KR20220012270A - 항-tdp-43 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 43 kDa의 분자량을 가진 트랜스활성 반응(transactive response) DNA 결합 단백질(TARDB 또는 또한 TDP-43) 분야이다. 본 발명은 TDP-43 특이적 결합 분자, 특히 항-TDP-43 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이의 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 비제한적으로 전측두엽 치매(FTD: Frontotemporal dementia), 근위축성 측삭 경화증(ALS: amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병(AD: Alzheimer's disease), 파킨슨병(PD: Parkinson's disease), 만성 외상성 뇌병증(CTE: Chronic Traumatic Encelopathy), 및 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE: limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy)을 포함하여, TDP-43응집과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상을 진단, 예방, 완화 및/또는 치료하는 수단 및 방법을 제공한다.

Description

항-TDP-43 결합 분자 및 이의 용도
본 발명은 43 kDa의 분자량을 가진 트랜스활성 반응(transactive response) DNA 결합 단백질(TARDB 또는 또한 TDP-43) 분야이다. 본 발명은 TDP-43 특이적 결합 분자, 특히 항-TDP-43 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이의 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 비제한적으로 전측두엽 치매(FTD: Frontotemporal dementia), 근위축성 측삭 경화증(ALS: amyotrophic lateral sclerosis), 알츠하이머병(AD: Alzheimer's disease), 파킨슨병(PD: Parkinson's disease), 만성 외상성 뇌병증(CTE: Chronic Traumatic Encelopathy), 및 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE: limbic-predominant age-related TDP-43 encephalopathy)을 포함하여, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증(proteinopathy)을 진단, 예방, 완화 및/또는 치료하는 수단 및 방법을 제공한다.
중추신경계(CNS)(단백질병증) 및 말초 기관에서 단백질의 병리학적 응집을 특징으로하는 연령-관련 뇌 장애는 전 세계에서 장애 및 사망의 주요 원인 중 하나를 나타낸다. 알츠하이머병 및 관련 장애에서 가장 잘 특성분석된 응집체를 형성하는 단백질은 아밀로이드 베타이다. 신경퇴행을 야기하는 다른 질환-관련, 응집-경향 단백질은 비제한적으로 Tau, 알파-시누클레인(aSyn, a-syn), 헌팅틴, 육종 융합(FUS: fused in sarcoma), C9orf72의 반복 확장(expansion)의 비통상적인 번역에 의해 생성된 디펩티드 반복 단백질(DPR: dipeptide repeat protein), 슈퍼옥시드 디스뮤타제 1(SOD1), 및 TDP-43이다. TDP-43 응집체와 관련된 질환은 일반적으로 비제한적으로 ALS 및 FTD를 포함하여 TDP-43 단백질병증으로 열거된다.
I. TDP-43 소개
트랜스활성 반응(TAR: transactive response) DNA 결합 단백질 43 kDa(TDP-43)은 염색체 1p36.2(ALS10) 상의 TARDBP 유전자에 의해 코딩된 414-아미노산 단백질이다. TARDBP은 6개의 엑손(엑손 1은 비-코딩이고; 엑손 2~6은 단백질-코딩임)으로 구성된다. TDP-43은 이종 리보뉴클레오단백질(hnRNP) RNA 결합 단백질의 패밀리에 속한다(문헌[Wang et al., Trends in Molecular Medicine Vol.14 No.11, 2008, 479-485]; 문헌[Lagier-Tourenne et al., Human Molecular Genetics, 2010, Vol. 19, Review Issue 1 R46-R64]). TDP-43은 5개의 기능성 도메인을 포함한다(문헌[Warraich et al., The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 42 (2010) 1606-1609]의 도 1): 2개의 고도로 보존된 6량체 리보뉴클레오단백질 2(RNP2) 및 8량체 리보뉴클레오단백질 1(RNP1) 영역을 갖는 2개 RNA 인식 모티프(RRM1 및 RRM2), 결합된 mRNA를 수송하는 핵과 세포질 사이를 왕복할 수 있도록 하는 핵 방출 신호(NES: nuclear export signal) 및 핵 국소화 신호(NLS: nuclear localization signal), 및 단백질-단백질 상호작용을 매개하는, C-말단의 글리신 풍부 도메인. TDP-43은 전사, 스플라이싱, 수송, 및 안정화를 포함하는 RNA 처리의 여러 측면에 관련되어 있다(문헌[Buratti and Baralle, FEBS Journal 277 (2010) 2268-2281]). 이는 핵과 세포질 사이를 연속적으로 왕복하는 엄격하게 자가조절된 발현 수준을 갖는 고도로 보존된, 편재적으로 발현된 단백질이지만, 주로 핵에 국소화되어 있다. 2006년에, TDP-43은 tau-음성, 유비퀴틴-양성 봉입체(FTLD-TDP로 지칭됨)가 있는 전측두엽 퇴행(FTLD: frontotemporal lobar degeneration)의 대부분의 경우에, 대부분 근위축성 측삭 경화증(ALS)에 축적되는 단백질로 확인되었다(문헌[Arai et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 351 (2006) 602-611]; 문헌[Neumann et al., Science 314, (2006), 130-133]).
TDP-43의 38개의 음성-우성 돌연변이는 산발성 및 가족성 ALS 환자뿐만 아니라 주로 글리신 풍부 도메인에 위치한 유전성 FTD 환자에서 확인되었다(문헌[Lagier-Tourenne and Cleveland, Cell 136, 2009, 1001-1004]의 도 1). TDP-43은 침강 분석에 의해 나타난 바와 같이 본질적으로 응집되기 쉽고, 이러한 경향은 TDP-43 응집을 임상 질환 징후와 연결하는 ALS-관련 TARDBP 돌연변이(문헌[Ticozzi et al., CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 2010, 9(3), 285-296.])의 일부에 의해 추가로 증가된다.
II. 신경퇴행에서의 TDP-43
TDP-43 응집체는 비제한적으로 다음을 포함하는, 신경퇴행성 병태의 증가하는 목록에서 확인되었다(문헌[Lagier-Tourenne et al., Human Molecular Genetics, 2010, Vol. 19, Review Issue 1 R46-R64]): 전측두엽 치매(FTD, 예컨대 산발성 또는 가족성, 운동-뉴런 질환(MND)이 있거나 없는 것, 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이가 있는 것, C9orf72 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, 염색체 9p와 연결된 것, 피질기저 퇴행, 유비퀴틴-양성 TDP-43 봉입체(FTLD-TDP)가 있는 전측두엽 퇴행(FTLD), 호은성 입자 질병, 픽병, 의미형 변이체 원발 진행성 실어증(svPPA), 행동 변이 FTD(bvFTD), 비유창 변이 원발 진행성 실어증(nfvPPA) 등), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 예컨대 산발성 ALS, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 안지오제닌(ANG) 돌연변이가 있는 것), 알렉산더병(AxD), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 페리 증후군, 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 다운 증후군, 영국 가족성 치매, 폴리글루타민 질환(헌팅턴병 및 척수소뇌 실조 유형 3(SCA3; 마카도 조셉병으로도 알려져 있음)), 해마 경화증 치매 및 근병증(산발성 봉입체 근염, 발로신-함유 단백질(VCP)에 돌연변이가 있는 봉입체 근염(또한 골의 파제트병 및 전측두엽 치매), 테두리 액포가 있는 눈인두 근이영양증, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 있는 근섬유 근병증), 외상성 뇌손상(TBI), 루이소체가 있는 치매(DLB) 또는 파킨슨병(PD).
환자 뇌의 응집체화된 TDP-43은 과인산화, 유비퀴틴화, 아세틸화 및 단백질분해 절단을 통한 C-말단 단편을 포함하여 다수의 비정상적 변형을 나타낸다(문헌[Arai et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 351 (2006) 602-611]; 문헌[Neumann et al., Science 314, (2006), 130-133]; 문헌[Neumann et al., Acta Neuropathol. (2009) 117: 137-149]; 문헌[Hasegawa et al., (2008) Annals of Neurology Vol 64 No 1, 60-70]; 문헌[Cohen et al., Nat Commun. 6: 5845, 2015]). TDP-43 병리학의 또 다른 특징적인 특징은 핵에서 세포질로의 TDP-43의 재분배 및 축적이다. FTLD-TDP의 특징적인 병변은 TDP-43, 및 유비퀴틴 및 p62에 대해 면역반응을 나타내지만, 다른 신경퇴행성 질환-관련 단백질에는 음성인 뉴런 및 신경교 세포질 봉입체(각각 NCI 및 GCI) 및 이영양성 신경돌기(DN)이다. 봉입체 형태 및 이의 조직 분포의 차이는 특이적 돌연변이 및/또는 임상적인 표현과 관련이 있다. 현재까지 4가지 유형의 TDP-43 병리학이 조직학적 분류에 의해 기술되었다(문헌[Mackenzie and Neumann, J. Neurochem. (2016) 138 (Suppl. 1), 54-70]). FTLD-TDP 유형 A 사례는 주로 신피질의 II층에서 우세한, 짧은 이영양성 신경돌기(DN) 및 조밀한(compact) 타원형 또는 초승달 모양의 NCI를 특징으로 한다(문헌[Mackenzie et al., 2016 J. Neurochem. 138 (Suppl. 1), 54-70]의 도 2f). 이러한 병리학을 가진 사례는 일반적으로 임상적으로 행동-변이형 전측두엽 치매(bvFTD) 또는 비유창성/비문법적 변이체의 원발 진행성 실어증(nfvPPA)과 함께 나타나며 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이와 관련이 있다. 유형 B 사례는 상대적으로 적은 수의 DN 및 NII를 가진 표층 및 깊은 피질층 둘 모두에서 적당한 수의 조밀하거나 과립화된 NCI를 나타낸다(뉴런 핵내 봉입체; 문헌[Mackenzie et al., 2016 J. Neurochem. 138 (Suppl. 1), 54-70]의 도 2g). FTD와 ALS 증상이 동시에 나타나는 대부분의 경우에는 FTLD-TDP 유형 B 병리학을 갖는 것으로 밝혀졌다. 유형 C 사례는 길고, 구불구불한 신경돌기가 풍부하고 주로 표면 피질 라미나에 우세하게 풍부하고, NCI가 거의 없거나 전혀 없다(문헌[Mackenzie et al., 2016 J. Neurochem. 138 (Suppl. 1), 54-70]의 도 2j). 이러한 병리학은 특히 원발 진행성 실어증의 의미형 변이체(svPPA)를 나타내는 사례에서 발견된다. FTLD-TDP 유형 D는 희귀한 NCI만이 있는 신피질에서 풍부한 렌즈형(lentiform) 뉴런 핵내 봉입체(NII) 및 짧은 DN을 나타낸다(문헌[Mackenzie et al., 2016 J. Neurochem. 138 (Suppl. 1), 54-70]의 도 2k). 유형 E는 과립필라멘트 신경 봉입체(GFNI) 및 백질의 곡선적 희소돌기교세포 봉입체에 첨가하여 모든 신피질층에 영향을 미치는 매우 미세한, 점-모양의 신경필 응집체를 특징으로 한다(문헌[Edward B. Lee et al., Acta Neuropathol. 2017 July ; 134(1): 65-78.]). 병리학의 이러한 패턴은 봉입체 근염과 관련된 VCP의 사례에서만 발견된다.
III. FTD에서의 TDP-43
전측두엽 치매(FTD)는 전두엽과 측두엽의 퇴행을 기반으로 하는 광범위한 장애를 포괄하는 임상 용어이다 - 전측두엽 퇴행(FTLD)이라 지칭되는 병리학적 특징. FTD는 65세 미만의 연령군에서 조기 퇴행성 치매의 두 번째로 풍부한 원인이다(문헌[Le Ber, Revue Neurologique 169 (2013) 811-819]). FTD는 성격과 행동의 변화를 특징으로 하는 bvFTD를 포함하여 여러 증후군으로 나타난다; 의미 치매(SD) 및 진행성 비유창성 실어증(PNFA)은 언어 기능의 변화를 특징으로 하며; 피질기저 증후군(CBS), 진행성 핵상 마비 증후군 및 운동 뉴런 질환(FTD-MND)은 운동 기능부전을 특징으로 한다. 이러한 증후군의 임상 진단은 복잡하며 최종 결론은 응집된 단백질을 검출하고 영향받은 뇌 영역을 한정하는 사후 병태조직학적 분석을 통해서만 달성될 수 있다. 병리학적, 단백질성 봉입체의 측면에서, 약 45%의 사례는 미스폴딩 Tau의 병리학적 축적을 나타내고, 45%의 사례는 병리학적 TDP-43을 가지며 더 작은 하위군은 FUS 및 다른 단백질의 응집체를 갖는다.
IV. ALS에서의 TDP-43
근위축성 측삭 경화증(ALS)은 상부 및 하부 운동 뉴런의 조기 상실을 특징으로 하는 신경퇴행성 장애이다. ALS의 진행은 진단에서 사망까지 1 내지 5년의 질환 경과와 함께 치명적인 마비 및 호흡부전으로 표시된다. 산발성 ALS의 대부분의 경우, 신경병리학은 1차 운동 피질, 뇌간 운동 핵, 척수 및 관련 백질 관의 뉴런 및 신경교의 TDP-43의 비정상적인 세포질 축적을 특징으로 한다. 치매가 있는 ALS는 운동외(extramotor) 신피질 및 해마의 TDP-43의 축적을 수반한다. ALS 환자에서 TDP-43의 인산화의 역할은 TDP-43의 인산화의 주요 부위로서 아미노산 S379, S403, S404, S409, S410을 갖는 핵 및 세포질 봉입체에서 인산화된 TDP-43에 특이적으로 결합하는 항체의 도움으로 탐구되었다(문헌[Hasegawa et al., Ann Neurol 2008; 64: 60-70]; 문헌[Neumann et al., Acta Neuropathol (2009) 117: 137-149]).
V. AD 및 다른 질환에서의 TDP-43
TDP-43 병리학은 알츠하이머병의 환자의 뇌의 최대 57%에서 발생한다(문헌[Josephs KA et al., Acta Neuropathol. 2014; 127(6): 811-824]; 문헌[Josephs KA et al., Acta Neuropathol. 2014; 127(3): 441-450]; 문헌[McAleese et al., Brain Pathol. 2017 Jul; 27(4): 472-479]). TDP-43 응집은 환자의 연령과 관련이 있으며 AD의 인지 저하, 기억 상실 및 내측 측두 위축과 상관관계가 있다. AD에서 TDP-43은 내측 측두엽에서 아밀로이드 베타 및 tau 병리와 중첩되는 뇌 분포를 공유하는 2차 또는 독립적인 병리를 나타내는 것으로 보인다. 병리학적 TDP-43은 AD(TAD) 병기 계획에서 소위 TDP-43으로 설명된 전형적인 진행성 침착 패턴을 따른다: TDP-43은 편도체에서 첫 번째 침착(I기)에 이어, 해마, 변연계, 측두엽, 및 마지막으로 전두선조체에서 침착된다(V기)(문헌[Josephs KA et al., Acta Neuropathol. 2014;127(6): 811-824]; 문헌[Josephs KA et al., Acta Neuropathol. 2014; 127(3): 441-450]).
VI. TDP-43 확산
ALS 및 FTD 발병 및 첫 번째 증상은 환자마다 크게 다르지만, 질병 진행의 일반적인 특징은 초기 초점 영역에서 대부분의 뉴런으로 병리학이 확산된다는 것이다. 증상의 지속적인 악화는 TDP-43 병리학의 점진적인 확산으로 설명될 수 있다. ALS 환자의 노에서 TDP-43 병리학은 4단계 과정으로 확산되는 것으로 보여지며 전파는 전향 축삭 수송을 사용하여 피질복합 축삭 투영을 통해 트랜스시냅스적으로 발생하는 것으로 여겨진다(문헌[Brettschneider et al., Ann Neurol. 2013 July; 74(1): 20-38.]). 최근 실험 증거는 프리온-유사 기작에 의한 아밀로이도-베타, Tau, 알파-시누클레인 및 TDP-43에 대한 신경 조직에서의 단백질 전파 가설을 뒷받침하며(문헌[Hasegawa et al., 2017]), 출발점과 지형적 확산 패턴은 4가지 단백질에 대해 구별된다(문헌[Brettschneider J et al., Nature Rev. Neuroscience, 2015, 109]). 일반적인, 질병 통합 기작은 병리학적 단백질 응집체의 세포간 확산을 기반으로 하는 것으로 여겨진다. 이러한 기작은 질환 세포로부터 응집체 방출, 나이브 세포에 의한 흡수 및 내인성 단백질의 주형화된 형태학적 변화에 의한 병리학적 단백질 형태의 씨딩으로 이루어진다.
TDP-43 세포간 확산이 분자 수준에서 시험관 내 모델에서 연구되어 왔으며, 여기서 환자 뇌 유래의 불용성 TDP-43 제제는 수용체 세포에서 세포내 응집체 형성을 유도할 수 있다(문헌[Nonaka et al., Cell Reports 4 (2013), 124-134]; 문헌[Feiler et al., 2015; Porta et al., Nat. Comm., 2018]). 또한 세포내 TDP-43 응집체가 다음 세포로 확산되기 전에 엑소좀과 함께 방출되는 것이 관찰되었다(문헌[Nonaka et al., Cell Reports 4 (2013, 124-134)]). 유사하게, 아데노바이러스-형질도입된 TDP-43 발현은 세포질 응집체를 유도하며 이는 인산화, 유비퀴틴화되고 보다 중요하게는 세포간 확산을 개시하는 씨드로서 작용한다(문헌[Ishii et al., PLoS ONE 12(6): e0179375, 2017]). 환자-유래 병리학적 TDP-43은 형질전환 및 야생형 마우스에 뇌내 접종 후 내인성 TDP-43의 광범위한 침착을 유발할 수 있다(문헌[Porta et al., Nat. Comm., 2018]).
VII. TDP-43 단백질병증의 예방 및 치료
TDP-43 응집 및 병리의 확산은 ALS 및 FTD의 주요 특징이다 - 현재 이용가능한 치료법이 없는 치명적인 질환임. TDP-43의 돌연변이는 TDP-43 미스폴딩과 질환 진행 사이의 인과관계를 제공하는 ALS 및 FTD의 가족성 사례와 관련이 있다.
VIII. TDP-43 단백질병증 진단
특히 초기 단계에서 임상적 표현이 다른 질환과 겹칠 수 있기 때문에 임상적인 징후를 기반으로하는 FTD의 진단은 불충분하다.
다수의 접근법은 다양한 유형의 FTD 병리학을 구별하기 위한 생화학적 바이오마커의 개발을 목표로 한다. TDP-43의 상이한 형태에 대한 항체의 개발은 보다 민감하고 특이적 진단 도구를 생성하는 것을 가능케 할 수 있다. 생화학적 바이오마커와 병행하여 이미지화 바이오마커의 개발은 TDP-43 단백질병증에서 병리를 조기에 특이적으로 탐지할 수 있다. 뇌에서 TDP-43 침착을 이미지화하는 능력은 TDP-43 단백질병증에 대한 진단 및 약물 개발을 위한 실질적인 성과일 수 있다. 세포 투과성 항체 단편을 사용하면 이러한 검출을 가능케 할 수 있다.
상이한 단백질의 미스폴딩에 기초한 신경퇴행성 질환의 가장 초기 사건은 단백질 독성을 만드는데 대안적인 형태의 획득이다. 또한, 이러한 미스폴딩 형태는 영향을 받은 조직을 통해 관찰된 확산에 대한 기계론적 기반으로서 미스폴딩된 형태로 내인성, 정상 단백질을 모집함으로써 자가-전파될 수 있다.
주어진 단백질의 상이한 형태학적 상태에 대한 항체를 개발하기 위해, 제시된 항원의 형태가 특이적 형태학적 상태에서 주어진 표적에 대해 형태학적-특이적 항체를 상승시키도록 제어되는 초분자 항원 구조물을 설계하였다(국제공개 WO2012/055933호 및 국제공개 WO2012/020124호). 형태학적-특이적 항체는 이러한 단백질의 질환-관련 및 기능적, 내인성 형태 사이를 구별할 수 있기 때문에 다수의 이점을 제공한다. 이러한 접근법은 이러한 항체가 이의 미스폴딩된, 질환 관련 이소형을 표적으로 하는 동안 단백질의 정상적인 형태에 의해 덜 흡착될 가능성이 있기 때문에 치료 적용에 다수의 이점을 제공한다. 이와 유사하게 진단 적용의 경우 이러한 항체는 민감하고 특이적인 진단의 개발에 중요한 단백질의 질환-관련, 구조적 상태만을 인식한다.
TDP-43 단백질병증에서 TDP-43-기반 바이오마커의 사용은 여전히 확립되어야 한다. 이러한 평가는 생체유체에서 병리학적 TDP-43의 정량화에 적합한 면역분석에서 사용될 수 있는 고친화성 항체의 부족으로 인해 부분적으로 방해되었다(문헌[Feneberg et al., Molecular Neurobiology, 2018]).
따라서, 특히 인간 샘플에서, 상이한 유형의 TDP-43 단백질병증의 진단 및/또는 TDP-43, 특히 TDP-43 응집체 관련 질환, 장애 및 비정상 또는 TDP-43 단백질병증의 치료를 위해 사용되는 치료 약물의 모니터링 효율을 위한, 미스폴딩된 응집된 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 TDP-43을 검출할 수 있는 바이오마커에 대한 분명한 요구가 존재한다.
TDP-43 단백질병증은 병리학적 TDP-43을 특징으로 하는 일련의 신경퇴행성 장애로 정의된다.
IX. 선행 기술
특허출원 국제공개 WO 2008/151055호는 포유류가 신경퇴행성 질환을 갖는지 여부를 결정하기 위해 생물학적 유체에서 TDP-43 폴리펩티드 및/또는 TDP-43 폴리펩티드 절단 생성물(예컨대 25 kD 및 35 kD TDP-43 폴리펩티드 절단 생성물)의 수준을 사용하기 위한 방법 및 물질을 개시한다.
특허 출원 국제공개 WO 2013/061163호는 인간 항체 및 이의 단편, 유도체 및 변이체와 같은 폴리펩티드를 포함하는 TDP-43 특이적 결합 분자를 개시한다.
전술한 관점에서, 미스폴딩된 응집된 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 TDP-43, 특히 인간 TDP-43에 결합하는 항 TDP-43 결합 분자가 필요하다. 또한, FTD 스펙트럼 내에서 병리학 유형 간의 구별을 가능케 하는 민감성 및 특이적 바이오마커의 개발이 시급한 과제이다.
기술적인 문제는 본원에 제공된 실시형태에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 특히 미스폴딩된 응집된 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 TDP-43을 인식하는 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명 내에서, 미스폴딩된 TDP-43은 미스폴딩된 모노머 및/또는 미스폴딩된 올리고머 및/또는 미스폴딩된 응집된 및/또는 번역 후 변형된 및/또는 미스폴딩된 절단된 TDP-43을 포함한다. 번역 후 변형된 TDP-43은 인산화된, 유비퀴틴화된, 아세틸화된, 수모화된, 및/또는 메틸화된 TDP-43을 포함한다. 생리학적 TDP-43은 가용성 핵 TDP-43을 포함한다. 본 발명의 결합 분자가 TDP-43 응집체 및 인산화된 TDP-43을 포함하여 병리학적 TDP-43에 결합할 수 있음이 본원에서 입증된다(실시예 13 참조). 따라서, 본 발명은 미스폴딩된 응집된 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 TDP-43을 특이적으로 인식하는 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 이러한 결합 분자는 본원에서 "pan-TDP-43" 결합 분자, 특히 pan-TDP-43 항체로 지칭된다. 본원에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 TDP-43 결합 분자는 미스폴딩된 응집된 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 TDP-43에 동등하게 결합하거나, TDP-43의 두 부류 모두에 특이적으로 결합하면서 하나에 우선적으로 다른 하나에 결합할 수 있다. 본 발명은 또한 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 예방, 완화, 치료 및/또는 진단을 위한, 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 신경 퇴행을 유발하는 특이적 유형의 병리학을 검출 및/또는 이해(즉, 식별)하기 위한 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다. TDP-43 단백질병증에 대한 새로운 치료제의 개발을 지원하는 임상 연구에서 종단 모니터링을 위한 보다 효율적이고 정확한 대상체 선별을 가능케 하는 진단 바이오마커의 사용이 예상된다.
