TWI593705B - Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient - Google Patents

Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient Download PDF

Info

Publication number
TWI593705B
TWI593705B TW101150028A TW101150028A TWI593705B TW I593705 B TWI593705 B TW I593705B TW 101150028 A TW101150028 A TW 101150028A TW 101150028 A TW101150028 A TW 101150028A TW I593705 B TWI593705 B TW I593705B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antibody
epiregulin
amino acid
seq
cells
Prior art date
Application number
TW101150028A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201335183A (zh
Inventor
Hirotake Shiraiwa
Keiko Esaki
Tomoyuki Igawa
Taichi Kuramochi
Atsuhiko Maeda
Shigero Tanba
Hiroyuki Tsunoda
Tatsuhiko Tachibana
Yasuko Kinoshita
Masami Suzuki
Atsuhiko Kato
Etsuko Takeiri
Eri Hashimoto
Yoshinori Watanabe
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48697597&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TWI593705(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of TW201335183A publication Critical patent/TW201335183A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI593705B publication Critical patent/TWI593705B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Description

人型化抗表皮調節素抗體及包含該抗體為有效成分之癌治療劑
本發明係關於癌症的治療方法、及癌細胞之增殖抑制劑及抗癌劑。
癌症在已開發國家係死亡率之主要原因。為了治療癌症，在過去50年已開發的許多化學療法劑。大半的化學療法劑可分類為烷基化劑、代謝拮抗劑、蒽環類藥物(anthracycline)、植物生物鹼、拓撲異構酶抑制劑及抗腫瘤劑。該等藥劑均係影響細胞***或DNA之合成，通過某些形式作用的機制而帶來治療效果。
特定化學療法劑之有效性，在癌症之間、患者之間、或個別的患者中隨時間經過而不同。暴露於化學療法劑的癌細胞會對如此的化學療法劑產生耐受性，而對於其多數抗癌劑也常同樣會產生交叉耐受性。再者，由上述化學療法劑之機制，為了控制該等化學療法劑對正常細胞造成之細胞傷害的結果也會帶來的副作用，故化學療法劑之用量或用法在許多情形受到限制。
替代習知的化學療法劑，近年來開發以對於癌細胞為專一性表現之分子作為標靶的分子標靶藥已有進展。由於 此種分子標靶藥的出現，可避免以往化學療法劑固有的副作用，可作有助於癌患者之生活品質(QOL)的癌症治療。如此的分子標靶藥除了低分子(small molecule)藥劑以外，也包含抗體等高分子藥劑。治療抗體，除了為活體內原本存在的分子且對於活體造成的毒性低的優點，除此以外尚有藉由經由效應子機能之細胞毒性等低分子藥劑以外的作用機轉而專一性的傷害標靶細胞並發揮治療效果的優點，近年已有許多治療抗體上市。
就藉由如此的效應子機能之細胞毒性等低分子藥劑以外的作用機轉而專一性的傷害標靶細胞的抗體而言，已有人揭示以於大腸癌、肺腺癌、胰臟癌、胃癌、腎癌中有高表現的表皮調節素作為標靶的治療抗體(專利文獻1)。具體而言，測定抗表皮調節素抗體之補體依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity；CDC)活性、並進一步測定抗體依存性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC)活性，已發現抗表皮調節素抗體對於表現表皮調節素之細胞具有CDC活性及ADCC活性。又，已明白：抗表皮調節素抗體對於癌細胞株具有利用中和作用之增殖抑制效果。再者，由以上知識，發現抗表皮調節素抗體對於原發性、或轉移性的各種癌症的診斷、預防及治療有效。
包括如前述抗癌劑的各種新穎的候選藥劑，為了上市必需通過嚴格的試驗。例如：此種試驗區分為前臨床試驗及臨床試驗。其中，後者一般再細分為第I相試驗、第II相試驗、及第III相試驗，係使用人類患者實施，但前者係使用動 物實施。一般而言，前臨床試驗的目的在於確立藥劑候選者有作用且確認該藥劑有效且安全。具體而言，該等動物試驗之目的在於確立藥劑無致癌性，無突變誘發性，或無致畸形性，並同時為了理解藥劑之藥物動態學。僅於在前臨床試驗中已確立待驗藥劑對動物之安全性及待驗藥劑的有效性的情況，方認可該待驗藥劑對人類投予之臨床試驗。
於動物，低分子(small molecule)之待驗藥劑(例如從蒽環類藥物衍生的新穎抗癌劑)的作用在許多情況可成為對人類投予時該藥劑之預測作用的指標。因此從如此的前臨床試驗獲得之數據，一般可對於人類投予時的作用可提供高預測性。但是如此的預測性並非在所有種類的待驗藥劑均可獲得，從前臨床試驗之結果的預測性、及關於臨床試驗之藥劑候選者受認可之可能性，非常減少。
一般而言，抗體通常藉由極專一的認識蛋白質性標靶分子而可作用。大部分情形，為單株抗體之待驗抗體藥劑僅認識標靶分子上的單一部位、或單一抗原決定基。單株抗體在以往由於具有標靶之高識別機能，所以抗體係開發藥劑時非常有吸引力的候選者，但另一方面，由於其識別機能，有時前臨床試驗會變得困難。原因為：如此的抗體所結合之標靶分子之序列有種依存性的突變。在人類，例如經由抗原決定基X而專一性的認識分子Y並與該分子結合之單株抗體，在前臨床試驗使用之生物種中之對應標靶分子(同源體(ortholog))Y'中對應存在之抗原決定基X'，可能與人類中對應之標靶分子中存在之X不同，所以時常於非人類種，係專一性的認識同源體分子 Y'且不能與該分子結合。連對於人類及靈長類抗原具有反應性之單株抗體群間，也有許多僅與人類及黑猩猩抗原相同體反應之抗體之例。例如：關於抗CD3單株抗體已觀察到如此的例子。最廣為使用且最充分決定性質的對於CD3複合體為專一性的單株抗體之一為OKT-3，其雖與黑猩猩CD3反應，但是並不與其他靈長類，例如獼猴(Macaca mulatto)之CD3相同體、或犬CD3反應(非專利文獻2)。另一方面，也存在認識獼猴抗原但不認識其人類同源體之單株抗體之例。此群組之一例為來自獼猴之對抗CD3之單株抗體FN-18(非專利文獻2)。
為了應付如前述由於單株抗體之高專一性產生之前臨床動物試驗的問題，已有人採用一些策略。
第一公知的方式，係使用黑猩猩‧模型實施待驗抗體藥劑之前臨床試驗。黑猩猩在基因上的類緣與人類最接近，其基因體有99%與人類基因體相同，所以待驗抗體藥劑專一性結合之標靶分子在黑猩猩的突變，與該分子在人類的突變為相同的可能性非常高，實際上Schlereth等人已發現CD3之突變在人類與黑猩猩為共通(非專利文獻3)。因此黑猩猩中，據認為待驗抗體藥劑不認識該分子的風險性低。但是使用黑猩猩的試驗非常昂貴，且伴隨有倫理的問題。再者，黑猩猩係瀕危動物，所以能使用於實驗的動物數目非常有限。因此待驗抗體藥劑之大部分開發，係排除在黑猩猩進行如此的前臨床試驗。
第二方法，係使於前臨床試驗使用之分子適應於在該試驗使用之動物之方法。該方法中，為了對於試驗動物投予，藉由建構所謂的「代理(surrogate))」抗體，而於前臨床試 驗獲得必要的安全性資訊。一般而言，如此的代理抗體，係專一性的認識非代理抗體，亦即在人類實際之待驗抗體藥劑所結合之標靶分子之試驗動物的同源體，並且修飾成與該同源體結合之抗體。因此使用如此的「代理」抗體的方法，必須分別開發二種不同分子，亦即待驗臨床藥劑以及對應於該待驗臨床藥劑之標靶專一性之在動物種中用於前臨床試驗之待驗前臨床藥劑，並調查其安全性等。如此的代理方法的一大缺點為為了前臨床試驗用之代理抗體係待驗臨床抗體藥劑之修飾物。因此，使用代理抗體之前臨床試驗獲得之數據，時常無法直接適用在人類。所以，基於使用該等方法之前臨床研究的試驗結果預見臨床試驗結果之結果預見性可能減少。
上述方法係使待驗藥劑適應使適合在前臨床試驗使用之動物的方法。另一方面，其他公知方法有：使前臨床試驗使用之動物適應對於人類投予之藥劑候選者之方法。
使試驗動物適應於意圖對人類投予之待驗抗體藥劑之一例，係取代該試驗動物之種為內因性之非人類分子，而創製表現待驗抗體藥劑專一性結合之人類分子的基因轉殖動物。此方式中，在前臨床試驗投予之待驗抗體藥劑，在該基因轉殖試驗動物應與人類抗原結合。就如此的例而言，於Bugelski等人進行的研究中，為了預測在人類患者之類風濕性關節炎之長期治療，使用人類CD4基因轉殖小鼠，進行單株抗體keliximab之前臨床安全性評價。Keliximab，係對於人類及黑猩猩之CD4有專一性的單株抗體。Bugelski等人獲得結論為：使用表現人類蛋白質之基因轉殖小鼠，係使用具有交叉種 專一性之生物藥劑之受限的黑猩猩的研究的有用替代法。但是為了試驗目的製作基因轉殖動物，須耗費許多勞力，要花費時間及成本。
【先前技術文獻】
【專利文獻】
【專利文獻1】WO2008/047723
【非專利文獻】
【非專利文獻1】J.Med.Primatol. (1986) 15, 441-451
【非專利文獻2】J.Med.Primatol. (2001) 40, 141-147
【非專利文獻3】Cancer Immunol. Immunother. 2006 May; 55(5):503-14
【非專利文獻4】Hum.Exp.Toxicol. (2000) 19, 230-243
本發明係關於顯示非人類動物及人類動物間之種交叉反應性(cross-species reactivity)之抗表皮調節素抗體。本發明並關於化學性分解受抑制之抗表皮調節素抗體。本發明尚關於等電點下降之抗表皮調節素抗體。再者，本發明係關於組合體量減少的抗表皮調節素抗體。又，本發明係關於含有前述抗表皮調節素抗體之醫藥組合物、或癌治療劑。再者，本發明係關於前述抗表皮調節素抗體之製造方法。
本案發明人等發現：藉由對於表現人類表皮調節素 之癌細胞發揮細胞毒性及中和活性而將抑制癌細胞增殖之人型化EP27抗體之可變區序列中之胺基酸殘基取代為精胺酸殘基，會有對於從食蟹猴單離之表皮調節素的結合活性及對於人類表皮調節素之結合活性之比上升的結果。亦即，本案發明人等製出了顯示非人類動物食蟹猴及人類動物間之種交叉反應性(cross-species reactivity)的抗表皮調節素抗體。又，藉由將人型化EP27抗體之可變區序列中之胺基酸殘基予以適當取代，製作了化學性分解受抑制的抗表皮調節素抗體。再者，藉由將人型化EP27抗體之可變區序列中之胺基酸殘基予以適當取代，製作了等電點下降之抗表皮調節素抗體。又，藉由將人型化EP27抗體之可變區序列中之胺基酸殘基予以適當取代，製作了組合體量減少的抗表皮調節素抗體。又，本案發明人等明白了：具有該等性質之抗表皮調節素抗體對於癌細胞株顯示由於細胞毒性及中和活性所得之增殖抑制效果。再者，由以上知識，本案發明人等發現抗表皮調節素抗體對於原發性或轉移性的各種癌症的治療有效，乃完成本發明。
更具體而言，本發明係關於以下。
[1]一種抗表皮調節素抗體，其係與包含序列編號：9、10及11表示之重鏈可變區CDR及序列編號：12、13及14表示之輕鏈可變區CDR之抗表皮調節素抗體所結合之抗原決定部位結合之抗體，其特徵為：對於序列編號：170表示之猿表皮調節素之KD值(cEREG KD)與對於序列編號：34表示之人類表皮調節素之KD值(hEREG KD)之比(cEREG KD/hEREG KD)，比起包含序列編號：9、10及11表示之重鏈可變區CDR 及序列編號：12、13及14表示之輕鏈可變區CDR之抗表皮調節素抗體之cEREG KD/hEREG KD為小。
[2]如[1]之抗表皮調節素抗體，其中，cEREG KD/hEREG KD小於40。
[3]如[1]之抗表皮調節素抗體，其中，cEREG KD/hEREG KD小於10。
[4]如[1]之抗表皮調節素抗體，其中，cEREG KD/hEREG KD小於6。
[5]如[1]之抗表皮調節素抗體，其中，cEREG KD/hEREG KD小於4。
[6]如[1]至[5]中任一項之抗表皮調節素抗體，其中，包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區含有序列編號：9表示之重鏈CDR1、選自由序列編號：161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101、及100構成之群組中之重鏈CDR2、及選自由序列編號：158、154、152、151、112、111、110、及11構成之群組中之重鏈CDR3，該輕鏈可變區含有選自由序列編號：163、68、67及12構成之群組中之輕鏈CDR1、選自由序列編號：71、69、及13構成之群組中之輕鏈CDR2、及選自由序列編號：164、48、47及14構成之群組中之輕鏈CDR3。
[7]如[1]至[5]中任一項之抗表皮調節素抗體，其中，包含選自由序列編號：150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、 116、及115構成之群組中之重鏈可變區、及選自由序列編號：141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57、及29構成之群組中之輕鏈可變區。
[8]一種抗表皮調節素抗體，係選自於以下中之任一者： (1)抗表皮調節素抗體，其係包含選自由序列編號：150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49、及38構成之群組中之重鏈可變區、 (2)抗表皮調節素抗體，其係包含選自由序列編號：141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57、及29構成之群組中之輕鏈可變區、或 (3)抗表皮調節素抗體，其係包含選自由序列編號：150、149、148、147、146、145、144、143、142、140、139、138、137、135、134、133、132、131、127、126、125、124、123、122、121、120、119、118、117、116、115、98、97、96、95、94、93、92、79、78、77、76、75、74、73、72、56、55、54、53、52、51、50、49、及38構成之群組中之重鏈可變區、及選自由序列編號：141、136、130、129、128、99、85、84、83、82、81、80、58、57、及29構成之群組中之輕鏈可變區。
[9]如[6]至[8]中任一項之抗表皮調節素抗體，其中，包含序列編號：26之重鏈恆定區。
[10]如[6]至[9]中任一項之抗表皮調節素抗體，其中，包 含序列編號：27之輕鏈恆定區。
[11]如[1]至[10]中任一項之抗表皮調節素抗體，其係具有中和活性。
[12]如[1]至[11]中任一項之抗表皮調節素抗體，其係具有細胞毒性。
[13]如[12]之抗表皮調節素抗體，其中，細胞毒性為CDC及/或ADCC。
[14]如[1]至[12]中任一項之抗表皮調節素抗體，其係連結有增殖抑制劑或細胞毒性物質。
[15]如[14]之抗表皮調節素抗體，其中，抗體為低分子抗體。
[16]如[12]至[15]中任一項之抗表皮調節素抗體，其中，於序列編號：26之重鏈恆定區，含有選自由EU編號表示之230位、240位、244位、245位、247位、262位、263位、266位、273位、275位、299位、302位、313位、323位、325位、328位及332位構成之群組中之胺基酸之至少1個取代。
[17]一種載體，其係包含編碼為重鏈可變區之聚核苷酸，該重鏈可變區含有序列編號：9之重鏈CDR1、選自由序列編號：161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101、及100構成之群組中之重鏈CDR2、及選自由序列編號：158、154、152、151、112、111、110、及11構成之群組中之重鏈CDR3。
[18]如[17]之載體，其中，包含編碼為序列編號：26之重鏈恆定區的聚核苷酸。
[19]一種載體，其係包含編碼為輕鏈可變區之聚核苷酸，該輕鏈可變區含有選自由序列編號：163、68、67及12構成之群組中之輕鏈CDR1、選自由序列編號：71、69、及13構成之群組中之輕鏈CDR2、及選自由序列編號：164、48、47及14構成之群組中之輕鏈CDR3。
[20]如[19]之載體，其中，包含編碼為序列編號：27之輕鏈恆定區的聚核苷酸。
[21]一種載體，其係包含；(1)編碼為重鏈可變區之聚核苷酸，該重鏈可變區含有序列編號：9表示之重鏈CDR1、選自由序列編號：161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101、及100構成之群組中之重鏈CDR2、及選自由序列編號：158、154、152、151、112、111、110、及11構成之群組中之重鏈CDR3；及(2)編碼為輕鏈可變區之聚核苷酸，該輕鏈可變區含有選自由序列編號：163、68、67及12構成之群組中之輕鏈CDR1、選自由序列編號：71、69、及13構成之群組中之輕鏈CDR2、及選自由序列編號：164、48、47及14構成之群組中之輕鏈CDR3。
[22]一種載體，其係包含；(1)編碼為重鏈可變區之聚核苷酸及編碼為序列編號：26表示之重鏈恆定區之聚核苷酸，該重鏈可變區含有選自由序列編號：9表示之重鏈CDR1、序列編號：161、160、159、157、156、155、153、108、107、106、105、104、103、102、101、 及100構成之群組中之重鏈CDR2、及選自由序列編號：158、154、152、151、112、111、110、及11構成之群組中之重鏈CDR3；及(2)編碼為輕鏈可變區之聚核苷酸及編碼為序列編號：27表示之輕鏈恆定區之聚核苷酸，該輕鏈可變區含有選自由序列編號：163、68、67及12構成之群組中之輕鏈CDR1、選自由序列編號：71、69、及13構成之群組中之輕鏈CDR2、及選自由序列編號：164、48、47及14構成之群組中之輕鏈CDR3。
[23]如[18]或[22]之載體，其中，在編碼為序列編號：26表示之重鏈恆定區之聚核苷酸中，包含編碼為選自由EU編號表示之221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377 位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群組中之胺基酸之至少1個取代的突變核苷酸。
[24]一種宿主細胞，其係包含如[17]及[19]之載體、如[18]及[20]之載體、如[21]或[22]之載體。
[25]一種宿主細胞，其係包含如[23]之載體。
[26]如[25]之宿主細胞，其中，該宿主細胞對於糖鏈加成岩藻糖之能力低。
[27]如[26]之宿主細胞，其中，該對於糖鏈加成岩藻糖之能力低之宿主細胞，係選自由岩藻糖基轉移酶、岩藻糖轉運蛋白、GMD(GDP-甘露糖4,6-脫水酶)、Fx(GDP-酮-6-去氧甘露糖3,5-差向異構酶，4-還原酶)、及GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)構成之群組中之機能性蛋白質之一或更多有缺損之宿主細胞。
[28]如[25]之宿主細胞，其中，該宿主細胞具有於糖鏈形成二分化N-乙醯基葡萄糖胺結構之能力。
[29]如[28]之宿主細胞，其中，該具有於糖鏈形成二分化N-乙醯基葡萄糖胺結構之能力之宿主細胞，具有帶有β(1,4)-半乳糖基轉移酶活性且包含編碼為駐高爾基體多胜肽之機能性之高爾基體局部化分域之聚核苷酸之載體。
[30]如[29]之宿主細胞，其包含含有編碼為選自甘露糖苷酶II之局部化分域、β(1,2)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶I之局部化分域、β(1,2)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶II之局部化分域、甘露糖苷酶I之局部化分域、及α1-6核岩藻糖基轉移酶 之局部化分域構成之群組中之機能性高爾基體局部化分域之聚核苷酸之載體，且包含編碼為含有β(1,4)-半乳糖基轉移酶之觸媒分域之融合多胜肽的聚核苷酸。
[31]如[24]至[30]中任一項之宿主細胞，其中，該宿主細胞係選自由CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、或融合瘤細胞構成之群組中之宿主細胞。
[32]一種如[1]至[16]中任一項之抗表皮調節素抗體之製造方法，包含從如[24]至[31]中任一項之宿主細胞之培養液回收的步驟。
[33]一種抗體，其係藉由如[32]之方法製造。
[34]如[33]之抗體，其中，連結有增殖抑制劑或細胞毒性物質。
[35]一種醫藥組合物，其係包含如[1]至[16]或[33]至[34]中之任一項之抗體作為有效成分。
[36]一種癌治療劑或癌症復發或轉移抑制劑，其係包含如[1]至[16]或[33]至[34]中之任一項之抗體作為有效成分。
[37]如[36]之癌治療劑或癌症復發或轉移抑制劑，其中，該癌係選自由大腸癌、肺腺癌、胰臟癌、胃癌、及腎癌構成之群組中之任意癌症。
[38]如[37]之癌治療劑或癌症復發或轉移抑制劑，其中，該大腸癌係低分化大腸癌、中分化大腸癌、高分化大腸癌。
[39]如[36]至[38]中任一項之癌治療劑或癌症復發或轉移抑制劑，其中，該癌治療劑投予之對象，係包含癌細胞的對 象，該癌細胞表現單離之組織標本檢測到的表皮調節素蛋白質。
又，本發明係關於抑制細胞增殖之方法、預防或治療癌症之方法、或抑制癌症復發或轉移之方法，包含將本發明之抗體或依本發明之製造方法製造之抗體對於對象投予之步驟。又，本發明係關於本發明之抗體或依本發明之製造方法製造之抗體使用於製造細胞增殖抑制劑、癌症預防劑或癌治療劑、或癌症復發或轉移抑制劑的用途。又，本發明係關於本發明之抗體或依本發明之製造方法製造之抗體，其係使用於細胞增殖抑制、癌症預防或治療、或癌症復發或轉移之抑制。又，本發明係關於製造細胞增殖抑制劑、癌症預防劑或癌治療劑、或癌症復發或轉移抑制劑之方法，其係包含使用本發明之抗體或依本發明之製造方法製造之抗體之步驟。
圖1顯示各抗體對於人類表皮調節素之親和性(affinity)比(各抗體之KD值/嵌合抗體EP27之KD值)的圖。抗體名的表示記載僅記載了可變區，但係包含重鏈為G1d、輕鏈為kappa之恆定區的抗體之試驗結果。
圖2顯示各抗體中的親和性比(對猿表皮調節素之KD值/對人類表皮調節素之KD值)的圖。抗體名之表示記載僅記載了可變區，但係包含重鏈為G1d、輕鏈為kappa之恆定區的抗體之試驗結果。
圖3顯示各抗體對於人類表皮調節素之親和性比(各抗體 之KD值/嵌合抗體EP27之KD值)之圖。
圖4各抗體中的親和性比(對猿表皮調節素之KD值/對人類表皮調節素之KD值)的圖。
圖5顯示各抗體所為之ADCC活性(專一性的鈣黃綠素(Calcein)AM游離率)之圖。
圖6顯示將各抗體所為之中和活性以對於人類表皮調節素依存性的BAF_EGFR細胞增殖抑制率表示之圖。
圖7顯示將各抗體的中和活性以對於猿表皮調節素依存性的BAF_EGFR細胞增殖抑制率表示之圖。
圖8顯示將各抗體所為之體內(in vivo)人類腫瘤增殖抑制活性以於人類癌細胞移植小鼠模型之抗腫瘤活性表示之圖。
圖9顯示人類表皮調節素(hsEREG-His)及猿表皮調節素(cysEREG-His)之電泳圖案的電泳圖。
圖10顯示彼此表現不同量表皮調節素蛋白質之細胞之螢光染色、及移植有該細胞之小鼠之組織免疫學染色圖。
圖11顯示對於表現彼此不同量之表皮調節素蛋白質的細胞之ADCC活性圖。
圖12顯示將體內人類腫瘤增殖抑制活性以在移植有表現彼此不同量之表皮調節素蛋白質的細胞的小鼠模型中的抗腫瘤活性表示之圖。
圖13顯示於低分化大腸癌之臨床症例中的表皮調節素的表現。
圖14顯示表示EP27人型化Glycomab抗體對於大腸癌轉移之藥效的對於大腸癌幹細胞PLR123之腫瘤植活 (engraftment)之藥效之圖。
圖15顯示表示EP27人型化Glycomab抗體對大腸癌幹細胞之轉移之藥效的對於大腸癌幹細胞PLR123之肺轉移之藥效之圖。
圖16顯示使用低分化大腸癌模型COL-53-JCK之EP27人型化Glycomab抗體對於低分化大腸癌之藥效之圖。
圖17顯示使用中分化大腸癌模型PLR379之EP27人型化Glycomab抗體對於中分化大腸癌之藥效之圖。
圖18顯示在肺腺癌之臨床症例中的表皮調節素的表現。
圖19顯示EP27人型化Glycomab抗體對於人類肺腺癌株Calu-3之ADCC活性(專一性鈣黃綠素(Calcein)AM游離率)之圖。
圖20顯示使用肺腺癌模型Calu-3之EP27人型化Glycomab抗體對於肺腺癌之藥效之圖。
圖21顯示含有EP27人型化Glycomab抗體之抗體藥物複合體內化到表現表皮調節素之DLD-1細胞株之細胞內，並且引起對於DLD-1細胞株之細胞傷害之圖。
本發明係關於顯示非人類動物及人類動物間之種交叉反應性(cross-species reactivity)之抗表皮調節素抗體。本發明更關於化學性分解受抑制之抗表皮調節素抗體。本發明並關於等電點下降之抗表皮調節素抗體。再者，本發明係關於組合體量減少的抗表皮調節素抗體。又，本發明係關於含有前述抗表皮調節素抗體之醫藥組合物、或癌治療劑。再者，本發明 係關於前述抗表皮調節素抗體之製造方法。
以下定義及詳細說明係為了使容易理解在本說明書說明之本發明而提供。
定義
胺基酸
本說明書中，以例如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所表示，將胺基酸以單字母碼或三字母碼、或其兩者表示記載。又，本發明記載之胺基酸序列所含之胺基酸，有時會經過轉譯後修飾(例如：將N末端之麩醯胺酸進行焦麩胺醯基化成為焦麩胺酸的修飾為該技術領域中具有通常知識者周知的修飾)，以此方式當胺基酸經過轉譯後修飾的情形也當含包括在本發明記載之胺基酸序列。
抗原
本發明提供之抗體係結合於作為抗原的表皮調節素。表皮調節素係膜結合型上皮細胞成長因子蛋白質。其胺基酸序列揭示於GenBank登錄編號NP_001423(序列編號：167)。本發明中，表皮調節素之定義包括全長蛋白質及其片段兩者。片段係包含表皮調節素之任意區域之多胜肽，也可不具天然表皮調節素之功能。片段例如包含表皮調節素之細胞外區域之片段。表皮調節素之細胞外區域，相當於序列編號：167之胺基酸序列中的30-118號。又，穿膜區域相當於序列編號：167之胺基酸序列之119-140號。又，本說明書中，有時將表皮調節素稱為 EREG，該等以同義用語使用。
意指抗原中存在之抗原決定基的抗原決定部位(epitope)，係指本說明書揭示之抗表皮調節素抗體中之抗原結合分域所結合之抗原上之部位。所以，例如：抗原決定部位可由其結構定義。又，該抗原決定部位也可由認識該抗原決定部位之抗表皮調節素抗體對於抗原之結合活性定義。抗原為胜肽或多胜肽時，也可利用構成抗原決定部位之胺基酸殘基指定抗原決定部位。又，抗原決定部位為糖鏈時，也可利用特定糖鏈構造來指定抗原決定部位。
直線狀抗原決定部位，例如由胺基酸一次序列中連續的多數胺基酸構成的的抗原決定部位，係由胺基酸之一次序列認識的抗原決定部位。直線狀抗原決定部位典型在固有序列中至少含有3個，且最普通為至少5個，例如約8至約10個，6至20個胺基酸。
立體構造抗原決定部位，與直線狀抗原決定部位相對照，係指含有抗原決定部位之胺基酸之一次序列並非所認識之抗原決定部位之單一規定成分的抗原決定部位(例如：胺基酸之一次序列不一定由規定抗原決定部位之抗體所認識之抗原決定部位)。立體構造抗原決定部位，可能包含對於直線狀抗原決定部位為更多之數之胺基酸。關於立體構造抗原決定部位之認識，抗體認識胜肽或蛋白質之三維構造。例如：蛋白質分子折疊形成三維構造時，形成立體構造抗原決定部位之某個胺基酸及/或多胜肽主鏈成為並排，抗體可認識抗原決定部位。決定抗原決定部位之立體構造之方法，包含例如X射線結 晶學、二維核磁共振分光學及部位專一性旋轉標誌及電磁常磁性共振分光學，但不限於該等。例如參考：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(編)。
結合活性
以下例示確認抗體對於之表皮調節素、亦即對於表皮調節素分子中存在之抗原決定部位之結合的確認方法，但是不限於以下方法，該技術領域中具有通常知識者可適當使用測定對於抗原之結合活性的方法。
例如：抗表皮調節素抗體會認識表皮調節素分子中存在之線狀抗原決定部位之情事，例如可以如下方式確認。為了上述目的，合成由構成表皮調節素之細胞外分域之胺基酸序列構成的線狀胜肽。該胜肽可化學合成。或，利用編碼為表皮調節素之cDNA(例如：就cDNA序列而言，可舉例CR541887(序列編號：169)等，就mRNA序列而言，可舉例NM_001432等)中之編碼為相當於細胞外分域之胺基酸序列之區域，以基因工程方法可獲得。其次，評價由構成細胞外分域之胺基酸序列所構成的線狀胜肽與含有抗表皮調節素抗體間的結合活性。例如，利用以經固定化之線狀胜肽為抗原之ELISA，可評價該抗體對於該胜肽之結合活性。或，依據表皮調節素表現細胞中，該抗體之結合時由於線狀胜肽所致抑制的水平，可以明確獲得對於線狀胜肽之結合活性。利用該等試驗，可以明確獲得該抗體對於線狀胜肽之結合活性。
又，抗表皮調節素抗體會認識立體構造抗原決定 部位之情事，可由以下方式確認。為了上述目的，製備表現表皮調節素之細胞。抗表皮調節素抗體接觸表皮調節素表現細胞時，會強力結合於該細胞，另一方面，對於固定化有該抗體之由構成表皮調節素之細胞外分域的胺基酸序列而成的線狀胜肽，實質上不結合時等。在此，實質上不結合，係指對於人類表皮調節素表現細胞之結合活性之80%以下、通常50%以下，較佳為30%以下，尤佳為15%以下之結合活性。
抗表皮調節素抗體對於表皮調節素表現細胞之結合活性之測定方法，例如：Antibodies A Laboratory Manual記載之方法(Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。亦即，可利用以表皮調節素表現細胞為抗原之ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting)之原理評價。
ELISA格式中，抗表皮調節素抗體對於表皮調節素表現細胞之結合活性，可利用比較酵素反應所生成之信號水平而定量評價。亦即，在固定化有表皮調節素表現細胞之ELISA板添加待驗抗體，利用認識待驗抗體分子之酵素標記抗體檢測結合於細胞之待驗抗體。或FACS中，製作待驗抗體之稀釋系列，決定對於表皮調節素表現細胞之抗體結合力價(titer)，藉此可比較待驗抗體對於表皮調節素表現細胞之結合活性。
待驗抗體對於在懸浮於緩衝液等之細胞表面上表現之抗原之結合，可利用流式細胞計數器檢測。流式細胞計數器已知例如如下裝置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均為BD Biosciences公司的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均為Beckman Coulter公司之商品名)
例如：抗表皮調節素抗體對於表皮調節素之結合活性之理想測定方法，例如以下方法。首先，以認識與表現表皮調節素之細胞反應之待驗抗體的經FITC標定的二次抗體染色。將待驗抗體以適當理想的緩衝液稀釋，可將該抗表皮調節素抗體製成所望濃度。例如可使用10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度。其次，以FACSCalibur(BD公司)測定螢光強度及細胞數。抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所得之螢光強度，亦即幾何平均值(幾何平均)。亦即，藉由獲得該幾何平均之值，可測定待驗抗體之結合量所代表之待驗抗體之結合活性。
抗表皮調節素抗體與某抗原結合分子共有抗原決定部位之情事，可藉由兩者對於相同抗原決定部位之彼此競爭而確認。抗體間之彼此競爭，可利用交叉阻斷試驗等檢測。例如彼此競爭ELISA試驗為較佳的交叉阻斷試驗。
具體而言，交叉阻斷試驗中，塗覆在微滴定板之井上的表皮調節素蛋白質，於候選的彼此競爭抗體存在下或非存在下，預備溫育後，添加待驗抗體。井中之表皮調節素蛋白質所結合之待驗抗體之量，間接相關於成為彼此競爭之候選的彼此競爭抗體對於相同抗原決定部位之結合之結合能力。亦即，彼此競爭抗體對於相同抗原決定部位之親和性愈大，則對於塗覆有待驗抗體之表皮調節素蛋白質之井的結合活性愈低。
經由表皮調節素蛋白質而結合於井之待驗抗體之量，可藉由預先標記抗體而輕易測定。例如，經生物素標記之抗體，可藉由抗生物素蛋白過氧化酶接合體及適當基質測定。利用過氧化酶等酵素標記之交叉阻斷試驗，尤其稱為彼此競爭ELISA試驗。抗體可以用能檢測或測定之其他標記物質予以標記。具體而言，放射標記或螢光標記等為公知。
比起於不存在候選之彼此競爭抗體下實施之對照試驗中獲得之結合活性，彼此競爭抗體若能阻斷包含對表皮調節素之抗體之結合至少20%，較佳為至少20-50%，更佳為至少50%，則該待驗抗體係與彼此競爭抗體實質上結合於相同抗原決定部位，或對於相同抗原決定部位之結合為彼此競爭之抗體。
抗表皮調節素抗體所結合之抗原決定部位在鑑定構造時，待驗抗體與對照抗體共有抗原決定部位之情事，可藉由比較兩者之抗體對於構成該抗原決定部位之胜肽導入有胺基酸突變而成之胜肽之結合活性而予以評價。
如此測定結合活性之方法，例如可藉由比較前述 ELISA格式中，待驗抗體及對照抗體對於導入有突變的線狀胜肽的結合活性而測定。就ELISA以外之方法而言，也可藉由將對於結合於管柱之該突變胜肽的結合活性，以使待驗抗體與對照抗體流下該管柱後溶出到溶出液中之抗體進行定量而測定。使突變胜肽例如與GST之融合胜肽吸附於管柱之方法為公知。
