KR20210138588A - 세포외 소포 상에서 막 관련 단백질을 검출하고 정량하기 위한 방법 - Google Patents

세포외 소포 상에서 막 관련 단백질을 검출하고 정량하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본원 발명은 막 관련 종양 항원을 포함하는 세포외 소포-기초된 교정기를 통합하는, 막 관련 단백질, 예를 들면, 순환 CD20 (cCD20)의 검출 및/또는 정량을 위한 검정뿐만 아니라 과증식성 장애의 검출과 치료에서 이런 검정의 용도를 제공한다.

Description

세포외 소포 상에서 막 관련 단백질을 검출하고 정량하기 위한 방법
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 3월 8일자 제출된 U.S. 가출원 일련 번호 62/815,863에 우선권을 주장하고, 이의 내용은 전체적으로 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본원 발명은 막 관련 단백질을 포함하는 세포외 소포-기초된 교정기를 통합하는, 막 관련 단백질, 예를 들면, 순환 CD20 (cCD20)의 검출 및/또는 정량을 위한 검정뿐만 아니라 과증식성 장애의 검출과 치료에서 이런 검정의 용도를 제공한다.
배경
B-림프구 항원 CD20 (인간 B-림프구-한정된 분화 항원, Bp35로 또한 불림)은 대략 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 막경유 단백질이다. CD20은 전구- 및 성숙-B-림프구의 표면 상에서 검출될 수 있다. CD20은 B 세포 주기 개시, 세포 분화, 그리고 세포 증식을 위한 활성화 과정에서 초기 단계(들)를 조절한다. CD20은 또한, 칼슘 이온 통로로서 기능하는 것으로 알려져 있다.
CD20은 세포 표면에서, 그리고 세포질 내에 위치된 N 및 C 말단 둘 모두에서 큰 세포외 루프를 형성하는 4개의 막경유 스패닝 영역을 갖는 막 단백질이다. 이의 C 및 N 말단 둘 모두 세포질 내에 위치되기 때문에, 결합 항체 상에서, CD20은 세포 표면으로부터 탈락되거나 또는 개열될 것 같지 않은 것으로 고려되었다. CD20은 지질 뗏목으로 전위할 때, 이합체 또는 소중합체를 형성할 수 있다. B 세포 림프종에서 CD20의 발현을 고려할 때, 이러한 항원은 다른 막 관련 종양 항원과 유사하게, 이런 림프종의 "표적화"에 대한 후보로서 역할을 할 수 있다. 예를 들면, 세포외 루프에 결합하는 B 세포의 CD20 표면 항원에 대해 특이적인 항체가 신생물 B 세포의 파괴와 고갈을 조장하기 위해 환자에게 투여되었다. 추가적으로, 신생물 B 세포로 특이적으로 "전달"되도록, 종양을 파괴하는 잠재력을 갖는 화학적 작용제 또는 방사성 표지가 항-CD20 항체에 접합될 수 있다. 앞서 말한 내용에 비추어, CD20 항체는 만성 림프성 백혈병, 비호지킨 림프종, 또는 호지킨병을 앓는 환자를 비롯하여, 림프구증식 장애를 앓는 환자의 요법에서 증가하는 역할을 수행하고 있다.
막 관련 단백질은 세포막 단편 또는 큰 막 복합체에서 다른 단백질과 함께 순환할 수 있다. 예를 들면, 순환 CD20 단백질은 전장 단백질로서 순환 동안 막 관련 입자의 문맥 내에 존재할 수 있다. 따라서, 순환 동안 존재할 때, 이들 막 관련 단백질 약물 표적, 예컨대 CD20은 치료 항체에 결합하여 이들을 격리할 수 있고, 그리고 이런 이유로, 종양을 표적화하도록 의도된, 항-CD20 항체에 대한 약물 싱크 (drug sink)로서 행동한다. 이런 격리는 치료 항체의 치료 효율을 감소시킬 수 있다. 막 관련 단백질, 예를 들면, 순환 CD20은 또한, 림프구증식 장애 예컨대 만성 림프성 백혈병, 비호지킨 림프종, 또는 호지킨병에 대한 바이오마커로서 뿐만 아니라 특이적 종양 항원의 존재에 의존하는 치료에 대한 반응의 가능성과 연관된 마커로서 행동할 수 있다. 과증식성 장애 검출과 치료에 대하여, 막 관련 단백질, 예를 들면, 순환 CD20의 유의미한 역할을 고려할 때, 개체 내에 존재하는 막 관련 종양 항원, 예를 들면, 순환 CD20의 양을 결정하기 위한 검정이 당해 분야에서 여전히 요구된다.
요약
본원에서 개시된 요부는 막 관련 단백질을 포함하는 세포외 소포-기초된 교정기를 통합하는, 막 단백질, 예를 들면, 순환 CD20 (cCD20)의 검출 및/또는 정량을 위한 검정과 방법뿐만 아니라 과증식성 장애의 검출과 치료에서 이런 검정의 용도에 관계한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 표본 내에서 막 관련 단백질을 검출하기 위한 검정에 관계하고, 이들 검정은 a) 표본 내에서 막 관련 단백질을 포함하는 세포외 소포에 결합하여, 포획 항체-세포외 소포 복합체를 산출하는 포획 항체, 그리고 b) 포획 항체-세포외 소포 복합체에 결합하여, 검출가능한 결합된 복합체를 형성하는 검출 항체를 포함하되, 상기 검출가능한 결합된 복합체로부터 획득된 신호가 상기 단백질을 포함하는 세포외 소포로부터 검출된 하나 또는 그 이상의 공지된 값에 대해 교정된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 검정은 세포외 소포 교정기를 더욱 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 검정은 검출 항체와의 결합에 대해 경쟁하지 않는 포획 항체를 포함한다. 일정한 구체예에서, 포획 항체는 검출 항체와 상이한 에피토프에 결합한다. 일정한 구체예에서, 포획 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 검출 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 표본 내에서 막 관련 단백질이 활용되는 검정에 관계한다. 일정한 구체예에서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 막 관련 단백질은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원, 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 표본 내에서 순환 단백질의 농도를 정량하기 위한 방법에 관계하고, 이들 방법은 a) 표본 내에서 세포외 소포에서 표적 단백질의 수준을 결정하는 단계, 그리고 b) 표본 내에서 세포외 소포에서 상기 단백질의 수준을, 표적 단백질을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 산출된 교정 곡선과 비교하는 단계를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 표본 내에서 순환 단백질의 농도를 정량하기 위한 방법에 관계하고, 이들 방법은 a) 상기 단백질을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 교정 곡선을 산출하는 단계, 그리고 b) 표본 내에서 세포외 소포에서 표적 단백질의 수준을 교정 곡선과 비교하여, 표본 내에서 세포외 소포에서 상기 단백질의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 B-세포 림프종을 앓는 환자가 항-CD20 요법에 대한 반응을 나타낼 가능성이 높은 지를 결정하기 위한 방법에 관계하고, 이들 방법은 a) 환자로부터 표본을 획득하는 단계, b) 표본 내에서 세포외 소포에서 순환 CD20의 양을 결정하는 단계, c) 표본 내에서 세포외 소포에서 CD20의 수준을, CD20을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 산출된 교정 곡선과 비교하는 단계, 그리고 d) 표본에서 결정된 세포외 소포에서 순환 CD20의 양에 근거하여, 환자가 CD20 요법에 대한 반응을 나타낼 가능성이 높은 지를 결정하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 항-CD20 요법은 항-CD20 항체의 투여를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 항-표적 단백질 항체, 예를 들면, 항-CD20 항체의 친화성을 결정하기 위한 방법에 관계하고, 이들 방법은 상기 항체에 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 실행하되, 상기 SPR 분석이 리간드로서 표적 단백질, 예를 들면, CD20을 발현하는 세포외 소포 및 피분석물로서 항체, 예를 들면, 항-CD20 항체의 이용을 포함하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, SPR 분석은 2개 또는 그 이상의 항-표적 항체를 구별하기 위해 본원에서 설명된 바와 같이 이용된다. 일정한 구체예에서, SPR 분석은 항-표적 항체의 순위 매김을 가능하게 한다. 일정한 구체예에서, 특정 항-표적 항체의 선택은 SPR 분석을 통한 2개 또는 그 이상의 항-표적 항체를 순위 매기고 가장 높게 순위 매겨진 항-표적 항체를 선택함으로써, 또는 원하는 친화성을 나타내는 항-표적 항체를 선택함으로써 수행된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 환자로부터 획득된 T 세포의 활성화를 결정하기 위한 방법에 관계하고, 이들 방법은 a) CD20을 발현하는 세포외 소포를 T 세포 및 CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체와 함께 배양하는 단계, 그리고 b) T 세포의 활성화를 결정하는 단계를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 치료가 필요한 개체에서 종양을 치료하는 방법에 관계하고, 이들 방법은 a) 개체로부터 표본을 획득하는 단계, b) 종양 항원을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 교정 곡선을 산출하는 단계, c) 표본 내에서 세포외 소포에서 종양 항원의 수준을 교정 곡선과 비교하여, 표본 내에서 세포외 소포에서 표적 종양 항원의 양을 결정하는 단계, d) 표본 내에서 세포외 소포에서 종양 항원의 수준에 근거하여, 개체가 항체 요법에 대한 반응을 나타낼 가능성이 높은 지를 결정하는 단계, 그리고 e) d)에서 결정에 대응하여 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 방법은 세포외 마커를 이용하여 세포외 소포의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 단계를 더욱 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 막 관련 단백질의 농도 및 교정 곡선이 면역검정, ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정되는 방법에 관계한다. 일정한 구체예에서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 종양 항원은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원 및 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 항-CD20 항체를 활용하는 방법에 관계하고, 여기서 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
도면의 간단한 설명
도 1a는 전장 단백질로서 순환 동안 막 관련 입자로서 존재하는 예시적인 cCD20 구조를 묘사한다. 도 1b는 I형 CD20 항체의 예시적인 사합체내 결합 기전을 묘사한다.
도 2는 웨스턴 블롯에 의한 막 관련 소포 교정기의 예시적인 특징화를 묘사하는데, 여기서 칼럼 1은 마커를 나타내고, 칼럼 2는 EV 2ug를 나타내고, 칼럼 3은 EV 1ug를 나타내고, 칼럼 4는 EV 0.5ug를 나타내고, 칼럼 5는 EV 0.25ug를 나타내고, 칼럼 6은 rhCD20 250ng를 나타내고, 칼럼 7은 rCD20 100ng를 나타내고, 칼럼 8은 rCD20 40ng를 나타내고, 칼럼 9는 rCD20 16ng를 나타내고, 그리고 칼럼 10은 rCD20 6.4ng를 나타낸다.
도 3은 막 및/또는 세포외 소포에서 CD20의 예시적인 특징화를 묘사한다.
도 4는 2가지 항-CD20 항체 중 어느 한 가지로 포획 및 검출 (왼쪽 패널); 또는 항-CD20 항체로 포획, 그리고 항-CD9, 항-CD63 및 항-CD81 항체로 검출 (오른쪽 패널)의 결과를 묘사한다.
도 5a는 예시적인 3-일 순차 검정 형식을 묘사한다. 도 5b는 예시적인 가교 검정 형식을 묘사한다.
도 6은 예시적인 대안 면역검정 형식을 묘사한다.
도 7은 CD20 검출에 대한 세정제의 영향의 예시적인 분석을 묘사한다.
도 8은 예시적인 약물 내성 분석을 묘사한다.
도 9a는 세포외 소포 상에서 발현된 CD20에 대한 항-CD20 TDB의 특징화를 위한 예시적인 검정 형식을 묘사한다. 도 9b는 동역학적 분석 및 Biacore 센서그램에 의해 결정된 바와 같은, CD20 EVs에 대한 항-CD20 TDB의 예시적인 결합 친화성을 묘사한다.
도 10은 예시적인 표준 곡선을 묘사한다.
상세한 설명
본원 발명은 막 관련 단백질을 포함하는 세포외 소포-기초된 교정기를 통합하는, 막 관련 단백질, 예를 들면, 순환 CD20의 검출 및/또는 정량을 위한 검정뿐만 아니라 과증식성 장애의 검출과 치료에서 이런 검정의 용도를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 검정은 표본 내에서 세포외 소포 내에 존재하는 CD20의 수준을 결정하고 표본 내에서 CD20의 수준을 CD20을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 산출된 교정 곡선과 비교함으로써, 막 관련, 예를 들면, 세포외 소포 관련, 단백질, 예를 들면, 순환 CD20의 농도를 정량하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 항체를 이용하는 면역검정, 예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯이 표본 내에서 또는 교정 곡선의 준비와 관련하여 막 관련 단백질의 농도를 결정하는 데 이용된다.
명료함을 위해, 하지만 제한 없이, 본원에서 개시된 요부의 상세한 설명은 하기의 하위섹션으로 나눠진다:
I. 정의;
II. 면역검정;
III. 항체;
IV. 키트; 그리고
V. 예시적인 구체예.
I. 정의
별도로 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본원 발명이 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 다음의 참고문헌은 본원 발명에서 이용된 많은 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 그리고 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에서 이용된 바와 같이, 하기 용어는 별도로 명시되지 않으면, 아래에서 그들에 생득된 의미를 갖는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정될 때 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미할 수 있는데, 이것은 상기 값이 어떻게 계측되거나 또는 결정되는 지, 예를 들면, 계측 시스템의 제한에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들면, "약"은 소정의 값에서 관례에 따라, 1 이내 또는 1보다 큰 표준 편차를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구항에서 설명되는 경우에, 별도로 명시되지 않으면, 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위, 예컨대 용어 "약" 에 의해 수식된 값의 ±10%를 의미할 수 있다.
본원에서 목적으로 용어 "수용자 인간 프레임워크"는 아래에 규정된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변화를 내포할 수 있다. 일정한 구체예에서, 아미노산 변화의 숫자는 10 또는 그 이하, 9 또는 그 이하, 8 또는 그 이하, 7 또는 그 이하, 6 또는 그 이하, 5 또는 그 이하, 4 또는 그 이하, 3 또는 그 이하, 또는 2 또는 그 이하이다. 일정한 구체예에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열에서 동일하다.
용어 "친화성"은 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이에 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (KD)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 구체예는 하기에서 설명된다.