본 발명은 또한 약제(치료제)로서 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명은 TDP-43 단백질 또는 전체 TDP-43 단백질로부터 유도된 변형된 형태-특이적 항원 펩티드 및 펩티드 단편 및 상기 펩티드 또는 단편 또는 전체 TDP-43 단백질에 의해 수득가능하거나 수득된 항체가 TDP-43 세포간 전파를 차단, 및/또는 TDP-43 응집체를 분해 및/또는 TDP-43 씨딩을 차단 및/또는 TDP-43 단백질 또는 이의 단편의 응집을 억제한다는 가정에 기반하여 개발되었다. 본 발명의 결합 분자, 특히 폴리펩티드, 보다 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 미스폴딩된 응집된 TDP-43, 특히 세포질 및 세포외 미스폴딩된 TDP-43에 결합한다. 본 발명의 결합 분자, 특히 폴리펩티드, 보다 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전장 TDP-43 및/또는 절단된 TDP-43에 결합한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 결합 분자, 특히 폴리펩티드, 보다 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포질 미스폴딩된 TDP-43에 특이적으로 결합한다.
미스폴딩된 응집된, 또는 병리학-관련, TDP-43은 이의 정상 폴딩을 잃고(즉, 미스폴딩) 국소화된 TDP-43 단백질로 구성된다. 미스폴딩된 응집된 TDP-43은 TDP-43에 면역반응성인 사전봉입체 및 뉴런 및 신경교 세포질 봉입체(각각 NCI 및 GCI), 뉴런 핵내 봉입체(NII) 및 이영양성 신경돌기(DN)에서 발견될 수 있다.
비-응집된 생리학적 TDP-43은 생리학적으로 기능적인 TDP-43 단백질로서 주로 핵에 위치하고 세포질로 왕복하며, 생체 내 세포 환경에서 원하는 기능을 나타낼 수 있는 상태이다.
본 발명의 결합 분자, 특히 폴리펩티드, 보다 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 놀랍게도 다음의 특성 중 적어도 1, 바람직하게는 2, 보다 바람직하게는 3, 보다 더 바람직하게는 4개 모두를 갖는다:
- TDP-43 세포간 전파 차단;
- TDP-43 응집체 분해;
- TDP-43 단백질 또는 이의 단편의 응집 억제;
- TDP-43 씨딩 차단.
상기 열거된 특성 중 1, 2, 3 또는 4개의 조합과 무관하게, 본 발명의 결합 분자, 바람직하게는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TDP-43 단백질병증의 생체 내 모델 및 보다 중요하게는 TDP-43 병리가 있는 환자에서 TDP-43 병리의 형성을 개선/억제/감소시킬 수 있다.
본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 미세아교세포를 모집 및/또는 활성화할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 TDP-43 결합 분자는 세포 크기 및 활성화 상태의 관점에서 미세아교세포 형태에 영향을 미칠 수 있는 것으로 본원에서 나타났다(실시예 10 및 도 5 참조). 이는 본 발명의 TDP-43 결합 분자에 의해 입증된 TDP-43 병리의 감소에 기여할 수 있다.
본 발명에서, 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TDP-43을 특이적으로 인식한다. 본 발명의 결합 분자는 TDP-43 단백질에 특이적인 폴리펩티드 및/또는 항체 및/또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. "TDP-43을 특이적으로 인식하다"는 본 발명의 결합 분자가 TDP-43, 특히 TDP-43 내의 일부 에피토프, 특히 TDP-43 단백질의 하나 이상의 병리학적 형태에 노출된/접근가능한 에피토프에 다른 에피토프보다 더 큰 친화도로 특이적으로, 일반적으로, 그리고 집단적으로 결합하는 것을 의미한다. TDP-43에 특이적으로 결합하는 본 발명의 결합 분자, 특히 폴리펩티드, 보다 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 미스폴딩된 응집된 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 TDP-43을 특이적으로 인식한다. 바람직한 실시형태에서, 전장 인간 TDP-43은 SEQ ID NO:1의 서열을 포함, 바람직하게는 갖는다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 전장 및/또는 절단된 TDP-43 내의 한정된 결합 영역에 특이적으로 결합하며, 여기서 결합 영역은 바람직하게는 아미노산 181-195, 199-213, 307-321, 352-366, 389-411, 397-411 또는 140-200 내에 포함되며, 보다 바람직하게는 결합 영역은 SEQ ID NO:1의 서열을 갖는 전장 인간 TDP-43의 아미노산 183-188, 203-213, 204-208, 204-211, 205-210, 316-323, 358-361, 400-405, 400-406 또는 400-412 내에 포함된다. 따라서, 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 서열을 갖는 전장 인간 TDP-43의 아미노산 181-195, 199-213, 307-321, 352-366, 389-411, 397-411 또는 140-200로 이루어진 결합 영역을 포함하는 펩티드, 바람직하게는 이로 이루어진 결합 영역으로 이루어진 펩티드에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에서, 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 바람직하게는 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 183-188, 203-213, 204-208, 204-211, 205-210, 316-323, 358-361, 400-405, 400-406 또는 400-412로 이루어진 결합 영역을 포함하는 펩티드, 바람직하게는 이로 이루어진 결합 영역으로 이루어진 펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 TDP-43의 C-말단 영역 내에 결합한다. 이는 예컨대 TDP-43의 C-말단 단편이 불용성 분획에서 발견되고 따라서 병리학적으로 관련이 있을 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 보다 구체적으로, TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 400-405, 400-406 또는 400-412 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 뮤린, 뮤린화된, 인간, 인간화된, 또는 키메라 항체이다. 동등한 결합 영역이 비-인간 TDP-43에 존재함을 이해할 것이다. 따라서, 예컨대, 마우스 TDP-43 아미노산 서열(Uniprot 기탁 Q921F2 참조)도 또한 길이가 414 아미노산이고 인간 서열과 96%(398/414 잔기) 동일하다. 본 발명은 비-인간 TDP-43, 특히 뮤린 TPD-43에서 SEQ ID NO: 1을 참조하여 상기 명시된 것과 동등한 영역/펩티드에 결합하는 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특히, 본 발명은 다음의 실시형태로 요약된다:
1. 미스폴딩된 응집된 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 TDP-43, 특히 인간 TDP-43에 결합하는 TDP-43 결합 분자.
2. 선행 실시형태에 있어서, 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 181-195, 199-213, 307-321, 352-366, 389-411, 397-411 또는 140-200 내의 에피토프에 결합하는 TDP-43 결합 분자.
3. 선행 실시형태에 있어서, 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 183-188, 203-213, 204-208, 204-211, 205-210, 316-323, 358-361, 400-405, 400-406 또는 400-412 내의 에피토프에 결합하는 TDP-43 결합 분자.
4. 선행 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 결합 분자.
5. 선행 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는 결합 분자 또는 TDP-43 결합 분자:
a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
b) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
c) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
d) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
e) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
f) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 73을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
g) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
h) SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
i) SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
j) SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 145의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 146의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
k) SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 157의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
6. 선행 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 결합 분자, 또는 TDP-43 결합 분자:
a. SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
b. SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열과 적어도 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
c. SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열과 적어도 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열과 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
d. SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
e. SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO:　60의 아미노산 서열과 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
f. SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 70의 아미노산 서열과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　74의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
g. SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 80의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　84의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
h. SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 100의 아미노산 서열과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　104의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
i. SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 120의 아미노산 서열과 적어도 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 124의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
j. SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 140의 아미노산 서열과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 144의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
k. SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 150의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 154의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL).
7. 선행 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 다음을 포함하는 결합 분자, 또는 TDP-43 결합 분자:
a. SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
c. SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
d. SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
e. SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
f. SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
g. SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
h. SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
i. SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
j. SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
k. SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 144의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
l. SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
일부 실시형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
b) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
c) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
d) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
e) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
f) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
g) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
h) SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
i) SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
j) SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 145의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 146의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
k) SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 157의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 실시형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; 또는
b) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; 또는
c) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 또는
d) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 또는
e) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 또는
f) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 또는
g) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 또는
h) SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 또는
i) SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 또는
j) SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; 또는
k) SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3.
일부 실시형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
a) SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
b) SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
c) SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
d) SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
e) SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
f) SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
g) SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
h) SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
i) SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 157의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 실시형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
a) SEQ ID NO:　11과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　12와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)를 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　15의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
b) SEQ ID NO:　21과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　22와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)를 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
c) SEQ ID NO:　31과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　32와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO:　33과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　35의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO:　36의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO:　37의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
d) SEQ ID NO:　41과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　42와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO:　43과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　45의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO:　46의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO:　47의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
e) SEQ ID NO:　61과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　62와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO:　63과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　65의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO:　66의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO:　67의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
f) SEQ ID NO:　71과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　72와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO:　73과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　75의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO:　16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO:　77의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
g) SEQ ID NO:　81과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　82와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO:　83과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　85의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO:　86의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO:　87의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
h) SEQ ID NO:　101과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　102와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO:　103과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　105의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO:　106의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO:　107의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
i) SEQ ID NO:　121과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　122와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO:　123과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　125의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO:　16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO:　127의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
j) SEQ ID NO:　141과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　142와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO:　143과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　145의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO:　146의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO:　147의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
k) SEQ ID NO:　151과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO:　152와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO:　153과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO:　155의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO:　156의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO:　157의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
일부 실시형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 15와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 17과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
b) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 25와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 27과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
c) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 35와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 36과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 37과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
d) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 45와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 46과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 47과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
e) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 65와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 66과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 67과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
f) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 75와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 77과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
g) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 85와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 86과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 87과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
h) SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 105와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 106과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 107과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
i) SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 125와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 127과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
j) SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 145와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 146과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 147과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
k) SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 155와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 156과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 157과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 적어도 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3으로부터 선택되는 1, 2, 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 145의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 146의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 (f) SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; (b) SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; (c) SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; (d) SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; (e) SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 (f) SEQ ID NO: 157의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, TDP-43 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 SEQ ID NO: 10, 20, 30, 40, 60, 70, 80, 100, 120, 140, 150으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 중쇄 가변 도메인(VH)은 (a) SEQ ID NO: 11, 21, 31, 41, 61, 71, 81, 101, 121, 141, 151로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1 , (b) SEQ ID NO: 12, 22, 32, 42, , 62, 72, 82, , 102, 122, 142, 152로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2 (c) SEQ ID NO: 33, 43, 63, 73, 89, 103, 123, 143, 153, 및 ES(Glu-Ser)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, TDP-43 항체는 해당 서열의 번역 후 변형을 포함하여 SEQ ID NO: 14, 24, 34, 64, 74, 84, 104, 124, 154로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인(VL)은 (a) SEQ ID NO: 15, 25, 35, 65, 75, 85, 105, 125, 155로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1 및 (b) SEQ ID NO: 16, 36, 66, 86, 106, 156으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, (c) SEQ ID NO : 17, 27, 37, 67, 77, 87, 107, 127,, 157, 및 ES(Glu-Ser)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43항체는 (a) SEQ ID NO: 11, 21, 31, 41, 61, 71, 81, 101, 111, 121, 141, 151로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1, (b) SEQ ID NO: 12, 22, 32, 42, 62, 72, 82, 102, 122, 142, 152로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2 (c) SEQ ID NO: 33, 43, 63, 73, 83, 103, 123, 143, 153, 및 ES(Glu-Ser)로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, TDP-43 항체는 (a) SEQ ID NO: 15, 25, 35, 65, 75, 85, 105, 125, 155로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1 (b) SEQ ID NO: 16, 36, 66, 86, 106, 156으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, (c) SEQ ID NO: 17, 27, 37, 67, 77, 87, 107, 127, 157로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인(VL)은 (a) SEQ ID NO: 15, 25, 35, 45, 65, 75, 85, 105, 125, 145, 155로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1 및 (b) SEQ ID NO: 16, 36, 66, 86, 106, 156으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2, (c) SEQ ID NO: 17, 27, 37, 67, 77, 87, 107, 127, 157로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3으로부터 선택되는 적어도 1, 2, 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하이브리도마 클론 631B2A2, 633B12C8, 634H10H7, 636E5B8, 641H1E7, 642A10B11, 642D12B4, 646B7F7, 712A6B10, 809D9C2 또는 809F12D8로부터 유도된 항체에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 ACI-7069-631B2-Ab1, ACI-7069-633B12-Ab1, ACI-7069-634H10-Ab2, ACI-7069-636E5-Ab1, ACI-7069-641H1-Ab2, ACI-7069-642A10-Ab1, ACI-7069-642D12-Ab1, ACI-7069-646B7-Ab1, ACI-7071-712A6-Ab1, ACI-7071-809D9-Ab2 및 ACI-7071-809F12-Ab1로부터 선택되는 항체에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 결합 분자 또는 항체는 특히 TDP-43, 특히 가용성 TDP-43, 응집된 TDP-43 및/또는 올리고머 TDP-43에 대한 결합에 대해, ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM(예컨대 10-8 M 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 가용성 TDP-43보다 응집된 TDP-43에 대해 더 낮은 KD를 가질 수 있다. 예컨대, 본 발명의 TDP-43 결합 분자는 30 nM 이하, 구체적인 실시형태에서 1 nM 이하의 응집된 TDP-43에 대한 KD, 및 500 nM 이하의 가용성 TDP-43에 대한 KD를 가질 수 있다. 이는 표 8을 참조하여 실시예 8A에서 본 발명의 TDP-43 결합 분자에 대해 입증된다.
일 실시형태에서, 가용성 또는 응집된 FL TDP-43에 대한 결합 친화도는 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance; Biacore T200, GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 해리 상수(KD)를 결정하여 평가될 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 SPR 방법의 상세한 설명에 대해 실시예 8A 및 8B를 참조할 수 있다.
본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전형적으로 고친화도로 TDP-43에 결합한다. 예컨대, 이는 Luminex 분석에 의해 측정되는 바와 같이 200 pM 이하, 보다 바람직하게는 20 pM 이하 및 보다 더 바람직하게는 10 pM 이하의 EC50 값을 입증할 수 있다. 적합한 분석법의 추가 세부사항에 대해 실시예 3을 참조할 수 있다. 유사하게, 이들은 간접 ELISA에 의해 측정되는 바와 같이 1600 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 120 ng/ml 이하 보다 더 바람직하게는 60 ng/ml 이하의 EC50 값을 입증할 수 있다. 적합한 분석법의 추가 세부사항에 대해 실시예 4를 참조할 수 있다.
본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-응집된 생리학적 TDP-43 및 응집된 TDP-43 둘 모두에 결합한다. 따라서, 본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 가용성 및 응집된 TDP-43에 대략 동등하게 잘 결합할 수 있다. 본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-응집된 TDP-43에 비해 응집된 TDP-43에 대략 동등하게 결합할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 핵에서 비-응집된 TDP-43에 비해 세포질에서 응집된 TDP-43에 대략 동등하게 결합할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 비-응집된 TDP-43에 비해 응집된 TDP-43에 우선적으로 결합할 수 있지만, 두 종 모두에 결합한다. 보다 특히, 본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 핵에서 비-응집된 TDP-43에 비해 세포질에서 응집된 TDP-43에 우선적으로 결합할 수 있지만, 두 종 모두에 결합한다. 대안적으로, 다른 실시형태에서, 본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 응집된 TDP-43에 비해 비-응집된 TDP-43에 우선적으로 결합할 수 있지만, 두 종 모두에 결합한다. 보다 특히, 본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포질에서 응집된 TDP-43에 비해 핵에서 비-응집된 TDP-43에 우선적으로 결합할 수 있지만, 두 종 모두에 결합한다. 이러한 결합 특성은 예를 들어 면역조직화학을 사용하여 입증될 수 있다. 적합한 방법론은 관련 대조군이 제공되는 실시예 6을 참조하여 본원에 설명되어 있다. 결과는 표 7에 나와있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 본 발명의 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편(TDP-43-결합 항체 단편 및 유도체 포함)을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 TDP-43 단백질병증의 예방, 진단 및/또는 치료에서 이러한 조성물을 사용하는 면역요법 및/또는 면역진단 방법에 관한 것으로서, 여기서 유효량의 조성물이 이를 필요로 하는 대상체에 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 TDP-43에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 본 발명의 결합 분자, 특히 항체 및 이의 항원-결합 단편 및 비제한적으로 전측두엽 치매(FTD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 만성 외상성 뇌병증(CTE) 및 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE)을 포함하여 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 진단, 예방, 완화 및/또는 치료를 위한 이러한 결합 분자의 용도를 포괄한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 비제한적으로 전측두엽 치매(FTD), 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 포함하여 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 진단, 예방, 완화 및/또는 치료의 적용을 갖는다. 바람직하게는, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 진단, 예방, 완화 및/또는 치료를 위한 이러한 결합 분자의 용도는 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD) 또는 전측두엽 치매(FTD)에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 용도는 근위축성 측삭 경화증(ALS)에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 용도는 알츠하이머병(AD)에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 용도는 전측두엽 치매(FTD)에 관한 것이다.
또 다른 실시형태에서, TDP-43에 특이적인 본원에 기술된 본 발명의 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합은 전측두엽 치매(FTD, 예컨대 산발성 또는 가족성, 운동-뉴런 질환(MND)이 있거나 없는 것, 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이가 있는 것, C9orf72 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, 염색체 9p와 연결된 것, 피질기저 퇴행, 유비퀴틴-양성 TDP-43 봉입체(FTLD-TDP)가 있는 전측두엽 퇴행(FTLD), 호은성 입자 질병, 픽병, 의미형 변이체 원발 진행성 실어증(svPPA), 행동 변이 FTD(bvFTD), 비유창 변이 원발 진행성 실어증(nfvPPA) 등), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 예컨대 산발성 ALS, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 안지오제닌(ANG) 돌연변이가 있는 것), 알렉산더병(AxD), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군, 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 다운 증후군, 영국 가족성 치매, 폴리글루타민 질환(헌팅턴병 및 척수소뇌 실조 유형 3(SCA3; 마카도 조셉병으로도 알려져 있음)), 해마 경화증 치매 및 근병증(산발성 봉입체 근염, 발로신-함유 단백질(VCP)에 돌연변이가 있는 봉입체 근염(또한 골의 파제트병 및 전측두엽 치매), 테두리 액포가 있는 눈인두 근이영양증, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 있는 근섬유 근병증, 외상성 뇌손상(TBI), 루이소체가 있는 치매(DLB) 또는 파킨슨병(PD)으로부터 선택되는, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 검출, 진단 및/또는 모니터링을 위해 샘플과 접촉된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 샘플에서 TDP-43의 존재를 검출하기 위한, TDP-43에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 이러한 분자, 특히 이러한 항체의 용도를 포함한다. 따라서, 본 발명의 TDP-43 결합 분자, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 항-TDP43 항체는 그 중에서도, 예컨대 ELISA-기반 또는 표면 적응 분석을 사용하여 샘플에서 TDP-43의 존재에 대해 임상 샘플, 특히 인간 혈액, CSF, 장액(ISF) 및/또는 소변을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 조직 샘플은 뇌 조직 샘플과 같은 일부 상황에서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 또한 증상전(presymptomatic) 질환을 진단하고/하거나 질환 진행 및/또는 치료 효능을 모니터링하는데 적용된다. 일부 실시형태에 따르면, TDP-43에 특이적인 항체(예컨대, 전장 항체 또는 TDP-43 결합 단편 또는 항체 유도체)가 전측두엽 치매(FTD, 예컨대 산발성 또는 가족성, 운동-뉴런 질환(MND)이 있거나 없는 것, 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이가 있는 것, C9orf72 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, 염색체 9p와 연결된 것, 피질기저 퇴행, 유비퀴틴-양성 TDP-43 봉입체(FTLD-TDP)가 있는 전측두엽 퇴행(FTLD), 호은성 입자 질병, 픽병, 의미형 변이체 원발 진행성 실어증(svPPA), 행동 변이 FTD(bvFTD), 비유창 변이 원발 진행성 실어증(nfvPPA) 등), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 예컨대 산발성 ALS, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 안지오제닌(ANG) 돌연변이가 있는 것), 알렉산더병(AxD), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군, 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 다운 증후군, 영국 가족성 치매, 폴리글루타민 질환(헌팅턴병 및 척수소뇌 실조 유형 3(SCA3; 마카도 조셉병으로도 알려져 있음)), 해마 경화증 치매 및 근병증(산발성 봉입체 근염, 발로신-함유 단백질(VCP)에 돌연변이가 있는 봉입체 근염(또한 골의 파제트병 및 전측두엽 치매), 테두리 액포가 있는 눈인두 근이영양증, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 있는 근섬유 근병증, 외상성 뇌손상(TBI), 루이소체가 있는 치매(DLB) 또는 파킨슨병(PD)을 검출, 진단 및/또는 모니터링 하기 위해 샘플(예컨대, 혈액, 뇌척수액(CSF), 장액(ISF) 또는 뇌 조직)과 접촉된다. 본 발명의 TDP-43 결합 분자는 적합한 샘플, 특히 임상 샘플 예컨대 혈액, CSF, ISF 또는 소변에서 질환 및/또는 보다 진행된 질환을 나타내는, 적합한 대조군에 비해 상대적으로 높은 TDP-43 수준을 나타내는 TDP-43을 정량화하는데 사용될 수 있다. 다수의 적합한 면역분석 포맷이 알려져 있다. 따라서, 상기 방법(예컨대 ELISA, MSD(Meso Scale Discovery), HTRF(Homogeneous Time Resolved Fluorescence) 및 AlphaLISA)이 질환을 나타내는 높은 수준의 TDP-43으로 진단 목적으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 방법은 모니터링 목적으로 수행될 수 있다. 시간 경과에 따른 수준 증가는 질환의 진행을 나타낼 수 있다. 시간 경과에 따른 수준 감소는 질환 퇴행을 나타낼 수 있다. 상기 방법은 또한 요법을 모니터링하기 위해, 특히 특정 치료의 효능을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 성공적인 요법은 치료 후 TDP-43의 안정한 또는 감소하는 수준을 참고하여 측정될 수 있다. TDP-43 수준이 본 발명의 항체를 사용하여 측정될 때 건강한 대상체(건강한 대조군)으로부터 취해진 대조군 샘플보다 TDP-43 단백질병증 환자의 CSF 샘플에서 더 높은 것으로 본원에서 입증되었다(실시예 12). 대조군 샘플은 시험 샘플과 병렬로 실행될 수 있거나 실행되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서 대조군 수준은 유사하거나 동일한 실험 조건 하에서 건강한 대상체로부터 취해진 일련의 대조군 샘플로부터 결정되고 시험 샘플에서 결정된 수준에 대한 비교기로 사용된다. 본 발명의 결합 분자를 사용하여 적합한 샘플에서 TDP-43을 정령화하는 방법은 또한 요법(대상체의 추가 치료를 위해)을 선택하는데 사용될 수 있다. 따라서, 개인화된 치료 방법이 고려된다. 샘플은 치료 전후에 채취된다. 요법을 사용한 치료가 안정하거나 바람직하게는 치료 후 TDP-43 수준을 감소시키는 경우 해당 대상체에 대해 요법을 선택할 수 있다. 요법이 치료 후 TDP-43의 수준을 안정하게, 또는 바람직하게는 감소시키지 않는 경우 요법은 대상체에 대해 선택되지 않는다. 요법은 TDP-43 단백질병증의 치료를 위한 임의의 적합한 후보 치료제일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 요법은 본 발명의 TDP-43 결합 분자를 전형적으로 본원에 기술된 약학 조성물 형태로 포함한다.
