IT201700004589A1

IT201700004589A1 - Kit e metodo per l’immissione di uno o più fluidi in un dispositivo microfluidico

Info

Publication number: IT201700004589A1
Application number: IT102017000004589A
Authority: IT
Inventors: Nicola Pecorari; Andrea Faenza; Dario Biscarini; Massimo Bocchi
Original assignee: Cellply S R L
Priority date: 2016-12-01
Filing date: 2016-12-01
Publication date: 2018-06-01

Description

Titolo: “Kit e metodo per l’immissione di uno o più fluidi in un dispositivo microfluidico”

Descrizione

E’ oggetto della presente invenzione un sistema per lo scarico di uno o più fluidi in un dispositivo microfluidico. Si descrive una regione di scarico (70) compresa in un dispositivo microfluidico (1) che comprende: un contenitore di scarico (12) in collegamento fluidico con detto dispositivo microfluidico (1) tramite almeno un canale di scarico (22) e una porta di uscita (10).

Stato dell’arte

La movimentazione di fluidi in dispositivi microfluidici tipicamente si avvale di pompe, a vuoto o a spinta, e/o di valvole. La combinazione di pompe e valvole permette un controllo fine dei movimenti di fluidi in un circuito.

A titolo di esempio Byun et al. (Pumps for Microfluidic Cell Culture, Electrophoresis 2014, 35:245–257) descrivono dispostivi microfluidici per la coltura cellulare e sistemi di pompaggio associate agli stessi. Anche in Au et al. (Microvalves and Micropumps for BioMEMS, Micromachines 2011, 2:179-220) sono descritte un’ampia varietà di valvole e pompe, da usarsi in specifiche combinazioni, ciascuna con caratteristiche peculiari che la rendono applicabile in determinati contesti e non in altri.

Dalla letteratura disponibile, emerge che non vi sono parametri standard sui quali basare la scelta di microvalvole e micropompe, rendendo necessario uno specifico studio per ciascun specifico sistema.

Un problema fortemente avvertito è quello di gestire in maniera efficiente il movimento bidirezionale di fluidi in un microcircuito, senza doversi necessariamente basare su pompe e valvole, ingombranti e impegnative dal punto di vista dei costi di acquisto e di gestione.

Un ulteriore problema associato ai dispositivi microfluidici basati su valvole è che, qualora sia prevista l’integrazione di valvole nel microsistema per ottenere alto parallelismo e/o ingombri ridotti, la complessità tecnologica richiesta è elevata, data per esempio la necessità di integrare elastomeri oltre a materiali rigidi.

La presente invenzione offre una soluzione semplice e vantaggiosa al problema, permettendo l’impiego di un comune strumento di liquid handling per il caricamento, il pompaggio ed eventualmente lo scarico ad alta precisione di fluidi in un dispositivo microfluidico. Descrizione dell’invenzione

Descrizione delle figure

Figura 18: schema del kit secondo la presente invenzione che comprende un puntale e un dispositivo microfluidico. Figura 19: rappresentazione schematica di una forma di realizzazione del kit secondo la presente invenzione. (A) puntale, (B) regione di ingresso, (C) puntale inserito nella regione di ingresso.

Figura 20: rappresentazione schematica di una forma di realizzazione del kit secondo la presente invenzione, puntale inserito nella regione di ingresso.

Figura 21: rappresentazione schematica di una ulteriore forma di realizzazione del kit secondo la presente invenzione. (A) puntale, (B) regione di ingresso, (C) puntale inserito nella regione di ingresso.

Figura 22: rappresentazione schematica di una ulteriore forma di realizzazione del kit secondo la presente invenzione, puntale inserito nella regione di ingresso che comprende un canale verticale e un connettore.

Figura 23: rappresentazione schematica di una ulteriore forma di realizzazione del kit secondo la presente invenzione. (A) puntale, (B) regione di ingresso, (C) puntale inserito nella regione di ingresso, (D) puntale inserito nella regione di ingresso in una forma di realizzazione alternativa.

Figura 24: rappresentazione schematica di una ulteriore forma di realizzazione del kit secondo la presente invenzione. (A) puntale, (B) regione di ingresso, (C) puntale inserito nella regione di ingresso, (D) puntale inserito nella regione di ingresso in una forma di realizzazione alternativa.

Figura 25: sistema a micropozzetti aperti invertito secondo la presente invenzione, vista dall’alto.

Figura 26: sistema a micropozzetti aperti invertito secondo una ulteriore forma di realizzazione, vista dall’alto.

Figura 27: tre forme di realizzazione, nei pannelli A, B e C, della regione di scarico (70) di un dispositivo microfluidico (1).

Figura 1: schema esemplificativo di un sistema a micropozzetti aperti invertito impiegato nella metodica della presente invenzione, vista prospettica (a), sezione verticale (b) e vista dall’alto (c).

Figura 2: schema di un sistema a micropozzetti aperti invertito impiegato in una ulteriore forma di realizzazione della metodica della presente invenzione, vista prospettica (a), sezione verticale (b) e vista dall’alto (c).

Figura 3: schema di un sistema a micropozzetti aperti invertito impiegato in una forma di realizzazione preferita della metodica della presente invenzione, vista prospettica (a), sezione verticale (b) e vista dall’alto (c).

Figura 4: schema di un sistema a micropozzetti aperti invertito impiegato in una ulteriore forma di realizzazione preferita della metodica della presente invenzione, vista prospettica (a), sezione verticale (b) e vista dall’alto (c).

Figura 5: vista in sezione di una porzione di sistema a micropozzetti aperti invertito impiegato nella metodica della presente invenzione.

Figura 6: esempio di immagini acquisite nel visibile (A), nel canale fluorescente DAPI (B), nel canale fluorescente FITC (C) e nel canale fluorescente CY5 (D). (E) è il risultato della sovrapposizione delle immagini acquisite nel canale FITC e nel canale CY5.

Figura 7: classificazione della popolazione cellulare della Figura 6 secondo i diversi parametri valutati.

Figura 8: classificazione delle cellule tumorali in un campione di midollo osseo estratto da paziente malato di Leucemia acuta mieloide (AML). In (A) e (B) risultati ottenuti al FACS, in (C) e (D) risultati ottenuti secondo la metodica descritta nella presente applicazione. In (A) e (C) la lettura basale, effettuata su cellule controllo non marcate, che permette di definire un valore soglia, indicato dalla freccia; in (B) e (D) la conta delle cellule positive per l’anticorpo anti CD34, ovvero degli eventi al di sopra del valore definito soglia.

Figura 9: dati ottenuti su un mix di cellule estratte da donatore sano e una linea cellulare di linfoma di Burkitt (Raji) secondo la metodica descritta nella presente applicazione. Classificazione delle cellule tumorali all’interno di un mix di cellule estratte da donatore sano e cellule tumorali (A), analisi della morte cellulare nella popolazione tumorale e in quella sana (B) e curva dose/risposta dopo esposizione al farmaco (C).

Figura 10: rappresentazione schematica in sezione di un sistema a micropozzetti aperti invertito utilizzato in una forma alternativa alla metodica secondo la presente descrizione, che comprende altresì elettrodi nel micropozzetto e sulla superficie inferiore del canale. Figura 11: saggio su cellule tumorali SU-DHL-4 trattate (RTX) e non trattate (CTRL) con l’anticorpo monoclonale Rituximab. (A) osservazione delle cellule vive (grigio chiaro) e delle cellule morte (indicate con la freccia) al tempo zero (T0), e dopo 30 (T1) e 60 (T2) minuti di trattamento utilizzando la metodica secondo la presente invenzione; (B) conta delle cellule vive al T0, T1 e T2 ottenuta mediante citofluorimetria; (C) confronto tra i dati di conta cellulare ottenuti dopo 60 minuti di trattamento mediante citofluorimetria o utilizzando la metodica secondo la presente invenzione.

Figura 12: Conta cellulare indicata come percentuale delle cellule tumorali SU-DHL-4 sopravvissute in seguito al trattamento, ottenuta al FACS (quadretti) e utilizzando la metodica secondo la presente invenzione (cerchio) in cellule controllo (grigio chiaro) e trattate con Rituximab (grigio scuro).

Figura 13: classificazione di cellule tumorali Raji all’interno di un mix di cellule estratte da donatore sano e dette cellule tumorali Raji utilizzando la metodica secondo la presente invenzione. (A) osservazione in contrasto di fase e in fluorescenza; (B) dati morfologici cellula-specifici; (C) classificazione delle cellule considerando parametri morfologici (diametro) e funzionali (espressione CD38); (D) analisi statistica dei dati morfologici (diametro) e funzionali (espressione CD38) da una popolazione di cellule sane (Cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC) e tumorali (Raji).

Figura 14: Variazione del segnale di fluorescenza nel tempo. Dati ottenuti in time-lapse in modalità cellulospecifica (A) o come osservazione totale della popolazione cellulare (B). In figura (A) sono evidenziate colonne dell’istogramma che corrispondono alla sottopopolazione che ha subito il minor danno cellulare, ovvero la minor variazione relativa di segnale fluorescente. In figura (B) sono evidenziate le colonne corrispondenti a sottopopolazioni che contengono le medesime cellule identificate nel grafico (A).

Figura 15: Processo di marcatura automatizzato. In (A) è riportato il segnale di fondo ed in (B) la variazione di detto segnale nel tempo, così come misurato in un micropozzetto operando con una velocità di flusso di 16 µl/minuto. La linea tratteggiata in (A) rappresenta il segnale di fondo che si misura non operando in timelapse, ma alternando lavaggio a misurazioni. In (C) è riportato il rapporto segnale/rumore di fondo espresso come il segnale medio misurato sulle cellule diviso per il segnale di fondo medio. In (D) sono riportate foto rappresentative della raccolta di immagini in time-lapse durante i lavaggi.

Figura 16: Analisi temporale al citofluorimetro della variazione del segnale emesso alla lunghezza d’onda di 480 nm (FITC) da cellule Jurkat marcate con Fluo-4 a seguito della stimolazione con (a) Ionomicina e (b) anticorpo OKT3 purificato.

Figura 17: Analisi temporale nel sistema a micropozzetti aperti della variazione del segnale emesso alla lunghezza d’onda di 480nm (FITC) da cellule Jurkat marcate con Fluo-4 a seguito della stimolazione con (a) Ionomicina e (b) anticorpo OKT3 purificato. Le curve tratteggiate rappresentano l'andamento del segnale ottenuto per singole cellule all'interno dei micropozzetti. La curva continua rappresenta il valor medio del segnale.