용어 "친화성 성숙된" 항체는 변경을 갖지 않는 부모 항체와 비교하여, 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 (HVRs)에서 한 가지 또는 그 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하는데, 이런 변경은 항원에 대한 항체의 친화성에서 향상을 유발한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv); 그리고 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
관심되는 항원, 예를 들면, CD20 단백질에 "결합하는 항체"는 상기 항체가 검정 시약으로서, 예컨대 포획 항체로서 또는 검출 항체로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 항원에 결합하는 항체이다. 전형적으로, 이런 항체는 다른 폴리펩티드와 유의미하게 교차반응하지 않는다. 표적 분자에 폴리펩티드의 결합에 대하여, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 표적 상에서 에피토프에 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적이다"는 비특이적 상호작용과 계측가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들면, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조 분자의 결합과 비교하여 표적 분자의 결합을 결정함으로써 계측될 수 있다.
용어 "항종양 항원 항체"는 항체가 종양 항원, 예를 들면, CD20을 표적화하는 작용제로서, 예를 들면, 본원에서 설명된 검정에서 작용제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 종양 항원에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 관련 없는 단백질에 항종양 항원 항체의 결합의 정도는 예를 들면, 방사면역검정 (RIA)에 의해 계측될 때 표적화된 종양 항원에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 구체예에서, 표적화된 종양 항원에 결합하는 항체는 ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 μM, ≤ 10 μM, ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된, CD20에 결합하는 항체의 KD는 10-3 M 또는 그 이하 또는 10-8 M 또는 그 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된, 표적화된 종양 항원에 결합하는 항체의 KD는 10-10 M 내지 10-13 M일 수 있다. 일정한 구체예에서, 항종양 항원 항체는 상이한 종으로부터 표적화된 종양 항원 사이에서 보존되는, 표적화된 종양 항원의 에피토프에 결합한다.
참조 항체와 "결합에 대해 경쟁하는 항체"는 경쟁 검정에서 항원에 대한 참조 항체의 결합을 50% 또는 그 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 그리고 반대로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 항원에 대한 항체의 결합을 50% 또는 그 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정은 "Antibodies", Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)에서 설명된다.
"B-세포"는 골수 내에서 성숙하는 림프구이고, 그리고 미경험 B 세포, 기억 B 세포, 또는 작동체 B 세포 (혈장 세포)를 포함한다. 본원에서 B-세포는 정상적인 또는 비악성 B-세포일 수 있다.
"결합 도메인"은 표적 에피토프, 항원, 리간드, 또는 수용체에 특이적으로 결합하는 화합물 또는 분자의 부분인 것으로 의미된다. 결합 도메인은 항체 (예를 들면, 단일클론, 다중클론, 재조합, 인간화 및 키메라 항체), 항체 단편 또는 이들의 부분 (예를 들면, Fab 단편, Fab′2, scFv 항체, SMIP, 도메인 항체, 디아바디, 미니바디, scFv-Fc, 어피바디, 나노바디 및 항체의 VH 및/또는 VL 도메인), 수용체, 리간드, 앱타머, 그리고 확인된 결합 파트너를 갖는 다른 분자를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "포획 항체"는 표본 내에서 표적 분자, 예를 들면, CD20의 형태에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 일정한 조건 하에, 포획 항체는 항체-표적 분자 복합체가 표본의 나머지 부분으로부터 분리될 수 있도록, 표적 분자와 복합체를 형성한다. 일정한 구체예에서, 이런 분리는 포획 항체에 결합하지 않은, 표본 내에서 물질 또는 재료를 씻어내는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 포획 항체는 고체 지지체 표면, 예컨대 예를 들면 하지만 제한 없이, 평판 또는 비드, 예를 들면, 상자성 비드에 부착될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "CD20"은 말초혈 또는 림프성 장기로부터 유래된 B 세포 중 90% 이상의 표면 상에서 발견되는 거의 35 kDa, 인단백질인 CD20 항원을 지칭한다. CD20은 초기 전구 B 세포 발달 동안 발현되고 형질 세포 분화 때까지 남아있다. CD20은 정상적인 B 세포뿐만 아니라 악성 B 세포 둘 모두 상에 존재한다. 기존 문헌에서 CD20에 대한 다른 명칭은 "B-림프구-한정된 항원" 및 "Bp35"를 포함한다. CD20 항원은 예를 들면, Clark et al. PNAS (USA) 82:1766 (1985)에서 설명된다.
본원에서 용어 "CD20 핵산"은 CD20 단백질의 적어도 일부를 인코딩하는 핵산 (DNA 및 mRNA 포함) 및/또는 상보성 핵산을 지칭한다.
"종양 항원을 검출하는"은 표본이 종양 항원을 포함하는 지를 평가하는 것으로 의미된다. 일반적으로, 종양 항원 단백질, 예를 들면, CD20 단백질이 검출될 것이지만, 종양 항원 핵산, 예를 들면, CD20 핵산을 검출하는 것 또한 본원에서 이러한 관용구에 의해 포괄된다.
본원에서 용어 "종양 항원 핵산"은 종양 항원 단백질의 적어도 일부를 인코딩하는 핵산 (DNA 및 mRNA 포함) 및/또는 상보성 핵산을 지칭한다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본 명세서 및 청구항 전반에서, 단어 "포함한다" 또는 변이, 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 완전체 또는 완전체의 군의 포함, 그러나 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 군의 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
용어 "상관시키다" 또는 "상관시키는"은 일차 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과를 이차 분석 또는 프로토콜의 성과 및/또는 결과와, 어떤 방식으로든 비교하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 두 번째 프로토콜을 실행함에 있어서 일차 분석 또는 프로토콜의 결과가 이용될 수 있고 및/또는 이차 분석 또는 프로토콜이 수행되어야 하는 지를 결정하기 위해 일차 분석 또는 프로토콜의 결과가 이용될 수 있다. 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 구체예에 대하여, 특정한 치료 섭생이 수행되어야 하는 지를 결정하기 위해 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 결과가 이용될 수 있다.
본원에서 용어 "검출하는"은 표적 분자, 예를 들면, CD20 또는 이의 처리된 형태의 정성적 및 정량적 계측 둘 모두를 포함하는 데 이용된다. 일정한 구체예에서, 검출하는 것은 표본 내에서 표적 분자의 존재를 단순히 확인하는 것뿐만 아니라 표적 분자가 표본 내에서 검출가능한 수준으로 존재하는 지를 결정하는 단계를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "검출 항체"는 표본 내에서 또는 표본-포획 항체 조합 물질 내에서 표적 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 일정한 조건 하에, 검출 항체는 표적 분자 또는 표적 분자-포획 항체 복합체와 복합체를 형성한다. 검출 항체는 증폭될 수 있는 표지를 통해 직접적으로, 또는 예를 들면, 표지화되고 검출 항체에 결합하는 다른 항체의 이용을 통해 간접적으로 검출될 수 있다. 직접적인 표지화의 경우에, 검출 항체는 전형적으로, 일부 수단, 예를 들면, 비오틴 또는 루테늄을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 수단에 의해 검출가능한 모이어티에 접합된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "검출 수단"은 신호 리포팅을 통해 검출가능한 항체의 존재를 검출하는 데 이용된 모이어티 또는 기술을 지칭하고, 상기 리포팅은 이후, 검정에서 판독된다. 전형적으로, 검출 수단은 고정된 표지, 예컨대 마이크로역가 평판 위에 포획된 표지를 증폭하는 시약, 예를 들면, 검출 작용제, 예를 들면, 아비딘, 스트렙타비딘-HRP 또는 스트렙타비딘-β-D-갈락토피라노오스를 이용한다.
작용제의 "효과량"은 이것이 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 유발하는 데 필요한 양을 지칭한다.
용어 "작동체 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 작동체 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절; 그리고 B 세포 활성화.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는 데 이용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일정한 구체예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 카르복실 말단까지 걸친다. 하지만, Fc 영역의 C 말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 별도로 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 영역을 내포하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다.
"이종다합체", "이종다합체성 복합체" 또는 "이종다합체성 단백질"은 첫 번째 힌지-내포 폴리펩티드 및 두 번째 힌지-내포 폴리펩티드를 적어도 포함하는 분자를 지칭하고, 여기서 두 번째 힌지-내포 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 의해, 첫 번째 힌지-내포 폴리펩티드와 아미노산 서열에서 서로 다르다. 이종다합체는 첫 번째와 두 번째 힌지-내포 폴리펩티드에 의해 형성된 "이종이합체"를 포함할 수 있거나, 또는 첫 번째와 두 번째 힌지-내포 폴리펩티드 이외에 폴리펩티드가 존재하는 고차 삼차 구조를 형성할 수 있다. 이종다합체의 폴리펩티드는 비펩티드성, 공유 결합 (예를 들면, 이황화 결합) 및/또는 비공유 상호작용 (예를 들면, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘 및/또는 소수성 상호작용)에 의해 서로 상호작용할 수 있다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 일차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전히 동일하지는 않을 수 있으며, 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 선별검사되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3의 경우에서와 같은 하위군이다. 일정한 구체예에서, VL의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 카파 I이다. 일정한 구체예에서, VH의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비인간 HVRs로부터 아미노산 잔기 및 인간 FRs로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 HVRs (예를 들면, HVRs)의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 FRs의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성 (본원에서 "상보성 결정 영역" 또는 "HVRs" 로서 또한 지칭됨)이고 및/또는 구조적으로 규정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고 및/또는 항원 접촉 잔기 ("항원 접촉")를 내포하는, 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, HVR 잔기 및 가변 도메인에서 다른 잔기 (예를 들면, FR 잔기)는 본원에서 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 넘버링된다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR: VH에서 3개 (H1, H2, H3), 그리고 VL에서 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 HVRs는 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 그리고 95-102 (H3)에서 발생하는 HVRs (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 그리고 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 그리고
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 그리고 94-102 (H3)를 비롯한, (a), (b) 및/또는 (c)의 조합. 본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, "개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐 및 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
"면역접합체"는 세포독성 작용제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한 가지 또는 그 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체를 지칭한다.
"단리된" 핵산은 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, "개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐 및 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
"항체를 인코딩하는 단리된 핵산" (특이적 항체, 예를 들면, 항-CD20 항체에 대한 참조 포함)은 항체 중쇄와 경쇄 (또는 이들의 단편)를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자, 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서 이런 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포 내에 하나 또는 그 이상의 위치에서 존재하는 이런 핵산 분자(들)를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "표지" 또는 "검출가능한 표지"는 검출되거나 또는 정량되는 물질, 예를 들면, 항체에 연결될 수 있는 임의의 화학적 기 또는 모이어티를 지칭한다. 표지는 물질의 민감한 검출 또는 정량에 적합한 검출가능한 표지이다. 검출가능한 표지의 무제한적 실례는 발광 표지, 예를 들면, 형광, 인광성, 화학발광, 생물발광 및 전기화학발광 표지, 방사성 표지, 효소, 입자, 자성 물질, 전기활성 종류 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 대안으로, 검출가능한 표지는 특이적 결합 반응에 참여함으로써 자신의 존재를 신호할 수도 있다. 이런 표지의 무제한적 실례는 합텐, 항체, 비오틴, 스트렙타비딘, his-태그, 니트릴로트리아세트산, 글루타티온 S-전달효소, 글루타티온 등을 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "막 관련 단백질"은 항원, 펩티드 및 단백질을 비롯한 임의의 막 관련 표적을 지칭한다. 막 관련 단백질은 내재성 막 단백질 및/또는 외재성 막 단백질을 포함할 수 있다. 막 관련 단백질의 무제한적 실례는 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원 및 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 그리고 이들의 조합을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 균질한 항체의 개체군으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 개체군을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 균질한 개체군으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본원에서 개시된 요부에 따라서 이용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "포장 삽입물"은 포장의 구성요소의 이용에 관한 정보를 내포하는 상업적인 포장 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭한다.
"병원성" 세포는 질환 또는 이상을 유발하는 것이고, 그리고 병든 조직 또는 세포 내에 또는 주변에 존재할 수 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 하지만, 본원에서 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 산출된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 소스 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087 하에 등록된다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc., South San Francisco, California로부터 공개적으로 가용하거나, 또는 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체계에서 이용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 세팅되고 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (이것은 대안으로, 소정의 아미노산 서열 B에 대해 일정한 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 아래와 같이 계산된다:
100 곱하기 분율 X/Y
여기서 X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해, 상기 프로그램의 A와 B의 정렬에서 동일한 정합으로서 채점된 아미노산 잔기의 숫자이고, 그리고 여기서 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우에, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것으로 인지될 것이다. 별도로 특정되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 직전 단락에서 설명된 바와 같이 획득된다.