본 발명의 TDP-43 결합 분자는 또한 특정 유형 또는 하위유형으로의 질환 분류에 사용될 수 있다. 따라서, 다음의 단계를 포함하는, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상을 분류하는 방법 또는 TDP-43 단백질병증 분류 방법이 제공된다:
a. TDP-43 수준을 적합한 대조군과 비교하여 정량화하는 본 발명의 방법을 수행하는 단계,
b. 비제한적으로 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이, C9orf72 돌연변이, TARDBP 돌연변이, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이, 안지오제닌(ANG) 돌연변이), 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이, 미오틸린 (MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 포함하여 선택적으로 대상체의 샘플에서 돌연변이를 식별하는 단계, 및
c. TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증을 분류하는 단계.
유사하게, 다음의 단계를 포함하는 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상을 분류하는 방법, 또는 43 단백질병증을 분류하는 방법이 제공된다: TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 있는 대상체로부터 수득된 샘플에서 TDP-43의 수준을 정량화하는 본 발명의 방법을 수행하는 단계로서, 여기서 상기 수준은 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 상이한 유형 또는 하위유형의 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 있는 대상체로부터 채취된 대조군 샘플과 비교되는 단계(즉, 대조군 수준의 대표적인 세트가 관심 유형 또는 하위유형에 대해 결정됨); 및 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증을 비교에 기초하여 분류하는 단계. 따라서, 분류는 시험 샘플과 하나 이상의 대조군 샘플 사이 같이 가장 근접한 일치를 결정하는 것을 기반으로 한다. 이러한 방법은 비제한적으로 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이, C9orf72 돌연변이, TARDBP 돌연변이, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이, 안지오제닌(ANG) 돌연변이), 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 포함하여 샘플에서 돌연변이를 식별하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 식별된 돌연변이는 또한 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증을 분류하기 위해 사용된다. 의심의 여지를 없애기 위해, 샘플에서 돌연변이의 식별은 임의의 적합한 방법에 의해; 예컨대 샘플 내의 핵산 분자의 핵산 서열분석에 기초하여 수행될 수 있다. 샘플은 TDP-43 수준이 결정되는 샘플과 분리되고 구별될 수 있지만, 동일한 대상체에서 유래한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 예방, 완화 및/또는 치료 방법을 제공한다. 일 실시형태에 따르면, 본 발명의 방법은 유효 농도의 결합 분자, 특히 본원에 기술된 바와 같이 TDP-43에 특이적인 본 발명의 항체(예컨대 전장 항체 또는 TDP-43 결합 단편 또는 항체 유도체)를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 TDP-43 단백질병증의 예방, 완화 및/또는 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태에 따르면, 결합 분자, 특히 TDP-43에 특이적인 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전측두엽 퇴행(FTD) 또는 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료, 완화 및/또는 예방하기 위해 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 결합 분자, 특히 TDP-43에 특이적인 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전측두엽 치매(FTD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 파킨슨병(PD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE)으로부터 선택되는 신경퇴행성 질환의 예방, 완화 및/또는 치료를 위해 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 결합 분자, 특히 TDP-43에 특이적인 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전측두엽 치매(FTD, 예컨대 산발성 또는 가족성, 운동-뉴런 질환(MND)이 있거나 없는 것, 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이가 있는 것, C9orf72 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, 염색체 9p와 연결된 것, 피질기저 퇴행, 유비퀴틴-양성 TDP-43 봉입체(FTLD-TDP)가 있는 전측두엽 퇴행(FTLD), 호은성 입자 질병, 픽병, 의미형 변이체 원발 진행성 실어증(svPPA), 행동 변이 FTD(bvFTD), 비유창 변이 원발 진행성 실어증(nfvPPA) 등), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 예컨대 산발성 ALS, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 안지오제닌(ANG) 돌연변이가 있는 것), 알렉산더병(AxD), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군, 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 다운 증후군, 영국 가족성 치매, 폴리글루타민 질환(헌팅턴병 및 척수소뇌 실조 유형 3(SCA3; 마카도 조셉병으로도 알려져 있음), 해마 경화증 치매 및 근병증(산발성 봉입체 근염, 발로신-함유 단백질(VCP)에 돌연변이가 있는 봉입체 근염; 또한 골의 파제트병 및 전측두엽 치매), 테두리 액포가 있는 눈인두 근이영양증, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 있는 근섬유 근병증, 외상성 뇌손상(TBI), 루이소체가 있는 치매(DLB) 또는 파킨슨병(PD)으로부터 선택되는 질환의 예방, 완화 및/또는 치료를 위해 투여된다.
본 발명의 실시형태의 상세한 설명
X. 정의
본원에서 사용된 바와 같이, "항원 결합 분자"는 항원, 특히 TDP-43에 특이적으로 또는 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자이다. 결합 분자는 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있거나 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 항- TDP-43 결합 분자는 특이적 인식 부위인 에피토프에서 TDP-43 단백질에 결합하는 분자, 예컨대 항-TDP-43 항체 또는 이의 단편이다. 즉, 본 발명의 항원-결합 분자는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열 내의 에피토프에 결합한다. 본원에 제공된 항원-결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 전장 TDP-43을 인식한다. 다른 항-TDP-43 결합 분자는 또한 다가 분자, 다중-특이적 분자(예컨대, 디아바디), 융합 분자, 압타머, 아비머, 또는 다른 천연 발생 또는 재조합적으로 생성된 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 예시적인 항원-결합 분자는 항체-유사 분자를 포함한다. 항체-유사 분자는 표적 분자로의 결합에 의해 기능을 나타낼 수 있는 분자이며(예컨대, 문헌[Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10]; 문헌[Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469]; 문헌[Protein Science 2006, 15:14-27] 참조), 예컨대, DARPins(국제공개 WO 2002/020565호), 아피바디(Affibody)(국제공개 WO 1995/001937호), 아비머(Avimer)(국제공개 WO 2004/044011호; 국제공개 WO 2005/040229호), 애드넥틴(Adnectin)(국제공개 WO 2002/032925호) 및 피노머(fynomer)(국제공개 WO　2013/135588호)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "항 TDP-43 항체" 및 "TDP-43에 결합하는 항체" 또는 단순히 "항체"는 항체가 TDP-43을 표적으로 하는 진단 및/또는 치료제로서 유용할 수 있도록 충분한 친화도로 TDP-43에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일반적으로, 용어 "항체"는 본원에서 최광의로 사용되며 비제한적으로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예컨대 이특이적 또는 바이파라토픽(biparatopic) 항체), 완전-인간 항체 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하여, 다양한 항체 구조를 포함한다. 본 발명 내의 항체는 또한 키메라 항체, 재조합 항체, 재조합 항체의 항원-결합 단편, 인간화 항체 또는 파지 표면 상에 디스플레이되거나 키메라 항원 수용체(CAR: chimeric antigen receptor) T 세포의 표면 상에 디스플레이되는 항체일 수 있다.
항체의 "항원-결합 단편"은 온전한 항체의 일부를 포함하고 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab' -SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자(예컨대 scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
단백질의 한정된 영역 내의 "에피토프에 결합하는 항체"는 단백질에 결합하기 위해 해당 영역 내의 하나 초과의 아미노산의 존재를 필요로 하는 항체이다.
특정 실시형태에서, 단백질의 한정된 영역 내의 "에피토프에 결합하는 항체"는 단백질의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이 분석으로 식별되며, 생성된 변경된 단백질(예컨대 에피토프를 포함하는 변경된 단백질)에 대한 항체의 결합은 변경되지 않은 단백질의 결합의 적어도 20%인 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 단백질의 한정된 영역 내의 "에피토프에 결합하는 항체"는 단백질의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이 분석으로 식별되며, 생성된 변경된 단백질(예컨대 에피토프를 포함하는 변경된 단백질)에 대한 항체의 결합은 변경되지 않은 단백질의 결합의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%인 것으로 결정된다. 특정 실시형태에서, 항체의 결합은 FACS, WB에 의해, 또는 ELISA와 같은 적합한 결합 분석에 의해 결정된다.
본 발명의 맥락에서 사용된 용어 "~에 대한 결합"은 서로 적어도 2개의 "항원-상호작용-부위"의 결합(상호작용)을 정의한다. 본 발명에 따라, 용어 "항원-상호작용-부위"는 폴리펩티드의 모티프, 즉, TDP-43의 특이적 항원 또는 특이적 항원 군과 특이적으로 상호작용 능력을 나타내는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 부분을 정의한다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인식"을 정의하는 것으로 이해된다. "특이적으로 인식하는"은 본 발명에 따라 항체가 본원에 정의된 바와 같은 TDP-43의 적어도 2개의 아미노산과 특이적으로 상호작용 및/또는 결합할 수 있음, 특히 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 181-195, 199-213, 307-321, 352-366, 389-411, 397-411 및 140-200의 적어도 2개 아미노산에 상호작용/결합할 수 있음, 보다 더 특히 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 183-188, 203-213, 204-208, 204-211, 205-210, 316-323, 358-361, 400-405, 400-406 또는 400-412 내의 적어도 2개의 아미노산에 결합하여 상호작용할 수 있음을 의미한다.
용어 "pan TDP-43 항체"는 모노머 TDP-43, 올리고머 TDP-43, 번역 후 변형된 TDP-43(예컨대 인산화된, 유비퀴틴화된, 아세틸화된, 수모화된, 및/또는 메틸화된), 응집된 TDP-43 및 절단된 TDP-43을 포함하여, 미스폴딩된 응집된 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 TDP-43에 결합하는 항체를 지칭한다.
본 발명에 따라 사용된 용어 "특이적 상호작용"은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 유사한 구조의 (폴리)펩티드와 교차반응하지 않거나 본질적으로 교차반응하지 않음을 의미한다. 따라서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 특이적으로 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 181-195, 199-213, 307-321, 352-366, 389-411, 397-411 및 140-200 내의 특정 아미노산 서열에 의해 형성된 TDP-43의 구조에 결합/상호작용하며, 보다 특히 인간 TDP-43(SEQ ID NO:　1)의 아미노산 잔기 183-188, 203-213, 204-208, 204-211, 205-210, 316-323, 358-361, 400-405, 400-406 또는 400-412 내의 특정 아미노산 서열에 의해 형성된 TDP-43의 구조에 결합/상호작용한다.
항원-결합 분자, 특히 조사 중인 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 패널의 교차반응성이 예컨대 관심 (폴리)펩티드뿐만 아니라 다소 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 밀접하게 관련된 다수의 (폴리)펩티드에 대해 통상적인 조건 하에서(예컨대, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)] 및 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)] 참조) 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 패널의 결합을 평가함으로써 시험될 수 있다. 본원에 정의된 TDP-43의 특정 구조, 예컨대 본원에 정의된 TDP-43의 특정 에피토프 또는 (폴리)펩티드/단백질에 결합하지만 동일한 TDP-43의 임의의 다른 에피토프 또는 (폴리)펩티드에 결합하지 않거나 본질적으로 결합하지 않는 다른 구조물만이(즉, 항체, 이의 항원-결합 단편 등) 관심 에피토프 또는 (폴리)펩티드/단백질에 대해 특이적인 것으로 간주되고 본원에 제공된 방법에 따라 추가로 연구하기 위해 선택된다. 이러한 방법은 그 중에서도 구조적으로 및/또는 기능적으로 밀접하게 관련된 분자와 결합 연구, 차단 및 경쟁 연구를 포함할 수 있다. 이러한 결합 연구는 또한 FACS 분석, 표면 플라즈몬 공명(SPR, 예컨대 BIACORETM 사용), 분석적 초원심분리, 등온 적정 열량계, 형광 이방성, 형광 분광법 또는 방사성표지된 리간드 결합 분석을 포함한다.
따라서, 특이성은 당업계에 공지된 방법 및 본원에 기술된 방법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 이러한 방법은 비제한적으로 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-시험 및 펩티드 스캔을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 매우 특이적이다. 모노클로날 항체는 본질적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. 변형된 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단에 속하는 것으로서 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체가 문헌[Kohler, Nature 256 (1975), 495]에 의해 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리클로날 항체"는 하나 이상의 다른, 비-동일한 항체 사이에서 또는 존재 하에 생산된 항체를 지칭한다. 일반적으로, 폴리클로날 항체는 동일하지 않은 항체를 생산하는 다른 여러 B-림프구의 존재 하에 B-림프구로부터 생산된다. 통상적으로, 폴리클로날 항체는 면역화된 동물로부터 직접적으로 수득된다.
본원에서 사용된 용어 "완전 인간 항체"는 인간 면역글로불린 단백질 서열만 포함하는 항체를 지칭한다. 완전 인간 항체는 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 세포로부터 유도된 하이브리도마에서 생산되는 경우 뮤린 탄수화물 사슬을 함유할 수 있다. 유사하게, "마우스 항체" 또는 "뮤린 항체"는 마우스/뮤린 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 대안적으로, "완전 인간 항체"는 랫트, 랫트 세포, 랫트 세포로부터 유도된 하이브리도마에서 생산되는 경우 랫트 탄수화물 사슬을 함유할 수 있다. 유사하게, 용어 "랫트 항체"는 랫트 면역글로불린 서열만을 포함하는 항체를 지칭한다. 완전 인간 항체는 또한 예컨대 완전 인간 항체의 생산 및 스크리닝을 가능케 하는 널리 사용되는 스크리닝 기술인 파지 디스플레이에 의해 생산될 수 있다. 또한 파지 항체가 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 파지 디스플레이 방법은 예컨대 미국특허 US 5,403,484호, 미국특허 US 5,969,108호 및 미국특허 US 5,885,793호에 기술되어 있다. 완전 인간 항체의 개발을 가능케 하는 다른 기술은 마우스 하이브리도마 기술의 변형을 포함한다. 마우스는 자신의 고유한 마우스 유전자와 교환하여 인간 면역글로불린 유전자좌를 함유하도록 형질전환된다(예컨대, 미국특허 US 5,877,397호 참조).
용어 "키메라 항체"는 다른 인간 또는 비-인간 종(예컨대, 마우스, 말, 토끼, 개, 소, 닭)의 항체 영역(예컨대, 불변 영역)과 융합되거나 키메라화된 본 발명의 가변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다.
용어 항체는 또한 재조합 인간 항체, 이종 항체 및 이종하이브리드 항체에 관한 것이다. 용어 "재조합 (인간) 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 서열 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환된 동물(예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체; 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 다른 DNA 서열에 대해 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역(존재하는 경우)을 포함한다. 그러나, 이러한 항체는 시험관 내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 동물 형질전환이 사용되는 경우, 생체 내 체세포 돌연변이유발)에 적용될 수 있으며 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 관련되지만, 생체 내에서 인간 항체 생식세포 레퍼토리 내에서 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"이종 항체"는 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 비-인간 유기체와 관련하여 정의된다. 이러한 용어는 트랜스제닉 비-인간 동물로 이루어지지 않은 유기체에서 발견되는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 지칭하며, 일반적으로 트랜스제닉 비-인간 동물 이외의 종으로부터 유래한다.
용어 "이종하이브리드 항체"는 상이한 유기체의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다. 예컨대, 뮤린 경쇄와 결합된 인간 중쇄를 갖는 항체는 이종하이브리드 항체이다. 이종하이브리드 항체의 예는 키메라 및 인간화된 항체를 포함한다.
용어 항체는 또한 인간화된 항체에 관한 것이다. 비-인간(예컨대 뮤린 또는 토끼) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 서열)이다. 종종, 수용체의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 비-인간 종(공여체 항체) 예컨대 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응할 것이며 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 보다 상세한 사항을 위해 문헌[Jones et al., Nature 321 (1986), 522-525]; 문헌[Reichmann Nature 332 (1998), 323-327] 및 문헌[Presta Curr Op Struct Biol 2 (1992), 593-596.]을 참조한다.
항체의 인간화를 위한 인기있는 방법은 CDR 그래프팅을 포함하며, 여기서 비-인간 "공여체" 항체의 기능적인 항원-결합 부위가 인간 "수용체" 항체 상으로 그래프팅된다. CDR 그래프팅 방법이 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 미국특허 US 5,225,539호, 미국특허 US 5,693,761호 및 미국특허 US 6,407,213에 기술되어 있다. 또 다른 관련된 방법은 유전자 재배열 및 유전자 전환을 겪을 수 있는 하나 이상의 인간화된 면역글로불린 유전자좌를 함유하도록 유전적으로 조작된 트랜스제닉 동물로부터 인간화된 항체의 생산이다(예컨대, 미국특허 US 7,129,084호 참조).
따라서, 본 발명의 맥락에서, 용어 "항체"는 완전 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이러한 면역글로불린 분자의 부분(즉, "이의 항원-결합 단편")에 관한 것이다. 또한, 상기 논의된 바와 같이, 상기 용어는 변형된 및/또는 변경된 항체 분자에 관한 것이다. 상기 용어는 또한 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된/합성된 항체에 관한 것이다. 상기 용어는 또한 온전한 항체뿐만 아니라 이의 항체 단편, 예컨대 분리된 경쇄 및 중쇄, Fab, Fv, Fab', Fab'-SH, F(ab')2에 관한 것이다. 용어 항체는 또한 비제한적으로 완전 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, CDR-그래프팅된 항체 및 항체 구조, 예컨대 단일 쇄 Fv(scFv) 또는 항체-융합 단백질을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 가지며, 여기서 이러한 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일반적으로 scFv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며 이는 scFv로 하여금 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 한다. 단일 쇄 항체의 생산을 위해 설명된 기술이 예컨대 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, N.Y. (1994), 269-315]에 기술되어 있다.
본원에 기술된 "Fab 단편"은 하나의 경쇄 및 CH1 및 하나의 중쇄의 가변 영역으로 이루어져 있다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 다이설파이드 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 다이설파이드 결합에 의해 그리고 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및 VH 도메인 및 C H1 도메인을 함유하는 하나의 중쇄의 일부 및 또한 CH1과 C H2 도메인 사이의 영역을 함유하며, 이에 따라 사슬간 다이설파이드 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자가 형성될 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하며, 이에 따라 사슬간 다이설파이드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성된다. F(ab')2 단편은 따라서 2개의 중쇄 사이의 다이설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역을 포함하지만 불변 영역은 없다.
본 발명에 따라 사용될 항체, 항체 구조물, 항체 단편, 항체 유도체(모두 Ig-유도됨) 또는 이들의 상응하는 면역글로불린 사슬은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여, 예컨대 아미노산 결실, 삽입, 치환, 부가, 및/또는 재조합에 의해 및/또는 당업계에 공지된 임의의 다른 변형을 단독으로 또는 조합하여 추가로 변형될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열의 기초가 되는 DNA 서열에 이러한 변형을 도입하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있으며; 예컨대 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual]; 문헌[Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition (1989) and 3rd edition (2001)]을 참조한다. 용어 "Ig-유도된 도메인"은 특히 적어도 하나의 CDR을 포함하는 (폴리)펩티드 구조물에 관한 것이다. 언급된 Ig-유도된 도메인의 단편 또는 유도체는 상기 항체 분자의 일부이고/이거나 화학적/생화학적 또는 분자 생물학적 방법에 의해 변형된 (폴리)펩티드를 정의한다. 해당 방법이 당업계에 공지되어 있고 특히 실험실 매뉴얼에 기술되어 있다(문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual]; 문헌[Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition (1989) and 3rd edition (2001)]; 문헌[Gerhardt et al., Methods for General and Molecular Bacteriology ASM Press (1994)]; 문헌[Lefkovits, Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques]; 문헌[Academic Press (1997); Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)] 참조).
본원에서 사용된 용어 "CDR"은 당업계에 잘 알려진 "상보성 결정 영역"에 관한 것이다. CDR은 상기 분자의 특이성을 결정하고 특이적 리간드와 접촉하는 면역글로불린의 일부이다. CDR은 분자의 가장 가변적인 부분이고 이러한 분자의 다양성에 기여한다. 3가지 CDR 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3 각각의 V 도메인에 존재한다. CDR-H는 가변 중쇄의 CDR 영역을 나타내고 CDR-L은 가변 경쇄의 CDR 영역에 관한 것이다. VH는 가변 중쇄를 의미하고 VL은 가변 경쇄를 의미한다. Ig-유도된 영역의 CDR 영역은 문헌[Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th edit. NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services (1991)]에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다. 본원에 제공된 CDR 서열은 Kabat에 따라 정의된다. 그러나, 본 발명은 CDR 서열이 임의의 유용한 식별/번호매김 방식에 따라 정의된 결합 분자를 포함하도록 의도된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예컨대, Chothia(면역글로불린의 초가변 영역에 대한 정규 구조. 문헌[Chothia C, Lesk AM. J Mol Biol. 1987 Aug 20; 196(4):901-17]), IMGT(IMGT, 국제 ImMunoGeneTics 데이터베이스. 문헌[Giudicelli V, Chaume D, Bodmer J, Muller W, Busin C, Marsh S, Bontrop R, Marc L, Malik A, Lefranc MP. Nucleic Acids Res. 1997 Jan 1; 25(1):206-11] 및 면역유전학적 분석에 대한 고유 데이터베이스 번호매김 시스템. 문헌[Lefranc MP. Immunol Today. 1997 Nov; 18(11):509]), MacCallum(MacCallum RM, 문헌[Martin AC, Thornton JM, J Mol Biol. 1996 Oct 11; 262(5):732-45]) 및 Martin(Abhinandan KR, Martin ACR. Kabat에 대한 분석 및 개선 및 항체 가변 도메인의 구조적으로 올바른 번호매김. 문헌[Mol Immunol. (2008) 45:3832-9. 10.1016/j.molimm.2008.05.022]) 번호매김 방식이 CDR을 정의하기 위해 채택될 수 있다.
따라서, 본 발명의 맥락에서, 전술된 항체 분자는 완전 항체(면역글로불린, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgA1, IgGA2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD 또는 IgE), F(ab)-, Fab'-SH-, Fv-, Fab'-, F(ab')2- 단편, 키메라 항체, CDR-그래프팅된 항체, 완전 인간 항체, 2가 항체-구조물, 항체-융합 단백질, 합성 항체, 2가 단일 사슬 항체, 3가 단일 사슬 항체 및 다가 단일 사슬 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다
"인간화 접근법"이 당업계에 잘 알려져 있으며 특히 항체 분자, 예컨대 Ig-유도된 분자에 대해 기술되어 있다. 용어 "인간화된"은 비-인간(예컨대, 뮤린) 항체 또는 비-인간 항체로부터 유도된 서열의 일부 부분을 함유하는 이의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab'), scFv, 또는 항체의 다른 항원-결합 부분 서열)의 인간화된 형태를 지칭한다. 인간화된 항체는 인간 면역글로불린의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기가 원하는 결합 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 예컨대 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린을 포함한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 그리고 일반적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다; 특히 문헌[Jones et al., Nature 321 (1986),522-525, Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 (1992),593-596]을 참조한다. 비-인간 항체의 인간화 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 항체의 본래 결합 활성을 여전히 유지하는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산을 갖는다. 항체/항체 분자의 인간화 방법이 문헌[Jones et al., Nature 321 (1986),522-525]; 문헌[Reichmann et al., Nature 332 (1988),323-327]; 및 문헌[Verhoeyen et al., Science 239 (1988),1534-1536]에 더 자세히 기술되어 있다. 인간화된 항체에 대한 특정 예, 예컨대 EpCAM에 대한 항체가 당업계에 공지되어 있다(예컨대 문헌[LoBuglio, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997), 1562] 및 문헌[Khor, Proceedings of the American Society of Clinical Oncology Abstract (1997), 847] 참조).
