CN111868237A - P38抑制剂降低dux4表达的用途 - Google Patents

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A.M.卡卡塞
L.G.A.罗哈斯索托
L.A.汤普森三世
O.B.***
L.V.龙科
沈宁
A.S.罗伯森
张洛源
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Wellcome Medical Co
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Abstract

本发明涉及抑制p38激酶以降低DUX4和由DUX4调控的下游基因的基因和蛋白质表达的组合物和方法。本发明进一步涉及用于治疗患有与DUX4的表达增加或DUX4的异常形式的表达相关的疾病，如面肩肱型肌营养不良症(FSHD)的患者的方法。

Description

P38抑制剂降低DUX4表达的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求以下申请的优先权：于2017年10月5日提交的美国临时申请第62/568,673号；于2017年10月5日提交的美国临时申请第62/568,754号；于2018年6月8日提交的美国临时申请第62/682,563号；以及于2018年6月8日提交的美国临时申请第62/682,565号；所有所述申请以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式特此并入的序列表。创建于2018年10月4日的所述ASCII副本命名为FULC_027_02WO_ST25.txt，并且大小为27KB。
技术领域
本发明涉及抑制p38激酶以降低DUX4和由DUX4调控的下游基因的基因和蛋白质表达的组合物和方法。本发明进一步涉及用于治疗患有与DUX4的表达增加或DUX4的异常形式表达相关的疾病和病症(如面肩肱型肌营养不良症(FSHD))的受试者的方法。
背景技术
肌肉营养不良症(MD)是一组以控制移动的骨骼肌的进行性无力和退化为特征的多于30种不同的遗传疾病。一些形式的MD发生在婴儿期或儿童期，而其它可能直到中年或年龄更大时才会出现。各种MD疾病在肌无力的分布和程度(一些形式的MD还会影响心肌)、发病年龄、进展速率和遗传模式方面有所不同。
面肩肱型肌营养不良症(FSHD)是第三种最常见的肌营养不良症，并且困扰着全世界约1/15,000的人。FSHD是由导致DUX4基因的表观遗传去阻遏的基因突变引起的，这使得这种疾病在肌肉营养不良症中是独特的。FSHD的主要表现是面部、肩胛带、上臂和躯干的肌肉无力和消瘦，并且在更严重的情况下会影响下肢。
与FSHD相关的基因突变导致D4Z4染色质结构部分分解，并导致阻遏骨骼肌中的DUX4(即由D4Z4单元编码的转录因子)失效。占报告的FSHD病例约95％的FSHD1与染色体4q35的亚端粒区中的大卫星D4Z4重复序列缺失，留下1-10个D4Z4重复序列相关(综述于Tawil等人，2014)。FSHD2是由染色体18上的含柔性铰链域的染色体结构维持1基因(SMCHD1)的突变引起的(综述于van der Maarel等人，2007)。FSHD1和FSHD2突变两者导致4q35 D4Z4重复序列阵列处的阻遏损失，从而使肌肉中的编码双同源盒4(DUX4)转录因子的全长形式的双同源盒4(DUX4)mRNA(DUX4-fl)异常转录(Tawil等人，2014)。所发现的与FSHD相关的DUX4-fl RNA同种型仅在3'非翻译区有所不同，并且没有鉴定的功能区别。
目前还没有可以终止或逆转FSHD效应的经过批准的治疗方法，即使经常开具非甾体类抗炎药来改善舒适度和移动性。因此，本领域显然需要用于降低DUX4(例如，DUX4-flmRNA和/或DUX4蛋白)的表达水平以例如治疗FSHD和其它疾病的新方法。本发明满足了此需求。
附图说明
图1A和1B示出了FSHD肌管中的DUX4蛋白和RNA的表达。图1A包含使用结合DUX4蛋白和/或4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；以检测细胞核)的抗体进行染色的FSHD肌管的显微照片。成熟的FSHD肌管示出培养物中的肌动蛋白条纹(未示出)和分化的肌管内含有的离散细胞核组中的经过表达的DUX4蛋白(图1A)。图1B是示出FSHD肌管和来自同基因野生型(健康)对照的肌管中的DUX4 mRNA的相对表达的图表。
图2是示出用DMSO处理的野生型肌管或用FTX-2或DMSO处理的FSHD肌管中所指示的DUX4调控基因的mRNA表达的图表。对于每个所指示的基因，从左到右的条与用DMSO处理的野生型肌管、用DMSO处理的FSHD肌管和用FTX-2(DUX4靶向ASO)处理的FSHD肌管相关。
图3A-3C示出了用DUX4靶向ASO处理的FSHD肌管中的MBD3L2 mRNA的减少。如通过qPCR所测量的，相对于POLR2A mRNA对MBD3L2进行归一化。图3A是示出经过分组的板质量对照数据的图表，所述数据将MBD3L2在用DMSO对照或1μM DUX4靶向ASO处理的FSHD肌管中与健康的正常同基因野生型肌管(WT)中的表达进行比较。图3B是示出用不同稀释度的DUX4靶向ASO(FTX-2)处理的FSHD肌管中的MBD3L2 mRNA表达的剂量依赖性降低的图表。图3C示出了基于板的分析统计数据，所述分析统计数据将MBD3L2在用DMSO处理的FSHD肌管中与用DMSO处理的DUX4靶向ASO或野生型肌管中的信号进行比较。
图4A-4D是示出用所指示p38α/β抑制剂处理的FSHD肌管中MBD3L2 mRNA和MYOGmRNA相对于用DMSO对照处理的表达水平的图表。p38α/β抑制剂包含SB 239063(图4A)、VX-702(图4B)、帕吡莫德(Pamapimod)(图4C)和TAK-715(图4D)。还提供了抑制剂的结构。
图5A和5B示出了来自用帕吡莫德处理的FSHD肌管的数据。图5A是示出DUX4-flmRNA(填充圆圈)和MBD3L2 mRNA(空心圆圈)的剂量依赖性减少的图表。图5B示出了用DMSO或帕吡莫德处理的FSHD肌管的显微照片。
图6A-6C是示出与非靶向性对照(NT CTRL)相比，用siRNA靶向性p38a MAPK14(图6A中的siMAPK14 85和图6B中的siMAPK14 86)处理的或用p38a激酶(MAPK14和DUX4 pLAM)Cas9/sgRNA RNP(图6C)处理的FSHD肌管中的MAPK14(图6A)和MBD3L2(图6B和图6C)的mRNA水平的图表。在图6C中，对于每种处理，从左到右示出的结果分别对应于MBD3L2和MYOG。
图7是示出在用增加剂量的FTX-1821(所示结构)处理后FSHD肌管中的DUX4蛋白、MBD3L2 mRNA和p-HSP27蛋白的表达水平占DMSO对照处理水平的百分比的图表。条表示标准偏差。
图8A和8B示出了FTX-1821对肌管形成的影响。图8A提供了在用媒剂(DMSO)或指示浓度的FTX-1821处理并用针对MHC和DAPI(核染色)的抗体染色后获得的永生化FSHD肌管的形态学的代表性图像。图8B是示出在用测试浓度的FTX-1821处理后如由MHC染色所定义的肌管中的细胞核的定量的图表。条表示三个重复的标准偏差。
图9A和9B示出了体外FSHD肌管中的细胞凋亡测定的结果。图9A提供了对活性半胱天冬酶-3(作为细胞凋亡的标志物)或DAPI染色的FSHD肌管的显微照片。在培养物中的肌管的子集中以散发性方式检测到细胞凋亡，如左图中的白色圆圈和右侧的放大区所示。图9B是示出用指示浓度的FTX 1821处理的FSHD肌管中的活性半胱天冬酶-3信号的定量的图表。
图10A和10B展示了通过FTX-1821对FSHD肌管中下调的基因的鉴定。图10A是展示了通过RNA-seq图谱鉴定的差异表达基因的热图。通过RNA-seq分析每种条件的三个重复，并按如所指示的变化的方向和强度对基因进行聚类。颜色条指示观察到的归一化变化，例如在仅用DMSO处理的样品中富集了通过FTX-1821下调的基因。图10A中列出了下调的基因。图10B是示出在用媒剂对照DMSO处理的野生型细胞、用DMSO处理的FSHD细胞或用FTX-1821处理的FSHD细胞中，在用FTX-1821处理时被下调的DUX4靶基因的归一化表达水平读段的图表。
图11是示出在用DMSO媒剂对照、FTX-1821或FTX-839进行所指示的处理后，在源自四种不同的FSHD患者成肌细胞系FTCE-016、-020、-197、-196和两种野生型(WT)对照系的肌管中通过DUX4靶基因MBD3L2(相对于POLR2A归一化)的qRT-PCR进行的mRNA表达水平的图表。
图12A和12B提供了关于各种p38抑制剂的信息。图12A是总结所指示p38α和β抑制剂的药理学的数据表，包含降低FSHD细胞中的MBD3L2表达的IC50。示出了可比较的MBD3L2IC50值，表明跨报道具有类似酶效价的p38α和β抑制剂的广泛结构图对FSHD肌管中的DUX4下游基因表达的抑制。这些数据表明p38抑制导致DUX4靶基因MBD3L2的IC50值降低范围为约6-68nM。图12B提供了图12A中列出的p38抑制剂的化合物结构。
图13是在“培养皿中的临床试验”中利用的各种细胞系的表，所述表示出了基因型的多样性，并且包含原代和永生化细胞系以及FSHD1和FSHD2患者细胞系。
图14A和14B是示出在用FTX-1821、FTX-839或DMSO媒剂对照处理后(通过qRT-PCR)(图14A)相对于POLR2A归一化的MBD3L2 mRNA表达和如通过在九个FSHD1和三个FSHD2患者肌管(列于表2中，图14B包含仅两个FSHD2细胞系)中确定的裂解半胱天冬酶-3(图14B)测量的细胞凋亡的图表。
图15是示出在口服施用0.3mg/kgFTX-1821后大鼠的血浆暴露、斜方肌暴露和p38靶参与(磷酸化p38α:总p38α比率)的时间过程的图表。
图16是示出A4和C6异种移植TA肌肉中的MBD3L2 mRNA水平的图表。
图17是示出用媒剂对照或p38抑制剂FTX-2865处理后小鼠斜方肌中磷酸/总MC2比率的图表。
图18是示出在用媒剂对照或p38抑制剂FTX-2865处理后C6异种移植TA肌肉中的MBD3L2 mRNA水平的图表。
发明内容
本公开提供了降低细胞中DUX4-fl mRNA、DUX4多肽或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达的方法，所述方法包括使细胞与导致细胞中活性p38蛋白减少的药剂接触，由此降低DUX4多肽或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达。这些方法可以使用多种不同类型的药剂来实践，并且用于调节细胞中多种不同的生物过程，并且用于治疗受试者的与异常DUX4表达相关的疾病(如FSHD)。
在本文公开的方法中的任何一种方法的某些实施例中，细胞是肌细胞，任选地终末分化的肌细胞。在一些实施例中，与对照细胞(例如，从健康受试者获得的细胞)中DUX4-fl mRNA、DUX4多肽或由下游靶基因编码的多肽的表达水平相比，所述细胞中的DUX4-flmRNA、DUX4多肽或由下游靶基因编码的多肽的表达水平增加。在一些实施例中，DUX4-flmRNA、DUX4多肽或由下游靶基因编码的多肽的表达水平增加是由于细胞中D4Z4基因座的阻遏减少引起的。在某些实施例中，细胞与面肩肱型肌营养不良症(FSHD)相关，例如，其是从诊断患有FSHD的受试者获得的，或者存在于诊断患有FSHD的受试者中。在一些实施例中，细胞在染色体4q35的亚端粒区中包括一个或多个大卫星D4Z4重复序列的缺失，任选地其中所述细胞在染色体4q35的亚端粒区中包括<7个大卫星D4Z4重复序列。在一些实施例中，细胞在含柔性铰链域的染色体结构维持1(SMCHD1)基因中包括一个或多个突变。在一些实施例中，细胞包括至少一个未缺失的4qA等位基因。
在本文公开的方法的某些实施例中，所述药剂抑制p38蛋白的表达或活性或减少其量，其中活性任选地是激酶活性。
在一些实施例中，所述药剂抑制p38蛋白的表达。在特定实施例中，所述药剂结合对所述p38蛋白进行编码的多核苷酸，或结合其反义多核苷酸。在特定实施例中，所述药剂包括核酸或由其组成，任选地DNA、RNA、gRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。
在一些实施例中，所述药剂抑制所述p38蛋白的活性。在特定实施例中，所述药剂结合所述p38蛋白。在特定实施例中，所述药剂包括多肽或由其组成，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。在一些实施例中，所述药剂包括小分子，任选地小有机分子或小无机分子。
在本文公开的方法中的任何一种方法的某些实施例中，下游靶基因是RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、KHDC1L、ZSCAN4、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A。
在本文公开的方法中的任何一种方法的特定实施例中，p38蛋白的表达或活性或p38蛋白的量降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
在相关实施例中，本公开提供了一种治疗或预防有需要的受试者的与DUX4-flmRNA、DUX4蛋白或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达增加相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者提供包括导致受试者的一个或多个组织中的活性p38蛋白的量减少的药剂的药物组合物，由此降低受试者的一个或多个组织中DUX4-fl mRNA、DUX4蛋白或对下游靶基因进行编码的多肽的表达。在一些实施例中，所述疾病或病症是面肩肱型肌营养不良症(FSHD)，任选地FSHD1或FSHD2。在某些实施例中，所述受试者包括D4Z4基因座处减少的阻遏。在一些实施例中，所述受试者在染色体4q35的亚端粒区中包括一个或多个大卫星D4Z4重复序列的缺失，任选地其中所述细胞在染色体4q35的亚端粒区中包括<7个大卫星D4Z4重复序列。在一些实施例中，所述受试者在含柔性铰链域的染色体结构维持1(SMCHD1)基因中包括一个或多个突变。在一些实施例中，所述受试者包括至少一个未缺失的4qA等位基因。在某些实施例中，所述p38蛋白的表达或活性或量在所述受试者的肌肉组织中降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施例中，所述方法减少了所述受试者的肌肉退化。在一些实施例中，所述方法减少了所述受试者的肌细胞的细胞凋亡。在一些实施例中，所述肌肉组织是终末分化的。在特定实施例中，所述药物组合物通过肠胃外或口服提供给所述受试者。在某些实施例中，所述药物组合物任选地通过肠胃外或肌肉内提供到所述受试者的肌肉组织。在特定实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者提供第二药剂或疗法以治疗与DUX4蛋白或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达增加相关的疾病或病症。
本公开还提供了一种药物组合物的单位剂型，所述药物组合物包括导致细胞中活性p38蛋白的量减少的药剂以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂，其中所述单位剂型有效降低施用所述单位剂型的受试者的一个或多个细胞或组织中DUX4-fl mRNA、DUX4多肽或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达或活性。在特定实施例中，所述药剂结合所述DUX4多肽或结合对所述DUX4多肽进行编码的多核苷酸。在一些实施例中，所述药剂包括核酸或由其组成，任选地DNA、RNA、gRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。在一些实施例中，所述药剂包括多肽或由其组成，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。在一些实施例中，所述药剂包括小分子，任选地有机分子或无机分子。在某些实施例中，所述组织是肌肉组织，任选地其中所述组织包括包含与面肩肱型肌营养不良症(FSHD)相关的突变的细胞。
在另外的相关实施例中，本公开提供了一种减少细胞(例如，肌细胞)的细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与导致所述细胞中活性p38蛋白的量减少的药剂接触，任选地其中所述肌细胞是终末分化的，由此降低所述细胞中DUX4-fl mRNA、DUX4蛋白或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达。在一些实施例中，与对照细胞中所述DUX4多肽或由所述下游靶基因编码的所述多肽的表达水平相比，所述细胞中的所述DUX4-fl mRNA、所述DUX4多肽或由所述下游靶基因编码的所述多肽的表达水平增加。在一些实施例中，DUX4-flmRNA、DUX4多肽或由下游靶基因编码的多肽的表达水平增加是由于细胞中D4Z4基因座的阻遏减少引起的。在特定实施例中，所述细胞包括一个或多个与FSHD相关的突变。在某些实施例中，所述药剂抑制所述p38蛋白的表达，任选地其中所述药剂结合对所述p38蛋白进行编码的多核苷酸或其反义多核苷酸。例如，在一些实施例中，所述药剂包括核酸或由其组成，任选地例如靶向p38的DNA、RNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。在一些实施例中，所述药剂抑制所述p38蛋白的活化，任选地其中所述药剂结合所述p38蛋白。在一些实施例中，所述药剂包括多肽或由其组成，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。在一些实施例中，所述药剂包括小分子，任选地小有机分子或小无机分子。在特定实施例中，所述p38蛋白、所述DUX4蛋白或由DUX4下游基因编码的所述多肽的表达或活性降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。在特定实施例中，与对照(例如，未经处理的细胞)相比，所述方法使肌肉组织中的肌细胞的细胞凋亡减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
在本文公开的方法中的任何一种方法的某些实施例中，所述药剂降低了DUX4或下游靶基因的表达。在某些实施例中，所述药剂结合p38蛋白，例如p38-α或p38-β，或结合对所述p38蛋白进行编码的多核苷酸，例如p38-α或p38-β，或其反义多核苷酸。在特定实施例中，所述药剂包括以下或由以下组成：核酸，任选地DNA、RNA、shRNA、siRNA、CRISPRgRNA或反义寡核苷酸。在特定实施例中，所述药剂包括以下或由以下组成：多肽，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。在特定实施例中，所述药剂包括：小分子，任选地有机分子或无机分子。在一些实施例中，所述下游靶基因是RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、KHDC1L、ZSCAN4、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A。在特定实施例中，所述下游靶基因是MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43或KHDC1L。
在本文公开的方法中的任何一种方法的某些实施例中，所述药剂结合p38蛋白，例如p38-α或p38-β，或结合对p38蛋白进行编码的多核苷酸，例如p38-α或p38-β。在一些实施例中，所述药剂包括以下或由以下组成：核酸，任选地DNA、RNA、shRNA、siRNA、mRNA、CRISPRgRNA、经过修饰的mRNA、吗啉代或反义寡核苷酸。在一些实施例中，所述mRNA或经过修饰的mRNA对抗体或其功能片段进行编码。在一些实施例中，所述药剂包括以下或由以下组成：多肽，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。在一些实施例中，所述药剂包括基因疗法载体或由其组成，例如病毒载体，所述病毒载体包括对p38(例如，p38-α或p38-β或其它靶标)的多核苷酸或多肽抑制剂进行编码的核酸序列。在一些实施例中，所述药剂包括小分子或由其组成，任选地有机分子或无机分子。在一些实施例中，所述下游靶标是RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、KHDC1L、ZSCAN4、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A。在一些实施例中，所述下游靶基因是MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43或KHDC1L。在一些实施例中，所述下游靶基因是CCNA1。
具体实施方式
