JP2001004628A - 免疫分析装置と免疫分析方法 - Google Patents

免疫分析装置と免疫分析方法

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JP2001004628A JP11173041A JP17304199A JP2001004628A JP 2001004628 A JP2001004628 A JP 2001004628A JP 11173041 A JP11173041 A JP 11173041A JP 17304199 A JP17304199 A JP 17304199A JP 2001004628 A JP2001004628 A JP 2001004628A
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Takehiko Kitamori
武彦 北森
Hiroko Kimura
博子 木村
Manabu Tokeshi
学 渡慶次
Norikazu Sato
記一 佐藤
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 微量試料で、簡便に短時間で、高精度な免疫
分析を可能とする。 【解決手段】 反応固相としての直径１ｍｍ以下の固体
微粒子（２）とともに、この固体微粒子（２）の径より
も大きい断面積を有するマイクロチャンネル反応槽部
（３）と、前記固体微粒子（２）の径よりも小さい断面
積を有するマイクロチャンネル分離部（４）とを備え、
抗原および標識抗体を別々に前記反応槽部（３）へと導
く導入部もしくはマイクロチャンネル流入部（５）
（６）を有している免疫分析マイクロチップを構成し、
これを用いて分析する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、免疫分析
装置とこれを用いた分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】従来より、各種の抗原−抗体
反応による免疫分析法が知られており、この分析のため
の簡便化手段としての分析キット類についての検討が進
められてきてもいる。しかしながら、従来一般的な方法
においては、免疫分析には複雑な工程と数日間にわたる
時間が必要とされる等の問題があり、また、多くの場合
には、蛍光色素による標識が必要とされていることか
ら、この蛍光色素標識による試料ダメージの発生が避け
られない等の問題もあった。
【０００３】このため、従来より、生体高分子等の免疫
分析法については、反応・分離検出を簡便な手段によっ
て短時間で高精度で行うことができ、しかも試料にダメ
ージを与えることもない分析方法の実現が望まれてい
た。このような状況において、ガラス等の基板（以下マ
イクロチップと呼ぶ）上に化学システムを集積化する試
みは操作の簡便化・自動化による分析時間の短縮などの
メリットをもたならすと期待され、μ−ＴＡＳと称され
近年盛んに行われてきている。この出願の発明者も、熱
レンズ顕微鏡による超微量分析や微小空間のサイズ効果
として迅速分子輸送に分子拡散力が有効なことなどに注
目し、独自の集積化の研究を進めているところである。
しかしながら、免疫分析については、ＤＮＡ解析と同様
に電気浸透・電気泳動を利用したμ−ＴＡＳの重要な対
象として期待され、高度な構造を持つ様々な形状のチッ
プが開発されてきているが、これまでのところ、実際に
マイクロチップ内で抗原−抗体反応をさせた例はほとん
ど報告されていないのが実情である。
【０００４】そこでこの出願の発明は、以上のとおりの
従来技術の限界を超えて、実際にマイクロチップ内にお
ける抗原−抗体反応を可能として免疫分析を実施するこ
とのできる新しい免疫分析装置と、これを用いた分析方
法を提供することを課題としている。そして、この出願
の発明は、このような新しい分析装置と新しい分析方法
によって、反応・分離検出を簡便な手段によって短時間
で高精度で行い、しかも試料にダメージを与えることも
ないようにする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、第１には、反応固相とし
ての直径１ｍｍ以下の固体微粒子とともに、この固体微
粒子の径よりも大きい縦断面積を有するマイクロチャン
ネル反応槽部と、前記固体微粒子の径よりも小さい縦断