又，當鑑定的抗原決定部位為立體抗原決定部位時，待驗抗體與對照抗體共有抗原決定部位之情事，可藉由以下方法評價。首先，製備表現表皮調節素之細胞以及表現對於抗原決定部位導入有突變之表皮調節素的細胞。對於該等細胞懸浮於PBS等適當緩衝液而成的細胞懸浮液添加待驗抗體與對照抗體。其次，對於經適當緩衝液洗滌的細胞懸浮液，添加能夠認識待驗抗體與對照抗體的經FITC標記的抗體。利用FACSCalibur(BD公司)測定由標記抗體染色之細胞之螢光強度及細胞數。將待驗抗體與對照抗體之濃度以適當緩衝液適當稀釋以製備為所望濃度後使用。例如可使用10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度。標記抗體對於該細胞之結合量，反映於使用CELL QUEST軟體(BD公司)解析所獲得之螢光強度，亦即幾何平均值。亦即藉由獲得該幾何平均值，可以測定以標記抗體之結合量所代表之待驗抗體與對照抗體之結合活性。
本方法中，例如「實質上不結合於突變表皮調節素表現細胞」之情事，可藉由以下方法判斷。首先，將已對於表現突變表皮調節素之細胞結合之待驗抗體與對照抗體以標記抗體染色。接著，檢測細胞之螢光強度。螢光檢測使用 FACSCalibur當做流式細胞計數儀時，獲得之螢光強度可以使用CELL QUEST軟體解析。從抗體存在下及非存在下之幾何平均值，將其比較值(△幾何平均)依下列計算式計算，可以求得抗體之結合所致之螢光強度之增加比例。
(式1)△幾何平均值=幾何平均值(抗體存在下)/幾何平均值(抗體非存在下)
將由解析獲得之反映待驗抗體對於突變表皮調節素表現細胞之結合量的幾何平均比較值(突變表皮調節素分子△幾何平均值)，與反映待驗抗體對於表皮調節素表現細胞之結合量的△幾何平均值比較值進行比較。於該情形，求取對於突變表皮調節素表現細胞及表皮調節素表現細胞之△幾何平均比較值時使用之待驗抗體之濃度調整為彼此相同或實質上為相同濃度尤佳。可利用預先確認認識表皮調節素中之抗原決定部位的抗體當做對照抗體。
待驗抗體對於突變表皮調節素表現細胞之△幾何平均比較值，若比起待驗抗體對於表皮調節素表現細胞之△幾何平均比較值之至少80%、較佳為50%、更佳為30%、尤佳為15%還小，則判定為「實質上不結合於突變表皮調節素表現細胞」。求取幾何平均值(Geometric Mean)之計算式，記載於CELL QUEST Software User’s Guide(BD biosciences公司)。若比較比較值而其實質上可視為相同之程度，則可評價待驗抗表皮調節素抗體與對照抗表皮調節素抗體之抗原決定部位為相同。
抗體
本說明書中，抗體係指天然者或部分或完全合成所製造之免疫球蛋白。抗體可從其天然存在之血漿或血清等天然資源或產生抗體之融合瘤細胞之培養上清單離，或可使用基因重組等方法部分或完全合成。抗體例如免疫球蛋白之構造同型(isotype)及此等構造同型之次類(subclass)為較佳例。人類免疫球蛋白已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM9種類型(構造同型)。本發明之抗體在該等構造同型之中，可含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。。
製作具有所望結合活性之抗體之方法於該技術領域之具有通常知識者為公知。以下列舉製作與表皮調節素結合之抗體(抗表皮調節素抗體)之一非限定方法。
抗表皮調節素抗體可使用公知方法以多株或單株抗體之形式取得。抗表皮調節素抗體，宜製作哺乳動物來源的單株抗體。哺乳動物來源的單株抗體，包含由融合瘤產生者，及由基因工程的方法以含抗體基因之表現載體轉形而得之宿主細胞所產生者等。本發明之單株抗體包括「人型化抗體」或「嵌合抗體」。
單株抗體產生融合瘤，可使用公知技術依例如以下方式製作。亦即，使用表皮調節素蛋白質當做感作抗原，依通常之免疫方法將哺乳動物免疫。將獲得之免疫細胞以通常的細胞融合法與公知之親代細胞融合。其次依照通常之篩選法，篩選與表皮調節素分子中之抗原決定部位結合之單株抗體產生細胞，可選擇產生抗表皮調節素抗體之融合瘤。
具體而言，單株抗體之製作係依例如以下所示方 式實行。首先，藉由表現在序列編號：169揭示其核苷酸序列之人類表皮調節素基因，取得當做抗體取得之感作抗原使用的以序列編號：167表示的人類表皮調節素蛋白質。亦即，藉由將編碼為人類表皮調節素之基因序列***公知之表現載體，而將適當的宿主細胞轉形。從該宿主細胞中或培養上清中以公知方法精製所望之人類表皮調節素蛋蛋白質。為了從培養上清中取得可溶型之人類表皮調節素，例如可使包含序列編號：167表示之人類表皮調節素多胜肽序列當中30至118號之胺基酸的多胜肽、或包含30至108號之胺基酸的序列編號：34表示之蛋白質表現。又，經精製的天然人類表皮調節素蛋白質也同樣可當做感作抗原使用。
對於哺乳動物免疫時使用之感作抗原，可使用該精製表皮調節素蛋白質。表皮調節素之部分胜肽也可當做感作抗原使用。於此時，該部分胜肽可利用人類表皮調節素之胺基酸序列以化學合成取得。又，也可將人類表皮調節素基因之一部分納入表現載體使表現而取得。再者，使用蛋白質分解酵素將人類表皮調節素蛋白質分解也可取得，但是當做部分胜肽使用之人類表皮調節素胜肽之區域及大小不限於特別之態樣。較佳區域可從由序列編號：167之胺基酸序列當中相當於30至118號或30至108號胺基酸之胺基酸序列選擇任意序列。構成當做感作抗原之胜肽的胺基酸的數目至少為5以上，例如6以上或7以上較佳。更具體而言，可將8~50、較佳為10~30個殘基之胜肽當做感作抗原使用。
又，將表皮調節素蛋白質之所望之部分多胜肽或 胜肽與不同的多胜肽融合成的融合蛋白質可利用為感作抗原。為了製造當做感作抗原使用之融合蛋白質，例如可適當利用抗體之Fc片段或胜肽標籤(tag)等。表現融合蛋白質之載體，可藉由將編碼為所望之二種或更多種多胜肽片段之基因於同一讀框(inframe)融合，並將該融合基因以前述方式***表現載體而製作。融合蛋白質之製作方法記載於Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。可當做感作抗原使用之表皮調節素之取得方法及使用其之免疫方法，在WO2008/047723等亦有具體記載。
以該感作抗原免疫之哺乳動物不限於特定動物，宜考慮與細胞融合使用之親代細胞之間的適合性選擇。一般的囓齒類動物例如小鼠、大鼠、倉鼠，或兔、猴等較佳。
依公知方法將上述動物以感作抗原免疫。例如就一般方法而言，係藉由將感作抗原對於哺乳動物之腹腔內或皮下注射而投予以實施免疫。具體而言，將以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理食鹽水等以適當稀釋倍率稀釋過的感作抗原，視所望與通常的佐劑例如佛洛依德完全佐劑混合並乳化後，將該感作抗原對於哺乳動物每4至21日投予數次。又，感作抗原免疫時可以使用適當擔體。尤其使用小分子量之部分胜肽當做感作抗原時，有時以結合有白蛋白、血藍蛋白(keyhole lympet hemocyanin)等擔體蛋白質的該感作抗原胜肽進行免疫為理想。
又，產生所望抗體之融合瘤可使用DNA免疫並依 以下方式製作。DNA免疫，係指在免疫動物中投予以能表現編碼為抗原蛋白質之基因的態樣構建之載體DNA的該免疫動物中，藉由感作抗原在該免疫動物之活體內表現，能提供免疫刺激之免疫方法。比起對於免疫動物投予蛋白質抗原之一般免疫方法，DNA免疫可期待如下的優越性。
-可維持如表皮調節素之膜蛋白質之構造而提供免疫刺激
-無需精製免疫抗原
為了以DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先將表現表皮調節素蛋白質之DNA對於免疫動物投予。編碼為表皮調節素之DNA可利用PCR等公知方法合成。將獲得之DNA***適當表現載體並對於免疫動物投予。表現載體例如可以理想地利用pcDNA3.1等市售表現載體。將載體對於活體投予之方法，可使用一般使用之方法。例如，可藉由將吸附有表現載體之金粒子以基因槍導入免疫動物個體之細胞內而實施DNA免疫。再者，認識表皮調節素之抗體之製作也可使用國際公開WO2003/104453記載之方法製作。
以此方式將哺乳動物免疫，確認血清中與表皮調節素結合之抗體力價上升後，從哺乳動物採取免疫細胞以供細胞融合。較佳之免疫細胞尤佳為使用脾細胞。
與前述免疫細胞融合之細胞，可使用哺乳動物之骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞宜具有為了篩選的適當選擇標記。選擇標記，係指能於特定培養條件下生存之(或無法生存)之形質。選擇標記中，次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺損(以下簡 稱為HGPRT缺損)、或胸腺嘧啶激酶缺損(以下簡稱為TK缺損)等為公知。具HGPRT或TK缺損之細胞，具有次黃嘌呤-胺基喋呤-胸腺嘧啶感受性(以下簡稱為HAT感受性)。HAT感受性之細胞在HAT選擇培養基中無法合成DNA會死滅，但若與正常細胞融合則會利用正常細胞之補救合成路徑(salvage pathway)繼續合成DNA，故能在HAT選擇培養基中增殖。
HGPRT缺損或TK缺損之細胞，各可以含6硫鳥嘌呤(thioguanine)、8氮雜鳥嘌呤(以下簡稱為8AG)、或5'溴去氧尿嘧啶之培養基選擇。於DNA中納入該等嘧啶類似物之正常細胞會死滅。另一方面，未納入該等嘧啶類似物之該等酵素缺損之細胞，能在選擇培養基中生存。其他稱為G418耐受性之選擇標記，係利用新黴素耐受性基因提供對於2-去氧鏈黴胺(streptamine)系抗生物質(慶大黴素(gentamycin類似體)之耐受性。對細胞融合為理想的各種骨髓瘤細胞為公知。
如此的骨髓瘤細胞例如可理想地使用P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本上可依照公知方法例如Keller與Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)等，實施前述免疫 細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合。
更具體而言，可於例如細胞融合促進劑存在下於通常的營養培養液中實施前述細胞融合。融合促進劑可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，為更提高融合效率，可視所望添加使用二甲基亞碸等輔助劑。
免疫細胞與骨髓瘤細胞之使用比例可任意設定。例如相對於骨髓瘤細胞將免疫細胞定為1至10倍較佳。前述細胞融合使用之培養液，例如適於前述骨髓瘤細胞株增殖之RPMI1640培養液、MEM培養液、此外，可使用該種細胞培養使用之通常之培養液，再者，可理想地添加胎牛血清(FCS)等血清補液。
細胞融合係將前述免疫細胞與骨髓瘤細胞以既定量於前述培養液中充分混合，並且將預先加溫至約37℃之PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)以通常30至60%(w/v)之濃度添加。藉由將混合液緩慢混合，會形成所望之融合細胞(融合瘤)。接著，逐次添加上述列舉之適當培養液，反複實施離心並去除上清之操作，可將對於融合瘤之生長不利的細胞融合劑等除去。
以如此方式獲得之融合瘤，可藉由於通常之選擇培養液，例如HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。為了使所望之融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可使繼續進行使用上述HAT培養液之培養足夠時間(通常該足夠時間為數日至數週)。其次，以通常之極限稀釋法，實施產生所望抗體之融合瘤之篩選及單一選殖。
以如此方式獲得之融合瘤，可利用因應細胞融合使用之骨髓瘤具有之選擇標記的選擇培養液而選擇。例如具HGPRT或TK缺損之細胞，可藉由以HAT培養液(含次黃嘌呤、胺基喋呤及胸腺嘧啶之培養液)培養而選擇。亦即，當使用HAT感受性骨髓瘤細胞於細胞融合時，可在HAT培養液中將成功與正常細胞細胞融合的細胞選擇性增殖。為了使所望融合瘤以外之細胞(非融合細胞)死滅，可以繼續使用上述HAT培養液之培養足夠時間。具體而言，一般可藉由數日至數週的培養而選擇所望之融合瘤。其次可利用通常之極限稀釋法，實施產生所望之抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。
所望之抗體之篩選及單一選殖，可依照基於公知抗原抗體反應之篩選方法而理想地實施。例如，結合於表皮調節素之單株抗體可以結合於在細胞表面表現的表皮調節素。如此的單株抗體例如可藉由FACS(fluorescence activated cell sorting)篩選。FACS係將與螢光抗體接觸之細胞以雷射光解析，並測定各個細胞發出之螢光，而可測定抗體對於細胞表面之結合的系統。
為了利用FACS篩選產生本發明之單株抗體的融合瘤，首先要製備表現表皮調節素之細胞。用於篩選之較佳細胞為使表皮調節素強制表現之哺乳動物細胞。藉由以當做宿主細胞之未經轉形之哺乳動物細胞為對照，可以選擇性檢測抗體對於細胞表面之表皮調節素的結合活性。亦即，藉由選擇產生未結合於宿主細胞而結合於表皮調節素強制表現細胞的抗體的融合瘤，可以取得產生表皮調節素單株抗體之融合瘤。
或抗體對於經固定化之表皮調節素表現細胞的結合活性可依據ELISA之原理評價。例如，將表皮調節素表現細胞固定化在ELISA板的井。使融合瘤之培養上清接觸井內之固定化細胞，以檢測結合於固定化細胞的抗體。單株抗體為小鼠來源時，與細胞結合之抗體可利用抗小鼠免疫球蛋白抗體檢測。該等篩選所選擇之產生具有對於抗原之結合能力的所望抗體的融合瘤，可利用極限稀釋法等選殖。
以此方式製作之產生單株抗體之融合瘤可在通常之培養液中繼代培養。而且，該融合瘤可於液態氮中長期保存。
將該融合瘤依照通常方法培養，可從其培養上清取得所望之單株抗體。或可將融合瘤對於與其具適合性之哺乳動物投予使增殖，並從其腹水獲取單株抗體。前者之方法對於獲得高純度抗體為適當。
從該融合瘤等抗體產生細胞選殖的抗體基因所編碼之抗體也可適當利用。藉由將經選殖的抗體基因納入適當載體並導入宿主，可以表現該基因所編碼的抗體。抗體基因之單離與對於載體之導入、及用於將宿主細胞轉形之方法，例如已由Vandamme等人確立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。下列所述重組抗體之製造方法亦為公知。
例如，可從產生抗表皮調節素抗體之融合瘤細胞取得編碼為抗表皮調節素抗體之可變區(V區)之cDNA。為此，通常首先從融合瘤萃取全體RNA。用於從細胞萃取mRNA之方法，例如可利用如下方法。
-胍(guanidine)超離心法(Biochemistry(1979)18(24), 5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
萃取到的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等精製。或如QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Health care bioscience製)等，也有用於從細胞直接萃取全體mRNA之市售套組。使用如此的套組，可從融合瘤取得mRNA。從獲得之mRNA使用反轉錄酵素可合成編碼為抗體V區之cDNA。cDNA可利用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化學工業社製)等合成。又，為了cDNA之合成及放大，可適當利用SMART RACE cDNA放大套組(Clontech製)及使用PCR之5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23),8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8),2919-2932)。又，在如此的cDNA合成之過程中，可在cDNA的兩末端導入後述適當的限制酶部位。
從獲得之PCR產物精製目的之cDNA片段，其次與載體DNA連結。以如此方式製作重組載體，並導入大腸菌等，選擇群落(colony)後，從形成有該群落之大腸菌製備所望之重組載體。並且針對該重組載體是否具有目的cDNA之鹼基序列，可使用公知之方法例如二去氧核苷酸鏈終結法等確認。
為了取得編碼為可變區之基因，利用使用可變區基因放大用引子之5’-RACE法係屬簡便。首先，以從融合瘤細胞萃取之RNA當做模板，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA庫。5’-RACE cDNA庫之合成可適當使用SMART RACE cDNA放大套組等市售套組。
以獲得之5’-RACE cDNA庫為模板，以PCR法將抗體基因放大。依據公知之抗體基因序列可設計小鼠抗體基因放大用之引子。此等引子為依免疫球蛋白之次類而各不相同的鹼基序列。因此，次類理想為預先使用Iso Strip小鼠單株抗體同種型決定套組(Roche diagnostics)等市售套組決定。
具體而言，當目的為取得例如編碼為小鼠IgG之基因時，可利用能將編碼為當做重鏈之γ1、γ2a、γ2b、γ3、當做輕鏈之κ鏈與λ鏈的基因放大的引子。為了放大IgG之可變區基因，一般係利用於3'側之引子黏合有相當於接近可變區之恆定區之部分的引子。另一方面，5'側之引子係利用5’RACE cDNA庫製作套組所附帶的引子。
利用如此放大之PCR產物，可再構成由重鏈與輕鏈之組合而成的免疫球蛋白。以再構成之免疫球蛋白對於表皮調節素之結合活性當做指標，可以篩選所望之抗體。例如目的為取得對抗表皮調節素之抗體時，抗體對於表皮調節素之結合，更佳為專一性的。與表皮調節素結合之抗體可藉由例如以下方式篩選；(1)使從融合瘤獲得之含有由cDNA編碼之V區的抗體接觸表皮調節素表現細胞之步驟、(2)檢測表皮調節素表現細胞與抗體之間的結合之步驟、及(3)選擇與表皮調節素表現細胞結合之抗體之步驟。
檢測抗體與表皮調節素表現細胞之間的結合的方法為公知。具體而言，可利用先前所述FACS等方法，檢測抗體與表皮調節素表現細胞間之結合。為了評價抗體之結合活 性，可適當利用表皮調節素表現細胞之固定標本。
以結合活性為指標之抗體之篩選方法，亦宜使用利用噬菌體載體之淘選法。從多株抗體表現細胞群，以重鏈與輕鏈之次類之庫的形式取得抗體基因時，利用噬菌體載體之篩選方法係屬有利。編碼為重鏈與輕鏈之可變區之基因，可藉由以適當連結子序列連結，而形成單鏈Fv(scFv)。藉由將編碼為scFv之基因***噬菌體載體，可取得於表面表現scFv之噬菌體。該噬菌體與所望抗原接觸後，藉由回收與抗原結合之噬菌體，可以回收編碼為具目的結合活性之scFv的DNA。該操作可視需要反複實施，而將具所望之結合活性之scFv濃縮。
獲得編碼為目的抗表皮調節素抗體之V區的cDNA後，將該cDNA以認識***於該cDNA之兩末端的限制酶部位之限制酶消化。較佳之限制酶，係認識構成抗體基因之鹼基序列中出現頻度低之鹼基序列並消化。再者，為了將1副本的消化片段以正確方向***載體，宜***提供附著末端之限制酶。藉由將以上述方式經消化之編碼為抗表皮調節素抗體之V區的cDNA***適當表現載體，可以取得抗體表現載體。此時，若將編碼為抗體恆定區(C區)之基因、與編碼為前述V區之基因於同一讀框融合，則可取得嵌合抗體。在此，嵌合抗體係指恆定區與可變區之來源不同者。因此，除了小鼠-人類等的異種嵌合抗體，人類-人類同種嵌合抗體也包含在本發明之嵌合抗體。藉由預先在具恆定區之表現載體***前述V區基因，可以構建嵌合抗體表現載體。具體而言，可於例如保持有編碼為所望之抗體恆定區(C區)之DNA的表現載體之5’側，適 當配置消化前述V區基因之限制酶之限制酶認識序列。藉由將以相同組合之限制酶消化過的兩者於同一讀框融合，可以構建嵌合抗體表現載體。
為了製造與表皮調節素結合之單株抗體，可以將抗體基因於由表現控制區控制之下表現的方式納入表現載體。用於表現抗體之表現控制區，包含例如增強子或啟動子。又，也可在胺基末端附加適當的信號序列，以使表現的抗體分泌到細胞外。例如在後面記載之實施例中係使用具胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(序列編號：168)之胜肽當做信號序列，但是也可附加其他適當的信號序列。將表現的多胜肽在上述序列之羧基末端部分切斷，切斷的多胜肽可以成熟多胜肽之形式分泌到細胞外。其次，藉由以該表現載體將適當的宿主細胞轉形，可以取得表現編碼為抗表皮調節素抗體之DNA的重組細胞。
為了表現抗體基因，可將編碼為抗體重鏈(H鏈)及輕鏈(L鏈)之DNA納入分別的表現載體。藉由納入有H鏈與L鏈之載體，對於相同宿主細胞同時轉形(co-transfect)，可以表現具備H鏈與L鏈之抗體分子。或可將編碼為H鏈及L鏈之DNA納入單一的表現載體，而將宿主細胞轉形(參照國際公開WO 1994/11523)。
用以藉由將經單離之抗體基因導入適當宿主而製作抗體之宿主細胞與表現載體的多數組合為公知。該等表現系均可應用於單離本發明之抗原結合分域。真核細胞當做宿主細胞時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體而 言，動物細胞例如以下細胞。
(1)哺乳類細胞、：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero、HEK(human embryonic kidney)293等
(2)兩生類細胞：非洲爪蟾卵母細胞等
(3)昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等
或植物細胞以煙草(Nicotiana tabacum)等煙草(Nicotiana)屬來源之細胞而得之抗體基因表現系為公知。植物細胞之轉形可以適當利用癒傷組織培養之細胞。
又，真菌細胞可以利用如下的細胞。
酵母：啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等糖化酵母(Saccharomyces)屬、甲醇同化酵母(Pichia pastoris)等畢赤酵母(Pichia)屬
絲狀菌：黑麴黴(Aspergillus niger)等麴黴(Aspergillus)屬
又，利用原核細胞之抗體基因之表現系亦為公知。例如使用細菌細胞時，可以適當利用大腸菌(E.coli)、枯草菌等細菌細胞。於該等細胞中，以轉形導入含有目的抗體基因之表現載體。藉由將經轉形之細胞於體外培養，可從該轉形細胞之培養物獲取所望之抗體。
重組抗體之產生，除了上述宿主細胞，尚可利用基因轉殖動物。亦即，從導入有編碼為所望抗體之基因的動物，可獲取該抗體。例如，將抗體基因藉由於同一讀框***編碼為乳汁中固有產生之蛋白質的基因內部，可以構建融合基因。乳汁中分泌之蛋白質，例如可利用羊β酪蛋白等。將含有 ***有抗體基因之融合基因的DNA片段注入羊胚，並將該經注入之胚胎導入雌羊體內。從接受胚胎的羊產生之基因轉殖羊(或其子孫)所產之乳汁，可以取得所望之抗體與乳汁蛋白質之融合蛋白質。又，為了增加從基因轉殖羊產生之含所望之抗體之乳汁量，可對於基因轉殖羊投予荷爾蒙(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
本說明書記載之抗表皮調節素抗體對於人類投予時，該分子中之抗原結合分域，可適當採用以降低對於人類之異種抗原性等為目的經人為改變過的基因重組型抗體來源的抗原結合分域。基因重組型抗體例如包含人型化(Humanized)抗體等。該等改變抗體可使用公知方法適當製造。
本說明書記載之用於製作抗表皮調節素抗體中的抗原結合分域所使用之抗體之可變區，通常由***在4個框架區(FR)的3個互補性決定區(complementarity-determining region；CDR)構成。CDR係實質上決定抗體之結合專一性之區域。CDR之胺基酸序列富有多樣性。另一方面，構成FR之胺基酸序列，即使在具有不同之結合專一性的抗體之間也常會顯示高度同一性。所以，一般可利用CDR之移植而將某抗體之結合專一性移植到其他抗體。
人型化抗體也稱為再構成(reshaped)人類抗體。具體而言，將人類以外之動物例如小鼠抗體之CDR移植到人類抗體而成之人型化抗體等為公知。為了獲得人型化抗體之一般基因重組方法亦為已知。具體而言，就將小鼠抗體之CDR移植到人類FR的方法而言，例如Overlap Extension PCR為公 知。於Overlap Extension PCR，係對於用於合成人類抗體FR之引子中，附加編碼為待移植之小鼠抗體之CDR的鹼基序列。引子係針4個FR各別準備。一般將小鼠CDR移植到人類FR時，選擇與小鼠之FR具高同一性之人類FR時，對於維持CDR機能為有利。亦即，一般較佳為利用與相鄰於待移植之小鼠CDR的FR之胺基酸序列為高同一性之胺基酸序列構成之人類FR。
又，連結之鹼基序列可設計為彼此於同一讀框連接。藉由各引子，可個別合成人類FR。其結果，可獲得於各FR附加有編碼為小鼠CDR之DNA的產物。各產物之編碼為小鼠CDR之鹼基序列，可設計成彼此重疊。接著，使以人類抗體基因為模板而合成之產物之重疊的CDR部分彼此黏合，進行互補鏈合成反應。利用該反應，人類FR經由小鼠CDR之序列而連結。
最後，將連結有3個CDR與4個FR之V區基因，利用黏合在其5'末端與3'末端並附加有適當之限制酶認識序列的引子，將其全長放大。藉由將以上述方式獲得之DNA與編碼為人類抗體C區之DNA以於同一讀框融合之方式***於表現載體中，藉此可製作人類型抗體表現用載體。將該重組載體導入宿主並樹立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼為該人型化抗體之DNA表現，藉此使該培養細胞之培養物中產生該人型化抗體(參照歐洲專利公開EP 239400、國際公開WO1996/002576)。
以定性或定量測定以上述方式製作之人型化抗體 對於抗原之結合活性並進行評價，可以理想地選擇當經由CDR連結時該CDR會形成良好之抗原結合部位的人類抗體之FR。視需要，可以將FR之胺基酸殘基取代，使再構成人類抗體之CDR能形成適當的抗原結合部位。例如，應用將小鼠CDR移植到人類FR時使用之PCR法，可對於FR導入胺基酸序列之突變。具體而言，可對於與FR黏合之引子導入部分的鹼基序列的突變。以如此的引子合成之FR，導入有鹼基序列之突變。以上述方法測定並評價將胺基酸取代過的突變型抗體對於抗原之結合活性，可以選擇具所望性質之突變FR序列(Cancer Res,1993,53,851-856)。
又，可以將具有人類抗體基因所有曲目的基因轉殖動物(參照國際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)當做免疫動物，以DNA免疫取得所望之人類抗體。
再者，使用人類抗體庫以淘選取得人類抗體之技術亦為已知。例如，將人類抗體之V區以單鏈抗體(scFv)之形式，以噬菌體呈現法使表現在噬菌體之表面。可以選擇表現與抗原結合之scFv的噬菌體。藉由解析選擇之噬菌體之基因，可以決定編碼為與抗原結合之人類抗體之V區的DNA序列。決定與抗原結合之scFv之DNA序列後，將該V區序列與所望之人類抗體C區之序列於同一讀框融合後***適當表現載體，可以製作表現載體。將該表現載體導入上述列舉之適當表現細胞中，並使編碼為該人類抗體之基因表現，可取得該人類抗體。該等方法已為公知(參照國際公開WO1992/001047、 WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
又，就取得抗體基因之方法而言，除上述以外，也可適當使用Bernasconi等人(Science(2002)298,2199-2202)或WO2008/081008記載之B細胞選殖(各抗體之編碼序列之鑑定及選殖、其單離、及各抗體(尤其IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)製作用之表現載體構建之用途等)之方法。
EU編號及Kabat編號
依照本發明使用之方法，指定為抗體之CDR與FR之胺基酸位置係依照Kabat規定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda,Md.,1987年及1991年)。本說明書中，抗表皮調節素抗體之可變區之胺基酸係依照Kabat編號，恆定區之胺基酸係依照根據Kabat之胺基酸位置的EU編號表示。
胺基酸之改變
為了抗原結合分子之胺基酸序列中之胺基酸之改變，可適當採用部位專一性的突變誘發法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或Overlap extension PCR等公知方法。又，取代為天然胺基酸以外之胺基酸之胺基酸之改變方法，也可採用多數公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。例如於含有為終止密碼子的1個UAG密碼子(amber codon)的互補amber suppressor tRNA結合有非天然胺基酸之tRNA的無細胞轉譯系系統(Clover Direc (Protein Express))等也可理想地使用。
本說明書中，表示胺基酸之改變部位時使用的「及/或」之用語之含意，包括「及」與「或」適當組合的各種組合。具體而言，例如「33位、55位、及/或96位之胺基酸被取代」，包括以下胺基酸的改變的多樣性；(a)33位、(b)55位、(c)96位、(d)33位及55位、(e)33位及96位、(f)55位及96位、(g)33位及55位及96位。
免疫原性之減低
本發明之抗體，宜為在人類宿主預測之免疫原性減低較佳。
「低免疫原性」，係指在為了達成治療效果的充分時間中，為了使抗體投予之持續效果降低而投予足夠量抗體之個體之至少過半數中未因抗體引起抗體反應。
人類中的免疫原性的水平，可使用MHC類別II結合預測程式Propred(http：//www.imtech.res.in/raghava/propred)，使用所有對偶基因之1%閾值解析進行預測。可使用的其他程式包括：
-Rankpep(http：//bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)
-Epibase(Algonomics proprietary software：algonomics.com)。
免疫原性減低的分子，相較於初始的捐出者分子，不包括預測會與標靶集團中高度表現之MHC類別II對偶基因結合的胜肽、或該胜肽之數目減低(Flower等人(Drug Discov.Today(2004)9(2),82-90))。
MHC類別II結合之機能分析，可藉由生成與該蛋白質對應的重複的胜肽，測試誘發T細胞活化之此等能力(T細胞增殖分析)、或藉由取代報告子胜肽、既知之MHC類別II結合胜肽以實施(Hammer等人(J.Exp.Med.(1994)180,2353-2358))。
為了減低本發明之抗表皮調節素抗體之免疫原性，可採用數種方法。第一種方法係進行前述抗體之人型化之方法。更具體而言，將人類以外之動物，例如從小鼠單離之抗表皮調節素抗體之CDR移植到人類抗體。為了維持或增強對表皮調節素之結合，可取代FR之胺基酸殘基以使追加的人型化抗表皮調節素抗體之CDR形成適當的抗原結合部位。
本發明之從小鼠單離之抗表皮調節素抗體之CDR之一非限定態樣，可列舉序列編號：9表示之重鏈CDR1(HCDR1)、序列編號：10表示之重鏈CDR2(HCDR2)及序列編號：11表示之重鏈CDR3(HCDR3)。又，本發明之從小鼠單離之抗表皮調節素抗體之CDR之一非限定態樣，可列舉序列編號：12表示之輕鏈CDR1(LCDR1)、序列編號：13表示之輕鏈CDR2(LCDR2)及序列編號：14表示之輕鏈CDR3(LCDR3)。
本發明之人類抗體之FR之一非限定態樣，可列舉序列編號：1表示之重鏈FR1(HFR1)、序列編號：2表示之重鏈FR2(HFR2)、序列編號：3表示之重鏈FR3(HFR3)、及序列編號：4表示之重鏈FR4(HFR4)。又，本發明之人類抗體之FR之一非限定態樣，可列舉序列編號：5表示之輕鏈FR1(LFR1)、 序列編號：6表示之輕鏈FR2(LFR2)、序列編號：7表示之輕鏈FR3(LFR3)、及序列編號：8表示之輕鏈FR4(LFR4)。
本發明之人型化抗表皮調節素抗體之可變區之一非限定態樣，可列舉序列編號：15表示之重鏈可變區。又，本發明之人型化抗表皮調節素抗體之可變區之一非限定態樣，可列舉序列編號：16表示之輕鏈可變區。
又，本發明之人類抗體之FR之一非限定態樣，可列舉序列編號：17表示之重鏈FR1(HFR1)、或序列編號：18表示之重鏈FR3(HFR3)。又，本發明之人類抗體之FR之一非限定態樣，可列舉序列編號：20表示之輕鏈FR2(LFR2)、序列編號：21表示之輕鏈FR3(LFR3)或序列編號：23表示之輕鏈FR3(LFR3)。
本發明之人型化抗表皮調節素抗體之可變區之一非限定態樣，可列舉序列編號：19表示之重鏈可變區。又，本發明之人型化抗表皮調節素抗體之可變區之一非限定態樣，可列舉序列編號：22或序列編號：24表示之輕鏈可變區。
又，本發明之人型化抗體之FR之一非限定態樣，可列舉序列編號：35表示之重鏈FR3(HFR3)、或序列編號：36表示之重鏈FR3(HFR3)。本發明之人型化抗表皮調節素抗體之可變區之一非限定態樣，可列舉序列編號：37、或序列編號：38表示之重鏈可變區。
第二種方法，係使用前述MHC類別II結合預測程式來解析抗表皮調節素抗體之胺基酸序列中之胺基酸經改變而得的改變序列，並設計免疫原性減弱之改變序列之方法。為 了使本發明之抗表皮調節素抗體之免疫原性減弱而改變胺基酸之部位之非限定例，可列舉序列編號：38表示之抗表皮調節素抗體之重鏈序列中之Kabat編號表示之87位、及/或101位之胺基酸為理想例。又，為了使抗表皮調節素抗體之免疫原性減弱而改變胺基酸之部位之非限定例，宜為序列編號：29表示之抗表皮調節素抗體之輕鏈序列中之Kabat編號表示之24位之胺基酸。
前述胺基酸取代之一非限定態樣，可理想地列舉序列編號：38表示之抗表皮調節素抗體之重鏈序列中之Kabat編號表示之87位之胺基酸取代為Ser(S)、及/或101位之胺基酸取代為Tyr(Y)或Phe(F)。又，前述胺基酸取代之一非限定態樣，可適當列舉序列編號：29表示之抗表皮調節素抗體之輕鏈序列中之Kabat編號表示之24位之胺基酸取代為Arg(R)。
第三種方法，係在設計例如包括IgG1抗體之恆定區之抗表皮調節素抗體時，適當選擇從為IgG1之副型(allotype)G1m3型(在序列編號：31表示之序列之C末端附加GK而得之序列)、G1m17,1型(序列編號：26)或G1m17型(在序列編號：30表示之序列之C末端附加GK而得之序列)選出之副型之恆定區的方法。已知被投予抗體藥劑之人類生物種之副型與該抗體藥劑之副型之適合性會影響該生物種之免疫應答(Genes and Immunity(2011)12,213-221)。
免疫原性減低之本發明之人型化抗表皮調節素抗體之重鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編號：37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140、及142-150 構成之群組中選出之重鏈。又，本發明之人型化抗表皮調節素抗體之輕鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編號：29、57、58、80-85、99、128-130、136、及141構成之群組中選出之輕鏈。