본원에서 교체가능하게 이용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형이거나 또는 분지될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그리고 비-아미노산이 끼어들 수 있다. 이들 용어는 또한, 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분으로 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 또한, 상기 정의 내에는 예를 들면, 아미노산의 하나 또는 그 이상의 유사체 (예를 들면, 비자연적인 아미노산 등 포함)뿐만 아니라 당해 분야에서 공지된 다른 변형을 내포하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에서 이용된 바와 같이 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 항체를 특이적으로 포괄한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "표본"은 더 많은 양의 물질의 작은 부분을 지칭한다. 일정한 구체예에서, 표본은 배양 중인 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청, 혈액 혈장, 생물학적 유체 (예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 림프액, 복수, 도관 세척액, 타액 및 뇌척수액) 및 조직 표본을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 표본의 공급원은 고형 조직 (예를 들면, 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기, 조직 표본, 생검 또는 흡인물로부터), 혈액 또는 임의의 혈액 성분, 체액 (예컨대, 예를 들면, 소변, 림프, 뇌척수액, 양수, 복막액 또는 사이질액), 또는 순환성 세포를 비롯한, 개체로부터 획득된 세포일 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료"는 치료되는 개체 또는 세포의 자연 코스를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 그리고 임상 병리의 코스 전 또는 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환 또는 장애 또는 이의 증상의 발생 또는 재발을 예방하고, 질환의 상태 또는 증상을 경감하고, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과를 축소하고, 질환 진행의 속도를 감소시키고, 질환 상태를 개선하거나 또는 완화시키고, 그리고 관해 또는 향상된 예후를 달성하는 것을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 방법과 조성물은 질환 또는 장애의 발달을 지연시키려는 시도에서 유용하다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FRs) 및 3개의 초가변 영역 (HVRs)을 포함한다. (참조: 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 참조: 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
II. 면역검정
본원 발명은 막 관련 단백질, 예를 들면, 막 관련 단백질을 포함하는 세포외 소포-기초된 교정기를 통합하는 순환 CD20의 검출 및/또는 정량을 위한 검정뿐만 아니라 과증식성 장애의 검출과 치료에서 이런 검정의 용도를 제공한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 검정은 표본 내에서 세포외 소포 내에 존재하는 CD20의 수준을 결정하고 표본 내에서 CD20의 수준을 CD20을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 산출된 교정 곡선과 비교함으로써, 막 관련, 예를 들면, 세포외 소포 관련, 단백질, 예를 들면, 순환 CD20의 농도를 정량하는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 항체를 이용하는 면역검정, 예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯이 표본 내에서 또는 교정 곡선의 준비와 관련하여 막 관련 종양 항원의 농도를 결정하는 데 이용된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 막 관련 단백질의 검출과 정량을 위한 면역검정 방법을 제공한다. 예를 들면, 본원 발명의 면역검정 방법은 샌드위치 검정, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA) 검정, ELISA의 디지털 형태, 전기화학적 검정 (ECL) 검정 및 자성 면역검정을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 당해 분야에서 공지된 전략을 통합할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 세포외 소포 (EV)-기초된 교정기를 제공한다. EV 교정기는 막 결합된 단백질 교정기일 수 있다. 예를 들면, EV 교정기는 선천적 CD20에 확증적으로 유사할 수 있다. 오크렐리주맙이 4개의 막경유 스팬으로부터 발생하는 삼차 구조 (루프의 형태에서)를 갖는 CD20의 에피토프에 결합하기 때문에, 막 결합된 단백질 교정기를 산출하는 것이 중요하다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 EV 교정기를 산출하기 위한 방법을 제공한다. 예시적인 방법은 3 내지 4 일마다 시드 트레인을 계대하는 단계, 시드 트레인을 생산 배지에서 희석하여 배양액을 생산하는 단계, 생산 배양액을 형질감염시키는 단계 (예를 들면, DNA/jetPEI 복합체), 형질감염된 생산 배양액으로부터 EV 교정기를 수집하는 단계, 그리고 EV 교정기를 정제하는 단계를 포함한다. 정제된 EV 교정기는 웨스턴 로트를 통해 특징화될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 순차 검정을 위한 방법을 제공한다. 순차 검증은 3-일 순차 검정일 수 있다. 3-일 순차 검정은 향상된 민감도가 바람직한 사례에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 1일 차에, 평판은 4 ℃에서 포획 항체로 코팅될 수 있다. 2일 차에, 표본은 평판에 첨가되고 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양될 수 있다. 3일 차에, 검출 항체 (예를 들면, 비오틴에 접합됨) 및 시약 (예를 들면, HRP). 무제한적 구체예에서, Ocre (포획 항체), Ofa (검출 항체) 및 HRP 100ng/mL (신호)가 3-일 순차 검정에 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 가교 검정을 위한 방법을 제공한다. 가교 검정은 2-일 가교 검정일 수 있다. 2-일 가교 검정이 결과까지 감소된 시간이 바람직한 사례에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 1일 차에, 표본은 비오틴 접합된 오크렐리주맙 및 dig 접합된 오파투무맙 항체를 포함하는 마스터 믹스와 함께 배양될 수 있다. 2일 차에, 표본은 스트렙타비딘 평판으로 이전될 수 있고, 그리고 차후에, HRP 접합된 항-DIG 항체가 첨가되고 검출을 위해 배양될 수 있다. 무제한적 구체예에서, 평판은 검출 흡광도의 경우 450 nm 및 참조 흡광도의 경우 630 nm에서 판독될 수 있다. 표본 농도는 데이터를, 1/y2 곡선 가중치를 갖는 5-파라미터 로지스틱 곡선-적합 내로 입력함으로써 결정될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 방법은 표본 내에서 CD20 단백질에 포획 항-CD20 항체의 결합을 허용하는 조건 하에, 개체로부터 획득된 표본을 포획 항체, 예컨대 본원에서 설명된 것들과 접촉시키는 단계를 포함한다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 표본은 표본-포획 항체 조합 물질을 산출하기 위해, CD20 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 포획 항체와 함께 배양될 수 있다. 표본 및 포획 항체의 배양을 위한 조건은 검정의 민감도를 최대화하고 및/또는 해리를 최소화할 뿐만 아니라 표본 내에서 존재하는 CD20 단백질이 포획 항체에 결합하는 것을 담보하도록 선택될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 면역검정 방법에서 이용되는 포획 항체는 약 0.1 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml의 농도에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 포획 항체는 약 0.1 μg/ml 내지 약 0.5 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 1.0 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 1.5 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 2.0 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 2.5 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 3.0 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 3.5 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 4.0 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 4.5 μg/ml, 약 0.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 1.0 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 1.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 2.0 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 2.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 3.0 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 3.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 4.0 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 4.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 0.5 μg/ml 내지 약 2.0 μg/ml 또는 약 0.5 μg/ml 내지 약 1.0 μg/ml, 예를 들면, 약 0.5 μg/ml의 농도에서 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 포획 항체는 코팅 완충액에서 희석될 수 있다. 코팅 완충액의 무제한적 실례는 PBS, 탄산염 완충액, 중탄산염 완충액 또는 이들의 조합을 포함한다. 일정한 구체예에서, 코팅 완충액은 중탄산나트륨이다. 일정한 구체예에서, 코팅 완충액은 PBS이다. 일정한 구체예에서, 코팅 완충액은 약 10 mM 내지 약 1 M의 농도에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 코팅 완충액은 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 300 mM, 약 10 mM 내지 약 400 mM, 약 10 mM 내지 약 500 mM, 약 10 mM 내지 약 600 mM, 약 10 mM 내지 약 700 mM, 약 10 mM 내지 약 800 mM, 약 10 mM 내지 약 900 mM, 약 100 mM 내지 약 1 M, 약 200 mM 내지 약 1 M, 약 300 mM 내지 약 1 M, 약 400 mM 내지 약 1 M, 약 500 mM 내지 약 1 M, 약 600 mM 내지 약 1 M, 약 700 mM 내지 약 1 M, 약 800 mM 내지 약 1 M 또는 약 900 mM 내지 약 1 M의 농도에서 이용될 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, 포획 항체는 고체상 위에 고정될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 고체상은 예를 들면, 표면, 입자, 다공성 매트릭스, 비드 등의 형태에서 지지체를 비롯하여, 면역계측 검정에서 유용한 임의의 비활성 지지체 또는 운반체일 수 있다. 통상적으로 이용되는 지지체의 무제한적 실례는 작은 시트, SEPHADEX®, 겔, 폴리염화비닐, 플라스틱 비드, 그리고 96 웰 마이크로역가 평판을 비롯하여, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로부터 제조된 검정 평판 또는 시험관뿐만 아니라 미립자 물질, 예컨대 필터 페이퍼, 아가로오스, 교차연결된 덱스트란 및 다른 다당류를 포함한다. 일정한 구체예에서, 고정에 이용되는 고체상은 비드일 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원에서 개시된 포획 항체는 상자성 비드에 고정된다. 일정한 구체예에서, 고정된 포획 항체는 여러 표본을 한꺼번에 분석하는 데 이용될 수 있는 마이크로역가 평판 위에 코팅된다.
일정한 구체예에서, 포획 항체에 연계된 상자성 비드는 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 예를 들면, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 0.5 x 107개 비드/ml, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 1.0 x 107개 비드/ml, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 2.0 x 107개 비드/ml, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 3.0 x 107개 비드/ml, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 4.0 x 107개 비드/ml, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 5.0 x 107개 비드/ml, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 6.0 x 107개 비드/ml, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 7.0 x 107개 비드/ml, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 8.0 x 107개 비드/ml, 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 9.0 x 107개 비드/ml, 약 0.5 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 1.0 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 2.0 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 3.0 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 4.0 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 5.0 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 6.0 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 7.0 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 8.0 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 9.0 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml, 약 0.5 x 107개 비드/ml 내지 약 1.0 x 107개 비드/ml, 약 0.5 x 107개 비드/ml 내지 약 2.0 x 107개 비드/ml 또는 약 0.5 x 107개 비드/ml 내지 약 3.0 x 107개 비드/ml의 농도에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 상자성 비드는 약 0.5 x 107개 비드/ml 내지 약 2.0 x 107개 비드/ml의 농도에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 상자성 비드는 약 1.0 x 107개 비드/ml, 예를 들면, 약 1.22 x 107개 비드/ml의 농도에서, 또는 약 0.5 x 107개 비드/ml, 예를 들면, 약 0.59 x 107개 비드/ml의 농도에서 이용될 수 있다.
본원에서 개시된 면역검정 방법은 표본-포획 항체 조합 물질을 검출 항체와 접촉시키는 것을 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 검출 항체는 CD20 상에 존재하는 에피토프에 결합한다. 일정한 구체예에서, 검출 항체는 표본-포획 항체 조합 물질 상에는 존재하지만, CD20의 부재에서 포획 항체 상에는 존재하지 않는 에피토프에 결합한다. 일정한 구체예에서, 표본-포획 항체 조합에 결합된 검출 항체는 차후에, 검출 항체에 의해 결합된 CD20 단백질의 양을 결정하기 위해 검출 항체에 대한 검출 수단, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 검출 작용제를 이용하여 계측되거나 또는 정량된다.
일정한 구체예에서, 검출 항체는 약 0.1 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml의 농도에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 검출 항체는 약 0.1 μg/ml 내지 약 0.5 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 1.0 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 1.5 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 2.0 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 2.5 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 3.0 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 3.5 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 4.0 μg/ml, 약 0.1 μg/ml 내지 약 4.5 μg/ml, 약 0.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 1.0 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 1.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 2.0 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 2.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 3.0 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 3.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 4.0 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 4.5 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml, 약 1.0 μg/ml 내지 약 3.0 μg/ml, 약 0.5 μg/ml 내지 약 3.0 μg/ml 또는 약 0.5 μg/ml 내지 약 2.0 μg/ml의 농도에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 총 CD20 단백질을 검출하기 위한 면역검정은 약 0.1 μg/ml 내지 약 1.0 μg/ml, 예를 들면, 약 0.4 μg/ml 또는 약 0.8 μg/ml 사이의 농도에서 검출 항체를 이용할 수 있다. 일정한 구체예에서, 활성 CD20 단백질을 검출하기 위한 면역검정은 약 1.0 μg/ml 내지 약 3.0 μg/ml, 예를 들면, 약 1.1 μg/ml 또는 약 2.1 μg/ml 사이의 농도에서 검출 항체를 이용할 수 있다.
일정한 구체예에서, 개시된 방법에서 이용을 위한 항-CD20 항체는 표지화될 수 있다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티, 예컨대 형광, 색소생산, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지뿐만 아니라 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 표지의 무제한적 실례는 염료 전구체를 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정된 유리 라디칼 등과 연계된 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예를 들면, 개똥벌레 루시페라아제 및 세균 루시페라아제 (참조: U.S. 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프타라진디온, 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 헤테로환상 옥시다아제, 예컨대 요산분해효소 및 크산틴 옥시다아제를 포함한다. 일정한 구체예에서, 검출 항체는 비오틴으로 표지화된다, 예를 들면, 검출 항체는 비오틴에 접합된다.
일정한 구체예에서, 비오틴화된 검출 항체에 대한 검출 작용제는 아비딘, 스트렙타비딘-HRP 또는 스트렙타비딘-β-D-갈락토피라노오스 (SBG)이다. 일정한 구체예에서, 검출 작용제의 판독은 형광측정 또는 비색이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 테트라메틸벤지딘 및 과산화수소가 판독으로서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 만약 검출 작용제가 스트렙타비딘-HRP이면, 판독은 테트라메틸벤지딘 및 과산화수소를 이용함으로써 비색일 수 있다. 대안으로, 일정한 구체예에서, 레조루핀 β-D-갈락토피라노시드가 판독으로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 만약 검출 작용제가 SBG이면, 판독은 레조루핀 β-D-갈락토피라노시드를 이용함으로써 형광측정일 수 있다.
일정한 구체예에서, 검출 작용제, 예를 들면, SBG는 약 50 내지 약 500 pM의 농도에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 검출 작용제는 약 50 내지 약 100 pM, 약 50 내지 약 150 pM, 약 50 내지 약 200 pM, 약 50 내지 약 250 pM, 약 50 내지 약 300 pM, 약 50 내지 약 350 pM, 약 50 내지 약 400 pM, 약 50 내지 약 450 pM, 약 100 내지 약 500 pM, 약 150 내지 약 500 pM, 약 200 내지 약 500 pM, 약 250 내지 약 500 pM, 약 300 내지 약 500 pM, 약 350 내지 약 500 pM, 약 400 내지 약 500 pM, 약 450 내지 약 500 pM, 약 100 내지 약 400 pM 또는 약 200 내지 약 400 pM의 농도에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 검출 작용제는 약 100 pM 내지 약 400 pM의 농도에서 이용될 수 있다, 예를 들면, SBG가 약 110 pM, 약 155 pM 또는 약 310 pM의 농도에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, SBG는 약 310 pM 의 농도에서 이용된다. 일정한 구체예에서, 검출 작용제, 예를 들면, HRP는 약 1/10 내지 약 1/1000의 희석도에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 검출 작용제는 약 1/10 내지 약 1/100, 약 1/10 내지 약 1/500, 약 1/100 내지 약 1/1000 또는 약 1/500 내지 약 1/1000의 희석도에서 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 검출 작용제는 약 1/100 내지 약 1/1000의 희석도에서 이용될 수 있다, 예를 들면, HRP가 약 1/100 또는 약 1/500의 희석도에서 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 방법은 포획 항체를 차단 완충액으로 차단하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 차단 완충액은 PBS, 소 혈청 알부민 (BSA) 및/또는 살생물제, 예를 들면, ProClin™ (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 상기 방법은 복수의 세척 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 세척에 이용되는 용액은 일반적으로 완충액 (예를 들면, "세척 완충액"), 예컨대, 그러나 제한 없이, 세정제, 예를 들면, Tween 20을 포함하는 PBS 완충액이다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 포획 항체는 차단 후 세척될 수 있고 및/또는 표본은 예를 들면, 세척에 의해 포획 항체로부터 분리되어 포획되지 않은 물질이 제거될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 면역검정 방법은 약 2 pg/ml 내지 약 20 pg/ml의 검출 민감도, 예를 들면, 웰내 민감도를 갖는다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원에서 개시된 면역검정은 약 2 pg/ml 내지 약 3 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 4 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 5 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 6 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 7 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 8 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 10 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 11 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 12 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 13 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 14 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 15 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 16 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 17 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 18 pg/ml, 약 2 pg/ml 내지 약 19 pg/ml, 약 3 pg/ml 내지 약 15 pg/ml, 약 3 pg/ml 내지 약 10 pg/ml 또는 약 3 pg/ml 내지 약 5 pg/ml의 민감도를 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 면역검정은 약 2 pg/ml 또는 그 이상, 1 pg/ml 또는 그 이상 또는 0.5 pg/ml 또는 그 이상의 민감도를 갖는다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 면역검정은 약 0.2 pg/ml 내지 약 2.0 pg/ml, 예를 들면, 약 0.2 pg/ml 내지 약 0.5 pg/ml, 약 0.2 pg/ml 내지 약 1.0 pg/ml 또는 약 0.2 pg/ml 내지 약 1.5 pg/ml의 검출 민감도, 예를 들면, 웰내 민감도를 갖는다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원에서 개시된 면역검정, 예를 들면, Simoa HD-1 Analyzer™을 이용한 단일 분자 면역검정은 약 0.2 pg/ml 내지 약 0.5 pg/ml의 민감도, 예를 들면, 웰내 민감도를 갖는다.
