresión de la variante de deleción de la región intracelular de ROBO4 humano

Para de construir un vector para la expresión de una proteína que comprende una región que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 1 a 511 de la SEQ ID NO: 2 de ROBO4 humano (de aquí en adelante, esta región se denomina "hROBO4- AC "), se insertó un codón de terminación inmediatamente después de un codón que codifica el aminoácido número 511 de ROBO4 humano con pCI-hROBO4 utilizando como molde un conjunto de cebadores para hROBO4-AC:

cebador 8F: 5'-cagatataccagtgaggatgcctgaatcctaaaacacaggatggatc-3' y

cebador 8R: 5'-gatccatcctgtgttttaggattcaggcatcctcactggtatatctg-3',

y el kit de mutagénesis dirigida QuikChange XL (fabricado por Agilent Technologies, Inc.) para preparar un vector de expresión hROBO4-AC (de aquí en adelante, denominado "pCI-hROBO4-AC").

1)-2 Preparación del vector de expresión de ROBO4 de ratón

La reacción de PCR se realizó con ADNc de corazón de ratón de QUICK-Clone (fabricado por Takara Bio Inc.) utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 9F: 5'-ggtaccgccatgggacaaggagaggagccgagagcagccatg-3' y

cebador 9R: 5'-gcggccgcggaggaatcaccagccttgggcacagcaccag-3'

El producto de PCR obtenido se incorporó en un vector pCR-Blunt II-TOPO (fabricado por Life Technologies Corp.) para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de ROBO4 de ratón. Del vector de clonación, el ADNc de ROBO4 de ratón se escindió con KpnI y NotI y se incorporó entre KpnI y NotI de un vector pCI para preparar un vector de expresión de ROBO4 de ratón (de aquí en adelante, denominado "pCI-mROBO4"). En los nucleótidos N.° 7 a 3051 de la SEQ ID NO: 15, se muestra la secuencia de un sitio de ORF (siglas de open reading frame, marco abierto de lectura) en el gen ROBO4 de ratón clonado en este vector. Asimismo, en la SEQ ID NO:16 se muestra la secuencia de aminoácidos de ROBO4 de ratón.

1)-3 Preparación del vector de expresión de ROBO4 de rata

La reacción de PCR se realizó con ADNc de bazo de rata de QUICK-Clone (fabricado por Takara Bio Inc.) utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 10F: 5'-ggtaccgccatgggacaaggagaggagctgagagcagcc-3' y

cebador 10R: 5'-gcggccgcggaggaatcaccagccttgggcacaacacc-3'

El producto de PCR obtenido se incorporó en un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de ROBO4 de rata.

Del vector de clonación, el ADNc de ROBO4 de rata se escindió con Kpnl y NotI y se incorporó entre Kpnl y NotI de un vector pCI para preparar un vector de expresión de ROBO4 de rata (de aquí en adelante, denominado "pCI-raROBO4"). En la s Eq ID NO: 17 se muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc de ROBO4 de rata. En la Se Q ID NO: 18 se muestra la secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótidos.

1)-4 Preparación del vector de expresión de ROBO4 de mono cinomolgo con etiqueta con FLAG en extremo N terminal

La reacción de PCR se realizó con ADNc sintetizado a partir de ARN total de riñón de mono cinomolgo utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 11F: 5'-ggtaccgccatgggctctggaggagaaagcctccggg-3' y

cebador 11R: 5'-ggagtaatctacaggagaagcaccagccttg-3'

El producto de PCR obtenido se incorporó en un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar dos tipos de vectores de clonación que comprendían, cada uno de ellos, ADNc de ROBO4 de mono cinomolgo (de aquí en adelante, denominado cinoROBO4-1 o cinoROBO4-2) (de aquí en adelante, estos vectores se denominan pCR- cinoROBO4-1 y pCR-cinoROBO4-2, respectivamente).

A continuación, la reacción de PCR se realizó con pCR-cinoROBO4-1 o pCR-cinoROBO4-2 utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 12F: 5'-ggatccgccatgggctctggaggagaaagcctccg-3' y

cebador 12R: 5'-gcggccgctcaggagtaatctacaggagaagcaccagccttg-3'

El producto de PCR obtenido se incorporó en un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar un vector de clonación que comprende cada ADNc de ROBO4 de mono cinomolgo. Del vector de clonación, el ADNc correspondiente de ROBO4 de mono cinomolgo se escindió con BamHI y NotI y se incorporó entre BamHI y NotI de un vector pCI para preparar dos tipos de vectores de expresión de ROBO4 de mono cinomolgo (de aquí en adelante, denominados pCI-cinoROBO4-1 y pCI-cinoROBO4-2, respectivamente).

A continuación, la reacción de PCR se realizó con pCI-cinoROBO4-1 o pCI-cinoROBO4-2 utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 13F: 5'-ggtaccgccatgggctctggaggagaaagcctccgaggctcccgggcttcccggcctctgctgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatgacga cgataagcaggactccccgccccagatcctagtccac-3' y el cebador 12R.

El producto de PCR obtenido se incorporó en un vector pCR-TOPO (fabricado por Life Technologies Corp.) para preparar cada vector de clonación que comprende el ADNc de ROBO4 de mono cinomolgo con etiqueta FLAg en el extremo N terminal. Del vector de clonación, el ADNc correspondiente de ROBO4 de mono cinomolgo se escindió con KpnI y NotI y se incorporó entre KpnI y NotI de un vector pCI para preparar vectores de expresión de ROBO4 de mono cinolmolgo con etiqueta FLAG en el extremo N terminal (de aquí en adelante denominados "pCI-FLAG-cinoROBO4-1" y "pCI-FLAG-cinoROBO4-2", respectivamente). La secuencia de nucleótidos de ADNc de ROBO4 de mono cinomolgo clonada en cada uno de pCI-FLAG-cinoROBO4-1 y pCI-FLAG-cinoROBO4-2 se muestra en las SEQ ID NO: 19 y 21, respectivamente. La secuencia de aminoácidos codificada por cada secuencia de nucleótidos se muestra en las SEQ ID NO: 20 y 22, respectivamente.

1)-5 Preparación del vector de expresión ROBO1 humano con etiqueta FLAG en el extremo N terminal

La reacción de PCR se realizó con ADNc de corazón humano de QUICK-Clone (fabricado por Takara Bio Inc.) utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 13F: 5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcaccatgattgcggagcccgctcacttttacctg-3' y

cebador 13R: 5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgctttcagtttcctctaattcttc-3'

El producto de PCR obtenido y un vector pDONR221 (fabricado por Life Technologies Corp.) se sometieron a reacción de BP para preparar un vector donador que comprende ADNc de ROBO1 humano.

A continuación, la reacción de PCR se realizó con el vector donador utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 14F: 5'-gcggccgcatgattgcggagcccgctcacttttacctgtttggattaatatgtctctgttcaggctcccgtcttgattacaaggatgacgacgataagcgtcaggaagatttt ccacctcgcattgttg-3' y

cebador 14R: 5'-gctagctcagctttcagtttcctctaattcttc-3'

El producto de PCR obtenido se incorporó en un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de ROBO1 humano con etiqueta FLAG en el extremo N terminal.

Del vector de clonación, el ADNc de ROBO1 humano con etiqueta FLAG en el extremo N terminal se escindió con Nhel y NotI y se incorporó entre NheI y NotI de un vector pCI para preparar un vector de expresión (de aquí en adelante, denominado "pCI-FLAG-hROBO1"). En la SEQ ID NO: 23 se muestra la secuencia de nucleótidos del a Dnc de ROBO1 humano con etiqueta FLAG en el extremo N-terminal. En la SEQ ID NO: 24 se muestra la secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótidos.

1)-6 Preparación de vector de expresión de ROBO2 humano

La reacción de PCR se realizó con ADNc de pulmón humano de QUICK-Clone (fabricado por Takara Bio Inc.) utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 15F: 5'-gcggccgcatgagtctgctgatgtttacacaactactg-3' y

cebador 15R: 5'-gctagcctataattcacctgtaaactgtccttgactgttg-3'

El producto de PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de ROBO2 humano. Del vector de clonación, el ADNc de ROBO2 humano se escindió con NotI y NheI y se incorporó entre NotI y NheI de un vector pCI para preparar un vector de expresión (de aquí en adelante, denominado "pCI-hROBO2"). En la SEQ ID NO: 25 se muestra la secuencia de nucleótidos del a Dnc de ROBO2 humano. En la SEQ ID NO: 26 se muestra la secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótidos.

1) -7 Preparación de vector de expresión de ROBO3 humano

La reacción de PCR se realizó con ROBO3/pENTR223.1 humano (fabricado por Open Biosystems) utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 16F: 5'-gcggccgcatgctgcgctacctgctgaaaacgctgctg-3' y

cebador 16R: 5'-gctagctcatcttggttcctctcggcgtttctgtcc-3'

El producto de PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de ROBO3 humano. Del vector de clonación, el ADNc de ROBO3 humano se escindió con NotI y NheI y se incorporó entre NotI y NheI de un vector pCI para preparar un vector de expresión (de aquí en adelante, denominado "pCI-hROBO3"). En los nucleótidos N.° 35 a 4192 de la SEQ ID NO: 27 se muestra la secuencia de un sitio de ORF en el gen ROBO3 humano clonado en este vector. Asimismo, en la SEQ ID NO: 28 se muestra la secuencia de aminoácidos de ROBO3 humano.

(Ejemplo 2) Preparación de anticuerpo monoclonal

2) -1 Preparación de proteína antigénica

Para expresar rROBO4-ECD, Células FreeStyle 293-F (fabricadas por Life Technologies Corp.) se transfectaron con pEF6-ROBO4-ECD utilizando 293fectin (fabricado por Life Technologies Corp.) y se cultivaron a 37 °C durante 6 días con CO2 al 8 %. Después de finalizar el cultivo, la solución de cultivo se recogió por centrifugación y se utilizó como reserva de purificación de rROBO4-ECD. El sobrenadante de cultivo obtenido se dializó frente a Tris-HCl 20 mM, a un pH de 7,5 utilizando un tubo de diálisis que tenía un límite de peso molecular de 15000, se filtró a través de un filtro (0,45 |jm) y después se añadió a HiTrap 16/10 Q XL (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Crop.) equilibrado con Tris- HCl 20 mM, pH 7,5. La elución se realizó con un gradiente de NaCl (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5/NaCl 0,2 M, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5/NaCl 1 M). Una parte de la fracción de elución se separó mediante electroforesis con gel de poliacrilamida en presencia de SDS (de aquí en adelante, "SDS-PAGE"). Después, el gel se sometió a tinción con azul brillante de Coomassie (de aquí en adelante, "tinción CBB, por las sigas Coomassie Brilliant Blue") y se detectó mediante transferencia Western para confirmar una fracción que contenía rROBO4-ECD. A continuación, la fracción que contenía rROBO4-ECD se recuperó y se añadió a HiLoad 16/60 Superdex 75 pg (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Crop.) equilibrado con PBS. Después de la elución con PBS, una parte de la fracción de elución se separó mediante SDS-PAGE. Después, el gel se sometió a tinción con CBB y a detección mediante transferencia Western para confirmar una fracción que contenía rROBO4-ECD. La fracción que contenía rROBO4-ECD se recuperó y se utilizó como un antígeno para la inmunización y como un antígeno para el ensayo de afinidad de unión. La concentración de proteína se midió utilizando el reactivo de ensayo de proteínas de BCA (fabricado por Pierce Biotechnology, Inc.).

2)-2 Inmunización

Se utilizaron ratones BALB/c de seis semanas de vida. El día 0, a cada ratón se le administró por vía hipodérmica o intradérmica 50 jg de una mezcla de rROBO4-ECD y un adyuvante completo de Freund. Los días 7, 14 y 21, los ratones recibieron 50 jg de una mezcla de rROBO4-ECD y un adyuvante incompleto de Freund por vía hipodérmica o intradérmica. El día 38, los ratones recibieron 50 jg de rROBO4-ECD por vía intraperitoneal. El día 42, se extrajo el ganglio linfático o el bazo de los ratones y se utilizaron en la preparación de hibridomas.