免疫原性減低之本發明之人型化抗表皮調節素抗體之一非限定態樣，可列舉包含從由序列編號：37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈、及從由序列編號：29、57、58、80-85、99、128-130、136、及141構成之群組中選出之輕鏈的人型化抗表皮調節素抗體。
脫醯胺化、異構化、水解之抑制
本發明之抗表皮調節素抗體，宜使脫醯胺化、異構化、水解受抑制較佳。
控制蛋白質醫藥品之組合體量，在品質管理上、及考慮對於藥效及免疫原性造成之影響的情形非常重要(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),708-714)。一般而言，組合化受起因於蛋白質溶液環境之colloidal stability(膠體安定性)及起因於蛋白質結構之conformational stability(立體配置安定性)兩者影響(J.Phar.m Sci.(2010)100(4),1306-1315)。藉由探討抗體製劑之配方，來篩選抗體濃度或pH、緩衝液物質、離子強度、添加劑等，能獲得對於colloidal stability為有效的條件。另一方面，conformational stability會有依存於胺基酸序列的部分，為抗體之情形，維持CDR之典型(canonical)結構或FR之一致性序列、VH/VL界面等特徵結構被認為係重要(Jung等 人(J.Mol.Biol.(2001)309(3),701-716)、Xiang等人(J.Mol.Biol.(1995)253(3),385-390)、Ewert等人(Methods.(2004)34(2),184-199)、Vargas-Madrazo等人(J.Mol.Recognit.(2003)16(3),113-120)、Morea等人(J.Mol.Biol.(1998)275,269-294)。
脫醯胺化反應，係在天冬醯胺酸及麩醯胺酸之側鏈非酵素的發生，天冬醯胺酸及麩醯胺酸之側鏈存在之醯胺變換為羧酸之反應。又，異構化，係由於天冬醯胺酸及天冬胺酸之側鏈的羰基受位在C末端側之殘基之氮原子電子對攻擊，結果由於天冬醯胺酸之脫醯胺化或天冬胺酸之脫水而形成不安定的環狀醯亞胺中間體所引起。該中間體由於開裂，多數變化為異天冬胺酸，其餘變化為天冬胺酸。為麩醯胺酸之情形，脫醯胺化速度一般為天冬醯胺酸的情形的10分之1，但其機構本質上相同，進行時僅須要水分子。該等抗體等蛋白質在保存中發生的脫醯胺化、異構化反應，會成為上述非均質性之原因，所以希望儘量抑制。又，脫醯胺化反應，據報告尤其在天冬醯胺酸與甘胺酸為相鄰的部位(Asn-Gly)容易發生(Geiger等人J.Biol.Chem.1987；262：785-794)。再者，天冬胺酸據報告會因為水解反應而引起胜肽鏈之切斷，尤其C末端側存在脯胺酸之序列(Asp-Pro)在酸性條件下容易分解(Segalas等人、FEBS Letters 1995；371：171-175)。
為了抑制脫醯胺化、異構化、水解，可適當實施將受脫醯胺化之部位即麩醯胺醯基殘基及天冬醯胺醯基殘基除去之胺基酸之改變等。除去特別有用之脫醯胺化部位之一非 限定態樣，可列舉脫醯胺化反應受促進之部位，亦即，作為NG及QG序列表示之模體中之甘胺酸殘基、天冬醯胺酸殘基或麩醯胺酸殘基為佳。該等任意者之胺基酸殘基(N、Q或G)之取代，能顯著抑制脫醯胺化反應(WO2003/057881或WO2005/067620等)。也能適當使用藉由調整產生抗體之細胞之培養方法，而製造脫醯胺化反應受抑制之抗體之方法。依本發明提供之抗表皮調節素抗體，也包括應用抑制前述脫醯胺化反應之技術而得的抗表皮調節素抗體。
受脫醯胺化之部位之非限定例，可列舉序列編號：38表示之抗表皮調節素抗體之重鏈序列中之Kabat編號表示之31位、52位、54位、56位及/或101位之胺基酸為理想例。又，受脫醯胺化之部位之非限定例，可列舉序列編號：29表示之抗表皮調節素抗體之輕鏈序列中之Kabat編號表示之28位、92位、及/或93位之胺基酸為理想例。
作為前述胺基酸取代之一非限定態樣，可列舉序列編號：38表示之抗表皮調節素抗體之重鏈序列中之Kabat編號表示之31位之胺基酸取代為Ala(A)、及/或55位之胺基酸取代為Thr(T)、Lys(K)、Phe(F)、Val(V)、Arg(R)或Leu(L)為理想例。又，前述胺基酸取代之一非限定態樣，可列舉序列編號：29表示之抗表皮調節素抗體之輕鏈序列中之Kabat編號表示之92位之胺基酸取代為Glu(E)、及/或93位之胺基酸取代為Arg(R)或Gln(Q)為理想例。
脫醯胺化、異構化、水解受抑制之本發明之人型化抗表皮調節素抗體之重鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列 編號：49-56、98、115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈。又，脫醯胺化、異構化、水解受抑制之本發明之人型化抗表皮調節素抗體之輕鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編號：57、58、128、及141構成之群組中選出之輕鏈。
脫醯胺化、異構化、水解受抑制之本發明之人型化抗表皮調節素抗體之一非限定態樣，可列舉包含從由序列編號：49-56、98、115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈、及從由序列編號：57、58、128、及141構成之群組中選出之輕鏈之人型化抗表皮調節素抗體。
等電點之改變
本發明之抗表皮調節素抗體，其等電點宜改變較佳。作為控制抗體之血漿中半減期之一方法，已知有改變抗體分子表面露出之胺基酸殘基，並且控制抗體分子表面電荷之方法(WO2007/114319及WO2009/041543)。具體而言，已知藉由使抗體的等電點(pI)之值下降，能夠延長抗體之血漿中半減期。反之，藉由使抗體之等電點上升，已知血漿中半減期縮短，抗體之組織移行性提高(Vaisitti等人(J.Biol.Regul.Homeost.Agents.(2005)19(3-4),105-112)、Pardridge等人(J.Pharmacol.Exp.Ther.(1998)286(1),548-554))。另一方面，已知該等電點減低的改變抗體之抗腫瘤效果比起改變前之抗體為增強(WO2009/041062)。
抗體等蛋白質之pI，係定義為多胜肽帶有實效電荷的pH。該領域中，蛋白質溶解性已知典型上係於該溶液之 pH等於蛋白質之等電點(pI)時為最低。因此可基於其pI來評價在給定pH，例如：pH6之蛋白質之溶解性。蛋白質之pI亦為液體製劑中之蛋白質之黏性優異的指標。高pI代表高溶解性及低黏性(高濃度製劑之情形尤為重要)。本發明之一非限定態樣中，係選擇具有比預定閾值為高之pI之候選分域。抗體之pI在抗體之活體分布或藥效也有特定作用。例如：已知抗體之pI若提高，其在細胞內及/或脈管外的局部化會增大。為了達成所望目的，必須決定哪種pI特性是對於特定抗體最理想者。在一些實施態樣中，可獲得pI值約5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0以上之抗體。在其他非限定態樣中，可選擇pI值低於約9.0、8.5、8.0、7.5、7.0、6.5、6.0、5.5或5.0之抗體。對於該技術領域中具有通常知識者，能理解單一蛋白質帶有多數的電荷形態。雖不拘於特定理論，但是蛋白質之電荷可利用多數的各種作用機構而改變，如此的機構雖不限定，可列舉胺基酸取代、陽離子化、脫胺基、羧基末端胺基酸不均質性、磷酸化及糖化等。本說明書使用之pI，係定義為主要電荷形態之pI。
蛋白質之pI可由各種方法決定，如此的方法雖不限定，但可列舉等電點電泳及各種電腦演算法(例如參照Bjellqvist等人(Electrophoresis(1993)14,1023)作為一非限定態樣。一非限定態樣中，係使用具備多溫度(multi temp)三冷卻浴再循環單元及EPS 3501 XL電源之Pharmacia Biotech Multiphor 2電泳裝置決定。一起提供Precast Anhoril Gel(Amersham Biosciences、pI範圍：2.5~10)與5μg蛋白質。使用 廣pI標記標準(Amersham、pI範圍：3~10、8μL)，決定抗體之相對pI。於1,500V、50 mA之條件下實施105分鐘電泳。其次使用以精製水稀釋為1x的Sigma固定溶液(5x)，固定凝膠。使用簡單藍(Simply Blue)染料(Invitrogen)，於室溫一晚之條件下將該凝膠染色。使用包含25%乙醇、8%乙酸及67%精製水構成的溶液，將該凝膠脫染。使用Bio-Rad光密度計，依據標準之校正曲線決定等電點。
為了使本發明之抗表皮調節素抗體之等電點變化，可適當實施將抗表皮調節素抗體之胺基酸序列中帶電的胺基酸除去、或於抗表皮調節素抗體之胺基酸序列加成或***帶電荷之胺基酸之胺基酸之改變等。胺基酸之中，已知存在帶電荷之胺基酸。一般而言，帶正電荷的胺基酸(正電荷胺基酸)，已知有離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)。帶負電荷之胺基酸(負電荷胺基酸)，已知有天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)等。該等以外之胺基酸已知作為不帶電荷之胺基酸。
上述「經改變之胺基酸殘基」，較佳為從以下(a)或(b)任意者之群所含之胺基酸殘基之加成、***或除去適當選擇，但不特別限於該等胺基酸。
(a)麩胺酸(E)、天冬胺酸(D)
(b)離胺酸(K)、精胺酸(R)、組胺酸(H)
又，當原本(改變前之)胺基酸殘基已有電荷的情形，改變成不帶電荷之胺基酸殘基亦為本發明之一理想態樣。亦即，本發明之改變，可列舉(1)從帶電荷之胺基酸取代為不帶電荷之胺基酸、(2)從帶電荷之胺基酸取代為與該胺基酸有相反 電荷之胺基酸、(3)從不帶電荷之胺基酸取代為帶電荷之胺基酸。
為了使本發明之抗表皮調節素抗體之等電點變化，改變胺基酸之部位之非限定例，可列舉序列編號：38表示之抗表皮調節素抗體之重鏈序列中之Kabat編號表示之13位、61位、62位、64位、65位、97位、及/或98位之胺基酸為理想。又，為了使抗表皮調節素抗體之等電點變化而改變胺基酸之部位之非限定例，可列舉序列編號：29表示之抗表皮調節素抗體之輕鏈序列中之Kabat編號表示之24位、55位、56位、及/或107位之胺基酸為理想例。
作為前述胺基酸取代之一非限定態樣，可列舉序列編號：38表示之抗表皮調節素抗體之重鏈序列中之Kabat編號表示之14位之胺基酸取代為Asn(N)或Lys(K)、61位之胺基酸取代為Asp(D)或Glu(E)、62位之胺基酸取代為Ser(S)或Gln(Q)、64位之胺基酸取代為Asp(D)或Glu(E)、65位之胺基酸取代為Asp(D)或Glu(E)、97位之胺基酸取代為Arg(R)、及/或98位之胺基酸取代為Glu(E)為理想例。又，作為前述胺基酸取代之一非限定態樣，可列舉序列編號：29表示之抗表皮調節素抗體之輕鏈序列中之Kabat編號表示之24位之胺基酸取代為Gln(Q)或Ser(S)、55位之胺基酸取代為Glu(E)、56位之胺基酸取代為Glu(E)、及/或106a位之胺基酸取代為Glu(E)為理想例。
作為等電點已改變之本發明之抗表皮調節素抗體之重鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編號：72-79、98、 115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈。又，作為等電點已改變之本發明之人型化抗表皮調節素抗體之輕鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編號：80-85、及99構成之群組中選出之輕鏈。
作為等電點已改變之本發明之抗表皮調節素抗體之一非限定態樣，可列舉包含從由序列編號：72-79、98、115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈、及從由序列編號：80-85、及99構成之群組中選出之輕鏈的抗表皮調節素抗體。
安定性之改善
本發明之抗表皮調節素抗體其安定性宜改善較佳。代表抗體之安定性之一以上之參數，可列舉分域之熱融解溫度(Tm)值。抗體之Tm值，成為抗體之熱安定性之優良指標，且也可成為抗體之保管期間之指標。Tm值愈低，則代表組合體之形成/低安定性，反之，Tm值愈高，代表組合體之不形成/高安定性。因此，宜提供Tm值高之抗體較佳。本發明之一非限定態樣，可選擇具有比預定閾值高之Tm值的抗體。於一些實施形態，選擇具有至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、或100℃以上之Tm值之抗體。
抗體之熱融解溫度(Tm)，可由該領域周知之任意標準方法測定。例如：Vermeer等人利用差示掃描熱量測定(DSC)及利用圓二色性(CD)光譜研究了構造同型2b之單株小鼠抗大鼠IgG之解折疊及改性(Biophys.J.(2000)78,394-404、Colloids Surfaces A：Physicochem.Eng.Aspects.(2000)161, 139-150、J.Colloid Interface Sci.(2000)225,394-397、2000,Biophys.J.(2000)79,2150-2154)。其結果，據認為IgG之折疊及解折疊為2個主要的轉變(transition)，並了解該等轉變本身亦是由各種步驟重疊者。DSC及CD實驗兩者中觀測到的雙峰分布，在實驗中未受掃描速度影響。2個轉變似乎為獨立，解折疊為不可逆。將從該IgG消化而得之Fab及Fc片段之二次結構及熱力學的安定性，與完整的免疫球蛋白的此特性比較(Vermeer等人(Biophys.J.(2000)79,2150-2154))。了解到：在完整的IgG可觀測到的2個峰部，各分配到Fab及Fc片段。Vermeer等人也解明：熱誘發以外，一般而言，gG的結構的微擾能由pH變更(Biophys.J.(2000)78,394-404)或與疏水性環境間的交互作用，如：對於特氟龍表面之吸附或與界面活性劑間之交互作用(Vermeer等人、1998,Biochim.Biophys.Acta.(1988)1425,1-12、Colloids Surfaces A：Physicochem.Eng.Aspects.(2000)161,139-150、J.Colloid Interface Sci.225(2000)394-397)誘發。
本發明之一非限定態樣中，係使用含有經單離抗體之樣本來測定抗體之Tm值。一實施形態中，抗體之Tm值係使用VP-DSC(MicroCal、LLC)，於掃描速度：1.0℃/分及溫度範圍：25~120℃之條件下測定。可使用5分鐘的掃描前調溫及濾器時間8秒。具體例中，使用Pierce透析杯(3.5 kD)，對於25 mM組胺酸-HCl透析以製備樣本。平均抗體濃度為50μg/mL，且其可由280 nm之吸光度決定。使用與裝置一起提供的原版軟體，依製造者的程序決定融解溫度。簡言之，藉由 對於樣本及對照室兩者，將多數的基線與緩衝液一起流入，來確立熱平衡。從樣本熱分析圖減去基線後，將數據進行濃度基準化，使用反褶積(deconvolution)函數擬合(fitting)。於其他實施態樣中，抗體之安定性係使用以下方法評價。1個以上之測定基準，尚可包含從各種pH值、各種溫度、各種剪切應力、及各種冷凍/解凍循環構成的群組中選出的一個以上的各種條件下代表抗體之安定性之測定基準。
本發明之一非限定態樣，DSC可使用Setaram Micro-DSC III(Setaram、Caluire、法國)測定。於熱量計之含有適當的空白溶液之1 mL之對照小室，及相對於其之1 mL之樣本小室配置樣本。於熱量計內以4小時25℃使小室安定化後，以選擇之加熱速度加熱該小室到最終溫度。可使用Setaram軟體(Setaram、1.3版)，決定轉移溫度及焓。
本發明之一非限定態樣中，熱改性/再生曲線可使用圓二色性(CD)光譜取得。作為溫度及/或例如：pH之函數的IgG之二次結構之變化，可以用CD光譜檢查(Fasman等人(Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules.(1996)Plenum Press))。依de Jongh等人，該方法的優點為分光信號不受周圍溶液之存在所影響、及能使用明確的程序，依據各種結構要素的基準光譜來解決二次結構(Biochemistry(1994)33,14521-14528)。二次結構要素之級分可從CD光譜取得。
本發明之一非限定態樣中，可以用JASCO分光偏光計、模型J-715(JASCO International Co.)測定。可使用光徑 長0.1 cm之石英比色管。溫度調節可使用JASCO PTC-348WI(JASCO International)熱電偶實施。使用解析能力：0.2℃及時間常數：16秒之Peltier熱電偶，記錄溫度掃描。於遠紫外線區域(0.2 nm解析能力)的波長掃描，可藉由累積有理想掃描速度之多數掃描來取得。
熱改性/再生曲線也可利用分光法測定。若溶液中之蛋白質回應於加熱而改性，分子會凝集，且溶液會更強地使光散射。由於凝集會使樣本之光學的透明性起變化，故可藉由監控規定波長之可見或紫外線之吸收變化來測定凝集。
本發明之一非限定態樣中，可使用螢光分光學取得熱改性/再生曲線。一實施態樣中，係監控固有蛋白質螢光，例如：固有色胺酸螢光。於另一實施形態，係監控螢光探測分子。實施螢光分光學實驗之方法係該技術領域中具有通常知識者周知。例如參考Bashford等人(Spectrophotometry and Spectrofluorometry：A Practical Approach(1987)91-114,IRL Press Ltd.)、Bell J.E.(Spectroscopy in Biochemistry(1981)Vol.I,155-194,CRC Press)或Brand等人(Ann.Rev.Biochem.(1972)41,843)。
與其生物學的活性同樣，可以利用基於抗體之物理學的及化學結構來評價抗體組合物之安定性的各種方法。例如為了探討抗體之改性，除了上述分析以外，還可利用電荷移動吸收、螢光分光法、NMR、rCGE(還原毛細管凝膠電泳)及/或HPSEC(高速尺寸排除層析)等方法(例如：Wang等人(J.Parenteral Science & Technology 42(Suppl),S4-S26))
還原毛細管凝膠電泳及高速尺寸排除層析，係用以評價蛋白質之組合體或蛋白質之分解物、及蛋白質之片段形成最一般且簡便的方法。所以，本發明提供之含抗表皮調節素抗體之組合物之安定性也可利用該等方法評價。
為了改變本發明之抗表皮調節素抗體之安定性，可適當實施抗表皮調節素抗體之胺基酸序列中之胺基酸之改變等。
為了改變本發明之抗表皮調節素抗體之安定性之一非限定態樣，於抗表皮調節素抗體為IgG1抗體之情形，據報告使人類IgG抗體之重鏈C末端序列(G1、序列編號：25)來源的不均質性之C末端胺基酸之離胺酸殘基之缺損、及C末端之2胺基酸之甘胺酸、離胺酸兩者之缺損造成之C末端胺基之醯胺化(Anal.Biochem.(2007)360(1),75-83)減少的方法，可列舉使重鏈C末端之2個胺基酸，亦即EU編號表示之446位之甘胺酸及447位之離胺酸缺損之改變(WO2009/041613)為理想例。本發明之抗表皮調節素抗體之重鏈C末端序列來源之不均質性希望不存在，故可將使人類IgG1之EU編號表示之446位之甘胺酸及447位之離胺酸缺損的IgG1序列(G1d、序列編號：26)利用於作為恆定區序列。
安定性已改善之本發明之抗表皮調節素抗體之重鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編號：37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈。又，安定性已改善之本發明之人型化抗表皮調節素抗體之輕鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編 號：99、128-130、136、及141構成之群組中選出之輕鏈。
安定性已改善之本發明之抗表皮調節素抗體之一非限定態樣，可列舉包含從由序列編號：37、38、49-56、72-79、92-98、115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈、及從由序列編號：99、128-130、136、及141構成之群組中選出之輕鏈之抗表皮調節素抗體。
組合體量之減少
本發明之抗表皮調節素抗體，其組合體量宜減少較佳。控制蛋白質醫藥品之組合體量，在考慮品質管理上及對藥效及免疫原性之影響時非常重要(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),708-714)。一般而言組合化係受起因於蛋白質溶液環境之colloidal stability及起因於蛋白質結構之conformational stability兩者(J.Pharm.Sci.(2010)100(4),1306-1315)。利用探討抗體製劑之配方，並篩選抗體濃度或pH、緩衝液種類、離子強度、添加劑等，能獲得對於colloidal stability有效的理想條件。另一方面，conformational stability也有依存於胺基酸序列之部分，為抗體之情形，維持CDR之典型(canonical)結構或FR之一致性序列、VH/VL界面等特徵結構被認為係重要(Jung等人(J.Mol.Biol.(2001)309(3),701-716)、Xiang等人(J.Mol.Biol.(1995)253(3),385-390)、Ewert等人(Methods.(2004)34(2),184-199)、Vargas-Madrazo等人(J.Mol.Recognit.(2003)16(3),113-120)、Morea等人(J.Mol.Biol.(1998)275,269-294)、Vargas-Madrazo等人(J.Mol.Recognit.(2003)16(3),113-120))。
為了利用依據蛋白質之物理及化學結構、及此等之生物活性來評價包含抗體製劑之蛋白質製劑之安定性，可利用各種方法。例如為了研究蛋白質之改性，可利用電荷移動吸收、熱分析、螢光分光法、圓二色性(CD)、NMR、及HPSEC、切向流過濾(TFF)、靜態光散射法(SLS)、傅利葉變換紅外分光法(FTIR)、尿素誘發蛋白質解折疊技術、固有色胺酸螢光、差示掃描熱量測定法、及1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)蛋白質結合技術等方法。例如可從Wang等人(J.of Parenteral Science & Technology(1988)42(Suppl),S4-S26)記載之方法適當選用。
rCGE及HPSEC，係為了評價蛋白質凝集體之形成、蛋白質分解、及蛋白質片段化之最一般且最簡單的方法。因此本發明之液體製劑之安定性可依該等方法評價。
例如：本發明之抗表皮調節素抗體之安定性，可以依HPSEC或rCGE評價，此時，峰部區域率代表未分解抗體或未分解抗體片段。於一非限定態樣中，將約250μg抗體(含有前述抗體10 mg/mL之液體製劑約25μL)注入裝有TSK SW x1保護管柱(6.0 mm×4.0 cm)之TosoH Biosep TSK G3000SWXL管柱(7.8 mm×30 cm)中。抗體(包含其抗體片段)係使用含0.1 M硫酸鈉及0.05%疊氮化鈉之0.1 M磷酸二鈉，以流量0.8-1.0 mL/min使以均勻濃度溶出。溶出蛋白質可使用UV吸光度280 nm檢測。分析時，使作為對照的參照標準運行，與將在約12~14分鐘觀察到的含有容量峰部以外的其他全部的峰部比較，報告生成單體峰部之區域率的結果。將比單體峰部早溶出的峰部記錄為凝集率。
為了使本發明之抗表皮調節素抗體之組合體量減少，使含有抗表皮調節素抗體之重鏈及輕鏈的分子間之疏水***互作用減弱。具體而言，適當實施將抗表皮調節素抗體之重鏈或輕鏈之胺基酸序列中之疏水性殘基取代為親水性殘基的胺基酸之改變等。一理想之非限定態樣中，適當實施將抗表皮調節素抗體之CDR內含有之疏水性殘基取代為親水性殘基之胺基酸之改變等。胺基酸之中，已知存在親水性之胺基酸及疎水性之胺基酸。一般而言，親水性胺基酸已知為Asp(D)、Glu(E)、Arg(R)、Lys(K)、His(H)、Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Asn(N)、Gln(Q)、Tyr(Y)。疏水性胺基酸已知為Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Met(M)、Trp(W)、Phe(F)、Pro(P)。前述胺基酸之改變，較佳為適當選擇將從前述疏水性殘基之中選出一個以上之胺基酸取代為從前述親水性殘基中選出之胺基酸，但不特別限於特定之胺基酸。
為了減少本發明之抗表皮調節素抗體之組合體量而改變胺基酸之部位之非限定例，可列舉序列編號：38表示之抗表皮調節素抗體之重鏈序列中之Kabat編號表示之60位、及/或98位之胺基酸為理想例。
前述胺基酸取代之一非限定態樣，可列舉序列編號：38表示之抗表皮調節素抗體之重鏈序列中之Kabat編號表示之60位之胺基酸取代為His(H)、Lys(K)、Thr(T)、Ser(S)或Arg(R)、及/或98位之胺基酸取代為Ser(S)或Glu(E)為理想例。
組合體量減少之本發明之抗表皮調節素抗體之重鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編號：92-98、115-127、 131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈。
組合體量減少之本發明之抗表皮調節素抗體之一非限定態樣，可列舉包含從由序列編號：92-98、115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈、及從由序列編號：99、128-130、136、及141構成之群組中選出之輕鏈之抗表皮調節素抗體。
賦予與非人類動物之表皮調節素及人類動物之表皮調節素結合之種交叉反應性
本發明之抗表皮調節素抗體，宜為顯示非人類動物及人類動物間之種交叉反應性(cross-species reactivity)之抗表皮調節素抗體為較佳。亦即，本發明提供一種抗表皮調節素抗體，其係包含序列編號：9、10及11表示之重鏈可變區CDR及序列編號：12、13及14表示之輕鏈可變區CDR之抗表皮調節素抗體結合之抗原決定部位所結合之抗體，且對序列編號：170表示之猿表皮調節素之KD值(cEREG KD)與序列編號：34表示之對人類表皮調節素之KD值(hEREG KD)之比(cEREG KD/hEREG KD)，比起包含序列編號：9、10及11表示之重鏈可變區CDR及序列編號：12、13及14表示之輕鏈可變區CDR之抗表皮調節素抗體之cEREG KD/hEREG KD小。
具體而言，本發明為了改變包含序列編號：9、10及11表示之重鏈可變區CDR及序列編號：12、13及14表示之輕鏈可變區CDR之抗表皮調節素抗體其相對於猿表皮調節素之結合活性，改變前述CDR之胺基酸序列。由於猿表皮調節素與人類表皮調節素在結構上的差異不明顯，故完全無若改 變抗表皮調節素抗體之哪個胺基酸殘基能增強對猿表皮調節素之結合活性的指引。本發明中，設計CDR之任意部位之胺基酸殘基經取代之多數抗體序列。具體而言，製作前述CDR序列中之胺基酸取代為Arg(R)殘基之抗表皮調節素抗體。
CDR序列中之胺基酸取代為Arg(R)殘基而得之抗表皮調節素抗體，意外地，對猿表皮調節素之結合活性有增強。亦即，藉由將抗表皮調節素抗體之CDR序列中之胺基酸取代為Arg(R)殘基，能夠賦予與非人類動物之表皮調節素及人類動物之表皮調節素結合之種交叉反應性。
對於序列編號：170表示之猿表皮調節素之KD值(cEREG KD)，可由前述結合活性之項目記載之方法計算。抗表皮調節素抗體對於表皮調節素之結合活性可利用對該技術領域中具有通常知識者為公知之方法測定，關於其測定條件可由該技術領域中具有通常知識者適當決定。抗表皮調節素抗體對表皮調節素之結合活性，可就KD(Dissociation constant：解離常數)、視KD(Apparent dissociation constant：視解離常數)、解離速度kd(Dissociation rate：解離速度常數)、或視kd(Apparent dissociation：視解離速度常數)等評價。該等可利用該技術領域中具有通常知識者公知之方法測定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、Scatchard Plot、FACS等。該KD值除以對於序列編號：34表示之人類表皮調節素之KD值(hEREG KD)，可決定對猿表皮調節素之KD值(cEREG KD)與對人類表皮調節素之KD值(hEREG KD)之比(cEREG KD/hEREG KD)。
本發明中，cEREG KD/hEREG KD宜比40小較佳。 又，於一非限定態樣，cEREG KD/hEREG KD宜比10小較佳。於另一非限定態樣中，cEREG KD/hEREG KD宜比6小較佳，於另一不同之非限定態樣，cEREG KD/hEREG KD宜比4小為佳。
本發明提供之為了賦予與非人類動物之表皮調節素及人類動物之表皮調節素結合之種交叉反應性而改變胺基酸之部位之非限定例，可列舉序列編號：38表示之抗表皮調節素抗體之重鏈序列中之Kabat編號表示之33位、51位、54位、55位、56位、57位、58位、59位、60位、62位、65位、96位、97位、及/或98位之胺基酸。又，本發明提供之為了賦予與非人類動物之表皮調節素及人類動物之表皮調節素結合之種交叉反應性而改變胺基酸之部位之非限定例，可列舉序列編號：29表示之抗表皮調節素抗體之輕鏈序列中之Kabat編號表示之24位、93位、及/或94位之胺基酸為理想例。上述胺基酸之一以上取代為Arg(R)之胺基酸之改變可做為理想例。
已賦予種交叉性之本發明之抗表皮調節素抗體之重鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編號：115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈。又，已賦予種交叉性之本發明之人型化抗表皮調節素抗體之輕鏈之一非限定態樣，可列舉從由序列編號：128-130、136、及141構成之群組中選出之輕鏈。
已賦予種交叉性之本發明之抗表皮調節素抗體之一非限定態樣，可列舉包含從由序列編號：98、115-127、131-135、137-140、及142-150構成之群組中選出之重鏈、及 從由序列編號：29、128-130、136、及141構成之群組中選出之輕鏈的抗表皮調節素抗體。
中和活性
本發明之抗表皮調節素抗體較佳為具有中和活性之抗體。一般而言，中和活性係指抑制對於病毒或毒素等對細胞有生物學活性之配體之該生物學活性之活性。亦即，有中和活性之物質，係指結合於該配體或該配體所結合之受體，並抑制該配體與受體之結合之物質。利用中和活性使與配體結合受抑制之受體，不能發揮經由該受體媒介之生物學活性。具有如此之中和活性之抗體，一般稱為中和抗體。該中和活性，係藉由將在成為對象的配體存在下其生物學活性在待驗物質存在或非存在下之條件之間比較而測定。
例如，作為本發明之表皮調節素之主要受體考量者之EGF受體的情形，由於配體之結合使二聚體形成，並活化細胞內存在之自身的分域即酪胺酸激酶。受活化之酪胺酸激酶由於自磷酸化，而形成含磷酸化酪胺酸之胜肽，且與各種信號傳達的附屬分子組合。該等主要有PLCγ(磷酸脂解酶Cγ)、Shc、Grb2等。該等附屬分子之中，前二者會進一步由於EGF受體之酪胺酸激酶而受磷酸化。從EGF受體開始的信號傳達的主要路徑，係依Shc、Grb2、Sos、Ras、Raf/MAPK激酶/MAP激酶的順序傳達磷酸化的路徑。又，據認為存在為副路徑之PLCγ至PKC之路徑。
如此之細胞內之信號串流對每一細胞種類不同，可因應目的標靶細胞適當設定標的分子，不限定於上述因子。活體內信 號活化之測定套組可適當使用市售品(例如：Protein激酶C活性測定系統(GEHealthcare Bioscience(股)公司)等)。
又，以對於存在活體內信號串流之下游的標的基因的轉錄誘導作用作為指標，可檢測活體內信號之活化。標的基因之轉錄活性之改變，可利用報告子試驗法的原理檢測。具體而言，在標的基因之轉錄因子或起動子區之下游配置GFP(Green Fluorescence Protein)或發光酶等報告子基因，並測定其報告子活性，可就轉錄活性之改變測定作為報告子活性。
再者，EGF受體通常作用為促進細胞增殖之方向，所以藉由測定作為標靶之細胞之增殖活性，能評價活體內信號傳達之活化。本發明中，係藉由評價後者之細胞增殖活性來評價本發明之中和抗體之中和活性，但不限於本方法，能對各標靶細胞適當採用選擇的前述列舉的方法並評價。
亦即，藉由例如測定如以下之細胞增殖活性，可評價或測定抗表皮調節素抗體之中和活性。可使用測定培養基中添加之[3H]標記胸腺嘧啶由活細胞之攝入作為DNA複製能力指標的方法。就更簡便的方法，有於顯微鏡下計測將trypan blue等色素排除到細胞外之能力的色素排除法、或MTT法。後者係利用活細胞有將四唑鎓鹽MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)轉換為藍色的甲臢(formazan)產物的能力。更具體而言，在待驗細胞的培養液中加入待驗抗體並經過一定時間後，將MTT溶液加入培養液並靜置一定時間以使細胞攝入MTT。其結果黃色化合物MTT由於細胞內之粒腺體內的琥珀酸脫氫酵素而變換為藍色的化合 物。使該藍色生成物溶解並呈色後測定其吸光度，作為活細胞數的指標。
MTT以外，也有MTS、XTT、WST-1、WST-8等試藥有市售(nacalai tesque等)，可理想地使用。又，以細胞之ATP或細胞培養物之阻抗作為指標來評價細胞增殖活性之方法亦為公知。活性之測定時，將作為對照抗體之具有與抗表皮調節素抗體為相同的構造同型之抗體且不具該中和活性之結合抗體，與抗表皮調節素抗體同樣使用，藉由抗表皮調節素抗體顯示比對照抗體為強之中和活性可判定活性。中和活性之測定方法之具體例，在WO2008/047723等已揭示，該技術領域中具有通常知識者可適當使用該等公知之測定方法。
細胞毒性
本發明使用之抗體，較佳為有細胞毒性之抗體。