面積を有するマイクロチャンネル分離部と、抗原および
標識抗体を別々に前記反応槽部へと導く導入部もしくは
マイクロチャンネル流入部とを有しているマイクロチッ
プとを備えていることを特徴とする免疫分析装置を提供
する。
【０００６】また、第２には、標識抗体とは別の抗体の
ためのマイクロチャンネル流入部を有している免疫分析
装置を、第３には、固体微粒子はガラスビーズもしくは
高分子ビーズである請求項１または２の免疫分析装置を
提供する。そして、この出願の発明は、第４には、前記
第１ないし第３のいずれかのマイクロチップによる免疫
分析方法であって、反応固相としての固体微粒子をマイ
クロチャンネル反応槽部に装入し、マイクロチャンネル
流入部より導入した抗原および標識抗体の固体微粒子上
での反応を行い、未反応物をマイクロチャンネル分離部
で分離し、光熱変換分析により分析することを特徴とす
るマイクロチップ免疫分析方法を提供し、第５には、第
一抗体とともに、第二抗体としての標識抗体を反応槽部
へと導く方法を、第６には、標識抗体を金コロイド標識
抗体とする方法を、第７には、光熱変換分析が２μｍ以
下の高空間分解能の熱レンズ顕微鏡、蛍光分析あるいは
化学発光による分析である分析方法も提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】この出願の発明は、上記のとおり
の特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態につ
いて説明する。まず、この発明の免疫分析装置である
が、その構成はたとえば図１に沿って例示説明すること
ができる。
【０００８】たとえば図１に示したように、ガラス、シ
リコン等の基板、より好ましくは透明なガラス等の基板
（１）において、この発明の免疫分析マイクロチップの
場合には、反応固相としての直径１ｍｍ以下の固体微粒
子（２）とともに、この固体微粒子（２）の径よりも大
きい縦断面積を有するマイクロチャンネル反応槽部
（３）と、前記固体微粒子（２）の径よりも小さい縦断
面積を有するマイクロチャンネル分離部（４）とを備
え、抗原および標識抗体を別々に前記反応槽部へと導く
導入部もしくはマイクロチャンネル流入部（５）（６）
を有している。
【０００９】また、図１の例においては、第二抗体とし
ての標識抗体の反応槽部（３）への導入のためのマイク
ロチャンネル流入部（６）とともに、第一抗体の導入の
ためのマイクロチャンネル流入部（７）、並びにバッフ
ァー液や洗浄液の導入のためのマイクロチャンネル流入
部（８）を備えており、各々のマイクロチャンネル流入
部（５）（６）（７）（８）の端部には、抗原、標識抗
体（第二抗体）、第一抗体、そして洗浄液の注入穴部
（５Ａ）（６Ａ）（７Ａ）（８Ａ）が設けられてもい
る。
【００１０】そして、図１の例では、マイクロチャンネ
ル分離部（４）の端部には、廃液部（４Ａ）が設けられ
ている。固体微粒子（２）は、免疫抗原−抗体反応のた
めの反応固相としての役割を果たすものであって、たと
えばガラスビーズ、あるいはポリスチレン等の高分子ビ
ーズ等が用いられることになる。この固体微粒子（２）
は、この発明のマイクロチップにおいては、直径が１ｍ
ｍ以下、たとえば１５〜８５μｍ、さらには直径４０〜
６５μｍのものとして用いられる。
【００１１】マイクロチャンネル反応槽部（３）の大き
さは、その縦断面積、より具体的には、半球状、あるい
は湾曲状の穴部である場合、垂直方向の最大断面積が前
記の固体微粒子（２）の直径よりも大きく、一方、マイ
クロチャンネル分離部（４）の流路断面積、つまり図１
のα−α位置での断面積が固体微粒子（２）の直径より
も小さいことがこの発明においては要件となっている。
【００１２】たとえば、より具体的には、マイクロチャ
ンネル反応槽部（３）の大きさは、半球状の穴部とした
場合には、たとえばその半径が１００μｍ以上、より好
ましくは１５０μｍ以上とすることが考慮される。ま
た、マイクロチャンネル分離部（４）はたとえば、深さ
が１０μｍ以下、幅１０μｍ以下とすることが考慮され
る。このようにすることによって、反応固相としての固
体微粒子（２）は、マイクロチャンネル分離部（４）に
流入することはなく、せき止められることになる。そし
て未反応物だけが、マイクロチャンネル分離部（４）に
流入して分離されていることになる。また、必要に応じ
て、固体微粒子（２）から脱着された反応生成物のみが
分離されることになる。
【００１３】抗原の導入のためのマイクロチャンネル流
入部（５）は必ずしも図１のようである必要はなく、直
接的に抗原を反応槽部（３）に導入するようにしてもよ
いし、あるいは、あらかじめ抗原を吸着させた状態の固
体微粒子（２）をマイクロチャンネル反応槽部に導入す
るようにしてもよい。マイクロチャンネル流入部（５）
（６）（７）（８）については、たとえば、深さを１５
０μｍ以下、幅を３００μｍ以下程度のものとして構成
することができる。抗原や抗体がマイクロチャンネル反
応槽部（３）に流入できる大きさの断面積をもつものと
すればよい。
【００１４】この発明の免疫分析マイクロチップは、基
板（１）の表面に対して以上の構成を形成したものとし
てもよいし、あるいは、多層構造として、たとえば図２
に、図１のα−α部の断面を例示したように、マイクロ
チャンネル分離部４等の形成した基板（１）の表面に保
護プレート（１１）を、また、さらに必要に応じて裏面
に補強のための支持プレート（１２）を積層した構造と
してもよい。この図２ような積層体の構造の場合には、
保護プレート（１１）には、前記の反応槽部（３）、注
入穴部（５Ａ）（６Ａ）（７Ａ）（８Ａ）、廃液部（４
Ａ）の相当位置に開口が設けられているものとする。
【００１５】いずれの場合においてもこの発明の免疫分
析マイクロチップによって、微量の試料等の使用によっ
て、簡便に短い反応時間で免疫分析が可能となる。免疫
分析の方法としては、この発明においては、反応固相と
しての固体微粒子（２）をマイクロチャンネル反応槽部
（３）に導入し、導入部もしくはマイクロチャンネル流
入部（５）（６）より導入した抗原および標識抗体、さ
らに必要によりマイクロチャンネル流入部（７）より導
入した抗体の固体微粒子（２）上での反応を行い、未反
応物をマイクロチャンネル分離部（４）で分離し、光熱
変換分析により分析することを可能としている。
【００１６】標識抗体としては、代表的には、金コロイ
ド標識抗体が適当なものとして例示される。反応物は、
固体微粒子（２）上に吸着され、未反応物のみがマイク
ロチャンネル分離部（４）にて分離されるか、反応生成
物は固体微粒子（２）より脱着されてマイクロチャンネ
ル分離部（４）にて分離されることになる。
【００１７】光熱変換分析については、たとえばその代
表例としてはこの出願の発明者らがすでに提案している
熱レンズ顕微鏡による分析がある。より好ましくは、２
μｍ以下の高空間分解能の熱レンズ顕微鏡による分析で
ある。この分析は、反応生成物が吸着されている固体微
粒子（２）に対して行われもよいし、マイクロチャンネ
ル分離部（４）に対して行われるようにしてもよい。ま
た、熱レンズ顕微鏡による分析だけでなく蛍光分析でも
よいし、化学発光分析等が採用されてもよい。
【００１８】以上のとおりのこの出願の発明によって、
反応・分離検出を簡便に、短時間で、しかも高精度で行
うことができ、しかも従来の方法のように、試料に対し
てダメージを与えることもない。そこで以下に実施例を
示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。
【００１９】
【実施例】（実施例１）モデル試料として局所免疫やス
トレス関連物質として知られるｓｌｇＡを選定し、Ｂ／
Ｆ分離操作などの集積化について検討した。すなわち、
ヒトｓｌｇＡを吸着させた直径４３〜６０μｍのガラス
微粒子やポリスチレン微粒子をそれぞれマイクロチャン
ネル反応槽部内に導入して堰き止め、反応固相とした。
次に金コロイド標識抗体をマイクロチャンネル流入部を
通じて反応槽部に流入させ、抗原抗体反応を行った。そ
の後、リン酸バッファーをマイクロチャンネル流入部を
通じて送液し、未反応残さの分離（Ｂ／Ｆ分離）を行っ
た。検出には熱レンズ顕微鏡を用いた。
【００２０】実験では、深さ１００μｍ、幅２００μｍ
のマイクロチャンネル流入部を石英ガラス基板内に作製
し、ＦＡＢ（Fast Atom Beam) で深さ５μｍのさらに微
細なチャンネルを加工してマイクロチャンネル分離部を
形成し、また、半径約１ｍｍの反応槽部を加工してマイ
クロチップとした。このマイクロチップでは、ＦＡＢ加
工の部分だけチャンネル深さが浅く、反応固槽として用
いるビーズをせき止められる構造を意図したものであ
る。
【００２１】なお、このマイクロチップにおいては多層
構造は採用していない。反応を行う、Ｂ／Ｆ分離等の条
件を最適化するための実験をパルク量で行った。次に最
適化した条件下でチャンネル内に堰き止め構造の反応槽
部分に微粒子を導入しておき、ＰＢＳバッファーを送液
してそのままＢ／Ｆ分離した。その後、この微粒子上に
結合した標識金コロイドを熱レンズ顕微鏡で測定した。
比較のため、通常用いられている方法でＢ／Ｆ分離した
微粒子を同じチップ内に導入して同様に測定した。その
結果、ｓｌｇＡ濃度に対して信号強度に対する検量曲線
が得られ、マイクロチャンネル内でＢ／Ｆ分離を行った
ビーズと、通常法でＢ／Ｆ分離を行ったビーズとでは差
異がみられないことを確認した。以上より、マイクロチ
ャンネルの微小空調を利用した免疫分析が可能であるこ
とを示した。 （実施例２）実施例１において、ヒトｓｌｇＡをマイク
ロチャンネル流入部より反応槽部に導入し、これをガラ
ス微粒子に吸着させ、次いで同様に反応を行わせ、熱レ
ンズ顕微鏡により分析した。
【００２２】その結果、通常のバルク量の分析に比べて
はるかに微量の試料で短時間で、同様のＢ／Ｆ分離が可
能であることを確認した。
【００２３】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
説明によって、従来技術の限界を超えて、実際にマイク
ロチップ内における抗原−抗体反応を可能として免疫分
析を実施することができる。そして、このような新しい
マイクロチップと新しい分析方法によって、反応、分離
検出を簡単な手段によって短時間で高精度で行い、しか
も試料にダメージを与えることもない分析が実現され
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のマイクロチップを例示した斜視図で
ある。
【図２】多層構造のものを例示した断面図である。
【符号の説明】
１ 基板 ２ 固体微粒子 ３ マイクロチャンネル反応槽部 ４ マイクロチャンネル分離部 ４Ａ 廃液部 ５，６，７，８ マイクロチャンネル流入部 ５Ａ，６Ａ，７Ａ，８Ａ 注入穴部 １１ 保護プレート １２ 支持プレート
フロントページの続き (72)発明者 佐藤 記一 東京都板橋区中台３−27−Ｇ−2103 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FA16 FB03 FB07 FB12 FB13

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 反応固相としての直径１ｍｍ以下の固体
    微粒子とともに、この固体微粒子の径よりも大きい縦断
    面積を有するマイクロチャンネル反応槽部と、前記固体
    微粒子の径よりも小さい縦断面積を有するマイクロチャ
    ンネル分離部と、抗原および標識抗体を別々に前記反応
    槽部へと導く導入部もしくはマイクロチャンネル流入部
    とを有しているマイクロチップとを備えていることを特
    徴とする免疫分析装置。
  2. 【請求項２】 標識抗体とは別の抗体のためのマイクロ
    チャンネル流入部を有している請求項１の免疫分析装
    置。
  3. 【請求項３】 固体微粒子はガラスビーズもしくは高分
    子ビーズである請求項１または２の免疫分析装置。
  4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかの装置によ
    る免疫分析方法であって、反応固相としての固体微粒子
    をマイクロチャンネル反応槽部に装入し、マイクロチャ
    ンネル流入部より導入した抗原および標識抗体の固体微
    粒子上での反応を行い、未反応物をマイクロチャンネル
    分離部で分離し、光熱変換分析により分析することを特
    徴とするマイクロチップ免疫分析方法。
  5. 【請求項５】 第一抗体とともに、第二抗体としての標
    識抗体を反応槽部へと導く請求項４の分析方法。
  6. 【請求項６】 標識抗体を金コロイド標識抗体とする請
    求項４または５の分析方法。
  7. 【請求項７】 光熱変換分析が２μｍ以下の高空間分解
    能の熱レンズ顕微鏡、蛍光分析、あるいは化学発光によ
    る分析である請求項４ないし６のいずれかの分析方法。
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