JP5768147B2 - 一価抗原結合タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、CH1-CLドメイン交換を有する一価抗原結合タンパク質、それを作製するための方法、抗体を含有している薬学的組成物、およびそれらの使用に関する。

発明の背景
過去二十年間に、単一特異性または多特異性の、一価または多価の、遺伝子工学で作製された様々な抗体誘導体が、開発されて評価されてきた（例えば、Holliger,P.,et al.,Nature Biotech 23(2005)1126-1136（非特許文献1）；Fischer,N.,and Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14（非特許文献2））。

特定の抗原、例えば、c-Metについて、一価抗体は、アゴニスト機能の欠如、または対応する二価型より低下した抗体結合時の受容体内部移行等の、様々な特性を有しており、従って、治療的に使用するための魅力的な型である。例えば、WO2005/063816（特許文献1）は、治療薬としての一価抗体断片に言及している。

US2004/0033561（特許文献2）は、VH-CH1-CH2-CH3抗体鎖とVL-CL-CH2-CH3抗体鎖との同時発現に基づく一価抗体の生成の方法を記載しているが、しかしながら、この方法の欠点は、図2に図示されるとおりのVL-CL-CH2-CH3鎖の結合不活性ホモ二量体の形成である。分子量が類似しているため、そのようなホモ二量体副産物は、分離するのが困難である。

WO2007/048037（特許文献3）も、VH-CH1-CH2-CH3抗体鎖とVL-CL-CH2-CH3抗体鎖との同時発現に基づく一価抗体に言及しているが、それは、分離するのが困難なホモ二量体副産物のより容易な精製のため、重鎖に付着したタグ付き部分を有している。

WO2009/089004（特許文献4）は、静電的ステアリング（electrostatic steering）効果を使用してヘテロ二量体一価抗体を生成する別の可能性を記載している。

WO2010/145792（特許文献5）は、類似の重量のミスマッチ副産物が減少して、所望の二特異性抗体の収率がより高くなる、四価二特異性抗体に関する。

WO2005/063816 US2004/0033561 WO2007/048037 WO2009/089004 WO2010/145792

Holliger,P.,et al.,Nature Biotech 23(2005)1126-1136 Fischer,N.,and Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14

本発明は、
（a）VHドメインが抗体のVLドメインに置換されている、抗原と特異的に結合する該抗体の修飾された重鎖；および
（b）CH1ドメインが該抗体のCLドメインに置換されている、該抗体の修飾された重鎖
を含む一価抗原結合タンパク質を含む。

本発明の一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、（a）の抗体の修飾された重鎖のCH3ドメインと、（b）の抗体の修飾された重鎖のCH3ドメインとが各々、抗体CH3ドメイン間の当初境界面を含む境界面において接すること
を特徴とし、該境界面は、該一価抗原結合タンパク質の形成を促進するよう改変されており、該改変は、
（i）該一価抗原結合タンパク質内の他方の重鎖のCH3ドメインの該当初境界面に接する一方の重鎖のCH3ドメインの該当初境界面内で、
アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、他方の重鎖のCH3ドメインの該境界面内の空隙内に位置し得る突出部が、一方の重鎖のCH3ドメインの該境界面内に生じるように、
一方の重鎖のCH3ドメインが改変されること、および
（ii）該一価抗原結合タンパク質内の第1のCH3ドメインの該当初境界面に接する第2のCH3ドメインの該当初界面内で、
アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、第1のCH3ドメインの該境界面内の突出部が位置し得る空隙が、第2のCH3ドメインの該境界面内に生じるように、
他方の重鎖のCH3ドメインが改変されること
を特徴とする。

本発明の一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、
より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）からなる群より選択され、かつより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）からなる群より選択されること
を特徴とする。

本発明の一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、両CH3ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るように、各CH3ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（C）の導入により、両CH3ドメインがさらに改変されていること
をさらに特徴とする。

一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、ヒトIgGアイソタイプであることを特徴とする。

一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、
（a）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；
または
（a）SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；
または
（a）SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；
または
（a）SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；
または
（a）SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；
または
（a）SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。

本発明の一つの局面において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、（a）および（b）の修飾された重鎖がIgG1アイソタイプであり、かつ、該抗原結合タンパク質が、脱フコシル化され、Asn297において総オリゴ糖（糖）量の80％またはそれ未満（好ましくは、65％〜5％）であるフコース量を有することを特徴とする。

本発明は、
（a）本発明に係る一価抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターで、宿主細胞を形質転換する工程、
（b）該一価抗原結合タンパク質分子の合成を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する工程、および
（c）培養物から該一価抗原結合タンパク質分子を回収する工程
を含む、本発明に係る一価抗原結合タンパク質の調製のための方法をさらに含む。

本発明は、本発明に係る一価抗原結合タンパク質をコードする核酸をさらに含む。

本発明は、本発明に係る一価抗原結合タンパク質をコードする核酸を含むベクターをさらに含む。

本発明は、前記ベクターを含む宿主細胞をさらに含む。

本発明は、本発明に係る一価抗原結合タンパク質の組成物、好ましくは、薬学的組成物または診断用組成物をさらに含む。

本発明は、本発明に係る一価抗原結合タンパク質と、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物をさらに含む。

本発明は、治療を必要とする患者の処置のための方法であって、本発明に係る一価抗原結合タンパク質の治療的有効量を該患者へ投与することを特徴とする、方法をさらに含む。

本発明に係る抗原結合タンパク質は、VL-CH1-CH2-CH3鎖とVH-CL-CH2-CH3鎖とがヘテロ二量体のみを形成し、構造および分子量が類似している分離が困難なホモ二量体副産物を形成し得ないという原理に基づく。この修飾の効果は、主として副産物の低下にあるのではなく、形成された唯一の副産物が、類似のサイズのホモ二量体副産物から高分子量四量体（図1D）へ変化するという点にある。この高分子量四量体は、SECまたはその他のMW分離技術により容易に除去可能である。

形成された二量体副産物（図1D）は、異なる分子量（分子量はおよそ2倍である）および構造のため、容易に分離可能である。従って、（例えば、タグの遺伝子導入等の）さらなる修飾の導入なしに、精製が可能である。

本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、生物学的活性または薬理学的活性（例えば、ADCCまたはアンタゴニスト生物学的活性、およびアゴニスト活性の欠如）等の有益な特徴を有することがさらに見出された。それらは、例えば、癌等の疾患の処置のために使用され得る。一価抗原結合タンパク質は、さらに、高度に有益な（例えば、半減期（t1/2）またはAUC等の）薬物動態特性を有する。
[本発明1001]
（a）VHドメインが抗体のVLドメインに置換されている、抗原と特異的に結合する該抗体の修飾された重鎖；および
（b）CH1ドメインが該抗体のCLドメインに置換されている、該抗体の修飾された重鎖
を含む、一価抗原結合タンパク質。
[本発明1002]
（a）の抗体の修飾された重鎖のCH3ドメインと、（b）の抗体の修飾された重鎖のCH3ドメインとが各々、抗体CH3ドメイン間の当初境界面を含む境界面において接すること
を特徴とし、該境界面が、前記一価抗原結合タンパク質の形成を促進するよう改変されており、該改変が、
（i）該一価抗原結合タンパク質内の他方の重鎖のCH3ドメインの該当初境界面に接する一方の重鎖のCH3ドメインの該当初境界面内で、
アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、他方の重鎖のCH3ドメインの該境界面内の空隙内に位置し得る突出部が、一方の重鎖のCH3ドメインの該境界面内に生じるように、
一方の重鎖のCH3ドメインが改変されること、および
（ii）該一価抗原結合タンパク質内の第1のCH3ドメインの該当初境界面に接する第2のCH3ドメインの該当初境界面内で、
アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、該第1のCH3ドメインの該境界面内の突出部が位置し得る空隙が、該第2のCH3ドメインの該境界面内に生じるように、
他方の重鎖のCH3ドメインが改変されること
を特徴とする、本発明1001の一価抗原結合タンパク質。
[本発明1003]
より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）からなる群より選択され、かつ、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）からなる群より選択されること
を特徴とする、本発明1002の一価抗原結合タンパク質。
[本発明1004]
両CH3ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るように、各CH3ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（C）の導入により、両CH3ドメインがさらに改変されていること
を特徴とする、本発明1003の一価抗原結合タンパク質。
[本発明1005]
ヒトIgG1アイソタイプであることを特徴とする、本発明1001〜1004のいずれかの一価抗原結合タンパク質。
[本発明1006]
（a）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
（a）SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
（a）SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
（a）SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
（a）SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
（a）SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖
を含むことを特徴とする、本発明1001の一価抗原結合タンパク質。
[本発明1007]
（a）および（b）の修飾された重鎖がIgG1アイソタイプであり、かつ、前記抗原結合タンパク質が、脱フコシル化されAsn297において総オリゴ糖（糖）量の80％またはそれ未満であるフコース量を有し、ヒトIgG1アイソタイプであることを特徴とする、本発明1001、1002、1003、1004、または1006のいずれかの一価抗原結合タンパク質。
[本発明1008]
本発明1001〜1007のいずれかの一価抗原結合タンパク質の薬学的組成物。
[本発明1009]
本発明1001〜1007のいずれかの一価抗原結合タンパク質と、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
[本発明1010]
癌の処置において使用するための、本発明1001〜1007のいずれかの一価抗原結合タンパク質。
[本発明1011]
癌の処置用の医薬の製造のための、本発明1001〜1007のいずれかの一価抗原結合タンパク質の使用。
[本発明1012]
治療を必要とする患者の処置のための方法であって、本発明1001〜1007のいずれかの一価抗原結合タンパク質の治療的有効量を該患者へ投与することを特徴とする、方法。
[本発明1013]
（a）本発明1001〜1007のいずれかの一価抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターで、宿主細胞を形質転換する工程、
（b）該一価抗原結合タンパク質分子の合成を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する工程、および
（c）培養物から該一価抗原結合タンパク質分子を回収する工程
を含む、本発明1001〜1007のいずれかの一価抗原結合タンパク質の調製のための方法。
[本発明1014]
本発明1001〜1007のいずれかの一価抗原結合タンパク質をコードする、核酸。
[本発明1015]
本発明1014の核酸を含む、ベクター。
[本発明1016]
本発明1015のベクターを含む、宿主細胞。