本發明中，細胞毒性，例如抗體依存性細胞介在性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、補體依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性等。本發明中，CDC活性係指藉由補體系帶來的細胞毒性。另一方面，ADCC活性係指對於標靶細胞之細胞表面抗原為專一的抗體附著時，於其Fc部分有Fcγ受體保有細胞(免疫細胞等)經由Fcγ受體而結合，對於標靶細胞造成傷害之活性。本發明使用之抗體，可為具有CDC活性或ADCC活性之抗體，或兼具CDC活性及ADCC活性之抗體。
抗表皮調節素抗體是否有ADCC活性、或是否有CDC活性，可利用公知方法測定(例如：Current protocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies in humans,Editor,John E,Coligan et al.,John Wiley & Sons,Inc.,(1993)等)。
具體而言，首先製備效應子細胞、補體溶液、標靶細胞。
(1)效應子細胞之製備
從CBA/N小鼠等摘出脾臟，在RPMI1640培養基(Invitrogen)中將脾臟細胞分離。將以含10%胎牛血清(FBS、HyClone)之同培養基洗滌過的該脾臟細胞之濃度調整為5×106/ml，可製備效應子細胞。
(2)補體溶液之製備
以含10% FBS之培養基(Invitrogen)將Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)稀釋為10倍，可製備補體溶液。
(3)標靶細胞之製備
將表現表皮調節素蛋白質之細胞與0.2 mCi之51Cr-鉻酸鈉(GEhealthcare bioscience)一起在含10% FBS之DMEM培養基中，於37℃培養1小時，將該標靶細胞做放射性標記。作為表現表皮調節素蛋白質之細胞，可利用以編碼為表皮調節素蛋白質之基因轉形而得之細胞、原發性大腸癌細胞、轉移性大腸癌細胞、肺腺癌細胞、胰臟癌細胞、胃癌細胞、腎癌細胞、大腸癌細胞、食道癌細胞等。放射性標記後，將以含10% FBS之RPMI1640培養基洗滌3次後的細胞濃度調整為2×105/ml，可製備該標靶細胞。
ADCC活性、或CDC活性依下列所述方法測定。測定ADCC活性的情形，將加到96井U底板(Becton Dickinson) 各50μl的標靶細胞與抗表皮調節素抗體在冰上靜置15分鐘。之後，將加有效應子細胞100μl之該板在二氧化碳培養箱內溫育4小時。抗體之終濃度可設為例如0或10μg/ml等的濃度。溫育後，使用蓋氏計數器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)測定從各井回收的100μl上清的放射活性。使用測定值依(式2)(A-C)/(B-C)x 100之計算式可計算細胞毒性(%)。A係表示在各試樣之放射活性(cpm)、B係表示在加有1% NP-40(nacalai tesque)之試樣之放射活性(cpm)、C係表示在僅含標靶細胞之試樣之放射活性(cpm)。
另一方面，進行CDC活性測定的情形，係將於各井各加入標靶細胞、及抗表皮調節素抗體50μL的96井平底板(Becton Dickinson公司製)於冰上靜置15分鐘。之後將於各井加有補體溶液100μL之板於於二氧化碳培養箱內溫育4小時。抗體之終濃度調整為0或3μg/mL。溫育後，使用蓋氏計數器測定回收之100μL上清中之放射活性。細胞毒性與ADCC活性之測定以同樣方式計算。
ADCC活性增強之抗表皮調節素抗體
ADCC活性增強之抗表皮調節素抗體也可理想地作為本發明之抗表皮調節素抗體。如前述，ADCC活性係指專一性抗體附著於標靶細胞之細胞表面抗原時，其Fc部分有Fcγ受體表現細胞(免疫細胞等)經由受體而結合並對於標靶細胞造成傷害之活性，所以藉由增強免疫細胞等Fcγ受體表現細胞對於Fcγ受體之結合活性，可增強抗表皮調節素抗體中介之ADCC活 性。作為增強免疫細胞等Fcγ受體表現細胞對於Fcγ受體之結合活性的方法，至少可利用以下三種公知方法。
(1)Fc區域之胺基酸改變之抗表皮調節素抗體
可藉由改變本發明之抗表皮調節素抗體所含之Fc區域之胺基酸，而取得對於Fcγ受體之結合活性增強之抗表皮調節素抗體。用於改變之理想IgG型免疫球蛋白之Fc區域，例如人類IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、此等之改變體)之Fc區域。
對於其他胺基酸之改變，只要在對Fcγ受體之結合活性增強的限度內，任一位置之胺基酸均可改變。本發明之抗表皮調節素抗體當含有人類IgG1之Fc區域作為人類Fc區域之情形，宜包含使對Fcγ受體之結合比起人類IgG1來源之Fc區域之結合活性更增強之效果的改變較佳。用以使對Fcγ受體之結合活性增強之胺基酸改變，例如在WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260及WO2006/023403等已有報告。
可作如此改變之胺基酸，例如選自於EU編號表示之221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255 位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位之群組中的至少1個以上之胺基酸。藉由該等胺基酸之改變，能增強本發明之抗表皮調節素抗體之Fc區域對Fcγ受體之結合。本發明之抗表皮調節素抗體，在序列編號：26之重鏈恆定區中，也可含有例如從EU編號表示之230位、240位、244位、245位、247位、262位、263位、266位、273位、275位、299位、302位、313位、323位、325位、328位及332位構成之群組中選出之胺基酸之至少1個取代。
為了於本發明使用之特別理想的改變，例如從本發明之抗表皮調節素抗體之Fc區域之EU編號表示之；221位之胺基酸為Lys或Tyr中之任一者、222位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、223位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys中之任一者、 224位之胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr中之任一者、225位之胺基酸為Glu、Lys或Trp中之任一者、227位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、228位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、230位之胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr中之任一者、231位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、232位之胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr中之任一者、233位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、234位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、235位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、236位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、237位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、238位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之 任一者、239位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、240位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、241位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中之任一者、243位之胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中之任一者、244位之胺基酸為His、245位之胺基酸為Ala、246位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、247位之胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中之任一者、249位之胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr中之任一者、250位之胺基酸為Glu或Gln中之任一者、251位之胺基酸為Phe、254位之胺基酸為Phe、Met或Tyr中之任一者、255位之胺基酸為Glu、Leu或Tyr中之任一者、256位之胺基酸為Ala、Met或Pro中之任一者、258位之胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr中之任一者、260位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、262位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中之任一者、263位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、 264位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、265位之胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、266位之胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr中之任一者、267位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、268位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中之任一者、269位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、270位之胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、271位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、272位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、273位之胺基酸為Phe或Ile中之任一者、274位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、275位之胺基酸為Leu或Trp中之任一者、 276位之胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、278位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、279位之胺基酸為Ala、280位之胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中之任一者、281位之胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr中之任一者、282位之胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中之任一者、283位之胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中之任一者、284位之胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中之任一者、285位之胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中之任一者、286位之胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr中之任一者、288位之胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr中之任一者、290位之胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中之任一者、291位之胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中之任一者、292位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中之任一者、293位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 294位之胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、295位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、296位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中之任一者、297位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、298位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、299位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、300位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中之任一者、301位之胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr中之任一者、302位之胺基酸為Ile、303位之胺基酸為Asp、Gly或Tyr中之任一者、304位之胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr中之任一者、305位之胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr中之任一者、311位之胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中之 任一者、313位之胺基酸為Phe、315位之胺基酸為Leu、317位之胺基酸為Glu或Gln、318位之胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中之任一者、320位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、322位之胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、323位之胺基酸為Ile、324位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、325位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、326位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、327位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、328位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、 329位之胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、330位之胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、331位之胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、332位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中之任一者、333位之胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中之任一者、334位之胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中之任一者、335位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中之任一者、336位之胺基酸為Glu、Lys或Tyr中之任一者、337位之胺基酸為Glu、His或Asn中之任一者、339位之胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中之任一者、376位之胺基酸為Ala或Val中之任一者、377位之胺基酸為Gly或Lys中之任一者、378位之胺基酸為Asp、 379位之胺基酸為Asn、380位之胺基酸為Ala、Asn或Ser中之任一者、382位之胺基酸為Ala或Ile中之任一者、385位之胺基酸為Glu、392位之胺基酸為Thr、396位之胺基酸為Leu、421位之胺基酸為Lys、427位之胺基酸為Asn、428位之胺基酸為Phe或Leu中之任一者、429位之胺基酸為Met、434位之胺基酸為Trp、436位之胺基酸為Ile、或440位之胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr中之任一者、之群組選出之至少1個以上之胺基酸之改變。又，改變之胺基酸之數目不特別限定，可僅有一處胺基酸改變，也可有二處以上之胺基酸改變。二處以上之胺基酸之改變之組合，例如表1-1及表1-2記載之組合。
【表1-1】
表1-2為接續表1-1之表。
【表1-2】
本說明書中，抗表皮調節素抗體之Fc區域對Fcγ受體之結合活性增強，係指施有前述胺基酸之改變之抗表皮調節素抗體之Fc區域對FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa及/或FcγRIIIb中之任一者之人類Fcγ受體之結合活性，相較於施以前述胺基酸之改變前之抗表皮調節素抗體之Fc區域對該等 人類Fcγ受體之結合活性為高。例如：依據上述解析方法，與作為對照之改變前之抗表皮調節素抗體之結合活性比較，改變後抗表皮調節素抗體之結合活性顯示105%以上，較佳為110%以上、115%以上、120%以上、125%以上，尤佳為130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上之結合活性。
(2)與Fc區域結合之糖鏈中之岩藻糖含量減少之抗表皮調節素抗體
作為本發明之抗表皮調節素抗體之一非限定態樣，可理想地列舉該抗表皮調節素抗體之Fc區域所結合之糖鏈之組成修飾成使得接合有岩藻糖缺損糖鏈之Fc區域之比例提高的抗表皮調節素抗體。可依後述糖鏈結構之解析方法，由該技術領域中具有通常知識者適當選擇結合有岩藻糖缺損糖鏈之Fc區域之比例為高的抗表皮調節素抗體。如此之結合有岩藻糖缺損糖鏈之Fc區域之比例，可從10%至100%之中由該技術領域中具有通常知識者適當選擇。一非限定態樣中，該比例可從10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%之中選擇。已知若從抗體之Fc區域所結合之N-配糖體結合複合型糖鏈還 原末端之N-乙醯基葡萄糖胺將岩藻糖殘基除去，則對FcγRIIIa之親和性增強(J.Biol.Chem.(2003)278,3466-3473)。含有如此之Fc區域之IgG1抗體，已知後述ADCC活性增強，因此含有該Fc區域之抗表皮調節素抗體，作為本發明之醫藥組合物含有之抗表皮調節素抗體亦為有用。從抗體Fc區域所結合之N-配糖體結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺將岩藻糖殘基除去之抗體之一非限定態樣，可列舉經糖苷基(glycosyl)化修飾之抗體(WO1999/054342)為理想例。
從抗體Fc區域所結合之N-配糖體結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺去除岩藻糖殘基而得之抗體之一不同的非限定態樣，也可列舉對於糖鏈加成之岩藻糖缺損之抗體(WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)為理想例。接受糖鏈修飾之多胜肽其形成糖鏈結構之活性改變的結果，導致於糖鏈加成岩藻糖之能力低的宿主細胞可用以製作於糖鏈加成之岩藻糖缺損之抗體。藉由於該宿主細胞表現所望之抗體基因，可從該宿主細胞之培養液回收其糖鏈中之岩藻糖缺損之該抗體。就形成多胜肽之糖鏈結構之活性而言，可列舉從岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.152)、岩藻糖轉運蛋白(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖4,6-脫水酶)(EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-去氧甘露糖3,5-差向異構酶，4-還原酶)(EC 1.1.1.271)、及GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)(EC 2.7.7.30)構成之群組中選出之酵素或轉運蛋白之活性為非限定之理想例。該等酵素或轉運蛋白只要能發揮活性即可，不指定其結構。本說明書中，將能發揮該等活性之蛋白質稱為機能性蛋白 質。作為改變該等活性之方法之一非限定態樣，可列舉該等活性之缺失。為了製作該等活性缺失之宿主細胞，可適當採用破壞該等機能性蛋白質之基因使不能作用之方法等公知方法(WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。如此之活性缺失之宿主細胞，可以利用將CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、或融合瘤細胞等的內在性該等機能性蛋白質之基因破壞使無法作用之方法等以製作。
藉由從轉形有含抗表皮調節素抗體基因之表現載體的前述宿主細胞之培養上清回收，可以回收從抗體Fc區域所結合之N-配糖體結合複合型糖鏈還原末端之N-乙醯基葡萄糖胺將岩藻糖殘基除去而得之抗表皮調節素抗體。
(3)含有加成了二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區域的抗表皮調節素抗體
作為本發明之抗表皮調節素抗體之一非限定態樣，含有加成了二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區域之抗表皮調節素抗體亦為理想例。具有含二分化GlcNAc結構之糖鏈的抗體(WO2002/079255等)為公知。具有形成含二分化GlcNAc結構之糖鏈之活性之宿主細胞，可用於製作加成了含二分化GlcNAc結構之糖鏈的抗體。非限定之一理想態樣中，係製作表現編碼為具有GnTIII(β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶)(EC 2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖基轉移酶)(EC 2.4.1.38)活性之機能性蛋白質的基因的宿主細 胞。另一非限定之理想態樣中，係製作除了前述機能性蛋白質以外，尚共同表現編碼為具有人類ManII(甘露糖苷酶II)(3.2.1.114)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有GnTI(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶I)(EC 2.4.1.94)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有GnTII(β-1,2-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶II)(EC 2.4.1.143)活性之機能性蛋白質之基因、編碼為具有ManI(甘露糖苷酶)(EC 3.2.1.113)活性之機能性蛋白質之基因、及α-1,6-岩藻糖基轉移酶(EC 2.4.1.68)之宿主細胞(WO2004/065540)。具有形成含有如前述二分化GlcNAc結構之糖鏈之活性之宿主細胞，可藉由對於CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、HEK293細胞、或融合瘤細胞等轉形含前述機能性蛋白質之基因的表現載體以製作。
藉由從已轉形含抗表皮調節素抗體基因之表現載體的前述宿主細胞之培養上清回收，可回收含有已加成二分化N-乙醯基葡萄糖胺之Fc區域的抗表皮調節素抗體。為了解析於抗體連結之糖鏈結構，可使用公知方法。一非限定態樣中，藉由使N-Glycosidase F(Roche diagnostics)作用於本發明之抗表皮調節素抗體，使抗表皮調節素抗體所結合之糖鏈從蛋白質游離(J.Pharm.Sci.(1994)83(12),1670-1675)。在使用乙醇去除蛋白質之操作後(J.Clin.Invest.(2001),108(11),1687-95)，將游離糖鏈濃縮乾固，其次以2-胺基吡啶或2-胺基苯甲醯胺施以螢光標識(Anal.Biochem.(1995)230(2),229-238)。將獲得之2-AP化糖鏈或2-AB化糖鏈利用使用纖維素匣之固相萃取予 以脫試藥後以離心分離濃縮，製作精製2-AB化糖鏈供以後之解析。其次使β-Galactosidase(生化學工業)作用於精製2-AB化糖鏈，以製備無無半乳糖基2-AB化糖鏈。以從本發明之抗表皮調節素抗體游離之糖鏈作為出發材料所製備的無半乳糖基2-AB化糖鏈，利用醯胺管柱TSKgel Amide-80(東曹)以順相HPLC分析，並比較其層析圖。
又，據報告抗體之Fc區域與FcgR間的交互作用強度取決於Zn2+離子濃度(Immunology Letters 143(2012)60-69)。抗體之Fc區域之zn2+離子濃度愈高，則Fc區域與FcgR間的交互作用愈增強。藉由以抗體之Fc區域之CH3存在之His310、His435將Zn2+螯合，位於遠位之Fc區域之各CH2分域打開。藉此，CH2分域與FcgR容易交互作用，Fc區域與FcgR之交互作用增強。作為本發明之抗體之一非限定態樣，可列舉EU編號表示之310位之His、435位之His、433位之His及/或434位之Asn的zn2+被螯合之抗體。
抗體藥物複合體(Antibody-Drug Conjugate)
作為本發明之抗表皮調節素抗體之一非限定態樣，也可適當列舉於抗表皮調節素抗體連結具有細胞毒性之藥物的抗表皮調節素抗體藥物複合體為理想例。抗體藥物複合體(Antibody-Drug Conjugate)，以下在本說明書有時也稱為ADC。更具體而言，本發明使用之抗表皮調節素抗體藥物複合體，可以與增殖抑制劑、或毒性胜肽或放射性化學物質等細胞毒性物質適當連結。本發明中，放射性化學物質係指包括放射性同位體之物質。放射性同位體不特別限定，可使用任意放射 性同位體，可使用例如：32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Re等。如此之抗表皮調節素抗體藥物複合體，可藉由對於獲得之抗表皮調節素抗體施以化學性修飾而得到。亦即，以增殖抑制劑或細胞毒性物質與抗表皮調節素抗體能彼此化學性共軛(例可共價鍵)的方式，連結子分子將增殖抑制劑或細胞毒性物質經由化學鍵(如上述)而與抗體連結。
較佳為結合劑(連結子)係可切斷的連結子。更佳為在溫和條件(亦即，藥物活性不受影響之細胞內條件)之下將連結子切斷。適合的可切斷的連結子，例如二硫醚連結子、對酸不安定之連結子、對光不安定之連結子、對肽解酶不安定之連結子、及對酯酶不安定之連結子。含二硫醚之連結子，係可利用於生理學的條件之下會發生之二硫醚交換切斷之連結子。對酸不安定之連結子，係能於酸性pH切斷之連結子。例如在內體及溶體此種特定之細胞內隔間，具有酸性pH(pH4~5)且提供將酸不安定之連結子切斷之適合條件。光不安定之連結子，於可暴露於光之體表面及許多體腔為有用。又，紅外線光能透過組織。對肽解酶不安定之連結子，可用於將細胞內或外之特定胜肽切斷(例如參照Trouet等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79,626-629、及Umemoto等人Int.J.Cancer(1989)43,677-684)。
如此的ADC，除了前述化學性修飾以外，也可以認識增殖抑制劑、或毒性胜肽或放射性化學物質等細胞毒性物質之方式使用基因重組技術設計之雙專一性抗體(bispecific antibody)之類的分子型取得。本發明中，「抗表皮調節素抗體」 也包括該等抗體。
又，本發明提供之抗表皮調節素抗體藥物複合體之一非限定態樣，也可列舉經蓖麻蛋白、相思豆毒素(Abrin)、核糖核酸酶(ribonuclease)、Onconase、DNase I、金黃色葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal enterotoxin A)、商陸(Pokeweed)抗病毒蛋白、白樹種子儲藏蛋白(Gelonin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、假單胞菌內毒素(Pseudomonas endotoxin)、L-天冬醯胺酶(L-asparaginase)、PEG L-天冬醯胺酶等毒性胜肽修飾之抗表皮調節素抗體。又，另一態樣中，可將一或二以上之增殖抑制劑與毒性胜肽等細胞毒性物質分別組合，而使用在抗表皮調節素抗體之修飾。如前述，抗表皮調節素抗體與上述增殖抑制劑、或毒性胜肽或放射性化學物質等細胞毒性物質間的連結，可利用共價鍵或非共價鍵。此等連接有增殖抑制劑、或毒性胜肽或放射性化學物質等細胞毒性物質的ADC之製作方法係為公知。例如將抗表皮調節素抗體與增殖抑制劑、或毒性胜肽或放射性化學物質等細胞毒性物質直接結合時，連結基例如在連結時利用SH基之雙硫鍵。具體而言，可將利用還原劑例如二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)等將其Fc區域之分子內雙硫鍵還原而得之抗表皮調節素抗體、及其分子內之雙硫鍵同樣經還原之增殖抑制劑、或細胞毒性物質，以雙硫鍵予以連結。連結前可以用活化促進劑、例如Ellman試藥(Ellman's reagent)使抗體或增殖抑制劑、或細胞毒性物質中之任一者活化，促進兩者之間之雙硫鍵形成。將抗表皮調節素抗體與增殖抑制劑、或毒性胜肽 或放射性化學物質等細胞毒性物質直接結合之其他方法，例如：使用希夫鹼(schiff base)之方法、碳二醯亞胺法、活性酯法(N-hydroxysucccinimide法)、使用混合酐(Mixed anhydride)之方法、使用重氮反應之方法等作為非限定之理想例。
本發明可使用之毒性胜肽，例如可列舉以下者。
-白喉毒素A鏈(Diphtheria toxin A Chain)(Langone等人(Methods in Enzymology(1993)93,307-308)
-假單胞菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin)(Pai等人(Nat.Med.(1996)2(3),350-353)
-蓖麻蛋白鏈(Ricin A Chain)(Fulton等人(J.Biol.Chem.(1986)261,5314-5319)、Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、Gheeite等人(J.Immunol.Methods(1991)142,223-230))
-無糖鏈蓖麻蛋白A鏈(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe等人(Cancer Res.(1987)47,5924-5931)
-相思豆毒素A鏈(Abrin A Chain)(Wawrzynczak等人(Br.J.Cancer(1992)66,361-366)、；Wawrzynczak等人(Cancer Res(1990)50,7519-7562)、Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Thorpe等人(Cancer Res.(1987)47,5924-5931)
-白樹種子儲藏蛋白(Gelonin)(Sivam等人(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50, 7519-7562)、Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346))
-商陸抗病毒蛋白(PAP-s或Pokeweed anti-viral protein fromseeds)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992),89,341-346))
- Briodin(Briodin)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346))
-皂草毒蛋白(Saporin)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992),89,341-346))
-苦瓜毒蛋白(Momordin)(Cumber等人(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、(Wawrzynczak等人(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)
-木鳖毒蛋白(Momorcochin)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)
-香石竹毒蛋白32(Dianthin 32)(Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)