본원 발명의 면역검정 방법에 의해 분석되는 표본은 임상적 표본, 배양 중인 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 혈청 표본, 혈액 혈장 표본, 다른 생물학적 유체 (예를 들면, 림프액) 표본 또는 조직 표본일 수 있다. 일정한 구체예에서, 표본의 공급원은 고형 조직 (예를 들면, 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기, 조직 표본, 혈청, 혈액 혈장, 생검 또는 흡인물로부터) 또는 개체로부터 획득된 세포일 수 있다. 일정한 구체예에서, 표본은 혈액 표본이다. 일정한 구체예에서, 표본은 혈장 표본이다. 일정한 구체예에서, 표본, 예를 들면, 혈액 또는 혈장 표본은 개체로부터 획득되고, 그리고 한 가지 또는 그 이상의 프로테아제, 에스테라아제, DDP-IV 및/또는 포스파타아제 저해제로 처리될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 표본은 프로테아제 및 포스파타아제 저해제의 칵테일, 예를 들면, MS-SAFE (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)로 처리될 수 있다. 일정한 구체예에서, 표본은 항응고제로 처리되거나 또는 항응고제, 예를 들면, K2-EDTA를 내포하는 관에서 수집된다. 일정한 구체예에서, 표본은 P800 혈액 수집 시스템 (BD Biosciences, San Jose, CA)을 이용하여 수집될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 표면 플라스몬 공명 분석 (SPR)을 이용하여 치료제의 친화성을 계측하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, 세포외 소포 상에서 발현된 표적 단백질, 예를 들면, CD20 및 항-표적 단백질 항체, 예를 들면, 항-CD20 항체 사이에 결합 상호작용은 SPR 분석에 의해 평가될 수 있는데, 여기서 표적, 예를 들면, CD20을 발현하는 세포외 소포는 리간드로서 이용될 수 있고, 그리고 항-표적 항체, 예를 들면, 항-CD20 항체는 피분석물로서 이용될 수 있다. SPR 분석을 통해, 해리 평형 상수 (KD), 해리 속도 상수 (kd) 및 연관 속도 상수 (ka) 값이 계산될 수 있다. 일정한 구체예에서, 치료제는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체, 그리고 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, SPR 분석은 2개 또는 그 이상의 항-표적 항체를 구별하기 위해 본원에서 설명된 바와 같이 이용된다. 일정한 구체예에서, SPR 분석은 항-표적 항체의 순위 매김을 가능하게 한다. 일정한 구체예에서, 특정 항-표적 항체의 선택은 SPR 분석을 통한 2개 또는 그 이상의 항-표적 항체를 순위 매기고 가장 높게 순위 매겨진 항-표적 항체를 선택함으로써, 또는 원하는 친화성을 나타내는 항-표적 항체를 선택함으로써 수행된다.
III. 항체
본원 발명은 CD20에 결합하는 항체를 더욱 제공한다. 본원 발명의 항체는 표본 내에서 CD20 단백질 수준을 검출하고 정량하는 데 유용하다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 본원에서 개시된, CD20 단백질의 검출과 정량을 위한 면역검정 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 항체는 표본 내에서 순환 CD20 단백질의 수준을 검출하는 데 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 인간화될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 비롯한 단일클론 항체일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체는 IgG이다. 일정한 구체예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에서 선택된다. 일정한 구체예에서, 상기 항체는 전장 항체, 예를 들면, 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에서 규정된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 아이소타입이다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 항체는 표지화될 수 있다, 예를 들면, 비오틴에 접합될 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 아래에 상술된 섹션 1-7에서 설명된 바와 같은 임의의 특질을 단독적으로 또는 조합으로 통합할 수 있다.
A. 예시적인 항체
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체, 예를 들면, 항-CD20 항체는 ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 μM, ≤ 10 μM, ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (KD)를 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 약 10-3 또는 그 이하 또는 10-8 M 또는 그 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M의 KD를 가질 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 항체는 약 10-10 M 내지 10-13 M의 KD를 가질 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 본원 발명의 포획 항체 또는 검출 항체는 약 10-10 M 내지 10-13 M의 KD로 표적 항원에 결합한다.
일정한 구체예에서, KD는 방사성표지화된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 계측될 수 있다. 일정한 구체예에서, RIA는 관심되는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 항원에 대한 Fabs의 용해 결합 친화성은 표지화되지 않은 항원의 적정 연속의 존재에서 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형시키고, 이후 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 평판으로 포획함으로써 계측된다 (참조: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). 검정을 위한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 다중웰 평판 (Thermo Scientific)이 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 하룻밤 동안 코팅되고, 그리고 차후에, 실온 (대략 23℃)에서 2 내지 5 시간 동안 PBS에서 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비흡착성 평판 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원이 관심되는 Fab의 연속 희석액과 혼합된다 (예를 들면, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 사정과 일치). 관심되는 Fab는 이후, 하룻밤 동안 항온처리된다; 하지만, 항온처리는 평형이 도달되도록 담보하기 위해 더 긴 기간 (예를 들면, 약 65 시간) 동안 계속될 수도 있다. 그 후에, 혼합물이 실온에서 항온처리를 위해 포획 평판으로 이전된다 (예를 들면, 1 시간 동안). 용액은 이후, 제거되고, 그리고 평판이 PBS에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척된다. 평판이 건조될 때, 150 μl/웰의 신틸란트 (MICROSCINT-20TM; Packard)가 첨가되고, 그리고 이들 평판은 TOPCOUNTTM 감마 계수기 (Packard)에서 10 분 동안 계수된다. 최대 결합의 20% 이하이거나 또는 이와 동등한 결합을 제공하는 각 Fab의 농도가 경쟁적 결합 검정에서 이용을 위해 선택된다.
일정한 구체예에서, KD는 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 검정을 이용하여 계측될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, BIACORE®-2000, BIACORE®-3000, BIACORE X100 또는 BIACORE T200 처리 장치 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 검정이 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 수행된다. 일정한 구체예에서, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, Biacore, Inc.)은 공급업체의 사용설명서에 따라 N-에틸-N'- (3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 거의 10 반응 단위 (RU)의 연계된 단백질을 달성하기 위해, 5 μl/분의 유속에서 주입 전에 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된다. 항원의 주입 이후에, 반응하지 않은 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 동역학 계측을 위해, Fab의 2-배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)이 거의 25 μl/분의 유속에서 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20™) 계면활성제를 포함하는 PBS (PBST)에 주입된다. 연관 속도 (k온) 및 해리 속도 (k오프)는 연관 및 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 단순한 1 대 1 랭뮤어 결합 모형 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (KD)는 비율 k오프/k온으로서 계산될 수 있다. 참조: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). 온 레이트가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1를 초과하면, 온 레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 달린 8000-시리즈 SLM-AMINCOTM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 계측될 때 증가하는 농도의 항원의 존재에서 PBS, pH 7.2에서, 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역)의 증가 또는 감소를 계측하는 형광 퀀칭 기술을 이용함으로써 결정될 수 있다.
1. 항체 단편
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항원 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 그리고 아래에 설명된 다른 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 리뷰를 위해, Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)를 참조한다. ScFv 단편의 리뷰를 위해, 예를 들면, Pluckth
Figure pct00001
n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)를 참조한다; 또한, WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894와 5,587,458을 참조한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 관한 논의를 위해, U.S. 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 디아바디일 수 있다. 디아바디는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 참조: 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). 본원 발명의 항체의 범위 안에 추가 항체 단편인 트리아바디 및 테트라바디 역시 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에서 설명된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 단일 도메인 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일정한 구체예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,248,516 B1).
항체 단편은 본원에서 설명된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들면 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
2. 키메라 및 인간화 항체
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 키메라 항체이다. 일정한 키메라 항체는 당해 분야, 예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에서 설명된다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 키메라 항체는 비인간 가변 영역 (예를 들면, 생쥐, 쥐, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 실례에서, 키메라 항체는 "부류 전환된" 항체일 수 있는데, 여기서 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화되었다. 키메라 항체는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 키메라 항체는 인간화 항체일 수 있다. 전형적으로, 비인간 항체는 부모 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVRs (또는 이들의 부분)가 비인간 항체로부터 유래되고, 그리고 FRs (또는 이들의 부분)가 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 또는 그 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일정한 구체예에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 리뷰되고, 그리고 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 합체를 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "보도된 선택" 접근법을 설명)에서 더욱 설명된다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: "최고 적합" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); 인간 성숙 (체성으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 그리고 선별검사 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
3. 인간 항체
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 인간 항체일 수 있다. 인간 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다.
인간 항체는 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 포함하는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이런 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포한다. 이런 유전자도입 생쥐에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화된다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법에 관한 리뷰를 위해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예를 들면, XENOMOUSETM 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HUMAB® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 7,041,870, 그리고 VELOCIMOUSE® 기술을 설명하는 U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이런 동물에 의해 산출된 무손상 항체로부터 인간 가변 영역은 예를 들면, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 더욱 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한, 하이브리도마-기초된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 설명되었다. (참조: 예를 들면, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). 인간 B-세포 하이브리도마 기법을 통해 산출된 인간 항체 역시 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가 방법은 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기법 (트리오마 기술) 역시 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
인간 항체는 또한, 인간-유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 산출될 수 있다. 이런 가변 도메인 서열은 이후, 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 아래에 설명된다.
4. 라이브러리-유래된 항체
본원 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, 파지 전시 라이브러리를 산출하고, 그리고 원하는 결합 특징을 소유하는 항체에 대해 이런 라이브러리를 선별검사하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에서 공지된다. 이런 방법은 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에서 리뷰되고, 그리고 예를 들면, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)에서 더욱 설명된다.
일정한 파지 전시 방법에서, VH와 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이들 라이브러리는 이후, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 선별검사될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일 사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마를 구축하는 요건 없이 면역원에 대한 높은 친화성 항체를 제공한다. 대안으로, 미경험 레퍼토리는 Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 의해 설명된 바와 같이, 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하도록 클로닝될 수 있다 (예를 들면, 인간으로부터). 일정한 구체예에서, 미경험 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 의해 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 그리고 고도로 가변적 HVR 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성하기 위한 무작위 서열을 내포하는 PCR 프라이머를 이용함으로써 합성적으로 만들어질 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 공보는 예를 들면, US 특허 번호 5,750,373, 그리고 US 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편인 것으로 고려된다.
5. 다중특이적 항체
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면 이중특이적 항체일 수 있다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 일정한 구체예에서, 결합 특이성 중에서 하나는 CD20 상에 존재하는 에피토프에 대한 것이고, 그리고 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 만들기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (참조: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), 그리고 "노브-인-홀 (knob-in-hole)" 가공 (참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,731,168)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이합체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 가공하고 (WO 2009/089004A1); 2개 또는 그 이상의 항체 또는 단편을 교차연결하고 (참조: 예를 들면, US 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 이용하고 (참조: 예를 들면, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위해 "디아바디" 기술을 이용하고 (참조: 예를 들면, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); 그리고 단일 사슬 Fv (sFv) 이합체를 이용하고 (참조: 예를 들면, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); 그리고 예를 들면, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 설명된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어질 수 있다.
"문어 항체"를 비롯하여, 3개 또는 그 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체 역시 본원에서 포함된다 (참조: 예를 들면, US 2006/0025576A1).
6. 항체 변이체
본원에서 개시된 요부는 개시된 항체의 아미노산 서열 변이체를 더욱 제공한다. 예를 들면, 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질을 향상시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형은 항체의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 이들 서열 내로 삽입 및/또는 이들 서열 내에 잔기의 치환을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 최종 항체, 다시 말하면, 변형된 항체가 원하는 특징, 예를 들면, 항원 결합을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
항체 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 가질 수 있다. 이런 변형을 위한 관심되는 부위는 HVRs 및 FRs를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 보존성 치환의 무제한적 실례는 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 1에서 도시된다. 더 실제적인 변화의 무제한적 실례는 "예시적인 치환"의 표제 하에 표 1에서 제공되고, 그리고 아미노산 측쇄 부류에 관하여 아래에 더욱 설명된다. 아미노산 치환은 관심되는 항체 내로 도입될 수 있고, 그리고 산물은 원하는 활성, 예를 들면, 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 향상된 보체 의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC)에 대해 선별검사될 수 있다.
표 1
본래
잔기 		예시적인
치환 		바람직한
치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 군화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향정위에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
일정한 구체예에서, 비보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
일정한 구체예에서, 치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 또는 그 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다, 예를 들면, 인간화 또는 인간 항체이다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 결과의 변이체(들)는 부모 항체에 비하여 일정한 생물학적 특성에서 변형, 예를 들면, 향상, 예컨대 하지만 제한 없이, 증가된 친화성, 감소된 면역원성을 가질 것이고 및/또는 부모 항체의 실제적으로 유지된 일정한 생물학적 특성을 가질 것이다. 치환 변이체의 무제한적 실례는 친화성 성숙된 항체인데, 이것은 예를 들면, 파지 전시-기초된 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에서 설명된 것들을 이용하여 편의하게 산출될 수 있다. 간단히 말하면, 하나 또는 그 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 그리고 변이체 항체는 파지에서 전시되고 특정 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화성)에 대해 선별검사된다.