따라서, 본 발명의 맥락에서, 인간화되고 약학 조성물에서 성공적으로 사용될 수 있는 항체 분자 또는 이의 항원-결합 단편이 제공된다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 특이성은 상기 정의된 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열의 특성에 의해 발현될 수 있을 뿐만 아니라 항체가 결합할 수 있는 에피토프에 의해 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 일 실시형태에서, 본 발명의 항체와 동일한 에피토프를 인식하는 항-미스폴딩된 TDP-43 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
당업자는 에피토프가 TDP-43 단백질에 포함될 수 있지만, 이의 분해 생성물에도 또한 포함될 수 있거나 화학적으로 합성된 펩티드일 수 있음을 이해할 수 있다. 아미노산 위치는 TDP-43 단백질의 서열에서 해당 아미노산 서열의 위치를 입증하기 위해서만 표시된다. 본 발명은 상기 에피토프를 포함하는 모든 펩티드를 포함한다. 펩티드는 길이가 100개 아미노산 초과의 폴리펩티드의 일부일 수 있거나 100개 미만, 바람직하게는 50개 미만, 보다 바람직하게는 24개 미만의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 16개 미만의 아미노산의 작은 펩티드일 수 있다. 이러한 펩티드의 아미노산은 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산(예컨대, 베타-아미노산, 감마-아미노산, D-아미노산)일 수 있거나 이들의 조합일 수 있다. 또한, 본 발명은 에피토프의 각각의 레트로-인버소 펩티드를 포함할 수 있다. 펩티드는 결합하지 않을 수 있거나 결합될 수 있다. 이는 예컨대 소분자(예컨대, 약물 또는 형광단), 고분자량 중합체(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 이민(PEI), 히드록시프로필메틸아크릴레이트(HPMA) 등)에, 또는 단백질, 지방산, 당 모이어티에 결합될 수 있거나 막에 삽입될 수 있다.
문제의 항체와 본 발명의 항체가 동일한 에피토프를 인식하는지 여부를 시험하기 위해, 다음의 경쟁 연구가 수행될 수 있다: 3 MOI(감염 다중도)로 감염된 Vero 세포를 20시간 후에 다양한 농도의 문제의 항체를 경쟁자로 하여 1시간 동안 함께 인큐베이션 하였다. 제2 인큐베이션 단계에서, 본 발명의 항체를 100 nM의 일정한 농도로 적용하고 이의 결합을 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대해 지시된 형광-표지된 항체를 사용하여 유세포 분석법으로 검출하였다. 문제의 항체의 농도에 반대-비례(반비례)하는 결합은 항체 둘 모두가 동일한 에피토프를 인식함을 나타낸다. 그러나, 사용될 수 있는 다수의 다른 분석법이 공지되어 있다.
본 발명은 또한 TDP-43의 천연 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드에 대한 특이적 항체의 생산에 관한 것이다. 이러한 생산은, 예컨대 동물, 예컨대 마우스의 면역화에 기초한다. 그러나, 항체/항혈청 생산을 위한 다른 동물이 본 발명 내에서 고려된다. 예컨대, 모노클로날 및 폴리클로날 항체가 토끼, 마우스, 염소, 당나귀 등에 의해 생산될 수 있다. TDP-43의 상응하는 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 벡터 내로 서브클로닝될 수 있으며, 여기서 재조합 폴리펩티드는 발현이 가능한 유기체, 예컨대 박테리아에서 발현되어야 한다. 따라서, 발현된 재조합 단백질은 마우스에 복강내 주입될 수 있고 생성된 특이적 항체는, 예컨대 심장 내 혈액 천자에 의해 제공되는 마우스 혈청으로부터 수득될 수 있다. 본 발명은 또한 첨부된 실시예에서 예시되는 바와 같이 DNA 백신 전략을 사용하여 천연 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드에 대한 특이적 항체의 생산을 고려한다. DNA 백신 전략은 당업계에 잘 알려져 있으며 유전자 총 또는 제트 주입 및 근육 내 또는 피내 주사에 의한 리포좀-매개 전달을 포함한다. 따라서, TDP-43의 폴리펩티드 또는 단백질 또는 에피토프, 특히 본원에 제공된 항체의 에피토프에 대한 항체가 TDP-43의 원하는 폴리펩티드 또는 단백질 또는 에피토프, 특히 본 발명의 항체의 에피토프를 발현하는 벡터를 직접적으로 근육 내 주사에 의해 동물을 직접적으로 면역화하여 수득될 수 있으며, 이는 SEQ ID NO:1의 아미노산 잔기 181-195, 199-213, 307-321, 352-366, 389-411, 397-411 및 140-200 내에 있으며, 보다 특히 SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 aa 183-188, 203-213, 204-208, 204-211, 205-210, 316-323, 358-361, 400-405, 400-406, 400-412 내에 있는 본 발명의 항체의 에피토프이다. 수득된 특이적 항체의 양은 ELISA를 사용하여 정량화될 수 있으며, 이는 또한 하기 기술되어 있다. 항체 생산을 위한 추가 방법이 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 문헌[Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988]을 참조한다.
따라서, 지정된 검정 조건 하에서, TDP-43의 구체화된 항체 및 상응하는 에피토프는 서로 결합하며 샘플에 존재하는 다른 성분에는 상당한 양으로 결합하지 않는다. 이러한 조건 하의 표적 분석물에 대한 특이적 결합은 특정 표적 분석물에 대한 이의 특이성을 위해 선택된 결합 모이어티를 필요로 할 수 있다. 다양한 면역분석 포맷이 특정 항원과 특이적으로 반응성인 항체를 선택하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 고상 ELISA 면역분석법을 통상적으로 사용하여 분석물과 특이적으로 면역반응성인 모노클로날 항체를 선택한다. 면역분석 포맷 및 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 조건의 설명에 대해, 문헌[Shepherd and Dean (2000), Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press and/or Howard and Bethell]을 참조한다. 전형적으로, 특이적 또는 선택적 반응은 노이즈에 대한 배경 신호의 적어도 2배이며 보다 전형적으로는 배경보다 10배 초과 내지 100배 더 크다. 당업자는 신규 폴리펩티드에 대해 지시된 특이적 결합 분자를 제공하고 생성할 수 있는 위치에 있다. 특이적 결합-분석의 경우, 원치 않는 교차 반응성을 피하기 위해 이것이 쉽게 사용될 수 있으며, 예컨대, 폴리클로날 항체는 공지된 방법(문헌[Shepherd and Dean, loc. cit.] 참조)에 의해 용이하게 정제되고 선택될 수 있다.
항체의 "부류"는 중쇄가 소유한 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류가 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들 몇몇은 하위부류(이소타입), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 지칭된다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예컨대, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 적절한 변형을 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 도입하여, 또는 펩티드 합성으로 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예컨대 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 잔기로의 삽입 및/또는 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구조물이 원하는 특성, 예컨대, 항원-결합을 보유하는 한, 최종 구조물에 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이 유발의 관심 부위는 CDR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하의 표 1에 제시되어 있다. 보다 실질적인 변화가 "예시적인 치환"의 표제 하에 표 1에 제공되어 있으며, 아미노산 측쇄 부류를 참조하여 하기 추가로 상세히 기술되어 있다. 아미노산 치환은 관심 항체 및 원하는 활성, 예컨대 보유된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝된 생성물 내로 도입될 수 있다
본래 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
본래 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gin
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gin (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 통상적인 측쇄 특성에 따라 군을 지을 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
한 유형의 치환 변이체는 모 항체(예컨대, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 수반한다. 일반적으로 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체는 모 항체에 비해 특정 생물학적인 특성(예컨대, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 변형(예컨대, 개선)을 가질 것이고/이거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는 예컨대 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기법 예컨대 본원에 기술된 것들을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간단하게, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고 특정 생물학적 활성(예컨대, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
예컨대, 항체 친화도를 개선하기 위해 CDR에서 변경(예컨대, 치환)이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟", 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기(예컨대, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 결합 친화도에 대해 시험될 생성된 변이체 VH 또는 VL을 갖는 SDR(a-CDR)에서 이루어질 수 있다. 2차 라이브러리를 구성하고 재선택함에 의한 친화도 성숙이 예컨대 문헌[Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).)]에 기술되어 있다. 친화도 성숙의 일부 실시형태에서, 다양성은 임의의 다양한 방법(예컨대, 오류가 발생하기 쉬운 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발)에 의해 성숙을 위해 선택된 다양한 유전자에 도입된다. 이어서 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서 라이브러리는 원하는 친화도를 가진 임의의 항체 변이체를 식별하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하기 위한 또 다른 방법은 CDR-지시된 접근법을 수반하며, 여기서 몇몇 CDR 잔기(예컨대 한번에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 CDR 잔기는 예컨대 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다. CDR- H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
특정 실시형태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 CDR 내에서 발생할 수 있다. 예컨대, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예컨대, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 CDR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR "핫스팟" 또는 SDR의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시형태에서, 각각의 CDR은 변경되지 않거나, 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 식별을 위한 유용한 방법을 소위 알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 하며, 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science , 244: 1081-1085]에 의해 기술되어 있다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군(예컨대, 하전된 잔기 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)이 식별되고 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 치환되어 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부가 결정된다. 추가의 치환이 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정형 구조가 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 식별하기 위해 사용된다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기가 있는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소(예컨대 ADEPT 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경하여 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 FC 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형, 바이안테너리 올리고사카라이드를 포함한다. 예컨대, 문헌[Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예컨대 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 "스템"의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 항체의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 가진 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
일 실시형태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 가진 항체 변이체가 제공된다. 예컨대, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 푸코스의 양은 예컨대 국제공개 WO 2008/077546호에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 Asn 297(예컨대, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조)에 부착된 모든 글리코구조의 합에 상대적인, Asn297에서 당 사슬 내의 푸코스의 평균 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내의 대략 위치 297에 위치한 아스파라진 잔기를 지칭하지만(Fc 영역 잔기의 Eu 번호매김; 문헌[Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)] 참조); Asn297은 또한 항체의 사소한(minor) 서열 변이체로 인해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉, 294 내지 300 사이의 위치에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화된 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예컨대, 미국 특허출원공개 US 2003/0157108호(Presta, L.); 미국 특허출원공개 US 2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조한다. "디프코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 공개문헌의 예는 다음을 포함한다: 미국 특허출원공개 US 2003/0157108호; 국제공개 WO 2000/61739호; 국제공개 WO 2001/29246호; 미국 특허출원공개 US 2003/0115614호; 미국 특허출원공개 US 2002/0164328호; 미국 특허출원공개 US 2004/0093621호; 미국 특허출원공개 US 2004/0132140호; 미국 특허출원공개 US 2004/0110704호; 미국 특허출원공개 US 2004/0110282호; 미국 특허출원공개 US 2004/0109865호; 국제공개 WO 2003/085119호; 국제공개 WO 2003/084570호; 국제공개 WO 2005/035586호; 국제공개 WO 2005/035778호; 국제공개 W02005/053742호; 국제공개 W02002/031140호; 문헌[Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 디푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허출원공개 US 2003/0157108 Al호, Presta, L; 및 국제공개 WO 2004/056312 Al호, Adams et al., 특히 실시예 11), 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예컨대, 문헌[Yamane-Ohnuki et al., Bioteeh. Bioeng. 87: 614 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al., Bioteehnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 국제공개 W02003/085 l07호)를 포함한다.
예컨대 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테너리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된, 이등분된 올리고사카라이드가 있는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예가 예컨대 국제공개 WO 2003/011878호(Jean-Mairet et al.); 미국특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 미국 특허출원공개 US 2005/0123546호(Umana et al.)에 기술되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에 적어도 하나의 갈락토스 잔기가 있는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체가, 예컨대 국제공개 WO 1997/30087호(Patel et al.); 국제공개 WO 1998/58964호(Raju, S.); 및 국제공개 WO 1999/22764호(Raju, S.)에 기술되어 있다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입될 수 있으며, 이에 따라 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에 아미노산 변형(예컨대 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 이펙터 기능 모두가 아닌 일부를 보유하는 항체 변이체를 고려하며, 이는 생체 내 항체 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능(예컨대 보체 활성화 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용에서 바람직한 후보가 된다. 시험관 내 및/또는 생체 내 세포독성 분석은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예컨대 Fc 수용체(FcR) 결합 분석이 항체가 FcγR 결합이 결여되어 있지만(따라서 ADCC 활성이 결여되어 있을 수 있음), FcRn 결합 능력을 유지하는지 확인하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구 및 미세아교세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현이 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464페이지 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관 내 분석의 비-제한적인 예가 미국특허 제5,500,362호(예컨대 문헌[Hellstrom, I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499- 1502 (1985)]; 미국특허 제5,821,337호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기술되어 있다.
대안적으로, 비-방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예컨대 유세포 분석을 위한 ACTITM 비-방사성 세포독성 분석(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 분석(Promega, Madison, WI). 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다.
대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체 내, 예를 들어 문헌[Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같이 동물 모델에서 평가될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인하기 위해 C1q 결합 분석을 또한 수행할 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO 2006/029879호 및 국제공개 WO 2005/100402호의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석이 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; 문헌[Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참조). FcRn 결합 및 생체 내 제거율/반감기 측정은 또한 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
이펙터 기능이 감소된 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체(미국특허 제7,332,581호)를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327의 2개 이상의 위치에 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다. 대안적으로, 이펙터 기능이 감소된 항체는 Fc 영역 잔기 234, 235 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들, 잔기 234 및 235가 알라닌으로 치환되고 329가 글리신으로 치환된 소위 "PG-LALA" Fc 돌연변이체(문헌[Lo, M. et al., Journal of Biochemistry, 292, 3900-3908])를 포함한다.
FcR에 대한 개선되거나 감소된 결합을 가진 특정 항체 변이체가 기술되어 있다(예컨대, 미국특허 제6,737,056호; 국제공개 WO 2004/056312호, 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
특정 실시형태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기의 EU 번호매김)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역에서 변경이 이루어져 변경된(즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 상보체 의존성 세포독성(CDC)이 초래되며, 예컨대 미국특허 제6,194,551호, 국제공개 WO 99/51642호, 및 문헌[Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기술되어 있다.
반감기가 증가하고 모체 IgG를 태아에게 전달하는 역할을 하는(문헌[Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kirn et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체가 미국 특허출원공개 US2005/0014934Al호(Hinton et al.)에 기술되어 있다. 이러한 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 이들 안에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 하나 이상의 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에 치환을 갖는 것, 예컨대, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것(미국 특허 제7,371,826호)을 포함한다. 또한 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 국제공개 WO 94/29351호를 참조한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 항체 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예컨대 "thioMAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시형태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 위치되고 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시키는데 사용하여 본원에 추가로 기술되는 바와 같은 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 임의의 하나 이상의 다음의 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(Kabat 번호매김); 중쇄의 A118(EU 번호매김); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호매김). 시스테인 조작된 항체는 예컨대 미국 특허 제7,521,541호에 기술된 바와 같이 생성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 제공된 항체는 당업계에 공지되어 있고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체 유도체화에 적합한 모이어티는 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레 무수 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌, 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 이의 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형이거나 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 중합체의 수 및/또는 종류는 비제한적으로 개선될 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 한정된 조건 하에서 요법에 사용될지 여부를 포함하여 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체와 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 일 실시형태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 비제한적으로 일반 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 인접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함한다.
항체는 예컨대 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 일 실시형태에서, 본원에 기술된 항-미스폴딩된 TDP-43 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩할 수 있다(예컨대, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄). 추가 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예컨대, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시형태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 숙주 세포는 다음을 포함한다(예컨대, 다음으로 형질전환된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포 또는 림프구 세포(예컨대 YO, NSO, Sp20)이다. 일 실시형태에서, 항-미스폴딩된 TDP-43 항체의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건 하에 상기 제공된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항-미스폴딩된 TDP-43 항체의 재조합 생산의 경우, 예컨대 전술된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산이 단리되어 추가 클로닝 및/또는 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템에서 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입된다. 이러한 핵산은 용이하게 단리되고 통상적인 절차를 사용하여(예컨대, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열분석될 수 있다.
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에 기술된 바와 같은 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예컨대, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서 항체 단편 및 폴리펩티드 발현에 대해, 예컨대 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호를 참조한다. (또한 대장균에서 항체 단편의 발현을 기술하는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Val. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]도 참조). 발현 후, 항체는 가용성 분획으로 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵세포 외에, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생성하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현 숙주에 적합할 수 있다. 문헌[Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)], 및 문헌[Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 배큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양이 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호(형질전환 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명함)을 참조한다).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예컨대, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)으로 형질전환된 마카크 신장 CVl 계통; 인간 배아 신장 계통(예컨대 문헌[Graham et al., J. Gen Viral. 36:59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예컨대 문헌[Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 마카크 신장 세포(CV l); 아프리카 그린 마카크 신장 세포(VER0-76); 인간 자궁경부암 세포(HeLa); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(Wl38); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예컨대 문헌[Mather et al., Annals N. Y Aead. Sei. 383:44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. cii. USA 77:4216 (1980)])를 비롯하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골주송 세포주 예컨대 YO, NSO 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위해, 예컨대 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Val. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
본 발명의 TDP-43 결합 분자, 특히 항체의 생성 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
a. 결합 분자, 특히 항체의 생산에 적합한 조건 하에 적합한 숙주 세포 또는 무세포 발현 시스템을 배양하는 단계; 및
b. 결합 분자, 특히 항체를 단리하는 단계, 적합한 배양 및 단리 기술이 당업자에게 이용가능하다.
본원에 제공된 항-TDP-43 항체는 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해 이들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 식별, 스크리닝, 또는 특성분석될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 항체는 예컨대 공지된 방법 예컨대 ELISA, BIACore®, FACS, 면역형광 또는 면역조직화학에 의해 이의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 양태에서, TDP-43에 대한 결합에 대해 본원에 기술된 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 식별하기 위해 경쟁 분석이 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 경쟁 항체는 본원에 기술된 항체에 의해 결합되는 동일한 에피토프(예컨대, 선형 또는 입체형태학적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 상세한 예시적인 방법이 문헌[Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다.
예시적인 경쟁 분석에서, 고정된 TDP-43은 TDP-43에 결합하는 제1 표지된 항체(예컨대, 본원에 기술된 임의의 항체) 및 TDP-43에 결합하는 제1 항체와 경쟁할 수 있는 능력에 대해 시험될 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션된다. 대조군으로서, 고정된 TDP-43은 제1 표지된 항체를 포함하지만 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션된다. TDP-43에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에 인큐베이션한 후, 과량의 비결합 항체를 제거하고, 고정된 TDP-43과 결합된 표지 양을 측정한다. 고정된 TDP-43과 결합된 표지 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우, 이는 제2 항체가 TDP-43에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하고 있음을 나타낸다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 치료제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예컨대, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 이의 단편), 방사성 동위원소(즉, 방사선접합체), 혈액 뇌 장벽 투과 모이어티 또는 검출가능한 표지와 접합된 본원에 제공된 항-TDP-43 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술된 바와 같이 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애, 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 위 또는 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예컨대 병, 바이알, 주사기, 정맥내(IV) 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 효과적인 또 다른 조성물과 함께 조합된 조성물을 보유하며 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예컨대 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 관통가능한 마개가 있는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택한 병태를 치료하는데 유용함을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 그 안에 포함된 조성물이 있는 제1 용기로서, 상기 조성물이 본 발명의 항체를 포함하는 것; 및 (b) 그 안에 포함된 조성물이 있는 제2 용기로서, 상기 조성물은 추가 치료제를 포함하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시형태의 제조 물품은 조성물의 특정 병태의 치료에 유용할 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예컨대 정균 주사용수(BWFI: bacteriostatic water for injection), 포스페이트-완충된 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 항-TDP-43 항체 대신 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
XI. 예시적인 TDP-43 특이적 결합 분자 또는 항체
본 발명의 일부 실시형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
b) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
c) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
d) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
e) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
f) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 73을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
g) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
h) SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
i) SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
j) SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 145의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 146의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
k) SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 157의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
일부 실시형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
a. SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
b. SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
c. SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
d. SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
e. SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
f. SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
g. SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
h. SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
i. SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
j. SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 144의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
k. SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
일부 실시형태에서, 항체는 다음을 포함한다:
a. SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
b. SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열과 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열과 적어도 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
c. SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열과 적어도 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열과 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
d. SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
e. SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열과 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
f. SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 70의 아미노산 서열과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 SEQ ID NO: 74의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
g. SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 80의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 SEQ ID NO: 84의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
h. SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 100의 아미노산 서열과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 SEQ ID NO: 104의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
i. SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 120의 아미노산 서열과 적어도 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 SEQ ID NO: 124의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
j. SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 140의 아미노산 서열과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 144의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
k. SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 150의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 SEQ ID NO: 154의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL).
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 추가 기술된 바와 같이, 하이브리도마 클론 631B2A2, 633B12C8, 634H10H7, 636E5B8, 641H1E7, 642A10B11, 642D12B4, 646B7F7, 712A6B10, 809D9C2 또는 809F12D8로부터 유도된 항체에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 추가 기술된 바와 같이, ACI-7069-631B2-Ab1, ACI-7069-633B12-Ab1, ACI-7069-634H10-Ab2, ACI-7069-636E5-Ab1, ACI-7069-641H1-Ab2, ACI-7069-642A10-Ab1, ACI-7069-642D12-Ab1, ACI-7069-646B7-Ab1, ACI-7071-712A6-Ab1, ACI-7071-809D9-Ab2 및 ACI-7071-809F12-Ab1로부터 선택된 항체에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 본원에 기술된 항체를 코딩하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 18을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 19를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO:28을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 29를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 38을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 39를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 48을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 49를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 68을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 69를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 78을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 79를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 88을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 89를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 108을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 109를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 128을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO:129를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 148을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 149를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 158을 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
일부 실시형태에서, (단리된) 핵산이 항-TPD-43 항체를 코딩하는 SEQ ID NO: 159를 포함하는 (단리된) 핵산이 제공된다.
XII. 조성물 및 방법
일부 실시형태에서, 면역접합체가 본원에 기술된 (단리된) 항체 및 치료제를 포함하는 면역접합체가 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기술된 항체 및 검출가능한 표지를 포함하는 표지된 항체가 제공된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 (단리된) 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서 본 발명의 TDP-43 특이적 결합 분자는 검출가능한 표지에 연결된다.
일부 실시형태에서 TDP-43 특이적 결합 분자는 TDP-43 특이적 결합 분자가 또 다른 적합한 치료제에 공유적으로 연결된 면역접합체의 일부이다.
일부 실시형태에서 TDP-43 특이적 결합 분자 또는 이를 포함하는 면역접합체는 TDP-43 특이적 결합 분자 및 TDP-43 작용제 및 동족체 분자, 또는 대안적으로, 이의 길항제를 포함하는 조성물로서 존재한다.