-香石竹毒蛋白30(Dianthin 30)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-蒴蓮根毒蛋白(Modeccin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-檞寄生素(Viscumin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
- Volkesin(Volkesin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195, 1-8)
-商陸毒蛋白(Dodecandrin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
- Tritin(Tritin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-絲瓜籽毒蛋白(Luffin)(Stirpe等人(FEBS Let.(1986)195,1-8)
-括樓種子毒蛋白(Trichokirin)(Casellas等人(Eur.J.Biochem.(1988)176,581-588)、Bolognesi等人(Clin.Exp.Immunol.(1992)89,341-346)
蛋白質或胜肽性之藥劑或毒素，也可利用基因工程的方法與抗表皮調節素抗體連結。具體而言，可建構例如編碼為上述毒性胜肽之DNA與編碼為本發明之抗表皮調節素抗體之DNA於讀框內融合而得之重組DNA納入表現載體中之重組載體。培養將該載體導入適當宿主細胞而獲得之轉形細胞，並將已納入之DNA於該細胞中表現。從前述培養液單離及精製，獲得連結有毒性胜肽之抗表皮調節素抗體藥物複合體。獲得與抗體之融合蛋白質之情形，一般多將該等DNA連結使在抗體之C末端側配置蛋白質性之藥劑或毒素，但不限於此等。抗體、與蛋白質性藥劑或毒素之間，也可***有胜肽連結子。
增殖抑制劑
一非限定態樣中，增殖抑制劑可舉DNA損傷劑、抗有絲***劑及/或代謝拮抗劑為理想例。DNA損傷劑，可為烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑及/或DNA嵌入劑。卡鉑(carboplatin)(DNA烷基化劑)、依托泊苷(etoposide)(拓樸異構 酶II之抑制劑)、多柔比星(doxorubicin)(DNA嵌入劑)、多西他賽(Docetaxel)(抗有絲***劑)及Gemzar(吉西他濱(Gemcitabine)、代謝拮抗劑)等可作為非限定之理想增殖抑制劑。
烷基化劑可從以下至少1種選擇。亦即，可使用從苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、環磷醯胺、異環磷醯胺(Ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、馬法蘭(melphalan)、尿嘧啶芥末(Uracilmustard)、塞替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、賽特鉑(Satraplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、六甲蜜胺(altretamine)、ET-743、XL119(becatecarin)、達卡巴嗪(Dacarbazine)、chlormethine、苯達莫司汀(bendamustine)、trofosfamide、Uramustine、Fotemustine、尼莫司汀(Nimustine)Puredonimusuchin、ranimustine，司莫司汀(semustine)、Nedaplatin、tetranitrotriplatin、mannosulfan、Treosulfan、temoZolomide,carboquone、Triaziquone、三伸乙基三聚氰胺及甲基芐肼(Procarbazine)等選擇之至少一種烷基化劑。
拓樸異構酶抑制劑，可從以下至少一種選擇。可使用從多柔比星(Doxil)、柔紅黴素(Daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、蒽二酮(Novantrone)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、絲裂黴素(mitomycin)C、博萊黴素(Bleomycin)、更生黴素(dactinomycin)、preCardelmycin、伊立替康(irinotecan)(Camptosar)、喜樹鹼(Camptothecin)、 Rubitecan、belotecan、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)及topotecan(Hycamptin)等選擇之至少一種拓樸異構酶抑制劑。
DNA嵌入劑，可使用從Proflavine、多柔比星(doxorubicin)(阿黴素)、柔紅黴素(Daunorubicin)、放線菌素D(dactinomycin)及沙利度胺(Thalidomide)等選擇之至少一種DNA嵌入劑。
抗有絲***劑，可從以下至少一種選擇。可使用從紫杉醇(Paclitaxel)(Abraxane)/Taxol、多西他賽(Docetaxel)(Taxotere)、BMS-275183、Xyotax、Tocosal、Binorurebin(vinorlebine)、長春新鹼(Vincristine)、長春花鹼(Vinblastine)、長春地辛(Vindesine)、vinzolidine、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷(VM-26)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、larotaxel、Ortataxel、tesetaxel(tesetaxel)及Ispinesib等選擇之至少一種抗有絲***劑。
代謝拮抗劑，可從以下至少一種選擇。可使用從氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(Floxuridine)(5-FUdR)、氨甲喋呤(Methotrexate)、Xeloda、Arranon、亞葉酸鈣(Leucovorin)、羥基尿素、硫鳥嘌呤(Thioguanine)(6-TG)、巰基嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷(Cytarabine)、噴司他丁(pentostatin)、磷酸氟達拉濱(Fludarabine)、克拉屈濱(Cladribine)(2-CDA)、天冬醯胺酶(Asparaginase)、吉西他濱(Gemcitabine)、培美曲塞(Pemetrexed)、硼替佐米(Bortezomib)、胺基蝶呤、雷替曲塞(Raltitrexed)、氯法拉濱(Clofarabine)、依諾他濱(Enocitabine)、 sapacitabine及氮雜胞苷(Azacytidine)等選擇之至少一種代謝拮抗劑。
抗表皮調節素抗體藥物複合體當攝入細胞內的情形，可藉由與該複合體連結之增殖抑制劑或毒性胜肽等細胞毒性物質對於攝入該抗體之細胞誘導細胞死。因此，已連結增殖抑制劑或毒性胜肽等細胞毒性物質之抗體宜更有內化活性較佳。本發明中，「具有內化活性之抗體」，係指於細胞表面上之表皮調節素結合時，輸送到細胞內(細胞質內、小胞內、其他小器官內等)之抗體。抗體是否有內化活性，可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法確認。例如可利用以下方法：使已結合標識物質之抗表皮調節素抗體接觸表現表皮調節素之細胞，確認是否該標識物質攝入細胞內之方法、將已有增殖抑制劑或毒性胜肽等細胞毒性物質結合之抗表皮調節素抗體接觸表現表皮調節素之細胞之結果，確認對於該表皮調節素表現細胞是否誘導細胞死之方法等。更具體而言，可利用下列實施例記載之方法等來確認抗體是否有內化活性。
具有ADCC等細胞毒性之抗體與在細胞表面表現之標靶抗原結合後，藉由對該抗原之結合而停留於細胞表面，使得NK細胞等效應子細胞與該抗體之Fc區域結合，結果該效應子細胞對於表現標靶抗原之細胞引起細胞傷害。相對於此，作為ADC使用之抗體與抗原結合後，宜內化於細胞內較佳。從前述作用機轉所推定，可認為：通常利用ADCC等細胞毒性傷害標靶細胞之抗體之內化活性宜小較佳，作為ADC傷害標靶細胞之抗體之內化活性宜大較佳(Anticancer Research (1993)13,2207-2212)。相對於此，意外地發現：本申請案之抗表皮調節素抗體，不僅由其中和活性發揮表現表皮調節素之細胞之增殖抑制，且利用ADCC等細胞毒性對於表現表皮調節素之細胞引起細胞傷害，而且包含本申請案之抗表皮調節素抗體之抗體藥物複合體也對表現表皮調節素之細胞引起細胞毒性。
低分子抗體
一非限定態樣中，本發明之抗表皮調節素抗體藥物複合體所含之抗表皮調節素抗體也可為低分子抗體。低分子抗體，包括全長抗體(whole antibody、例如whole IgG等)有部分缺損之抗體片段。只要有對表皮調節素抗原之結合活性，則容許抗體分子部分缺損。本發明中的抗體片段，宜包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)中之任一者、或兩者較佳。VH或VL之胺基酸序列可包含取代、缺失、加成及/或***。又，只要具有對表皮調節素抗原之結合活性，則VH及VL中之任一者、或兩者部分缺損亦可。又，可變區可嵌合化或人型化。抗體片段之具體例，例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等。又，低分子抗體之具體例，例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv(single chain Fv)、雙體抗體(Diabody)、sc(Fv)2(single chain(Fv)2)等。該等抗體之多量體(例如：二聚體、三聚體、四聚體、聚合物)也包括在本發明之低分子抗體。
低分子抗體，可藉由將抗體以酵素處理使生成抗體片段而獲得。生成抗體片段之酵素，例如木瓜酶、胃蛋白酶、或纖溶酶等為公知。或，可藉由培養導入有已***編碼為該等抗體片段之基因的表現載體的適當宿主細胞，並將表現之抗體 片段從細胞培養液單離及精製而取得(例如參考Co等人(J.Immunol.(1994)152,2968-2976、Better等人(Methods in Enzymology(1989)178,476-496)、Plueckthun等人(Methods in Enzymology(1989)178,476-496)、Lamoyi(Methods in Enzymology(1989)121,652-663)、Rousseaux等人(Methods in Enzymology(1989)121,663-669)、Bird等人(TIBTECH(1991)9,132-137))。
雙體抗體係指利用基因融合而建構之二價(bivalent)抗體片段(Holliger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,6444-6448、EP404,097、WO1993/11161等)。雙體抗體，係由二條多胜肽鏈構成之二聚體。通常，構成二聚體之多胜肽鏈分別在相同鏈中以VL及VH之連結子結合。雙體抗體中的連結子，一般係VL與VH無法彼此結合之程度之短。具體而言，構成連結子之胺基酸殘基，例如：約5個殘基。所以，在同一多胜肽鏈上編碼之VL與VH，無法形成單鏈可變區片段，而會與其他單鏈可變區片段形成二聚體。其結果，雙體抗體成為有二個抗原結合部位。
scFv可藉由將抗體之H鏈V區域與L鏈V區域連結以取得。具體而言，scFv可藉由將H鏈V區域與L鏈V區域經由連結子，較佳為胜肽連結子予以連結而製作(Huston等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,(1988)85,5879-5883)。scFv中，H鏈V區域及L鏈V區域，也可為在本說明書作為抗體記載之抗表皮調節素抗體之任意抗體來源。將V區域連結之胜肽連結子，無特別的結構或性質限制。例如可使用由3各至25個殘基左 右構成的任意單鏈胜肽作為連結子。
sc(Fv)2，係將二個VH及二個VL以連結子等結合成單鏈的低分子抗體(Hudson等人(J.Immunol.Methods(1999)231,177-189)。sc(Fv)2，例如可將scFv以連結子連結而製作。
醫藥組合物
於其他觀點中，本發明提供包含本發明之抗表皮調節素抗體作為有效成分之醫藥組合物。又，本發明係關於包含抗表皮調節素抗體作為有效成分之細胞增殖抑制劑，尤其關於抗癌劑或癌症復發或轉移抑制劑。本發明之細胞增殖抑制劑及抗癌劑或癌症復發或轉移抑制劑，宜對於正罹癌之對象或現在或未來可能罹癌之對象投予較佳。
本發明中，包含抗表皮調節素抗體作為有效成分之細胞增殖抑制劑，也可表達為包含將抗表皮調節素抗體對於對象投予之步驟之抑制細胞增殖之方法、或在細胞增殖抑制劑之製造時使用抗表皮調節素抗體、或用於抑制細胞增殖使用之抗表皮調節素抗體。
又，本發明中，包含抗表皮調節素抗體作為有效成分之抗癌劑或癌症復發或轉移抑制劑，也可表達為包含將抗表皮調節素抗體對於對象投予之步驟之預防或治療癌之方法或抑制癌復發或轉移之方法、或在抗癌劑或癌復發或轉移抑制劑之製造時使用抗表皮調節素抗體、或用以預防或治療癌或抑制癌復發或轉移所使用之抗表皮調節素抗體。
本發明中，包含抗表皮調節素抗體作為有效成分，係指包含抗表皮調節素抗體作為主要活性成分，抗表皮調 節素抗體之含有率不限。本發明之醫藥組合物(例如：本發明之細胞增殖抑制劑、抗癌劑。以下同。)含有之抗體，只要能與表皮調節素蛋白質結合即可，不特別限制，可列舉本說明書中記載之抗體。
本發明之醫藥組合物，可經口、非經口投予中之任一者對對象(患者)投予。較佳為非經口投予。該投予方法具體而言，可列舉注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予，例如可利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等將本發明之醫藥組合物對全身或局部投予。又，可因應患者年齡、症狀選擇適當投予方法。投予量例如每次就體重1 kg以0.0001 mg至1000 mg之範圍選擇投予量。或例如每名患者以0.001 mg/體重至100000 mg/體重之範圍選擇投予量。但是本發明之醫藥組合物，不限於該等投予量。
本發明之醫藥組合物、細胞增殖抑制劑或抗癌劑，可依常法製劑化(例如Remington's Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)，可同時含有醫藥上可容許的擔體或添加物。例如界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存劑、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。又，不限於該等，可適當使用其他常用擔體。具體而言，可使用輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯基乙縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化篦麻子油60、 白糖、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽類等作為擔體。
抗表皮調節素抗體，作為本發明之醫藥組合物含有之與表皮調節素蛋白質結合之抗體而言如前述。抗表皮調節素抗體結合之細胞，只要是表現表皮調節素之細胞即可，不特別限定。本發明之理想表皮調節素表現細胞為癌細胞。更佳為大腸癌細胞、肺腺癌細胞、胰臟癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、及腎癌細胞。本發明之方法，也可對該等癌之原發病灶及轉移病灶任一者適用。更理想之癌細胞為原發性大腸癌細胞、轉移性大腸癌細胞、及胰臟癌細胞。
本發明中，「接觸」可藉由對於例如試驗管內培養之表皮調節素表現細胞之培養液添加抗體以實施。於此情形，添加之抗體之形狀可適當使用溶液或以冷凍乾燥等獲得之固體等形狀。以水溶液形式添加時，可為僅純粹含抗體之水溶液，也可為含有例如上述記載之界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等之溶液。添加之濃度不特別限定，就培養液中之最終濃度較佳為1 pg/mL至1 g/mL之範圍，更佳為1 ng/mL至1 mg/mL，又更佳為1μg/mL至1 mg/mL。
又，本發明中「接觸」就另一態樣，可藉由對於在體內移殖表皮調節素表現細胞之非人類動物或內在具有表現表皮調節素之癌細胞的動物投予抗體以進行。投予方法可利用經口、非經口投予中之任一者實施。特佳為利用非經口投予之投予方法，該投予方法具體而言，可列舉注射投予、經鼻投 予、經肺投予、經皮投予等。注射投予，例如利用靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等將本發明之醫藥組合物細胞增殖抑制劑及抗癌劑進行全身或局部投予。又，可依待驗動物之年齡、症狀選擇適當投予方法。以水溶液形式投予時，可為純粹僅含抗體之水溶液，也可為含有例如上述記載之界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、保存料、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張化劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等之溶液。投予量，例如：就一次投予體重每1 kg選擇0.0001 mg至1000 mg之範圍的投予量。或例如每名患者從0.001至100000 mg/body之範圍選擇投予量。但是本發明之抗體投予量不限於該等投予量。
對於含有表現表皮調節素蛋白質之癌細胞的對象投予之癌治療劑或癌症之復發或轉移之抑制劑
本發明並提供癌治療劑或癌症復發或轉移之抑制劑投予之對象係包含表現於單離之組織標本檢測到之表皮調節素蛋白質的癌細胞的對象之癌治療劑或癌症復發或轉移之抑制劑。表皮調節素蛋白質之表現量除了本說明書記載之方法以外，尚可由該技術領域中具有通常知識者公知之方法決定。為了決定是否為本發明之癌治療劑或癌症復發或轉移之抑制劑投予之對象，可決定從對象之候選者單離之組織標本中的表皮調節素蛋白質之表現量。若該標本可檢測到表皮調節素蛋白質，則該標本之來源對象可成為本發明之癌治療劑或癌症復發或轉移之抑制劑投予的對象。表皮調節素蛋白質之表現量不限於特定數值，就非限定態樣可從103、104、105、106、107、108 之數值的位數(order)之範圍適當設定。作為一非限定態樣，可從1x103、2x103、3x103、4x103、5x103、6x103、7x103、8x103、9x103、1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、9x108中之任一者選擇表皮調節素蛋白質之表現量可作為用以選擇投予之對象用的基準可設定之數值(閾值)之理想例。上述數值可為就有效數字一位數算得之數值，但於此情形，例如以有效數字一位數算得之EREG之表現量為1x103，以有效數字為二位數計算之情形EREG之表現量有包含0.5x103、0.6x103、0.7x103、0.8x103、0.9x103、1.0x103、1.1x103、1.2x103、1.3x103、1.4x103中之任一者之數值的情況。
組織標本
本發明使用之用語「組織標本」，係指從個體、體液(例如：血液、血清、血漿、及髓液)、組織培養物或組織切片等獲得之任意生物學的標本。可作為生物學的標本使用者，可列舉待驗體標本為理想例。理想之待驗體標本係從待驗體獲得之組織，更佳為待驗體之大腸組織。取得大腸組織之方法可理想地使用公知之方法，即生檢(biopsy)。生檢方式可適當採用公知方法。如此之例，可列舉吸引生檢、夾取生檢、擦拭生檢、細胞診用生檢、內視鏡生檢、細針吸引生檢、針生檢、經支氣管 的肺生檢等生檢(biopsy)，或於外科手術時獲得。
本發明中，組織標本為了於顯微鏡下以穿透光觀察，係將組織標本薄切至顯微鏡使用之光線能充分穿透的程度。薄切的前階段係將組織標本固定。亦即，使組織‧細胞之蛋白質脫水或發生改性而使凝固，而使構成組織之細胞快速死滅，且其結構安定化及不溶化。首先，將成為固定對象之組織標本以手術刀等刀具切取成製於適作石蠟包埋切片的大小及形狀片段。其次，為了實施固定，將該片段於使用之試藥固定液中浸漬。固定液，宜使用福馬林，又更佳為中性緩衝福馬林。中性緩衝福馬林之濃度可因應組織標本之特性或物性適當選擇。濃度為可於1~50%，較佳為5~25%，又更佳為10~15%之間適當變更並使用。將浸有組織標本之固定液使用真空泵浦適當脫氣。固定係將組織標本於常壓及室溫條件下在固定液中放置數小時間以實施。固定須要之時間為1小時至7日，較佳為2小時至3日，又較佳為3小時至24小時，又更佳為在4小時至16小時之範圍適當選擇。固定後可於磷酸緩衝液等再適當浸漬數小時(可於2小時至48小時，較佳為3小時至24小時，又更佳為4小時至16小時之範圍適當選擇之時間)。
其次從固定適用之組織標本，使用冷凍切片法或石蠟切片法可理想地製作切片。冷凍切片法之理想例，可列舉在O.C.T.compound(Miles.Inc)中投入組織並使冷凍後使用Cryostat(冷凍切片製作裝置)薄切之方法。石蠟切片法中，係藉由將固定適用之組織標本浸漬於包埋劑並固定，而賦予均勻且適當的硬度。包埋劑可理想地使用石蠟。固定適用之組織標 本，可使用乙醇脫水。具體而言，將組織標本依序浸於70%乙醇、80%乙醇、100%乙醇，可將該組織標本脫水。浸漬花費的時間及次數可從1小時至數日及1次至3次之範圍適當選擇。又，於室溫或4℃都可浸漬，但於4℃浸漬的情形，浸漬時間宜為終夜等時間較長為佳。其次將其液相取代為二甲苯後，將組織標本以石蠟包埋。其液相取代為二甲苯花費的時間可從1小時至數時間之範圍適當選擇。此時，可於室溫取代，也可於4℃取代，但於4℃取代的情形，取代之時間宜為終夜等時間較長者較佳。石蠟包埋花費的時間及次數，可從1小時至數小時及1次至4次之範圍適當選擇。此時，可於室溫包埋，也可於4℃包埋，但於4℃包埋的情形，包埋時間宜為終夜等時間較長者較佳。又，石蠟包埋反應可使用藉由自動化處理之石蠟包埋裝置(EG1160、Leica等)，將組織標本理想地包埋於石蠟。
將以上述方式進行石蠟包埋的組織標本黏於標本台，製成「塊體」，將該塊體以微切刀薄切為從1至20μm之厚度選擇的理想厚度。將已薄切之組織切片靜置於穿透性之支持體即載玻片上使固定。於此情形，為了防止組織切片剝離，也可理想地使用於載玻片塗佈0.01%聚-L-離胺酸(Sigma)並使乾燥而得之載玻片。將已固著的組織切片以從數分鐘至1小時之間選擇之適當時間風乾。
抗原賦活化
本發明之方法中，將與利用福馬林固定之抗體之反應性已減弱之抗原之反應性賦活化。本發明中，對於二個組織標本其中一標本，應用蛋白酶抗原賦活化法(PIER法)，並對另一標本 應用熱誘導抗原賦活化法(HIER法)，將與抗體反應時兩者間之染色程度之差異予以數值化。
熱誘導抗原賦活化法，可適當使用利用微波之加熱方法或利用高壓釜之加熱方法、或利用煮沸處理之加熱方法等。當以液溫保持在約98℃，以780W之輸出進行煮沸處理時，處理等賦活化花費之時間可從5分鐘-60分鐘之間適當選擇，例如10分鐘。抗原之賦活化處理，除了10mM檸檬酸鈉緩衝液以外，可於市售之Target Retrieval Solution(DakoCytomation)等中進行。於下列實施例係使用Target Retrieval Solution。賦活化處理之結果為獲得表皮調節素抗體認識之抗原中之抗原決定部位與抗體之結合性且若可檢測到後述抗原與抗體之複合體，則任一緩衝液、水溶液均可理想地使用。
蛋白酶抗原賦活化法使用之蛋白酶，針對其種類或來源不特別限定，可適當選擇一般可取得之蛋白酶並使用。使用之蛋白酶，例如0.01N鹽酸中0.05%濃度之胃蛋白酶、或在pH7.6之Tris緩衝液中更含有0.01%濃度之CaCl2的0.1%濃度之胰蛋白酶、含有10mM之EDTA及0.5%之SDS之pH7.8之10mM Tris鹽酸緩衝液中之1~50μg/ml濃度之蛋白酶K等為理想例。又，使用蛋白酶K的情形，其反應液之pH可從6.5至9.5之間適當選擇，也可適當使用SH試藥或胰蛋白酶抑制劑或胰凝乳蛋白酶抑制劑。本說明書實施例中記載之Histofine HER2套組(MONO)(NICHIREI BIOSCIENCE)附帶的蛋白酶也可作為如此的理想蛋白酶之具體例。蛋白酶抗原賦活化通常於37℃進行，但反應溫度可於25℃至50℃之範圍內適當變更。 蛋白酶抗原賦活化於37℃進行的情形，反應時間可於例如1分鐘至5小時之間適當選擇，例如：15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時等。賦活化處理結束後，將已施以該處理之組織標本以洗滌用緩衝液洗滌。洗滌用緩衝液可理想地使用PBS(Phosphate buffer saline)，此外，也可理想地使用Tris鹽酸緩衝液。通常，洗滌條件係採用於室溫實施3次5分鐘洗滌之方法，但洗滌時間及溫度可適當改變。
本發明使用之檢測用物質，通常可列舉抗體、核酸等。例如：(1)使用能檢測EREG蛋白質之EREG抗體依免疫學手法檢測EREG蛋白質、(2)使用於能檢測編碼為EREG之mRNA之該mRNA為互補的核酸分子(例如DNA、RNA、mRNA)等，但理想為互補的核酸分子，可利用相關核酸分子彼此的雜交來檢測編碼為EREG之mRNA(例如FISH法)。本發明中，宜使用免疫學的手法，尤其組織免疫學染色法。
組織標本與表皮調節素抗體之反應
對於經以熱誘導抗原賦活化法實施抗原賦活化處理而得之組織標本及經以蛋白酶抗原賦活化法實施抗原賦活化處理而得之組織標本，以表皮調節素抗體作為一次抗體使反應。該反應係於為了使表皮調節素抗體認識抗原中之抗原決定部位而形成抗原抗體複合體為適當之條件下實施。通常該反應於4℃實施終夜、或於37℃實施1小時，但反應條件可在對於抗體認識抗原中之抗原決定部位並形成抗原抗體複合體為適當的範圍內適當改變。例如：反應溫度可於4℃至50℃之範圍內改變，反應時間可從1分鐘至7日之間變更。於低溫實施反應 時，宜反應長時間較佳。一次抗體反應結束後，將組織標本以洗滌用緩衝液洗滌。洗滌用緩衝液可理想地使用PBS(Phosphate buffer saline)，此外也可理想地使用Tris鹽酸緩衝液。通常洗滌條件採用於室溫進行5分鐘洗滌3次之方法，但洗滌的時間及溫度可適當變更。
其次，對於已施以一次抗體反應之組織標本，使認識一次抗體之二次抗體反應。通常，係使用經以用以使二次抗體可見化之標識物質予以預先標識之二次抗體。標識物質，理想例有FITC(螢光素異硫氰酸酯)或Cy2(Amersham)、Alexa488(Molecular Probe)等螢光色素、過氧化酶或鹼性磷解酶等酵素、或金膠體等。
與二次抗體之反應，係於為了使表皮調節素抗體、與認識該表皮調節素抗體之二次抗體形成抗原抗體複合體為適當的條件下實施。通常該反應係於室溫或於37℃實施30分鐘至1小時，但為了使表皮調節素抗體與二次抗體形成抗原抗體複合體，可於適當的範圍適當變更。例如：反應溫度可從4℃至50℃之範圍內變更，反應時間可從1分鐘至7日之間變更。於低溫實施反應，宜反應長時間較佳。二次抗體反應結束後，將組織標本以洗滌用緩衝液洗滌。洗滌用緩衝液可理想地使用PBS(Phosphate buffer saline)，此外也可理想地使用Tris鹽酸緩衝液。通常洗滌條件採用於室溫實施5分鐘洗滌3次之方法，但洗滌時間及溫度可適當變更。
其次，對於已施以二次抗體反應之組織標本，使將標識物質可見化之物質反應。二次抗體之標識物質使用過氧 化酶時，係將0.02%過氧化氫水與pH7.2之0.1MTris鹽酸緩衝液調整為0.1%濃度之DAB(二胺基聯苯胺)溶液於即將溫育時等量混合，以獲得之反應液將組織標本溫育。DAB以外，可適當選擇DAB-Ni或AEC+(以上、DAKO)等成色基質。溫育過程中，偶爾於顯微鏡下觀察成色的程度，於已確認適當成色的階段將組織標本以PBS浸漬，使可見化反應中止。
二次抗體之標識物質當使用鹼性磷解酶時，係於BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)/NBT(硝基藍四唑鎓鹽)(Zymed)基質溶液(含10mM濃度之MgCl2及28mM濃度之NaCl的pH9.8的50mM碳酸鈉緩衝液，以0.4mM濃度溶解NBT及以0.38mM濃度溶解BCIP者)將組織標本溫育。又，BCIP及NBT以外，也可適當使用Permanent Red、Fast Red、或Fuchsin+(以上、DAKO)等。在溫育前，將1mM濃度之內在性鹼性磷解酶之抑制劑即氯化levamisole(NACALAI TESQUE)、含有0.1M氯化鈉及50mM氯化鎂之0.1MTris-鹽酸緩衝液(pH9.5)，於室溫預溫育1分鐘至數小時亦可。溫育過程，偶爾於顯微鏡下觀察，於觀察到反應最終產物紫色甲臢(formazan)之沉澱的階段，將組織標本水洗或以含2%聚乙烯醇之TBS使反應停止後，以TBST(含0.1%之Tween20之TBS)洗滌。當金膠體作為二次抗體之標識使用的情形，可藉由銀增感使金粒子附著金屬銀，而使金膠體可見化。銀增感之方法對該技術領域中具有通常知識者為公知。
當將FITC(螢光素異硫氰酸酯)或Cy2(Amersham)、Alexa488(Molecular Probe)等螢光色素作為二 次抗體之標識物質使用的情形，不須可見化物質之反應步驟，可藉由照射該螢光物質之激發波長之光，將放出之光使用螢光顯微鏡適當檢測。
本發明中，係檢測如上述從待驗對象單離之組織標本所含之表皮調節素蛋白質。檢測之該組織標本所含之表皮調節素蛋白質是否在含癌細胞之組織中為高表現，可由上述組織免疫學的染色法得到的染色圖案經數值化之染色強度分數判定。染色圖案數值化之一非限定態樣，例如可例示如下列判定基準。
-染色強度分數0：檢體組織中之腫瘤細胞之中無呈表皮調節素陽性之細胞。或低於10%
-染色強度分數1：檢體組織中之腫瘤細胞之中呈表皮調節素陽性之細胞有10%以上，係局限在腫瘤細胞之一部分膜的弱染色強度者
-染色強度分數2：檢體組織中之腫瘤細胞之中呈表皮調節素陽性之細胞有30%以上，或檢體組織中之腫瘤細胞之中呈表皮調節素陽性之細胞有10%以上，係局限在腫瘤細胞之膜之中程度之染色強度
-染色強度分數3：檢體組織中之腫瘤細胞之中呈表皮調節素陽性之細胞有60%以上，或檢體組織中之腫瘤細胞之中呈表皮調節素陽性之細胞有10%以上，係局限在腫瘤細胞之膜之強度之染色強度者
又，本發明中，依上述組織免疫學的染色法獲得之染色圖案經數值化而得之染色強度分數，進行從待驗對象單 離之組織標本所含之表皮調節素之表現量之判定時，也可以與製備為檢測校正用之預先已決定表皮調節素蛋白質之表現量之染色圖案之圖像比較。表皮調節素蛋白質之表現量之決定，可適當使用為了抗原定量之檢量線所使用之螢光標識珠粒之公知手法(例如：BD Quantibrite PETM等)。
依上述方法可決定從待驗對象單離之組織標本所含之表皮調節素是否為高表現。高表現，例如：換算為每一細胞之表皮調節素分子之表現數時，可從1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x105、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107之範圍適當選擇。
又，本說明書引用的全部先前技術文獻，作為參照納入本說明書。
【實施例】
以下以實施例更具體的說明本發1明，但本發明不限於該等實施例。
[實施例1]嵌合抗體EP27之人型化
1-1.人型化用框架序列之選定
將由小鼠可變區與人類IgG1恆定區構成之嵌合抗體EP27(WO2008/047723記載)實施人型化。CDR、FR之決定係依循Kabat之定義(Kabat編號)。
首先，比較資料庫上之人類抗體可變區序列與 EP27小鼠可變區序列，選擇能作為人型化之模板利用的以下人類FR序列。資料庫利用IMGT Database(http：//www.imgt.org/)及NCBI GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。表2顯示選擇的FR序列。
其次藉由將EP27可變區之H鏈及L鏈之CDR序列(表3、序列編號：9~14)與上述選擇之人類FR連結，以設計人型化抗體可變區序列。將該等定為人型化H鏈可變區序列HA(序列編號：15)、人型化L鏈可變區序列LA(序列編號：16)。
1-2. EP27人型化可變區HJ之設計
於表2選擇之H鏈FR1之序列，據報告Kabat編號表示之2號、4號、24號、27號、29號之胺基酸殘基形成上部核(upper core)而有助於抗體結構之安定化(Ewert等人(Methods.2004 Oct；34(2)：184-99))。又，Chothia之定義中，Kabat編號表示之 26至30號之胺基酸殘基包括於CDR1(Honegger等人、J.Mol.Biol.(2001)309,657-670)。從該等資訊，為了製作具有與嵌合抗體EP27有同等抗原結合活性之人型化抗體，使上述相應之胺基酸殘基回復到EP27小鼠可變區序列存在之殘基。因此，重新設計表2選擇之人類H鏈FR1(序列編號：1)之Kabat編號表示之2號、24號、27號、28號、29號、30號之胺基酸殘基回復到EP27小鼠可變區序列存在之胺基酸殘基的人型化H鏈FR1(表4、序列編號：17)。
於表2選擇之H鏈FR3之序列，Kabat編號表示之93號之胺基酸殘基為Ala，但EP27小鼠可變區序列之胺基酸殘基為Val。從小鼠及人類之germline序列之資料庫IMGTDatabase(http：//www.imgt.org/)，已確認該部位含有Val之序列少的情事。EP27小鼠可變區序列所含之Kabat編號表示之93號之Val據認為涉及抗原結合，所以，重新設計表2選擇之人類H鏈FR3(序列編號：3)之Kabat 93號之胺基酸殘基取代為EP27小鼠可變區序列存在之殘基而得之人型化H鏈FR3(表4、序列編號：18)。
從人型化H鏈可變區序列HA(序列編號：15)重新設計的表4所示之含FR1(表4、序列編號：17)，並設計含FR3(表4、序列編號：18)之人型化H鏈可變區序列HJ(序列編號：19)。
1-3. EP27人型化可變區LB、L18之設計
於表2選擇之L鏈FR2之序列，Kabat編號表示之49號為Tyr，但EP27小鼠可變區序列中為Gln。從小鼠及人類之germline序列之資料庫IMGT Database(http：//www.imgt.org/)確認相應部位含有Gln之序列係少。因此，啟示EP27小鼠可變區序列所含之49號之Gln可能涉及抗原結合。因此，重新設計表2選擇之人類L鏈FR2(序列編號：6)之Kabat編號表示之49號之胺基酸殘基取代為EP27小鼠可變區序列之胺基酸殘基之人型化L鏈FR2(表5、序列編號：20)。
