BR112020006677A2 - uso de inibidores p38 para reduzir a expressão de dux4 - Google Patents

uso de inibidores p38 para reduzir a expressão de dux4 Download PDF

Info

Publication number
BR112020006677A2
BR112020006677A2 BR112020006677-0A BR112020006677A BR112020006677A2 BR 112020006677 A2 BR112020006677 A2 BR 112020006677A2 BR 112020006677 A BR112020006677 A BR 112020006677A BR 112020006677 A2 BR112020006677 A2 BR 112020006677A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
dux4
protein
expression
cell
agent
Prior art date
Application number
BR112020006677-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Angela Marie CACACE
Luis Gustavo Alejandro Rojas Soto
Lorin A. Thompson Iii
Owen Brendan Wallace
Lucienne V. Ronco
Ning Shen
Alan Scott Robertson
Aaron Nakwon Chang
Original Assignee
Fulcrum Therapeutics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fulcrum Therapeutics, Inc. filed Critical Fulcrum Therapeutics, Inc.
Publication of BR112020006677A2 publication Critical patent/BR112020006677A2/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5061—Muscle cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/415—1,2-Diazoles
    • A61K31/416—1,2-Diazoles condensed with carbocyclic ring systems, e.g. indazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4418—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having a carbocyclic group directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cyproheptadine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/53—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with three nitrogens as the only ring hetero atoms, e.g. chlorazanil, melamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4707—Muscular dystrophy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11024—Mitogen-activated protein kinase (2.7.11.24), i.e. MAPK or MAPK2 or c-Jun N-terminal kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Abstract

A presente invenção refere-se às composições e métodos de inibição da quinase p38 para reduzir a expressão genética e proteica do DUX4 e genes a jusante regulados pelo DUX4. A presente invenção refere-se ainda a métodos de tratamento de pacientes que sofrem de doenças associadas com a expressão aumentada do DUX4 ou a expressão de uma forma aberrante do DUX4, como a distrofia muscular Fascio-escápulo-Umeral (FSHD).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “USO DE INIBIDORES P38 PARA REDUZIR A EXPRESSÃO DE DUX4”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos EUA n° 62/568.673, depositado em 5 de outubro de 2017; Pedido Pro- visório dos EUA nº 62/568.754, depositado em 5 de outubro de 2017; Pedido Provisório dos EUA n° 62/682.563, depositado 8 de junho de 2018; e Pedido Provisório dos EUA n° 62/682.565, depositado em 8 de junho de 2018; todos os quais são incorporados por referência no pre- sente documento em suas totalidades.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi apresentada eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorporado por referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 4 de outubro de 2018, é denominada FULC_027_02WO_ST25.txt e tem 27 KB de tamanho.
CAMPO DA DIVULGAÇÃO
[0003] A presente invenção refere-se às composições e métodos de inibição da quinase p38 para reduzir a expressão genética e proteica do DUX4 e genes a jusante regulados pelo DUX4. A presente invenção relaciona-se ainda com métodos de tratamento de pacientes com doen- ças e distúrbios associados com a expressão aumentada do DUX4 ou a expressão de uma forma aberrante do DUX4, como a distrofia muscu- lar Fascio-escápulo-Umeral (FSHD).
ANTECEDENTES
[0004] As distrofias musculares (DM) são um grupo de mais de 30 doenças genéticas diferentes, caracterizadas por fraqueza progressiva e degene- ração dos músculos esqueléticos que controlam o movimento. Algumas formas de DM ocorrem na infância, enquanto outras podem não aparecer até a meia- idade ou mais. As várias doenças da DM diferem em termos de distribuição e extensão da fraqueza muscular (algumas formas de DM também afetam o músculo cardíaco), idade de início, taxa de progressão e padrão de herança.
[0005] A distrofia muscular fascio-escápulo-umeral (FSHD) é a ter- ceira forma mais comum de distrofia muscular e afeta aproximadamente 1 em cada 15.000 pessoas em todo o mundo. A FSHD é causada por mutações genéticas que resultam na desrepressão epigenética do gene DUX4, o que torna essa doença única entre as distrofias musculares. As manifestações primitivas da FSHD são fraqueza e perda de múscu- los da face, da cintura escapular, dos braços e do tronco e afetam as extremidades inferiores em casos mais graves.
[0006] As mutações genéticas associadas à FSHD levam a uma descompactação parcial da estrutura da cromatina D4Z4 e a uma falha resultante na repressão de DUX4, um fator de transcrição codificado pela unidade D4Z4, no músculo esquelético. A FSHD1, representando cerca de 95% dos casos de FSHD relatados, está associada a supres- sões de repetições D4Z4 macrossatélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35, deixando de 1a 10 repetições D4Z4 (revisadas em Tawil et al., 2014). A FSHD2 é causada por mutações na Manutenção Estrutural de Domínios Cromossômicos Articulados Flexíveis Contendo o gene 1 (SMCHD1) no cromossomo 18 (revisado em van der Maarel et al., 2007). Ambas as mutações FSHD1 e FSHD2 levam à perda de re- pressão na matriz de repetição D4ZA no 4q35 permitindo a transcrição aberrante no músculo de uma forma de comprimento total da homeobox dupla 4, DUX4, mRNA (DUX4-fl), que codifica o fator de transcrição da double homeobox dupla 4 (DUX4) (Tawil et. al., 2014). As isoformas de RNA de DUX4-fl encontradas associadas à FSHD variam apenas na região não traduzida de 3' e não têm distinção funcional identificada.
[0007] Atualmente, não existe tratamento aprovado que possa in- terromper ou reverter os efeitos da FSHD, embora medicamentos anti-
inflamatórios não esteróides sejam frequentemente prescritos para me- lhorar o conforto e a mobilidade. Claramente, portanto, existe uma ne- cessidade na técnica de novos métodos para reduzir os níveis de ex- pressão de DUX4, por exemplo, mRNA de DUX4-fl e/ou proteína DUX4, por exemplo, para tratar a FSHD e outras doenças. A presente invenção atende a essa necessidade.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0008] As Figuras 1A e 1B mostram expressão da proteína DUX4 e RNA em miotubos de FSHD. A Figura 1A inclui micrografias de miotubos de FSHD corados usando um anticorpo que liga a proteína DUX4 e/ou 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; para detectar núcleos). Os miotubos de FSHD maduros mostraram estriações de actina em cultura (não mos- tradas) e expressaram a proteína DUX4 em conjuntos discretos de nú- cleos contidos em um miotubo diferenciado (Figura 1A). A Figura 1B é um gráfico mostrando a expressão relativa de mRNA de DUX4 em mio- tubos de FSHD e miotubos de um controle do tipo selvagem isogênico (saudável).
[0009] A Figura 2 é um gráfico mostrando a expressão de mRNA dos genes DUX4 regulados indicados em miotubos do tipo selvagem tratados com DMSO ou miotubos de FSHD tratados com FTX-2 ou DMSO. Para cada gene indicado, as barras da esquerda para a direita se correlacionam com os miotubos de tipo selvagem tratados com DMSO, os miotubos de FSHD tratados com DMSO e os miotubos de FSHD tratados com FTX-2 (ASO direcionado a DUX4).
[0010] As Figuras 3A a 3C mostram redução do mRNA de MBD3L2 em miotubos de FSHD tratados com ASOs direcionados a DUX4. O MBD3L2 foi normalizado para mRNA de POLR2A, conforme medido pela qPCR. A Figura 3A é um gráfico mostrando dados de controle de qualidade de placas agrupados comparando a expressão de MBD3L2 em miotubos de FSHD tratados com controle de DMSO ou ASOs dire- cionados a DUX4 de 1 µM e miotubos do tipo selvagem (WT) isogênicos normais saudáveis. A Figura 3B é um gráfico mostrando a redução de- pendente de dose da expressão do mRNA de MBD3L2 em miotubos de FSHD tratados com diferentes diluições do ASO direcionado a DUX4 (FTX-2). A Figura 3C mostra estatísticas de ensaios baseados em pla- cas comparando o sinal de MBD3L2 em miotubos de FSHD tratados com DMSO para ASOs direcionados a DUX4 ou miotubos do tipo sel- vagem tratados com DMSO.
[0011] As Figuras 4A a 4D são gráficos mostrando os níveis de ex- pressão de mRNA de MBD3L2 e mRNA de MYOG em miotubos de FSHD tratados com os inibidores de p38/ indicados, em relação ao tratamento com controle de DMSO. Os inibidores de p38a/β incluíram SB 239063 (Figura 4A), VX-702 (Figura 4B), Pamapimod (Figura 4C), e TAK-715 (Figura 4D). São também fornecidas as estruturas dos inibido- res.
[0012] As Figuras 5A e 5B mostram dados dos miotubos de FSHD tratados com Pamapimod. A Figura 5A é um gráfico mostrando que a redução dependente de dose no mRNA de DUX4-fl (círculos preenchi- dos) e no mRNA de MBD3L2 (círculos abertos). A Figura 5B mostra mi- crografias de miotubos de FSHD tratados com DMSO ou Pamapimod.
[0013] As Figuras 6A a 6C são gráficos mostrando os níveis de mRNA de MAPK14 (Figura 6A) e de MBD3L2 (Figura 6B e Figura 6C) em miotubos de FSHD tratados com siRNAs direcionando a p38a MAPK14 (siMAPK14 85 e siMAPK14 86; Figura 6A e Figura 6B) ou tra- tados com a quinase p38a (MAPK14 e DUX4 pLAM) Cas9/sgRNA RNPs (Figura 6C), em comparação com o controle sem direcionamento (NT CTRL). Na Figura 6C, para cada tratamento, os resultados mostrados da esquerda para a direita correspondem a MBD3L2 e MYOG, respec- tivamente.
[0014] A Figura 7 é um gráfico mostrando os níveis de expressão da proteína DUX4, do mRNA de MBD3L2 e da proteína p-HSP27 nos miotubos de FSHD após o tratamento com dosagens crescentes de FTX-1821 (estrutura mostrada), como uma porcentagem dos níveis de tratamento de controle de DMSO. As barras representam o desvio-pa- drão.
[0015] As figuras 8A e 8B mostram o efeito de FTX-1821 na forma- ção de miotubos. A Figura 8A fornece imagens representativas da mor- fologia dos miotubos de FSHD imortalizados obtidos após o tratamento com veículo (DMSO) ou as concentrações indicadas de FTX-1821 e da coloração com anticorpos contra MHC e DAPI (coloração nuclear). A Figura 8B é um gráfico mostrando a quantificação de núcleos em mio- tubos, conforme definido pela coloração com MHC, após tratamento com FTX-1821 nas concentrações testadas. As barras representam um desvio-padrão de três réplicas.
[0016] A Figuras 9A e 9B mostram os resultados dos ensaios de apoptose em miotubos de FSHD in vitro. A Figura 9A fornece microgra- fias de miotubos de FSHD corados para caspase 3 ativa (como um mar- cador de apoptose) ou DAPI. A apoptose foi detectada de maneira es- porádica em um subconjunto de miotubos em cultura, conforme mos- trado por círculos brancos no painel esquerdo e na região ampliada à direita. A Figura 9B é um gráfico mostrando a quantificação do sinal da caspase 3 ativa em miotubos de FSHD tratados com as concentrações indicadas de FTX 1821.
[0017] As Figuras 10A e 10B ilustram a identificação de genes down-regulados em miotubos de FSHD por FTX-1821. A Figura 10A é um mapa de calor, que ilustra genes expressos diferencialmente identi- ficados por perfil de RNA-seq. Três réplicas para cada condição foram analisadas por RNA-seq e os genes foram agrupados pela direção e intensidade da alteração, conforme indicado. A barra de cores indica as alterações normalizadas observadas, por exemplo, genes que foram down-regulados por FTX-1821 são enriquecidos em amostras tratadas somente com DMSO. Os genes down-regulados estão listados na Fi- gura 10A. A Figura 10B é um gráfico que mostra as leituras normaliza- das do nível de expressão dos genes DUX4 alvo que foram down-regu- lados após o tratamento com FTX-1821 em células do tipo selvagem tratadas com o controle de veículo DMSO, células de FSHD tratadas com DMSO ou células de FSHD tratadas com FTX-1821.
[0018] A Figura 11 é um gráfico mostrando os níveis de expressão de mRNA por qRT-PCR do gene DUX4 alvo, MBD3L2 (normalizado para POLR2A), em miotubos derivados de quatro linhas distintas de mioblastos de pacientes com FSHD, FTCE-016, -020, -197, -196 e duas linhas de controle do tipo selvagem (WT), seguindo o tratamento indi- cado com o controle de veículo DMSO, FTX-1821 ou FTX-839.
[0019] As Figuras 12A e 12B fornecem informações sobre vários inibidores da quinase p38. A Figura 12A é uma tabela de dados que sumariza a farmacologia para os inibidores da p38α e β indicados, in- cluindo IC50 para reduzir a expressão de MBD3L2 em células de FSHD. São mostrados valores de IC50 comparáveis de MBD3L2, indicando ini- bição da expressão de genes a a jusante de DUX4 em miotubos de FSHD através de um amplo painel estrutural de inibidores da p38α e β relatados como tendo potências enzimáticas semelhantes. Estes dados indicam que a inibição da p38 resulta no gene DUX4 alvo, MBD3L2, redução dos valores de IC50 na faixa de ~6 a 68 nM. A Figura 12B for- nece as estruturas de composto dos inibidores p38 listados na Figura 12A.
[0020] A Figura 13 é uma tabela de várias linhas de célula usadas em um "ensaio clínico em um prato", que mostra diversidade de genóti- pos e inclui linhas primitivas e imortalizadas, bem como linhas de paci- entes com FSHD1 e FSHD2.
[0021] As Figuras 14A e 14B são gráficos mostrando a expressão do mRNA de MBD3L2 normalizada para POLR2A (por qRT-PCR) (Fi- gura 14A) e apoptose conforme medida pela caspase 3 clivada (Fi- gura14B) determinada em miotubos de nove pacientes com FSHD1 e três pacientes com FSHD2 (listados na Tabela 2, Figura 14B contém apenas duas linhas de célula de FSHD2) após o tratamento com FTX- 1821, FTX-839 ou controle de veículo DMSO.
[0022] A Figura 15 é um gráfico que mostra o curso temporal da exposição plasmática, exposição muscular de trapézio e engajamento alvo p38 (Razão P38 Fosforilado:P38a Total) no rato após administra- ção oral de 0,3 mg/kg FTX-1821.
[0023] A Figura 16 é um gráfico que mostra os níveis de mRNA de MBD3L2 nos músculos tibiais anteriores bilaterais de xenoenxerto A4 e C6.
[0024] A Figura 17 é um gráfico mostrando a razão fósforo/MC2 to- tal nos músculos trapézios de camundongos após o tratamento com controle de veículo ou inibidor p38, FTX-2865.
[0025] A Figura 18 é um gráfico mostrando os níveis de mRNA de MBD3L2 nos músculos tibiais anteriores bilaterais de xenoenxerto C6 após tratamento com controle de veículo ou inibidor de p38, FTX-2865.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0026] A presente divulgação fornece métodos para reduzir a ex- pressão de um mRNA de DUX4-fl, um polipeptídeo DUX4 ou um poli- peptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a jusante, nas células, compreendendo o contato das células com um agente que resulta em uma redução da proteína p38 ativa na célula, reduzindo assim a expres- são do polipeptídeo DUX4 ou do polipeptídeo codificado pelo gene alvo a jusante do DUX4. Esses métodos podem ser praticados usando uma variedade de diferentes tipos de agentes e para modular uma variedade de processos biológicos diferentes na célula, bem como para tratar pa- cientes de doenças associadas à expressão aberrante do DUX4, tal como a FSHD.
[0027] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos divul- gados no presente documento, a célula é uma célula muscular, opcio- nalmente uma célula muscular diferenciada terminalmente. Em algumas modalidades, a célula tem um nível de expressão aumentada do mRNA de DUX4-fl, o polipeptídeo DUX4, ou o polipeptídeo codificado pelo gene alvo a jusante, em comparação com o nível de expressão do mRNA de DUX4-fl, o polipeptídeo DUX4, ou o polipeptídeo codificado pelo gene alvo a jusante, em uma célula de controle, por exemplo, uma célula obtida de um paciente saudável. Em algumas modalidades, o ní- vel de expressão aumentada do mRNA de DUX4-fl, o polipeptídeo DUX4, ou o polipeptídeo codificado pelo gene alvo a jusante, é devido à repressão reduzida em um lócus D4Z4 na célula. Em certas modali- dades, a célula é associada a distrofia muscular fascio-escápulo-umeral (FSHD), por exemplo, foi obtida de um paciente diagnosticado com FSHD ou está presente dentro de um paciente diagnosticado com FSHD. Em algumas modalidades, a célula compreende uma supressão de uma ou mais repetições uma ou mais repetições D4Z4 macrossaté- lites na região subtelomérica do cromossomo 4q35, opcionalmente em que a célula compreende <7 repetições uma ou mais repetições D4Z4 macrossatélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35. Em al- gumas modalidades, a célula compreende uma ou mais mutações na Manutenção Estrutural de Domínios Cromossômicos Articulados Flexí- veis Contendo o gene 1 (SMCHD1)(SMCHD1). Em algumas modalida- des, a célula compreende pelo menos um alelo 4qA não suprimido.
[0028] Em certas modalidades dos métodos divulgados no presente documento, o agente inibe a expressão ou atividade, ou reduz a quan- tidade, da proteína p38, na qual a atividade é opcionalmente atividade de cinase.
[0029] Em algumas modalidades, o agente inibe a expressão da proteína p38. Em modalidades particulares, o agente se liga a um poli- nucleotídeo que codifica a proteína p38 ou se liga a um polinucleotídeo antissenso. Em modalidades específicas, o agente compreende ou con- siste de um ácido nucleico, opcionalmente, um DNA, RNA, gRNA, shRNA, siRNA, ou oligonucleotídeo antissenso.
[0030] Em algumas modalidades, o agente inibe a atividade da pro- teína p38. Em modalidades particulares, o agente p38 se liga à proteína p38. Em modalidades particulares, o agente compreende ou consiste em um polipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um peptídeo, uma proteína mimética, um peptidomimético ou um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o agente compreende uma molécula pequena, opcionalmente, uma molécula orgânica pe- quena ou uma molécula inorgânica pequena.
[0031] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos divul- gados no presente documento, o gene alvo a jusante é RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, KHDC1L, ZSCAN4, PRAMEF20, TRIM49, PRA- MEF4, PRAME6, PRAMEF15 ou ZNF280A.
[0032] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos divulgados no presente documento, a expressão ou a atividade da pro- teína p38, ou a quantidade da proteína p38, é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40 %, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
[0033] Em uma modalidade relacionada, a presente divulgação for- nece um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúr- bio associado à expressão aumentada de um mRNA de DUX4-fl, uma proteína DUX4 ou um polipeptídeo codificado por um gene alvo de
DUX4 a jusante, em um paciente em necessidade do mesmo, compre- endendo fornecer ao paciente uma composição farmacêutica compre- endendo um agente que resulta em uma redução na quantidade de pro- teína p38 ativa em um ou mais tecidos do paciente, reduzindo assim a expressão do mRNA de DUX4-fl, da proteína DUX4, ou do polipeptídeo que codifica o gene alvo a jusante em um ou mais tecidos do paciente.
Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio é uma distrofia mus- cular fascio-escápulo-umeral (FSHD), opcionalmente FSHD1 ou FSHD2. Em certas modalidades, o paciente compreende repressão re- duzida em um lócus D4Z4. Em algumas modalidades, o paciente com- preende uma supressão de uma ou mais repetições uma ou mais repe- tições D4Z4 macrossatélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35, opcionalmente em que a célula compreende <7 repetições uma ou mais repetições D4Z4 macrossatélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35. Em algumas modalidades, o paciente compreende uma ou mais mutações na Manutenção Estrutural de Domínios Cromos- sômicos Articulados Flexíveis Contendo o gene 1 (SMCHD1)(SMCHD1). Em algumas modalidades, o paciente compre- ende pelo menos um alelo 4qA não suprimido.
Em certas modalidades, a expressão ou a atividade da proteína p38 é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% em um tecido muscular do paciente.
Em algumas modalidades, o método diminui a degeneração muscular no paciente.
Em algumas modalida- des, o método reduz a apoptose das células musculares no paciente.
Em algumas modalidades, o tecido muscular é terminalmente diferenci- ado.
Em modalidades particulares, a composição farmacêutica é forne- cida ao paciente por via parentérica ou oral.
Em certas modalidades, a composição farmacêutica é fornecida a um tecido muscular do paciente,
opcionalmente por via parentérica ou intramuscular. Em modalidades particulares, o método compreende ainda o fornecer ao indivíduo um segundo agente ou terapia para tratar a doença ou distúrbio associado com a expressão aumentada de uma proteína DUX4, ou de um polipep- tídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a jusante.
[0034] A presente divulgação também fornece uma forma de dosa- gem unitária de uma composição farmacêutica, caracterizada por com- preender um agente que resulta numa redução da quantidade de prote- ína p38 ativa em uma célula, e um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente ou excipiente, em que forma de dosagem unitária é eficaz para reduzir a expressão ou atividade de um mRNA DUX4-fl, um polipeptídeo DUX4, ou um polipeptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a ju- sante, em uma ou mais células ou tecidos de um paciente para quem a forma de dosagem unitária é administrado. Em modalidades particula- res, o agente se liga ao polipeptídeo DUX4 ou se liga a um polinucleotí- deo que codifica o polipeptídeo DUX4. Em algumas modalidades, o agente compreende ou consiste de um ácido nucleico, opcionalmente, um DNA, RNA, gRNA, shRNA, siRNA, ou oligonucleotídeo antissenso. Em algumas modalidades, o agente compreende ou consiste em um polipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um peptídeo, uma proteína mimética, um peptidomimético ou um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o agente compreende uma mo- lécula pequena, opcionalmente, uma molécula orgânica ou uma molé- cula inorgânica. Em certas modalidades, o tecido é tecido muscular, op- cionalmente em que o tecido compreende células que compreendem uma mutação associada à distrofia muscular fascio-escápulo-umeral (FSHD).
[0035] Em ainda uma modalidade relacionada, a presente divulgação fornece um método para reduzir a apoptose de uma célula muscular, carac- terizado pelo fato de que compreende colocar a célula em contato com um agente que resulta numa redução da quantidade de proteína p38 ativa na célula, opcionalmente em que a célula muscular é diferenciada ter- minalmente, reduzindo, assim, a expressão de um mRNA DUX4-fl, uma proteína DUX4 ou o polipeptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a jusante, na célula.
Em algumas modalidades, a célula tem um nível de expressão aumentada do mRNA DUX4-fl, do polipeptídeo DUX4, ou do polipeptídeo codificado pelo gene alvo a jusante, em comparação com o nível de expressão do polipeptídeo DUX4, ou do polipeptídeo codifi- cado pelo gene alvo a jusante, numa célula de controle.
Em algumas modalidades, o nível de expressão aumentada do mRNA de DUX4-fl, o polipeptídeo DUX4, ou o polipeptídeo codificado pelo gene alvo a ju- sante, é devido à repressão reduzida em um lócus D4Z4 na célula.
Em modalidades particulares, a célula compreende uma ou mais mutações associadas à FSHD.
Em certas modalidades, o agente inibe a expres- são da proteína p38, opcionalmente em que o agente se liga a um poli- nucleotídeo que codifica a proteína p38, ou a um polinucleotídeo antis- senso.
Por exemplo, em algumas modalidades, o agente compreende ou consiste de um ácido nucleico, opcionalmente, um DNA, RNA, shRNA, siRNA, ou oligonucleotídeo antissenso, por exemplo, que tem p38 como alvo.
Em algumas modalidades, o agente inibe a atividade da proteína p38, opcionalmente na qual o agente se liga à proteína p38. Em algumas modalidades, o agente compreende ou consiste em um polipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um peptídeo, uma proteína mimética, um peptidomimético ou um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo.
Em algumas modalidades, o agente compreende uma mo- lécula pequena, opcionalmente, uma molécula orgânica pequena ou uma molécula inorgânica pequena.
Em modalidades particulares, a ex- pressão ou a atividade da proteína p38, a proteína DUX4, ou o polipep- tídeo codificado pelo gene a jusante DUX4, é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40 %, pelo menos
50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%. Em modalidades particulares, o método reduz a apoptose das células musculares no tecido muscular, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% em comparação ao um controle, ou seja, uma célula não tratada.
[0036] Em certas modalidades de quaisquer dos métodos aqui di- vulgados, o agente reduz a expressão de DUX4 ou do gene alvo a ju- sante. Em certas modalidades, o agente se liga a uma proteína p38, por exemplo, p38- ou p38-, ou se liga a um polinucleotídeo que codifica a proteína p38, por exemplo, p38- ou p38-, ou um polinucleotídeo an- tissenso do mesmo. Em modalidades específicas, o agente compre- ende ou consiste de: um ácido nucleico, opcionalmente, um DNA, RNA, shRNA, siRNA, CRISPR gRNA, ou oligonucleotídeo antissenso. Em modalidades particulares, o agente compreende ou consiste em: um po- lipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um peptídeo, uma proteína mi- mética, um peptidomimético ou um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo. Em modalidades particulares, o agente compreende: uma mo- lécula pequena, opcionalmente, uma molécula orgânica ou uma molé- cula inorgânica. Em certas modalidades, o gene alvo a jusante é RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, KHDC1L, ZSCAN4, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 ou ZNF280A. Em modalidades parti- culares, o gene alvo a jusante é MBD3L2, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, ou KHDC1L.
[0037] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos divul- gados aqui, o agente liga-se a uma proteína p38, por exemplo, p38- ou p38- , ou se liga a um polinucleotídeo que codifica uma proteína p38, por exem- plo, p38- ou p38-. Em algumas modalidades, o agente compreende ou consiste de: um ácido nucleico, opcionalmente, um DNA, RNA, shRNA, siRNA, mRNA, CRISPR gRNA, mRNA modificado, morfolino ou oligonucleotídeo antissenso. Em algumas modalidades, o mRNA ou mRNA modificado codifica um anticorpo ou um fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o agente compreende ou consiste em: um polipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um peptídeo, uma proteína mimética, um peptidomimético ou um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o agente compreende ou consiste em um vetor de terapia genética, por exemplo, um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um poli- nucleotídeo ou um polipeptídeo inibidor de p38, por exemplo, p38- ou p38- ou outro alvo. Em algumas modalidades, o agente compreende ou consiste em uma molécula pequena, opcionalmente, uma molécula orgânica ou uma molécula inorgânica. Em certas modalidades, o alvo a jusante é RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, KHDC1L, ZSCAN4, PRA- MEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 ou ZNF280A. Em algumas modalidades, o gene alvo a jusante é MBD3L2, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, ou KHDC1L. Em algumas modalidades, o gene alvo a jusante é CCNA1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0038] A presente invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que a inibição da quinase p38, por exemplo, p38-, resulta na redução da expressão de DUX4 e genes a jusante regulados pelo DUX4. Por conseguinte, a invenção inclui métodos e composições relacionados ao uso de um inibidor de p38, por exemplo, p38-, (sozinho ou em combi- nação com outro agente) para reduzir os níveis de expressão e/ou ativi- dade de DUX4 e/ou qualquer um de seus genes alvo a jusante, por exemplo, no tratamento ou prevenção de doenças associadas à expres- são do DUX4 aberrante, tal como a FSHD, um tipo de distrofia muscular. Isto pode ser realizado de várias maneiras, por exemplo, reduzindo a expressão do mRNA de DUX4-fl, reduzindo a expressão da proteína DUX4, inibindo a atividade da proteína DUX4; edição do genoma por CRISPR e/ou induzindo a degradação da proteína DUX4.
[0039] As distrofias musculares são um grupo diversificado de do- enças genéticas que causam fraqueza progressiva dos músculos do corpo. Alguns tipos de distrofia muscular apresentarão sintomas na pri- meira infância, enquanto outros tipos aparecerão na idade adulta. Dife- rentes grupos musculares também podem ser afetados, dependendo do tipo de distrofia muscular. Vide, por exemplo, Isin Dalkilic e Louis M. Kunkel. Sabe-se que quase 30 genes dão origem a várias formas de distrofia muscular, que diferem na idade de início, gravidade e grupos musculares afetados. O número de genes identificados aumenta a cada ano, adicionando entendimento e revelando a complexidade geral da patogênese dessas doenças.
[0040] Por exemplo, duas distrofias musculares comuns - Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e Distrofia Muscular Fascio-Escápulo- Umeral (FSHD) - são consideradas doenças únicas com algumas ca- racterísticas compartilhadas. As semelhanças entre DMD e FSHD in- cluem que ambas são doenças genéticas e os sintomas incluem perda muscular com fraqueza muscular levando à incapacidade (portanto, DMD e FSHD estão agrupadas na grande categoria de distrofias mus- culares, o que significa degeneração muscular). No entanto, DMD e FSHD têm etiologia e diagnóstico de doença muito diferentes (perda de distrofina na DMD versus expressão de DUX4-miotoxina na FSHD). Por exemplo, na DMD, mutações no gene DMD (> 2000 conhecidas) resul- tam em distrofina ausente ou disfuncional. Na FSHD, a doença é cau- sada pela superexpressão do gene DUX4 no tecido muscular; não é devido a mutações pontuais no gene (a proteína DUX4 é expressa quando o número de repetições D4Z4 no gene DUX4 está entre 1 e 8,
ou quando a repressão é perdida em D4Z4 por mutações em outro me- canismo de silenciamento). Outras diferenças incluem que apenas o músculo esquelético está envolvido na FSHD, visto que ambos os mús- culos esquelético e cardíaco são afetados na DMD; o diafragma está envolvido na DMD, mas não na FSHD; geralmente há início na infância na DMD, mas início no adulto/adolescente na FSHD; e início com en- volvimento ambulatorial na DMD, mas início com face e braço/ombros proximais na FSHD. Outra distinção importante é que há resposta aos esteróides na DMD, mas não na FSHD. Além disso, o tratamento apro- vado para DMD (Exondys-51 nos EUA; Ataluren na UE) não terá efeito na FSHD. Finalmente, apenas os homens são afetados na DMD, en- quanto há envolvimento igual de ambos os sexos na FSHD.
[0041] A FSHD também possui uma patologia incomum e é única entre as distrofias musculares, pois seu desenvolvimento requer condi- ções genéticas e epigenéticas. A condição genética é a presença de um gene DUX4 completo. O gene DUX4 é um retrógeno normalmente ex- presso na linha germinativa e nas células embrionárias precoces, mas é reprimido pelo silenciamento induzido por repetição D4Z4 nos tecidos adultos (Ehrlich e Lacey, 2012). Cada elemento D4Z4 contém um pro- motor e a fase de leitura aberta (ORF) de DUX4, mas não possui um sinal de poliadenilação (PAS), resultando em rápida degradação do mRNA de DUX4. Em contraste, os transcritos iniciados na unidade distal D4Z4 em um alelo permissivo 4qA se estendem para fora da matriz de repetição e atingem um PAS na sequência flanqueadora pLAM (revisado em Tawil, et al., 2014; Himeda, et al., 2015). A cauda poli-A resultante es- tabiliza os mRNAS de DUX4 e permite a sua tradução em uma proteína que não é normalmente expressa em um músculo saudável e é tóxica para a função muscular esquelética. Dois aperfeiçoadores, o aperfeiçoador mi- ogênico DUX4 1 (DME1) e o DME2, que ativam a expressão de DUX4-fl nos miócitos esqueléticos, foram descritos para regular a expressão de
DUX4-fl na FSHD (Himeda et al., 2014).
[0042] Estágios FSHD1, FSHD2 no desenvolvimento inicial, bem como estágios de formação de linha germinativa, parecem conferir uma conformação transcricionalmente permissiva à cromatina D4Z4. Isso é evidenciado por alterações na modificação de histonas, hipometilação parcial mas variável de D4Z4 na FSHD1 e hipometilação mais extensa na FSHD2 (Himeda et al., 2015). No entanto, a hipometilação de D4Z4 não é suficiente para a doença, pois há ausência de sintomas de distro- fia muscular em pacientes com ICF (imunodeficiência, instabilidade na região centromérica e anomalias faciais), uma doença rara e associada à hipometilação do DNA, na qual D4Z4 é fortemente hipometilada (En- trada OMIM - # 614069).
[0043] DUX4 é uma proteína do fator de transcrição de homeobox, e a expressão de DUX4 no músculo induz um programa transcricional que leva à expressão de genes a jusante e produtos proteicos que nor- malmente não são expressos no músculo esquelético. Por exemplo, a expressão de DUX4 resulta na indução de vários genes de linha germi- nativa nos músculos esqueléticos d\ FSHD e nas células transfectadas (Yao et al, 2014; Ehrlich e Lacey, 2012). Muitos desses novos transcritos são expressos em células musculares da FSHD, mas não em células musculares de controle (Yao et al., 2014; Homma et al., 2015; Shadle et al., 2017; Bosnakovski et al., 2014). Como alguns dos genes alvo a jusante de DUX4 codificam fatores de transcrição, a ativação patológica de DUX4 leva a uma grande cascata de desregulação da expressão genética no músculo, que causa a doença (Yao et al., 2014; Homma et al., 2015; Shadle et al., 2017; Bosnakovski et al., 2014).
[0044] A expressão de DUX4 endógena (na miofibra FSHD) e for- çada nas células musculares é tóxica, leva à apoptose e ao estresse oxidativo e interfere na miogênese e na função sarcômero (Rickard et al., 2015; Homma et al., 2015; Bosnokovski et al., 2014; Tawil et al.,
2014; Himeda et al., 2015). A heterogeneidade clínica na progressão da doença e na idade de início pode ser explicada, em parte, pela instabi- lidade epigenética, levando a alterações progressivas na transcrição de DUX4. O papel da hipometilação do DNA e da transcrição permissiva de DUX4 é exemplificado pela alta gravidade clínica observada em pa- cientes que herdaram deficiências combinadas de FSHD1 e 2 (exami- nado em Tawil et al., 2014; van der Maarel et al., 2007). A heterogenei- dade clínica também é explicada pelas diferenças na gravidade do en- curtamento da repetição D4Z4, com fenótipo mais grave e idade mais jovem de início em pacientes com repetições mais curtas (1-3) em com- paração com pacientes com menos repetições severamente contraídas (4-7).
[0045] O DUX4 é agora reconhecido como a causa da patologia da FSHD, uma vez que a ativação de seus genes alvo é a principal assina- tura molecular no músculo FSHD (examinado em Tawil et al., 2014; Hi- meda et al., 2015). Os principais genes alvo a jusante são membros de famílias de genes altamente homólogos, que são agrupadas espacial- mente nos cromossomos, incluindo PRAMEF (preferencialmente ex- presso em melanoma), TRIM (contendo motivo tripartido), MBDL (pro- teína de ligação a metil-CpG), ZSCAN (dedo de zinco e contendo domí- nio SCAN) e famílias RFPL (do tipo proteína dedo ret) (Geng et al., 2012; Yao et al., 2014; Shadle et al., 2017; Ehrlich e Lacey, 2012; Tawil et al., 2014 van der Maarel et al., 2007). A discriminação entre FSHD e con- trole do músculo esquelético pode ser feita usando ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, ZNF280A, etc., (descrito em, mas não limitado a, Yao et al., 2014; Shadle et al., 2017; Ehrlich e Lacey, 2012).