일부 실시형태에서 TDP-43 특이적 결합 분자는 TDP-43 특이적 결합 분자, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자가 또 다른 적합한 치료제에 공유적으로 연결된 면역접합체, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자 및 TDP-43 작용제 및 동족체 분자, 또는 대안적으로 약학적으로 허용되는 담체와 결합된 이의 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 약학 조성물의 일부이다.
일부 실시형태에서 TDP-43 특이적 결합 분자는 TDP-43 특이적 결합 분자, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자가 또 다른 적합한 치료제에 공유적으로 연결된 면역접합체, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자 및 TDP-43 작용제 및 동족체 분자, 또는 대안적으로, 이의 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 검출 및/또는 진단 키트의 일부이다.
본 발명의 결합 분자를 함유하는 키트가 또한 제공된다. 특히, 이러한 키트는 본 발명의 진단 방법(분류, 모니터링 및 요법 선별 방법 포함)을 수행하는데 유용할 수 있다. 따라서, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 진단을 위한, 또는 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 TDP-43 특이적 결합 분자를 포함하는 키트가 제공된다. 이러한 키트는 본원에 제공된 방법을 수행하는데 필요한 모든 구성요소를 포함할 수 있다. 전형적으로 각각의 구성성분은 단일 전체 포장에 별도로 보관된다. 키트에 포함되기에 적합한 추가 구성성분은, 예컨대 완충제, 검출가능한 염료, 실험실 장비, 반응 용기, 지침 등이다. 사용 지침은 키트가 사용되는 특정 방법에 맞게 조정될 수 있다. 본 발명의 적합하게 표지된 TDP-43 결합 분자가 또한 제공되며, 이는 이러한 키트 안에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서 TDP-43 특이적 결합 분자는 TDP-43 단백질병증의 예방, 진단 또는 치료에서 사용하기 위한 면역진단 방법에서 사용된다.
일부 실시형태에서 TDP-43 특이적 결합 분자는 TDP-43 단백질병증의 예방, 또는 치료를 위한 면역요법 방법의 일부이며, 여기서 상기 TDP-43 특이적 결합 분자, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자가 또 다른 적합한 치료제에 공유적으로 연결된 면역접합체, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자 및 TDP-43 작용제 및 동족체 분자, 또는 대안적으로, 동일한 것의 길항제를 포함하는 조성물의 유효량이 이를 필요로 하는 대상체에 투여된다.
일부 실시형태에서 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 TDP-43 특이적 결합 분자, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자가 또 다른 적합한 치료제에 공유적으로 연결된 면역접합체, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자 및 TDP-43 작용제 및 동족체 분자, 또는 대안적으로, 동일한 것의 길항제를 포함하는 조성물은 비제한적으로 전측두엽 치매(FTD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE)을 포함하여 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증을 진단, 예방, 완화 또는 치료하기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 TDP-43 특이적 결합 분자, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자가 또 다른 적합한 치료제에 공유적으로 연결된 면역접합체, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자 및 TDP-43 작용제 및 동족체 분자, 또는 대안적으로, 동일한 것의 길항제를 포함하는 조성물은 전측두엽 치매(FTD, 예컨대 산발성 또는 가족성, 운동-뉴런 질환(MND)이 있거나 없는 것, 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이가 있는 것, C9orf72 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, 염색체 9p와 연결된 것, 피질기저 퇴행, 유비퀴틴-양성 TDP-43 봉입체(FTLD-TDP)가 있는 전측두엽 퇴행(FTLD), 호은성 입자 질병, 픽병, 의미형 변이체 원발 진행성 실어증(svPPA), 행동 변이 FTD(bvFTD), 비유창 변이 원발 진행성 실어증(nfvPPA) 등), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 예컨대 산발성 ALS, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 안지오제닌(ANG) 돌연변이가 있는 것), 알렉산더병(AxD), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군, 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 다운 증후군, 영국 가족성 치매, 폴리글루타민 질환(헌팅턴병 및 척수소뇌 실조 유형 3(SCA3; 마카도 조셉병으로도 알려져 있음)), 해마 경화증 치매 및 근병증(산발성 봉입체 근염, 발로신-함유 단백질(VCP)에 돌연변이가 있는 봉입체 근염(또한 골의 파제트병 및 전측두엽 치매)), 테두리 액포가 있는 눈인두 근이영양증, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 있는 근섬유 근병증), 외상성 뇌손상(TBI), 루이소체가 있는 치매(DLB) 또는 파킨슨병(PD)으로부터 선택되는 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증을 진단 또는 모니터링하는 방법에서 사용된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 전측두엽 치매(FTD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 및 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE)으로부터 선택되는 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증을 검출, 진단 또는 모니터링하기 위한 임의의 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증은 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD) 및 전측두엽 치매(FTD)로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증은 근위축성 측삭 경화증(ALS)이다. 보다 바람직하게는, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증은 알츠하이머병(AD)이다. 보다 바람직하게는, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증은 전측두엽 치매(FTD)이다.
일부 실시형태에서 TDP-43 특이적 결합 분자는 증상전 질환의 진단을 위한 방법 또는 질환 진행 및 치료 효능을 모니터링하기 위한 방법, 또는 반응성을 예측하기 위한 방법, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자를 사용하는 치료에 대해 반응할 가능성이 있는 대상체를 선별하기 위한 방법에서 사용된다. 상기 방법은 바람직하게는 인간 혈액 또는 소변의 샘플을 사용하여 수행된다. 보다 바람직하게는 상기 방법은 ELISA-기반 또는 표면 적응 분석을 수반한다.
일부 실시형태에서 TDP-43 특이적 결합 분자는 전측두엽 퇴행(FTD) 또는 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군, 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE) 및/또는 파킨슨병(PD)을 검출, 진단 또는 모니터링하기 위해 본 발명의 TDP-43 특이적 결합 분자가 샘플(예컨대 혈액, 뇌척수액, 또는 뇌 조직)과 접촉되는 방법에서 사용된다.
일부 실시형태에서 TDP-43 특이적 결합 분자는 전측두엽 치매(FTD, 예컨대 산발성 또는 가족성, 운동-뉴런 질환(MND)이 있거나 없는 것, 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이가 있는 것, C9orf72 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, 염색체 9p와 연결된 것, 피질기저 퇴행, 유비퀴틴-양성 TDP-43 봉입체(FTLD-TDP)가 있는 전측두엽 퇴행(FTLD), 호은성 입자 질병, 픽병, 의미형 변이체 원발 진행성 실어증(svPPA), 행동 변이 FTD(bvFTD), 비유창 변이 원발 진행성 실어증(nfvPPA) 등), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 예컨대 산발성 ALS, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 안지오제닌(ANG) 돌연변이가 있는 것), 알렉산더병(AxD), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군, 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 다운 증후군, 영국 가족성 치매, 폴리글루타민 질환(헌팅턴병 및 척수소뇌 실조 유형 3(SCA3; 마카도 조셉병으로도 알려져 있음)), 해마 경화증 치매 및 근병증(산발성 봉입체 근염, 발로신-함유 단백질(VCP)에 돌연변이가 있는 봉입체 근염(또한 골의 파제트병 및 전측두엽 치매), 테두리 액포가 있는 눈인두 근이영양증, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 있는 근섬유 근병증), 외상성 뇌손상(TBI), 루이소체가 있는 치매(DLB) 또는 파킨슨병(PD)으로부터 선택되는 질환을 검출, 진단하기 위해 본 발명의 TDP-43 특이적 결합 분자가 샘플(예컨대, 혈액, 뇌척수액, 또는 뇌 조직)과 접촉되는 방법에서 사용된다.
일부 실시형태에서 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 TDP-43 특이적 결합 분자, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자가 또 다른 적합한 치료제에 공유적으로 연결된 면역접합체, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자 및 TDP-43 작용제 및 동족체 분자, 또는 대안적으로, 동일한 것의 길항제를 포함하는 조성물은 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증, 또는 전측두엽 퇴행(FTD) 또는 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군 및 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE) 및/또는 파킨슨병(PD)의 예방, 완화 또는 치료를 위해 사용된다.
일부 실시형태에서 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 TDP-43 특이적 결합 분자, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자가 또 다른 적합한 치료제에 공유적으로 연결된 면역접합체, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자 및 TDP-43 작용제 및 동족체 분자, 또는 대안적으로, 동일한 것의 길항제를 포함하는 조성물은 다음으로부터 선택되는 질환의 치료를 위해 사용된다: 전측두엽 치매(FTD, 예컨대 산발성 또는 가족성, 운동-뉴런 질환(MND)이 있거나 없는 것, 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이가 있는 것, C9orf72 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, 염색체 9p와 연결된 것, 피질기저 퇴행, 유비퀴틴-양성 TDP-43 봉입체(FTLD-TDP)가 있는 전측두엽 퇴행(FTLD), 호은성 입자 질병, 픽병, 의미형 변이체 원발 진행성 실어증(svPPA), 행동 변이 FTD(bvFTD), 비유창 변이 원발 진행성 실어증(nfvPPA) 등), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 예컨대 산발성 ALS, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 안지오제닌(ANG) 돌연변이가 있는 것), 알렉산더병(AxD), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군, 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 다운 증후군, 영국 가족성 치매, 폴리글루타민 질환(헌팅턴병 및 척수소뇌 실조 유형 3(SCA3; 마카도 조셉병으로도 알려져 있음)), 해마 경화증 치매 및 근병증(산발성 봉입체 근염, 발로신-함유 단백질(VCP)에 돌연변이가 있는 봉입체 근염(또한 골의 파제트병 및 전측두엽 치매), 테두리 액포가 있는 눈인두 근이영양증, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 있는 근섬유 근병증), 외상성 뇌손상(TBI), 루이소체가 있는 치매(DLB) 또는 파킨슨병(PD). 바람직하게는, 상기 질환 치료는 정신 인식을 유지하거나 증가시키는데 도움이 되고 되거나 뇌에서 TDP-43 응집체의 수준을 감소시킨다.
일부 실시형태에서 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 TDP-43 특이적 결합 분자, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자가 또 다른 적합한 치료제에 공유적으로 연결된 면역접합체, 또는 TDP-43 특이적 결합 분자 및 TDP-43 작용제 및 동족체 분자, 또는 대안적으로, 동일한 것의 길항제를 포함하는 조성물은 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증 또는 전측두엽 퇴행(FTD) 또는 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군 및 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 및/또는 파킨슨병(PD)의 치료를 위한 약제의 제조에 사용된다.
본원에 기술된 항-TDP-43 항체(TPD-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체의 약학 제형은 원하는 정도의 순도를 가진 이러한 항체 또는 면역접합체를 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여 동결건조된 제형 또는 수성 용액 형태로 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 투여시 및 사용되는 농도에서 수용자에게 비독성이며, 비제한적으로 다음을 포함한다: 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 항산화제 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 기타 탄수화물 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 소듐; 금속 복합체(예컨대 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 간질성(insterstitial) 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예컨대, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하여 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허출원공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기술되어 있다. 일 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코사미노글리카나제 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 또는 면역접합체 제형이 미국 특허 제6,267,958호에 기술되어 있다. 수성 항체 또는 면역접합체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 국제공개 W02006/044908호에 기술된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원에 기술된 제형은 또한 치료되는 특정 적응증, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 것들을 필요로 하는 하나 초과의 활성 성분을 함유할 수 있다.
활성 성분은 예컨대 코아세르베이트화 기술에 의해 또는 계면 중합, 예컨대 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 에 의해 콜로이드성 약물 전달 시스템(예컨대, 리포좀, 알부민 미소구체, 미세에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마이크로에멀젼으로 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방 제제가 제조될 수 있다. 서방 제제의 적합한 예는 항체 또는 면역접합체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형품 형태, 예컨대 필름, 또는 마이크로캡슐 형태이다. 생체 내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 무균이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 항원-결합 분자, 항-TDP-43 항체 또는 면역접합체는 방법, 예컨대 치료 방법에서 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 항-TDP-43 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체가 제공된다. 추가 양태에서, 치료 방법에서 사용될 항-미스폴딩된 TDP-43 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체가 제공된다. 특정 실시형태에서, TDP-43 단백질병증의 예방, 진단 및/또는 치료에서 사용하기 위한 항-TDP-43 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체가 제공된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 비제한적으로 전측두엽 치매(FTD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 및/또는 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE)을 포함하는, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 예방, 진단 및/또는 치료에서 사용하기 위한 항-TDP-43 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체가 제공된다.
추가 양태에서, 본 발명은 약제의 제조에 또는 준비에서의 항-TDP-43 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체의 용도가 제공된다. 하나의 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 예컨대 하기된 바와 같이, 유효량의 적어도 하나의 추가 치료제를 개인에게 투여하는 단계를 포함한다.
임의의 상기 실시형태에 따른 "대상체" 또는 "개인"은 동물, 포유류, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 예컨대 임의의 상기 치료 방법에서 사용하기 위한, 임의의 항-TDP-43 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 일 실시형태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-TDP-43 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 항-TDP-43 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체 및 예컨대 하기된 바와 같은, 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체 또는 면역접합체는 요법에서 단독으로 또는 다른 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체는 적어도 하나의 추가 치료제와 동시투여될 수 있다.
상기 언급된 이러한 병용 요법은 병용 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 별도의 제형에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하며, 이러한 경우, 본 발명의 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체의 투여는 추가 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 동시에 및/또는 이후에 발생할 수 있다. 본 발명의 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체는 또한 방사선 요법과 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체(및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내, 및 비강내, 및 국소 치료가 바람직한 경우, 병변 내, 자궁 내 또는 방광 내 투여를 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 일시적인지 또는 만성인지에 따라 임의의 적합한 경로, 예컨대 주입, 예컨대 정맥내 또는 피하 주입에 의한 것일 수 있다. 비제한적으로 다중 시점에 걸쳐 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여, 및 펄스 주입을 포함하여 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체는 우수 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야할 요소는 특히 치료될 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증, 특히 치료될 포유류, 개별 대상체의 임상 조건, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 원인, 제제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 기타 요소를 포함한다. 항체 또는 면역접합체는 문제의 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제일 필요는 없지만 선택적으로 이와 함께 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 항체 또는 면역접합체의 양, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증 또는 치료 유형, 상기 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 동일한 투약으로 본원에 기술된 투여 경로와 함께 사용되거나, 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 임의의 투여량으로 그리고 경험적으로 또는 임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체의 적절한 투여량은(단독으로 사용되거나 하나 이상의 추가 치료제와 병용하여 사용되는 경우) 치료될 질환의 유형, 항체 또는 면역접합체의 유형, 질환의 중증도 및 코스, 항체 또는 면역접합체가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지 여부, 이전의 요법, 대상체의 임상 이력 및 항체 또는 면역접합체에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체는 한번에 또는 일련의 치료 시리즈에 걸쳐 대상체에 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예컨대 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체가 예컨대 하나 이상의 별도의 투여에 의한, 또는 연속 주입에 의한 대상체의 투여를 위한 초기 후보 투여량이 될 것이다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있으며, 상기 언급한 인자에 따라 달라진다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 조건에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. 항체 또는 면역접합체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위이다. 따라서 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 투여량이 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예컨대 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다(예컨대 대상체가 약 2 내지 약 20회, 또는 예컨대 약 6회 용량의 항체를 받도록). 초기에 더 높은 로딩 용량이 투여된 후, 하나 이상의 더 늦은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행 상황은 기존 기술과 분석법으로 쉽게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 본 발명의 면역접합체와 항-TDP-43 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 둘 모두를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술된 바와 같이, TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 위에 또는 이와 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예컨대 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 또는 TDP-43과 관련된, 특히 TDP-43 응집체와 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 치료, 예방 및/또는 진단을 위해 효과적인 또 다른 조성물과 함께 조합된 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예컨대 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 관통가능한 마개가 있는 바이알일 수 있음). 조성물 중의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체 또는 면역접합체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택한 병태를 치료하는데 유용함을 나타낸다.
또한, 제조 물품은 (a) 그 안에 포함된 조성물이 있는 제1 용기로서, 상기 조성물이 본 발명의 항체(TDP-43 특이적 결합 분자의 바람직한 유형) 또는 면역접합체를 포함하는 것; 및 (b) 그 안에 포함된 조성물이 있는 제2 용기로서, 상기 조성물은 추가 치료제를 포함하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시형태의 제조 물품은 조성물의 특정 병태의 치료에 유용할 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예컨대 정균 주사용수(BWFI: bacteriostatic water for injection), 포스페이트-완충된 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자, 본 발명의 면역접합체, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 인지 기억 능력, 운동 및 언어 기능의 유지 또는 증가 또는 인지 기억 능력, 운동 및 언어 기능의 예방 및/또는 늦추는 방법에 관한 것이다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자, 본 발명의 면역접합체, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, TDP-43 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 적어도 하나의 추가 요법을 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 추가 요법은 비제한적으로 신경학적 약물, 항-abeta 항체, 항-Tau 항체, Tau 응집 억제제, 베타-아밀로이드 응집 억제제, 항-BACE1 항체, 및 BACE1 억제제로부터 선택된다.
본 발명은 또한 샘플을 본 발명의 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, TDP-43를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 바람직하게는 상기 샘플은 뇌 샘플, 뇌척수액 샘플, 소변 샘플 또는 혈액 샘플이다.
도 1. 유형 A 병리가 있는 전측두엽 치매(FTD)가 있는 대상체의 조직 섹션에서 TDP-43 검출. 검출을 위해 형광으로 표지된 2차 항체를 사용하여 유형 A 병리가 있는 FTD 대상체의 전두엽 피질의 10 μm 두께의 동결 섹션 상에서 면역조직화학을 수행하였다. 다음의 항체를 대조군으로 사용하였다: 병리학적 봉입체 및 생리학적 핵 TDP-43을 검출하기 위한 토끼 폴리클로날 pan TDP-43 항체(Proteintech, 10782-2-AP); 병리학적 응집된 및 인산화된 TDP-43을 검출하기 위한 토끼 모노클로날 포스포 TDP-43 p409/410 항체(Cosmobio, TIP-PTD-P02). 화살표는 TDP-43 응집체를 나타낸다; 두꺼운 화살촉은 핵에서의 생리학적 TDP-43을 나타낸다(핵을 DAPI 염색으로 시각화함). 하이브리도마 명칭 및 상용 항체 공급원을 각 이미지의 상부 좌측 모서리에 표시하였다.
도 2. FTD 유형 A 사후 뇌 조직(전두엽 피질)로부터 수득된 세제(사르코실) 가용성 및 불용성 분획에서 TDP-43 검출. N-말단 영역(A, B) 또는 C-말단 영역(C)에 결합하는 상용 항체를 사용한 면역블롯은 사르코실 가용성(레인 1) 및 불용성(레인 2) 분획에서 TDP-43의 존재를 나타낸다. TDP-43의 N-말단 영역에서 에피토프를 사용하여 본 연구에서 생성된 TDP-43에 대한 mAb의 면역블롯(D 내지 I). TDP-43의 C-말단 영역에서 결합하는 TDP-43에 대한 mAb의 면역블롯(J 내지 N). TDP-43에 대한 모든 mAb는 전장 TDP-43을 특이적으로 인식한다. 추가적으로 일부 mAb(K, M, N)는 불용성 분획에서의 C-말단 단편과 같이 질환 상태의 병리학적 시그니처를 인식한다.
도 3. 비히클(n = 30, 회색 막대) 및 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리된 마우스(n = 25, 점선의 회색 막대)에 대해 측정된 pTDP-43 면역반응 개체의 밀도를 2개의 뇌 영역에 대해 나타냈다: 선조체(a) 및 대뇌 피질(b). (c) 좌뇌 반구의 피질로부터 수득된 불용성 분획을 비히클(n = 30) 및 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)(n = 25) 처리군에서 총 TDP-43에 대해 정량화하였다(*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001).
도 4. ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 또는 이소타입 대조군의 존재 하에 TEV 절단에 의해 유도된 TDP-43 응집을 30시간 후 600 nm에서의 혼탁도로 측정하였다. 30시간 후 종결점을 이소타입 대조군(회색 막대)에 대해 정규화하고 응집된 TDP-43%를 ACI-7069-633B12-Ab1(점선의 회색 막대)에 대해 계산하였다. 3개의 독립적인 실험에 대한 평균 값 ± SD를 나타냈고 이소타입 대조군과 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 사이의 통계학적 차이를 Welch's t-검정으로 분석하였다(***p < 0.001).
도 5. (A) 비히클(n = 16, 회색 막대) 및 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리된 마우스(n = 16, 점선의 회색 막대)에 대해 측정된 Iba1 양성 면역반응성 영역을 뇌 피질에 대해 나타냈다. 오차 막대는 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다. (B 내지 C) 비히클(n = 16, 회색 막대) 및 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리된 마우스(n = 16, 점선의 회색 막대)에 대해 측정된 평균 미세아교 세포 크기를 뇌 피질에 대해 나타냈다. 미세아교세포를 이들의 형태에 기초하여 3가지 부류로 분류하였다: (B) 큰 비후, (C) 작은 분지 및 (D) 분지 휴식. 비히클 대조군과 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 사이의 통계학적 차이를 t-검정으로 분석하였다(*p < 0.05).
도 6. ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 및 ACI-7071-809F12-Ab1(IgG2a 변이체)을 사용한 AlphaLISA 분석으로 건강한 대조군과 비교한 다양한 FTLD-TDP 환자의 CSF에서 TDP-43 수준의 정량화. 다양한 CSF 샘플(x-축)에 대해 수득된 총 TDP-43에 대한 원시 AlphaLISA 카운트(y-축). 군, 실험, 성별 및 연령을 고정 요인으로 사용하고 세 가지 독립적인 실험의 데이터와 함께 개인을 무작위 요인으로 사용하여 원시 카운트에 대한 선형 혼합 모델을 사용하여 통계 분석을 수행하였다(**p < 0.01).
도 7. FTD 유형 A 사후 뇌 조직으로부터 수득된 세제(사르코실) 불용성 분획으로부터의 항체 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)(1), ACI-7069-642D12-Ab1(IgG2a 변이체) (2) 및 마우스 IgG2a 대조군(3)에 의한 TDP-43 및 pTDP-43의 면역고갈. 면역고갈 분획 1 내지 3을 TDP-43 또는 pTDP-43 특이적 검출 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. IN은 입력 물질(면역고갈 전)에 대한 것이다.
실시예
실시예 1: TDP-43 백신 조성물 제조
국제공개 WO2012/055933호에 공개된 프로토콜에 따라 리포좀-기반 백신을 제조하였다. 항원(표 2, SEQ ID NO:　1)으로서 전장 TDP-43(FL TDP-43) 단백질을 함유하는 백신을 항체 생성에 사용하였다.