本发明部分地基于以下发现：对p38激酶(例如，p38-α)的抑制导致DUX4和由DUX4调控的下游基因的表达降低。因此，本发明包含例如在治疗或预防与异常DUX4表达相关的疾病如FSHD(一种肌营养不良症)中与使用p38抑制剂(例如，p38-α)(单独地或与另一种药剂组合)来降低DUX4和/或其下游靶基因中的任何一个的表达和/或活性水平有关的方法和组合物。这可以通过多种方式实现，例如降低DUX4-fl mRNA的表达、降低DUX4蛋白的表达、抑制DUX4蛋白活性；CRISPR基因组编辑和/或诱导DUX4蛋白降解。
肌营养不良症是导致身体肌肉进行性无力的一组不同的遗传疾病。一些类型的肌营养不良症将在儿童早期呈现症状，而其它类型将在成年期出现。根据肌营养不良症的类型，不同的肌肉群也可能受到影响。参见例如Isin Dalkilic和Louis M Kunkel。已知近30种基因会引起各种形式的肌营养不良症，所述肌营养不良症的发病年龄、严重程度和受影响的肌肉群各不相同。被鉴定的基因数量每年都在增加，这加深了我们的理解，也揭示了这些疾病的发病机制的整体复杂性。
例如，两种常见的肌营养不良症——杜氏肌营养不良症(DMD)和面肩肱型营养不良症(FSHD)——被认为是具有某些共有特性的独特疾病。DMD与FSHD之间的相似性包含两者都是遗传性疾病，并且症状包含肌肉减少伴有肌无力，从而导致残疾(因此DMD和FSHD两者被分组为意味着肌肉退化的肌营养不良症的大类)。然而，DMD和FSHD的病因和疾病诊断却大不相同(DMD中肌营养不良蛋白损失与FSHD中DUX4-肌肉毒素的表达)。例如，在DMD中，DMD基因的突变(已知>2000种)产生功能失调肌营养不良蛋白或缺少肌营养不良蛋白。在FSHD中，所述疾病是由于肌肉组织中的DUX4基因的过度表达而造成的；这并不是由于基因中的点突变而造成的(当DUX4基因中的D4Z4重复序列的数量介于1与8之间时，或者当D4Z4处的阻遏因其它沉默机制中的突变而丧失时，DUX4蛋白被表达)。其它差异包含：在FSHD中，只涉及骨骼肌，而在DMD中，骨骼肌和心肌两者都受到影响；DMD中涉及膈肌，但FSHD不涉及；通常，DMD中存在儿童期发病，而FSHD中存在成人/青少年期发病；并且在DMD中，发病时涉及非卧床，而在FSHD中，发病时涉及面部和近侧臂/肩。另一个重要的区别是DMD中对类固醇有应答，而FSHD中没有。另外，经过批准的DMD治疗(美国的Exondys-51；欧洲的Ataluren)将对FSHD没有任何效果。最后，在DMD中，只有男性会受到影响，而在FSHD中，男女都会涉及。
FSHD还有一种不寻常的病理，并且所述病理在肌肉营养不良症中是独特的，因为其发展需要遗传和表观遗传条件两者。遗传条件是存在完整的DUX4基因。DUX4基因是一种通常在种系和早期胚胎细胞中表达的逆基因，但其在成人组织中被D4Z4重复序列诱导的沉默所阻遏(Ehrlich和Lacey，2012)。每个D4Z4元件含有启动子和DUX4 ORF，但缺少多腺苷酸化信号(PAS)，从而导致DUX4 mRNA快速降解。相比之下，在4qA许可等位基因上的远侧D4Z4单位中引发的转录物延伸到重复序列陈列之外，并到达侧接pLAM序列中的PAS(综述于Tawil等人，2014；Himeda等人，2015)。所产生的poly-A尾使DUX4 mRNA稳定，并允许其转化为一种在健康肌肉中通常不表达且对骨骼肌功能有毒的蛋白质。已经描述了两种增强子，即活化骨骼肌细胞中的DUX4-fl表达的DUX4成肌增强子1(DME1)和DME2，以调节FSHD中的DUX4-fl表达(Himeda等人，2014)。
FSHD1、FSHD2早期发展阶段以及种系形成阶段似乎为D4Z4染色质赋予了转录许可构象。这可以通过组蛋白修饰的改变、FSHD1中D4Z4的部分但可变的低甲基化以及FSHD2中更广泛的低甲基化来证明(Himeda等人，2015)。然而，D4Z4低甲基化不足以治疗所述疾病，因为患有免疫缺陷、着丝粒区不稳定和面部异常(ICF)的患者没有肌营养不良症状，所述ICF是一种罕见的、不相关的DNA低甲基化相关疾病，其中D4Z4高度低甲基化(OMIM条目-#614069)。
DUX4是一种同源盒转录因子蛋白，并且DUX4在肌肉中的表达诱导转录程序，从而导致通常不在骨骼肌中表达的下游基因和蛋白产物的表达。例如，DUX4表达导致对FSHD骨骼肌和转染细胞中若干个种系基因的诱导(Yao等人，2014；Ehrlich和Lacey，2012)。这些新颖转录物中的许多转录物在FSHD肌细胞中表达，但在对照肌细胞中不表达(Yao等人，2014；Homma等人，2015；Shadle等人，2017；Bosnakovski等人，2014)。由于DUX4的下游靶基因中的一些下游靶基因对转录因子进行编码，因此DUX4病理学活化导致肌肉中的大规模基因表达失调级联，从而引起疾病(Yao等人，2014；Homma等人，2015；Shadle等人，2017；Bosnakovski等人，2014)。
肌细胞中的内源性(在FSHD肌纤维中)和强制性DUX4表达是有毒的，导致细胞凋亡和氧化应激，并干扰肌生成和肌节功能(Rickard等人，2015；Homma等人，2015；Bosnokovski等人，2014；Tawil等人，2014；Himeda等人，2015)。疾病进展和发病年龄两者的临床异质性可能部分地归因于导致DUX4转录渐进改变的表观遗传不稳定性。DNA低甲基化和许可DUX4转录的作用通过在患有遗传性组合FSHD1和2缺陷的患者中观察到的高临床严重程度来例示(Tawil等人，2014；van der Maarel等人，2007)。临床异质性还通过D4Z4重复序列缩短的严重程度的差异来解释，其中与重复序列(4-7)收缩不太严重的患者相比，具有较短重复序列(1-3)的患者的表型更严重，发病年龄更小。
DUX4现在被认为是FSHD的病理学病因，因为其靶基因的活化是FSHD肌肉的主要分子特征(综述于Tawil等人，2014；Himeda等人，2015)。主要的下游靶基因是在染色体上空间聚集的高度同源基因家族的成员，包含PRAMEF(优先在黑素瘤中表达)、TRIM(含三重基序)、甲基-CpG结合蛋白样(MBDL)、含锌指和SCAN结构域(ZSCAN)和ret指蛋白样(RFPL)家族(Geng等人，2012；Yao等人，2014；Shadle等人，2017；Ehrlich和Lacey，2012年；Tawil等人，2014；van der Maarel等人，2007)。可以使用ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15、ZNF280A等来区分FSHD与对照骨骼肌(描述于但不限于Yao等人，2014；Shadle等人，2017；Ehrlich和Lacey，2012)。
筛选有注释的化学探针，以鉴定降低FSHD肌管中的DUX4表达的疾病修饰小分子药物靶标。这些筛选鉴定抑制p38丝裂原活化蛋白激酶α(MAPK14或p38α)的活性的多种化学支架。如所附实例中所述，已经示出，使用小干扰RNA(siRNA)技术或用选择性地靶向p38激酶的α异构体的特异性向导RNA(gRNA)编辑的CRISPR介导的基因组敲除MAPK14基因还降低了FSHD肌管中的DUX4和DUX4相关的下游基因表达。还发现，选择性p38α和β激酶抑制剂特异性地减少了FSHD肌管中的DUX4和其下游基因，由此影响FSHD疾病过程的核心病理生理学(本文中所例示的数据)。相同的实验揭示，p38α和β激酶抑制剂不影响成肌素或其它成肌因子的表达，也不影响FSHD肌管中成肌融合所展示的成肌细胞的增殖或分化，由此证明所述效应并不是由于对肌肉的整体毒性造成的。这些p38激酶抑制剂小分子减少了DUX4和相关下游基因的表达，由此影响FSHD疾病过程的病理生理学，包含减少凋亡细胞死亡。预期p38介导的DUX4减少将影响FSHD中下游炎症、脂肪浸润和纤维化过程。
由α、β、γ和δ异构体构成的p38MAPK家族的成员由独立的基因编码，所述基因在适应于应激和生存所需的细胞应答中发挥关键作用(综述于Whitmarsh，2010；Martin等人，2014；Krementsov等人，2013)。在许多炎性疾病(包含心血管疾病和其它慢性疾病)中，这些相同的p38 MAPK应激诱导的信号可能触发加重而非减轻疾病的不适应应答(综述于Whitmarsh，2010；Martin等人，2014)。事实上，在骨骼肌中，包含慢性运动、胰岛素暴露和内分泌状态改变、成肌细胞分化成肌细胞、活性氧类别以及细胞凋亡的各种细胞应激都已被示出为诱导p38激酶途径(Keren等人，2006；Zarubin等人，2006)。事实上，p38激酶途径可以通过许多外部刺激活化，包含促炎细胞因子和细胞应激，从而使双特异性MAPK激酶MKK3和MKK6活化。进而使其活化环中的p38磷酸化的MKK3和MKK6的活化触发了下游磷酸化事件。这些包含HSP27、MAPKAPK2(MK2)和多种转录因子的磷酸化，最终导致细胞核中的转录改变。已经鉴定出p38激酶的数量适中的p38调节转录物和大量下游效应子(描述于Cuenda等人，2007和Kyriakis等人，2001，Viemann等人，2004)。
来自抑制p38αMAPK信号传导途径的不同化学支架的若干种化合物已进入多种(非神经肌肉)适应症的临床试验，包含类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺部疾病、疼痛、心血管疾病和癌症。临床试验中对p38α和β的抑制被证明是安全的。体外和体内药理学表明，在这些临床研究中，p38α靶标参与是稳健的，如通过测量HSP27(间接靶标)和pMK2(直接靶标)磷酸化的减少所证明的。
已知p38αMAPK在骨骼肌生物学中，具体地在消除增殖成肌细胞分化并随后融合以形成多核肌管中起关键作用。用p38α抑制剂治疗组成性地经历退变和再生过程的肌营养不良症患者将并不明显。p38α的完全敲除(KO)在胚胎期是致命的。胚胎挽救使幼仔存活至出生后几天，并分离出卫星细胞以对缺乏p38α的成肌前体进行研究。完全缺少p38α的成肌细胞表达显著较少的关键分化基因，并且示出融合严重不足。P2幼仔的组织学表明，循环卫星细胞显著增加并且纤维分布向左移动。(Perdiguero等人，2007)。重要的是，成熟肌肉中p38α的KO(由Myl1启动子驱动的cre)在早期时间点没有示出缺陷，但是与对照相比，缺乏p38α的小鼠在6个月大时示出显著更高的再生能力和I型纤维，以及更小的纤维分布(Wissing等人，2014)。这些数据表明，除了FSHD外，p38α的抑制将通过独立于调节DUX4表达的机制触发再生缺陷疾病中的骨骼肌再生。
在骨骼肌中，p38已被证明在肌生成期间调节基因表达。p38γ已被证明是使用特异性基因敲除和条件性敲除方法两者进行肌生成所必需的(Cuenda等人，2007；Kerin等人，2006；Aouadi等人，2006)。在成人中，p38α和β的选择性抑制剂避免了对肌生成的p38γ相关影响。
本公开发现p38在肌生成过程中被活化，并且通过本文中所例示的分子(包含FTX-839、FTX-1821等)进行的p38α和β的抑制显著降低FSHD肌管中DUX4表达和其下游基因程序(在本文中所例示的数据)。不希望受理论的束缚，p38α似乎通过在具有较短重复序列(FSHD1)或SMCHD1突变(FSHD2)的突变D4Z4基因座的水平上或当FSHD患者的肌肉中的其它机制失去阻遏作用时影响病理性DUX4表达所需的关键成肌增强子的活性来直接调节DUX4表达。这是与先前临床研究不同的机制，所述先前临床研究以细胞质中的p38的功能为目标并且在许多疾病中未显示疗效，包含类风湿性关节炎、疼痛、抑郁症、慢性阻塞性肺部疾病和心血管疾病。从未在临床上探索p38抑制剂对FSHD的作用。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包含复数指代，除非上下文另有明确指示。
如在本说明书中所使用的，除非另有说明，否则在本公开中使用术语“和/或”指代“和”或“或”。
贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变型应当理解为暗示包含所述的要素或整体或要素或整体组，但不排除任何其它要素或整体或要素或整体组。
如本申请中使用的，术语“约”和“大约”用作等效物。本申请中使用的有或无约/大约的任何数值意指涵盖相关领域普通技术人员所了解的任何正常波动。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指在规定的参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值的范围，除非另行说明或另外从上下文明显可见(除了这些数量将超过可能值的100％的情况)。
“施用”在本文中是指将药剂或组合物引入到受试者体内，或使药剂或组合物与细胞和/或组织接触。
在某些方面，本公开包含一种用于降低细胞、组织、器官或受试者的DUX4基因、mRNA或多肽的表达或活性或用于降低DUX4下游基因或多肽的表达或活性的方法，包含但不限于本文所公开的那些多肽中的任何一种多肽。在特定实施例中，DUX4mRNA是DUX4-fl。如本文所使用的，术语“DUX4下游基因”是指被DUX4转录活化(即，其表达增加)的基因，并且术语“DUX4下游多肽”是指经过编码的多肽。本文提供了DUX4下游基因的说明性实例。在某些实施例中，DUX4下游基因选自图10A中所示的那些。
本文公开的方法可以在体外或体内实践，并且在某些实施例中，所述方法包括使细胞、组织、器官或受试者与p38抑制剂接触，从而导致细胞、组织、器官或受试者的活性p38蛋白的量减少。术语“p38抑制剂”可以指导致细胞、组织、器官或受试者的活性p38蛋白的量减少的任何药剂。细胞中活性p38蛋白的量可以通过多种方式减少，包含但不限于减少p38蛋白的总量或抑制p38蛋白的一种或多种活性。在各个实施例中，p38抑制剂可以抑制p38基因、p38 mRNA或p38蛋白的表达，和/或p38抑制剂可以抑制p38蛋白的生物活性。在某些实施例中，生物活性是激酶活性。例如，p38抑制剂可以竞争性地与p38 MAPK的ATP结合位点结合并抑制其激酶活性，或者其可以变构地阻断p38 MAPK的激酶活性。在某些实施例中，p38抑制剂使p38蛋白的降解增加。在特定实施例中，p38基因或p38蛋白是哺乳动物p38基因或哺乳动物p38蛋白，例如人p38基因或人p38蛋白，例如人p38-α(MAPK14)或p38-β(MAPK11)基因或蛋白。
p38 MAP激酶(MAPK)(也称为RK或细胞***素特异性结合蛋白(CSBP))是酵母Hog1p MAP激酶的哺乳动物直系同源物，其参与控制对细胞因子和应激的细胞应答的信号传导级联。已鉴定出四种p38MAP激酶，即p38-α(MAPK14)、p38-β(MAPK11)、p38-γ(MAPK12/ERK6)和p38-δ(MAPK13/SAPK4)。这些包含各种亚型。在特定实施例中，这些中的任何一个可以通过本文公开的方法来靶向。在某些实施例中，p38抑制剂抑制p38-α(MAPK14)或p38-β(MAPK11)，例如这些基因或蛋白质的人类版本。
在某些实施例中，所靶向的p38蛋白包括以下所示的或在GenBank登录NP_001306.1中公开的p38激酶(丝裂原活化的蛋白激酶14亚型1，智人)的氨基酸序列：
MSQERPTFYRQELNKTIWEVPERYQNLSPVGSGAYGSVCAAFDTKTGLRVAVKKLSRPFQSIIHAKRTYRELRLLKHMKHENVIGLLDVFTPARSLEEFNDVYLVTHLMGADLNNIVKCQKLTDDHVQFLIYQILRGLKYIHSADIIHRDLKPSNLAVNEDCELKILDFGLARHTDDEMTGYVATRWYRAPEIMLNWMHYNQTVDIWSVGCIMAELLTGRTLFPGTDHIDQLKLILRLVGTPGAELLKKISSESARNYIQSLTQMPKMNFANVFIGANPLAVDLLEKMLVLDSDKRITAAQALAHAYFAQYHDPDDEPVADPYDQSFESRDLLIDEWKSLTYDEVISFVPPPLDQEEMES(SEQ ID NO:1)。
在某些实施例中，所靶向的p38基因、cDNA、mRNA或编码序列包括以下所示的或在GenBank登录NM_001315.2中公开的p38-α核酸序列，或其互补体：
TTCTCTCACGAAGCCCCGCCCGCGGAGAGGTTCCATATTGGGTAAAATCTCGGCTCTCGGAGAGTCCCGGGAGCTGTTCTCGCGAGAGTACTGCGGGAGGCTCCCGTTTGCTGGCTCTTGGAACCGCGACCACTGGAGCCTTAGCGGGCGCAGCAGCTGGAACGGGAGTACTGCGACGCAGCCCGGAGTCGGCCTTGTAGGGGCGAAGGTGCAGGGAGATCGCGGCGGGCGCAGTCTTGAGCGCCGGAGCGCGTCCCTGCCCTTAGCGGGGCTTGCCCCAGTCGCAGGGGCACATCCAGCCGCTGCGGCTGACAGCAGCCGCGCGCGCGGGAGTCTGCGGGGTCGCGGCAGCCGCACCTGCGCGGGCGACCAGCGCAAGGTCCCCGCCCGGCTGGGCGGGCAGCAAGGGCCGGGGAGAGGGTGCGGGTGCAGGCGGGGGCCCCACAGGGCCACCTTCTTGCCCGGCGGCTGCCGCTGGAAAATGTCTCAGGAGAGGCCCACGTTCTACCGGCAGGAGCTGAACAAGACAATCTGGGAGGTGCCCGAGCGTTACCAGAACCTGTCTCCAGTGGGCTCTGGCGCCTATGGCTCTGTGTGTGCTGCTTTTGACACAAAAACGGGGTTACGTGTGGCAGTGAAGAAGCTCTCCAGACCATTTCAGTCCATCATTCATGCGAAAAGAACCTACAGAGAACTGCGGTTACTTAAACATATGAAACATGAAAATGTGATTGGTCTGTTGGACGTTTTTACACCTGCAAGGTCTCTGGAGGAATTCAATGATGTGTATCTGGTGACCCATCTCATGGGGGCAGATCTGAACAACATTGTGAAATGTCAGAAGCTTACAGATGACCATGTTCAGTTCCTTATCTACCAAATTCTCCGAGGTCTAAAGTATATACATTCAGCTGACATAATTCACAGGGACCTAAAACCTAGTAATCTAGCTGTGAATGAAGACTGTGAGCTGAAGATTCTGGATTTTGGACTGGCTCGGCACACAGATGATGAAATGACAGGCTACGTGGCCACTAGGTGGTACAGGGCTCCTGAGATCATGCTGAACTGGATGCATTACAACCAGACAGTTGATATTTGGTCAGTGGGATGCATAATGGCCGAGCTGTTGACTGGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTAACCAGCTTCAGCAGATTATGCGTCTGACAGGAACACCCCCCGCTTATCTCATTAACAGGATGCCAAGCCATGAGGCAAGAAACTATATTCAGTCTTTGACTCAGATGCCGAAGATGAACTTTGCGAATGTATTTATTGGTGCCAATCCCCTGGCTGTCGACTTGCTGGAGAAGATGCTTGTATTGGACTCAGATAAGAGAATTACAGCGGCCCAAGCCCTTGCACATGCCTACTTTGCTCAGTACCACGATCCTGATGATGAACCAGTGGCCGATCCTTATGATCAGTCCTTTGAAAGCAGGGACCTCCTTATAGATGAGTGGAAAAGCCTGACCTATGATGAAGTCATCAGCTTTGTGCCACCACCCCTTGACCAAGAAGAGATGGAGTCCTGAGCACCTGGTTTCTGTTCTGTTGATCCCACTTCACTGTGAGGGGAAGGCCTTTTCACGGGAACTCTCCAAATATTATTCAAGTGCCTCTTGTTGCAGAGATTTCCTCCATGGTGGAAGGGGGTGTGCGTGCGTGTGCGTGCGTGTTAGTGTGTGTGCATGTGTGTGTCTGTCTTTGTGGGAGGGTAAGACAATATGAACAAACTATGATCACAGTGACTTTACAGGAGGTTGTGGATGCTCCAGGGCAGCCTCCACCTTGCTCTTCTTTCTGAGAGTTGGCTCAGGCAGACAAGAGCTGCTGTCCTTTTAGGAATATGTTCAATGCAAAGTAAAAAAATATGAATTGTCCCCAATCCCGGTCATGCTTTTGCCACTTTGGCTTCTCCTGTGACCCCACCTTGACGGTGGGGCGTAGACTTGACAACATCCCACAGTGGCACGGAGAGAAGGCCCATACCTTCTGGTTGCTTCAGACCTGACACCGTCCCTCAGTGATACGTACAGCCAAAAAGGACCAACTGGCTTCTGTGCACTAGCCTGTGATTAACTTGCTTAGTATGGTTCTCAGATCTTGACAGTATATTTGAAACTGTAAATATGTTTGTGCCTTAAAAGGAGAGAAGAAAGTGTAGATAGTTAAAAGACTGCAGCTGCTGAAGTTCTGAGCCGGGCAAGTCGAGAGGGCTGTTGGACAGCTGCTTGTGGGCCCGGAGTAATCAGGCAGCCTTCATAGGCGGTCATGTGTGCATGTGAGCACATGCGTATATGTGCGTCTCTCTTTCTCCCTCACCCCCAGGTGTTGCCATTTCTCTGCTTACCCTTCACCTTTGGTGCAGAGGTTTCTTGAATATCTGCCCCAGTAGTCAGAAGCAGGTTCTTGATGTCATGTACTTCCTGTGTACTCTTTATTTCTAGCAGAGTGAGGATGTGTTTTGCACGTCTTGCTATTTGAGCATGCACAGCTGCTTGTCCTGCTCTCTTCAGGAGGCCCTGGTGTCAGGCAGGTTTGCCAGTGAAGACTTCTTGGGTAGTTTAGATCCCATGTCACCTCAGCTGATATTATGGCAAGTGATATCACCTCTCTTCAGCCCCTAGTGCTATTCTGTGTTGAACACAATTGATACTTCAGGTGCTTTTGATGTGAAAATCATGAAAAGAGGAACAGGTGGATGTATAGCATTTTTATTCATGCCATCTGTTTTCAACCAACTATTTTTGAGGAATTATCATGGGAAAAGACCAGGGCTTTTCCCAGGAATATCCCAAACTTCGGAAACAAGTTATTCTCTTCACTCCCAATAACTAATGCTAAGAAATGCTGAAAATCAAAGTAAAAAATTAAAGCCCATAAGGCCAGAAACTCCTTTTGCTGTCTTTCTCTAAATATGATTACTTTAAAATAAAAAAGTAACAAGGTGTCTTTTCCACTCCTATGGAAAAGGGTCTTCTTGGCAGCTTAACATTGACTTCTTGGTTTGGGGAGAAATAAATTTTGTTTCAGAATTTTGTATATTGTAGGAATCCTTTGAGAATGTGATTCCTTTTGATGGGGAGAAAGGGCAAATTATTTTAATATTTTGTATTTTCAACTTTATAAAGATAAAATATCCTCAGGGGTGGAGAAGTGTCGTTTTCATAACTTGCTGAATTTCAGGCATTTTGTTCTACATGAGGACTCATATATTTAAGCCTTTTGTGTAATAAGAAAGTATAAAGTCACTTCCAGTGTTGGCTGTGTGACAGAATCTTGTATTTGGGCCAAGGTGTTTCCATTTCTCAATCAGTGCAGTGATACATGTACTCCAGAGGGACAGGGTGGACCCCCTGAGTCAACTGGAGCAAGAAGGAAGGAGGCAGACTGATGGCGATTCCCTCTCACCCGGGACTCTCCCCCTTTCAAGGAAAGTGAACCTTTAAAGTAAAGGCCTCATCTCCTTTATTGCAGTTCAAATCCTCACCATCCACAGCAAGATGAATTTTATCAGCCATGTTTGGTTGTAAATGCTCGTGTGATTTCCTACAGAAATACTGCTCTGAATATTTTGTAATAAAGGTCTTTGCACATGTGACCACATACGTGTTAGGAGGCTGCATGCTCTGGAAGCCTGGACTCTAAGCTGGAGCTCTTGGAAGAGCTCTTCGGTTTCTGAGCATAATGCTCCCATCTCCTGATTTCTCTGAACAGAAAACAAAAGAGAGAATGAGGGAAATTGCTATTTTATTTGTATTCATGAACTTGGCTGTAATCAGTTATGCCGTATAGGATGTCAGACAATACCACTGGTTAAAATAAAGCCTATTTTTCAAATTTAGTGAGTTTCTCAAGTTTATTATATTTTTCTCTTGTTTTTATTTAATGCACAATATGGCATTATATCAATATCCTTTAAACTGTGACCTGGCATACTTGTCTGACAGATCTTAATACTACTCCTAACATTTAGAAAATGTTGATAAAGCTTCTTAGTTGTACATTTTTTGGTGAAGAGTATCCAGGTCTTTGCTGTGGATGGGTAAAGCAAAGAGCAAATGAACGAAGTATTAAGCATTGGGGCCTGTCTTATCTACACTCGAGTGTAAGAGTGGCCGAAATGACAGGGCTCAGCAGACTGTGGCCTGAGGGCCAAATCTGGCCCACCACCTGTTTGGTGTAGCCTGCTAAGAATGGCTTTTACATTTTTAAATGGTTGGGAAAGAAAAAAAAAGAAGTAGTAGATTTTGTAGCATGTGATGTAAGTAATGTAAAACTTAAATTCCAGTATCCATAAATAAAGTTTTATGAGAACAGA(SEQIDNO:2)。
在某些实施例中，所靶向的p38蛋白包括以下所示的或在GenBank登录NP_002742.3中公开的p38激酶(丝裂原活化的蛋白激酶11亚型1，智人)的氨基酸序列：
MSGPRAGFYRQELNKTVWEVPQRLQGLRPVGSGAYGSVCSAYDARLRQKVAVKKLSRPFQSLIHARRTYRELRLLKHLKHENVIGLLDVFTPATSIEDFSEVYLVTTLMGADLNNIVKCQALSDEHVQFLVYQLLRGLKYIHSAGIIHRDLKPSNVAVNEDCELRILDFGLARQADEEMTGYVATRWYRAPEIMLNWMHYNQTVDIWSVGCIMAELLQGKALFPGSDYIDQLKRIMEVVGTPSPEVLAKISSEHARTYIQSLPPMPQKDLSSIFRGANPLAIDLLGRMLVLDSDQRVSAAEALAHAYFSQYHDPEDEPEAEPYDESVEAKERTLEEWKELTYQEVLSFKPPEPPKPPGSLEIEQ(SEQ IDNO:3)。
在某些实施例中，所靶向的p38基因、cDNA、mRNA或编码序列包括以下所示的或在GenBank登录NM_002751.6中公开的p38-β核酸序列，或其互补体：
CGCCGCCTCCGCCGCCCTCCGCTCCGCTCGGCTCGGGCTCGGCTCGGGCGCGGGCGCGGGGCGCGGGGCTGGGCCCGGGCGGAGCGGCGGCTGCTCCGGACATGTCGGGCCCTCGCGCCGGCTTCTACCGGCAGGAGCTGAACAAGACCGTGTGGGAGGTGCCGCAGCGGCTGCAGGGGCTGCGCCCGGTGGGCTCCGGCGCCTACGGCTCCGTCTGTTCGGCCTACGACGCCCGGCTGCGCCAGAAGGTGGCGGTGAAGAAGCTGTCGCGCCCCTTCCAGTCGCTGATCCACGCGCGCAGAACGTACCGGGAGCTGCGGCTGCTCAAGCACCTGAAGCACGAGAACGTCATCGGGCTTCTGGACGTCTTCACGCCGGCCACGTCCATCGAGGACTTCAGCGAAGTGTACTTGGTGACCACCCTGATGGGCGCCGACCTGAACAACATCGTCAAGTGCCAGGCGCTGAGCGACGAGCACGTTCAATTCCTGGTTTACCAGCTGCTGCGCGGGCTGAAGTACATCCACTCGGCCGGGATCATCCACCGGGACCTGAAGCCCAGCAACGTGGCTGTGAACGAGGACTGTGAGCTCAGGATCCTGGATTTCGGGCTGGCGCGCCAGGCGGACGAGGAGATGACCGGCTATGTGGCCACGCGCTGGTACCGGGCACCTGAGATCATGCTCAACTGGATGCATTACAACCAAACAGTGGATATCTGGTCCGTGGGCTGCATCATGGCTGAGCTGCTCCAGGGCAAGGCCCTCTTCCCGGGAAGCGACTACATTGACCAGCTGAAGCGCATCATGGAAGTGGTGGGCACACCCAGCCCTGAGGTTCTGGCAAAAATCTCCTCAGAACACGCCCGGACATATATCCAGTCCCTGCCCCCCATGCCCCAGAAGGACCTGAGCAGCATCTTCCGTGGAGCCAACCCCCTGGCCATAGACCTCCTTGGAAGGATGCTGGTGCTGGACAGTGACCAGAGGGTCAGTGCAGCTGAGGCACTGGCCCACGCCTACTTCAGCCAGTACCACGACCCCGAGGATGAGCCAGAGGCCGAGCCATATGATGAGAGCGTTGAGGCCAAGGAGCGCACGCTGGAGGAGTGGAAGGAGCTCACTTACCAGGAAGTCCTCAGCTTCAAGCCCCCAGAGCCACCGAAGCCACCTGGCAGCCTGGAGATTGAGCAGTGAGGTGCTGCCCAGCAGCCCCTGAGAGCCTGTGGAGGGGCTTGGGCCTGCACCCTTCCACAGCTGGCCTGGTTTCCTCGAGAGGCACCTCCCACACTCCTATGGTCACAGACTTCTGGCCTAGGACCCCTCGCCTTCAGGAGAATCTACACGCATGTATGCATGCACAAACATGTGTGTACATGTGCTTGCCATGTGTAGGAGTCTGGGCACAAGTGTCCCTGGGCCTACCTTGGTCCTCCTGTCCTCTTCTGGCTACTGCACTCTCCACTGGGACCTGACTGTGGGGTCCTAGATGCCAAAGGGGTTCCCCTGCGGAGTTCCCCTGTCTGTCCCAGGCCGACCCAAGGGAGTGTCAGCCTTGGGCTCTCTTCTGTCCCAGGGCTTTCTGGAGGACGCGCTGGGGCCGGGACCCCGGGAGACTCAAAGGGAGAGGTCTCAGTGGTTAGAGCTGCTCAGCCTGGAGGTAGGGGGCTGTCTTGGTCACTGCTGAGACCCACAGGTCTAAGAGGAGAGGCAGAGCCAGTGTGCCACCAGGCTGGGCAGGGACAACCACCAGGTGTCAAATGAGAAAAGCTGCCTGGAGTCTTGTGTTCACCCGTGGGTGTGTGTGGGCACGTGTGGATGAGCGTGCACTCCCCGTGTTCATATGTCAGGGCACATGTGATGTGGTGCGTGTGAATCTGTGGGCGCCCAAGGCCAGCAGCCATATCTGGCAAGAAGCTGGAGCCGGGGTGGGTGTGCTGTTGCCTTCCCTCTCCTCGGTTCCTGATGCCTTGAGGGGTGTTTCAGACTGGCGGCTCCAGTGGGCCAAAGGGCAACCACATGAGCATGGGCAGGGGCTTTCTCCTTGGATGTGGGACCCACAGCAGCTTCCTGAGGCTGGGGGTGGGTGGGTGGGTGGTTTGGCCTTGAGGACGCTAGGGCAGGCAGCACACCTGGATGTGGACTTGGACTCGGACACTTCTGCCCTGCACCCTGGCCCGCTCTCTACCTCTGCCCACCGTTGTGGCCCTGCAGCCGGAGATCTGAGGTGCTCTGGTCTGTGGGTCAGTCCTCTTTCCTTGTCCCAGGATGGAGCTGATCCAGTAACCTCGGAGACGGGACCCTGCCCAGAGCTGAGTTGGGGGTGTGGCTCTGCCCTGGAAAGGGGGTGACCTCTTGCCTCGAGGGGCCCAGGGAAGCCTGGGTGTCAAGTGCCTGCACCAGGGGTGCACAATAAAGGGGGTTCTCTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:4)。
在某些实施例中，本文所公开的包括使细胞、组织、器官或受试者与p38抑制剂接触的方法被实践以抑制或降低DUX4或一个或多个DUX4下游基因的表达或活性。在某些实施例中，DUX4或DUX4下游基因是人类基因。例如，DUX4双同源盒4(智人)基因可以包括以下所示的或在GenBank登录NG_034189.2中公开的核苷酸序列，或其互补体：
ATGGCCCTCCCGACACCCTCGGACAGCACCCTCCCCGCGGAAGCCCGGGGACGAGGACGGCGACGGAGACTCGTTTGGACCCCGAGCCAAAGCGAGGCCCTGCGAGCCTGCTTTGAGCGGAACCCGTACCCGGGCATCGCCACCAGAGAACGGCTGGCCCAGGCCATCGGCATTCCGGAGCCCAGGGTCCAGATTTGGTTTCAGAATGAGAGGTCACGCCAGCTGAGGCAGCACCGGCGGGAATCTCGGCCCTGGCCCGGGAGACGCGGCCCGCCAGAAGGCCGGCGAAAGCGGACCGCCGTCACCGGATCCCAGACCGCCCTGCTCCTCCGAGCCTTTGAGAAGGATCGCTTTCCAGGCATCGCCGCCCGGGAGGAGCTGGCCAGAGAGACGGGCCTCCCGGAGTCCAGGATTCAGATCTGGTTTCAGAATCGAAGGGCCAGGCACCCGGGACAGGGTGGCAGGGCGCCCGCGCAGGCAGGCGGCCTGTGCAGCGCGGCCCCCGGCGGGGGTCACCCTGCTCCCTCGTGGGTCGCCTTCGCCCACACCGGCGCGTGGGGAACGGGGCTTCCCGCACCCCACGTGCCCTGCGCGCCTGGGGCTCTCCCACAGGGGGCTTTCGTGAGCCAGGCAGCGAGGGCCGCCCCCGCGCTGCAGCCCAGCCAGGCCGCGCCGGCAGAGGGGATCTCCCAACCTGCCCCGGCGCGCGGGGATTTCGCCTACGCCGCCCCGGCTCCTCCGGACGGGGCGCTCTCCCACCCTCAGGCTCCTCGCTGGCCTCCGCACCCGGGCAAAAGCCGGGAGGACCGGGACCCGCAGCGCGACGGCCTGCCGGGCCCCTGCGCGGTGGCACAGCCTGGGCCCGCTCAAGCGGGGCCGCAGGGCCAAGGGGTGCTTGCGCCACCCACGTCCCAGGGGAGTCCGTGGTGGGGCTGGGGCCGGGGTCCCCAGGTCGCCGGGGCGGCGTGGGAACCCCAAGCCGGGGCAGCTCCACCTCCCCAGCCCGCGCCCCCGGACGCCTCCGCCTCCGCGCGGCAGGGGCAGATGCAAGGCATCCCGGCGCCCTCCCAGGCGCTCCAGGAGCCGGCGCCCTGGTCTGCACTCCCCTGCGGCCTGCTGCTGGATGAGCTCCTGGCGAGCCCGGAGTTTCTGCAGCAGGCGCAACCTCTCCTAGAAACGGAGGCCCCGGGGGAGCTGGAGGCCTCGGAAGAGGCCGCCTCGCTGGAAGCACCCCTCAGCGAGGAAGAATACCGGGCTCTGCTGGAGGAGCTTTAGGACGCGGGGTTGGGACGGGGTCGGGTGGTTCGGGGCAGGGCGGTGGCCTCTCTTTCGCGGGGAACACCTGGCTGGCTACGGAGGGGCGTGTCTCCGCCCCGCCCCCTCCACCGGGCTGACCGGCCTGGGATTCCTGCCTTCTAGGTCTAGGCCCGGTGAGAGACTCCACACCGCGGAGAACTGCCATTCTTTCCTGGGCATCCCGGGGATCCCAGAGCCGGCCCAGGTACCAGCAGGTGGGCCGCCTACTGCGCACGCGCGGGTTTGCGGGCAGCCGCCTGGGCTGTGGGAGCAGCCCGGGCAGAGCTCTCCTGCCTCTCCACCAGCCCACCCCGCCGCCTGACCGCCCCCTCCCCACCCCCACCCCCCACCCCCGGAAAACGCGTCGTCCCCTGGGCTGGGTGGAGACCCCCGTCCCGCGAAACACCGGGCCCCGCGCAGCGTCCGGGCCTGACACCGCTCCGGCGGCTCGCCTCCTCTGCGCCCCCGCGCCACCGTCGCCCGCCCGCCCGGGCCCCTGCAGCCTCCCAGCTGCCAGCACGGAGCGCCTGGCGGTCAAAAGCATACCTCTGTCTGTCTTTGCCCGCTTCCTGGCTAGACCTGCGCGCAGTGCGCACCCCGGCTGACGTGCAAGGGAGCTCGCTGGCCTCTCTGTGCCCTTGTTCTTCCGTGAAATTCTGGCTGAATGTCTCCCCCCACCTTCCGACGCTGTCTAGGCAAACCTGGATTAGAGTTACATCTCCTGGATGATTAGTTCAGAGATATATTAAAATGCCCCCTCCCTGTGGATCCTATAG(SEQ ID NO:5)。
例如，DUX4双同源盒4[智人]mRNA基因可以包括以下所示的或在GenBank登录NM_001293798.2中公开的核苷酸序列，或其互补体：
ATGGCCCTCCCGACACCCTCGGACAGCACCCTCCCCGCGGAAGCCCGGGGACGAGGACGGCGACGGAGACTCGTTTGGACCCCGAGCCAAAGCGAGGCCCTGCGAGCCTGCTTTGAGCGGAACCCGTACCCGGGCATCGCCACCAGAGAACGGCTGGCCCAGGCCATCGGCATTCCGGAGCCCAGGGTCCAGATTTGGTTTCAGAATGAGAGGTCACGCCAGCTGAGGCAGCACCGGCGGGAATCTCGGCCCTGGCCCGGGAGACGCGGCCCGCCAGAAGGCCGGCGAAAGCGGACCGCCGTCACCGGATCCCAGACCGCCCTGCTCCTCCGAGCCTTTGAGAAGGATCGCTTTCCAGGCATCGCCGCCCGGGAGGAGCTGGCCAGAGAGACGGGCCTCCCGGAGTCCAGGATTCAGATCTGGTTTCAGAATCGAAGGGCCAGGCACCCGGGACAGGGTGGCAGGGCGCCCGCGCAGGCAGGCGGCCTGTGCAGCGCGGCCCCCGGCGGGGGTCACCCTGCTCCCTCGTGGGTCGCCTTCGCCCACACCGGCGCGTGGGGAACGGGGCTTCCCGCACCCCACGTGCCCTGCGCGCCTGGGGCTCTCCCACAGGGGGCTTTCGTGAGCCAGGCAGCGAGGGCCGCCCCCGCGCTGCAGCCCAGCCAGGCCGCGCCGGCAGAGGGGATCTCCCAACCTGCCCCGGCGCGCGGGGATTTCGCCTACGCCGCCCCGGCTCCTCCGGACGGGGCGCTCTCCCACCCTCAGGCTCCTCGCTGGCCTCCGCACCCGGGCAAAAGCCGGGAGGACCGGGACCCGCAGCGCGACGGCCTGCCGGGCCCCTGCGCGGTGGCACAGCCTGGGCCCGCTCAAGCGGGGCCGCAGGGCCAAGGGGTGCTTGCGCCACCCACGTCCCAGGGGAGTCCGTGGTGGGGCTGGGGCCGGGGTCCCCAGGTCGCCGGGGCGGCGTGGGAACCCCAAGCCGGGGCAGCTCCACCTCCCCAGCCCGCGCCCCCGGACGCCTCCGCCTCCGCGCGGCAGGGGCAGATGCAAGGCATCCCGGCGCCCTCCCAGGCGCTCCAGGAGCCGGCGCCCTGGTCTGCACTCCCCTGCGGCCTGCTGCTGGATGAGCTCCTGGCGAGCCCGGAGTTTCTGCAGCAGGCGCAACCTCTCCTAGAAACGGAGGCCCCGGGGGAGCTGGAGGCCTCGGAAGAGGCCGCCTCGCTGGAAGCACCCCTCAGCGAGGAAGAATACCGGGCTCTGCTGGAGGAGCTTTAGGACGCGGGGTCTAGGCCCGGTGAGAGACTCCACACCGCGGAGAACTGCCATTCTTTCCTGGGCATCCCGGGGATCCCAGAGCCGGCCCAGGTACCAGCAGACCTGCGCGCAGTGCGCACCCCGGCTGACGTGCAAGGGAGCTCGCTGGCCTCTCTGTGCCCTTGTTCTTCCGTGAAATTCTGGCTGAATGTCTCCCCCCACCTTCCGACGCTGTCTAGGCAAACCTGGATTAGAGTTACATCTCCTGGATGATTAGTTCAGAGATATATTAAAATGCCCCCTCCCTGTGGATCCTATAG(SEQ ID NO:6)。
在特定实施例中，DUX4多肽序列如下所示或在GenBank登录NP_001280727.1中公开：
MALPTPSDSTLPAEARGRGRRRRLVWTPSQSEALRACFERNPYPGIATRERLAQAIGIPEPRVQIWFQNERSRQLRQHRRESRPWPGRRGPPEGRRKRTAVTGSQTALLLRAFEKDRFPGIAAREELARETGLPESRIQIWFQNRRARHPGQGGRAPAQAGGLCSAAPGGGHPAPSWVAFAHTGAWGTGLPAPHVPCAPGALPQGAFVSQAARAAPALQPSQAAPAEGISQPAPARGDFAYAAPAPPDGALSHPQAPRWPPHPGKSREDRDPQRDGLPGPCAVAQPGPAQAGPQGQGVLAPPTSQGSPWWGWGRGPQVAGAAWEPQAGAAPPPQPAPPDASASARQGQMQGIPAPSQALQEPAPWSALPCGLLLDELLASPEFLQQAQPLLETEAPGELEASEEAASLEAPLSEEEYRALLEEL(SEQ ID NO:7)。