[0046] As sondas químicas anotadas foram rastreadas para identificar alvos de fármacos de moléculas pequenas modificadoras de doenças que reduzem a expressão de DUX4 em miotubos FSHD. Essas triagens identificaram várias estruturas químicas que inibem a atividade da pro- teína quinase alfa ativada por mitogênio p38 (MAPK14 ou p38). Con- forme descrito nos exemplos anexos, foi demonstrado que o colapso do gene MAPK14 usando a tecnologia de RNA pequeno interferente (siRNA) ou edição de genoma mediado por CRISPR com RNAs guia específicos (gRNAs) que visam seletivamente a isoforma alfa da qui- nase p38 também reduz a expressão de DUX4 e de genes a jusante relacionados ao DUX4 em miotubos FSHD. Verificou-se também que os inibidores seletivos da quinase p38α e β reduziram especificamente DUX4 e seus genes a jusante em miotubos FSHD, impactando assim a fisiopatologia do processo da doença FSHD (dados exemplificados no presente documento). Os mesmos experimentos revelaram que os ini- bidores da quinase p38α e β não afetam a miogenina ou a expressão de outros fatores miogênicos, nem a proliferação de mioblastos ou a diferenciação de mioblastos exibidos por fusão miogênica nos miotubos FSHD, demonstrando, assim, que o efeito não é devido à toxicidade ge- ral para os músculos. Essas pequenas moléculas inibidoras de quinase p38 reduzem a expressão de DUX4 e genes a jusante relacionados, impactando assim a fisiopatologia do processo da doença FSHD, inclu- indo a redução da morte celular apoptótica. Esperava-se que a redução de DUX4 mediada por p38 impactasse os processos inflamatórios, de infiltração gordurosa e fibróticos a jusante na FSHD.
[0047] Membros da família p38 MAPK, compostos por isoformas α, β, γ e δ, são codificados por genes separados que desempenham um papel crítico nas respostas celulares necessárias para a adaptação ao es- tresse e à sobrevivência (examinado em Whitmarsh 2010; Martin et al., 2014; Krementsov et al., 2013). Em muitas doenças inflamatórias, inclu- indo cardiovasculares e outras doenças crônicas, esses mesmos sinais induzidos pelo estresse de p38 MAPK podem desencadear respostas não adaptativas que agravam, ao invés de aliviar, a doença (examinado em Whitmarsh 2010; Martin et al., 2014). De fato, no músculo esquelético, uma variedade de estresses celulares, incluindo exercícios crônicos, ex- posição à insulina e estados endócrinos alterados, diferenciação de mioblastos em miócitos, espécies reativas de oxigênio e apoptose, to- dos demonstraram induzir a via da quinase p38 (Keren, et al., 2006; Zarubin, et al., 2006). De fato, a via da quinase p38 pode ser ativada por vários estímulos externos, incluindo citocinas pró-inflamatórias e es- tresse celular, levando à ativação das quinases MAPK de e dupla espe- cificidade MKK3 e MKK6. A ativação de MKK3 e MKK6, que por sua vez fosforilam p38 em seu loop de ativação, desencadeia eventos de fosfo- rilação a jusante. Isso inclui a fosforilação de HSP27, MAPKAPK2 (MK2) e uma variedade de fatores de transcrição, que culminam em alterações transcricionais no núcleo. Um número modesto de transcritos regulados por p38 e um grande número de efetores a jusante da quinase p38 fo- ram identificados (descritos em Cuenda et al., 2007 e Kyriakis et al., 2001, Viemann et al. 2004).
[0048] Vários compostos de diferentes estruturas químicas que ini- bem a via de sinalização da p38α MAPK entraram em ensaios clínicos em diversas indicações (não neuromusculares), incluindo artrite reuma- tóide, doença pulmonar obstrutiva crônica, dor, doenças cardiovascula- res e câncer. A inibição de p38a e β em ensaios clínicos provou ser segura. A farmacologia in vitro e in vivo sugere que o envolvimento alvo de p38α nesses estudos clínicos foi robusto, conforme demonstrado pela medição da redução na fosforilação de HSP27 (um alvo indireto) e pMK2 (um alvo direto).
[0049] Sabe-se que p38α MAPK desempenha papéis críticos na bi- ologia do músculo esquelético, especificamente na revogação de mioblastos em proliferação para diferenciação e, subsequentemente, fu- são para formar miotubos multinucleados. O tratamento de pacientes com distrofia muscular que estão em processo constitutivo de degene- ração e regeneração com inibidores da p38α não seria óbvio. O nocaute completo (KO) da p38α é embrionicamente letal. O resgate embrionário permite a sobrevivência de filhotes até alguns dias após o nascimento e isolamento das células satélites para estudar precursores miogênicos isentos de 38α. Os mioblastos isentos de p38α expressam genes de diferenciação significativamente menos críticos e mostram déficits gra- ves na fusão. A histologia de filhotes P2 mostra células satélites ciclísti- cas aumentadas significamente e uma distribuição de fibra deslocada para a esquerda. (Perdiguero et al., 2007). É importante ressaltar que o KO de p38α no músculo maduro (cre impulsionado pelo promotor Myl1) não mostra deficiências nos primeiros momentos, mas camundongos com deficiência de p38α aos 6 meses de idade apresentam maior rege- neração significativamente e fibras tipo I, bem como uma menor distri- buição de fibras comparada a controles. (Wissing et. al, 2014). Estes dados sugerem que a inibição de p38α desencadeia a regeneração do músculo esquelético em doenças deficientes na regeneração, além da FSHD, por um mecanismo independente da regulação da expressão de DUX4.
[0050] No músculo esquelético, foi demonstrado que p38 regula a expressão genética durante a miogênese. Demonstrou-se que p38γ é necessária para a miogênese usando abordagens específicas de no- caute genético e nocaute condicional (Cuenda et.al., 2007; Kerin et.al., 2006; Aouadi et.al., 2006). No adulto, os inibidores seletivos de p38α e β evitam o impacto relacionado à p38γ na miogênese.
[0051] A presente divulgação descobriu que p38 é ativada durante a miogênese e que a inibição de p38α e β pelas moléculas exemplificadas no presente documento, incluindo FTX-839, FTX-1821, etc., reduz profunda- mente a expressão de DUX4 e seu programa de genes a jusante nos miotu- bos FSHD (dados exemplificados no presente documento). Sem desejar ser limitado pela teoria, a p38α parece regular diretamente a expressão de DUX4, afetando a atividade de aperfeiçoadores miogênicos críticos ne- cessários para a expressão patológica de DUX4 no nível do lócus D4Z4 mutado com repetições mais curtas (FSHD1) ou mutações SMCHD1 (FSHD2) ou quando a repressão é perdida por outros mecanismos nos músculos dos pacientes com FSHD. Esse é um mecanismo diferenciado dos estudos clínicos anteriores, que tinham como alvo as funções da p38 no citoplasma e falharam em mostrar eficácia em inúmeras doen- ças, incluindo artrite reumatóide, dor, depressão, doença pulmonar obs- trutiva crônica e doença cardiovascular. Inibidores da p38 nunca foram explorados clinicamente para FSHD.
[0052] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindica- ções anexas, as formas singulares "um(a)" e "o(a)" incluem referências plurais, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário.
[0053] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo "e/ou" é usado nesta divulgação para "e" ou "ou", salvo indicação em contrário.
[0054] Em todo este relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreender", ou variações como "com- preendendo" ou "compreende", serão entendidas como implicando a in- clusão de um elemento declarado ou número inteiro ou grupo de ele- mentos ou números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro ele- mento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros.
[0055] Conforme usado neste pedido, os termos "cerca de" e "apro- ximadamente" são usados como equivalentes. Quaisquer números usa- dos neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente destinam-se a cobrir quaisquer flutuações normais apreciadas por um técnico no as- sunto. Em certas modalidades, o termo "cerca de" ou "aproximada- mente" refere-se a uma faixa de valores que caem dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em qualquer direção (maior ou menor que) do indicado valor de referência, salvo indicação em contrário ou evidente do contexto (exceto quando esse número exceder 100% de um valor possível).
[0056] "Administração" ou "administrar" referem-se no presente do- cumento à introdução de um agente ou composição em um paciente ou ao contato de um agente ou composição com uma célula e/ou tecido.
[0057] Em certos aspectos, a divulgação inclui um método para re- duzir a expressão ou atividade de um polipeptídeo, mRNA ou gene DUX4, ou para reduzir a expressão ou atividade de um gene a jusante DUX4 ou polipeptídeo, incluindo, mas não limitado a qualquer daqueles divulgado aqui, em uma célula, tecido, órgão, ou paciente. Em modali- dades particulares, o mRNA DUX4 é DUX4-fl. Como usado aqui, o termo "gene a jusante de DUX4" refere-se a um gene que é transcripci- onalmente ativado (i.e., sua expressão é aumentada) por DUX4, e o termo "polipeptídeo a jusante de DUX4" refere-se ao polipeptídeo codi- ficado. São aqui fornecidos exemplos ilustrativos de genes a jusante de DUX4. Em certas modalidades, o gene a jusante de DUX4 é selecio- nado a partir daqueles mostrados na Figura 10A.
[0058] Os métodos aqui divulgados podem ser praticados in vitro ou in vivo e, em certas modalidades, os métodos compreendem colocar uma célula, tecido, órgão ou paciente em contato com um inibidor p38, resultando em uma quantidade reduzida de proteína P38 ativa na célula, tecido, órgão ou paciente. O termo "inibidor de p38" pode referir-se a qualquer agente que resulte numa quantidade reduzida de proteína P38 ativa na célula, tecido, órgão ou paciente. A quantidade de proteína P38 ativa numa célula pode ser reduzida através de uma variedade de meios, incluindo, mas não se limitando, à redução da quantidade total de proteína p38 ou à inibição de uma ou mais atividades da proteína p38. Em várias modalidades, um inibidor p38 pode inibir a expressão de um gene p38, um mRNA p38, ou uma proteína p38, e/ou um inibidor p38 pode inibir uma atividade biológica de uma proteína p38. Em certas modalidades, a atividade biológica é a atividade quinase. Por exemplo, um inibidor de p38 pode ligar-se competitivamente ao local de ligação ATP do P38 MAPK e inibir a sua atividade quinase, ou pode bloquear alostericamente a atividade quinase do P38 MAPK. Em certas modali- dades, um inibidor de p38 causa o aumento da degradação de uma pro- teína p38. Em modalidades particulares, o gene p38 ou proteína p38 é um gene p38 ou proteína p38 de mamífero, por exemplo, um gene p38 humano ou proteína p38 humana, por exemplo, um gene ou proteína humano p38- (MAPK14) ou p38- (MAPK11).
[0059] Quinase P38 MAP (MAPK), também chamada RK ou CSBP (Proteína de Ligação Específica à Citocinina), é o ortólogo mamífero da quinase Hog1p MAP da levedura, que participa de uma cascata de si- nalização que controla as respostas celulares às citocinas e estresse. Quatro quinases p38 MAP,  (MAPK14), -β (MAPK11), -γ (MAPK12 / ERK6), e –δ (MAPK13 / SAPK4), foram identificados. Estes incluem vá- rias isoformas. Em modalidades particulares, qualquer uma delas pode ser alvo dos métodos aqui divulgados. Em certas modalidades, o inibi- dor p38 inibe inhibits p38- (MAPK14) ou p38- (MAPK11), por exem- plo, versões humanas destes genes ou proteínas.
[0060] Em certa modalidade, a proteína P38 alvo compreende a se- quência de aminoácidos a seguir apresentada ou divulgada no acesso do GenBank NP_001306.1 para a quinase P38 (proteína quinase 14 isoforma 1 ativada por mitogênio, homo sapiens): MSQERPTFYRQELNKTIWEVPERYQNLSPVGSGAYGSVCAAFDT- KTGLRVAVKKLS-
RPFQSIIHAKRTYRELRLLKHMKHENVIGLLDVFTPARSLEEFNDVYLV THLMGADLNNIVKCQKLTDDHVQFLIYQILRGLKYIHSADIIHRDLK- PSNLAVNEDCELKIL- DFGLARHTDDEMTGYVATRWYRAPEIMLNWMHYNQTVDIWSVGCIM AELLTGRTLFPGTDHIDQLKLILRLVGTPGAELLKKISSESARNYIQS- LTQMPKMNFANVFI-
GANPLAVDLLEKMLVLDSDKRITAAQALAHAYFAQYHDPDDEPVADP YDQSFESRDLLIDEWKSLTYDEVISFVPPPLDQEEMES (SEQ ID NO:1).
[0061] Em certas modalidades, o gene P38, o cDNA, o mRNA ou a sequência de codificação alvos compreendem a sequência de ácido nu- cleico p38- estabelecida abaixo ou divulgada no acesso do GenBank NM_001315.2, ou um complemento deste: TTCTCTCACGAAGCCCCGCCCGCGGAGAGGTTCCATATTGGG- TAAAATCTCGGCTCTCGGA-
GAGTCCCGGGAGCTGTTCTCGCGAGAGTACTGCGGGAGGCTCCC GTTTGCTGGCTCTTGGAACCGCGACCACTGGAGCCTTAGCGGG- CGCAGCAGCTGGAACGGGA- GTACTGCGACGCAGCCCGGAGTCGGCCTTGTAGGGGCGAAGGT GCAGGGAGATCGCGGCGGGCGCAGTCTTGAGCGCCGGAGCG- CGTCCCTGCCCTTAGCGGGG- CTTGCCCCAGTCGCAGGGGCACATCCAGCCGCTGCGGCTGACAG CAGCCGCGCGCGCGGGAGTCTGCGGGGTCGCGGCAGCCGCAC- CTGCGCGGGCGACCAGCG- CAAGGTCCCCGCCCGGCTGGGCGGGCAGCAAGGGCCGGGGAGA GGGTGCGGGTGCAGGCGGGGGCCCCACAGGGCCACCTTCTTG- CCCGGCGGCTGCCGCTGGA- AAATGTCTCAGGAGAGGCCCACGTTCTACCGGCAGGAGCTGAAC AAGACAATCTGGGAGGTGCCCGAGCGTTACCAGAACCTG- TCTCCAGTGGGCTCTGGCGCCTA- TGGCTCTGTGTGTGCTGCTTTTGACACAAAAACGGGGTTACGTGT GGCAGTGAAGAAGCTCTCCAGACCATTTCAGTCCATCATTCATG- CGAAAAGAACCTACA- GAGAACTGCGGTTACTTAAACATATGAAACATGAAAATGTGATTGG TCTGTTGGACGTTTTTACACCTGCAAGGTCTCTGGAGGAATTCAA- TGATGTGTATCTGGTGA- CCCATCTCATGGGGGCAGATCTGAACAACATTGTGAAATGTCAGA AGCTTACAGATGACCATGTTCAGTTCCTTATCTACCAAATT- CTCCGAGGTCTAAAGTATATA- CATTCAGCTGACATAATTCACAGGGACCTAAAACCTAGTAATCTAG CTGTGAATGAAGACTGTGAGCTGAAGATTCTGGATTTTGGACTGG- CTCGGCACACAGA- TGATGAAATGACAGGCTACGTGGCCACTAGGTGGTACAGGGCTC CTGAGATCATGCTGAACTGGATGCATTACAACCAGACAGTTGATA- TTTGGTCAGTGGGATG- CATAATGGCCGAGCTGTTGACTGGAAGAACATTGTTTCCTGGTAC AGACCATATTAACCAGCTTCAGCAGATTATGCGTCTGACAGGAA- CACCCCCCGCTTATCT- CATTAACAGGATGCCAAGCCATGAGGCAAGAAACTATATTCAGTC TTTGACTCAGATGCCGAAGATGAACTTTGCGAATGTATTTATTGG- TGCCAATCCCCTGGCTG- TCGACTTGCTGGAGAAGATGCTTGTATTGGACTCAGATAAGAGAA TTACAGCGGCCCAAGCCCTTGCACATGCCTACTTTGCTCAGTAC- CACGATCCTGATGATGAACCAGTGGCCGATCCTTATGATCAGTCC TTTGAAAGCAGGGACCTCCTTATAGATGAGTGGAAAAGCCTGACC- TATGATGAAGTCATCAG- CTTTGTGCCACCACCCCTTGACCAAGAAGAGATGGAGTCCTGAGC ACCTGGTTTCTGTTCTGTTGATCCCACTTCACTGTGAGGGGAAGG- CCTTTTCACGGGAAC- TCTCCAAATATTATTCAAGTGCCTCTTGTTGCAGAGATTTCCTCCA TGGTGGAAGGGGGTGTGCGTGCGTGTGCGTGCGTGTTAGTGTG- TGTGCATGTGTGTGTCTG- TCTTTGTGGGAGGGTAAGACAATATGAACAAACTATGATCACAGT GACTTTACAGGAGGTTGTGGATGCTCCAGGGCAGCCTCCAC- CTTGCTCTTCTTTCTGAGAG- TTGGCTCAGGCAGACAAGAGCTGCTGTCCTTTTAGGAATATGTTC AATGCAAAGTAAAAAAATATGAATTGTCCCCAATCCCGGTCATG- CTTTTGCCACTTTGGCTT- CTCCTGTGACCCCACCTTGACGGTGGGGCGTAGACTTGACAACAT CCCACAGTGGCACGGAGAGAAGGCCCATACCTTCTGGTTGCTT- CAGACCTGACACCGTCCCT- CAGTGATACGTACAGCCAAAAAGGACCAACTGGCTTCTGTGCACT AGCCTGTGATTAACTTGCTTAGTATGGTTCTCAGATCTTGACAGTA- TATTTGAAACTGTAAA- TATGTTTGTGCCTTAAAAGGAGAGAAGAAAGTGTAGATAGTTAAAA GACTGCAGCTGCTGAAGTTCTGAGCCGGGCAAGTCGAGAGGG- CTGTTGGACAGCTGCTTG- TGGGCCCGGAGTAATCAGGCAGCCTTCATAGGCGGTCATGTGTG CATGTGAGCACATGCGTATATGTGCGTCTCTCTTTCTCCCTCAC- CCCCAGGTGTTGCCATTT- CTCTGCTTACCCTTCACCTTTGGTGCAGAGGTTTCTTGAATATCTG CCCCAGTAGTCAGAAGCAGGTTCTTGATGTCATGTACTTCCTGTG- TACTCTTTATTTCTAG- CAGAGTGAGGATGTGTTTTGCACGTCTTGCTATTTGAGCATGCAC AGCTGCTTGTCCTGCTCTCTTCAGGAGGCCCTGGTGTCAGGCA- GGTTTGCCAGTGAAGACTT- CTTGGGTAGTTTAGATCCCATGTCACCTCAGCTGATATTATGGCAA GTGATATCACCTCTCTTCAGCCCCTAGTGCTATTCTGTGTTGAA- CACAATTGATACTTCAGG- TGCTTTTGATGTGAAAATCATGAAAAGAGGAACAGGTGGATGTATA GCATTTTTATTCATGCCATCTGTTTTCAACCAACTATTTTTGAGGA- ATTATCATGGGAAAA- GACCAGGGCTTTTCCCAGGAATATCCCAAACTTCGGAAACAAGTT ATTCTCTTCACTCCCAATAACTAATGCTAAGAAATGCTGAAAAT- CAAAGTAAAAAATTAAAG- CCCATAAGGCCAGAAACTCCTTTTGCTGTCTTTCTCTAAATATGAT TACTTTAAAATAAAAAAGTAACAAGGTGTCTTTTCCACTCCTATG- GAAAAGGGTCTTCTTGG- CAGCTTAACATTGACTTCTTGGTTTGGGGAGAAATAAATTTTGTTT CAGAATTTTGTATATTGTAGGAATCCTTTGAGAATGTGATT- CCTTTTGATGGGGAGAAAGGG- CAAATTATTTTAATATTTTGTATTTTCAACTTTATAAAGATAAAATAT CCTCAGGGGTGGAGAAGTGTCGTTTTCATAACTTGCTGAATTTCA- GGCATTTTGTTCTACA- TGAGGACTCATATATTTAAGCCTTTTGTGTAATAAGAAAGTATAAA GTCACTTCCAGTGTTGGCTGTGTGACAGAATCTTGTATTTGGG- CCAAGGTGTTTCCATTTCT- CAATCAGTGCAGTGATACATGTACTCCAGAGGGACAGGGTGGAC CCCCTGAGTCAACTGGAGCAAGAAGGAAGGAGGCAGAC- TGATGGCGATTCCCTCTCACCCGG- GACTCTCCCCCTTTCAAGGAAAGTGAACCTTTAAAGTAAAGGCCT CATCTCCTTTATTGCAGTTCAAATCCTCACCATCCACAGCAAGA- TGAATTTTATCAGCCATG- TTTGGTTGTAAATGCTCGTGTGATTTCCTACAGAAATACTGCTCTG AATATTTTGTAATAAAGGTCTTTGCACATGTGACCACATACGTGT- TAGGAGGCTGCATG- CTCTGGAAGCCTGGACTCTAAGCTGGAGCTCTTGGAAGAGCTCTT CGGTTTCTGAGCATAATGCTCCCATCTCCTGATTTCTCTGAACA- GAAAACAAAAGAGAGAA- TGAGGGAAATTGCTATTTTATTTGTATTCATGAACTTGGCTGTAATC AGTTATGCCGTATAGGATGTCAGACAATACCACTGGTTAAAA- TAAAGCCTATTTTTCAAATT- TAGTGAGTTTCTCAAGTTTATTATATTTTTCTCTTGTTTTTATTTAAT GCACAATATGGCATTATATCAATATCCTTTAAACTGTGACCTGGCA- TACTTGTCTGACAGA- TCTTAATACTACTCCTAACATTTAGAAAATGTTGATAAAGCTTCTTA GTTGTACATTTTTTGGTGAAGAGTATCCAGGTCTTTGCTGTGGA- TGGGTAAAGCAAAGAG- CAAATGAACGAAGTATTAAGCATTGGGGCCTGTCTTATCTACACTC GAGTGTAAGAGTGGCCGAAATGACAGGGCTCAGCAGACTGTGG- CCTGAGGGCCAAATCTGG- CCCACCACCTGTTTGGTGTAGCCTGCTAAGAATGGCTTTTACATTT TTAAATGGTTGGGAAAGAAAAAAAAAGAAGTAGTAGATTTTGTAG- CATGTGATGTAAGTAA-
TGTAAAACTTAAATTCCAGTATCCATAAATAAAGTTTTATGAGAACA GA (SEQ ID NO:2).
[0062] Em certa modalidade, a proteína P38 alvo compreende a se- quência de aminoácidos a seguir apresentada ou divulgada no acesso do GenBank NP_002742.3 para a quinase P38 (proteína quinase 11 isoforma 1 ativada por mitogênio, homo sapiens): MSGPRAGFYRQELNKTVWEVPQRLQGLRPVGS- GAYGSVCSAYDARLRQKVAVKKLSRPFQS-
LIHARRTYRELRLLKHLKHENVIGLLDVFTPATSIEDFSEVYLVTTLMG ADLNNIVKCQALSDEHVQFLVYQLLRGLKYIHSAGIIHRDLKPSN- VAVNEDCELRILDF- GLARQADEEMTGYVATRWYRAPEIMLNWMHYNQTVDIWSVGCIMA ELLQGKALFPGSDYIDQLKRIMEVVGTPSPEVLAKISSEHARTYIQSL- PPMPQKDLSSIFR-
GANPLAIDLLGRMLVLDSDQRVSAAEALAHAYFSQYHDPEDEPEAEP YDESVEAKERTLEEWKELTYQEVLSFKPPEPPKPPGSLEIEQ (SEQ ID NO:3).
[0063] Em certas modalidades, o gene P38, o cDNA, o mRNA ou a se- quência de codificação alvos compreendem a sequência de ácido nucleico p38- estabelecida abaixo ou divulgada no acesso do GenBank NM_002751.6, ou um complemento desta: CGCCGCCTCCGCCGCCCTCCGCTCCGCTCGGCTCGGGCTCGG- CTCGGGCGCGGGCGCGGGG-
CGCGGGGCTGGGCCCGGGCGGAGCGGCGGCTGCTCCGGACAT GTCGGGCCCTCGCGCCGGCTTCTACCGGCAGGAGCTGAACAA- GACCGTGTGGGAGGTGCCG- CAGCGGCTGCAGGGGCTGCGCCCGGTGGGCTCCGGCGCCTACG GCTCCGTCTGTTCGGCCTACGACGCCCGGCTGCGCCAGAAGG- TGGCGGTGAAGAAGCTGTCG- CGCCCCTTCCAGTCGCTGATCCACGCGCGCAGAACGTACCGGGA GCTGCGGCTGCTCAAGCACCTGAAGCACGAGAACGTCATCGGG- CTTCTGGACGTCTTCACG- CCGGCCACGTCCATCGAGGACTTCAGCGAAGTGTACTTGGTGAC CACCCTGATGGGCGCCGACCTGAACAACATCGTCAAGTGCCAGG- CGCTGAGCGACGAGCACG- TTCAATTCCTGGTTTACCAGCTGCTGCGCGGGCTGAAGTACATCC ACTCGGCCGGGATCATCCACCGGGACCTGAAGCCCAGCAACG- TGGCTGTGAACGAGGACTG- TGAGCTCAGGATCCTGGATTTCGGGCTGGCGCGCCAGGCGGACG AGGAGATGACCGGCTATGTGGCCACGCGCTGGTACCGGGCAC- CTGAGATCATGCTCAACTG- GATGCATTACAACCAAACAGTGGATATCTGGTCCGTGGGCTGCAT CATGGCTGAGCTGCTCCAGGGCAAGGCCCTCTTCCCGGGAAG- CGACTACATTGACCAG- CTGAAGCGCATCATGGAAGTGGTGGGCACACCCAGCCCTGAGGT TCTGGCAAAAATCTCCTCAGAACACGCCCGGACATATATCCAG- TCCCTGCCCCCCATG- CCCCAGAAGGACCTGAGCAGCATCTTCCGTGGAGCCAACCCCCT GGCCATAGACCTCCTTGGAAGGATGCTGGTGCTGGACAGTGAC- CAGAGGGTCAGTGCAG- CTGAGGCACTGGCCCACGCCTACTTCAGCCAGTACCACGACCCC GAGGATGAGCCAGAGGCCGAGCCATATGATGAGAGCGTTGAGG- CCAAGGAGCGCACGCTGGA- GGAGTGGAAGGAGCTCACTTACCAGGAAGTCCTCAGCTTCAAGC CCCCAGAGCCACCGAAGCCACCTGGCAGCCTGGAGATTGAGCA- GTGAGGTGCTGCCCAGCAG- CCCCTGAGAGCCTGTGGAGGGGCTTGGGCCTGCACCCTTCCACA GCTGGCCTGGTTTCCTCGAGAGGCACCTCCCACACTCCTATGGT- CACAGACTTCTGGCCTAG- GACCCCTCGCCTTCAGGAGAATCTACACGCATGTATGCATGCACA AACATGTGTGTACATGTGCTTGCCATGTGTAGGAGTCTGGGCA- CAAGTGTCCCTGGGCCTAC- CTTGGTCCTCCTGTCCTCTTCTGGCTACTGCACTCTCCACTGGGA CCTGACTGTGGGGTCCTAGATGCCAAAGGGGTTCCCCTGCGGAG- TTCCCCTGTCTGTCCCA- GGCCGACCCAAGGGAGTGTCAGCCTTGGGCTCTCTTCTGTCCCA GGGCTTTCTGGAGGACGCGCTGGGGCCGGGACCCCGGGAGACT- CAAAGGGAGAGGTCTCAG- TGGTTAGAGCTGCTCAGCCTGGAGGTAGGGGGCTGTCTTGGTCA CTGCTGAGACCCACAGGTCTAAGAGGAGAGGCAGAGCCAGTG- TGCCACCAGGCTGGGCAGG- GACAACCACCAGGTGTCAAATGAGAAAAGCTGCCTGGAGTCTTGT GTTCACCCGTGGGTGTGTGTGGGCACGTGTGGATGAGCGTG- CACTCCCCGTGTTCATATGT- CAGGGCACATGTGATGTGGTGCGTGTGAATCTGTGGGCGCCCAA GGCCAGCAGCCATATCTGGCAAGAAGCTGGAGCCGGGGTGGG- TGTGCTGTTGCCTT- CCCTCTCCTCGGTTCCTGATGCCTTGAGGGGTGTTTCAGACTGGC GGCTCCAGTGGGCCAAAGGGCAACCACATGAGCATGGGCA- GGGGCTTTCTCCTTGGATGTGG- GACCCACAGCAGCTTCCTGAGGCTGGGGGTGGGTGGGTGGGTG GTTTGGCCTTGAGGACGCTAGGGCAGGCAGCACACCTGGATGTG- GACTTGGACTCGGACAC- TTCTGCCCTGCACCCTGGCCCGCTCTCTACCTCTGCCCACCGTTG TGGCCCTGCAGCCGGAGATCTGAGGTGCTCTGGTCTGTGGGTCA- GTCCTCTTTCCTTG- TCCCAGGATGGAGCTGATCCAGTAACCTCGGAGACGGGACCCTG CCCAGAGCTGAGTTGGGGGTGTGGCTCTGCCCTGGAAAGGGGG- TGACCTCTTG-
CCTCGAGGGGCCCAGGGAAGCCTGGGTGTCAAGTGCCTGCACCA GGGGTGCACAATAAAGGGGGTTCTCTCT- CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO:4)
[0064] Em certas modalidades, métodos divulgados aqui compre- endendo colocar uma célula, tecido, órgão ou paciente em contato com um inibidor de p38, são praticados para inibir ou diminuir a expressão ou atividade do DUX4 ou um ou mais genes a jusante de DUX4. Em certas modalidades, o DUX4 ou gene a jusante de DUX4 é um gene humano. Por exemplo, o gene homeobox dupla 4 de DUX4 (Homo sa- piens) pode incluir a sequência de nucleotídeos estabelecida abaixo ou divulgada no acesso do GenBank NG_034189.2, ou um complemento desta: ATGGCCCTCCCGACACCCTCGGACAGCACCCTCCCCGCGGAAG- CCCGGGGACGAGGACGG-
CGACGGAGACTCGTTTGGACCCCGAGCCAAAGCGAGGCCCTGCG AGCCTGCTTTGAGCGGAACCCGTACCCGGGCATCGCCACCA- GAGAACGGCTGGCCCAGG- CCATCGGCATTCCGGAGCCCAGGGTCCAGATTTGGTTTCAGAATG AGAGGTCACGCCAGCTGAGGCAGCACCGGCGGGAATCTCGG- CCCTGGCCCGGGAGACGCGG- CCCGCCAGAAGGCCGGCGAAAGCGGACCGCCGTCACCGGATCC CAGACCGCCCTGCTCCTCCGAGCCTTTGAGAAGGATCGCTTT- CCAGGCATCGCCGCCCGGGA- GGAGCTGGCCAGAGAGACGGGCCTCCCGGAGTCCAGGATTCAGA TCTGGTTTCAGAATCGAAGGGCCAGGCACCCGGGACAGGGTGG- CAGGGCGCCCGCGCAGGCA- GGCGGCCTGTGCAGCGCGGCCCCCGGCGGGGGTCACCCTGCTC CCTCGTGGGTCGCCTTCGCCCACACCGGCGCGTGGGGA- ACGGGGCTTCCCGCACCCCACGTG- CCCTGCGCGCCTGGGGCTCTCCCACAGGGGGCTTTCGTGAGCCA GGCAGCGAGGGCCGCCCCCGCGCTGCAGCCCAGCCAGGCCG- CGCCGGCAGAGGGGA- TCTCCCAACCTGCCCCGGCGCGCGGGGATTTCGCCTACGCCGCC CCGGCTCCTCCGGACGGGGCGCTCTCCCACCCTCAGG- CTCCTCGCTGGCCTCCGCACCCGGG- CAAAAGCCGGGAGGACCGGGACCCGCAGCGCGACGGCCTGCCG GGCCCCTGCGCGGTGGCACAGCCTGGGCCCGCTCAAGCGGGG- CCGCAGGGCCAAGGGGTG- CTTGCGCCACCCACGTCCCAGGGGAGTCCGTGGTGGGGCTGGG GCCGGGGTCCCCAGGTCGCCGGGGCGGCGTGGGAACCCCAAG- CCGGGGCAGCTCCAC- CTCCCCAGCCCGCGCCCCCGGACGCCTCCGCCTCCGCGCGGCA GGGGCAGATGCAAGGCATCCCGGCGCCCTCCCAGGCGCTCCAG- GAGCCGGCGCCCTGGTCTG- CACTCCCCTGCGGCCTGCTGCTGGATGAGCTCCTGGCGAGCCCG GAGTTTCTGCAGCAGGCGCAACCTCTCCTAGAAACGGAGG- CCCCGGGGGAGCTGGAGG- CCTCGGAAGAGGCCGCCTCGCTGGAAGCACCCCTCAGCGAGGAA GAATACCGGGCTCTGCTGGAGGAGCTTTAGGACGCGGGGTTGG- GACGGGGTCGGGTGGTT- CGGGGCAGGGCGGTGGCCTCTCTTTCGCGGGGAACACCTGGCT GGCTACGGAGGGGCGTGTCTCCGCCCCGCCCCCTCCACCGGG- CTGACCGGCCTGGGATT- CCTGCCTTCTAGGTCTAGGCCCGGTGAGAGACTCCACACCGCGG AGAACTGCCATTCTTTCCTGGGCATCCCGGGGATCCCAGAG- CCGGCCCAGGTACCAGCAGG- TGGGCCGCCTACTGCGCACGCGCGGGTTTGCGGGCAGCCGCCT GGGCTGTGGGAGCAGCCCGGGCAGAGCTCTCCTGCCTCTCCAC- CAGCCCACCCCGCCG- CCTGACCGCCCCCTCCCCACCCCCACCCCCCACCCCCGGAAAAC GCGTCGTCCCCTGGGCTGGGTGGAGACCCCCGTCCCGCGAAA- CACCGGGCCCCGCGCAGCG- TCCGGGCCTGACACCGCTCCGGCGGCTCGCCTCCTCTGCGCCCC CGCGCCACCGTCGCCCGCCCGCCCGGGCCCCTGCAGCCTCCCA- GCTGCCAGCACGGAGCG- CCTGGCGGTCAAAAGCATACCTCTGTCTGTCTTTGCCCGCTTCCT GGCTAGACCTGCGCGCAGTGCGCACCCCGGCTGACGTGCAAGG- GAGCTCGCTGGCCTCTCTG-
TGCCCTTGTTCTTCCGTGAAATTCTGGCTGAATGTCTCCCCCCAC CTTCCGACGCTGTCTAGGCAAACCTGGATTAGAGTTACA- TCTCCTGGATGATTAGTTCAGA- GATATATTAAAATGCCCCCTCCCTGTGGATCCTATAG (SEQ ID NO:5).
[0065] Por exemplo, o mRNA de homeobox dupla 4 de DUX4 [Homo sapiens] pode incluir a sequência de nucleotídeos estabelecida abaixo ou divulgada no acesso do GenBank NM_001293798.2, ou um comple- mento desta:
ATGGCCCTCCCGACACCCTCGGACAGCACCCTCCCCGCGGAAG- CCCGGGGACGAGGACGG- CGACGGAGACTCGTTTGGACCCCGAGCCAAAGCGAGGCCCTGCG AGCCTGCTTTGAGCGGAACCCGTACCCGGGCATCGCCACCA- GAGAACGGCTGGCCCAGG- CCATCGGCATTCCGGAGCCCAGGGTCCAGATTTGGTTTCAGAATG AGAGGTCACGCCAGCTGAGGCAGCACCGGCGGGAATCTCGG- CCCTGGCCCGGGAGACGCGG- CCCGCCAGAAGGCCGGCGAAAGCGGACCGCCGTCACCGGATCC CAGACCGCCCTGCTCCTCCGAGCCTTTGAGAAGGATCGCTTT- CCAGGCATCGCCGCCCGGGA- GGAGCTGGCCAGAGAGACGGGCCTCCCGGAGTCCAGGATTCAGA TCTGGTTTCAGAATCGAAGGGCCAGGCACCCGGGACAGGGTGG- CAGGGCGCCCGCGCAGGCA- GGCGGCCTGTGCAGCGCGGCCCCCGGCGGGGGTCACCCTGCTC CCTCGTGGGTCGCCTTCGCCCACACCGGCGCGTGGGGA- ACGGGGCTTCCCGCACCCCACGTG- CCCTGCGCGCCTGGGGCTCTCCCACAGGGGGCTTTCGTGAGCCA GGCAGCGAGGGCCGCCCCCGCGCTGCAGCCCAGCCAGGCCG- CGCCGGCAGAGGGGA- TCTCCCAACCTGCCCCGGCGCGCGGGGATTTCGCCTACGCCGCC CCGGCTCCTCCGGACGGGGCGCTCTCCCACCCTCAGG- CTCCTCGCTGGCCTCCGCACCCGGG- CAAAAGCCGGGAGGACCGGGACCCGCAGCGCGACGGCCTGCCG GGCCCCTGCGCGGTGGCACAGCCTGGGCCCGCTCAAGCGGGG- CCGCAGGGCCAAGGGGTG- CTTGCGCCACCCACGTCCCAGGGGAGTCCGTGGTGGGGCTGGG GCCGGGGTCCCCAGGTCGCCGGGGCGGCGTGGGAACCCCAAG- CCGGGGCAGCTCCAC- CTCCCCAGCCCGCGCCCCCGGACGCCTCCGCCTCCGCGCGGCA GGGGCAGATGCAAGGCATCCCGGCGCCCTCCCAGGCGCTCCAG- GAGCCGGCGCCCTGGTCTG- CACTCCCCTGCGGCCTGCTGCTGGATGAGCTCCTGGCGAGCCCG GAGTTTCTGCAGCAGGCGCAACCTCTCCTAGAAACGGAGG- CCCCGGGGGAGCTGGAGG- CCTCGGAAGAGGCCGCCTCGCTGGAAGCACCCCTCAGCGAGGAA GAATACCGGGCTCTGCTGGAGGAGCTTTAGGACGCGGGGTC- TAGGCCCGGTGAGAGACTCCA- CACCGCGGAGAACTGCCATTCTTTCCTGGGCATCCCGGGGATCC CAGAGCCGGCCCAGGTACCAGCAGACCTGCGCGCAGTGCGCAC- CCCGGCTGACGTGCAAGG- GAGCTCGCTGGCCTCTCTGTGCCCTTGTTCTTCCGTGAAATTCTG GCTGAATGTCTCCCCCCACCTTCCGACGCTGTCTAGGCAAAC- CTGGATTAGAGTTACA-
TCTCCTGGATGATTAGTTCAGAGATATATTAAAATGCCCCCTCCCT GTGGATCCTATAG (SEQ ID NO:6).