일정한 구체예에서, 예를 들면, 항체 친화성을 향상시키기 위해 HVRs에서 변경 (예를 들면, 치환)이 만들어질 수 있다. 이런 변경은 HVR "핫스팟", 다시 말하면, 체성 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (예를 들면, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 및/또는 항원에 접촉하는 잔기에서 만들어질 수 있으며, 결과의 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 검사된다. 이차 라이브러리를 구축하고 이들로부터 재선별함에 의한 친화성 성숙은 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에서 설명되었다. 친화성 성숙의 일정한 구체예에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들면, 오류 가능성 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이)에 의해, 성숙을 위해 선택된 가변적 유전자 내로 도입될 수 있다. 이차 라이브러리가 이후 창출된다. 상기 라이브러리는 이후, 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별검사된다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 HVR-지향된 접근법을 수반하는데, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들면, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기는 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다.
일정한 구체예에서, 치환, 삽입 및/또는 결실은 이런 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실제적으로 감소시키지 않으면, 하나 또는 그 이상의 HVRs 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성을 실제적으로 감소시키지 않는 보존성 변경 (예를 들면, 본원에서 제시된 바와 같은 보존성 치환)이 HVRs에서 만들어질 수 있다. 이런 변경은 예를 들면, HVRs에서 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 앞서 제공된 변이체 VH와 VL 서열의 일정한 구체예에서, 각 HVR은 변경되지 않거나, 또는 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 내포한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들면, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)이 확인되고, 그리고 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는 지를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가 치환은 초기 치환에 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 항체 및 항원 사이에 접촉 포인트를 확인하기 위한 항원 항체 복합체의 결정 구조. 이런 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 내포하는 지를 결정하기 위해 선별검사될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 100개 또는 그 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들면, 항체-지향된 효소 전구약물 요법 (ADEPT)의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N 또는 C 말단에 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
본원 발명의 항체는 일정한 구체예에서, 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 또는 감소시키기 위해 변경될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 항체에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위가 창출되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편의하게 달성될 수 있다.
본원 발명의 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 거기에 부착된 탄수화물 (만약 존재하면)은 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 선천적 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연쇄에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 바이안테나리 올리고당류를 포함한다. 참조: 예를 들면, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당류는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나리 올리고당류 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체에서 올리고당류의 변형은 일정한 향상된 특성을 갖는 항체 변이체를 창출하기 위해 만들어질 수 있다.
일정한 구체예에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 이런 항체에서 푸코오스의 양은 약 1% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 65% 또는 약 20% 내지 약 40%, 그리고 그 사이에 값일 수 있다.
일정한 구체예에서, 푸코오스의 양은 예를 들면, WO 2008/077546에서 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 계측될 때, Asn 297에 부착된 모든 당구조의 총합 (예를 들면, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노오스 구조)에 비하여, Asn297에서 당 사슬 내에 푸코오스의 평균량을 계산함으로써 결정될 수 있다. Asn297은 Fc 영역 내에 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에서 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭한다; 하지만, Asn297은 또한, 항체에서 경미한 서열 변이로 인해, 위치 297의 대략 ± 3개 아미노산 상류 또는 하류에, 다시 말하면, 위치 294 및 300 사이에 위치될 수 있다. 이런 푸코실화 변이체는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). "탈푸코실화된" 또는 "푸코오스-결함성" 항체 변이체에 관련된 간행물의 실례는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004).
탈푸코실화된 항체는 단백질 푸코실화에서 결함되는 임의의 세포주에서 생산될 수 있다. 세포주의 무제한적 실례는 단백질 푸코실화에서 결함성인 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11), 그리고 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (참조: 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107)를 포함한다.
항체 변이체는 양분된 올리고당류가 더욱 제공되는데, 예를 들면, 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고당류는 GlcNAc에 의해 양분된다. 이런 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체의 무제한적 실례는 예를 들면, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에서 설명된다. 올리고당류 내에 적어도 하나의 갈락토오스 잔기가 Fc 영역에 부착되는 항체 변이체 역시 제공된다. 이런 항체 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체는 예를 들면, WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에서 설명된다.
c) Fc 영역 변이체
일정한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어, Fc 영역 변이체가 산출될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들면, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명은 전부는 아니지만 일부 작동체 기능을 소유하는 항체 변이체를 제공한다. 이런 한정된 작동체 기능으로 인해, 이들 항체 변이체는 생체내에서 항체의 반감기가 중요하고 일정한 작동체 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)가 불필요하거나 또는 유해한 적용을 위한 바람직한 후보가 될 수 있다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확증하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들면, 항체가 FcγR 결합을 결여 (따라서, ADCC 활성을 아마도 결여)하지만, FcRn 결합 능력을 유지하도록 담보하기 위해, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지 상에 표 3에서 요약된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위한 시험관내 검정의 무제한적 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362 (예를 들면, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)을 참조한다) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)을 참조한다)에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (참조: 예를 들면, 유세포분석법의 경우에 ACTITM 비방사성 세포독성 검정 (Cell Technology, Inc. Mountain View, CA); 및 CYTOTOX 96® 비방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)). 이런 검정을 위한 유용한 작동체 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예컨대 Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확증하기 위해, C1q 결합 검정 또한 실행될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 사정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 소실/반감기 결정이 또한, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)). 일정한 구체예에서, 예를 들면, US 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (다시 말하면, 향상된 또는 축소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유발하는 Fc 영역에서 변경이 만들어질 수 있다.
감소된 작동체 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (U.S. 특허 번호 6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 번호 7,332,581).
FcRs에 향상된 또는 축소된 결합을 갖는 일정한 항체 변이체가 설명된다. 참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 그리고 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일정한 구체예에서, 본원에서 개시된 항체, 예를 들면, 이중특이적 항체의 Fc 영역에서 만들어진 변경은 증가된 반감기, 그리고 모계 IgGs의 태아로의 전달을 책임지는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 향상된 결합을 갖는 변이체 항체 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))를 생산할 수 있고, US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 Fc 영역의 결합을 향상시키는, 그 안에 하나 또는 그 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이런 Fc 변이체는 다음의 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 또는 그 이상에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (US 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 실례와 관련하여, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 번호 5,648,260; U.S. 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 또한 참조한다.
d) 시스테인 가공된 항체 변이체
일정한 구체예에서, 시스테인 가공된 항체, 예를 들면 "thioMAbs"를 창출하는 것이 바람직할 수 있는데, 여기서 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다. 특정한 구체예에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 따라서, 항체의 접근가능한 부위에서 위치되고, 그리고 상기 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여 본원에서 더욱 설명된 바와 같은 면역접합체를 창출하는 데 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 하기 잔기 중에서 하나 또는 그 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (Kabat 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 가공된 항체는 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,521,541에서 설명된 바와 같이 산출될 수 있다.
e) 항체 유도체
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체는 당해 분야에서 공지되고 쉽게 가용한 추가 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 무제한적 실례는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 그리고 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤릴프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 그리고 이들의 혼합물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 안정성으로 인해, 제조 시에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 그리고 분지되거나 또는 분지되지 않을 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 숫자는 변할 수 있고, 그리고 하나 이상의 중합체가 부착되면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용되는 중합체의 숫자 및/또는 유형은 향상되는 항체의 특정 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 이용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고려 사항에 근거하여 결정될 수 있다.
일정한 구체예에서, 방사선에 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 구체예에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 일정한 구체예에서, 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 그리고 일상적인 세포를 훼손하지 않지만 비단백질성 모이어티를 항체-비단백질성 모이어티 근위의 세포가 사멸되는 온도까지 가열하는 파장을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
B. 항체 생산 방법
본원에서 개시된 항체, 예를 들면, 포획 항체 및/또는 검출 항체는 당해 분야에서 임의의 가용한 또는 공지된 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 항체는 예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567에서 설명된 바와 같은 재조합 방법과 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 항체를 산출하기 위한 상세한 절차는 아래의 실시예에서 설명된다.
본원에서 개시된 요부는 본원에서 개시된 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 더욱 제공한다. 예를 들면, 단리된 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열, 예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 인코딩할 수 있다.
일정한 구체예에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 벡터, 예를 들면, 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신에게 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 가지 유형은 "플라스미드"인데, 이것은 추가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터인데, 여기서 추가 DNA 분절이 바이러스 유전체 내로 결찰될 수 있다. 일정한 벡터 (예를 들면, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들면, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 유전체 내로 통합되고, 그리고 따라서, 숙주 유전체와 함께 복제된다. 게다가, 일정한 벡터, 발현 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 유전자의 발현을 주동할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종, 플라스미드 (벡터)의 형태이다. 하지만, 개시된 요부는 동등한 기능을 제공하는 이런 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예를 들면, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 연관된 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 및/또는 상기 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포 내로 핵산의 도입은 형질감염, 전기천공, 미량주사, 핵산 서열을 내포하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로 감염, 세포 융합, 염색체-매개된 유전자 전달, 마이크로세포-매개된 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 실행될 수 있다. 일정한 구체예에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 첫 번째 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 두 번째 벡터를 포함할 수 있다, 예를 들면, 이것으로 형질전환되었다. 일정한 구체예에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
일정한 구체예에서, 개시된 항-CD20 항체를 만드는 방법은 상기 항체의 발현에 적합한 조건 하에, 상기 항체를 인코딩하는 핵산이 도입된 숙주 세포를 배양하는 단계, 그리고 숙주 세포 및/또는 숙주 세포 배양 배지로부터 항체를 임의적으로 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 항체는 크로마토그래피 기술을 통해 숙주 세포로부터 회수된다.
본원 발명의 항체의 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 그리고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 또는 그 이상의 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이런 핵산은 전통적인 절차를 이용하여 (예를 들면, 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 쉽게 단리되고 염기서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에서 설명된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 작동체 기능이 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 세균에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,648,237, 5,789,199 및 5,840,523을 참조한다. (대장균 (E. coli)에서 항체 단편의 발현을 설명하는, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254를 또한 참조한다). 발현 후, 항체는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 유발하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006). 글리코실화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다.
글리코실화된 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다.
일정한 구체예에서, 식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 및 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명).
일정한 구체예에서, 척추동물 세포 또한, 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 무제한적 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)에서 설명된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)에서 설명된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들면, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에서 설명된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 그리고 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 리뷰를 위해, 예를 들면, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조한다.
일정한 구체예에서, 이중특이적 및/또는 다중특이적 항체를 만들기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (참조: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), PCT 특허 출원 번호 WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), 그리고 "노브-인-홀 (knob-in-hole)" 가공 (참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,731,168)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이합체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 가공하고 (WO 2009/089004A1); 2개 또는 그 이상의 항체 또는 단편을 교차연결하고 (참조: 예를 들면, US 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 이중특이적 항체를 생산하기 위해 류신 지퍼를 이용하고 (참조: 예를 들면, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위해 "디아바디" 기술을 이용하고 (참조: 예를 들면, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); 그리고 단일 사슬 Fv (sFv) 이합체를 이용하고 (참조: 예를 들면, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); 그리고 예를 들면, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 설명된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어질 수 있다.
본원 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한, 화학적 기술 (참조: 예를 들면, Kranz (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), "폴리도마" 기술 (참조: 예를 들면, U.S. 특허 4,474,893) 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어질 수 있다. 본원에서 개시된 요부의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한, 당해 분야에서 공지되고 본원에서 설명된 바와 같은 방법을 이용하여, 성분 결합 특이성, 예를 들면, 첫 번째 에피토프 및 두 번째 에피토프 결합 특이성을 접합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각 결합 특이성은 별개로 산출되고, 그리고 이후 서로 접합될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드일 때, 다양한 연계 또는 교차연결 작용제가 공유 접합에 이용될 수 있다. 교차연결 작용제의 무제한적 실례는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세트산염 (SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피온산염 (SPDP), 그리고 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실산염 (술포-SMCC)을 포함한다 (참조: 예를 들면, Karpovsky (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). 다른 방법은 Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132; Brennan (1985) Science 229:81-83), Glennie (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)에 의해 설명된 것들을 포함한다. 결합 특이성이 항체 (예를 들면, 2개의 인간화 항체)일 때, 이들은 2개 중쇄의 C 말단 힌지 영역의 술피드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 일정한 구체예에서, 힌지 영역은 접합에 앞서, 홀수, 예를 들면, 하나의 술피드릴 잔기를 내포하도록 변형될 수 있다.
일정한 구체예에서, 이중특이적 항체의 양쪽 결합 특이성은 동일한 벡터에서 인코딩되고, 그리고 동일한 숙주 세포에서 발현되고 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 이중특이적 항체는 단일 사슬 분자, 예컨대 단일 사슬 이중특이적 항체, 하나의 단일 사슬 항체 및 결합 결정인자를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자, 또는 2개의 결합 결정인자를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한, 단일 사슬 분자일 수 있거나 또는 적어도 2개의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조하기 위한 방법은 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,260,203; U.S. 특허 번호 5,455,030; U.S. 특허 번호 4,881,175; U.S. 특허 번호 5,132,405; U.S. 특허 번호 5,091,513; U.S. 특허 번호 5,476,786; U.S. 특허 번호 5,013,653; U.S. 특허 번호 5,258,498; 및 U.S. 특허 번호 5,482,858에서 설명된다. "문어 항체"를 비롯하여, 3개 또는 그 이상의 기능적 항원 결합 부위 (예를 들면, 에피토프 결합 부위)를 갖는 가공된 항체 역시 본원에서 포함된다 (참조: 예를 들면, US 2006/0025576A1).
일정한 구체예에서, 동물 시스템이 본원 발명의 항체를 생산하는 데 이용될 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 한 가지 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 생쥐에서 하이브리도마 생산은 매우 널리 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜과 기술은 당해 분야에서 공지된다. 융합 파트너 (예를 들면, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차 또한 알려져 있다 (참조: 예를 들면, Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York).
IV. 키트
본원에서 개시된 요부는 본원에서 개시된 면역검정을 수행하는 데 유용한 물질을 내포하는 키트를 더욱 제공한다. 일정한 구체예에서, 키트는 본원에서 개시된 항체, 예를 들면, 항-CD20 항체를 내포하는 용기를 포함한다. 적합한 용기의 무제한적 실례는 병, 시험관, 바이알 및 마이크로역가 평판을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 일정한 구체예에서, 키트는 개시된 면역검정 방법에서 항체, 예를 들면, 항-CD20 항체를 이용하기 위한 사용설명서를 제공하는 포장 삽입물을 더욱 포함한다.