2)-3 Preparación de hibridomas

Las células de los ganglios linfáticos o los esplenocitos y las células SP2/0-ag14 de mieloma de ratón, se fusionaron eléctricamente utilizando el Sistema de Producción de Hibridoma Hybrimune (fabricado por Cyto Pulse Sciences, Inc.), se diluyeron con medio de selección D de ClonaCell-HY (fabricado por StemCell Technologies Inc. ) y se cultivaron. Las colonias de hibridomas que aparecieron se recogieron para preparar hibridomas monoclonales. Cada colonia de hibridoma recogida se cultivó y el sobrenadante de cultivo de hibridoma obtenido se examinó en busca de hibridomas productores de anticuerpos anti-ROBO4.

2)-4 Reconocimiento de anticuerpos

2)-4-1 Preparación de células que expresan genes antigénicos mediante ensayo de ELISA basado en células

Células HEK293 se ajustaron a 7,5 x 105 células/ml en un medio DMEM que contenía FBS al 10 %. Las células se transfectaron con pCI-hROBO4 o con un pCI-falso como control negativo utilizando Lipofectamine 2000 (fabricado por Life Technologies Corp.), dispensado a una concentración de 50 pl/pocillo en una placa de zona media de 96 pocillos (fabricada por Corning Inc.) y se cultivó durante la noche en medio DMEM que contenía FBS al 10 % a una temperatura de 37 °C con CO2 al 5 %. Las células transfectadas obtenidas se utilizaron en el ensayo de ELISA basado en células con dichas células adheridas entre sí.

2)-4-2 Preparación de células que expresan genes antigénicos por análisis de citometría de flujo

En un matraz de 225 cm2 (fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) se inocularon células HEK293T a una concentración de 1,125 x 107 células/matraz y se cultivaron durante la noche en un medio DMEM que contenía FBS al 10 % a una temperatura de 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células HEK293T se transfectaron con pCI-ROBO4 o con un pCI-falso como control negativo utilizando Lipofectamine 2000 y se cultivaron adicionalmente durante la noche a 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células HEK293T transfectadas con el vector de expresión se trataron con TrypLE Express (fabricado por Life Technologies Corp.), se lavaron con DMEM que contenía f Bs al 10 % y después se suspendieron en PBS que contenía FBS al 5 %. La suspensión celular obtenida se utilizó en el análisis de citometría de flujo.

2)-5 ELISA basado en células

Después de retirar un sobrenadante de las células HEK293 transfectadas con vector de expresión preparadas en el apartado 2)-4-1, el sobrenadante del cultivo del hibridoma se añadió a cada una de las células HEK293 transfectadas con pCI-hROBO4 y pCI-falso, y las células se dejaron en reposo durante 1 hora a una temperatura de 4 °C. Las células de cada pocillo se lavaron una vez con PBS que contenía FBS al 5 %. Después, a estas células se añadió anticuerpo anti IgG de ratón conjugado con peroxidasa producido en cabra (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.) diluido 500 veces con PBS que contenía FBS al 5 % y se dejaron en reposo durante 1 hora a una temperatura de 4 °C. Las células de cada pocillo se lavaron 5 veces con PBS que contenía FBS al 5 %. Después, a estas células se añadió una solución colorante de OPD (dihidrocloruro de o-fenilendiamina (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y H2O2 disuelto a concentraciones de 0,4 mg/ml y 0,6 % (v/v), respectivamente, en una solución de disolución de OPD (citrato trisódico 0,05 M, dodecahidrato de hidrógeno fosfato disódico 0,1 M, pH 4,5)) a una concentración de 25 pl/pocillo. La reacción de color se realizó con agitación intermitente y se detuvo añadiendo HCl 1 M a una concentración de 25 pl/pocillo. Después, se midió la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de placas (ENVISION; fabricado por Perkin Elmer, Inc.). Para seleccionar hibridomas productores de un anticuerpo que se une específicamente a ROBO4 expresado en la superficie de la membrana celular, en los sobrenadantes de cultivo, los hibridomas que presentaban mayor absorbancia en las células HEK293 transfectadas con pCI-hROBO4 en comparación con las células HEK293 transfectadas con pCI-falso como control negativo, se seleccionaron como hibridomas positivos de producción de anticuerpos anti-ROBO4.

2)-6 Análisis por citometría de flujo

Mediante citometría de flujo, se confirmó además, que el anticuerpo producido por cada hibridoma determinado como positivo en el apartado 2)-5 de ELISA basado en células, se unía a ROBO4. La suspensión de células HEK293T preparada en el apartado 2)-4-2 se centrifugó. Después de retirar el sobrenadante, el sobrenadante del cultivo del hibridoma se añadió a cada una de las células transfectadas con pCI-hROBO4 y a las células transfectadas con pCI-falso, y la suspensión resultante se dejó en reposo durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con PBS que contenía FBS al 5 %. Después, a estas células se añadió anti-IgG de ratón conjugado con FITC (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.) diluido 1000 veces con PBS que contenía FBS al 5 % anti-IgG de rata conjugado con FITC (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.) diluido 320 veces con PBS que contenía FBS al 5 %, y la suspensión resultante se dejó en reposo durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía FBS al 5 %, después, se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 5 % y 7-aminoactinomicina D 2 pg/ml (fabricada por Molecular Probes), y se sometieron a detección utilizando un citómetro de flujo (FC500; fabricado por Beckman Coulter, Inc.). Los datos se analizaron utilizando Flowjo (fabricado por TreeStar Inc.). Las células muertas positivas a 7-aminoactinomicina D, se excluyeron por selección y se preparó el histograma de intensidad de fluorescencia de FITC para las células vivas. Los hibridomas que producen una muestra en la que el histograma de las células HEK293T transfectadas con pCI-ROBO4 se desplaza a una región de intensidad de fluorescencia más fuerte en comparación con el histograma de las células 293T transfectadas con pCI-falso como control negativo, se obtuvieron como hibridomas productores de anticuerpos anti-ROBO4. Los anticuerpos anti-ROBO4 producidos por los hibridomas obtenidos se denominaron como MAb1, MAb2, MAb3 e MAb4, respectivamente.

2)-7 Isotipado de anticuerpos monoclonales

El isotipo de cada anticuerpo monoclonal se determinó utilizando el kit de isotipado monoclonal de ratón o el kit de isotipado monoclonal de rata (fabricado por AbD Serotec). Los resultados fueron IgG1 (MAb1 y MAb2) e IgG2b (MAb3 y MAb4).

2) -8 Preparación de anticuerpos monoclonales

Cada anticuerpo monoclonal se purificó de un sobrenadante de cultivo de hibridoma (de aquí en adelante, denominado "reserva de purificación de anticuerpos").

La reserva de purificación de anticuerpos se preparó de la siguiente manera: en un matraz de 1272 cm2 (fabricado por Corning Inc.) se inocularon de 8 a 9 x 107 hibridomas y se cultivaron en un medio de hibridoma SFM (fabricado por Life Technologies Corp.) que contenía suero bovino fetal Ultra-LoW IgG al 20 % a 37 °C durante 4 días con CO2 al 5 % y después se recuperó el sobrenadante.

El anticuerpo se purificó utilizando HP con proteína G de Hitrap o MabSelect SuRe (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Crop.). Para HP con proteína G de Hitrap, la reserva de purificación de anticuerpos se añadió a una columna y se lavó con un tampón de unión (fosfato de sodio 0,02 M, pH 7,0), seguido de elución con glicina 0,1 M, pH 2,7. Por el contrario, para Hitrap MabSeleccione SuRe, la reserva de purificación de anticuerpos se añadió a una columna y se lavó con PBS, seguido de elución con arginina-HCl 2 M, pH 4,0. La solución de anticuerpo eluída se neutralizó y después, el tampón se reemplazó por PBS. La concentración del anticuerpo purificado con HP con proteína G de Hitrap, se midió utilizando el reactivo de ensayo de proteínas de BCA. Como patrón para una curva de calibración, se utilizó IgG2a de ratón (fabricado por R&D systems, Inc.). Como alternativa, la concentración del anticuerpo purificado con Hitrap MabSelect SuRe se determinó midiendo la absorbancia (D.O. 280 nm) en un eluato del anticuerpo unido a una columna PEEK de 20 pm de POROS G, 4,6 mm x 50 mm, 0,83 ml (fabricada por Applied Biosystems, Inc.). Específicamente, la muestra de anticuerpo diluida con PBS se añadió a POROS G 20 pm equilibrada con un tampón de equilibrado (dodecahidrato de dihidrógeno fosfato de sodio 30,6 mM, fosfato monopotásico 19,5 mM, NaCl 0 ,l5 M, pH 7,0). La columna se lavó con un tampón de equilibrio y después, un anticuerpo unido a la columna se eluyó con un eluyente (HCl al 0,1 % (v/v), NaCl 0,15 M). Se midió el área del pico de absorbancia (D.O. 280 nm) en el eluato y la concentración se calculó según la siguiente ecuación: concentración de la muestra del anticuerpo (mg/ml) = (área del pico de la muestra del anticuerpo) / (área del pico del patrón (IgG 1 humana)) x concentración del patrón (mg/ml) x relación de dilución de la muestra.

(Ejemplo 3) Detección de la activación de la señal de ROBO4 en sentido descendente

3) -1 Preparación de un vector indicador que comprende la región del promotor de interleucina-8 (IL-8) como elemento de respuesta

La reacción de PCR se realizó con ADN de la región del promotor de IL-8 utilizando como molde un conjunto de cebadores:

cebador 17F: 5'-ggtaccgataaggaacaaataggaag-3' y

cebador 17R: 5'-gagctcagcttgtgtgctctgctgtc-3'

El producto de PCR obtenido se incorporó en un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar un vector de clonación que comprende ADN de la región del promotor de IL-8 (-253 a -59). Del vector de clonación, el ADN de la región del promotor de IL-8 (-253 a -59) se escindió con KpnI y SacI y se incorporó entre KpnI y SacI de un vector pGL4.15 (fabricado por Promega Corp.) para preparar un vector indicador que comprende la región del promotor de IL-8 como elemento de respuesta. En la s Eq ID NO: 29 se muestra la secuencia de nucleótidos del ADN de la región del promotor de IL-8 (-253 a -59).

3)-2 Vector indicador que comprende, como elementos de respuesta, el factor nuclear-KB (NF-kB), la secuencia de activación de interferón gamma (GAS), el elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE) y el factor de linfocitos T (TCF, T cell factor) de grado de transfección

Como vectores indicadores, se utilizaron, el Vector pGL4.32[luc2P/NF-KB-RE/Higro (fabricado por Promega Corp.), el Vector pGAS-TA-Luc (fabricado por Takara Bio Inc.), el Vector pISRE-TA-Luc (fabricado por Takara Bio Inc.) y TOPflash (fabricado por Millipore Corp.), respectivamente, que comprendían, como elementos de respuesta, NF-KB, GAS, ISRE o TCF. Como alternativa, como control negativo se utilizó el vector pTA-Luc sin secuencia de respuesta (fabricado por Takara Bio Inc.). Como control interno se utilizó el vector pRL-TK (fabricado por Takara Bio Inc.).

3) -3 Análisis de variación de señal en células que expresaban de manera transitoria ROBO4 humano

En una placa de 96 pocillos (revestida con colágeno I; fabricada por Asahi Glass Co., Ltd.) se inocularon células HEK293 a una concentración de 2 x 104 células/pocillo y se cultivaron durante la noche en medio DMEM que contenía FBS al 10 % a una temperatura de 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células HEK293 se transfectaron con pCI-ROBO4, pCI-ROBO4-AC, o con un pCI-falso como control negativo y con cada uno de los vectores indicadores mostrados en los apartados 3)-1 y 3)-2 utilizando reactivo de transfección FuGene6, y se cultivaron durante la noche a 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las actividades de luciferasa de luciérnaga y de luciferasa de Renilla de cada pocillo se determinaron como intensidad de luminiscencia en un lector de placa (Mithras; fabricado por Berthold Technologies GmbH & Co, KG) utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (fabricado por Promega Corp.), y la actividad indicadora de cada pocillo se calculó según la siguiente ecuación: actividad indicadora = intensidad de luminiscencia derivada de la actividad de luciferasa de luciérnaga/Intensidad de luminiscencia derivada de la actividad de luciferasa de Renilla. Como resultado, solo aumentó la actividad del promotor de IL-8 en las células transfectadas con pCI-hROBO4 en comparación con las células transfectadas con pCI-falso como control negativo (Figura 1). Por otra parte, este aumento en la actividad del promotor IL-8 detectada en las células transfectadas con pCI-hROBO4, se atenuó drásticamente en las células transfectadas con pCI-hROBO4-AC (mutante por deleción de la región intracelular de hROBO4), demostrando que el aumento detectado en la actividad del promotor de IL-8 en las células transfectadas con pCI-hROBO4 requiere la región intracelular de ROBO4 (Figura 2). Por consiguiente, el aumento en la actividad del promotor de IL-8 en las células transfectadas con pCI-hROBO4 demostró que se detectó la activación de la señal de ROBO4 en sentido descendente.