於表2選擇之L鏈FR3之序列，據報告Kabat編號表示之71號形成upper core並有助於抗體結構之安定化(Ewert等人(Methods.2004 Oct；34(2)：184-99))。為了製作與嵌合抗體EP27為同等抗原結合活性之人型化抗體，為了將上述相應的胺基酸殘基取代為EP27小鼠可變區序列之胺基酸殘基，重新設計表2選擇之人類L鏈FR3(序列編號：7)之Kabat編號表示之71號之胺基酸殘基取代為EP27小鼠可變區序列之胺基酸殘基的人型化L鏈FR3(表5、序列編號：21)。
從人型化L鏈可變區序列LA(序列編號：16)，設計包含重新設計之FR2、FR3(表5、序列編號：20、21)之人型化L鏈可變區序列LB(序列編號：22)。
又，從人型化L鏈可變區序列LA(序列編號：16)，設計包含重新設計之FR2(表5、序列編號：20)、及Accession No.AB064134(NCBI GenBank)記載之人類抗體L鏈序列之FR3(表5、序列編號：23)之人型化L鏈可變區序列L18(序列編號：24)。
1-4. EP27人型化抗體序列之製作
首先，為了製作EP27人型化可變區之cDNA，分別針對H鏈(HJ)、L鏈(LB)設計合成寡聚DNA。其次將各合成寡聚DNA混合，以組合PCR法等該技術領域中具有通常知識者公知之方法，將編碼為EP27人型化抗體之可變區之基因片段增幅。最後將獲得之增幅片段利用適當動物細胞表現載體選殖並與人類IgG1恆定區基因連結。獲得之表現載體之鹼基序列依該技術領域中具有通常知識者公知之方法決定。
就人類IgG抗體之H鏈C末端序列(G1、序列編號：25)來源之非均質性而言，據報告C末端胺基酸之離胺酸殘基缺損、及C末端之2胺基酸之甘胺酸、離胺酸兩者缺損導致之C末端胺基之醯胺化(Anal Biochem.2007 Jan 1；360(1)：75-83.)。作為使該等非均質性減低之方法，已知有使H鏈C末端之2胺基酸、亦即EU編號表示之446號之甘胺酸及447號之離胺酸缺損之方法(WO 2009/041613)。EP27人型化抗體之情形，係希望H鏈C末端序列來源之非均質性不存在，所以可利用人類IgG1之EU編號表示之446號之甘胺酸及447號之離胺酸缺損之IgG1序列(G1d、序列編號：26)作為恆定區序列。另一方面，L鏈恆定區可利用天然型人類κ鏈(k、序列編號：27)作為恆定區序列。製作HJ-G1d(序列編號：28)作為 依以上方式獲得之EP27人型化抗體序列之H鏈、LB-k(序列編號：29)作為L鏈。又，IgG1恆定區已有人報告副型(Jefferis等人、mAbs 1：4,1-7；July/August 2009)，上述記載之IgG1之G1m17,1型之恆定區(序列編號：26)以外，G1m17型(序列編號：30)或G1m3型(序列編號：31)也可利用於製作EP27人型化抗體。
1-5. EP27人型化抗體之評價
為了評價製作之EP27人型化抗體序列，藉由使H鏈(HJ-G1d、序列編號：28)及L鏈(LB-k、序列編號：29)共同表現，獲得EP27人型化抗體HJ-G1d/LB-k。具體而言，藉由將上述製作之H鏈表現載體及L鏈表現載體暫時性導入人類胎兒腎癌細胞來源HEK293H株(Invitrogen)、或FreeStyle293細胞(Invitrogen)以使抗體表現。從獲得之培養上清以使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(GE HEALTHCARE)等之該技術領域中具有通常知識者公知之方法將抗體精製。將含抗體之溶液以分光光度計測定(波長280 nm)，使用從獲得之吸光度與PACE法算出之吸光係數來計算抗體濃度(Protein Science 1995；4：2411-2423)。又，作為對照，嵌合抗體EP27cH-G1/cL-k也使用H鏈(cH-G1、序列編號：32)及L鏈(cL-k、序列編號：33)依同樣手法製作。
利用對嵌合抗體EP27之表皮調節素結合抑制評價系(參考例5)，評價EP27人型化抗體對人類表皮調節素(序列編號：167)之結合能力。定嵌合抗體EP27(cH-G1/cL-k)之IC50濃度為100時，EP27人型化抗體HJ-G1d/LB-k之值為24。
1-6.與嵌合抗體具同等活性之EP27人型化抗體之製作
設計將EP27人型化抗體之H鏈序列HJ-G1d之FR序列之部分胺基酸殘基取代為EP27小鼠可變區序列之胺基酸殘基之序列。首先，設計Kabat編號表示之75-76號之胺基酸殘基從人類FR3序列之胺基酸殘基Thr-Asp取代為EP27小鼠可變區序列包含之胺基酸殘基Ser-Asn之序列(序列編號：35)，並設計僅有76號之Asp取代為EP27小鼠可變區序列之胺基酸殘基Asn之序列(序列編號：36)(表6)。其次，對於含人型化H鏈可變區序列HJ-G1d(序列編號：28)之表現載體導入突變，以製作具有表6所示之FR3序列(序列編號：35)之人型化H鏈可變區序列HS-G1d(序列編號：37)。胺基酸殘基取代之導入，係使用PCR法等以該技術領域中具有通常知識者公知之方法實施。同樣地，製作包含表6所示之FR3序列(序列編號：36)之人型化H鏈可變區序列HY-G1d(序列編號：38)。依與實施例1-4同樣之方法獲得EP27人型化抗體HS-G1d/LB-k、HY-G1d/LB-k及HY-G1d/L18-k。評價獲得之抗體對人類表皮調節素之結合能力，作為對嵌合抗體EP27之表皮調節素結合抑制(參考例5)。其結果，當定嵌合抗體EP27(cH-G1/cL-k)之IC50濃度為100時，EP27人型化抗體HS-G1d/LB-k、HY-G1d/LB-k及HY-G1d/L18-k之IC50濃度各為142、146、100。
由以上，發現：與利用人型化之嵌合抗體EP27比較，免疫原性風險減弱，且與嵌合抗體EP27有同等抗原結合 能力之EP27人型化抗體序列。
[實施例2]抑制脫醯胺化、異構化、水解反應之突變之導入
醫藥品使用之抗體，雖是從單一抗體產生細胞來源之選殖體獲得之單株抗體，仍有非均質性存在。如此之抗體之非均質性，係由於氧化、脫醯胺化、異構化、水解等修飾引起，已知抗體等蛋白質於長期間保存中或於熱緊張、光緊張之緊張條件下暴露會增加(Heterogeneity of Monoclonal Antibodies：Journal of pharmaceutical sciences,vol.97,No.7,2426-2447)。但是當開發抗體作為醫藥品時，其蛋白質之物性，其中均勻性與安定性極重要，希望減低目的物質之非均質性且儘可能為單一物質。
脫醯胺化反應，係在天冬醯胺酸及麩醯胺酸之側鏈非酵素的發生，天冬醯胺酸及麩醯胺酸之側鏈存在之醯胺變換為羧酸之反應。又，異構化，係由於天冬醯胺酸及天冬胺酸之側鏈的羰基受位在C末端側之殘基之氮原子電子對攻擊，結果由於天冬醯胺酸之脫醯胺化或天冬胺酸之脫水而形成不安定的環狀醯亞胺中間體所引起。該中間體由於開裂，多數變化為異天冬胺酸，其餘變化為天冬胺酸。該等抗體等蛋白質在保存中發生的脫醯胺化、異構化反應，會成為上述非均質性之原因，所以希望儘量抑制。又，脫醯胺化反應，據報告尤其在天 冬醯胺酸與甘胺酸為相鄰的部位(Asn-Gly)容易發生(Geiger等人J.Biol.Chem.1987；262：785-794)。再者，天冬胺酸據報告會因為水解反應而引起胜肽鏈之切斷，尤其C末端側存在脯胺酸之序列(Asp-Pro)在酸性條件下容易分解(Segalas等人、FEBS Letters 1995；371：171-175)。
人型化H鏈可變區序列HY之CDR序列中，天冬醯胺酸及天冬胺酸殘基，係存在於Kabat編號表示之31號(Asp)、52號(Asp)、54號(Asn)、56號(Asn)、101號(Asp)。人型化L鏈可變區序列LB之CDR序列中，存在於Kabat編號表示之28號(Asp)、92號(Asp)、93號(Asn)。有人探討藉由該等部位之胺基酸殘基之取代，是否能獲得脫醯胺化、異構化、水解反應受抑制之改變體。
為了以胺基酸殘基取代抑制上述分解反應，將該殘基取代為相異的殘基。具體而言，作為含有表7所示之CDR序列(序列編號：39~46)之H鏈基因，製作H71-G1d(序列編號：49)、H57-G1d(序列編號：50)、H61-G1d(序列編號：51)、H65-G1d(序列編號：52)、H66-G1d(序列編號：53)、H67-G1d(序列編號：54)、H23-G1d(序列編號：55)、H40-G1d(序列編號：56)。同樣地，作為含有表7所示之CDR序列(序列編號：47、48)之L鏈基因，設計L30-k(序列編號：57)、L32-k(序列編號：58)。利用實施例1之手法，將導入有殘基取代之H鏈基因載體與LB-k載體共同表現，獲得EP27人型化抗體H71-G1d/LB-k、H57-G1d/LB-k、H61-G1d/LB-k、H65-G1d/LB-k、H66-G1d/LB-k、H67-G1d/LB-k、 H23-G1d/LB-k、H40-G1d/LB-k。同樣地，將導入有殘基取代之L鏈基因載體與HY-G1d載體共同表現，獲得EP27人型化抗體HY-G1d/L32-k。評價獲得之抗體對人類表皮調節素之之結合能力，作為對嵌合抗體EP27之表皮調節素結合抑制(參考例5)的結果，如表8。藉此可確認含有表7表示之序列的抗體，與嵌合抗體EP27有同等結合活性。由以上發現：脫醯胺化、異構化反應等化學性分解受抑制之EP27人型化抗體序列。
(IC50濃度：定嵌合抗體EP27(cH-G1/cL-k)之IC50濃度為100時之各抗體之IC50濃度)
[實施例3]使等電點變化之突變之導入
作為控制抗體之血漿中半減期之一方法，已知有改變露出抗體分子表面之胺基酸殘基，並控制抗體分子表面電荷之方法(WO2007/114319及WO2009/041543)。具體而言，藉由使抗體具有之等電點(pI)之值降低，已知能延長抗體之血漿中半減期。反之，藉由使抗體之等電點上昇，已知血漿中半減期縮短且抗體之組織移動性提高(Vaisitti等人(J.Biol.Regul.Homeost.Agents.(2005)19(3-4),105-112)、Pardridge等人(J.Pharmacol.Exp.Ther.(1998)286(1),548-554))。
由以上，使等電點變化而得之EP27人型化抗體，由於血漿中半減期之延長或組織移動性提高，可期待有更強抗腫瘤活性。而嘗試鑑定能夠不影響EP27人型化抗體對抗原之結合活性、其立體結構，而藉由調節抗體分子表面電荷以控制抗體之藥物動態之胺基酸殘基。具體而言，探索能不使EP27人型化抗體HY-G1d/LB-k(H鏈HY-G1d、序列編號：38、及L鏈LB-k、序列編號：29)之抗原結合抑制活性大幅降低，而可使其等電點降低之突變處。
使用EP27人型化抗體HY-G1d/LB-k之立體結構模型，篩選能不使對表皮調節素之結合大幅降低，而可使可變區之等電點變化之殘基。具體而言，設計H3-G1d(序列編號：72)、H5-G1d(序列編號：73)、H6-G1d(序列編號：74)、H7-G1d(序列編號：75)、H8-G1d(序列編號：76)、H9-G1d(序列編號：77)、H10-G1d(序列編號：78)、H31-G1d(序列編號：79)，作為含有表9所示之CDR序列(序列編號：59~71)中之任一者或多數之 H鏈基因。同樣地，設計L1-k(序列編號：80)、L2-k(序列編號：81)、L12-k(序列編號：82)、L20-k(序列編號：83)、L21-k(序列編號：84)、L23-k(序列編號：85)作為含有表9所示之CDR序列之L鏈基因。依實施例1之手法，將已有殘基取代導入之H鏈基因載體與LB-k載體共同表現，獲得EP27人型化抗體H3-G1d/LB-k、H5-G1d/LB-k、H6-G1d/LB-k、H7-G1d/LB-k、H8-G1d/LB-k、H9-G1d/LB-k、H10-G1d/LB-k、H31-G1d/LB-k。同樣地，將已有殘基取代導入之L鏈基因載體與HY-G1d載體共同表現，獲得EP27人型化抗體HY-G1d/L1-k、HY-G1d/L2-k、HY-G1d/L12-k、HY-G1d/L63-k。評或獲得之抗體對人類表皮調節素之結合能力，作為對嵌合抗體EP27之表皮調節素結合抑制(參考例5)。其結果，如表10所示，各EP27人型化抗體之抗原結合能力與嵌合抗體EP27為同等。從上述探討發現：抗體之等電點可變化之EP27人型化抗體序列。
(IC50濃度：定嵌合抗體EP27(cH-G1/cL-k)之IC50濃度為100時之各抗體之IC50濃度)
[實施例4]使組合體量減低之突變之導入
控制蛋白質醫藥品之組合體量，在考慮品質管理上及對藥效及免疫原性之影響時非常重要(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),708-714)。一般而言組合化係受起因於蛋白質溶液環境之colloidal stability及起因於蛋白質結構之conformational stability兩者(J.Pharm.Sci.(2010)100(4),1306-1315)。利用探討抗體製劑之配方，並篩選抗體濃度或pH、緩衝液種類、離子強度、添加劑等，能獲得對於colloidal stability有效的理想條件。另一方面，conformational stability也有依存於胺基酸序列之部分，為抗體之情形，維持CDR之典型(canonical)結構或FR之一致性序列、VH/VL界面等特徵結構被認為係重要(Jung等人(J.Mol.Biol.(2001)309(3),701-716)、Xiang等人(J.Mol.Biol.(1995)253(3),385-390)、 Ewert等人(Methods.(2004)34(2),184-199)、Vargas-Madrazo等人(J.Mol.Recognit.(2003)16(3),113-120)、Morea等人(J.Mol.Biol.(1998)275,269-294)、Vargas-Madrazo等人(J.Mol.Recognit.(2003)16(3),113-120))。
從上述觀點，本發明設計為了製作據認為結構更安定之人型化抗體。其結果，發現EP27人型化抗體HY-G1d/LB-k。為了使HY-G1d/LB-k所含之組合體量更減少，探討將HY-G1d/LB-k之CDR內所含之疏水性殘基取代為親水性殘基，使分子間之疏水***互作用減弱所得之組合化抑制效果。
具體而言，設計H25-G1d(序列編號：92)、H41-G1d(序列編號：93)、H42-G1d(序列編號：94)、H43-G1d(序列編號：95)、H44-G1d(序列編號：96)、H45-G1d(序列編號：97)，作為對EP27人型化抗體HY-G1d/LB-k(H鏈HY-G1d/序列編號：38、L鏈LB-k/序列編號：29)導入有表11所示之CDR序列(序列編號：86~91)中之任一者而得之H鏈基因。依實施例1之手法，使殘基經取代之H鏈基因載體與LB-k載體共同表現，獲得EP27人型化抗體H25-G1d/LB-k、H41-G1d/LB-k、H42-G1d/LB-k、H43-G1d/LB-k、H44-G1d/LB-k、H45-G1d/LB-k。該等EP27人型化抗體所含之組合體量以凝膠過濾層析法(參考例9)測定之結果，如表12。藉此，發現與嵌合抗體EP27(cH-G1d/cL-k)相較，組合體量大幅減少之EP27人型化抗體序列。
【表11】
又，評價獲得之抗體對人類表皮調節素之結合能力，作為對嵌合抗體EP27之表皮調節素結合抑制(參考例5)。如表13所示，各EP27人型化抗體之抗原結合能力與嵌合抗體EP27為同等。由上述探討，發現其組合體量受抑制且具有與嵌合抗體EP27為同等抗原結合能力之EP27人型化抗體序列。
(IC50濃度：定嵌合抗體EP27(cH-G1/cL-k)之IC50濃度為100時之各抗體之IC50濃度)
再者，依實施例1之方法製作以下抗體，作為設計之含有實施例1至4發現的胺基酸殘基取代之序列任意組合 而得之EP27人型化抗體；H87-G1d/LB-k(H鏈：序列編號：98、L鏈：序列編號：29)、H87-G1d/L21-k(H鏈：序列編號：98、L鏈：序列編號：84)、H87-G1d/L37-k(H鏈：序列編號：98、L鏈：序列編號：99)。評價對於人類表皮調節素之結合能力，作為對嵌合抗體EP27之表皮調節素結合抑制(參考例5)。其結果如表14，任一抗體均與嵌合抗體EP27(cH-G1/cL-k)有同等結合能力。又，該等EP27人型化抗體所含之組合體量以凝膠過濾層析法(參考例9)、Fab之熱改性中間溫度(Tm)以差示掃描熱量分析計(參考例10)，等電點(pI)以等電點電泳法(參考例11)測定。如表14，與嵌合抗體EP27(cH-G1d/cL-k)相較，確認其組合體量為大幅減少且其Tm值上昇。藉此，找到實施例1至4顯示之達成了由於人型化所得之免疫原性風險減低、化學性分解抑制、等電點降低、組合體量減低的EP27人型化抗體序列。
(IC50濃度：定嵌合抗體EP27(cH-G1/cL-k)之IC50濃度為100時之各抗體之IC50濃度)
[實施例5]猴抗原結合能力之改善及使免疫原性減低之突變之導入
開發醫藥品時，一般於前臨床試驗之毒性‧安全性評價據 認為係用於決定臨床試驗之投予量或用於各種風險評價之重要探討。抗體醫藥品之情形，由於其抗原結合專一性，有時前臨床試驗使用之動物種之選擇受限定，許多情形，會選擇與人類在基因上接近的靈長類。但是當目的抗體不與靈長類之抗原結合、或其結合能力與對人類抗原之結合能力相比有顯著差異時，會有不判斷使用靈長類之評價為妥當的情況。為了因應如此的事例，有人嘗試使用與使用動物種之抗原結合之代理抗體、或使用人類抗原基因轉殖動物，而評價前臨床試驗的毒性‧安全性(Chapman等人(Nat.Rev.Drug Discov.(2007)6,120-126))。
使目的之抗體之抗原結合能力變化之方法，使用Phage library或Ribosome display之affinity maturation等該技術領域中具有通常知識者公知之方法所為胺基酸殘基之取代據認為有效。又，也可從抗原與抗體可變區結合部位之立體結構，以計算科學的手法使種交叉性改善(Farady等人、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19(2009)3744-3747)。但是並無不倚賴大規模篩選或計算科學的手法，而使抗人類表皮調節素抗體對抗原之結合能力變化的報告。又，由於猿表皮調節素與人類表皮調節素之結構上的差異並未明瞭，完全未有人揭示是否將抗人類表皮調節素抗體之胺基酸殘基改變，能增強對猿表皮調節素之結合活性的指引。本發明中，設計CDR之任意部位之胺基酸殘基經取代之多數抗體序列。依實施例1之手法，實施該等殘基經取代之抗體基因之製作及抗體表現。具體而言，設計表15所示之H鏈CDR2及 CDR3、L鏈CDR3取代為Arg殘基之序列，並製作表16所示之抗體。對人類及猿表皮調節素之親和性，係使用利用表面電漿子散射之裝置(BIACORE)評價(參考例6)。
其結果，發現：相較於嵌合抗體EP27，對人類表皮調節素之親和性未降低、對猿表皮調節素之親和性增強、顯示猿表皮調節素與人類表皮調節素之交叉性的指標親和性比(=對猿表皮調節素之KD值/對人類表皮調節素之KD值)小的EP27人型化抗體序列(圖1及2)。
【表16】
又，醫療用醫藥品開發時，對投予後之醫藥品出現抗體係藥效、安全性上之課題。所以，降低目的醫藥品之免疫原性之操作係為重要。預測生物產品的免疫原性之手法，存在體內(in vivo)、體外(in vitro)、電腦模擬(in silico)之手法，與實際臨床時抗醫藥品抗體之出現率間的相關也已有人報告(Baker等人(Curr.Drug Saf.(2010)5(4),308-313、Bryson等人(BioDrugs.(2010)24(1),1-8)、Groot等人(Curr.Opin.Pharmacol.(2008)8(5),620-626)。本發明中，可藉由參考例13記載之手法預測T-cell epitope，預測無損目的抗體之抗原結合能力且使免疫原性風險降低之EP27人型化抗體序列。
設計對於包含實施例1至4發現之改變的序列，使對猿表皮調節素之親和性改善及/或使免疫原性之突變以任意組合成的序列。依實施例1之方法製作以此方式設計之表17(序列編號：115~150)所示之EP27人型化抗體。表17記載之EP27人型化抗體之突變CDR序列如表18。對人類及猿表 皮調節素之親和性之評價係使用利用表面電漿子散射之裝置(BIACORE)(參考例6)。如圖3，各EP27人型化抗體對人類表皮調節素之親和性，與嵌合抗體EP27(cH-G1/cL-k)之親和性為同等。又，作為顯示猴抗原與人類抗原之親和性之差異的指標，比較親和性比(=對猿表皮調節素之KD值/對人類表皮調節素之KD值)，結果確認比起嵌合抗體，各EP27人型化抗體對兩抗原之親和性之差異大為減少(圖4)。由此可發現：能使對人類表皮調節素之親和性不降低，使對猿表皮調節素之親和性改善之EP27人型化抗體序列。
【表17】
【表18】
再者，該等EP27人型化抗體所含之組合體量利用凝膠過濾層析法(參考例9)、從該等EP27人型化抗體製備之Fab之熱改性中間溫度(Tm)利用差示掃描熱量分析計(參考例10)測定。如表19，相較於嵌合抗體EP27(cH-G1d/cL-k)，可確認組合體量大幅減少、Tm值上昇。由此可發現：實施例1至5所示之包含由於人型化所致之免疫原性風險減低、化學性分解抑制、等電點降低、組合體量減低、對猴抗原之結合能力改善之EP27人型化抗體序列。
【表19】
(KD比，表示定cH-G1/cL-k為1時之相對比。)
[實施例7]使用人類末梢血單核球作為效應子細胞之各待驗抗體之ADCC活性
使用人類末梢血單核球(以下稱為人類PBMC。)作為效應子細胞，依以下方式測定各待驗抗體之ADCC活性。人類來源效應子細胞，使用從人類末梢血採取之單核球級分。其結果可知：試驗使用之全部EP27人型化抗體對於MIA PaCa-2細胞會誘導ADCC(參考例7)(圖5)。
[實施例8]抗表皮調節素單株抗體對於人類或猿表皮調節素所致之細胞增殖刺激之中和活性之測定
實施例5發現與猴之親和性有增強之EP27人型化抗體序列。而為了評價在細胞之活性，測定EP27人型化抗體對於猴及人類表皮調節素所為之細胞增殖刺激之之中和活性。細胞使用BAF_EGFR，本次評價的所有EP27人型化抗體，係探討抑制依存於人類及猿表皮調節素之EGFR_BAF細胞之增殖的中和活性(參考例8)，任一EP27人型化抗體均相較於嵌合抗體，對猿表皮調節素之中和活性有增強。(圖6、7)
[實施例9]使用體內(in vivo)模型之EP27人型化抗體之藥效試驗
使用已移植人類腫瘤之小鼠模型，評價於實施例7及實施例8已確認的in vitro的細胞活性之EP27人型化抗體在體內的抗腫瘤活性(參考例14)。評價的MIA PaCa-2及DLD-1人類癌細胞移植小鼠模型中各待驗抗體之抗腫瘤效果，係藉由測定投予試樣之投予最終日起7日後之腫瘤體積以評價。其結果，如圖8，cH-G1/cL-k抗體、H206-G1d/L73-k抗體、H240-G1d/L73-k抗體之各抗體以0.4mg/kg及2mg/kg投予的情形，確認在動物模型亦有由於改變之EP27人型化抗體所得之優異藥效。
[實施例10]使用抗表皮調節素抗體之免疫組織化學性染色
使用EP27抗體反映抗原表現量之免疫組織化學性染色方法已確立。使用將表現量不同之EREG強制表現細胞株SKE-18(其抗原量估計為7.7x103)、SKE-23(其抗原量估計為6.1x104)、SKE-4B2(其抗原量估計為2.9x105)與宿主細胞之SK-HEP-1(抗原量8.4×102)移植到scid小鼠之組織之石蠟包埋塊體，實施免疫組織化學性染色。從該等石蠟塊體作成之薄切組織切片中之EREG之表現，係在以EP27抗體作為一次抗體之溫育後，使與作為二次抗體之兔抗小鼠IgG多株抗體(Jackson Imunoresearch Laboratories)、作為三次抗體之聚合物-HRP(Dako cytomation)結合之山羊抗兔IgG抗體反應，並以二胺基聯苯胺作為基質以可見化。如圖10，染色的細胞‧組織因應於EREG之表現量而可認出染色性之階調性。又，確認因應 該等細胞之表現量之H240-G1d/L73-k抗體在體外的ADCC活性(圖11)。上述試驗中，H240-G1d/L73-k抗體係使用低岩藻糖抗體。該低岩藻糖抗體係依WO2004/065540記載之方法製作。以下也將該低岩藻糖抗體稱為EP27人型化Glycomab抗體。上述4株EREG強制表現細胞株以外，也確認對抗抗原量估計為2.8x104之SKE-10及SKE-15之H240-G1d/L73-k抗體(EP27人型化Glycomab抗體)在體內的ADCC活性。與圖11同樣，確認因應該等細胞之表現量之H240-G1d/L73-k抗體在體外的ADCC活性(表20)。再者，也確認因應該等細胞之表現量之H240-G1d/L73-k抗體(EP27人型化Glycomab抗體)在體內的腫瘤增殖抑制活性(圖12)。亦即，利用免疫組織化學的染色法確認了EREG之表現量之評價與藥效之間有相關性。
[實施例11]於臨床低分化大腸癌中之EREG之表現
為了探討在低分化大腸癌之臨床9病例中的EREG表現，將同病例之石蠟包埋薄切標本依實施例10記載之染色法染色，結果於7/9病例確認明確的陽性圖像(圖13)。
[實施例12]EP27人型化Glycomab抗體對於大腸癌幹細胞之腫瘤植活(engraftment)之藥效
對於已將曾人類大腸癌腫瘤模型PLR123(WO02012/046797)單離之細胞數1x106之大腸癌幹細胞移植到鼠蹊部的SCID小鼠，從該幹細胞之投予之次日將EP27人型化Glycomab抗體以10 mg/kg每週投予一次。其結果，實施Wilcoxon符號順位檢定(SAS系統8.02 TS水平02M0及SAS前臨床套裝軟體Version 5.00.010720)，確認在移植後第29日，如圖14所示，抗體群相較於對照群，腫瘤植活顯著地受抑制。
[實施例13]EP27人型化Glycomab抗體對於大腸癌幹細胞之轉移之藥效
對於已將從人類大腸癌腫瘤模型PLR123單離之細胞數2x106之大腸癌幹細胞從尾靜脈移植之SCID-beige小鼠，在該幹細胞之投予3日後，將EP27人型化Glycomab抗體以10 mg/kg每週投予1次。其結果，於移植後第52日，如圖15所示，確認：抗體投予群相較於對照群，小鼠肺中的腫瘤塊數(轉移病灶數)、及腫瘤塊尺寸(轉移病灶直徑)顯著地受抑制。
[實施例14]EP27人型化Glycomab抗體對於低分化大腸癌之藥效
對於已移植人類低分化大腸癌腫瘤COL-53-JCK(實驗動物中央研究所)之腫瘤組織片的SCID小鼠，從該腫瘤組織片移植後第14日起將EP27人型化Glycomab抗體以10 mg/kg每週投予1次。其結果，從該抗體之投予開始後第14日評價腫瘤體積，確認抗體投予群比起對照群，腫瘤增殖顯著地受抑制(圖16)。
[實施例15]EP27人型化Glycomab抗體對中分化 大腸癌之藥效
人類中分化大腸癌腫瘤模型PLR379(PCT/JP2012/072852)中的腫瘤具有觀察到Tumor budding之形態上的特徵，但表皮調節素之表現不拘於Tumor budding之部位進行檢測。對於已移植該PLR379之腫瘤組織片之SCID小鼠，從該腫瘤組織片移植後第21日起將EP27人型化Glycomab抗體以10 mg/kg每週投予1次。該抗體之投予開始後第18日評價腫瘤體積，確認抗體投予群相較於對照群，腫瘤增殖顯著地受抑制(圖17)。
[實施例16]臨床肺腺癌中之EREG之表現
為了探討肺腺癌之臨床7病例中的EREG表現，將同病例之石蠟包埋薄切標本依實施例10記載之染色法染色。其結果，於4/7病例確認有明確的陽性圖像(圖18)。
[實施例17]將人類末梢血單核球作為效應子細胞使用之EP27人型化Glycomab抗體之ADCC活性
評價使用人類PBMC作為效應子細胞對人類肺腺癌株Calu-3之ADCC活性。其結果，確認EP27人型化Glycomab抗體會對Calu-3細胞誘導ADCC。(圖19)。
[實施例18]EP27人型化Glycomab抗體對肺腺癌之藥效
對於已移植人類肺腺癌模型Calu-3之腫瘤組織片之SCID小鼠，從該腫瘤移植片移植後第13日起將EP27人型化Glycomab抗體以10 mg/kg每週投予1次。於該抗體之投予開始後第28日測定腫瘤體積，確認抗體投予群比起對照群，腫瘤增殖顯著地受抑制(圖20)。
[實施例19]EP27人型化抗體之細胞內在化
EP27人型化抗體之細胞內在化係依以下系評價。一次抗體若內在化，則與二次抗體抱合之核糖體不活化蛋白質皂草毒蛋白(Saporin)會經由二次抗體對於一次抗體之結合而往細胞內輸送。若內在化，則皂草毒蛋白(Saporin)從IgG抱合體分離，且抑制蛋白質合成，最終引起細胞死亡。於每井將表現EREG之細胞株DLD-1、或作為對照之細胞株SK-HEP1各以1x103細胞之細胞密度接種後的96井微平板之各井，在接種的次日加入作為一次抗體之EP27人型化Glycomab抗體、作為二次抗體之結合有核糖體不活化蛋白質之認識人類單株抗體之山羊IgG、Hum-ZAP(Advanced Targeting Systems)。添加4日後，以WST8(Dojindo)評價細胞生存率。如圖21，EP27人型化Glycomab抗體僅對於表現EREG之細胞株DLD-1引起細胞傷害。另外，對作為對照之細胞株SK-HEP1未引起細胞傷害。
[參考例1]人類及食蟹猿表皮調節素基因之單離
將全長人類EREG cDNA(CR541887、序列編號：169)依定法單離，將該基因片段選殖於哺乳細胞表現用載體(pMCN)而得之質體命名為hEREG/pMCN。pMCN可於mouse CMV啟動子(ACCESSION No.U 68299)下誘導外來基因表現，且係***有新黴素耐性基因之載體。全長食蟹猴EREG cDNA依據獼猴EREG cDNA(XM_001102069)序列資訊從食蟹猴cDNA庫依定法單離之基因片段(編碼為序列編號：165之基因片段)選殖於哺乳細胞表現用載體(pMCN)而得之質體，命名為cyEREG/pMCN。hEREG/pMCN及cyEREG/pMCN係藉由電穿 孔法導入CHO細胞DG44株(Invitrogen)，並以500μg/mL Geneticin挑選，而建立全長人類EREG穩定表現CHO細胞及全長食蟹猴EREG穩定表現CHO，各命名為hEREG_DG及cyEREG_DG。
[參考例2]人類及食蟹猴成熟型表皮調節素表現方法之樹立
將表現人類及食蟹猿表皮調節素基因之成熟型人類EREG細胞外區域(各為序列編號：170及序列編號：34表示之多胜肽之N末端融合有序列編號171之序列而得之多胜肽)之C末端的6個組胺酸重複序列的cDNAPCR法增幅。將已分別***該等而得的哺乳動物細胞用表現載體以限制酶作用使成直鏈狀後，於Free style 293細胞使用293FECTIN導入，以暫時性的表現人類及食蟹猴成熟型表皮調節素。
[參考例3]表皮調節素之製備
將成熟型人類表皮調節素基因及成熟型食蟹猿表皮調節素基因分別***哺乳動物細胞用表現載體。將從各基因依下列方法使表現之動物細胞之培養液單離之成熟型人類EREG-6His及食蟹猴EREG-6His融合蛋白精製。
構建於哺乳動物細胞用表現載體將成熟型人類EREG細胞外區域(序列編號：34之N末端有序列編號：171之序列融合而得之多胜肽)及6個組胺酸區域於讀框內連結而得的hsEREG-6His表現載體(表現的融合多胜肽以下稱為hsEREG-His)。建構於哺乳動物細胞用表現載體將成熟型食蟹猴EREG細胞外區域(於序列編號：170之N末端有序列編號： 171之序列融合而得之多胜肽)與6個組胺酸區域於讀框內連結而得的csEREG-6His表現載體(表現之EREG，以下稱為cysEREG-His)。hsEREG-6His表現載體及csEREG-6His表現載體，係藉由293fectin(Invitrogen)導入FreeStyle 293細胞(Invitrogen)，將轉形導入株以500μg/mL ZEOCIN篩選，於37℃之8%CO2培養箱中培養6日。
其次由培養上清精製hsEREG-His與cysEREG-His。對培養上清加入4 M咪唑使終濃度成為10 mM咪唑而得之混合液，與HisMicroSpin Purification System(Amersham)之Ni樹脂混合。將該樹脂以20 mM咪唑及50 mM咪唑洗滌後，以200 mM咪唑將hsEREG-His或cysEREG-His溶出(溶出級分1)，然後以400 mM咪唑溶出hsEREG-His或cysEREG-His(溶出級分2)。其次將溶出之含hsEREG-His或cysEREG-His之緩衝液，使用Bio-tech透析杯MWCO8000，透析取代為PBS。精製蛋白之定量，係從280 nm之波長使用PACE法換算其蛋白質含量。
精製蛋白質之電泳圖案如(圖9)。
[參考例4]表皮調節素ELISA系確立
具有成熟型EGF分域結構之可溶型人類EREG片段(相當於63Val至108Leu之序列編號：34記載之多胜肽)係從R&D Systems(cat.no.1195- EP/CF)購買。將可溶型人類EREG片段塗覆於nunc免疫平板，以含BSA之溶液阻斷後，解析精製抗EREG抗體之結合反應性。添加精製抗EREG抗體後經1小時溫育後，對於已洗滌之板之各井加入經鹼性磷解酶標識之抗人 類IgG抗體(Zymed)，以實施反應。進行各井洗滌後，加入檢測試藥Sigma p-Nitrophenyl phosphate Tablets，測定抗體結合量。
[參考例5]利用彼此競爭ELISA確立表皮調節素結合抑制系
具有成熟型EGF分域結構之可溶型人類EREG片段(相當於63Val至108Leu之序列編號：34記載之多胜肽)，係從R&D Systems(cat.no.1195- EP/CF)購買。將可溶型人類EREG片段塗覆於nunc免疫平板，以含BSA之溶液阻斷後，解析精製人型化抗EREG抗體對於小鼠融合瘤來源之EP27之彼此競爭結合反應性。添加小鼠融合瘤來源之EP27及精製人型化抗EREG抗體並經2小時溫育後，對於已洗滌之板之各井加入經鹼性磷解酶標識之抗人類IgG抗體(Zymed)，以實施反應。進行各井洗滌後，加入檢測試藥Sigma p-Nitrophenyl phosphate Tablets，測定抗體結合量(A405/655檢測值)。
[參考例6]抗原結合能力(親和性測定法)之確立