일정한 구체예에서, 키트는 한 가지 또는 그 이상의 항체를 내포하는 하나 또는 그 이상의 용기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 그러나 제한 없이, 키트는 포획 항체를 포함하는 적어도 하나의 용기 및 검출 항체를 포함하는 적어도 하나의 용기를 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 표본 내에서 종양 항원 단백질을 검출하기 위한 키트는 표적 단백질의 아미노산 서열 내에 존재하는 에피토프에 결합하는 포획 항체를 내포하는 첫 번째 용기, 표적 단백질의 아미노산 서열 내에 존재하는 에피토프에 결합하는 검출 항체를 내포하는 두 번째 용기, 그리고 검출 작용제를 내포하는 세 번째 용기를 포함한다. 일부 구체예에서, 포획 항체 및 검출 항체는 표적 단백질의 아미노산 서열 내에 존재하는 상이한 에피토프에 결합한다.
일정한 구체예에서, 포획 항체 및/또는 검출 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
일정한 구체예에서, 포획 항체 및/또는 검출 항체는 본원 발명의 키트에서 약 0.1 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml의 농도로 제공될 수 있다. 예를 들면, 포획 항체 및/또는 검출 항체는 ELISA 키트에서 약 0.1 μg/ml 내지 약 5.0 μg/ml의 농도로 제공될 수 있다. 무제한적 구체예에서, 포획 항체 및/또는 검출 항체는 Quanterix 키트에서 약 0.1 μg/ml 내지 약 2.0 μg/ml의 농도로 제공될 수 있다. 일정한 구체예에서, 검출 항체는 예를 들면, 비오틴으로 표지화될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원 발명의 키트에서 제공되는 검출 작용제는 아비딘, 스트렙타비딘-HRP 또는 스트렙타비딘-β-D-갈락토피라노오스 (SBG)일 수 있다. 일정한 구체예에서, 본원 발명의 키트는 테트라메틸벤지딘, 과산화수소 및/또는 레조루핀 β-D-갈락토피라노시드를 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 만약 키트가 스트렙타비딘-HRP를 포함하면, 키트는 테트라메틸벤지딘 및 과산화수소를 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 만약 키트가 SBG를 포함하면, 키트는 레조루핀 β-D-갈락토피라노시드를 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, SBG는 키트에서 약 100 pM 내지 약 400 pM의 농도로 제공될 수 있다.
일정한 구체예에서, 포획 항체는 고체 지지체 표면, 예컨대 예를 들면 하지만 제한 없이, 평판 또는 비드, 예를 들면, 상자성 비드에 제공되어 부착될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 키트는 포획 항체에 연계될 수 있는 고체 지지체 표면을 더욱 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 고체 지지체는 상자성 비드일 수 있고, 그리고 약 0.1 x 107개 비드/ml 내지 약 10.0 x 107개 비드/ml의 농도로 제공될 수 있다.
대안으로 또는 부가적으로, 키트는 다른 완충액, 희석제 및 필터를 비롯하여, 상업적인 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다. 일정한 구체예에서, 키트는 혈액 표본을 수집하고 및/또는 처리하기 위한 물질을 포함할 수 있다.
하기 실시예는 본원에서 개시된 요부를 단지 예시하고, 그리고 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다.
IV. 예시적인 구체예
A1. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명은 표본 내에서 막 관련 단백질을 검출하기 위한 검정을 제공하고, 상기 검정은 표본 내에서 막 관련 단백질을 포함하는 세포외 소포에 결합하여, 포획 항체-세포외 소포 복합체를 산출하는 포획 항체; 그리고 b) 포획 항체-세포외 소포 복합체에 결합하여, 검출가능한 결합된 복합체를 형성하는 검출 항체를 포함하되, 상기 검출가능한 결합된 복합체로부터 획득된 신호가 상기 단백질을 포함하는 세포외 소포로부터 검출된 하나 또는 그 이상의 공지된 값에 대해 교정된다.
A2. A1의 일정한 구체예에서, 포획 항체는 검출 항체와의 결합에 대해 경쟁하지 않는다.
A3. A1 및 A2의 일정한 구체예에서, 포획 항체는 검출 항체와 상이한 에피토프에 결합한다.
A4. A1-A3의 일정한 구체예에서, 막 관련 단백질은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원, 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
A5. A1-A4의 일정한 구체예에서, 포획 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
A6. A1-A5의 일정한 구체예에서, 검출 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
A7. A1-A6의 일정한 구체예에서, 검정은 세포외 소포 교정기를 더욱 포함한다.
A8. A1-A7의 일정한 구체예에서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
B1. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명은 표본 내에서 순환 단백질의 농도를 정량하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 a) 표본 내에서 세포외 소포에서 표적 단백질의 수준을 결정하는 단계; 그리고 b) 표본 내에서 세포외 소포에서 표적 단백질의 수준을, 표적 단백질을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 산출된 교정 곡선과 비교하는 단계를 포함한다.
B2. B1의 일정한 구체예에서, 표적 단백질은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원, 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
B3. B1 또는 B2의 일정한 구체예에서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
B4. B1-B3의 일정한 구체예에서, 표적 단백질의 농도 및 교정 곡선은 면역검정, ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정된다.
B5. B1-B4의 일정한 구체예에서, 상기 방법은 세포외 소포 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 단계를 더욱 포함한다.
C1. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명은 표본 내에서 순환 단백질의 농도를 정량하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 a) 상기 단백질을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 교정 곡선을 산출하는 단계, 그리고 b) 표본 내에서 세포외 소포에서 상기 단백질의 수준을 교정 곡선과 비교하여, 표본 내에서 세포외 소포에서 상기 단백질의 양을 결정하는 단계를 포함한다.
C2. C1의 일정한 구체예에서, 단백질은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원, 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
C3. C1 또는 C2의 일정한 구체예에서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
C4. C1-C3의 일정한 구체예에서, 순환 단백질의 농도 및 교정 곡선은 면역검정, ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정된다.
C5. C1-C4의 일정한 구체예에서, 상기 방법은 세포외 소포 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 단계를 더욱 포함한다.
D1. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명은 B-세포 림프종을 앓는 환자가 항-CD20 요법에 대한 반응을 나타낼 가능성이 높은 지를 결정하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 a) 환자로부터 표본을 획득하는 단계; b) 표본 내에서 세포외 소포에서 순환 CD20의 양을 결정하는 단계; c) 표본 내에서 세포외 소포에서 CD20의 수준을, CD20을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 산출된 교정 곡선과 비교하는 단계; 그리고 d) 표본에서 결정된 세포외 소포에서 순환 CD20의 양에 근거하여, 환자가 CD20 요법에 대한 반응을 나타낼 가능성이 높은 지를 결정하는 단계를 포함한다.
D2. D1의 일정한 구체예에서, 항-CD20 요법은 항-CD20 항체의 투여를 포함한다.
D3. D1 또는 D2의 일정한 구체예에서, 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
D4. D1-D3의 일정한 구체예에서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
D5. D1-D4의 일정한 구체예에서, 순환 단백질의 농도 및 교정 곡선은 면역검정, ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정된다.
D6. D1-D5의 일정한 구체예에서, 상기 방법은 세포외 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 단계를 더욱 포함한다.
E1. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명은 항-CD20 항체의 친화성을 결정하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 항-CD20 항체에 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 실행하되, 상기 SPR 분석이 리간드로서 CD20을 발현하는 세포외 소포 및 피분석물로서 항-CD20 항체의 이용을 포함하는 단계를 포함한다.
E2. E1의 일정한 구체예에서, 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
E3. E1-E2의 일정한 구체예에서, 상기 방법은 세포외 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 단계를 더욱 포함한다.
F1. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명은 환자로부터 획득된 T 세포의 활성화를 결정하기 위한 방법에 관계하고, 상기 방법은 a) CD20을 발현하는 세포외 소포를 T 세포 및 CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체와 함께 배양하는 단계; 그리고 b) T 세포의 활성화를 결정하는 단계를 포함한다.
F2. F1의 일정한 구체예에서, 상기 방법은 세포외 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 단계를 더욱 포함한다.
G1. 일정한 무제한적 구체예에서, 본원 발명은 치료가 필요한 개체에서 종양을 치료하는 방법에 관계하고, 상기 방법은 a) 개체로부터 표본을 획득하는 단계; b) 종양 항원을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 교정 곡선을 산출하는 단계; c) 표본 내에서 세포외 소포에서 종양 항원의 수준을 교정 곡선과 비교하여, 표본 내에서 세포외 소포에서 표적 종양 항원의 양을 결정하는 단계; d) 표본 내에서 세포외 소포에서 종양 항원의 수준에 근거하여, 개체가 항체 요법에 대한 반응을 나타낼 가능성이 높은 지를 결정하는 단계; 그리고 e) d)에서 결정에 대응하여 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
G2. G1의 일정한 구체예에서, 상기 방법은 세포외 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 단계를 더욱 포함한다.
G3. G1-G2의 일정한 구체예에서, 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
G4. G1-G3의 일정한 구체예에서, 표적 종양 항원은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원, 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
G5. G1-G4의 일정한 구체예에서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
G6. G1-G5의 일정한 구체예에서, 순환 종양 항원의 농도 및 교정 곡선은 면역검정, ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정된다.
실시예
실시예 1. 종양 항원 검정 교정 곡선의 준비
A. 종양 항원을 발현하는 세포의 배양
시드 계통 유지: 시드 트레인은 3 내지 4 일마다 계대되었다. 3-일 계대의 경우에, 세포는 비배플형 진탕 플라스크 내에 32% 채움 (예를 들면 250 mL 비배플형 진탕 플라스크에서 80 mL 채움) 또는 50% 채움 (예를 들면 2 L 비배플형 진탕 플라스크에서 1 L 채움) Expi293 발현 배지에서 0.8 x 106개 세포/mL로 파종되었다; 125 rpm (32% 채움) 또는 160 rpm (50% 채움), 25 mm 궤도 직경에서 교반하고, 그리고 8% CO2, 80% 습도, 37℃에서 배양한다; 세포는 >4 x 106개 세포/mL, >95% 생존력까지 성장되어야 한다. 4-일 계대의 경우, 세포는 비배플형 진탕 플라스크 내에 32% 채움 (예를 들면 250 mL 비배플형 진탕 플라스크에서 80 mL 채움) 또는 50% 채움 (예를 들면 2 L 비배플형 진탕 플라스크에서 1 L 채움) Expi293 발현 배지에서 0.4 x 106개 세포/mL로 파종되었다; 125 rpm (32% 채움) 또는 160 rpm (50% 채움), 25 mm 궤도 직경에서 교반하고, 그리고 8% CO2, 80% 습도, 37℃에서 배양한다; 세포는 >4 x 106개 세포/mL, >95% 생존력까지 성장되어야 한다.
시드 생산 배양액: Expi293 시드 트레인은 Hyclone HyCell TransFX-H 배지, 10 mg/mL 젠타마이신 (A466), 10% 플루로닉 F-68, 20mM L-글루타민 (A0821)에서 배양되었다. 용기 및 125 mL 진탕 플라스크/50 mL 튜브스핀이 희석에 이용되었다.
생존가능 세포 밀도 및 생존력 (>4 x 106개 세포/mL, >95% 생존력에서)에 대해 시드 트레인 배양액을 계수한다: 형질감염을 위해 필요한 배양액의 용적이 계산되었다 (VF = 30 mL x 형질감염의 #).
생산 배지를 제조한다: Hyclone 배지가 0.5 g/L 플루로닉 F-68 (5 mL의 10% 플루로닉 F-68을 1 L Hyclone 배지에 첨가한다); 4 mM L-글루타민 (20 mL 20 mM L-글루타민 (A0821)을 1 L Hyclone 배지에 첨가한다); 그리고 0.21 g/L 젠타마이신 (21 mL의 10 mg/mL 젠타마이신 (A466)을 1 L Hyclone 배지에 첨가한다)(선택적)으로 보충되었다.
Expi293 시드 트레인이 적절한 양의 생산 배지에서 2.0 x 106개 세포/mL로 희석되었다; 이것은 형질감염될 배양액이다. 하기 공식이 희석에 필요한 시드 트레인 배양액을 계산하는 데 이용되었다:
Figure pct00002
여기서:
Figure pct00003
= 필요한 시드 트레인 배양액 용적 (mL)
Figure pct00004
= 형질감염을 위한 최종 원하는 생존가능 세포 밀도 (2.0 x 106개 세포/mL)
Figure pct00005
= 모든 형질감염에 필요한 최종 배양 용적 (mL)
Figure pct00006
= 시드 트레인 배양액 생존가능 세포 밀도 (세포/mL)
Expi293 생산 배양 희석액이 플라스크/튜브스핀마다 25.5 mL씩 분취되었다. 플라스크/튜브스핀을 37 ℃, 8% CO2, 125 rpm (25 mm 궤도 직경에서 플라스크) 또는 225 rpm (50 mm 궤도 직경에서 튜브스핀)에 위치시키고 평형화되도록 허용한다 (적어도 15 분).
B. 세포외 소포 종양 항원 교정기 정제 프로토콜
pB_EF1_hCD20 작제물 형질감염된 Expi293 7-일 배양액이 수집되고 500g에서 10 분 동안 스핀다운되었다. 상층액이 다른 50ml 코니칼 내로 옮겨 부어지고 2000g에서 10 분 동안 회전되었다. 상층액이 0.22um 진공 필터 내로 옮겨 부어지고 여과되었다. 여과된 배지는 70 ml 원심분리 농축기 (Centricon Plus-70, UFC710008)로 농축되었다: 3750 rpm에서 4 ℃에서 10 분 동안 60 ml 상층액이 부하되고, 3750 rpm에서 4 ℃에서 10 분 동안 상층액이 온건하게 혼합되고; 여과액이 옮겨 부어지고, 더 많은 상층액이 첨가되고, 용적이 12 ml보다 적을 때까지 수회 회전되었다. 농축물이 750 g (최대 1000g)에서 4 ℃에서 2 분 동안 회수되었다. 농축물이 침전 및 응집을 방지하기 위해 10 분 이내로 회전되었다. 농축된 배지가 초원심분리기에서 30k rpm에서 4 ℃에서 75 분 동안 회전되었다. 관이 표본이 없는 것들을 비롯한 PBS로 0.01g 내에서 적절하게 균형화되었다 (균형화를 위해 H2O를 이용한다). Accel 및 Decel 둘 모두 Max를 이용하였다. 상층액이 옮겨 부어졌다. 펠렛이 관의 아래쪽에서 보일 것이다. 펠렛은 500uL PBS, 그리고 이후, 12 mL 1X PBS를 포함하는 재충전된 초원심분리기 관에서 재현탁되었다. 혼합물이 PBS로 다시 한 번 균형화되고, 그리고 30k rpm (100,000g)에서 4 ℃에서 75 분 동안 재원심분리되었다. 상층액이 흘러 버려졌고, 그리고 펠렛이 0.5 내지 1 ml PBS에서 온건하게 재현탁되었다.