(Ejemplo 4) Propiedades de MAb1

4) -1 Activación de la señal de ROBO4 en sentido descendente por MAb1

Las células transfectadas con pCI-hROBO4 o las células transfectadas con pCI-falso, preparadas en el apartado 3)-3, se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, cada anticuerpo anti-ROBO4 (MAb1, MAb2, MAb3 o MAb4) o una IgG1 de ratón de control negativo (fabricada por R&D systems, Inc.) se añadió a estas células a concentraciones de 0, 0,3125, 1,25, 5 y 20 pg/ml o de 0, 0,25, 1,4 y 16 pg/ml, y las células se cultivaron durante 5 horas a 37° C con CO2 al 5 %. Después, las actividades de luciferasa de luciérnaga y de luciferasa de Renilla de cada pocillo, se determinaron como intensidad de luminiscencia en un lector de placas (Mithras) utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (fabricado por Promega Corp.), y la actividad indicadora de cada pocillo se calculó según la siguiente ecuación: Actividad indicadora = Intensidad de luminiscencia derivada de la actividad de luciferasa de luciérnaga/Intensidad de luminiscencia derivada de la actividad de luciferasa de Renilla. Como resultado, la IgG de ratón de control negativo no influyó en la actividad del promotor de IL-8 en células que expresaban de manera transitoria ROBO4 humano, mientras que el MAb1 aumentó la actividad del promotor de IL-8 (figura 3). Al igual que MAb1, MAb2 también aumentó la actividad del promotor de IL-8, mientras que MAb3 o MAb4 no aumentaron la actividad del promotor de IL-8 (figura 4). En las células con pCI falso, ninguno de MAb1 o MAb2 aumentó la actividad del promotor de IL-8. Estos resultados demostraron que MAb1 activó la señal de ROBO4 en sentido descendente y que no todos los anticuerpos contra ROBO4 activaban la señal de ROBO4 en sentido descendente.

MAb3 y MAb4, que se confirmó que no aumentaban la actividad de la señal de ROBO4 en sentido descendente, se evaluaron para determinar la actividad del promotor en presencia de anticuerpos de entrecruzamiento (fragmento Fc específico de cabra anti-IgG de ratón de AffiPure, Cat NO. 115-005-071, Jackson ImmunoResearch) (dos moléculas de anticuerpo que se entrecruzan con respecto a una molécula de MAb3 o MAb4). Como resultado, se observó un aumento en la actividad del promotor en ambos anticuerpos.

4)-2 Ensayo de migración de HUVEC

Durante la noche se cultivaron células HUVEC (fabricadas por KURABO INDUSTRIES LTD.) en HuMedia-EB2 (fabricado por KURABO INDUSTRIES LTD.) que contenía BSA al 0,1 % a 37 °C con CO2 al 5 % y después se ajustó a 4 x 105 células/ml con HuMedia-EB2 que contenía BSA al 0,1 %. A la capa superior de una cámara en el sistema de inserción de múltiples pocillos BD Falcon FluoroBlok 24 (tamaño de poro: 8 pm) que tenía una membrana recubierta de gelatina, se añadieron 0,25 ml de la suspensión celular que tenía una concentración de 4 x 105 células/ml. Después, a la capa inferior de la cámara, se añadió HuMedia-EB2 que contenía BSA al 0,1 % y VEGF165 humano (fabricado por PeproTech Inc.) o bFGF humano (BD Biosciences) 10 ng/ml e IgG2a de ratón 2 pg/ml o cada anticuerpo anti-ROBO4 (MAb1, MAb2, MAb3 o MAb4). Después de 2 a 3 horas de incubación a 37 °C con CO2 al 5 %, las HUVEC que migraron a la capa inferior, se tiñeron durante 15 minutos con HuMedia-EB2 que contenía calceína-AM (fabricada por Life Technologies Corp.) 4 pg/ml. Después, la intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación / longitud de onda de fluorescencia: 485 nm/538 nm) de cada pocillo se midió utilizando un lector de placas (Flex-Station; Molecular Devices, LLC.), y se calculó la cantidad de células que migran en cada pocillo según la siguiente ecuación: cantidad de células que migran = intensidad de fluorescencia del pocillo complementado con HUVEC - intensidad de fluorescencia del pocillo no complementado con HUVEC. Como resultado, MAb1 suprimió la migración de HUVEC inducida por VEGF o bFGF (figura 5). Al igual que MAb1, MAb2 también suprimió la migración de HUVEC inducida por bFGF, mientras que MAb3 o MAb4 no suprimieron la migración celular (figura 6). Estos resultados demostraron que el aumento en la actividad del promotor de IL-8 por el anticuerpo anti-ROBO4 se correlacionó con la actividad supresora contra la migración de HUVEC.

4)-3 Reactividad cruzada entre especies

4)-3-1 Preparación de células que expresan genes antigénicos

En una placa de 60 mm (fabricada por Corning Inc.) se inocularon células HEK293 a una concentración de 1,5 x 106 células/placa y se cultivaron durante la noche en medio DMEM que contenía FBS al 10 % a una temperatura de 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células HEK293 se transfectaron con pCI-hROBO4, pCI-mROBO4, pCI-raROBO4, pCI-FLAG-cinoROBO4-1, pCI-FLAG-cinoROBO4-2, pCI-hROBO1, pCI-hROBO2 o pCI-hROBO3, utilizando el reactivo de transfección FuGENE6 y adicionalmente se cultivaron durante la noche a 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células transfectadas con el vector de expresión se trataron con TrypLE Express (fabricado por Life Technologies Corp.), se lavaron con PBS que contenía f Bs al 5 % y después se suspendieron en PBS que contenía FBS al 5 %. La suspensión celular obtenida se utilizó en el análisis de citometría de flujo.

4)-3-2 Análisis de citometría de flujo

Cada suspensión celular preparada en los apartados 4)-3-1 se centrifugó y el sobrenadante se retiró. Después, a 2 x 105 células transfectadas con el vector de expresión, se añadió MAb1 o IgG2a de ratón de control negativo, a una concentración de 10 pg/ml y la suspensión resultante se dejó en reposo durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron una vez con PBS que contenía FBS al 5 %. Después, se añadió anti-IgG de ratón conjugado con FITC diluido 1000 veces con PBS que contenía FBS al 5 %, y la suspensión resultante se dejó en reposo durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía FBS al 5 %, después, se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 5 % y se sometieron a detección utilizando un citómetro de flujo (BD FACS-Calibur). Los datos se analizaron utilizando Flowjo. Se preparó el histograma de intensidad de fluorescencia de FITC. Se determinó que el anticuerpo se unía de manera cruzada entre especies cuando el histograma de MAb1 se desplazaba a una región de intensidad de fluorescencia más fuerte en comparación con el histograma de IgG2a de ratón de control negativo. Los resultados del estudio de reactividad cruzada entre especies demostraron que MAb1 no se unió a ROBO4 de ratón ni a ROBO4 de rata, pero se unió a ROBO4 humano y a ROBO4 de mono cinomolgo (figura 7).

4)-4 Especificidad de unión

4)-4-1 Preparación de células que expresan genes antigénicos

En una placa de 60 mm (fabricada por Corning Inc.) se inocularon células HEK293 a una concentración de 1,2 x 106 células/placa o 1,5 x 106 células/placa y se cultivaron durante la noche en medio DMEM que contenía FBS al 10 % a una temperatura de 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células HEK293 se transfectaron con pCI-hROBO4, pCI-FLAG-hROBO1, pCI-hROBO2 o pCI-hROBO3, utilizando el reactivo de transfección FuGENE6 y adicionalmente se cultivaron durante la noche a 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células transfectadas con el vector de expresión se trataron con TrypLE Express (fabricado por Life Technologies Corp.), se lavaron con PBS que contenía FBS al 5 % y después se suspendieron en PBS que contenía FBS al 5 %. La suspensión celular obtenida se utilizó en el análisis de citometría de flujo.

4)-4-2 Análisis de citometría de flujo

Cada suspensión celular preparada en los apartados 4)-4-1 se centrifugó y el sobrenadante se retiró. Después, a 2 x 105 células transfectadas con el vector de expresión, se añadió MAb1, un anticuerpo ROBO4 humano de control positivo (fabricado por R&D systems, Inc.), un anticuerpo monoclonal ANTI-FLAG m 2 producido en ratón (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.), un anticuerpo ROBO2 humano (fabricado por R&D systems, Inc.), o un anticuerpo monoclonal anti-ROBO3 humano (fabricado por R&D systems, Inc.), o una IgG1 de ratón o IgG2a de ratón como control positivo, a una concentración de 10 pg/ml, y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron una vez con PBS que contenía FBS al 5 %. Después, se añadió anti-IgG de ratón conjugado con FITC diluido 1000 veces con PBS que contenía FBS al 5 %, y la suspensión resultante se dejó en reposo durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía FBS al 5 %, después, se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 5 % y se sometieron a detección utilizando un citómetro de flujo (BD FACS-Calibur). Los datos se analizaron utilizando Flowjo. Se preparó el histograma de intensidad de fluorescencia de FITC. Se determinó que el anticuerpo se unía de una manera específica cuando el histograma de MAb1 se desplazaba a una región de intensidad de fluorescencia más fuerte en comparación con el histograma de IgG1 de ratón o IgG2a de ratón de control negativo. Los resultados demostraron que MAb1 no se unía ni a hROBO1, ni a hROB02 ni a hROBO3 y que se unía específicamente a hROBO4 (figura 8). En este contexto, utilizando el anticuerpo de control positivo (figura 8), se confirmó que, cada uno de hROBO4, hROBO1, hROBO2 y hROBO3, se expresaba en la membrana celular.

4)-5 Determinación epítopos

4)-5-1 Preparación de células que expresan genes antigénicos

En una placa de 60 mm (fabricada por Corning Inc.) se inocularon células HEK293 a una concentración de 1,5 x 106 células/placa y se cultivaron durante la noche en medio DMEM que contenía FBS al 10 % a una temperatura de 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células HEK293 se transfectaron con pCI-FLAG-hROBO4-28, pCI-FLAG-hROBO4-46, pCI-FLAG-hROBO4-132, pCI-FLAG-hROBO4-210, pCI-FLAG-hROBO4-225, pCI-FLAG-hROBO4-341 utilizando el reactivo de transfección FuGENE6 y adicionalmente se cultivaron durante la noche a 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, las células transfectadas con el vector de expresión se trataron con TrypLE Express (fabricado por Life Technologies Corp.), se lavaron con PBS que contenía f Bs al 5 % y después se suspendieron en PBS que contenía FBS al 5 %. La suspensión celular obtenida se utilizó en el análisis de citometría de flujo.

4)-5-2 Análisis de citometría de flujo

Cada suspensión celular preparada en los apartados 4)-5-1 se centrifugó y el sobrenadante se retiró. Después, a 2 x 105 células transfectadas con el vector de expresión, se añadió MAb1, un anticuerpo monoclonal de control positivo ANTI-FLAG M2 producido en ratón, o una IgG2a de ratón de control negativo, a una concentración de 10 pg/ml y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron una vez con PBS que contenía FBS al 5 %. Después, se añadió anti-IgG de ratón conjugado con FITC diluido 1000 veces con PBS que contenía FBS al 5 %, y la suspensión resultante se dejó en reposo durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía FBS al 5 %, después se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 5 % y se sometieron a detección utilizando un citómetro de flujo (BD FACSCalibur; BD Biosciences). Los datos se analizaron utilizando Flowjo. Se preparó el histograma de intensidad de fluorescencia de FITC. Se determinó que el anticuerpo se unía a una célula cuando el histograma de MAb1 se desplazaba a una región de intensidad de fluorescencia más fuerte en comparación con el histograma de IgG2a de ratón de control negativo. Los resultados demostraron que MAb1 se unía a células transfectadas con pCI-FLAG-hROBO4-28-, pCI-FLAG-hROBO4-46- o pCI-FLAG-hROBO4-132 y no se unió a células transfectadas con pCI-FLAG-hROBO4-210-, pCI-FLAG-hROBO4-225- o pCI-FLAG-hROBO4-341. Por tanto, se demostró que MAb1 reconoce la secuencia de aminoácidos de los N.° 132 a 209 en ROBO4 humano mostrada en la SEQ ID NO: 2 (figura 9). En este contexto, se confirmó que cada variante por deleción de la región/dominio intracelular se expresaba en la membrana celular utilizando el anticuerpo de control positivo anti-FLAG (figura 9).