SEQ ID NO 정의 아미노산 서열 (1-문자 코드)
SEQ ID NO: 1
 Q13148 (UniProt)
TADBP_HUMAN TAR DNA-결합 단백질 43
aa 1-414		 MSEYIRVTEDENDEPIEIPSEDDGTVLLSTVTAQFPGACGLRYRNPVSQCMRGVRLVEGILHAPDAGWGNLVYVVNYPKDNKRKMDETDASSAVKVKRAVQKTSDLIVLGLPWKTTEQDLKEYFSTFGEVLMVQVKKDLKTGHSKGFGFVRFTEYETQVKVMSQRHMIDGRWCDCKLPNSKQSQDEPLRSRKVFVGRCTEDMTEDELREFFSQYGDVMDVFIPKPFRAFAFVTFADDQIAQSLCGEDLIIKGISVHISNAEPKHNSNRQLERSGRFGGNPGGFGNQGGFGNSRGGGAGLGNNQGSNMGGGMNFGAFSINPAMMAAAQAALQSSWGMMGMLASQQNQSGPSGNNQNQGNMQREPNQAFGSGNNSYSGSNSGAAIGWGSASNAGSGSGFNGGFGSSMDSKSSGWGM
TDP-43 단백질 및 펩티드 항원 설명
실시예 2: 항-TDP-43 항체 생성
A. 마우스 면역화
암컷 C57BL/6JOlaHsd(C57BL/6) 및 BALB/c OlaHsd(BALB/c) 야생형 마우스(Harlan, USA)를 9주령에 받았다. 10주차에 백신접종을 시작하였다. 보조제로서 모노포스포릴 헥사-아실 지질 A, 3-디아실(합성)(3D-(6-아실) PHAD®)의 존재 하에 리포좀의 표면에 제시된 전장 TDP-43 단백질을 사용하여 마우스를 백신접종 하였다.
마우스를 0, 4, 8, 21, 35, 및 60일차에 피하 주사(s.c.)로 백신접종하였다. 마우스를 채혈하고 면역화 7일 전(면역화 전 혈장) 및 1차 면역화 후 14, 28, 42, 81 및 121일차에 헤파린 처리한 혈장을 제조하였다. 골수종 융합에 사용한 마우스는 보조제 없이 i.p. 주입 당 TDP-43 단백질의 매 3일 마다 추가 접종으로 추가로 백신접종하였다.
마우스 혈장에서 백신 반응을 측정하였다. 고정된 재조합 전장 (FL) TDP-43에 대한 면역화된 마우스로부터의 혈장 유래 항체의 결합은 TDP-43에 대한 항체에 대한 높은 역가를 나타냈다.
B. 하이브리도마의 생성 및 서브클로닝을 위한 선택
마우스를 안락사시키고 4마리의 개별 마우스의 비장세포를 사용하여 골수종 세포와의 융합을 수행하였다. 성공적으로 융합된 하이브리도마 세포주로부터 항체에 대한 스크리닝을 다음과 같이 수행하였다. 희석된(1:32) 세포 배양 상등액을 Luminex 비드-기반 다중 분석(Luminex, The Netherlands)을 사용하여 분석하였다. Luminex 비드를 FL TDP-43에 접합하고 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3 하위부류(Jackson Immunoresearch, USA)에 특이적인 항-마우스 IgG-Fc 항체로 IgG를 포획하였다. FL TDP-43에 접합된 비드에 대한 결합은 FL TDP-43 리포좀 백신으로 면역화된 마우스에서 유래된 386개의 히트를 확인하였다.
혈청-함유 선별 배지를 사용하여 생존 가능한 하이브리도마를 성장시켰다. 인간 FTD 뇌에서 TDP-43 봉입체에 우선적으로 결합하는 클론과 TDP-43의 C-말단에 결합하는 클론을 추가 서브클로닝을 위해 선택하였다. 제한 희석 후, 클론 하이브리도마를 낮은 면역글로불린 함유 배지에서 성장시키고 항체 스크리닝 및 선택을 위해 안정한 콜로니를 선택하였다. 이러한 스크린에서 표 3에 표시된 항체를 식별하였다.
실시예 3: 결합 효능(EC50) 측정
FL TDP-43에 대한 항체 결합의 절반 최대 유효 농도(EC50)를 결정하기 위해 항체의 연속 희석을 사용한 Luminex 분석을 앞서 설명한 대로 수행하였다. 모든 EC50 값은 표 3에 요약되어 있다. 요약하면, 모든 시험된 항체는 높은 친화도로 전장 TDP-43에 결합한다.
Figure pct00001
Luminex 분석에 의해 결정된 EC50 값
실시예 4: 인간 FL TDP-43에 대한 항체 결합
간접 ELISA를 사용하여 인간 FL TDP-43에 대한 항체 결합을 결정하였다. 1 μg/ml 인간 FL TDP-43을 사용하여 ELISA 플레이트 코팅을 4℃에서 카보네이트 완충제에서 밤새 수행하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20/PBS로 세척한 다음 0.05% Tween-20/PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 이어서 하이브리도마 상등액으로부터 정제한 항체를 1　μg/ml에서 시작하여 3배 연속 희석액에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 세척하였다. AP-접합된 항-마우스 IgG 2차 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories, United Kingdom)를 0.05% Tween-20/PBS 중의 1/1000 희석으로 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 pNPP(Sigma-Aldrich, Switzerland) 포스파타제 기질 용액과 함께 인큐베이션하고, ELISA 플레이트 판독기(Tecan, Switzerland)를 사용하여 405 nm에서 판독하였다. 시험한 모든 클론은 10 내지 1567 ng/ml의 범위의 다양한 EC50 값으로 전장 TDP-43에 결합한다(표 4).
하이브리도마 클론 명칭 EC50 ng/ml
631B2A2 53
633B12C8 32
634H10H7 53
636E5B8 15
641H1E7 16
642A10B11 1567
642D12B4 14
646B7F7 11
712A6B10 102
809D9C2 17
809F12D8 14
2E2D3 대조군 20.7
ELISA에 의한 EC50 값
실시예 5: ELISA 및 펩티드 어레이에 의한 에피토프 맵핑
무혈청 하이브리도마 상등액으로부터 정제한 항체를 간접 ELISA 분석으로 스크리닝하여 40 내지 66 aa 선형 펩티드 또는 N-말단에서 비오티닐화되고 9 aa 오프셋 및 6 aa 중첩을 갖는 TDP-43의 전체 서열을 커버하는 15-량체 펩티드 라이브러리를 사용하여 결합 영역을 결정하였다. 펩티드 서열이 표 5에 제공되어 있다.
96-웰 플레이트를 5 μg/ml 비-비오티닐화된 펩티드를 사용하여 4℃에서 카보네이트 완충제 중에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20/PBS로 세척한 다음 0.05% Tween-20/PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 이어서 하이브리도마 상등액으로부터 정제한 항체를 1　μg/ml으로 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 세척하였다. AP-접합된 항-마우스 IgG 2차 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories, United Kingdom)를 0.05% Tween-20/PBS 중의 1/1000 희석으로 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 pNPP(Sigma-Aldrich, Switzerland) 포스파타제 기질 용액과 함께 인큐베이션하고, ELISA 플레이트 판독기(Tecan, Switzerland)를 사용하여 405 nm에서 판독하였다.
비오티닐화된 펩티드의 경우, 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 ELISA 플레이트를 5 μg/mL의 비오티닐화된, 15-량체 펩티드와 함께 인큐베이션 하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20/PBS를 사용하여 3회 세척한 다음 0.05% Tween-20/PBS 중의 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 이어서 하이브리도마 상등액으로부터 정제한 항체를 1　μg/ml으로 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 플레이트를 세척하였다. AP-접합된 항-마우스 IgG 2차 항체(Jackson Immunoresearch Laboratories, United Kingdom)를 0.05% Tween-20/PBS 중의 1/1000 희석으로 37℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 AP 기질 용액인 pNPP(Sigma-Aldrich, Switzerland)와 함께 인큐베이션하고, ELISA 플레이트 판독기(Tecan)를 사용하여 405 nm에서 판독하였다. 결정된 결합 영역을 표 6에 제공하였다. 시험한 항체는 다음의 펩티드에 결합하는 것으로 밝혀졌다: TP-21, TP-23, TP-35, TP-40, TP-48, TDP-6, 각각 SEQ ID NO:　1의 영역 181-195, 199-213, 307-321, 352-366, 389-411, 140-200에 상응함.
보다 정밀한 선형 에피토프를 고체 지지체에서 직접 합성하고 1 aa 오프셋 및 14 aa 중첩(Pepscan, Netherlands)을 갖는 SEQ ID NO:1에 따른 TDP-43의 전체 서열을 커버하는 15-량체 펩티드의 라이브러리를 사용하여 맵핑하였다. 펩티드 어레이를 말 혈청 및 난백알부민으로 차단하고 0.75 내지 5 μg/ml 사이의 농도의 정제된 항체 용액과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 세척 후, 펩티드 어레이를 1/1000 희석의 토끼 항-마우스 IgG(H+L) HRP 접합체(Southern Biotech, USA)와 함께 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 세척 후, 퍼옥시다제 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트(ABTS) 및 20 μl/ml의 3% H2O2를 첨가하였다. 1시간 후, 전하 결합 소자(CCD: charge coupled device) - 카메라 및 이미지 처리 시스템으로 발색을 정량화하였다. 이러한 결합 영역을 에피토프 맵핑에 의해 확인하였으며 다음의 에피토프(표 6에 제공됨)가 확인되었다: SEQ ID NO:1의 aa 183-188, 203-213, 204-208, 204-211, 205-210, 316-323, 358-361, 400-405, 400-406, 400-412.
펩티드 번호 SEQ ID NO:　1에 따른 위치
TP-21 181-195
TP-23 199-213
TP-35 307-321
TP-40 352-366
TP-48 389-411
TDP-6 140-200
ELISA에 의한 결합 영역의 결정에 사용된 펩티드
하이브리도마 클론 명칭 결합 영역, aa 에피토프, aa
631B2A2 397-411 400-406
633B12C8 397-411 400-405
634H10H7 140-200 183-188
636E5B8 352-366 358-361
641H1E7 199-213 204-211
642A10B11 389-411 400-412
642D12B4 181-195 183-188
646B7F7 199-213 205-210
712A6B10 307-321 316-323
809D9C2 199-213 203-213
809F12D8 199-213 204-208
시험한 항체에 대한 결합 영역 및 에피토프
실시예 6: 면역조직화학에 의한 FTD/ALS 대상체의 뇌 조직에서 TDP-43의 검출
표적 결합을 FTD 대상체 뇌의 조직 상에서 면역조직화학 실험으로 평가하였다. 인간 FTD 뇌 조직을 The Netherlands Brain Bank, Netherlands Institute for Neuroscience, Amsterdam(공개 접근: www.brainbank.nl) 및 Queen Square Brain Bank for Neurological Disorders, UCL로부터 수득하였다. 모든 자료는 뇌 부검 및 연구 목적을 위한 자료 및 임상 정보 사용에 대한 서면 동의서를 뇌 은행에서 얻은 기증자로부터 수집하였다. 검출을 위해 형광으로 표지된 2차 항체를 사용하여 10 μm 두께의 동결 섹션에서 면역조직화학을 수행하였다. 다음의 항체를 대조군으로 사용하였다: 병리학적 봉입체 및 생리학적 핵 TDP-43을 검출하기 위한 토끼 폴리클로날 pan TDP-43 항체(Proteintech, 10782-2-AP); 병리학적 응집된 및 인산화된 TDP-43을 검출하기 위한 토끼 모노클로날 포스포 TDP-43 p409/410 항체(Cosmobio, TIP-PTD-P02) 및 비-특이적 배경을 검출하기 위한 1차 항체(No 1° Ab) 없이 2차 항체.
본 발명의 모든 항체는 핵, 비응집 및 응집된 TDP-43에 결합한다. 본 발명의 일부 항체는 유형 A 병리에서 세포질에서 응집된 TDP-43에 우선적으로 결합한다(도 1). 결합 특성에 대한 상세한 평가는 표 7에 요약되어 있다.
항체 명칭
응집된 TDP-43의 IHC 검출 핵 비-응집된 TDP-43의 IHC 검출
ACI-7069-631B2-Ab1 +++ +++
ACI-7069-633B12-Ab1 +++ +++
ACI-7069-634H10-Ab2 ++ ++
ACI-7069-636E5-Ab1 +/- +++
ACI-7069-641H1-Ab2 +++ +
ACI-7069-642A10-ab1 +++ +
ACI-7069-642D12-Ab1 ++ +
ACI-7069-646B7-Ab1 +++ +++
ACI-7071-712A6-Ab1 ++ +
ACI-7071-809D9-Ab2 +++ +++
ACI-7071-809F12-Ab1 +++ +++
NA 이용불가능한 데이터; - 부재; +/- 불분명; + 약함; ++ 중간; +++ 풍부
FTD 대상체의 뇌 조직에서 TDP-43 검출
실시예 7: 웨스턴 블롯에 의한 FTD/ALS 대상체의 뇌 조직에서 TDP-43의 검출
CK 혼합 균질화 튜브(Labgene, BER0092)를 사용하여 프리셀리스(precellys)를 사용하여 4℃에서 균질화-가용화 완충제(HS 완충제) 중의 1:4(w/v) 비율로 뇌 조직(전두엽 피질) 영역을 균질화하였다. 균질화를 위해 다음의 순서를 사용하였다: 5000 rpm에서 30초의 3회 사이클(각 사이클 사이에 15초 중지). 균질화된 샘플을 분취하고 1.5 ml 저단백질 결합 튜브(Axygen MCT-175-L-C)에서 -80℃에서 저장하였다.
● HS 완충제 - 10 mM Tris.HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 완전히 EDTA가 없는 프로테아제 억제제(Roche, 32524300) 및 PhosSTOP 포스파타제 억제제(Roche, 4906837001).
뇌 균질액을 얼음 위에서 해동하고 HS 완충제에서 재현탁하여 최종 농도 2%의 사르코실, 1 단위/μL 벤조나제(Benzonase) 및 1 mM MgCl2를 수득하였다. 이어서 샘플을 열혼합기에서 45분 동안 600 rpm에서 일정한 진탕 하에 37℃에서 인큐베이션 하였다. 상등액을 새로운 튜브에 수집하였다. 펠릿을 1000 μl 미엘린 부유 완충제 중에 재현탁하고 벤치탑 원심분리기에서 4℃에서 20,000 g에서 60분 동안 원심분리하였다. 상등액을 조심스럽게 제거하여 모든 부유 지질을 제거하였다. 지질이 단일 단계로 제거될 수 없는 경우 이러한 단계를 반복하였다. 이어서 펠릿을 PBS로 세척하고 벤치탑 원심분리기에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 최종 펠릿을 200 μl PBS 중에 재현탁하고 -80℃에 저장하였다. 변성 조건에서 면역블롯팅으로 샘플을 분석하였다.
● 사르코실 포함 HS 완충제, 벤조나제 및 MgCl2 - 10 mM Tris.HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 4% 사르코실, 1 단위/μL 벤조나제(Novagen 70746-4), 4 mM MgCl2 완전히 EDTA가 없는 프로테아제 억제제(Roche) 및 PhosSTOP 포스파타제 억제제(Roche).
● 미엘린 부유 완충제 - 1% Triton X-100 및 30% 수크로스 포함 HS 완충제
MES SDS 러닝 완충제(Thermofisher)를 사용하여 Bolt 12% Bis-Tris Plus 겔 1.0 mm(Thermofisher) 상에서 웨스턴 블롯을 수행하였다. 샘플(30 μl/샘플)을 100 mM의 DTT를 함유하는 로딩 완충제(1x, Licor, 928-40004)인 PBS 중에 희석한 다음 겔에 로딩하였다. 단백질을 100 V의 일정한 전압 하에 1시간 동안 분해하였다. 전기영동 후, 단백질을 20 볼트에서 7분 동안 iBLOT(Thermofisher, IB21001)를 사용하여 니트로셀룰로스 막(Thermofisher, IB23001)으로 옮겼다. 단백질 전달 후, 막을 PBS 중에 1:3 희석된 Licor 차단 완충제(Odyssey 차단 완충제 927-40000) 중에서 1시간 동안 차단하였다. 다음의 1차 항체와 함께 막을 밤새 인큐베이션 하였다: 총 TDP-43(Proteintech, 60019-2-Ig 또는 10782-2-AP), pTDP-43(Cosmobio, TIP-PTD-M01). 1차 항체의 경우, 차단 완충제를 PBS-T(0.4% Tween-20 포함 PBS) 중에 1:1로 희석하였다. PBS-T(0.1% Tween-20 포함 PBS)로 4회 세척한 후, 막을 LICOR 염료와 커플링된 2차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 2차 항체 - 당나귀 항-마우스(카탈로그 번호 926-68072) 또는 염소 항-토끼(카탈로그 번호 926-32211) -를 실온에서 1시간 동안 PBS-T(0.4% Tween-20 포함 PBS)를 사용하여 1:1로 희석된 Licor 차단 완충제 중의 1:10000의 희석으로 사용하였다. 다시 PBS-T(0.1% Tween-20 포함 PBS)를 사용하여 막을 4회 세척하고 LICOR 시스템을 사용하여 스캐닝하였다. 도 2는 모든 mAb가 전장 TDP-43을 특이적으로 인식함을 보여준다. 추가로 일부 mAb(K, M, N)는 불용성 분획의 C-말단 단편 및 고분자량 응집체와 같이 질환 상태의 병리학적 시그니처를 인식한다.
실시예 8A: SPR을 사용한 결합력 측정
가용성 또는 응집된 FL TDP-43에 대한 결합 결합력을 표면 플라즈몬 공명(SPR; Biacore T200, GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 해리 상수(KD) 결정에 의해 평가하였다. 재조합 인간 가용성 또는 응집된 FL TDP-43을 아민 커플링에 의해 CM5 Series S 센서 칩(GE Healthcare Life Sciences) 상에 고정시켰다. 가용성 TDP-43을 420초 동안 5 μl/분의 유속으로 10 mM 소듐 아세테이트(pH 4.5) 중의 5 μg/ml 농도로 고정시켜 150 RU의 고정화 수준을 생성하였다. 응집된 TDP-43을 840초 동안 5 μl/분의 유속으로 10 mM 소듐 아세테이트(pH 4.5) 중의 50 μg/ml 농도로 고정시켜 110 RU의 고정화 수준을 생성하였다. 비오티닐화된 TP-73 펩티드(SEQ ID NO: 1의 aa 181-190)를 30초 동안 5 μl/분의 유속으로 PBS-P+ 중의 5 μg/ml 농도로 Series S 센서 칩 SA(GE Healthcare Life Sciences) 상에 고정시켜 400 RU의 고정화 수준을 생성하였다. KD 값을 평가하기 위해, 정제된 항체 및 대조군 항체(2E2-D3)를 333　nM에서 시작하여 0.15 nM으로 희석하여 낮추어 PBS-P+ 중의 3배 희석으로 주입하였다. 항체를 50 μl/분의 유속으로 90초의 접촉 시간동안 주입하고 700초의 해리 단계 후 10　mM 글리신-HCl pH 1.7로 3회 재생시켰다. 최적화된 SPR 프로토콜을 위해, 항체를 3배 희석하여 300　nM에서 시작하여 1.2 nM으로 희석하여 낮추고 30 μl/분에서 300초 동안 주입한 후 600초 동안 해리하였다. 표면을 10　mM 글리신-HCl pH 1.7로 1회 주입으로 재생시켰다. 결합 동력학으로부터 수득한 결과를 블랭크 플로우 셀과 완충제 사이클을 사용하여 이중참조 하였으며 RI가 있는 글로벌 1:1 피팅 모델을 사용하여 평가하였다. 11개 항체 및 2개의 Fab 단편에 대한 결합력을 표 8에 도시하였다. 본 발명의 항체는 0.62 nM 내지 4.64 nM의 범위의 KD로 응집된 TDP-43에 결합한다. 또한, 일부 항체는 가용성 TDP-43에 비해 응집된 TDP-43에 우선적인 결합을 나타낸다. 2개의 Fab 단편은 2.8 nM 내지 21.8 nM의 KD 범위로 가용성 TDP-43에 결합하고 응집된 TDP-43에 대한 유사한 KD를 나타낸다. 2개의 항체(*로 표시)를 특히 느린 해리 속도를 가진 항체에 대해 보다 정확한 KD 결합을 가능케 하는 보다 긴 결합 및 해리 단계를 갖는 최적화된 SPR 프로토콜을 사용하여 재분석하였다. 2개의 항체는 0.22 nM 내지 3.9 nM의 KD 범위로 가용성 TDP-43에 결합하고 응집된 TDP-43은 0.18 nM 내지 0.69 nM의 KD 범위를 가졌다. 항체 ACI-7069-642D12-Ab1은 3.6 nM의 KD로 TP-73 펩티드에 결합한다.
하이브리도마 클론 명칭 가용성 TDP-43 응집된 TDP-43
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) Rmax (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM) Rmax (RU)
631B2A2 1.59 E+03 7.74 E-04 486 243.4 8.61 E+04 7.10 E-05 0.82 72
633B12C8 8.73 E+02 3.19 E-04 365 323.3 8.21 E+04 5.01 E-05 0.62 74.1
633B12C8 Fab 5.51E+04 1.46E-04 2.8 69.0 3.22E+04 2.15E-04 6.9 102.4
633B12C8* 6.18E+04 1.08E-05 0.22 107.7 8.40E+04 1.32E-05 0.18 134.6
634H10H7 4.43 E+04 8.74 E-04 19.7 16 1.10 E+05 1.66 E-04 1.51 117.9
636E5B8 1.56 E+04 6.82 E-04 43.84 23.3 1.13 E+05 2.74 E-04 2.43 80.8
641H1E7 1.25 E+05 8.41 E-04 6.76 50.8 1.21 E+05 1.93 E-04 1.6 128.7
642A10B11 NA NA NA NA 1.26 E+06 5.85 E-03 4.64 53.2
642D12B4 1.59 E+05 8.38 E-04 5.28 43.1 1.48 E+05 1.31 E-04 0.88 170.2
642D12B4 Fab 1.28E+05 2.67E-03 21.8 43.0 9.40E+04 1.76E-03 21.8 275.9
642D12B4* 1.15E+05 4.50E-04 3.9 74.3 1.49E+05 9.87E-05 0.69 498.7
646B7F7 1.78 E+05 6.50 E-04 3.66 67.3 1.44 E+05 1.84 E-04 1.28 148.3
712A6B10 1.34 E+03 5.45 E-04 406 85.7 3.48 E+04 2.36 E-05 0.68 29.4
809D9C2 7.71 E+04 8.21 E-04 10.6 47.7 9.59 E+04 2.16 E-04 2.25 88.4
809F12D8 9.94 E+04 1.67 E-04 1.68 70.6 9.47 E+04 7.63 E-05 0.81 132.3
SPR에 의한 결합 특성분석
NA, 피팅에 이용가능한 곡선이 3개 미만이므로 적용불가
* 재조합적으로 생산된 IgG2a 이소타입 항체에 대한 최적화된 SPR 프로토콜을 사용한 결합 특성분석.
실시예 8B: SPR을 사용한 결합력 측정
가용성 FL TDP-43에 대한 결합 결합력을 표면 플라즈몬 공명(SPR; Biacore T200, GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 해리 상수(KD)를 측정하여 평가하였다. 염소-항 마우스 포획 항체를 아민 커플링에 의해 CM5 Series S 센서 칩(GE Healthcare Life Sciences) 상에 고정시켰다. 항체를 10 μl/분의 유속으로 120초 동안 PBS-P+(GE Healthcare Life Sciences) 중의 2 내지 5 μg/ml의 농도로 포획하여 350 내지 1000 RU의 포획 수준을 생성하였다. KD 값을 평가하기 위해, FL TDP-43 또는 TP-51 펩티드(SEQ ID NO: 1의 aa 352-414)를 1.2 nM에서 시작하여 최대 100 nM까지 3배 희석 PBS-P+ 중에서 300초의 접촉 시간 동안 단일-사이클 동력학에서 30 μl/분의 유속으로 주입하였다. 해리를 1시간 동안 기록한 다음 10　mM 글리신-HCl pH 1.7을 사용하여 1회 재생시켰다. 결합 동력학으로부터 수득한 결과를 블랭크 플로우 셀과 완충제 사이클을 사용하여 이중참조 하였으며 RI가 있는 글로벌 1:1 피팅 모델을 사용하여 평가하였다. 3개의 항체에 대한 온-속도(ka), 오프-속도(kd) 및 친화도(KD)를 12(ACI-7069-633B12-Ab1), 2(ACI-7069-642D12-Ab1) 또는 3(ACI-7071-809F12-Ab1) 반복의 평균 값 ± SD로 표 9에 나타냈다. 항체 ACI-7069-633B12-Ab1, ACI-7069-642D12-Ab1 및 ACI-7071-809F12-Ab1은 각각 15 내지 135 pM, 226 내지 272 pM 및 389 내지 457 pM의 범위의 친화도로 가용성 TDP-43에 결합한다. 항체 ACI-7069-633B12-Ab1은 1184 내지 1316 pM의 친화도로 TP-51 펩티드에 결합한다.