C. 웨스턴 블롯에 의한 EV 종양 항원 교정기 값 배정
도 2는 본원에서 설명된 바와 같이 제조된 EV 종양 항원 교정기의 예시적인 특징화를 묘사하는데, 여기서 이들 값은 웨스턴 블롯에 의해 배정된다. 칼럼 1은 마커를 나타내고, 칼럼 2는 EV 2ug를 나타내고, 칼럼 3은 EV 1ug를 나타내고, 칼럼 4는 EV 0.5ug를 나타내고, 칼럼 5는 EV 0.25ug를 나타내고, 칼럼 6은 rhCD20 250ng를 나타내고, 칼럼 7은 rCD20 100ng를 나타내고, 칼럼 8은 rCD20 40ng를 나타내고, 칼럼 9는 rCD20 16ng를 나타내고, 그리고 칼럼 10은 rCD20 6.4ng를 나타낸다.
도 3은 포획으로서 항-CD20 Ab, 그리고 검출로서 항-CD20 또는 검출로서 항-테트라스패닌 항체를 이용하여, 정상적인 및 NHL (예를 들면, DLBCL 및 FL) 공여자로부터 유래된 혈장 표본에서 CD20의 존재를 보여준다. 테트라스패닌 항체는 또한, 세포외 소포에서 CD20의 존재를 검출하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, CD20을 이용한 포획 및 CD81, CD9, CD63을 이용한 검출은 이들 마커가 공동국지화되고, 그리고 CD20이 막 (또는 세포외 소포) 내에 존재한다는 것을 증명하였다. 소포가 반드시 모든 또는 동일한 마커를 갖는 것은 아니기 때문에, 검출을 위해 칵테일이 필요하였다.
도 4는 항-CD20 항체가 정상적인 및 NHL (예를 들면, DLBCL 및 FL)로부터 유래된 혈장에서 CD 20을 검출하는 데 이용될 때, 예시적인 ELISA 형식을 도시한다. 도 4에서 ELISA 데이터는 초원심분리 없이, 순수한 혈장에서 이들 마커의 공동국지화의 증거를 보여준다.
D. Quanterix에 의한 EV 종양 항원 표준 곡선
하기 재료가 Quanterix 검정에 이용되었다: a) 표준 곡선 및 표본 희석제 PBS, 1.5% BSA, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린 300, pH 7.4, b) 항-DIG 항체 연계된 비드, c) CD20 항원에 대한 포획 항체로서 DIG 연계된 오파투무맙, d) 검출 항체로서 비오틴 연계된 오파투무맙, e) 효소 시약으로서 스트렙타비딘 연계된 베타 갈락토시다아제 (SBG), 그리고 f) 신호에 대한 리포터로서 이용된 SBG에 대한 기질인 RGP (도 10을 또한 참조한다).
세포외 소포에서 발현된 CD20은 500 ng/mL의 시작 농도에서 표준 곡선 희석제에 희석되었다. 10개의 2배 연속 희석액이 0.5 ng/mL의 최종 농도로 만들어진다. 11개 수준 플러스 비특이적 블랭크가 Quanterix 폴리프로필렌 낮은 결합 평판 내로 피펫팅되었다. 0.5 ug/mL까지 PBS, 1.5% BSA, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린 300, pH 7.4에서 희석된 검출기 및 포획 항체가 제조되고, 그리고 96 웰 평판 이전에 상기 기기 위에 부하되었다. 효소 시약 SA 베타 갈락토시다아제가 자체 완충액에서 150 pM의 농도로 희석되었다. 미가공 데이터가 상기 기기로부터 excel cvs 파일 형태로 다운로드되고, 그리고 SoftMax Pro 소프트웨어를 이용하여 5pl 적합으로 회귀되었다. 표 2는 Quanterix에 의한 예시적인 EV CD20 표준 곡선을 제공한다.
표 2. Quanterix에 의한 EV CD20 표준 곡선
공칭 농도
(ng/ml)		 AEB AEB CV(%) 검정된 농도 (ng/ml) CV (검정된 농도) (%) 공칭으로부터 회수 (%)
비특이적 신호 0.048 5.635
0.488 0.058 1.0 0.24 22.6 49
0.977 0.066 5.0 0.91 29.3 92.9
1.953 0.083 4.0 2.16 11.5 111
3.906 0.115 7.7 4.51 13.7 116
7.813 0.167 2.8 8.00 3.9 102
15.625 0.292 3.5 15.9 3.9 102
31.25 0.517 4.7 29.4 4.9 94.1
62.5 0.964 4.2 54.8 4.1 87.8
125 2.679 9.4 147 9.1 118
250 5.007 1.2 271 1.2 109
500 8.773 1.2 478 1.3 95.6
실시예 2. 교정 곡선을 이용한 & 이것 없이 종양 항원의 검출
혈장 수집. 6mL의 전혈이 수집되고 혈장 라벤더 톱 배큐테이너관 (혈장 수집관, BD #367863) 내로 이전되었다. 상기 수집관은 혈류가 멈출 때까지 완전히 채워졌다. 전혈 수집 후, 균일하게 혼합하기 위해, 혈장 라벤더 톱 배큐테이너관이 부드럽게 및 완전히 5 회 반전되었다. 적혈구는 관을 활발하게 반전시켜도 파열되지 않았다. 세포 용해는 검체 분해를 야기할 수 있다. 혈액 수집 직후에, 검체가 일반 얼음 상에 배치되었다. 상기 과정은 채혈의 30 분 이내에 시작되었다.
표본이 처리 후 즉시 동결되었다. 배큐테이너관이 1600 x g에서 4 ℃에서 15 분 동안 원심분리되었다. 세포의 흰색 층을 교란하지 않으면서, 혈장이 전달 피펫을 이용하여 관의 상위층으로부터 느리게 및 신중하게 수집되고 (~3mL), 그리고 전표지화된 2개의 4.5mL NUNC 관 내로 이전되었다. 나머지 세포 펠렛은 적절하게 폐기되었다. 모든 가능한 혈장이 제거되는 것은 아니었다. 혈장은 세포 물질 (단핵 세포)로 혈장의 오염을 방지하기 위해, 백혈구연층으로부터 약 5 mm 떨어져 있었다. 혈장은 5-6 회 반전에 의해 혼합되고, 그리고 전표지화된 2.0mL Sarstedt 관에서 분취되었다. 이들 표본은 보관을 위해, -70/-80℃ 냉동기 (바람직) 또는 -20℃ 냉동기 (대안)에 직립 자세로 이전되었다.
이들 표본은 분석 때까지, -70/-80℃ (바람직) 또는 -20℃ (대안)에서 보관되었다.
순차 검정. 3-일 순차 검정 (도 5a)이 향상된 민감도가 바람직한 사례에서 이용될 수 있다. 1일 자: 평판이 4 ℃에서 하룻밤 동안 포획 항체로 코팅되었다. 2일 자: 표본이 첨가되고 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 3일 자: 검출 항체 (비오틴에 접합됨) 및 SA-HRP가 첨가되었다. 하기 항체 및 신호 조건이 이용되었다: Ocre 1ug/ml (포획 항체), Ofa 0.5ug/ml (검출 항체) 및 HRP 100ng/mL (신호). 표 3은 순차 검정에 의해 창출된 예시적인 데이터를 제공한다.
표 3. 병렬성: 3 일 순차 검정
표본 희석 흡광도 교정된 희석 (ng/mL) 순수로부터 회수 % 2배로부터 회수 %
D8 순수 0.63 153.5 참조 -
2 0.403 190 124 참조
4 0.25 219.2 115 115
8 0.161 240.7 110 110
16 0.335 1237.4 514 514
F9 순수 2.432 816.466 참조 -
2 1.745 991.9 121 참조
4 0.902 904.2 91 91
8 0.425 804.7 89 89
16 0.203 672.7 84 84
F10 순수 0.911 228.397 참조 -
2 0.524 252.1 110 참조
4 0.281 252.4 100 100
8 0.139 185.9 74 74
16 0.099 164.1 88 88
F3 순수 1.031 262.143 참조 -
2 0.626 305 116 참조
4 0.404 380.9 125 125
8 0.192 311.6 82 82
16 0.116 256 82 88
F6 순수 0.767 189.456 참조 -
2 0.556 268.7 142 참조
4 0.303 276.3 103 103
8 0.221 375.4 136 136
16 0.158 463.9 124 124
F1 순수 0.777 192.092 참조 -
2 0.519 249.6 130 참조
4 0.311 284.1 114 114
8 0.392 737.9 260 260
16 0.15 428.6 58 58
가교 검정. 2-일 가교 검정 (도 5b)이 결과까지 감소된 시간이 바람직한 사례에서 이용될 수 있다. 1일 자: 100 uL 표본이 4 ℃에서 하룻밤 동안 100 uL 마스터 믹스 (Ab-DIG + Ab-비오틴)와 함께 배양되었다. 2일 자: 마스터 믹스를 포함하는 100 uL의 표본이 제거되고 SA 평판으로 이전되었다. 신호가 항-DIG-HRP로 검출되었다. 하기 항체 및 신호 조건이 이용되었다: 마스터 믹스 1ug/mL (ofa-DIG + 항-DIG-비오틴) 및 HRP 50 ng/mL(신호). 표 4는 가교 검정에 의해 창출된 예시적인 데이터를 제공한다.
표 4. 병렬성: 2 일 가교 검정
표본 배수 희석 신호 Obs 농도 [ng/ml] 회수 % (순수로부터) 회수 % (½ MRD로부터)
F1 1 0.228 81.40 참조 -
2 0.118 39.00 96% 참조
4 0.080 23.61 116% 121%
8 0.55 13.77 135% 141%
F2 1 0.322 117.92 - -
2 0.168 58.15 99% -
4 0.109 35.43 120% 122%
8 0.084 25.37 172% 175%
F3 1 2.649 1647.70 참조 -
2 2.054 1030.81 125% 참조
4 1.189 494.65 120% 96%
8 0.740 287.90 140% 112%
D1 1 0.137 43.95 - -
2 0.062 13.99 64% -
4 0.046 8.22 75% 117%
8 0.033 3.57 65% 102%
D2 1 0.242 89.46 참조 -
2 0.147 48.18 108% 참조
4 0.093 25.88 116% 107%
8 0.070 17.01 152% 141%
D3 1 0.053 10.67 - -
2 0.032 3.44 64% -
4 0.025 1.26 47% 73%
8 0.028 1.96 147% 228%
D4 1 0.101 29.23 참조 -
2 0.066 15.65 107% 참조
4 0.040 5.93 81% 76%
8 0.032 3.24 89% 83%
교정 곡선 없이 신호 검출: 표본 및 시약이 EV 교정기 없이 표준 곡선 희석제에서 희석되었다. 표본이 연속 2배 희석되었다. 희석된 표본이 Quanterix 폴리프로필렌 낮은 결합 평판 내로 피펫팅되었다. 항-DIG 항체, 오파투무맙-DIG 및 오파투무맙-비오틴에 연계된 비드가 0.5ug/mL의 농도로 표준 곡선 희석제에서 희석되었다. 비드가 1.4 x 109개 비드/mL의 공칭 비드 농도로 희석된다. 효소 (스트렙타비딘 β-갈락토시다아제, SBG)가 150pM으로 SBG 희석제에서 희석되었다. 이들 비드, 검출기, 효소, 기질 및 96 웰 평판 내포 표준/표본은 상기 기기 위에 부하되었다. 미가공 데이터가 상기 기기로부터 excel cvs 파일 형태로 다운로드되었다. 상기 미가공 데이터는 Excel 스프레드시트를 이용하여 처리되었다.
표 5에서 도시된 바와 같이, 재조합 인간으로 어떤 교정 곡선도 산출되지 않았는데, 여기서 오크렐리주맙이 포획 항체로서 이용되었고 오파투무맙이 검출 항체로서 이용되었다. 상업적으로 가용한 재조합 인간은 아마도 막경유 나선에 의한 루프의 형성의 결여로 인해, Ocre/Ofa 조합으로 신호를 이끌어 내지 못하였다. 막에 결합되지 않은 선형 펩티드 또는 재조합 단백질은 ELISA에서 신호를 이끌어 내지 못하는데, 이것은 오크렐리주맙 또는 오파투무맙이 상기 입체형태에서 CD20에 결합하지 않는다는 것을 암시한다.
표 5. 교정 곡선 없이 신호의 검출
Ab 쌍:
Ocre/Ofa		 Rh CD20 실험 농도 (ng/ml) 신호 전장 신호 절두된 1 신호 절두된 2
1 200 0.01 0.01 0.01
2 66.67 0.01 0.01 0.01
3 22.22 0.01 0.01 0.01
4 7.41 0.01 0.01 0.01
5 2.47 0.01 0.02 0.01
6 0.82 0.01 0.01 0.01
7 0.27 0.01 0.01 0.01
8 0 0.01 0.01 0.01
교정 곡선을 이용한 신호 검출: CD20 EV가 500 ng/mL의 시작 농도에서 표준 곡선 희석제에서 희석되었다. 10개의 2배 연속 희석액이 0.5 ng/mL의 최종 농도로 만들어졌다. 11개 수준 플러스 비특이적 블랭크가 Quanterix 폴리프로필렌 낮은 결합 평판 내로 피펫팅되었다.
오파투무맙-DIG 및 오파투무맙-비오틴이 0.5ug/mL의 농도로 BA003 + 1.5% BSA에서 희석되었다. 항-DIG Ab-비드가 1.4 x 109개 비드/mL의 공칭 비드 농도로 BA003 + 1.5% BSA에서 희석된다. 효소 (스트렙타비딘 β-갈락토시다아제, SBG)가 150pM으로 SBG 희석제에서 희석되었다. 이들 비드, 검출기, 효소, 기질 및 96 웰 평판 내포 표준/표본은 상기 기기 위에 부하되었다. 미가공 데이터가 Softmax Pro를 이용하여 이출되고 분석되었다.