4)-6 Evaluación de la eficacia farmacológica en modelos de monos con neovascularización coroidea inducida por láser 4)-6-1 Anestesia

A cada mono cinomolgo se le inyectó clorhidrato de medetomidina (fabricado por Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) por vía intramuscular a una dosis de 0,04 mg/kg. Quince minutos después, se les inyectó clorhidrato de ketamina (fabricado por Daiichi Sankyo Co., Ltd.) por vía intramuscular a una dosis de 15 mg/kg.

4)-6-2 Preparación del modelo

Cada mono cinomolgo, anestesiado como se indica en el apartado 4)-6-1, se sujetó en una silla para monos. Se aplicaron gotas oculares de xilocaína al 4 % (fabricada por AstraZeneca plc) en los dos ojos para el tratamiento anestésico/analgésico de la superficie ocular. En los ojos se aplicó una mezcla de gotas oculares de tropicamida 5 mg/ml - clorhidrato de fenilefrina 5 mg/ml (fabricada por Santen Pharmaceutical Co., Ltd.) para la midriasis. La región macular de la retina se dañó térmicamente por irradiación con láser (cantidad de calor irradiado: 350-500 mW, tiempo de irradiación: 0,1 segundos, tamaño de mancha: 50 pm, cantidad de manchas: 6 o 9 manchas) utilizando un fotocoagulador con láser verde OcuLight GLx (fabricado por Iridex Corp.).

4)-6-3 Administración de sustancias de ensayo

El día 7 después de la preparación del modelo, se insertó una aguja Nanopass de 33G en el cuerpo vítreo desde la conjuntiva y se inyectaron 50 pl de vehículo o 13,2 mg/ml de MAb1 durante 2 minutos utilizando una jeringa Hamilton de 100 pl a través de un tubo de polietileno PE20. El ensayo se realizó en cada grupo, lo que suponía 4 ojos. Después de finalizar la administración, se aplicaron a los ojos gotas oculares de hidrato de levofloxacino al 0,5 % (fabricado por Santen Pharmaceutical Co., Ltd.).

4)-6-4 Evaluación de la eficacia farmacológica

Los días 7, 14 y 21 después de la preparación del modelo, el fondo de ojo se fotografió con anestia mediante un método habitual utilizando una cámara de fondo de ojo híbrida CX-1 (fabricada por Canon Inc.). Después, se inyectó por vía intravenosa fluoresceína al 10 % a una dosis de 0,1 ml/kg. Después de finalizar la inyección intravenosa de fluoresceína, se realizó una angiografía fluorescente cada 1 minuto hasta 6 minutos más tarde. Los datos de las imágenes se almacenaron y utilizando un analizador de imágenes (WinRoof, fabricado por Mitani Corp.) se calculó el área de un sitio en donde se acumulaba la fluoresceína. La cantidad de vasos sanguíneos recién formados se calculó según la siguiente ecuación: Cantidad de vasos sanguíneos recién formados = Área del sitio en donde se acumula la fluoresceína el día 21 después de la preparación del modelo - Área del sitio en donde se acumula la fluoresceína el día 7 después de la preparación del modelo. Como resultado de la comparación de la cantidad de vasos sanguíneos recién formados entre el grupo al que se le administró con vehículo y el grupo al que se le administró MAb1, se confirmó que, en tres de los cuatro ojos del grupo al que se le administró MAb1, disminuía la cantidad de vasos sanguíneos recién formados, aunque no se confirmó ninguna diferencia en cuanto a la cantidad de vasos sanguíneos recién formados entre el otro ojo y el grupo tratado con vehículo. Esto significa que la administración de MAb1 suprimió la neovascularización coroidea inducida por láser (figura 10).

(Ejemplo 5) Clonación y secuenciación del ADNc de MAb1

5)-1 Determinación de secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas pesada y ligera de MAb1

Para determinar las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas pesada y ligera de MAb1, el MAb1 purificado en el Ejemplo 2)-8 se separó mediante SDS-PAGE. Las proteínas así separadas en el gel se transfirieron del gel a una membrana de PVDF Sequi-Blot (Bio-Rad Laboratories, Inc.), que a su vez se lavó con un tampón de lavado (tampón de NaCl 25 mM, borato de sodio 10 mM, pH 8,0), después se tiñeron sumergiendo durante 5 minutos en una solución de tinción (metanol al 50 %, ácido acético al 20 %, azul brillante de Coomassie al 0,05 %) y después se eliminó el color con metanol al 90 %. Las partes de la banda correspondientes a la cadena pesada (banda con menor movilidad) y a la cadena ligera (banda con mayor movilidad) observadas en la membrana de PVDF, se separaron. Sus respectivas secuencias de aminoácidos N-terminales se identificaron según el método automático de Edman (véase, Edman et al., (1967) Eur. J. Biochem. 1, 80) utilizando el secuenciador de proteínas Procise cLC Modelo 492cLC (Applied Biosystems, Inc.). Como resultado, la secuencia de aminoácidos N-terminal de la banda correspondiente a la cadena pesada de MAb1 fue

EVQLVESGGGLVKPGGSLKL, y

la secuencia de aminoácidos N-terminal de la banda correspondiente a la cadena ligera fue DAVMTQTPLSLPVSL.

5)-2 Preparación de ARNm a partir de hibridoma productor de MAb1

Para clonar los ADNc de MAb1 que codifican la cadena pesada y la cadena ligera, se preparó ARNm a partir del hibridoma productor de MAb1 utilizando un kit de aislamiento de ARNm (Roche Applied Science).

5)-3 Clonación y secuenciación del ADNc de MAb1

Se sintetizaron varios cebadores oligonucleotídicos que hibridaban con la secuencia 5'-terminal de la región codificante del gen del anticuerpo y con la secuencia 3'-terminal que contenía su codón de terminación, respectivamente, con referencia a las secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas pesada y ligera determinadas en función de los isotipos y1 y k de las cadenas pesada y ligera de MAb1, respectivamente (Ejemplos 2)-7) y 5-1), y de la base de datos de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo preparada por Kabat et al. (véase Strausberg, R. L., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 99. 16899-16903, y Kabat, E. A., et al. (1991) en Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. I y II, U.S. Department of Health and Human Services). Los ADNc que codifican la cadena pesada y la cadena ligera se amplificaron utilizando el ARNm preparado en el apartado 5)-2 y el kit de PCR de ARN de una etapa de TaKaRa (AMV) (Takara Bio Inc.). Como resultado, los ADNc del anticuerpo que codifican la cadena pesada y la cadena ligera se amplificaron con éxito utilizando el siguiente conjunto de cebadores:

conjunto de cebadores para la cadena pesada

LYHF6: 5'-cctcaccatgaactttgg-3'

G1EVR1:5'-aagatatcttatttaccaggagagtgggagag-3'

conjunto de cebadores para la cadena ligera

MK19EIF1: 5'-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3'

KEVR1: 5'-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3'

Los ADNc de las cadenas pesada y ligera amplificados por PCR se clonaron por separado utilizando el kit de expresión de TOPO TA pEF6/V5-His (Invitrogen Corp.). Las secuencias de nucleótidos de los ADNc clonados que codifican las regiones variables respectivas de las cadenas pesada y ligera se determinaron utilizando un secuenciador de genes ("ABI PRISM 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems "o" Applied Biosystems 3730xl Analyzer; Applied Biosystems"). La reacción de secuenciación se realizó utilizando GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.).

La secuencia de nucleótidos determinada del ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada de MAb1 se muestra en la SEQ ID NO: 30, y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 31. La secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo MAb1 de ratón se muestra en la SEQ ID NO: 32, y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 33.

(Ejemplo 6) Preparación de MAb1 quimérico (cMAbl)

6)-1 Preparación de los vectores de expresión pCMA-LK, pCMA-G1 y pCMA-G2

6)-1-1 Construcción del vector de expresión pCMA-LK de cadena ligera quimérica y humanizada

Para preparar pcDNA3.3/lK, un plásmido pcDNA3.3-TOPO/lacZ (Invitrogen Corp.), se digirió con las enzimas de restricción XbaI y PmeI, y el fragmento obtenido, de aproximadamente 5,4 kb, se ligó a un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 34) que codificaba una señal secretora de la cadena k humana y una región constante de la cadena k humana, utilizando el kit de clonación de PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.).

La PCR se realizó con pcDNA3.3/lK utilizando, como molde, un conjunto de cebadores mostrado más adelante. El fragmento obtenido, de aproximadamente 3,8 kb, se fosforiló y después se autoligó para construir, a partir de pcDNA3.3/lK, un vector de expresión pCMA-LK de cadena ligera quimérica y humanizada que tenía una secuencia codificante de la secuencia señal, un sitio de clonación y una secuencia que codifica la región constante de la cadena k humana en sentido descendente de un promotor de CMV.

Conjunto de cebadores

3. 3-F1: 5'-tataccgtcgacctctagctagagcttggc-3'

3. 3-R1: 5'-gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-3'

6)-1-2 Construcción del vector de expresión pCMA-G1 de cadena pesada de tipo IgG1 quimérica y humanizada

pCMA-LK se digirió con XbaI y PmeI para eliminar una secuencia que codifica una señal secretora de una cadena k y una región constante de la cadena k humana. El fragmento de ADN resultante se ligó a un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 35) que codificaba los aminoácidos de una secuencia señal de cadena pesada humana y una región constante de IgG1 humana utilizando el kit de clonación de PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión pCMA-G1 de cadena pesada de tipo IgG1 quimérica y humanizada que tenía una secuencia codificante de la secuencia señal, un sitio de clonación, y una secuencia codificante de la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana en sentido descendente de un promotor de CMV.

6)-1-3 Construcción del vector de expresión pCMA-G2 de cadena pesada de tipo IgG2 quimérica y humanizada

pCMA-LK se digirió con XbaI y PmeI para eliminar una secuencia que codifica una señal secretora de una cadena k y una región constante de la cadena k humana. El fragmento de a Dn resultante se ligó a un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 36) que codificaba los aminoácidos de una secuencia de señal de cadena pesada humana y una región constante de IgG2 humana utilizando el kit de clonación de PCR In-Fusion Advantage (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión pCMA-G2 de cadena pesada de tipo IgG2 humanizada que tenía una secuencia codificante de secuencia señal, un sitio de clonación, y una secuencia que codifica la región constante de la cadena pesada de IgG2 humana en sentido descendente de un promotor de CMV.

6)-2 Construcción del vector de expresión de la cadena ligera de MAb1 quimérica

Un sitio que comprende ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera, se amplificó con ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera de MAb1 utilizando como molde KOD-Plus-(TOYOBO CO., LTD.) y un conjunto de cebadores mostrado más adelante, y se insertó en un sitio escindido con la enzima de restricción BsiWI del vector pCMA-LK de propósito general para la expresión de la cadena ligera del anticuerpo quimérico y humanizado utilizando el kit de clonación In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de cadena ligera de MAb1 quimérico. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-LK/MAb1 L". La secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de MAb1 quimérica se muestra en la SEQ ID NO: 37, y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 38. Los nucleótidos N.° 1 a 60 de la SEQ ID NO: 37 representan la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia señal. Los nucleótidos N.° 61 a 402 de la misma representan la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable. Los nucleótidos N.° 403 a 717 de la misma representan la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante. Los aminoácidos N.° 1 a 20 de la SEQ ID NO: 38 representan los aminoácidos de la secuencia señal. Los aminoácidos N.° 21 a 134 representan los aminoácidos de la región variable. Los aminoácidos N.° 135 a 239 representan los aminoácidos de la región constante.