（A）VL-CH1-CH2-CH3鎖およびVH-CL-CH2-CH3鎖に基づくCH1-CLドメイン交換を有する本発明に係る一価抗原結合タンパク質（MoAbと略記する）のスキーム。（B）CH3ドメインにノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-holes）を含む、本発明に係るMoAbのスキーム。（C）二量体二価抗原結合タンパク質（異なる構造および分子量のため容易に分離可能な、副産物として形成されたMoAb二量体）のスキーム。 （A）（例えば、US2004/0033561に記載された）VL-CL-CH2-CH3鎖およびVH-CH1-CH2-CH3鎖の一価抗体、ならびに（B）（例えば、WO2007/048037に記載された）分離が困難な、VL-CL-CH2-CH3鎖の結合不活性ホモ二量体副産物のスキーム。 MoAb c-Met（c-Met 5D5 MoAb（「wt」））の生化学的特徴決定。（A）プロテインAで精製された抗原結合タンパク質を、Superdex 200 26/60カラムで分離した。個々のピークは、MoAb（3）、MoAb二量体（2）、および凝集物画分（1）に対応する。（B）ピーク画分（1、2、3）をプールし、非還元条件および還元条件の下でSDS-PAGEに供した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルー色素で染色した。 一価のMoAb IGF1R（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））の生化学的特徴決定。プロテインAで精製された抗原結合タンパク質をSuperdex 200 26/60カラムで分離した。個々のピークは、MoAb（2）およびMoAb二量体（1）に対応する。 一価のMoAb IGF1R（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））の生化学的特徴決定。ピーク画分（1、2）をプールし、非還元条件および還元条件の下でSDS-PAGEに供した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルー色素で染色した。 一価のMoAb IGF1R（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））の生化学的特徴決定。ピーク画分1および2の分子量をSEC-MALLSにより調査した。ピーク2が一価抗原結合タンパク質MoAb IGF1Rと同定された。 MoAb Her3（Her3 205 MoAb（「wt」））の生化学的特徴決定。（A）プロテインAで精製された抗体をSuperdex 200 26/60カラムで分離した。個々のピークは、MoAb（3）、MoAb二量体（2）、および凝集物画分（1）に対応する。（B）ピーク画分（1、2、3）をプールし、非還元条件および還元条件の下でSDS-PAGEに供した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルー色素で染色した。 KiH変異を有するMoAb Her3（Her3 205 MoAb KiH）の生化学的特徴決定。（A）プロテインAで精製された抗原結合タンパク質をSuperdex 200 26/60カラムで分離した。（B）ピーク画分をプールし、非還元条件および還元条件の下でSDS-PAGEに供した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルー色素で染色した。 KiH変異を有するMoAb IGF1R（IGF1R AK18 MoAb KiH）の生化学的特徴決定。（A）プロテインAで精製された抗体をSuperdex 200 26/60カラムで分離した。個々のピークは、MoAb（2）およびMoAb二量体（1）に対応する。（B）ピーク画分（1、2）をプールし、非還元条件および還元条件の下でSDS-PAGEに供した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルー色素で染色した。 KiH変異を有するMoAb c-Met（c-Met 5D5 MoAb KiH）の生化学的特徴決定。（A）プロテインAで精製された抗体をSuperdex 200 26/60カラムで分離した。（B）ピーク画分をプールし、非還元条件および還元条件の下でSDS-PAGEに供した。ポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルー色素で染色した。 A549細胞におけるc-Met受容体リン酸化アッセイ法。A549細胞を、c-Met結合抗体またはc-Met 5D5 MoAb（「wt」）の非存在下または存在下で、HGFにより刺激した。全細胞溶解物をイムノブロット分析に供した。アスタリスクは、2本の非特異的なバンドの間のホスホc-Metバンドをマークしている。 フローサイトメトリー分析によるA549細胞に対するMoAb c-Met（c-Met 5D5 MoAb（「wt」）の細胞結合。A549細胞を、示された抗体の希釈系列と共にインキュベートした。結合した抗体を、Fcと結合する二次フルオロフォア結合抗体により可視化した。 一価抗原結合タンパク質IGF1R AK18 MoAb（「wt」）の結合親和性を分析するために適用された表面プラズモン共鳴アッセイ法の模式図。 フローサイトメトリー分析によるA549細胞に対するMoAb IGF-1R（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））の細胞結合。A549細胞を、示された抗体の希釈系列と共にインキュベートした。結合した抗体を、Fcと結合する二次フルオロフォア結合抗体により可視化した。 親となる糖鎖工学的に作製されていない（non-ge）IGF1R Mabおよび親となる糖鎖工学的に作製された（ge）IGF1R Mabおよび糖鎖工学的に作製されていない一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））によるADCCアッセイ法。ドナー由来の末梢血単核細胞（PBMC）を、親non-ge IGF1R Mab（＝1）、親ge IGF1R Mab（＝2）、およびnon-ge一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（＝3）の存在下で、前立腺癌細胞（DU145）と共にインキュベートした。 親IGF-1R IgG1抗体および一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））とのインキュベーションの後、IGF-1Rの内部移行を査定した。データは、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））が結合した場合、IGF-1Rの内部移行が、力価および絶対内部移行に関して低下することを示す。 IGF-1R IgG1抗体および一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））とのインキュベーションの後、IGF-1により誘導されるIGF-1Rの自己リン酸化を査定した。データは、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））が結合した場合、IGF-1により誘導されるIGF-1Rの自己リン酸化が、力価に関して低下することを示す。 DLS経時変化実験により、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））の凝集傾向を査定した。5日間にわたり、単離された単量体画分（図4参照）の水力学的半径（Rh）の測定可能な増加は検出され得なかった。 脱グリコシル化の後の、非還元条件下での一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））のESI-MSスペクトル。 脱グリコシル化および還元の後のIGF1R一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））のESI-MSスペクトル。

発明の詳細な説明
本発明は、
（a）VHドメインが抗体のVLドメインに置換されている、抗原と特異的に結合する該抗体の修飾された重鎖；および
（b）CH1ドメインが該抗体のCLドメインに置換されている、該抗体の修飾された重鎖
を含む一価抗原結合タンパク質を含む。

本発明の一つの好ましい態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質のCH3ドメインは、WO96/027011、Rigdway,J.B.,et al.,Protein Eng.9(1996)617-621；およびMerchant,A.M.,et al.,Nat Biotechnol 16(1998)677-681にいくつかの実施例と共に詳細に記載されている「ノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-holes）」（KiH）テクノロジーにより改変され得る。本発明においては、2個のCH3ドメインの相互作用面が、これらの2個のCH3ドメインを含有している両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させるため、改変される。（2本の重鎖の）2個のCH3ドメインの一方が「ノブ」であり得、他方が「ホール」である。この修飾の効果は、高分子量四量体副産物が有意に低下することである。

ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体をさらに安定化し（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35）、収率を増加させる。

従って、本発明の一つの局面において、一価抗原結合タンパク質は、
（a）の全長抗体の修飾された重鎖のCH3ドメインと、（b）の全長抗体の修飾された重鎖のCH3ドメインとが各々、抗体CH3ドメイン間の当初境界面を含む境界面において接すること
を特徴とし、該境界面は、該一価抗原結合タンパク質の形成を促進するよう改変されており、該改変は、
（i）該一価抗原結合タンパク質内の他方の重鎖のCH3ドメインの該当初境界面に接する一方の重鎖のCH3ドメインの該当初境界面内で、
アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、他方の重鎖のCH3ドメインの該境界面内の空隙内に位置し得る突出部が、一方の重鎖のCH3ドメインの該境界面内に生じるように、
一方の重鎖のCH3ドメインが改変されること、および
（ii）該一価抗原結合タンパク質内の第1のCH3ドメインの該当初境界面に接する第2のCH3ドメインの該当初境界面内で、
アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、第1のCH3ドメインの該境界面内の突出部が位置し得る空隙が、第2のCH3ドメインの境界面内に生じるように、
他方の重鎖のCH3ドメインが改変されること
を特徴とする。

好ましくは、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）からなる群より選択される。

好ましくは、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基は、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）からなる群より選択される。

本発明の一つの局面において、両CH3ドメインは、両CH3ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るように、各CH3ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（C）の導入により、さらに改変される。

一つの好ましい態様において、一価抗原結合タンパク質は、「ノブ鎖」のCH3ドメインにT366W変異を含み、かつ「ホール鎖」のCH3ドメインにT366S変異、L368A変異、Y407V変異を含む。例えば、「ノブ鎖」のCH3ドメインにY349C変異を導入し、「ホール鎖」のCH3ドメインにE356C変異またはS354C変異を導入することにより、CH3ドメイン間の付加的な鎖間ジスルフィド架橋が使用されてもよい（Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech 16(1998)677-681）。従って、別の好ましい態様において、一価抗原結合タンパク質は、2個のCH3ドメインの一方にY349C変異、T366W変異を含み、2個のCH3ドメインの他方にE356C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を含むか、または一価抗原結合タンパク質は、2個のCH3ドメインの一方にY349C変異、T366W変異を含み、2個のCH3ドメインの他方にS354C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を含む（一方のCH3ドメインの付加的なY349C変異および他方のCH3ドメインの付加的なE356C変異またはS354C変異は、鎖間ジスルフィド架橋を形成する）（番号付けは常にKabatのEUインデックスに従う）。しかし、代替的にまたは付加的に、EP 1 870 459 A1に記載されたとおりの他のノブ・イントゥ・ホールテクノロジーが使用されてもよい。一価抗原結合タンパク質についての好ましい例は、「ノブ鎖」のCH3ドメインのR409D変異；K370E変異、および「ホール鎖」のCH3ドメインのD399K変異；E357K変異である（番号付けは常にKabatのEUインデックスに従う）。

別の好ましい態様において、一価抗原結合タンパク質は、「ノブ鎖」のCH3ドメインにT366W変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメインにT366S変異、L368A変異、Y407V変異を含み、さらに、「ノブ鎖」のCH3ドメインにR409D変異；K370E変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメインにD399K変異；E357K変異を含む。

別の好ましい態様において、一価抗原結合タンパク質は、2個のCH3ドメインの一方にY349C変異、T366W変異を含み、2個のCH3ドメインの他方にS354C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を含むか、または一価抗原結合タンパク質は、2個のCH3ドメインの一方にY349C変異、T366W変異を含み、2個のCH3ドメインの他方にS354C変異、T366S変異、L368A変異、Y407V変異を含み、さらに、「ノブ鎖」のCH3ドメインにR409D変異；K370E変異を含み、「ホール鎖」のCH3ドメインにD399K変異；E357K変異を含む。

一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、
（a）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。

一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、
（a）SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。

一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、
（a）SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。

一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、
（a）SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。

一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、
（a）SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。

一つの態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、
（a）SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
（b）SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖
を含むことを特徴とする。

本明細書において使用される場合の「抗体」という用語は、2本の抗体重鎖および2本の抗体軽鎖からなる全長抗体を意味する（図1参照）。全長抗体の重鎖は、N末端からC末端への方向に、VH-CH1-HR-CH2-CH3と略記される、抗体重鎖可変ドメイン（VH）、抗体重鎖定常ドメイン1（CH1）、抗体ヒンジ領域（HR）、抗体重鎖定常ドメイン2（CH2）、および抗体重鎖定常ドメイン3（CH3）からなり；任意で、サブクラスIgEの抗体の場合には、さらに抗体重鎖定常ドメイン4（CH4）からなるポリペプチドである。好ましくは、全長抗体の重鎖は、N末端からC末端への方向に、VH、CH1、HR、CH2、およびCH3からなるポリペプチドである。全長抗体の軽鎖は、N末端からC末端への方向に、VL-CLと略記される、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）および抗体軽鎖定常ドメイン（CL）からなるポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（CL）は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）であり得る。抗体鎖は、CLドメインとCH1ドメインとの間（即ち、軽鎖と重鎖との間）および全長抗体重鎖のヒンジ領域の間でポリペプチド間ジスルフィド結合を介して共に連結されている。典型的な全長抗体の例は、IgG（例えば、IgG1およびIgG2）、IgM、IgA、IgD、ならびにIgE等の天然抗体である。本発明に係る抗体は、単一種、例えば、ヒトに由来してもよいし、またはキメラ化もしくはヒト化された抗体であってもよい。本発明に係る全長抗体は、いずれも、同一の（第1の）抗原と特異的に結合する、VHおよびVLの対により各々形成された2個の抗原結合部位を含む。これらの全長抗体から、（a）VHドメインを該抗体のVLドメインに置換することにより該抗体の第1の重鎖を修飾し；（b）CH1ドメインを該抗体のCLドメインに置換することにより該抗体の第2の重鎖を修飾することにより、本発明の一価抗原結合タンパク質が導出される。従って、得られた一価抗原結合タンパク質は、2本の修飾された重鎖を含み、軽鎖を含まない。

全長抗体の重鎖または軽鎖のC末端とは、重鎖または軽鎖のC末端の最後のアミノ酸を意味する。

本明細書において使用される場合の「結合部位」または「抗原結合部位」とは、リガンド（例えば、抗原またはその抗原断片）が実際に結合する、抗体分子またはその断片（例えば、Fab断片）に由来する、本発明に係る抗原結合タンパク質の領域を意味する。本発明に係る抗原結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン（VH）および抗体軽鎖可変ドメイン（VL）を含む。

所望の抗原と特異的に結合する抗原結合部位（即ち、VH/VLの対）は、（a）その抗原に対する既知の抗体に由来してもよいし、または（b）とりわけ、抗原タンパク質もしくは抗原核酸もしくはそれらの断片のいずれかを使用したデノボ免疫感作法により、もしくはファージディスプレイにより入手された新たな抗体もしくは抗体断片に由来してもよい。

本発明の一価抗原結合タンパク質の抗原結合部位は、様々な程度に、抗原に対する結合部位の親和性に寄与する、6個の相補性決定領域（CDR）を含有している。3個の重鎖可変ドメインCDR（CDRH1、CDRH2、およびCDRH3）ならびに3個の軽鎖可変ドメインCDR（CDRL1、CDRL2、およびCDRL3）が存在する。CDRおよびフレームワーク領域（FR）の範囲は、これらの領域が配列間の可変性に従って定義されている、アミノ酸配列のコンパイルされたデータベースとの比較により決定される。

抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的な認識をさす。例えば、天然抗体は、単一特異性である。二特異性抗体とは、2種の異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、「単一特異性」であり、それぞれの抗原のエピトープと特異的に結合する。

本願において使用される場合の「価」という用語は、抗体分子における特定の数の結合部位の存在を意味する。例えば、天然抗体は、2個の結合部位を有し、二価である。「一価抗原結合タンパク質」という用語は、抗原結合部位を1個のみ含有しているポリペプチドを意味する。