하이브리도마 클론 명칭 ACI-7069-633B12-Ab1 ACI-7069-642D12-Ab1 ACI-7071-809F12-Ab1
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (pM)
가용성 TDP-43 평균 4.39E+04 3.45E-06 75 1.10E+05 2.76E-05 249 3.20E+04 1.36E-05 423
가용성 TDP-43 SD 5.35E+03 3.03E-06 60 8.00E+03 4.40E-06 23 2.16E+03 1.88E-06 34
TP-51 평균 1.10E+05 1.38E-04 1250
TP-51 SD 9.41E+03 1.72E-05 66
SPR에 의한 가용성 FL TDP-43 및 TP-51 펩티드에 대한 친화도
실시예 9: 항체 서열분석
클론 하이브리도마 세포 용해물을 가변 영역의 유전자 서열분석을 위해 사용하였다. 마우스 하이브리도마를 수확하고 RNase를 불활성화시키기 위해 구아니디늄 염을 함유하는 세포용해 완충제를 사용하여 세포용해하였다. 이어서 RNase가 없는 DNase를 사용하여 게놈 DNA를 제거하고, RNA를 다중 세척을 사용하여 실리카-기반 친화도 컬럼을 사용하여 정제하고 RNase가 없는 물을 사용하여 컬럼에서 용리하였다. RNA가 추출되면, 이의 순도 및 농도를 분광분석법으로 측정하였다. RNA의 무결성을 변성 아가로스 겔 상에서 평가하고 RNA를 역 트랜스크립타제(RT)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. RT 반응 혼합물에 첨가하기 전에, RNA를 10분 동안 70℃로 가열하여 RNA 2차 구조를 파괴하였다. RT 생성물을 PCR 증폭에 직접 사용하였다. cDNA의 고충실도 PCR 증폭을 위해, 항체에 대해 상이한 유전자 패밀리에 해당하는 각각의 가변 영역 프라이머를 50 μl의 총 반응 부피로 별도로 VH 및 VL에 대해 개별적으로 불변 프라미어와 혼합하였다. 처음에, 축퇴 프라미어 풀을 사용하였고(VH에 대해 12개 및 VL에 대해 12개), 결과에 따라 두 번째 풀을 사용하여 PCR 생성물을 수득하였다. PCR 반응 후, 생성물을 에티듐 브로마이드로 염색된 2% 아가로스 겔 상에서 겔 전기영동하여 분석하였다. VL 및 VH에 대한 PCR 생성물을 tris-아세테이트-EDTA(TAE)를 사용하여 아가로스 겔 상에서 개별적으로 정제하였다. 겔에서 절단한 정제된 단편을 PCR에서 사용하였던 것과 동일한 프라이머를 사용하여 염료-종결자 서열분석 방법을 사용하여 서열분석하였다. 서열분석을 두 방향 모두에서 수행하여 두 말단에서 중첩을 수득하였다. 서열을 다중 서열 정렬(Clustal 도구)을 사용하여 분석하고 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 91-3242 (1991)]에 기술된 바와 같이 Kabat 알고리즘을 사용하여 주석을 달았다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(VH 및 VL)의 뉴클레오티드 서열을 표 10에 도시하였다. 선택된 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 가변 도메인에 대한 번역된 단백질 서열, 및 이들의 상보성-결정 영역(CDR)을 도 11에 도시하였다.
[표 10]
중쇄 및 경쇄 가변 도메인(VH 및 VL)의 뉴클레오티드 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
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Figure pct00009
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[표 11]
중쇄 및 경쇄 가변 도메인(VH 및 VL) 및 이들의 CDR의 아미노산 서열
Figure pct00012
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실시예 10: TDP-43 단백질병증의 형질전환 마우스 모델에서 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)의 생체 내 효능
생체 내에서 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)의 효능을 평가하기 위해, NEFH-tTA x hTDP-43ΔNLS 바이제닉 마우스(rNLS8 마우스, Walker et al. 2015)에서 TDP-43 병리학을 감소시키는 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)의 능력을 시험하였다. rNLS8 마우스에 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)(n = 30) 또는 비히클(n = 30)을 매주 주입하고 투여 종료 시, 분자 병리학적 마커 예컨대 인산화된 및/또는 총 불용성 TDP-43을 분석하였다.
10.1 동물
연구를 시작하기 전에, 모든 동물을 환경에 적응시키고, 적절한 건강을 보장하고 실험 조작과 관련된 비-특이적 스트레스를 최소화하기 위해 검사, 취급 및 무게를 측정하였다. 마우스를 번식 동안 8주령까지 독시사이클린(200 mg/kg)을 함유하는 식이 요법을 유지하였다. 8주령에 식단을 독시사이클린(DOX)을 함유하지 않은 식이 요법으로 변경하여 트랜스진이 발현되도록 하였다. 연구 전반에 걸쳐, 명/암 주기(12/12), 실온(20 내지 23℃) 및 상대 습도(약 50%)를 일정하게 유지하였다. 식이 요법 및 물을 연구 기간 도안 자유롭게 급식하였다. 마우스가 움직임에 어려움을 나타내기 시작했을 때, 식이를 케이지 바닥 상에 습식 사료 및 히드로겔로 변경하였다. 모든 행동 시험을 동물 명주기 동안 수행하였다.
10.2. 화합물 투여
주사일에, ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)(60 mg/kg) 및 비히클을 신선하게 제조하고 연구 기간 전반에 걸쳐 매주 투여 요법에 따라 i.p.로 투여하였다.
10.3. 뇌 수집
뇌를 2개의 반구로 나누었다. 좌측 반구를 해부하여 피질 뇌 영역을 수집하였다. 추가 생화학적 분석을 위해 마우스 피질과 나머지 뇌 조직을 급속 동결하였다. 나머지 우측 반구를 실온에서 3시간 동안 관류한 후 직접 침지-고정하고 4% 파라포름알데히드(PFA)를 함유하는 신선하게 제조된 1x PBS 중에 수집하였다.
10.4. 면역조직화학
침지 고정 우뇌 반구를 10 마이크론의 섹션 두께에서 Leica CM1950 크라이오톰(cryotome)에서 균일하고 체계적인 무작위 프로토콜에서 시상 방향으로 절단하였다. 마우스 당 시상 섹션의 체계적 무작위 세트(뇌의 수준 2, 3, 4, 6, 8, 10 및 11로부터의 7개 섹션)을 TDP-43 및 인산화된 TDP-43에 대해 면역염색하였다. Iba1 염색을 수행하여 미세아교세포 수 및 뇌 형태를 정량화하였다. 항체 결합을 형광으로 표지된 2차 항체를 사용하여 시각화하였다. 표준 음성 대조군은 야생형 뇌 섹션 및 1차 항체 적용을 하지 않은 트랜스제닉 동물의 섹션을 포함하였다.
10.5. 면역반응성의 이미지화 및 결정
장착된 섹션을 LED(Colibri2) 조명과 민감한 Orca Flash 4.0 단색 카메라를 사용하여 10x 배율로 ZEN 소프트웨어로 구동되는 Axio.Scan Z1 슬라이드 스캐너에서 전체적으로 이미지화하였다. 대뇌 피질과 등쪽 선조체에서 관심 영역의 개별 묘사를 사용하여 뇌 크기를 측정하였다. 물체 밀도(OD)(mm2 당 물체 수)를 조직 인공물(조직 폴드 등)을 제외한 두 번째 묘사의 관심 영역에 대한 백분율 및 OD로 표지된 영역의 모든 마커에 대해 측정하였다.
10.6. 뇌 피질에서 단백질 샘플 제조:
조직을 얼음 위에서 해동한 다음 1 mM PMSF 및 프로테아제-/포스파타제 억제제 칵테일(Roche Applied Science)을 함유하는 5X v/w 방사성면역침전 분석 완충제(RIPA, 50mM Tris, 150mM NaCl, 1% IGEPAL CA630, 5mM EDTA, 0.5% 소듐 디옥시콜레이트 및 0.1% SDS, pH 8.0) 중에서 초음파처리하였다. 샘플을 4℃, 100,000 g에서 30분 동안 원심분리하고 상등액을 가용성 분획으로 간주하였다. 펠릿을 RIPA를 사용하여 초음파처리로 세척하고 상등액을 버렸다. RIPA-불용성 펠릿을 2X v/w 우레아 완충제(7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS, 및 30 mM Tris, pH8.5) 상에서 초음파처리하고 22℃, 100,000 g에서 30분 동안 원심분리하였다. 이러한 상등액을 RIPA-불용성/ 우레아-가용성 분획으로 간주하였다. RIPA-가용성 분획의 단백질 농도를 BCA 단백질 분석(Pierce)을 사용하여 측정하였다.
10.7. 불용성 TDP-43의 정량화
RIPA 불용성 분획 중의 총 TDP-43 수준을 상업용 인간 TDP-43 AlphaLISA 키트(Perkin Elmer, AL387HV)로 분석하였다.
10.8. 통계학적 분석
IHC 및 AlphaLISA 데이터를 평균 ± SEM으로 나타냈다. 비히클과 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리된 동물 사이의 통계학적 차이를 Welch's t-검정으로 분석하고 이를 각 막대 위에 별모양으로 표시하였다(*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001). 조직학적 측정치에서 이상치는 군 또는 수준에서 Grubbs 이상치(단일 측정)이거나, 기술적인 이유(이미지 인공물, 조직 폴드, 등)로 인해 제외하였다.
10.9. 결과
ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리는 rNLS8 마우스에서 인산화된 TDP-43 및 불용성 TDP-43을 감소시킨다.
DOX 억제가능한 형태의 K82A/R83A/K84A 돌연변이 인간 TDP-43 (hTDP-43ΔNLS)의 과발현은 rNLS8 마우스 모델에서 뉴런의 세포질에서 TDP-43의 현저한 축적 및 응집을 야기한다. 이러한 모델의 병리학적 특징은 불용성 및 인산화된 TDP-43 봉입체(pTDP-43)의 침착이다. 이러한 작은 구형 세포질 봉입체는 트랜스제닉 동물에만 존재하며 WT 및 모노제닉, 트랜스제닉 tTA 대조군 마우스에는 전혀 존재하지 않는다. 또한, pTDP-43는 DOX 부재의 첫 주 동안 광범위하게 부재하였고, 3 내지 4주의 DOX 제거 동안 가파른 진행으로 축적된다(문헌[Walker et al., 2015]). ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리는 비히클 처리된 마우스에 비해 선조체 및 대뇌 피질(도 3a 내지 b) 둘 모두에서 인산화된 TDP-43의 밀도의 통계학적으로 유의한 감소를 야기하였으며 이는 TDP-43 병리학을 감소시키는 기능적 효능을 시사한다. 선조체 및 대뇌 피질은 이들 영역에서 높은 트랜스진 발현으로 인해 정량화를 위해 선택하였다.
10.10. ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리는 rNLS8 마우스에서 불용성 TDP-43을 감소시킨다
면역조직화학 판독에서 관찰된 TDP-43 병리학의 감소를 확인하기 위해, 뇌의 총 불용성/응집된 TDP-43의 양을 생화학적 분류 후에 정량화하였다. RIPA-불용성 분획을 불용성/응집된 TDP-43을 함유하는 좌뇌 반구의 피질로부터 제조하였다. 불용성 TDP-43의 양의 유의한 감소가 비히클 처리된 동물의 것에 비해 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리된 마우스에서 관찰되었다(도 3c). 분자 TDP-43 병리학의 이러한 감소는 면역조직화학에 의해 관찰된 결과와 일치하며, 이는 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)을 사용한 치료 효능을 확인시켜준다. 우리가 아는 한, 말초 항체 투여가 TDP-43 단백질병증에 대한 생체 내 모델에서 TDP-43 병리의 형성을 개선한다는 것은 이번이 최초이다.
10.11. rNLS8 마우스에서 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리는 미세아교세포 면역반응성 영역을 증가시킨다
트랜스진 발현 억제 후 rNLS8 마우스에서 기능 회복은 미세아교세포 활성의 증가를 수반한다. 미세아교세포 세포체 영역이 이러한 단계에서 증가하며 TDP-43 병리 제거 및 운동 결핍의 기능적 회복을 초래하며, 이는 rNLS8 마우스 모델에서 치료 패러다임을 시사한다(문헌[Spiller K.J et al., Nature Neuroscience, 2018]).
rNLS8 마우스에서 TDP-43 병리를 감소시키는 ACI-7069-633B12-Ab1의 작용 방식을 평가하기 위해, 미세아교세포 활성에 대한 효능을 평가하였다. Iba1 염색을 면역조직화학으로 수행하여 마우스 대뇌 피질의 미세아교세포의 수 및 상태를 정량화하였다. 미세아교세포가 말기 단계(5주 오프 DOX)에서 rNLS8 마우스에서 발견되었다. ACI-7069-633B12-Ab1 처리는 비히클-처리된 대조군에 비해 피질에서 Iba1 양성 면역반응성 영역을 증가시켰다(도 5a). 이러한 증가는 미세아교세포 수의 증가 또는 미세아교세포 형태의 변화로 인해 발생할 수 있다. 이를 위해, 먼저 피질에서 Iba1-양성 세포의 밀도를 평가하였다. ACI-7069-633B12-Ab1 처리는 비히클-대조군과 비교하여 세포 수를 나타내는 미세아교세포 세포 밀도에 영향을 미치지 않았다.
다음으로, 미세아교세포 형태에 대한 ACI-7069-633B12-Ab1의 영향을 평가하였다. Iba1 면역반응성 영역의 증가를 형태를 나타내는 미세아교세포 활성화 상태의 변화와 연관시키기 위해, 미세아교세포를 이들의 크기 및 형태(큰 비후, 작은 분지 및 분지 휴식)에 기초하여 3가지 상태로 분류하였다. 평균 세포 크기의 유의한 증가가 비히클-처리 대조군에 비해 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 처리에서 큰 비후 미세아교세포에 대해 나타났다(도 5b). 덜 활성화된 상태를 나타내는 다른 2개 부류의 미세아교세포에서 유의한 차이가 발견되지 않았다(도 5c 내지 d). 이러한 분석은 ACI-7069-633B12-Ab1 처리 코호트에서 관찰된 총 Iba1 양성 면역반응성 영역의 증가가 미세아교세포 세포 크기 및 활성화 상태의 증가에 반영되는 형태의 변화로부터 기인한다는 것을 시사한다. 이는 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)이 이러한 동물 모델에서, 적어도 부분적으로 미세아교세포의 모집 및 활성화를 통해 TDP-43 병리를 감소시킴을 시사한다.
실시예 11: 재조합 TDP-43 응집 분석에서 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)의 시험관 내 기능성
시험관 내 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체)의 기능성을 평가하기 위해, TDP-43 응집을 억제하는 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 의 능력을 시험하였다. FL TDP-43을 담배 식각 바이러스(TEV: Tobacco Etch Virus) 프로테아제 절단 부위에 의해 분리되고 재조합적으로 생성된 말토스 결합 단백질(MBP)에 C-말단에 융합시켰다. 2.5 μM ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 또는 TDP-43에 결합하지 않는 이소타입 대조군의 존재 하에 30 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4에서 2.5 μM TDP-43-TEV-MBP 융합 단백질의 응집을 TEV 프로테아제(AcTEV, Invitrogen)를 첨가하여 유도하였고 흡광도를 μclear 96웰 플레이트(Greiner)에서 600 nm에서 30시간에 걸쳐 모니터링하였다. 평가를 위해, 종점을 이소타입 대조군에 대해 정규화하고 응집된 TDP-43의 퍼센트를 ACI-7069-633B12-Ab1에 대해 계산하였다. 항체 ACI-7069-633B12-Ab1은 이소타입 대조군에 비해 TDP-43 응집을 98%까지 유의하게 억제한다(도 4).
실시예 12: ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 및 ACI-7071-809F12-Ab1(IgG2a 변이체)를 사용하여 체액에서 TDP-43의 검출 및 정량화
방법: PerkinElmer's 비드-기반 AlphaLISA 면역분석을 ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 변이체) 및 ACI-7071-809F12-Ab1(IgG2a 변이체)을 사용하여 확립하였다. CSF 샘플의 경우, 스파이크 회복 실험에서 희석 선형성을 설정하였다. 이어서 TDP-43의 농도를 CSF 샘플에서 측정하였다. 샘플을 백색 optiplateTM - 384 마이크로플레이트에서 제조하고 615 nm에서의 방출을 원시 AlphaLISA 계수로 측정하였다.
결과: 건강한 대조군 및 FTLD-TDP(의미 치매, C9orf72 또는 GRN) 환자의 뇌척수액(CSF) 샘플의 총 TDP-43을 본 면역분석에서 정량화하였다(도 6). GRN 돌연변이가 있는 FTLD-TDP 환자의 다양한 환자의 CSF 샘플에 대한 상대 TDP-43 정량화는 3개의 독립적인 실험에서 건강한 대조군에 비해 유의하게 더 높은 TDP-43 수준을 나타냈다(도 6). C9orf72 돌연변이 및 의미 치매가 있는 FTLD-TDP 환자의 다양한 환자의 CSF 샘플에 대한 상대 TDP-43 정량화는 또한 3개의 독립적인 실험에서 건강한 대조군에 비해 더 높은 TDP-43 수준을 나타냈다(도 6).
실시예 13: FTD 뇌 추출물에서 면역고갈에 의해 평가된 병리학적 TDP-43에 대한 결합
천연 상태에서 TDP-43 응집체에 특이적으로 결합하는 항체의 효능을 평가하기 위해, 풍부한 병리학적 TDP-43이 있는 뇌 추출물에서 면역고갈 실험을 수행하였다.
방법: FTD 유형 A(FTD-A) 사후 뇌의 불용성 분획을 실시예 7에 기술된 바와 같이 준비하였다. 면역고갈을 DynabeadsTM 자기 비드, 단백질 G(Thermoscientific 10003D)를 사용하여 수행하였다. 튜브에 재현탁한 후, 130 μl의 비드를 1.5 ml 저결합 튜브로 옮겼다. 비드를 자석을 사용하여 0.05% Tween-20이 보충된 PBS로 2회 세척하여 상등액을 제거하였다. 비드를 3개의 상이한 저결합 튜브에 동등하게 분할하였다. 항체(ACI-7069-633B12-Ab1(IgG2a 이소타입), ACI-7069-642D12-Ab1(IgG2a 이소타입), 마우스 IgG2a 대조군)을 100 μg/ml로 희석하고 100 μl을 상등액 제거(자석 사용) 후 각 튜브에 첨가하였다. 항체-비드 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비드-항체 복합체를 500 μl PBS-0.05% Tween-20으로 1회 세척하고 PBS로 1회 세척한 다음 250 μl PBS에 재현탁하였다. 항체-비드를 2개의 새로운 튜브에 분할하였다(튜브 당 120 μl). 불용성 분획을 얼음 상에서 해동하고 얼음 상에서 30 진폭에서 30초 동안 초음파처리하였다. 상등액을 제거한 후 30 마이크로그램의 뇌 물질을 각 항체-비드 튜브에 첨가하고 연속 회전 하에 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 튜브를 자석 위에 두고 상등액을 면역고갈된 분획으로서 수집하였다. 입력 및 면역고갈된 물질을 웨스턴 블롯으로 추가로 분석하였다. 웨스턴 블롯을 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행하였다. 20 μl의 샘플을 레인 당 로딩하였다. 다음에 따라 면역블롯팅을 수행하였다: 총 TDP-43(DyLight680에 커플링된 ACI-7069-633B12-Ab1), pTDP-43(Biolegend, 829901)을 각각 1:2000 및 1:1000 희석으로 사용하였다. 염소 항-랫트 2차 항체(카탈로그 번호 925-32219)를 1:10000 희석으로 사용하였다.
결과: ACI-7069-633B12-Ab1 및 ACI-7069-642D12-Ab1은 이소타입 대조군 항체에 비해 FTD 유형 A 뇌 조직으로부터 수득된 사르코실 불용성 분획으로부터의 TDP-43 및 pTDP-43에 특이적으로 결합 및 고갈시킬 수 있었다(도 7). 이러한 데이터는 인간 환자의 표적에 관여하는 이러한 항체의 특성을 확인시켜준다.