Conjunto de cebadores para la cadena ligera

MAb1 LF: 5'-tctccggcgcgtacggcgatgctgtgatgacccaaactccactctcc-3'

MAb1 LR: 5'-ggagggggcggccacagcccgtttgatttccagcttggtgcctcc-3'

6)-3 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo IgG1 de MAb1 quimérica

Un sitio que comprende ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada se amplificó con ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada de MAb1 utilizando como molde KOD-Plus-(TOYOBO CO., LTD.) y un conjunto de cebadores mostrado más adelante, y se insertó en un sitio escindido con la enzima de restricción BsiWI del vector de expresión pCMA-G1 de cadena pesada de tipo IgG1 quimérico y humanizado utilizando el kit de clonación In-Fusion Advantage p Cr (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de cadena pesada de tipo IgG1 de MAb1 quimérico. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G1/MAb1 H". La secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada quimérica de tipo IgG1 de MAb1 se muestra en la SEQ ID NO: 39, y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 40. Los nucleótidos N.° 1 a 57 de la SEQ ID NO: 39 representan la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia señal. Los nucleótidos N.° 58 a 411 de la misma representan la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable. Los nucleótidos N.° 412 a 1401 de la misma representan la secuencia de nucleótidos que codifica la región constante. Los aminoácidos N.° 1 a 19 de la SEQ ID NO: 40 representan la secuencia de aminoácidos de la secuencia señal. Los aminoácidos N.° 20 a 137 de la misma representan la secuencia de aminoácidos de la región variable. Los aminoácidos N.° 138 a 467 representan la secuencia de aminoácidos de la región constante.

Conjunto de cebadores para la cadena pesada de tipo IgG1

MAb1 HF: 5'-cagatgggtgctgagcgaagtgcagctggtggagtctgggggag-3'

MAb1 H1R: 5'-ttggtggaggctgagctgactgtgagagtggtgccgtggccccag-3'

6) -4 Construcción del vector de expresión de la cadena pesada de tipo IgG2 de MAb1 quimérico

Un sitio que comprende ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada se amplificó con ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada de MAb1 utilizando como molde KOD-Plus-(TOYOBO CO., LTD.) y un conjunto de cebadores mostrado más adelante, y se insertó en un sitio escindido con la enzima de restricción BsiWI del vector de expresión pCMA-G2 de cadena pesada de tipo IgG2 quimérico y humanizado utilizando el kit de clonación In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de cadena pesada de tipo IgG2 de MAb1 quimérico. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G2/MAb1". La secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de tipo IgG2 de MAb1 quimérico se muestra en la SEQ ID NO: 41, y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 42.

Conjunto de cebadores para la cadena pesada de tipo IgG2

MAb1 HF: 5'-cagatgggtgctgagcgaagtgcagctggtggagtctgggggag-3'

MAb1 2R: 5'-ttggtgctggctgagctgactgtgagagtggtgccgtggccccag-3'

(Ejemplo 7) Preparación del anticuerpo MAb1 quimérico de tipo IgG1 y del anticuerpo MAb1 quimérico de tipo IgG2

7) -1 Producción del anticuerpo MAb1 quimérico de tipo IgG1 y del anticuerpo MAb1 quimérico tipo IgG2

Se subcultivaron células FreeStyle 293-F (Invitrogen Corp.) y se cultivaron según el manual. En un matraz Erlenmeyer Fernbach de 3 l (Corning Inc.), se inocularon 1,2 x 109 células de células FreeStyle 293-F (Invitrogen Corp.) en la fase de crecimiento logarítmico, se diluyeron con medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) en 1,0 x 106 células/ml, y después se cultivaron con agitación durante una hora en una incubadora con CO2 al 8 % a 90 rpm a una temperatura de 37° C. 3,6 mg de polietilenimina (Polysciences, Inc., n.° 24765) se disolvieron en 20 ml de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). A continuación, un vector de expresión de cadena H (0,4 mg) y un vector de expresión de cadena L (0,8 mg), preparados utilizando el kit de plásmido PureLink HiPure (Invitrogen Corp.), se suspendieron en 20 ml de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Se añadieron 20 ml de la solución de mezcla de vector de expresión/Opti-Pro SFM a 20 ml de la solución de mezcla de polietilenimina/Opti-Pro SFM, y la mezcla se agitó gradualmente, adicionalmente se dejó durante 5 minutos, y después se añadió a las células FreeStyle 293-F. Las células se cultivaron con agitación durante 7 días en una incubadora a 90 rpm a 37 °C con CO2al 8 % y el sobrenadante de cultivo obtenido se filtró a través de un filtro de cápsula desechable (Advantec, n° CCS-045-E1H).

Los anticuerpos MAb1 quiméricos de tipo IgG1 e IgG2 obtenidos por las combinaciones entre pCMA-G1/MAb1 H y pCMA-LK/MAb1 L y entre pCMA-G2/MAb1 H y pCMA-LK/MAb1 L se abreviaron a "cMAb1-1 "y" cMAb1-2", respectivamente. El término "cMAb1" significa anticuerpos MAb1 quiméricos tanto de tipo IgG1 como de tipo IgG2.

7)-2 Purificación de cMAb1-1 y cMAb1-2

El sobrenadante del cultivo obtenido anteriormente en el apartado 7-1) se purificó por cromatografía de afinidad con rProteína A (a 4-6 °C). Después de la purificación por cromatografía de afinidad con rProteína A a temperatura ambiente, se llevó a cabo una etapa de reemplazo de tampón. En primer lugar, se aplicaron de 1100 a 1200 ml del sobrenadante del cultivo a MabSelect SuRe (fabricado por GE Healthcare BioSciences Crop., columna HiTrap; volumen 1 ml x 2 conectada) equilibrado con PBS. La solución de cultivo completo se colocó en la columna y la columna se lavó con PBS. A continuación, la elución se realizó con una solución de clorhidrato de arginina 2 M (pH 4.0) para recuperar una fracción que contenía anticuerpos. En esta fracción, el tampón se reemplazó por PBS utilizando una columna desalinizadora (fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences Corp., columna desalinizadora de HiTrap; volumen 5 ml x 2 conectada). Por último, la fracción se concentró con el dispositivo de filtro UF centrífugo VIVASPIN20 (límite de peso molecular: 30 K, Sartorius, a 4 °C) en una concentración de IgG de 20,0 mg/ml o mayor y se utilizó como muestra de purificación.

7)-3 Propiedades de cMAb1-1 y cMAb1-2

7)-3-1 Activación de la señal de ROBO4 en sentido descendente

Este ensayo se realizó según el método del apartado 4)-1, excepto que: como control negativo, se utilizó IgG humana (fabricada por Sigma-Aldrich Corp.); y la IgG humana, el cMAb1-1 o el cMAb1-2, se añadieron a una concentración final de 0,313 pg/ml a un medio. Como resultado, la IgG humana como control negativo, no influyó en la actividad del promotor de iL-8 en células que expresaban de manera transitoria ROBO4 humano, mientras que el cMAb1-1 y el cMAb1-2 aumentaron la actividad del promotor de IL-8 (Figura 11). Estos resultados demostraron que el cMAb1-1 o el cMAb1-2 activaron la señal de ROBO4 en sentido descendente, como ocurría con MAb1.

7) -3-2 Ensayo de migración de HUVEC

Este ensayo se realizó según el método del apartado 4)-2, excepto que: como control negativo, se utilizó IgG humana; y la IgG humana, el cMAb1-1 o el cMAb1-2, se añadieron a una concentración final de 0,5 pg/ml a un medio. Como resultado, el cMAb1-1 o el cMAb1-2 suprimió la migración de HUVEC inducida por bFGF (Figura 12). Estos resultados demostraron que el cMAb1-1 o el cMAb1-2 suprimieron la migración de HUVEC, como ocurría con MAb1.

(Ejemplo 8) Diseño del anticuerpo humanizado del anticuerpo monoclonal MAb1 anti-ROBO4 humano de ratón

8) -1 Diseño de la versión humanizada de MAb1

8)-1-1 Modelado molecular de la región variable de MAb1

El modelado molecular de las regiones variables de MAb1 se llevó a cabo mediante un método de modelado de homología generalmente conocido (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Las secuencias primarias (disponibles como estructuras tridimensionales inducidas a partir de estructuras cristalinas de rayos X) de regiones variables de inmunoglobulina humana registradas en Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) se compararon con las de las regiones variables de MAb1 así determinadas. Como resultado, debido a su mayor homología de secuencia con la región variable de la cadena pesada de MAb1, se seleccionó el anticuerpo 3FFD entre los anticuerpos con déficit en las región marco. Asimismo, debido a su mayor homología de secuencia con la región variable de la cadena ligera de MAb1, se seleccionó el anticuerpo 1T66. Las estructuras tridimensionales de las regiones marco se prepararon obteniendo un "modelo de región marco" a partir de la combinación de las coordenadas de 3FFD y 1T66 correspondientes a las cadenas pesada y ligera de MAb1. En cuanto a las CDR de MAb1, CDRL1, CDRL2, CDRL3, La CDRH1 y la CDRH2 se asignaron a los grupos 16A, 7A, 9A, 10A y 10B, respectivamente, según la clasificación de Thornton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)). La CDRH3 se clasificó en k(7)B utilizando la norma H3 (FEBS letter 399, 1-8 (1996)). Posteriormente, la conformación típica de cada CDR se incorporó en el modelo de región marco.

Por último, para excluir el contacto interatómico desfavorable se realizó un cálculo de energía para obtener un modelo molecular que probablemente esté en las regiones variables de MAb1 en términos de energía. Estos procedimientos se realizaron utilizando un programa de predicción Prime de estructura tridimensional de proteínas disponible en el comercio, y el programa de búsqueda de coordenadas MacroModel (Schrodinger, LLC).

8)-1-2 Diseño de la secuencia de aminoácidos de MAb1 humanizado

Cada anticuerpo MAb1 humanizado (hMAb1) se construyó mediante un método de injerto de CDR generalmente conocido (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Se seleccionaron dos anticuerpos aceptores diferentes en función de la homología de aminoácidos en regiones marco. Las secuencias de las regiones marco de MAb1 se compararon con todas las regiones marco humanas en la base de datos de secuencias de aminoácidos de anticuerpos de Kabat (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)). Como resultado, se seleccionó un anticuerpo B3 como aceptor debido a su homología de secuencia del 83 % con las regiones marco. Los restos de aminoácidos de las regiones marco de B3 se alinearon con los de MAb1 para identificar las posiciones de los diferentes aminoácidos utilizados. Estas posiciones de los restos se analizaron utilizando el modelo tridimensional de MAb1 construido anteriormente. Después, los restos donadores a injertar en el aceptor se seleccionaron según los criterios dados por Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Algunos restos donadores seleccionados se integraron en el anticuerpo aceptor para construir la secuencia de MAb1 humanizado como se describe más adelante en los ejemplos. Asimismo, las variantes de hMAb1 se construyeron sustituyendo de 1 a 3 restos de aminoácido en cada CDR de hMAb1 por otros restos de aminoácido, como se describe más adelanta en los ejemplos.

8)-2 Humanización de la cadena pesada de cMAb1

8)-2-1 cadena pesada de tipo hMAb1-H1:

Una cadena pesada de MAb1 humanizada, diseñada reemplazando el aminoácido N.° 32 (lisina) por glutamina, el aminoácido N.° 38 (lisina) por arginina, el aminoácido N.° 59 (treonina) por alanina, el aminoácido N.° 61 (ácido glutámico) por glicina, el aminoácido N.° 63 (arginina) por glicina, el aminoácido N.° 95 (ácido glutámico) por lisina, el aminoácido N.° 103 (serina) por asparagina, el aminoácido N.° 107 (serina) por alanina, el aminoácido N.° 112 (metionina) por valina, el aminoácido N.° 114 (fenilalanina) por tirosina, el aminoácido N.° 129 (histidina) por glutamina, el aminoácido N.° 132 (treonina) por leucina y el aminoácido N.° 133 (leucina) por valina, en la cadena pesada de cMAb1-2 representada por la Se Q ID NO: 42, se denominó "cadena pesada de tipo hMAb1-H1".

En la SEQ ID NO: 56 se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H1. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 1 a 19, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 20 a 137, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 138 a 463 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, corresponde a una secuencia señal, a una región variable de cadena pesada y a una región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 50 a 54, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 69 a 85, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 118 a 126 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56, corresponde a una secuencia de CDRH1, a una secuencia de CDRH2 y a una secuencia de CDRH3, respectivamente. En la SEQ ID NO: 55 se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56. Una secuencia que consta de los nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consta de los nucleótidos 58 a 411 y una secuencia que consta de los nucleótidos 412 a 1389 en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 55, codifica la secuencia señal, la secuencia de la región variable de la cadena pesada, y la secuencia de la región constante de la cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 55 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 56 también se muestran en las Figuras 31 y 32, respectivamente.

8)-2-2 cadena pesada de tipo hMAb1-H2:

Una cadena pesada de MAb1 humanizada, diseñada reemplazando el aminoácido N.° 32 (lisina) por glutamina, el aminoácido N.° 38 (lisina) por arginina, el aminoácido N.° 59 (treonina) por alanina, el aminoácido N.° 61 (ácido glutámico) por glicina, el aminoácido N.° 63 (arginina) por glicina, el aminoácido N.° 72 (asparagina) por glutamina, el aminoácido N.° 95 (ácido glutámico) por lisina, el aminoácido N.° 103 (serina) por asparagina, el aminoácido N.° 107 (serina) por alanina, el aminoácido N.° 112 (metionina) por valina, el aminoácido N.° 114 (fenilalanina) por tirosina, el aminoácido N.° 129 (histidina) por glutamina, el aminoácido N.° 132 (treonina) por leucina y el aminoácido N.° 133 (leucina) por valina, en la cadena pesada de cMAb1-2 representada por la SEQ ID NO: 42, se denominó "cadena pesada de tipo hMAb1-H2".

En la SEQ ID NO: 58 se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H2. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 1 a 19, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 20 a 137, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 138 a 463 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58, corresponde a una secuencia señal, a una región variable de cadena pesada y a una región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 50 a 54, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 69 a 85, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 118 a 126 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58, corresponde a una secuencia de CDRH1, a una secuencia de CDRH2 y a una secuencia de CDRH3, respectivamente. En la SEQ ID NO: 57 se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58. Una secuencia que consta de los nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consta de los nucleótidos 58 a 411 y una secuencia que consta de los nucleótidos 412 a 1389 en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 57, codifica la secuencia señal, la secuencia de la región variable de la cadena pesada, y la secuencia de la región constante de la cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 57 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 58 también se muestran en las Figuras 33 y 34, respectivamente.

8)-2-3 cadena pesada de tipo hMAb1-H3:

Una cadena pesada de MAb1 humanizada, diseñada reemplazando el aminoácido N.° 32 (lisina) por glutamina, el aminoácido N.° 38 (lisina) por arginina, el aminoácido N.° 59 (treonina) por alanina, el aminoácido N.° 61 (ácido glutámico) por glicina, el aminoácido N.° 95 (ácido glutámico) por lisina, el aminoácido N.° 103 (serina) por asparagina, el aminoácido N.° 107 (serina) por alanina, el aminoácido N.° 112 (metionina) por valina, el aminoácido N.° 114 (fenilalanina) por tirosina, el aminoácido N.° 129 (histidina) por glutamina, el aminoácido N.° 132 (treonina) por leucina y el aminoácido N.° 133 (leucina) por valina, en la cadena pesada de cMAb1-2 representada por la SEQ ID NO: 42, se denominó "cadena pesada de tipo hMAb1-H3".

En la SEQ ID NO: 60 se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H3. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 1 a 19, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 20 a 137, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 138 a 463 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60, corresponde a una secuencia señal, a una región variable de cadena pesada y a una región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 50 a 54, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 69 a 85, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 118 a 126 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60, corresponde a una secuencia de CDRH1, a una secuencia de CDRH2 y a una secuencia de CDRH3, respectivamente. En la SEQ ID NO: 59 se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60. Una secuencia que consta de los nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consta de los nucleótidos 58 a 411 y una secuencia que consta de los nucleótidos 412 a 1389 en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 59, codifica la secuencia señal, la secuencia de la región variable de la cadena pesada, y la secuencia de la región constante de la cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 59 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 60 también se muestran en las Figuras 35 y 36, respectivamente.

8)-2-4 cadena pesada de tipo hMAb1-H4:

Una cadena pesada de MAb1 humanizada, diseñada reemplazando el aminoácido N.° 32 (lisina) por glutamina, el aminoácido N.° 38 (lisina) por arginina, el aminoácido N.° 59 (treonina) por alanina, el aminoácido N.° 61 (ácido glutámico) por glicina, el aminoácido N.° 72 (asparagina) por glutamina, el aminoácido N.° 95 (ácido glutámico) por lisina, el aminoácido N.° 103 (serina) por asparagina, el aminoácido N.° 107 (serina) por alanina, el aminoácido N.° 112 (metionina) por valina, el aminoácido N.° 114 (fenilalanina) por tirosina, el aminoácido N.° 129 (histidina) por glutamina, el aminoácido N.° 132 (treonina) por leucina y el aminoácido N.° 133 (leucina) por valina, en la cadena pesada de cMAb1-2 representada por la Se Q ID NO: 42, se denominó "cadena pesada de tipo hMAb1-H4".

En la SEQ ID NO: 62 se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H4. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 1 a 19, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 20 a 137, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 138 a 463 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62, corresponde a una secuencia señal, a una región variable de cadena pesada y a una región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 50 a 54, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 69 a 85, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 118 a 126 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62, corresponde a una secuencia de CDRH1, a una secuencia de CDRH2 y a una secuencia de CDRH3, respectivamente. En la SEQ ID NO: 61 se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62. Una secuencia que consta de los nucleótidos 1 a 57, una secuencia que consta de los nucleótidos 58 a 411 y una secuencia que consta de los nucleótidos 412 a 1389 en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 61, codifica la secuencia señal, la secuencia de la región variable de la cadena pesada, y la secuencia de la región constante de la cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 61 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 62 también se muestran en las Figuras 37 y 38, respectivamente.

8)-3 Humanización de la cadena ligera de MAb1

8)-3-1 cadena ligera de tipo hMAb1-L1:

Una cadena ligera de MAb1 humanizada diseñada reemplazando el aminoácido N.° 22 (alanina) por isoleucina, el aminoácido N.° 27 (treonina) por serina, el aminoácido N.° 34 (serina) por treonina, el aminoácido N.° 37 (ácido aspártico) por ácido glutámico, el aminoácido N.° 38 (glutamina) por prolina, el aminoácido N.° 62 (fenilalanina) por leucina, el aminoácido N.° 84 (leucina) por prolina, el aminoácido N.° 108 (fenilalanina) por valina, el aminoácido N.° 112 (fenilalanina) por tirosina, el aminoácido N.° 125 (glicina) por prolina, el aminoácido N.° 129 (leucina) por valina, el aminoácido N.° 130 (ácido glutámico) por ácido aspártico y el aminoácido N.° 134 (alanina) por treonina, en la cadena ligera de cMAb1 representada por la SEQ ID NO: 38, se denominó "cadena ligera de tipo hMAb1-L1".

En la SEQ ID NO: 64 se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hMAb1-L1. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 1 a 20, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 21 a 134, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 135 a 239 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64, corresponde a una secuencia señal, a una región variable de cadena ligera y a una región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 44 a 59, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 75 a 81, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 114 a 122 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64, corresponde a una secuencia de CDRL1, a una secuencia de CDRL2 y a una secuencia de CDRL3, respectivamente. En la SEQ ID NO: 63 se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64. Una secuencia que consta de los nucleótidos 1 a 60, una secuencia que consta de los nucleótidos 61 a 402 y una secuencia que consta de los nucleótidos 403 a 717 en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 63, codifica la secuencia señal, la secuencia de la región variable de la cadena ligera y la secuencia de la región constante de la cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 63 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 64 también se muestran en las Figuras 39 y 40, respectivamente.

8)-3-2 cadena ligera de tipo hMAb1-L2:

Una cadena ligera de MAb1 humanizada diseñada reemplazando el aminoácido N.° 22 (alanina) por isoleucina, el aminoácido N.° 27 (treonina) por serina, el aminoácido N.° 34 (serina) por treonina, el aminoácido N.° 37 (ácido aspártico) por ácido glutámico, el aminoácido N.° 38 (glutamina) por prolina, el aminoácido N.° 52 (serina) por ácido glutámico, el aminoácido N.° 54 (glicina) por lisina, el aminoácido N.° 56 (treonina) por leucina, el aminoácido N.° 62 (fenilalanina) por leucina, el aminoácido N.° 84 (leucina) por prolina, el aminoácido N.° 108 (fenilalanina) por valina, el aminoácido N.° 112 (fenilalanina) por tirosina, el aminoácido N.° 125 (glicina) por prolina, el aminoácido N.° 129 (leucina) por valina, el aminoácido N.° 130 (ácido glutámico) por ácido aspártico y el aminoácido N.° 134 (alanina) por treonina, en la cadena ligera de cMAb1 representada por la SEQ ID NO: 38 se denominó como una "cadena ligera de tipo hMAb1-L2".

En la SEQ ID NO: 66 se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hMAb1-L2. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 1 a 20, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 21 a 134, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 135 a 239 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66, corresponde a una secuencia señal, a una región variable de cadena ligera y a una región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia que consta de los restos de aminoácido 44 a 59, una secuencia que consta de los restos de aminoácido 75 a 81, y una secuencia que consta de los restos de aminoácido 114 a 122 en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66, corresponde a una secuencia de CDRL1, a una secuencia de CDRL2 y a una secuencia de CDRL3, respectivamente. En la SEQ ID NO: 65 se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66. Una secuencia que consta de los nucleótidos 1 a 60, una secuencia que consta de los nucleótidos 61 a 402 y una secuencia que consta de los nucleótidos 403 a 717 en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 65, codifica la secuencia señal, la secuencia de la región variable de la cadena ligera y la secuencia de la región constante de la cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 65 y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 66 también se muestran en las Figuras 41 y 42, respectivamente.

(Ejemplo 9) Preparación de MAb1 humanizado

9)-1 Construcción del vector de expresión de cadena pesada de MAb1 humanizado

9)-1-1 Construcción del vector de expresión de cadena pesada de tipo hMAb1-H1

El ADN que comprende el gen que codifica la región variable de la cadena pesada de tipo hMAb1-H1, representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 56, se sintetizó (servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt) y se escindió con una enzima de restricción BlpI. El fragmento de ADN obtenido se insertó en un sitio de escindido por la enzima de restricción BlpI del vector de expresión de la cadena pesada de tipo IgG2 quimérico y humanizado (pCMA-G2) para construir un vector de expresión de la cadena pesada de tipo hMAb1-H1. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G2/hMAb1-H1". En la SEQ ID NO: 55, se muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H1.

9)-1-2 Construcción del vector de expresión de cadena pesada de tipo hMAb1-H2

Con el pCMA-G2/hMAb1-H1 construido en el apartado 9)-1-1 utilizando como molde un conjunto de cebadores mostrado más adelante y el kit de mutagénesis dirigida QuikChange XL (Agilent Technologies, Cía.) se construyó un vector de expresión de cadena pesada de tipo hMAb1-H2. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G1/hMAb1-H2". La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H2 se muestra en la SEQ ID NO: 57, y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 58.

Conjunto de cebadores:

H-N53Q-F: 5'-gggtggcaaccatcagccaaggcggcacctacacctac-3'

H-N53Q-R: 5'-gtaggtgtaggtgccgccttggctgatggttgccaccc-3'

9)-1-3 Construcción del vector de expresión de cadena pesada de tipo hMAb1-H3

El ADN que comprende el gen que codifica la región variable de la cadena pesada de tipo hMAb1-H3, representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 60, se sintetizó (servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt) y se escindió con una enzima de restricción BlpI. El fragmento de ADN obtenido se insertó en un sitio de escindido por la enzima de restricción BlpI del vector de expresión de la cadena pesada de tipo IgG2 quimérico y humanizado (pCMA-G2) para construir un vector de expresión de la cadena pesada de tipo hMAb1-H3. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G2/hMAb1-H3". En la SEQ ID NO: 59, se muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H3.

9)-1-4 Construcción del vector de expresión de cadena pesada de tipo hMAb1-H4

Con el pCMA-G2/hMAb1-H3 construido en el apartado 9)-1-3 utilizando como molde un conjunto de cebadores mostrado más adelante y el kit de mutagénesis dirigida QuikChange XL (Agilent Technologies, Cía.) se construyó un vector de expresión de cadena pesada de tipo hMAb1-H4. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G1/hMAb1-H4". La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de tipo hMAb1-H4 se muestra en la SEQ ID NO: 61, y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 62.

Conjunto de cebadores:

H-N53Q-F: 5'-gggtggcaaccatcagccaaggcggcacctacacctac-3'

H-N53Q-R: 5'-gtaggtgtaggtgccgccttggctgatggttgccaccc-3'

9)-2 Construcción del vector de expresión de cadena ligera MAb1 humanizado

9)-2-1 Construcción del vector de expresión de cadena ligera de tipo hMAb1-L1

El ADN que comprende el gen que codifica la región variable de la cadena ligera de tipo hMAb1-L1, representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64, se sintetizó (servicio de síntesis de genes artificiales GeneArt) y se escindió con una enzima de restricción BsiWI. El fragmento de ADN obtenido se insertó en un sitio escindido con la enzima de restricción BsiWI del vector (pCMA-LK) de propósito general para la expresión de la cadena ligera del anticuerpo quimérico y humanizado para construir un vector de expresión de cadena ligera de tipo hMAb1-L1. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-LK/hMAb1-L1". La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de tipo hMAb1-L1 se muestra en la SEQ ID NO: 63.

9)-2-2 Construcción del vector de expresión de cadena ligera de tipo hMAb1-L2

A través de PCR se obtuvieron fragmentos de ADN con el pCMA-LK/hMAb1-L1 construido en el apartado 9)-2-1 utilizando como molde KOD-Plus-(TOYOBO CO., LTD.) y cada uno de los conjuntos de cebadores A y B, y se unieron mediante PCR de extensión por solapamiento utilizando el conjunto de cebadores C para preparar ADN que comprende un gen que codifica la cadena ligera de tipo hMAb1-L2. Este ADN se escindió con las enzimas de restricción XbaI y PmeI para obtener un fragmento de ADN, que después se insertó en un sitio escindido por las enzimas de restricción XbaI/PmeI del vector (pCMA-LK) de propósito general para la expresión de la cadena ligera del anticuerpo quimérico y humanizado para construir un vector de expresión de cadena ligera de tipo hMAb1-L2. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-LK/hMAb1-L2". La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del tipo hMAb1-L2 se muestra en la SEQ ID NO: 65, y su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 66. Conjunto de cebadores A

L inf-F: 5'-gcctccggactctagagccaccatggtgctgcagacccaggtgttc-3'

L-EKL-R: 5'-caggtacaggttcttgttctcgttttccaggctctggctgcttctgcagc-3'

Conjunto de cebadores B

L-EKL-F: 5'-gaaaacgagaacaagaacctgtacctgaactggtatctgcagaagcccg-3'

L inf-R: 5'-tagcctcccccgtttaaacgggcccctaacactcccccctg-3'

Conjunto de cebadores C

L inf-F: 5'-gcctccggactctagagccaccatggtgctgcagacccaggtgttc-3'

L inf-R: 5'-tagcctcccccgtttaaacgggcccctaacactcccccctg-3'

(Ejemplo 10) Preparación de MAb1 humanizado

10-7-1) Producción de MAb1 humanizado

Se subcultivaron células FreeStyle 293-F (Invitrogen Corp.) y se cultivaron según el manual.

En un matraz Erlenmeyer Fernbach de 3 l (Corning Inc.), se inocularon 1,2 x 109 células de células FreeStyle 293-F (Invitrogen Corp.) en la fase de crecimiento logarítmico, se diluyeron con medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) en 1,0 x 106 células/ml, y después se cultivaron con agitación durante una hora en una incubadora con CO2 al 8 % a 90 rpm a una temperatura de 37° C. 3,6 mg de polietilenimina (Polysciences, Inc., n.° 24765) se disolvieron en 20 ml de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). A continuación, un vector de expresión de cadena H (0,4 mg) y un vector de expresión de cadena L (0,8 mg), preparados utilizando el kit de plásmido PureLink HiPure (Invitrogen Corp.), se suspendieron en 20 ml de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Se añadieron 20 ml de la solución de mezcla de vector de expresión/Opti-Pro SFM a 20 ml de la solución de mezcla de polietilenimina/Opti-Pro SFM, y la mezcla se agitó gradualmente, adicionalmente se dejó durante 5 minutos, y después se añadió a las células FreeStyle 293-F. Las células se cultivaron con agitación durante 7 días en una incubadora a 90 rpm a 37 °C con CO2al 8 % y el sobrenadante de cultivo obtenido se filtró a través de un filtro de cápsula desechable (Advantec, n° CCS-045-E1H) y se purificaron de la misma manera que en el apartado 7)-2.

El anticuerpo humanizado MAb1 obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAb1-H1 y pCMA-LK/hMAb1-L1 se denominó "H-1040". El anticuerpo humanizado MAb1 obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAb1-H2 y pCMA-LK/hMAb1-L1 se denominó "H-1140". El anticuerpo humanizado MAb1 obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAb1-H2 y pCMA-LK/hMAb1-L2 se denominó "H-1143". El anticuerpo humanizado MAb1 obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAb1-H3 y pCMA-LK/hMAb1-L1 se denominó "H-2040". El anticuerpo humanizado MAb1 obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAb1-H4 y pCMA-LK/hMAb1-L1 se denominó "H-2140". El anticuerpo humanizado MAb1 obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAb1-H4 y pCMA-LK/hMAb1-L2 se denominó "H-2143".

(Ejemplo 11) Propiedades del anticuerpo humanizado anti-ROBO4

11)-1 Afinidad de unión

La constante de disociación entre cada anticuerpo y rROBO4-ECD se determinó con el anticuerpo inmovilizado como un ligando y el antígeno como un analito utilizando Biacore 3000 (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Aproximadamente 80 UR del anticuerpo se unieron mediante un anticuerpo anti-IgG humano (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) inmovilizado en una microplaca detectora CM5 (fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) mediante un método de acoplamiento de amina. El tampón de funcionamiento utilizado fue PBS que contenía tensioactivo P20 al 0,05 %. En la microplaca unida al anticuerpo, se añadieron soluciones en series de dilución (0,1-200 nM) del antígeno, a un caudal de 30 pl/min. durante 300 segundos. Posteriormente, se monitorizó una fase de disociación durante 300 segundos. A esto, se le añadió MgCb 3 M, como una solución de regeneración a un caudal de 10 pl/min. durante 30 segundos. Los datos se analizaron utilizando el modelo de unión 1: 1 del programa de análisis informático (programa informático BIAevaluation, versión 4.1) para calcular una constante de velocidad de asociación kon, una constante de velocidad de disociación koff y una constante de disociación (K^d; K^d= koff/kon). Como resultado, el valor de K^dfue de 0,41 nM para H-1040, de 3,5 nM para H-1143, de 3,9 nM para H-1140, de 0,40 nM para H-2040, de 1,7 nM para H-2143 y de 1,8 nM para H-2140.

11)-2 Activación de la señal de ROBO4 en sentido descendente

Este ensayo se realizó según el método del apartado 4)-1, excepto que: como control negativo, se utilizó IgG humana; y la IgG humana, H-1040, H-1140, H-1143, H-2040, H-2140, H-2143 o el cMAb1-2, se añadieron a un medio a una concentración final de 0,63 pg/ml. Como resultado, la IgG humana como control negativo, no influyó en la actividad del promotor de IL-8 en células que expresaban de manera transitoria ROBO4 humano, mientras que todos los anticuerpos humanizados anti-ROBO4 aumentaron la actividad del promotor de IL-8 a un nivel equivalente al de cMAb1-2 (Figura 49). Estos resultados demostraron que todos los anticuerpos humanizados anti-ROBO4 activaron la señal de ROBO4 en sentido descendente, como ocurría con MAb1.

11)-3 Ensayo de migración de HUVEC

Este ensayo se realizó según el método del apartado 4)-2, excepto que: como control negativo, se utilizó IgG humana; la IgG humana, H-1143, H-2140 o H-2143 se añadieron a un medio a una concentración final de 0,5 pg/ml; y la intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación/longitud de onda fluorescente: 485 nm/538 nm) de cada pocillo se midió utilizando un lector de placas (EnVision: Perkin Elmer, Inc.). Como resultado, H-1143, H-2140 o H-2143, suprimieron la migración de HUVEC inducida por bFGF (Figura 50). Adicionalmente, H-1140 mostró la actividad supresora contra la migración de HUVEC. Estos resultados demuestran que H-1140, H-1143, H-2140 o H-2143, suprimieron la migración de HUVEC.

11)-4 Reactividad cruzada entre especies

11)-4-1 Preparación de células que expresan genes antigénicos

Las células se prepararon según el método del apartado 4)-3-1.

11)-4-2 Análisis de citometría de flujo

Este ensayo se realizó según el método del apartado 4)-3-2, excepto que, como control negativo, se utilizó IgG humana; Anti-IgG humana de cabra-FITC de AffiniPure, como anticuerpo secundario fragmento específico Fcy (fabricado por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) y como detector se utilizó un citómetro de flujo (FC500; fabricado por Beckman Coulter, Inc.). Como resultado, H-1143, H-2140 o H-2143, no se unieron a ROBO4 de ratón ni a ROBO4 de rata, pero se demostró que se unían a ROBO4 humano y a ROBO4 de mono cinomolgo, como en el anticuerpo parental MAb1 (Figuras 51, 52 y 53). Adicionalmente, H-1140 mostró el mismo resultado que H-1143, H-2140 y H-2143.

11)-5 Especificidad de unión de H-1140, H-1143, H-2140 o H-2143

11)-5-1 Preparación de células que expresan genes antigénicos

Las células se prepararon según el método del apartado 4)-4-1, excepto que como un vector de expresión de ROBO4 humano se utilizó pCI-FLAG-hROBO4-28.

11)-5-2 Análisis de citometría de flujo

Este ensayo se realizó según el método del apartado 4)-4-2, excepto que: como control negativo, se utilizó IgG humana o IgG2A de ratón; fracción de IgG de cabra conjugada con fluoresceína contra IgG de ratón (fabricada por Cappel Laboratories, Inc.) o Anti-IgG humana de cabra-FITC de AffiniPure, el Fragmento específico de Fcy se utilizó como un anticuerpo secundario; y como detector se utilizó un citómetro de flujo (FC500). Como resultado, H-1143, H-2140 o H-2143, no se unieron a hROBOl, a hROBO2 o a hROBO3, pero se demostró que se unían específicamente a hROBO4, como en el anticuerpo parental MAb1 (Figura 54). Adicionalmente, H-1140 mostró el mismo resultado que H-1143, H-2140 y H-2143. En este contexto, se confirmó que, cada uno de hROBO4, hROBOl, hROBO2 y hROBO3, se expresaba en la membrana celular utilizando el anticuerpo de control positivo (Figura 54).

11)-6 Evaluación de la eficacia farmacológica en modelos de mono con neovascularización coroidea inducida por láser

11)-6-1 Anestesia

A cada mono cinomolgo se le inyectó clorhidrato de medetomidina por vía intramuscular a una dosis de 0,08 mg/kg. Quince minutos después, se inyectó clorhidrato de ketamina por vía intramuscular a una dosis de 15 mg/kg.

11)-6-2 Preparación del modelo

Cada mono cinomolgo anestesiado en el apartado 11 )-6-1, se sujetó en una mesa de operaciones de acero inoxidable en posición de decúbito supino. En los ojos se aplicó una mezcla de gotas oculares de tropicamida 5 mg/ml - clorhidrato de fenilefrina 5 mg/ml para la midriasis. La región macular de la retina se dañó térmicamente por irradiación con láser (cantidad de calor irradiado: 500 mW, tiempo de irradiación: 0,1 segundos, tamaño de mancha: 50 pm, cantidad de manchas: 9 manchas ) utilizando un fotocoagulador con láser verde OcuLight GLx. Después de la operación, se añadieron por goteo, gotas oculares Cravit a los ojos operados.

11)-6-3 Administración de las sustancias de ensayo

El día 7 después de la preparación del modelo, cada mono cinomolgo se anestesió y después se sujetó en una mesa de operaciones de acero inoxidable en posición de decúbito supino. Después, para desinfectar la parte exterior de los ojos, se aplicó solución oftálmica y de lavado ocular de PA IODO (Nitten Pharmaceutical Co., Ltd.) diluida 4 veces con agua estéril purificada. Se insertó una aguja de 33G en el cuerpo vítreo desde la conjuntiva y con una jeringa de 1 ml se inyectó solución salina o 0,05 ml del anticuerpo H-2143 ajustado a 1,1 mg/0,05 ml. Después de finalizar la administración, con un hisopo, se aplicó pomada Rinderon-A ocular y ótica a la conjuntiva y se extendió en toda la superficie ocular abriendo y cerrando los ojos.

11)-6-4 Evaluación de la eficacia farmacológica

Los días 7, 14 y 21 después de la preparación del modelo, el fondo de ojo se fotografió mediante un método habitual con anestesia, utilizando una cámara de fondo de ojo híbrida CX-1. Después, se inyectó fluoresceína por vía intravenosa en el ojo a una dosis de 0,05 ml/kg. Después de finalizar la inyección intravenosa de fluoresceína, se realizó una angiografía fluorescente cada 1 minuto hasta 10 minutos más tarde, y se almacenaron los datos de las imágenes. De los datos de las imágenes, la gravedad se clasificó a una escala de grados de 1 a 5 según la intensidad de la fluorescencia de cada sitio irradiado con láser, en donde se acumuló fluoresceína según el método de Zahn G et al. (Zahn G et al., Arch. Ophthalmol. 2009 127: 1329-1335). Después, para evaluar la neovascularización coroidea, entre todos los sitios irradiados con láser, se calculó porcentualmente la proporción de un sitio correspondiente a los grados 4 y 5 en la clasificación de gravedad. Como resultado de la comparación de la neovascularización coroidea entre el grupo administrado con solución salina y el grupo administrado con H-2143, la proporción de grados 4 y 5 aumentó en el grupo administrado con solución salina con un intervalo de tiempo desde la preparación del modelo, mientras que dicho aumento no se observó en el grupo administrado con H-2143. Esto significa que la administración de H-2143 suprimió la neovascularización coroidea inducida por láser (figura 55).

[Aplicabilidad industrial]

El uso de un anticuerpo proporcionado por la presente invención permite el tratamiento o la prevención de una enfermedad angiogénica, tal como degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia u obesidad, y el examen o diagnóstico de la enfermedad angiogénica.

[Texto libre de Listado de Secuencias]

SEQ ID NO: 1: Secuencia de nucleótidos de ADNc de ROBO4 humano de longitud completa (figura 13) SEQ ID NO: 2: Secuencia de aminoácidos de ROBO4 humano (figura 14)

SEQ ID NO: 3: Secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de ROBO4 humano de longitud completa con etiqueta FLAG en el extremo N terminal

SEQ ID NO: 4: Secuencia de aminoácidos de ROBO4 humano de longitud completa con etiqueta FLAG N-terminal SEQ ID NO: 5: Secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región/dominio extracelular con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 46 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 6: Secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región/dominio extracelular con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 46 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 7: Secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región/dominio extracelular con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 132 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 8: Secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región/dominio extracelular con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 132 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 9: Secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región/dominio extracelular con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 210 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 10: Secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región/dominio extracelular con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 210 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 11: Secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región/dominio extracelular con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 225 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 12: Secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región/dominio extracelular con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 225 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 13: Secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región extracelular/dominio con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 341 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 14: Secuencia de aminoácidos de una variante por deleción de la región/dominio extracelular con etiqueta FLAG en el extremo N terminal de ROBO4 humano que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 341 a 1007 de la SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 15: Secuencia de nucleótidos de ADNc de ROBO4 de ratón

SEQ ID NO: 16: Secuencia de aminoácidos de ROBO4 de ratón

SEQ ID NO: 17: Secuencia de nucleótidos de ADNc de ROBO4 de rata

SEQ ID NO: 18: Secuencia de aminoácidos de ROBO4 de rata

SEQ ID NO: 19: Secuencia de nucleótidos de ADNc1 de ROBO4 de mono

SEQ ID NO: 20: Secuencia de aminoácidos 1 de ROBO4 de mono

SEQ ID NO: 21: Secuencia de nucleótidos de ADNc2 de ROBO4 de mono

SEQ ID NO: 22: Secuencia de aminoácidos 2 de ROBO4 de mono

SEQ ID NO: 23: Secuencia de nucleótidos de ADNc de ROBO1 de ser humano

SEQ ID NO: 24: Secuencia de aminoácidos de ROBO1 de ser humano

SEQ ID NO: 25: Secuencia de nucleótidos de ADNc de ROBO2 de ser humano

SEQ ID NO: 26: Secuencia de aminoácidos de ROBO2 de ser humano

SEQ ID NO: 27: Secuencia de nucleótidos de ADNc de ROBO3 de ser humano

SEQ ID NO: 28: Secuencia de aminoácidos de ROBO4 de ser humano

SEQ ID NO: 29: Secuencia de nucleótidos de una región del promotor de IL-8

SEQ ID NO: 30: Secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada de MAb1 (figura 15)

SEQ ID NO: 31: Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de MAb1 (figura 16) SEQ ID NO: 32: Secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera de MAb1 (figura 17)

SEQ ID NO: 33: Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de MAb1 (figura 18) SEQ ID NO: 34: Secuencia de nucleótidos que comprende ADNc que codifica los aminoácidos de la señal secretora de la cadena k humana y la región constante de la cadena k humana

SEQ ID NO: 35: Secuencia de nucleótidos que comprende ADNc que codifica los aminoácidos de la secuencia señal de la cadena pesada humana y la región constante de IgG 1 humana

SEQ ID NO: 36: Secuencia de nucleótidos que comprende ADNc que codifica los aminoácidos de la secuencia señal de la cadena pesada humana y la región constante de IgG2 humana

SEQ ID NO: 37: Secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica la cadena ligera de cMAb1 (figura 19) SEQ ID NO: 38: Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cMAb1 (figura 20)

SEQ ID NO: 39: Secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica la cadena pesada de cMAb1-1 (figura 21) SEQ ID NO: 40: Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de cMAb1-1 (figura 22)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que tiene las propiedades descritas en los siguientes apartados (I) a (III):

(I) unión con la proteína ROBO4 con un valor K^dde 1 x 10-8 M o inferior según lo determinado por resonancia de plasmón superficial;

(III) supresión o inhibición de la angiogénesis in vivo,

en donde el anticuerpo consta de una cadena pesada que comprende una CDRH1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44 (figura 25), una CDRH2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46 (figura 26) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46 por la sustitución de un aminoácido, y una CDRH3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 48 (figura 27), y una cadena ligera que comprende una CDRL1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 50 (figura 28) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50 por la sustitución de uno a tres aminoácidos, una CDRL2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 52 (figura 29) y una CDRL3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 54 (figura 30).

2. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo consta de una cadena pesada que comprende una CDRH1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 44 (figura 25), una CDRH2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 46 (figura 26) o la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 68 (figura 44) y una CDRH3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 48 (figura 27), y una cadena ligera que comprende una CDRL1 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 50 (figura 28) o la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 70 (figura 46), una CDRL2 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 52 (figura 29) y una CDRL3 que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 54 (figura 30).

3. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 31 (figura 16), y una región variable de cadena ligera que consta de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 33 (figura 18).

4. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende una cualquiera de la región variable de cadena pesada seleccionada de los siguientes apartados a) a d) y una región variable de cadena ligera seleccionada de los apartados e) y f):

a) una región variable de cadena pesada (de tipo hMAb1-H1) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID n O: 56 (figura 32),

b) una región variable de cadena pesada (de tipo hMAb1-H2) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID n O: 58 (figura 34),

c) una región variable de cadena pesada (de tipo hMAb1-H3) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID n O: 60 (figura 36), y

d) una región variable de cadena pesada (de tipo hMAb1-H4) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID n O: 62 (figura 38); y

f) una región variable de cadena ligera (de tipo hMAb1-L2) que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42).

5. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende una cualquiera de las siguientes combinaciones 1) a 6) de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera:

1) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 58 (figura 34) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40), 2) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 58 (figura 34) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42), 3) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 62 (figura 38) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42).

4) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 62 (figura 38) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40), 5) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 56 (figura 32) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40), y 6) una región variable de cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 137 de la SEQ ID NO: 60 (figura 36) y una región variable de cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 134 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40).

6. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína ROBO4 es la proteína ROBO4 humana.

7. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína ROBO4 es una proteína que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 1 a 1007 o de los aminoácidos N.° 46 a 1007 de la SEQ ID NO: 2.

8. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según la reivindicación 7, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se une a un sitio que consta de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos N.° 132 a 209 de la SEQ ID NO: 2.

9. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo.

10. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo quimérico o un fragmento funcional del mismo o un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo.

11. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de IgG1 humana o IgG2 humana.

12. El anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo comprende una cualquiera de las siguientes combinaciones 1) a 6) de una cadena pesada y una cadena ligera:

1) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 58 (figura 34) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40) (H-1140),

2) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO: 66 (Figura 42) (H-1143),

3) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 62 (figura 38) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO: 66 (figura 42) (H-2143).

4) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 62 (figura 38) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40) (H-2140),

5) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 56 (Figura 32) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO: 64 (Figura 40) (H-1040), y

6) una cadena pesada que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 20 a 463 de la SEQ ID NO: 60 (figura 36) y una cadena ligera que consta de una secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos N.° 21 a 239 de la SEQ ID NO: 64 (figura 40) (H-2040).

13. Un anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende una forma modificada de una cadena pesada de uno cualquiera de los anticuerpos según la reivindicación 12, en donde dicha forma modificada carece de uno a varios aminoácidos carboxi-terminal de dicha cadena pesada.

14. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo es 95 % o más idéntico en la secuencia de aminoácidos a cualquier anticuerpo según la reivindicación 12; tiene un valor K^dde 1 x 10-8 M o inferior por una ROBO4 humana según lo determinado por resonancia de plasmón superficial; suprime o inhibe la migración de células endoteliales vasculares en ausencia de un anticuerpo de entrecruzamiento in vitro; y suprime o inhibe la angiogénesis in vivo.

15. Una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consta de los siguientes apartados (I) a (III):

(I) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14,

(II) una secuencia de nucleótidos que consta de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y

(III) una secuencia de nucleótidos que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Un vector recombinante que contiene un inserto de una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 15.

17. Una célula recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 15 o un vector recombinante según la reivindicación 16 introducido en la misma.

18. Una célula que produce un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

19. Un método para producir un anticuerpo o una parte funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que comprende las siguientes etapas (I) y (II):

(I) cultivar una célula según la reivindicación 17 o 18; y

(II) recuperar del cultivo obtenido en la etapa (I), el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

20. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo producido por un método de producción según la reivindicación 19.

21. Una forma modificada de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según la reivindicación 1, que comprende una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consta de glicosilación ligada a N, glucosilación ligada a O, procesamiento N-terminal, procesamiento C-terminal, desamidación, isomerización de ácido aspártico, oxidación de metionina y la deleción de 1 o 2 aminoácidos en el extremo C de la cadena pesada y amidación de un resto de prolina recientemente localizado en el extremo C de la cadena pesada.

22. Una composición farmacéutica que comprende, como principio activo, un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y 20 o una forma modificada según la reivindicación 21.

23. La composición farmacéutica según la reivindicación 22 para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad angiogénica seleccionada del grupo que consta de degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, ateroesclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea o de otros trasplantes tisulares, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, septicemia y obesidad.

24. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 23, en donde la enfermedad angiogénica es degeneración macular exudativa relacionada con la edad, retinopatía diabética, edema macular, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular o rechazo inmunitario de un trasplante de tejido de córnea.

25. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 23 o 24, en donde dicha composición se utiliza en combinación con un agente terapéutico o profiláctico adicional.

26. Un inhibidor de angiogénesis que, como principio activo, comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y 20 o una forma modificada según la reivindicación 21.