Descrizione dettagliata dell’invenzione:

Vengono qui descritti un dispositivo microfluidico (1), un kit che comprende un puntale (20) ed una regione di ingresso (18) di un dispositivo microfluidico (1), una regione di scarico (70) di detto dispositivo microfluidico (1). Formano altresì parte della presente descrizione un metodo per l’immissione e/o lo scarico di uno o più fluidi da detto dispositivo microfluidico (1) e un metodo per l’analisi high-content in detto dispositivo microfluidico (1).

Definizioni:

Con accoppiamento ad interferenza si intende qui una cooperazione tra due elementi, tale per cui detti due elementi possano considerarsi incastrati. Quando detti due elementi, nella fattispecie un puntale ed un canale verticale, sono accoppiati ad interferenza, un fluido caricato in detto puntale e rilasciato in detto canale verticale è forzato a muoversi all’interno del canale, detto accoppiamento ad interferenza essendo tale da impedire il passaggio di fluido, ovvero detto accoppiamento ad interferenza è tale da sigillare tra loro i due elementi.

Con connettore si intende qui qualsiasi elemento tubolare, di forma cilindrica, più o meno rastremato, convergente o divergente, funzionale a mettere in comunicazione fluidica due compartimenti.

Con semiapertura del tronco di cono si intende l’angolo formato dalla retta generatrice di detto tronco di cono con la retta che costituisce l’asse di rotazione dello stesso.

Fluido: qualsiasi sostanza in forma liquida o gassosa. Campione biologico: campione che comprende cellule ottenuto da un microorganismo, un animale e/o un uomo, preferibilmente da un uomo, dove detto campione è preferibilmente selezionato nel gruppo che comprende fluidi biologici o biopsie. Detto campione comprende cellule in sospensione, oppure è un tessuto. In una forma preferita di realizzazione, è un campione di sangue o un aspirato di midollo osseo. Alternativamente, detto campione biologico è costituito da cellule in coltura, quali ad esempio una linea cellulare, oppure da una composizione che comprende cellule in coltura e cellule da paziente.

Saggio high-content: saggio fenotipico condotto su cellule.

Time-lapse: tecnica di acquisizione di immagini che prevede una serie di scatti dello stesso campo raccolti in successione temporale.

Ex-vivo: sperimentazione effettuata su un tessuto ottenuto da un organismo in un ambiente esterno all’organismo stesso, con alterazione minima delle condizioni naturali.

Kit e metodo per l’immissione di uno o più fluidi in un dispositivo microfluidico

Forma oggetto della presente invenzione un kit che comprende un puntale (20) e un dispositivo microfluidico (1) che comprende almeno un microcanale (3) e una regione di ingresso (8) che comprende almeno un canale verticale (18), detto puntale (20) e detto canale verticale (18) essendo dimensionati in modo da produrre un accoppiamento ad interferenza fra di essi.

Detto puntale è selezionato tra uno dei puntali disponibili in commercio che comprendono almeno una porzione prossimale destinata a cooperare con un sistema di dispensazione di fluidi ed una porzione distale rastremata aperta.

Con riferimento alla figura 18, detto puntale (20) comprende una porzione prossimale (22) destinata a cooperare con un sistema di dispensazione di fluidi ed una porzione distale (21), detta porzione prossimale (22) di configurazione generalmente tubolare e detta porzione distale (21) rastremata aperta dove la base terminale (25) di detta porzione distale (21) ha un diametro esterno di dimensioni d3, e la base superiore (24) di detta porzione distale (21) ha un diametro esterno di dimensioni d4, dove detta regione di ingresso (8) comprende un canale verticale (18) che immette, opzionalmente per il tramite di uno o più connettori, in detto almeno un microcanale (3), l’apertura verso l’alto di detto canale verticale (18) avendo un diametro che misura d2, laddove d3<d2, detto puntale (20) e detto canale verticale (18) essendo dimensionati in modo da produrre un accoppiamento ad interferenza fra di essi. Detto accoppiamento ad interferenza avviene tipicamente secondo una delle modalità schematizzate nelle figure 19 e 20. Con riferimento alla figura 19, detto puntale (20) e detto canale (18) hanno come punto di contatto a tenuta la base superiore (9) di detto canale verticale (18). Con riferimento alla figura 20, il punto di contatto a tenuta è all’interno del canale verticale (18), essendo in questa versione la base terminale (25) della porzione distale (21) del puntale (20) ad entrare in contatto con la parete interna di detto canale verticale (18). In entrambi i casi, si verifica un contatto a tenuta. Preferibilmente, detta porzione terminale (21) di detto puntale (20) e detto canale verticale (18) sono in materiale plastico e rendono il sistema elastico quanto basta a garantire la tenuta, evitando guarnizioni. In una forma particolarmente preferita, le geometrie del sistema più oltre descritte garantiscono che il contatto tra detto canale verticale (18) e detto puntale (20) non avvenga in un singolo punto ma sia distribuito su una porzione di superficie, garantendo ulteriormente una tenuta efficace. In particolare, è vantaggiosamente verificata questa condizione laddove l’angolo di semiapertura di detta porzione terminale (21) di detto puntale e di detto canale verticale (18) sono tra loro poco differenti, preferibilmente differiscono tra loro di meno di 10°. Ancor più preferibilmente, detto canale verticale (18) è un cilindro, opzionalmente leggermente rastremato verso il basso.

Con riferimento alla figura 19A, la lunghezza di detta porzione distale (21) di detto puntale (20) è h2, la semiapertura del tronco di cono formato da detta porzione distale (21) misura (90°- �) e la lunghezza di detta porzione prossimale (22) misura h3. Si rimanda alla stessa figura 19A per una descrizione ancora più esaustiva di detto puntale, dove è indicato l’angolo (26) di misura � e l’asse longitudinale x che permette la definizione di detta semiapertura del tronco di cono. Le figure da 20 a 24 e la descrizione che segue intendono rappresentare alcune forme di realizzazione particolarmente preferite dell’invenzione, non vogliono in alcun modo limitare l’ambito di tutela della stessa che si estende a quanto rivendicato nella rivendicazione 1.

In una forma preferita di realizzazione, il riferimento è alla figura 19, dove detto canale verticale (18) è un canale rastremato verso il basso che ha una base superiore (9) e una base inferiore (12), detta base inferiore (12) avendo un diametro di dimensioni d1 e detta base superiore (9) avendo diametro di dimensioni d2, detto canale verticale (18) avendo un altezza h1 e la semiapertura del tronco di cono formato da detto canale rastremato misura (90° - �1). In una forma preferita, �1 è di 90° e detto canale verticale (18) è un cilindro.

Preferibilmente, dette misure � e �1 differiscono tra loro di un massimo di 15°, preferibilmente di 10°, ancora più preferibilmente di un valore compreso tra i 4 e i 5°.

In una forma preferita di realizzazione, con riferimento alla figura 19A, 19C, detta porzione distale (21) di detto puntale (20) ha una sezione di diametro di dimensioni d2 in un punto (28) posizionato lungo detta porzione distale (21) ad un’altezza h_x rispetto alla base terminale (25) di detta porzione distale, detta altezza h_x essendo inferiore alla distanza tra detta base superiore (9) di detto canale verticale (18) e il punto di immissione in detto microcanale (3), dove detta distanza è h1 in assenza di alcun connettore, dove d3<d2<d4 e (90° - �1��(90° - �� preferibilmente �1 è compreso tra 80° e 90°, ancor più preferibilmente è uguale a 90°. In particolare, detto puntale (20) si inserisce in detta regione di ingresso (8) che è detto canale verticale (18) per una porzione (27) di lunghezza h_x, ovvero, detto puntale si inserisce in detta regione di ingresso (8) raggiungendo il punto di accoppiamento ad interferenza prima di raggiungere il microcanale (3), ovvero detto puntale e detto canale verticale (18) compreso in detta regione di ingresso (8) raggiungono la posizione di tenuta quando la porzione di detto puntale inserita in detto canale verticale (18) non è tale da far raggiungere a detto puntale detto microcanale (3). In questa forma di realizzazione, (90° -�1) < (90° -�) e h_x = ((d2-d3)/2)*tg�, preferibilmente �1 è compreso tra 80° e 90°, ancor più preferibilmente è di 90°.

Alternativamente, con riferimento alla figura 22, detto puntale (20) si inserisce in detto canale verticale (18) compreso in detta regione di ingresso (8) per una porzione (27) di lunghezza h_x, dove d1<d3<d2, (90° -�1��(90° - ��. Sempre con riferimento alla stessa figura 22, opzionalmente detta regione di ingresso (8) comprende un connettore (60), avente una base superiore (12) che coincide con la base inferiore (12) di detto canale verticale (18).

In una forma di realizzazione alternativa, con riferimento alla figura 21, detta regione di ingresso (8) comprende altresì una porzione definita di svaso (30) di forma tronco conica cava, avente un’altezza h4 e una base superiore (33) e una base inferiore (9) che coincide con la base superiore (9) di detto canale verticale (18), detta base superiore (33) avente un diametro d5 maggiore del diametro d2 di detta base inferiore (9), dove la semiapertura del tronco di cono che forma detta porzione di svaso (30) misura (90° -�2), dove (90° -��) > (90° -�).

Preferibilmente, con riferimento alla figura 23, detta regione di ingresso (8) comprende altresì, al di sopra di detta porzione di svaso (30), una regione di stoccaggio (40) che comprende almeno due porzioni: una porzione superiore (42) e una porzione inferiore (41), dove detta porzione superiore (42) ha una forma generalmente tubolare avente una base superiore (43) e una base inferiore (44) di diametro di misura d6 e detta porzione inferiore (41) è rastremata verso il basso e ha una base superiore (44) che coincide con detta base inferiore (44) di detta porzione superiore (42) e una base inferiore (45) di diametro di misura d5, detta regione di stoccaggio (40) ha un’altezza h5 e la semiapertura del tronco di cono che forma detta la porzione inferiore (41) misura (90° - �3), dove �3 è inferiore o uguale a 90°, preferibilmente �3 è 0°.

Laddove detta regione di ingresso comprende anche detta regione di stoccaggio (40), detto puntale (20) si inserisce in detta regione di ingresso (8) per una lunghezza superiore alla lunghezza di detta porzione distale (21) di detto puntale (20), la distanza tra detta base terminale (25) di detta porzione distale (21) di detto puntale (20) e la base superiore (43) di detta regione di stoccaggio (40) misura h_tot, essendo (h_tot > h2) e la distanza tra detta base superiore (24) di detta porzione distale (21) di detto puntale (20) e la base inferiore (45) di detta regione di stoccaggio (40) misura h_y, essendo 2*h_y*cot�3 d5 > d4.