[0066] Em modalidade particular, a sequência de polipeptídeos DUX4 é a que se segue ou é divulgada no acesso do GenBank NP_001280727.1: MALPTPSDSTLPAEARGRGRRRRLVWTPSQSEALRACFERNPYPGI- ATRERLAQAIGIPE-
PRVQIWFQNERSRQLRQHRRESRPWPGRRGPPEGRRKRTAVTGS QTALLLRAFEKDRFPGIAAREELARETGLPESRIQIWFQNR- RARHPGQGGRA- PAQAGGLCSAAPGGGHPAPSWVAFAHTGAWGTGLPAPHVPCAPGA LPQGAFVSQAARAAPALQPSQAAPAEGISQPAPARGDFAYAAPAPP- DGALSHPQAPRW- PPHPGKSREDRDPQRDGLPGPCAVAQPGPAQAGPQGQGVLAPPTS QGSPWWGWGRGPQVAGAAWEPQAGAAPPPQPAPPDASASAR- QGQMQGIPAPSQALQEPA-
PWSALPCGLLLDELLASPEFLQQAQPLLETEAPGELEASEEAASLEA PLSEEEYRALLEEL (SEQ ID NO:7).
[0067] Sequências de alvos ou genes a jusante de DUX4 são co- nhecidas na técnica e os genes a jusante de DUX4 ilustrativos são for- necidos pelos números de acesso abaixo indicados: MBD3L2: Acesso de nucleotídeo genômico NC_000019.10 (7049340..7051735) acesso de nucleotídeo mRNA NM_144614.3 acesso de polipeptídeo protéico NP_653215.2 ZSCAN4: NC_000019.10 (57651497..57679152) NM_152677.2 NP_689890.1 LEUTX: NC_000019.10 (39776594..39786135) NM_001143832.1 NP_001137304.1 PRAMEF2: NC_000001.11 (12857086..12861909) NM_023014.1 NP_075390.1 TRIM43: NC_000002.12 (95592018..95599723) NM_138800.2 NP_620155.1 KHDC1L: NC_000006.12 (73223544..73225452, complement) NM_001126063.2 NP_001119535.1
[0068] Métodos para determinar o nível de expressão de p38, DUX4, ou um gene a jusante de DUX4 ou polipeptídeo em uma amostra biológica, por exemplo, tecido, são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, RT-PCR e FACS.
[0069] Em uma modalidade, um método para reduzir a expressão de um mRNA DUX4 (por exemplo, DUX4-fl), um polipeptídeo DUX4, ou um polipeptídeo codificado por gene alvo de DUX4 a jusante, em uma célula, tecido, órgão, ou paciente, compreende colocar a célula, tecido, órgão, ou paciente em contato com um agente que resulta em uma quantidade reduzida de proteína p38 ativa (também referido aqui como um inibidor de p38), por exemplo, um inibidor de p38- e/ou p38-. Em certas modalidades, o agente inibe a expressão ou atividade da proteína p38. Em certas modalidades, o agente causa degradação aumentada de uma proteína p38, por exemplo, p38- e/ou p38-. Em modalidades particulares, a célula ou o tecido é colocado(a) em contato com uma quantidade do agente eficaz para reduzir a expressão ou atividade de um polipeptídeo DUX4, ou um polipeptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a jusante, na célula ou tecido. Em certas modalidades, a célula ou o tecido são colocados em contato com uma quantidade do agente eficaz para reduzir a quantidade de proteína p38 ativa na célula ou no tecido. Em modalidades particulares, as células são células musculares. Em certas modalidades, as células são terminalmente diferenciadas, por exemplo, células musculares diferenciadas terminalmente. Em algu- mas modalidades, as células têm um nível de expressão aumentada do polipeptídeo DUX4, ou o polipeptídeo codificado pelo gene alvo a ju- sante, em comparação com o nível de expressão em uma célula de con- trole. Em certas modalidades, as células estão associadas com a dis- trofia muscular fascio-escápulo-umeral (FSHD), por exemplo, FSHD1 ou FSHD2. Por exemplo, as células podem ser derivadas ou obtidas a partir de células ou tecidos de um paciente diagnosticado com FSHD.
Os métodos aqui divulgados podem ser praticados in vitro ou in vivo.
[0070] Em uma modalidade, a divulgação fornece um método de redução de apoptose em uma célula ou tecido, compreendendo colocar a célula ou tecido em contato com um agente que inibe a expressão ou atividade de uma proteína p38 (também referido aqui como um inibidor de p38), por exemplo, um inibidor de p38- e/ou p38-. Em modalidades particulares, a célula ou o tecido é colocado(a) em contato com uma quantidade do agente eficaz para reduzir a expressão ou atividade de um polipeptídeo DUX4, ou um polipeptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a jusante, na célula ou tecido. Em certas modalidades, a célula ou o tecido são colocados em contato com uma quantidade do agente eficaz para reduzir a quantidade de proteína p38 ativa na célula ou no tecido. Em modalidades particulares, as células são células musculares. Em certas modalidades, as células são terminalmente diferenciadas, por exemplo, células musculares diferenciadas terminalmente. Em algu- mas modalidades, as células têm um nível de expressão aumentada do polipeptídeo DUX4, ou o polipeptídeo codificado pelo gene alvo a ju- sante, em comparação com o nível de expressão em uma célula de con- trole (isto é, antes do tratamento). Em certas modalidades, as células estão associadas com a distrofia muscular fascio-escápulo-umeral (FSHD), por exemplo, FSHD1 ou FSHD2. Por exemplo, as células po- dem ser derivadas ou obtidas a partir de células ou tecidos de um paci- ente diagnosticado com FSHD. Os métodos aqui divulgados podem ser praticados in vitro ou in vivo.
[0071] Em um aspecto relacionado, a divulgação inclui um método para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio associado com o au- mento da atividade ou expressão de uma proteína DUX4 ou um gene alvo de DUX4 a jusante em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo fornecer ao paciente uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um agente que reduz a quantidade de proteína p38 ativa (por exemplo, p38- e/ou p38-) no paciente, ou em determinadas células ou tecidos do paciente. Em algu- mas modalidades, o agente inibe a expressão ou atividade de uma pro- teína p38- e/ou p38-. Em certas modalidades, o agente induz a de- gradação da proteína p38. Em certas modalidades, o agente inibe a ati- vidade de uma proteína p38, por exemplo, inibe a atividade quinase da proteína p38. Em modalidades particulares de qualquer um dos méto- dos, o inibidor de p38 reduz a expressão de DUX4 e/ou um ou mais genes a jusante de DUX4 nas células ou tecidos do paciente.
[0072] Em modalidades particulares de métodos de tratamento aqui divulgados, a doença ou distúrbio é selecionado entre FSHD 1, FSHD2, síndrome de Imunodeficiência, instabilidade do Centrômero e anomalias Faciais (ICF), esclerose lateral amiotrófica (ELA), miosite do corpo de inclusão (IBM), Sarcoma de Ewing, sarcoma de tecidos moles, rabdo- miossarcoma e leucemia linfoblástica aguda de células B em adultos e crianças.
[0073] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui divulgados, o paciente é diagnosticado com FSHD1 ou FSHD2 e, em certas modalidades, o paciente compreende uma ou mais mutações genéticas associadas a FSHD1 e/ou FSHD2. Em certas modalidades, o paciente compreende repressão reduzida em um lócus D4Z4.
[0074] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos divul- gados aqui, o paciente é identificado como tendo FSHD baseado na presença de um DUX4 transcripcionalmente ativo. Em outra modali- dade, o paciente é identificado como tendo FSHD com base na pre- sença de níveis de expressão aumentada de um ou mais genes a ju- sante, por exemplo, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4 , PRAME6, PRAMEF15 ou ZNF280A em relação a um con- trole saudável. Em outra modalidade, o paciente é identificado como tendo FSHD com base na presença de um DUX4 transcricionalmente ativo e níveis de expressão aumentada de um ou mais genes DUX4 a jusante, por exemplo, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, ou ZNF280A.
[0075] Em outra modalidade, o método pode incluir medir o nível de expressão de um ou mais de DUX4 e genes a jusante de DUX4, por exemplo, DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, ou ZNF280A, no paciente antes da administração do inibidor de quinase p38. O método pode, ainda, incluir a determinar que o paciente tem necessidade de tratamento se o nível de expressão de um ou mais de DUX4 e genes a jusante de DUX4, por exemplo, DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, e ZNF280A KHDC1L está/estão ele- vados em relação a um controle saudável.
[0076] Em outra modalidade, o método pode incluir medir o nível de expressão de um ou mais de DUX4 e genes a jusante de DUX4, por exemplo, DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, ou ZNF280A, nas células do paci- ente antes e depois da administração do inibidor de quinase p38. O mé- todo pode incluir comparar o nível de expressão de um ou mais de DUX4 e genes a jusante de DUX4, por exemplo, DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, ou ZNF280A, no paciente antes e depois da administração do inibidor de quinase p38. O método pode incluir determinar a eficácia do tratamento através da comparação do nível de expressão de um ou mais de DUX4 e genes a jusante de DUX4, por exemplo, DUX4, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, e ZNF280A antes e depois da administração do inibidor de quinase p38, em que uma diminuição no(s) nível(is) de expressão é indicativo de um tratamento eficaz.
[0077] Em algumas modalidades, o inibidor da quinase p38 reduz um ou mais genes a jusante selecionados a partir de ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, e ZNF280A.
[0078] Em uma modalidade, um modulador transcricional de DUX4 e genes a jusante ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15, e ZNF280A são inibidos pela qui- nase p38.
[0079] Em modalidades particulares, o paciente compreende con- tração da matriz 4q35A D4Z4, de tal forma que o paciente compreende < 10 ou < 7 repetições (FSHD1). Em certas modalidades, o paciente, ou uma ou mais células ou tecidos do paciente, compreende uma supres- são de uma ou mais repetições uma ou mais repetições D4Z4 macros- satélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35, opcionalmente em que a célula compreende <7 repetições uma ou mais repetições D4Z4 macrossatélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35. Em certas modalidades, o paciente compreende uma ou mais mutações na Manutenção Estrutural de Domínios Cromossômicos Articulados Fle- xíveis Contendo o gene 1 (SMCHD1)(SMCHD1). Em certas modalida- des, o paciente compreende pelo menos um alelo 4qA não suprimido. Em certas modalidades, o paciente compreende pelo menos um alelo 4qA não suprimido e uma mutação SMCHD1 (FSHD2). Em algumas modalidades, o paciente está preso a uma cadeira de rodas (por exem- plo, CSS 4,5 e 5). Em certas modalidades, durante ou após o trata- mento, o paciente apresenta uma quantidade ou taxa reduzida ou dimi- nuída de degeneração muscular, por exemplo, um paciente diagnosti- cado com FSHD1 ou FSHD2. Em certas modalidades, durante ou após o tratamento, o paciente apresenta uma redução da substituição do músculo esquelético por gordura, por exemplo, determinada através de uma MRI quantitativa, por exemplo, uma redução de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, ou pelo menos 70%. Em certas modalidades, durante ou após o trata- mento, o paciente apresenta evidência de benefício numa ou mais das seguintes avaliações dos resultados clínicos:  Função ombro/braço medida pelos pesos w/wo do espaço de trabalho alcançável (RWS);  Mobilidade medida em função do teste Time Up and Go (TUG) ou um teste semelhante;  Relatórios do paciente de atividades da vida cotidiana (ADLs) e qualidade de vida (QOL); e  Resistência quantitativa do músculo esquelético medida pela dinamometria.
[0080] Em algumas modalidades, o paciente exibe qualquer uma destas melhorias por pelo menos algum tempo, por exemplo, durante pelo menos uma semana, um mês, dois meses, seis meses, ou um ano após o início ou cessação do tratamento.
[0081] Em outro aspecto, a divulgação fornece os métodos divulga- dos de usar inibidores de p38, por exemplo, um inibidor de p38- ou p38- para o tratamento de FSHD1, FSHD2, ICF, e doenças em que mudanças patológicas semelhantes são encontradas, tais como ELA e IBM (Tawil et al., 2014).
[0082] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui descritos, a composição farmacêutica é fornecida ao paciente pa- renteralmente.
[0083] Em modalidades particulares de qualquer um dos métodos aqui descritos, a composição farmacêutica é fornecida a um tecido mus- cular do paciente.
[0084] Em algumas modalidades, qualquer dos métodos aqui des- critos que compreendem o fornecimento ao paciente de um inibidor p38 pode ainda compreender o fornecimento ao paciente de um tratamento adicional.
[0085] Em modalidades particulares, a terapia adicional compre- ende gerenciamento clínico. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir FSHD 1, FSHD2, ICF, ELA, IBM, Sarcoma de Ewing, sarcoma de tecidos moles, rabdomiossarcoma e leucemia linfoblástica aguda de células B em adultos e crianças, em que os inibidores de p38 usados para diminuir a expressão e/ou ativi- dade de proteína e/ou o gene a jusante e/ou DUX4, e pode ser combi- nada com o tratamento clínico envolvendo a terapia física, exercício ae- róbico, terapia da função respiratória e/ou intervenções ortopédicas.
[0086] Em modalidades particulares, a terapia adicional consiste em fornecer ao paciente um ou mais inibidores da miostatina, agentes anti- inflamatórios ou vetores de terapia genética, por exemplo, para reduzir a produção de proteína DUX4 patogênica na FSHD, controlando a me- tilação de D4Z4, suprimindo o mRNA de DUX4 e/ou inibindo as vias do DUX4. Em uma modalidade, a presente divulgação fornece um método de tratamento de FSHD 1, FSHD 2, ICF, ELA, ou IBM, em um paciente em necessidade do mesmo, em que inibidores de p38, por exemplo, inibidores de p38- ou p38- são usados para reduzir DUX4 e gene a jusante e/ou expressão de proteína e pode ser combinado com inibido- res de miostatina, agentes anti-inflamatórios e/ou terapia de genes, por exemplo, para reduzir produção de proteína DUX4 patogênica na FSHD,
controlando a metilação de D4Z4, suprimindo o mRNA de DUX4 e ini- bindo as vias do DUX4. Em certas modalidades, os métodos são prati- cados usando um inibidor de p38 e um inibidor de miostatina. Inibidores específicos da via da miostatina que agem extracelularmente, ligando a miostatina diretamente (Fstl3, Follistatina, anticorpo miostatina, GASP1, propeptídeo de miostatina, peptídeos de decorina, ActRIIB-Fc) ou li- gando seu complexo receptor (anticorpo ActRIIB) a fim de bloquear a miostatina que envolve seu complexo receptor e que ativa a sinalização a jusante podem ser usados em certas modalidades. Alguns dos inibi- dores da miostatina são de ocorrência natural (propeptídeo de miosta- tina, Gasp1, folistatina, Fstl3), enquanto outros são projetados (anti- corpo de miostatina, anticorpo ActRIIB, ActRIIB-Fc).
[0087] Em modalidades particulares, a terapia adicional compre- ende fornecer ao paciente um inibidor de DUX4 ou um alvo ou gene a jusante de DUX4, por exemplo, um inibidor que inibe a expressão de mRNA de DUX-4fl e/ou proteína DUX4 (ou expressão de mRNA ou pro- teína de um alvo a jusante do DUX4) ou um inibidor que inibe a atividade do DUX4, por exemplo, sua atividade como ativador transcricional ou atividade de um alvo a jusante do DUX4. Em modalidades particulares, o inibidor induz a degradação do polipeptídeo DUX4 ou do polipeptídeo alvo DUX4 a jusante. Em modalidades particulares, o inibidor é um siRNA, miRNA, gRNA, shRNA ou oligonucleotídeo antissenso que liga especificamente uma sequência de ácido nucleico ou antissenso da mesma de um DUX4 ou um gene alvo DUX4 a jusante. Em uma moda- lidade, a presente invenção fornece um método de tratamento de FSHD1, FSHD2, ICF, ELA, ou MCI, em que os inibidores de p38 são usados para reduzir o DUX4 e a expressão genética e proteica a jusante e podem ser combinados com um inibidor do DUX4 ou alvo a jusante de DUX4 , por exemplo, RNA pequeno interferente (siRNA), RNA em gancho de cabelo curto (shRNA), RNA guia (gRNA), microRNA (miRNA)
e oligonucleotídeos antissenso direcionados ao DUX4 e/ou um ou mais transcritos alvo a jusante do DUX4 (por exemplo, DNA ou mRNA).
[0088] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método para usar inibidores de moléculas pequenas de quinase p38, por exemplo, um inibidor de p38- ou p38-para reduzir DUX4 e ex- pressão genética a jusante em miotubos do músculo esquelético FSHD para tratar a FSHD ou qualquer outra doença ou distúrbio divulgado pre- sente documento e/ou relacionado à expressão ou atividade aberrante do DUX4.
[0089] Em algumas modalidades, p38, por exemplo, p38- e/ou p38-é inibido por qualquer das moléculas pequenas ou outros agentes aqui divulgados.
[0090] Os inibidores de p38 e/ou outros agentes e composições (por exemplo, inibidores) aqui descritos podem ser formulados de qualquer maneira adequada para uma via de administração desejada (por exem- plo, administração parentérica ou oral). Em algumas modalidades, o contato de um agente ou composição com uma célula e/ou tecido é re- sultado da administração ou fornecimento de um agente ou composição a um paciente. Em algumas modalidades, um agente ou composição (por exemplo, um inibidor p38) é administrado pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais vezes. Em algumas modalidades de terapias com- binadas, a administração de um primeiro agente ou composição é se- guida ou ocorre sobreposição com ou simultaneamente com a adminis- tração de um segundo agente ou composição. O primeiro e o segundo agente ou composição podem ser os mesmos ou podem ser diferentes. Em algumas combinações, o primeiro e o segundo agentes ou composi- ções são administrados pelo mesmo ator e/ou no mesmo local geográfico. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo agentes ou composi- ções são administrados por diferentes atores e/ou em diferentes localiza- ções geográficas. Em algumas modalidades, múltiplos agentes descritos aqui são administrados como uma única composição.
[0091] Uma grande variedade de métodos de administração pode ser usada em conjunto com os inibidores de p38 de acordo com os mé- todos aqui divulgados. Por exemplo, os inibidores de p38 podem ser administrados ou co-administrados por via tópica, oral, intraperitoneal, intravenosa, intra-arterial, transdérmica, sublingual, intramuscular, retal, transbucal, intranasal, lipossômica, inalatória, vaginal, intra-ocular, libe- ração local (por exemplo, por cateter ou stent), subcutânea, intra-adipo- sal, intra-articular, intratecal, transmucosa, pulmonar ou parenteral, por exemplo, por injeção, incluindo subcutânea, intradérmica, intramuscu- lar, intravenosa, intra-arterial, intracardíaca, intratecal, intraspinal, intra- capsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcu- ticular, intra-articular, subaracnóide e intraesternal; por implante de um depósito ou reservatório, por exemplo, por via subcutânea ou intramus- cular.
[0092] "Pacientes" inclui animais (por exemplo, mamíferos, suínos, peixes, aves, insetos, etc.). Em algumas modalidades, os pacientes são mamíferos, particularmente primatas, especialmente humanos. Em al- gumas modalidades, os pacientes são animais como gado, ovelhas, ca- bras, vacas, suínos e afins; aves como galinhas, patos, gansos, perus e semelhantes; e animais domesticados como cães e gatos. Em algumas modalidades (por exemplo, particularmente em contextos de pesquisa) os pacientes são roedores (por exemplo, camundongos, ratos, hams- ters), coelhos, primatas, ou suínos, como porcos congênitos e afins. Os termos "paciente" e "indivíduo" são usados indistintamente aqui.
[0093] "Tecido" é um conjunto de células similares da mesma ori- gem que, juntas, realizam uma função específica. Em certas modalida- des, o tecido é o tecido muscular.
[0094] Os métodos divulgados no presente documento podem ser praticados com qualquer agente capaz de inibir a expressão ou atividade de um gene ou proteína p38, por exemplo, um inibidor de um gene ou proteína p38- ou p38-, incluindo, mas não limitado a, qualquer um desses divulgados aqui.
[0095] Em particular, os métodos divulgados no presente docu- mento resultam em uma diminuição em um nível de expressão ou na atividade de DUX4 e/ou de um ou mais genes de DUX4 a jusante em células ou tecidos (por exemplo, em um paciente), por exemplo, em comparação com o nível de expressão ou atividade em células de con- trole ou tecidos não colocados em contato com um inibidor p38, ou com um nível de referência. "Diminuir" refere-se a uma diminuição de pelo menos 5%, por exemplo, pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 ou 100%, por exemplo, em relação ao nível de referência. Diminuir significa também diminui por pelo menos 1 vez, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000 vezes, ou mais, por exemplo, em relação ao nível de uma referência ou de células ou tecido de con- trole.
[0096] Os métodos descritos no presente documento podem ser praticados usando qualquer tipo de inibidor que resulte em uma quanti- dade ou nível reduzido de uma proteína p38 ativa, por exemplo, em uma célula ou tecido, por exemplo, uma célula ou tecido em um paciente. Em modalidades particulares, o inibidor de p38 causa uma redução na pro- teína p38 ativa (por exemplo, p38- e/ou p38- ativa), uma redução na proteína p38 total (por exemplo, proteína p38- e/ou p38- total), uma redução no mRNA de p38 (por exemplo, mRNA de p38- e/ou p38-) e/ou uma redução na atividade da proteína p38 (por exemplo, atividade de p38- e/ou de quinase p38-) em uma célula ou tecido colocados em contato com o inibidor de p38. Em modalidades particulares, o inibidor de p38 causa uma redução na atividade ou expressão da via de sinali- zação de p38- e/ou p38-. Em certas modalidades, a redução é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, em comparação com o nível no mesmo tipo de célula ou tecido não contatado com o inibidor de p38. Métodos para medir os níveis totais de proteína p38 ou mRNA ou a ati- vidade da quinase p38 em uma célula são conhecidos na técnica. Em certas modalidades, o inibidor inibe ou reduz a atividade ou expressão de p38, por exemplo, a expressão de proteína e/ou mRNA. Em certas modalidades, o inibidor provoca uma degradação aumentada da prote- ína p38, resultando em quantidades mais baixas de proteína p38 numa célula ou tecido. Métodos particulares podem também empregar qual- quer tipo de inibidor de expressão ou atividade de DUX4 ou um gene a jusante de DUX4. Em certos casos, o inibidor inibe ambas as proteínas p38- e p38-, enquanto em outros casos, o inibidor seletivamente ou preferencialmente inibe tanto p38- quanto p38-. Em certas modalida- des, o inibidor não inibe o p38-.
[0097] Os inibidores que podem ser usados para praticar os méto- dos divulgados incluem, mas não estão limitados a, agentes que inibem ,reduzem ou diminuem a expressão ou atividade de uma biomolécula (por exemplo, uma proteína ou ácido nucleico), tal como, mas não se limitando a, um gene, mRNA ou proteína p38- ou p38-. Em certas modalidades, um inibidor pode causar maior degradação da biomolé- cula. Em modalidades particulares, um inibidor pode inibir uma biomo- lécula por meios competitivos, incompetitivos ou não competitivos. Os inibidores exemplares incluem, mas não estão limitados a, ácidos nu- cléicos, DNA, RNA, gRNA, shRNA, siRNA, mRNA modificado (mRNA), microRNA (miRNA), proteínas, proteínas miméticas, peptídeos, pepti- domiméticos, anticorpos, moléculas pequenas, moléculas orgânicas pe- quenas, moléculas inorgânicas, químicos, análogos que imitam o local de ligação de uma enzima, receptor ou outra proteína, por exemplo, que é envolvida na transdução de sinal, agentes terapêuticos, composições farmacêuticas, fármacos e combinações dos mesmos. Em algumas mo- dalidades, o inibidor pode ser uma molécula de ácido nucleico incluindo, mas não limitado a, siRNA que reduz a quantidade de proteína funcional em uma célula. Assim, compostos ou agentes ditos "capazes de inibir" uma determinada proteína, por exemplo, p38, compreendem qualquer tipo de inibidor. Em certas modalidades, um inibidor de p38 ou um inibi- dor de DUX4 ou um gene alvo de DUX4 a jusante é qualquer uma das diferentes classes de inibidores divulgadas no presente documento ou qualquer outro.
[0098] Em modalidades particulares, um inibidor de p38 (ou outro inibidor) compreende um ácido nucleico que se liga a um gene p38 (por exemplo, gene MAPK14 ou MAPK11) ou mRNA (ou outro gene alvo ou mRNA). Por conseguinte, um inibidor de ácido nucleico pode compre- ender uma sequência complementar a uma sequência polinucleotídica alvo, por exemplo, a sequência p38- divulgada no presente docu- mento, ou uma região da mesma ou um antissenso da mesma. Em mo- dalidades particulares, um inibidor de ácido nucleico compreende pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 20, pelo menos 24 ou pelo menos 30 sequências nucle- otídicas correspondentes ou complementares a uma sequência polinu- cleotídica alvo ou antissenso da mesma.
[0099] Em certas modalidades, um inibidor de ácido nucleico é uma interferência de RNA ou agente de RNA antissenso ou uma porção ou mimético do mesmo, ou um morfolino, que diminui a expressão de um gene alvo quando administrado a uma célula. Tipicamente, um inibidor de ácido nucleico compreende pelo menos uma porção de uma molé- cula de ácido nucleico alvo, ou um ortólogo da mesma, ou compreende pelo menos uma porção da cadeia complementar de uma molécula de ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, a expressão de um gene alvo é reduzida por 10%, 25%, 50%, 75%, ou até 90 a 100%.
[0100] Uma sequência de ácido nucleico "complementar" é uma se- quência de ácido nucleico capaz de hibridizar com outra sequência de ácido nucleico composta por pares de bases de nucleotídeos comple- mentares. Por "hibridizar" entende-se um par para formar uma molécula de fita dupla entre bases nucleotídicas complementares (por exemplo, adenina (A) forma um par de bases com timina (T), assim como guanina (G) com citosina (C) no DNA) sob condições adequadas de rigor. (Vide, por exemplo, Wahl, G. M. e S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507).
[0101] "Antissenso" refere-se a uma sequência de ácido nucleico, independentemente do comprimento, que é complementar a uma se- quência de ácido nucleico. Em certas modalidades, RNA antisenso re- fere-se a moléculas de RNA de fita simples que podem ser introduzidas em uma célula individual, tecido ou paciente e resultam na expressão diminuída de um gene alvo por meio de mecanismos que não dependem de vias endógenas de silenciamento de genes. Um ácido nucleico an- tissenso pode conter uma cadeia principal modificada, por exemplo, fos- forotioato, fosforoditioato ou outros conhecidos na técnica, ou pode con- ter ligações internucleosídeas não naturais. O ácido nucleico antissenso pode compreender, por exemplo, ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
[0102] "Interferência de RNA", conforme usado neste documento, refere-se ao uso de agentes que diminuem a expressão de um gene alvo pela degradação de um mRNA alvo por meio de vias endógenas de silenciamento de gene (por exemplo, Dicer e complexo de silencia- mento induzido por RNA (RISC)). A interferência de RNA pode ser rea- lizada usando vários agentes, incluindo shRNA e siRNA. "RNA em gan- cho de cabelo curto" ou "shRNA" refere-se a uma molécula de RNA ar- tificial de fita dupla com uma curva de gancho de cabelo que pode ser usada para silenciar a expressão do gene alvo por interferência de RNA
(RNAi). A expressão de shRNA nas células é normalmente realizada através da liberação de plasmídeos ou através de vetores virais ou bac- terianos. O shRNA é um mediador vantajoso de RNAi, pois apresenta uma taxa relativamente baixa de degradação e rotatividade. O RNA in- terferente pequeno (siRNA) é uma classe de moléculas de RNA de fita dupla, geralmente de 20 a 25 pares de bases em comprimento, seme- lhantes ao miRNA e que operam no interior da via de interferência de RNA (RNAi). Ele interfere na expressão de genes específicos com se- quências nucleotídicas complementares, degradando o mRNA após a transcrição, impedindo a tradução. Em certas modalidades, um siRNA tem 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 nucleotídeos de comprimento e tem uma saliência de 2 bases na sua extremidade de 3'. Os siRNAs podem ser introduzidos em uma célula individual e/ou sistema de cultura e re- sultar na degradação das sequências alvo de mRNA. "Morfolino", como usado aqui, refere-se a um oligômero de ácido nucleico modificado em que bases de ácido nucleico padrão estão ligadas aos anéis de morfo- lina e estão ligadas através de ligações fosforodiamidate. Semelhante a siRNA e shRNA, morfolinos ligam-se a sequências de mRNA comple- mentares. No entanto, os morfolinos funcionam através da inibição es- térica da tradução de mRNA e da alteração do splicing de mRNA, em vez de direcionar sequências complementares de mRNA para degrada- ção.
[0103] Em certas modalidades, um inibidor de ácido nucleico é um RNA mensageiro que pode ser introduzido em uma célula, em que co- difica um inibidor de polipeptídeo de p38 ou outro alvo divulgado no pre- sente documento. Em modalidades particulares, o mRNA é modificado, por exemplo, para aumentar sua estabilidade ou reduzir sua imunoge- nicidade, por exemplo, pela incorporação de um ou mais nucleosídeos modificados. As modificações adequadas são conhecidas na técnica.
[0104] Em certas modalidades, um inibidor compreende um cassete de expressão que codifica um polinucleotídeo ou polipeptídeo inibidor de p38 ou outro alvo aqui divulgado. Em modalidades particulares, o cassete de expressão está presente em um vetor de terapia genética, por exemplo, um vetor viral de terapia genética. Uma variedade de ve- tores de terapia genética, incluindo vetores virais de terapia genética, é conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, vetores de terapia gené- tica baseados em AAV.
[0105] Em algumas modalidades, um inibidor é um inibidor polipep- tídeo. Em modalidades particulares, um inibidor do polipeptídeo liga-se a um polipeptídeo alvo tal como o p38, inibindo assim a sua atividade, por exemplo, atividade de quinase. Exemplos de inibidores de polipep- tídeo incluem quaisquer tipos de polipeptídeos (por exemplo, peptídeos e proteínas), tais como anticorpos e fragmentos dos mesmos.
[0106] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina (Ig) capaz de ligar-se especificamente a um alvo, tal como um carboidrato, polinu- cleotídeo, lipídeo ou polipeptídeo, através de pelo menos um local de reconhecimento de epítopo, localizado na região variável da molécula de Ig. Como usado presente documento, o termo abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também fragmen- tos dos mesmos, tais como dAb, Fab, Fab', F(ab') 2, Fv, cadeia única (scFv), variantes sintéticas dos mesmos, variantes de ocorrência natu- ral, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo com um fragmento de ligação ao antígeno da especificidade necessária, an- ticorpos quiméricos, nanocorpos e qualquer outra configuração modifi- cada da molécula de imunoglobulina que compreende um local ou frag- mento de ligação ao antígeno da especificidade necessária.
[0107] "Fragmento" refere-se a uma porção de uma molécula de po- lipeptídeo ou ácido nucleico. Esta porção contém, de preferência, pelo me- nos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% do comprimento total do polipeptídeo ou da molécula de ácido nucleico de referência. Um fragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1000 nucleotídeos ou aminoáci- dos. Um "fragmento funcional" de um anticorpo é um fragmento que mantém uma ou mais atividades do anticorpo, por exemplo, ele liga o mesmo epítopo e ou possui uma atividade biológica do anticorpo. Em modalidades particulares, um fragmento funcional compreende os seis CDRs presentes no anticorpo.
[0108] Em certas modalidades, o inibidor induz a degradação de um polipeptídeo alvo, por exemplo, a proteína p38. Por exemplo, os inibido- res incluem quimeras direcionadas à proteólise (PROTAC), que indu- zem proteólise intracelular seletiva de proteínas alvo. PROTACs in- cluem domínios funcionais, que podem ser moléculas de ligação às pro- teínas ligadas covalentemente: uma é capaz de engajar uma ligase ubi- quitina E3 e a outra se liga à proteína alvo destinada à degradação. O recrutamento da ligase E3 para a proteína alvo resulta em ubiquitinação e subsequente degradação da proteína alvo pelo proteassoma. Em mo- dalidades particulares, um inibidor é uma PROTAC que direciona uma proteína p38 (por exemplo, p38- e/ou p38-).
[0109] Em certas modalidades, um inibidor é um inibidor de molé- cula pequena, ou um estereoisômero, enantiômero, diastereômero, composto enriquecido isotopicamente, pró-fármaco ou sal farmaceuti- camente aceitável do mesmo. Em modalidades particulares, o inibidor de p38 inibe p38- e/ou p38-. Em modalidades particulares, ele não inibe significativamente p38-. Em modalidades particulares, um inibidor de molécula pequena de p38 inclui, mas não está limitado a, qualquer dos compostos de molécula pequena divulgados no presente docu- mento, incluindo, mas não se limitando, aos mostrados na Figura 12B. Uma variedade de inibidores de p38 é conhecida e disponível, e alguns estão em desenvolvimento clínico. Qualquer um destes pode ser usado. Estas incluem, mas não estão limitadas a, ARRY-797, VX-745, VX-702,
RO-4402257, SCIO- 469, BIRB-796, SD-0006, PH-797804, AMG-548, LY2228820, SB-681323 e GW-856553. Compostos inibidores ilustrati- vos também incluem, mas não estão limitados a: N-(4-(2-etil-4-(m-tolil)tiazol-5-il)piridin-2-il)benzamida; 2-(2,4-difluorofenil)-6-(1-(2,6-difluorofenil)ureido)nicotinamida; 6-(2,4-difluorofenóxi)-8-metil-2-((tetra-hidro-2H-piran-4- il)amino)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona; 6-(2,4-difluorofenóxi)-2-((1,5-di-hidroxipentan-3-il)amino)-8- metilpirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona; (R)-6-(2-(4-fluorofenil)-6-(hidroximetil)-4,5,6,7-tetra-hidropirazolo[1,5- a]pirimidin-3-il)-2-(o-tolil)piridazin-3(2H)-ona; 6-(5-(ciclopropilcarbamoíl)-3-fluoro-2-metilfenil)-n- neopentilnicotinamida; 5-(2-(terc-butil)-4-(4-fluorofenil)-1H-imidazol-5-il)-3-neopentil-3H-imi- dazo[4,5-b]piridin-2-amina; 2-(6-cloro-5-((2R,5S)-4-(4-fluorobenzil)-2,5-dimetilpiperazina-1-carbo- nil)-1-metil-1H-indol-3-il)-N,N-dimetil-2-oxoacetamida; 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-(2-morfolinoetóxi)nafta- len-1-il)ureia; 4-((5-(ciclopropilcarbamoíl)-2-metilfenil)amino)-5-metil-N-propilpir- rolo[2,1-f][1,2,4]triazina-6-carboxamida; 3-(3-bromo-4-((2,4-difluorobenzil)óxi)-6-metil-2-oxopiridin-1(2H)-il)-N,4- dimetilbenzamida; 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(5-fluoro-2-((1-(2-hidroxietil)- 1H-indazol-5-il)óxi)benzil)ureia; 8-(2,6-difluorofenil)-2-((1,3-di-hidroxipropan-2-il)amino)-4-(4-fluoro-2- metilfenil)pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona; 5-(2,6-diclorofenil)-2-((2,4-difluorofenil)tio)-6H-pirimido[1,6-B]piridazin- 6-ona; (5-(2,4-difluorofenóxi)-1-isobutil-1H-indazol-6-il)((2-(dimetilamino)etil)-
l2-azaneíl)metanona; e (R)-2-((2,4-difluorofenil)amino)-7-(2,3-di-hidroxipropóxi)-10,11-di-hidro- 5H-dibenzo[a,d][7]anulen-5-ona.
[0110] Certos compostos inibidores da presente invenção podem existir em formas estereoisoméricas (por exemplo, eles podem conter um ou mais átomos de carbono assimétricos ou podem exibir isome- rismo cis-trans). Alguns compostos podem incluir mais de um átomo de carbono assimétrico. "Estereoisômero" refere-se a um composto que di- fere na orientação (R/S) sobre um ou mais átomo(s) de carbono assi- métrico(s) ou difere na orientação (cis:trans) sobre uma ligação dupla. O termo estereoisômero também pode abranger atropisômeros, que surgem a partir da rotação dificultada a cerca de uma ligação simples, por exemplo, em compostos tendo uma fração bifenil substituída. Um "enantiômero" é um composto que é uma imagem espelhada de outro composto, isto é, todos os átomos de carbono assimétricos de um enan- tiômero existem em orientação oposta (R/S) em relação ao outro com- posto. Um "diastereômero" é um composto que não é uma imagem es- pelhada de outro composto, mas inclui um ou mais átomos de carbono assimétricos existentes em orientação oposta (R/S) em relação ao outro composto. As modalidades da presente invenção podem incluir misturas de estereoisômeros ou podem incluir um único estereoisômero. Enanti- ômeros ou diastereômeros únicos podem ser preparados começando com reagentes quirais ou por técnicas sintéticas estereosseletivas ou estereoespecíficas. Alternativamente, os enantiômeros ou diastereôme- ros únicos podem ser isolados a partir de misturas por técnicas conven- cionais cromatográficas quirais ou de cristalização. "Enriquecido isoto- picamente" refere-se a um composto em que um ou mais átomos são enriquecidos com um isótopo além de sua abundância natural. Por exemplo, a abundância natural de deutério é de 0,015%. Um técnico no assunto reconhece que em todos os compostos químicos com um átomo de H, o átomo de H de fato representa uma mistura de H e D, com cerca de 0,015% sendo D. Um composto enriquecido isoptica- mente pode ter um ou mais locais químicos específicos em que a razão H/D é maior que 0,015%. Um composto enriquecido isotopicamente pode ser referido como marcado isotopicamente.
[0111] Em certas modalidades, o inibidor compreende um ou mais componentes de um sistema de edição de genes. Como usado presente documento, o termo "sistema de edição de genes" refere-se a uma pro- teína, ácido nucleico ou combinação dos mesmos que é capaz de mo- dificar um lócus alvo de uma sequência endógena de DNA quando in- troduzido em uma célula. Numerosos sistemas de edição de genes ade- quados para uso nos métodos da presente invenção são conhecidos na técnica, incluindo, entre outros, sistemas de nuclease de dedos de zinco, sistemas TALEN e sistemas CRISPR/Cas.
[0112] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genes usado nos métodos descritos neste documento é um sistema de nu- clease CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regu- larmente Interespaçadas)/Cas (Associado ao CRISPR), que é um sis- tema de nuclease projetado com base em um sistema bacteriano que pode ser usado para engenharia de genoma de mamíferos. Geralmente, o sistema compreende uma endonuclease associada ao CRISPR (por exemplo, uma endonuclease Cas) e um RNA guia (gRNA). O gRNA é composto por duas partes; um RNA-crispr (crRNA) que é específico para uma sequência genômica alvo de DNA e um RNA de ativação em trans (tracrRNA) que facilita a endonuclease de se ligar ao DNA no local de in- serção alvo. Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA podem es- tar presentes no mesmo oligonucleotídeo de RNA, referido como um RNA- guia único (sgRNA). Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA po- dem estar presentes como oligonucleotídeos de RNA separados. Em tais modalidades, o gRNA é composto de um oligonucleotídeo de crRNA e um oligonucleotídeo de tracrRNA que se associam para formar um duplex crRNA:tracrRNA. Como usado no presente documento, o termo "RNA guia" ou "gRNA" refere-se à combinação de um tracrRNA e um crRNA, presente tanto como um sgRNA quanto um duplex crRNA:tracrRNA.
[0113] Em algumas modalidades, os sistemas CRISPR/Cas com- preendem uma proteína Cas, um crRNA e um tracrRNA. Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA são combinados como uma molé- cula de RNA duplex para formar um gRNA. Em algumas modalidades, o duplex crRNA:tracrRNA é formado in vitro antes da introdução em uma célula. Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA são introduzi- dos em uma célula como moléculas de RNA separadas e o duplex crRNA:tracrRNA é então formado intracelularmente. Em algumas mo- dalidades, são fornecidos polinucleotídeos que codificam o crRNA e o tracrRNA. Em tais modalidades, os polinucleotídeos que codificam o crRNA e o tracrRNA são introduzidos em uma célula e as moléculas de crRNA e tracrRNA são então transcritas intracelularmente. Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA são codificados por um único poli- nucleotídeo. Em algumas modalidades, o crRNA e o tracrRNA são co- dificados por polinucleotídeos separados.
[0114] Em algumas modalidades, uma endonuclease Cas é direci- onada para o local de inserção alvo pela especificidade da sequência da porção de crRNA do gRNA, que pode incluir uma sequência de mo- tivo adjacente ao protospacer (PAM) próxima ao local de inserção alvo. Uma variedade de sequências de PAM adequadas para uso com uma endonuclease específica (por exemplo, uma endonuclease Cas9) é co- nhecida na técnica (Vide, por exemplo, Nat Methods. Nov 2013; 10(11): 1116–1121 e Sci Rep. 2014; 4: 5405).
[0115] A especificidade de um gRNA para um lócus alvo é mediada pela sequência de crRNA, que compreende uma sequência de cerca de 20 nucleotídeos que são complementares à sequência de DNA em um lócus alvo, por exemplo, complementares a uma sequência de DNA p38- ou p38-. Em algumas modalidades, as sequências de crRNA usadas nos métodos da presente invenção são pelo menos 90% com- plementares a uma sequência de DNA de um lócus alvo. Em algumas modalidades, as sequências de crRNA usadas nos métodos da pre- sente invenção são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% comple- mentares a uma sequência de DNA de um lócus alvo. Em algumas mo- dalidades, as sequências de crRNA usadas nos métodos da presente invenção são 100% complementares a uma sequência de DNA de um lócus alvo, por exemplo, um gene MAPK14 ou MAPK11. Em algumas modalidades, as sequências de crRNA descritas no presente docu- mento são projetadas para minimizar a ligação fora de alvo usando al- goritmos conhecidos na técnica (por exemplo, localizador Cas-OFF) para identificar sequências alvo que são exclusivas a um lócus ou gene alvo específico.
[0116] Em algumas modalidades, a endonuclease é uma proteína ou ortólogo Cas. Em algumas modalidades, a endonuclease é uma pro- teína Cas9. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é derivada a partir de Streptococcus pyogenes (por exemplo, SpCas9), Staphylococ- cus aureus (por exemplo, SaCas9) ou Neisseria meningitides (Nme- Cas9). Em algumas modalidades, a endonuclease Cas é uma proteína Cas9 ou um ortólogo Cas9 e é selecionada a partir do grupo que con- siste em SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9- HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9, e NmeCas9. Em algumas mo- dalidades, a endonuclease é selecionada a partir do grupo que consiste em C2C1, C2C3, Cpf1 (também referido como Cas12a), Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (also known as Csnl and Csx12), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl,
Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3, e Csf4. Em algumas modalidades, Cas9 é um mutante de Cas9 nickase. Os mutantes de Cas9 nickase compreendem somente um domínio cataliticamente ativo (tanto o domínio HNH quanto o domínio RuvC).
[0117] Em aspectos particulares, a divulgação inclui composições, por exemplo, composições farmacêuticas compreendendo um inibidor de p38, incluindo qualquer uma das várias classes de inibidores descri- tas no presente documento. A invenção abrange composições farma- cêuticas compreendendo um inibidor de p38 e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis. Qualquer excipiente inerte que é comumente usado como veículo ou diluente pode ser usado em composições da presente invenção, tais como açúcares, poliálcoois, po- límeros solúveis, sais e lipídios. Os açúcares e poliálcoois que podem ser empregados incluem, sem limitação, lactose, sacarose, manitol e sorbitol. Os ilustrativos dos polímeros solúveis que podem ser empre- gados são polioxietileno, poloxâmeros, polivinilpirrolidona e dextrano. Os sais úteis incluem, sem limitação, cloreto de sódio, cloreto de mag- nésio e cloreto de cálcio. Os lipídios que podem ser usados incluem, sem limitação, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos de glicerol, gli- colipídios e fosfolipídios.
[0118] Além disso, as composições farmacêuticas podem ainda compreender ligantes (por exemplo, acácia, amido de milho, gelatina, carbômero, etil celulose, goma de guar, hidroxipropil celulose, hidroxipropil metil celulose, povidona), agentes desintegrantes (por exemplo, amido de milho, amido de batata, ácido algínico, dióxido de silício, croscarmelose sódica, crospovidona, goma de guar, amido glicolato de sódio, Primogel), tampões (por exemplo, tris-HCL, acetato, fosfato) de vários pH e força iô- nica, aditivos como albumina ou gelatina para impedir a absorção de su- perfícies, detergentes (por exemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sais de ácidos biliares), inibidores de protease, tensoativos (por exemplo,
lauril sulfato de sódio), aperfeiçoadores de permeação, agentes solubi- lizantes (por exemplo, glicerol, polietileno glicerol, ciclodextrinas), um deslizante (por exemplo, dióxido de silício coloidal), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio, hidroxianisole buti- lado), estabilizadores (por exemplo, hidroxipropil celulose, hidroxipropi- lmetil celulose), agentes de aumento da viscosidade (por exemplo, car- bômero, dióxido de silício coloidal, etil celulose, goma de guar), adoçan- tes (por exemplo, sacarose, aspartame, ácido cítrico), agentes aromati- zantes (por exemplo, hortelã-pimenta, salicilato de metila ou aroma de laranja), conservantes (por exemplo, timerosal, álcool benzílico, parabe- nos), lubrificantes (por exemplo, ácido esteárico, estearato de magné- sio, polietileno glicol, lauril sulfato de sódio), auxiliares de fluxo (por exemplo, dióxido de silício coloidal), plastificantes (por exemplo, ftalato de dietila, citrato de trietila), emulsificantes (por exemplo, carbômero, hidroxipropilcelulose, lauril sulfato de sódio, metilcelulose, hidroxietilce- lulose, carboximetilcelulose sódica), revestimentos de polímeros (por exemplo, poloxâmeros ou poloxaminas), agentes de revestimento e de formação de película (por exemplo, etilcelulose, acrilatos, polimetacrila- tos) e/ou adjuvantes.
[0119] Em uma modalidade, as composições farmacêuticas são preparadas com veículos que protegerão o composto contra a rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microencapsulados. Podem ser usados polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como Etileno acetato de vinila, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para os técnicos no assunto. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente a partir de Alza Corporation e Nova Pharmaceuti- cals, Inc. As suspensões lipossomais (incluindo lipossomas direcionados para células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais)
também podem ser usadas como veículos farmaceuticamente aceitá- veis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos técnicos no assunto, por exemplo, conforme descrito na Patente dos EUA de nº 4.522.811.
[0120] Além disso, a invenção abrange as composições farmacêu- ticas que compreendem qualquer forma física sólida ou líquida do com- posto da invenção. Por exemplo, os compostos podem estar na forma cristalina, na forma amorfa e ter qualquer tamanho de partícula. As par- tículas podem ser micronizadas ou podem ser aglomeradas, grânulos, pós, óleos, suspensões oleosas ou qualquer outra forma de forma física sólida ou líquida.
[0121] Quando os compostos de acordo com a presente invenção exibem solubilidade insuficiente, podem ser usados métodos para solu- bilizar os compostos. Tais métodos são conhecidos dos técnicos no as- sunto e incluem, mas não estão limitados a, ajuste de pH e formação de sal, usando co-solventes, tais como etanol, propileno glicol, polietileno glicol (PEG) 300, PEG 400, DMA (10 a 30%), DMSO (10 a 20%), NMP (10 a 20%), usando tensoativos, tais como polissorbato 80, polissorbato 20 (1 a 10%), Cremophor EL, Cremophor RH40, Cremophor RH60 (5 a 10%), Pluronic F68/Poloxamer 188 (20 a 50%), Solutol HS15 (20 a 50%), Vitamina E TPGS e succinato PEG 1000 d-a-tocoferil (20 a 50%), usando complexação como HP  CD e SBE  CD (10 a 40%), e usando abordagens avançadas como micela, adição de polímero, sus- pensões de nanopartículas e formação de lipossomas.
[0122] Os inibidores de p38 também podem ser administrados ou coadministrados em formas de dosagem de liberação lenta. Os inibido- res de p38 podem estar na forma gasosa, líquida, semilíquida ou sólida, formulados de uma maneira adequada para a via de administração a ser usada. Para administração oral, formulações orais sólidas adequa- das incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, péletes, sachês e efervescentes, pós e similares. As formulações orais líquidas adequa- das incluem soluções, suspensões, dispersões, xaropes, emulsões, óleos e similares. Para administração parentérica, a reconstituição de um pó liofilizado é normalmente usada.
[0123] Doses adequadas dos compostos para uso no tratamento das doenças ou distúrbios descritos no presente documento podem ser determinadas pelos técnicos no assunto relevante. As doses terapêuti- cas são geralmente identificadas através de um estudo de variação de dose em seres humanos, com base em evidências preliminares deriva- das dos estudos em animais. As doses devem ser suficientes para re- sultar em um benefício terapêutico desejado sem causar efeitos colate- rais indesejados. O modo de administração, as formas de dosagem e os excipientes farmacêuticos adequados também podem ser bem usa- dos e ajustados pelos técnicos no assunto. Todas as alterações e mo- dificações estão previstas no escopo do presente pedido de patente.
[0124] Em certas modalidades, a divulgação inclui formas de dosa- gem unitárias de uma composição farmacêutica compreendendo um agente que inibe a expressão ou a atividade de um polipeptídeo p38 (ou resulta em níveis reduzidos de uma proteína p38 ativa) e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis, em que a forma de dosagem unitária é eficaz para reduzir a expressão de um polipeptí- deo DUX4, ou um polipeptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a jusante, em um ou mais tecidos em um paciente ao qual a forma de dosagem unitária é administrada. Em certas modalidades, o gene alvo a jusante é MBD3L2, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, ou KHDC1L. Em algumas modalidades, o gene alvo a jusante é RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, KHDC1L, ZSCAN4, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 ou ZNF280A. Em certas modalida- des, o tecido é tecido muscular. Em certas modalidades, o tecido é ter-
minalmente diferenciado, por exemplo, tecido muscular diferenciado ter- minalmente. Em certas modalidades, o tecido compreende células que compreendem uma mutação associada à distrofia muscular fascio-es- cápulo-umeral (FSHD). Em modalidades particulares, o agente se liga a um polipeptídeo p38 (por exemplo, p38- ou p38-) ou se liga a um po- linucleotídeo que codifica o polipeptídeo p38. Em certas modalidades, o agente compreende ou consiste de: um ácido nucleico, opcionalmente, um DNA, RNA, mRNA modificado (mmRNA), shRNA, siRNA, RNA guia (gRNA), microRNA (miRNA) ou oligonucleotídeo antissenso. Em moda- lidades particulares, o agente compreende ou consiste em um polipep- tídeo, opcionalmente uma proteína, um peptídeo, uma proteína mimé- tica, um peptidomimético ou um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo. Em outras modalidades, o agente compreende: uma molécula pequena, opcionalmente uma molécula orgânica ou uma molécula inor- gânica. Em outras modalidades, o agente compreende um cassete de expressão genética, opcionalmente um vetor de terapia genética, que expressa um polinucleotídeo ou agente polipeptídico que inibe a expres- são ou a atividade de um polipeptídeo p38.
[0125] Em modalidades particulares, as formas de dosagem unitária compreendem uma quantidade eficaz, uma concentração eficaz e/ou uma concentração inibitória de um inibidor de p38 para tratar uma do- ença ou distúrbio associado ao aumento da atividade ou expressão de DUX4 e/ou um gene alvo de DUX4 a jusante, incluindo qualquer uma das doenças ou distúrbios divulgados no presente documento, por exemplo, a FSHD.
[0126] "Composições farmacêuticas" incluem composições de um ou mais agentes capazes de serem administrados ou liberados a um paciente e/ou célula para a prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio específicos.
[0127] "Farmaceuticamente aceitável" é empregado no presente documento para se referir aos compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de um julgamento clínico adequado, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alér- gica ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação be- nefício/risco razoável.
[0128] "Veículo farmaceuticamente aceitável" inclui, sem limitação, qualquer adjuvante, veículo, excipiente, deslizante, adoçante, diluente, conservante, colorante/corante, aperfeiçoador de sabor, tensoativo, agente umectante, agente dispersante, agente de suspensão, estabili- zador, agente isotônico, solvente, tensoativo e/ou emulsificante que te- nha sido aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Uni- dos como aceitável para uso em seres humanos e/ou animais domésti- cos. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e ace- tato de celulose; tragacanto; malte; gelatina; talco; manteiga de cacau, ceras, gorduras animais e vegetais, parafinas, silicones, bentonites, ácido silícico, óxido de zinco; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como propilenoglicol; polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico; soluções tampão de fosfato; e quaisquer outras substâncias compatí- veis empregadas em formulações farmacêuticas. Exceto na medida em que qualquer meio e/ou agente convencional é incompatível com os agentes da presente divulgação, seu uso em composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[0129] "Quantidade eficaz", conforme usado neste documento, re- fere-se a uma quantidade de um agente eficaz para alcançar um efeito específico, por exemplo, redução do mRNA de DUX4-fl ou da proteína DUX4, ou mRNA ou proteína de um ou mais alvos de DUX4 a jusante em uma célula, tecido, órgão ou paciente. No contexto do tratamento terapêutico de um paciente, uma quantidade eficaz pode ser, por exem- plo, uma quantidade eficaz ou suficiente para reduzir um ou mais sinto- mas de doença no paciente, por exemplo, um paciente com FSHD. Em certas modalidades, a redução é de pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60% ou pelo menos 70%, em comparação com a quantidade anterior ou sem tratamento.
[0130] "Concentração eficaz", conforme usado no presente docu- mento, refere-se à concentração mínima (massa/volume) de um agente e/ou composição necessários para resultar em um efeito fisiológico es- pecífico. Como usado no presente documento, concentração eficaz re- fere-se normalmente à concentração de um agente necessária para au- mentar, ativar e/ou aperfeiçoar um efeito fisiológico específico.
[0131] "Concentração inibitória" é a concentração mínima (massa/volume) de um agente necessário para inibir um efeito fisioló- gico específico. Conforme usado no presente documento, a concentra- ção inibitória refere-se normalmente à concentração de um agente ne- cessário para diminuir, inibir e/ou reprimir um efeito fisiológico particular.
[0132] Em algumas modalidades, um agente ou composto descrito no presente documento pode ser administrado em uma dosagem de cerca de 1 mg/kg a cerca de 300 mg/kg. Em outra modalidade, um agente ou composto descritos aqui podem ser administrados em uma dosagem de cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Por exemplo, o agente ou composto podem ser administrados a um paciente em uma dosagem de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 mg/kg, ou dentro de uma faixa entre qualquer um dos valores procedentes, por exemplo, entre cerca de 10 mg/kg e cerca de 15 mg/kg, entre cerca de 6 mg/kg e cerca de 12 mg/kg, e similares. Em outra modalidade, um agente ou composto descritos no presente docu- mento são administrados em uma dosagem de ≤15 mg/kg. Por exemplo, um agente ou composto podem ser administrados a 15 mg/kg por dia durante 7 dias, para um total de 105 mg/kg por semana. Por exemplo, um composto pode ser administrado a 10 mg/kg duas vezes por dia du- rante 7 dias para um total de 140 mg/kg por semana.
[0133] Em muitas modalidades, as dosagens descritas no presente documento podem se referir a uma dose única, uma dose diária ou uma dose semanal. Em uma modalidade, um agente ou composto podem ser administrados uma vez por dia. Em outra modalidade, um composto pode ser administrado duas vezes por dia. Em algumas modalidades, um agente ou composto podem ser administrados três vezes por dia. Em algumas modalidades, um composto pode ser administrado quatro vezes por dia. Em algumas modalidades, um agente ou composto des- critos aqui podem ser administrados 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 vezes por semana. Em modalidades, o composto é administrado uma vez quinzenalmente.
[0134] Em algumas modalidades, um composto descrito no pre- sente documento pode ser administrado oralmente. Em algumas moda- lidades, um composto descrito no presente documento pode ser admi- nistrado oralmente em uma dosagem de ≤15 mg/kg uma vez por dia.
[0135] A dosagem usada pode variar dependendo das necessida- des do paciente e da gravidade da condição a ser tratada. A determinação do regime de dosagem adequado para uma situação particular está dentro dos conhecimentos da técnica. Por conveniência, a dosagem diária total pode ser dividida e administrada em porções durante o dia, conforme necessário.
[0136] O regime de dosagem usando o composto divulgado é sele- cionado de acordo com uma variedade de fatores, incluindo tipo, espé- cie, idade, peso, sexo e condição médica do paciente; a gravidade da condição a ser tratada; a via de administração; a função renal ou hepá- tica do paciente; e o composto particular divulgado empregado. Um clí- nico ou veterinário técnico no assunto pode determinar e prescrever prontamente a quantidade eficaz do medicamento necessária para pre- venir, contrariar ou interromper o progresso da condição médica.
[0137] A quantidade e frequência de administração dos compostos da invenção e/ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos serão reguladas de acordo com o julgamento do clínico presente, conside- rando tais fatores como idade, condição e tamanho do paciente, bem como a gravidade dos sintomas sendo tratados.
[0138] Em alguns aspectos, a presente invenção refere-se a méto- dos usados para triagem para identificar alvos de fármacos usando mo- léculas pequenas e/ou ferramentas genômicas (por exemplo, RNA pe- queno interferente (siRNA), RNA em gancho de cabelo curto (shRNA), microRNA (miRNA), oligonucleotídeos antissenso e vírus terapêuticos genéticos) que reduzem a expressão e/ou atividade de DUX4 e trans- critos a jusante, MBD3L2, em miotubos FSHD. Em modalidades parti- culares, os métodos compreendem colocar um miotubo compreen- dendo células FSHD, por exemplo, células compreendendo um defeito FSHD1 e/ou FSHD2 (por exemplo, mutação) em contato com um ou mais agentes candidatos e, em seguida, determinar se os miotubos em contato com o agente candidato têm atividade reduzida de DUX4, níveis reduzidos de mRNA ou proteína DUX4, atividade reduzida de um ou mais genes a jusante regulados por DUX4; ou níveis reduzidos de um ou mais genes a jusante regulados por DUX4, em comparação com os níveis em miotubos em contato com um controle negativo, por exemplo, veículo somente. Os agentes candidatos associados a níveis reduzidos de atividade ou expressão de DUX4 e/ou um gene de DUX4 a jusante são então identificados e os alvos que eles modulam podem ser identi- ficados. Por exemplo, no caso de siRNA, o alvo gene do siRNA associ- ado à expressão reduzida de DUX4 e/ou um gene alvo de DUX4 a ju- sante é identificado como alvo de fármaco para o tratamento de doenças ou distúrbios associados à expressão aberrante de DUX4 e/ou de um gene alvo de DUX4 a jusante, incluindo qualquer um dos descritos no presente documento, por exemplo, a FSHD. Da mesma forma, no caso de moléculas pequenas, o alvo de fármaco da molécula pequena asso- ciada à atividade ou expressão reduzida de DUX4 e/ou de um gene alvo de DUX4 a jusante é identificado como alvo de fármaco para o trata- mento de doenças ou distúrbios associados à expressão aberrante de DUX4 e/ou de um gene alvo de DUX4 a jusante, incluindo qualquer um dos descritos no presente documento, por exemplo, a FSHD. Em certas modalidades, os métodos podem ser praticados avaliando uma proprie- dade física ou qualitativa dos miotubos, a fim de identificar um agente candidato e seu alvo, que pode ser usado para melhorar a propriedade física ou qualitativa dos miotubos, identificando assim o alvo como um alvo terapêutico para o tratamento de doenças ou distúrbios associados à expressão aberrante de DUX4 e/ou de um gene alvo de DUX4 a ju- sante, incluindo qualquer um dos descritos no presente documento, por exemplo, a FSHD.
[0139] Em certas modalidades, a divulgação inclui um método para identificar um agente que inibe a expressão de uma proteína DUX4 ou inibe a expressão de uma proteína codificada por um gene alvo de DUX4 a jusante, o método compreendendo: colocar um miotubo prepa- rado a partir de células associadas a distrofia muscular fascio-escápulo- umeral (FSHD) em contato com um agente candidato; e determinar um nível de expressão da proteína DUX4, um polinucleotídeo que codifica a proteína DUX4, o gene alvo de DUX4 a jusante ou um polinucleotídeo que codifica o gene alvo de DUX4 a jusante no miotubo, em que o agente candidato é identificado como um agente que inibe a expressão da proteína DUX4, ou a proteína codificada pelo gene alvo a jusante, se o nível de expressão determinado após o contato for reduzido em com- paração com o nível de expressão da proteína DUX4 ou a proteína co- dificada pelo gene alvo a jusante em um miotubo preparado a partir de células associadas a FSHD não colocado em contato com o agente can- didato ou não colocado em contato com um agente de controle negativo.
[0140] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos descri- tos no presente documento, o agente candidato pode ser qualquer uma das classes de inibidores aqui divulgadas, incluindo moléculas peque- nas, polipeptídeos e ácidos nucleicos, tais como, por exemplo, em que o agente candidato compreende ou consiste em: um ácido nucleico, op- cionalmente um DNA, RNA, gRNA, shRNA, miRNA, siRNA ou oligonu- cleotídeo antissenso; um polipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um peptídeo, uma proteína mimética, um peptidomimético, vetor de terapia genética, ou um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo; ou uma molécula pequena, opcionalmente uma molécula orgânica ou uma mo- lécula inorgânica.
[0141] Em certas modalidades de qualquer um dos métodos, o gene alvo a jusante é, por exemplo, MBD3L2, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, ou KHDC1L. Em certas modalidades, o gene alvo a jusante é, por exemplo, ZSCAN4, LEUTX, PRAMEF2, TRIM43, MBD3L2, KHDC1L, RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, ou PRAMEF15.
[0142] Em certas modalidades, qualquer um dos métodos descritos no presente documento é realizado rastreando uma biblioteca de potenciais agentes candidatos. Em certas modalidades, os métodos são realizados usando ensaios de alta produtividade.
[0143] Em certas modalidades, os métodos são realizados usando miotubos FSHD maduros derivados de pacientes.
[0144] Em uma modalidade, uma biblioteca de moléculas pequenas é usada para rastrear modificadores alvo da expressão ou atividade de DUX4 ou de genes alvo a jusante nos miotubos FSHD. Três dias antes do tratamento, as células são plaqueadas a 15.000 células por poço em uma placa gelatinizada de 96 poços com meio de crescimento muscular esquelético (PromoCell, C-23060) com 20% de FBS e Pen/Strep (Gibco, 15140148). No dia do tratamento, o meio é alterado para Meio de cres- cimento muscular esquelético (PromoCell, C-23061) suplementado com 20% de reposição de soro KnockOut (Gibco, 10828010) ou meio NbAc- tiv4 (BrainBits Nb4-500) e Pen/Strep. Os agentes moduladores de p38 são adicionados na concentração desejada ao meio de cultura contendo miotubos FSHD diferenciados e cultivados por 3 a 4 dias na incubadora. Os miotubos são removidos da incubadora e o RNA é extraído usando o RNeasy Micro Plus Kit (Qiagen Cat Nº/ID: 74034). O cDNA é prepa- rado a partir do RNA extraído para o ensaio Taqman Gene Expression para medir a expressão de DUX4 genes alvo a jusante. O transcrito POL2RA é usado como controle endógeno.
EXEMPLOS
[0145] Os estudos descritos nos seguintes Exemplos foram realiza- dos usando os Materiais e Métodos descritos abaixo.
ABREVIAÇÕES ASO oligonucleotídeos antissensos DAPI 4',6-diamidino-2-fenilindol (dicloridrato) DMSO sulfóxido de dimetila DUX4 homeobox dupla 4 DUX4-fl homeobox dupla 4 de comprimento total FSHD distrofia muscular fascio-escápulo-umeral gRNA RNA guia MBD3L2 proteína de domínio de ligação de metil CpG 3 como 2 MHC cadeia pesada de miosina MPAK14 proteína quinase 14 ativada por mitogênio mRNA RNA mensageiro MYOG miogenina (fator miogênico 4) p HSP27 proteína 27 de choque térmico fosforilada PCR reação em cadeia da polimerase pLAM sequência sinal de poliadenilação POLR2A Subunidade A do RNA Polimerase II qPCR reação em cadeia da polimerase quantitativa RNA ácido ribonucleico sgRNA RNA guia simples siRNA RNA pequeno interferente
MATERIAIS E MÉTODOS GERAIS MIOBLASTOS DO MÚSCULO ESQUELÉTICO HUMANO:
[0146] FTCE-00016-01 (linha de mioblastos FSDH imortalizados, 6,3 repetições) e linhas isogênicas A4 controlam mioblastos normais saudáveis e C12 FSHD foram usados em todos os estudos (conforme descrito em Mamchaoui, et al., 2011; Thorley, et al., 2016). Quatro linhas primárias distintas de mioblastos de pacientes, FTCE-016, -020, -197, - 196 foram fornecidas por R. Tawil. Os mioblastos FSHD demonstraram expressar DUX4 aberrante por desmetilação do D4Z4 no cromossomo 4q35.
OS COMPONENTES DE MÍDIA E OS MATERIAIS DE CULTURA DE TECIDOS INCLUEM:
[0147] Meio de crescimento muscular esquelético (PromoCell, C- 23160) suplementado com 15% de FBS (Hyclone, SH30071) e Pen/Strep (Gibco, 15140148). NbActiv4 (BrainBits Nb4-500) e
Pen/Strep (Meio de Diferenciação). EmbryoMax 0,1% Solução de Gela- tina (EMDmillipore ES-006-B). PBS (Gibco, 10010023), microplaca de 96 poços tratada com cultura de tecidos (Corning, CLS3595), Placa de Cultura de Células Multiwell Tratada com TC (Falcon, 353046). REAGENTES E KITS DE PCR EM TEMPO REAL:
[0148] Tampão de lise-Roche Realtime Ready lysis buffer 19,5 µL.(20 µL) (Roche, 07248431001), DNAse I (Ambion, AM2222) de 0,25 µL, Protector RNase Inhibitor (Roche, 3335402001) de 0,25 µL, RNeasy Micro Kit (Qiagen, 74004), Taqman Preamp Master Mix (ThermoFisher Scientific, 4391128), Taqman Multiplex Master Mix (ThermoFisher Sci- entific, 4484262), ZSCAN4 Taqman Assay (ThermoFisher Scientific, Hs00537549_m1, FAM-MGB), MYOG Taqman Assay (ThermoFisher Scientific, Hs01072232_m1, JUN-QSY), RPLP0 Taqman Assay (Ther- moFisher Scientific, Hs99999902_m1), LEUTX Taqman Assay (Ther- moFisher Scientific, Hs00418470_m1). OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISSENSOS (ASOS)
[0149] ASOs foram adquiridos a partir de Exiqon: FTSE-000001 (DUX4 ASO de Exiqon, CAGCGTCGGAAGGTGG (SEQ ID NO:18), 300610)), e ASO não direcionado (Exiqon, AACACGTCTATACGC (SEQ ID NO:19, 300610). REVESTIMENTO DE GELATINA DE PLACAS DE CULTURA DE TECI- DOS:
[0150] Realizada três dias antes do tratamento, a solução de gela- tina a 0,1% foi preparada combinando 1 g de gelatina (por exemplo, Sigma G9391) e 1 L de água para cultura de tecidos; autoclavada por 30 minutos para dissolver e, esterilizada. Foi aplicada uma quantidade suficiente de 0,1% de gelatina para revestir o prato usando uma pipeta estéril, depois a solução foi aspirada e os pratos foram secos ao ar e armazenados à temperatura ambiente. PLAQUEAMENTO DE CÉLULAS:
[0151] Realizadas três dias antes do tratamento, 10.000 células fo- ram plaqueadas por poço em placas de 96 poços gelatinizadas ou
100.000 células em placas de 6 poços gelatinizadas. OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENSO E TRATAMENTO DO COM- POSTO:
[0152] Para tratamentos com ASO ou composto, as células foram plaqueadas em 100 μL de meio de crescimento Promocell contendo ASO ou compostos nas concentrações descritas. DIFERENCIAÇÃO DO MIOTUBO DO MÚSCULO ESQUELÉTICO:
[0153] No dia 0, o meio foi alterado para meio de diferenciação. As placas foram removidas da incubadora e o meio de crescimento foi as- pirado, as placas foram lavadas uma vez com PBS, 100 μL para 96 po- ços e 1 mL para uma placa de 6 poços, foram adicionados 100 μL ou 2 mL de meio de diferenciação por poço, 96 ou 6 poços, respectivamente. Oligonucleotídeos antissenso ou fármacos foram adicionados na con- centração desejada, e as placas foram colocadas de volta na incuba- dora e incubadas por 3-4 dias. PREPARAÇÃO DO RNA:
[0154] As células foram removidas da incubadora e os meios aspi- rados. As células foram lisadas rapidamente, seguindo um dos seguin- tes protocolos: para lise em placas de 96 poços, direcionar lise e proto- colo qPCR RT-Preamp foram realizados de acordo ao protocolo descrito abaixo. Para cada placa de 96 poços, uma mistura contendo: Foi pre- parado 19,5 μL de tampão de lise Roche Realtime Ready, 0,25 μL de inibidor de RNAse, 0,25 μL de DNAseI (da Thermo, não a incluída no kit). 20 μL da mistura foram adicionados a cada poço, misturadas 5 ve- zes e incububadas por 5 minutos em temperatura ambiente ou alterna- damente agitadas vigorosamente por 15 minutos. A lise foi observada ao microscópio. As amostras foram congeladas a -80º C por pelo menos 15 minutos,
ETAPA UM qPCR:
[0155] Para qPCR, o lisado celular foi diluído 1:10 e 2 μL foram usa- dos para uma reação de 10 μL de RT-qPCR de uma etapa para detec- ção de GAPDH, RPLP0, TBP, MYOG, FRG1, MYH3, ACTN2, etc. Por 10 µL de reação, a mistura de reação incluía: 2 mL de RNA (lisado de diluição 1:10), 5 mL de Fast Advanced Taqman Master Mix (2X), 0,25 μL de mistura enzimática RT (40X), 0,5 μL de conjunto de sonda Taqman (20X), 2,25 μL de H20. O seguinte protocolo de reação foi exe- cutado no QuantStudio 7: 48°C por 15 min, 50°C por 2 min, 95°C por 30 seg, 40x, 95°C por 5 seg, 60°C por 30 seg; pós o qual as placas foram lidas conforme especificado pelo fabricante (Thermo).
[0156] A pré-amplificação por RT de uma etapa foi usada para a detecção de genes a jusante DUX4, isto é, MBD3L2, ZSCAN4, LEUTX, TRIM43, KHDC1L e POL2RA-VIC foi usado como controle endógeno. Por 10 µL de reação,a mistura de reação incluía: 2, 25 µL de RNA (lisato de diluição de 1:10), 5 µL de Taqman Pré-Amp Master Mix (2X), 0, 25 µL de mistura enzimática RT (40X), 2,5 µL de conjunto de sonda Taqman (0,2X)*. * Para agrupar os ensaios TaqMan, foram usados vo- lumes iguais de cada ensaio de 20✕ TaqMan® Gene Expression As- say, e até 100 ensaios foram combinados. Por exemplo, para agrupar 50 ensaios de TaqMan, 10 µL de cada ensaio foram combinados em um tubo de microcentrífuga. Os ensaios de TaqMan agrupados foram diluí- dos usando tampão 1✕ TE, de modo que cada ensaio estivesse em uma concentração final de 0,2✕. Para o exemplo acima, 500 µl de tam- pão 1✕ TE foi adicionado aos ensaios de TaqMan agrupados para obter um volume final total de 1 mL. O protocolo QuantStudio7 foi usado a 48°C 15 min, 95°C 10 min, 10 ciclos: 95°C 15 seg, 60°C 4 min e 4°C infinito. As amostras foram então diluídas a 50 µL e continuadas com a etapa qPCR. Por 10 µL de reação,a mistura de reação incluía: 2 μL de diluição de Preamp, 5 μL de Fast Advanced Taqman Master Mix (2X),
0,5 μL de conjunto de sondas Taqman (20X) e 2,5 μL de H20. Ao multi- plexar, o volume foi ajustado para 10 μL total. O programa seguinte foi executado no QuantStudio7: 50°C por 2 min, 95°C por 30 seg, 40x, 95°C por 5 seg, 60°C por 30 seg e as placas foram lidas de acordo com as especificações do fabricante (Thermo).
MÉTODOS PARA EXTRAÇÃO TOTAL DE RNA DE MIOTUBOS USANDO O RNEASY MICRO PLUS KIT:
[0157] Em uma placa de 6 poços, foram adicionados 450 μL de Buf- fer RLT Plus. O lisado foi homogeneizado por transferência do lisado para uma coluna de rotação de gDNA Eliminator colocada em um tubo de coleta de 2 mL (fornecido), a coluna foi centrifugada por 30 s a ≥8000 xg (≥10.000 rpm) e, em seguida, a coluna foi descartada ao salvar o escoamento. 250 μL de etanol (35% final) foram adicionados ao escoa- mento e misturados bem por pipetagem (não centrifugados). As amos- tras foram então transferidas, incluindo qualquer precipitado que possa ter se formado, à uma coluna de rotação RNeasy MinElute colocada em um tubo de coleta de 2 mL (fornecido). As colunas foram centrifugadas por 15 seg a ≥8000 x g. O fluxo foi descartado ou coletado para precipi- tação de proteínas. Foram adicionados 700 μL de tampão RW1 à coluna de rotação RNeasy MinElute e então centrifugados por 15 seg a ≥8000 x g. O escoamento foi descartado. O tratamento com DNAse foi reali- zado misturando suavemente 10 μL de DNAseI com 70 μL de Tampão RDD e a solução resultante foi adicionada diretamente à coluna, que foi incubada à temperatura ambiente por 20 min. Em seguida, 700 μL de tampão RW1 (por especificação do fabricante) foram adicionados à co- luna de rotação RNeasy MinElute, a coluna foi centrifugada por 15 s a ≥8000 x g. e o escoamento descartado. 500 μL de tampão RPE foram adicionados à coluna de rotação RNeasy MinElute, que foi centrifugada por 15 s a ≥8000 x g, após o qual o escoamento foi descartado. 500 μL de etanol a 80% foram adicionados à coluna de centrifugação RNeasy
MinElute, a coluna foi centrifugada por 2 min a ≥8000 x g para lavar a membrana da coluna de centrifugação e o tubo de coleta foi descartado com o escoamento. A coluna de rotação RNeasy MinElute foi colocada em um novo tubo de coleta de 2 mL (fornecido) centrifugado em veloci- dade máxima por 5 minutos para secar a membrana e o tubo de coleta foi descartado com o escoamento. A coluna de rotação RNeasy MinE- lute foi colocada em um novo tubo de coleta de 1,5 mL (fornecido). 14 μL de água livre de RNase foram adicionados diretamente ao centro da membrana da coluna de rotação, que foi então centrifugada por 1 min a toda velocidade para eluir o RNA. Foi eluído aproximadamente 12 µL de RNA. DETECÇÃO DE DUX4-FL USANDO O MÉTODO DESCRITO POR HI- MEDA ET AL., 2015:
[0158] Preparação de cDNA. As reações de 10 μL incluíram 1 μL de RNA (1 μg), 0,5 μL de Oligo dT, 0,5 μL de 10 mM de dNTPs e 4,5 μL de H20. As amostras de reação foram incubadas a 65°C por 2 min e rapi- damente movidas para gelo e mantidas por pelo menos 1 min antes de adicionar a mistura enzimática, que incluía 2 μL de 5x First-Strand Buf- fer, 0,5 μL de 0,1M DTT, 0,5 μL de inibidor de RNAse e 0,5 mL de SSIV RT. As amostras foram incubadas a 55°C por 20 minutos e 80°C por 10 minutos, seguidas de resfriamento a 4°C. A pré-amplificação de DUX4 foi realizada em uma mistura de reação de 10 μL contendo 1 μL de re- ação RT, 2 μL de tampão 5X GC, 0,8 μL de DMSO, 0,2 μL de 10 mM de dNTPs, 0,2 μL de 10 μM de TJ38F, 0,2 μL de 10 μM TJ40R, 0,1 μL de Phusion II DNA pol e 5,5 μL de H20. O seguinte protocolo foi executado no QuantStudio 7: 98°C 2 min, 10 ciclos de 98°C 15 segundos, 64°C 20 segundos, 72°C 15 segundos, 4°C infinito.
[0159] O qPCR DUX4 com inciadores aninhados foi realizado em uma reação de 10 μL contendo 1 μL de DNA de pré-amplificação do DUX4, 5 μL de 2X IQ SYBR Mix, 0,4 μL de 10 μM de TJ38F, 0,4 μL de
10 μM de TJ41R e 3,2 μL de H20. O seguinte protocolo foi executado no QuantStudio 7: 95°C 3 min, 40 ciclos de 95°C 10 segundos, 64°C 15 segundos, 72°C20 seg, 86°C 10 seg, em seguida, as placas foram lidas de acordo com as especificações do fabricante (Thermo). Os valores Ct foram extraídos do software QuantStudio Realtime PCR e Genedata foi usado para calcular os níveis relativos de expressão usando POLR2A como um gene de manutenção. MÉTODOS DE RNASEQ:
[0160] As leituras de extremidade única de 40 bp do Illumina tiveram boa qualidade verificando com FastQC (http://www.bioinformatics.ba- braham.ac.uk/projects/fastqc/). As leituras foram mapeadas para hg19 usando o TopHat v2.1.1 (Kim et al., 2013) com opções como o modo "solexa1.3-quals'' e ''no-novel-juncs''. O modelo genético do TopHat foi criado mesclando o gene conhecido no formato gtf com a tabela kgXref. O gene conhecido e o kgXref foram baixados do navegador de tabelas UCSC no conjunto de hg19. As contagens de leitura foram obtidas usando a função Count do recurso do pacote Subread com a opção de vertente como –r 2. As leituras foram normalizadas com DESeq2 (Love et al., 2014). IMUNOCITOQUÍMICA DO MIOTUBO FSHD:
[0161] Resumidamente, as células foram fixadas em paraformalde- ído a 4% e permeabilizadas em paraformaldeído a 4% (PFA) durante 10 minutos à temperatura ambiente. As células foram permeabilizadas com PBST (solução 1 x PBS com 0,1% de Triton X-100) antes de serem blo- queadas com 10% de Soro de Burro Normal ou 3% de BSA (NDS) em PBST. As células foram então incubadas com anticorpos primários ade- quadamente diluídos em PBST com NDS a 5% por 1 hora à temperatura ambiente ou 12 horas a 4°C, lavadas com PBST por 3 vezes à tempe- ratura ambiente e depois incubadas com anticorpos secundários dese- jados em TBST com NDS a 5% e DAPI para combater a mancha dos núcleos. DUX4 foi detectado por imunocitoquímica usando o anticorpo E5-5 em miotubos FSHD diferenciados. A Caspase-3 ativada foi detec- tada através de um anticorpo comercialmente disponível (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/cleaved-cas- pase-3-asp175-antibody/9661). MÉTODOS DE RNASEQ:
[0162] As leituras de extremidade única de 40 bp do Illumina tiveram boa qualidade verificando com FastQC (http://www.bioinformatics.ba- braham.ac.uk/projects/fastqc/). As leituras foram mapeadas para hg19 usando TopHat v2.1.1. O modelo genético do TopHat foi criado pela fu- são do knownGene no formato gtf com a tabela kgXref. O gene conhe- cido e o kgXref foram baixados do navegador de tabelas UCSC no con- junto de hg19. As contagens de leitura foram obtidas usando a função Count do recurso do pacote Subread com a opção de vertente como –r
2. As leituras foram normalizadas com DESeq2. As réplicas biológicas nas amostras de neurônios, processadas em diferentes períodos de tempo, tiveram efeito em lote, conforme sugerido pela análise de com- ponentes principais. Consequentemente, Combat foi usado para reduzir esse efeito de lote. Valores de expressão RPKM padrão calculados. A assinatura total do gene foi muito pequena e definida nos cortes estatís- ticos padrão: 86/19.799 genes mRNA. A assinatura do gene regulado pelo DUX4 foi a maioria da assinatura total: 77/86 genes mRNA = 90%. Os genes não regulados pelo DUX4 eram minoria da assinatura total, com alterações moderadas nas dobras: 9/86 genes mRNA = 10%; 2-2,7 X logFC. MÉTODOS PARA A TRANSDUÇÃO DE SIRNA E CAS9/SGRNA RNP DE MIOTUBOS FSHD:
[0163] Os crRNAs sintéticos foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific e o recozimento com tracrRNAs foi realizado de acordo com as especificações. Em suma, crRNAs e tracrRNA foram ressuspensos em tampão TE a 100 μM, misturados e diluídos 5 vezes em tampão de recozimento. O recozimento foi realizado em um sistema ProFlex PCR seguindo a recomendação do fabricante. 100 ng de crRNA: tracrRNA montado foram incubados com 500 ng de TrueCut Cas9 (ThermoFisher, #A36497) no tampão de ressuspensão fornecido com o kit de sistema de transfecção Neon (ThermoFisher, #MPK10096). Após 15 minutos de incubação, a reação foi usada para transfectar 50.000 mioblastos de acordo com os métodos descritos. As sequências usadas para o direci- onamento de MAPK14 (3 sgRNAs) e da região pLAM (sequência de po- liadenilação de DUX4, 4 gRNAs) foram: NT-CTRL, GTATTACTGATA- TTGGTGGG (SEQ ID NO:8); MAPK14, GCTGAACAAGACAATCTGGG (SEQ ID NO:9), CTGCTTTTGACACAAAAACG (SEQ ID NO:10), CTTA- TCTACCAAATTCTCCG (SEQ ID NO:11); pLAM, AGAATTTCACGGA- AGAACAA (SEQ ID NO:12), CAGGTTTGCCTAGACAGCGT (SEQ ID NO:13), ATTAAAATGCCCCCTCCCTG (SEQ ID NO:14), AATCTTCTA- TAGGATCCACA (SEQ ID NO:15), e siRNA MAPK14, Antissenso: UA- GAUUACUAGGUUUUAGGTC (SEQ ID NO:16), Senso: CCUAAAAC- CUAGUAAUCUATT (SEQ ID NO:17).
MATERIAIS E MÉTODOS IN VIVO RATOS PARA ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS E FARMACODINÂ- MICOS:
[0164] Ratos Sprague Dawley machos (6 a 8 semanas de idade) foram fornecidos por Hilltop Lab Animals, Inc. (EUA). Após a chegada ao Wuxi AppTec, os animais foram avaliados quanto à sua saúde geral por um membro da equipe veterinária ou outra pessoa designada. Os animais foram aclimatados por pelo menos 2 dias (após a chegada ao WuXi AppTec) antes do início do estudo. Os animais foram alojados in- dividualmente durante a aclimatação e durante todo o estudo. O ambi- ente da sala dos animais foi controlado de acordo com o funcionamento da instalação (condições alvo: temperatura de 20 a 26°C, umidade rela- tiva de 30 a 70%, ciclo de 12 horas de luzes acesas e apagadas). As luzes, a temperatura e a umidade relativa são constantemente monito- rizadas por um Sistema de Monitorização Ambiental AmegaView. A di- eta (Certified Roedor Diet #5002, PMI Feeds, Inc., Brentwood, MO) foi irradiada com péletes com embalagem dupla; o número e as especifica- ções do lote da dieta serão registrados no caderno de estudo e arquiva- dos no WuXi AppTec. Água (osmose reversa) foi fornecida aos animais ad libitum. Análises periódicas da qualidade da água foram realizadas e os resultados foram arquivados no WuXi AppTec. Não há contaminan- tes conhecidos na dieta ou na água que, nos níveis de detecção, devam interferir no resultado do estudo. No estudo # FULTH - 20171120, os ratos foram submetidos a jejum durante a noite antes da administração do fármaco: os ratos tiveram acesso livre à água o tempo todo e foram alimentados 4 horas após a administração. Para o estudo # FULTH- 20171228, foi permitido aos ratos acesso ad-libitum a alimentos e água durante todo o estudo. CAMUNDONGOS PARA ESTUDOS DE XENOENXERTO:
[0165] Camundongo macho NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ (Nod-Rag) (6 a 8 semanas de idade) foram fornecidos pela VR breeding colony da Universidade de Maryland (EUA). Os ani- mais foram alojados na UMB central animal facility em Howard Hall, na Universidade de Maryland. Os animais foram alojados em grupo (4/gai- ola) durante a aclimatação (4-5 dias), durante todo o procedimento de enxerto e durante o estudo de tratamento de fármaco. O ambiente da sala dos animais foi controlado de acordo com o funcionamento da ins- talação (condições alvo: temperatura de 20 a 26°C, umidade relativa de 30 a 70%, ciclo de 12 horas de luzes acesas e apagadas). As luzes, a temperatura e a umidade relativa são constantemente monitorizadas por um Sistema de Monitorização Ambiental AmegaView. A dieta (Lab- Diets 5P76 22,5% de comida de roedor protéica) foi fornecida ad libitum durante o estudo. A água esterilizada foi fornecida ad libitum. Não exis- tem contaminantes conhecidos na dieta ou na água que possam inter- ferir no resultado do estudo. CRIAÇÃO DE CAMUNDONGOS DE FSHD E CONTROLE DE XENO- ENXERTO:
[0166] Os camundongos com FSHD e de controle foram gerados por xenoenxerto de linhas celulares de mioblastos isogênicos imortali- zados humanos derivados de IPSC (FSHD) e A4 (controle) nos múscu- los tibiais anteriores bilaterais (TA) de camundongos machos Nod-Rag com aproximadamente 8 semanas de idade. Para criar os xen-enxertos musculares humanos, foi criado um nicho para semear as células A4 ou C6 dentro do TA dos membros traseiros de camundongo, por irradiação por raios-X dos membros traseiros dos camundongos NRG imunodefi- cientes com 8 semanas de idade, para prevenir a regeneração muscular de camundongo. Um dia depois, 50 ul de uma solução BaCl2 de 2% foi injetada ao longo do comprimento de cada TA para eliminar o tecido muscular do camundongo. Após a ablação do tecido do camundongo, as células 2x106 C6 foram injetadas em cada região TA, bilateral, e dei- xadas desenvolver por quatro semanas. Após o enxerto das células A4 ou C6, os animais foram expostos a 4 semanas de estimulação elétrica neuromuscular intermitente (iNMES), a fim de melhorar o enxerto das células humanas, conforme descrito por Sakellariou et al., 2016.
FORMULAÇÃO E PREPARAÇÃO DE ARTIGOS DE TESTE
[0167] A quantidade apropriada de FTX-1821 foi pesada com preci- são e misturada com o volume apropriado de excipientes (0,5% (1% de DMSO, 99% de metilcelulose)) em água para obter uma suspensão uni- forme com uma concentração final de 0,03 mg/mL. A formulação foi pre-
parada no dia do estudo e foi dosada dentro de 1 hora após a prepara- ção. O volume da dose administrada aos animais foi de 10 mL/kg. Duas alíquotas de 20 a 50 μL da solução da dose foram retiradas de cada formulação e reservadas para a determinação da precisão da dose por LC-MS/MS.
[0168] A quantidade apropriada de FTX-2865 foi pesada com preci- são e misturada com o volume apropriado de solução salina estéril a 0,9% para injeção para obter uma solução clara com uma concentração final de 1 mg/mL. A formulação foi preparada no dia do estudo e foi ad- ministrada aos animais usando um volume de dose de 10mL/kg. ADMINISTRAÇÃO DO ARTIGO DE TESTE FTX-1821 E PROJETO DO ESTUDO FARMACOCINÉTICO E FARMACODINÂMICO:
[0169] A solução de dosagem de FTX-1821 (0,03 mg/mL) foi admi- nistrada por sonda oral a um volume de dose de 10 mL/kg, a fim de produzir uma dose final de 0,3 mg/kg seguindo os POPs das instalações Wuxi. O volume da dose foi determinado pelo peso corporal medido an- tes da dosagem. As concentrações da solução de dosagem (mg/ML), volumes de dose (mL/kg) e dose final (mg/kg) para os respectivos gru- pos de tratamento foram registrados na folha inclúida de estudo em Ex- cel. Condição de alimentação: jejum durante a noite, retorno da alimen- tação 4 horas após a dosagem.
[0170] Administração do Artigo de Teste FTX-2865 e Projeto do Es- tudo de Xenoenxerto
[0171] A solução de dosagem de FTX-2865 (1 mg/mL) foi adminis- trada por meio de injeção IP a um volume de dose de 10 mL/kg, a fim de produzir uma dose final de 10 mg/kg (para cada dose). Solução sa- lina estéril a 0,9% foi administrada por meio de injeção IP a um volume de dose de 10 mL/kg como controle de veículo (para cada dose). O vo- lume de dose foi determinado pelo peso corporal medido antes da ad- ministração pela manhã. As concentrações da solução de dosagem
(mg/ML), volumes de dose (mL/kg) e dose final (mg/kg) para os respec- tivos grupos de tratamento foram registrados na folha inclúida de estudo em Excel. As injeções BID foram espaçadas aproximadamente por 12 horas para maximizar a cobertura do alvo. Os animais do estudo rece- beram um total de 14 injeções de veículo ou FTX-2865 durante 8 dias e foram sacrificados aproximadamente 1 hora após a injeção final pela manhã no dia 8. COLETA DE AMOSTRAS:
[0172] Amostras de sangue para farmacocinética: Aproximada- mente 100 µl de amostra de sangue foram obtidos por meio de veia jugular ou veia da cauda em cada ponto do tempo predefinido. As amos- tras de sangue foram colocadas em tubos coletores pré-resfriados tra- tados com EDTA-K2 como anticoagulante e colocados em gelo até a centrifugação.
[0173] Coleta de plasma para avaliação da farmacocinética: As amostras de sangue farmacocinéticas foram centrifugadas a 4°C, 3000g por 15 min dentro de meia hora para a coleta de plasma. As amostras de plasma foram armazenadas em tubos de polipropileno ou placas de 96 poços, congeladas rapidamente em gelo seco e armazenadas a - 70°C até análise por LC/MS/MS.
[0174] Coleta Muscular para Avaliação Farmacocinética e Farma- codinâmica: Os músculos tibiais anteriores e de trapézio bilaterais foram coletados após a coleta de sangue por punção cardíaca. Cada músculo dos lados esquerdo e direito foi rapidamente pesado separadamente e colocado em tubos separados e congelado rapidamente em gelo seco. Os músculos de um lado foram usados para a medição da concentração de compostos, e os do outro lado foram enviados ao patrocinador para análise farmacodinâmica. A dosagem foi escalonada, de modo que a coleta de amostra foi realizada aproximadamente à mesma hora no final do dia.
PROCESSAMENTO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE FARMACOCI- NÉTICA:
[0175] Preparação de Amostra de Plasma para Análise por LC/MS: Uma alíquota de 10 µL de amostra de plasma foi precipitada com prote- ína com 150 µL de solução IS (100 ng/mL de Labetalol e 100 ng/mL de Tolbutamida e 100 ng/mL de Diclofenac em ACN), a mistura foi bem misturada em vórtice e centrifugada a 4000 rpm por 15 min, 4°C. Uma alíquota de 80 μL de sobrenadante foi transferida para a placa de amos- tra e misturada com 80 μL de água, depois a placa foi agitada a 800 rpm por 10 min. 1 µL de sobrenadante foi então injetado para análise por LC- MS/MS. Preparação de Amostras de Músculo para Análise por LC/MS: As amostras de músculo foram homogeneizadas em água na proporção de 1:4 (p/v) usando o homogeneizador Omni. Os homogenatos foram então usados para a medição da concentração do fármaco. Uma alí- quota de 20 µL de homogenato de tecido muscular foi precipitada com proteína com 200 µL de solução IS (100 ng/mL de Labetalol e 100 ng/mL de Tolbutamida e 100 ng/mL de Diclofenac em ACN), a mistura foi bem misturada em vórtice e centrifugada a 4000 rpm por 15 min, 4 ℃. Uma alíquota de 80 μL de sobrenadante foi transferida para a placa de amos- tra e misturada com 80 μL de água, depois a placa foi agitada a 800 rpm por 10 min. 0,3 µL de sobrenadante foi então injetado para análise por LC-MS/MS. MÉTODO ANALÍTICO (LC/MS), NÃO BPL):
[0176] Os detalhes técnicos usados para executar métodos analíti- cos incluem: Instrumento: LCMS Triple Quad QTRAP 6500+ (SCIEX, MA, EUA), Matriz: plasma masculino de rato SD (EDTA-K2), Padrão(ões) interno(s): 100 ng/mL de Labetalol & 100 ng/mL de Tolbutamida & 100 ng/mL de Diclofenaco em condições CAN, MS ESI: positivo, detec- ção SRM de FTX-1821: [Camundongo + humano]+ m/z 383.838>299.231; Labetalol (IS): [M + H] + m/z 329,2/162,1; Tolbutamida (IS): [M+H]+ m/z
271,1/155; Curva de calibração: 1,00 a 3000 ng/mL para FTX001821-02 no plasma de rato SD macho (EDTA-K2) e homogenato muscular Método de Quantificação: A área de pico do artigo de teste nas amostras e na amostra da solução padrão foi determinada pelo método LC/UV ou LC-MS/MS. Critérios de aceitação do método: Linearidade: ≥75% das DSTs foram calculadas novamente para dentro de ± 20% de seus valo- res nominais (± 25% para LLOQ) em biofluido e dentro de 25% de seus valores nominais (30% para LLOQ) em amostras de homogenato de te- cido e de fezes. CQ: ≥ 67% de todos os CQs foram calculados nova- mente para dentro de ± 20% de seus valores nominais para biofluido e dentro de 25% de seus valores nominais para amostras de tecido e de fezes. Especificidade: A concentração média calculada de analito na matriz única em branco foi menos que 0,5 vezes o LLOQ. Sensibilidade: O LLOQ no biofluido e no homogenato de tecido foi de 1 a 3 ng/mL. Transferência: A concentração média calculada de transferência na ma- triz única em branco imediatamente após a injeção padrão mais alta foi menos que LLOQ. PROTOCOLO PARA CRIOFRATURA, LISE E PREPARAÇÃO DE TE- CIDO MUSCULAR PARA AVALIAÇÃO POR IMUNOENSAIO DO EN- GAJAMENTO ALVO:
[0177] Aproximadamente 50 mg de tecido muscular foram coloca- dos em gelo seco. As amostras de músculo foram cortadas, conforme necessário para obter o peso de 50 mg usando uma lâmina de barbear limpa por amostra. 50 mg de tecido muscular foram colocados em uma bolsa Covaris TT1 pré-rotulada (Covaris, MA, EUA) e mantidos em gelo seco. A bolsa TT1 Covaris foi submersa em nitrogênio líquido e a amostra foi criografada em Covaris cryoPREP (Covaris, MA, EUA) na configuração “5”. A bolsa TT1 foi girada a 180º e as etapas 2-a foram repetidas. A amos- tra foi transferida para um tubo pré-pesado/marcado e mantida em gelo seco até que todas as amostras estivessem preparadas. Os pesos da amostra foram registrados. O tampão de lise RIPA foi preparado (R0278-500ML, Sigma, MO, EUA). Para 10 ml, foram adicionados dois comprimidos inibidores de fosfatase Roche PhosSTOP e um compri- mido inibidor de protease Roche livre de EDTA. Ao material criofratado, 8 µl por mg de tampão RIPA foram adicionados a cada tubo e cada tubo foi submetido a vórtice até que o lisado fosse homogêneo. Os lisados foram mantidos em gelo até que todas as amostras fossem processa- das. O lisado foi eliminado por centrifugação a 13.000g por 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e congelado ra- pidamente em nitrogênio líquido (deixando 10 µl para o ensaio de pro- teína). Para medir o teor de proteína de cada amostra, foi realizado um ensaio de proteína Bradford DC (5000112, Bio-Rad, CA, EUA). As amostras foram diluídas 1:20 em PBS para avaliação da proteína. IMUNOENSAIO FOSFO MK2 E TOTAL MK2:
[0178] O lisado homogeneizado do músculo trapézio foi avaliado usando um imunoensaio fosfo MK2/MK2 total Meso Scale Discovery (MSD) multiplexado desenvolvido internamente (Meso Scale Diagnos- tics, MD, EUA). Para cada amostra, 50 μL de lisado muscular, igual a 50 μg de proteína, foram carregados no ensaio MSD. As concentrações de proteína nos lisados musculares foram determinadas por um ensaio de proteína Bradford DC conforme descrito acima. As amostras foram avaliadas em duplicado. As amostras de músculo foram incubadas em uma placa MSD pré-revestida durante a noite a 4°C, em um agitador orbital (300 rpm) e avaliadas na manhã seguinte. PROTOCOLO PARA CRIOFRATURA, EXTRAÇÃO DE RNA E PURIFI- CAÇÃO DE RNA DE TECIDO MUSCULAR E AVALIAÇÃO QUANTITA- TIVA POR PCR DE MBD3L2 E CDKN1B:
[0179] Aproximadamente 3 a 5 mg de tecido muscular TA foram co- locados em gelo seco. O tecido muscular foi colocado em uma bolsa
TT1Covaris pré-rotulada (Covaris, MA, EUA) e mantido em gelo seco. A bolsa TT1 Covaris foi submersa em nitrogênio líquido e a amostra foi criografada em Covaris cryoPREP (Covaris, MA, EUA) na configuração “5”. A bolsa TT1 foi girada a 180º e as etapas 2-a foram repetidas. A amostra foi transferida para um tubo pré-pesado/marcado e mantida em gelo seco até que todas as amostras estivessem preparadas. O RNA foi purificado usando o kit Zymo Direct-zol microprep RNA (CA, EUA) a par- tir de 3 a 5 mg de tecido muscular criofraturado. O cDNA foi sintetizado a partir do modelo de RNA por meio de transcrição reversa. Os transcri- tos alvo foram então pré-amplificados em um ensaio de PCR de 14 ci- clos usando sondas TaqMan diluídas específicas para humanos. A ex- pressão genética foi analisada em um ensaio de qPCR usando as son- das TaqMan específicas para humanos. O nível de expressão relativo foi normalizado para expressão de CDKN1B usando o método 2-ΔCt. ANÁLISE DE DADOS:
[0180] A concentração plasmática e muscular versus tempo foi ana- lisada por abordagens não compartimentais usando o software Phoenix WinNonlin 6.3 (Cetera, NJ, EUA). C0, CLp, Vdss, Cmax, Tmax, T½, AUC(0-t), AUC(0-inf), MRT(0-t), MRT(0-inf), %F e gráficos de concen- tração plasmática e muscular versus o perfil de tempo e os pontos de extremidade PD são relatados usando o software GraphPad Prizm ver- são 7 (CA, EUA). A PD muscular foi avaliada por ANOVA unidirecional usando o software GraphPad Prizm versão 7 (CA, EUA). O efeito de enxerto de células de C6 vs. A4 no mRNA MBD3L2 nos músculos xe- noenxertados foi avaliado através do teste T bicaudal usando o software GraphPad Prizm versão 7 (CA, EUA). O efeito de tratamento de FTX- 2865 vs. de veículo no mRNA MBD3L2 nos músculos xenoenxertados FSHD foi avaliado através do teste T bicaudal usando o software Gra- phPad Prizm versão 7 (CA, EUA). EXEMPLO 1
REPRESSÃO DO DUX4 USANDO OLIGONUCLEOTÍDEO ANTIS- SENSO DIRECIONADO A SEQUÊNCIA REDUZ GENES ALVO A JU-
SANTE
[0181] Os miotubos do tipo selvagem foram tratados com veículo de controle DMSO e os miotubos FSHD maduros derivados de pacientes que expressam a proteína DUX4 foram tratados com controle de veículo DMSO ou 1 M de um oligonucleotídeo antissenso direcionado a se- quência DUX4 (ASO; FTX-2) adquirido da Exiqon. Após o tratamento, os miotubos foram lisados em 19, L de tampão de lise Roche Real Time Ready, 0,25 L de DNAse1 (Ambion, AM2222), 0,25 L de Inibidor protetor da RNase (Roche, 3335402001) e o RNA foi coletado em um RNeasy Micro Kit Master Mix. Os níveis de expressão de genes a ju- sante regulados por DUX4 (ZSCAN4, TRIM43, MBD3L2, LEUTX, e KHDC1L) foram determinados por PCR em tempo real (ThermoFisher Científica, 4484262), ZSCAN4 Taqman Assay (ThermoFisher Scientific, Hs00537549_m1, FAM-MGB), MYOG Taqman Assay (ThermoFisher Scientific, Hs01072232_m1, JUN-QSY), RPLP0 Taqman Assay (Ther- moFisher Scientific, Hs99999902_m1), e/ou LEUTX Taqman Assay (ThermoFisher Scientific, Hs00418470_m1). Os valores Ct foram extra- ídos do software QuantStudio Realtime PCR e Genedata foi usado para calcular os níveis relativos de expressão usando o POLR2A como um gene de manutenção.
[0182] Os resultados mostraram que os miotubos FSHD tratados com ASO direcionado à sequência DUX4 expressam quantidades redu- zidas de DUX4 e genes alvo do fator de transcrição a jusante por DUX4, ZSCAN4, TRIM43, MBD3L2, LEUTX e KHDC1L, em comparação com miotubos FSHD tratados com controle de veículo DMSO (Figura 2).
[0183] Os dados na Figura 3A são dados de controle de qualidade de placa agrupados comparando a expressão de mRNA de MBD3L2 em miotubos FSHD tratados com controle DMSO ou DUX4 ASO de 1 µM e miotubos de controle isogênico normais saudáveis. A Figura 3B mostra dados de controle de qualidade farmacológica e redução dependente de dose de DUX4 e do gene a jusante, MBD3L2, usando diferentes di- luições do DUX4 ASO. A Figura 3C mostra estatísticas de ensaios ba- seados em placas comparando miotubos FSHD tratados com DMSO a WT: Z' é 0,512 E Sinal para Ruído (S/N) é 5,1, e miotubos FSHD trata- dos com DMSO ou DUX4 ASO: Z' é 0,319 e o Sinal para Ruído (S/N) é 4,6. EXEMPLO 2 INIBIDORES DE MOLÉCULAS PEQUENAS P38 REDUZEM A EX- PRESSÃO DO MRNA DE MBD3L2
[0184] Os miotubos do tipo selvagem e os miotubos FSHD maduros derivados do paciente que expressam a proteína DUX4 foram tratados com controle de veículo DMSO ou múltiplas concentrações de vários inibidores de p38α/β com diferentes faixas de seletividade de isoformas e cinoma, incluindo SB239063 (Figura 4A), VX-702 (Figura 4B), Pama- pimod (Figura 4C) e TAK-715 (Figura 4D). Após o tratamento, as células de controle e tratadas foram processadas para quantificação por PCR em tempo real da expressão de mRNA de MBD3L2 (gene a jusante DUX4) e de mRNA de miogenina (MYOG) (controle). Estes inibidores de p38α/p mostraram uma redução potente (IC50 aproximadamente <10 nM, Figuras 4A a D) da expressão de mRNA de MBD3L2 sem impacto na expressão de mRNA de MYOG em miotubos FSHD.
[0185] Nos miotubos FSHD, os inibidores da p38 (por exemplo, Pamapimod) reduziram de maneira dependente de dose a expressão do mRNA de DUX4 e do mRNA do gene a jusante MBD3L2 de DUX4 sem afetar a formação de miotubos. Quando comparado ao tratamento com DMSO, 10, 100 e 1000 nM de FTX000839 (Pamapimod) reduziram de ma- neira dependente de dose os níveis de mRNA do DUX4-fl e do gene a ju- sante MBD3L2, normalizados para o mRNA de POLR2A, conforme medido por qPCR e Taqman nos miotubos FSHD (Figura 5A) sem impactar a diferenciação em miotubos (Figura 5B). Os dados mostram que os ini- bidores da p38 reduzem de maneira dependente de dose a expressão do mRNA de MBD3L2, sem afetar a expressão do mRNA de miogenina. EXEMPLO 3 REDUÇÃO DO MRNA DE P38 MAPK14 E DO MRNA DE MBD3L2
POR MEIO DE COLAPSO DE SIRNA
[0186] Os siRNAs de p38α MAPK14 85 e p38α MAPK14 86 foram transfectados em miotubos FSHD do paciente como descrito em Mate- riais e Métodos. Cada um do siRNA de p38α MAPK14 85 e siRNA de p38α MAPK14 86 (em menor extensão) reduziu a expressão de p38 MAPK14, como mostrado na Figura 6A, e expressão do mRNA de MBD3L2 (gene alvo de DUX4), como mostrado na Figura 6B, em com- paração com siRNAs de controle não alvo (NT CTRL 1 e NT CTRL 2). Os dados mostram que a redução genômica de p38α MAPK14> 50% reduziu especificamente DUX4 e genes alvo a jusante, como exemplifi- cado por MBD3L2. EXEMPLO 4 REDUÇÃO DO MRNA DE MBD3L2 POR MEIO DE P38Α QUINASE CAS9/SGRNA RNPS
[0187] O direcionamento do gRNA de CRISPR de MAPK14 ou pLAM (sequência sinal de poliadenilação para DUX4) foi conduzido como descrito em Materiais e Métodos. O gRNA de CRISPR direcio- nado para MAPK14 ou pLAM (sequência sinal de poliadenilação para DUX4) resultou em uma redução na expressão de MBD3L2, mas não na de MYOG. Os dados indicam que a redução genômica de p38α MAPK14 reduziu especificamente DUX4 e genes alvo a jusante, como exemplificado por MBD3L2. EXEMPLO 5 O FTX-1821 DOWN-REGULA NEGATIVAMENTE A PROTEÍNA DUX4
E O MRNA DE MBD3L2.
[0188] Os miotubos FSHD derivados do paciente (com 6 repetições de matrizes D4Z4) foram tratados com controle de veículo DMSO e di- ferentes concentrações de FTX-1821, e os níveis da proteína DUX4 e do mRNA de MBD3L2 foram determinados conforme descrito em Méto- dos e materiais. Para DUX4 e MBD3L2, quatro réplicas biológicas foram analisadas. Além disso, os níveis de pHSP27 foram determinados. Para quantificação de pHSP27, foram obtidas três réplicas em dois experi- mentos independentes.
[0189] O tratamento dos miotubos derivados do paciente com FSHD com FTX 1821 resultou em uma redução dependente da concen- tração da proteína DUX4 (IC50 = 25nM) e do mRNA de MBD3L2 (IC50 = 25nM) que se correlacionou com as alterações observadas nos níveis de fosfo HSP27 (IC50 = 10nM) como evidência do engajamento alvo (Fi- gura 7). Os resultados foram indicativos de uma redução dependente da concentração da proteína DUX4 (IC50 = 25 nM) e do mRNA de MBD3L2 (IC50 = 10 nM). As reduções na proteína DUX4 e no mRNA de MBD3L2 se correlacionaram com as alterações observadas nos níveis de p-HSP27 (IC50 = 10 nM) como evidência do engajamento alvo. Estes resultados indicam que a inibição da via de p38α por FTX-1821 resulta em uma down-regulação potente da proteína DUX4 e do mRNA de MBD3L2. EXEMPLO 6 FTX-1821 NÃO AFETA A FORMAÇÃO DE MIOTUBOS
[0190] Os miotubos FHSD imortalizados foram diferenciados e tra- tados com controle de veículo DMSO ou FTX-1821 em concentrações de 1 µM, 0,33 µM, 0,11 µM ou 0,037 µM. Após 4 dias, as células foram fixadas e coradas com anticorpos direcionados contra MHC ou DAPI. Vide Figura 8A. Os núcleos nos miotubos foram quantificados de acordo com a coloração por MHC (Figura 8B). Os resultados não mostraram alterações na formação ou fusão do miotubo após o tratamento com FTX-1821 nas concentrações testadas. EXEMPLO 7 FTX-1821 REDUZ APOPTOSE EM MIOTUBOS FSHD
[0191] A apoptose foi medida pelos níveis de Caspase-3 ativa em miotubos FSHD in vitro, conforme descrito em Materiais e Métodos. A apoptose foi detectada de uma maneira esporádica em um subconjunto de miotubos em cultura, conforme mostrado pelos círculos brancos e região ampliada na Figura 9A. O sinal da Caspase-3 ativa foi quantifi- cado em miotubos FSHD que foram tratados com FTX-1821 em diferen- tes concentrações (Figura 9B). Os resultados mostraram uma redução dependente de dose do sinal apoptótico, como indicado pela redução na detecção da Caspase 3 ativa (IC50 = 45 nM), e esse efeito foi espe- cífico para os miotubos FSHD em comparação aos miotubos de con- trole. Não foi observada alteração no sinal da Caspase-3 ativa após o tratamento com DMSO. EXEMPLO 8 FTX-1821 REDUZ A EXPRESSÃO DO PROGRAMA TRANSCRICIO- NAL PATOLÓGICO DE DUX4
[0192] Os estudos foram conduzidos conforme descrito em Méto- dos e Materiais para identificar genes na via DUX4 cuja expressão é down-regulada nos miotubos FSHD tratados com FTX-1821 em compa- ração com os miotubos FSHD tratados com controle de veículo DMSO. Além disso, a expressão genética também foi determinada em miotubos do tipo selvagem tratados com DMSO. Três réplicas para cada condição foram analisadas por RNA-seq e os genes foram agrupados pela dire- ção e intensidade da alteração.
[0193] Como mostrado no mapa de calor da Figura 10A, vários ge- nes expressos diferencialmente foram identificados por perfil de RNA- seq. A barra indica que as alterações normalizadas observadas, por exemplo, genes que foram down-desregulados por FTX-1821, são enri- quecidas em amostras tratadas apenas com DMSO. A expressão des- tes genes foi normalizada após o tratamento com FTX-1821 (1 µM) e assemelhava-se mais às observações em células do tipo selvagem. Cal- culada usando valores de expressão padrão de RPKM, a assinatura to- tal do gene foi muito pequena e definida com cortes estatísticos padrão: 86/19.799 genes mRNA. A assinatura genética down-regulada por DUX4 era a maioria da assinatura total e esses genes estão listados na Figura 10A. Os genes não regulados por DUX4 foram minoria da assi- natura total com alterações moderadas nas dobras: 9/86 genes mRNA = 10%; 2-2,7 X logFC. A Figura 10B mostra as leituras normalizadas, conforme descrito em Materiais e Métodos, dos genes alvo de DUX4 que foram down-regulados após o tratamento com FTX-1821. Três ré- plicas independentes por grupo foram analisadas. EXEMPLO 9 REDUÇÃO DO MRNA DE MBD3L2 EM VÁRIOS GENÓTIPOS E FE- NÓTIPOS FSHD1
[0194] A capacidade dos inibidores da p38 para reduzir a expressão dos genes alvo de DUX4 em células obtidas de pacientes com vários genótipos FSHD1 diferentes foi conduzida conforme descrito em Méto- dos e Materiais. Quatro linhas distintas de mioblastos de pacientes com FSHD, ou seja, FTCE-016, -020, -197 e -196 (gentilmente fornecido por Rabi Tawil) foram tratadas com FTX-1821 (1 µM) ou FTX-839 (1 µM) e os níveis do mRNA do gene alvo MBD3L2 de DUX4 foram determinados após o tratamento.
[0195] Os níveis de expressão de MBD3L2 foram reduzidos em to- das as linhas FSHD, resultando em níveis semelhantes aos medidos em con- troles saudáveis, FTCE-396 e FTCE-014 (Figura 11). Esta é uma evidência da redução do gene alvo de DUX4 por inibidores da p38 nos miotubos deri- vados de diversos genótipos e fenótipos FSHD1 (resultados semelhantes foram observados para FSHD2, dados não mostrados). EXEMPLO 10 REDUÇÃO DO MRNA DE MBD3L2 A PARTIR DOS GENÓTIPOS E FENÓTIPOS FSHD1 E FSHD2
[0196] Para avaliar o efeito do tratamento da inibição seletiva da p38 usando FTX-1821 nas células FSHD1 e FSHD2, as linhas primárias de mioblastos foram gentilmente fornecidas por Rabi Tawil na Universi- dade de Rochester. A Figura 13 sumariza os genótipos e fenótipos de mioblastos de 13 pacientes com FSHD1 e de 3 pacientes com FSHD2 usados no estudo. Os vários mioblastos FSHD1 e FSHD2 foram trata- dos com DMSO, FTX-1821 ou FTX-839 (1 µM) e, após o tratamento, foram determinados os níveis de expressão de mRNA do gene alvo DUX4, MBD3L2. Além disso, a apoptose foi determinada pela medição da caspase-3 ativa nas linhas FSHD1 e FSHD2.
[0197] Cada um dos vários mioblastos FSHD1 e FSHD2 mostrou uma redução de MBD3L2 (Figura 14A, linhas superiores 11). A redução resultou em níveis de expressão semelhantes aos das linhas de controle saudáveis (CTRL-FTCE-014) (Figura 14A, 2 linhas inferiores 2). Além disso, o tratamento com FTX-839 mostrou uma redução na apoptose nas linhas FSHD1 e FSHD2, para um nível semelhante à quantidade determinada em uma linha de controle saudável (CTRL-FTCE-014) (Fi- gura 14B). Estes resultados indicam que os mioblastos clínicos de bióp- sia de FSHD, quando diferenciados em miotubos, mostram uma redu- ção patológica na expressão do gene a jusante de DUX4 e na morte celular resultante nos genótipos e fenótipos FSHD1 e FSHD2. EXEMPLO 11 O ENGAJAMENTO ALVO NO MÚSCULO DE RATOS DO TIPO SEL- VAGEM APÓS TRATAMENTO COM UM INIBIDOR POTENTE E SE- LETIVO DA P38
[0198] As propriedades farmacocinéticas do FTX-1821 foram estu- dadas em um modelo animal. O FTX-1821 foi administrado por via oral a ratos Sprague-Dawley machos em jejum ou não jejum (N = 6 animais por ponto de tempo e grupo de tratamento), e os níveis de fosfo p38α:to- tal de p38α foram determinados. A análise farmacodinâmica do compro- metimento do sistema p38 alvo no tecido muscular foi realizada me- dindo-se a alteração na proteína quinase 2 ativada por fosfo-MAP-qui- nase (MK2) para a razão total de MK2 antes e após o tratamento com fármaco. Todos os métodos usados estão descritos na seção Materiais e Métodos.
[0199] FTX-1821 exibiu propriedades farmacocinéticas plasmáticas semelhantes às descritas anteriormente (Aston et al., 2009; dados não mostrados). Esses estudos também demonstraram a rápida distribui- ção de FTX-1821 para múltiplos músculos e plasma. As proporções de exposição muscular/plasma foram iguais ou superiores a 1 no rato quando as exposições plasmáticas clinicamente relevantes foram alcan- çadas.
[0200] A análise farmacodinâmica demonstrou que uma dose oral única de FTX-1821 (0,3 mg/kg) resultou em concentrações plasmáticas clinicamente relevantes (Barbour et al., 2012) e diminuiu significativa- mente a proporção de fosfo MK2 para MK2 total no músculo trapézio de ratos dentro de 1 a hora de tratamento com fármaco (Figura 15). O en- gajamento alvo do sistema p38 persistiu por pelo menos 12 horas após a dose única de FTX-1821 (Figura 15). O engajamento alvo do sistema p38 no trapézio muscular foi máximo quando as concentrações plasmá- ticas e musculares de FTX-1821 foram maiores que 20 ng.mL ou ng.g e diminuiu nos períodos em que as exposições diminuíram. Prevê-se que as concentrações musculares de FTX-1821 alcançadas no estudo com ratos resultem em redução> 70% na Cmax nos genes alvo dependentes de DUX4 nas biópsias musculares de pacientes com FSHD com base em dados in vitro nos miotubos FSHD (acima).
[0201] Esta análise farmacocinética e farmacodinâmica indicou que a inibição máxima do sistema p38 no músculo foi alcançada quando as concentrações plasmáticas de FTX-1821 eram maiores que 20 ng/mL e que seria esperada inibição significativa da via de p38 no músculo hu- mano, com doses clínicas de 7,5 ou 15 mg BID (Barbour et al., 2012). EXEMPLO 12 INIBIÇÃO DO PROGRAMA GENÔMICO DE DUX4 EM CAMUNDON-
GOS COM XENOENXERTO COM FSHD APÓS TRATAMENTO COM UM INIBIDOR POTENTE E SELETIVO DE P38
[0202] Os camundongos com FSHD e xenoenxerto de músculo de controle foram gerados por xenoenxerto C6 (FSHD) e A4 (controle) de linhas celulares de mioblastos isogênicos imortalizados humanos deri- vados de IPSC (FSHD) e A4 (controle) nos músculos tibiais anteriores bilaterais (TA) de camundongos machos Nod-Rag com aproximada- mente 8 semanas de idade, conforme descrito por Sakellariou et al.,
2016. Após as 4 semanas de enxerto e procedimento INMES, os ani- mais com xenoenxerto com FSHD foram tratados com injeções BID de veículo ou FTX-2865 (10 mg/kg) por 8 dias (um total de 14 injeções) e foram sacrificados aproximadamente no momento das concentrações plasmáticas máximas (Tmax) 1 hora após a injeção final da manhã no dia 8. No sacrifício, o plasma, o músculo trapézio e os músculos tibiais anteriores bilaterais foram coletados e congelados rapidamente para análise dos parâmetros farmacocinéticos, envolvimento alvo e mRNAs dependentes de DUX4. O MBD3L2 foi avaliado por qPCR usando uma sonda humana específica e foi normalizado para o gene de manutenção CDKN1B. As concentrações das proteínas pMK2 e MK2 foram avalia- das por um ensaio quantitativo MSD.
[0203] A análise do tecido TA por qPCR a partir de animais enxertados por 4 a 6 semanas com tecidos de mioblastos A4 ou C6 demonstrou um aumento significativo (p <0,05) e >10 vezes maior no MBD3L2 e outros genes dependentes de DUX4 (não mostrado) nos músculos TA com xe- noenxerto com FSHD (C6) versus controle (A4) (Figura 16). N = 8 amos- tras TA por grupo.
[0204] O tratamento de animais com xenoenxerto com FSHD com o inibidor potente e seletivo de p38, FTX-2865, produziu o engajamento alvo do sistema p38, medido por uma alteração na proteína quinase 2 ativada por fosfo-MAP-quinase (MK2) para a proporção MK2 total de> 50% em músculos TA e trapézio de camundongos do tipo selvagem após administração repetida de BID de uma dose de 10 mg/kg adminis- trada por injeção intraperitoneal (IP) (dados não mostrados). O trata- mento com FTX-2865 (p <0,05) diminuiu significativamente a proporção de fosfo para MK2 total no músculo trapézio de camundongo, indicando envolvimento significativo do sistema p38, e também indicando concen- trações suficientes de fármacos nos músculos esqueléticos dos animais para inibir o sistema p38 em > 80% (Figura 17; N=8 amostras de trapé- zio por grupo). Além disso, o tratamento com FTX-2865 (p <0,05) dimi- nuiu significativamente a expressão de MBD3L2 nos músculos TA com xenoenxerto com FSHD em comparação com animais tratados com ve- ículo, indicando supressão do programa patológico do gene DUX4 por inibição de p38 (Figura 18; N=5-7 amostras de TA por grupo). REFERÊNCIAS: Tawil R., van der Maarel S. M. e Tapscott S. J.. Facioscapulohumeral dystrophy: the path to consensus on pathophysiology. Skeletal Muscle 2014, 4:12. van der Maarel S. M., Frants R. R., Padberg G. W.. Facioscapulohume- ral muscular dystrophy. Biochimica et Biophysica Acta 2007, 1772:186–
194. Ehrlich M. e Lacey M.. Deciphering transcription dysregulation in FSH muscular Dystrophy. J Hum Genet. 2012, 57(8): 477–484.
Cuenda A. e Rousseau, S. 2007. BBA-Mol Cell Res.
Review: p38 MAP- Kinases pathway regulation, function and role in human diseases.
Vol.1773: 8, p. 1358-1375. Himeda C.
L., Jones T.
I., e Jones P.
L.. Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy As a Model for Epigenetic Regulation and Disease.
Antioxid Redox Signal. 2015, 22(16): 1463–1482. Yao Z., Snider L., Balog J., Lemmers R.
J.L.F., Van Der Maarel S.
M., Tawil R., e Tapscott S.
J.
DUX4-induced gene expression is the major molecular signature in FSHD skeletal muscle.
Human Molecular Genet- ics. 2014, 23:20 5342–5352. Rickard A.M., Petek L.
M. e Miller D.
G.. Endogenous DUX4 expression in FSHD myotubes is sufficient to cause cell death and disrupts RNA splicing and cell migration pathways.
Human Molecular Genetics, 2015, 24:20 5901–5914. Geng L.N., Yao Z., Snider L., Fong A.P., Cech J.N., Young J.M., van der Maarel S.M., Ruzzo W.L., Gentleman R.C., Tawil R., Tapscott S.J.
DUX4 activates germline genes, retroelements and immunemediators: Implications for facioscapulohumeral dystrophy.
Dev Cell. 2012, 22(1): 38–51. Wallace L.
M., Garwick S.
E., Mei W., Belayew A., Coppee F., Ladner K.
J., Guttridge D., Yang J., e Harper S.
Q.. DUX4, a Candidate Gene for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy, Causes p53-Dependent My- opathy In Vivo.
Ann Neurol. 2011, 69(3): 540–552. Homma S., Beermann M.- L., Boyce F.
M., e Miller J.
B.. Expression of FSHD-related DUX4-FL alters proteostasis and induces TDP-43 aggre- gation.
Ann Clin Transl Neurol. 2015, 2(2): 151–166. Shadle S.
C., Zhong J.
W., Campbell A.
E., Conerly M.
L., Jagannathan S., Wong C.-J., Morello T.
D., van der Maarel S.
M., Tapscott S.
J.. DUX4-induced dsRNA and MYC mRNA stabilization activate apoptotic pathways in human cell models of facioscapulohumeral dystrophy.
PLOS Genetics. 2017, https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006658 Dandapat A., Hartweck L.
M., Bosnakovski D., e Kyba M.. Expression of the Human FSHD-Linked DUX4 Gene Induces Neurogenesis During Dif- ferentiation of Murine Embryonic Stem Cells.
Stem Cells Dev. 2013, 22:(17) 2440–2448. Bosnakovski D., Choi S.
H., Strasser J.
M., Toso E.
A., Walters M.
A. e Kyba M.. High-throughput screening identifies inhibitors of DUX4-in- duced myoblast toxicity.
Skeletal Muscle. 2014, 4:4. Mamchaoui K, Trollet C, Bigot A, Negroni E, Chaouch S, Wolff A, et al.
Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.
Skeletal Muscle 2011, 1:34. Thorley M, Duguez S, Mazza EM, Valsoni S, Bigot A, Mamchaoui K, Harmon B, Voit T, Mouly V, Duddy W.
Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines.
Skeletal Mus- cle 2016, 6:43. Isin Dalkilic e Louis M Kunkel.
Current Opinion in Genetics & Develop- ment 2003, 13:231–238. Zarubin, T. e Han J.
Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway.
Cell Research. 2005; 15, 11–18. Aouadi M., Binetruy, B., Caron, L.,Le Marchand-Brustel, Y. 2006. Bio- chimie.
Role of MAPKs in development and differentiation: lessons from knockout mice.
Biochimie. 2006; 88:9: 1091-1098. Keren, A., Tamir, Y., Bengal, E.
The p38 MAPK signaling pathway: A major regulator of skeletal muscle development.
Molecular and Cellular Endocrinology. 2006. Volume 252, Issues 1–2, Pages 224-230. Kyriakis JM, Avruch J: Mammalian mitogen-activated protein kinase sig- nal transduction pathways activated by stress and inflammation.
Physiol Rev 2001, 81:807-869. Himeda, CL, Debarnot, C, Homma S., Beermann M., Miller JB., Jones
PL., Jones TI.
Myogenic Enhancers Regulate Expression of the Faci- oscapulohumeral Muscular Dystrophy-Associated DUX4 Gene.
MCB 2014 vol. 34 no. 11 1942-1955. Dandapat A., Hartweck L.
M., Bosnakovski D., e Kyba M.. Expression of the Human FSHD-Linked DUX4 Gene Induces Neurogenesis During Dif- ferentiation of Murine Embryonic Stem Cells.
Stem Cells Dev. 2013, 22:(17) 2440–2448. Bosnakovski D., Choi S.
H., Strasser J.
M., Toso E.
A., Walters M.
A. e Kyba M.. High-throughput screening identifies inhibitors of DUX4-in- duced myoblast toxicity.
Skeletal Muscle. 2014, 4:4. Mamchaoui K, Trollet C, Bigot A, Negroni E, Chaouch S, Wolff A, et al.
Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.
Skeletal Muscle 2011;1:34. Thorley M, Duguez S, Mazza EM, Valsoni S, Bigot A, Mamchaoui K, Harmon B, Voit T, Mouly V, Duddy W.
Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines.
Skelet Muscle 2016;6:43. Zarubin, T. e Han J.
Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway.
Cell Research.2005; 15, 11–18. Aouadi M., Binetruy, B., Caron, L.,Le Marchand-Brustel, Y. 2006. Bio- chimie.
Role of MAPKs in development and differentiation: lessons from knockout mice.
Biochimie. 2006; 88:9: 1091-1098. Keren, A., Tamir, Y., Bengal, E.
The p38 MAPK signaling pathway: A major regulator of skeletal muscle development.
Molecular and Cellular Endocrinology. 2006. Volume 252, Issues 1–2, Pages 224-230. Kyriakis JM, Avruch J: Mammalian mitogen-activated protein kinase sig- nal transduction pathways activated by stress and inflammation.
Physiol Rev 2001, 81:807-869. Himeda, CL, Debarnot, C, Homma S., Beermann M., Miller JB., Jones
PL., Jones TI.
Myogenic Enhancers Regulate Expression of the Faci- oscapulohumeral Muscular Dystrophy-Associated DUX4 Gene.
MCB 2014 vol. 34 no. 11 1942-1955. Wissing, ER, Boyer, JG., Kwong, JQ, Sargent, MA, Karch, J, McNally, EM, Otsu, K, Molkentin JD. p38α MAPK underlies muscular dystrophy and myofiber death through a Bax-dependent mechanism.
Hum Mol Genet. 2014 Oct 15; 23(20): 5452–5463. Perdiguero, E, Ruiz-Bonilla, V, Gresh, G, Hui, L, Ballestar, E, Sousa- Victor, P, Baeza-Raja, B, Bosch-Comas, A, Esteller, M, Caelles, C, Ser- rano, AL, Wagner, EF, Muñoz-Cánoves, P.
Genetic analysis of p38 MAP kinases in myogenesis: fundamental role of p38α in abrogating myoblast proliferation.
EMBO J. 2007 Mar 7; 26(5): 1245–1256. Aston, Nicola M.; Bamborough, Paul; Buckton, Jacqueline B.; Edwards, Christopher D.; Holmes, Duncan S.; Jones, Katherine L. et al. (2009): p38alpha mitogen-activated protein kinase inhibitors.
Optimization of a series of biphenylamides to give a molecule suitable for clinical progres- sion.
In J Med.
Chem. 52 (20), pp. 6257–6269. Barbour, April M.; Sarov-Blat, Lea; Cai, Gengqian; Fossler, Michael J.; Sprecher, Dennis L.; Graggaber, Johann et al. (2013): Safety, tolerabil- ity, pharmacokinetics and pharmacodynamics of losmapimod following a single intravenous or oral dose in healthy volunteers.
In Br.
J Clin Phar- macol. 76 (1), pp. 99–106. Boudou, T., Legant, W.
R., Mu, A., Borochin, M.
A., Thavandiran, N., Radisic, M., Chen, C.
S. (2012). A Microfabricated Platform to Measure and Manipulate the Mechanics of Engineered Cardiac Microtissues.
Tis- sue Engineering.
Part A, 18(9-10), 910–919. Sakellariou, P., O’Neil, A., Mueller, A.L., Stadler, G., Wright, W.E., Roche, J.A., Bloch, R.J. (2016). Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortal- ized human myoblasts.
Skeletal Muscle 6:4, 1-14.
Todas as publicações e pedidos de patente aqui descritos são incorpo- rados por referência em sua integralidade.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades específicas estabelecidas acima, muitas alternativas, mo- dificações e outras variações das mesmas serão evidentes para os téc- nicos no assunto Todas essas alternativas, modificações e variações são destinadas a estar dentro do espírito e escopo da presente inven- ção.

Claims (64)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para reduzir a expressão de um mRNA DUX4-fl, um polipeptídeo DUX4, ou um polipeptídeo codificado por um do gene alvo de DUX4 a jusante, em uma célula, caracterizado por compreender colocar a célula em contato com um agente que resulta em uma redução da proteína p38 ativa na célula, reduzindo, assim, a expressão do poli- peptídeo DUX4 ou o polipeptídeo codificado pelo gene alvo de DUX4 a jusante.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente inibe a expressão ou atividade, ou reduz a quantidade, da proteína p38, em que a atividade é opcionalmente ativi- dade quinase.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindica- ção 2, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula muscular, opcionalmente uma célula muscular diferenciada terminalmente.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula tem um nível de expressão aumentada do mRNA DUX4-fl, do polipeptídeo DUX4, ou do polipeptídeo codificado pelo gene alvo a jusante, em comparação com o nível de expressão do mRNA DUX4-fl, do polipeptídeo DUX4, ou do polipeptídeo codificado pelo gene alvo a jusante, numa célula de controle.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão aumentada do mRNA DUX4-fl, do polipeptídeo DUX4 ou do polipeptídeo codificado pelo gene alvo a ju- sante, deve-se a uma repressão reduzida num lócus D4Z4 na célula.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a célula está associada à distrofia muscular fascio-escápulo-umeral (FSHD).
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula compreende a supressão de uma ou mais re- petições D4Z4 macrossatélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35, opcionalmente em que a célula compreende <7 repetições D4Z4 macrossatélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a célula compreende uma ou mais mutações na Manutenção Estrutural de Domínios Cromossômicos Arti- culados Flexíveis Contendo o gene 1 (SMCHD1).
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a célula compreende pelo menos um alelo 4qA não suprimido.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o agente inibe a expressão da proteína p38.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente se liga a um polinucleotídeo que codifica a proteína p38, ou a um polinucleotídeo antissenso da mesma.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste em um ácido nucleico, opcionalmente um DNA, RNA, gRNA, shRNA, siRNA ou oligonucleotídeo antissenso.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o agente inibe a atividade da pro- teína p38.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e 13, caracterizado pelo fato de que o agente se liga à proteína p38.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, 13 e 14, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste de um polipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um peptídeo,
uma proteína mimética, um peptidomimético, ou um anticorpo ou frag- mento funcional dos mesmos.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, 13 e 14, caracterizado pelo fato de que o agente compreende uma molécula pequena, opcionalmente uma molécula orgânica pequena ou uma molécula inorgânica pequena.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o gene alvo a jusante é RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, KHDC1L, ZSCAN4, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 ou ZNF280A.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a expressão ou a atividade da proteína p38 é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
19. Método para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio associado à expressão aumentada de um mRNA DUX4-fl, uma proteína DUX4 ou um polipeptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a ju- sante, em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer ao paciente uma composição farma- cêutica compreendendo um agente que resulta em uma quantidade re- duzida de proteína p38 ativa em um ou mais tecidos do paciente, redu- zindo assim a expressão do mRNA DUX4-fl, da proteína DUX4 ou do polipeptídeo que codifica o gene alvo a jusante em um ou mais tecido do paciente.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é uma distrofia muscular fascio- escápulo-umeral (FSHD), opcionalmente FSHD1 ou FSHD2.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindi- cação 20, caracterizado pelo fato de que o paciente compreende repres- são reduzida em um lócus D4Z4.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o paciente compreende a su- pressão de uma ou mais repetições D4Z4 macrossatélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35, opcionalmente em que a célula compreende <7 repetições D4Z4 macrossatélites na região subtelomé- rica do cromossomo 4q35.
23. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou a reivindi- cação 20, caracterizado pelo fato de que o paciente compreendem uma ou mais mutações na Manutenção Estrutural de Domínios Cromossômi- cos Articulados Flexíveis Contendo o gene 1 (SMCHD1).
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o paciente compreende pelo menos um alelo 4qA não suprimido.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que o agente inibe a expressão da proteína p38.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 25, caracterizado pelo fato de que o agente se liga a um polinucle- otídeo que codifica a proteína p38, ou a um polinucleotídeo antissenso da mesma.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 26, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou con- siste em um ácido nucleico, opcionalmente um DNA, RNA, gRNA, shRNA, siRNA ou oligonucleotídeo antissenso.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que o agente inibe a atividade da proteína p38.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24 e 28, caracterizado pelo fato de que o agente se liga à proteína p38.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, 28 e 29, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste de um polipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um pep- tídeo, uma proteína mimética, um peptidomimético, ou um anticorpo ou fragmento funcional dos mesmos.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, 28 e 29, caracterizado pelo fato de que o agente compreende uma molécula pequena, opcionalmente uma molécula orgânica pe- quena ou uma molécula inorgânica pequena.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 31, caracterizado pelo fato de que o gene alvo a jusante é RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, KHDC1L, ZSCAN4, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 ou ZNF280A.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 32, caracterizado pelo fato de que a expressão ou a atividade da proteína p38 é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% em um tecido muscular do pa- ciente.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 33, caracterizado pelo fato de que o método inibe a expressão ou atividade da proteína p38 em um tecido muscular do paciente.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 34, caracterizado pelo fato de que o método diminui a degeneração muscular no paciente.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
19 a 35, caracterizado pelo fato de que o método reduz a apoptose de células musculares no paciente.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o tecido muscular é diferenciado terminalmente.
38. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é fornecida ao paciente de forma parenteral.
39. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é fornecida a um tecido muscular do paciente.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 39, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda fornecer ao paciente um segundo agente para o tratamento da doença ou distúrbio associado com a expressão aumentada de uma proteína DUX4, ou de um polipeptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a jusante.
41. Forma de dosagem unitária de uma composição farma- cêutica, caracterizada por compreender um agente que resulta em uma quantidade reduzida de proteína p38 ativa em uma célula, e um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente ou excipiente, em que forma de dosagem unitária é eficaz para reduzir a expressão ou atividade de um mRNA DUX4-fl, um polipeptídeo DUX4, ou um polipeptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a jusante, em uma ou mais células ou teci- dos de um paciente para quem a forma de dosagem unitária é adminis- trado.
42. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindica- ção 41, caracterizada pelo fato de que o agente se liga ao polipeptídeo DUX4 ou se liga a um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo DUX4.
43. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindica- ção 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que o agente compreende ou consiste em um ácido nucleico, opcionalmente um DNA, RNA, gRNA, shRNA, siRNA ou oligonucleotídeo antissenso.
44. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindica- ção 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que o agente compreende ou consiste de um polipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um peptídeo, uma proteína mimética, um peptidomimético, ou um anticorpo ou frag- mento funcional dos mesmos.
45. Forma de dosagem unitária, de acordo com a reivindica- ção 41 ou 42, caracterizada pelo fato de que o agente compreende uma pequena molécula, opcionalmente uma molécula orgânica ou uma mo- lécula inorgânica.
46. Forma de dosagem unitária, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 45, caracterizada pelo fato de que o gene alvo a jusante é RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, KHDC1L, ZSCAN4, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 ou ZNF280A.
47. Forma de dosagem unitária, de acordo com qualquer uma das reivindicações 41 a 46, caracterizada pelo fato de que o tecido é tecido muscular, opcionalmente em que o tecido compreende células compreendendo uma mutação associada à distrofia muscular fascio-es- cápulo-umeral (FSHD).
48. Método para reduzir a apoptose de uma célula muscular, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a célula em contato com um agente que resulta em uma quantidade reduzida da proteína p38 ativa na célula, opcionalmente em que a célula muscular é diferen- ciada terminalmente, reduzindo, assim, a expressão de um mRNA DUX4-fl, uma proteína DUX4 ou o polipeptídeo codificado por um gene alvo de DUX4 a jusante, na célula.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a célula tem um nível de expressão aumentada do mRNA DUX4-fl, do polipeptídeo DUX4, ou do polipeptídeo codificado pelo gene alvo a jusante, em comparação com o nível de expressão do polipeptídeo DUX4, ou do polipeptídeo codificado pelo gene alvo a ju- sante, numa célula de controle.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o nível de expressão aumentada do mRNA DUX4-fl, do polipeptídeo DUX4 ou do polipeptídeo codificado pelo gene alvo a ju- sante, deve-se a uma repressão reduzida num lócus D4Z4 na célula.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 50, caracterizado pelo fato de que a célula está associada à distro- fia muscular fascio-escápulo-umeral (FSHD).
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 51, caracterizado pelo fato de que a célula compreende a supres- são de uma ou mais repetições D4Z4 macrossatélites na região subte- lomérica do cromossomo 4q35, opcionalmente em que a célula compre- ende <7 repetições D4Z4 macrossatélites na região subtelomérica do cromossomo 4q35.
53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 52, caracterizado pelo fato de que a célula compreende uma ou mais mutações na Manutenção Estrutural de Domínios Cromossômicos Articulados Flexíveis Contendo o gene 1 (SMCHD1).
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a célula compreende pelo menos um alelo 4qA não suprimido.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 59, caracterizado pelo fato de que o agente inibe a expressão da proteína p38.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 55, caracterizado pelo fato de que o agente se liga a um polinucle- otídeo que codifica a proteína p38, ou a um polinucleotídeo antissenso da mesma.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou con- siste em um ácido nucleico, opcionalmente um DNA, RNA, shRNA, siRNA ou oligonucleotídeo antissenso.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, caracterizado pelo fato de que o agente inibe a atividade da proteína p38.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54 e 58, caracterizado pelo fato de que o agente se liga à proteína p38.
60. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, 58 e 59, caracterizado pelo fato de que o agente compreende ou consiste de um polipeptídeo, opcionalmente uma proteína, um pep- tídeo, uma proteína mimética, um peptidomimético, ou um anticorpo ou fragmento funcional dos mesmos.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, 58 e 59, caracterizado pelo fato de que o agente compreende uma molécula pequena, opcionalmente uma molécula orgânica peque- na ou uma molécula inorgânica pequena.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 61, caracterizado pelo fato de que o gene alvo a jusante é RFPL2, CCNA1, SLC34A2, TPRX1, KHDC1L, ZSCAN4, PRAMEF20, TRIM49, PRAMEF4, PRAME6, PRAMEF15 ou ZNF280A.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 62, caracterizado pelo fato de que a expressão ou a atividade da proteína p38 é reduzida em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
48 a 63, caracterizado pelo fato de que reduz a apoptose de células musculares em um tecido muscular em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60 %, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
BR112020006677-0A 2017-10-05 2018-10-05 uso de inibidores p38 para reduzir a expressão de dux4 BR112020006677A2 (pt)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762568673P 2017-10-05 2017-10-05
US201762568754P 2017-10-05 2017-10-05
US62/568,754 2017-10-05
US62/568,673 2017-10-05
US201862682565P 2018-06-08 2018-06-08
US201862682563P 2018-06-08 2018-06-08
US62/682,563 2018-06-08
US62/682,565 2018-06-08
PCT/US2018/054638 WO2019071144A1 (en) 2017-10-05 2018-10-05 USE OF P38 INHIBITORS TO REDUCE DUX4 EXPRESSION

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020006677A2 true BR112020006677A2 (pt) 2020-10-06

Family

ID=63963605

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020006169-7A BR112020006169A2 (pt) 2017-10-05 2018-10-05 inibidores de quinase p38 que reduzem dux4 e expressão de gene a jusante para o tratamento de fshd
BR112020006677-0A BR112020006677A2 (pt) 2017-10-05 2018-10-05 uso de inibidores p38 para reduzir a expressão de dux4

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020006169-7A BR112020006169A2 (pt) 2017-10-05 2018-10-05 inibidores de quinase p38 que reduzem dux4 e expressão de gene a jusante para o tratamento de fshd

Country Status (28)

Country Link
US (5) US11479770B2 (pt)
EP (3) EP3691620B1 (pt)
JP (5) JP7012152B2 (pt)
KR (2) KR20200066655A (pt)
CN (4) CN111601593B (pt)
AU (2) AU2018346712B2 (pt)
BR (2) BR112020006169A2 (pt)
CA (4) CA3128468A1 (pt)
CL (3) CL2020000911A1 (pt)
CO (2) CO2020005351A2 (pt)
DK (1) DK3691620T3 (pt)
EC (1) ECSP20024210A (pt)
ES (1) ES2927715T3 (pt)
HR (1) HRP20221196T1 (pt)
HU (1) HUE060024T2 (pt)
IL (2) IL273589B (pt)
LT (1) LT3691620T (pt)
MX (2) MX2020003594A (pt)
NZ (1) NZ762856A (pt)
PH (2) PH12020550195A1 (pt)
PL (1) PL3691620T3 (pt)
PT (1) PT3691620T (pt)
RS (1) RS63581B1 (pt)
SG (2) SG10202110259QA (pt)
TW (1) TWI793191B (pt)
UY (1) UY37918A (pt)
WO (2) WO2019071147A1 (pt)
ZA (1) ZA202002315B (pt)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT3691620T (pt) * 2017-10-05 2022-10-06 Fulcrum Therapeutics Inc Os inibidores da quinase p38 reduzem a expressão de dux4 e genes a jusante para o tratamento de fshd
WO2019152820A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
TW202112368A (zh) 2019-06-13 2021-04-01 荷蘭商法西歐知識產權股份有限公司 用於治療有關dux4表現之疾病的抑制劑組合
WO2021105474A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Facio Intellectual Property B.V. New compounds for treatment of diseases related to dux4 expression
US20230271953A1 (en) 2019-11-29 2023-08-31 Facio Intellectual Property B.V. Novel compounds for treatment of diseases related to DUX4 expression
CN111004802A (zh) * 2019-12-31 2020-04-14 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 特异抑制p38MAPK基因表达的shRNA重组载体构建方法与应用
MX2023002853A (es) 2020-09-11 2023-03-31 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de arni para inhibir la expresion de dux4, composiciones de dichos agentes, y metodos de uso.
WO2023009672A1 (en) * 2021-07-27 2023-02-02 Fulcrum Therapeutics, Inc. Treatment of facioscapulohumeral muscular dystrophy with losmapimod

Family Cites Families (448)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5593992A (en) 1993-07-16 1997-01-14 Smithkline Beecham Corporation Compounds
US5670527A (en) 1993-07-16 1997-09-23 Smithkline Beecham Corporation Pyridyl imidazole compounds and compositions
US6369068B1 (en) 1995-06-07 2002-04-09 Smithkline Beecham Corporation Amino substituted pyrimidine containing compounds
US5658903A (en) 1995-06-07 1997-08-19 Smithkline Beecham Corporation Imidazole compounds, compositions and use
AP9700912A0 (en) 1996-01-11 1997-01-31 Smithkline Beecham Corp Novel cycloalkyl substituted imidazoles
ZA97175B (en) 1996-01-11 1997-11-04 Smithkline Beecham Corp Novel substituted imidazole compounds.
EP0883402A4 (en) 1996-01-11 1999-08-11 Smithkline Beecham Corp NEW CYCLOALKYL-SUBSTITUTED IMIDAZOLES
US6372741B1 (en) 1996-03-08 2002-04-16 Smithkline Beecham Corporation Use of CSAID™ compounds as inhibitors of angiogenesis
JP2000510327A (ja) 1996-03-12 2000-08-15 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 医薬的に活性な化合物の同定方法
EP0888335A4 (en) 1996-03-13 2002-01-02 Smithkline Beecham Corp NEW PYRIMIDINE COMPOUNDS AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF CYTOKININ MEDIATOR DISEASES
US6096739A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Smithkline Beecham Corporation Treatment for CNS injuries
US6235760B1 (en) 1996-03-25 2001-05-22 Smithkline Beecham Corporation Treatment for CNS injuries
WO1998007425A1 (en) 1996-08-21 1998-02-26 Smithkline Beecham Corporation Imidazole compounds, compositions and use
US6096753A (en) 1996-12-05 2000-08-01 Amgen Inc. Substituted pyrimidinone and pyridone compounds and methods of use
US6147080A (en) 1996-12-18 2000-11-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of p38
WO1998028292A1 (en) 1996-12-23 1998-07-02 Smithkline Beecham Corporation Novel piperidine containing compounds
IL132318A0 (en) 1997-04-24 2001-03-19 Ortho Mcneil Pharm Inc Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
US6514977B1 (en) 1997-05-22 2003-02-04 G.D. Searle & Company Substituted pyrazoles as p38 kinase inhibitors
JP2002504909A (ja) 1997-06-13 2002-02-12 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション 新規な置換ピラゾールおよびピラゾリン化合物
AU8154998A (en) 1997-06-19 1999-01-04 Smithkline Beecham Corporation Novel aryloxy substituted pyrimidine imidazole compounds
US6093742A (en) 1997-06-27 2000-07-25 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of p38
TW517055B (en) 1997-07-02 2003-01-11 Smithkline Beecham Corp Novel substituted imidazole compounds
AR016294A1 (es) 1997-07-02 2001-07-04 Smithkline Beecham Corp Compuesto de imidazol sustituido, composicion farmaceutica que la contiene, su uso en la fabricacion de un medicamento y procedimiento para supreparacion
GB9721437D0 (en) 1997-10-10 1997-12-10 Glaxo Group Ltd Heteroaromatic compounds and their use in medicine
EP1025102B1 (en) 1997-10-20 2004-05-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Bicyclic kinase inhibitors
US6162613A (en) 1998-02-18 2000-12-19 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Methods for designing inhibitors of serine/threonine-kinases and tyrosine kinases
CA2329065A1 (en) 1998-05-05 1999-11-11 Francisco Xavier Talamas Pyrazole derivatives as p-38 map kinase inhibitors
US6316466B1 (en) 1998-05-05 2001-11-13 Syntex (U.S.A.) Llc Pyrazole derivatives P-38 MAP kinase inhibitors
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
EP1080087A4 (en) 1998-05-22 2001-11-21 Smithkline Beecham Corp NEW 2-ALKYL-SUBSTITUTED IMIDAZOLES
US6589954B1 (en) 1998-05-22 2003-07-08 Scios, Inc. Compounds and methods to treat cardiac failure and other disorders
NZ508790A (en) 1998-05-22 2003-10-31 Scios Inc Heterocyclic compounds and methods to treat cardiac failure and other disorders
US6867209B1 (en) 1998-05-22 2005-03-15 Scios, Inc. Indole-type derivatives as inhibitors of p38 kinase
US6448257B1 (en) 1998-05-22 2002-09-10 Scios, Inc. Compounds and methods to treat cardiac failure and other disorders
US6340685B1 (en) 1998-05-22 2002-01-22 Scios, Inc. Compounds and methods to treat cardiac failure and other disorders
EP1086085A1 (en) 1998-06-12 2001-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated INHIBITORS OF p38
EP1112070B1 (en) 1998-08-20 2004-05-12 Smithkline Beecham Corporation Novel substituted triazole compounds
US6184226B1 (en) 1998-08-28 2001-02-06 Scios Inc. Quinazoline derivatives as inhibitors of P-38 α
JP2002526482A (ja) 1998-09-18 2002-08-20 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ｐ３８のインヒビター
CA2346665A1 (en) 1998-10-07 2000-04-13 Smithkline Beecham Corporation Novel treatment for stroke management
WO2000025791A1 (en) 1998-11-04 2000-05-11 Smithkline Beecham Corporation Pyridin-4-yl or pyrimidin-4-yl substituted pyrazines
UA73492C2 (en) 1999-01-19 2005-08-15 Aromatic heterocyclic compounds as antiinflammatory agents
IL146105A (en) 1999-04-23 2005-09-25 Tadeda Pharmaceutical Company 5-pyridyl-1, 3-azole compounds, process for producing the same and use therefor
NZ515285A (en) 1999-05-21 2004-01-30 Scios Inc Indole-type derivatives as inhibitors of p38 kinase
WO2001004115A2 (en) 1999-07-09 2001-01-18 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Novel process for synthesis of heteroaryl-substituted urea compounds
US6541477B2 (en) 1999-08-27 2003-04-01 Scios, Inc. Inhibitors of p38-a kinase
TR200200673T2 (tr) 1999-09-17 2002-12-23 Smithkline Beecham Corporation Rinovirüs enfeksiyonlarında csaıd'lerin kullanılması
BR0015243A (pt) 1999-10-21 2002-07-16 Hoffmann La Roche Heterociclos de nitrogênio bicìclico substituìdos por heteroalquilamino como inibidores da proteìna cinase p38
CN1156477C (zh) 1999-10-21 2004-07-07 霍夫曼-拉罗奇有限公司 作为p38蛋白激酶的抑制剂的烷基氨基-取代的双环氮杂环类化合物
US7053099B1 (en) 1999-11-23 2006-05-30 Smithkline Beecham Corporation 3,4-dihydro-(1H)quinazolin-2-one compounds as CSBP/p38 kinase inhibitors
EP1248624A4 (en) 1999-11-23 2003-01-22 Smithkline Beecham Corp 3,4-DIHYDRO- (1H) -CHIRAZOLINE-2-ONES AND THE USE THEREOF AS CSBP / P38 KINASE INHIBITORS
EP1233950B1 (en) 1999-11-23 2005-10-05 Smithkline Beecham Corporation 3,4-DIHYDRO-(1H)QUINAZOLIN-2-ONE COMPOUNDS AS CSBP/P39 kINASE INHIBITORS
JP2003514900A (ja) 1999-11-23 2003-04-22 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション ＣＳＢＰ／ｐ３８キナーゼ阻害剤としての３，４−ジヒドロ−（１Ｈ）−キナゾリン−２−オン化合物
AU2457201A (en) 1999-12-28 2001-07-09 Bristol-Myers Squibb Company Cytokine, especially tnf-alpha, inhibitors
US6906067B2 (en) 1999-12-28 2005-06-14 Bristol-Myers Squibb Company N-heterocyclic inhibitors of TNF-α expression
WO2001064676A2 (en) 2000-02-28 2001-09-07 Scios, Inc. INHIBITORS OF p38-α KINASE
AR030053A1 (es) 2000-03-02 2003-08-13 Smithkline Beecham Corp 1h-pirimido [4,5-d] pirimidin-2-onas y sales, composiciones farmaceuticas, uso para la fabricacion de un medicamento y procedimiento para producirlas
MXPA02012909A (es) 2000-07-24 2004-05-05 Boehringer Ingelheim Pharma Formulaciones mejoradas de dosis oral de 1-(5-ter-butil -2-p-tiolil2h -pirazol-3 -il)-3-(4-2 (2-morfolin-4-il -etoxi) -naftalen -1-il) -urea.
PE20020506A1 (es) 2000-08-22 2002-07-09 Glaxo Group Ltd Derivados de pirazol fusionados como inhibidores de la proteina cinasa
CA2420286A1 (en) 2000-08-31 2002-03-07 F. Hoffmann-La Roche Ag 7-oxo pyridopyrimidines as inhibitors of a cellular proliferation
ATE298751T1 (de) 2000-08-31 2005-07-15 Hoffmann La Roche 7-oxopyridoryrimidine
EP1337255A4 (en) 2000-10-19 2006-01-25 Smithkline Beecham Corp USE OF P38 INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY COUGH
WO2002032862A2 (en) 2000-10-19 2002-04-25 Smithkline Beecham Corporation Use of p38 inhibitors for the treatment of smoke inhalation
HU229471B1 (en) 2000-10-23 2014-01-28 Smithkline Beecham Corp 2,4,8-trisubstituted-8h-pyrido[2,3d]pyrimidine-7-one compounds, for the treatment of diseases mediated by csbp/p38 kinase
ATE318820T1 (de) 2000-11-17 2006-03-15 Bristol Myers Squibb Co Verfahren zur behandlung von mit p38-kinase assoziierten leiden und pyrrolotriazin- verbindungen als kinaseinhibitoren.
AU2002237657A1 (en) 2000-11-20 2002-06-11 Scios Inc. Indole-type inhibitors of p38 kinase
JP2004533989A (ja) 2000-11-20 2004-11-11 サイオス インコーポレイテッド ｐ３８キナーゼのピペリジン／ピペラジン型阻害剤
WO2002042292A2 (en) 2000-11-20 2002-05-30 Scios Inc. Indol derivative and their use as inhibitors of p38 kinase
US20020165286A1 (en) 2000-12-08 2002-11-07 Hanne Hedeman Dermal anti-inflammatory composition
JP2004521892A (ja) 2000-12-20 2004-07-22 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド （ハロ−ベンゾカルボニル）複素環縮合フェニル系ｐ３８キナーゼ阻害剤
BRPI0207172B8 (pt) 2001-02-12 2021-05-25 Hoffmann La Roche pirido-pirimidinas 6-substituída, sua composição e seu uso, bem como seu intermediário
WO2002069892A2 (en) 2001-02-28 2002-09-12 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education METHOD FOR PROTECTING CELLS AND TISSUES FROM IONIZING RADIATION TOXICITY WITH α, β UNSATURATED ARYL SULFONES
CA2440211A1 (en) 2001-03-09 2002-09-19 Pfizer Products Inc. Benzimidazole anti-inflammatory compounds
NZ526528A (en) 2001-03-09 2005-02-25 Pfizer Prod Inc Triazolopyridines as anti-inflammatory agents
AU2002303145A1 (en) 2001-03-23 2002-10-08 Smithkline Beecham Corporation Compounds useful as kinase inhibitors for the treatment of hyperproliferative diseases
WO2002076954A1 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Smithkline Beecham Corporation Compounds useful as kinase inhibitors for the treatment of hyperproliferative diseases
WO2002076985A1 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Smithkline Beecham Corporation Compounds useful as kinase inhibitors for the treatment of hyperproliferative diseases
WO2002076463A1 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Smithkline Beecham Corporation Compounds useful as kinase inhibitors for the treatment of hyperproliferative diseases
WO2002076984A1 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Smithkline Beecham Corporation Compounds useful as kinase inhibitors for the treatment of hyperproliferative diseases
ES2247271T3 (es) 2001-04-04 2006-03-01 Pfizer Products Inc. Nuevos benzotriazoles como compuestos antiinflamatorios.
KR100861466B1 (ko) 2001-04-24 2008-10-02 메르크 파텐트 게엠베하 항혈관형성제 및 ＴＮＦα를 이용한 병용 요법
WO2002090360A1 (en) 2001-05-10 2002-11-14 Smithkline Beecham Corporation Compounds useful as kinase inhibitors for the treatment of hyperproliferative diseases
EP1392300A1 (en) 2001-05-11 2004-03-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated 2,5-disubstituted pyridine, pyrimidine, pyridazine and 1, 2, 4-triazine derivatives for use as p38 inhibitors
ES2289116T3 (es) 2001-05-24 2008-02-01 Eli Lilly And Company Nuevos derivados de pirrol como agentes farmaceuticos.
JP2005500284A (ja) 2001-06-11 2005-01-06 バーテックス　ファーマシューティカルズ　インコーポレイテッド Ｐ３８のイソキノリンインヒビター
US7196095B2 (en) 2001-06-25 2007-03-27 Merck & Co., Inc. (Pyrimidinyl) (phenyl) substituted fused heteroaryl p38 inhibiting and PKG kinase inhibiting compounds
EP1406875B1 (en) 2001-06-26 2013-07-31 Bristol-Myers Squibb Company N-heterocyclic inhibitors of tnf-alpha expression
ATE360417T1 (de) 2001-07-11 2007-05-15 Boehringer Ingelheim Pharma Methode zur behandlung von zytokinvermittelten erkrankungen
CA2454913A1 (en) 2001-08-20 2003-02-27 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Parenteral formulations of 1-(5-tert-butyl-2-p-tolyl-2h-pryrazol-3-yl)-3-¬4-(2-morpholin-4-yl-ethoxy)-naphthalen-1-yl|-urea and a cyclodextrin
DE60207273T2 (de) 2001-08-30 2006-07-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Aminopyrrolverbindungen als entzündungshemmende Wirkstoffe
AU2002330031B2 (en) 2001-09-21 2007-07-05 Merck & Co., Inc. Androstanes as androgen receptor modulators
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
AU2002329570A1 (en) 2001-10-12 2003-01-30 Pfizer Products Inc. Method of monitoring neuroprotective treatment
GB0124938D0 (en) 2001-10-17 2001-12-05 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB0124931D0 (en) 2001-10-17 2001-12-05 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB0124939D0 (en) 2001-10-17 2001-12-05 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB0124941D0 (en) 2001-10-17 2001-12-05 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB0124928D0 (en) 2001-10-17 2001-12-05 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB0124936D0 (en) 2001-10-17 2001-12-05 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB0124933D0 (en) 2001-10-17 2001-12-05 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
GB0124932D0 (en) 2001-10-17 2001-12-05 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
WO2003039534A1 (en) 2001-11-08 2003-05-15 Merck & Co., Inc. Compositions and methods for treating osteoporosis
JP2005511616A (ja) 2001-11-09 2005-04-28 サイオス インク． 嚢胞性繊維症を治療する方法
EP1461758A4 (en) 2001-12-05 2005-10-05 Vertex Pharma CRYSTAL STRUCTURE OF AN MITOGENIC ACTIVATED PROTEIN, KINASE-ACTIVATED PROTEIN, KINASE-2 AND BINDING POCKETS THEREFOR
JP2005511722A (ja) 2001-12-11 2005-04-28 ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｂｉｒｂ７９６ｂｓの投与方法
EP1478345A4 (en) 2002-01-03 2010-11-17 Glaxosmithkline Llc NOVEL PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND PROCESS FOR PRODUCTION OF SAID DOSAGE FORMS
CA2472475C (en) 2002-01-15 2010-05-18 Merck & Co., Inc. 17-hydroxy-4-aza-androstan-3-ones as androgen receptor modulators
DE10203749A1 (de) 2002-01-31 2003-08-14 Boehringer Ingelheim Pharma Neue Anticholinergika, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
DE10203753A1 (de) 2002-01-31 2003-08-14 Boehringer Ingelheim Pharma Neue Xanthencarbonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
DE10203741A1 (de) 2002-01-31 2003-08-14 Boehringer Ingelheim Pharma Neue Fluorencarbonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
US20040023961A1 (en) 2002-02-11 2004-02-05 Bayer Corporation Aryl ureas with raf kinase and angiogenisis inhibiting activity
EP2258687B1 (en) 2002-02-12 2012-12-26 Glaxosmithkline LLC Nicotinamide derivates useful as P38 inhibitors
JP4187657B2 (ja) 2002-03-07 2008-11-26 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ｐ３８キナーゼインヒビターとしての二環式ピリジン及びピリミジン
IL163825A0 (en) 2002-03-13 2005-12-18 Merck & Co Inc Fluorinated 4-azasteroid derivatives as androgen receptor modulators
AU2003220401A1 (en) 2002-03-18 2003-10-08 Bristol-Myers Squibb Company Uracil derivatives as inhibitors of tnf-alpha converting enzyme (tace) and matrix metalloproteinases
US6900208B2 (en) 2002-03-28 2005-05-31 Bristol Myers Squibb Company Pyrrolopyridazine compounds and methods of use thereof for the treatment of proliferative disorders
CN1293078C (zh) 2002-04-03 2007-01-03 霍夫曼-拉罗奇有限公司 咪唑并稠合化合物
MXPA04009605A (es) 2002-04-05 2005-01-11 Boehringer Ingelheim Pharma Metodo para tratar una hipersecrecion de mucosidad.
US20030225089A1 (en) 2002-04-10 2003-12-04 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Pharmaceutical compositions based on anticholinergics and p38 kinase inhibitors
DE10216339A1 (de) 2002-04-13 2003-10-23 Boehringer Ingelheim Pharma Neue Ester hydroxy-substituierter Stickstoffheterocyclen, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel
AU2003229689A1 (en) 2002-04-15 2003-10-27 Glaxo Group Limited A method of identifying a modudator for a serine/theronine kinase
CA2482022A1 (en) 2002-04-19 2003-10-30 Smithkline Beecham Corporation Novel compounds
KR101025675B1 (ko) 2002-04-23 2011-03-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 키나제 억제제로서 유용한 피롤로-트리아진 아닐린 화합물
AU2003221753A1 (en) 2002-04-23 2003-11-10 Bristol-Myers Squibb Company Aryl ketone pyrrolo-triazine compounds useful as kinase inhibitors
US7388009B2 (en) 2002-04-23 2008-06-17 Bristol-Myers Squibb Company Heteroaryl-substituted pyrrolo-triazine compounds useful as kinase inhibitors
JP4516839B2 (ja) 2002-04-30 2010-08-04 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション アンドロゲン受容体修飾因子としての４−アザステロイド誘導体
GB0209891D0 (en) 2002-04-30 2002-06-05 Glaxo Group Ltd Novel compounds
WO2003097615A1 (en) 2002-05-17 2003-11-27 Scios, Inc. TREATMENT OF FIBROPROLIFERATIVE DISORDERS USING TGF-β INHIBITORS
TW200400034A (en) 2002-05-20 2004-01-01 Bristol Myers Squibb Co Pyrazolo-pyrimidine aniline compounds useful as kinase inhibitors
US7008958B2 (en) 2002-05-21 2006-03-07 Bristol-Myers Squibb Company 2-substituted 5-oxazolyl indole compounds useful as IMPDH inhibitors and pharmaceutical compositions comprising same
EP1515727A4 (en) 2002-06-11 2009-04-08 Merck & Co Inc INHIBITORS OF P38 KINASE (HALO-BENZO CARBONYL) HETEROBICYCLIC
AU2003245989A1 (en) 2002-07-09 2004-01-23 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh And Co. Kg Pharmaceutical compositions of anticholinergics and p38 kinase inhibitors in the treatment of respiratory diseases
WO2004010929A2 (en) 2002-07-25 2004-02-05 Scios, Inc. METHODS FOR IMPROVEMENT OF LUNG FUNCTION USING TGF-β INHIBITORS
GB0217757D0 (en) 2002-07-31 2002-09-11 Glaxo Group Ltd Novel compounds
CA2492112A1 (en) 2002-08-06 2004-02-19 F. Hoffmann-La Roche Ag 6-alkoxy-pyrido-pyrimidines as p-38 map kinase inhibitors
JP2006504667A (ja) 2002-08-08 2006-02-09 ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 炎症過程に関与するサイトカインの抑制剤としてのフッ素化フェニル−ナフタレニル−尿素化合物
DE60309342T2 (de) 2002-08-09 2007-05-16 Eli Lilly And Co., Indianapolis Benzimidazole und benzothiazole als inhibitoren der map-kinase
US20040110755A1 (en) 2002-08-13 2004-06-10 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy with p38 MAP kinase inhibitors and their pharmaceutical compositions
US20040033222A1 (en) 2002-08-14 2004-02-19 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Anticoagulant and fibrinolytic therapy uning p38 MAP kinase inhibitors
AU2003262911A1 (en) 2002-08-29 2004-03-19 Scios Inc. Methods of promoting osteogenesis
US7005523B2 (en) 2002-08-30 2006-02-28 Pfizer Inc. Cycloalkyl-[4-(trifluorophenyl)-oxazol-5yl]-triazolo-pyridines
US7037923B2 (en) 2002-08-30 2006-05-02 Pfizer, Inc. Alkyl-[4-(trifluorophenyl)-oxazol-5-yl]-triazolo-pyridines
US20040092547A1 (en) 2002-08-30 2004-05-13 Pfizer Inc Alkyl-[4-(difluorophenyl)-oxazol-5-yl]-triazolo-pyridines
PA8579601A1 (es) 2002-08-30 2004-05-07 Pfizer Prod Inc Compuestos antiinflamatorios de di y trifloruro-triazolo-piridinas
EP1537107A2 (en) 2002-08-30 2005-06-08 Pfizer Products Inc. Novel processes and intermediates for preparing triazolo-pyridines
US7012143B2 (en) 2002-08-30 2006-03-14 Dombroski Mark A Cycloalkyl-[4-(difluorophenyl)-oxazol-5-yl]-triazolo-pyridines
US7220763B2 (en) 2002-09-03 2007-05-22 Scios, Inc. Indole-type derivatives as inhibitors of p38 kinase
WO2004021988A2 (en) 2002-09-05 2004-03-18 Scios Inc. Treatment of pain by inhibition of p38 map kinase
WO2004021979A2 (en) 2002-09-06 2004-03-18 Smithkline Beecham Corporation PYRROLO[2, 3-d]PYRIMIDINE-4-YL AND PURIN-6-YL UREA COMPOUNDS
US7115644B2 (en) 2002-09-13 2006-10-03 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. Heterocyclic compounds
AU2003268156A1 (en) 2002-09-17 2004-04-08 Eli Lilly And Company Novel pyrazolopyridine derivatves as pharmaceutical agents
BR0314783A (pt) 2002-09-27 2005-07-26 Janssen Pharmaceutica Nv Pirróis 3,4-dissubstituìdos e seu uso no tratamento de doenças inflamatórias
AU2003282920A1 (en) 2002-10-04 2004-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Hydantoin derivatives as inhibitors of matrix metalloproteinases and/or tnf-alpha converting enzyme (tace)
US20050288299A1 (en) 2002-10-09 2005-12-29 Mavunkel Babu J Azaindole derivatives as inhibitors of p38 kinase
EP1560582A4 (en) 2002-10-09 2008-03-12 Scios Inc AZAINDOL DERIVATIVES AS INHIBITORS OF THE p38 KINASE
AU2003286757B2 (en) 2002-11-01 2009-06-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Carbonylamino-benzimidazole derivatives as androgen receptor modulators
DE60327097D1 (de) 2002-11-18 2009-05-20 Hoffmann La Roche Diazinopyrimidine und ihre verwendung als proteinkinaseinhibitoren
DE10255040A1 (de) 2002-11-26 2004-06-03 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue Carbaminsäureester mit anticholinerger Wirksamkeit
US20040171659A1 (en) 2002-12-06 2004-09-02 Satyanarayana Medicherla Methods for treating diabetes
US7105537B2 (en) 2003-01-28 2006-09-12 Bristol-Myers Squibb Company 2-substituted cyclic amines as calcium sensing receptor modulators
PL378121A1 (pl) 2003-02-05 2006-03-06 Bristol-Myers Squibb Company Sposób wytwarzania pirolotriazynowych inhibitorów kinazy
CN101723891A (zh) 2003-02-10 2010-06-09 沃泰克斯药物股份有限公司 通过使n-芳基氨基甲酸酯与卤代杂芳基反应制备n-杂芳基-n-芳基胺的方法和类似方法
US7205322B2 (en) 2003-02-12 2007-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Thiazolidine compounds as calcium sensing receptor modulators
EP1596860A4 (en) 2003-02-14 2009-05-27 Smithkline Beecham Corp NEW CONNECTIONS
DE602004001676T2 (de) 2003-02-14 2007-08-30 Pfizer Products Inc., Groton Triazolo-Pyridine als entzündungshemmende Verbindungen
PT1611131E (pt) 2003-02-27 2010-12-20 Palau Pharma Sa Derivados de pirazolopiridina
US7135575B2 (en) 2003-03-03 2006-11-14 Array Biopharma, Inc. P38 inhibitors and methods of use thereof
JP4617299B2 (ja) 2003-03-03 2011-01-19 アレイ バイオファーマ、インコーポレイテッド ｐ３８阻害剤及びその使用法
US7030112B2 (en) 2003-03-25 2006-04-18 Bristol-Myers Squibb Company Pyrrolopyridazine compounds and methods of use thereof for the treatment of proliferative disorders
GB0308186D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Smithkline Beecham Corp Novel compounds
GB0308185D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Smithkline Beecham Corp Novel compounds
GB0308201D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Smithkline Beecham Corp Novel compounds
JP2006523638A (ja) 2003-04-16 2006-10-19 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アーゲー キナゾリン化合物
MXPA05010975A (es) 2003-04-16 2005-11-28 Hoffmann La Roche Derivados de (6-(fenoxi)-pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)-amina como inhibidores de p38 cinasa para el tratamiento de condiciones inflamatorias como artritis reumatoide.
CN1816529A (zh) 2003-05-01 2006-08-09 布里斯托尔-迈尔斯.斯奎布公司 用作激酶抑制剂的芳基取代的吡唑－酰胺化合物
GB0320244D0 (en) 2003-05-06 2003-10-01 Aventis Pharma Inc Pyrazoles as inhibitors of tumour necrosis factor
JP4832303B2 (ja) 2003-05-07 2011-12-07 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション アンドロゲン受容体モジュレータおよびこれらの使用
EP1633714B1 (en) 2003-06-04 2008-01-23 Pfizer Limited 2-amino-pyridine derivatives as beta-2 adrenoreceptor agonists
SI2298743T1 (sl) 2003-06-26 2012-12-31 Novartis Ag Inhibitorji p38-kinaze na osnovi 5-ÄŤlenskih heterociklov
CA2530025A1 (en) 2003-06-30 2005-01-20 William P. Dankulich 17-acetamido-4-azasteroid derivatives as androgen receptor modulators
CA2530182A1 (en) 2003-06-30 2005-01-20 Merck & Co., Inc. 17-acetamido-4-azasteroid derivatives as androgen receptor modulators
US20060234931A1 (en) 2003-07-17 2006-10-19 Biggs William H Iii Treatment of diseases with kinase inhibitors
US7153870B2 (en) 2003-07-25 2006-12-26 Pfizer Inc. Nicotinamide derivatives useful as PDE4 inhibitors
US20050020587A1 (en) 2003-07-25 2005-01-27 Pfizer Inc Nicotinamide derivatives useful as PDE4 inhibitors
GB0317482D0 (en) 2003-07-25 2003-08-27 Pfizer Ltd Nicotinamide derivatives useful as pde4 inhibitors
GB0317516D0 (en) 2003-07-25 2003-08-27 Pfizer Ltd Nicotinamide derivatives useful as PDE4 inhibitors
GB0317484D0 (en) 2003-07-25 2003-08-27 Pfizer Ltd Nicotinamide derivatives useful as pde4 inhibitors
US20070105114A1 (en) 2003-07-29 2007-05-10 Martha Li Biomarkers of cyclin-dependent kinase modulation
GB0318814D0 (en) 2003-08-11 2003-09-10 Smithkline Beecham Corp Novel compounds
CL2004002050A1 (es) 2003-08-13 2005-06-03 Pharmacia Corp Sa Organizada B Compuestos derivados de piridinonas sustituidas; su uso en el tratamiento de afecciones causadas o exacerbadas por actividad p38 map kinasa y/o tnf no regulada, tales como inflamaciones, tumores, sida y otros.
JP2007503393A (ja) 2003-08-22 2007-02-22 ベーリンガー インゲルハイム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｃｏｐｄ及び肺高血圧の治療方法
WO2005023201A2 (en) 2003-09-09 2005-03-17 Medarex, Inc. Methods for treating rheumatoid arthritis
JP2007505120A (ja) 2003-09-10 2007-03-08 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド アンドロゲン受容体調節因子としての１７−複素環式−４−アザステロイド誘導体。
JP4895811B2 (ja) 2003-09-11 2012-03-14 ケミア，インコーポレイテッド サイトカイン阻害剤
EP1675830A4 (en) 2003-09-30 2008-08-20 Scios Inc HETEROCYCLIC AMIDES AND SULFONAMIDES
US20060019971A1 (en) 2003-09-30 2006-01-26 Higgins Linda S Treatment of cardiovascular disease with inhibitors of p38 kinase
US7232824B2 (en) 2003-09-30 2007-06-19 Scios, Inc. Quinazoline derivatives as medicaments
US7419978B2 (en) 2003-10-22 2008-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Phenyl-aniline substituted bicyclic compounds useful as kinase inhibitors
AU2004289428B2 (en) 2003-11-13 2010-06-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Hydroxyalkyl substituted pyrido-7-pyrimidin-7-ones
EP1538201A1 (en) 2003-12-02 2005-06-08 F.Hoffmann-La Roche Ag Method for the recombinant production and purification of protein kinases
GB0329275D0 (en) 2003-12-18 2004-01-21 Merck Sharp & Dohme Therapeutic treatment
WO2005063715A1 (en) 2003-12-18 2005-07-14 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Polymorph of birb 796, a p38map kinase inhibitor
KR20060120205A (ko) 2003-12-18 2006-11-24 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 ｐ38 ＭＡＰ 키나제 억제제를 사용하여 동물의 급성 염증을치료하는 방법
US20060058296A1 (en) 2003-12-24 2006-03-16 Scios, Inc. Treatment of osteolytic lesions associated with multiple myeloma by inhibition of p38 map kinase
WO2005065691A1 (en) 2003-12-24 2005-07-21 Scios, Inc. Treatment of malignant gliomas with tgf-beta inhibitors
US20060052390A1 (en) 2003-12-24 2006-03-09 Scios, Inc. Treatment of multiple myeloma by p38 MAP kinase and proteasome inhibition
US20060079461A1 (en) 2003-12-24 2006-04-13 Scios, Inc. Treatment of multiple myeloma by inhibition of p38 MAP kinase
CN1972925A (zh) 2004-01-30 2007-05-30 默克专利有限公司 双芳基脲类衍生物
GB0402140D0 (en) 2004-01-30 2004-03-03 Smithkline Beecham Corp Novel compounds
TWI332003B (en) 2004-01-30 2010-10-21 Lilly Co Eli Kinase inhibitors
GB0402138D0 (en) 2004-01-30 2004-03-03 Smithkline Beecham Corp Novel compounds
GB0402143D0 (en) 2004-01-30 2004-03-03 Smithkline Beecham Corp Novel compounds
GB0402137D0 (en) 2004-01-30 2004-03-03 Smithkline Beecham Corp Novel compounds
EP1720862A1 (en) 2004-02-03 2006-11-15 Eli Lilly And Company Kinase inhibitors
US7652146B2 (en) 2004-02-06 2010-01-26 Bristol-Myers Squibb Company Process for preparing 2-aminothiazole-5-carboxamides useful as kinase inhibitors
TWI338004B (en) 2004-02-06 2011-03-01 Bristol Myers Squibb Co Process for preparing 2-aminothiazole-5-aromatic carboxamides as kinase inhibitors
EP1718637A2 (en) 2004-02-26 2006-11-08 MERCK PATENT GmbH Benzimidazolyl derivatives as kinase inhibitors
KR100844864B1 (ko) 2004-02-27 2008-07-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 헤테로아릴-융합 피라졸로 유도체
EP1747202A1 (en) 2004-02-27 2007-01-31 F.Hoffmann-La Roche Ag Indazole derivatives and pharmaceutical compositions containing them
JP2007528393A (ja) 2004-03-11 2007-10-11 カイセラ バイオファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 皮膚の状態および毛の状態を予防および処置するための組成物および方法
EP1574501A1 (en) 2004-03-11 2005-09-14 Pfizer Limited Quinolinone derivatives, pharmaceutical compositions containing them and their use
EP1577292A1 (en) 2004-03-17 2005-09-21 Pfizer Limited Phenylaminoethanol derivatives as beta2 receptor agonists
EP1577291A1 (en) 2004-03-17 2005-09-21 Pfizer Limited Phenylethanolamine derivatives as beta-2 agonists
AU2005237501A1 (en) 2004-04-28 2005-11-10 Merck Sharp & Dohme Corp. Fluorinated 4-azasteroids as androgen receptor modulators
WO2005110455A2 (en) 2004-05-13 2005-11-24 Intermune, Inc. Combination therapy for treating hepatitis virus infection
UA87854C2 (en) 2004-06-07 2009-08-25 Мерк Энд Ко., Инк. N-(2-benzyl)-2-phenylbutanamides as androgen receptor modulators
EP1609789A1 (en) 2004-06-23 2005-12-28 Eli Lilly And Company Ureido-pyrazole derivatives and their use as kinase inhibitors
SI1761520T1 (sl) 2004-06-23 2008-10-31 Lilly Co Eli Inhibitorji kinaze
US7253167B2 (en) 2004-06-30 2007-08-07 Bristol-Myers Squibb Company Tricyclic-heteroaryl compounds useful as kinase inhibitors
US20060035893A1 (en) 2004-08-07 2006-02-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmaceutical compositions for treatment of respiratory and gastrointestinal disorders
PL1778686T3 (pl) 2004-08-12 2009-04-30 Pfizer Pochodne triazolopirydynylosulfanylowe jako inhibitory kinazy MAP P38
TW200618803A (en) 2004-08-12 2006-06-16 Bristol Myers Squibb Co Process for preparing pyrrolotriazine aniline compounds useful as kinase inhibitors
US7482359B2 (en) 2004-08-25 2009-01-27 Merck & Co., Inc. Androgen receptor modulators
US20070054916A1 (en) 2004-10-01 2007-03-08 Amgen Inc. Aryl nitrogen-containing bicyclic compounds and methods of use
AR055271A1 (es) 2004-10-05 2007-08-15 Smithkline Beecham Corp Compuesto del acido bifenil carboxilico, composicion farmaceutica que lo comprende, su uso para preparar esta ultima y proceso para prepararlo
MX2007004248A (es) 2004-10-13 2007-06-12 Merck Patent Gmbh Derivados heterociclicos de bisarilurea sustituidos como inhibidores de cinasa.
MX2007004551A (es) 2004-10-18 2007-05-23 Amgen Inc Compuestos tiadiazol y metodos de uso.