참고문헌
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
SEQUENCE LISTING <110> AC Immune SA <120> Anti-TDP-43 binding molecules and uses thereof <130> P215020WO00 <160> 159 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 414 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Q13148 <400> 1 Met Ser Glu Tyr Ile Arg Val Thr Glu Asp Glu Asn Asp Glu Pro Ile 1 5 10 15 Glu Ile Pro Ser Glu Asp Asp Gly Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Thr 20 25 30 Ala Gln Phe Pro Gly Ala Cys Gly Leu Arg Tyr Arg Asn Pro Val Ser 35 40 45 Gln Cys Met Arg Gly Val Arg Leu Val Glu Gly Ile Leu His Ala Pro 50 55 60 Asp Ala Gly Trp Gly Asn Leu Val Tyr Val Val Asn Tyr Pro Lys Asp 65 70 75 80 Asn Lys Arg Lys Met Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Val Lys Val 85 90 95 Lys Arg Ala Val Gln Lys Thr Ser Asp Leu Ile Val Leu Gly Leu Pro 100 105 110 Trp Lys Thr Thr Glu Gln Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Ser Thr Phe Gly 115 120 125 Glu Val Leu Met Val Gln Val Lys Lys Asp Leu Lys Thr Gly His Ser 130 135 140 Lys Gly Phe Gly Phe Val Arg Phe Thr Glu Tyr Glu Thr Gln Val Lys 145 150 155 160 Val Met Ser Gln Arg His Met Ile Asp Gly Arg Trp Cys Asp Cys Lys 165 170 175 Leu Pro Asn Ser Lys Gln Ser Gln Asp Glu Pro Leu Arg Ser Arg Lys 180 185 190 Val Phe Val Gly Arg Cys Thr Glu Asp Met Thr Glu Asp Glu Leu Arg 195 200 205 Glu Phe Phe Ser Gln Tyr Gly Asp Val Met Asp Val Phe Ile Pro Lys 210 215 220 Pro Phe Arg Ala Phe Ala Phe Val Thr Phe Ala Asp Asp Gln Ile Ala 225 230 235 240 Gln Ser Leu Cys Gly Glu Asp Leu Ile Ile Lys Gly Ile Ser Val His 245 250 255 Ile Ser Asn Ala Glu Pro Lys His Asn Ser Asn Arg Gln Leu Glu Arg 260 265 270 Ser Gly Arg Phe Gly Gly Asn Pro Gly Gly Phe Gly Asn Gln Gly Gly 275 280 285 Phe Gly Asn Ser Arg Gly Gly Gly Ala Gly Leu Gly Asn Asn Gln Gly 290 295 300 Ser Asn Met Gly Gly Gly Met Asn Phe Gly Ala Phe Ser Ile Asn Pro 305 310 315 320 Ala Met Met Ala Ala Ala Gln Ala Ala Leu Gln Ser Ser Trp Gly Met 325 330 335 Met Gly Met Leu Ala Ser Gln Gln Asn Gln Ser Gly Pro Ser Gly Asn 340 345 350 Asn Gln Asn Gln Gly Asn Met Gln Arg Glu Pro Asn Gln Ala Phe Gly 355 360 365 Ser Gly Asn Asn Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ser Gly Ala Ala Ile Gly 370 375 380 Trp Gly Ser Ala Ser Asn Ala Gly Ser Gly Ser Gly Phe Asn Gly Gly 385 390 395 400 Phe Gly Ser Ser Met Asp Ser Lys Ser Ser Gly Trp Gly Met 405 410 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <400> 8 000 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-631B2-Ab1 VH <400> 10 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Glu Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asp Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-631B2-Ab1 VH CDR1 <400> 11 Glu Tyr Ser Ile His 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-631B2-Ab1 VH CDR2 <400> 12 Gly Ile Asn Pro Asp Asn Gly Gly Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-631B2-AB1 VL <400> 14 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Arg Ile Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-631B2-AB1 VL CDR1 <400> 15 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-631B2-AB1 VL CDR2 <400> 16 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-631B2-Ab1 VL CDR3 <400> 17 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr 1 5 <210> 18 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-631B2-Ab1 VH <400> 18 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatactcca tacactgggt gaaacagagc 120 catggagaga gccttgagtg gattggaggt attaatcctg acaatggtgg tactaggtac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggcgacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240 atggacctcc gcagcctgac atctgaggat tctgcagttt attattgtgc aagagagtcc 300 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tct 333 <210> 19 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-631B2-Ab1 VL <400> 19 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta aatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctagaatcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300 cacacgttcg gttctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 20 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-633B12-Ab1 VH <400> 20 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-633B12-Ab1 VH CDR1 <400> 21 Glu Tyr Ser Met His 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-633B12-Ab1 VH CDR2 <400> 22 Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <400> 23 000 <210> 24 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-633B12-Ab1 VL <400> 24 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Arg Ile Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-633B12-Ab1 VL CDR1 <400> 25 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 26 <400> 26 000 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-633B12-Ab1 VL CDR3 <400> 27 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr 1 5 <210> 28 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-633B12-Ab1 VH <400> 28 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60 tcctgcaaga cttctggatt cacattcact gaatactcca tgcactgggt gaaacagagc 120 catggaaaga gccttgagtg gattggaggt attaatccta acaatggtgg tactagctac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca agtcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctaac atctgaggat tctgcagtct attactgtgc aagagagtcc 300 tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tca 333 <210> 29 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-633B12-Ab1 VL <400> 29 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta catagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctagaatcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300 cacacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 30 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-634H10-Ab2 VH <400> 30 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Ser Asn Thr Lys Phe Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Tyr Gly Gly Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-634H10-Ab2 VH CDR1 <400> 31 Asp Thr Tyr Met His 1 5 <210> 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ACI-7069-634H10-Ab2 VL CDR1 <400> 35 Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-634H10-Ab2 VL CDR2 <400> 36 Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Asp 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-634H10-Ab2 VL CDR3 <400> 37 Leu Gln Gln Gly Glu Ser Pro Tyr Thr 1 5 <210> 38 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-634H10-Ab2 VH <400> 38 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaggttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggaatg gattggaagg attgatcctg cgaatagtaa tactaaattt 180 gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acatcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagattctac 300 ggtggtagcc actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-634H10-Ab2 VL <400> 39 gacatcaaga tgacccagtc tccatcctcc atgtatgcat cgttgggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcataaacca 120 tggaaatctc ctaaggccct gatctattat gctacaagct tggcagatgg ggtcccatca 180 agattcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctaa ccatcagcag cctggagtct 240 gacgatacag caacttacta ctgtctacag caaggtgaga gcccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-636E5-Ab1 VH <400> 40 Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Met Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Lys Tyr Ile Asn Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Tyr Gly Ser Gly Trp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val 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Val Gly Asp 85 90 95 Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Thr Val Leu 115 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-636E5-Ab1 VL CDR1 <400> 45 Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu 1 5 10 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-636E5-Ab1 VL CDR2 <400> 46 Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 1 5 <210> 47 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-636E5-Ab1 VL CDR3 <400> 47 Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 1 5 10 <210> 48 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-636E5-Ab1 VH <400> 48 gaggtacatc tggtggagtc tgggggagac ttagtgatgc ctggagggtc cctgaagctc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg gtggtaaata tatcaactac 180 ttagacagtt tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctatac 240 ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggat acagccatgt attactgtgc aaaagactac 300 ggtagtggct gggcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 49 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-636E5-Ab1 VL <400> 49 caacttgtgc tcactcagtc atcttcagcc tctttctccc tgggagcctc agcaaaactc 60 acgtgcacct tgagtagtca gcacagtacg tacaccattg aatggtatca gcaacagcca 120 ctcaagcctc ctaagtatgt gatggagctt aagaaagatg gaagccacag cacaggtgat 180 gggattcctg atcgcttctc tggatccagc tctggtgctg atcgctacct tagcatttcc 240 aacatccagc ctgaagatga agcaatatac atctgtggtg tgggtgatac aattaaggaa 300 caatttgtgt atgttttcgg cggtggaacc aaggtcactg tccta 345 <210> 50 <400> 50 000 <210> 51 <400> 51 000 <210> 52 <400> 52 000 <210> 53 <400> 53 000 <210> 54 <400> 54 000 <210> 55 <400> 55 000 <210> 56 <400> 56 000 <210> 57 <400> 57 000 <210> 58 <400> 58 000 <210> 59 <400> 59 000 <210> 60 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7069-641H1-Ab2 VH <400> 60 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr 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Pro Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 125 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-712A6-Ab1 VL CDR1 <400> 125 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Pro Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 126 <400> 126 000 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-712A6-Ab1 VL CDR3 <400> 127 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Pro Thr 1 5 <210> 128 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-712A6-Ab1 VH <400> 128 caggtccagc tgcagcagtc tggagctgag ctggtgaaac ccgggacatc agtgaagctg 60 tcctgtaagg cttctgccta caccttcact gaatatacta tacactggat aaagcagaaa 120 tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg tttcaccctg aaaatgataa tataaagtac 180 aatgagaatt tcaaggacaa ggccacattg actgcggaca gatcctccag cacagtctat 240 atggaactta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc agggacgtca 300 ggctacggag actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcttca 348 <210> 129 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-712A6-Ab1 VL <400> 129 gatgttgtga tgacccagat tccactcact ttgtcgatta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta cctagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgacga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300 cctacgttcg gtgctgggac caagctggaa ctgaaa 336 <210> 130 <400> 130 000 <210> 131 <400> 131 000 <210> 132 <400> 132 000 <210> 133 <400> 133 000 <210> 134 <400> 134 000 <210> 135 <400> 135 000 <210> 136 <400> 136 000 <210> 137 <400> 137 000 <210> 138 <400> 138 000 <210> 139 <400> 139 000 <210> 140 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VH <400> 140 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Val 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ser His Thr Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Tyr Gly Asn Phe Pro Ala Ser Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 141 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VH CDR1 <400> 141 Asp Tyr Ser Met His 1 5 <210> 142 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VH CDR2 <400> 142 Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 143 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VH CDR3 <400> 143 Tyr Gly Asn Phe Pro Ala Ser Phe Ser Tyr 1 5 10 <210> 144 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VL <400> 144 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 145 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VL CDR1 <400> 145 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr 1 5 10 15 <210> 146 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VL CDR2 <400> 146 Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VL CDR3 <400> 147 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 148 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VH <400> 148 caggtccagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg gttctggcta caaattcact gattattcta tgcactgggt gaaacagagt 120 catacaaaga gtctagagtg gattggagtt attagtactt actatggtga tactacctac 180 aaccagaaat tcaagggcaa ggccacaatc actgtagaca aatcctccag cacagcctat 240 atggaacttg ccagactgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aacgtacggt 300 aacttcccgg cctcattttc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 149 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809D9-Ab2 VL <400> 149 gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct atacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 120 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 240 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcca 300 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaa 336 <210> 150 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VH <400> 150 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Arg Asn 20 25 30 Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Pro Gly Gly Ser Thr Asn Cys Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Val Gly Gly Asn Tyr Val Trp Asp Tyr Asn Asn Tyr Ala Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 151 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VH CDR1 <400> 151 Arg Asn Gly Val Gln 1 5 <210> 152 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VH CDR2 <400> 152 Val Ile Trp Pro Gly Gly Ser Thr Asn Cys Asn Ser Ala Leu Met Ser 1 5 10 15 <210> 153 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VH CDR3 <400> 153 Val Gly Gly Asn Tyr Val Trp Asp Tyr Asn Asn Tyr Ala 1 5 10 <210> 154 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VL <400> 154 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Ile Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg 100 105 110 <210> 155 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VL CDR1 <400> 155 Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Ile Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 156 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VL CDR2 <400> 156 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VL CDR3 <400> 157 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 1 5 <210> 158 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VH <400> 158 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60 acttgcactg tctctgggtt ttcgttaaac agaaatggtg tacagtgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggcctg gcggaagcac aaattgtaat 180 tcggctctca tgtccagact gagcatcagc aaagacaact ccaagagtca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcacac tgatgacaca ggcatatatt actgtgccag agtagggggt 300 aactacgtgt gggactataa taactacgcc tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360 gca 363 <210> 159 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACI-7071-809F12-Ab1 VL <400> 159 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaggcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gaacattgta catagtattg gaaacaccta tttagagtgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctagaa ataaga 336

Claims (57)

  1. 미스폴딩된 응집된 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 TDP-43에 결합하는, TDP-43 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 미스폴딩된 응집된 인간 TDP-43 및 비-응집된 생리학적 인간 TDP-43에 결합하는, TDP-43 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음의 특징 중 하나 이상, 최대 모두를 나타내는, TDP-43 결합 분자:
    a) TDP-43 단백질 또는 이의 단편의 응집 억제,
    b) TDP-43 세포간 전파 차단,
    c) TDP-43 응집체 분해; 및
    d) TDP-43 씨딩 차단.
  4. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 생체 내에서 TDP-43 병리학을 감소시키는, TDP-43 결합 분자.
  5. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 생체 내에서 응집된 TDP-43 및/또는 인산화된 TDP-43의 수준을 감소시키는, TDP-43 결합 분자.
  6. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 181-195, 199-213, 307-321, 352-366, 389-411, 397-411 또는 140-200 내의 에피토프, 또는 비-인간 TDP-43의 동등한 에피토프에 결합하는, TDP-43 결합 분자.
  7. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 183-188, 203-213, 204-208, 204-211, 205-210, 316-323, 358-361, 400-405, 400-406 또는 400-412 내의 에피토프 또는 비-인간 TDP-43의 동등한 에피토프에 결합하는, TDP-43 결합 분자.
  8. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 인간 TDP-43(SEQ ID NO: 1)의 아미노산 잔기 400-405, 400-406 또는 400-412 내의 에피토프 또는 비-인간 TDP-43의 동등한 에피토프에 결합하는, TDP-43 결합 분자.
  9. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, TDP-43 결합 분자.
  10. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하는, TDP-43 결합 분자:
    a) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    b) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    c) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    d) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    e) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    f) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 73을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    g) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    h) SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 102의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    i) SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    j) SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 142의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 145의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 146의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2 및 SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3; 또는
    k) SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 157의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3.
  11. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하는, TDP-43 결합 분자:
    a. SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　14의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    b. SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO:　20의 아미노산 서열과 적어도 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열과 적어도 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    c. SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열과 적어도 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　34의 아미노산 서열과 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    d. SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO:　40의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    e. SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열과 적어도 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　64의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    f. SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO: 70의 아미노산 서열과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　74의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    g. SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO:　80의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　84의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    h. SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO:　100의 아미노산 서열과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　104의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    i. SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO:　120의 아미노산 서열과 적어도 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　124의 아미노산 서열과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    j. SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO:　140의 아미노산 서열과 적어도 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 144의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    k. SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 SEQ ID NO:　150의 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역(VH); 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는 SEQ ID NO:　154의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역(VL).
  12. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 포함하는, TDP-43 결합 분자:
    a. SEQ ID NO: 10의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 14의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    b. SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    c. SEQ ID NO: 30의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 34의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    d. SEQ ID NO: 40의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 44의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    e. SEQ ID NO: 60의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 64의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    f. SEQ ID NO: 70의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 74의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    g. SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    h. SEQ ID NO: 100의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 104의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    i. SEQ ID NO: 120의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    j. SEQ ID NO: 140의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 144의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    k. SEQ ID NO: 150의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 154의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
  13. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 아미노산 서열 ES(Glu-Ser)을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함하는, TDP-43 결합 분자.
  14. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 20의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 24의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 TDP-43 결합 분자.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR1; SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR2; 및 SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH-CDR3; SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR1; SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR2; 및 SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL-CDR3을 포함하는, TDP-43 결합 분자.
  16. 제1항 내지 제12항, 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 80의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 84의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, TDP-43 결합 분자.
  17. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, TDP-43 결합 분자.
  18. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, TDP-43 결합 분자.
  19. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, IgA, IgD, IgE, IgM, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, TDP-43 결합 분자.
  20. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 수의학적 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한, TDP-43 결합 분자.
  21. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, TDP-43 결합 분자가 진단 또는 치료적 도구인, 인간 또는 수의학적 치료 및/또는 진단에서 사용하기 위한, TDP-43 결합 분자.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 특히 분석 도구 또는 참조 분자로서 연구 용도를 위한, TDP-43 결합 분자.
  23. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상의 예방, 완화, 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한, TDP-43 결합 분자.
  24. 전술하는 항들 중 어느 한 항에 있어서, TDP-43 단백질병증의 예방, 완화, 치료 및/또는 진단에 사용하기 위한, TDP-43 결합 분자.
  25. 제21항에 있어서, TDP-43 단백질병증을 모니터링하기 위한 진단 도구로서 사용하기 위한, TDP-43 결합 분자.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 전측두엽 치매(FTD, 예컨대 산발성 또는 가족성의 운동-뉴런 질환(MND)이 있거나 없는 것, 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이가 있는 것, C9orf72 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, 염색체 9p에 연결되어 있는 것, 피질기저 퇴행, 유비퀴틴-양성 TDP-43 봉입체(FTLD-TDP)가 있는 전측두엽 퇴행(FTLD), 호은성 입자 질병, 픽병, 의미형 변이체 원발 진행성 실어증(svPPA), 행동 변이 FTD(bvFTD), 비유창 변이 원발 진행성 실어증(nfvPPA) 등), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 예컨대 산발성 ALS, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 안지오제닌(ANG) 돌연변이가 있는 것), 알렉산더병(AxD), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군, 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 다운 증후군, 영국 가족성 치매, 폴리글루타민 질환(헌팅턴병 및 척수소뇌 실조 유형 3(SCA3; 마카도 조셉병으로도 공지됨)), 해마 경화증 치매 및 근병증(산발성 봉입체 근염, 발로신-함유 단백질(VCP)에 돌연변이가 있는 봉입체 근염; 또한 골의 파제트병 및 전측두엽 치매), 테두리 액포가 있는 눈인두 근이영양증, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 있는 근섬유 근병증, 외상성 뇌손상(TBI), 루이소체가 있는 치매(DLB) 또는 파킨슨병(PD)인, TDP-43 결합 분자.
  27. 제26항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 전측두엽 치매(FTD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 또는 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE)인, TDP-43 결합 분자.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 근위축성 측삭 경화증(ALS)인, TDP-43 결합 분자.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 알츠하이머병(AD)인, TDP-43 결합 분자.
  30. 제26항 또는 제27항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 전측두엽 치매(FTD)인, TDP-43 결합 분자.
  31. 전술하는 항들 중 어느 한 항의 TDP-43 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는, 약학 조성물.
  32. 전술하는 항들 중 어느 한 항의 TDP-43 결합 분자를 코딩하는, 핵산 분자.
  33. 다음으로 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자:
    a. SEQ ID NO: 18의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 19의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    b. SEQ ID NO: 28의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 29의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    c. SEQ ID NO: 38의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 39의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    d. SEQ ID NO: 48의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 49의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    e. SEQ ID NO: 68의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 69의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    f. SEQ ID NO: 78의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 79의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    g. SEQ ID NO: 88의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 89의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    h. SEQ ID NO: 108의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 109의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL) 또는
    i. SEQ ID NO: 128의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 129의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    j. SEQ ID NO: 148의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 149의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    k. SEQ ID NO: 158의 서열을 코딩하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 159의 서열을 코딩하는 경쇄 가변 영역(VL).
  34. 제32항 또는 제33항의 핵산을 포함하는, 재조합 벡터.
  35. 제32항 또는 제33항의 핵산 및/또는 제34항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  36. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 TDP-43 결합 분자를 발현하는, 숙주 세포.
  37. 제32항 또는 제33항의 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터.
  38. 제37항의 발현 벡터를 함유하는, 무세포 발현 시스템.
  39. TDP-43 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    a) 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 생성에 적합한 조건 하에 제35항 또는 제36항의 숙주 세포 또는 제38항의 무세포 발현 시스템을 배양하는 단계; 및
    b) 결합 분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 단리하는 단계.
  40. 대상체로부터 수득된 샘플에서 TDP-43을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 TDP-43 결합 분자를 샘플과 접촉시키는 단계 및 샘플의 TDP-43 수준을 대조군 샘플 또는 샘플들의 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 방법.
  41. 제40항의 방법을 수행하는 단계를 포함하는 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증의 진단 방법으로서 건강한 대상체에 기초한 대조군 수준과 비교하여 샘플에서 TDP-43의 더 높은 수준이 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증을 나타내는, 방법.
  42. 제40항 또는 제41항의 방법을 수행하는 단계를 포함하는 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증의 진단 방법으로서 질환에 걸린 대조군과 비교하여 샘플에서 TDP-43의 유사하거나 더 높은 수준이 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증을 나타내는, 방법.
  43. TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상의 분류 방법 또는 TDP-43 단백질병증의 분류 방법으로서 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    a. 제41항 및/또는 제42항의 방법을 수행하는 단계,
    b. 비제한적으로 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이, C9orf72 돌연변이, TARDBP 돌연변이, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이, TARDBP 돌연변이, 안지오제닌(ANG) 돌연변이, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 포함하여 선택적으로 샘플에서 돌연변이를 식별하는 단계, 및
    c. TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증을 분류하는 단계.
  44. TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상의 분류 방법 또는 TDP-43 단백질병증의 분류 방법으로서 다음의 단계를 포함하는, 방법:
    a. TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 있는 대상체로부터 수득된 샘플에서 제42항의 방법을 수행하는 단계로서, 질환에 걸린 대조군과의 비교가 상이한 유형 또는 하위유형의 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 있는 대상체로부터의 다수의 대조군 샘플에 기초하는 것인 단계; 및
    b. 상기 비교에 기초하여 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증을 분류하는 단계.
  45. 대상체의 샘플을 사용하여 2개 이상의 시점에서 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상을 모니터링하는 방법 또는 TDP-43 단백질병증을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 TDP-43 결합 분자를 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하고 하나 이상의 조기 샘플과 비교하여 후기 샘플에서 TDP-43의 더 높은 수준은 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증의 진행을 나타내는, 방법.
  46. 대상체의 샘플을 사용하여 2개 이상의 시점에서 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상을 모니터링하는 방법 또는 TDP-43 단백질병증을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 TDP-43 결합 분자를 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하고 하나 이상의 조기 샘플과 비교하여 후기 샘플에서 TDP-43의 더 낮은 수준은 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증의 퇴행을 나타내는, 방법.
  47. 특정 요법으로 치료된 대상체의 샘플을 사용하여 2개 이상의 시점에서 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상을 모니터링하는 방법 또는 TDP-43 단백질병증을 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 TDP-43 결합 분자를 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하고 하나 이상의 조기 샘플과 비교하여 후기 샘플에서 TDP-43의 더 낮은 수준은 TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증의 성공적인 치료를 나타내는, 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 시점이 요법으로 처리하기 전이고 제2 시점이 요법으로 처리한 후인, 방법.
  49. TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상의 치료를 위한 요법을 선택하는 방법 또는 TDP-43 단백질병증의 치료를 위한 요법을 선택하는 방법으로서, 상기 방법은 요법으로 치료 전후에 채취한 샘플을 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 TDP-43 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하며 치료 전 취해진 샘플과 비교하여 치료 후 취해진 샘플에서 TDP-43의 더 낮은 수준이 TPD-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증의 성공적인 치료를 나타내고 따라서 상기 요법이 치료에 대해 선택되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 요법이 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 TDP-43 결합 분자 또는 제31항의 약학 조성물을 포함하는, 방법.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액, CSF, ISF 또는 소변 샘플을 포함하는, 방법.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증이 전측두엽 치매(FTD, 예컨대 산발성 또는 가족성의 운동-뉴런 질환(MND)이 있거나 없는 것, 프로그래뉼린(GRN) 돌연변이가 있는 것, C9orf72 돌연변이가 있는 것, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 것, 염색체 9p에 연결된 것, 피질기저 퇴행, 전측두엽 퇴행(FTLD) 유비퀴틴-양성 TDP-43 봉입체(FTLD-TDP), 호은성 입자 질병, 픽병, 의미형 변이체 원발 진행성 실어증(svPPA), 행동 변이 FTD(bvFTD), 비유창 변이 원발 진행성 실어증(nfvPPA) 등), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 예컨대 산발성 ALS, TARDBP 돌연변이가 있는 것, 안지오제닌(ANG) 돌연변이가 있는 것), 알렉산더병(AxD), 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE), 만성 외상성 뇌병증, 페리 증후군, 알츠하이머병(AD, AD의 산발성 및 가족성 형태 포함), 다운 증후군, 영국 가족성 치매, 폴리글루타민 질환(헌팅턴병 및 척수소뇌 실조 유형 3(SCA3; 마카도 조셉병으로도 알려져 있음)), 해마 경화증 치매 및 근병증(산발성 봉입체 근염, 발로신-함유 단백질(VCP)의 돌연변이가 있는 봉입체 근염; 또한 골의 파제트병 및 전측두엽 치매), 테두리 액포가 있는 눈인두 근이영양증, 미오틸린(MYOT) 유전자의 돌연변이 또는 데스민(DES)을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 있는 근섬유 근병증, 외상성 뇌손상(TBI), 루이소체가 있는 치매(DLB) 또는 파킨슨병(PD)인, 방법.
  53. 제52항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증이 전측두엽 치매(FTD), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 만성 외상성 뇌병증(CTE), 또는 변연계-우세 연령-관련 TDP-43 뇌병증(LATE)을 포함하는, 방법.
  54. 제52항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증이 근위축성 측삭 경화증(ALS)인, 방법.
  55. 제52항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환 또는 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증이 알츠하이머병(AD)인, 방법.
  56. 제52항에 있어서, TDP-43과 관련된 질환, 장애 및/또는 이상 또는 TDP-43 단백질병증이 전측두엽 치매(FTD)인, 방법.
  57. TDP-43과 질환, 장애 및/또는 이상, 또는 TDP-43 단백질병증의 진단을 위한, 또는 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 TDP-43 결합 분자를 포함하는 제40항 내지 제56항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한, 키트.
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