Alternativamente, e con riferimento alla figura 23D, detto puntale (20) si inserisce in detta regione di ingresso (8) per una lunghezza inferiore alla lunghezza di detta porzione distale (21) di detto puntale (20), la distanza tra detta base terminale (25) di detta porzione distale (21) di detto puntale (20) e la base superiore (43) di detta regione di stoccaggio (40) misura h_tot, e la distanza tra detta base terminale (25) di detta porzione distale (21) di detto puntale (20) e la base superiore (9) di detto canale verticale (18) misura h_x essendo h_tot = h_x h4 h5 e la distanza tra detta base superiore (24) di detta porzione distale (21) di detto puntale (20) e la base inferiore (45) di detta regione di stoccaggio (40) misura h_y, essendo h_y =h2 – h_x –h4.

In un’ulteriore forma di realizzazione, con riferimento alla figura 24, detta regione di ingresso (8) comprende altresì una porzione definita di stoccaggio (50) che comprende almeno due porzioni: una porzione superiore (52) e una porzione inferiore (51), dove detta porzione superiore (52) ha una forma generalmente tubolare avente una base superiore (53) e una base inferiore (54), di diametro d6 e detta porzione inferiore (51) è rastremata verso il basso e ha una base superiore (54) che coincide con detta base inferiore (54) di detta porzione superiore (52) e una base inferiore (55) di diametro d2, detta regione di stoccaggio (50) ha un’altezza h5 e la semiapertura del tronco di cono che forma detta porzione di stoccaggio (50) misura (90° - �3), dove (90° - �3) > (90° - �).

Laddove detta regione di ingresso comprende detta regione di stoccaggio (50), detto puntale (20) si inserisce in detta regione di ingresso (8) per una lunghezza inferiore alla lunghezza totale di detto puntale (20), la distanza tra detta base terminale (25) di detta porzione distale (21) di detto puntale (20) e la base superiore (53) di detta regione di stoccaggio (50) misura h_tot, essendo h_tot minore o uguale a h2 e (2*h_tot*cot � d3) < d6.

Alternativamente, e il riferimento è alla figura 24D, detto puntale (20) si inserisce in detta regione di ingresso (8) per una lunghezza inferiore alla lunghezza totale di detto puntale (20), la distanza tra detta base terminale (25) di detta porzione distale (21) di detto puntale (20) e la base superiore (53) di detta regione di stoccaggio (50) misura h_tot e la distanza tra detta base terminale (25) di detta porzione distale (21) di detto puntale (20) e la base superiore (9) di detto canale verticale (18) misura h_x, essendo h_tot > h2 e h_tot = h_x h5.

L’esperto del settore comprende che ulteriori forme di realizzazioni sono possibili.

La forma di realizzazione che prevede la presenza di un serbatoio di stoccaggio in detta regione di ingresso (8) trova vantaggioso impiego ogniqualvolta è necessario controllare l’evaporazione nel dispositivo microfluidico. Infatti, detta regione di stoccaggio può essere lasciata vantaggiosamente piena del fluido caricato nel dispositivo microfluidico così che, anche laddove siano necessari lunghi tempi di incubazioni, non si verifichino indesiderati effetti di evaporazione.

La presenza opzionale della regione di stoccaggio permette di avere un canale verticale (18) e, opzionalmente, connettori (60) i cui volumi sono ridotti al minimo, così da evitare lo spreco di fluidi, potendo disporre di uno o più serbatoi di stoccaggio da usarsi solo all’occorrenza.

La possibilità di disporre di una porzione di svaso (30) offre il vantaggio di fornire una apertura sufficientemente ampia per permettere ad un puntale (20) che si inserisce in detta regione di ingresso (8) anche in modo non centrato lungo l’asse centrale verticale del canale di ingresso (18) di entrare in detta porzione di svaso (30) e, successivamente, durante la discesa verso il basso di detto puntale (20), nel canale di ingresso (18), tramite lo scorrimento dello stesso puntale lungo le pareti interne della porzione di svaso e del canale ingresso, anche con un eventuale piegamento/incurvamento del puntale (20).

Opzionalmente, detto dispositivo microfluidico (1) comprende altresì una piastrina di calibrazione impedenzometrica e detto puntale (20) è collegato ad un sistema di dispensazione dotato di un sistema di rilevazione di impedenza.

Opzionalmente, detto dispositivo microfluidico comprende un elemento di chiusura di detta regione di ingresso (8), a titolo di esempio detto elemento di chiusura è un tappo o una pellicola protettiva. Detta pellicola protettiva è, in una forma di realizzazione, in materiale elastomerico, a titolo di esempio un silicone.

La soluzione sorprendente evidenziata dagli autori della presente invenzione e descritta nella rivendicazione 1 permette, con la metodica di seguito descritta, di gestire l’immissione di uno o più fluidi in un dispositivo microfluidico solo utilizzando l’accoppiamento ad interferenza che si realizza tra detto puntale e detto canale verticale, senza dover ricorrere a pompe o valvole.

In particolare, il metodo di carico/scarico di fluidi nel dispositivo microfluidico (1) compreso nel kit descritto e rivendicato comprende i seguenti passaggi: a) Mettere a disposizione un kit secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8;

b) Opzionalmente, caricare in detto puntale (20) un fluido;

c) Posizionare detto puntale (20) al di sopra di detta regione di ingresso (8) e inserirlo fino a raggiungere una posizione di accoppiamento ad interferenza tra detta regione distale (21) di detto puntale (20) e detto canale verticale (18) in detta regione di ingresso (8);

d) Rilasciare il fluido contenuto in detto puntale (20) in detto dispositivo microfluidico (1) attraverso detta regione di ingresso (8) o, alternativamente, aspirare con detto puntale (20) fluido già contenuto in detto dispositivo microfluidico.

Quando il metodo è applicato all’aspirazione di fluido, e non al rilascio, e detto fluido è un liquido, convenientemente detto canale verticale (18) e detti eventuali connettori (60) contengono anch’essi detto liquido, ovvero detto liquido non è solo contenuto nel dispositivo microfluidico. La presenza di liquido nella porzione di contatto con il puntale (20), abbassando la tensione superficiale, facilita il processo di aspirazione che risulterebbe più difficoltoso laddove detto puntale aspirasse inizialmente aria prima di poter aspirare il fluido contenuto in detto dispositivo microfluidico.

Dispositivo microfluidico

Si descrive anche un dispositivo microfluidico (1) che è un sistema a micropozzetti aperti invertiti che comprende una matrice di micropozzetti aperti 2, almeno un microcanale 3, almeno una porta di ingresso 8 per reagenti e/o per uno o più campioni biologici e almeno una porta di uscita 10 per gli stessi, dette porte di ingresso e di uscita essendo in comunicazione microfluidica con uno o più di detti microcanali 3, dove detto microcanale 3 ha un'area in sezione trasversale di dimensioni micrometriche e fornisce fluido a detti micropozzetti 2, dove detto sistema a micropozzetti aperti invertiti è in una forma di realizzazione inserito in un sistema automatizzato di gestione che comprende le seguenti funzionalità: incubatore a temperatura, umidità e CO2controllate, sistema di dispensazione di fluidi, acquisizione delle immagini in contrasto di fase e in fluorescenza.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, a ciascuno dei microcanali 3 è associata una porta di ingresso 8 e una porta di uscita 10.

In una forma preferita, detto dispositivo microfluidico (1) comprende altresì reservoirs 6, 7, dove detti reservoirs sono almeno un reservoir 6 per reagenti e almeno un reservoir 7 per uno o più campioni biologici. Detti reservoirs sono selezionati nel gruppo che comprende: piastre, una o più piastre a multipozzetto, ad esempio piastre a 96 pozzetti, tubi eppendorf. Detti reservoirs 6 e 7 possono essere 2, oppure 4, 8, 16, 24, 48, 96, 384.

In una forma di realizzazione preferita, schematizzata in Figura 3, 26 detti reservoirs 6, 7 sono integrati in detto sistema a micropozzetti aperti invertiti 1.

In una ulteriore forma di realizzazione, schematizzata in Figura 4, detta almeno una porta di ingresso 8 per reagenti comprende altresì una zona di stoccaggio 11. In questa forma di realizzazione, detti reagenti e/o detto campione biologico stazionano in detta zona di stoccaggio prima di attraversare detta porta di ingresso 8. Anche detta porta di uscita 11 può opzionalmente comprendere una zona di stoccaggio 11. Detta zona di stoccaggio è preferibilmente posizionata al di sopra rispetto a detto porta di ingresso e, in una forma preferita di realizzazione, si compone vantaggiosamente di due porzioni: una porzione superiore 13 e una porzione inferiore 14. Detta porzione superiore 13 ha una forma cilindrica e detta porzione inferiore 14 ha una forma ad imbuto, dove detta porzione superiore 13 è un cilindro con una base avente un diametro maggiore del diametro di detta porta di ingresso 8 e detta porzione inferiore 14 è un imbuto che connette detta porzione superiore con detta porta di ingresso.

Regione di scarico

In un’ulteriore forma di realizzazione, con riferimento alla figura 27, detta regione di scarico (70) deputata allo scarico di fluidi da detto dispositivo microfluidico (1) che comprende almeno una regione di ingresso (8), comprende un contenitore di scarico (12) in collegamento fluidico con detto dispositivo microfluidico (1) tramite almeno un canale di scarico (22) e una porta di uscita (10). In una forma di realizzazione, detto fluido, spinto da una pressione applicata in detta regione di ingresso (8) in detto dispositivo microfluidico (1), raggiunge in maniera unidirezionale detto contenitore di scarico (12) laddove il volume V di detto fluido è minore o uguale al volume di detto contenitore di scarico (12). Preferibilmente, con riferimento alla figura 27A, detto canale di scarico (22) emerge dall’ almeno un microcanale (3) compreso in detto dispositivo microfluidico (1) ed è un sifone.

Preferibilmente, il diametro di detto canale di scarico (22) è tale che il sifone esercita una forza capillare sul fluido contenuto in detto microcanale (3).

In un’ulteriore forma di realizzazione, schematizzata in figura 27C, detto canale di scarico (22) è posto sul fondo di almeno un microcanale (3) ed è pressoché ortogonale allo stesso e mette in collegamento detto almeno un microcanale (3) con detto contenitore di scarico (12) che è posizionato al di sotto rispetto allo stesso microcanale (3).

In un’ulteriore forma di realizzazione, con riferimento alla figura 27B, detta porta di uscita (10) è posta sul fondo di detto almeno un microcanale (3) ed immette in un primo contenitore di scarico (12a), posizionato al di sotto rispetto a detto microcanale (3) e da detto primo contenitore di scarico (12a) emerge detto canale di scarico (22) che immette in detto contenitore di scarico (12). Preferibilmente, con riferimento alla figura 27B, il canale di scarico (22) è un sifone.

Detto canale di scarico (22) ha preferibilmente un’area in sezione trasversale di dimensioni micrometriche, dette dimensioni essendo comprese tra 100 �m e 5mm, preferibilmente tra 500�m e 2 mm.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, il kit secondo la presente invenzione comprende un dispositivo microfluidico come sopra descritto.