本発明の全長抗体は、1種または複数種の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、IgGクラス、IgMクラス、IgAクラス、IgDクラス、およびIgEクラス（またはアイソタイプ）が含まれ、IgGおよびIgAの場合には、それらのサブクラス（またはサブタイプ）が含まれる。好ましい態様において、本発明の全長抗体、従って、本発明の一価抗原結合タンパク質は、IgGクラス抗体の定常ドメイン構造を有する。

本明細書において使用される場合の「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一のアミノ酸組成の抗体分子の調製物をさす。

「キメラ抗体」という用語は、一般的には、組換えDNA技術により調製される、ある起源または種に由来する可変領域、即ち、結合領域と、異なる起源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体をさす。マウス可変領域とヒト定常領域とを含むキメラ抗体が好ましい。本発明に包含される「キメラ抗体」の他の好ましい型は、本発明に係る特性、特に、C1q結合および／またはFc受容体（FcR）結合に関する特性を生成するため、定常領域が最初の抗体のものから修飾されたまたは変化させられたものである。そのようなキメラ抗体は、「クラススイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントとを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。キメラ抗体を作製する方法には、当技術分野において周知の、従来の組換えDNA技術および遺伝子トランスフェクション技術が含まれる。例えば、Morrison,S.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；米国特許第5,202,238号および米国特許第5,204,244号を参照のこと。

「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（CDR）が、親免疫グロブリンのものと比較して異なる特異性の免疫グロブリンのCDRを含むよう修飾されている抗体をさす。好ましい態様において、「ヒト化抗体」を調製するため、マウスCDRがヒト抗体のフレームワーク領域に移植される。例えば、Reichmann,L.,et al.,Nature 332(1988)323-327；およびNeuberger,M.S.,et al.,Nature 314(1985)268-270を参照のこと。特に好ましいCDRは、キメラ抗体について上述された抗原を認識する配列を表すものに相当する。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の型は、本発明に係る特性、特に、C1q結合および／またはFc受容体（FcR）結合に関する特性を生成するため、定常領域が最初の抗体のものからさらに修飾されたまたは変化させられたものである。

本明細書において使用される場合の「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものとする。ヒト抗体は当技術分野において周知である（van Dijik,M.A.,and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374）。免疫感作により、内在性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の完全レパートリーまたは選択されたものを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）において、ヒト抗体を作製することも可能である。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような生殖系列変異マウスへの移入は、抗原チャレンジによりヒト抗体の産生をもたらすと考えられる（例えば、Jakobovits,A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits,A.,et al.,Nature 362(1993)255-258；Bruggemann,M.,et al.,Year Immunol.7(1993)33-40を参照のこと）。ファージディスプレイライブラリーにおいてヒト抗体を作製することも可能である（Hoogenboom,H.R.,and Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.,et al.,J.Mol.Biol.222(1991)581-597）。ColeらおよびBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Cole,et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；およびBoerner,P.,et al.,J.Immunol.147(1991)86-95）。本発明に係るキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及された場合の「ヒト抗体」という用語は、本明細書において使用される、例えば、「クラススイッチ」、即ち、Fc部分の変化または変異（例えば、IgG1からIgG4への変異、および／またはIgG1/IgG4変異）により、本発明に係る特性、特に、C1q結合および／またはFcR結合に関する特性を生成するため、定常領域において修飾されたそのような抗体も含む。

本明細書において使用される場合の「組換えヒト抗体」という用語は、NS0細胞もしくはCHO細胞等の宿主細胞、もしくはヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックの動物（例えば、マウス）から単離された抗体、または宿主細胞へトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体等の、組換え手段により調製された、発現された、作出された、または単離された全てのヒト抗体を含むものとする。そのような組換えヒト抗体は、再編成された形態で可変領域および定常領域を有する。本発明に係る組換えヒト抗体は、インビボ体細胞突然変異に供されたものである。従って、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VH配列およびVL配列に由来し関係しているが、インビボのヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。

本明細書において使用される場合の「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（VL）、重鎖の可変ドメイン（VH））とは、抗体の抗原との結合に直接関与している軽鎖および重鎖の対の各々を意味する。ヒトの軽鎖および重鎖の可変ドメインは、同一の一般構造を有し、各ドメインは、3個の「超可変領域」（または相補性決定領域、CDR）により接続された、配列が広く保存されている4個のフレームワーク（FR）領域を含む。フレームワーク領域はβシートコンフォメーションをとり、CDRはβシート構造を接続するループを形成し得る。各鎖内のCDRはフレームワーク領域によりその三次元構造に維持され、他の鎖からのCDRと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖のCDR3領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たしており、従って、本発明のさらなる目的を提供する。

「超可変領域」または「抗体の抗原結合部分」という用語は、本明細書において使用される時、抗原結合を担う、抗体のアミノ酸残基をさす。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」領域または「FR」領域とは、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖および重鎖は、N末端からC末端へ、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。各鎖上のCDRは、そのようなフレームワークアミノ酸により分離されている。特に、重鎖のCDR3は、抗原結合に最も大きく寄与する領域である。CDR領域およびFR領域は、Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)の標準的な定義に従い決定される。

本明細書において使用される場合、「結合」または「特異的結合」という用語は、精製された野生型抗原を用いたインビトロアッセイ法、好ましくは、プラズモン共鳴アッセイ法（BIAcore,GE-Healthcare Uppsala,Sweden）における一価抗原結合タンパク質の抗原のエピトープとの結合をさす。結合の親和性は、ka（抗体／抗原複合体への抗体の会合についての速度定数）、k_D（解離定数）、およびK_D（k_D/ka）という用語により定義される。結合または特異的結合とは、10^-8mol/lまたはそれ未満、好ましくは、10^-9M〜10^-13mol/lの結合親和性（K_D）を意味する。従って、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、10^-8mol/lまたはそれ未満、好ましくは、10^-9M〜10^-13mol/lの結合親和性（K_D）で、それが特異的である各抗原と特異的に結合する。

一価抗原結合タンパク質のFcγRIIIとの結合は、BIAcoreアッセイ法（GE-Healthcare Uppsala,Sweden）により調査され得る。結合の親和性は、ka（抗体／抗原複合体への抗体の会合についての速度定数）、k_D（解離定数）、およびK_D（k_D/ka）という用語により定義される。

「エピトープ」という用語は、一価抗原結合タンパク質と特異的に結合することができるポリペプチド決定基を含む。特定の態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニル等の、分子の化学的に活性な表面基を含み、特定の態様において、特異的な三次元構造特徴およびまたは特異的な電荷特徴を有し得る。エピトープは、一価抗原結合タンパク質が結合する抗体の領域である。

特定の態様において、抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物の中の標的抗原を優先的に認識する時、その抗原と特異的に結合すると言われる。

さらなる態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、全長抗体が、ヒトIgG1サブクラス、または変異L234AおよびL235Aを有するヒトIgG1サブクラスのものであることを特徴とする。

さらなる態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、全長抗体が、ヒトIgG2サブクラスのものであることを特徴とする。

さらなる態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、全長抗体が、ヒトIgG3サブクラスのものであることを特徴とする。

さらなる態様において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、全長抗体が、ヒトIgG4サブクラス、または付加的な変異S228PおよびL235Eを有するヒトIgG4サブクラス（IgG4 SPLEとも呼ばれる）のものであることを特徴とする。

本願において使用される場合の「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの全部を意味する。定常領域は、抗原の結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依って、抗体は、クラス（アイソタイプとも呼ばれる）：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMに分類され、これらのいくつかは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、IgA1およびIgA2等のサブクラス（アイソタイプとも呼ばれる）へとさらに分類され得る。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。5種の抗体クラス全てに見出され得る軽鎖定常領域（CL）は、κ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる。

本願において使用される場合の「ヒト起源に由来する定常領域」という用語は、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4のヒト抗体の重鎖定常領域、および／または軽鎖定常領域カッパもしくはラムダを意味する。そのような定常領域は、当技術分野において周知であり、例えば、Kabat,E.A.により記載されている（例えば、Johnson,G.and Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat,E.A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788を参照のこと）。

IgG4サブクラスの抗体は、低下したFc受容体（FcγRIIIa）結合を示すが、他のIgGサブクラスの抗体は強力な結合を示す。しかしながら、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc炭水化物の喪失）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、およびHis435は、改変された場合、やはり低下したFc受容体結合を提供する残基である（Shields,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.,et al.,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.,et al.,Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434）。

一つの態様において、本発明に係る抗体は、IgG1抗体と比較して低下したFcR結合を有し、全長親抗体は、FcR結合に関して、S228、L234、L235、および／もしくはD265に変異を有するIgG4サブクラスまたはIgG1サブクラスもしくはIgG2サブクラスのものであり、かつ／またはPVA236変異を含有している。一つの態様において、全長親抗体における変異は、S228P、L234A、L235A、L235E、および／またはPVA236である。別の態様において、全長親抗体の変異は、IgG4においては、S228PおよびL235E、IgG1においては、L234AおよびL235Aである。

抗体の定常領域は、ADCC（抗体依存性細胞傷害）およびCDC(補体依存性細胞傷害）に直接関与している。補体活性化（CDC）は、補体因子C1qが大部分のIgG抗体サブクラスの定常領域と結合することにより開始する。C1qの抗体との結合は、いわゆる結合部位において、定義されたタンパク質間相互作用により引き起こされる。そのような定常領域結合部位は、当技術分野において公知であり、例えば、Lukas,T.J.,et al.,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Bunkhouse,R.and Cobra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.,et al.,Nature 288(1980)338-344；Thomason,J.E.,et al.,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idiocies,E.E.,et al.,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hearer,M.,et al.,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.,et al.,Immunology 86(1995)319-324；およびEP 0 307 434に記載されている。そのような定常領域結合部位は、例えば、アミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、およびP329（番号付けはKabatのEUインデックスに従う）を特徴とする。

「抗体依存性細胞傷害（ADCC）」という用語は、エフェクター細胞の存在下での本発明に係る抗体によるヒト標的細胞の溶解をさす。ADCCは、好ましくは、新たに単離されたPBMC、または単球もしくはナチュラルキラー（NK）細胞等のバフィーコートから精製されたエフェクター細胞、または永久増殖NK細胞株等のエフェクター細胞の存在下で、本発明に係る抗体により、抗原発現細胞の調製物を処理することにより、測定される。

驚くべきことに、本発明に係る抗原結合タンパク質は、親全長抗体と比較して改善されたADCC特性を示すことが見出された。これらの改善されたADCC効果は、糖鎖工学などのFc部分のさらなる修飾なしに達成された。「補体依存性細胞傷害（CDC）」という用語は、補体因子C1qが大部分のIgG抗体サブクラスのFc領域と結合することにより開始する過程を意味する。C1qの抗体との結合は、いわゆる結合部位において、定義されたタンパク質間相互作用により引き起こされる。そのようなFc部分結合部位は当技術分野において公知である（上記参照）。そのようなFc部分結合部位は、例えば、アミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、およびP329（番号付けはKabatのEUインデックスに従う）を特徴とする。サブクラスIgG1、IgG2、およびIgG3の抗体は、一般的に、C1qおよびC3の結合を含む補体活性化を示すが、IgG4は、補体系を活性化せず、C1qおよび／またはC3と結合しない。

モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、Umana,P.,et al.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180および米国特許第6,602,684号に記載されたとおりにそれらのオリゴ糖成分を遺伝子工学で作製することにより増強され得る。最も一般的に使用されている治療用抗体であるIgG1型抗体は、各CH2ドメインのAsn297に保存されたN結合型グリコシル化部位を有する糖タンパク質である。Asn297に付着した2種の複合二分岐オリゴ糖は、CH2ドメイン間に埋もれ、ポリペプチド骨格との広範な接点を形成しており、その存在は、抗体が抗体依存性細胞傷害（ADCC）等のエフェクター効果を媒介するために必須である（Lifely,M.R.,et al.,Glycobiology 5(1995)813-822；Jefferis,R.,et al.,Immunol.Rev.163(1998)59-76；Wright,A.,and Morrison,S.,L.,Trends Biotechnol.15(1997)26-32）。Umana,P.,et al.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180およびWO99/54342は、二分岐型オリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（「GnTIII」）のチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞における過剰発現が、抗体のインビトロADCC活性を有意に増加させることを示した。Asn297炭水化物の組成の改変またはその排除も、FcγRおよびC1qとの結合に影響を与える（Umana,P.,et al.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180；Davies,J.,et al.,Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294；Mimura,Y.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547；Radaev,S.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483；Shields,R.,L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Shields,R.,L.,et al.,J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740；Simmons,L.,C.,et al.,J.Immunol.Methods 263(2002)133-147）。