DUX4下游基因或靶标的序列是本领域已知的，并且说明性DUX4下游基因由如下所示的登录号提供：
MBD3L2：
基因组核苷酸登录NC_000019.10(7049340..7051735)
mRNA核苷酸登录NM_144614.3
蛋白多肽登录NP_653215.2
ZSCAN4：
NC_000019.10(57651497..57679152)
NM_152677.2
NP_689890.1
LEUTX：
NC_000019.10(39776594..39786135)
NM_001143832.1
NP_001137304.1
PRAMEF2：
NC_000001.11(12857086..12861909)
NM_023014.1
NP_075390.1
TRIM43：
NC_000002.12(95592018..95599723)
NM_138800.2
NP_620155.1
KHDC1L：
NC_000006.12(73223544..73225452，互补体)
NM_001126063.2
NP_001119535.1
确定生物样品(例如，组织)中p38、DUX4或DUX4下游基因或多肽的表达水平的方法是本领域已知的，并且包含例如RT-PCR和FACS。
在一个实施例中，一种降低细胞、组织、器官或受试者的DUX4 mRNA(例如，DUX4-fl)、DUX4多肽或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达的方法包括使细胞、组织、器官或受试者与导致活性p38蛋白(本文中也称为p38抑制剂，例如p38-α和/或p38-β的抑制剂)的量减少的药剂接触。在某些实施例中，所述药剂抑制p38蛋白的表达或活性。在某些实施例中，所述药剂使p38蛋白(例如，p38-α和/或p38-β)的降解增加。在特定实施例中，细胞或组织与一定量的有效降低细胞或组织中DUX4多肽或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达或活性的药剂接触。在某些实施例中，细胞或组织与一定量的有效降低细胞或组织中活性p38蛋白的量的药剂接触。在特定实施例中，细胞是肌细胞。在某些实施例中，细胞是终末分化的，例如终末分化的肌细胞。在一些实施例中，与对照细胞中的表达水平相比，所述细胞中的DUX4多肽或由下游靶基因编码的多肽的表达水平增加。在某些实施例中，细胞与面肩肱型肌营养不良症(FSHD)，任选地FSHD1或FSHD2相关。例如，细胞可以源自于或获自诊断患有FSHD的受试者的细胞或组织。可以在体外或体内实践本文公开的方法。
在一个实施例中，本公开提供了一种减少细胞或组织的细胞凋亡的方法，所述方法包括使细胞或组织与抑制p38蛋白的表达或活性的药剂(本文也称为p38抑制剂)接触，例如，p38-α和/或p38-β抑制剂。在特定实施例中，细胞或组织与一定量的有效降低细胞或组织中DUX4多肽或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达或活性的药剂接触。在某些实施例中，细胞或组织与一定量的有效降低细胞或组织中活性p38蛋白的量的药剂接触。在特定实施例中，细胞是肌细胞。在某些实施例中，细胞是终末分化的，例如终末分化的肌细胞。在一些实施例中，与对照细胞中(即，治疗前)的表达水平相比，所述细胞中的DUX4多肽或由下游靶基因编码的多肽的表达水平增加。在某些实施例中，细胞与面肩肱型肌营养不良症(FSHD)，任选地FSHD1或FSHD2相关。例如，细胞可以源自于或获自诊断患有FSHD的受试者的细胞或组织。可以在体外或体内实践本文公开的方法。
在相关方面，本公开包含一种治疗或预防有需要的受试者的与DUX4蛋白或DUX4的下游靶基因的活性或表达增加相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者提供有效量的包括减少受试者或受试者的某些细胞或组织中的活性p38蛋白(例如，p38-α和/或p38-β)的量的药剂的药物组合物。在一些实施例中，所述药剂抑制p38蛋白(例如，p38-α和/或p38-β)的表达或活性。在某些实施例中，所述药剂诱导p38蛋白降解。在某些实施例中，所述药剂抑制p38蛋白的活性，例如抑制p38蛋白的激酶活性。在所述方法的任何一种方法的特定实施例中，p38抑制剂降低受试者的细胞或组织中DUX4和/或一个或多个DUX4下游基因的表达。
在本文公开的治疗方法的特定实施例中，所述疾病或病症选自FSHD1、FSHD2、免疫缺陷、着丝粒不稳定和面部异常综合征(ICF)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、包涵体肌炎(IBM)、尤文氏肉瘤、软组织肉瘤、横纹肌肉瘤以及成人和儿童B细胞急性淋巴细胞白血病。
在本文公开的方法中的任何一种方法的特定实施例中，受试者被诊断患有FSHD1或FSHD2，并且在某些实施例中，受试者包括与FSHD1和/或FSHD2相关的一个或多个基因突变。在某些实施例中，所述受试者包括D4Z4基因座处减少的阻遏。
在本文公开的方法中的任何一种方法的某些实施例中，基于转录活性DUX4的存在，受试者被鉴定为患有FSHD。在另一个实施例中，基于相对于健康对照表达水平增加的一个或多个下游基因(例如，ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15和/或ZNF280A)表达水平的存在，受试者被鉴定为患有FSHD。在另一个实施例中，基于转录活性DUX4的存在和一个或多个DUX4下游基因(例如，ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15和/或ZNF280A)的增加的表达水平，受试者被鉴定为患有FSHD。
在另一个实施例中，所述方法可以包含测量施用p38激酶抑制剂之前受试者的DUX4和DUX4下游基因(例如，DUX4、ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A)中的一种或多种的表达水平。所述方法进一步包含确定受试者需要治疗，条件是DUX4和DUX4下游基因(例如，DUX4、ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15和ZNF280AKHDC1L)中的一种或多种的表达水平相对于健康对照升高。
在另一个实施例中，所述方法可以包含测量施用p38激酶抑制剂之前和之后受试者的细胞中DUX4和DUX4下游基因(例如，WO4、ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A)中的一种或多种的表达水平。所述方法可以包含将施用p38激酶抑制剂之前和之后受试者的DUX4和DUX4下游基因(例如，DUX4、ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A)中的一种或多种的表达水平进行比较。所述方法可以包含通过比较施用p38激酶抑制剂之前和之后DUX4和DUX4下游基因(例如，DUX4、ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15和ZNF280A)中的一种或多种的表达水平来确定治疗有效性，其中一种或多种表达水平的降低指示有效治疗。
在一些实施例中，p38激酶抑制剂减少一个或多个选自以下的下游基因：ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15和ZNF280A。
在一个实施例中，DUX4和下游基因ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15和ZNF280A的转录调节子被p38激酶抑制。
在特定实施例中，受试者包括4q35AD4Z4阵列的收缩，使得受试者包括≤10或≤7个重复序列(FSHD1)。在某些实施例中，受试者或受试者的一个或多个细胞或组织在染色体4q35的亚端粒区中包括一个或多个大卫星D4Z4重复序列的缺失，任选地其中所述细胞在染色体4q35的亚端粒区中包括<7个大卫星D4Z4重复序列。在某些实施例中，受试者在含柔性铰链域的染色体结构维持1(SMCHD1)基因中包括一个或多个突变。在某些实施例中，受试者包括至少一个未缺失的4qA等位基因。在某些实施例中，受试者包括至少一个未缺失的4qA等位基因和SMCHD1突变(FSHD2)。在一些实施例中，受试者被束缚在轮椅上(例如，CSS4.5和5)。在某些实施例中，在治疗期间或治疗后，受试者表现出肌肉退化的量或速率减少或降低，例如诊断患有FSHD1或FSHD2的受试者。在某些实施例中，在治疗期间或治疗后，受试者表现出由脂肪替代的骨骼肌减少，例如如通过定量MRI确定的，例如减少了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或至少70％。在某些实施例中，在治疗期间或治疗后，受试者在以下临床结果评估中的一项或多项中表现出有益的证据：
·如通过具有/不具有重量的可达工作空间(RWS)测量的肩/臂功能；
·通过起立行走试验(TUG)或类似测定测量的移动性；
·患者日常生活活动(ADL)和生活质量(QOL)报告；以及
·如通过肌力测定法测量的定量骨骼肌强度。
在一些实施例中，受试者在开始或中止治疗后的至少一段时间(例如，至少一周、一个月、两个月、六个月或一年)内表现出这些改善中的任何一种改善。
另一方面，本公开提供了使用p38抑制剂(例如，p38-α或p38-β抑制剂)治疗FSHD1、FSHD2、ICF以及在如ALS和IBM中发现的类似病理变化的疾病(Tawil等人，2014)的公开方法。
在本文描述的方法中的任何一种方法的特定实施例中，药物组合物经胃肠外提供给受试者。
在本文描述的方法中的任何一种方法的特定实施例中，药物组合物被提供到受试者的肌肉组织。
在一些某些实施例中，本文所述的包括向受试者提供p38抑制剂的方法中的任何一种方法可以进一步包括向受试者提供另外的疗法。
在特定实施例中，另外的疗法包括临床管理。在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗或预防FSHD1、FSHD2、ICF、ALS、IBM、尤文氏肉瘤、软组织肉瘤、横纹肌肉瘤以及成人和儿童B细胞急性淋巴细胞白血病的方法，其中p38抑制剂用于降低DUX4和/或下游基因和/或蛋白表达和/或活性并且可以与涉及物理疗法、有氧运动、呼吸功能疗法和/或矫形介入的临床管理组合。
在特定实施例中，另外的疗法包括向受试者提供一种或多种肌肉生长抑制素抑制剂、抗炎剂或基因疗法载体，例如以通过控制D4Z4甲基化、抑制DUX4mRNA和/或抑制DUX4信号传导途径来减少FSHD中致病性DUX4蛋白的产生。在一个实施例中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的FSHD1、FSHD2、ICF、ALS或IBM的方法，其中p38抑制剂(例如，p38-α或p38-β抑制剂)用于降低DUX4和下游基因和/或蛋白表达并且可以与肌肉生长抑制素抑制剂、抗炎剂和/或基因疗法组合，例如以通过控制D4Z4甲基化、抑制DUX4 mRNA和抑制DUX4途径来降低FSHD中致病性DUX4蛋白的产生。在某些实施例中，使用p38抑制剂和肌肉生长抑制素抑制剂来实践所述方法。在某些实施例中，可以使用特定肌肉生长抑制素途径抑制剂，所述肌肉生长抑制素途径抑制剂通过直接结合肌肉生长抑制素(Fstl3、卵泡抑制素、肌肉生长抑制素抗体、GASP1、肌肉生长抑制素前肽、核心蛋白聚糖肽、ActRIIB-Fc)或通过结合其受体复合物(ActRIIB抗体)在细胞外起作用，以阻断肌肉生长抑制素与其受体复合物接合并使下游信号传导活化。肌肉生长抑制素抑制剂中的一些抑制剂是天然存在的(肌肉生长抑制素前肽、Gasp1、卵泡抑制素、Fstl3)，而其它的是工程化的(肌肉生长抑制素抗体、ActRIIB抗体、ActRIIB-Fc)。
在特定实施例中，另外的疗法包括向受试者提供DUX4或DUX4下游靶或基因抑制剂(例如，抑制DUX-4fl mRNA和/或DUX4蛋白的表达(或DUX4下游靶的mRNA或蛋白的表达)的抑制剂)或抑制DUX4活性(例如，其作为转录活化物的活性或DUX4下游靶的活性)的抑制剂。在特定实施例中，抑制剂诱导DUX4多肽或DUX4下游靶多肽的降解。在特定实施例中，抑制剂是特异性结合DUX4或DUX4下游靶基因的核酸序列或其反义序列的siRNA、miRNA、gRNA、shRNA或反义寡核苷酸。在一个实施例中，本发明提供了一种治疗FSHD1、FSHD2、ICF、ALS或IBM的方法，其中p38抑制剂用于减少DUX4和下游基因和蛋白表达，并且可以与DUX4或DUX4下游靶抑制剂组合，例如，针对DUX4和/或一种或多种DUX4下游靶转录物(例如，DNA或mRNA)的小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、向导RNA(gRNA)、微RNA(miRNA)和反义寡核苷酸。
在某些实施例中，本发明提供了一种使用p38激酶的小分子抑制剂(例如，p38-α或p38-β抑制剂)降低FSHD骨骼肌肌管中的DUX4和下游基因表达以治疗FSHD或本文公开的和/或与异常DUX4表达或活性相关的任何其它疾病或病症的方法。
在一些实施例中，p38(例如，p38-α和/或p38-β)被本文公开的小分子或其它药剂中的任何一种所抑制。
本文所述的p38抑制剂和/或其它药剂和组合物(例如，抑制剂)可以以适合于所期望施用途径(例如，肠胃外或口服施用)的任何方式调配。在一些实施例中，使药剂或组合物与细胞和/或组织接触是向受试者施用或提供药剂或组合物的结果。在一些实施例中，药剂或组合物(例如，p38抑制剂)被施用至少1、2、3、4、5、10、15、20次或更多次。在联合疗法的一些实施例中，施用第一药剂或组合物之后施用第二药剂或组合物，或者与施用第二药剂或组合物重叠或同时进行。第一药剂和第二药剂或组合物可以相同或者可以不同。在一些实施例中，第一药剂和第二药剂或组合物由相同的执行者和/或在相同的地理位置施用。在一些实施例中，第一药剂和第二药剂或组合物由不同的执行者和/或在不同的地理位置施用。在一些实施例中，本文所述的多种药剂作为单一组合物施用。
根据本文所公开的方法，多种施用方法可以与p38抑制剂结合使用。例如，p38抑制剂可以例如通过局部、口服、腹腔内、静脉内、动脉内、经皮、舌下、肌内、直肠、经颊、鼻内、脂质体、经吸入、***、眼球内、经局部递送(例如通过导管或支架)、皮下、脂肪内、关节内、鞘内、经粘膜、肺部或肠胃外施用或联合施用，例如通过注射，包含皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、囊内、包膜下、眶内、腹膜内、气管内、皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内；通过植入贮库或储库，例如皮下或肌内。
“受试者”包含动物(例如，哺乳动物、猪、鱼、鸟、昆虫等)。在一些实施例中，受试者是哺乳动物，具体地灵长类动物，尤其是人类。在一些实施例中，受试者是家畜，如牛、绵羊、山羊、奶牛、猪等；家禽，如鸡、鸭、鹅、火鸡等；以及家养动物，如狗和猫。在一些实施例中(例如，具体地在研究环境中)，受试者是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠)、兔子、灵长类动物或猪，如近交系猪等。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
“组织”是一起执行特定功能的来自同一来源的类似细胞的集合。在某些实施例中，组织是肌肉组织。
本文所公开的方法可以用能够抑制p38基因或蛋白的表达或活性的任何药剂实践，例如p38-α或p38-β基因或蛋白抑制剂，包含但不限于本文公开的那些药剂中的任何一种药剂。
在特定实施例中，例如，与未与p38抑制剂接触的对照细胞或组织中的表达水平或活性或与参考水平相比，本文公开的方法导致(例如，受试者体内的)细胞或组织中的DUX4和/或一个或多个DUX4下游基因的表达水平或活性降低。“降低”是指例如与参考水平相比降低至少5％，例如，至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。降低还意味着例如与参考或对照细胞或组织的水平相比降低至少1倍，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1000倍或更多倍。
本文所述的方法可以使用任何类型的导致例如细胞或组织(例如，受试者的细胞或组织)中活性p38蛋白的量或水平降低的抑制剂来实践。在特定实施例中，p38抑制剂使得与p38抑制剂接触的细胞或组织中的活性p38蛋白(例如，活性p38-α和/或p38-β)减少、总p38蛋白(例如，总p38-α和/或p38-β蛋白)减少、p38mRNA(例如，p38-α和/或p38-βmRNA)减少和/或p38蛋白活性(例如，p38-α和/或p38-β激酶活性)降低。在特定实施例中，p38抑制剂使p38-α和/或p38-β信号传导途径活性或表达降低。在某些实施例中，相比于没有与p38抑制剂接触的相同类型的细胞或组织中的水平，减少至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。测量细胞中总p38蛋白或mRNA水平或p38激酶活性的方法是本领域已知的。在某些实施例中，抑制剂抑制或降低p38活性或表达，例如mRNA和/或蛋白质表达。在某些实施例中，抑制剂使p38蛋白的降解增加，从而导致细胞或组织中的p38蛋白的量较少。特定方法还可以采用DUX4或DUX4下游基因的任何类型的表达或活性抑制剂。在某些情况下，抑制剂抑制p38-α和p38-β蛋白两者，而在其它情况下，抑制剂选择性地或优先地抑制p38-α或p38-β。在某些实施例中，抑制剂不抑制p38-γ。
可以用于实践所公开的方法的抑制剂包含但不限于抑制或降低生物分子(例如，蛋白或核酸)的表达或活性的药剂，如但不限于p38-α或p38-β基因、mRNA或蛋白。在某些实施例中，抑制剂可以使生物分子的降解增加。在特定实施例中，抑制剂可以通过竞争性、无竞争性或非竞争性方式抑制生物分子。示例性抑制剂包含但不限于核酸、DNA、RNA、gRNA、shRNA、siRNA、经过修饰的mRNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、蛋白质、蛋白质模拟物、肽、肽模拟物、抗体、小分子、小有机分子、无机分子、化学品、例如涉及信号转导的模拟酶、受体或其它蛋白质的结合位点的类似物、治疗剂、药物组合物、药物以及这些的组合。在一些实施例中，抑制剂可以是核酸分子，包含但不限于减少细胞中的功能蛋白的量的siRNA。因此，被称为“能够抑制”特定蛋白质(例如，p38)的化合物或药剂包括任何类型的抑制剂。在某些实施例中，p38抑制剂或DUX4或DUX4下游靶基因的抑制剂是本文公开的不同种类的抑制剂中的任何一种抑制剂或任何其它抑制剂。
在特定实施例中，p38抑制剂(或其它抑制剂)包括与p38基因(例如，MAPK14或MAPK11基因)或mRNA(或其它靶基因或mRNA)结合的核酸。因此，核酸抑制剂可以包括与靶多核苷酸序列互补的序列(例如，本文所公开的p38-α序列或其区域)或其反义。在特定实施例中，核酸抑制剂包括至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少20个、至少24个或至少30个对应于或与靶多核苷酸序列或其反义互补的核苷酸序列。
在某些实施例中，核酸抑制剂是当施用于细胞时降低靶基因的表达的RNA干扰或反义RNA药剂或其部分或模拟物或吗啉代。典型地，核酸抑制剂包括靶核酸分子的至少一部分或其直系同源物，或者包括靶核酸分子的互补链的至少一部分。在一些实施例中，靶基因的表达减少了10％、25％、50％、75％或甚至90-100％。
“互补”核酸序列是能够与包含互补核苷酸碱基对的另一个核酸序列杂交的核酸序列。“杂交”意指在合适的严格条件下在互补核苷酸碱基之间形成双链分子(例如，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)形成碱基对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)也是如此)的对。(参见例如Wahl,G.M.和S.L.Berger(1987)《酶学方法(MethodsEnzymol.》152:399；Kimmel,A.R.(1987)《酶学方法》152:507)。
“反义”是指与核酸序列互补的核酸序列，无论其长度如何。在某些实施例中，反义RNA是指单链RNA分子，所述单链RNA分子可以被引入到单个细胞、组织或受试者中并通过不依赖于内源性基因沉默途径的机制使靶基因的表达降低。反义核酸可以含有经过修饰的骨架，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其它物质，或者可以含有非天然的核苷间键。反义核酸可以包括例如锁定的核酸(LNA)。
