CN105203523A - 一种基于sers技术检测血清中特异性抗原的微流装置 - Google Patents

Abstract

一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置，该装置为三明治结构，主要由3微流液进口、1个微流液出口、SERS检测单元和传感控制器组成。在控制传感器的控制下，各微流通道入口的微流液在通道内发生抗原抗体反应，SERS检测单元使生成微流液中免疫复合物分离，聚集在离SERS检测单元最近的微流通道内，对免疫复合聚集物进行拉曼测试，根据所得到的SERS信号强度数据处理分析可得出待测抗原在血清中的浓度，判断是否患有疾病。该装置具有耗费时间少，样品损耗少，检测时间短、可重复利用等特点。

Description

一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置

技术领域

本发明属于光谱学和生物分析领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼散射技术检测血清中特异性抗原的微流装置的设计及应用。

背景技术

随着环境问题的日益严重，我们所处在一个极易被病毒感染的环境中。非典、流感、MERS等病毒让人人自危，大部分病毒都是存在于血液当中，如何检测血清中的某种病毒含量的方法在早期诊断和曝光后治疗诊断有着重要作用。已知利用抗原抗体反应用于测量血清病毒细胞的检测手段有免疫荧光显微镜法、酶联免疫测定法和聚合酶链式反应检测，但存在一定缺陷。免疫荧光显微镜成本高，用于定量测试有一定困难，且技术程序较复杂。酶联免疫测定法较难寻找合适的酶催化底物，使其在应用上有一定困难，而且显示对比存在较大的误差。聚合酶链式反应检测技术手段困难，对仪器设备要求过高，操作繁琐，价格昂贵。这些缺点限制了这些手段的应用，只能用于实验室检测。

表面增强拉曼散射(简称为SERS)是指在粗糙的金属(如金、银、铜)的表面或溶胶体系中，由于样品表面或近表面的电磁场的增强导致分子的拉曼散射信号较普通拉曼散射信号大大增强的现象。近年来，SERS已经成为一种成熟的分子振动光谱技术，广泛应用于化学、材料和生命科学等领域。SERS所得到的拉曼光谱信号强度比常规拉曼光谱信号强度高出10⁶以上的数量级，为痕量物质检测开拓了一个新的技术方向。微流体技术是指流体在微米级别的通道中对其操控的技术，通过对微流体***所需的器件包括泵、阀、混合器、过滤器等的加工，将装置加工成一块芯片大小。微流控装置具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点。近年来微流体技术的快速发展，已经在化学、医药及生命科学等领域上造成革命性的冲击。利用微流技术与SERS技术手段联用，可以在生物分子检测和痕量样品检测应用上开启一个新的方向。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置。该装置通过对人体血清中某些病毒细菌的特异性抗原含量的测定，可以判断人体血清中这些病毒细菌的含量是否超过人体健康标准。待测试人体血清样本、结合了特异性抗体的免疫磁珠溶液、结合待测血清抗原的核壳结构金纳米粒子溶液分别通过其对应的微流通道入口注入到微流装置中，通过安装在入口处的微流泵控制微流通道中的流速。在微流装置中，血清中的病毒抗原和金纳米颗粒携带的抗原与磁珠携带的抗体发生免疫复合反应，生成的免疫复合物键合在磁珠上。在微流装置末端，通过控制SERS检测单元上的通电螺线管来吸附键合了特异性抗原抗体复合物的磁珠，聚合物吸附在离SERS检测单元最近的微流通道处。对磁珠携带的免疫复合物进行拉曼光谱测试，并对光谱数据进行化学计量学分析，最终得到血清中待测抗原的浓度。

本发明所采用的技术方案是：一种基于SERS技术检测人体血清中特异性抗原的微流装置，主要由待测血清样品通道入口(1)、结合了特异性抗体的免疫磁珠通道入口(2)、结合了待测血清抗原的核壳结构金纳米粒子通道入口(3)、微流装置通道出口(4)、SERS检测单元(5)、传感控制器(6)组成。该微流装置为三明治结构，最下层为基底层，中间层为微流通道层，上层为封装层。每个微流通道入口与相应的微流导管相连；待测血清样品通道口(1)、免疫磁珠通道口(2)、金纳米粒子通道口(3)处安装了控制通道中流速的微流泵。微流通道采用螺线管形状设计。在微流装置底部，分布着SERS检测单元(5)和微流装置传感控制器(6)，二者均贴片放置在封装层上。