本発明の一つの局面において、本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、（a）および（b）の修飾された重鎖がIgG1アイソタイプであり、かつ、該抗原結合タンパク質が、脱フコシル化され、Asn297において総オリゴ糖（糖）量の80％またはそれ未満であるフコース量を有することを特徴とする。

一つの態様において、抗原結合タンパク質は、脱フコシル化され、Asn297において総オリゴ糖（糖）量の65％〜5％であるフコース量を有する。

「脱フコシル化された抗原結合タンパク質」という用語は、フコース残基の低下したレベルを有する、Fc領域内のAsn297における改変されたグリコシル化パターンを有する、IgG1アイソタイプまたはIgG3アイソタイプ（好ましくは、IgG1アイソタイプ）の抗原結合タンパク質をさす。ヒトIgG1またはヒトIgG3のグリコシル化は、2個までのGal残基で終結するコア脱フコシル化二分岐複合オリゴ糖グリコシル化として、Asn297において起こる。これらの構造は、終末Gal残基の量に依って、G0グリカン残基、G1（α1,6もしくはα1,3）グリカン残基、またはG2グリカン残基と名付けられている（Raju,T.S.,BioProcess Int.1(2003)44-53）。抗体Fc部分のCHO型グリコシル化は、例えば、Routier,F.H.,Glycoconjugate J.14(1997)201-207に記載されている。非糖鎖修飾CHO宿主細胞において組換え発現された抗体は、一般的に、少なくとも85％の量、Asn297においてフコシル化されている。本明細書において使用される場合の脱フコシル化抗体という用語は、グリコシル化パターンにフコースを有しない抗体を含むことが理解されるべきである。抗体における典型的なグリコシル化残基位置は、EU番号付け方式による297位のアスパラギン（「Asn297」）である。

従って、本発明に係る脱フコシル化抗原結合タンパク質とは、Asn297におけるフコース量が総オリゴ糖（糖）量の80％またはそれ未満(例えば、80％〜1％）である（即ち、Asn297におけるFc領域のオリゴ糖の少なくとも20％またはそれ以上が脱フコシル化されている）IgG1アイソタイプまたはIgG3アイソタイプ（好ましくは、IgG1アイソタイプ）の抗体を意味する。一つの態様において、フコース量は、Fc領域のAsn297におけるオリゴ糖の65％またはそれ未満（例えば、65％〜1％）であり、一つの態様において、65％〜5％であり、一つの態様において、40％〜20％である。本発明によると、「フコース量」とは、MALDI-TOF質量分析により測定され、平均値として算出された、Asn297に付着している全オリゴ糖（糖）（例えば、複合構造、ハイブリッド構造、および高マンノース構造）の全部に対する、Asn297におけるオリゴ糖（糖）鎖内の該オリゴ糖（フコース）量を意味する（フコース量を測定するための詳細な手法については、例えば、WO2008/077546を参照のこと）。さらに、一つの態様において、Fc領域のオリゴ糖は二分岐型である。本発明に係る脱フコシル化抗体は、Fc領域のオリゴ糖を部分的にフコシル化するために十分な量、GnTIII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1種の核酸を発現するよう遺伝子工学で作製された糖鎖修飾宿主細胞において発現され得る。一つの態様において、GnTIII活性を有するポリペプチドは融合ポリペプチドである。あるいは、宿主細胞のα1,6-フコシルトランスフェラーゼ活性を、糖鎖修飾宿主細胞を生成するため、米国特許第6,946,292号に従い、減少させるかまたは排除することができる。抗体フコシル化の量は、例えば、発酵条件（例えば、発酵時間）、または異なるフコシル化量を有する少なくとも2種の抗体の組み合わせのいずれかにより予め測定され得る。そのような脱フコシル化抗原結合タンパク質およびそれぞれの糖鎖工学的方法は、WO2005/044859、WO2004/065540、WO2007/031875、Umana,P.,et al.,Nature Biotechnol.17(1999)176-180、WO99/154342、WO2005/018572、WO2006/116260、WO2006/114700、WO2005/011735、WO2005/027966、WO97/028267、US2006/0134709、US2005/0054048、US2005/0152894、WO2003/035835、WO2000/061739に記載されている。本発明に係るこれらの糖鎖工学的に作製された抗原結合タンパク質は、（親抗原結合タンパク質と比較して）増加したADCCを有する。脱フコシル化抗原結合タンパク質を与えるその他の糖鎖工学的方法は、例えば、Niwa,R.,et al.,J.Immunol.Methods 306(2005)151-160；Shinkawa,T.,et al.,J.Biol.Chem,278(2003)3466-3473；WO03/055993、またはUS2005/0249722に記載されている。

従って、本発明の一つの局面は、癌の処置のための、Asn297におけるフコース量が総オリゴ糖（糖）量の60％またはそれ未満(例えば、60％〜1％）である、IgG1アイソタイプまたはIgG3アイソタイプ（好ましくは、IgG1アイソタイプ）の本発明に係る脱フコシル化抗原結合タンパク質である。本発明の別の局面は、癌の処置用の医薬の製造のための、Asn297におけるフコース量が総オリゴ糖（糖）量の60％またはそれ未満である、CD20と特異的に結合するIgG1アイソタイプまたはIgG3アイソタイプ（好ましくは、IgG1アイソタイプ）の脱フコシル化抗CD20抗体の使用である。一つの態様において、Asn297におけるフコース量は、総オリゴ糖（糖）量の60％〜20％である。一つの態様において、Asn297におけるフコース量は、総オリゴ糖（糖）量の60％〜40％である。一つの態様において、Asn297におけるフコース量は、総オリゴ糖（糖）量の0％である。

「EU番号付け方式」または「（Kabatによる）EUインデックス」は、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基または位置に言及する時に一般に使用されている（例えば、EUインデックスは、参照により本明細書に明示的に組み入れられるKabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)に報告されている）。

「糖鎖が、CHO細胞において組換え発現された抗体のAsn297に付着したN結合型グリカンの特徴を示す」という用語は、本発明に係る全長親抗体のAsn297における糖鎖が、未修飾CHO細胞において発現された同抗体のもの、例えば、WO2006/103100に報告されたものと、フコース残基を除き、同一の構造および糖残基配列を有することを意味する。

本願において使用される場合の「NGNA」という用語は、糖残基N-グリコリルノイラミン酸を意味する。

本発明に係る抗体は、組換え手段により作製される。従って、本発明の一つの局面は、本発明に係る抗体をコードする核酸であり、さらなる局面は、本発明に係る抗体をコードする核酸を含む細胞である。組換え作製の方法は、当技術分野において広く公知であり、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現と、その後の抗体の単離を含み、一般的には、薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞における上記抗体の発現のため、それぞれの修飾された軽鎖および重鎖をコードする核酸が、標準的な方法により発現ベクターへ挿入される。発現は、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母、または大腸菌（E.coli）細胞等の適切な原核宿主細胞または真核宿主細胞において実施され、抗体が細胞（溶解後の上清または細胞）から回収される。抗体の組換え作製の一般的な方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.,et al.,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880の概説に記載されている。

本発明に係る一価抗原結合タンパク質は、例えば、プロテインAセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィ等の従来の免疫グロブリン精製手法により培養培地から適切に分離される。

モノクローナル抗体をコードするDNAおよびRNAは、従来の手法を使用して容易に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAおよびRNAの起源となり得る。単離後、DNAを発現ベクターへ挿入し、次いで、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を入手するため、他の免疫グロブリンタンパク質を産生しないHEK293細胞、CHO細胞、または骨髄腫細胞等の宿主細胞へ、それをトランスフェクトすることができる。

一価抗原結合タンパク質のアミノ酸配列バリアント（または変異体）は、適切なヌクレオチド変化を抗体DNAへ導入することにより、またはヌクレオチド合成により、調製される。しかしながら、そのような修飾は、例えば、前記のとおりの極めて限定された範囲でのみ実施され得る。例えば、修飾は、IgGアイソタイプおよび抗原結合等の前記の抗体特徴を改変しないが、組換え作製の収率、タンパク質安定性を改善するか、または精製を容易にすることができる。

本願において使用される場合の「宿主細胞」という用語は、本発明に係る抗体を生成するため遺伝子工学で作製され得る任意の種類の細胞システムを意味する。一つの態様において、HEK293細胞およびCHO細胞が宿主細胞として使用される。本明細書において使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのそのような表記には子孫が含まれる。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語には、第1の主細胞、および継代数に関わらないそれらに由来する培養物が含まれる。全ての子孫が、必然または偶然の変異のため、DNA含量に関して正確に同一ではないかもしれないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされるのと同一の機能または生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。

NS0細胞における発現は、例えば、Barnes,L.M.,et al.,Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes,L.M.,et al.,Biotech.Bioeng.73(2001)261-270によって記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher,Y.,et al.,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9によって記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi,R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；およびNorderhaug.L.,et al.,J.Immunol.Methods 204(1997)77-87によって記載されている。好ましい一過性発現システム（HEK293）は、Schlaeger,E.-J.,and Christensen,K.,in Cytotechnology 30(1999)71-83およびSchlaeger,E.-J.,in J.Immunol.Methods 194(1996)191-199によって記載されている。

原核生物のために適当な制御配列には、例えば、プロモーター、任意で、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルを利用することが公知である。

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている時、「機能的に連結されている」。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのDNAと機能的に連結されており；プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列と機能的に連結されており；またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするよう位置付けられている場合、コーディング配列と機能的に連結されている。一般に、「機能的に連結されている」とは、連結されているDNA配列が連続していること、分泌リーダーの場合には、連続しておりかつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、便利な制限部位におけるライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の実務に従い使用される。

一価抗原結合タンパク質の精製は、アルカリ／SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知のその他のもの（Ausubel,F.,et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)を参照のこと）を含む、標準的な技術によって、細胞成分またはその他の混入物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質（例えば、副産物）を排除するため実施される。微生物タンパク質を用いたアフィニティクロマトグラフィ（例えば、プロテインAまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィ）、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、および混合型交換）、（例えば、βメルカプトエタノールおよびその他のSHリガンドを用いた）チオフィリック吸着、（例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリック樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を用いた）疎水性相互作用クロマトグラフィまたは芳香族吸着クロマトグラフィ、（例えば、Ni(II)アフィニティ材料およびCu(II) アフィニティ材料を用いた）金属キレートアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ならびに（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等の）電気泳動法等の、種々の方法が、よく確立され、タンパク質精製のために広範囲に使用されている（Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102）。精製の例は、実施例1および対応する図3〜8に記載される。

本発明の一つの局面は、本発明に係る抗体を含む薬学的組成物である。本発明の別の局面は、薬学的組成物の製造のための本発明に係る抗体の使用である。本発明のさらなる局面は、本発明に係る抗体を含む薬学的組成物の製造の方法である。別の局面において、本発明は、薬学的担体と共に製剤化された本発明に係る抗体を含有している組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。

本発明の一つの態様は、癌の処置のための本発明に係る一価抗原結合タンパク質である。

本発明の別の局面は、癌の処置のための薬学的組成物である。

本発明の一つの態様は、癌の処置において使用するための本発明に係る一価抗原結合タンパク質である。

本発明の別の局面は、癌の処置用の医薬の製造のための本発明に係る抗体の使用である。

本発明の別の局面は、そのような処置を必要とする患者へ、本発明に係る抗体を投与することによる、癌に罹患した患者の処置の方法である。

本明細書において使用される場合、「薬学的担体」には、生理学的に適合性である、任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与のために適当である。

本発明の組成物は、当技術分野において公知の多様な方法により投与され得る。当業者に認識されるとおり、投与の経路および／またはモードは、所望の結果によって変動すると考えられる。特定の投与経路により本発明の化合物を投与するためには、不活化を防止する材料により化合物をコーティングするか、または不活化を防止する材料と共に化合物を同時投与することが必要であり得る。例えば、化合物は、適切な担体、例えば、リポソーム、または希釈剤で、対象へ投与され得る。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。薬学的担体には、無菌の水性の溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において公知である。

本明細書において使用される場合の「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、一般的には、注射による、経口投与および局所投与以外の投与のモードを意味し、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄膜内、被嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内への注射および注入を含む。

