JP2002357607A

JP2002357607A - 集積化反応装置

Info

Publication number: JP2002357607A
Application number: JP2002079589A
Authority: JP
Inventors: Akira Suyama; 明陶山
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-03-20
Filing date: 2002-03-20
Publication date: 2002-12-13

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明の課題は、固相化領域毎に固相化され
た固相化対象を用いた測定を行う際に、必要な各処理用
の流体、例えば試料や洗浄液のような各種液体の取り扱
いが簡単である反応装置を提供する。【解決手段】複数の固相化領域が直列配置されて延在
する固相化領域群と、前記固相化領域毎に固相化された
生物学的反応のための固相化対象と、を具備し、前記固
相化領域群を前記直列配置された領域について互いに平
行になるように複数並列されるか束状に集積化されてい
ることを特徴とする集積化反応装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的反応のた
めの固相化対象、例えば、複数のＤＮＡプロ−ブを用い
てそのＤＮＡプロ−ブと相補的に反応するタ−ゲットＤ
ＮＡやｍＲＮＡを検出するためのデバイスに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ヒトゲノム計画と言われるような
プロジェクトが世界的規模で進められており、人間の全
遺伝子の塩基配列の解析が試みられている。この作業は
非常に多くの人手を要し、かつ煩雑な作業にもかかわら
ず、２１世紀の初頭には解明が終了すると言われてい
る。この塩基配列の解析（シ−ケンシング）は先に述べ
たように非常に煩雑なため、解析機器の改良、自動化や
ＤＮＡチップと呼ばれる新規な解析方法の提案がなされ
ている。ＤＮＡチップとはシリコン等の基板に半導体の
リソグラフィ技術を用いて多数の種類のＤＮＡプロ−ブ
が決められた位置に配置されたものである。また、ＤＮ
Ａプロ−ブとはＤＮＡを構成する４種の塩基アデニン
（Ａ），グアニン（Ｇ），シトシン（Ｃ），チミン
（Ｔ）が相補的に結合する性質を利用したもので、例え
ば塩基Ａと塩基Ｔ、塩基Ｇと塩基Ｃがそれぞれ相補的に
結合する。従って、ＡＧＣＴＴ（５’→３’）という塩
基配列のプロ−ブを用いるとＡＡＧＣＴという塩基配列
のＤＮＡを選択的に捕らえることができる。

【０００３】例えばＤＮＡプロ−ブの固相化方法として
は、Ｓｉｅｎｃｅ２５１：７６７−７７３（１９９１年
２月発行）に示されているように、光反応を用いて実質
的に平坦な基板上にＤＮＡプロ−ブを構成する方法があ
る。この方法をに示す。シラン処理によりアミノ基を基
板表面に形成し、光保護分子Ｘを結合させた表面の一部
に紫外線を照射し、目的の位置の保護基をはずしてアミ
ノ基を露出させる（ａ）。次いで露出したアミノ基と光
保護基の付いた４種のＤＮＡ塩基のうちの１種の塩基Ａ
を選択し、反応させる（ｂ）。その結果、光保護基Ｘの
付いたＤＮＡ塩基Ａと光保護基のみが付いた表面が形成
される（ｃ）。さらに、保護基のみが付いた表面の一部
を選択し、その部分に光を照射して光保護基の付いたＤ
ＮＡ塩基Ｂと反応させる（ｄ）。その結果、光保護基の
付いたＤＮＡ塩基Ａと光保護基の付いたＤＮＡ塩基Ｂを
含む表面が形成される（ｅ）。これらの反応を２次元的
な位置決めでＤＮＡ塩基Ｃと塩基Ｄについても同様に行
うと４種の塩基全てを基板表面に固定することが出来
る。さらに、任意の塩基と光保護基とが付いた部分に対
して上述したプロセスを繰り返すことにより、３次元的
に塩基の積み重ねが行われて（ｆ）に示すように異なっ
た塩基配列を有するＤＮＡプロ−ブを特定の場所に特定
の配列で形成することが出来る。従って、本技術を用い
ることにより例えば８種類の塩基から成るあらゆる塩基
配列の組み合わせのＤＮＡプロ−ブを基板上に構成する
場合、３２枚のマスクを用意してリソグラフィと光反応
技術を３２回繰り返せば全ての組み合わせのＤＮＡプロ
−ブを基板上に構成することが出来る。このように形成
された基板はＤＮＡチップと呼ばれ主に未知の塩基配列
のＤＮＡのシ−ケンシングに用いる事が出来、従来の電
気泳動を利用したシ−ケンシング技術に比べ、高速で簡
便にシ−ケンシングできるという利点がある。

【０００４】また、国際出願特許公開ＷＯ９３／０９６
６８号（特表平７−５０６５６１号）は、上記国際出願
に記載されたシ−ケンシング技術の応用に関するもので
あり、複数のフロ−式チャネルに適用する方法が述べら
れている。予めシラン処理によりアミノ基を基板表面に
形成した実質的に平坦な基板に対して複数のフロ−式チ
ャネルを取り付けた後に、それぞれのチャネルの全長に
亙って一種類の、しかしチャネル毎には異種の塩基配列
からなるＤＮＡプロ−ブが固定化される。また、本技術
の好ましい態様では、即ち、アミノ基を有する基板を複
数の平行に並んだチャネルブロックと合接させた後に、
選択されたＤＮＡプロ−ブを含む処理液を特定のチャネ
ルに流すことにより、目的のＤＮＡプロ−ブの１つ目の
塩基を固相化し、次に、基板とチャネルブロックとを互
いに所定角度（例えば９０度）相対的に回転させてから
再び基板とチャネルブロックとを合接させた後に、２つ
目の塩基に相当する塩基を固相化する工程を順次繰り返
すことにより、所望の塩基配列からなるＤＮＡプロ−ブ
を構成する方法が述べられている。この方法は光反応に
よる方法と組み合わせることもでき、先に述べたＤＮＡ
チップを一度に大量に製作することが出来るという利点
がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来技術は、ＤＮＡ配
列のシ−ケンシングを行うという目的では有力な方法と
考えられるが、最近ではポストゲノムの観点から、得ら
れたＤＮＡ情報を如何に利用するかということが今後の
課題である。例えば、ＤＮＡがどのように発現するかを
研究するために細胞内で発現するｍＲＮＡのパタ−ンを
解析することが行われるようになってきている。同じ遺
伝子を持ちながら臓器の違いによるｍＲＮＡ発現の違い
や同一の細胞でも時間的な発現の変化を研究することは
遺伝子治療、医薬品開発、農業・畜産など多くの分野に
応用する事が出来、今後の発展が期待されている。その
ような発現パタ−ンを調べるにはｍＲＮＡ、またはｍＲ
ＮＡから転換したｃＤＮＡに対応する複数のＤＮＡプロ
−ブを準備し、目的の細胞に含まれるｍＲＮＡ、または
ｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡとＤＮＡプロ−ブを反応
させる方法が考えられる。このような測定においては測
定対象のｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤＮ
Ａの塩基配列はある程度既知のものであり、また測定の
正確さ、効率性を考慮すると２０〜６０塩基程度、好ま
しくは４０塩基付近の長さのＤＮＡプロ−ブが用いられ
る。先に述べたＤＮＡチップでこのようなプロ−ブを構
成するには８０〜２４０枚のマスクを準備してリソグラ
フィと光反応による塩基の合成を８０〜２４０回繰り返
す必要がある。従って、ＤＮＡプロ−ブの長さが長くな
るにつれ多大な労力が必要になるという問題がある。さ
らに、合成の収率を考慮すると、長さが４０塩基に揃っ
たＤＮＡプロ−ブを基板上に直接合成することは実用上
不可能といえるが、長さが揃っていないと測定が不正確
になってしまうので好ましくない。

【０００６】また、一つの細胞では約１０万個の遺伝子
のうち２〜３万種のｍＲＮＡが発現していると考えられ
るが、それらのうち細胞特異的なものの割合は、数％
（１〜３％程）程度であると推測されている。従って、
測定対象のｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転換したｃＤ
ＮＡの種類は数百〜千程度と考えられる。先に述べたＤ
ＮＡチップで８塩基の長さのプロ−ブは４⁸ すなわち６
５，５３６種類形成できるが、測定対象のｍＲＮＡ、ま
たはｍＲＮＡから転換したｃＤＮＡの種類は最大で２〜
３万程度、実際にはその１／１０以下と想定されるので
このように大量種類のプロ−ブを形成する必要はない。
ＤＮＡプロ−ブと測定対象のｍＲＮＡ或いはｃＤＮＡの
断片とのハイブリダイゼ−ションの熱安定性は一様では
ない。また、測定装置のダイナミックレンジを考慮する
と、処理濃度が大きく異なるｍＲＮＡ或いはｃＤＮＡ断
片を同時に処理することは不可能である。したがって、
同一測定条件の下にある大量種類のＤＮＡプロ−ブの中
で、有効な結果を与えるものは限られる。このことから
も、大量種類のＤＮＡプロ−ブを基板上に形成する必要
が無いことが分かる。

【０００７】さらに、先に述べたＤＮＡチップでは光反
応による合成を繰り返すため、光照射時のＤＮＡプロ−
ブの紫外線による劣化が問題となる可能性もあり２０塩
基以上の長さのプロ−ブを形成する方法としては適切で
はない。また、ＤＮＡチップは実質的に平坦な基板上に
形成されるが、固相化時には多数の試薬を交互に反応さ
せたり、また測定時には試料との反応や洗浄を行うため
に液体を何度も作用させる必要がある。平坦な基板のＤ
ＮＡチップを用いて上記の処理を行うには反応液の入っ
た容器にＤＮＡチップを浸漬するか、ＤＮＡチップ表面
を有して流路を形成するような治具を製作して液体処理
をする必要がある。従って、これらの処理を円滑に行う
ためにはＤＮＡチップ以外に液体処理をするための治具
を必要とする。しかし、浸漬する方法では、固相化およ
び試料の測定に当って余剰量の各種処理液を必要とす
る。また、流路を適用する方法では、ＤＮＡプロ−ブが
固相化された面積が制限されてしまう。

【０００８】従って、本発明の目的は、固相化領域毎に
固相化された固相化対象を用いた測定を行う際に、必要
な各処理用の流体、例えば試料や洗浄液のような各種液
体の取り扱いが簡単である反応装置を提供することであ
る。

【０００９】また、本発明の更なる目的は、複数の固相
化領域群に亘り、直列する複数の固相化領域に固相化さ
れる固相化対象について効率よく検出することが可能な
反応装置を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の本発明は、複数の固相化領域が直列配置されて延在す
る固相化領域群と、前記固相化領域毎に固相化された生
物学的反応のための固相化対象と、を具備し、前記固相
化領域群を前記直列配置された領域について互いに平行
になるように複数並列されるか束状に集積化されている
ことを特徴とする集積化反応装置；並びに（１）複数の
固相化領域が直列配置されて延在する固相化領域群であ
り、且つ前記固相化領域群が前記直列配置された領域に
ついて互いに平行になるように複数並列されるか束状に
集積化されていることを特徴とする固相化領域群に固相
化される生物学的反応のための固相化対象と試料とを反
応させる工程と、（２）複数の固相化領域群に亘って直
列する固相化領域毎に生じた測定対象による反応パター
ンを測定する工程と、を具備するを使用する生物学的測
定対象の検出方法である。

【００１１】また、光透過性の流路の内壁に複数のＤＮ
Ａプロ−ブが各々独立して配置されていることを特徴と
するＤＮＡキャピラリィである。ここで、前記流路の末
端部が、開放された中空状のキャピラリィであることが
好ましい。また、前記流路は、筒形状のキャピラリィで
あることが一層好ましい。前記流路が、複数個で且つ一
体に配置されていれば、処理能力が向上する。特に、複
数個の流路の全てが、少なくとも一つの末端部付近で合
流路と連通していれば、ＤＮＡプロ−ブの固定化処理や
該ＤＮＡプロ−ブによる試料の測定等に際して、合流路
を通じて各種処理用液体が一括して導入されるか或いは
回収される。

【００１２】また、複数のＤＮＡプロ−ブが、前記流路
に沿って直列した配置である場合には、流路に沿って処
理用の液体（場合によっては、乾燥その他の目的のため
の気体）を流路に沿って流すことにより、それぞれのＤ
ＮＡプロ−ブが次々に処理される。

【００１３】また、前記流路が、ガラスまたはシリコン
基板上にエッチング加工されて形成されていれば、ＤＮ
Ａプロ−ブの固定が容易になる。しかも、好ましい態様
においては、ＤＮＡプロ−ブが光反応を用いて固定され
ることで、本発明のＤＮＡキャピラリィを好適に製造す
ることができる。

【００１４】

【発明の実施の形態】に本発明のＤＮＡキャピラリィの
第一の実施の形態を示す。この発明の実施の形態は次の
ように構成されている。は、種々のＤＮＡプロ−ブ１
ａ，１ｂ，１ｃ…が、注入用開口部２ａおよび排出用開
口部２ｂを両端に有する光透過性の円筒状キャピラリィ
４の内壁５に縞状に固定されている状態を示している。
キャピラリィのサイズは内径が０．１ｍｍから数ｍｍま
で種々のサイズが用いられるが、取り扱いの容易さから
０．５ｍｍから１ｍｍ程度のものが好適である。キャピ
ラリィ４の内径や流路長は、測定する試料の容量や液体
の流動し易さに応じて決定される。

【００１５】キャピラリィ４の内部に固定するＤＮＡプ
ロ−ブは、予め所望の塩基配列からなる２０塩基以上、
好ましくは２０〜６０塩基、特に４０塩基付近（例え
ば、３５〜４５塩基）のものであって、その種類は目的
によって異なり、測定対象となるｍＲＮＡ、またはｍＲ
ＮＡから転換したｃＤＮＡの数に依存するが、１種類か
ら数千種類までを対象とする。本発明の第一の目的であ
るｍＲＮＡの発現パタ−ンを解析するためには数千種類
のＤＮＡプロ−ブを固定する必要があるが、例えば感染
症などの検査を目的とする場合には１から数種類のＤＮ
Ａプロ−ブで十分である。各ＤＮＡプロ−ブ１ａ，１
ｂ，１ｃ…の間隔は、測定対象の数が多い場合には密に
すればよい。測定対象の数が少ない場合にはその間隔を
広く取ることができ、そうすることにより測定し易さが
増す。実際には、２０〜６０塩基程度のＤＮＡプロ−ブ
を複数種類直列的に配置するために、１μｍから数ｍｍ
程度まで種々の間隔で各ＤＮＡプロ−ブ１ａ，１ｂ，１
ｃ…を配置することができる。必要ならば、同種のＤＮ
Ａプロ−ブを複数固定化したり、対照用のタンパクを固
定化することにより、測定の多様性を加えてもよい。

【００１６】通常、ＤＮＡキャピラリィを用いた測定
は、測定対象が微量である場合を考慮して、蛍光や化学
発光を利用した光増感方式を採用するのが好ましい。キ
ャピラリィ４に固定化された各ＤＮＡプロ−ブ１ａ，１
ｂ，１ｃ…の間隔が密であるとき、蛍光顕微鏡等のよう
に高い分解能を有する測定手段を用いて複数の反応パタ
−ンを個別に読み取る必要があるが、数ｍｍの粗い間隔
であればトランスイルミネ−タを用いることにより、肉
眼でも観察が可能である。このような光測定をし易くす
るためには、光透過性のよい任意の部材（プラスチック
類、シリカ、ガラス、ポリマ−等）からなるＤＮＡキャ
ピラリィを使用するべきであり、特に後述するシラン処
理による製造方法を行うにはガラス或いはシリコンが好
適である。必要ならば、部分的に光反射性または遮光性
であってもよい。市販のガラスキャピラリィを利用する
と安価にＤＮＡキャピラリィを製作することができる。

【００１７】次にＤＮＡキャピラリィの製作方法につい
て説明する。は、種々のＤＮＡプロ−ブ１ａ，１ｂ，１
ｃ…をガラスキャピラリィの内壁５に固定化する方法を
示している。以下に示す各製造プロセスにおける各種処
理用液体の導入は、キャピラリィ４の注入用開口部２ａ
から適宜の分注手段によって行なわれ、処理後の液体の
排出は、排出用開口部２ｂから適宜の吸引手段によって
行なわれる。まず、内壁５をシランカップリング剤を含
む溶液をキャピラリィ４中に導入して、アミノ基（ＮＨ
_２）６をその表面に形成する（Ｓ１）。次に、特定の波
長の光、好ましくは紫外線で光分解を起こすキャッピン
グ剤７を含む溶液をキャピラリィ４中に導入して、内壁
５全体をアミノ基で覆う（Ｓ２）。次に、内壁５の固定
化したい領域に紫外線照射して、その領域のみのアミノ
基６を露出させる（Ｓ３）。ここで、特定の場所のみに
紫外線８を照射するためには、半導体のリソグラフィ技
術で用いられているマスク部材で特定の場所以外に光が
当たらないようにするか、光をレンズ等で照射範囲を絞
り込めばよい。また、キャピラリィ４が円筒形状である
から、キャピラリィ側面をほぼ直角に入射する角度であ
れば、任意の方向から光照射して構わない。また、キャ
ピラリィ４全体が光透過性であるために、キャピラリィ
４の内壁５は、紫外線照射された領域のみがリング状に
脱保護された状態になる。

【００１８】次に、アミノ基と反応して結合する結合性
部分を分子の一端に、アミノ基もしくはチオ−ル基と反
応して結合する結合性部分を分子の他端に有するリンカ
−分子９を含む液体をキャピラリィ４中に導入する（Ｓ
４）。このとき、リンカ−分子９の一端の結合性部分の
みが内壁５上のアミノ基６と結合し、他端の結合性部分
はフリ−の状態となる。次に、末端部にアミノ基或いは
チオ−ル基を形成させたＤＮＡプロ−ブ１０を含む液体
をキャピラリィ４中に導入して、リンカ−分子９にＤＮ
Ａプロ−ブ１０を結合させる（Ｓ５）。なお、適宜の洗
浄液を適量導入してキャピラリィ４内を洗浄するプロセ
スを介して、上記（Ｓ３）、（Ｓ４）、（Ｓ５）の固定
化プロセスを所要の間隔だけ離間させた別の場所に変え
て繰り返すことにより、に示すような目的の場所に目的
のＤＮＡプロ−ブ１ａ，１ｂ，１ｃ…を各々リング状に
独立して固相化したＤＮＡキャピラリィを製作すること
ができる。ここで、本発明においてリング状または環状
とは、中空状流路の断面形状に応じて円形、多角形、楕
円形等の種々の形を含んでいる。また、流路とは、少な
くとも所要量の処理用液体が流れることのできる幅と高
さを有している。この流路は、好ましくは毛管力による
流動促進作用を有するように選ばれる。したがって、単
に、凹凸の***が形成された表面は、流路とは呼ばな
い。

【００１９】なお、（Ｓ１）で用いられるシランカップ
リング剤としては、例えばアミノエチルアミノピロピル
トリメトキシシラン等が用いられるが、これに限定され
るものではなくアミノ基を表面に形成できるようなもの
であれば、アミノエチルアミノピロピルメチルジメトキ
シシシラン等のアミノシラン類が利用可能である。（Ｓ
２）で用いられるキャッピング剤としては、４，５−Ｄ
ｉｍｅｔｈｏｘｙ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌｃｈ
ｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、６−Ｎｉｔｒｏｖｅｒａｔｒ
ｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、4−Ｎｉｔｒｏｂｅ
ｎｚｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ、ｏ−Ｎｉｔｒ
ｏｂｅｎｚｙｌ−ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｙｎｙｌｃａｒｂ
ｏｎａｔｅ等が用いられるが、この限りでなく紫外線ま
たは可視光によりアミノ基との結合が外れるような分子
内開裂を示す物質が用いられる。

【００２０】（Ｓ３）で用いられる光は通常３５０ｎｍ
前後の光が用いられるが、キャッピング剤や用いる溶媒
の種類に依存して最適な光分解性が得られるような波長
帯の光が選択される。また、紫外線のような特定光の照
射のための光学装置は、市販のものでよい。

【００２１】（Ｓ４）リンカ−分子としては、Ｄｉｓｕ
ｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｂｅｒａｔｅ等のｈｏｍｏ
ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃ
ｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（ＮＨＳ）ｅｓｔｅｒｓグル−プ分
子やＤｉｍｅｔｈｙｌａｄｉｐｉｍｉｄａｔｅ−２−Ｈ
ＣＬ等のｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｍｉｄ
ｏｅｓｔｅｒｓグル−プ分子が用いられる。また、本実
施の形態で用いたリンカ−分子は分子の両末端にアミノ
基と反応するスクシイミド基を有しているが、片方は例
えばチオ−ル基やカルボキシル基と反応するようなヘテ
ロな反応基を有するリンカ−分子を用いることも可能で
ある。

【００２２】（Ｓ５）で用いられるＤＮＡプロ−ブ１０
は、ＤＮＡプロ−ブ合成時にＤＮＡの５’末端にアミノ
基或いはチオ−ル基を付与したものが用いられる。アミ
ノ基或いはチオ−ル基の付与は、市販のＤＮＡシンセサ
イザ−の専用キットを用いて容易に得られる。ＤＮＡプ
ロ−ブに用いる塩基配列は、遺伝学的、生化学的または
免疫学的、病理学的に有意義な任意の生物学的材料に関
するものが選択される。

【００２３】キャピラリィ４の内壁５に対する（Ｓ
１）、（Ｓ２）、（Ｓ３）、（Ｓ４）および（Ｓ５）の
各プロセスでの処理条件は、キャピラリィの材質、形
状、サイズやＤＮＡプロ−ブの種類に応じて適宜設定す
ればよい。

【００２４】製作したＤＮＡキャピラリィを用いて測定
を行うには、注入用開口部２ａおよび排出用開口部２ｂ
を通じて、試料や試薬等の処理用液体の注入および排出
を行えばよい。ここで、排出用開口部２ｂからの排出時
機を種々変更することによって、所望の反応時間を得る
ことが可能となる。例えば、試料をキャピラリィ４の一
端の開口から導入し、ＴＭ値から１０〜１５度低い温度
で反応させ、キャピラリィ洗浄のため洗浄液による洗浄
操作を行った後、蛍光測定等に用いられる。ここで使用
する洗浄液は、使用温度や組成を適宜変えることによ
り、ストリンジェンシ−を調節したものが望ましい。試
料の測定に関与するプロセスが、固定化したＤＮＡに対
するハイブリダイゼ−ション反応を含む場合には、試料
中のＤＮＡはハイブリダイゼ−ション可能な状態に調製
された上で、ＤＮＡキャピラリィに適用される。試料
は、生物学的材料がそれ自体液状であるか適宜の溶液に
溶解または懸濁された液状のものをいう。従って、試料
の種類は、任意である。

【００２５】また、本実施の形態では１本のキャピラリ
ィを用いて行った例を示したが、複数本並列させるか束
状にして同時に処理することも可能である。複数のキャ
ピラリィの配置は任意であるが、測定に関与する一部ま
たは全部のプロセスにとって都合の良い配置とするのが
好ましい。

【００２６】に本発明のＤＮＡキャピラリィの第二の実
施の形態を示す。これは複数のＤＮＡキャピラリィを効
率よく製作するに適した形態を示している。（ａ）は全
体像、（ｂ）は上面から見た図を示している。ガラス又
はシリコン等の材料からなる下側基板１６ａおよび上側
基板１６ｂとを接着させた基板１６には、下側基板１６
ａ上に図示するようなパタ−ンの溝が設けられており、
これによって複数のＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３
ｂ，１３ｃ…が形成されている。（ｂ）に示すように各
々のＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…の一
端は個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…の真下まで延
在して、各個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…を通じ
て外気に開放されており、他端は合流路としての連結流
路１７で一本に連結され、共通出入口１５の真下まで延
在して、この共通出入口１５を通じて外気に開放されて
いる。個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…および共通
出入口１５は、例えばスクリ−ン印刷技術を利用して接
着剤を所定の位置に薄膜状に形成して接着することによ
り取り付けることが出来る。ＤＮＡプローブ１２ａ，１
２ｂ，１２ｃ…は、図示するように各々のＤＮＡキャピ
ラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…の流路に沿って流体の
流れる方向とは直角な方向に直線上に配置されている。

【００２７】ＤＮＡプローブの固相化プロセスは、第一
の実施の形態で述べた光反応を利用した方法が適用でき
る。第二の実施の形態においてはＤＮＡプローブの固相
化に用いる固相化用処理液は共通出入口15から連結流路
１７を介し、各々のＤＮＡキャピラリィに同時に供給で
きるとともに、それら処理液の排出もまた共通出入口１
５を通じて一括して吸引排液が行なわれる。また、紫外
線による露光プロセスは、適宜の紫外線照射手段を上方
でＸＹ方向に移動可能にし、ＤＮＡキャピラリィ１３
ａ，１３ｂ，１３ｃ…に対して直交するライン状にスキ
ャニングしながら照射することにより、一度に全てのＤ
ＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…の特定の場
所にＤＮＡプロ−ブ１２ａを形成することが出来る。本
実施形態では、下側基板１６ａが光透過性を有していな
くとも、上側基板１６ｂが光透過性であれば、下側基板
１６ａおよび上側基板１６ｂの両壁面が露光されて、環
状の固相化が達成される。

【００２８】次に、ライン状に照射する位置をＤＮＡキ
ャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…平行に所定間隔分
だけ移動し、同様のスキャニング照射を行った後にＤＮ
Ａプロ−ブ１２ｂによる固相化を行う。このような操作
を繰り返すことにより、に示すように独立して配置した
ＤＮＡプロ−ブ１２ａ，１２ｂ，１２ｃ…を形成するこ
とが出来る。なお、上述した露光プロセスにおいて、ス
キャニングの軌跡上で露光したくないＤＮＡキャピラリ
ィが有る場合には、例えば紫外線照射手段による照射の
有無を適当なスイッチ回路により選択的に切り替えるよ
うにして、スキャニングの際に紫外線が照射されないよ
うにすることにより、各ＤＮＡキャピラリィ毎に多様な
ＤＮＡプロ−ブの組合せで固相化することができる。こ
のことは、多項目の測定対象を測定する上で、必要最小
限の項目での測定を可能とするとともに、余分なＤＮＡ
の固相化を省くのに有効である。各ＤＮＡキャピラリィ
に同種のＤＮＡプロ−ブの組合せを固相化すれば、最大
キャピラリィと同数の試料に関する測定を同時に実施で
きる。

【００２９】上記の固相化プロセスにおいて、共通出入
口１５を通じてＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１
３ｃ…に導入された固相化用処理液のうち、特に、ＤＮ
Ａプロ−ブを含む液体（のＳ５参照）及びそれに続く洗
浄のための洗浄液については個別出入口１４ａ，１４
ｂ，１４ｃ…から排出するようにすれば、異なった液を
複数用いる際に起きるコンタミネーションの影響も極力
避けることが出来る。また、測定の際には個別出入口１
４ａ，１４ｂ，１４ｃ…から試料等を注入して測定を行
うことにより、異なった試料間で各液とが完全に分離さ
れた状態で流動させることが出来るので、測定精度が向
上する。

【００３０】ＤＮＡキャピラリィのサイズは用途に合わ
せ種々の大きさに加工することが出来るが、実用的には
幅が１０μｍ〜数ｍｍ、深さ１μｍ〜５００μｍ、長さ
が数ｍｍ〜１００ｍｍ、ＤＮＡキャピラリィ間隔１０μ
ｍ〜数ｍｍ程度で十分である。但し、反応の効率性を考
えると測定対象となるｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡから転
換したｃＤＮＡの拡散速度は毎秒で数μと遅いのでＤＮ
Ａキャピラリィ断面形状は、幅を広くしても深さは浅く
するような扁平構造をとることにより、反応時間の短
縮、試料の微量化、観察視野の増加等が期待できる。

【００３１】ＤＮＡキャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３
ｃ…の溝部分の物理的な加工方法としては、エキシマレ
−ザエッチング、フォトリソグラフィによるエッチング
等様々な方法が考えられ、本発明においてはその加工方
法を限定するものではないが、以下に、半導体加工技術
を用いて溝加工する方法を例にしてに従って説明する。
また、説明の都合上、ａにおける下側基板１６ａと上側
基板１６ｂとを別々にしてシラン処理したときの場合を
例にして説明する。まず、ａのように、シリコンウエハ
−基板２０に酸化膜１９を５０００Å程度形成し、さら
にレジスト膜１８を形成する。次に、ｂのように、シリ
コンウエハ−基板２０上の溝パタ−ンに応じたマスクを
製作し、アライナ−を用いてレジスト露光を行って現像
する。次に、ｃのように、パタ−ニングされたレジスト
膜18を用いて、酸化膜１９のエッチングを行う。エッチ
ングにはフッ酸とフッ化アンモニウムを１：９程度に混
合した溶液を用いる。次に、ｄのように、レジスト膜１
８を除去する。除去には硫酸と過酸化水素溶液の混合液
や酸素プラズマによる方法が用いられる。次に、ｅのよ
うに、パタ−ニングされた酸化膜19を用いてシリコンウ
エハ−基板２０のエッチングを行う。エッチング方法と
しては等方性、異方性のウエットエッチングやプラズマ
を用いたドライエッチングなど既存の様々の方法が適用
可能である。次に、ｆのように、酸化膜１９を除去す
る。この場合は単に除去するだけであるので、例えばフ
ッ酸溶液を純水で５０％に希釈した溶液に浸すことによ
り行えばよい。次に、ｇのように、エッチングされた溝
部分も含めシリコンウエハ−基板20の周囲をシリコン酸
化膜21で覆う。

【００３２】以上で溝の物理的な加工は終了するが、さ
らに、ｈに示すように、光透過性の蓋２３を接合すれ
ば、で示したような個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ
…および共通出入口１５を設けたＤＮＡキャピラリィの
アレイを形成することが出来る。ａで示された基板１６
はｈでは酸化膜２１で覆われたシリコンウエハ−基板２
０に相当する。なお、蓋２３の接合は陽極接合法を用い
ることが出来る。陽極接合法とは５００℃程度に加熱し
ながらシリコンウエハ−基板２０と蓋２３に１０００Ｖ
の電圧を印加して基板同士を接合する方法で、このため
に蓋２３にはシリコンと熱膨張率のほぼ等しいパイレッ
クス（登録商標）ガラス等を用いる必要がある。また、
この方法では、必ずしも、蓋２３を同様のシラン処理す
る必要はなく、この場合には、シリコンウエハ−基板２
０の溝部分のみに光反応によるＤＮＡプロ−ブの固相化
が行われて、Ｕ字状の固相領域が得られる。しかし、蓋
２３も同様のシラン処理を行うようにすれば、で示した
のと同様に環状にＤＮＡプロ−ブを固相化されるので、
固相効率および反応感度上有利である。

【００３３】前記溝加工においてはシリコンウエハー基
板２０を用いたが、石英やパイレックスガラスなどのガ
ラス基板を用いることもできる。その場合には基板のエ
ッチングマスクを酸化膜１９の代わりに金などの金属マ
スクを用いる。また、接合もそのまま陽極接合法を用い
ることは出来ないが、間にシリコン薄膜を形成すること
により可能となる。シリコンウエハ−基板２０のエッチ
ングマスクに用いた酸化膜１９もこれに限定されること
なく、窒化シリコン膜やアルミナ等の膜が利用できる。

【００３４】このように形成されたＤＮＡキャピラリィ
アレイには次のような作用効果がある。一度に大量のＤ
ＮＡキャピラリィが形成できるため、コストを低価格に
することが出来る。また、キャピラリィが形成する流路
に対して紫外線照射による脱保護を行うので、ＤＮＡプ
ロ−ブをキャピラリィの内壁に効率良く固定化でき、試
料の測定感度が向上する。また、多くの試料を測定する
際にもＤＮＡキャピラリィが集積化されているため、例
えば、個別出入口１４ａ，１４ｂ，１４ｃ…からそれぞ
れ異なる試料を導入して、所要時間インキュ−ベション
して生物学的反応をさせた後に、共通出入口１５から一
括して試料を回収除去し、以後、適宜、洗浄液や測定用
試薬を同様の流れで処理できるから、自動化し易くひい
ては測定処理能力の高い装置を構成することが出来る。

【００３５】なお、本発明のＤＮＡキャピラリィは、上
述した実施の形態にとらわれることなく様々な変形が可
能である。例えば、上述した各実施の形態では、その製
造および試料測定に当って、いずれも互いに異なる開口
部を用いて注入と排出とを行っているので、各々の液体
については必ず一方向の流れが存在するが、場合によっ
ては注入時の開口部と同じ開口部から排液するように
て、注入時の流れとは反対方向に戻すようにしてもよ
い。また、第一の実施形態では、キャピラリィ４への固
相化処理用液体および試料測定用液体の注入を、ピペッ
タ−のような吐出手段を利用するように説明したが、所
要量の固相化処理用液体または試料測定用液体を各々収
容している容器に直接キャピラリィ４の先端（注入用開
口部２ａ）を漬けるだけで毛管力で自然注入できるし、
排液についても、特別な吸引装置を利用しなくとも高吸
水性材料（スポンジ、高吸水性ポリマ−等）に先端（排
出用開口部２ｂ）を接触させるだけで自然排液できるの
で、用手法・自動化ともに扱い易い。また、第一の実施
形態のキャピラリィ４は、横に寝せた状態でも縦向きに
立てて使用しても同様の作用効果が得られる。縦向きに
する場合には、注入用開口部２ａ側を上側にした姿勢の
まま、上方からの注入を行うとともに排出用開口部２ｂ
を通じて下方からの排液を行うようにすることもでき
る。

【００３６】また、第二の実施形態では、各々のＤＮＡ
キャピラリィ１３ａ，１３ｂ，１３ｃ…の一端を連結流
路１７で連結しているが、各ＤＮＡキャピラリィ１３
ａ，１３ｂ，１３ｃ…を放射状に配置して一端部をいず
れも中心付近で連結することで、各流路が合流する部分
のみからなる合流路とし、他端部を同心円上に配置する
ことも可能である。また、複数のＤＮＡキャピラリィ１
３ａ，１３ｂ，１３ｃ…を連結流路１７で連結せずに、
各々独立した流路で構成するようにすれば、複数の試料
を効率良く処理する集積化アレイを提供できる。

【００３７】また、本発明のＤＮＡキャピラリィは、試
料測定以外にも、ＤＮＡまたはｍＲＮＡの分離・精製に
も利用可能である。また、本発明のＤＮＡキャピラリィ
に固相化する対象は、抗原抗体反応に関与するタンパク
を構成するものであっても構わない。また、試料測定に
当っては、本件出願前に公知であるＤＮＡプロ−ブを用
いた任意の反応原理から適宜選択すればよい。このと
き、測定に必要な種々の試薬、例えば蛍光、化学発光物
質、発色物質等の標識試薬は公知の化学分析技術にした
がって利用してよい。必要ならば、選択した反応原理に
適した市販の分析装置によって、自動測定することも可
能である。

【００３８】上述した実施形態に述べたように、本発明
のＤＮＡキャピラリィは、それ自体が液体を流す流路を
形成しているため、上述した固相化、測定、分離等の各
種反応や洗浄操作も容易に行え、液体処理装置のような
種々の液体を連続的に処理するような装置に接続するだ
けで容易に一連の操作を行わせることが出来る。また、
予め所望の塩基配列からなるＤＮＡプロ−ブを用いるこ
とにより、１回の光照射でＤＮＡプロ−ブを固相化でき
るため、ＤＮＡプロ−ブへのダメ−ジをきわめて少なく
することが出来、良好な固相化状態を保てるという利点
がある。また、光反応を利用することで、複数のＤＮＡ
プロ−ブが流路に沿って直列して環状に且つ縞状に配置
されているので、試料を流路中に導入するだけで複数の
ＤＮＡプロ−ブと同時に且つ効率良く結合反応させるこ
とができる。さらに、ＤＮＡプロ−ブを固相化した表面
はキャピラリィの内面に保護されるため、汚染の影響も
少なくより一層のハンドリングの容易さが期待できる。

【００３９】図６に直列配置領域（１３ａから１３ｃ）
としての流路に沿ってその配置領域に垂直になるように
互いに独立して且つ縞状に配置されている複数の固相化
領域（１２ａから１２ｃ）からなる固相化領域群２２を
具備する集積化反応装置の例を示す。

【００４０】

【発明の効果】固相化領域毎に固相化された固相化対象
を用いた測定を行う際に、必要な各処理用の流体、例え
ば試料や洗浄液のような各種液体の取り扱いが簡単であ
る。

【００４１】また、複数の固相化領域群に亘り、直列す
る複数の固相化領域に固相化される固相化対象について
効率よく検出することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】従来のＤＮＡプローブの固相化方法を説明する
ための図。

【図２】本発明のＤＮＡキャピラリィの第一の実施の形
態を示す図。

【図３】ＤＮＡプロ−ブをキャピラリィの内壁に固定化
する方法を説明するための図。

【図４】本発明のＤＮＡキャピラリィの第二の実施の形
態を示す図。

【図５】本発明のＤＮＡキャピラリィにおいて半導体加
工技術を用いて溝加工する方法を説明するための断面
図。

【図６】本発明の反応装置の例を示す図。

【符号の説明】

１ＤＮＡプロ−ブ２ａ注入用開口部２ｂ排出用開口部４キャピラリィ５内壁１３ＤＮＡキャピラリィ１４個別出入口１５共通出入口１６基板１７連結流路

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複数の固相化領域が直列配置されて延在
する固相化領域群と、前記固相化領域毎に固相化された生物学的反応のための
固相化対象と、を具備し、前記固相化領域群を前記直列配置された領域について互
いに平行になるように複数並列されるか束状に集積化さ
れていることを特徴とする集積化反応装置。
【請求項２】（１）複数の固相化領域が直列配置され
て延在する固相化領域群であり、且つ前記固相化領域群
が前記直列配置された領域について互いに平行になるよ
うに複数並列されるか束状に集積化されていることを特
徴とする固相化領域群に固相化される生物学的反応のた
めの固相化対象と試料とを反応させる工程と、（２）複数の固相化領域群に亘って直列する固相化領域
毎に生じた測定対象による反応パターンを測定する工程
と、を具備するを使用する生物学的測定対象の検出方
法。
【請求項３】前記固相化領域群が、一体に配置されて
いることを特徴とする請求項１に記載の集積化反応装
置。
【請求項４】前記複数個の固相化領域群の全てが、１
本に連結されていることを特徴とする請求項１または３
の何れか１項に記載の集積化反応装置。
【請求項５】前記複数の固相化領域群の全てを１本に
連結して、一方方向に沿った反応または測定を行うこと
を特徴とする請求項２に記載の検出方法。