표 6은 용량-의존성 신호 (비드당 평균 효소, 도 10을 또한 참조한다), 표준 편차, CD 관찰된 농도, 농도의 변동 계수, 그리고 회수를 제공한다. 하기 공식이 이용되었다:
신호: 비드당 평균 효소 (AEB),
변동 계수 (%C.V.)
Figure pct00007
,
표준 편차 (S.D.)
Figure pct00008
, 그리고
이론과의 차이 (회수%)
Figure pct00009
표 6. 교정 곡선을 이용한, 항-CD20 항체로 CD20 EV 신호의 검출
표준 곡선 CD20 예상된 농도 [ng/ml] 신호 표준 편차 CD 관찰된 농도 [ng/ml] 농도 % CV 회수 %
1 500.00 2.92 0.002 498.92 0.12 99.78
2 250.00 1.90 0.007 252.92 0.51 101.17
3 125.00 1.05 0.020 121.56 2.17 97.25
4 62.50 0.58 0.002 62.71 0.44 100.34
5 31.25 0.32 0.003 32.82 1.19 105.01
6 15.63 0.17 0.007 16.55 4.46 105.91
7 7.81 0.10 0.003 8.09 3.90 103.60
8 3.91 0.06 0.002 4.39 4.00 112.42
9 1.95 0.04 0.001 1.34 6.80 68.54
10 0.98 0.03 0.002 0.37 56.40 37.68
12 0.00 0.02 0.000
실시예 3. 비드-기초된 면역검정 형식
단백질, 예를 들면, 종양 항원을 검출하는 데 유용한 대안적 형식은 비드-기초된 면역검정, 예를 들면, the Quanterix 플랫폼을 포함한다. 이런 검정에서 항-DIG Ab, 그 이후에 오파투무맙-DIG 코팅이 cCD20을 포획하는 데 이용될 수 있고, 그리고 오파투무맙-비오틴, 그 이후에 스트렙타비딘 베타 갈락토시다아제가 검출에 이용될 수 있다 (도 6).
예시적인 비드-기초된 면역검정 형식에서, 오파투무맙-DIG 및 오파투무맙-비오틴이 0.5ug/mL의 농도로 BA003 + 1.5% BSA에서 희석되었다. 디곡신에 대한 항체로 표지화된 비드 (항-DIG-비드)가 1.4 x 109개 비드/mL의 공칭 비드 농도로 BA003 + 1.5% BSA에서 희석되었다. 효소 (스트렙타비딘 β-갈락토시다아제, SBG)가 150pM으로 SBG 희석제에서 희석되었다. 이들 비드, 검출기, 효소, 기질 및 96 웰 평판 내포 표준/표본은 상기 기기 위에 부하된다.
도 6에서 도시된 바와 같이, 첫 번째 단계에서, 표본, 항-DIG 비드, 오파투무맙-비오틴 및 오파투무맙 DIG 검출기가 대략 67 카덴스 (50 분)의 배양을 위해, 큐벳 내로 피펫팅되어 샌드위치가 형성되었다. 이후, 두 번째 단계에서, 샌드위치가 SBG로 표지화되고 7 카덴스 (5 분) 동안 배양되었다. 단계 사이에, 자석이 비드를 펠렛화하고, 그 이후에 세척 단계가 뒤따랐다. 이들 비드는 레조루핀 β-D-갈락토피라노시드 (RGP) 기질에서 재현탁되고, 그리고 영상화를 위해 Simoa 디스크로 이전되었다. 표 7은 비드당 용량-의존성 평균 효소 (AEB), 변동 계수 (CV), 계산된 농도, 농도의 CV, 회수, 그리고 신호 대 배경 비율을 제공한다.
표 7. cCD20의 Quanterix 검출
예상된 농도
[CD20] (ng/ml)		 AEB
(신호)		 CV (%) 계산된 농도
(ng/ml)		 CV-농도 (%) 회수 (%) S/B
500 6.791 1.1 477.5 1.1 96 194
250 3.877 4.9 273 4.8 109 111
125 2.135 4 150.5 3.9 121 61
62.5 0.772 1 54 1 86 22.1
31.25 0.442 6.1 30.3 6.4 97 12.6
15.625 0.236 0.4 15.4 0.5 99 6.74
7.813 0.135 2.4 7.975 2.9 102 3.86
3.906 0.08 2.4 3.93 3.6 101 2.29
1.953 0.057 1.2 2.19 2.4 112 1.63
0.977 0.045 9.1 1.295 24.2 133 1.29
0.488 0.032 4.2 0.2555 41.4 52 0.91
블랭크 0.035
실시예 4. 검출감도에 대한 세정제의 영향
한 세트의 CD20 대조 (5 및 50 ng/mL)가 PBS, 1.5% BSA, 0.15% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린 300, pH 7.4에서 제조되었다. 두 번째 세트가 PBS, 1.5% BSA, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린 300, pH 7.4에서 제조되었다. 이들 대조는 Quanterix 기기에서 검정되었다. 도 7에서 도시된 바와 같이, 검정에서 더 낮은 세정제는 향상된 신호 대 배경 (S/B) 비율을 보여주었다.
실시예 5. 약물 내성 검정
약물 내성 대조가 내인성 영향을 경감하기 위한 완충액 매트릭스에서 제조되었다 (도 8). CD20 TDB 및 CD20이 각각, 공칭 농도의 2배 농도에서 PBS, 1.5% BSA, 0.05% 폴리소르베이트 20, 0.05% 프로클린 300, pH 7.4에서 희석되고, 그리고 이후 1 대 1로 조합되었다. 최종 농도는 0, 0.05, 0.5 및 5 ug/mL TDB, 그리고 50 ng/mL CD20이었다. 대조가 검정되고 표준 곡선에 대해 정량되었다. 약물 내성 검사는 5 ug/mL TDB (예를 들면, 항-CD20-CD3)의 존재에서 50 ng/mL CD20 EV에서 약 50% 간섭을 보여주었다.
실시예 6. Biacore™을 이용하여, 세포외 소포 상에서 발현된 CD20에 대한 항-CD20 TDB의 특징화
세포외 소포 (EVs) 상에서 발현된 CD20 및 항-CD20 TDB 사이에 결합 상호작용이 Biacore™ T200 기기 (GE Healthcare; Piscataway, NJ)에서 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술에 의해 평가되었다. 해리 평형 상수 (KD), 해리 속도 상수 (kd), 그리고 연관 속도 상수 (ka) 값이 이질성 피분석물 결합 모형을 이용하여 Biacore™ T200 평가 소프트웨어 (버전 3.0; GE Healthcare)로 계산되었다.
CD20 EVs가 간접적인 포획 방법을 이용하여 SA 센서 칩 상에서 상이한 흐름 셀 (FCs) 위에 포획되었다 (도 9a). 비오틴화된 항-CD81 및 항-CD9 항체 (30 ug/mL의 동등한 농도로 혼합됨)가 먼저, 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 4개의 FCs 모두 위에서 포획되어, 대략 2500 반응 단위 (RUs)의 포획 수준을 유발하였다. CD20 EVs는 이후, 40-120 초 (s) 동안 0.25 μg/mL의 농도에서 FC2 또는 FC4 위에 주입되었다. 이들 EVs에 대한 결과의 포획 수준은 600-1800 RU의 범위 안에 있었다. 다양한 농도의 항-CD20 TDB가 작업 완충액 (0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 그리고 3 mM EDTA, pH 7.4)에서 희석되고, 그리고 이후, 1 또는 2 분 (분) 동안 100 μL/분의 유속에서 4개의 FCs 내로 주입되었다; 이들 항체로부터 항-CD20 TDB의 해리가 동역학적 친화성 계측을 위해 10 분 동안 진행되도록 허용되었다. 실험이 37℃에서 수행되었고, 그리고 결과가 도 9b에서 요약된다. 37C에서 CD20 EVs에 대한 항-CD20 TBD의 결합의 대표적인 Biacore 센서그램 또한, 도 9b에서 제시된다.
* * *
묘사되고 청구된 다양한 구체예에 더하여, 개시된 요부는 본원에서 개시되고 청구된 특질의 다른 조합을 갖는 다른 구체예에 또한 관계한다. 따라서, 본원에서 제시된 특정 특질은 개시된 요부가 본원에서 개시된 특질의 임의의 적합한 조합을 포함하도록, 개시된 요부의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 조합될 수 있다. 개시된 요부의 특정한 구체예에 관한 전술한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제시되었다. 이것은 완전하거나 또는 개시된 요부를 개시된 구체예로만 한정하는 것으로 의도되지 않는다.
다양한 변형과 변이가 개시된 요부의 사상 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서, 개시된 요부의 조성물과 방법에서 만들어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 개시된 요부는 첨부된 청구항의 범위 안에 있는 변형과 변이 및 이들의 등가물을 포함하는 것으로 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되는데, 이들의 내용은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.

Claims (36)

  1. 표본 내에서 막 관련 단백질을 검출하기 위한 검정이며,
    a) 표본 내에서 막 관련 단백질을 포함하는 세포외 소포에 결합하여, 포획 항체-세포외 소포 복합체를 산출하는 포획 항체, 및
    b) 포획 항체-세포외 소포 복합체에 결합하여, 검출가능한 결합된 복합체를 형성하는 검출 항체
    를 포함하되, 상기 검출가능한 결합된 복합체로부터 획득된 신호가 상기 단백질을 포함하는 세포외 소포로부터 검출된 하나 이상의 공지된 값에 대해 교정되는, 검정.
  2. 제1항에 있어서, 포획 항체는 검출 항체와의 결합에 대해 경쟁하지 않는, 검정.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포획 항체는 검출 항체와 상이한 에피토프에 결합하는, 검정.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 막 관련 단백질은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원, 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 검정.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 검정.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 검정.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포 교정기를 더욱 포함하는, 검정.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 검정.
  9. 다음 단계를 포함하는, 표본 내에서 순환 단백질의 농도를 정량하는 방법:
    a) 표본 내 세포외 소포에서의 표적 단백질의 수준을 결정하는 단계, 및
    b) 표본 내 세포외 소포에서의 표적 단백질의 수준을, 표적 단백질을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 산출된 교정 곡선과 비교하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 표적 단백질은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원, 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 단백질의 농도 및 교정 곡선은 면역검정, ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정되는, 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  14. 다음 단계를 포함하는, 표본 내에서 순환 단백질의 농도를 정량하는 방법:
    a) 상기 단백질을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 교정 곡선을 산출하는 단계, 및
    b) 표본 내 세포외 소포에서의 상기 단백질의 수준을 교정 곡선과 비교하여, 표본 내 세포외 소포에서의 상기 단백질의 양을 결정하는 단계.
  15. 제14항에 있어서, 단백질은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원, 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 순환 단백질의 농도 및 교정 곡선은 면역검정, ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정되는, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  19. 다음 단계를 포함하는, B-세포 림프종을 앓는 환자가 항-CD20 요법에 대한 반응을 나타낼 가능성이 높은 지를 결정하는 방법:
    a) 환자로부터 표본을 획득하는 단계,
    b) 표본 내 세포외 소포에서의 순환 CD20의 양을 결정하는 단계,
    c) 표본 내 세포외 소포에서의 CD20의 수준을, CD20을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 산출된 교정 곡선과 비교하는 단계, 및
    d) 결정된 표본 내 세포외 소포에서의 순환 CD20의 양에 근거하여, 환자가 CD20 요법에 대한 반응을 나타낼 가능성이 높은 지를 결정하는 단계.
  20. 제19항에 있어서, 항-CD20 요법은 항-CD20 항체의 투여를 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 순환 단백질의 농도 및 교정 곡선은 면역검정, ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정되는, 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  25. 항-CD20 항체의 친화성을 결정하는 방법이며,
    항-CD20 항체에 표면 플라스몬 공명 (SPR) 분석을 실행하되, 상기 SPR 분석이 리간드로서 CD20을 발현하는 세포외 소포 및 피분석물로서 항-CD20 항체의 이용을 포함하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제26항에 있어서, 항-CD20 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 세포외 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  28. 다음 단계를 포함하는, 환자로부터 획득된 T 세포의 활성화를 결정하는 방법:
    a) CD20을 발현하는 세포외 소포를 T 세포 및 CD20 T-세포 의존성 이중특이적 항체와 함께 배양하는 단계, 및
    b) T 세포의 활성화를 결정하는 단계.
  29. 제28항에 있어서, 세포외 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  30. 다음 단계를 포함하는, 종양의 치료가 필요한 개체에서 종양을 치료하는 방법:
    a) 개체로부터 표본을 획득하는 단계,
    b) 종양 항원을 포함하는 세포외 소포를 이용하여 교정 곡선을 산출하는 단계,
    c) 표본 내 세포외 소포에서의 종양 항원의 수준을 교정 곡선과 비교하여, 표본 내 세포외 소포에서의 표적 종양 항원의 양을 결정하는 단계,
    d) 표본 내 세포외 소포에서의 종양 항원의 수준에 근거하여, 개체가 항체 요법에 대한 반응을 나타낼 가능성이 높은 지를 결정하는 단계, 및
    e) d)에서의 결정에 대응하여 치료제를 투여하는 단계.
  31. 제30항에 있어서, 세포외 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63, CD9, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것인 단계를 더욱 포함하는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 항체는 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오비누투주맙, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 종양 항원은 인간 CD20 항원, 생쥐 CD20 항원, 쥐 CD20 항원, 토끼 CD20 항원, 시노몰구스 원숭이 CD20 항원, 인간 CD3 항원, 생쥐 CD3, 쥐 CD3 항원, 토끼 CD3 항원, 시노몰구스 원숭이 CD3 항원, 인간 FcRH5 항원, 인간 Ly6G6 항원, 인간 HER2 항원, 인간 EGFR 항원, 인간 HER3 항원, 인간 HER4 항원, 인간 PSMA 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 표본은 혈장 표본, 혈청 표본, 조직 배양 상층액 표본, 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 방법.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 순환 종양 항원의 농도 및 교정 곡선은 면역검정, ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정되는, 방법.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세포외 소포 마커의 존재를 검출하되, 상기 세포외 마커가 CD81, CD63 및/또는 CD9를 포함하는 것인 단계를 더욱 포함하는, 방법.
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