本明細書において使用される場合の癌という用語は、上記癌のいずれかの難治性型を含む、リンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺（NSCL）癌、気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫、眼球内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌（stomach cancer、gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（CNS）新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、およびユーイング肉腫、または上記癌のうちの1種もしくは複数腫の組み合わせ等の増殖性疾患をさす。

これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤等の佐剤も含有していてよい。微生物の存在の防止は、前記の滅菌手法、ならびに様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の内含の両方によって確実にされ得る。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射可能薬学的形態の長期吸収は、ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤の内含によってもたらされ得る。

選択された投与経路に関わらず、適当な水和型で使用され得る本発明の化合物、および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容される剤形へと製剤化される。

本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性でなく、特定の患者、組成物、および投与モードについて、所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るため、変動し得る。選択される投薬レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、利用される特定の化合物の排出の速度、処置の継続期間、用いられる特定の化合物と組み合わせられて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康状態、および過去の病歴等の医学分野において周知の要因を含む、多様な薬物動態学的要因に依る。

組成物は、無菌であり、かつ注射器によって送達可能である程度に液体でなければならない。水に加え、担体は、好ましくは、等張緩衝生理食塩水溶液である。

適度の流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトール等の多価アルコール、および塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。

本明細書において使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は、互換的に使用され、全てのそのような表記には子孫が含まれる。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語には、第1の主細胞、および継代数に関わらないそれらに由来する培養物が含まれる。全ての子孫が、必然または偶然の変異のため、DNA含量に関して正確に同一ではないかもしれないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされるのと同一の機能または生物学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。別個の意味が意図される場合、それは前後関係から明らかになると考えられる。

本明細書において使用される場合の「形質転換」という用語は、宿主細胞へのベクター／核酸の移入の過程をさす。頑強な細胞壁障壁を有しない細胞が宿主細胞として使用される場合、トランスフェクションは、例えば、Graham and Van der Eh,Virology 52(1978)546により記載されたとおりのリン酸カルシウム沈殿法により実施される。しかしながら、核注射またはプロトプラスト融合等の、DNAを細胞へ導入するその他の方法が使用されてもよい。原核細胞または実質的な細胞壁構成を含有している細胞が使用される場合には、例えば、1種のトランスフェクション法は、Cohen,F.N,et al.,PNAS.69(1972)7110により記載されたとおりの塩化カルシウムを使用したカルシウム処理である。

本明細書において使用される場合、「発現」とは、核酸がmRNAへ転写される過程、および／または転写されたmRNA（転写物とも呼ばれる）が、その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へ翻訳される過程をさす。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に、遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、真核細胞における発現はmRNAのスプライシングを含み得る。

「ベクター」とは、挿入された核酸分子を宿主細胞へ移入し、かつ／または宿主細胞間で移動させる、特に、自己複製性である核酸分子である。その用語には、DNAまたはRNAの細胞への挿入（例えば、染色体組み込み）のために主に機能するベクター、DNAまたはRNAの複製のために主に機能する複製ベクター、ならびにDNAまたはRNAの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターが含まれる。記載された機能のうちの複数を提供するベクターも含まれる。

「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞へ導入された場合、転写されポリペプチドへ翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現システム」とは、一般的に、所望の発現産物を与えるために機能し得る、発現ベクターを含む適当な宿主細胞をさす。

以下の実施例、配列表、および図面は、本発明の理解を補助するために提供されるものであり、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の本旨を逸脱することなく、示された手法を修飾することが可能であることが理解される。

配列表の説明
SEQ ID NO:1 c-Met 5D5 MoAb（「wt」）−修飾された重鎖（a）VL-CH1-CH2-CH3
SEQ ID NO:2 c-Met 5D5 MoAb（「wt」）−修飾された重鎖（b）VH-CL-CH2-CH3
SEQ ID NO:3 IGF1R AK18 MoAb（「wt」）−修飾された重鎖（a）VL-CH1-CH2-CH3
SEQ ID NO:4 IGF1R AK18 MoAb（「wt」）−修飾された重鎖（b）VH-CL-CH2-CH3
SEQ ID NO:5 Her3 205 MoAb（「wt」）−修飾された重鎖（a）VL-CH1-CH2-CH3
SEQ ID NO:6 Her3 205 MoAb（「wt」）−修飾された重鎖（b）VH-CL-CH2-CH3
SEQ ID NO:7 c-Met 5D5 MoAb KiH 修飾された重鎖（a）VL-CH1-CH2-CH3ノブT366W、S354C
SEQ ID NO:8 c-Met 5D5 MoAb KiH 修飾された重鎖（b）VH-CL-CH2-CH3ホールL368A、Y407V、T366S、Y349C
SEQ ID NO:9 IGF1R AK18 MoAb KiH 修飾された重鎖（a）VL-CH1-CH2-CH3ノブT366W、S354C
SEQ ID NO:10 IGF1R AK18 MoAb KiH 修飾された重鎖（b）VH-CL-CH2-CH3ホールL368A、Y407V、T366S、Y349C
SEQ ID NO:11 Her3 205 MoAb KiH 修飾された重鎖（a）VL-CH1-CH2-CH3ノブT366W、S354C
SEQ ID NO:12 Her3 205 MoAb KiH 修飾された重鎖（b）VH-CL-CH2-CH3ホールL368A、Y407V、T366S、Y349C

実験方法
A. 材料および方法：
組換えDNA技術
Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)に記載されたとおりの標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。製造業者の指示に従い分子生物学用試薬を使用した。

DNAおよびタンパク質の配列分析ならびに配列データ管理
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No91-3242に与えられている。抗体鎖のアミノ酸は、EU番号付けに従って番号付けされる（Edelman,G.M.,et al.,PNAS 63(1969)78-85；Kabat,E.A.,et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No91-3242）。GCG（Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin）ソフトウェアパッケージバージョン10.2およびInfomax's Vector NTI Advance suiteバージョン8.0を、配列の作出、マッピング、分析、アノテーション、およびイラストレーションのために使用した。

DNA配列決定
SequiServe（Vaterstetten,Germany）およびGeneart AG（Regensburg,Germany）において実施された二本鎖配列決定によりDNA配列を決定した。

遺伝子合成
Geneart AG（Regensburg,Germany）が、合成オリゴヌクレオチドから所望の遺伝子セグメントを調製し、自動遺伝子合成によりPCR産物を調製した。単一制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接する遺伝子セグメントを、pGA18（ampR）プラスミドへクローニングした。形質転換された細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法により濃度を測定した。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定により確認した。2本の抗体鎖（VH-CL-CH2-CH3およびVL-CH1-CH2-CH3）をコードするDNA配列を、隣接する5'HpaI制限部位および3'NaeI制限部位を用いた遺伝子合成により完全断片として調製した。「ノブ・イントゥ・ホール」、即ち、CH3ドメインにT366W変異を保持する1本の抗体重鎖、ならびにCH3ドメインにT366S変異、L368A変異、およびY407V変異を保持する第2の抗体重鎖をコードする遺伝子セグメントを、5'-BclI制限部位および3'-NaeI制限部位を用いて合成した。同様にして、「ノブ・イントゥ・ホール」、CH3ドメインにS354C変異およびT366W変異を保持する抗体重鎖、ならびにY349C変異、T366S変異、L368A変異、およびY407V変異を保持する第2の抗体重鎖をコードするDNA配列を、隣接するBclI制限部位およびNaeI制限部位を用いた遺伝子合成により調製した。全ての構築物が、真核細胞における分泌のためタンパク質をターゲティングするリーダーペプチドをコードする5'末DNA配列を含んで設計された。

発現プラスミドの構築
Roche発現ベクターを全ての抗体鎖の構築のために使用した。ベクターは、以下の因子から構成されていた：
−エプスタインバーウイルス（EBV）の複製開始点oriP、
−大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、
−大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子、
−ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−ヒト1-免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列、ならびに
−独特のHpaI制限部位、BclI制限部位、およびNaeI制限部位。

VH-CL-CH2-CH3およびVL-CH1-CH2-CH3の順序の免疫グロブリン遺伝子ならびに「ノブ・イントゥ・ホール」構築物を、遺伝子合成により調製し、記載されたとおりのpGA18（ampR）プラスミドへクローニングした。合成されたDNAセグメントを保持しているpG18（ampR）プラスミドおよびRoche発現ベクターを、制限酵素HpaIおよびNaeI、またはBclIおよびNaeI（Roche Molecular Biochemicals）のいずれかにより消化し、アガロースゲル電気泳動に供した。次いで、精製されたDNAセグメントを、単離されたRoche発現ベクターのHpaI/NaeI断片またはBclI/NaeI断片へライゲートし、最終発現ベクターを得た。最終発現ベクターを大腸菌細胞へ形質転換し、発現プラスミドDNAを単離し（Miniprep）、制限酵素分析およびDNA配列決定に供した。正確なクローンを150ml LB-Amp培地で増殖させ、再びプラスミドDNAを単離し（Maxiprep）、配列の完全性をDNA配列決定により確認した。

HEK293細胞における免疫グロブリンバリアントの一過性発現
製造業者の指示に従い、FreeStyle（商標）293 Expression System（Invitrogen,USA）を使用して、ヒト胎児腎臓293-F細胞の一過性トランスフェクションにより、組換え免疫グロブリンバリアントを発現させた。簡単に説明すると、懸濁FreeStyle（商標）293-F細胞を、37℃／8％CO₂において、FreeStyle（商標）293 Expression培地において培養した。トランスフェクションの日に、細胞を1〜2×10⁶生細胞/mlの密度で新鮮な培地に播種した。250mlの最終トランスフェクション容量のため、325μlの293fectin（商標）（Invitrogen,Germany）および250μgの各プラスミドDNAを1:1モル比で使用して、Opti-MEM（登録商標）I培地（Invitrogen,USA）において、DNA-293fectin（商標）複合体を調製した。トランスフェクションの7日後に、14000gでの30分間の遠心分離により、抗体を含有している細胞培養上清を採集し、滅菌フィルター（0.22μm）で濾過した。精製まで、-20℃で上清を保管した。

あるいは、HEK293-EBNA細胞における一過性トランスフェクションにより抗体を生成した。10％Ultra Low IgG FCS（ウシ胎仔血清、Gibco）、2mM L-グルタミン（Gibco）、250μg/ml Geneticin（Gibco）が補足されたDMEM（ダルベッコ修飾イーグル培地、Gibco）において培養された接着増殖HEK293-EBNA細胞（エプスタインバーウイルス核抗原を発現しているヒト胎児腎細胞株293；アメリカンタイプカルチャーコレクション寄託番号ATCC＃CRL-10852、ロット959 218）において、それぞれの発現プラスミドの一過性同時トランスフェクションにより、抗体を発現させた。トランスフェクションのため、FuGENE（商標）6 Transfection Reagent（Roche Molecular Biochemicals）を、FuGENE（商標）試薬（μl）とDNA（μg）との比率4:1（3:1〜6:1の範囲）で使用した。等モル比のプラスミドを使用してそれぞれのプラスミドからタンパク質を発現させた。3日目に、4mMまでのL-グルタミン、グルコース［Sigma］、およびNAA［Gibco］を細胞に与えた。トランスフェクション後5〜11日目に、遠心分離により、二特異性抗体を含有している細胞培養上清を採集し、-200Cで保管した。例えば、HEK293細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する遺伝子情報は、Meissner,P.et al.,Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203に与えられている。

抗体の精製
Protein A-Sepharose（商標）（GE Healthcare,Sweden）を使用したアフィニティクロマトグラフィおよびSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィにより、細胞培養上清から抗体を精製した。簡単に説明すると、滅菌濾過された細胞培養上清を、PBS緩衝液（10mM Na₂HPO₄、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl、および2.7mM KCl、pH7.4）により平衡化されたHiTrap ProteinA HP（5ml）カラムへアプライした。未結合タンパク質を平衡化緩衝液により洗い流した。0.1Mクエン酸緩衝液、pH2.8により抗体および抗体バリアントを溶出させ、タンパク質含有画分を0.1ml 1M Tris、pH8.5により中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、Amicon Ultra遠心フィルターデバイス（MWCO：30K、Millipore）により3mlの容量にまで濃縮し、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0により平衡化されたSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60または26/60ゲル濾過カラム（GE Healthcare,Sweden）へ負荷した。5％未満の高分子量凝集物を含む、精製された抗体を含有している画分をプールし、-80℃で1.0mg/mlアリコートとして保管した。