抗EREG抗體對抗原之親和性及結合速度常數，係利用BiacoreTM-T100(GE Healthcare Japan)以表面電漿子共振分析之single-cycle kinetics法測定。電泳緩衝液使用HBS-EP+(GE Healthcare Japan)，並使用胺偶聯套組(GE Healthcare Japan)使Protein A共價鍵結於CM5晶片(羧基甲基葡聚糖被覆晶片)。電泳緩衝液使用HBS-EP+(GE Healthcare Japan)，並使用胺偶聯套組(GE Healthcare Japan)，使Protein A共價鍵結於CM5晶片(羧基甲基葡聚糖被覆晶片)。各抗EREG抗體係製備成於 Protein A捕捉約350 RU。作為分析物之人類EREG或食蟹猴EREG，係使用HBS-EP+製備為0、0.7、1.4、2.8、5.6、11.2 nM。測定首先使Protein A捕捉抗體溶液，再以流速30μL/min，連續各注射0.7、1.4、2.8、5.6、11.2 nM之人類EREG或食蟹猴EREG溶液3 mi以使反應，之後切換為HBS-EP+，測定15 min解離相。解離相之測定結束後，以25 mM NaOH洗滌，使感應晶片再生。濃度0之測定，同樣使Protein A捕捉抗體溶液，各注射HBS-EP+ 3 min連續5次，使反應之後，切換為HBS-EP+，測定15 min解離相。解離相之測定結束後，以25 mM NaOH洗滌，並將感應晶片再生。從獲得之感應圖，使用Biacore專用的資料解析軟體Biacore T100 Evaluation Software Version 2.0.1進行速度論的解析，計算結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)及速度常數比。結果如表21。又，為了補正測定值之日間差，圖1~4及表16及19係顯示以同日測定之對照試樣(cH-G1/cL-k)之值作為1之比。
[參考例7]ADCC活性測定法之確立
人類來源效應子細胞使用從人類末梢血採取之單核球級 分。使用預先注入1000單位/mL的肝素溶液(novo‧heparin注射用5千單位、novonordisk)200μL的注射器，從健常人自願者(成年男性)抽取末梢血50 mL。將以PBS(-)稀釋為2倍之該末梢血預先注入Ficoll-Paque PLUS並進行離心分離操作。加到Leucosep淋巴球分離管(Greiner bio-one)。將其離心分離(2150 rpm、10分鐘、室溫)後，分取單核球級分層。以10% FBS/D-MEM將細胞洗滌1次後，以10% FBS/D-MEM調整使細胞密度為5 x 106/mL，以製備效應子細胞浮游液。該細胞懸浮液作為人類PBMC溶液，供以後實驗用。
標靶細胞浮游液，係於試驗時在用時製備。人類胰臟癌細胞株MIA PaCa-2細胞(ATCC)於含10%FBS、2.5% Horse Serum、4 mmol/L L-Glutamine(Invitrogen)、4.5 g/L glucose(Invitrogen)、1.5 g/L Sodium bicarbonate(Invitrogen)之Dulbecco's Modified Eagle Media(Invitrogen)(以下稱為繼代用培氧基)中繼代並維持。標識試藥，係於含有12μL之調整為4 mg/mL之Calcein-AM/DMSO stock溶液(nacalai)之管內添加10%FBS/D-MEM 228μL並輕輕懸浮作為Calcein-AM溶液。對於經離心分離(1200 rpm,5分鐘，4℃)的1×106個MIA PaCa-2細胞株，將如上述製備之Calcein-AM溶液，以細胞丸粒每1×106/個添加200μL，以製備細胞懸浮液。將該懸浮液之全量移到多採血管(日本製藥)，於37℃之CO2培養箱中培養2小時。將以10%FBS/D-MEM洗滌過3次的細胞，以10%FBS/D-MEM懸浮使成為20×104/mL(1×104/50μL)，以製備標靶細胞浮游液。
標靶細胞浮游液係於96井平底板添加100μL的培養基。其次，將抗表皮調節素單株抗體(H206-G1d/L73-k(序列編號：142/141),H240-G1d/L73-k(序列編號：150/141)及嵌合EP27(序列編號：32/33))以培養基稀釋後，對於該板之各井各添加50μL。抗體係以終濃度0.0001~10μg/mL添加。然後，將PBMC溶液(1x107個/mL)對各井逐一添加50μL，將該板於5%二氧化碳培養箱中於37℃靜置4小時，決定專一性的鈣黃綠素(Calcein)-AM游離率。將從板經離心分離(1200 rpm、5分鐘、室溫)後的該板的各井回收的100μL的上清的螢光強度(λex=490 nm、λem=515 nm)，使用螢光光度計測定。由下式(式3)求算專一性的鈣黃綠素(Calcein)游離率。
(式3)專一性的鈣黃綠素(Calcein)游離率(%)=(A-C)x 100/(B-C)
A表示在各井之螢光強度、B表示在50μL之10% FBS/D-MEM添加了50μL之標靶細胞浮游液與100μL之NP-40溶液後，井之螢光強度之平均值，C表示在50μL 10% FBS/D-MEM添加了50μL之標靶細胞浮游液與100μL之10% FBS/D-MEM後，井之螢光強度之平均值。試驗以N=3進行，各抗體濃度之專一性的鈣黃綠素(Calcein)游離率使用Microsoft Office Excel 2007決定。
[參考例8]中和活性測定法
(1)表現人類EGFR嵌合受體之Ba/F3細胞株(EGFR_BAF)之樹立
依常法，將其序列為序列編號：166(GeneBank Acc.No. NM_005228)表示之人類EGF受體(以下記載為「hEGFR」。)單離後，製作表現人類EGF受體之載體(pCXZD1/EGFR#3)。
將以Pvu I切斷而直鏈化之hEGFR表現載體(pCXZD1/EGFR#3)15μg，於0.33 kV,950μFD之條件下對於Ba/F3細胞以電穿孔法(Gene Pulser；BioRad)導入。導入有基因之細胞，係以含10% FBS、300μg/mL Zeocin、及重組體人類表皮調節素(R&D SYSTEMS、Cat：1195-EP/CF、200 ng/mL)之RPMI1640培養基篩選，並進行EGFR_BAF株之單離。
(2)抗表皮調節素抗體對於人類表皮調節素或猿表皮調節素依存性EGFR_BAF株之細胞增殖的中和活性
使用依(1)記載之方法單離之EGFR_BAF株，實施測定抗表皮調節素抗體對於人類表皮調節素或猿表皮調節素依存性細胞增殖之中和活性的試驗。培養時為了去除人類表皮調節素，將細胞洗滌，再懸浮於含hsEREG-His或cysEREG-His(終濃度2.5 ng/mL)及10% FBS之RPMI1640培養基，以2x104細胞/100μL/well之密度接種於96孔板。將抗表皮調節素抗體以各濃度(0.014~30μg/mL)利用培養基稀釋後，添加到細胞，之後將細胞於37℃、5% CO2培養箱內培養3日。培養後，加入Cell Counting Kit(同仁化學研究所社)之測定試藥進行2小時成色，使用Benchmark Plus(BIO-RAD公司)測定反應液之吸光度(450/655 nm)。將抗體濃度0μg/mL之數值作為對照值，計算細胞增殖抑制率(各抗體濃度之OD值/對照組之OD值x100(%))。
[參考例9]利用凝膠過濾層析法所為之組合體量之測定
管柱使用G3000SWXL(粒徑5μm、7.8mmI.D.×30cm、TOSOH製)，移動相使用含300mM NaCl之50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)，以凝膠過濾層析測定組合體量。將與Alliance system(Waters製)連接的管柱以流量0.5mL/min平衡化之後，對於該管柱注入5-10μg抗體溶液。抗體之溶出以紫外吸光度檢測器(215或280nm)檢測。從獲得之層析圖，計算總峰部面積所含之組合體峰部面積之存在比率。
[參考例10]利用差示掃描熱量分析計所為之熱改性中間溫度(Tm)之測定
於調配為含150mmol/L氯化鈉之20mmol/L之乙酸鈉緩衝溶液(pH6.0)的透析外液，浸入封入50-100μg相當量之抗體溶液的透析膜，進行一日夜透析。將以透析外液調配成抗體濃度為50-100μg/mL者，作為試樣溶液用在Tm值之測定。
適當的DSC裝置，例如DSC-II(Calorimetry Sciences Corporation製)、MicroCal VP-DSC(GE healthcare製)可用於此實驗。將經充分脫氣的試樣溶液及參考溶液(透析外液)各封入熱量計小室，於40℃充分進行熱平衡化。其次，DSC掃描於40℃~100℃以約1K~2.5K/分掃描速度實施。結果，作為溫度之函數之改性峰部之頂點表示。參考非專利文獻(Rodolfo等人、Immunology Letters、1999年、p47-52)，進行Fab分域之峰部指定，以計算試樣之熱改性中間溫度。
[參考例11]利用等電點電泳所為之pI測定
使用Phastsystem Cassette(AmerchamBioscience)，於以下膨潤液中使Phast-Gel Dry IEF(AmerchamBioscience)凝膠膨潤 約30 min。
使用已膨潤的凝膠，以PhastSystem(AmerchamBioscience)以下列程式進行電泳。樣本係於Step 2添加到凝膠。pI標記使用Calibration Kit for Pi(AmerchamBioscience)。
使用Silver staining Kit,protein(AmerchamBioscience)，依套組附帶的實驗步驟，將以20% TCA固定之電泳後的凝膠進行銀染色。染色後，從pI標記的已知等電點計算樣本之等電點。
[參考例12]無岩藻糖基抗體表現株之建構
於相同染色體上之兩者之岩藻糖轉運蛋白基因之表現受人為抑制的細胞中，岩藻糖轉運蛋白之機能係受抑制。藉由使用該細胞，可獲得岩藻糖缺損之抗體(WO2006/067913等)。又，也可藉由使強制表現beta 1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III與Golgi alpha-mannosidase II之細胞產生抗體，而獲得岩藻糖缺損的抗體(Ferrara等人、Biotechnol.Bioeng.(2006)93 (5),851-861)。該等由該技術領域中具有通常知識者公知之手法製備之無岩藻糖基化EREG抗體使用於探討。
[參考例13]使用電腦模擬(in silico)免疫原性預測工具Epibase之免疫原性風險評價
臨床之抗體醫藥品之有用性與藥效受限於抗醫藥品抗體(ADAs)。ADAs會影響抗體醫藥品之藥效及動態，有時尚有帶來嚴重副作用的情況。影響免疫原性之因子已有多數被報告，但尤其T細胞抗原決定部位含於抗原係為重要。作為預測該T細胞抗原決定部位之電腦模擬(in silico)工具，，可利用Epibase(Lonza)、iTope/TCED(Antitope)及EpiMatrix(EpiVax)等。藉由使用該等工具，據報告能預測於包含目的蛋白質存在之T細胞抗原決定部位之序列(Expert Opin Biol Ther.2007 Mar；7(3)：405-18.)。
Epibase Light(Lonza)，係使用FASTER algorism(Expert Opin Biol Ther.2007 Mar；7(3)：405-18.)計算9-mer胜肽與主要DRB1等位基因(allele)間之結合能力之電腦模擬工具。本工具可鑑定成為對MHC classII有強結合及中程度結合的T細胞抗原決定部位。
各改變抗體之電腦模擬免疫原性分數，係利用Epibase Light(Lonza)系統內之以下計算式(式4)求取。
(式4)免疫原性分數=總和(各DRB1副型族群頻率X臨界抗原決定部位數)
計算反映DRB1副型之存在比，其可使用以下表示 之Caucasian之存在比。
DRB1*1501(24.5%)、DRB1*0301(23.7%)、DRB1*0701(23.3%)、DRB1*0101(15.0%)、DRB1*1101(11.6%)、DRB1*1302(8.2%)、DRB1*1401/1454(4.9%)、DRB1*0901(2.3%)、DRB1*1502(0.5%)、DRB1*1202(0.1%)
以FASTER演算法求取各改變抗體序列中所含之強結合與中程度之結合之所有抗原決定部位後，將排除人類生殖系列(germline)序列及可變區之恆定區之交界序列之後的序列，作為臨界抗原決定部位(critical epitope)，用於免疫原性分數計算。分數愈低，可認為係免疫原性風險愈小的序列。
[參考例14]使用體內(in vivo)模型之抗表皮調節素抗體之藥效試驗
(1)供移植到體內模型之細胞株之維持
作為體內模型，使用MIA PaCa-2細胞(ATCC)及DLD-1(ATCC)。MIA PaCa-2細胞，係於含有10%FBS、2.5% Horse Serum、4 mmol/l L-Glutamine(Invitrogen)、4.5 g/l glucose(Invitrogen)、1.5 g/l Sodium bicarbonate(Invitrogen)之Dulbecco's Modified Eagle Media(Invitrogen)(以下稱為繼代用培養基)中繼代並維持。DLD-1細胞，係於含有10%FBS、10 mmol/l HEPES(Invitrogen)、4.5 g/l glucose(Invitrogen)、1 mmol/l Sodium Pyruvate(Invitrogen)之RPMI1640培養基(SIGMA)(以下稱為繼代用培養基)中繼代並維持。
(2)MIA PaCa-2及DLD-1細胞移植小鼠模型之製作
MIA PaCa-2及DLD-1細胞之細胞懸浮液，係使用含繼代用培養基與MATRIGEL Matrix(BD Bioscience)為1：1之溶液製備為成為5x107細胞/mL，將該細胞懸浮液100μl(5x106細胞/小鼠)移植到SCID小鼠(雌、5週齡)(日本Clea)之腹部皮下。腫瘤體積，係使用式5計算，於腫瘤體積之平均為130-330mm3之時點判斷模型成立。
(式5)腫瘤體積=長徑×短徑×短徑/2
(3)含有各待驗抗體之投予試樣之製備
將含有cH-G1/cL-k抗體、H206-G1d/L7-3k抗體、H240-G1d/L73-k抗體之各抗體之投予試樣，在投予當日使用生理食鹽水製備為使成為0.04mg/mL(0.4mg/kg投予群)或0.2mg/mL(2mg/kg投予群)。
(4)含有抗體之投予試樣之投予
對於(2)製作之小鼠模型移植MIA PaCa-2細胞後14日起，每週1次以14日之期間，DLD細胞上述移植後12日起每週1次以14日之期間，從尾靜脈投予(3)製備之投予試樣。作為陰性對照，將生理食鹽水同樣地，以每週1次在分別的期間，以10mL/kg之投予量從尾靜脈投予。任一群均以5隻為1群，對各群實施含各待驗抗體之投予試樣之投予。
(5)各待驗抗體之抗腫瘤效果之評價
人類癌細胞移植小鼠模型中之各待驗抗體之抗腫瘤效果，係測定從投予試樣之投予最終日起3日或7日後之腫瘤體積來評價。
<110> 中外製藥股份有限公司(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)
<120> 人型化抗表皮調節素抗體及包含該抗體為有效成分之癌治療劑(HUMANIZED ANTI-EPIREGULIN ANTIBODIES AND CANCER THERAPEUTIC AGENTS COMPRISING SAID ANTIBODIES AS ACTIVE INGREDIENTS)
<130> C1-A1114Y1-TW
<150> JP 2011-287654
<151> 2011-12-28
<150> JP 2012-133394
<151> 2012-06-13
<160> 171
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
<210> 5
<211> 23
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 7
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 8
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus Musculus)
<400> 9
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus Musculus)
<400> 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus Musculus)
<400> 11
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus Musculus)
<400> 12
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus Musculus)
<400> 13
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus Musculus)
<400> 14
<210> 15
<211> 116
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 15
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 16
<210> 17
<211> 30
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 17
<210> 18
<211> 32
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 18
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 19
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 20
<210> 21
<211> 32
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 21
<210> 22
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 22
<210> 23
<211> 32
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 23
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 24
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 25
<210> 26
<211> 328
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 26
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 27
<210> 28
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 28
<210> 29
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 29
<210> 30
<211> 328
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 30
<210> 31
<211> 328
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 31
<210> 32
<211> 446
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 32
<210> 33
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 33
<210> 34
<211> 46
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 34
<210> 35
<211> 32
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 35
<210> 36
<211> 32
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 36
<210> 37
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 37
<210> 38
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 38
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 39
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 40
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 41
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 42
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 43
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 44
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 45
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 46
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 47
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 48
<210> 49
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 49
<210> 50
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 50
<210> 51
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 51
<210> 52
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 52
<210> 53
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 53
<210> 54
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 54
<210> 55
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 55
<210> 56
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 56
<210> 57
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 57
<210> 58
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 59
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 60
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 61
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 62
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 63
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 64
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 65
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 66
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 67
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 68
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 69
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 70
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 71
<210> 72
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 72
<210> 73
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 73
<210> 74
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 74
<210> 75
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 75
<210> 76
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 76
<210> 77
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 77
<210> 78
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 78
<210> 79
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 79
<210> 80
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 80
<210> 81
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 81
<210> 82
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 82
<210> 83
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 83
<210> 84
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 84
<210> 85
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 85
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 86
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 87
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 88
<210> 89
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 89
<210> 90
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 90
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 91
<210> 92
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 92
<210> 93
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 93
<210> 94
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 94
<210> 95
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 95
<210> 96
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 96
<210> 97
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 97
<210> 98
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 98
<210> 99
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 99
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 100
<210> 101
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 101
<210> 102
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 102
<210> 103
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 103
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 104
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 105
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 106
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 107
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 108
<210> 109
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 109
<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 110
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 111
<210> 112
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 112
<210> 113
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 113
<210> 114
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 114
<210> 115
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 115
<210> 116
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 116
<210> 117
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 117
<210> 118
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 118
<210> 119
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 119
<210> 120
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 120
<210> 121
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 121
<210> 122
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 122
<210> 123
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 123
<210> 124
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 124
<210> 125
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 125
<210> 126
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 126
<210> 127
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 127
<210> 128
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 128
<210> 129
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 129
<210> 130
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 130
<210> 131
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 131
<210> 132
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 132
<210> 133
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 133
<210> 134
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 134
<210> 135
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 135
<210> 136
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 136
<210> 137
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 137
<210> 138
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 138
<210> 139
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 139
<210> 140
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 140
