JPWO2005098022A1 - 細菌計数方法及び細菌計数装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、溶媒の流れの中で細菌から細菌内ＡＴＰを抽出し、抽出した細菌内ＡＴＰと細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液とを接触させてその接触に伴って発生する光信号を発光液と細菌内ＡＴＰとの接触部あるいはその下流に備えられた少なくとも１個以上の光検出手段で測定し、測定した光信号の強度に基づいて細菌を計数する細菌計数方法であって、閾値を設定し、測定される光信号の強度が前記閾値を上回った数を細菌の数として細菌を計数することを特徴とする細菌計数方法である。本発明によれば、迅速、且つ簡便で、計数精度を高くすることができる細菌計数方法、及び細菌計数装置を提供することができる。

Description

本発明は、細菌計数方法と細菌計数装置に関する。

従来、細菌の計数方法として、細菌を増殖させ、シャーレ中のコロニー（集落）が数１００個になったものを目視あるいはコロニーカウンターで計数する培養法が知られている。

また、培養液に懸濁した細菌を細管に通し、個別の細菌にレーザービームを照射し、細菌の性質（大きさやＤＮＡ含有量等）を光学的パラメータに変換して識別するフローサイトメトリ（ＦＣＭ）という方法も知られている。

更に、細菌内ＡＴＰとルシフェリン−ルシフェラーゼとの反応による発光強度を細菌数と予め関連付けておき、その発光強度から細菌数を推測することにより、細菌数を測定する方法が開示されている（特許文献１又は特許文献２参照）。

また、生きている細菌（生菌）と死んでいる細菌（死菌）の両者及び死菌のＤＮＡにそれぞれ別の蛍光性色素を付加して蛍光染色を行い、それぞれの蛍光性色素の個数を光学的に計測することで、細菌数（ここでは生菌数）を測定する方法が開示されている（特許文献３参照）。
特開平０６−２３７７９３号公報 特開２０００−１５７２９５号公報 特開２００１−２８６２９６号公報

しかしながら、従来の培養法においては、細菌を増殖させるのに数日を要し、迅速な細菌計数ができないという問題があった。従って、従来の培養法は、特に食品検査のように検査結果によって製品の出荷可否を早く判断したい場合には不都合な計数方法であった。

また、ＦＣＭは、装置が高価な上、並列計測できないため計数のスループットが低いという欠点があり、医療、バイオの研究所で限定的に使用されているに過ぎなかった。

一方、細菌内ＡＴＰによる細菌計数法は、迅速性と簡便性を備えたものであり、上記問題点は解決しているが、この方法では下記の理由から計数精度が低いという問題があった。
（１）菌種によって、保有するＡＴＰの量が異なるため、検体に２種類以上の細菌が含まれている場合には計数結果の精度が悪くなる。
（２）同じ菌種でもその栄養状態によって保有ＡＴＰの量は大きく異なる。従って検体に含まれている菌の種類が１つでも最大１０００％程度の誤差が生じる。

また、上記ＤＮＡへの蛍光染色により細菌を計数する方法ではバックグラウンドのＤＮＡだけを効率的に除去する現実的な手段が無いため、細菌以外の生体由来の細胞が存在する場合、計数精度が落ちるという欠点がある。

そこで、本発明は迅速、且つ簡便で、計数精度を高くすることができる細菌計数方法、及び細菌計数装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の細菌計数方法は、溶媒の流れの中で細菌から細菌内ＡＴＰを抽出し、抽出した細菌内ＡＴＰと前記細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液とを接触させてその接触に伴って発生する光信号を前記発光液と前記細菌内ＡＴＰとの接触部あるいはその下流に備えられた少なくとも１個以上の光検出手段で測定し、測定した前記光信号の強度に基づいて細菌を計数する細菌計数方法であって、閾値を設定し、測定される光信号の強度が前記閾値を上回った場合にその数を細菌の数として細菌を計数することを特徴とする。

本発明の細菌計数方法によれば、細菌内ＡＴＰと発光液との接触に伴って発生する光信号の強度を光検出手段で測定するときに閾値を設定しているため、光の拡散や乱反射によるノイズの検出を除くことができ、精度に優れた計数測定をすることができる。また、本発明の細菌計数方法によれば、測定された光信号に基づいて細菌が計数されるため、迅速且つ簡便に細菌数を測定することができる。更に、細菌の発光強度は種類やその栄養状態によって変化する。このような場合でもこの細菌計数方法では、閾値の適切な設定によって細菌を計数することが可能である。

また、閾値を細菌内ＡＴＰの抽出を行わない状態で測定された光信号の強度に基づいて設定することが好ましい。細菌内ＡＴＰの抽出を行わない状態で光信号を測定すれば、バックグラウンドの光信号の強度を把握することができ、更に精度に優れた計数測定をすることができる。

また、細菌の種類に応じて閾値を設定することが好ましい。上述したように、一般に細菌の種類によって発光強度が異なる。したがって、特に発光強度が弱い細菌も含めて計数測定したい場合は、該閾値を下げることによって、該細菌を計数測定することができる。

更に、上記閾値を前記細菌の種類に応じて複数設定することが好ましい。この場合、細菌の種類が多数であっても、閾値を適切な値に設定することで、多数の細菌を識別しながら計数を行うことができる。

また、前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出する前に、分解液により細菌のフロックを分解することが好ましい。細菌内ＡＴＰを抽出する前に細菌のフロックを分解することにより、複数の細菌を１つの細菌として計数することを防止することができる。したがって、細菌数と閾値以上の発光数とを正確に対応させることができ、計数精度をより向上させることができる。

また、前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出する前に、希釈液により細菌同士の間隔を広げることが好ましい。複数の細菌による光が同時に光検出器によって検出されるとき、同時に検出範囲に入ると計数を的確に行うことが困難となるおそれがあるが、細菌内ＡＴＰを抽出する前に細菌同士の間隔を広げることによって、斯かるトラブルを防ぐことができる。したがって、計数精度をより向上させることができる。

更に、前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出する前に、ＡＴＰ除去剤により遊離ＡＴＰを除去し、前記除去後に不活性化液によりＡＴＰ除去剤を不活性化させることが好ましい。この方法によれば、検体液に含まれるおそれのある遊離ＡＴＰを細菌内ＡＴＰを抽出する前に除去することができるため、所望の細菌内ＡＴＰのみを計数することができる。即ち遊離ＡＴＰは計数されない。したがって、計数精度をより向上させることができる。またＡＴＰ除去剤は、長時間細菌内ＡＴＰと接触していると、細菌内ＡＴＰを破壊するおそれがあるが、細菌から細菌内ＡＴＰが抽出された後は、不活性化液によりＡＴＰ除去剤が不活性化されるため、計数対象となる細菌内の本来の細菌内ＡＴＰを的確に計数することが可能となる。

更にまた、前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出した後に、増幅液によりＡＴＰを増幅させることが好ましい。ＡＴＰを増幅する反応系は例えば特開２００１−２９９３９０号公報（発明の名称「ＡＴＰを連鎖的に増幅させる方法及び該方法を利用して極微量のＡＴＰを検査する方法」）に開示されている。このように細菌内ＡＴＰを抽出した後に細菌内ＡＴＰを増幅させれば、低コストで低感度の光検出手段、例えばフォトダイオード、フォトトランジスタ等の使用が可能になる。前記光検出手段は半導体プロセスを用いて、シリコンあるいはガリウム砒素等の基板上に集積度高く形成することができる。すなわち、検出コストが下がると共に光検出手段の集積度が上がることとなる。

また本発明は、細菌から細菌内ＡＴＰを抽出する抽出液、前記細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液及び前記細菌を含む検体液を接触させる接触部と、前記接触部で発生する光信号の強度を測定する光検出手段とを備える細菌計数装置であって、測定した光信号の強度に応じて設定された閾値を、測定される光信号の強度が上回った場合にその数を細菌の数として細菌を計数する制御装置を備えることを特徴とする。

この細菌計数装置によれば、接触部で抽出液、発光液及び検体液が接触され、接触部で発生する光信号の強度が光強度測定装置、すなわち光検出手段によって測定される。そして、測定した光信号の強度に応じて設定された閾値を、測定される光信号の強度が上回った場合にその数を細菌の数として細菌が計数される。このように、細菌内ＡＴＰと発光液との接触に伴って発生する光信号の強度を測定するときに閾値が設定されているため、光の拡散や乱反射によるノイズの検出を除くことができ、精度に優れた計数測定をすることができる。また、本発明の細菌計数装置によれば、測定された光信号に基づいて細菌が計数されるため、迅速且つ簡便に細菌数を測定することができる。更に、細菌の発光強度は、種類やその栄養状態によって変化する。このような場合でもこの細菌計数装置では閾値の適切な設定によって細菌を計数することが可能である。

また上記細菌計数装置は、前記検体液を収容する第１ウェル、前記抽出液を収容する第２ウェル、前記発光液を収容する第３ウェル、細菌内ＡＴＰ及び発光液の反応により発光が生じる発光部、前記第１ウェルと発光部とを接続する第１チャネル、前記第１チャネルと前記第２ウェルとを接続する第２チャネル、及び、前記第１チャネルと前記第３ウェルとを接続する第３チャネルを有するマイクロチャネルチップを備えており、前記第１チャネルのチャネル幅が１ｍｍ以下であり、且つ前記第１チャネルが前記接触部であることが好ましい。

このような構造を有する細菌計数装置によれば、従来技術のような分取作業が不要となり、利便性が増すという効果を有する。すなわち、マイクロチャネルチップ内において、検体液を収容する第１ウェルと発光部とが第１チャネルで接続されているため、検体液を数秒で発光部に送流することができ、第２チャネル及び第３チャネルが第１チャネルに接続されているため、検体液が第１ウェルから発光部に送流される際に、第２ウェルに収容される抽出液と第３ウェルに収容される発光液とを順次第１チャネルに送流することができる。このため、抽出液及び発光液のそれぞれが第１チャネル内で混合されることにより、検体液と抽出液及び発光液との反応を効率よく行うことができる。

更に、第１〜第３チャネルのチャネル幅が１ｍｍ以下であるため、該チャネルにおいて検体液と抽出液及び発光液の拡散、混合が極めて短時間で行われることにより反応を瞬時に行うことができる。その結果、従来は最短でも１〜２時間要していた細菌の計数測定を数秒で行うことができるようになる。

また、マイクロチャネルチップは、細菌のフロックを分解する分解液を収容する第４ウェルと、第１チャネルと第４ウェルとを接続する第４チャネルとを更に備え、第４チャネルが前記第２チャネルよりも上流側で第１チャネルに接続されていることが好ましい。

このようにマイクロチャネルチップ内に分解液を送流する第４チャネルを備えることにより、第４チャネルから分解液を第１チャネルに導入させることができる。すなわち、細菌内ＡＴＰを抽出する前に細菌のフロックを分解することにより、複数の細菌を１つの細菌として計数することを防止することができる。即ち細菌内ＡＴＰを誤って計数することを防止することができる。したがって、細菌数と発光とを正確に対応させることができ、計数精度をより向上させることができる。

また、マイクロチャネルチップは、細菌同士の間隔を広げる希釈液を収容する第５ウェルと、第１チャネルと第５ウェルとを接続する第５チャネルとを更に備え、第５チャネルが第２チャネルよりも上流側で第１チャネルに接続されていることが好ましい。

このようにマイクロチャネルチップ内に希釈液を送流する第５チャネルを備えることにより、第５チャネルから希釈液を第１チャネルに導入させることができる。すなわち、複数の細菌による光が同時に光検出手段によって検出されるとき、同時に検出範囲に入ると計数が困難となるおそれがあるが、細菌内ＡＴＰを抽出する前に細菌同士の間隔を広げることによって、斯かるトラブルを防ぐことができる。したがって、計数精度をより向上させることができる。

また、マイクロチャネルチップは、遊離ＡＴＰを除去するＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容する第６ウェルと、ＡＴＰ除去剤を不活性化する不活性化剤を含む不活性化液を収容する第７ウェルと、第１チャネルと第６ウェルとを接続する第６チャネルと、第１チャネルと第７ウェルとを接続する第７チャネルとを更に備え、第６チャネル及び第７チャネルが第２チャネルよりも上流側で第１チャネルに接続されていることが好ましい。

このようにマイクロチャネルチップ内に除去液を送流する第６チャネルと不活性化液を送流する第７チャネルとを備えることにより、第６チャネルから除去液を、第７チャネルから不活性化液を第１チャネルに導入させることができる。すなわち、検体液に含まれるおそれのある遊離ＡＴＰを細菌内ＡＴＰを抽出する前に除去することができるため、所望の細菌内ＡＴＰのみを計数することができる。即ち遊離ＡＴＰは計数されない。したがって、計数精度をより向上させることができる。またＡＴＰ除去剤は、長時間細菌内ＡＴＰと接触していると、細菌内ＡＴＰを破壊するおそれがあるが、細菌から細菌内ＡＴＰが抽出された後は、不活性化液によりＡＴＰ除去剤が不活性化されるため、計数対象となる細菌内の本来の細菌内ＡＴＰを的確に計数することが可能となる。

また、マイクロチャネルチップは、ＡＴＰを増幅する増幅剤を含む増幅液を収容する第８ウェルと、第１チャネルと第８ウェルとを接続する第８チャネルとを更に備え、第８チャネルが第２チャネルよりも下流側で第１チャネルに接続されていることが好ましい。

このようにマイクロチャネルチップ内に増幅液を送流する第８チャネルを備えることにより、第８チャネルから増幅液を第１チャネルに導入させることができる。すなわち、このように細菌内ＡＴＰを抽出した後に細菌内ＡＴＰを増幅させれば、低コストで低感度の光検出手段、例えばフォトダイオード、フォトトランジスタ等の使用が可能になる。前記光検出手段は半導体プロセスを用いて、シリコンあるいはガリウム砒素等の基板上に集積度高く形成することができる。その結果、検出コストが下がると共に光検出手段の集積度が上がることとなる。

また、マイクロチャネルチップが、抽出液を収容する第２ウェル、発光液を収容する第３ウェル、分解液を収容する第４ウェル、希釈液を収容する第５ウェル、除去液を収容する第６ウェル、不活性化液を収容する第７ウェル、増幅液を収容する第８ウェルを備えており、第２〜第８ウェルの中の少なくとも１つのウェルにそのウェルに対応する前記抽出液、前記発光液、前記分解液、前記希釈液、前記除去液、前記不活性化液又は前記増幅液が収容されていることが好ましい。

予め第２〜第８ウェルにそのウェルに対応する液を収容しておくことで、細菌計数の際に該液を導入する手間が省け、簡単に計数測定を行うことができる。また、導入すべき液を間違えたり、外部から別の菌が侵入したりするトラブルも防ぐことができる。

本発明の細菌計数方法及び細菌計数装置によれば、迅速且つ簡便で、計数精度を高くすることができる。

本発明の細菌計数装置の一実施形態の主要部であるマイクロチャネルチップを示す斜視図である。 図１のマイクロチャネルチップを構成する本体部の厚さ方向に沿った部分断面図である。 図１のマイクロチャネルチップの一部を示す部分平面図である。 光検出装置及び制御装置の構成を示すブロック図である。 図５は、第１チャネル、第２チャネル及び第３チャネルの第１及び第２の態様を示す断面図である。 細菌が２種類存在する場合の発光ピーク強度と閾値との関係を示すグラフである。 本発明の細菌計数装置の他の実施形態を示す概略図である。

符号の説明

１…第１ウェル、２…第２ウェル、３…第３ウェル、４…第４ウェル、５…第５ウェル、６…第６ウェル、７…第７ウェル、８…第８ウェル、９…反応場（発光部）、９ａ…光検出部（光検出手段）、１０…マイクロチャネルチップ、１０ａ…本体部、１０ｂ…カバー、１１…第１チャネル（接触部）、１２…第２チャネル、１３…第３チャネル、１４…第４チャネル、１５…第５チャネル、１６…第６チャネル、１７…第７チャネル、１８…第８チャネル、２１ａ，２１ｂ…チャネル、２３ａ，２３ｂ，２４ａ〜２４ｃ…基材、３５…空洞部、３６…空気抜き孔、４０…制御装置、４１…Ａ／Ｄコンバータ、４２…比較判定部、４３…ＲＡＭ、４４…ＲＯＭ、４５…入出力インタフェース、ｄ…チャネル幅、Ｉ１，Ｉ２…閾値、Ｐ１，Ｐ２…発光ピーク。

以下、図面を参照して本発明に係る細菌計数装置の好適な実施形態について詳細に説明する。

図１は、本発明の細菌計数装置の第１実施形態の主要部であるマイクロチャネルチップを示す斜視図である。図１に示すように、本実施形態の細菌計数装置は、マイクロチャネルチップ１０を有しており、マイクロチャネルチップ１０は矩形平板状の本体部１０ａと、本体部１０ａの表面を覆うカバー１０ｂとを有している。本体部１０ａの一面には、両端部にそれぞれ第１ウェル１と、反応場（発光部）９とが形成されており、第１ウェル１には細菌を含む検体液が収容されるようになっている。また、第１ウェル１と反応場９とは、本体部１０ａの一面に形成される第１チャネル（接触部）１１で接続されており、第１ウェル１に検体液を投入することによって、検体液が第１ウェル１から第１チャネル１１を経て反応場９に送流されるようになっている。

更に本体部１０ａには、第２ウェル２と、第３ウェル３とが第１チャネル１１に沿って形成されており、第２ウェル２には細菌から細菌内ＡＴＰを抽出させる抽出液が、第３ウェル３には、細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液が収容されるようになっている。

また、第２ウェル２は第１チャネル１１の抽出液導入部３１ａと第２チャネル１２によって接続され、第３ウェル３は、反応場９と第３チャネルによって接続されている。第２チャネル１２及び第３チャネル１３は、いずれも本体部１０ａの一面上に形成されている。そして、反応場９は、抽出液導入部３１ａよりも下流側に配置されている。従って、検体液が第１チャネル１１を通じて反応場９に送流される際に、第２ウェル２から第２チャネル１２を通じて抽出液が送流され、更に第３ウェル３から第３チャネル１３を通じて発光液が送流される。送流された抽出液及び発光液は第１チャネル１１内で検出液と混合されて所望の反応が行われる。なお、本実施形態の細菌検出装置において、反応場９は発光液導入部３１ｂを兼ねている。

図２は、本体部１０ａの厚さ方向に沿った部分断面図である。図２において、第１チャネル１１の断面形状は四角形であり、第１チャネル１１のチャネル幅ｄは、１ｍｍ以下である。なお、「チャネル幅」とは、本体部の厚さ方向に対して垂直の方向で且つチャネルの延び方向に対して直交する方向の長さをいう。第１チャネル１１の断面形状が四角形の場合は横の長さをいい、台形や三角形の場合は前記本体部１０ａの厚さ方向において最も大きくなる長さをいう。また、円形や半円形の場合は直径の長さ、楕円形の場合は前記本体部１０ａの厚さ方向において最も長い径の長さをいう。なお、図示しないが、第２チャネル１２及び第３チャネル１３の断面形状も第１チャネル１１と同様であり、チャネル幅も第１チャネル１１と同様である。

これらの第１ウェル１、第２ウェル２及び第３ウェル３は検体液、抽出液及び発光液を収容できるように表面から垂直方向に沿って形成された孔である。

更に、本体部１０ａには、反応場９に対して第１ウェル１と反対側に配置される空洞部３５が形成されている。そして、空洞部３５には、本体部１０ａの縁部まで延びる空気抜き孔３６が形成されている。

更に、上述したカバー１０ｂは、第１ウェル１が検体液を導入するために開放されている以外は、第２ウェル２、第３ウェル３、第１チャネル１１、第２チャネル１２及び第３チャネル１３を密閉するように設けられている。またカバー１０ｂは、透光性であることが好ましい。この場合、各ウェル１，２，３内の液体が第１チャネル１１に導入されかどうかを目視で確認することができ、便利である。

また上記マイクロチャネルチップ１０においては、図３に示すように、反応場９に隣接して光検出部９ａが配置されている。具体的には、光検出部９ａは、本体部１０ａに対してカバー１０ｂと反対側に設けられている。光検出部９ａには、制御装置４０が電気的に接続されている。ここで、制御装置４０について図４を用いて説明する。

図４は、光検出部９ａ及び制御装置４０の構成を示すブロック図である。図４に示すように、制御装置４０は、Ａ／Ｄコンバータ４１と、比較判定部４２と、ＲＡＭ４３と、ＲＯＭ４４と、入出力インタフェース４５とで構成されている。Ａ／Ｄコンバータ４１は、光検出部９ａで検出された光強度のアナログ信号をデジタル信号に変換するものであり、ＲＡＭ４３は、入出力インタフェース４５を介して入力された閾値データを格納するものである。また、ＲＯＭ４４は、Ａ／Ｄコンバータ４１で得られるデジタル信号の強度が、ＲＡＭ４３に格納された閾値データを上回る場合にその数を細菌の数として計数するプログラムを格納するものである。比較判定部４２は、ＲＡＭ４３に格納された閾値データとＡ／Ｄコンバータ４１で得られる光強度とを比較し、光強度が、ＲＡＭ４３に格納された閾値データを上回る場合にその数を細菌の数として算出してＲＡＭ４３に格納し、あるいは入出力インタフェース４５を介してモニター等の出力部に出力するものである。更に、入出力インタフェース４５は、比較判定部４２で得られた細菌数のデータを出力したり、入力された閾値データを比較判定部４２を介してＲＡＭ４３に格納するためのものである。

以上のように構成された細菌計数装置においては、第２ウェル２に抽出液を、第３ウェル３に発光液を収容して本体部１０ａをカバー１０ｂで覆った後に第１ウェルに検体液を外部から導入し、カバー１０ｂにおいて空洞部３５の部分を押圧すると、空洞部３５の空間から空気抜き孔３６を通して空気が逃げる。何らかの方法（例えばゴム栓をするなどの方法）で空気抜き孔３６を塞いだ後に圧力を除去すると、空洞部３５の空間が負圧となる。すると、第１ウェル１の検体液、第２ウェル２の抽出液、第３ウェル３の発光液が第１チャネル１に導入されてこれら検体液、抽出液及び発光液はその流れの中で互いに接触される。そのとき、検体液と抽出液との接触により、検体液中の細菌から細菌内ＡＴＰが抽出され、細菌内ＡＴＰと発光液との接触により、発光液が発光し、この発光による光信号が、光検出部９ａで検出される。

このとき、検出された光信号の強度に応じて１つの閾値を設定する。ここでは、ノイズレベルよりは大きく且つ検出される最大の光信号よりは小さい値を閾値として設定する。以下、この閾値を設定閾値と呼ぶ。閾値の入力は、入出力インタフェース４５を介してＲＡＭ４３に格納することにより行う。

こうして閾値を設定した後、光検出部９ａで検出された光信号のアナログ信号は、Ａ／Ｄコンバータ４１でデジタル信号の光信号に変換され、比較判別部４２において、この光信号が、ＲＡＭ４３に格納された設定閾値と比較される。そして、比較判別部４２で光強度が設定閾値を上回ると判別された場合には、細菌の数が１個としてカウントされる。カウントされた細菌数のデータは、ＲＡＭ４３に格納されるか、入出力インタフェース４５を介してモニター等の出力部に出力される。比較判別部４２で光強度が設定閾値以下と判別された場合には、細菌の数はカウントされない。そして、以上の操作を繰り返して細菌の計数が行われる。

このようにして細菌の計数を行うと、細菌内ＡＴＰと発光液との接触に伴って発生する光信号の強度を測定するときに閾値をノイズレベルよりも高いレベルに設定しているため、光の拡散や乱反射によるノイズの検出を除くことができ、精度に優れた計数測定をすることができる。また、細菌の発光による光信号の強度は、細菌が同種であっても栄養状態によって光信号の強度値にはばらつきが生じることがあるが、この細菌計数方法では、測定した光信号の強度を測定し、測定した強度に応じて閾値を設定しているため、細菌が同種であっても、的確に細菌の計数を行うことができる。更に、細菌は一般に種類が異なると発生する光信号の強度も異なるが、この細菌計数方法によれば、このような場合でも、閾値を適切な値に設定することにより、特定の細菌のみの計数を選択的に行うこともできる。

また、上記のような構造を有する細菌計数装置を用いて細菌の計数を行うと、従来技術のような分取作業が不要となり、利便性が増すという効果を有する。すなわち、マイクロチャネルチップ１０内において、検体液を収容する第１ウェル１と反応場９とが第１チャネル１１で接続されているため、検体液を数秒で反応場９に送流することができ、第２チャネル１２及び第３チャネル１３が第１チャネル１１に接続されているため、検体液が第１ウェル１から反応場９に送流される際に、第２ウェル２に収容される抽出液と第３ウェル３に収容される発光液とを順次第１チャネル１１に送流することができる。そして、抽出液及び発光液のそれぞれが第１チャネル１１内で混合されることにより、検体液と抽出液及び発光液との反応を効率よく行うことができる。

更に、第１〜第３チャネル１１〜１３のチャネル幅ｄが１ｍｍ以下であるため、該チャネルにおいて検体液と抽出液及び発光液の拡散、混合が極めて短時間で行われることにより反応を瞬時に行うことができる。その結果、従来は最短でも１〜２時間要していた細菌の検出を数秒で行うことができ、ひいては細菌の計数を極めて短時間で行えるようになる。また、チャネル幅ｄが０．１〜５００μｍであると更に好ましい。

また上記マイクロチャネルチップ１０では、本体部１０ａがカバー１０ｂで密閉されているため、外部からの細菌の進入が十分に抑制される。従って、従来のようにクリーン環境中での検査や厳密な消毒等が不要であるため、極めて利便性に優れる。

上記光検出部９ａは、公知のものを用いることができ、例えばＣＣＤやフォトダイオード、フォトトランジスタ、光増倍管、イメージインテンシファイア等を使用することができる。光検出部９ａは、反応場９にて細菌内ＡＴＰが発光液と反応することによって生じる光を検出する。したがって、光検出部９ａの設置位置は特に限定はしないが、反応場９の近くに設置することが好ましい。なお、光検出部９ａは、マイクロチャネルチップ１０の本体部１０ａ内に設置することも可能である。

検体液に含まれる細菌としては、特に限定されないが食中毒を引き起こすおそれのある細菌（例えば腸炎ビブリオ、サルモネラ菌、黄色ブドウ球菌、セレウス菌又はカンピロバクター菌）等が挙げられる。

また、抽出液に含まれる成分としては、細菌内ＡＴＰを抽出できるものであれば良く、リゾチーム、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、界面活性剤（塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、トリトンＸ−１００等）、トリクロル酢酸、過塩素酸、ファージ、抗生物質が挙げられる。

更に、発光液に含まれる成分としては、ＡＴＰの存在下に発光するものであればよく、例えばルシフェラーゼ及びルシフェリンが挙げられる。

なお、これらの検体液、抽出液及び発光液は液状であればよく、サスペンションやエマルジョンであってもよい。

図５の（ａ）及び（ｂ）は、第１チャネル１１、第２チャネル１２及び第３チャネル１３の第２〜第３の態様を示す断面図である。

図５の（ａ）に示す、第２の態様のチャネル２１ａは、二つの基材を積層して形成される流路である。すなわち、一方の基材２３ａの下部と、他方の基材２３ｂの上部とにそれぞれ溝を設け、貼り合わせることによってチャネル２１ａが形成される。図５の（ｂ）に示す、第３の態様のチャネル２１ｂは、三つの基材を積層して形成されたものである。すなわち、中間層である基材２４ｂに貫通溝を設け、その上部と下部に、基材２４ｂを挟持するように基材２４ａ及び２４ｃを積層してチャネル２１ｂが形成される。なお、チャネル２１ａ及びチャネル２１ｂはそれぞれ第１チャネル１１、第２チャネル１２、第３チャネル１３に相当するものである。

これらの基材２３ａ，２３ｂ，２４ａ〜２４ｃは任意に定めることができ、石英ガラス又はパイレックス（登録商標）ガラス等のガラス、ＰＤＭＳ、ポリカーボネート又はポリイミド等のポリマー、鉄、ステンレス、アルミニウム、ニッケル又は銅等のメタル、又はシリコン等を使用することができ、積層する場合のそれぞれの基材は、同一の種類であっても異なった種類であってもよい。

また、第１チャネル１１、第２チャネル１２及び第３チャネル１３のチャネル幅は１ｍｍ以下である。

チャネル幅が上記の範囲であるため、このチャネル内で検体液、抽出液及び発光液が混合した場合には、単位体積あたりの接触表面積が増加するため、反応を促進することができる。すなわち拡散律速を最小にすることが可能になることから迅速な反応を実現することができる。一方、チャネル幅が１ｍｍを超えると十分に拡散律速を低減することができないので、本発明の目的を達成することができない。更に好ましいチャネル幅は０．１〜５００μｍである。

例えば第１実施形態に係るマイクロチャネルチップ１０は、第２ウェル２に抽出液を、第３ウェル３に発光液を収容させているが、これらは逆にすることもでき、混合して使用することもできる。

すなわち、第１ウェル１の検体液が第１チャネル１１を通じて反応場９に送流される際に、第２ウェル２から第２チャネル１２を通じて発光液が送流され、更に第３ウェル３から第３チャネル１３を通じて抽出液が送流されてもよく、同様に第１ウェル１の検体液が第１チャネル１１を通じて反応場９に送流される際に、第２ウェル２から第２チャネル１２を通じて抽出液及び発光液の混合液が送流されてもよい。

これは抽出液は細菌内ＡＴＰを抽出するための液であるため、細菌を含まない発光液と混合しても反応することは無く、一方で発光液はＡＴＰの存在下に発光するための液であるため、ＡＴＰを含まない抽出液と混合しても反応することはないからである。また、検体液と発光液とを混合させた後、抽出液と混合させると、検体液から細菌内ＡＴＰが抽出されると同時に発光させることができる。また、抽出液と発光液とを混合してから検体液と混合させるとウェルの数やチャネルの数を減らすことができ、細菌計数装置を簡略化できる。

本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。例えば上記実施形態では、閾値が細菌の種類とは無関係に設定されているが、閾値は、細菌の種類に応じて設定することが好ましい。上述したように、一般に細菌の種類によって発光強度が異なる。したがって、特に発光強度が弱い細菌も含めて計数測定したい場合は、該閾値を下げることによって、該細菌を計数測定することができる。

更に、上記閾値を前記細菌の種類に応じて複数設定することが好ましい。この場合、細菌の種類が多数であっても、閾値を適切な値に設定することで、多数の細菌を識別しながら計数を行うことができる。例えば細菌の種類が２種類ある場合には、図６に示すように、２種類の細菌に応じ、２種類の発光ピークＰ１，Ｐ２が観測される。この場合、１つの閾値Ｉ１を、発光ピークＰ１よりも低い閾値に設定し、もう１つの閾値Ｉ２を、発光ピークＰ２より小さく発光ピークＰ１よりも大きい値に設定する。このようにして細菌の計数を行うと、Ｉ１を上回る発光ピークの計数により、発光ピークＰ１及びＰ２に対応した細菌の計数が可能となり、Ｉ２を上回る発光ピークの計数により、発光ピークＰ２にのみ対応した細菌の計数が可能となる。従って、両者の計数の差をとれば、発光ピークＰ１に対応した細菌の数が算出される。その結果、発光ピークＰ１，Ｐ２のそれぞれに対応した細菌の計数が可能となり、２種類の細菌の識別も可能となる。

また上記実施形態では、第１ウェル１、第２ウェル２、第３ウェル３のみを有するマイクロチャネルチップ１０が用いられているが、図７に示すように、マイクロチャネルチップ１０は、更に細菌のフロックを分解する分解液を収容する第４ウェル４と、細菌同士の間隔を広げる希釈液を収容する第５ウェル５と、遊離ＡＴＰを除去するＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容する第６ウェル６と、ＡＴＰ除去剤を不活性化する不活性化剤を含む不活性化液を収容する第７ウェル７と、ＡＴＰを増幅する増幅剤を含む増幅液を収容する第８ウェルとを更に備えており、これに対応して、第１チャネル１１と第４ウェル４とを接続する第４チャネル１４、第１チャネル１１と第５ウェル５とを接続する第５チャネル１５、第１チャネル１１と第６ウェル６とを接続する第６チャネル１６、第１チャネル１１と第７ウェル７とを接続する第７チャネル１７、及び第１チャネル１１と第８ウェル８とを接続する第８チャネル１８を備えている。

この場合、分解液、希釈液、除去液、不活性化液及び増幅液を瞬時に第１チャネル１１に導入させることができる。すなわち、分解液を導入することによって細菌のフロックを分解し、希釈液を導入することによって細菌の間隔を広げることができる。更に、除去液によって不要な遊離ＡＴＰを除去することができ、不活性化液によって余分な除去液を不活性化させることができる。これらの液を導入すれば、極めて高精度な計数測定を行うことができる。更に細菌から細菌内ＡＴＰを抽出液によって抽出し、発光液によって発光させた後、増幅液を導入すると、低感度の光検出手段であっても細菌の計数を測定することが可能となる。更にこのような装置を用いれば、検出コストが下がると共に光検出手段の集積度が上がることとなる。

なお、これらの分解液、希釈液、除去液、不活性化液及び増幅液は細菌計数するに際し、所望の精度に応じて、適宜に導入することができ、必要に応じて省くことも可能である。

また、分解液に含まれる成分としては、特に限定されないがＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ等が挙げられる。

また、除去液に含まれる成分としては、アデノシンリン酸デアミナーゼ、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ヘキソキナーゼ及びアデノシントリホスファターゼ等が挙げられる。

また、不活性化液に含まれる成分としては、例えばコホルマイシン、ＥＤＴＡ、ジチオスレイトール、硫酸アンモニウム、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ等が挙げられる。

また、増幅液に含まれる成分としては、特に限定されないがアデニル酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ポリリン酸、アデノシンモノリン酸、ピルべートオルトホスフェートジキナーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、マグネシウムイオン等が挙げられる。

更に上記実施形態では、マイクロチャネルチップ１０を用いた細菌計数の例を示しているが、マイクロチャネルチップ１０を用いたものに限定されるものではない。要するに、検体液、抽出液および発光液を相互に接触させることができる接触部を有するものを用いていればよい。このような接触部を有するものとしては、例えば試験管、フラスコ等が挙げられる。

更にまた、本発明の他の実施形態では第２〜第８ウェルがそのウェルに対応する抽出液、発光液、分解液、希釈液、除去液、不活性化液、及び増幅液を予め収容しておくことも可能である。予めこれらの液を収容していれば、検体液を導入するのみで細菌計数を行うことができ、環境を選ばず、簡便に精度の高い測定ができる。

本発明の細菌計数方法及び細菌計数装置は、迅速、且つ簡便で、計数精度を高くすることができることから、特に食品検査のように検査結果によって製品の出荷可否を早く判断したい場合等に好適に用いることができる。

Claims (15)

1. 溶媒の流れの中で細菌から細菌内ＡＴＰを抽出し、抽出した細菌内ＡＴＰと前記細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液とを接触させてその接触に伴って発生する光信号を前記発光液と前記細菌内ＡＴＰとの接触部あるいはその下流側に配置された少なくとも１個以上の光検出手段で測定し、測定した前記光信号の強度に基づいて細菌を計数する細菌計数方法であって、
   閾値を設定し、測定される光信号の強度が前記閾値を上回った場合にその数を細菌の数として細菌を計数することを特徴とする細菌計数方法。
2. 前記閾値を前記細菌内ＡＴＰの抽出を行わない状態で測定された光信号の強度に基づいて設定することを特徴とする請求項１記載の細菌計数方法。
3. 細菌の種類に応じて前記閾値を設定することを特徴とする請求項１又は２に記載の細菌計数方法。
4. 前記閾値を前記細菌の種類に応じて複数設定することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌計数方法。
5. 前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出する前に、分解液により細菌のフロックを分解することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌計数方法。
6. 前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出する前に、希釈液により細菌同士の間隔を広げることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌計数方法。
7. 前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出する前に、ＡＴＰ除去剤により遊離ＡＴＰを除去し、前記除去後に不活性化液によりＡＴＰ除去剤を不活性化させることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の細菌計数方法。
8. 前記細菌から前記細菌内ＡＴＰを抽出した後に、増幅液によりＡＴＰを増幅させることを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載の細菌計数方法。
9. 細菌から細菌内ＡＴＰを抽出する抽出液、前記細菌内ＡＴＰの存在下に発光する発光液及び前記細菌を含む検体液を接触させる接触部と、
   前記接触部又はその下流側で発生する光による光信号の強度を測定する光検出手段と、を備える細菌計数装置であって、
   測定した光信号の強度に応じて設定された閾値を、測定される光信号の強度が上回った場合にその数を細菌の数として細菌を計数する制御装置を備えることを特徴とする細菌計数装置。
10. 前記検体液を収容する第１ウェル、
    前記抽出液を収容する第２ウェル、
    前記発光液を収容する第３ウェル、
    前記細菌内ＡＴＰ及び前記発光液の反応により発光が生じる発光部、
    
    前記第１ウェルと前記発光部とを接続する第１チャネル、
    
    前記第１チャネルと前記第２ウェルとを接続する第２チャネル、及び、
    前記第１チャネルと前記第３ウェルとを接続する第３チャネル
    を有するマイクロチャネルチップを備えており、
    前記第１チャネルのチャネル幅が１ｍｍ以下であり、且つ、
    前記第１チャネルが前記接触部である、ことを特徴とする請求項９記載の細菌計数装置。
11. 前記マイクロチャネルチップが、
    前記細菌のフロックを分解する分解液を収容する第４ウェルと、
    前記第１チャネルと前記第４ウェルとを接続する第４チャネルと、
    を更に備え、
    前記第４チャネルが前記第２チャネルよりも上流側で第１チャネルに接続されていることを特徴とする請求項１０記載の細菌計数装置。
12. 前記マイクロチャネルチップが、
    前記細菌同士の間隔を広げる希釈液を収容する第５ウェルと、
    前記第１チャネルと前記第５ウェルとを接続する第５チャネルと、
    を更に備え、
    前記第５チャネルが前記第２チャネルよりも上流側で第１チャネルに接続されていることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細菌計数装置。
13. 前記マイクロチャネルチップが、
    遊離ＡＴＰを除去するＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容する第６ウェルと、
    前記ＡＴＰ除去剤を不活性化する不活性化剤を含む不活性化液を収容する第７ウェルと、
    前記第１チャネルと前記第６ウェルとを接続する第６チャネルと、
    前記第１チャネルと前記第７ウェルとを接続する第７チャネルと、
    を更に備え、
    前記第６チャネル及び前記第７チャネルが前記第２チャネルよりも上流側で第１チャネルに接続されていることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の細菌計数装置。
14. 前記マイクロチャネルチップが、
    ＡＴＰを増幅する増幅剤を含む増幅液を収容する第８ウェルと、
    前記第１チャネルと前記第８ウェルとを接続する第８チャネルと、
    を更に備え、
    前記第８チャネルが前記第２チャネルよりも下流側で第１チャネルに接続されていることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の細菌計数装置。
15. 前記マイクロチャネルチップが、
    前記細菌のフロックを分解する分解液を収容する第４ウェル、前記細菌同士の間隔を広げる希釈液を収容する第５ウェル、遊離ＡＴＰを除去するＡＴＰ除去剤を含む除去液を収容する第６ウェル、前記ＡＴＰ除去剤を不活性化する不活性化剤を含む不活性化液を収容する第７ウェル及びＡＴＰを増幅する増幅剤を含む増幅液を収容する第８ウェルからなる群より選ばれる少なくとも１つのウェルと、
    前記ウェルと前記第１チャネルとを接続するチャネルとを更に備え、
    前記ウェルに、前記抽出液、前記発光液、前記分解液、前記希釈液、前記除去液、前記不活性化液及び前記増幅液からなる群より選ばれる液体のうち、前記ウェルに対応する液体が収容されていることを特徴とする請求項１０記載の細菌計数装置。

Images