如本文所使用的，“RNA干扰”是指使用通过内源性基因沉默途径(例如，Dicer和RNA诱导的沉默复合物(RISC))降解靶mRNA而降低靶基因的表达的药剂。RNA干扰可以使用各种药剂来实现，包含shRNA和siRNA。“短发夹RNA”或“shRNA”是指可以用于通过RNA干扰(RNAi)使靶基因表达沉默的双链的、具有发夹弯的人工RNA分子。细胞中的shRNA的表达通常通过质粒的递送或通过病毒或细菌载体来完成。shRNA是RNAi的有利介体，因为其具有相对低的降解和转换率。小干扰RNA(siRNA)是一类双链RNA分子，通常长度为20-25个碱基对，类似于miRNA，并在RNA干扰(RNAi)途径内运作。其通过在转录后降解mRNA来干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达，从而阻止转译。在某些实施例中，siRNA的长度为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸，并且在其3'端处具有2个碱基突出端。siRNA可以被引入到单独细胞和/或培养***中，并导致靶mRNA序列降解。如本文所使用的，“吗啉代”是指经过修饰的核酸寡聚体，其中标准核酸碱基与吗啉环结合并通过磷酸二酰胺键连接。类似于siRNA和shRNA，吗啉代与互补mRNA序列结合。然而，吗啉代通过立体抑制mRNA转译和改变mRNA剪接而非靶向互补mRNA序列进行降解来发挥作用。
在某些实施例中，核酸抑制剂是可以引入到细胞中的信使RNA，其中其对p38或本文公开的其它靶标的多肽抑制剂进行编码。在特定实施例中，例如通过并入一种或多种经过修饰的核苷来修饰mRNA，以增加其稳定性或降低其免疫原性。合适的修饰是本领域已知的。
在某些实施例中，抑制剂包括对p38或本文公开的其它靶标的多核苷酸或多肽抑制剂进行编码的表达盒。在特定实施例中，表达盒存在于基因疗法载体中，例如病毒基因疗法载体。多种基因疗法载体(包含病毒基因疗法载体)是本领域已知的，包含例如基于AAV的基因疗法载体。
在一些实施例中，抑制剂是多肽抑制剂。在特定实施例中，多肽抑制剂与如p38等靶多肽结合，从而抑制其活性，例如激酶活性。多肽抑制剂的实例包含任何类型的多肽(例如，肽和蛋白质)，如抗体和其片段。
抗体是能够通过位于Ig分子的可变区中的至少一个表位识别位点特异性结合靶标的免疫球蛋白(Ig)分子，如碳水化合物、多核苷酸、脂质或多肽。如本文所使用的，所述术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖其片段(如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链(scFv))、其合成变体、天然存在的变体、包括具有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白、嵌合抗体、纳米抗体以及包括具有所需特异性的抗原结合位点或片段的免疫球蛋白分子的任何其它经过修饰的构型。
“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。此部分优选地含有参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个核苷酸或氨基酸。抗体的“功能片段”是维持抗体的一种或多种活性的片段，例如，其结合相同的表位和/或具有抗体的生物活性。在特定实施例中，功能性片段包括抗体中存在的六种CDR。
在某些实施例中，抑制剂诱导靶多肽(例如，p38蛋白)降解。例如，抑制剂包含蛋白水解靶向性嵌合体(PROTAC)，所述蛋白水解靶向性嵌合体诱导靶蛋白的选择性细胞内蛋白水解。PROTAC包含功能结构域，所述功能结构域可以是共价连接的蛋白质结合分子：一种能够与E3泛素连接酶接合，而另一种则与用于降解的靶蛋白结合。E3连接酶向靶蛋白的募集导致泛素化和随后蛋白酶体对靶蛋白的降解。在特定实施例中，抑制剂是靶向p38蛋白(例如，p38-α和/或p38-β)的PROTAC。
在某些实施例中，抑制剂是小分子抑制剂或其立体异构体、对映异构体、非对映异构体、同位素富集的前药或药学上可接受的盐。在特定实施例中，p38抑制剂抑制p38-α和/或p38-β。在特定实施例中，其未显著抑制p38-γ。在特定实施例中，p38的小分子抑制剂包含但不限于本文公开的小分子化合物中的任何一种小分子化合物，包含但不限于图12B所示的那些。多种p38抑制剂是已知的且可获得的，并且一些正在临床开发中。可以使用这些抑制剂中的任何一种抑制剂。这些包含但不限于ARRY-797、VX-745、VX-702、RO-4402257、SCIO-469、BIRB-796、SD-0006、PH-797804、AMG-548、LY2228820、SB-681323和GW-856553。说明性抑制剂化合物还包含但不限于：
N-(4-(2-乙基-4-(间甲苯基)噻唑-5-基)吡啶-2-基)苯甲酰胺；
2-(2,4-二氟苯基)-6-(1-(2,6-二氟苯基)脲基)烟酰胺；
6-(2,4-二氟苯氧基)-8-甲基-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮；
6-(2,4-二氟苯氧基)-2-((1,5-二羟基戊-3-基)氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮；
(R)-6-(2-(4-氟苯基)-6-(羟甲基)-4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-2-(邻甲苯基)哒嗪-3(2H)-酮；
6-(5-(环丙基氨基甲酰基)-3-氟-2-甲基苯基)-N-新戊基烟酰胺；
5-(2-(叔丁基)-4-(4-氟苯基)-1H-咪唑-5-基)-3-新戊基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-胺；
2-(6-氯-5-((2R,5S)-4-(4-氟苄基)-2,5-二甲基哌嗪-1-羰基)-1-甲基-1H-吲哚-3-基)-N,N-二甲基-2-氧代乙酰胺；
1-(3-(叔丁基)-1-(对甲苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(4-(2-吗啉代乙氧基)萘-1-基)脲；
4-((5-(环丙基氨基甲酰基)-2-甲基苯基)氨基)-5-甲基-N-丙基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-甲酰胺；
3-(3-溴-4-((2,4-二氟苄基)氧基)-6-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)-基)-N,4-二甲基苯甲酰胺；
1-(3-(叔丁基)-1-(对甲苯基)-1H-吡唑-5-基)-3-(5-氟-2-((1-(2-羟乙基)-1H-吲唑-5-基)氧基)苄基)脲；
8-(2,6-二氟苯基)-2-((1,3-二羟基丙-2-基)氨基)-4-(4-氟-2-甲基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮；
5-(2,6-二氯苯基)-2-((2,4-二氟苯基)硫代)-6H-嘧啶并[1,6-b]哒嗪-6-酮；
(5-(2,4-二氟苯氧基)-1-异丁基-1H-吲唑-6-基)((2-(二甲基氨基)乙基)-12-氮烷二基)甲酮；以及
(R)-2-((2,4-二氟苯基)氨基)-7-(2,3-二羟基丙氧基)-10,11-二氢-5H-二苯并[a,d][7]轮烯-5-酮。
本发明的某些抑制剂化合物可以以立体异构形式存在(例如，其可以含有一个或多个不对称碳原子或者可以表现出顺式-反式异构)。一些化合物可能包含多于一个不对称碳原子。“立体异构体”是指关于一个或多个不对称碳原子朝向(R/S)不同或关于双键朝向(顺式:反式)不同的化合物。术语立体异构体还可以涵盖阻转异构体，所述阻转异构体由例如在具有经过取代的联苯部分的化合物中围绕单键的受阻旋转产生。“对映异构体”是一种作为另一种化合物的镜像的化合物，即，对映异构体的所有不对称碳原子相对于另一种化合物以相反的朝向(R/S)存在。“非对映异构体”是一种不是另一种化合物的镜像但包含相对于另一种化合物以相反的朝向(R/S)存在的一个或多个不对称碳原子的化合物。本发明的实施例可以包含立体异构体的混合物，或者可以包含单一立体异构体。单一对映异构体或非对映异构体可以从手性试剂开始，或通过立体选择性或立体特异性合成技术来制备。可替代地，单一对映异构体或非对映异构体可以通过标准手性色谱或结晶技术从混合物中分离。“同位素富集”是指其中一个或多个原子富集有超出其天然丰度的同位素的化合物。例如，氘的自然丰度为0.015％。本领域的普通技术人员认识到，在所有具有H原子的化合物中，H原子实际上代表H和D的混合物，其中约0.015％是D。同位素富集化合物可以具有一个或多个特异性化学位点，其中H/D比率大于0.015％。同位素富集化合物可以被称为同位素标记的。
在某些实施例中，抑制剂包括基因编辑***的一种或多种组分。如本文所使用的，术语“基因编辑***”是指当被引入到细胞中时能够修饰内源性DNA序列的靶基因座的蛋白质、核酸或其组合。许多适用于在本发明的方法中使用的基因编辑***是本领域已知的，包含但不限于锌指核酸酶***、TALEN***和CRISPR/Cas***。
在一些实施例中，在本文所述的方法中使用的基因编辑***是成簇规律间隔性短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)核酸酶***，所述***是基于可以用于哺乳动物基因组工程的细菌***的工程化核酸酶***。通常，所述***包括CRISPR相关的核酸内切酶(例如，Cas核酸内切酶)和向导RNA(gRNA)。gRNA包含两部分；对靶基因组DNA序列具有特异性的crispr-RNA(crRNA)以及促进核酸内切酶在所靶向的***位点处与DNA结合的反式活化RNA(tracrRNA)。在一些实施例中，crRNA和tracrRNA可以存在于相同的RNA寡核苷酸中，称为单个向导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，crRNA和tracrRNA可以作为单独的RNA寡核苷酸存在。在此类实施例中，gRNA包含缔合形成crRNA:tracrRNA双链体的crRNA寡核苷酸和tracrRNA寡核苷酸。如本文所使用的，术语“向导RNA”或“gRNA”是指作为sgRNA或crRNA:tracrRNA双链体存在的tracrRNA和crRNA的组合。
在一些实施例中，CRISPR/Cas***包括Cas蛋白、crRNA和tracrRNA。在一些实施例中，crRNA和tracrRNA组合为双链体RNA分子以形成gRNA。在一些实施例中，crRNA:tracrRNA双链体在引入到细胞之前在体外形成。在一些实施例中，将crRNA和tracrRNA作为单独的RNA分子引入到细胞中，并且然后在细胞内形成crRNA:tracrRNA双链体。在一些实施例中，提供了对crRNA和tracrRNA进行编码的多核苷酸。在此类实施例中，将对crRNA和tracrRNA进行编码的多核苷酸引入到细胞中，并且然后在细胞内转录crRNA和tracrRNA分子。在一些实施例中，crRNA和tracrRNA由单个多核苷酸编码。在一些实施例中，crRNA和tracrRNA由单独的多核苷酸编码。
在一些实施例中，Cas核酸内切酶通过gRNA的crRNA部分的序列特异性指向靶***位点，其可以包含靶***位点附近的前间隔基序(PAM)序列。适用于与特定核酸内切酶(例如，Cas9核酸内切酶)一起使用的多种PAM序列是本领域已知的(参见例如《自然方法(NatMethods)》2013年11月；10(11):1116-1121和《科学报告(Sci Rep.)》2014；4:5405)。
gRNA对靶基因座的特异性由crRNA序列介导，所述序列包括具有约20个核苷酸的序列，所述序列与靶基因座处的DNA序列互补，例如与p38-α或p-38-βDNA序列互补。在一些实施例中，在本发明的方法中使用的crRNA序列与靶基因座的DNA序列至少90％互补。在一些实施例中，在本发明的方法中使用的crRNA序列与靶基因座的DNA序列至少95％、96％、97％、98％或99％互补。在一些实施例中，在本发明的方法中使用的crRNA序列与靶基因座(例如，MAPK14或MAPK11基因)的DNA序列100％互补。在一些实施例中，本文所述的crRNA序列被设计成使用本领域已知的算法(例如，Cas-OFF查找器)使脱靶结合最小化，以鉴定对于特定靶基因座或靶基因而言唯一的靶序列。
在一些实施例中，核酸内切酶是Cas蛋白或直系同源物。在一些实施例中，核酸内切酶是Cas9蛋白。在一些实施例中，Cas9蛋白源自于酿脓链球菌(Streptococcus pyogene)(例如，SpCas9)、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如，SaCas9)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitide)(NmeCas9)。在一些实施例中，Cas核酸内切酶是Cas9蛋白或Cas9直系同源物，并且选自由SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF2、SpCas9-HF3、SpCas9-HF4、SaCas9、FnCpf、FnCas9、eSpCas9和NmeCas9组成的组。在一些实施例中，核酸内切酶选自由以下组成的组：C2C1、C2C3、Cpf1(也称为Cas12a)、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3和Csf4。在一些实施例中，Cas9是Cas9切口酶突变体。Cas9切口酶突变体仅包括一个催化活性结构域(HNH结构域或RuvC结构域)。
在特定方面，本公开包含组合物，例如包括p38抑制剂的药物组合物，包含本文所述的各种类型的抑制剂中的任何一种抑制剂。本发明涵盖包括p38抑制剂和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物。通常用作载剂或稀释剂的任何惰性赋形剂可以用于本发明的组合物中，如糖、多元醇、可溶性聚合物、盐和脂质。可以采用的糖和多元醇包含但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇。可以采用的可溶性聚合物的实例是聚氧乙烯、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮和葡聚糖。有用的盐包含但不限于氯化钠、氯化镁和氯化钙。可以采用的脂质包含但不限于脂肪酸、甘油脂肪酸酯、糖脂和磷脂。
另外，药物组合物可以进一步包括粘合剂(例如，***胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆胶、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交联维酮、瓜尔胶、羧基乙酸淀粉钠、初凝胶(Primogel))、不同pH和离子强度的缓冲液(例如，tris-HCL、乙酸盐、磷酸盐)、防止吸附到表面的添加剂(如白蛋白或明胶)、洗涤剂(例如，Tween 20、Tween 80、PluronicF68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)、渗透促进剂、增溶剂(例如，甘油、聚乙烯甘油、环糊精)、助流剂(例如，二氧化硅胶体)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基羟基茴香醚)、稳定剂(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(例如，卡波姆胶、二氧化硅胶体、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如，蔗糖、阿斯巴甜、柠檬酸)、调味剂(例如，薄荷、水杨酸甲酯或橙色调味剂)、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如，硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、流动性助剂(例如，二氧化硅胶体)、增塑剂(例如，邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如，卡波姆胶、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠)、聚合物涂层(例如，泊洛沙姆或泊洛沙明)、涂层和成膜剂(例如，乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或助剂。
在一个实施例中，药物组合物与保护p38抑制剂免于从体内快速消除的载剂一起制备，如控释调配物，包含植入物和微囊化的递送***。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类调配物的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。这些材料还可以从Alza公司(AlzaCorporation)和Nova制药公司(Nova Pharmaceuticals,Inc)商购获得。脂质体悬浮液(包含靶向受感染细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载剂。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如如美国专利第4,522,811号中所描述的。
此外，本发明涵盖包括p38抑制剂的任何固体或液体物理形式的药物组合物。例如，p38抑制剂可以呈结晶形式、无定形形式，并且具有任何粒径。颗粒可以是微粉化的，或者可以是附聚的颗粒、粉末、油、油性悬浮液或任何其它形式的固体或液体物理形式。
当p38抑制剂表现出溶解度不足时，可以使用用于使化合物溶解的方法。此类方法对于本领域的技术人员是已知的，并且包含但不限于：pH调节和盐形成；使用共溶剂，如乙醇、丙二醇、聚乙二醇(PEG)300、PEG400、DMA(10-30％)、DMSO(10-20％)、NMP(10-20％)；使用表面活性剂，如聚山梨酯80、聚山梨酯20(1-10％)、cremophor EL、Cremophor RH40、Cremophor RH60(5-10％)、Pluronic F68/泊洛沙姆188(20-50％)、Solutol HS15(20-50％)、维生素E TPGS和d-a-生育酚PEG1000琥珀酸盐(20-50％)；使用络合，如HPβCD和SBEβCD(10-40％)；以及使用先进的方法，如胶束、添加聚合物、纳米颗粒悬浮液和脂质体形成。
p38抑制剂还可以以缓释剂型施用或联合施用。p38抑制剂可以呈以适合所用施用途径的方式调配的气体、液体、半液体或固体形式。对于口服施用，合适的固体口服调配物包含片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、团粒、小袋和泡腾剂、粉剂等。合适的液体口服调配物包含溶液、悬浮液、分散体、糖浆剂、乳剂、油等。对于肠胃外施用，通常使用冻干粉的重构。
用于治疗本文所述疾病或病症的p38抑制剂的合适剂量可以由相关领域的技术人员确定。通常通过基于从动物研究得出的初步证据的人类剂量范围研究来确定治疗剂量。剂量应当足以产生预期的治疗效果，而不会造成不必要的副作用。本领域的技术人员还可以很好地使用和调整施用方式、剂型和合适的药物赋形剂。在本专利申请的范围内设想了所有变化和修改。
在某些实施例中，本公开包含药物组合物的单位剂型，所述药物组合物包括抑制p38多肽的表达或活性(或导致活性p38蛋白的水平降低)的药剂以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂，其中所述单位剂型有效降低施用所述单位剂型的受试者的一个或多个组织中DUX4多肽或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达。在某些实施例中，下游靶基因是MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43或KHDC1L。在某些实施例中，下游靶基因是RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、KHDC1L、ZSCAN4、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A。在某些实施例中，组织是肌肉组织。在某些实施例中，组织是终末分化的，例如终末分化的肌肉组织。在某些实施例中，组织包括包含与面肩肱型肌营养不良症(FSHD)相关的突变的细胞。在特定实施例中，药剂结合p38多肽(例如，p38-α或p38-β)或结合对p38多肽进行编码的多核苷酸。在某些实施例中，药剂包括以下或由以下组成：核酸，任选地DNA、RNA、经过修饰的mRNA(mmRNA)、shRNA、siRNA、向导RNA(gRNA)、微RNA(miRNA)或反义寡核苷酸。在其它实施例中，药剂包括以下或由以下组成：多肽，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。在其它实施例中，药剂包括：小分子，任选地有机分子或无机分子。在其它实施例中，试剂包括基因表达盒，任选地基因疗法载体，所述基因表达盒表达抑制p38多肽的表达或活性的多核苷酸或多肽剂。
在特定实施例中，单位剂型包括有效量、有效浓度和/或抑制浓度的用于治疗与DUX4和/或下游DUX4靶基因的增加的活性或表达相关的疾病或病症(包含本文公开的疾病或病症中的任何一种，例如FSHD)的p38抑制剂。
“药物组合物”包含能够被施用或递送给受试者和/或细胞以预防和/或治疗特定疾病或病症的一种或多种药剂的组合物。