精製されたタンパク質の分析
アミノ酸配列に基づき算出されたモル吸光係数を使用して、280nmにおける光学密度（OD）を測定することにより、精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を測定した。抗体の純度および分子量を、還元剤（5mM 1,4-ジチオスレイトール）の存在下および非存在下でのSDS-PAGEおよびクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析した。NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen,USA）を製造業者の指示に従い使用した（4〜12％トリス-グリシンゲル）。抗体試料の凝集物含量を、25℃で、200mM KH₂PO₄、250mM KCl、pH7.0ランニング緩衝液において、Superdex200分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare,Sweden）を使用した高速SECにより分析した。25μgのタンパク質を0.5ml/分の流速でカラムへインジェクションし、50分かけて均一濃度で溶出させた。安定性分析のため、1mg/mlの濃度の精製されたタンパク質を4℃および40℃で7日間インキュベートし、次いで、高速SEC（例えば、HP SEC分析（精製されたタンパク質））により評価した。Peptide-N-Glycosidase F（Roche Molecular Biochemicals）による酵素処理によるN-グリカンの除去の後、還元された二特異性抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸骨格の完全性を、NanoElectrospray Q-TOF質量分析により確証した。

質量分析およびSEC-MALLS
質量分析
全脱グリコシル化抗体質量を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって測定し確認した。簡単に説明すると、100μgの精製された抗体を、2mg/mlまでのタンパク質濃度で、100mM KH2PO4/K2HPO4、pH7において、37℃で12〜24時間、50mU N-Glycosidase F（PNGaseF、ProZyme）により脱グリコシル化し、その後、Sephadex G25カラム（GE Healthcare）でのHPLCによって脱塩した。それぞれの重鎖および軽鎖の質量を、脱グリコシル化および還元の後、ESI-MSにより測定した。簡単に説明すると、115μl中の50μgの抗体を、60μlの1M TCEPおよび50μlの8Mグアニジン塩酸塩と共にインキュベートし、その後、脱塩した。全質量ならびに還元された重鎖および軽鎖の質量を、NanoMateソースを備えたQ-Star Elite MSシステムでのESI-MSによって測定した。記録される質量範囲は、試料の分子量に依る。一般に、還元型抗体については、質量範囲は、600〜2000m/zに設定され、非還元型抗体または二特異性分子については、1000〜3600m/zに設定される。

SEC-MALLS
溶液中のタンパク質のおよその分子量を測定するため、SEC-MALLS（多角度レーザー光散乱検出器付きサイズ排除クロマトグラフィ）を使用した。光散乱理論により、MALLSは、分子の形またはその他の推測に関わらず、高分子の分子量推定を可能にする。SEC-MALLSは、濃度および散乱光に感受性の検出器により追跡される、SECクロマトグラフィを通したサイズ（水力学的半径）によるタンパク質の分離に基づいている。SEC-MALLSは、SEC分離が十分であれば、典型的には、単量体、二量体、三量体等の明白な区別を可能にする精度で分子量推定を与える。

本研究においては、以下の機器を使用した：Dionex Ultimate 3000 HPLC；カラム：Superose6 10/300（GE Healthcare）；溶出液：1×PBS；流速：0.25mL/分；検出器：OptiLab REX（Wyatt Inc.,Dernbach）、MiniDawn Treos（Wyatt Inc.,Dernbach）。Astraソフトウェア、バージョン5.3.2.13により分子量を算出した。50〜150μgのタンパク質量をカラムに負荷し、BSA（Sigma Aldrich）を参照タンパク質として使用した。

動的光散乱（DLS）経時変化
20mM His/HisCl、140mM NaCl、pH6.0中のおよそ1mg/mLの濃度の試料（30μL）を、384穴フィルタープレート（0.45μm孔サイズ）によって、384穴光学プレート（Corning）へ濾過し、20μLのパラフィン油（Sigma）で覆った。40℃の一定温度で、DynaPro DLSプレートリーダー（Wyatt）により、5日間、動的光散乱データを反復的に収集した。データをDinamics V6.10（Wyatt）により処理した。

c-Metリン酸化アッセイ法
HGF刺激の前日に、0.5％FCS（ウシ胎仔血清）を含むRPMIで、6穴プレートの各ウェルに5×10e5個のA549細胞を播種した。翌日、増殖培地を、0.2％BSA（ウシ血清アルブミン）を含有しているRPMIに1時間置換した。次いで、12.5μg/mLの二特異性抗体を培地へ添加し、細胞を15分間インキュベートし、その後、HGF（R&D,294-HGN）を25ng/mLの最終濃度でさらに10分間添加した。細胞を、1mMバナジン酸ナトリウムを含有している氷冷PBSにより1回洗浄し、その後、氷上に置き、100μLの溶解緩衝液（50mM Tris-Cl、pH7.5、150mM NaCl、1％NP40、0.5％DOC、アプロチニン、0.5mM PMSF、1mMバナジン酸ナトリウム）により細胞培養プレートにおいて溶解した。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、氷上で30分間、溶解を進行させた。タンパク質濃度をBCA法（Pierce）を使用して測定した。30〜50μgの溶解物を4〜12％Bis-Tris NuPageゲル（Invitrogen）上で分離し、ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜へ移した。膜を、5％BSAを含有しているTBS-Tにより1時間ブロッキングし、製造業者の指示に従って、Y1349に対するホスホ特異的c-Met抗体（Epitomics、2319-1）により発色させた。非リン酸化c-Metと結合する抗体（Santa Cruz、sc-161）によりイムノブロットのリプロービングを行った。

Her3（ErbB3）リン酸化アッセイ法
完全増殖培地（RPMI1640、10％FCS）で、12穴プレートの各ウェルに2×10e5個のMCF7細胞を播種した。2日以内に、細胞は90％コンフルエンシーにまで増殖した。次いで、培地を0.5％FCSを含む飢餓培地に置換した。翌日、それぞれの抗体を、示された濃度で補足し、1時間後、500ng/mLのHeregulin（R&D）を添加した。Heregulinの添加後、細胞をさらに10分間培養した後、細胞を採集し溶解した。タンパク質濃度をBCA法（Pierce）を使用して測定した。30〜50μgの溶解物を4〜12％Bis-Tris NuPageゲル（Invitrogen）上で分離し、ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜へ移した。膜を、5％BSAを含有しているTBS-Tにより1時間ブロッキングし、Tyr1289を特異的に認識するホスホ特異的Her3/ErbB3抗体（4791、Cell Signaling）により発色させた。

FACS
A549を剥離し計数した。コニカル96穴プレートの各ウェルに1.5×10e5個の細胞を播種した。細胞をスピンダウンし（1500rpm、4℃、5分）、2％FCS（ウシ胎仔血清）を含むPBSによるそれぞれの二特異性抗体の希釈系列50μLにおいて、氷上で30分間、インキュベートした。細胞を再びスピンダウンし、2％FCSを含有しているPBS 200μLにより1回洗浄した後、2％FCSを含有しているPBSで希釈されたヒトFcに対するAlexa488結合抗体（Jackson Immunoresearch,109116098）5μg/mLとの30分間の第2のインキュベーションを行った。細胞をスピンダウンし、2％FCSを含有しているPBS 200μLにより2回洗浄し、BD CellFix溶液（BD Biosciences）に再懸濁させ、氷上で少なくとも10分間インキュベートした。細胞の平均蛍光強度（mfi）をフローサイトメトリー（FACS Canto、BD）により測定した。2回の独立の染色について少なくとも2通りでmfiを測定した。フローサイトメトリースペクトルをさらにFlowJoソフトウェア（TreeStar）を使用して処理した。最大半量の結合をXLFit4.0（IDBS）およびdose response one site model 205を使用して測定した。

表面プラズモン共鳴
一価抗IGF-1R抗体の結合特性を、Biacore装置（Biacore,GE-Healthcare,Uppsala）を使用して、表面プラズモン共鳴（SPR）テクノロジーにより分析した。このシステムは、分子相互作用の研究のためによく確立されている。それは、様々なアッセイ状況において、リガンド／アナライト結合の連続的なリアルタイムのモニタリングを可能にし、従って、会合速度定数（ka）、解離速度定数（kd）、および平衡定数（KD）の決定を可能にする。SPRテクノロジーは、金によりコーティングされたバイオセンサーチップの表面付近の屈折率の測定に基づく。屈折率の変化は、固定化されたリガンドと溶液中のインジェクションされたアナライトとの相互作用により引き起こされた表面上の質量変化を示す。分子が表面上の固定化されたリガンドと結合する場合には、質量が増加し、解離の場合には、質量が減少する。捕捉のため、抗ヒトIgG抗体を、アミンカップリング化学を使用して、CM5バイオセンサーチップの表面に固定化した。フローセルを、5μl/分の流速で、0.1M N-ヒドロキシスクシンイミドと0.1M 3-(N,N-ジメチルアミノ)プロピル-N-エチルカルボジイミドとの1:1混合物により活性化した。酢酸ナトリウム、pH5.0で、10μg/mlの抗ヒトIgG抗体をインジェクションした。参照対照フローセルは、捕捉抗体の代わりに媒体緩衝液のみを用いた以外は同様に処理された。1Mエタノールアミン/HCl、pH8.5の投入により表面をブロッキングした。IGF-1R抗体をHBS-Pで希釈し、インジェクションした。全ての相互作用を25℃（標準温度）で実施した。各結合サイクルの後、非共有結合タンパク質を除去するため、3M塩化マグネシウムの再生溶液を5μl/分の流速で60秒間インジェクションした。1秒に1シグナルの速度でシグナルを検出した。試料を、増加する濃度でインジェクションした。図17は、適用されたアッセイフォーマットを図示する。一価結合を強制するため、捕捉抗体およびIGF-1R抗体の低い負荷密度を選んだ。

親和性測定のため、SPR装置（Biacore T100）で、標準的なアミンカップリングおよびブロッキングの化学により、Hisタグ付き受容体を、表面にカップリングされた抗His抗体（Penta-His,Qiagen）に捕捉することにより、ヒトFcgIIIaをCM-5センサーチップに固定化した。FcgIIIa捕捉の後、50nM IGF1R抗体を、5μL/分の流速で、25℃でインジェクションした。その後、10mMグリシンHCl、pH2.0溶液の60秒パルスによりチップを再生した。

抗体依存性細胞傷害アッセイ法（ADCC）
抗体媒介性エフェクター機能の、抗IGF-IR抗体による決定。生成された抗体の、免疫エフェクター機序を誘発する能力を決定するため、抗体依存性細胞傷害（ADCC）研究を実施した。ADCCにおける抗体の効果を研究するため、細胞インキュベーターにおいて37℃で25分間、DU145 IGF-IR発現細胞（1×106細胞/ml）を1μl/ml BATDA溶液（Perkin Elmer）により標識した。その後、細胞を、10mlのRPMI-FM/PenStrepにより4回洗浄し、200×gで10分間スピンダウンした。最後の遠心分離工程の前に、細胞数を決定し、その後、ペレットからRPMI-FM/PenStrep培地で1×10e5細胞/mlに細胞を希釈した。50μlの容量で丸底プレートに各ウェル5,000個の細胞を蒔いた。HuMAb抗体を、50μlの容量の細胞培養培地で、25〜0.1μg/mlの範囲の最終濃度で、50μlの細胞懸濁物に添加した。その後、50μlのエフェクター細胞、新たに単離されたPBMCを、25:1のE:T比で添加した。プレートを200×gで1分間遠心分離した後、37℃で2時間のインキュベーション工程を行った。インキュベーション後、細胞を200×gで10分間スピンダウンし、20μlの上清を採集し、Optiplate 96-Fプレートに移した。200μlのユーロピウム溶液（Perkin Elmer、室温）を添加し、プレートを振盪台上で15分間インキュベートした。Perkin ElmerのEu-TDAプロトコールを使用して、時間分解蛍光光度計（Victor 3,Perkin Elmer）で蛍光を定量化した。ADCCによる細胞溶解の大きさを、それぞれの標的細胞からのTDAの自然放出について補正された、界面活性剤により溶解された標的細胞からのTDA蛍光増強剤の最大放出に対する％として表す。

IGF-1R内部移行アッセイ法
本発明に係る抗体および抗原結合タンパク質のIGF-1Rとの結合は、受容体の内部移行および分解をもたらす。この過程は、IGF-1R発現HT29 CRC細胞をIGF-1Rを標的とする抗体と共にインキュベートした後、細胞溶解物中に残存するIGF-1Rタンパク質レベルをELISAにより定量化することによりモニタリングされ得る。

この目的のため、細胞の付着を可能にするため、1.5×104細胞/ウェルのHT29細胞を、37℃、5％CO2で、一夜、10％FCSを含むRPMIで、96穴MTPにおいてインキュベートした。翌朝、培地を吸引し、RPMI＋10％FCSで希釈されたIGF-1R抗体の10nM〜2pMの濃度の1:3希釈系列を100μl添加した。細胞を、37℃で18時間、抗体と共にインキュベートした。その後、培地を再び除去し、120μlのMES溶解緩衝液（25mM MES、pH6.5＋Complete）を添加した。

ELISAのため、ストレプトアビジンでコーティングされた96穴ポリスチレンプレート（Nunc）に、3％BSA/PBSTで1:200希釈されたMAK<hu IGF-1Rα>hu-1a-IgG-Bi（Ch.10）100μl（最終濃度2.4μg/ml）を負荷し、室温で1時間、絶えず撹拌しながらインキュベートした。その後、ウェルの内容物を除去し、各ウェルを200μlのPBSTで3回洗浄した。細胞溶解溶液100μlを各ウェルに添加し、プレートシェーカー上で、室温で1時間、再びインキュベートし、200μlのPBSTで3回洗浄した。上清の除去の後、3％BSA/PBSTで1:750希釈された100μl/ウェルのPAK<ヒトIGF-1Rα>Ra-C20-IgG（Santa Cruz＃sc-713）が添加され、続いて、上記と同一のインキュベーションおよび洗浄というインターバルが行われた。IGF-1Rと結合した特異抗体を検出するため、3％BSA/PBSTで1:4000希釈されたポリクローナル西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ウサギ抗体（Cell Signaling＃7074）を100μl/ウェル添加した。さらに1時間後、上記のとおり、6回、徹底的に洗浄することにより、未結合抗体を再び除去した。結合した抗体の定量化のため、100μl/ウェルの3,3'-5,5'-テトラメチルベンジジン（Roche,BM-Blue ID.-Nr.11484281）を添加し、室温で30分間インキュベートした。25μl/ウェルの1M H2SO4を添加することにより、発色反応を最終的に停止させ、450nmの波長で光吸収を測定する。抗体により処理されていない細胞を、0％下方制御についての対照として使用し、溶解緩衝液をバックグラウンド対照として使用する。

IGF-1R自己リン酸化アッセイ法（IGF-1刺激）
IGF-1R抗体によりIGF-1Rを標的とすることにより、IGF-1により誘導される自己リン酸化の阻害がもたらされる。本発明者らは、親IGF-1R IgG1抗体と比較して、ノブ・イントゥ・ホールなしの一価IGF-1R抗体の自己リン酸化の阻害を調査した。この目的のため、ヒトIGF-1Rを過剰発現しているマウス繊維芽細胞株である3T3-IGF-1R細胞を、異なる濃度の一価IGF-1R抗体および二価IGF-1R抗体の存在下で、10nM組換えヒトIGF-1により10分間処理した。細胞の溶解の後、リン酸化IGF-1Rタンパク質のレベルを、ヒトIGF-1R特異的な捕捉抗体とホスホチロシン特異的な検出抗体を組み合わせたホスホIGF-1R特異的なELISAにより決定した。

PK特性の決定：マウスにおける単回投与動態学
方法
動物：
NMRIマウス、雌、摂食、化合物投与の時点で23〜32gの体重。

実験プロトコール：
10mg/kgの単回i.v.投与のため、マウスを、各々2〜3匹を含む三つの群に割り当てた。群1からは、投薬後、0.5時間目、168時間目、および672時間目、群2からは24時間目および336時間目、群3からは48時間目および504時間目に、血液試料を採取した。

眼球後穿刺により約100μLの血液試料を得た。室温での2.5分間の遠心分離（9300×g）により、室温での1時間後の血液から、少なくとも40μlの血清試料を得た。遠心分離後、直接、血清試料を凍結させ、分析まで-20℃で凍結保管した。

分析：
1％マウス血清を使用して、酵素連結免疫吸着アッセイ法（ELISA）により、マウス血清中のヒト抗体の濃度を測定した。最初の工程で、ヒトFcγに対するビオチン化モノクローナル抗体（mAb<hFcγ_PAN>IgG-Bi）を、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートに結合させた。次の工程で、（様々な希釈率の）血清試料および参照標準を、それぞれ、固定化されたmAb<hFcγ_PAN>IgG-Biへ添加し、結合させた。次いで、ヒトFcγに対するジゴキシゲニン化モノクローナル抗体（mAb<hFcγ_PAN>IgG-Dig）を添加した。抗Dig-西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体コンジュゲートによってヒト抗体を検出した。ABTS溶液を西洋ワサビペルオキシダーゼの基質として使用した。マウスIgGと交差反応しない、使用された捕捉抗体および検出抗体の特異性は、マウス血清試料中のヒト抗体の定量的決定を可能にする。

算出：
薬物動態評価プログラムWinNonlin（商標）バージョン5.2.1を使用して、非コンパートメント分析により、薬物動態パラメータを算出した。

（表１）算出された薬物動態パラメータ

以下の薬物動態パラメータをヒト抗体の査定のために使用した。
・ボーラスIVモデルについて推定された初期濃度（C0）。
・（T_max）において見出される最大観察濃度（C_max）。
・最大観察濃度の時間（T_max）。
・濃度／時間曲線下面積AUC(0-inf)、これは時間0から無限大まで（直線内挿を含む）直線台形規則により算出された。
・見かけの終末半減期（T_1/2)、これは式：T_1/2＝ln2/λzから導き出された。
・全身クリアランス（CL）、これは用量/AUC(0-inf)として算出された。
・MRT(0-inf)×CLとして算出された、定常状態の分布容積（Vss）（MRT(0-inf)はAUMC(0-inf)/AUC(0-inf)として定義される）。

B. 実施例
実施例1：
一価抗体の生成
本発明者らは、図1Aに示される設計原理に基づき、c-Met（SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2；c-Met 5D5 MoAb（「wt」））、IGF-1R（SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4；IGF1R AK18 MoAb（「wt」））、ならびにHER3（SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6；Her3 205 MoAb（「wt」））に対する一価抗原結合タンパク質を設計した。さらに、ノブ・イントゥ・ホール（KiH）テクノロジー（Merchant,A.M.,et al.,Nat Biotechnol. 16(1998)677-681）により、ヘテロ二量体化を支持するため、CH3部分に変異が組み込まれたc-Met（SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8；c-Met 5D5 MoAb KiH）、IGF-1R（SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10；IGF1R AK18 MoAb KiH）、ならびにHER3（SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12；Her3 205 MoAb KiH）に対する同一の一価抗体を設計した。全ての一価抗体を、前記のとおりに、HEK293細胞において発現させ、その後、プロテインAアフィニティクロマトグラフィ、それに続くサイズ排除によって精製した。

図3〜5は、ノブ・イントゥ・ホールなしの3種の異なる一価抗原結合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィのクロマトグラム、ならびに非還元条件および還元条件の下での対応するSDS-PAGEを図示する。

異なるピークのサイズをSEC-MALLSにより確認し（図4C）、単離されたタンパク質の同一性を質量分析により確認した。総合すると、これらのデータは、CH1-CLクロスオーバーが、ヘテロ二量体化を強制するためにノブ・イントゥ・ホールをFc部分に含める必要なしに、純粋な一価抗体（図3のピーク3、図4のピーク2、図5のピーク3）の容易な精製を可能にすることを示している。この産物は、一価抗原結合タンパク質のピークに先行する、図1Cに図示される副産物としての抗原結合タンパク質の二価二量体型（MoAb二量体）から、サイズ排除クロマトグラフィにより分離された基線であり得る。二量体を架橋する二価二量体構築物内のシステイン架橋の大部分が閉じておらず、従って、非還元条件下でのSDS-PAGEにおいて、主産物は、予想される200kDaではなく、100kDaに観察されると考えられる（図3のピーク2、図4のピーク1、図5のピーク2）。c-Met 5D5 MoAb（「wt」）およびHer3 205 MoAb（「wt」）について観察可能な付加的なピーク（図3のピーク1、図5のピーク1）は、より高分子量の凝集物を図示する。これは、ヘテロ二量体一価抗体とホモ二量体一価抗体との混合物（図2）が従来の手段によって分離され得なかったWO/2007/048037に記載されている一価抗体とは対照的である。

図6〜5は、ノブ・イントゥ・ホールを含む3種の異なる一価抗原結合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィのクロマトグラム、ならびに非還元条件および還元条件の下での対応するSDS-PAGEを図示する。Fcヘテロ二量体化のためのこのノブ・イントゥ・ホールテクノロジーを適用することにより、図6〜8に示されるとおり、二価MoAb二量体と比較したヘテロ二量体一価抗原結合タンパク質の相対収率が増強され得る。

実施例2：
c-Metリン酸化（図9）
c-Metは、調節が解除された際に細胞形質転換をもたらす発癌性受容体チロシンキナーゼとして記載されている。c-Metを標的とする抗体は、過去に記載されている。MetMAb/OA-5D5（Genentech）は、c-Metのリガンド依存性の活性化を阻害する一つのそのような抗体である。二価抗体は、活性化性（activatory）であるため、それが、一価抗体となるよう1本のFAbアームを欠失させた1アーム構築物として遺伝子工学で作製された。OA-5D5および一価抗原結合タンパク質c-Met MoAb（c-Met 5D5 MoAb（「wt」））の類似の効果を証明するため、A549細胞を、c-Metの唯一の既知のリガンドHGFの非存在下または存在下で、それぞれの抗体と共にインキュベートした。二価MetMAb（MetMAb(biv.Ab)）とは対照的に、いずれの抗体も、HGFの非存在下では活性化能を有していなかった。さらに、予想通り、c-Met MoAb（c-Met 5D5 MoAb（「wt」））は、リガンドにより誘導される受容体リン酸化の抑制において、OA-5D5と同等の効果を有する。非特異的ヒトIgG対照抗体は、HGF依存性のc-Met受容体リン酸化に対して影響を有しない。

実施例3：
c-Met発現細胞株との細胞結合（図10）
一価抗原結合タンパク質c-Met MoAb（c-Met 5D5 MoAb（「wt」））の細胞結合を、A549細胞において証明した。細胞懸濁物を、示された抗体の3倍希釈系列（100〜0.0003μg/mL）と共にインキュベートした。結合した抗体を、ヒト免疫グロブリンの定常領域と結合する二次Alexa488結合抗体により可視化した。単一細胞の蛍光強度を、FACS Canto（BD Biosciences）フローサイトメーターで測定した。c-Met MoAbおよびOA-5D5の結合に違いは観察され得ず、このことから、c-Met MoAb（c-Met 5D5 MoAb（「wt」））が細胞表面c-Metと効率的に結合することが示された。
最大半量結合
OA-5D5： 1.45nM
c-Met MoAb 1.57nM

実施例4：
IGF-1R結合親和性（図11）
表面プラズモン共鳴（SPR）により、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））のIGF-1R細胞外ドメイン結合を、親<IGF-1R>IgG1抗体の結合と比較した。図17は、一価親和性を決定するためのSPRアッセイ法のスキームを図示する。分析（二重決定）は、IGF-1R結合親和性が一価抗体において保持されることを示した。
k(on) k(off) KD
Mab(IGF-1R) 1.74E+06 6.63E-03 3.80E-09
MoAb(IGF-1R) 1.3E+06 2.9E-03 2.16E-09
MoAb(IGF-1R) 2.4E+06 3.3E-03 1.4E-09

実施例5：
IGF-1R発現細胞株との細胞結合（図12）
一価抗原結合タンパク質IGF-1R MoAb（IGF-1R AK18 MoAb（「wt」））の細胞結合を、A549細胞において証明した。対数増殖期のA549細胞を、accutase（Sigma）により剥離し、2×10e5個の細胞を、個々の各抗体インキュベーションのために使用した。MoAbを3倍希釈系列（100〜0.0003μg/mL）で添加した。結合した抗体を、ヒト免疫グロブリンの定常領域と結合する二次Alexa488結合抗体（5μg/mL）により可視化した。死細胞を7-AAD（BD）により染色し、分析から排除した。単一細胞の蛍光強度を、FACS Canto（BD Biosciences）フローサイトメーターで測定した。データは、IGF-1R IgG1抗体は、細胞上のIGF-1Rと2本のアームで結合することができアビディティ効果を示すが、一価抗体は、1本のアームでしか結合し得ないという事実のため、細胞との最大半量結合に違いが存在することを示している。
最大半量結合
IGF-1R（150kDa）： 0.76nM
IGF-1R MoAb（100kDa）： 5.65nM

実施例6：
ADCC誘導（図13）
糖鎖工学的に作製されていない抗体および糖鎖工学的に作製された抗体による癌細胞へのエフェクター細胞動員を測定するため、ドナー由来の末梢血単核細胞（PBMC）を使用することができる。癌細胞の溶解は、NK細胞媒介性細胞傷害と相関し、抗体のNK細胞を動員する能力と比例する。この特定の状況において、それぞれの抗体の非存在下または存在下で、DU145前立腺癌細胞を1:25比（DU145：PBMC）でPBMCと共にインキュベートした。2時間後、前記のとおりにBATDA/ユーロピウムシステムを使用して細胞溶解を測定した。ADCCによる細胞溶解の大きさは、それぞれの標的細胞からのTDAの自然放出について補正された、界面活性剤により溶解された標的細胞からのTDA蛍光エンハンサーの最大放出に対する％として表される。データは、細胞上のIGF-1Rに対するより低い見かけの親和性にも関わらず、糖鎖工学的に作製されていない一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））が、糖鎖工学的に作製されていない親IGF-1R抗体と比較して、高濃度では、ADCCの誘導において優れていることを示している。驚くべきことに、糖鎖工学的に作製されていない一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））は、高濃度になるとADCCアッセイ法において降下を示す糖鎖工学的に作製された親IGF-1R抗体と比較しても、高濃度では、ADCCの誘導において優れている。IGF-1R内部移行の低下および内部移行の低下によるADCCの増強（下記参照）を媒介し、エフェクター細胞上のFcRIIIa受容体と会合するFc部分の量を倍加する一価IGF-1R抗原結合タンパク質（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））は、従って、糖鎖工学的に作製されていない抗体としてもまたは糖鎖工学的に作製された抗体としても、癌細胞上のIGF-1Rを標的とするための有望なアプローチとなり得る。

実施例7：
IGF-1R内部移行アッセイ法（図14）
二価親IGF-1R抗体によりIGF-1Rを標的とすることにより、IGF-1Rの内部移行がもたらされる。本発明者らは、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））の内部移行特性を調査した。図14のデータは、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））が結合した場合、IGF-1Rの内部移行が、力価および絶対内部移行に関して低下することを示している。

二価IGF-1R抗体により腫瘍細胞上のIGF-1Rを標的とすることにより、IGF-1Rの内部移行およびリソソーム分解がもたらされる。本発明者らは、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））の内部移行特性を調査した。この目的のため、HT29結腸癌細胞を、異なる濃度の一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））および二価親IGF-1R抗体により18時間処理した。細胞の溶解の後、残存IGF-1Rタンパク質レベルをIGF-1R特異的なELISAにより測定した。

図20のデータは、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））が結合した場合、IGF-1Rの内部移行が、力価および絶対内部移行に関して低下することを示している。最大内部移行は、83％（IgG1）から48％（MoAb）へ低下し、最大半量阻害のために必要とされる濃度は0.027nM（IgG1）から1.5nM（MoAb）へ増加した。

実施例8：
IGF-1R自己リン酸化（IGF-1刺激）（図15）
IGF-1R抗体によりIGF-1Rを標的とすることにより、IGF-1により誘導される自己リン酸化の阻害がもたらされる。本発明者らは、親IGF-1R IgG1抗体と比較して、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））の自己リン酸化の阻害を調査した。この目的のため、ヒトIGF-1Rを過剰発現しているマウス繊維芽細胞株3T3-IGF-1R細胞を、異なる濃度の一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））および二価親IGF-1R抗体の存在下で、10nM組換えヒトIGF-1により10分間処理した。細胞の溶解の後、リン酸化IGF-1Rタンパク質のレベルを、ヒトIGF-1R特異的な捕捉抗体とホスホチロシン特異的な検出抗体とを組み合わせたホスホIGF-1R特異的なELISAにより測定した。

図15のデータは、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））が、細胞上の一価結合（二価結合によるアビディティ効果の欠如）のため、より高い濃度においてではあるが、IGF-1により誘導される自己リン酸化を阻害し得ることを示している。最大半量阻害のために必要とされる濃度は、1.44nM（IgG1）から27.9nM（MoAb）へ増加した。一価抗体および二価抗体のIC50値の違いは、IGF-1R下方制御（59倍）と比較してIGF-1R自己リン酸化（19倍）の方がわずかに少ないため、下方制御に対する一価結合の影響の低下を、IGF-1Rに対する親和性の低下のみにより説明することはできない。

実施例9：
IGF-1R一価抗原結合タンパク質の安定性（図16）
一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））の安定性を、前記のとおりに動的光散乱により研究した。簡単に説明すると、一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAbの凝集傾向を、40℃で、DLS経時変化実験により査定した。5日間にわたり、単離された単量体画分（図10参照）の水力学的半径（Rh）の測定可能な増加は検出され得なかった（図22）。

実施例10：
PK特性の決定
本発明に係る一価抗体の薬物動態特性を、前記（方法セクション）のとおりに、単回投与PK研究において、NMRIマウス、雌、摂食、化合物投与の時点で23〜32gの体重において決定した。

PK特性は、下記表に与えられ、一価抗原結合タンパク質IGF-1R MoAb（IGF-1R AK18 MoAb（「wt」））が、親<IGF-1R>IgG1抗体と比較して、改善されたPK特性を有することを示している。

（表２）PK特性の要約

実施例11：
ESI-MS実験IGF-1R MoAb（図17および18）
一価抗原結合タンパク質IGF1R MoAb（IGF1R AK18 MoAb（「wt」））を一過性発現させ、プロテインAアフィニティクロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。調製用SECの後、抗体は、2個の別々のピーク（ピーク1およびピーク2）内に溶出し、それを収集した。画分2（ピーク2）からの分析用SECは、明確な単量体を示す100kDaの分子量に対応する。SEC-MALSは、初期SEC結果を確認し、画分2（単量体）について99.5kDaのMWを示している。変性還元条件下でのこの画分のSDS-PAGE分析は、50〜60kDaの見かけの分子量を有する1本の主要なバンドを示す。非還元条件下では、画分2（単量体）は、およそ100kDaのMWの主要なバンドを示す。
画分1＝165mL
画分2＝190mL

画分2由来の脱グリコシル化MoAbのESI-MSスペクトルは、98151Daの分子量を有する単量体に対応する1個のピーク系列を示す。

（表３）画分2由来の非還元ESI-MS測定からのMSデータの要約

画分2の還元条件下でのMS測定は、構築物の正確な配列および発現を示している。画分2からのMSデータは、ほぼ等しい量の47959Daおよび50211Daの分子量を有する2本の異なる重鎖を示している。

（表４）画分2由来の還元条件下での還元ESI-MS測定からのMSデータの要約

実施例12：
糖鎖工学的に作製された抗原結合タンパク質の作製
糖鎖工学的に作製された抗原結合タンパク質の作製のため、リン酸カルシウム法を使用して、HEK-EBNA細胞を、4種のプラスミドにより、それぞれ4：4：1：1の比率でトランスフェクトする。2種は抗体鎖をコードするものであり、1種は融合GnTIIIポリペプチド発現のためのものであり（GnT-III発現ベクター）、1種はマンｓノシダーゼII発現のためのものである（ゴルジマンノシダーゼII発現ベクター）。10％FCSが補足されたDMEM培養培地を使用して、Tフラスコにおいて接着単層培養物として細胞を増殖させ、50〜80％コンフルエントになった際に、トランスフェクトする。T150フラスコのトランスフェクションのため、トランスフェクションの24時間前に、1500万個の細胞を、FCS（10％V/V最終）が補足されたDMEM培養培地25mlに播種し、細胞を5％CO₂雰囲気のインキュベーター内に37℃で一夜置く。トランスフェクトされる各T150フラスコについて、軽鎖発現ベクターと重鎖発現ベクターとで等分された94μgの全プラスミドベクターDNA、水を、最終容量469μlおよび469μlの1M CaCl₂溶液へ混合することにより、DNA、CaCl₂、および水の溶液を調製する。この溶液に、938μlの50mM HEPES、280mM NaCl、1.5mM Na₂HPO₄溶液、pH7.05を添加し、直ちに10秒間混合し、20秒間室温で放置する。懸濁物を、2％FCSが補足されたDMEM 10mlで希釈し、既存の培地の代わりにT150に添加する。次いで、さらに13mlのトランスフェクション培地を添加する。細胞を、37℃、5％CO₂で約17〜20時間インキュベートし、次いで、培地を25mlのDMEM、10％FCSに置換する。210×gでの15分間の遠心分離により、培地交換のおよそ7日後に、条件培養培地を採集し、溶液を滅菌濾過し（0.22umフィルター）、最終濃度0.01％w/vのアジ化ナトリウムを添加し、4℃で維持する。

Claims (14)

1. （a）抗原と特異的に結合する抗体の第1の重鎖であって、VHドメインが該抗体のVLドメインに置換されている点において修飾されており、N末端からC末端への方向に、ドメインVL-CH1-HR-CH2-CH3を含む修飾された第1の重鎖をもたらす、第1の重鎖；および
   （b）該抗体の第2の重鎖であって、CH1ドメインが該抗体のCLドメインに置換されている点において修飾されており、N末端からC末端への方向に、ドメインVH-CL-HR-CH2-CH3を含む修飾された第2の重鎖をもたらす、第2の重鎖
   を含む、一価抗原結合タンパク質。
2. （a）の抗体の修飾された重鎖のCH3ドメインと、（b）の抗体の修飾された重鎖のCH3ドメインとが各々、抗体CH3ドメイン間の当初境界面を含む境界面において接すること
   を特徴とし、該境界面が、前記一価抗原結合タンパク質の形成を促進するよう改変されており、該改変が、
   （i）該一価抗原結合タンパク質内の他方の重鎖のCH3ドメインの該当初境界面に接する一方の重鎖のCH3ドメインの該当初境界面内で、
   アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、他方の重鎖のCH3ドメインの該境界面内の空隙内に位置し得る突出部が、一方の重鎖のCH3ドメインの該境界面内に生じるように、
   一方の重鎖のCH3ドメインが改変されること、および
   （ii）該一価抗原結合タンパク質内の第1のCH3ドメインの該当初境界面に接する第2のCH3ドメインの該当初境界面内で、
   アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換され、それにより、該第1のCH3ドメインの該境界面内の突出部が位置し得る空隙が、該第2のCH3ドメインの該境界面内に生じるように、
   他方の重鎖のCH3ドメインが改変されること
   を特徴とする、請求項1記載の一価抗原結合タンパク質。
3. より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）からなる群より選択され、かつ、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）からなる群より選択されること
   を特徴とする、請求項2記載の一価抗原結合タンパク質。
4. 両CH3ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るように、各CH3ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（C）の導入により、両CH3ドメインがさらに改変されていること
   を特徴とする、請求項3記載の一価抗原結合タンパク質。
5. ヒトIgG1アイソタイプであることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の一価抗原結合タンパク質。
6. （a）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
   （b）SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
   （a）SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
   （b）SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
   （a）SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
   （b）SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
   （a）SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
   （b）SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
   （a）SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
   （b）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；または
   （a）SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖；および
   （b）SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む修飾された重鎖
   を含むことを特徴とする、請求項1記載の一価抗原結合タンパク質。
7. （a）および（b）の修飾された重鎖がIgG1アイソタイプであり、かつ、前記抗原結合タンパク質が、脱フコシル化されAsn297において総オリゴ糖（糖）量の80％またはそれ未満であるフコース量を有し、ヒトIgG1アイソタイプであることを特徴とする、請求項1、2、3、4、または6のいずれか一項記載の一価抗原結合タンパク質。
8. 請求項1〜7のいずれか一項記載の一価抗原結合タンパク質の薬学的組成物。
9. 請求項1〜7のいずれか一項記載の一価抗原結合タンパク質と、少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
10. 請求項1〜7のいずれか一項記載の一価抗原結合タンパク質の治療的有効量を含む、治療を必要とする患者の処置のための薬学的組成物。
11. （a）請求項1〜7のいずれか一項記載の一価抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターで、宿主細胞を形質転換する工程、
    （b）該一価抗原結合タンパク質分子の合成を可能にする条件下で、該宿主細胞を培養する工程、および
    （c）培養物から該一価抗原結合タンパク質分子を回収する工程
    を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の一価抗原結合タンパク質の調製のための方法。
12. 請求項1〜7のいずれか一項記載の一価抗原結合タンパク質をコードする、核酸。
13. 請求項12記載の核酸を含む、ベクター。
14. 請求項13記載のベクターを含む、宿主細胞。

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