Ancora più preferibilmente, il kit secondo la presente invenzione comprende il dispositivo microfluidico come sopra descritto, caratterizzato anche dalla regione di scarico di fluido sopra descritta.

In una forma di realizzazione preferita, raffigurata in figura 25, il dispositivo microfluidico (1) comprende una regione di ingresso (8) adatta per essere ricompresa nel kit secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8 e una regione di scarico (70) secondo la rivendicazione 10.

Forma pertanto oggetto della presente invenzione un metodo per il carico/scarico di fluidi da un dispositivo microfluidico dove detto metodo comprende:

a)Mettere a disposizione un dispositivo microfluidico (1) che comprende una regione di ingresso (8) e una regione di scarico (70) secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6, ove detto dispositivo microfluidico (1) è caricato con almeno un primo fluido;

b)Opzionalmente, esercitare una pressione su detto almeno un primo fluido in ingresso in detto dispositivo microfluidico (1);

c)Alternativamente, disporre di una regione di scarico (70) dove detto canale di scarico (22) ha un diametro tale da far sì che detto fluido possa passare da detto dispositivo microfluidico a detto canale di scarico per capillarità;

caratterizzato dal fatto che, laddove il volume V di detto almeno un primo fluido è minore o uguale al volume di detto contenitore di scarico (12), detto almeno un fluido raggiunge detto contenitore di scarico (12) in maniera unidirezionale.

In un’ulteriore forma di realizzazione, detto metodo comprende altresì:

-immettere un secondo o ulteriore fluido attraverso detta regione di ingresso (8) in detto dispositivo microfluidico (1), laddove detto primo, secondo e/o ulteriori fluidi sono indipendentemente uguali o diversi tra loro e sono selezionati nel gruppo che comprende liquidi e gas;

-opzionalmente, detto secondo e/o ulteriore fluido sostituisce completamente in detto microcanale (3) o in detto microcanale (3) e in detti micropozzetti aperti invertiti (2), laddove presenti in detto dispositivo microfluidico (1), il fluido immesso in precedenza; caratterizzato dal fatto che detto primo, secondo e/o ulteriore fluido non si mescolano tra loro.

In una ulteriore forma di realizzazione, raffigurata in figura 26, il dispositivo microfluidico (1) è un dispositivo microfluidico a micropozzetti aperti invertiti (2) e comprende altresì reservoirs (6) per reagenti e reservoirs (7) per uno o più campioni biologici.

In una forma di realizzazione particolarmente vantaggiosa, detto dispositivo comprende 16 microcanali (3), ciascuno avente una regione di ingresso (8) e una regione di uscita (10), laddove ciascuno di detti microcanali (3) è affacciato su 1200 micropozzetti aperti invertiti.

In aggiunta ai vantaggi sopra evidenziati, si evidenzia che il dispositivo microfluidico (1) che comprende la regione di ingresso (8) secondo la presente invenzione è particolarmente vantaggioso perché:

i) consente l’interfacciamento diretto, ovvero senza l’ausilio di guarnizioni, di un dispositivo microfluidico con sistemi comunemente impiegati nel settore per la gestione ed il trasferimento di liquidi e gas; ii) consente di prelevare fluidi da piastre o contenitori inserendoli in pressione in microcanali del dispositivo microfluidico, dove i volumi in gioco in tali piastre o contenitori sono maggiori o molto maggiori (ad esempio 50 �l o più, 300 �l, 1 ml o più) rispetto a quelle caratteristiche del microcanale (40 �l o meno) e dove il trasferimento avviene utilizzando strumenti standard già comunemente impiegati in combinazione con le suddette piastre o contenitori,

iii) consente di inserire nel dispositivo microfluidico sequenze di fluidi, anche di tipologie diverse, senza l’utilizzo di ulteriori apparati, quali ad esempio pompe o valvole.

Metodo di carico/scarico di fluidi da un dispositivo microfluidico

Forma ulteriore aspetto della presente invenzione un metodo per la gestione di un dispositivo microfluidico (1) a micropozzetti aperti invertiti (2) che comprende almeno una regione di ingresso (8), almeno una regione di uscita (10) e almeno un microcanale (3), dove detto metodo comprende:

- immettere almeno un primo fluido attraverso detta regione di ingresso (8) in detto dispositivo microfluidico (1);

- opzionalmente, immettere un secondo o ulteriori fluido attraverso detta regione di ingresso (8) in detto dispositivo microfluidico (1), laddove detto primo, secondo e ulteriori fluidi sono indipendentemente uguali o diversi tra loro e sono selezionati nel gruppo che comprende liquidi e gas; - opzionalmente, detto secondo o ulteriore fluido sostituisce completamente in detto microcanale (3) o in detto microcanale (3) e in detti micropozzetti aperti invertiti (2) il fluido immesso in precedenza;

- opzionalmente, aspirare da detta regione di ingresso (8) il volume di fluido contenuto nel microcanale (3), lasciando detto fluido in detti micropozzetti (2).

In una forma di realizzazione, detto metodo è attuato in un dispositivo microfluidico (1) che comprende una regione di ingresso (8) secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8 e una regione di scarico (70) secondo la rivendicazione 10 ed è caratterizzato dal fatto che laddove il volume complessivo di detto primo e, opzionalmente, secondo e ulteriori fluidi immessi in detto dispositivo microfluidico (1) è inferiore al volume di detto contenitore di scarico (12), detti fluidi non si mescolano tra loro.

Metodo per l’analisi high-content di campioni biologici La metodica qui in seguito descritta permette sorprendentemente non solo un’analisi in time-lapse ma anche un processamento durante detta analisi time-lapse. Ovvero, grazie alla metodica della presente invenzione è possibile non solo monitorare uno stesso campione in tempi diversi (analisi in time-lapse classica), ma anche manipolare lo stesso campione in tempi diversi andando a variare nel tempo e in maniera controllata e automatizzata le condizioni al contorno. A titolo di esempio, la metodica qui descritta permette di valutare, per ogni singola cellula, la variazione di parametri morfologici e funzionali in seguito ad un’esposizione controllata ad un agente farmacologico, ove detto agente viene aggiunto durante detto monitoraggio. Alternativamente, con la stessa metodica è possibile un’analisi dinamica del campione, ove con analisi dinamica si intende qui un’analisi del campione effettuata a tempi diversi dopo l’esposizione a trattamenti di interesse. Ancora, grazie all’analisi dinamica effettuata secondo la presente invenzione, è possibile identificare in un campione cellule insensibili ad un trattamento così da esporre le stesse ad un trattamento diverso. La metodica qui rivendicata consente l’attuazione di un saggio high-content su larga scala con processamento in time-lapse, operatoreindipendente, disponendo di un’attrezzatura installabile in qualsiasi laboratorio di analisi.

La metodica della presente invenzione è attuata in un sistema a micropozzetti aperti invertiti la cui struttura è esemplificata nella Figura 1. Detto sistema a micropozzetti aperti invertiti 1 comprende una serie di micropozzetti 2, aperti ad entrambe le estremità, disposti secondo uno schema a matrice. Detto sistema a micropozzetti aperti invertiti comprende altresì almeno un microcanale 3, dove detto almeno un microcanale 3 ha un'area in sezione trasversale di dimensioni micrometriche e fornisce fluido a detti micropozzetti 2. Detto sistema comprende altresì almeno una porta di ingresso 8 per reagenti e/o per uno o più campioni biologici e almeno una porta di uscita 10 per gli stessi, dette porte di ingresso e di uscita essendo in comunicazione microfluidica con uno o più di detti microcanali 3.

In una forma preferita, detti reagenti sono contenuti in reservoirs 6, 7, dove detti reservoirs sono almeno un reservoir 6 per reagenti e almeno un reservoir 7 per uno o più campioni biologici. Detti reservoirs sono selezionati nel gruppo che comprende: piastre, una o più piastre a multipozzetto, ad esempio piastre a 96 pozzetti, tubi eppendorf. Detti reservoirs 6 e 7 possono essere 2, oppure 4, 8, 16, 24, 48, 96, 384.

In una forma di realizzazione, rappresentata in Figura 2, detti reservoirs 6, 7 sono esterni a detto sistema a micropozzetti aperti invertiti 1. In una forma di realizzazione preferita, schematizzata in Figura 3, detti reservoirs 6, 7 sono integrati in detto sistema a micropozzetti aperti invertiti 1.

Forma oggetto della presente invenzione un metodo per l’analisi high-content di campioni biologici su larga scala, ove detti campioni biologici sono definiti come sopra, che comprende i seguenti passaggi, non necessariamente nell’ordine indicato:

a) Mettere a disposizione un sistema a micropozzetti aperti invertiti che comprende una matrice di micropozzetti aperti 2, almeno un microcanale 3, almeno una porta di ingresso 8 per reagenti e/o per uno o più campioni biologici e almeno una porta di uscita 10 per gli stessi, dette porte di ingresso e di uscita essendo in comunicazione microfluidica con uno o più di detti microcanali 3, dove detto microcanale 3 ha un'area in sezione trasversale di dimensioni micrometriche e fornisce fluido a detti micropozzetti 2;

b) Mettere a disposizione un sistema automatizzato di gestione di detto sistema a micropozzetti aperti invertiti che comprende le seguenti funzionalità: incubatore a temperatura, umidità e CO2controllate, sistema di dispensazione di fluidi, acquisizione delle immagini in contrasto di fase e in fluorescenza;

c) Inserimento di detto sistema a micropozzetti aperti invertiti 1 in detto sistema automatizzato; d) Caricamento dei reagenti attraverso una o più di dette porte di ingresso per reagenti 8, dove detti reagenti comprendono: filling buffer e/o soluzione di lavaggio e/o uno o più farmaci e/o uno o più traccianti e/o uno o più anticorpi marcati e/o uno o più marcatori di vitalità cellulare;

e) Caricamento di detti uno o più campioni biologici attraverso una o più di dette porte di ingresso 8;

i) Opzionalmente, colorazione di dette cellule con uno o più traccianti, e/o uno o più anticorpi marcati e/o uno o più marcatori di vitalità cellulare;

j) Acquisizione di immagini da uno o più di detti micropozzetti 2, dove dette immagini sono definite immagini T0;

p) Classificazione delle cellule visualizzate, dove detta classificazione è effettuata con parametri morfologici e/o funzionali rilevati dalle immagini T0.

In una forma di realizzazione, detto sistema a micropozzetti aperti invertiti è il dispositivo microfluidico secondo la rivendicazione 9; in un’ulteriore forma di realizzazione è il dispositivo microfluidico secondo la rivendicazione 11, oppure è un dispositivo microfluidico (19 che comprende altresì il kit secondo una delle rivendicazioni da 1 a 8.

In una forma di realizzazione, laddove detti reagenti e campione biologico sono contenuti in 6, 7, detti reservoirs 6, 7 sono esterni a detto sistema a micropozzetti aperti invertiti 1, come schematizzato in figura 2, e detto caricamento dei reagenti e dell’almeno un campione biologico avviene manualmente, ovvero per mezzo di sistemi automatizzati per la dispensazione dei fluidi, prelevando dai reservoirs e caricando nelle porte di ingresso 8. Preferibilmente, detti reservoirs 6, 7 sono inseriti nel sistema automatizzato con il sistema a micropozzetti aperti invertiti.

In una forma ancor più preferita, schematizzata in figura 3, detti reservoirs 6, 7 sono integrati in detto sistema a micropozzetti aperti invertiti 1, e detto caricamento dei reagenti e dell’almeno un campione biologico avviene manualmente, ovvero per mezzo di sistemi automatizzati per la dispensazione dei fluidi, prelevando dai reservoirs e caricando nelle porte di ingresso 8. Alternativamente, detti reservoirs 6, 7, integrati in detto sistema a micropozzetti aperti invertiti 1, sono in comunicazione fluidica con detta almeno una porta di ingresso 8.

Anche laddove detta porta di ingresso 8 comprende detta zona di stoccaggio 11, detti reservoirs 6, 7 sono collocati come sopra descritto, ovvero sono esterni oppure integrati nel sistema a micropozzetti aperti invertiti.

In una forma di realizzazione preferita, alcuni di detti reservoirs 6 vengono precaricati di detti reagenti preventivamente allo svolgimento della metodica, anche giorni o mesi prima dello svolgimento della stessa, così da poter disporre di reservoirs 6 specifici pronti all’uso. In questa forma di realizzazione, l’unico passaggio manuale richiesto all’operatore è quello di precaricamento del campione biologico in detti uno o più reservoirs 7.

In un’ulteriore forma di realizzazione preferita, oltre a detto passaggio di caricamento del campione biologico, un ulteriore passaggio manuale eseguito dall’operatore è il caricamento di uno o più farmaci in uno o più di detti reservoirs 6.

In una forma preferita di realizzazione, detti reservoirs 6, 7, integrati oppure esterni a detto sistema a micropozzetti aperti invertiti, pre-caricati dei reagenti e del campione biologico, vengono immessi in detto sistema automatizzato. In questa forma di realizzazione, detti passaggi d) ed e) di caricamento attraverso dette porte di ingresso, anche dette regioni di ingresso (8) avvengono successivamente a detto passaggio c) di inserimento nel sistema automatizzato di detto sistema a micropozzetti aperti invertiti nel quale sono integrati detti reservoirs 6, 7 o di detto sistema a micropozzetti aperti invertiti e di detti reservoirs 6, 7 esterni allo stesso, preferibilmente mediante prelevamento automatizzato del campione biologico da detti reservoirs (7) con conseguente disposizione delle cellule contenute nello stesso in uno o più di detti micropozzetti (2) e, opzionalmente, successivo inserimento di farmaci in uno o più di detti micropozzetti e/o colorazione di dette cellule con uno o più traccianti, e/o uno o più anticorpi marcati e/o uno o più marcatori di vitalità cellulare, laddove detti traccianti, e/o uno o più anticorpi marcati e/o uno o più marcatori di vitalità cellulare sono alimentati a dette porte di ingresso (8) da detti reservoirs (6).

Detta classificazione morfologica/funzionale deriva dall’analisi in fluorescenza con risoluzione di una singola cellula, un singolo aggregato cellulare oppure l’intera popolazione cellulare che è contenuta in un singolo micropozzetto.

Detti parametri vengono acquisiti e analizzati in automatico, mediante l’utilizzo di sistemi noti all’esperto del settore.

Con parametri morfologici si intendono misure relative alla dimensione e alla forma della cellula. Con parametri funzionali si intendono quelle caratteristiche osservate grazie ai marcatori, quali ad esempio l’espressione di antigeni specifici.

In una forma preferita di realizzazione, detto metodo comprende altresì, dopo l’inserimento di detto sistema a micropozzetti aperti invertiti in detto sistema automatizzato:

f) Riempimento di almeno un detto microcanale 3 con filling buffer;

g) Acquisizione di immagini da uno o più di detti micropozzetti 2, singolarmente o per sottogruppi, dove dette immagini sono definite immagini baseline (Tbaseline);

e, in detto passaggio p) di classificazione, detta classificazione è effettuata con parametri morfologici e/o funzionali rilevati dal confronto delle immagini T0 con dette immagini baseline.

Ancor più preferibilmente, detto metodo comprende altresì:

k) Dispensazione di uno o più di detti farmaci, singolarmente o in combinazione, dove detti farmaci sono preferibilmente prelevati in maniera automatizzata da detti reservoirs 6 e dispensati in uno o più di detti micropozzetti 2;

l) Incubazione.

In detta forma di realizzazione, detto metodo permette, a titolo esemplificativo, l’analisi dell’attività di farmaci ex-vivo, dove la classificazione di dette cellule presenti in detto campione biologico effettuata in detto passaggio p) permette un confronto diretto tra, a titolo di esempio, la responsività al trattamento di cellule sane e cellule tumorali presenti nello stesso campione biologico, oppure un confronto tra la risposta dello stesso tipo cellulare a trattamenti diversi.

In una forma di realizzazione ancor più preferita, detto metodo comprende altresì, dopo detto passaggio l):

m) Acquisizione di almeno due immagini da detti uno o più micropozzetti 2, a tempi successivi durante detta incubazione, dove dette immagini sono definite immagini T1, T2, Tn, dove n è un numero qualsiasi uguale o superiore a 2, preferibilmente 1.000, oppure 100, ancora più preferibilmente 25, in una forma di realizzazione preferita è 9;

n) Opzionalmente, tra dette acquisizioni di dette immagini T1, T2, Tn, ulteriore colorazione di dette cellule con uno o più traccianti, e/o uno o più anticorpi marcati e/o uno o più marcatori di vitalità cellulare;

o) Opzionalmente, tra dette acquisizioni di dette immagini T1, T2, Tn, ulteriore dispensazione di uno o più di detti farmaci in un micropozzetto 2 o in uno o più sottogruppi di micropozzetti 2, singolarmente o in combinazione;

e detta classificazione di cui al passaggio p) comprende il confronto di parametri morfologici e/o funzionali rilevati dalle immagini T0, T1, Tn e, opzionalmente, Tbaseline.

Ancor più preferibilmente, detto metodo comprende altresì, dopo detto passaggio di classificazione p):

q) Analisi della vitalità cellulare, ove detta analisi è cellula specifica, oppure è effettuata a livello di aggregato cellulare, o ancora prende in considerazione l’intera popolazione cellulare contenuta in uno di detti micropozzetti 2.

In una forma preferita di realizzazione, in detto passaggio k) detti farmaci vengono dispensati in almeno due concentrazioni diverse e detta analisi di vitalità cellulare, laddove presente, porta ad ottenere una curva dose/risposta cellula specifica per gli uno o più farmaci testati.

Opzionalmente le diluizioni di ciascun farmaco sono preparate dal sistema di dispensazione di liquidi miscelando il farmaco con un diluente.

In un’ulteriore forma di realizzazione, il metodo prevede, dopo detta acquisizione di immagini di cui al passaggio j), la conta del numero di cellule mediamente presenti in ciascuno dei micropozzetti 2 e la successiva diluizione del campione, tramite detto sistema di dispensazione dei fluidi, così da raggiungere una concentrazione obiettivo, ovvero una concentrazione tale da garantire il numero di cellule desiderato per ciascun micropozzetto, ed il successivo caricamento del campione così diluito in uno o più microcanali di detto sistema a micropozzetti aperti invertiti, microcanali diversi dagli uno o più canali utilizzati nel passaggio d) di cui sopra.

In detto passaggio k), laddove sia necessaria la somministrazione combinata di almeno due farmaci, detti due o più farmaci sono opzionalmente combinati da un sistema di dispensazione di liquidi miscelando prima del caricamento il contenuto di almeno due reservoirs 6 contenenti detti farmaci.

Detto metodo si caratterizza per utilizzare un campione biologico il cui volume è compreso tra 1 µl e 1 ml, preferibilmente tra 10 µl e 100 µl, con una concentrazione cellulare compresa tra 5.000 cellule per ml e 5.000.000 cellule per ml.

In una forma preferita, detto filling buffer comprende terreno RPMI addizionato di Siero Fetale Bovino (FBS) 10% e, preferibilmente, un marcatore di morte cellulare, tipicamente propidio ioduro (PI) 5 µM.

Detto sistema a micropozzetti aperti invertiti 1, di cui in figura 1 ne è rappresentata una vista prospettica (a), in sezione verticale (b) e una vista dall’alto (c) e in Figura 5 una vista prospettica in sezione, in una forma preferita di realizzazione comprende 1200 micropozzetti 2 per ciascun microcanale 3 e 16 microcanali 3; in un’ulteriore forma di realizzazione, comprende 500 micropozzetti 2 e 5 microcanali 3.

In una forma preferita di realizzazione, detto metodo analizza un campione biologico che contiene solo circa 10-20 cellule e impiega il sistema a micropozzetti aperti invertiti del tipo descritto in WO2012/072822. In una forma di realizzazione preferita, detto campione biologico è ottenuto da un animale e/o un essere umano affetto da una patologia tumorale e detto campione biologico comprende cellule sane e cellule tumorali.

La totalità delle cellule viene evidenziata nelle immagini acquisite in contrasto di fase e/o, laddove dette cellule sono colorate con un tracciante, in un canale di fluorescenza, ad esempio nel DAPI se il tracciante è CMAC (7-ammino-4-clorometilcumarina). Altri traccianti utilizzabili nella metodica possono essere selezionati nel gruppo che comprende: Calceina-AM, carbocianine quali DiD, DiO, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole).

Altri traccianti utilizzabili per gli scopi della presente metodica sono marcatori di morte cellulare quali PI, Calceina-AM, JC1, Caspasi 3/7, Annessina V. In un’ulteriore forma di realizzazione, vengono utilizzati anticorpi marcati quali traccianti.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, detto metodo comprende una reiterazione del trattamento, dove le cellule che sopravvivono ad una prima esposizione ad uno o più di detti farmaci di cui al passaggio k), vengono ri-esposte ad un ulteriore trattamento farmacologico, dove detto ulteriore trattamento prevede l’esposizione ad uno o più di detti farmaci già usati in detto passaggio k) a concentrazione superiore, oppure dove in detto ulteriore passaggio si utilizzano uno o più farmaci diversi da quelli usati nel passaggio precedente.

La reiterazione del metodo avviene, in una forma di realizzazione, sulle cellule che rimangono vive in detti uno o più micropozzetti 2, dove questo ulteriore trattamento è reso possibile dal fatto che, in detto sistema a micropozzetti aperti invertiti, detto microcanale 3 viene svuotato di detto fluido che comprende detto uno o più farmaci e successivamente riempito con un secondo fluido che comprende detti ulteriori uno o più farmaci. Le cellule, restando posizionate sul menisco all’interfaccia aria/fluido, non vengono alterate dal cambio di fluido in detto microcanale. Dette cellule posizionate sul menisco, anche qualora non siano cellule che crescono in adesione, da un punto di vista fluidico si comportano come cellule che crescono in adesione sul fondo di un pozzetto chiuso, dove tipicamente è possibile sostituire il terreno di coltura senza pregiudicare dette cellule in adesione. Il vantaggio legato alla presente forma di realizzazione è da ricercarsi nel suo impiego anche con cellule che crescono in sospensione, laddove detto menisco permette di mimare il fondo di un pozzetto, senza tuttavia imporre un’adesione obbligata a dette cellule, ad esempio utilizzando substrati che stimolino l’adesione cellulare noti all’esperto del settore. Questo è particolarmente vantaggioso poiché permette di impattare il meno possibile sul campione biologico, evitando di imporre condizioni esterne estranee al contesto fisiologico.

In una forma preferita di realizzazione, detto metodo comprende i seguenti passaggi, nell’ordine indicato:

a) Mettere a disposizione un sistema a micropozzetti aperti invertiti (1) che comprende una matrice di micropozzetti aperti (2), almeno un microcanale (3), almeno una porta di ingresso (8) per reagenti e/o per uno o più campioni biologici e almeno una porta di uscita (10) per gli stessi, dette porte di ingresso e di uscita essendo in comunicazione microfluidica con uno o più di detti microcanali (3), dove detto microcanale (3) ha un'area in sezione trasversale di dimensioni micrometriche e fornisce fluido a detti micropozzetti (2);

c) Inserimento di detto sistema a micropozzetti aperti invertiti (1) in detto sistema automatizzato;

f) Opzionalmente, riempimento di almeno un detto microcanale (3) con filling buffer;

g) Opzionalmente, acquisizione di immagini da uno o più di detti micropozzetti (2), singolarmente o per sottogruppi, dove dette immagini sono definite immagini baseline;

d) Caricamento dei reagenti attraverso una o più di dette porte di ingresso (8), dove detti reagenti comprendono: filling buffer e/o soluzione di lavaggio e/o uno o più farmaci e/o uno o più traccianti, e/o uno o più anticorpi marcati e/o uno o più marcatori di vitalità cellulare e dove detti reagenti sono contenuti in reservoirs (6) per reagenti;

e) Caricamento di detti uno o più campioni biologici attraverso una o più di dette porte di ingresso (8), dove detto uno o più campione biologico è contenuto in reservoirs (7) per campione biologico;

j) Acquisizione di immagini da uno o più di detti micropozzetti (2), dove dette immagini sono definite immagini T0;

k) Dispensazione di uno o più di detti farmaci, attraverso dette porte di ingresso (8), in uno o più di detti micropozzetti (2);

l) Incubazione;

m) Acquisizione di almeno due immagini da detti uno o più micropozzetti (2), a tempi successivi durante detta incubazione, dove dette immagini sono definite immagini T1, T2, Tn, dove n è un numero qualsiasi uguale o superiore a 2, preferibilmente 1.000, oppure 100, ancora più preferibilmente 25, in una forma di realizzazione preferita è 9;

o) Opzionalmente, tra dette acquisizioni di dette immagini T1, T2, Tn, ulteriore dispensazione di uno o più di detti farmaci in un micropozzetto (2) o in uno o più sottogruppi di micropozzetti (2), singolarmente o in combinazione;

p) Classificazione delle cellule visualizzate, dove detta classificazione è effettuata con parametri morfologici e/o funzionali rilevati dalle immagini T0, T1, Tn e, opzionalmente, Tbaseline.

Le cellule tumorali vengono identificate per parametri dimensionali e di forma, per esempio rugosità della membrana, e per il legame con anticorpi marcati specifici per antigeni tumorali, laddove la presenza o l’assenza di segnale specifico emesso dall’uno o più anticorpi marcati specifici determina l’identificazione del tipo cellulare. A titolo di esempio, laddove il tumore in esame è un linfoma, viene utilizzato per l’analisi differenziale delle cellule tumorali un anticorpo anti CD38; laddove il tumore in esame è una leucemia mieloide acuta (AML), viene utilizzato un anticorpo anti CD34, oppure anti CD117, oppure anti HLA-DR, oppure anti CD33/CD14.

In una forma di realizzazione preferita, i farmaci testati sono selezionati tra anticorpi monoclonali, a titolo di esempio Alemtuzumab, Bevacizumab, Cetuximab, Ibritumomab, Ofatumumab, Panitumumab, Rituximab, Tositumomab, Trastuzumab, chemioterapici, a titolo di esempio citarabina, idarubicina, fludarabina, decitabina, 5-azacitidina e piccole molecole, a titolo di esempio ibrutinib, idasanutlin, venetoclax, laddove con il metodo della presente invenzione viene misurata l’attività citolitica mediata dal complemento, nel caso degli anticorpi monoclonali, o citotossica diretta, nel caso dei chemioterapici e piccole molecole.

L’analisi automatizzata delle immagini ottenute secondo il metodo della presente invenzione permette di estrarre le informazioni legate ad ogni singola cellula, oppure ad aggregato di cellule, catturata nelle immagini acquisite.

Al termine di detta metodica, le cellule contenute nei micropozzetti possono essere raccolte ed impiegate per successive analisi. In particolare, la metodica qui descritta rende possibile selezionare uno o più micropozzetti nei quali sono contenute cellule di particolare interesse, per esempio cellule resistenti al farmaco iniettato in uno specifico microcanale, ricaricare dette cellule in reservoir (7) di un ulteriore sistema a micropozzetti aperti invertiti, dispensando le stesse a una diluizione maggiore, così da ottenere micropozzetti contenenti una sola cellula. Identificata la cellula desiderata, la stessa può essere isolata. Su dette una o più cellule isolate vengono condotti saggi noti all’esperto del settore, ad esempio RT-PCR.

Il campione biologico può venire caricato così come prelevato/espiantato, oppure può venire preventivamente processato così da rendere lo stesso fruibile nel metodo secondo la presente invenzione. In particolare, laddove si tratta di un campione di sangue o midollo osseo, detto processamento prevede preferibilmente un passaggio di separazione dei globuli rossi con tecniche note all’esperto del settore, preferibilmente su un gradiente di densità, oppure mediante l’utilizzo di un tampone di lisi. Laddove detto campione comprende cellule in sospensione, dette cellule vengono contate e diluite alla concentrazione di dispensazione. Alternativamente, detto passaggio di conta e diluzione viene effettuato in automatico dal sistema. Laddove il campione è una biopsia, detto processamento comprende tipicamente l’isolamento di un frammento di dimensioni comprese tra 10 µm e 1000 µm, dimensioni compatibili con la microfluidica utilizzata. In una forma alternativa di realizzazione, detto campione biologico è utilizzato tal quale come isolato dall’animale e/o dall’uomo.

In Figura 6 è riportato un esempio di una serie di immagini acquisite al tempo T1 in un campione biologico costituito da cellule leucemiche da linea cellulare miscelate con sangue ottenuto da un donatore sano. Il campione biologico contiene quindi PBMC sane e cellule tumorali. L’immagine è ottenuta nel visibile (A), nel nel canale fluorescente DAPI con un tracciante (B), nel nel canale fluorescente FITC per il segnale dell’anticorpo marcato anti CD45 (C) e nel nel canale fluorescente CY5 per l’anticorpo marcato anti CD34 (D).

In (E) è infine riportata la sovrapposizione di dette immagini (C) e (D). La metodica è stata dimostrata avere un’alta sensibilità accompagnata da un’elevata specificità quando applicata alla classificazione delle cellule, come evidenziato dall’immagine (E) nella quale si ritrovano tutte le cellule presenti nel campione, ovvero quelle dell’immagine in (B), dove tutte le cellule sono CD45 positive (C) e solo una quota sono anche CD34 positive (D). Analizzando le cellule mediante parametri morfologici (diametro cellulare) e funzionali (espressione di CD45, CD34) si ottiene una classificazione corretta per pressoché la totalità di dette cellule tumorali, come evidenziato in Figura 7, figura che mostra chiaramente che il marcatore CD34 è il parametro che permette di identificare le cellule tumorali con elevata sensitività e specificità, come evidente dalla curva ROC per la quale si ottiene un’area sotto la curva pari al 99,8% delle cellule che effettivamente lo sono (CD34 ROC curve). Il parametro CD45 produce, invece, un’area sotto la curva pari al 85,2%, dimostrando quindi sensitività e specificità inferiori. Questo esperimento mostra come, per il tipo tumorale in analisi, CD34 è il marcatore di elezione e consente un’analisi estremamente accurata della popolazione cellulare.

In Figura 8 sono riportati i grafici relativi all’analisi dei dati acquisiti, in relazione alla classificazione delle cellule tumorali. In (C) è riportata la distribuzione delle cellule colorate con il tracciante CMAC e non colorate con anticorpi anti-CD34/CD45. Da tale distribuzione è possibile determinare il segnale massimo identificato in tale controllo negativo ed impostare, di conseguenza, una soglia minima per la classificazione. Successivamente in (D) la conta effettuata dopo marcatura con anti-CD34/CD45 è stata effettuata mantenendo la soglia identificata al punto (C) e classificando come tumorali le cellule caratterizzate da un segnale emesso dall’anticorpo superiore alla soglia. In particolare, le cellule tumorali possono essere classificate come tali perché positive all’anticorpo anti-CD34 (CD34+) e perché positive ad entrambi gli anticorpi anti-CD34 e anti-CD45 (CD34+/CD45+). Come controllo del metodo, i pannelli (A) e (B) riportano i risultati ottenuti mediante citofluorimetria sugli stessi campioni. Tali risultati mostrano che i dati ottenuti con la metodica della presente invenzione sono assolutamente confrontabili con quelli ottenuti per lo stesso campione mediante citofluorimetria, che è la tecnica ad oggi di elezione per questo tipo di analisi e conta cellulare.

Desiderando monitorare la vitalità cellulare, in detto passaggio i) dette cellule vengono colorate con marcatori di vitalità cellulare. A titolo di esempio, lo Ioduro di Propidio (PI) o Annexin V sono i marcatori comunemente usati a questo proposito: se la membrana è danneggiata, il PI entra nelle cellule emettendo fluorescenza dopo essersi legato agli acidi nucleici. Le cellule marcate corrispondono pertanto a quelle con la membrana compromessa o distrutta e sono da considerarsi come morte. Un altro marcatore di vitalità cellulare comunemente utilizzato è la calceina – acetossimetil (calceina-AM) (Lichtenfels R et al., CARE-LASS calceinrelease-assay, an improved fluorescence-based test system to measure cytotoxic T lymphocyte activity. J Immunol. Methods 1994, 172:227–239). L’acetossimetilestere della calceina attraversa passivamente la membrana cellulare e, una volta all’interno, viene convertito da un’esterasi intracellulare nella calceina, che è un prodotto fluorescente polare che è ritenuto all’interno delle cellule vitali ma rilasciato dalle cellule la cui membrana è danneggiata e pertanto da considerarsi morte. In Figura 9A-9B è riportato un esempio di un’analisi effettuata su un campione biologico che comprende cellule Raji, linea cellulare da linfoma, e leucociti. Nei campioni in esame è stato effettuato, secondo il metodo della presente invenzione, un trattamento con un farmaco, specificatamente con Rituximab. Il pannello (A) evidenzia la capacità del metodo secondo la presenza invenzione di distinguere tra cellule tumorali (cerchio) e cellule sane (quadretto), utilizzando contemporaneamente parametri morfologici e il marcatore CD38. In (B) è rappresentato il dato di vitalità cellulare, ottenuto quantificando la presenza di Calceina-AM nella cellula, in particolare confrontando il segnale emesso dopo il trattamento con il farmaco con il segnale emesso inizialmente, dove la riduzione di segnale è associata alla perdita di vitalità. In questo caso la soglia di riferimento è determinata utilizzando un controllo costituito da un canale nel quale il campione non viene esposto al farmaco. Alternativamente, vengono utilizzati riferimenti noti in letteratura riguardo alla perdita fisiologica di segnale (Neri S et al., Calcein-Acetyoxymethyl Cytotoxicity Assay: Standardization of a Method Allowing Additional Analyses on Recovered Effector Cells and Supernatants. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001, 8:1131–1135).

In Figura 9C sono riportate le curve dose/risposta ottenute per un differente modello costituito da linee cellulari leucemiche (KG-1, Kasumi-1 e HL-60) per le quali è stata effettuata una analisi di risposta al farmaco chemioterapico idarubicina. I risultati mostrano 3 differenti livelli di risposta, osservabili, per esempio, dai diversi valori IC50 misurabili indicati con le linee verticali tratteggiate: sensibile (IC50 = 0.0049 µM), mediamente sensibile (IC50 = 0.0218 µM) e resistente (IC50 = 0.2127 µM).

A titolo di esempio, un campione biologico derivante da espianto di un tumore epatico può venire impiegato nella presente metodica, previa disgregazione parziale non enzimatica. Il campione biologico viene quindi marcato e caricato in detti reservoirs. In meno di un’ora dall’espianto si dispone di un sistema a micropozzetti aperti invertiti pronto per l’analisi, che comprende cluster cellulari e cellule isolate. La possibilità di valutare l’effetto di farmaci anche su cluster cellulari è estremamente vantaggiosa, poiché permette altresì di valutare eventuali cambiamenti di volume del cluster stesso, oltre che aree di marcatura diverse nello stesso cluster. E’ anche possibile acquisire le immagini su piani focali diversi, potendo in questo modo ricostruire un’immagine 3D del cluster.

La Figura 10 riporta lo schema di un sistema a micropozzetti aperti invertiti che comprende altresì elettrodi 5 disposti attorno a detti micropozzetti 2 e sulla base di detto microcanale 3. Detti elettrodi 5 hanno la funzione di veicolare all’interno del micropozzetto 2 ai tempi e nei modi desiderati le cellule 4 presenti nel microcanale 3. Gli elettrodi favoriscono pertanto la formazione di cluster cellulari all’interno dei micropozzetti, permettendo pertanto un’analisi che tiene in considerazione anche la specifica interazione cellula/cellula.

VANTAGGI

La metodica qui descritta facilita l’approccio di medicina personalizzata, fortemente necessario soprattutto laddove si debba intervenire in patologie di tipo tumorale. Infatti, la metodica qui descritta rende sorprendentemente possibile testare su un campione biologico ex-vivo, che comprende anche solo poche cellule, ad esempio anche solo circa 10-20 cellule laddove il sistema a micropozzetti aperti invertiti utilizzato in detta metodica sia del tipo descritto in WO2012/072822, l’effetto di diversi farmaci così da permettere la scelta del farmaco più efficace per lo specifico paziente e/o della dose ottimale per lo specifico paziente e/o la determinazione della resistenza del campione del paziente ad una o più terapie farmacologiche. L’analisi viene effettuata immediatamente dopo la raccolta del campione biologico e si completa in un arco temporale di circa 24 ore. La tempistica veloce consente che le cellule all’interno del campione biologico non vadano incontro a sensibili variazioni della propria funzionalità, vitalità ed espressione genica, con riferimento alle caratteristiche dalle stesse possedute in-vivo. La rapidità con la quale i dati sono ottenuti permette l’impiego della stessa metodica in situazioni cliniche per le quali si rende necessario prendere decisioni rapidamente, ad esempio nelle leucemie acute.

Inoltre, considerata l’esiguità di campione biologico necessario, detto metodo si applica senza avere un impatto sostanziale sulla routine operativa, non necessitando di prelievi dedicati. Ad esempio, nel caso dell’utilizzo di sangue, è tipicamente sufficiente un volume inferiore ad 1 ml. Nel caso di midollo spinale sono tipicamente sufficienti volumi pari a 1 ml per l’esecuzione di test multipli, ovvero 0,1 ml o meno per esecuzione di un singolo test. Un campione da ago aspirato può offrire materiale a sufficienza.

La metodica qui sviluppata permette di utilizzare campioni complessi, inclusi campioni multicellulari e siero, con enormi vantaggi dal punto di vista delle condizioni quanto più vicine a quelle fisiologiche, per migliorare la predittività del saggio.

Il metodo qui descritto consente un’analisi ad alto contenuto, con la risoluzione fino ad una singola cellula, effettuando sia un’analisi dinamica (timelapse), che un processamento dinamico del campione (tramite ricambio programmabile nel tempo dei fluidi che circondano il campione) caratteristiche queste fortemente ambite poiché permettono di monitorare e comparare l’evoluzione nel tempo di una data cellula avente specifiche caratteristiche, di rendere automatica la preparazione del campione e la somministrazione dei farmaci e di realizzare protocolli complessi che prevedono, per esempio, l’inserimento di sequenze di farmaci o la marcatura con determinati reagenti, ad esempio la Annessina V, alla fine del periodo di incubazione con il farmaco per determinare l’esito dell’esperimento in termini di vitalità, induzione dell’apoptosi o valutazione della attivazione di specifici pathway associabili all’attività del farmaco. Tra le numerose applicazioni per le quali la metodica qui descritta è particolarmente funzionale, si menziona qui la possibilità di confrontare, in maniera rapida e automatizzata, la responsività delle cellule tumorali di un paziente ad uno specifico trattamento e la responsività media delle cellule tumorali di una popolazione di pazienti affetti dalla stessa tipologia di tumore. Ancora, vi è la possibilità di confrontare la responsività delle cellule tumorali di un paziente ad uno specifico trattamento con la responsività media di linee cellulari relative alla stessa tipologia di tumore e/o a tipologie di tumore differenti, ad esempio riferendosi a dati di letteratura.

Il processo è completamente automatizzato, l’intervento dell’operatore è ridotto al minimo, ovvero al solo caricamento dei campioni biologici e dei reagenti e farmaci nei reservoirs. In alcune forme di realizzazione, l’intervento è esclusivamente limitato al caricamento del campione biologico, laddove il sistema a micropozzetti aperti invertiti comprenda reservoirs già precaricati dei reagenti e dei farmaci, minimizzando gli errori, abbattendo il rischio di cross-contaminazione e aumentando in maniera considerevole la riproducibilità dei dati ottenuti. E’ anche possibile caricare il campione biologico tale quale, senza alcuna preparazione: il sistema stesso è in grado di rilevare il numero di cellule contenute nello stesso, diluirle alla diluizione ottimale e dispensarle nei micropozzetti di interesse.

Nella forma di realizzazione che comprende elettrodi nei micropozzetti, è possibile ottenere specifici raggruppamenti di cellule in singoli micropozzetti, così da valutare meccanismi d’azione cellula-dipendenti.

Come ulteriore vantaggio, si evidenzia qui che lavorando su scala micrometrica anche il consumo di reagenti e farmaci è assolutamente contenuto, ad esempio i farmaci vengono diluiti in volumi di soli 20-50 microlitri, con un considerevole risparmio rispetto a quanto richiesto dovendo lavorare su volumi più grandi, vantaggio questo particolarmente evidente laddove i farmaci utilizzati sono farmaci estremamente costosi, ovvero in fase di sviluppo del farmaco, laddove la disponibilità dello stesso può essere limitata, soprattutto nel caso, ad esempio, di farmaci biologici.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, si descrive un metodo per l’analisi high-content di campioni biologici su larga scala che comprende i seguenti passaggi, non necessariamente nell’ordine indicato:

a) Mettere a disposizione un kit secondo la rivendicazione 9 o 10;

d) Caricamento dei reagenti attraverso una o più di dette porte di ingresso (8), dove detti reagenti comprendono: filling buffer e/o soluzione di lavaggio e/o uno o più farmaci e/o uno o più traccianti, e/o uno o più anticorpi marcati e/o uno o più marcatori di vitalità cellulare;

e) Caricamento di detti uno o più campioni biologici attraverso una o più di dette porte di ingresso (8);

Esempio 1: Valutazione dell’efficacia di Rituximab su cellule di linfoma non-Hodgkin

Cellule: Sono state utilizzate cellule di linfoma SU-DHL-4 e cellule Raji (ATCC CCL-86). 3·10^5 cellule/ml sono state coltivate in terreno RPMI supplementato con 10% FBS, 1% puromicina/streptomicina a 37°C, 95% di umidità, 5% CO2. Le cellule sono state amplificate, dividendole quando a confluenza. PBMC sono state isolate dal sangue mediante centrifugazione in gradiente. Il sangue intero, proveniente da donatori sani, è stato raccolto in tubi trattati con anticoagulanti conformemente alla direttiva "principi etici e linee guida per la protezione dei soggetti umani di nella ricerca". PBMC isolate sono state lavate due volte con 10 ml di HBSS freddo dopo la lisi dei globuli rossi. La concentrazione delle cellule e la loro vitalità è stata determinata al Trypan blu su emocitometro. La concentrazione è stata regolata a 1 milione cellule/ml. Diversi lotti di cellule SU-DHL-4 o Raji sono state raccolte al picco della loro crescita, lavate con PBS e contate in un emocitometro con Trypan Blu. La concentrazione delle cellule è stata regolata a 1 milione cellule/ml e le stesse sono state marcate con Calceina AM (CAM) 5 nM per la citofluorimetria e 250 nM per il saggio secondo la presente invenzione. Le cellule marcate sono state lavate una volta in PBS e risospese in RPMI. Lo stesso protocollo è stato usato per marcare con CAM PBMC appena isolate. La vitalità cellulare è stata infine valutata con PI e citofluorimetria a flusso.