“药学上可接受的”在本文中是指在合理医学判断范围内的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，这些是适合用于与人类和动物组织接触使用而没有过多的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。
“药学上可接受的载剂”包含但不限于已经被美国食品药物管理局(UnitedStates Food and Drug Administration)批准为可接受用于人类或家畜的任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂和/或乳化剂。示例性药学上可接受的载剂包含但不限于：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂、蜡、动植物油脂、石蜡、有机硅、膨润土、硅酸、氧化锌；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、以及大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇类，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及在药物调配物中采用的任何其它相容性物质。除了在任何常规介质和/或药剂与本发明的药剂不相容的范围内之外，设想了其在治疗组合物中的用途。补充性活性成分也可以并入到组合物中。
如本文所使用的，“有效量”是指有效实现特定效果的药剂的量，例如减少细胞、组织、器官或受试者的DUX4-fl mRNA或DUX4蛋白或一个或多个DUX4下游靶的mRNA或蛋白。在对受试者进行治疗处理的情况下，有效量可以是例如有效或足以减轻受试者(例如，患有FSHD的受试者)的一种或多种疾病症状的量。在某些实施例中，与治疗前或未治疗的量相比，减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。
如本文所使用的，“有效浓度”是指产生特定生理效应所需的药剂和/或组合物的最小浓度(质量/体积)。如本文所使用的，有效浓度通常是指增加、活化和/或增强特定生理效应所需的药剂的浓度。
“抑制浓度”是指抑制特定生理效应所需的药剂的最小浓度(质量/体积)。如本文所使用的，抑制浓度通常是指降低、抑制和/或阻遏特定生理效应所需的药剂的浓度。
在一些实施例中，本文所述的药剂或化合物可以以约1mg/kg到约300mg/kg的剂量施用。在另一个实施例中，本文所述的药剂或化合物可以以约1mg/kg到约20mg/kg的剂量施用。例如，可以以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg或在前述值的任何值之间的范围内(例如，介于约10mg/kg与约15mg/kg之间，介于约6mg/kg与约12mg/kg之间等)的剂量将药剂或化合物施用于受试者。在另一个实施例中，本文所述的药剂或化合物可以以≤15mg/kg的剂量施用。例如，药剂或化合物可以以每天15mg/kg的剂量施用7天，每周共计105mg/kg。例如，化合物可以以每天两次，每次10mg/kg的剂量施用7天，每周共计140mg/kg。
在许多实施例中，本文所述的剂量可以指单一剂量、每日剂量或每周剂量。在一个实施例中，药剂或化合物可以每天施用一次。在另一个实施例中，化合物可以每天施用两次。在一些实施例中，药剂或化合物可以每天施用三次。在一些实施例中，化合物可以每天施用四次。在一些实施例中，本文所述的药剂或化合物可以每周施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次。在其它实施例中，化合物每两周施用一次。
在一些实施例中，本文所述的药剂或化合物可以口服施用。在一些实施例中，本文所述的药剂或化合物可以以每天一次≤15mg/kg的剂量口服施用。
所采用的实际剂量可以根据患者的需求和所治疗病状的严重程度而变化。确定用于特定情况的合适的剂量方案在本领域技术范围内。为了方便起见，可以将每日总剂量分成几份，并根据需要在一天中分批施用。
利用所公开化合物的剂量方案是根据多种因素选择的，包含患者的类型、种类、年龄、体重、性别和医疗状况；待治疗病状的严重程度；施用途径；患者的肾或肝功能；以及所采用的具体公开的化合物。具备本领域的普通技术的医师或兽医可以容易地确定并开出有效量的预防、对抗、或阻止病状进展所需的药物。
本发明的化合物和/或其药学上可接受的盐的施用量和施用频率将根据主治医师对考虑如患者的年龄、病状和大小以及所治疗症状的严重程度等因素的判断进行调控。
在一些方面，本发明涉及用于使用小分子和/或基因组工具(例如，小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸和基因***毒)进行筛选以鉴定药物靶标的方法，所述方法降低了FSHD肌管中的DUX4和下游转录物MBD3L2的表达和/或活性。在特定实施例中，所述方法包括使包括FSHD细胞(例如，包括FSHD1和/或FSHD2缺陷(例如，突变)的细胞)的肌管与一种或多种候选药剂接触，并且然后确定与候选药剂接触的肌管的DUX4活性是否降低、DUX4 mRNA或蛋白水平是否降低、由DUX4调控的一种或多种下游基因的活性是否降低；或者相较于仅与阴性对照(例如，媒剂)接触的肌管的水平，由DUX4调控的一种或多种下游基因的水平是否降低。然后鉴定与DUX4和/或DUX4下游基因的活性或表达水平降低相关的候选药剂，并且可以鉴定其调节的靶标。例如，在siRNA的情况下，与DUX4和/或DUX4下游靶基因表达降低相关的siRNA的基因靶标被鉴定为用于治疗与DUX4和/或下游DUX4靶基因的异常表达相关的疾病或病症(包含本文所述的那些中的任何一种，例如FSHD)的药物靶标。类似地，在小分子的情况下，与DUX4和/或DUX4下游靶基因的活性或表达降低相关的小分子的药物靶标被鉴定为用于治疗与DUX4和/或下游DUX4靶基因的异常表达相关的疾病或病症(包含本文所述的那些中的任何一种，例如FSHD)的药物靶标。在某些实施例中，所述方法可以通过评估肌管的物理或定性性质来实践，以鉴定候选药剂和其靶标，所述候选药剂和其靶标可以用于改善肌管的物理或定性性质，从而将靶标鉴定为用于治疗与DUX4和/或下游DUX4靶标基因的异常表达相关的疾病或病症(包含本文所述的那些中的任何一种，例如FSHD)的治疗靶标。
在某些实施例中，本公开包含鉴定抑制DUX4蛋白的表达或抑制由DUX4的下游基因靶标编码的蛋白的表达的药剂的方法，所述方法包括：使由与面肩肱型肌营养不良症(FSHD)相关的细胞制备的肌管与候选药剂接触；以及确定肌管中的DUX4蛋白、对DUX4蛋白进行编码的多核苷酸、DUX4的下游基因靶标或对DUX4的下游基因靶标进行编码的多核苷酸的表达水平，其中如果与肌管中的DUX4蛋白或由下游基因靶标编码的蛋白的表达水平相比，接触后确定的表达水平降低，则候选药剂被鉴定为抑制DUX4蛋白或由下游基因靶标编码的蛋白的表达的药剂，所述肌管由与FSHD相关、未与候选药剂接触或与阴性对照药剂接触的细胞制备。
在本文描述的方法中的任何一种方法的某些实施例中，候选药剂可以是本文公开的任何种类的抑制剂，包含小分子、多肽和核酸，例如，其中候选药剂包括以下或由以下组成：核酸，任选地DNA、RNA、gRNA、shRNA、miRNA、siRNA或反义寡核苷酸；多肽，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物、基因疗法载体或抗体或其功能片段；或小分子，任选地有机分子或无机分子。
在所述方法中的任何一种方法的某些实施例中，下游靶基因是例如MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43或KHDC1L。在某些实施例中，下游靶基因是例如ZSCAN4、LEUTX、PRAMEF2、TRIM43、MBD3L2、KHDC1L、RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6或PRAMEF15。
在某些实施例中，本文描述的方法中的任何一种方法都是通过筛选潜在候选药剂的文库来执行的。在某些实施例中，使用高通量测定来执行所述方法。
在某些实施例中，使用成熟的患者源性FSHD肌管来执行所述方法。
在一个实施例中，小分子文库用于筛选FSHD肌管中的DUX4或下游靶基因表达或活性的靶标修饰物。治疗前三天，将细胞以每孔15,000个细胞平板接种于涂有明胶的96孔板中，所述孔板具有FBS和Pen/Strep(吉博科公司(Gibco)，15140148)为20％的骨骼肌生长培养基(普乐思尔公司(PromoCell)，C-23060)。治疗当天，将培养基更换为补充有20％敲除血清替代物(吉博科公司，10828010)的骨骼肌细胞分化培养基(普乐思尔公司，C-23061)或NbActiv4培养基(BrainBits Nb4-500)和Pen/Strep。以所期望的浓度将p38调节剂添加到含有分化FSHD肌管的培养基中，并在温育箱中培养3-4天。从温育箱中移除肌管，并使用RNeasy微型加试剂盒(凯杰公司(Qiagen)目录号/ID：74034)提取RNA。用提取的RNA制备cDNA用于Taqman基因表达分析，以测量DUX4或下游靶基因表达。POL2RA转录物用作内源性对照。
实例
以下实例中描述的研究使用以下描述的材料和方法执行。
缩写
ASO 反义寡核苷酸
DAPI 4',6-二氨基-2-苯基吲哚(二盐酸盐)
DMSO 二甲亚砜
DUX4 双同源盒4
DUX4-fl 双同源盒4全长
FSHD 面肩肱型肌营养不良症
gRNA 向导RNA
MBD3L2 甲基CpG结合域蛋白3样2
MHC 肌球蛋白重链
MPAK14 丝裂原活化蛋白激酶14
mRNA 信使RNA
MYOG 成肌素(成肌因子4)
pHSP27 磷酸化热休克蛋白27
PCR 聚合酶链反应
pLAM 聚腺苷酸化信号序列
POLR2A RNA聚合酶II亚单元A
qPCR 定量聚合酶链反应
RNA 核糖核酸
sgRNA 单向导RNA
siRNA 小干扰RNA
一般材料和方法
人骨骼肌成肌细胞：
FTCE-00016-01(永生化的FSDH成肌细胞系，6.3个重复序列)以及等基因系A4对照健康正常成肌细胞和C12 FSHD成肌细胞用于所有研究(如Mamchaoui等人,2011；Thorley等人,2016所描述的)。R.Tawil提供了四种不同的原发性患者成肌细胞系，即FTCE-016、FTCE-020、FTCE-197、FTCE-196。示出FSHD成肌细胞通过使染色体4q35上的D4Z4去甲基化来表达异常DUX4。
包含的培养基组分和组织培养材料：
补充有15％FBS(海克隆公司(Hyclone)，SH30071)和Pen/Strep(吉博科公司，15140148)的骨骼肌生长培养基(普乐思尔公司，C-23160)。NbActiv4(BrainBits Nb4-500)和Pen/Strep(分化培养基)。EmbryoMax0.1％明胶溶液(默克密理博公司(EMDmillipore)ES-006-B)。PBS(吉博科公司，10010023)、组织培养物处理的96孔微板(康宁公司(Corning)，CLS3595)、TC处理的多孔细胞培养板(福尔肯公司(Falcon)，353046)。
实时PCR试剂和试剂盒：
裂解缓冲液-罗氏实时准备裂解缓冲液19.5μL(20μL)(罗氏公司(Roche)，07248431001)、DNAseI(艾莫宾公司(Ambion)，AM2222)0.25μL、保护RNase抑制剂(罗氏公司，3335402001)0.25μL、RNeasy微试剂盒(凯杰公司，74004)、Taqman Preamp预混合液(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)，4391128)、Taqman复用预混合液(赛默飞世尔科技公司，4484262)、ZSCAN4 Taqman测定(赛默飞世尔科技公司，Hs00537549_m1，FAM-MGB)、MYOGTaqman测定(赛默飞世尔科技公司，Hs01072232_m1，JUN-QSY)、RPLP0 Taqman测定(赛默飞世尔科技公司，Hs99999902_m1)以及LEUTXTaqman测定(赛默飞世尔科技公司，Hs00418470_m1)。
反义寡核苷酸(ASO)：
ASO购自Exiqon：FTSE-000001(来自Exiqon的DUX4ASO，CAGCGTCGGAAGGTGG(SEQ IDNO:18)，300610))、非靶向ASO(Exiqon，AACACGTCTATACGC(SEQ ID NO:19)，300610)。
组织培养皿的明胶涂层：
在处理前三天进行，通过将1g明胶(例如，西格玛(Sigma)G9391)和1L组织培养级水组合来制备0.1％明胶溶液；高压灭菌持续30分钟以溶解并灭菌。使用无菌移液管涂施足以覆盖培养皿的0.1％明胶，然后吸出溶液，并将培养皿风干并在室温下储存。
细胞平板接种：
在处理前三天进行，将每孔10,000个细胞平板接种于明胶化的96孔板上，或将100,000个细胞平板接种于明胶化的6孔板上。
反义寡核苷酸和化合物处理：
对于ASO或化合物处理，将细胞平板接种到含有在所描述的浓度下的ASO或化合物的100μL普乐思尔公司的生长培养基中。
骨骼肌肌管分化：
在第0天，培养基变成分化培养基。从温育箱中移除板并吸出生长培养基，用PBS洗涤板一次，对于96孔板用100μL洗涤，对于6孔板用1mL洗涤，分别向96孔板或6孔板每孔添加100μL或2mL分化培养基。添加所期望浓度的反义寡核苷酸或药物，并将板放回温育箱中并温育3-4天。
RNA制备：
从培养箱中移除细胞并吸出培养基。遵循以下方案之一快速裂解细胞：对于96孔板中的裂解，根据以下描述的方案执行直接裂解和一步式RT-PreampqPCR。对于每个96孔，制备含有以下的混合液：19.5μL罗氏实时准备裂解缓冲液、0.25μL RNAse抑制剂、0.25μLDNAseI(来自赛默，不是试剂盒中所包含的)。向每个孔添加20μL的混合液，混合5次并且在室温下温育5分钟，或者可替代地剧烈摇动持续15分钟。在显微镜下观察到裂解。将样品在-80℃下冷冻至少15分钟。
qPCR一步式：
对于qPCR，以1:10稀释细胞裂解物，并且将2μL用于10μL一步式RT-qPCR反应，以检测GAPDH、RPLP0、TBP、MYOG、FRG1、MYH3、ACTN2等。按照10μL反应，反应混合物包含：2μL RNA(1:10稀释裂解物)、5μL快速高级Taqman预混合液(2X)、0.25μL RT酶混合液(40X)、0.5μLTaqman探针组(20X)和2.25μLH20。在QuantStudio7上运行以下反应方案：在48℃下持续15分钟，在50℃下持续2分钟，在95℃下持续30秒，40x，在95℃下持续5秒，在60℃下持续30秒，之后如由制造商(赛默)所指定的读取板。
1步RT-预扩增用于检测DUX4下游基因，即MBD3L2、ZSCAN4、LEUTX、TRIM43、KHDC1L，并且POL2RA-VIC用作内源性对照。按照10μL反应，反应混合物包含：2.25μL RNA(1:10稀释裂解物)、5μL Taqman Pre-Amp预混合液(2X)、0.25μL RT酶混合液(40X)、2.5μL Taqman探针组(0.2X)*。*为了汇集TaqMan测定，使用等体积的每个20×
Figure BDA0002524043640000411
基因表达测定，并且组合多达100个测定。例如，为了汇集50个TaqMan测定，将每种测定的10μL组合在微量离心管中。使用1×TE缓冲液稀释汇集的TaqMan测定，使得每种测定的最终浓度为0.2×。对于上述实例，将500μL1×TE缓冲液添加到汇集的TaqMan测定中，最终总体积为1mL。QuantStudio7方案在48℃下使用15分钟，在95℃下使用10分钟，使用10个循环：在95℃下使用15秒，在60℃下使用4分钟，并且在4℃下不限时间。然后将样品稀释到50μL，并继续进行qPCR步骤。按照10μL反应，反应混合物包含：2μL Preamp稀释液、5μL快速高级Taqman预混合液(2X)、0.5μL Taqman探针组(20X)和2.5μLH20。复用时，将体积调整到总计10μL。在QuantStudio7上运行了以下程序：在50℃下持续2分钟，在95℃下持续30秒，40x，在95℃下持续5秒，在60℃下持续30秒，并且按照制造商的说明书(赛默)读取板。
用于使用RNeasy微加试剂盒从肌管中提取总RNA的方法：
在6孔板中，添加450μL缓冲液RLT Plus。通过将裂解液转移到置于2mL收集管(已供应)中的gDNA消除器旋转柱上将裂解液匀浆，以≥8000x g(≥10,000rpm)使柱离心30秒并且然后丢弃柱，同时保留流通液。将250μL乙醇(最终为35％)添加到流通液中，并通过移液(未离心)充分混合。然后将样品(包含可能已形成的任何沉淀物)转移到置于2mL收集管(已供应)中的RNeasy MinElute旋转柱中。然后以≥8000x g使柱离心15秒。丢弃或收集流通液以进行蛋白质沉淀。将700μL缓冲液RW1添加到RNeasy MinElute旋转柱中，以≥8000xg使柱离心15秒，之后丢弃流通液。通过将10μL DNAseI与70μL的缓冲液RDD轻轻混合来进行DNAse处理，并且将所得溶液直接添加到柱中，将所述柱在室温下温育20分钟。然后，将700μL缓冲液RW1(按照制造商的说明书)添加到RNeasy MinElute旋转柱，并以≥8000x g使柱离心15秒，并且丢弃流通液。将500μL缓冲液RPE添加到RNeasy MinElute旋转柱中，以≥8000xg使柱离心15秒，之后丢弃流通液。将500μL的80％乙醇添加到RNeasy MinElute旋转柱中，以≥8000x g使柱离心2分钟以便洗涤旋转柱膜，并将收集管随流通液丢弃。将RNeasyMinElute旋转柱置于新的2mL收集管(已供应)中，全速离心5分钟以干燥膜，并且将收集管随流通液丢弃。将RNeasyMinElute旋转柱置于新的1.5mL收集管(已供应)中。将14μL不含RNase的水直接添加到旋转柱膜的中心，并使旋转柱膜全速离心1分钟以洗脱RNA。大约洗脱了12μL RNA。
使用由Himeda等人,2015描述的方法检测DUX4-fl：
cDNA制备.10μL反应包含1μL RNA(1μg)、0.5μL寡核苷酸dT、0.5μL 10mM dNTP和4.5μL H20。将反应样品在65℃下温育2分钟，并迅速移动到冰上，并在添加酶混合液之前保持至少1分钟，所述酶混合液包含2μL的5x第一链缓冲液、0.5μL的0.1M DTT、0.5μL的RNAse抑制剂、0.5μL的SSIV RT。将样品在55℃下温育20分钟，在80℃下温育10分钟，然后冷却至4℃。在10μL反应混合物中执行DUX4预扩增，所述反应混合物含有1μL的RT反应、2μL的5XGC缓冲液、0.8μL的DMSO、0.2μL的10mM dNTP、0.2μL的10μM TJ38F、0.2μL的10μM TJ40R、0.1μL的Phusion II DNApol和5.5μL的H20。在QuantStudio7上运行以下方案：在98℃下持续2分钟，在98℃下持续15秒，在64℃下持续20秒，在72℃下持续15秒以及在4℃下不限时间的10个循环。
在10μL反应中用嵌套引物执行DUX4 qPCR，所述反应含有1μL的DUX4预扩增DNA、5μL的2X IQ SYBR混合液、0.4μL的10μM TJ38F、0.4μL的10μM TJ41R和3.2μL H20。以下方案在QuantStudio7上运行：在:95℃下持续3分钟，在95℃下持续10秒，在64℃下持续15秒，在72℃下持续20秒，在86℃下持续10秒的40个循环，然后按照制造商的指示(赛默)在QuantStudio7上读取板。从QuantStudio实时PCR软件提取Ct值，并且使用POLR2A作为管家基因，使用Genedata来计算相对表达水平。
RNAseq方法：
通过用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)检查，来自Illumina的40bp单端读段具有良好的质量。使用TopHatv2.1.1将读数映射到hg19(Kim等人，2013)，其中选项为“solexa1.3-quals”模式和“no-novel-juncs”。通过将呈gtf格式的已知基因与kgXref表合并来创建TopHat的基因模型。从hg19组装中的UCSC表浏览器下载已知基因和kgXref两者。读段计数使用来自Subread包的特征计数功能获得，其中链选项为-r2。读数用DESeq2进行归一化(Love等人，2014)。
FSHD肌管免疫细胞化学：
简而言之，将细胞固定于4％多聚甲醛中，并在室温下使其在4％低聚甲醛(PFA)中透化10分钟。在用含10％正常驴血清或3％BSA(NDS)的PBST封闭之前，将细胞用PBST(具有0.1％Triton X-100的1×PBS溶液)透化。然后在具有5％NDS的PBST中将细胞与适当稀释的一抗在室温下一起温育1小时或在4℃下一起温育12小时，在室温下用PBST洗涤3次，并且然后在具有5％NDS和DAPI的TBST中将其与所期望的二抗一起温育，以对细胞核进行复染。在分化的FSHD肌管中使用E5-5抗体通过免疫细胞化学检测DUX4。使用商业可得的抗体检测活化的半胱天冬酶-3(https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/cleaved-caspase-3-asp175-antibody/9661)。
RNAseq方法：
通过用FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)检查，来自Illumina的40bp单端读段具有良好的质量。使用TopHatv2.1.1将读段映射到hg19。通过将呈gtf格式的已知基因与kgXref表合并来创建TopHat的基因模型。从hg19组装中的UCSC表浏览器下载已知基因和kgXref两者。读段计数使用来自Subread包的特征计数功能获得，其中链选项为-r2。读段用DESeq2归一化。如在主成分分析中所建议的，在不同时间段处理的神经元样品中的生物学重复具有批效应。因此，使用Combat来减少这种批效应。计算标准RPKM表达值。总基因签名非常小，并以标准的统计临界值定义：86/19,799mRNA基因。DUX4调节的基因签名占总签名的大部分：77/86 mRNA基因＝90％。非DUX4调节的基因占总签名的少部分，所述总签名具有中等倍数变化：9/86 mRNA基因＝10％；2-2.7XlogFC。
用于siRNA和Cas9/sgRNA RNP转导FSHD肌管的方法：
合成crRNA购自赛默飞世尔科技公司，并且退火到tracrRNA根据说明书执行。简而言之，将crRNA和tracrRNA以100μM重悬于TE缓冲液中、混合，并且在退火缓冲液中稀释5倍。按照制造商的建议，在ProFlex PCR***中执行退火。100ng的经过组装的crRNA：将tracrRNA与500ng TrueCut Cas9(赛默飞世尔科技公司，#A36497)在设置有Neon转染***试剂盒(赛默飞世尔科技公司，#MPK 10096)的重悬缓冲液中温育。温育15分钟后，根据所描述的方法，将反应用于转染50,000个成肌细胞。用于靶向MAPK14(3个sgRNA)和pLAM区的序列(DUX4的多聚腺苷酸化序列，4个gRNA)为：NT-CTRL，GTATTACTGATATTGGTGGG(SEQ ID NO:8)；MAPK14，GCTGAACAAGACAATCTGGG(SEQ ID NO:9)，CTGCTTTTGACACAAAAACG(SEQ ID NO:10)，CTTATCTACCAAATTCTCCG(SEQ ID NO:11)；pLAM，AGAATTTCACGGAAGAACAA(SEQ ID NO:12)，CAGGTTTGCCTAGACAGCGT(SEQ ID NO:13)，ATTAAAATGCCCCCTCCCTG(SEQ ID NO:14)，AATCTTCTATAGGATCCACA(SEQ ID NO:15)和siRNAMAPK14，反义：UAGAUUACUAGGUUUUAGGTC(SEQ ID NO:16)，正义：CCUAAAACCUAGUAAUCUATT(SEQ ID NO:17)。
体内材料和方法
用于PK/PD研究的大鼠：
雄性斯普拉-道来大鼠(6-8周龄)由(美国)山顶实验室动物公司(Hilltop LabAnimals,Inc.)供应。抵达Wuxi AppTec后，由兽医人员或其它指定人员对动物的总体健康状况进行评估。在研究开始前，动物适应至少2天(抵达WuXi AppTec后)。在适应期间和整个研究过程中，单独圈养动物。动物房间环境根据设施运行情况来控制(目标条件：温度20℃到26℃，相对湿度30％到70％，灯亮灯熄周期12小时)。灯光、温度和相对湿度由Amega View环境监控***持续监测。饮食(经认证的啮齿动物饮食#5002，PMI饲料公司(PMI Feeds,Inc.)，密苏里州布伦特伍德)为使用双层包装的辐照团粒；饮食批号和规格将记录在研究笔记本中，并存档在WuXi AppTec处。水(反渗透)随意地提供给动物。对水质进行了定期分析，并将结果存档在WuXi AppTec处。从检测水平来看，饮食或水中没有会干扰研究结果的已知污染物。在研究#FULTH-20171120中，大鼠在药物施用前禁食过夜：允许大鼠随时自由饮水，并在给药后4小时喂食。对于研究#FULTH-20171228，在整个研究过程中允许大鼠随意进食和饮水。
用于异种移植研究的小鼠：
雄性NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ(Nod-Rag)小鼠(6-8周龄)由(美国)马里兰大学VR繁殖集落供应。动物圈养在马里兰大学霍华德厅的UMB中央动物设施中。在适应期间(4-5天)，在整个移植程序中和整个药物治疗研究期间，动物被分组圈养(4只/笼)。动物房间环境根据设施运行情况来控制(目标条件：温度20℃到26℃，相对湿度30％到70％，灯亮灯熄周期12小时)。灯光、温度和相对湿度由AmegaView环境监控***持续监测。在研究过程中随意提供饮食(实验室饮食5P76 22.5％蛋白质啮齿动物饲料)。随意提供无菌水。饮食或水中没有会干扰研究结果的已知污染物。
产生FSHD和对照异种移植小鼠：
通过将C6和A4 IPSC源性人永生化同基因成肌细胞系异种移植到大约8周龄雄性Nod-Rag小鼠的双侧胫前肌(TA)肌肉中来生成FSHD和对照小鼠。为了产生人肌肉异种移植物，通过对8周龄免疫缺陷的NRG小鼠的后肢进行X光照射来产生在小鼠后肢的TA内接种A4或C6细胞的生态位，以防止小鼠肌肉再生。一天后，沿每个TA的长度注射50μl的2％BaCl2溶液以消除小鼠肌肉组织。在小鼠组织消融后，将2x106 C6细胞注射到每个双侧TA区域中，并允许其发育四周。异种移植A4或C6细胞后，将动物暴露于4周的间歇性神经肌肉电刺激(iNMES)，以改善人类细胞的异种移植，如Sakellariou等人,2016所述。
测试品的调配和制备
准确称量适当量的FTX-1821，并将其与适当体积的赋形剂(0.5％(1％DMSO:99％甲基纤维素))在水中混合，以得到最终浓度为0.03mg/mL的均匀悬浮液。调配物在研究当天制备，并在制备后1小时内给药。给予动物的剂量体积为10mL/kg。从每种调配物中取两份20-50μL等分的给药溶液，并放在一旁以通过LC-MS/MS确定剂量准确性。
准确称量适当量的FTX-2865，并将其与适当体积的无菌0.9％注射用盐水混合，以获得最终浓度为1mg/mL的澄清溶液。调配物在研究当天制备，并使用10mL/kg的剂量体积给予动物。
FTX-1821测试品施用和PK/PD研究设计
FTX-1821的给药溶液(0.03mg/mL)以10mL/kg的剂量体积通过口服灌胃施用，以产生0.3mg/kg的最终剂量，遵循Wuxi设施SOP。由给药前测量的体重确定剂量体积。相应处理组的给药溶液浓度(mg/ML)、剂量体积(mL/kg)和最终剂量(mg/kg)记录在随附的excel研究表中。喂养条件：过夜禁食，给药后4小时恢复喂食。
FTX-2865测试品施用和异种移植研究设计
FTX-2865的给药溶液(1mg/mL)以10mL/kg的剂量体积通过IP注射施用，以产生10mg/kg的最终剂量(每剂)。以10mL/kg的剂量体积通过IP注射施用0.9％无菌生理盐水作为媒剂对照(每剂)。由早晨给药前测量的体重确定剂量体积。相应处理组的给药溶液浓度(mg/ML)、剂量体积(mL/kg)和最终剂量(mg/kg)记录在随附的excel研究表中。BID注射间隔大约12小时，以使目标覆盖率最大化。研究动物在8天内共接受了14次媒剂或FTX-2865注射，并在第8天早上最后一次注射后大约1小时处死。
样品收集：
用于PK的血液样品：在每个预定义的时间点，通过颈静脉或尾静脉获得大约100μl的血液样品。将血液样品置于用EDTA-K2作为阻凝剂处理的预冷收集管中，并放置在冰上直到离心。
用于PK评估的血浆收集：在半小时内，将PK血液样品在4℃、3000g下离心15分钟以收集血浆。将血浆样品储存在聚丙烯试管或96孔板中，在干冰上快速冷冻，并储存在-70℃下，直到进行LC/MS/MS分析。
用于PK和PD评估的肌肉收集：通过心脏穿刺进行血液收集后收集双侧胫骨前肌和斜方肌。迅速地分别对来自左右两侧的每块肌肉进行称重，并将其置于单独的试管中，然后在干冰上速冻。一侧的肌肉用于测量化合物浓度，而另一侧的肌肉则送给主办方进行PD分析。给药是交错进行的，使得在一天结束时大约同时进行样品收集。
用于PK分析的样品处理：
用于LC/MS分析的血浆样品制备：用150μL IS溶液蛋白质沉淀等分的10μL血浆样品(ACN中100ng/mL拉贝洛尔(Labetalol)和100ng/mL甲苯磺丁脲(Tolbutamide)和100ng/mL双氯芬酸)，将混合物充分涡旋混合，并在4℃下以4000rpm离心15分钟。将等分的80μL上清液转移到样品板上，并与80μL水混合，然后将所述板以800rpm摇动10分钟。然后注入1μL上清液以进行LC-MS/MS分析。用于LC/MS分析的肌肉样品制备：使用Omni珠均质器将肌肉样品在水中以1:4的比率(w/v)进行均质化。然后将匀浆用于测量药物浓度。用200μLIS溶液蛋白质沉淀等分的20μL肌肉组织匀浆(ACN中100ng/mL拉贝洛尔和100ng/mL甲苯磺丁脲和100ng/mL双氯芬酸)，将混合物充分涡旋混合，并在4℃下以4000rpm离心15分钟。将等分的80μL上清液转移到样品板上，并与80μL水混合，然后将所述板以800rpm摇动10分钟。然后注入0.3μL上清液以进行LC-MS/MS分析。
分析方法(LC/MS，非GLP)：
用于执行分析方法的技术细节包含：仪器：LCMS三重四极杆QTRAP 6500+(美国马萨诸塞州SCIEX)，基质：雄性SD大鼠血浆(EDTA-K2)，一种或多种内标物：100ng/mL拉贝洛尔和100ng/mL甲苯磺丁脲和100ng/mL双氯芬酸，在CAN，MS条件下ESI：FTX-1821的阳性SRM检测：[小鼠+人类]+m/z383.838>299.231；拉贝洛尔(IS)：[M+H]+M/z329.2/162.1；甲苯磺丁脲(IS)：[M+H]+m/z271.1/155；校准曲线：1.00-3000ng/mL，用于雄性SD大鼠血浆(EDTA-K2)和肌肉匀浆中的FTX001821-02
定量方法：通过LC/UV或LC-MS/MS方法确定样品和标准溶液样品中的测试样品的峰面积。方法验收标准：线性度：≥75％STD在生物流体中回算到其标称值(LLOQ为±25％)的±20％以内，在组织匀浆和粪便样品中回算到其标称值(LLOQ为30％)的25％以内。QC：≥67％的所有QC对于生物流体回算到其标称值的±20％以内，对于组织匀浆和粪便样品回算到其标称值的25％以内。特异性：单一空白基质中的分析物的平均计算浓度小于LLOQ的0.5倍。灵敏度：生物流体和组织匀浆中的LLOQ为1-3ng/mL。残留物：最高标准注射后立即计算的单一空白基质中的平均残留物浓度低于LLOQ。
靶接合免疫测定评估的肌肉组织的冷冻断裂、裂解和制备方案：
将大约50mg的肌肉组织放置在干冰上。根据需要使用干净的剃刀刀片切割肌肉样品，以获得每个样本50mg的重量。将50mg的肌肉组织置于预先标记的TT1Covaris袋(美国马萨诸塞州Covaris)中，并保存在干冰上。将TT1 Covaris袋浸没在液氮中，并且使样品在设置为“5”的Covaris cryoPREP(美国马萨诸塞州Covaris)中冷冻断裂。将TT1袋旋转180°，并且重复步骤2-a。将样品转移到预先称重/贴好标签的试管中，并维持在干冰上，直到制备好所有样品。记录样品重量。制备RIPA裂解缓冲液(R0278-500ML，美国密苏里州西格玛公司)。对于10ml，添加两个罗氏PhosSTOP磷酸酶抑制剂片剂和一个罗氏无EDTA蛋白酶抑制剂片剂。对于冷冻断裂材料，向每个试管中添加8μl/mg的RIPA缓冲液，并使每个试管涡旋直到裂解物均匀为止。将裂解物维持在冰上，直到所有样品都经过处理。通过在4℃下以13,000g离心5分钟来清除裂解物。将上清液转移到新试管中，并且在液氮中快速冷冻(留出10μl进行蛋白质测定)。为了测量每个样品的蛋白质含量，进行了布拉德福德(Bradford)DC蛋白质测定(5000112，美国加利福尼亚州Bio-Rad)。将样品在PBS中以1:20稀释以进行蛋白质评估。
磷酸MK2和总MK2免疫测定：
使用内部开发的中尺度发现(MSD)多重磷酸MK2/总MK2免疫测定法(中尺度诊断(Meso Scale Diagnostics)，美国马里兰州)对均质化的斜方肌裂解物进行评估。对于每个样品，将相当于50μg蛋白质的50μL的肌肉裂解物加载到MSD测定上。通过如上所述的布拉德福德DC蛋白质测定法确定肌肉裂解物中的蛋白质浓度。样品以一式两份进行评估。将肌肉样品在4℃下在预涂的MSD板上温育过夜，同时在定轨振荡器(300rpm)上温育，并在第二天早上进行评估。
肌肉组织的冷冻断裂、RNA提取和RNA纯化以及MBD3L2和CDKN1B的定量PCR测定评估方案：
将大约3-5mg的TA肌肉组织放置在干冰上。将肌肉组织置于预先标记的TT1Covaris袋(美国马萨诸塞州Covaris)中，并保存在干冰上。将TT1 Covaris袋浸没在液氮中，并且使样品在设置为“5”的Covaris cryoPREP(美国马萨诸塞州Covaris)中冷冻断裂。将TT1袋旋转180°，并且重复步骤2-a。将样品转移到预先称重/贴好标签的试管中，并维持在干冰上，直到制备好所有样品。使用Zymo Direct-zol microprep RNA试剂盒(美国加利福尼亚州)从3-5mg的冷冻断裂肌肉组织中纯化RNA。由RNA模板通过逆转录合成cDNA。然后使用经过稀释的人特异性TaqMan探针在14周期的PCR测定中对靶向转录物进行预扩增。使用人特异性TaqMan探针在qPCR测定中分析基因表达。使用2-ΔCt方法使相对表达水平相对于CDKN1B表达归一化。
数据分析：
使用Phoenix WinNonlin6.3软件(Cetera，美国新泽西州)通过无室方法分析血浆和肌肉浓度相对于时间的变化。使用GraphPad Prizm软件版本7(美国加利福尼亚州)报告C0、CLp、Vdss、Cmax、Tmax、T1/2、AUC(0-t)、AUC(0-inf)、MRT(0-t)、MRT(0-inf)、％F以及血浆和肌肉浓度相对于时间曲线和PD终点的图表。使用GraphPad Prizm软件第7版(美国加利福尼亚州)通过单向ANOVA评估肌肉PD。使用GraphPad Prizm软件第7版(美国加利福尼亚州)通过双尾T试验评估C6与A4细胞植入对异种移植肌肉中的MBD3L2 mRNA的影响。使用GraphPad Prizm软件第7版(美国加利福尼亚州)通过双尾T试验评估FTX-2865与媒剂治疗对FSHD异种移植肌肉中的MBD3L2 mRNA的影响。
实例1
使用序列定向反义寡核苷酸阻遏DUX4来减少下游靶基因
用DMSO对照媒剂处理野生型肌管，并且用DMSO媒剂对照或1μM购自Exiqon的DUX4序列定向反义寡核苷酸(ASO；FTX-2)处理表达DUX4蛋白的成熟患者源性FSHD肌管。处理后，将肌管裂解于19μL的罗氏实时准备裂解缓冲液、0.25μL的DNAse1(艾莫宾公司，AM2222)、0.25μL的保护RNase抑制剂(罗氏公司，3335402001)中，并且将RNA收集在RNeasy微试剂盒预混合液中。通过实时PCR(赛默飞世尔科技公司，4484262)、ZSCAN4 Taqman测定(赛默飞世尔科技公司，Hs00537549_m1，FAM-MGB)、MYOG Taqman测定(赛默飞世尔科技公司，Hs01072232_m1，JUN-QSY)、RPLP0 Taqman测定(赛默飞世尔科技公司，Hs99999902_m1)和/或LEUTX Taqman测定(赛默飞世尔科技公司，Hs00418470_m1)确定DUX4调节的下游基因(ZSCAN4、TRIM43、MBD3L2、LEUTX和KHDC1L)的表达水平。从QuantStudio实时PCR软件中提取Ct值，并且使用POLR2A作为管家基因，使用Genedata来计算相对表达水平。
结果显示，与用DMSO媒剂对照处理的FSHD肌管相比，用DUX4序列定向ASO处理的FSHD肌管表达DUX4和DUX4下游转录因子靶基因ZSCAN4、TRIM43、MBD3L2、LEUTX和KHDC1L的量减少(图2)。
图3A中的数据是将MBD3L2 mRNA在用DMSO对照或1μM DUX4 ASO处理的FSHD肌管中与健康的正常等基因对照肌管中的表达进行比较的经过分组的板质量控制数据。图3B示出了使用不同稀释度的DUX4 ASO的DUX4和下游基因MBD3L2的药理学质量控制数据和剂量依赖性降低。图3C示出了将以DMSO:WT:Z'为0.512并且信噪比(S/N)为5.1处理的FSHD肌管与以DMSO或DUX4 ASO:Z'为0.319并且信噪比(S/N)为4.6处理的FSHD肌管进行比较的基于板的测定统计数据。
实例2
P38小分子抑制剂降低MBD3L2 MRNA表达
用DMSO媒剂对照或多种浓度的各种p38α/β抑制剂处理野生型肌管和表达DUX4蛋白的成熟患者源性FSHD肌管，所述抑制剂具有不同的同种型和激酶组选择性范围，包含SB239063(图4A)、VX-702(图4B)、帕吡莫德(图4C)和TAK-715(图4D)。处理后，处理对照细胞和经过处理的细胞，以进行MBD3L2 mRNA(DUX4下游基因)和肌生成素(MYOG)mRNA(对照)表达的实时PCR定量。这些p38α/β抑制剂显示MBD3L2 mRNA表达的有效(IC50)大约<10nM，图4A-D)降低对FSHD肌管中的MYOG mRNA表达没有影响。
在FSHD肌管中，p38抑制剂(例如，帕吡莫德)剂量依赖性地降低了DUX4 mRNA和DUX4下游基因MBD3L2 mRNA的表达，而不影响肌管的形成。当与DMSO处理相比时，如通过FSHD肌管中的qPCR和Taqman测量的(图5A)，10、100和1000nM FTX000839(帕吡莫德)剂量依赖性地降低了相对于POLR2A mRNA归一化的DUX4-fl下游基因mRNA水平和MBD3L2下游基因mRNA水平两者，而不影响分化为肌管(图5B)。数据显示p38抑制剂剂量依赖性地降低MBD3L2mRNA表达，而不影响肌生成素mRNA表达。
实例3
通过SIRNA敲低减少P38 MAPK14 MRNA和MBD3L2 MRNA
如材料和方法中所描述的，将p38αMAPK14 85 siRNA和p38αMAPK14 86 siRNA转染到患者FSHD肌管中。与非靶对照siRNA(NT CTRL1和NT CTRL2)相比，p38αMAPK14 85 siRNA和p38αMAPK14 86 siRNA中的每个(在较小程度上)都降低了p38MAPK14的表达(如图6A所示)和MBD3L2 mRNA(DUX4靶基因)的表达(如图6B所示)。数据显示，p38αMAPK14的基因组减少>50％特异性地减少了DUX4和下游靶基因，如MBD3L2所例示的。
实例4
通过38Α激酶CAS9/SGRNARNP减少MBD3L2MRNA
如材料和方法中所描述的，进行MAPK14或pLAM(DUX4的聚腺苷酸信号序列)的CRISPR gRNA靶向。靶向MAPK14或pLAM(DUX4的聚腺苷酸信号序列)的CRISPR gRNA导致MBD3L2表达降低，但MYOG表达没有降低。数据表明，p38αMAPK14的基因组减少特异性地减少了DUX4和下游靶基因，如MBD3L2所例示的。
实例5
FTX-1821下调DUX4蛋白和MBD3L2 mRNA
用DMSO媒剂对照和不同的FTX-1821浓度处理患者源性FSHD肌管(具有D4Z4阵列的6个重复序列)，并且如方法和材料中所描述的，确定DUX4蛋白和MBD3L2 mRNA水平。对于DUX4和MBD3L2，分析了四个生物学重复。另外，确定了pHSP27水平。对于pHSP27定量，在两个独立的实验中获得了三个重复。
用FTX 1821处理FSHD患者源性肌管导致DUX4蛋白(IC50＝25nM)和MBD3L2 mRNA(IC50＝25nM)浓度依赖性降低，所述浓度依赖性降低与观察到的作为靶参与的证据的磷酸HSP27水平(IC50＝10nM)的变化相关(图7)。结果表明DUX4蛋白(IC50＝25nM)和MBD3L2 mRNA(IC50＝10nM)浓度依赖性降低。DUX4蛋白和MBD3L2mRNA的减少与观察到的作为靶参与的证据的p-HSP27水平(IC50＝10nM)的变化相关。这些结果表明，FTX-1821对p38α途径的抑制导致有效的DUX4蛋白和MBD3L2 mRNA下调。
实例6
FTX-1821不影响肌管的形成
分化永生化的FHSD肌管，并且用DMSO媒剂对照或FTX-1821以1μM、0.33μM、0.11μM或0.037μM的浓度对其进行处理。4天后，将细胞固定并用针对MHC或DAPI的抗体染色。参见图8A。根据MHC染色对肌管中的细胞核进行定量(图8B)。结果显示，在测试浓度下用FTX-1821处理后，肌管的形成或融合没有发生变化。
实例7
FTX-1821减少FSHD肌管中的凋亡
如材料和方法中所描述的，通过体外FSHD肌管中的活性半胱天冬酶-3水平来测量凋亡。如图9A中的白色圆圈和放大区所示，在培养基中的肌管子集中以散发性方式检测到凋亡。在已经用不同浓度的FTX-1821处理的FSHD肌管中对活性半胱天冬酶-3信号进行了定量(图9B)。结果示出如由活性半胱天冬酶3的检测降低(IC50＝45nM)所表明的凋亡信号的剂量依赖性降低，与对照肌管相比，此效应对FSHD肌管具有特异性。DMSO处理后未观察到活性半胱天冬酶-3信号的变化。
实例8
FTX-1821减少病理学Dux4转录程序表达
如方法和材料中所描述的进行研究，以鉴定与用DMSO媒剂对照处理的FSHD肌管相比，表达在用FTX-1821处理的FSHD肌管中下调的DUX4通路中的基因。另外，也在用DMSO处理的野生型肌管中确定了基因表达。通过RNA-seq分析每种条件的三个重复，并根据变化的方向和强度对基因进行聚类。