<210> 141
<211> 213
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 141
<210> 142
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 142
<210> 143
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 143
<210> 144
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 144
<210> 145
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 145
<210> 146
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 146
<210> 147
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 147
<210> 148
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 148
<210> 149
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 149
<210> 150
<211> 444
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 150
<210> 151
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 151
<210> 152
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 152
<210> 153
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 153
<210> 154
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 154
<210> 155
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 155
<210> 156
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 156
<210> 157
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 157
<210> 158
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 158
<210> 159
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 159
<210> 160
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 160
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 161
<210> 162
<211> 23
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 162
<210> 163
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 163
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 164
<210> 165
<211> 169
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 165
<210> 166
<211> 1210
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 166
<210> 167
<211> 169
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 167
<210> 168
<211> 19
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> 人工合成的胜肽序列
<400> 168
<210> 169
<211> 507
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 169
<210> 170
<211> 46
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 170
<210> 171
<211> 34
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 171

Claims (8)

  1. 一種抗表皮調節素抗體，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，該重鏈可變區含有序列編號：9之重鏈CDR1、序列編號：160之重鏈CDR2、及序列編號：158之重鏈CDR3，該輕鏈可變區含有序列編號：163之輕鏈CDR1、序列編號：13之輕鏈CDR2、及序列編號：164之輕鏈CDR3。
  2. 一種抗表皮調節素抗體，其包含一對應於序列編號：150中的重鏈可變區之重鏈可變區，以及一對應於序列編號：141中的輕鏈可變區之輕鏈可變區。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗表皮調節素抗體，其包含序列編號：30的重鏈恆定區。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之抗表皮調節素抗體，其包含序列編號：27的輕鏈恆定區。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之抗表皮調節素抗體，其具有中和活性。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之抗表皮調節素抗體，其具有細胞毒性。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗表皮調節素抗體，其中細胞毒性為CDC及/或ADCC。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之抗表皮調節素抗體，其中一增殖抑制劑或一細胞毒性物質連結至該抗體。
TW101150028A 2011-12-28 2012-12-26 Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient TWI593705B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011287654 2011-12-28
JP2012133394 2012-06-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201335183A TW201335183A (zh) 2013-09-01
TWI593705B true TWI593705B (zh) 2017-08-01

Family

ID=48697597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW101150028A TWI593705B (zh) 2011-12-28 2012-12-26 Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient

Country Status (23)

Country Link
US (2) US9556264B2 (zh)
EP (1) EP2799543A4 (zh)
JP (2) JP6010551B2 (zh)
KR (1) KR20140107610A (zh)
CN (1) CN104136610B (zh)
AU (1) AU2012361510B9 (zh)
BR (1) BR112014015581A2 (zh)
CA (1) CA2862254A1 (zh)
CL (1) CL2014001730A1 (zh)
CO (1) CO7101193A2 (zh)
CR (1) CR20140352A (zh)
HK (1) HK1200187A1 (zh)
IL (1) IL233368A0 (zh)
MX (1) MX350044B (zh)
MY (1) MY172428A (zh)
PE (1) PE20141560A1 (zh)
PH (1) PH12014501468A1 (zh)
RU (1) RU2634383C2 (zh)
SG (2) SG10201508095UA (zh)
TW (1) TWI593705B (zh)
UA (1) UA115046C2 (zh)
WO (1) WO2013100120A1 (zh)
ZA (1) ZA201405405B (zh)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007312367B2 (en) 2006-10-12 2012-09-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-EREG antibody
EP2436397B1 (en) 2009-05-29 2017-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing antagonist of egf family ligand as component
BR112013032630B1 (pt) 2011-06-30 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polipeptídeo heterodimerizado compreendendo região fc de igg
EP3603671A3 (en) 2011-10-28 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell-specific molecule
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
DK2940135T5 (da) 2012-12-27 2021-09-20 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Heterodimeriseret polypeptid
CN105517571A (zh) * 2013-06-24 2016-04-20 中外制药株式会社 含有人源化抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分的腺癌以外的非小细胞肺癌的治疗药
TWI787590B (zh) * 2013-12-27 2022-12-21 日商中外製藥股份有限公司 等電點低之抗體的精製方法
BR112016025312A2 (pt) * 2014-05-01 2017-10-17 Genentech Inc variantes de anticorpo, anticorpo anti-fator d, formulação farmacêutica, dispositivo de distribuição, utilização da formulação e de uma composição, composição e método de tratamento de uma desordem
EP3185004A4 (en) * 2014-08-20 2018-05-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for measuring viscosity of protein solution
JP2019202936A (ja) * 2016-08-17 2019-11-28 中外製薬株式会社 抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体と抗ＥＧＦＲ抗体との併用医薬
US20190382484A1 (en) 2017-02-24 2019-12-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition, antigen-binding molecules, treatment method, and screening method
CA3063344A1 (en) * 2017-05-23 2018-11-29 Helmholtz Zentrum Munchen - Deutsches Forschungszentrum Fur Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Novel cd73 antibody, preparation and uses thereof
GB201803892D0 (en) * 2018-03-12 2018-04-25 Ultrahuman Six Ltd C-met binding agents
WO2020045545A1 (ja) 2018-08-29 2020-03-05 中外製薬株式会社 抗体半分子、および抗体半分子のホモ二量体形成を抑制する方法
JPWO2020153467A1 (ja) * 2019-01-24 2021-12-02 中外製薬株式会社 新規がん抗原及びそれらの抗原に対する抗体
JP7232707B2 (ja) 2019-05-21 2023-03-03 トーソー株式会社 ブラケット構造
CN112574308A (zh) 2019-09-30 2021-03-30 和铂医药(苏州)有限公司 靶向bcma的抗体、双特异性抗体及其用途
CN113150155B (zh) * 2021-04-22 2022-04-08 安徽瀚海博兴生物技术有限公司 一种抗pd-l1人源化单克隆抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004065540A2 (en) * 2003-01-22 2004-08-05 Glycart Biotechnology Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
EP2070548A1 (en) * 2006-10-12 2009-06-17 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
WO2010142990A1 (en) * 2009-06-09 2010-12-16 Affitech Research As ANTI-EpCAM ANTIBODIES

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5190858A (en) 1989-02-01 1993-03-02 Oncogene Science, Inc. Monoclonal antibodies directed to epitopes of human transforming growth factor--α and uses thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
DK1024191T3 (da) 1991-12-02 2008-12-08 Medical Res Council Fremstilling af autoantistoffer fremvist på fag-overflader ud fra antistofsegmentbiblioteker
CA2131151A1 (en) 1992-03-24 1994-09-30 Kevin S. Johnson Methods for producing members of specific binding pairs
ATE381614T1 (de) 1992-07-24 2008-01-15 Amgen Fremont Inc Bildung von xenogenen antikörpern
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5783417A (en) 1993-06-04 1998-07-21 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Human-derived tumor cell growth inhibitors
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
CA2177367A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Andrew David Griffiths Recombinant binding proteins and peptides
AU701342B2 (en) 1994-07-13 1999-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5994511A (en) 1997-07-02 1999-11-30 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and methods of improving polypeptides
US6172213B1 (en) 1997-07-02 2001-01-09 Genentech, Inc. Anti-IgE antibodies and method of improving polypeptides
SK14812000A3 (sk) 1998-04-03 2001-08-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Chimérny reťazec protilátky, chimérna protilátka, v oblasť, humanizovaný reťazec protilátky, humanizovaná protilátka, dna, expresný vektor, hostiteľ, spôsob prípravy a liečivo
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
EP2275540B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
EP1189641B1 (en) 1999-06-25 2009-07-29 Genentech, Inc. HUMANIZED ANTI-ErbB2 ANTIBODIES AND TREATMENT WITH ANTI-ErbB2 ANTIBODIES
CA2424602C (en) 2000-10-06 2012-09-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
CU22979A1 (es) 2000-12-08 2004-09-09 Centro Inmunologia Molecular Combinación inmunoterapéutica para el tratamiento de tumores que sobre-expresan receptores con actividad quinasa en residuos de tirosina
US20030003097A1 (en) 2001-04-02 2003-01-02 Idec Pharmaceutical Corporation Recombinant antibodies coexpressed with GnTIII
WO2003057881A1 (fr) 2001-12-28 2003-07-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procede de stabilisation d'une proteine
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
EP1514928B1 (en) 2002-06-05 2013-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing antibodies using baculoviruses
PT1517921E (pt) 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
BRPI0314814C1 (pt) 2002-09-27 2021-07-27 Xencor Inc anticorpo compreendendo uma variante de fc
RU2312109C2 (ru) * 2003-03-14 2007-12-10 Тайсо Фармасьютикал Ко., Лтд. Моноклональное антитело и продуцирующая его гибридома
US7195764B2 (en) 2003-04-14 2007-03-27 Arius Research Inc. Cancerous disease modifying antibodies
DK1704166T3 (en) 2004-01-07 2015-06-01 Novartis Vaccines & Diagnostic M-CSF-SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODY AND APPLICATIONS THEREOF
SV2006001990A (es) 2004-01-09 2006-01-30 Pfizer Anticuerpos contra madcam
DE602005015542D1 (de) 2004-01-12 2009-09-03 Applied Molecular Evolution Varianten der fc-region
WO2005076979A2 (en) 2004-02-06 2005-08-25 Wyeth Diagnosis and therapeutics for cancer
EA012464B1 (ru) 2004-08-04 2009-10-30 Эпплайд Молекьюлар Эволюшн, Инк. Антитело против cd20 и его применение
AU2005277567A1 (en) 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Llc Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
CA2577133A1 (en) 2004-08-19 2006-03-23 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
US20090061485A1 (en) 2004-12-22 2009-03-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of Producing an Antibody Using a Cell in Which the Function of Fucose Transporter Is Inhibited
CN101365712A (zh) 2005-01-11 2009-02-11 莫勒丘尔洛吉克斯有限公司 Pan-HER拮抗剂及其使用方法
EP1871808A2 (en) 2005-03-31 2008-01-02 Xencor, Inc. Fc VARIANTS WITH OPTIMIZED PROPERTIES
CA2606102C (en) 2005-04-26 2014-09-30 Medimmune, Inc. Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
WO2007015578A1 (ja) 2005-08-02 2007-02-08 Eisai R & D Management Co., Ltd. 血管新生阻害物質の効果を検定する方法
SI2573114T1 (sl) 2005-08-10 2016-08-31 Macrogenics, Inc. Identifikacija in inženiring protiteles z variantnimi fc regijami in postopki za njih uporabo
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
KR20090057936A (ko) 2006-02-08 2009-06-08 타게티드 몰레큘라 다이아그노스틱스, 엘엘씨 2가 ｅｒｂｂ 리간드 결합 분자 및 그의 제조 방법 및 사용방법
DK3056568T3 (da) 2006-03-31 2021-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåder til kontrollering af antistoffers blodfarmakokinetik
CN103408661B (zh) 2007-01-05 2016-04-06 苏黎世大学 提供疾患特异性结合分子和靶的方法
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
JP2009078946A (ja) 2007-09-26 2009-04-16 Fujifilm Corp コア−シェル型金属酸化物粒子及びその製造方法
CL2008002886A1 (es) 2007-09-26 2009-12-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de un anticuerpo humano; anticuerpo anti-receptor de interleucina-6 (il-6) y composicion farmaceutica que la comprende.
AU2008305851B2 (en) 2007-09-28 2014-12-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody having improved kinetics in plasma
EP2436397B1 (en) 2009-05-29 2017-05-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing antagonist of egf family ligand as component
GB0909906D0 (en) 2009-06-09 2009-07-22 Affitech As Antibodies
CN103328626B (zh) 2010-10-06 2017-02-08 中外制药株式会社 癌干细胞群及其制备方法
BR112013032630B1 (pt) * 2011-06-30 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polipeptídeo heterodimerizado compreendendo região fc de igg
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
CN105517571A (zh) 2013-06-24 2016-04-20 中外制药株式会社 含有人源化抗上皮调节蛋白抗体作为有效成分的腺癌以外的非小细胞肺癌的治疗药

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004065540A2 (en) * 2003-01-22 2004-08-05 Glycart Biotechnology Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
EP2070548A1 (en) * 2006-10-12 2009-06-17 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
WO2010142990A1 (en) * 2009-06-09 2010-12-16 Affitech Research As ANTI-EpCAM ANTIBODIES

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Imai-Nishiya H et al., "Double knockdown of α1,6-fucosyltransferase (FUT8) and GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) in antibody-producing cells: a new strategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies with enhanced ADCC", BMC Biotechnology 2007;7:84 doi:10.1186/1472-6750-7-84, 2007/11/30 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2799543A1 (en) 2014-11-05
CO7101193A2 (es) 2014-10-31
AU2012361510B2 (en) 2018-04-26
RU2634383C2 (ru) 2017-10-26
SG10201508095UA (en) 2015-10-29
ZA201405405B (en) 2017-06-28
JP2017043622A (ja) 2017-03-02
AU2012361510B8 (en) 2018-05-10
BR112014015581A2 (pt) 2020-10-27
IL233368A0 (en) 2014-08-31
JP6329601B2 (ja) 2018-05-23
RU2014130766A (ru) 2016-02-20
PH12014501468A1 (en) 2014-10-08
PE20141560A1 (es) 2014-11-13
AU2012361510B9 (en) 2018-05-10
MY172428A (en) 2019-11-25
US9556264B2 (en) 2017-01-31
AU2012361510A1 (en) 2014-07-10
CN104136610A (zh) 2014-11-05
HK1200187A1 (zh) 2015-07-31
EP2799543A4 (en) 2015-07-29
KR20140107610A (ko) 2014-09-04
AU2012361510A8 (en) 2018-04-26
TW201335183A (zh) 2013-09-01
SG11201403565XA (en) 2014-10-30
NZ627024A (en) 2016-09-30
WO2013100120A1 (ja) 2013-07-04
MX2014008009A (es) 2014-11-14
JP6010551B2 (ja) 2016-10-19
CL2014001730A1 (es) 2014-10-17
CN104136610B (zh) 2018-05-29
CR20140352A (es) 2014-08-28
UA115046C2 (uk) 2017-09-11
JPWO2013100120A1 (ja) 2015-05-11
US20150110793A1 (en) 2015-04-23
US20170129950A1 (en) 2017-05-11
MX350044B (es) 2017-08-24
CA2862254A1 (en) 2013-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI593705B (zh) Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
CN105473615B (zh) 抗-CD38抗体和与致弱干扰素α-2B的融合体
TWI639441B (zh) 反應b7-h3之抗體、其免疫活性片段及使用
ES2864700T3 (es) Moléculas de unión al antígeno HER3
AU2015313268B2 (en) Cancer-cell-specific antibody, anticancer agent, and cancer testing method
KR20180072821A (ko) Pd-1과 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
TR201806936T4 (tr) Anti-dll3 antikoru.
WO2014208482A1 (ja) ヒト化抗Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ抗体を有効成分として含む腺癌以外の非小細胞肺癌の治療剤
WO2011105573A1 (ja) 抗icam3抗体およびその用途
CN114206929A (zh) 一种抗tigit免疫抑制剂及应用
CN117377694A (zh) 包含cd3抗原结合结构域的蛋白质及其用途
NZ627024B2 (en) Humanized anti-epiregulin antibody, and cancer therapeutic agent comprising said antibody as active ingredient
JP2023528350A (ja) Ｃｄ３抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees