JPH07506258A - 微細加工装置を用いたポリヌクレオチド増幅分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微細加工装置を用いたポリヌクレオチド増幅分析関連出願の相互参照 本出願は以下の関連する同時係属出願：１９９２年５月１日出願のＵＳＳＮ０７ ／８７７．７０２；１９９２年５月１日出１ｉのＵＳＳＮ０７／８７７．７０１ ；１９９２年５月１日出願のＵｓｓＮ　０７／８７７．５３６；および１９９２ 年５月１日出願のＵＳ、シリアルナンバー　０７／８７７．６６１と同時に出願 されており、これらの開示を引用して本明細書の一部とみなす。

発明の背景 本発明は、一般的に、分析を行うための方法と装置に関する。より具体的には、 本発明はポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を含む分析が可能な小さく、典型的には 単一使用法のモジュールのデザインと構成に関する。

ここ同士年かの間に、種々の診断および監視の目的のための生物学的試料の分析 を行うための非常に多数のプロトコル、試験キット、およびカートリッジが当該 技術により開発されてきた。イムノアッセイ、凝集アッセイ、ポリメラーゼ鎖反 応に基づく分析、種々のりガント−レセプター相互作用、そして複雑な試料中の 種の分別移動が全て種々の生物学的化合物もしくは汚染物の存在または濃度、ま たは特定の細胞のタイプの存在を決定するために用いられてきた。

最近、生物学的試料を取り扱うため、またある種の臨床テストを行うために小さ く使い捨ての装置が開発されてきた。ンヨウジ（Ｓｈｏｊｉ）らは、シリコンウ ェハーの上に加工された小型の血液のガスアナライザーの使用を報告している。

ショウ／（Ｓｈｏｊｉ）らの、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ（Ｓｅ ｎｓｏｒｓ　ａｎｄ＾ｃｔｕａｔｏｒｓ）、第１５巻：第１０１頁〜第１０７頁 （１９８８年）、サトウ（Ｓａｔｏ）らは、微小機械加工法によるソリコン装置 を用いた細胞融合技術を報告している、サトウ（Ｓａｔｏ）ら、センサーズ・ア ンド・アクチュエーターズ（Ｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ＾ｃｔｕａｔｏｒｓ）、Ａ 　２１−Ａ　２３　：第９４８頁〜第９５３頁（１９９０年）。チバ・コーニン グ・ダイアグノスティックス・コーポレイシジン（Ｃｉｂａ　ＣｏｒｎｉｎｇＤ ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐ、　）　Ｕ　ＳＡは血液凝固を探知するマイク ロプロセッサで制御されたレーサー光度計を製造した。

微小機械工学はマイクロ電子工業から起こった。アンゲル（＾ｎｇｅｌｌ）ら、 サイエンティフィツク・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ ）、第２４８巻、第４４頁〜第５５ｆｆｌ（１９８３年）。微小機械工学により 、最小寸法を同士ミクロン（生物の細胞の寸法）からナノメーター（い（つかの 生物学的高分子の寸法）まで変化させる横５！要素を有する微小工学装置の製造 が可能となった。このスケールは本明細書中において“メソスケール”と呼ばれ る。メソスケールの構造を伴う大部分の実験は微小機構の研究、すなわち、機械 の運転および流れの特性の研究を伴う。メソスケールの構造の潜在的な能力は生 命化学において十分には開発されてきていない。

ブルーネット（Ｂｒｕｎｅｔｔｅ）（！キスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅ ｘｐｅｒ、　Ｃｅｌ　ｌＲｅ５．　）、第１６７巻、２０３頁〜２１７頁（１９ ８６年）および第１２巻第１７９〜第２６頁（１９８６年））は、ノリコン、チ タン被覆ポリマー等の溝中における繊維芽細胞および上皮細胞の行動を研究した 。マツカートニー（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ）ら（キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、　）、第４１巻第３０４６頁〜第３０５１頁、１９８１年）は、 溝を彫ったプラスチックの基材中の腫瘍細胞の行動を試験した。ラセル（ＬａＣ ｅｌｌｅＸブランド・セルズ（Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ）、第１２巻第１７９頁 〜第１８９頁（１９８６年）は、微小循環を洞察するためにマイクロキャピラリ ー中における白血球と赤血球の流れを研究した。フング（Ｈｕｎｇ）とワイスマ ン（ｌｅｉｓｓｍａｎ）は微小機械加工したチャンネルの流体動力学の研究を報 告したが、分析装置に関連するデータは作成していない。フング（Ｈｕｎｇ）ら 、（メディカル・アンド・バイオロジカル・エンジニアリング（Ｍｅｄ、　ａｎ ｄ　Ｂｉｏｌ、　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第９巻：第２３７頁〜第２４５頁 （１９７１年）；およびワイスマン（ｆｅｉｓｓｍａｎ）ら、（アム・インスト ・ケム・インク・ジャーナル（＾ｍ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｃｈｅｗ、　Ｅｎｇ、　Ｊ 、）、第１７巻、第２５頁〜第３０頁（１９７１年））。コロンブス（Ｃｏｌｕ ｍｂｕｓ）らは、実験上のマルチ−チャンネル試験装置においてイオン選択的電 極を分離するために、生物学的液体の毛雪流の制御において、２枚の直角に配置 されＶ型溝にエンボス加工したノートからなるサンドイッチを利用した。コロン ブス（Ｃｏｌｕａ＋ｂｕｓ）ら（クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉｎ、　Ｃｈ ｅｍ、）、第３３巻・第１５３１頁〜第１５３７頁（１９８７年））。マスク（ Ｍａｓｕｄａ）らおよびワツズ（ｌａｓｈｉｚｕ）らは細胞の操作（例えば細胞 融合）のための流体流動チャンバーの使用について報告している。マスク（Ｍａ ｓｕｄａ）ら、プロノーデインゲス・アイイーイーイー／アイニーニス・ミーテ ィング（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ＩＥＥＥ／ＩＡＳ　Ｍｅｅｔｉｎｇ）、第１ ５４９頁〜第１５５３頁（１９８７年）：およびワツズ（ｆａｓｈｉｚｕ）ら、 プロン−ディンゲス・アイイーイーイー／アイニーニス・ミーティング（Ｐｒｏ ｃｅｅｄｉｎｇｓ　ＩＥＥＥ／ＩＡＳ　Ｍｅｅｔｉｎｇ）、第１７３５頁〜第１ ７４０頁（１９８８年）。本技術は生物学的流体の分析のためのメソスケールの 装置の使用の潜在力を十分に探求していない。

ＤＮＡ断片を増幅させるためポリメラーゼ鎖反応（Ｐ　ＣＲ）を用いる方法論は 十分に確立されている（例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキ ュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）ニア・ラボラト ーリ・マニュアル（＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ１１ａｎｕａｌ）、コールド′・ス プリング・ハーバ−・ラボラトーリ・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、頁１４．１〜１４． ３５参照）。

ＰＣＲ増幅反応は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、タック（Ｔａｑ）ＤＮＡ ポリメラーゼ（チェノ（（ｈｉｅｎ）ら、シ゛ヤーナル・オン・バクテリオロジ ー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）：第１２７巻：第１５５０頁（１９７６年） ）と、ヌクレオシド三リン酸、そして鋳型ＤＮＡと相対している二本の鎖に存在 する配列とそれぞれ相補的であり、増幅されるべきＤＮＡ断片に隣接する、異な る配列を有する２個のオリゴヌクレオチド（”プライマー”）を用い鋳型ＤＮＡ 上でなされる。反応成分は二本鎖鋳型ＤＮＡのハイブリッドを壊す（”融解する ”）ための高い方の温度（例えば９４°Ｃ）に続いてアニールし重合するための 低い方の温度（例えば６５℃）の間を循環する。ハイブリッド崩壊、アニーリン グ及び重合の間の継続的な反応サイクルにより鋳型ＤＮＡの指数関数的増幅が供 給される。例えば、長さが２ｋｂまでて１μｇまでの鋳型ＤＮＡは出発時のＤＮ Ａのわずか１０−６μｇから３０から３５サイクルの増幅により得られる。サー マル・サイクラ−を用い、自動化されたＰＣＲ鎖反応を？テうための機械が入手 可能である（パーキン・エルマー・コーボレインＢン（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅ ｒ　Ｃｏｒｐ、　））。

ＰＣＲ増幅は遺伝的な病気の診断に応用されてきた（エンゲルケ（Ｅｎｇｅｌｋ ｅ）ら、ブロン−ディンゲス・オン・ナチュラル・アカデミ−・オン・サイエン シズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、第８５巻：第５４ ４頁（１９８８年）、臨床試料の病原生物の核酸配列の検出、（オウ（Ｏｕ）ら 、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２３９巻：第２９５頁（１９８８年））、 裁判試料、例えば***の遺伝的同定（シー（Ｌｉ）ら、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕ ｒｅ）、第３３５巻：第４１４頁（１９８８年）、活性化された癌遺伝子におけ る変異の分析（ファー（Ｆａｒｒ）ら、プロシーディンゲス・オン・ナチュラル ・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、）　、第８５巻：第１６２９頁（１９８８年））および分子クローニングの 多くの態様において（オステ（Ｏｓｔり、バイオテクニックス（ＢｉｏＴｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ）、第６巻：第１６２頁（１９８８年））。ＰＣＨによる分析は、 プローブとしての使用のためのクローン化した二本鎖ＤＮＡの特定の配列を生成 するため、ｃＤＮＡの特定の断片を選択的に増幅させることにより、クローン化 されていない遺伝子に特定なプローブを生成するため、少量のｍＲＮＡからｃＤ ＮＡのライブラリーを調製するため、塩基配列決定のための大量の試料の調製の ため、変異の分析のため、の様に広い応用範囲で用いることができる。父系と、 遺伝的または伝染性の病気の試験のごとき試験で広範囲の潜在的適用において臨 床的に用いることのできる、ＰＣＲ分析のための簡便で迅速なシステムが必要と されている。

本発明の一つの目的は、微少な体積の試料を分析でき、非常に低い濃度のポリヌ クレオチドを検出でき、分析結果を迅速に出せるような最適の反応環境を伴う分 析／ステムを供給することにある。もう一つの目的は、一連の応用において前も って選択した細胞または無細胞試料の、迅速で自動化されたＰＣＲ分析用試料が 行えるメソスケールの機能要素を備えた、容易に大量生産できる、使捨ての小さ な（例えば体積にしてｌｃｃ以下）装置を供給することにある。本発明のさらな る目的は、迅速な臨床試験、例えばウィルスまたは細菌による感染の試験、細胞 培養の汚染物の試験、もしくは細胞中の組換えＤＮＡまたは遺伝子の存在の試験 等の一連の迅速な臨床試験を実施するために個々に使用できるような一部の装置 を供給することにある。

発明の要約 本発明は試料中のポリヌクレオチドの迅速な増幅を可能にするポリヌクレオチド 重合反応を行うための小さく、大量生産できる、典型的には単一使用の一連の装 置を供給する。一つの具体例において、本装置は、数ミリメーターの厚さで約０ ．２ないし２．０センチメーター平方の大きさであって、試料の注入ポートとメ ソスケールのフロー・システムを形成するように微細加工された固体基材よりな る。本装置のフロー・システムは、注入ボートから伸びる試料のフロー・チャン ネル、およびフロー・チャンネルのポリヌクレオチドと流体連絡したポリヌクレ オチド重合反応チャンバーを含む。”メソスケール”という用語は本明細書中に おいて横断面の寸法が０．１μｍないし５００μｍであって、好ましい反応チャ ンバーの幅が２．０ないし５００μｍであり、より好ましくは３ないし１００μ ｍであるようなチャンバーと流路を定義するのに用いる。多くの適用において、 ５ないし５０μｍの幅のチャンネルが有用であろう。増幅が起こる基材中のチャ ンバーは多少それより大きい寸法、例えば工ないし５ｍｍにすることができる。

好ましい反応チャンバーおよびチャンネルの深さはり１ないし１００μｍ１典型 的には２ないし５０μｍである。本装置のフロー・チャンネルは、反応チャンバ ーに通じており、好ましい幅は２．０ないし２００μｍであり、深さは０．１な いし１００μｍである。

一つの具体例において、本装置は反応チャンバー中でポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ Ｒ）を実施するために利用することができる。反応チャンバーには、試料のポリ ヌクレオチド、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、試料のポリヌクレオチド とハイブリダイズ可能な一番目のプライマー、試料のポリヌクレオチドに相補的 な配列とハイブリダイズ可能な二番目のプライマー（ここに一番目と二番目のプ ライマーは重合するポリヌクレオチド生成物の両末端を定義する）を含むＰＣＨ のための試薬を供給することができる。本装置は、各サイクルにおいて、温度を 制御して１）二本鎖ハイブリッドを壊す（”融解する゛）、２）プライマーを一 本鎖ＤＮＡにアニールさせる、および３）プライマーの間で増幅されたポリヌク レオチドを合成するようにＰＣＲチャンバーの内容物の温度を循環的に変化させ るための手段をも含む。一つの具体例において、ＰＣＲチャンバーは、ＰＣＲの ために必要な温度に連続的に温度が循環するような一個のセクションからなるも のとすることができる。別法として、ＰＣＲチャンバーは、ハイブリッド崩壊、 アニーリングおよび重合のために必要とされる異なる温度に設定された二個もし くはそれ以上のセクノジンからなり、この場合、本装置はさらに、例えば、本明 細書中で開示するごとく、ＰＣＲを実施するためにセクション間にチャンバーの 内容物を循環させる手段、例えば、ポンプその他の手段を含む。本装置は、さら に、増幅したポリヌクレオチドを検出する手段をも含む。本装置は、マーカーと してのある特定のポリヌクレオチドの存在を用いた、細胞中または溶液中のポリ ヌクレオチドの存在の分析、あるいはウィルスまたは細胞のタイプの分析を含め た、種々の自動化された、感度が良好な迅速なポリヌクレオチドの分析を実施す るために使用することができる。

一般的に、本明細書中で開示するごとく、固体基材はメソスケールのフロー・シ ステムと反応チャンバーを含むチップからなる。メソスケールのフロー・システ ムと反応チャンバーは確立された微小機械加工方法を用いシリコンおよび他の固 体基材からデザインされ加工される。装置中のメソスケールのフロー・システム はフロー・チャンネルと一個またはそれ以上の反応チャンバーを基材の表面に微 細加工し、次いでカバー、例えば透明なガラスのカバーを表面上に付着させるこ とにより組み立てることができる。本装置は、例えば、基材またはカッく−を貫 いて連絡する孔によって形成される注入ポートを通ってフロー・システムに導入 される微少体積（く１０μＬ）の試料を分析する。メソスケールのフロー・シス テムの体積は、典型的には、５μＬより小さいであろうし、個々のチャンネル、 チャンバー、または他の機能要素の体積は、しばしば、１μＬより小さく、例え ばナノリッターもしくはピコリッターの範囲であることさえある。非常に低い濃 度で存在するポリヌクレオチド（たとえばナノグラム量）が迅速に（〈１０分） 増幅され検出され得る。ポリヌクレオチドの重合分析が完結した後、装置を捨て ることができる。

チップは、典型的には、チップを保持するための収容部位を備え、−個またはそ れ以上の該チップ上の注入ボートが一個またはそれ以上のフロー・ラインとその 中で対合するような器具と共に用いられるであろう。ある特定のポリヌクレオチ ドを含むと思われる生物学的流体試料を基材の注入ポートに適用した後、該チッ プを器具内に据え付はポンプ、例えば器具内のそれを試料をフロー・システムに 強制的に通すために作動させる。別法として、試料は本器具によりチップ内に注 入できる。ポリメラーゼのような分析に必要とされる試薬類はチップへの注入の 前にポリヌクレオチドの試料に添加できる。別法として、分析を完結させるため に必要な試薬類を別々の注入ボートから、例えば、本器具によって反応チャンバ ーに注入できる。流体試料と試薬類は毛管作用によってもメソスケールのフロー ・システムに入れることができる。

一つの具体例において、本装置はＰＣＲ分析を行うために使用でき、反応チャン バー中の一個またはそれ以上のセクションの温度は、例えば、基材にある反応チ ャンバーの近くに一個またはそれ以上の電気抵抗加熱器を設けることにより、あ るいは反応チャンバーに向けたパルスレーザ−または他の電磁気エネルギー源を 用いることにより制御することができる。本器具は収容部位に、チップの構造に 組み込まれた接点と対合するような、例えば、反応チャンバーを加熱する電気抵 抗に電力を供給するための電気的接点を含む。反応チャンバーの温度制御におい て補助するために器具内には冷却要素を設けることもできる。本器具には、ハイ ブリッド崩壊と重合反応のため必要とされるＰＣＲｉ度サイクルを温度的に制御 するための、装置内のセンサーと接続された通常の回路素子センサーを設けるこ とができる。

メソスケールの反応チャンバー中のポリヌクレオチド増幅反応により生成した増 幅ポリヌクレオチドは基材中のポートを通じて収集することができて、例えば、 ゲル電気泳動その他の方法により検出できる。別法として、装置中の反応チャン バーと流体連結したメソスケールの検出領域を、メソスケールのフロー・システ ムの一部として、基材中に微細加工できる。該検出領域は、増幅したポリヌクレ オチドと検出可能に結合できる、ラベルされたポリヌクレオチドあるいは抗体プ ローブのごときラベルされた結合部分を包含することができる。重合したポリヌ クレオチド生成物の検出領域における存在は、例えば、重合したポリヌクレオチ ドと結合部位との凝集の、検出領域の上の力゛ラスのカバ゛−を通した、あるい は基材それ自体の半透明なセクンジンを通した光学的検出によって検出できる。

陽性の分析は、反応チャンバー中での重合したポリヌクレオチドの生産の際のフ ロー・システムの異なる地点における圧力または電気伝導度の変化のごとき試料 流体の流れの特性における検出可能な変化によっても子指できる。一つの具体例 において、本装置はポリヌクレオチド増幅反応チャンバーを備えたメソスケール のフロー・システムからなり、検出領域は、例えば、当該検出領域の上部に設け た光学的窓を通して陽性の結果を読取れるような分光光度計のごとき感知機器を 備えた器具と組み合わせて用いることができる。本器具は反応チャンバー、検出 領域、もしくはフロー・システムのどこか他の領域で感知される圧力の表示、導 電度等を示す電気的信号を受け取るように設計することができる。

水基材は混合物中のポリヌクレオチドの迅速な平行した検出を可能にする複数の 検出／反応チャンバーからなるものとすることができる。本メソスケールのフロ ー・システムは、微量試料中の細胞の溶解を反応チャンバーに運ばれる前に可能 にするための突出部分、あるいは減少した断面積のセクションを含む。流路の中 に入れられたノリコンの鋭い角を持つ断片もまた溶解の手段として用いることが できる。メソスケールのフロー・システムにはまた例えば、フロー・チャンネル の里に固定化され、細胞が、細胞を溶解する領域に、次いで反応チャンバーに運 ばれる前に、液体の流れの低い速度においては不均一な細胞の集団の中のある特 定のタイプの細胞を結合し、液体の流れの高い速度においては、そのタイプの細 胞を放出するような結合部位からなる細胞捕獲領域を含めることができる。この 具体例において、選択された細胞の副集団から細胞内ＤＮＡまたはＲＮＡは単離 され、−個の装置内でのポリヌクレオチド分析のためにメソスケールの反応チャ ンバーに運ばれる。

もう一つの具体例において、磁性ビーズがメソスケールのフロー・システムに設 けられ、これは、例えば、器具中の外部磁場によりフロー・システムにそって動 くことができる。一つの具体例において、ポリヌクレオチドのプローブが磁性ビ ーズに固定化され、このことによりビーズが反応チャンバー中の増幅したポリヌ クレオチドに結合することができる。固定化されたポリヌクレオチドのプローブ を含む磁性ビーズは、例えば、重合化したポリヌクレオチド生産物を結合するた めに、分析の終わりに、フロー・システムを通し反応チャンバーに送られるであ ろう。結合したポリヌクレオチドは、次いで、フロー・システム中の検出あるい は精製チャンバー、もしくは収集ポートに、磁性ビーズにのせて送ることができ る。

本装置の幾つかの特徴と利点を表１に示す。本装置は病原体である細菌またはウ ィルスの検出のため、もしくはある細胞のタイプの存在、もしくは細胞における 遺伝子または組換えＤＮＡの配列の存在のための迅速な試験を供給する。本明細 書中に開示される装置は全て、試料中のポリヌクレオチドを増幅するために用い られるＰＣＲチャンバーを含むメソスケールのフロー・システムにより特徴付け られ、これにはＰＣＲのために必要とされるポリメラーゼおよび他の試薬が供給 される。本装置は広範囲の適用でポリヌクレオチドを増幅するのに使用できる。

分析の終わりに、チップを一般的には捨てる。

適応性　チップのデザインの数あるいは利用できる応用の数には制限なし。

再生性　チップの信頼でき、標準化された大量生産が可能。

低コストの生産　目下のシステムとの競合する評価が可能で、単一使用の工程に おける使い捨て可能な性質。

小さいサイズ　大規模な器械利用を要さず、不便な実験室の環境での使用のため に設計された、持ち運び可能なユニットに適し、保存および輸送コストが最小限 。

ミクロスケール　必要な試料と試薬の体積が最小限で、試薬のコスト、特により 高価で、特別な試験方法のための試薬のコストが低減化され、簡単化された器具 利用の計画が可能。

滅菌性　クリーンな環境を必要とする微生物学的分析および他の手法で用いるた めにチップは滅菌可能。

密閉されたシステム　バイオハザードは最小限化され、工程の完全さは確実。

複数の回路が可能　−個のチップで多くの工程あるいは分析が実施可能で、であ ること　パネル分析が可能。

検出器の複数の能力　事実上はとんどのシステムに分析あるいは工程の監視の能 力を拡大でき、広範囲の応用が可能。

再利用可能なチップ　ある種の適用のためには工程あたりのコストが使用者にと って低減化可能。

図面の簡単な記載 図１は、基材の表面に付着した透明なカバー１２を有し、その上には注入ポート １６とＰＣＲ反応チャンバー２２に連結されたメソスケールのフロー・チャンネ ル２０が形成された本発明の装置の模式的縦断面図である。

図２は、図１の装置の斜視図である。

図３Ａは、それを子持するために用いることができ、その中の反応チャンバー２ ２の温度を制御するための加熱要素５７を含む、模式的に示した器具５０内に収 容された分析装置１０の模式図である。

図３Ｂは、それを子持するために用いることができ、その中の反応チャンバー２ ２の温度を制御するための加熱要素５３を含む、器具５０内に収容された分析装 置１０の模式図である。

図４は、基材の表面に付着した透明なカバー１２を有し、その上には注入ポート １６とＰＣＲ反応反応チャンバーセクション２２結されたメソスケールのフロー ・チャンネル２０が形成された本発明の装置の模式的縦断面図である。

図５は、図４の装置の斜視図である。

図６Ａは、それを子持するために用いることができ、その中の反応チャンバーセ クション２２の温度を制御するための加熱要素５７を含む、器具５０内に収容さ れた分析装置１０の模式図である。

図６Ｂは、それを子持するために用いることができ、その中の反応チャンバーセ ク／ジン２２Ａの温度を制御するための加熱要素５７を含む、器具５０内に収容 された分析装置１０の模式図である。

図７は、基材上に対称的に設けられた、フロー・チャンネルのフラクタル分岐シ ステム４０からなる検出チャンバーと流体連絡したメソスケールのＰＣＲチャン バーセクンコン２２Ａと２２Ｂを微細加工した当該基材１４の模式的平面図であ る。

図８は、チャンネルのをから延びた、細胞または破片を濾過する突出物８０を備 えた基材１４中のフロー・チャンネル２０の断面斜視図である。

図９は、チャンネルの壁から延びた、細胞を突き通す突出物９０を備えた基材ｌ ４中のフロー・チャンネル２０の断面斜視図である。

図１０は、ノリコン基材１４中に微細加工したＰＣＲチャンバーセクション２２ Ａと２２Ｂを含むメソスケールのＰＣＲ分析装置の模式的平面図である。

図１１は、シリコン基材１４中に微細加工したＰＣＲチャンバー２２Ａを含むも う１つのメソスケールのＰＣＲ分析装置の模式的平面図である。

図１２は、細胞の分別、細胞の溶解およびＰＣＲ分析を含む種々の機能を実施す るのに適した一連のメソスケールのチャンバーを加工した分析装置の模式的平面 図である。

図１３はフラクタル分岐フロー・チャンネル４０の一対を加工した分析装置の模 式的平面図である。

図１４．１５および１６は分析装置１０中のフロー・チャンネル２０中に微細加 工したメソスケールのフィルター２４の異なる具体例の計画の頂面図を示す。

図１７は、装置１０の内容物をみるために装置１０と組み合わせて用いられる装 置６０の模式的斜視図である。

図１８は、図１７の装ｆ１６０の模式的断面図である。

各図面中の同様の参照符号は対応する部分を示す。

詳細な記述 本発明は、流体試料中のポリヌクレオチドの迅速な増幅を可能にするポリヌクレ オチド重合反応を実施するための小さくて、大量生産できる、典型的には一回使 用の一連の装置を提供する。本装置は、数ミリメーターの厚さで約０．２ないし ２．０センチメーター平方のような大きさであって、試料の注入ボートとメソス ケールのフロー・／ステムを形成するように微細加工された基材よりなる。メソ スケールのフロー・システムは、注入ポートから伸びる少なくとも一つの試料フ ロー・チャンネル、およびフロー・チャンネルと流体連絡した少なくとも一つの ポリヌクレオチド重合反応チャンバーを含む。チャンネル、チャンバー、および 複数のポートを配置することにより、試料および試薬の連続的で、適宜で、かつ 容積が正確な装置内への添加を容易とする。反応チャンバーおよびフロー・チャ ンネルは、好ましくは、メソスケールの寸法、即ち、断面の寸法が０１μｍない し５００μｍである。反応チャンバーの好ましい深さは０．７ないし１００μｍ であり、好ましい幅は２．０ないし５００μｍである。好ましいフロー・チャン ネルの深さは０１ないし１００μｍ、好ましい幅は２．０ないし２００μｍであ る。

一つの具体例において、本装置は反応チャンバー（ＰＣＲチャンバー）中でポリ メラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を実施するために利用することができる。ＰＣＲチャ ンバーには、試料ポリヌクレオチド、タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼのごときポ リメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、試料ポリヌクレオチドとハイブリダイズ可 能な一番目のプライマー、ポリヌクレオチドに相補的な配列とハイブリダイズ可 能な二番目のプライマー（ここに一番目と二番目のプライマーは重合する生成物 ポリヌクレオチドの両末端を定義する）を含むポリメラーゼ鎖反応に必要なＰＣ Ｒ用試薬を供給することができる。ポリメラーゼ鎖反応は、当該分野で確立され た方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング（ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｉｎｇ）ア・ラボラトーリーｒ＝、アル（＾Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　ｌ１ａｎｕａｌ）、コールド・スプリング−バーバーＨラボラト ーリ・プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙＰｒｅｓｓ）、１９８９年）により実施できる。本装置には、各サイクルにお いて、温度を制御して二本鎖ポリヌクレオチドを脱ハイブリダイズさせて、−末 鎖ポリヌクレオチドを得、次いで、プライマーをアニールし、ポリヌクレオチド の重合を起こすようにチャンバーの内容物の温度を循環的に変化させるための手 段を包含させることができる。それに加え、制限酵素／ＤＮＡポリメラーゼシス テムによる等温のＤＮＡのインビトロ増幅を含めた当該分野で公知の他のポリヌ クレオチド重合反応も使用することもできる。ウォルカー（ｔａｌｋｅｒ）ら、 プロシーディンゲス・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）　Ｕ、Ｓ、Ａ、、第８９巻：第３９２頁〜第３９６頁（１９９２年） 。リガーゼ反応もまた使用できる。ベックマン、ケイ（ＢｅｃｋＩｌａｎｎ、　 Ｋ）、クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｗ、）、第３８巻・第４ ５７頁〜第４５８頁。

一つの具体例において、本装置には、増幅したポリヌクレオチドを検出する手段 を含ませることもできる。本装置は、細胞中または溶液中のポリヌクレオチドの 分析を含めた、種々の自動化された、感度良好で迅速なポリヌクレオチドの分析 を実施するために使用することができる。分析の終わりには、装置を一般的には 捨てる。使捨ての装置の使用により、試料間のコンタミネーションが排除される 。試料および反応混合物は常に葬ったままに維持でき、小容量により廃棄物の処 理が単純化される。

メソスケールのフロー・チャンネルおよび反応チャンバーを持つ分析装置は、固 体基材から設計することができ、大量に加工できる。これらは容易に滅菌できる 。ノリコンは、よく発達した技術によりその正確で能率的な加工が可能であるの で好ましいが、ポリテトラフルオロエチレンを含むポリマーのごとき他の材料も 使用できる。試料の注入その他のボート、試料のフロー・チャンネル、反応チャ ンバー、もしくは他の機能的要素を含むメソスケールのフロー・システムは、か くして、当業者に公知の種々の微小機械加工方法のいずれによっても大量に、費 用をかけてシリコン基材から加工できる。使用可能な微小機械加工の方法はスピ ンコーティングおよび化学蒸着、レーザー加工、またはＵＶまたは、Ｘ線のプロ セスのごとき写真平板技術、あるいは、湿式化学プロセスもしくはプラズマプロ セスのいずれかによりなされるエツチングの方法といったフィルム析出方法を含 む。（例えば、マンツ（ＭａｎＺ）ら、トレンス゛・イン・アナリティカル・ケ ミストリー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、第１０巻、第１４４頁〜第１４９頁（１９９１年）参照）。

変化する幅と深さのフロー・チャンネルはメソスケールの寸法で加工できる。

加工されたメソスケールのフロー・チャンネルを含むシリコン基材はアノードに 結合された薄いガラスのカバーで覆い、密閉することができる。他の透明な、あ るいは不透明なカバー材質も使用できる。別法として、二個のシリコン基材をサ ンドインチとし、または−個のノリコン基材を２枚のガラスカバーの中にはさみ こむことができる。透明なカバーを用いることにより、メソスケールのフロー・ ７ステム中の内容物を動的に眺めることが容易になる。他の加工へのアプローチ も用いることができる。

一つの具体例において、ＰＣＲ分析が本装置の反応チャンバー中で実施できる。

図１および図２中に模式的に示すごとく、装置１０には、注入ポート１６、メソ スケールのフロー・チャンネル２０、およびＰＣＲチャンバー２２を微細加工し たシリコン基材１４を包含させることができる。重合反応に必要とされるポリヌ クレオチド試料と試薬は、フロー・チャンネル２０のいずれかの端部に加工され た注入ポート１６を通り、フロー・チャンネル２０および反応チャンバー２２を 通って添加され、生成物は（もし必要ならば）取り出される。基材１４はガラス またはプラスチックのカバースリップ１２により覆われる。分析の間中、装置１ ０は図３Ａに模式的に示された器具５０のごとき器具と組み合わせて用いること ができる。器具５０はフロー・ライン５６をその中に備えており、装置１０を保 持するための、そして、例えば、装置１０上のボート１６のようなポートと対合 させるための、収容部位５８を含む。器具５０中のポンプ５２は、試料および／ または試薬を注入ポート１６を介し本器具内のフロー・ライン５６から反応チャ ンバー２２まで輸送するのに用いられる。

器具５０には、例えば、電気的加熱要素および／または冷却コイルのような、Ｐ ＣＲチャンバー中の温度を制御するための加熱／冷却要素５７を包含させること ができる。電気的加熱要素を、別法として、反応チャンバー２２の下方の器具中 のマツチング電気接点に対して対合する電源用の接点と共に、基材１０中に組み 込むこともできる。別法として、図３Ｂに示すごとくに、本器具には、装置１０ 中の反応チャンバーの上方に配置された、レーザーまたは他の電磁気エネルギー のごとき加熱手段５３を包含させることができる。別法として、レーザーは反応 チャンバーの下方の器具内に設けることもできる。器具中のマイクロプロセッサ はハイブリッド崩壊に適した温度、例えば９４℃とアニーリングおよび重合に適 した温度、例えば６５℃の間のＰＣＲチャンバー中での温度サイクルを供給する ための加熱要素を制御するために用いることができる。マイクロプロセッサが反 応チャンバー中の温度サイクルを検出し維持するために、器具と電気的に接触さ せて、基材中に熱電対を設けることもできる。小型の熱電によるヒートポンプ（ マテリアルズ・エレクトロニック・プロダクツ・コーポレーション（Ｍａｔｅｒ ｉａｌｓＥｌｅｃｔｒｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ト レトン（Ｔｒｅｔｏｎ）、ニューシャーシー（ＮｅｗＪｃｒｓｅｙ）のごとき冷 却要素もまた反応チャンバーの温度を調節するために器具中に含めることができ る。もう一つの具体例において、図３Ｂ中に示される器具５０中で、ＰＣＲサイ クルのため要求される温度に試料を連続的に加熱し冷却するために、ガラスカバ ー１２を通しての反応チャツバ−に向けた時間を定めたレーザーパルスにより反 応チャンバーの温度を制御することができる。／リコンの温度的特性により、迅 速な加熱および冷却のサイクルが可能となる。

分析装置は、当該装置内のメソスケール・チャンネルの内容物を見るための器具 と組み合わせて用いることもできる。一つの具体例における本器具は、装置内の メソスケールのチャンネルの内容物を見るための顕微鏡よりなるものであっても よい。もう一つの具体例において、図１７および１８に模式的に示した器具６０ 内で図示したごとく、カメラを器具内に含めることもできる。器具６０には、ハ ウ／レグ６２、眺めるためのスクリーン、およびチップを本器具中に挿入するｔ ：めのスロフト６６を設ける。図１７の断面図に示されるように、器具６０には 、ビデオカメラ６８、光学系７０、および、装置１０を保持し、かつ装置１０の 配置と角度を手動で調節できるようにするための傾斜機構装置７２をも含ませる ことができる。光学系７０には、光源だけでなくチャンネルの内容物を拡大する ためのレンズ系を含ませることもできる。ビデオカメラ６８およびスクリーン６ ４により、重合したポリヌクレオチドの存在によって引き起こされる、流れの特 性または色の変化のごとき試料流体の特性の変化が視覚的に監視され、また、所 望により該器具を用いて記録することが可能となる。

もう一つの具体例において、図４．５および６Ａに模式的に示すごとく、メソス ケールのＰＣＲチャンバーには、複数のセクション、例えば、フロー・チャンネ ル２ＯＢにより連結された２個のセクション２２Ａとセクション２２Ｂを微細加 工することができる。この具体例において、セクション２２Ａをハイブリッド崩 壊に適した温度に加熱し、セクション２２Ｂを、アニーリングおよび重合に適し た温度に加熱する。分析の間、装置ｉ！１０は器具５０の中に置くことができる （図６Ａ）。器具５０には、反応チャンバーセクションの温度を制御するための 手段５７を設ける。別法として、これらのセクションを加熱するためにレーザー を使用することもできる。反応チャンバー中のこれらのセクションの温度を監視 するために基材中に熱電対を含め、その出力をマイクロプロセッサの助けを借り て温度の入力を制御するために用いることができる。操作にあたり、器具中のポ ンプ５２は、ポリヌクレオチド試料を輸送し、また必要とされるＰＣＲ試薬を注 入ポー）１６Ａを通しセクション２２Ａまで輸送するために用いられる。器具中 のマイクロプロセッサによっても制御できるポンプ５２は、次いで、連続的なポ リメラーゼ鎖反応を実施するために試料をチャンネル２０Ｂを通ってセクション ２２Ａとセクション２２Ｂの間を連続的に循環させるために使用され、ここにポ ート１６Ｂはベントとして供される。反応の完結時には、器具５０中のポンプ５ ２は生成物を回収するため、器具中において試料をポート１６Ｂとライン５６を 通ってポート５９に輸送するために使用することができる。もちろん、３個また はそれ以上のチャンバーを用いることもでき、その各々は個々の反応を行うのに 適した温度に維持される。

もう一つの具体例において、図４．５および６Ｂ中に示される装置１０では、二 本鎖ＤＮＡのハイブリッド崩壊に適した温度、例えば、９４℃にセクション２２ Ａを加熱するために加熱要素が用いられ、一方セク７ジン２２Ｂとチャンネル２ ０Ｂは、セクション２２Ａ１セクシヨン２２Ｂと連結しているが、加熱された試 料の、セクション２２Ａからセクション２２Ｂまでの輸送の際に、試料の温度が 、試料がさらなる循環のためにセクション２２Ａに戻る前に、その温度がアニー リングおよび重合に必要とされる温度まで下がるように熱を効率的に放散させる ことができるように、セクション２２Ａから一定の間隔をおいて配置される。こ れは、ソリコンが比較的高い熱伝導度を有し、液体試料と基材との界面の面積が 非常に高いことにより容易に達成することができる。この具体例において、器具 ５０内のマイクロプロセッサは、セクション２２Ａと２２Ｂの間の試料の流れの サイクルを調節するポンプ５２を制御するために用いることができる。

それゆえ、動的熱平衡によってチャンバー間の流路に沿った温度勾配がつくられ 、双方において単一の加熱源を用いることにより適切な温度が達成される。池の 設計も可能である。例えば、アニーリングおよび重合反応は、異なる最適温度に 設定した一個のＰＣＲチャンバー中の異なるセクションで行なうことができる。

ポリメラーゼ鎖反応は、タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼのごときいずれの耐熱性 ポリヌクレオチド・ポリメラーゼを用いても実施することができる。タック（Ｔ ａｑ）ポリメラーゼのごとき試薬は試料に添加され、次いで、メソスケールの反 応チャンバーへの注入ポートを通して輸送されるか、あるいは試薬は試料とは別 に、別々の注入ポートを通し反応チャンバー中に輸送され得る。

本装置の容量は非常に小さく、それゆえ−回の分析に必要な試料流体の量は非常 に少ない。例えば、その表面に幅１０ミクロン×深さ１０ミクロン×長さ１ｃｍ （１０’ミクロン）の５００の溝が整列している１ｃｍＸ１ｃｍのソリコンの基 材において、谷溝の体積は１０゛３μしてあって、５００の溝の全体積は０５μ しである。メソスケールのフロー・システムの体積が小さいことにより、流体試 料の非常にｌｊ−さい量（く５μし）で分析がなされる。本装置のメソスケール のフロー・／ステムはマイクロリットルの体積にて微細加工されるかまたは、別 法としてナノリッターの体積もしくはそれより少ない体積にて微細加工され、こ のことにより一回の分析に必要とされる試料および／または試薬の流体の量を有 利に限定する。

本発明の装置は生物学的な流体試料においてポリヌクレオチドの迅速な増幅のた めに用いられるメソスケールのポリヌクレオチド重合反応チャンバーを供給する 。本装置は増幅したポリヌクレオチド生成物を検出するための基材中あるいは器 具中にある手段をも含む。装置中における増幅したポリヌクレオチド生成物の存 在はメソスケールのフロー・システム中の反応チャンバーに入るおよび／または 存在する試料流体の圧力もしくは電気伝導度を監視することを含めた多（の方法 のいずれによっても検出可能である。増幅されたポリヌクレオチド生成物の存在 は、ラベルされたオリゴヌクレオチドまたは抗体プローブのごときラベルされた プローブによる結合アッセイ、もしくはゲル電気泳動によっても検出できる。

一つの具体例において、増幅したポリヌクレオチド生成物は基材中にあって反む チャンバーと流体て連絡したメソスケールのフロー・／ステム中に加工された検 出チャンバーを用いて検出可能である。検出チャンバーには増幅されたポリヌク レオチドと結合可能な結合部位を設ける。結合部位は、例えば、ポリヌクレオチ ドまたは抗体プローブからなるものとすることができる。検出チャンノく−はＵ 、　Ｓ／リアルナンノ１′−［代理人明細書Ｎｏ、ＵＰＡｏｏｌ（８２６１／２ ）］、メンスケール・ディテクンジン・ストラクチャーズ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ 　ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）、に開示されている方法により加 工でき、その開示を引用により本明細書の一部とみなす。本装置は分析中に得ら れるデータを検出し記録するマイクロプロセッサを含む器具と組み合わせて用い ることができる。

一つの具体例において、メソスケールの検出チャンバーには、重合したポリヌク レオチド生成物の存在下において、検出可能なビーズの凝集を引き起こすために 、重合したポリヌクレオチドに結合することのできる不活性粒子、例えば、ビー ズあるいは池の粒子を設けることができる。粒子により誘導される凝集は、抗体 のごとき結合部位の粒子への付着により促進できる。

重合したポリヌクレオチドに結合可能な抗体あるいは他の結合部位は、結合を誘 導するために検出チャンバーに導入されるか、あるいは化学的かもしくは吸収に よるかのいずれかにより検出領域の表面に被覆されるか、あるいは別法として、 検出領域の不活性粒子の表面に被覆されるかされ、ポリヌクレオチドが陽性であ るかどうかの試験が行える。ノリカ質の表面の化学的活性化技術は、特にクロマ トグラフィーの方面においてよく発達している。（例えば、ソリ・ソド・７エー ス・バイオケミストリー（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）、ダブリュー・エイチ・スコーテン（Ｗ、　Ｈ，５ｃｏｕｔｅｎ）！ｉ、ジョ ン・ウィリー（Ｊｏｈｎ　ｆｉｌｅｙ）、ニューヨーク、第５３５頁〜第５９７ 頁（１９８３年）：における／％シラーＨａｌｌｅｒ）の文献、およびマンデニ ウス（Ｍａｎｄｅｎｉｕｓ）らの、アナリテイカル・ノ＼′イオケミストリ−（ ＾ｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、第１７０巻第６８頁〜第７２頁（１９８８年）参照）。

一つの具体例において、結合部位は抗体からなり、当該分野において公知のイム ノアンセイの技術を検出領域において実施することができる。（ポルトン（Ｂｏ ｌｔｏｎ）らの、／１ンドブノク・オン・エキスペリメンタル・イムノロノー（ Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、 ビア、ディーエム（ｔｉｅｒ、　Ｄ、　Ｍ）Ｗｌ　ブラックウェル・サイエンテ イフィック・パブリヶーノジンズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、１９８６ 年、第１巻、第２６章をイムノアッセイの一般的議論のために参照されたし）。

蛍光分子または蛍光ビーズのごとき光学的に検出できる標識を該結合部位に結合 させて、重合されたポリヌクレオチドの検出を向上させることもできる。別法と して、蛍光標識抗体のごとき二次標識物質を、該流動システムを通してデリバリ −して、該検出領域中の結合したポリヌクレオチド／結合部位に結合させて、分 析物の存在の指標となる光学的に検出可能な部分を含有する「サンドウィッチ」 を形成させることもできる。該検出領域における増幅されたポリヌクレオチドの 結合は、該検出領域にわたり配された透明窓を通して、例えば、光学的に、視覚 的または機械により検出することができる。−の具体例において、増幅されたポ リヌクレオチドの生成は、臭化エチ／ウムのごとき染料の添加により検出するこ とがてき、これは二重鎖ポリヌクレオチドへの結合に際し蛍光の向上を示す（ヒ グチ（ｌ（ｉｇｕｃｈｉ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ）、第１０巻第４１３頁（１９９２年））。

また、増幅されたポリヌクレオチドの１方の鎖に結合しつる標識した相補的ポリ ヌクレオチド鎖、例えば、ビーズ上に固定化させた標識ポリヌクレオチドを該検 出領域に配してもよく、ビーズ凝集の手段により、重合されたポリヌクレオチド 生成物を検出できる。当該分野で公知のポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーノ ジン技術を利用することができる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレ キュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールド ・スプリングＨハーバ−・プレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒ ｅｓｓ）、１９８９年）：ベナー（Ｖｅｎｅｒ）ら、アナリティカル・ケミスト リー（＾ｎａ１．　Ｃｈｅｆｆｌ、　）、第１９８巻・第３０８〜第３１１頁（ １９９１年））。ポリヌクレオチドプローブを、例えば、サブミクロンのラテッ クス粒子に、結合させることもできる（ウルツ（ｆｏｌｆ）ら、ヌクレイツク・ アノッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、第１ ５巻：第２９１１〜第２９２６頁（１９８７年））。

また、（出典明示して本明細書の一部とみなす）ＵＳＳＮ［代理人ファイル番号 ＵＰＡ００２（８２６１／３）］、アナリンス・ベースド・オン・フロー・レス トリクノジン（＾ｎａｌｙｓｉｓ　Ｂａ５ｅｄ　ｏｎ　Ｆｌｏｗ　Ｒｅ５ｔｒｉ ｃｔｔｉｏｎ）に開示されているように、該反応チャンバーで生成させた重合ポ リヌクレオチドの存在により引き起こされる流動制限に敏感な検出領域を用いて ポリヌクレオチド重合を検出することもできる。また、増幅されたポリヌクレオ チドの存在は、該流動システムを出入りする流体試料の圧力または電気の導電性 を検知することによっても検出することができる。該導電性は、他えば、該基材 を通して伸び該装置と組み合わせて用いる器具の電気接触部と接触する電気接触 部を用いて測定することができる。電気接触部は、公知の熱勾配帯溶融により加 工できる（ファンダメンタルズ・アンド・アプリケ＝／ジンズ・オン・ケミカル ・センサーズ（Ｆｕ口ｄａｍｅｎｔａｌｓ　ａｎｄ＾ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　 ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｅｎｓｏｒｓ）、ディー、シュエソツエル（Ｄ、　 ５ｃｈｕｅｔｚｌｅ）およびアール、ハメール（Ｒ，Ｈａａ＋ｍｅｒｌｅ）ｉｇ 、エイノーニス・シンポジウム・シリーズ・３０９（＾ＣＳ　ＳｙＩｌｐｏｓｉ ｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　３０９、ワシントン、ディーシー（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ 。

ＤＣ）中のゼーメル（Ｚｅｏｅｌ）ら、１９８６年、第２頁参照）。

該反応チャンバー中の増幅されたポリヌクレオチドは、該試料流体の圧力をモニ ターすることにより検出できる。例えば、図６Ａに模式的に図示する、器具５０ に収容させた装置１０においては、ポート１６を通して該メソスケール流動／ス テムを出入りする試料流体に連結した圧力検出器５４により、重合された生成物 および生成した目詰まりの存在または流動制限により引き起こされる圧力の下降 を検出することができよう。また、メソスケール圧力センサーを直接シリコン基 村上に加工してもよい（アンゲル（＾ｎｇｅｌｌ）ら、サイエンティフィック・ アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａａ＋ｅｒｉｃａｎ）、第２４８巻：第４ ４〜第５５頁（１９８３年））。

流動制限に敏感で、例えば、連続して流動チャンネルを分岐させる形状の、「フ ラクタル（ｆｒａｃｔａｌ）Ｊ　形状て構築されているメソスケール流動システ ムを用いることにより、ポリヌクレオチド重合を検出できる。該フラクタル分岐 チャンネルは、一連の狭い流動チャンネルを供するの各々の分岐点で、直径が小 さくなる／リコン基村上に加工してもよい。図７は、チャンネル２０を介してポ ート１６に連結した流動チャンネルのフラクタル分岐システム４０、ならびに、 部分２２Ａおよび２２ＢよりなるＰＣＲ反応チャンバーを加工した基材１４の模 式的な平面図である。試料中の増幅されたポリヌクレオチド生成物の存在は、該 フラクタル中における流動特性に影響するであろう。この具体例における該チャ ンネル４０は、対称に配されており、該フラクタルの中心に向かって連続して狭 くなる直ｌを有する。このフラクタルを通る流動は、重合された生成物の存在に より引き起こされる流体粘度の変化に敏感である。別法として、図１３に図示す るごとく、さらに複雑なフラクタル流動システムを利用することもできる。図１ ３は一対のフラクタル分岐流動チャンネル４０Ａおよび４０Ｂを図示する。該フ ラクタル流動チャンネル４０Ａは、該フラクタルの中心に向かって連続して狭く なる流動チャンネルで構築されており、その結果、流動制限に対する感受性が向 上している。

該フラクタル領域中の流動制限は、該検出領域にわたる透明カバーを通して、例 えば、光学的に、検出することがてきる。別法として、１またはそれを超える圧 力センサーを利用して、該フラクタル流路の中またはそれを越える増幅されたポ リヌクレオチドの存在により引き起こる流体特性の変化に起因する圧力変化を検 出してもよい。また、ポリヌクレオチド生成上の導電性の変化も、該流動領域に 接合する電気的な導電センサーを通して容易に検出できる。例えば、流入ポート １６Ａから排出ポート１６Ｂへの流動が遮断する該フラクタル領域４０の目詰り は、通常の導電プローブ１７により検出できる。該プローブの出力は、外部流動 チャネルにおける水性流体の存在または不在の指標である。標識した抗体または ポリヌクレオチドプローブのごとき結合部位は、フラクタル領域中に、例えば、 固定化するか、あるいは、ビーズのごとき固相反応物の上に含有させてもよ（、 生成ポリヌクレオチドに結合して該フラクタル流路中の流動制限を誘起する。

−の具体例において、該メソスケール流動／ステムは、下流のポリヌクレオチＩ ・分析の準備として、試料からの細胞を溶解するためのチャンバーを含有する。

また、該装置は、異種細胞集団中の特定の細胞型を分離するために適用される領 域を含有してもよい。該細胞分離領域は、該基材の構造上に固定化させた固定化 結合部位を含有し、これはタンパク質のごとき特徴的な細胞表面分子を介して標 的細胞に選択的に可逆的に結合する。該試料中の他の細胞は下流へ通過し、排水 溜または排出ポートを通して排出する。例えば、緩衝液の流動で、流動を続けて 該細胞を洗浄する。高流速および高流圧では、該洗浄した細胞は表面から剥ぎ取 られて、分離領域から放出され、下流の溶解手段へ移動され、該手段において、 細胞内のＲＮＡまたはＤＮＡ分子のＰＣＲ分析の前に該細胞が溶解される。

該細胞溶解手段は、典型的には、該細胞分離領域および該ポリヌクレオチド重合 反応チャンバーの間の流路に配されて、細胞内ポリヌクレオチドの分析の前に該 細胞を溶解できる。図９に図示するように、該細胞溶解手段は、流動チャンネル ２０の表面から伸びる細胞膜を貫通する突起物９０よりなるものとすることがで きる。該貫通する突起物９０を通して流体流動を押し込むと細胞が破壊される。

もう一つの具体例において、該細胞溶解は、単純に十分な流動圧の適用で細胞を 溶解する、制限された断面直径の領域よりなっていてもよい。該細胞溶解手段は 、メソスケール溶解チャンバーに捕捉された鋭利なソリコンピースよりなってい てもよい。ポンプのごとき、該細胞を含有する試料を該細胞溶解手段へ押し込む ための手段を含有する器具は、十分な流動圧の適用で細胞を溶解し、続いて流動 システムを通して該試料を該反応チャンバーへデリバリ−する。もう一つの具体 例において、該細胞溶解手段は、細胞溶解剤を含有していてもよい。当該分野で 公知の細胞溶解剤を利用することができる。

該反応チャンバーに流体連絡した該基材中の離れた流入ポートから、剤を該反応 チャンバーに添加してもよい。シリコン基村上の該流動チャンネルに微細加工さ れたフィルターを用いて、ポリヌクレオチド分析の前に細胞夾雑物を濾過するこ とができる。−の具体例において、図１４．１５および１６に示すように、装置 １０の該フィルター２４は、チャンネル２０に比して減少した直径のメソスケ− ル流動チャンネルよりなっていてもよい。操作において、試料はフィルター２４ を通って試料流動チャンネル２ＯＡから流動する。次いで、試料ａ液がフィルタ ー２４から排出されて、チャンネル２０Ｂを通って流動する。該フィルター２４ が、０〜１ないし２０μｍの単位の深さおよび幅で微細加工される一方、流動チ ャンネル２ＯＡおよびＢは、約５００μｍの単位の最大深さおよび幅を有する。

また、図８に図示するように、流動チャンネル２０の表面は、ＰＣＲ分析チャン バーから上流の、大きさにより細胞を分離するための細胞ふるい（ｃｅｌｌ　５ ｅｉｖｅ）を構成する突出物８０も含有してもよい。典型的には、低圧下にて、 細胞試料を該流動チャンネルを通して流動させると、該突出物８０の間を通るの に十分に小さな細胞のみが下流の機能要素（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｅｌｅｍｅ ｎｔ）にたどり着く。続いて、これらの細胞は、細胞溶解領域を通り、次いで、 分析用のＰＣＲ反応チャンバーにデリバリ−されうる。

もう一つの具体例において、常磁性または強磁性のビーズを該メソスケール流動 システム内に配して、例えば、器具のような、外部的な磁場により該流動システ ムに沿って動かすことができる。該ビーズを用いて該装置中の機能要素間に試薬 を移動することができるか、あるいは、試料、試薬または反応混合物を置き換え ることもできる。−の具体例において、ポリヌクレオチドプローブを該磁性ビー ズ上に固定化させて、該ビーズが該増殖させたポリヌクレオチドに結合できるよ うにしてもよい。ポリヌクレオチドプローブのコーティングよりなる磁性ビーズ は、アッセイの終了時に、該流動システムを通って該反応チャンバーに移動させ て、該重合させたポリヌクレオチド生成物に結合させてもよい。次いで、結合し た重合ポリヌクレオチドを該磁性ビーズ上にて、該流動システムの検出チャンバ ーまたは精製チャンバー、あるいは収集ポートへ移動させてもよい。

図１０に図示した本発明の−の具体例は、流路２０Ｂで連結されたセクション２ ２Ａおよび２２ＢよりなるメソスケールＰＣＲチャンバーが微細加工された基材 １４よりなる装置１０である。該ＰＣＲチップ１０は、該チップを支持するため の収容部位を含有する図６Ａに示す器具５０のごとき、器具と組み合わせて用い る。該器具５０は装置１０中でポート１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄｌ： 連結した流路５６を配する。また、該器具は、該ポート１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ および１６Ｄを機械的に開閉するバルブも含有する。−の具体例において、該装 置の流動システムを液圧的に満たしたまま維持し、該器具中、または別法として 、該装置中のバルブを利用して流体流動を向ける。該ＰＣＲチャンバーのセクシ ョン２２Ａおよび２２Ｂを９４℃および６５℃に各々加熱し、ＰＣＲに必要な融 解温度およびアニーリング温度にする。前記で論じたごとく、反応チャンバーセ クションは、該セクションの下に基剤中に組み込まれた電気接触部の手段により 加熱してもよ（、該セク／Ｍンは該器具の中の電気接触部と連結することができ る。

別法として、光学的レーザーを用いて、支持体にわたり配されているガラスカバ ーを通して、該反応チャンバ一部分を加熱してもよい。加熱センサーを、該器具 の電気接触部中の該基材中に配してもよい。該器具中のマイクロプロセッサ−を 用いて、該反応チャンバーセクションの温度、ならびに該流動システム中の流体 の流動を制御することがてきる。

最初に、該チャンネルおよびｌｆｆ１液を満たしたチャンバーの操作において、 ポート１６Ａおよび１６Ｃを開ける一方で１６Ｂおよび１６Ｄを閉める。該器具 中のポンプ５２は、該試料流体、ならびに、所望により、タック・ポリメラーゼ 、プライマーおよびヌクレオシド三リン酸のごときＰＣＨに要する試薬を、ポー ト１６Ａを介して、フィルター２４を通して反応チャンバーセクション２２Ａに デリバリ−する。次いで、ポート１６Ａを閉め、１６Ｂを開け、該器具中の該ポ ンプ５２を用いて、ポリヌクレオチド脱ハイブリダイゼーション（ｄｅｈｙｂｒ ｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を起こすセクション２２Ａと、アニーリングおよび重合反 応を起こすセクション２２Ｂとの間に流動チャンネル２０Ｂを通して流体流動を 相互循環させる。ポート１６Ｃを用いれば、該システムを排出でき、また、所望 により、タック・ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、プライマーおよび他の 試薬等をデリバリ−することもできる。例えば、３０ないし３５循環後の該ポリ メラーゼ循環反応が完了したら、ポート１６Ｃを閉め、ポート１６Ｄを開けて、 該器具中のポンプを作動させて該反応生成物をＰＣＲチャンバーセクションジン Ａおよび２２Ｂから、例えば、ビーズ９２に固定化させた増幅されたセンスおよ び／またはアンチセンス鎖に相補的なポリヌクレオチドを含有する検出チャン／ ＜−２２Ｃにデリノくり−する。重合生成物は、例えば、該検出領域にわたり配 した透明力／く−を通して、ビーズ９２の凝集を観察することにより視覚的に検 出する。

もう一つの具体例を図１１に図示する。この装置の機能、構造および操作は、単 一のＰＣＲ反応チャンバー２２Ａよりなることを除き、図１０に示したものと同 一である。該装置は、図３Ａに示した器具５０のごとき器具と組み合わせて用い る。該装置は、融解に要する温度およびアニーリングまたは重合に要する温度の いずれかに、反応チャンバー２２Ａを加熱および冷却するための手段を含有する 。

操作においては、該器具を用いて、ＰＣＲに要するポリメラーゼおよび他の試薬 を流入ボートを通して反応チャンバー２２Ａにデリノくり−する。次Ｌ）で、該 器具に連結したバルブを用いてポート１６Ａおよび１６Ｄを閉める一方、１６Ｂ および１６Ｃ開けたまま維持する。次いで、該器具中の加熱要素を利用して、脱 ／Ｘイブリダイゼーンジンに適当な温度と、アニーリングおよび重合に適当な温 度との間に該反応チャンバーを熱循環させる。該ＰＣＲ反応循環を完了しｔこら 、ポート１６Ｃを閉め、ポート１６Ｄを開けて該試料を、例えば、ビーズ９２上 １こ固定化させた、ポリヌクレオチドプローブを含有する該検出チャン／＜−２ ２８＋ニデーノバリーする。該ポリヌクレオチドの陽性アツセイは、該検出チャ ンノく一中のポリヌクレオチドプローブの凝集によって示される。

本発明は、以下の限定されない実施例からさらに理解されよう。

実施例１ 図１１に模式的に図示した装置の中でポリメラーゼ鎖反応を行う。細胞中のポリ ヌクレオチドを検出するためにＰＣＲ分析を行うには、試料細胞溶解物をタック ・ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドプライマーおよび池 のＰＣＲに要する試薬の緩衝液に添加する。該細胞試料溶解物を流入ポート１６ Ａを通して該器具を介して、ＰＣＲ反応チャンバー２２Ａにデリノくり−する。

該器具中に含有されるバルブ手段によりポート１６Ａおよび１６Ｄを閉じる一方 、ポート１６Ｂおよび１６Ｃを開ける。該器具中のマイクロプロセ・、サーおよ び温度制御要素を用いて、反応チャン／＜−２２Ａにて、ポリヌクレオチド脱ノ ）イブリダイセーンジンのための９４℃、およびポリメラーゼ反応のための６５ ℃の間に温度循環させる。該ポリメラーゼ鎖反応が完了した後に、ポート１６Ｃ を閉め、１６Ｄを開けて、ポート１６Ｂに連結した該器具中のポンプを用いて、 該ＰＣＲチャンバー２２Ａからの試料を流動チャンネル２０Ｂを通して該検出チ ャンツク−２２Ｂにデリバリ−する。ビーズ９２を含有する検出チャンバ−２２ Ｂは、増幅させたポリヌクレオチドに結合できる表面に固定化した相補的なポリ ヌクレオチドよりなる。増幅させたポリヌクレオチドおよび相補的なポリヌクレ オチドの間のハイブリダイゼーンジン反応により引き起こされるビーズの凝集は 、該検出領域２２Ｂにわたり配された窓を通して観察し、増幅させたポリヌクレ オチド生成物の存在テストを機供する。

実施例２ 図１２は、生物流体試料混合物中の細胞並集団から核酸を単離するの；こ用４％ 、次いで、特定のヌクレオチド配列のアッセイを行うために用いる基材１４を含 有する装置１０を模式的に図示する。装置１０上に微細加工されて（するの１よ 、細胞分離チャンバー２２Ａ１細胞溶解チヤン／＜−２２８１フイルター領域２ ４、セクション２２Ｃおよび２２ＤよりなるＰＣＲ反応反応チャイノ、ならびに フラクタル検出領域４０を含有するメソスケール流路２０である。また、該メソ スケール流動システム内は、流体投入／排出ポート１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよ び１６Ｄが配されている。該装置は、図６八に示す器具５０のごとき器具と組み 合わせて用いる。

最初に、該器具中のバルブを用いてポート１６Ｃおよび１６Ｄを閉める一方、ポ ート１６　Ａおよび１６Ｂを開ける。細胞混合物を含有する試料を、該器具中の ポンプ５２により試料インレット口１６Ａに向け、メソスケール流？３２０を通 して分離チャンバー２２Ａに流動させる。チャンバー２２Ａは、該チャンバーの 壁に固定化した結合部位を含有し、これは試料中の所望の細胞型上の表面分子に 選択的に結合する。残りの細胞成分は、ポート１６Ｂを介して基材の外に排出さ れる。チャンバー２２Ａ中の所望の細胞集団に結合した後も緩衝液を流動させて 洗浄し、該細胞集団の単離を確認する。次に、ポート１６Ｂを閉じ１６Ｃを開け る。

次いて、流動を十分に増加させて固定化している細胞を剥ぎとる。流動を続けて 、チャンバー２２Ｂ中の膜を貫通する突出物９０を通して細胞を押し込み、細胞 を破壊して細胞内物質を放出させる。

フィルター２４の後に試料を流動させ続け、大きな細胞膜成分および他の夾雑物 を、流動チャンネル２０ＢによりＰＣＲチャンバーセクション２２Ｄに連結した メソスケールＰＣＲチャンバーセクノジン２２Ｃに濾別する。次に、ＰＣＲアッ セイに要するタック・ポリメラーゼ、プライマーおよび池の試薬を、該器具中の 連結したポートおよび流路からポート１６Ｃを通してセクション２２Ｄに添加す ると、分離した細胞並集団からの細胞内可溶性成分と該ＰＣＲ試薬とが混合する 。

ポート１６Ａを閉じるとともに、ポート１６Ｂを介して連結した該器具中のポン プを用いて、ＰＣＲ試料および試薬を各々９４℃および６５℃に設定したセクン ヨノ２２Ｃおよび２２Ｄの間に流動チャンネル２０Ｂを通して循環させ、複数の ポリヌクレオチド融解および重合の循環を行い、生成物ポリヌクレオチドを増幅 させる。次に、該器具中のバルブを用いてポート１６Ｃを閉じ、ポート１６Ｄを 開ける。次いで、ポート１６Ｂに連結した該器具中のポンプを用いて、細胞集団 から単離した該増幅させたポリヌクレオチドを、流路４０の一連のフラクタル分 岐よりなる検出領域に向ける。該フラクタル領域４０における流動制限は、増幅 させたポリヌクレオチド生成物の存在の陽性指標として配され、該検出領域にわ たり配されたガラスカバーを通して光学的に検出される。

前記の記載が図示の方法により記載されたもので、本発明が、本明細書中に記載 した構造および方法の意図の範囲内の他の形態をとりうることは理解されよう。

当業者なら変形および修飾を思い付くであろうし、かかる全ての変形および修飾 は請求の範囲に定義したごとく、本発明の一部分と考えられよう。

ＦＩＧ、Ｉ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３Ａ ＦＩＧ、３Ｂ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ Ｆ　Ｉ　Ｇ、６Ａ ＦＩＧ、６Ｂ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、ｌｏ ＦＩＧ、ｌｌ Ｆ　Ｉ　Ｇ、　１４ ＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、１６ ＦＩＧ、１８ ＦＩＧ、１７ 国際調査報告　６ＭＡｌｔ　６２１Ｍ□１゜フロントページの続き （３１）優先権主張番号　８７７．６６２（３２）優先日　１９９２年５月１日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）優先権主張番号　８７７．７０１（３２）優先日　１９９２年５月１日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）優先権主張番号　８７７．７０２（３２）優先日　１９９２年５月１日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ’）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、Ｃ Ｈ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリヌクレオチド重合反応を行うことにより、試料中の予め選択されたポリ ヌクレオチドを増幅させるための装置であって；試料流入ボートと； 該流入ボートから伸びる試料流動チャンネル；および該流動チャンネルと流体連 結し、重合反応用の試薬を含有するポリヌクレオチド重合反応チャンバー；より なるメンスケール流動システムれとを形成するよう微細加工された固体基材；な らびに該チャンバーの内容物を熱調整し、温度をコントロールして該予め選択さ れたポリヌクレオチドを増幅させるための手段よりなる該装置。
2. ２．該重合反応がポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）であって、該ＰＣＲチャンバー が該予め選択されたポリヌクレオチド、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、 該試料ポリヌクレオチドとハイブリダイズする第一のプライマー、および該ポリ ヌクレオチドに相補的な配列とハイブリダイズする第二のプライマーよりなり、 該第一のプライマーおよび第二のプライマーが重合反応のポリヌクレオチド生成 物の末端を形成し；および 熱調整するための該手段が、二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖のポリヌクレオチ ドに分離し、該プライマーを−本鎖ポリヌクレオチドの相補領域にアニーリング するようコントロールされた温度と、該プライマーの間にポリヌクレオチドを合 成するようコントロールされた温度との間に、該チャンバー中の内容物を、熱循 環して該予め選択されたポリヌクレオチドを増幅させるための手段よりなる請求 項１記載の装置。
3. ３．該ＰＣＲチャンバーが： 二本鎖ポリヌクレオチドを分離する温度の第一のセクション；該プライマーを− 本鎖ポリヌクレオチドの相補領域にアニーリングする温度の第二のセクション； 該第一のセクションおよび第二のセクションの間に配された流路よりなり；ここ に、該装置が、 該チャンバーの内容物を、少なくとも該第一のセクションおよび第二のセクショ ンの間に繰り返し輸送して、該ポリヌクレオチドの複数の増幅循環を行うための 手段を含有する請求項２記載の装置。
4. ４．該第一のセクションが二本鎖ポリヌクレオチドを分離する温度にコントロー ルされ；かつ、 該第二のセクションおよび該流路が該第一のセクションから離れて位置し、それ により、該第一のセクションから該第二のセクションヘの該チャンバーの内容物 の輸送の間に、プライマーを−本鎖ポリヌクレオチドにアニーリングするのに十 分な温度まで試料か受動的に冷却される請求項３記載の装置。
5. ５．さらに、該第一のセクションおよび第二のセクションを別々に熱コントロー ルするための手段よりなる請求項３記載の装置。
6. ６．さらに、該第一のセクションを熱コントロールするための手段よりなる請求 項４記載の装置。
7. ７．該熱コントロールするための手段が、電気抵抗手段よりなる請求項５または ６記載の装置。
8. ８．該熱コントロールするための手段が、該ＰＣＲチャンバーに電磁気エネルギ ーを供給するための手段よりなる請求項５または６記載の装置。
9. ９．該基材が、さらに、該ＰＣＲチャンバーと流体連絡する第二のポートよりな る請求項２記載の装置。
10. １０．さらに、該増幅されたポリヌクレオチドを検出するための手段よりなる請 求項１記載の装置。
11. １１．該検出するための手段が、ポリヌクレオチド凝集により引き起こされる該 流路中の液体の流動に対する抵抗を検出するための手段よりなる請求項１０記載 の装置。
12. １２．該増幅されたポリヌクレオチドを検出するための該手段が、該反応チャン バーと流体連絡した該基材中に配されたメンスケール検出領域よりなり；および 該装置が さらに、該反応チャンバーを通しての、該増幅されたポリヌクレオチドを該検出 領域に輸送する流動を誘起させるための手段を含有する請求項１０記載の装置。
13. １３．該検出領域が、該増幅されたポリヌクレオチドに検出可能に結合しうるポ リヌクレオチド・プローブを含有する請求項１２記載の装置。
14. １４．該ポリヌクレオチド・プローブか、磁性ビーズ上に固定化されている請求 項１３記載の装置。
15. １５．該検出領域が、複数の第二の流動チャンネルに通じる分岐部よりなる、該 流動チャンネルに流体連絡したフラクタル領域よりなる請求項１４記載の装置。
16. １６．該試料が細胞試料であって、該装置が、さらに：該メソスケール流動シス テム中の該反応チャンバーに流体連絡し、細胞試料を溶解するための細胞溶解手 段；および 該細胞溶解手段、次いで、該反応チャンバーへの該試料の流動を誘起するための 手段よりなる請求項１記載の装置。
17. １７．さらに、：該細胞溶解手段から上流にあって、該細胞集団に結合しうる結 合部位よりなる、予め選択された細胞集団を選択的に捕捉すための細胞分離領域 ；および 該分離領域内において； 最初は、該試料からの該細胞集団を分離するための該結合部位によって、試料中 の該細胞集団を捕捉するのに十分に遅い流速；次いで、二番自に、該分離された 細胞集団を該分離領域から該溶解領域へ放出させるのに十分に速い流速にて流動 を誘起するための手段よりなる請求項１６記載の装置。
18. １８．該固体基材が、微細加工されたシリコンよりなる請求項１記載の装置。
19. １９．さらに、該基材と組み合わせて用いるための器具よりなり、該器具が；該 基材を保持するための手段；および 該基材上の流入ポートと接合する流体流入手段よりなる請求項１記載の装置。
20. ２０．さらに、該保持手段に保持させた場合に、該基材の流動システムを通して 流体を通過させるためのポンプ手段よりなる請求項１９記載の装置。
21. ２１．該器具が、さらに、試薬溜め、および、試薬を該流動システムにデリバリ ーするための手段よりなる請求項２０記載の装置。
22. ２２．該器具が、該反応チャンバーを加熱するための手段を含有する請求項１９ 記載の装置。
23. ２３．さらに、該基材と組み合わせて用いるための器具よりなり、該器具が：該 基材を支持するための手段；および 該基材中の該メンスケール流動システムの内容物を観察するための光学的手段よ りなる請求項１０記載の装置。
24. ２４．該光学的手段が拡大光学装置およびビデオカメラよりなり、該器具が、さ らに： 該装置の角度および位置を手動的に調整するための傾斜機構；および該流動シス テムの内容物を観察するためのビデオ・スクリーンよりなる請求項２３記載の装 置。
25. ２５．ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、試料中の予め選択され たポリヌクレオチドを増幅させるための装置であって：試料流入ポートと； 該流入ポートから伸びる試料流動チャンネル；および該流動チャンネルに流体連 絡し、該予め選択されたポリヌクレオチドおよびＰＣＲ試薬を受けるためのＰＣ Ｒチャンバーよりなるメンスケール流動システムとを形成するよう微細加工され た固体基材；ならびに該チャンバーの内容物を熱循環させ、それにより、各々の 循環において、温度をコントロールして二本鎖ポリヌクレオチドを分離させて、 ポリヌクレオチドを合成し、それによって該予め選択されたポリヌクレオチドを 増幅させるための手段よりなる該装置。
26. ２６．さらに、該流動システムが、該ＰＣＲチャンバーと流体連絡する検出チャ ンバーよりなる請求項２５記載の装置。
27. ２７．該ＰＣＲチャンバーが； 二本鎖ポリヌクレオチドを分離させる温度の第一のセクション；一本鎖ポリヌク レオチドをアニーリングさせ、ポリヌクレオチドを重合し増幅させる温度の第二 のセクション； 該第一のセクションおよび第二のセクションの間に配された流路；ならびに該チ ャンバーの内容物を、該第一のセクションおよび第二のセクションの間に繰り返 し輸送して該ポリヌクレオチドの複数の増幅循環を行うための手段よりなる請求 項２５記載の装置。
28. ２８．さらに、該基材と組み合わせて用いるための器具よりなり、該器具が：該 基材上の流入ポートに接合した流体流入手段よりなる、該基材を支持するための 収容部位よりなる請求項２５記載の装置。
29. ２９．基材に加工された電気接触部を含有する装置であって：該収容部位が、さ らに、該基材中にて該電気接触部と接合させるための電気コネクションを含有す る請求項２８記載の装置。
30. ３０．該器具が、さらに、該保持手段に保持された場合に、該基材の該流動シス テムを通して流体を通過させるためのポンプ手段よりなる請求項２８記載の装置 。
31. ３１．該流動システムが、さらに、該ＰＣＲチャンバーと流体連絡した検出領域 よりなる請求項２９記載の装置。
32. ３２．該器具が、さらに、電源よりなる請求項２８記載の装置。
33. ３３．ポリヌクレオチド重合反応を行うことによって試料中の予め選択されたポ リヌクレオチドを増幅させるための方法であって：（ｉ）試料流入ポートと； 該流入ポートから伸びる試料流動チャンネル；および該流動チャンネルと流体連 絡したポリヌクレオチド重合反応チャンバーよりなるメンスケール流動システム とを形成するように微細加工された固体基材；ならびに 該予め選択されたポリヌクレオチドを増幅させるために、該チャンバーの内容物 をコントロールされた温度に熱調整するための手段；よりなる装置を供し、 （ｉｉ）該試料ポリヌクレオチドおよび重合反応に要する試薬を、該流入ポート および該メンスケール流動システムを通してデリバリーし、次いで、（ｉｉｉ） 該チャンバーの内容物を熱コントロールして該ポリヌクレオチドを重合させす ことを特徴とする該方法。
34. ３４．該重合反応がポメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）であって；工程（ｉ）で、該熱 コントロールするための該手段が、該チャンバーの内容物を熱循環するための手 段よりなり； 工程（ｉｉ）が、：ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、該試料ポリヌクレオ チドとハイブリダイズする第一のプライマー、および該ポリヌクレオチドに相補 的な配列とハイブリダイズする第の二プライマーを該ＰＣＲチャンバーに添加す る工程を含有し、ここで、該第一のプライマーおよび第二のプライマーは重合反 応のポリヌクレオチド生成物の末端を形成し；および工程（ｉｉｉ）が、該チャ ンバーの内容物を熱循環させる工程を含有し、それにより、各々の循環において 、温度をコントロールして、二本鎖ポリヌクレオチドを分離し、それにより、す ることにより一本鎖ポリヌクレオチドを生成させ、一本鎖ポリヌクレオチドの相 補領域にアニーリングさせて該プライマーの間にポリヌクレオチドを合成し重合 させる請求項３３記載の方法。
35. ３５．該ＰＣＲチャンバーが： 二本鎖ポリヌクレオチドを分離する温度の第一のセクション；一本鎖ポリヌクレ オチドの相補領域をアニーリングさせ、ポリヌクレオチドを重合させ増幅させる 温度の第二のセクション；該第一のセクションおよび第二のセクションの間に配 された流路よりなり、該装置が、さらに、該チャンバーの内容物を、該第一のセ クションおよび該第二のセクションの間に繰り返し輸送するための手段を含有し ；工程（ｉｉｉ）が、該チャンバーの内容物を該第一のセクションおよび該第二 のセクションの間に繰り返し輸送させてポリヌクレオチドの複数の増幅循環を行 う工程を含有する； ことを特徴とする請求項３４記載の方法。
36. ３６．該第一のセクションを二本鎖ポリヌクレオチドを分離する温度にコントロ ールし；および 該チャンバーの内容物の該第一のセクションから該第二セクションヘの輸送に際 し、該試料がアニーリングし重合する温度まで実質的に冷却されるように、該第 二のセクションおよび該流路を該第一のセクションから離れて位置させ；ならび に 工程（ｉｉｉ）が、該チャンバーの内容物を該第一のセクションおよび該第二の セクションの間に繰り返し輸送させて該ポリヌクレオチドを重合させる工程を包 含する請求項３５記載の方法。
37. ３７．該装置が、さらに、増幅させたポリヌクレオチドを検出するための手段を 包含し、さらに、 （ｉｖ）該増幅させたポリヌクレオチドを検出することよりなる請求項３３記載 の方法。
38. ３８．該検出手段が、ポリヌクレオチド凝集により引き起こされる該チャンバー 内の液体の流動の抵抗を検出するための手段よりなり；および工程（ｉｖ）が、 流動に対する抵抗を該検出手段で検出する工程を包含する請求項３７記載の方法 。
39. ３９．該増幅させたポリヌクレオチドを検出するための該手段が、該基材の中に 該反応チャンバーと流体連絡して配されたメンスケール検出領域よりなり；およ び 該装置が、さらに、該反応チャンバーを通る流動を誘起して、該増幅させたポリ ヌクレオチドを該検出領域へ輸送するための手段を含有し；ならびに工程（ｉｖ ）が、該試料を該反応チャンバーから該検出領域へ該輸送手段でデリバリーし、 次いで、該増幅させたポリヌクレオチドを該検出領域中で検出する工程を包含す る請求項３７記載の方法。
40. ４０．該検出領域が、該試料ポリヌクレオチドに検出可能に結合できるポリヌク レオチド・プローブを包含し；および ここで、工程（ｉｖ）において、該試料ポリヌクレオチドの該プローブヘの結合 を検出する請求項３９記載の方法。
41. ４１．該検出領域が、該流動チャンネルと流体連絡した、複数の第二の流動チャ ンネルに通ずる分岐部よりなるフラクタル流動領域よりなり；およびここで、工 程（ｉｖ）において、該フラクタル流動領域を通しての試料流体の流動を検出す る請求項３９記載の方法。
42. ４２．該試料が細胞試料であって、該装置が、さらに：試料が反応チャンバーに デリバリーされる前に細胞試料を溶解させるための、該反応チャンバーと流体連 絡した該メンスケール流動システム中の細胞溶解手段；および 該細胞溶解手段を通しての該反応チャンバーへの該試料の流動を誘起させるため の手段よりなり；ならびに 工程（ｉｉ）が、該試科を該溶解手段へ、次いで、該反応チャンバーへとデリバ リーする工程を包含する請求項３３記載の方法。
43. ４３．該装置が、さらに： 予め選択された細胞集団を選択的に捕捉するための、該細胞溶解手段の前にあっ て、該細胞集団へ結合できる結合部位よりなる細胞分離領域よりなり；および工 程（ｉｉ）が、該細胞試料を該細胞溶解手段へデリバリーする前に第一に、該試 料中の該細胞集団が、該結合部位によって捕捉されて該試料から該細胞集団を分 離するのに十分な遅い流速；次いで、第二に、該分離された細胞集団を、該領域 から該細胞溶解手段へ放出させるのに十分に高流速で、 該試料を該細胞分離領域にデリバリーする工程を包含する請求項４２記載の方法 。