如图10A的热图所示，通过RNA-seq图谱鉴定了许多差异表达的基因。条指示观察到的归一化变化，例如在仅用DMSO处理的样品中富集了通过FTX-1821下调的基因。在用FTX-1821(1μM)处理后，这些基因的表达归一化，并且与野生型细胞中的观察结果更相似。使用标准的RPKM表达值计算，总基因签名非常小并且以标准的统计临界值定义：86/19,799mRNA基因。DUX4调节的基因签名占总签名的大部分，并且这些基因列在图10A中。非DUX4调节的基因占总签名的少部分，所述总签名具有中等倍数变化：9/86mRNA基因＝10％；2-2.7XlogFC。图10B示出了如材料和方法中所描述的DUX4靶基因的归一化读段，所述DUX4靶基因在用FTX-1821处理后下调。分析每组三个独立的重复。
实例9
各种FSHD1基因型和表型的MBD3L2 MRNA减少
如方法和材料中所描述的，执行了p38抑制剂减少从具有各种不同FSHD1基因型的患者获得的细胞中的DUX4靶基因表达的能力。用FTX-1821(1μM)或FTX-839(1μM)处理四种不同的FSHD患者成肌细胞系，即FTCE-016、FTCE-020、FTCE-197和FTCE-196(由RabiTawil友情提供)，并且处理后确定DUX4靶基因MBD3L2的mRNA水平。
所有FSHD系中MBD3L2表达水平降低，从而导致水平类似于在健康对照FTCE-396和FTCE-014中测量的水平(图11)。这是通过p38抑制剂跨源自不同FSHD1基因型和表型的肌管减少DUX4靶基因的证据(对于FSHD2观察到类似的结果，数据未示出)。
实例10
从FSHD1和FSHD2基因型和表型减少MBD3L2 MRNA
为了评估使用FTX-1821在FSHD1和FSHD2细胞中对p38选择性抑制的治疗效果，罗切斯特大学(University of Rochester)的Rabi Tawil友情提供了原代成肌细胞系。图13总结了研究中使用的13个FSHD1患者成肌细胞和3个FSHD2患者成肌细胞的基因型和表型。用DMSO、FTX-1821或FTX-839(1μM)处理各种FSHD1成肌细胞和FSHD2成肌细胞，并且在处理后，确定DUX4靶基因MBD3L2的mRNA表达水平。另外，通过测量FSHD1系和FSHD2系中的活性半胱天冬酶-3来确定凋亡。
各种FSHD1成肌细胞和FSHD2成肌细胞中的每个成肌细胞均显示MBD3L2的减少(图14A，顶部11行)。减少导致表达水平类似于健康对照品系(CTRL-FTCE-014)中的表达水平(图14A，底部2行)。另外，用FTX-839处理显示跨FSHD1和FSHD2系两者的凋亡降低到类似于健康对照系(CTRL-FTCE-014)中所确定的量的水平(图14B)。这些结果表明，临床FSHD活检成肌细胞在分化为肌管时不仅显示出病理学DUX4下游基因表达的减少，而且导致跨FSHD1和FSHD2基因型和表型两者的细胞死亡。
实例11
在用有效且选择性P38抑制剂处理后野生型大鼠肌肉中的靶参与
在动物模型中研究了FTX-1821的药代动力学特性。向禁食或未禁食的雄性斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠(每个时间点和治疗组N＝6只动物)口服给药FTX-1821，并确定磷酸p38α水平:总p38α水平。通过测量药物治疗前后磷酸MAP激酶活化的蛋白激酶2(MK2)与总MK2的比率的变化来对肌肉组织中的p38***靶参与进行药效学分析。材料和方法部分中描述了所使用的所有方法。
FTX-1821表现出的血浆药代动力学特性类似于先前描述的血浆药代动力学特性(Aston等人,2009；数据未示出)。这些研究另外证明了FTX-1821快速分布到多块肌肉和血浆中。当达到临床相关的血浆暴露时，大鼠的肌肉与血浆暴露比率等于或大于1。
药效学分析证明，单次口服给药FTX-1821(0.3mg/kg)会产生临床上相关的血浆浓度(Barbour等人,2012)，并且显著降低1小时的药物治疗范围内的大鼠斜方肌中磷酸MK2与总MK2的比率(图15)。单次给药FTX-1821后，P38***靶参与持续至少12小时(图15)。当FTX-1821的血浆浓度和肌肉浓度大于20ng.mL或ng.g时，斜方肌中的P38***靶参与最大，而当暴露减少时，P38***靶参与则下降。基于FSHD肌管中的体外数据(上文)，预测在大鼠研究中实现的FTX-1821肌肉浓度将导致FSHD患者肌肉活检中的DUX4依赖性靶基因的Cmax降低>70％。
此药代动力学和药效学分析表明，当血浆FTX-1821浓度大于20ng/mL时，对肌肉中的p38***的最大抑制得以实现，并且在人肌肉中，在临床剂量为7.5或15mg BID的情况下，将期望产生显著p38通路抑制(Barbour等人,2012)。
实例12
在用有效且选择性P38抑制剂处理后FSHD异种移植小鼠中的DUX4基因组程序的抑制
通过将C6(FSHD)和A4(对照)IPSC源性人永生化同基因成肌细胞系异种移植到大约8周龄雄性Nod-Rag小鼠的双侧胫前肌(TA)肌肉中来生成FSHD和对照肌肉异种移植小鼠，如Sakellariou等人,2016所描述的。在长达4周的移植和INMES程序之后，用BID注射媒剂或FTX-2865(10mg/kg)处理FSHD异种移植的动物持续8天(总共14次注射)，并且在第8天最后一次早晨注射后1小时，大约在最大血浆浓度(Tmax)时将其处死。处死时，收集血浆、斜方肌和双侧胫前肌并且速冻以分析药代动力学终点、靶参与和DUX4依赖性mRNA。使用人特异性探针通过qPCR评估MBD3L2，并且相对于管家基因CDKN1B对其进行归一化。通过定量MSD测定评估pMK2和MK2蛋白浓度。
通过qPCR对移植有A4或C6成肌细胞组织4-6周的动物的TA组织的分析证明FSHD(C6)中的MBD3L2和其它Dux4依赖性基因(未示出)相对于对照(A4)异种移植的TA肌肉显著(p<0.05)和>10倍增加(图16)。每组N＝8个TA样品。
用有效且选择性p38抑制剂FTX-2865处理FSHD异种移植动物产生了p38***靶参与，如通过腹膜内(IP)注射给定的重复BID施用10mg/kg剂量后野生型小鼠的TA和斜方肌中磷酸MAP激酶活化的蛋白激酶2(MK2)与总MK2的比率>50％的变化所测量的(数据未示出)。FTX-2865处理显著(p<0.05)降低了小鼠斜方肌中磷酸与总MK2的比率，表明显著p38***参与，并且还表明动物骨骼肌中的药物浓度足以抑制p38***>80％(图17；每组N＝8个斜方肌样品)。另外，与媒剂处理的动物相比，FTX-2865处理显著(p<0.05)降低了FSHD异种移植的TA肌肉中的MBD3L2表达，表明通过p38抑制遏制了病理学DUX4基因程序(图18；每组N＝5-7个TA样品)。
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本文描述的所有出版物和专利申请以全文引用的方式并入本文中。
尽管已经结合上文陈述的具体实施例描述了本发明，但许多替代方案、修改和其其它变化对于本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。所有这种替代方案、修改和变化都旨在落入本发明的精神和范围内。
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Claims (64)

1.一种降低细胞中DUX4-fl mRNA、DUX4多肽或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达的方法，所述方法包括使所述细胞与导致所述细胞中活性p38蛋白减少的药剂接触，由此降低所述DUX4多肽或由DUX4的所述下游靶基因编码的所述多肽的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂抑制所述p38蛋白的表达或活性或减少其量，其中所述活性任选地是激酶活性。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述细胞是肌细胞，任选地终末分化的肌细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中与对照细胞中所述DUX4-fl mRNA、所述DUX4多肽或由所述下游靶基因编码的所述多肽的表达水平相比，所述细胞中的所述DUX4-fl mRNA、所述DUX4多肽或由所述下游靶基因编码的所述多肽的表达水平增加。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述DUX4-fl mRNA、所述DUX4多肽或由所述下游靶基因编码的所述多肽的表达水平增加是由于所述细胞中D4Z4基因座处的阻遏减少引起的。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述细胞与面肩肱型肌营养不良症(FSHD)相关。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞在染色体4q35的亚端粒区中包括一个或多个大卫星D4Z4重复序列的缺失，任选地其中所述细胞在染色体4q35的所述亚端粒区中包括<7个大卫星D4Z4重复序列。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述细胞在含柔性铰链域的染色体结构维持1(StructuralMaintenance OfChromosomes Flexible Hinge DomainContaining1，SMCHD1)基因中包括一个或多个突变。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞包括至少一个未缺失的4qA等位基因。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制所述p38蛋白的表达。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述药剂结合对所述p38蛋白进行编码的多核苷酸或其反义多核苷酸。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述药剂包括核酸或由其组成，任选地DNA、RNA、gRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。
13.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制所述p38蛋白的活性。
14.根据权利要求1到9和13中任一项所述的方法，其中所述药剂结合所述p38蛋白。
15.根据权利要求1到9、13和14中任一项所述的方法，其中所述药剂包括多肽或由其组成，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。
16.根据权利要求1到9、13和14中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子，任选地小有机分子或小无机分子。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的方法，其中所述下游靶基因是RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、KHDC1L、ZSCAN4、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的方法，其中所述p38蛋白的所述表达或所述活性降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
19.一种治疗或预防有需要的受试者中与DUX4-fl mRNA、DUX4蛋白或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达增加相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供包括导致所述受试者的一个或多个组织中的活性p38蛋白的量减少的药剂的药物组合物，由此降低所述受试者的一个或多个组织中所述DUX4-fl mRNA、所述DUX4蛋白或对所述下游靶基因进行编码的所述多肽的表达。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述疾病或病症是面肩肱型肌营养不良症(FSHD)，任选地FSHD1或FSHD2。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述受试者包括D4Z4基因座处减少的阻遏。
22.根据权利要求19到21中任一项所述的方法，其中所述受试者在染色体4q35的亚端粒区中包括一个或多个大卫星D4Z4重复序列的缺失，任选地其中所述细胞在染色体4q35的所述亚端粒区中包括<7个大卫星D4Z4重复序列。
23.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述受试者在含柔性铰链域的染色体结构维持1(SMCHD1)基因中包括一个或多个突变。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者包括至少一个未缺失的4qA等位基因。
25.根据权利要求19到24中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制所述p38蛋白的表达。
26.根据权利要求19到25中任一项所述的方法，其中所述药剂结合对所述p38蛋白进行编码的多核苷酸或其反义多核苷酸。
27.根据权利要求19到26中任一项所述的方法，其中所述药剂包括核酸或由其组成，任选地DNA、RNA、gRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。
28.根据权利要求19到24中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制所述p38蛋白的活性。
29.根据权利要求19到24和28中任一项所述的方法，其中所述药剂结合所述p38蛋白。
30.根据权利要求19到24、28和29中任一项所述的方法，其中所述药剂包括多肽或由其组成，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。
31.根据权利要求19到24、28和29中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子，任选地小有机分子或小无机分子。
32.根据权利要求19到31中任一项所述的方法，其中所述下游靶基因是RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、KHDC1L、ZSCAN4、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A。
33.根据权利要求19到32中任一项所述的方法，其中所述p38蛋白的所述表达或所述活性在所述受试者的肌肉组织中降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
34.根据权利要求19到33中任一项所述的方法，其中所述方法抑制所述受试者的肌肉组织中所述p38蛋白的所述表达或活性。
35.根据权利要求19到34中任一项所述的方法，其中所述方法减少了所述受试者的肌肉退化。
36.根据权利要求19到35中任一项所述的方法，其中所述方法减少了所述受试者的肌细胞的细胞凋亡。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述肌肉组织是终末分化的。
38.根据权利要求11所述的方法，其中所述药物组合物通过肠胃外提供给所述受试者。
39.根据权利要求11所述的方法，其中所述药物组合物被提供到所述受试者的肌肉组织。
40.根据权利要求19到39中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述受试者提供第二药剂以治疗与DUX4蛋白或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达增加相关的疾病或病症。
41.一种药物组合物的单位剂型，所述药物组合物包括导致细胞中活性p38蛋白的量减少的药剂以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂，其中所述单位剂型有效降低施用所述单位剂型的受试者的一个或多个细胞或组织中DUX4-fl mRNA、DUX4多肽或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达或活性。
42.根据权利要求41所述的单位剂型，其中所述药剂结合所述DUX4多肽或结合对所述DUX4多肽进行编码的多核苷酸。
43.根据权利要求41或权利要求42所述的单位剂型，其中所述药剂包括核酸或由其组成，任选地DNA、RNA、gRNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。
44.根据权利要求41或权利要求42所述的单位剂型，其中所述药剂包括多肽或由其组成，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。
45.根据权利要求41或权利要求42所述的单位剂型，其中所述药剂包括小分子，任选地有机分子或无机分子。
46.根据权利要求41到45中任一项所述的单位剂型，其中所述下游靶基因是RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、KHDC1L、ZSCAN4、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A。
47.根据权利要求41到46中任一项所述的单位剂型，其中所述组织是肌肉组织，任选地其中所述组织包括包含与面肩肱型肌营养不良症(FSHD)相关的突变的细胞。
48.一种减少肌细胞的细胞凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞与导致所述细胞中活性p38蛋白的量减少的药剂接触，任选地其中所述肌细胞是终末分化的，由此降低所述细胞中DUX4-fl mRNA、DUX4蛋白或由DUX4的下游靶基因编码的多肽的表达。
49.根据权利要求48所述的方法，其中与对照细胞中所述DUX4多肽或由所述下游靶基因编码的所述多肽的表达水平相比，所述细胞中的所述DUX4-fl mRNA、所述DUX4多肽或由所述下游靶基因编码的所述多肽的表达水平增加。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述DUX4-fl mRNA、所述DUX4多肽或由所述下游靶基因编码的所述多肽的表达水平增加是由于所述细胞中D4Z4基因座处的阻遏减少引起的。
51.根据权利要求48到50中任一项所述的方法，其中所述细胞与面肩肱型肌营养不良症(FSHD)相关。
52.根据权利要求48到51中任一项所述的方法，其中所述细胞在染色体4q35的亚端粒区中包括一个或多个大卫星D4Z4重复序列的缺失，任选地其中所述细胞在染色体4q35的所述亚端粒区中包括<7个大卫星D4Z4重复序列。
53.根据权利要求48到52中任一项所述的方法，其中所述细胞在含柔性铰链域的染色体结构维持1(SMCHD1)基因中包括一个或多个突变。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述细胞包括至少一个未缺失的4qA等位基因。
55.根据权利要求53到59中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制所述p38蛋白的表达。
56.根据权利要求48到55中任一项所述的方法，其中所述药剂结合对所述p38蛋白进行编码的多核苷酸或其反义多核苷酸。
57.根据权利要求48到56中任一项所述的方法，其中所述药剂包括核酸或由其组成，任选地DNA、RNA、shRNA、siRNA或反义寡核苷酸。
58.根据权利要求48到54中任一项所述的方法，其中所述药剂抑制所述p38蛋白的活性。
59.根据权利要求48到54和58中任一项所述的方法，其中所述药剂结合所述p38蛋白。
60.根据权利要求48到54、583和59中任一项所述的方法，其中所述药剂包括多肽或由其组成，任选地蛋白质、肽、蛋白质模拟物、肽模拟物或抗体或其功能片段。
61.根据权利要求48到54、58和59中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子，任选地小有机分子或小无机分子。
62.根据权利要求48到61中任一项所述的方法，其中所述下游靶基因是RFPL2、CCNA1、SLC34A2、TPRX1、KHDC1L、ZSCAN4、PRAMEF20、TRIM49、PRAMEF4、PRAME6、PRAMEF15或ZNF280A。
63.根据权利要求48到62中任一项所述的方法，其中所述p38蛋白的所述表达或所述活性降低了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
64.根据权利要求48到63中任一项所述的方法，其中所述方法使肌肉组织中的肌细胞的细胞凋亡减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。
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