进一步地，在本发明中，该微流通道底层和封装层为使用石英层或聚乙烯构成的透明结构；微流通道层使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料加工形成方形通道，所有通道为200-250μm宽、80-100μm高。

进一步地，在本发明中，SERS检测单元包含一个可控制开关的通电螺线管，通过开关来控制SERS检测单元对免疫复合物的聚集。

进一步地，在本发明中，传感控制器包含中心控制芯片、显示流速的LED显示屏、微流泵组成，传感控制器通过控制微流泵的转速使得微流通道入口处三种液体流速一致，达到最佳免疫反应条件。

一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置，使用方法包括以下步骤：

1)微流装置制备：以石英玻璃为底层，在上面涂抹一层光刻胶，用软光刻技术在光刻胶上刻出微流通道形状，使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)处理生成微流通道层，加热固化底层和中间层，所有微流通道为200-250μm宽、80-100μm高，通过热压法对微流通道层和相应的最上层进行封装，在微流装置封装层上贴片放置SERS检测单元和传感控制器；

2)制备结合了待测抗原的核壳结构的金纳米粒子：通过氯金酸盐和柠檬酸钠水溶液法得到粒径为50nm左右的金纳米粒子，然后得到金胶体纳米粒子与正硅酸乙酯(TEOS)和氨水反应，生成具有金核二氧化硅壳的纳米粒子，二氧化硅壳厚度约为2nm；使用物理或化学方式对纳米粒子处理，使其表面修饰待测血清中的抗原；

3)制备结合了特定抗体的免疫磁珠：1μm大小磁珠通过购买获得，对磁珠进行生物保护处理，在其表面包裹一层生物免疫膜，如链霉亲和素，用生物方法使特定抗体修饰在磁珠表面，制备磁珠保存在生理溶液中；

4)打开传感控制器开关，分别在各个微流通道入口通入相对应的微流液，微流液在微流通道内流动1分钟后调控传感控制来控制好微流液流速，打开SERS检测单元开关，当离SERS检测单元最近的微流通道内聚集大量黑色磁性复合物，关闭传感控制器停止微流液的流动；将微流装置置于拉曼光谱仪的样品池中，对聚集的复合物进行不同位置的信号测试；

5)数据处理，得到结果：通过得到的SERS光谱数据进行化学计量学分析，得到该检测特异性抗原的浓度。

本发明的有益效果如下：

1)本发明设计的一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置，整个装置大小约为一个火柴盒大小，便于测试和携带，可直接置于拉曼样品池中检测。通过在待测区域对免疫复合物进行SERS光谱测试，可以获得高重复高特异性的SERS信号，为生物分子检测开拓了一个新思路。

2)通过SERS技术与微流技术联用，用于检测血清中特异性抗原，利用本装置检测，具有检测耗时少，检测样品少，结果准确，灵敏度高，微流装置可重复利用的特点。

附图说明

图1为一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置的平面结构图；

图2为一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置的3维图；

图3为一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置检测抗原流程图；

图4为待测抗原、免疫磁珠、金纳米粒子发生特异性抗原抗体反应过程；

图1中，1为待测血清样品通道入口；2为结合了特定抗体的免疫磁珠通道入口；3为结合了待测抗原的核壳结构金纳米粒子通道入口；4为微流通道出口；5为SERS检测单元；6为传感控制器；61、62、63为传感控制器内的微流泵。

具体实施方式

下面结合微流装置图对本发明结构原理和工作原理作更进一步的说明。

如图1和图2，一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置，主要由待测血清样品通道口1、与特定抗体结合的免疫磁珠通道口2、与检测抗原结合的核壳结构金纳米粒子通道口3、微流通道出口4、SERS检测单元5，传感控制器6组成。

图3为一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置检测抗原流程图，首先打开传感控制器开关，各微流通道入口流入相对应的微流液，传感控制器控制好各微流通道入口微流液的流速，微流液在微流通道内流动1分钟后，打开SERS检测单元开关，发现离SERS检测单元最近的微流通道内聚集了一层黑色的免疫复合物，当免疫复合物肉眼观察不在增多时，关闭传感控制器停止微流液的流动；将微流装置置于拉曼光谱仪的样品池中，对聚集的复合物进行不同位置的信号测试，通过对SERS光谱数据进行化学计量学分析，得出待测血清中特异性抗原的浓度。

传感控制器6通过微流泵61、62、63来控制好各微流通道内微流液速度，检测样品血清通过1通道入口进入微流装置，结合了特定抗体免疫磁珠通过2通道入口进入微流装置，使得二者混合一段时间，初步发生抗原抗体特异性结合反应，待测血清中的特异性抗原吸附在免疫磁珠上。反应一定程度的免疫磁珠和与结合了待测血清抗原的核壳结构金纳米粒子进一步免疫复合反应，三者反应形成一个聚集在一起的磁性免疫复合物，免疫复合反应如图4所示。当微流液流经微流装置底部，微流液中的磁性免疫复合物由SERS检测单元5分离，通过磁性吸附作用，使磁性免疫复合物聚集在离SERS检测单元最近的微流通道内，微流反应结束后，将整个微流装置置于拉曼光谱样品池中，调节激发光焦距于SERS检测单元5聚集的磁性免疫复合物上，进行拉曼测试，得到特异性好的SERS光谱。通过使用该微流装置对不同标准血清样品进行测试，得到不同的SERS谱线，对这些SERS谱线进行数据处理和线性拟合，得到一个浓度曲线公式，存于数据库中，与未知浓度待测血清得到的SERS光谱数据对比，然后便可检测未知浓度血清中的特异性抗原的浓度，进一步判断人体是否患有疾病。

本发明中与待测抗原结合的金核二氧化硅壳结构的纳米粒子作为SERS增强的贵金属；离SERS检测单元最近的微流通道内聚集的免疫复合物作为SERS基底。

本发明中使用的表面键合了特定抗体结合免疫磁珠大小为1μm，能使抗原抗体充分地键合在磁珠表面，磁珠使用对血清无损害的生物膜包裹，如链霉亲和素。

本发明中使用待测血清抗原与核壳结构金纳米粒子结合是为了使核壳结构金纳米粒子键合到磁珠上，方便SERS信号测试；

传感控制器通过控制微流泵的转速使得微流通道中三种液体流速一致，达到最佳免疫反应条件。选择与待测抗原结合的核壳结构的金纳米粒子是为了利用贵金属纳米粒子来增强待测抗原的拉曼信号，核壳结构的金纳米粒子能够有效的避免这些纳米粒子在溶液中发生团聚，二氧化硅壳厚度最优为2nm，金纳米粒子直径为30-50nm。

SERS检测单元中的通电螺线管通电产生磁性，聚集已经在通道内发生免疫复合反应的磁性免疫复合物，通过控制通电螺线管的磁场大小，使磁性免疫复合物仅聚集在最靠近SERS检测单元的微流通道处，通过测量不同位置该复合物的SERS信号，从而对待测样品达到检测效果。

实施例1

1)制备微流装置：以石英玻璃为底层，在上面涂抹一层光刻胶，用软光刻技术在光刻胶上刻出微流通道形状，使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)处理生成微流通道层，加热固化底层和中间层，所有通道为200-250μm宽、80-100μm高，通过热压法对微流通道层和相应的最上层进行封装，在微流装置封装层上贴片放置SERS检测单元和传感控制器。微流装置底层为3mm，封装层厚度为3mm，整个微流装置大小为6cm×8cm×0.8mm。

2)结合了待测血清抗原的核壳结构纳米粒子的制备：通过氯金酸盐和柠檬酸钠水溶液法得到粒径为50nm左右的金纳米粒子，然后得到金胶体纳米粒子与正硅酸乙酯(TEOS)和氨水反应，生成具有金核二氧化硅壳的纳米粒子，二氧化硅壳厚度约为2nm；使用物理或化学方式对纳米粒子处理，使其表面修饰待测血清中的抗原。

3)结合了特异性抗体磁珠的制备：1μm大小磁珠通过购买获得，对磁珠进行生物保护处理，在其表面包裹一层生物免疫膜，如链霉亲和素，用生物方法使特定抗体修饰在磁珠表面。

4)打开传感控制器开关，分别在各个微流通道入口通入相对应的微流液，微流液在微流通道内流动1分钟后调控传感控制来控制好微流液流速，打开SERS检测单元开关，当离SERS检测单元最近的微流通道内聚集大量黑色磁性复合物，关闭传感控制器停止微流液的流动；将微流装置置于拉曼光谱仪的样品池中，对聚集的复合物进行不同位置的信号测试；

5)数据处理，得到结果：通过得到的SERS光谱数据进行化学计量学分析，得到该检测特异性抗原的浓度。

实施例2

以检测血清中炭疽病毒为例，炭疽芽孢杆菌是主要由γ-聚谷氨酸(PGA)组成，可以通过检测血清中PGA的含量，从而确定人体内炭疽芽孢杆菌的含量。

1)制备微流装置：以石英玻璃为底层，在上面涂抹一层光刻胶，用软光刻技术在光刻胶上刻出微流通道形状，使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)处理生成微流通道层，加热固化底层和中间层，所有通道为200-250μm宽、80-100μm高，通过热压法对微流通道层和相应的最上层进行封装，在微流装置封装层上贴片放置SERS检测单元和传感控制器。微流装置底层为3mm，封装层厚度为3mm，整个微流装置大小为6cm×8cm×0.8mm；

2)制备结合了特异性抗原的核壳结构金纳米粒子：通过氯金酸盐和柠檬酸钠水溶液法得到粒径为50nm左右的金纳米粒子，然后得到金胶体纳米粒子与正硅酸乙酯(TEOS)和氨水反应，生成具有金核二氧化硅壳的纳米粒子，二氧化硅壳厚度约为2nm。所得纳米粒子通过二氢硫辛酸(DHLA)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)处理后与待测血清溶液反应混合，所制备粒子PBS缓冲液中；

3)制备结合了特异性抗体的磁珠：选取大小为1μm的磁珠，一定量浓度的NHS和PGA抗体反应一段时间后，把浸泡链霉亲和素的磁珠加入溶液中，混合后离心搅拌出去上清液。保存在在PBS缓冲液中；

4)打开传感控制器开关，分别在各个微流通道入口通入相对应的微流液，微流液在微流通道内流动1分钟后调控传感控制来控制好微流液流速，打开SERS检测单元开关，当离SERS检测单元最近的微流通道内聚集大量黑色磁性复合物，关闭传感控制器停止微流液的流动；将微流装置置于拉曼光谱仪的样品池中，对聚集的复合物进行不同位置的信号测试；

5)数据处理，得到结果：通过得到的SERS光谱数据进行化学计量学分析，得到该检测特异性抗原PGA的浓度。

以上所述仅为本发明专利的较佳实施方法，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置，主要由待测血清样品通道入口(1)、结合了特异性抗体的免疫磁珠通道入口(2)、结合了待测血清抗原的核壳结构金纳米粒子通道入口(3)、微流装置通道出口(4)、SERS检测单元(5)、传感控制器(6)组成。该微流装置为三明治结构，最下层为基底层，中间层为微流通道层，上层为封装层；每个微流通道入口与相应的微流导管相连；待测血清样品通道入口(1)、免疫磁珠通道入口(2)、金纳米粒子通道入口(3)处安装了控制通道中流速的微流泵，微流通道采用螺线管形状设计；在微流装置底部，分布着SERS检测单元(5)和微流装置传感控制器(6)，二者均贴片放置在封装层上。

2.根据权利1要求所述的一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置，其特征在于：该微流通道底层和封装层为使用石英层或聚乙烯构成的透明结构；微流通道层使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜加工形成方形通道，所有通道为200-250μm宽、80-100μm高。

3.根据权利1要求所述的一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置，其特征在于：SERS检测单元包含一个可控制开关的导电磁棒。

4.根据权利1要求所述的一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置，其特征在于：传感控制器包含中心控制芯片、显示流速的LED显示屏、微流泵组成，传感控制器通过控制微流泵的转速使得微流通道入口处三种液体流速一致，达到最佳免疫反应条件。

5.根据权利1要求所述的一种基于SERS技术检测血清中特异性抗原的微流装置，检测方式包括以下步骤：

1)制备权利要求1至4任意一项所述的微流装置；

2)制备结合了待测血清抗原的核壳结构金纳米粒子；

3)制备结合了特定抗体的免疫磁珠；

4)打开传感控制器开关，分别在各个微流通道入口通入相对应的微流液，预流1分钟后调控传感控制器来控制微流液流速，在微流通道内发生抗原抗体复合反应，打开SERS检测单元开关，通电螺线管具有磁性，使得反应生成的磁性免疫复合物聚集在离SERS检测单元最近的微流通道内，当肉眼观察黑色免疫复合物不在增加时，关闭传感控制器停止微流液的流动；将微流装置置于拉曼光谱仪的样品池中，对聚集的复合物进行不同位置的信号测试；

5)通过对得到的SERS光谱数据进行化学计量学分析，得到该检测特异性抗原的浓度。