JP2008518968A (ja) 2004-10-29 2008-06-05 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド アンドロゲン受容体モジュレーターとしてのｎ−（ピリジン−３−イル）−２−フェニルブタンアミド
WO2006048266A2 (en) 2004-11-04 2006-05-11 Roche Diagnostics Gmbh Gene expression profiling of leukemias with mll gene rearrangements
WO2006055302A2 (en) 2004-11-04 2006-05-26 Scios Inc. Method of treating myelodysplastic syndromes
WO2006051373A1 (en) 2004-11-12 2006-05-18 Pfizer Limited Compounds for the treatment of diseases
GB0425057D0 (en) 2004-11-12 2004-12-15 Pfizer Ltd L-tartrate salt of N-1-adamantyl-2-{3-[(2R)-2-hydroxy-2-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)phenyl]eth yl}amino)propyl]phenyl}acetamide
CN101056842A (zh) 2004-11-16 2007-10-17 默克公司 治疗中风的(2r)－2－丙基辛酸前药
WO2006058023A2 (en) 2004-11-23 2006-06-01 Merck & Co., Inc. Treatment of stroke with histamine h3 inverse agonists or histamine h3 antagonists
US20060111416A1 (en) 2004-11-24 2006-05-25 Lane Charlotte A L Octahydropyrrolo[3,4-C]pyrrole derivatives
US20070224662A1 (en) 2004-12-17 2007-09-27 Jun Luo Post-translational modification of proteins in cell-free expression systems
US20060154939A1 (en) 2004-12-24 2006-07-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Medicaments for the Treatment or Prevention of Fibrotic Diseases
PE20060777A1 (es) 2004-12-24 2006-10-06 Boehringer Ingelheim Int Derivados de indolinona para el tratamiento o la prevencion de enfermedades fibroticas
PE20061155A1 (es) 2004-12-24 2006-12-16 Boehringer Ingelheim Int Derivados de indolinona como agentes para el tratamiento o la prevencion de enfermedades fibroticas
CA2591912C (en) 2004-12-28 2013-06-25 Aska Pharmaceutical Co., Ltd. Pyrimidinylisoxazole derivatives
US20060178388A1 (en) 2005-02-04 2006-08-10 Wrobleski Stephen T Phenyl-substituted pyrimidine compounds useful as kinase inhibitors
ES2351308T3 (es) 2005-02-28 2011-02-02 Merckle Gmbh Derivados de imidazol 2-sulfinil- y 2-sulfonil-sustituidos y su uso como inhibidores de citocina.
US7759337B2 (en) 2005-03-03 2010-07-20 Amgen Inc. Phthalazine compounds and methods of use
TW200724142A (en) 2005-03-25 2007-07-01 Glaxo Group Ltd Novel compounds
PE20100737A1 (es) 2005-03-25 2010-11-27 Glaxo Group Ltd Nuevos compuestos
EP1868612A4 (en) 2005-03-25 2010-03-24 Glaxo Group Ltd NOVEL CONNECTIONS
US20060235020A1 (en) 2005-04-18 2006-10-19 Soojin Kim Process for preparing salts of 4-[[5-[(cyclopropylamino)carbonyl]-2-methylphenyl]amino]-5-methyl-N-propylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazine-6-carboxamide and novel stable forms produced therein
TW200716561A (en) 2005-05-11 2007-05-01 Array Biopharma Inc P38 inhibitors and methods of use thereof
US20090074676A1 (en) 2005-05-23 2009-03-19 Smithkline Beecham Corporation Inhibition of p38 MAPK For Treatment Of Obesity
GB0512429D0 (en) 2005-06-17 2005-07-27 Smithkline Beecham Corp Novel compound
US20070032506A1 (en) 2005-07-02 2007-02-08 Peter Giannousis Crystalline forms of (2r-trans)-6-chloro-5[[4-[(4-fluorophenyl)methyl]-2,5-dimethyl-1-piperazinyl]carbonyl]-n,n, 1-trimethyl-alpha-oxo-1h-indole-3-acetamide monohydrochloride
US7473784B2 (en) 2005-08-01 2009-01-06 Bristol-Myers Squibb Company Benzothiazole and azabenzothiazole compounds useful as kinase inhibitors
EP1912945A4 (en) 2005-08-02 2010-06-16 Merck Sharp & Dohme N- (PYRIDIN-4-YL) -2-PHENYLBUTANAMIDES AS MODULATORS OF THE ANDROGEN RECEPTOR
CN102627640A (zh) 2005-08-12 2012-08-08 默沙东公司 可用作p38激酶抑制剂的杂二环化合物
US20070049592A1 (en) 2005-08-22 2007-03-01 Geuns-Meyer Stephanie D Bis-aryl urea compounds and methods of use
WO2007023114A1 (en) 2005-08-25 2007-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag P38 map kinase inhibitors and methods for using the same
KR101011957B1 (ko) 2005-08-25 2011-01-31 에프. 호프만-라 로슈 아게 Ｐ３８ ｍαｐ 키나아제 저해제 및 이의 사용 방법
BRPI0615272A2 (pt) 2005-08-25 2009-08-04 Hoffmann La Roche inibidores de p38 map kinase e métodos para uso dos mesmos
EP1919470A1 (en) 2005-08-25 2008-05-14 F.Hoffmann-La Roche Ag FUSED PYRAZOLE AS p38 MAP KINASE INHIBITORS
JP2009506007A (ja) 2005-08-25 2009-02-12 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤及びその使用方法
CN101268079B (zh) 2005-09-01 2011-09-14 安斯泰来制药有限公司 用于治疗疼痛的哒嗪酮衍生物
PT1928821E (pt) 2005-09-21 2009-03-10 Pfizer Ltd Derivados de carboxamida enquanto antagonistas dos receptores muscarínicos
JP2009509969A (ja) 2005-09-26 2009-03-12 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド アンドロゲン受容体モジュレーターとしてのｎ−（４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）ブタンアミド
WO2007045989A1 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Pfizer Limited Pyridyl derivatives useful as h3 ligands
PE20070640A1 (es) 2005-10-28 2007-08-10 Lilly Co Eli Compuestos derivados de pirazol-isoquinolina urea como inhibidores de la cinasa p38
DOP2006000234A (es) 2005-10-28 2007-05-31 Lilly Co Eli Inhibidores de cinasa
WO2007056016A2 (en) 2005-11-02 2007-05-18 Kemia, Inc. Bisamide cytokine inhibitors
WO2007052124A1 (en) 2005-11-04 2007-05-10 Pfizer Limited Tetrahydronaphthyridine derivative
US8026377B2 (en) 2005-11-08 2011-09-27 Ranbaxy Laboratories, Limited Process for (3R, 5R)-7-[2-(4-fluorophenyl)-5-isopropyl-3-phenyl-4-[(4-hydroxy methyl phenyl amino) carbonyl]-pyrrol-1-yl]-3,5-dihydroxy-heptanoic acid hemi calcium salt
TW200738243A (en) 2005-11-15 2007-10-16 Glaxo Group Ltd Novel process and formulations
NL2000323C2 (nl) 2005-12-20 2007-11-20 Pfizer Ltd Pyrimidine-derivaten.
WO2007075896A2 (en) 2005-12-22 2007-07-05 Kemia, Inc. Heterocyclic cytokine inhibitors
ES2389062T3 (es) 2006-01-18 2012-10-22 Amgen, Inc Compuestos de tiazol como inhibidores de proteína cinasa B (PKB)
UA94733C2 (ru) 2006-01-31 2011-06-10 Эррей Биофарма Инк. Ингибиторы киназы и способы их использования
WO2007091152A1 (en) 2006-02-09 2007-08-16 Pfizer Limited Triazolopyridine compounds
CA2640665A1 (en) 2006-02-10 2007-08-16 Pfizer Products Inc. Pyridinone pyrazole urea and pyrimidinone pyrazole urea derivatives
GB0603684D0 (en) 2006-02-23 2006-04-05 Novartis Ag Organic compounds
CA2645031A1 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Bristol-Myers Squibb Company Pyrrolotriazine aniline prodrug compounds useful as kinase inhibitors
CA2644421A1 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Use of vx-702 for treating rheumatoid arthritis
MEP9608A (en) 2006-03-20 2010-06-10 Pfizer Ltd Amine derivatives
WO2007126871A1 (en) 2006-03-29 2007-11-08 Array Biopharma Inc. P38 inhibitors and methods of use thereof
JP2009533362A (ja) 2006-04-12 2009-09-17 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング キナーゼ媒介性疾患を治療するための複素環式置換ビスアリール尿素のｎ−オキシド
US7745449B2 (en) 2006-04-21 2010-06-29 Amgen Inc. Thieno-[2,3-d]pyrimidine and thieno-pyridazine compounds and methods of use
EP2035005A4 (en) 2006-06-09 2011-07-06 Kemia Inc THERAPY BASED ON CYTOKINE INHIBITORS
US20090318424A1 (en) 2006-06-16 2009-12-24 Mauro Corsi Novel compounds
EP2034838A4 (en) 2006-06-16 2012-01-04 Glaxo Group Ltd NOVEL CONNECTIONS
JP2009542817A (ja) 2006-06-16 2009-12-03 グラクソ グループ リミテッド 新規化合物
GB0612026D0 (en) 2006-06-16 2006-07-26 Smithkline Beecham Corp New use
US20090192164A1 (en) 2006-06-28 2009-07-30 Aska Pharmaceutical Co., Ltd. Treating agent of inflammatory bowel disease
US8207203B2 (en) 2006-06-28 2012-06-26 Aska Pharmaceutical Co., Ltd. Pyridylisoxazole derivatives
WO2008011032A1 (en) 2006-07-17 2008-01-24 Amgen Inc. Quinazoline and pyridopyrimidine derivatives as p38 kinase inhibitors
WO2008013823A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Scios Inc. Co-crystals of (2r-trans)-6-chloro-5-[[4-[(4-fluorophenyl)methyl]-2,5-dimethyl-1-piperazinyl]carbonyl]-n,n,1-trimethyl-alpha-oxo-1h-indole-3-acetamide
EP2046343B1 (en) 2006-07-28 2014-05-14 Onconova Therapeutics, Inc. Formulations of radioprotective alpha, beta unsaturated aryl sulfones
PE20080906A1 (es) 2006-08-17 2008-07-05 Kemia Inc Derivados heteroarilo como inhibidores de citocina
WO2008024391A1 (en) 2006-08-22 2008-02-28 Scios Inc. Pharmaceutical formulations of an indole-type derivative and related methods of use
WO2008041095A1 (en) 2006-10-04 2008-04-10 Pfizer Limited Sulfonamide derivatives as adrenergic agonists and muscarinic antagonists
WO2008045393A2 (en) 2006-10-11 2008-04-17 Amgen Inc. Imidazo- and triazolo-pyridine compounds and methods of use therof
JP2010506914A (ja) 2006-10-18 2010-03-04 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド アンドロゲン受容体モジュレーターとしての２−ヒドロキシ−２−フェニル／チオフェニルプロピオンアミド
WO2008049842A2 (en) 2006-10-26 2008-05-02 Boehringer Ingelheim International Gmbh Egfr kinase inhibitor combinations for the treatment of respiratory and gastrointestinal disorders
US7943617B2 (en) 2006-11-27 2011-05-17 Bristol-Myers Squibb Company Heterobicyclic compounds useful as kinase inhibitors
WO2008071664A1 (en) 2006-12-12 2008-06-19 Smithkline Beecham Corporation Nicotinamide derivative used as a p38 kinase inhibitor
WO2008071665A1 (en) 2006-12-12 2008-06-19 Smithkline Beecham Corporation A nicotinamide derivative useful as p38 kinase inhibitor
CN101657460A (zh) 2006-12-13 2010-02-24 基利得科学公司 用于治疗肺炎症和支气管收缩的作为抗炎性信号转导调节剂(AISTM’S)和β-激动剂的相互前药的单磷酸酯
EP2102161B1 (en) 2006-12-13 2012-05-02 Pfizer Products Inc. Processes for the preparation of 3-(4-(2,4-difluorobenzyloxy)-3-bromo-6-methyl- 2-oxopyridin-1(2H)-yl)-N,4-dimethylbenzamide
JP2010513370A (ja) 2006-12-19 2010-04-30 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンｐ３８ＭＡＰキナーゼインヒビター
WO2008079857A1 (en) 2006-12-20 2008-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of aryl-substituted pyrazole-amide compounds
WO2008089034A2 (en) 2007-01-11 2008-07-24 Kemia, Inc. Cytokine inhibitors
US8063094B2 (en) 2007-02-08 2011-11-22 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-cytokine heterocyclic compounds
JP2010519203A (ja) 2007-02-16 2010-06-03 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 生物活性分子の活性を強化するための組成物及び方法
JP4588791B2 (ja) 2007-02-16 2010-12-01 あすか製薬株式会社 微粒子油性懸濁液を含む医薬組成物
WO2008104473A2 (en) 2007-02-28 2008-09-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Pyrazolopyriidine derivatives and their use as kinase inhibitors
EP2125714B1 (en) 2007-03-16 2011-06-08 Pfizer Limited Hydrochloride salt of 5-[3-(3-hydroxyphenoxy)azetidin-1-yl]-5-methyl-2,2- diphenylhexanamide
EP2152704A1 (en) 2007-05-07 2010-02-17 Amgen, Inc Pyrazolo-pyridinone compounds, process for their preparation, and their pharmaceutical use
AU2008248296B2 (en) 2007-05-07 2011-12-01 Amgen Inc. Pyrazolo-pyridinone and pyrazolo-pyrazinone compounds as P38 modulators, process for their preparation, and their pharmaceutical use
EP2173728A2 (en) 2007-07-17 2010-04-14 Amgen Inc. Heterocyclic modulators of pkb
WO2009011871A2 (en) 2007-07-17 2009-01-22 Amgen Inc. Thiadiazole modulators of pkb
US7943658B2 (en) 2007-07-23 2011-05-17 Bristol-Myers Squibb Company Indole indane amide compounds useful as CB2 agonists and method
WO2009015000A1 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Array Biopharma Inc. Pyrazole urea derivatives used as kinase inhibitors
CA2699463A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Pfizer Limited Novel compounds active as muscarinic receptor antagonists
WO2009038784A1 (en) 2007-09-21 2009-03-26 Amgen Inc. Triazole fused heteroaryl compounds as p38 kinase inhibitors
WO2009069032A2 (en) 2007-11-30 2009-06-04 Pfizer Limited Novel glucocorticoid receptor agonists
WO2009074518A1 (en) 2007-12-12 2009-06-18 Glaxo Group Limited Combinations of prolinamide p2x7 modulators with further therapeutic agents
GB0724258D0 (en) 2007-12-12 2008-01-30 Glaxo Group Ltd Novel combinations
WO2009078992A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Amgen Inc. Linear tricyclic compounds as p38 kinase inhibitors
US20110166154A1 (en) 2008-01-25 2011-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Identification of predictive markers of response to dasatinib in human colon cancer
CA2716124A1 (en) 2008-02-20 2009-08-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Powder inhalers
WO2009117156A1 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Amgen Inc. Pyrazolo-pyrazinone compounds and methods of use thereof
JP2009263234A (ja) 2008-04-21 2009-11-12 Ranbaxy Lab Ltd ホスホジエステラーゼタイプｉｖ阻害剤の組成物
AR072008A1 (es) 2008-06-13 2010-07-28 Merck & Co Inc Compuestos heterobiciclicos como agentes de inhibicion de quinasa p38
EP2300466B1 (en) 2008-06-20 2014-08-06 Bristol-Myers Squibb Company Imidazopyridine and imidazopyrazine compounds useful as kinase inhibitors
EP2307411B1 (en) 2008-06-20 2014-01-01 Bristol-Myers Squibb Company Triazolopyridine compounds useful as kinase inhibitors
WO2009158450A1 (en) 2008-06-25 2009-12-30 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of ((((4-((5-(cyclopropylcarbamoyl)-2-methylphenyl)amino)-5-methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yl)carbonyl)(propyl)carbamoyl)oxy)methyl (4-(phosphonooxy)phenyl)acetate, preparation and use thereof
WO2009158446A2 (en) 2008-06-25 2009-12-30 Bristol-Myers Squibb Company Crystalline forms of ((((4-((5-(cyclopropylcarbamoyl)-2-methylphenyl)amino)-5-methylpyrrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-yl)carbonyl)(propyl)carbamoyl)oxy)methyl (4-(phosphonooxy)phenyl)acetate, method of preparation and use thereof
US8263623B2 (en) 2008-07-11 2012-09-11 Pfizer Inc. Triazol derivatives useful for the treatment of diseases
EP2328868A1 (en) 2008-07-15 2011-06-08 Pfizer Limited Novel compounds active as muscarinic receptor antagonists
WO2010007561A1 (en) 2008-07-15 2010-01-21 Pfizer Limited Novel compounds active as muscarinic receptor antagonists
EP2334673A1 (en) 2008-08-29 2011-06-22 Amgen Inc. PYRIDO[3,2-d]PYRIDAZINE-2(1H)-ONE COMPOUNDS AS P38 MODULATORS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2010025201A1 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Amgen Inc. Pyridazino- pyridinone compounds for the treatment of protein kinase mediated diseases.
WO2010038428A1 (ja) 2008-09-30 2010-04-08 武田薬品工業株式会社 タキサン系抗がん剤の置き換え薬
EP2206534A1 (de) 2008-10-09 2010-07-14 c-a-i-r biosciences GmbH Dibenzocycloheptanonderivate und pharmazeutische Mittel, welche diese Verbindungen enthalten
WO2010042649A2 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Amgen Inc. PHTHALAZINE COMPOUNDS AS p38 MAP KINASE MODULATORS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2010042646A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Amgen Inc. Aza- and diaza-phthalazine compounds as p38 map kinase modulators and methods of use thereof
US20110263647A1 (en) 2009-01-15 2011-10-27 Amgen Inc. Fluoroisoquinoline substituted thiazole compounds and methods of use
JP2012517405A (ja) 2009-02-09 2012-08-02 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 呼吸器及び胃腸の疾患の治療のための新規医薬組成物
EP2396302A2 (en) 2009-02-13 2011-12-21 Vertex Pharmceuticals Incorporated Processes for producing phenyl-6-(1-(phenyl)ureido)nicotinamides)
JP2012518003A (ja) 2009-02-13 2012-08-09 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ２−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−（１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミドの固体形態
MX2011008496A (es) 2009-02-17 2011-11-18 Chiesi Farma Spa Derivados de triazolopiridina como inhibidores de proteinas cinasas activadas por mitogeno p38 (map).
GB0902648D0 (en) 2009-02-17 2009-04-01 Argenta Discovery Ltd Pharmaceutical compounds and compositions
US20120035177A1 (en) 2009-04-16 2012-02-09 Bristol-Myers Squibb Company Tablet formulation for p38 inhibitor and method
AU2010245072B2 (en) 2009-05-05 2013-11-28 Merck Sharp & Dohme Corp. p38 kinase inhibiting agents
WO2011025685A1 (en) 2009-08-24 2011-03-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Jak inhibition blocks rna interference associated toxicities
CN104043126A (zh) 2009-10-22 2014-09-17 霍夫曼-拉罗奇有限公司 轴突变性的调节
US20110117055A1 (en) 2009-11-19 2011-05-19 Macdonald James E Methods of Treating Hepatitis C Virus with Oxoacetamide Compounds
WO2011083387A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Pfizer Limited Hydrochloride salt of biphenyl-2-yl-carbamic acid 1-{9-[(3-fluoro-4-hydroxy-benzoyl)-methyl-amino]-nonyl}-piperidin-4-yl ester
AU2011232326B2 (en) 2010-03-24 2014-09-04 Onconova Therapeutics, Inc. Compositions and methods for prevention and treatment of wounds
US9060967B2 (en) 2010-03-26 2015-06-23 Onconova Therapeutics, Inc Stable aqueous formulation of (E)-4-carboxystyryl-4-chlorobenzyl sulfone
GB201009731D0 (en) 2010-06-10 2010-07-21 Pulmagen Therapeutics Inflamma Kinase inhibitors
CA2803665C (en) 2010-06-28 2019-03-05 Dieter Dorsch 2,4- diaryl - substituted [1,8] naphthyridines as kinase inhibitors for use against cancer
ES2535656T3 (es) 2010-07-05 2015-05-13 Merck Patent Gmbh Derivados de bipiridilo útiles para el tratamiento de enfermedades inducidas por quinasas
WO2012031057A1 (en) 2010-09-01 2012-03-08 Bristol-Myers Squibb Company Bms- 582949 for the treatment of resistant rheumatic disease
WO2012074933A1 (en) 2010-11-29 2012-06-07 Genentech, Inc. Methods for detecting neurodegenerative diseases or disorders
TWI410425B (zh) 2010-12-03 2013-10-01 Lilly Co Eli 唑并［５，４－ｂ］吡啶－５－基化合物
AU2012224979B2 (en) 2011-03-09 2017-01-19 Merck Patent Gmbh Pyrido [2, 3 - b] pyrazine derivatives and their therapeutical uses
AU2012253615B2 (en) 2011-05-09 2017-03-02 Eip Pharma, Llc Compositions and methods for treating Alzheimer's disease
ES2552538T3 (es) 2011-06-10 2015-11-30 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Compuestos que tienen una actividad antagonista de un receptor muscarínico y agonista de un receptor beta-2 adrenérgico
EP3111937B1 (en) 2011-07-08 2020-06-17 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Medicament for treatment of liver cancer
PT2780011T (pt) 2011-11-11 2018-05-14 Lilly Co Eli Terapia de combinação para cancro do ovário
WO2013086002A1 (en) 2011-12-05 2013-06-13 Cellworks Research India Private Limited Compositions, process of preparation of said compositions and method of treating cancer
BR112014013178A2 (pt) 2011-12-09 2017-06-13 Chiesi Farm Spa composto, composição farmacêutica e uso de um composto
CN105968110B (zh) 2011-12-09 2018-04-27 奇斯药制品公司 激酶抑制剂
JP6145849B2 (ja) 2011-12-09 2017-06-14 チエシ ファルマスーティシ エス．ピー．エー． キナーゼ阻害剤
RU2666530C2 (ru) 2012-01-12 2018-09-11 Йейл Юниверсити Соединения и способы усиления деградации белков-мишеней и других полипептидов с помощью е3 убиквитин лигазы
KR102477065B1 (ko) 2012-03-01 2022-12-13 어레이 바이오파마 인크. 1-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)-3-(5-플루오로-2-(1-(2-하이드록시에틸)-1H-인다졸-5-일옥시)벤질)우레아 하이드로클로라이드의 결정 형태
JP6091593B2 (ja) 2012-03-20 2017-03-08 メレオ バイオファーマ １ リミテッド 慢性閉塞性肺疾患の急性増悪の治療におけるピラゾール誘導体の使用
JP6267193B2 (ja) 2012-05-22 2018-01-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 置換ジピリジルアミン類及びそれらの使用
US20150209337A1 (en) * 2012-07-17 2015-07-30 Glaxosmithkline Llc Nicotinamide derivate in the treatment of acute coronary syndrome
GB201214750D0 (en) 2012-08-17 2012-10-03 Respivert Ltd Compounds
GB201215357D0 (en) 2012-08-29 2012-10-10 Respivert Ltd Compounds
WO2014033447A2 (en) 2012-08-29 2014-03-06 Respivert Limited Kinase inhibitors
EP2890701B1 (en) 2012-08-29 2017-03-29 Respivert Limited Kinase inhibitors
US20150210722A1 (en) 2012-08-29 2015-07-30 Respivert Limited Kinase inhibitors
US9155747B2 (en) 2012-09-13 2015-10-13 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Isoxazolidine derivatives
EP2925742B1 (en) 2012-11-16 2016-10-26 Respivert Limited Kinase inhibitors
KR20150075115A (ko) 2012-11-30 2015-07-02 에프. 호프만-라 로슈 아게 브루톤 티로신 키나제의 억제제
US9370527B2 (en) 2012-12-28 2016-06-21 The Regents Of The University Of Michigan Amelioration of intestinal fibrosis and treatment of Crohn's disease
WO2014134313A1 (en) 2013-02-27 2014-09-04 Array Biopharma Inc. Intermediates for use in the preparation of indazole derivatives and processes for the preparation thereof
EP2970190A1 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Respivert Limited Kinase inhibitors
GB201305714D0 (en) 2013-03-28 2013-05-15 Ucl Business Plc Method
EP2981535B8 (en) 2013-04-02 2021-03-10 Oxular Acquisitions Limited Urea derivatives useful as kinase inhibitors
WO2014181213A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Pfizer Inc. Crystalline form of (sa)-(-)-3-(3-bromo-4-((2,4-difluorobenzyl)oxy)-6-methyl-2-oxopyridin-1 (2h)-yl)-n,4-dimethylbenzamide
RU2015151886A (ru) 2013-06-06 2017-06-08 КЬЕЗИ ФАРМАЧЕУТИЧИ С.п.А. Ингибиторы киназ
CA2914457A1 (en) 2013-06-06 2014-12-11 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Kinase inhibitors
EP3004098B1 (en) 2013-06-06 2017-08-09 Chiesi Farmaceutici S.p.A. Kinase inhibitors
US9707219B2 (en) 2013-07-10 2017-07-18 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Losmapimod for use in treating glomerular disease
WO2015006752A1 (en) 2013-07-12 2015-01-15 The Regents Of The University Of California Combination therapies for malaria
US9814728B2 (en) 2013-09-20 2017-11-14 Saint Louis University Inhibition of DUX4 expression using bromodomain and extra-terminal domain protein inhibitors (BETi)
WO2015072580A1 (ja) * 2013-11-14 2015-05-21 学校法人同志社 細胞増殖促進または細胞障害抑制による角膜内皮治療薬
WO2015092423A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Respivert Limited Urea derivatives useful as kinase inhibitors
MX2016008110A (es) 2013-12-20 2016-08-19 Hoffmann La Roche Derivados de pirazol como inhibidores de la cinasa de cremallera de leucina dual (dlk) y usos de los mismos.
ES2774249T3 (es) 2014-02-14 2020-07-20 Respivert Ltd Compuestos heterocíclicos aromáticos como compuestos antiinflamatorios
EP3107897A1 (en) 2014-02-19 2016-12-28 H. Lundbeck A/S 2-amino-3, 5, 5-trifluoro-3, 4, 5, 6-tetrahydropyridines as bace1 inhibitors for treatment of alzheimer's disease
WO2015191996A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
WO2015191986A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
EP3166610B1 (en) 2014-07-09 2022-11-02 Eip Pharma, LLC Methods for treating neurologic disorders
MA40775A (fr) 2014-10-01 2017-08-08 Respivert Ltd Dérivé d'acide 4-(4-(4-phényluréido-naphtalén -1-yl) oxy-pyridin-2-yl) amino-benzoïque utilisé en tant qu'inhibiteur de la kinase p38
WO2016051186A1 (en) 2014-10-01 2016-04-07 Respivert Limited N-phenyl-3-quinazolin-6-yl-benzamide derivatives as p38 kinase inhibitors
WO2016049677A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Method of treating cancer
WO2016066687A1 (en) * 2014-10-30 2016-05-06 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Losmapimod for treating copd
WO2016114655A1 (en) * 2015-01-12 2016-07-21 Ry Pharma B.V. Treating neuromuscular or neurologic disease through reducing gabaergic and/or glycinergic inhibitory neurotransmitter overstimulation
US10538763B2 (en) * 2015-01-16 2020-01-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of DUX4
WO2016124793A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Association Institut De Myologie Treatment of facioscapulohumeral dystrophy
TWI703138B (zh) 2015-02-12 2020-09-01 義大利商吉斯藥品公司 具有蕈毒鹼受體拮抗劑及β２腎上腺素受體促效劑活性之化合物
WO2016142310A1 (en) 2015-03-09 2016-09-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Tricyclic dlk inhibitors and uses thereof
US20190083470A1 (en) * 2015-03-24 2019-03-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania P38 map kinase inhibitors for treating friedreich's ataxia
JP2016193870A (ja) 2015-04-01 2016-11-17 国立大学法人広島大学 慢性骨髄性白血病治療剤
US9968604B2 (en) 2015-04-16 2018-05-15 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Chromene derivatives as phoshoinositide 3-kinases inhibitors
JP6515182B2 (ja) * 2015-05-20 2019-05-15 大日本住友製薬株式会社 Ｗｔ１抗原ペプチドおよび免疫調節剤の併用
WO2016198698A2 (en) 2015-06-12 2016-12-15 Cnic Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii P38 inhibitors for the treatment and prophylaxis of liver cancer
KR102161364B1 (ko) 2015-09-14 2020-09-29 화이자 인코포레이티드 LRRK2 억제제로서 이미다조[4,5-c]퀴놀린 및 이미다조[4,5-c][1,5]나프티리딘 유도체
JP6889493B2 (ja) 2015-10-26 2021-06-18 イーアイピー ファーマ， エルエルシー 脳卒中からの回復のための方法および組成物
US9427439B1 (en) 2015-10-26 2016-08-30 Eip Pharma, Llc Methods and compositions for recovery from stroke
EP3383867B1 (en) 2015-12-03 2021-04-14 Chiesi Farmaceutici S.p.A. Compounds having muscarinic receptor antagonist and beta2 adrenergic receptor agonist activity
AR107163A1 (es) 2015-12-23 2018-03-28 Chiesi Farm Spa Inhibidores de quinasa
US10980787B2 (en) 2015-12-24 2021-04-20 The Doshisha Drug for treating or preventing disorder caused by TGF-B signals, and application thereof
WO2017117182A1 (en) 2015-12-29 2017-07-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of p38 mapk for the treatment of cancer
CA3016308A1 (en) * 2016-02-01 2017-08-10 President And Fellows Of Harvard College Small molecules for mouse satellite cell proliferation
US10189844B2 (en) 2016-02-04 2019-01-29 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Pyrazole derivatives as phosphoinositide 3-kinases inhibitors
HUE053648T2 (hu) 2016-06-08 2021-07-28 Support Venture Gmbh Gyógyászati kombinációk rák kezelésére
GB201611712D0 (en) 2016-07-02 2016-08-17 Hvivo Services Ltd Methods and compounds for the treatment or prevention of severe or persistent influenza
EP3582781A4 (en) 2017-02-15 2020-12-09 The University of Melbourne TREATMENT PROCEDURES
PT3691620T (pt) * 2017-10-05 2022-10-06 Fulcrum Therapeutics Inc Os inibidores da quinase p38 reduzem a expressão de dux4 e genes a jusante para o tratamento de fshd
US10342786B2 (en) 2017-10-05 2019-07-09 Fulcrum Therapeutics, Inc. P38 kinase inhibitors reduce DUX4 and downstream gene expression for the treatment of FSHD
WO2019103926A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Saint Louis University P38 inhibitors for the treatment of fshd
EP3883597A2 (en) 2018-11-20 2021-09-29 Fulcrum Therapeutics, Inc. Compositions and methods for increasing fetal hemoglobin and treating sickle cell disease
WO2020132004A1 (en) * 2018-12-20 2020-06-25 Saint Louis University Bet inhibitors for modulating dux4 expression in fshd
MX2021011118A (es) 2019-03-15 2022-01-18 Fulcrum Therapeutics Inc Derivados de azolopiridina macrocíclicos como moduladores de eed y prc2.
MX2023002853A (es) * 2020-09-11 2023-03-31 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de arni para inhibir la expresion de dux4, composiciones de dichos agentes, y metodos de uso.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200067170A (ko) 2020-06-11
JP2023113691A (ja) 2023-08-16
US20200332291A1 (en) 2020-10-22
EP3692144A1 (en) 2020-08-12
LT3691620T (lt) 2022-09-26
CL2020001719A1 (es) 2020-09-11
AU2018346709A1 (en) 2020-04-16
JP7012152B2 (ja) 2022-02-10
US20220282254A1 (en) 2022-09-08
JP2020536884A (ja) 2020-12-17
AU2018346712B2 (en) 2021-04-01
NZ762856A (en) 2020-07-31
WO2019071147A1 (en) 2019-04-11
TWI793191B (zh) 2023-02-21
CN111601593A (zh) 2020-08-28
IL273657A (en) 2020-05-31
UY37918A (es) 2019-04-30
NZ765534A (en) 2021-04-30
CO2020005417A2 (es) 2020-07-31
KR20200066655A (ko) 2020-06-10
CN114732910A (zh) 2022-07-12
CN111868237A (zh) 2020-10-30
IL273589A (en) 2020-05-31
US20200383963A1 (en) 2020-12-10
EP4159212A1 (en) 2023-04-05
CA3077499A1 (en) 2019-04-11
CN111601593B (zh) 2022-04-15
IL273589B (en) 2020-11-30
CL2020000911A1 (es) 2021-02-19
ECSP20024210A (es) 2020-07-31
AU2018346712A1 (en) 2020-04-09
PH12020550195A1 (en) 2020-12-07
ZA202002315B (en) 2021-07-28
CA3128468A1 (en) 2019-04-11
US11291659B2 (en) 2022-04-05
US20230257743A1 (en) 2023-08-17
SG10202110259QA (en) 2021-10-28
CN114748622A (zh) 2022-07-15
WO2019071144A1 (en) 2019-04-11
PT3691620T (pt) 2022-10-06
US20220133704A1 (en) 2022-05-05
CA3077499C (en) 2021-09-21
CO2020005351A2 (es) 2020-05-15
PL3691620T3 (pl) 2022-11-21
JP2021501130A (ja) 2021-01-14
TW201924676A (zh) 2019-07-01
EP3691620A1 (en) 2020-08-12
ES2927715T3 (es) 2022-11-10
EP3691620B1 (en) 2022-07-27
RS63581B1 (sr) 2022-10-31
PH12020550215A1 (en) 2021-02-15
HUE060024T2 (hu) 2023-01-28
MX2020003961A (es) 2020-09-22
MX2020003594A (es) 2021-04-07
DK3691620T3 (da) 2022-10-03
BR112020006169A2 (pt) 2020-10-20
US11479770B2 (en) 2022-10-25
SG11202003035SA (en) 2020-04-29
CA3127373A1 (en) 2019-04-11
JP2022031915A (ja) 2022-02-22
CL2020000913A1 (es) 2020-09-25
JP2024012295A (ja) 2024-01-30
HRP20221196T1 (hr) 2022-12-09
CA3078232A1 (en) 2019-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11479770B2 (en) Use of p38 inhibitors to reduce expression of DUX4
JP2022521454A (ja) 加齢関連炎症および障害を治療する、予防するまたは逆転させるための組成物および方法
CN111094581A (zh) 治疗肝病的方法
HU229263B1 (en) The use of pharmaceutical compositions containing 4-h-1-benzopyran-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
US11490603B2 (en) Animal model of brain tumor and manufacturing method of animal model
AU2014348291A9 (en) Compositions and methods of using transposons
WO2014161046A1 (en) Methods of treating diseases characterized by excessive wnt signalling
CN109312407A (zh) 用于癌症的诊断和治疗方法
US20200316038A1 (en) Methods and compositions for treating urea cycle disorders, in particular otc deficiency
Carotenuto et al. Targeting the MITF/APAF-1 axis as salvage therapy for MAPK inhibitors in resistant melanoma
JP2022529824A (ja) Ｒａｓ変異体癌を治療するための組成物および方法
Long et al. Resistance to PRMT5-targeted therapy in mantle cell lymphoma
AU2017205162A1 (en) Tacrolimus for treating TDP-43 proteinopathy
TW202021626A (zh) 辨識有可能受益於以端粒酶抑制劑治療之患者的方法
JP6646302B2 (ja) リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びに心不全又は不整脈性突然死の予防又は治療剤
JP6646303B2 (ja) リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びに心不全又は不整脈性突然死の予防又は治療剤
JP6646304B2 (ja) リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びに心不全又は不整脈性突然死の予防又は治療剤
JP6637092B2 (ja) リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びに心不全又は不整脈性突然死の予防又は治療剤
US20230232794A1 (en) Animal model of brain tumor and manufacturing method of animal model
JP6573408B2 (ja) リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキット
WO2023230523A1 (en) Modulation of satellite cell polarity and asymmetric cell division
JP6436654B2 (ja) リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びにリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤
JP2023010407A (ja) 子宮肉腫を予防及び／又は治療するための医薬組成物
WO2023086552A2 (en) Lncrna transcripts in melanomagenesis
US20230133972A1 (en) Biomarkers indicative of prostate cancer and treatment thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]