Citofluorimetria a flusso (comparativo)

10^5 cellule marcate CAM per ciascun lotto sono state seminate in duplicato su una piastra a 96 pozzetti. Il gruppo controllo (CTRL) è stato trattato con RPMI addizionato con PI ad una concentrazione finale di 1,5 µM. Il gruppo di trattamento (RTX) è stato trattato con Rituximab ad una concentrazione finale di 10 µg/ml in RPMI addizionato con PI ad una concentrazione finale di 1,5 µM ed incubato a temperatura ambiente per 5 min. Subito dopo, siero umano (hS) è stato aggiunto ad una concentrazione finale 1%. Il volume finale di ciascun pozzetto era di 200 µl. Campioni di 50 µl sono stati presi al tempo 0, 30 e 60 min dopo l'aggiunta hS, ed analizzati al FACS (FACSAria BD, USA).

Saggio in micropozzetti aperti

Diversi lotti di cellule marcate CAM sono stati risospesi in RPMI ad una concentrazione finale di 2 · 10^6/ ml. Analogamente alla procedura seguita per la citometria a flusso, il gruppo RTX è stato trattato con Rituximab ad una concentrazione finale di 10 µg/ml offchip ed incubato a temperatura ambiente per 5 min. Cellule CTRL e RTX sono state seminate nel sistema a micropozzetti aperti invertiti come descritto, ottenendo un numero ottimale pari o inferiore a 7 cellule per micropozzetto. I canali sono stati poi risciacquati con PBS addizionato con il 20% di FBS. Una prima serie di immagini era stata acquisita per impostare le condizioni iniziali (Tbaseline). Dopo il caricamento, il canale CTRL è stato trattato con RPMI integrato con hS ad una concentrazione finale di 1% e PI ad una concentrazione di 5 μM. Il canale RTX è stato trattato con RPMI supplementato con Rituximab 10 µg/ml, HS 1% e PI 5 μM.

Immagini in time-lapse T1, T2, T3, T4 sono state acquisite ogni 15’ e fino ad un’ora dal trattamento.

Microscopia

Le immagini sono state acquisite in campo chiaro (BF) per valutare le caratteristiche morfologiche e poi in fluorescenza per valutare il segnale nelle bande DAPI (ex: 360/40 nm, em: 460/50 nm), FITC (ex: 480/30 nm, em: 535 / 40nm), TRITC (ex: 540/25 nm, em: 605/55 nm). Tutte le immagini sono state acquisite con l'obiettivo 10x con una fotocamera Nikon. Durante l'imaging il microscopio lavorava in atmosfera controllata a 37 °C, 95% di umidità, 5% CO2.

Visualizzazione

Cellule tumorali SU-DHL-4 sono state marcate con CAM e successivamente caricate nel sistema open microwell, trattate con farmaco nel caso del gruppo RTX ed osservate.

I risultati sono riportati in Figura 11. Il pannello A mostra una sequenza di immagini in time-lapse di campioni CTRL e trattati RTX ai tempi T05-10 min, T1 30 min e T3 60 min. Le cellule indicate dalle frecce si riferiscono alla colorazione acquisita nel canale TRITC (PI) e rappresentano le cellule morte. Sono presenti solo al T2 e T3 nel gruppo RTX. A maggior contrasto, si vedono le cellule acquisite nel canale FITC, ovvero le cellule vive marcate con Calceina-AM. Nel pannello B sono riportati i dati ottenuti con il FACS. Il pannello C riporta gli istogrammi dell’analisi effettuata al FACS e secondo la metodica della presente invenzione al tempo T2 60 minuti. Le percentuali indicate si riferiscono alla popolazione di cellule Calceina-AM positive, quindi vive. Come si può osservare, i dati ottenuti con le due metodiche sono assolutamente paragonabili. A conferma, i dati sono riportati in maniera lineare in Figura 12, portando alla conclusione che il sistema secondo la presente invenzione può essere usato per quantificare le cellule vive e morte nel tempo, fornendo dati equivalenti a quella che è ad oggi la tecnica di elezione, ovvero la citofluorimetria a flusso, con tutti i vantaggi legati alla possibilità di effettuare analisi high-content, non possibili con la citofluorimetria a flusso.

Il metodo secondo la presente invenzione si mostra in aggiunta in grado di fornire importanti risultati, non ottenibili con la citofluorimetria a flusso. Dapprima, si è osservato come dalla miscela di cellule tumorali Raji e PMBC fosse possibile, grazie alla marcatura CD38, colorare e osservare selettivamente le cellule tumorali. A tal fine, cellule tumorali Raji e PBMC sono state marcate con CAM e con un anticorpo anti-CD38 Alexa Fluor 488 1:10, separatamente. Una quota delle cellule è stata poi miscelata in rapporto 1:1. Le cellule Raji, PMBC, e la miscela sono state quindi piastrate in tre diversi canali del sistema a micropozzetti aperti invertiti e poi osservate. Come evidenziato dalla Figura 13, le cellule tumorali, evidenziate in A per la selettiva colorazione con l’anticorpo anti-CD38 rispetto alle cellule totali colorate con CAM, vengono facilmente evidenziate dalla metodica della presente invenzione non solo per la fluorescenza associata al marcatore specifico (pannello C) ma anche per parametri morfologici (pannello B e D)

L’acquisizione di immagini in time-lapse ha il vantaggio di fornire un'analisi precisa di ogni risposta cellulare a stimoli rappresentati, ad esempio, dal trattamento farmacologico, dove l’analisi precisa viene ottenuta attraverso la valutazione della variazione relativa della fluorescenza che, in caso di colorazione con un colorante vitale, fornisce un mezzo per determinare la risposta cellulare. Anche laddove la colorazione iniziale non è uniforme, il segnale emesso da ciascuna cellula viene così normalizzato al suo valore iniziale. In confronto, l'analisi della fluorescenza assoluta dopo l'applicazione di un trattamento, dato tipicamente fornito mediante citometria a flusso, fornisce in questo caso un risultato meno accurato.

Per esempio, la Figura 14 mette a confronto la distribuzione ottenuta mediante analisi dinamica ovvero di variazione di fluorescenza relativa, in A, verso la distribuzione del dato ottenuto in termini assoluti, in B. La prima distribuzione in Figura 14A è stata ottenuta secondo il metodo qui descritto su cellule Raji dopo esposizione a Rituximab. Le cellule che mostrano una variazione di segnale di minor intensità rappresentano una sotto-popolazione di cellule possibilmente resistenti, oppure che hanno riportato un danno minore. Utilizzando questa distribuzione, sono state selezionate quelle cellule per le quali la variazione era inferiore ad una diminuzione del 45%, indicate con una stella (*) in figura, e analizzato le stesse all’interno di un’analisi che riporta la variazione in termini assoluti (Figura 14B). In particolare, in questa figura le colonne contrassegnate con la stella indicano la presenza di almeno una cellula identificata come resistente dalla precedente analisi. Come mostrato in Figura 14B, l’analisi assoluta non fornisce un mezzo per identificare le cellule con un danno basso con la stessa precisione del metodo riportato in Figura 14A, come evidenziato dal fatto che esiste una colonna sul lato sinistro dell’istogramma che mostra un sottogruppo di cellule aventi intensità assoluta minima ma che non sono classificate come resistenti secondo l’analisi relativa, infatti la colonna non è contrassegnata da alcuna stella. Analogamente, sul lato destro del grafico, esistono cellule che pur avendo un’intensità del segnale elevata hanno mostrato una perdita di segnale importante e che, quindi, vanno ritenute sensibili alla terapia secondo l’analisi relativa.

Esempio 2: processo automatizzato di marcatura, analisi in time-lapse

Cellule vengono caricate in micropozzetti 2 di un sistema a micropozzetti aperti invertiti. Il terreno nel quale dette cellule erano contenute viene quindi eliminato con una serie di lavaggi ripetuti, dove detti lavaggi avvengono facendo passare attraverso detti microcanali 3 un fluido di lavaggio, a titolo di esempio HBSS. Immagini vengono acquisite a tempi successivi durante dette operazioni di lavaggio e il pannello D della Figura 15 riporta immagini acquisite al tempo 0 e dopo 3, 5, 7, 8, 10 e 12 minuti dal lavaggio. Nei grafici riportati nei pannelli B e C della stessa Figura 15, le curve indicano la riduzione del rumore di fondo che si ottiene grazie a detti lavaggi. Nel pannello A, la procedura secondo la metodica qui descritta è messa a confronto con una metodica standard, che necessita di centrifugate successive. In particolare, la linea continua contraddistinta dal rombo indica il risultato nel tempo con la metodica secondo la presente invenzione, dove una diminuzione del 79,1% del rumore di fondo è osservabile dopo 5 minuti di infusione continua della soluzione di lavaggio ad una velocità di 16 µl/minuto. La linea tratteggiata rappresenta il risultato ottenuto tramite il processo standard di centrifugazione, dove il risultato ottenuto dopo 4 cicli di lavaggio separati da 5 minuti di centrifuga a 1000 rcf è riportato. La linea continua contraddista dal triangolo riporta il risultato ottenuto dopo 2 cicli di lavaggio separati da 5 minuti di centrifuga a 1000 rcf. La metodica secondo la presente invenzione permette di ottenere risultati paragonabili, con l’evidente vantaggio di non necessitare di laboriose centrifugazioni che inevitabilmente comportano una perdita di materiale biologico, perdita che in alcune situazioni può essere significativa ad un punto tale da compromettere l’analisi stessa, oltre che un’esposizione del campione biologico a stress aggiuntivi.

Esempio 3: Valutazione dell’efficacia di OKT3 su linfoblasti T

Cellule della linea cellulare Jurkat (cellule T leucemiche di origine umana) sono state ottenute da ATCC e coltivate in terreno RPMI 1640 addizionato con 10% FBS inattivato, Hepes 10 mM, Sodio piruvato 1 mM, Ultraglutamine 2 mM e Penicillina/Streptomicina 1%, in fiasche da 25 cm<2>a 37°C and 5% CO2.

Gli ibridomi OKT3 sono stati coltivati in bioreattori (CellLine, Integra Biosciences) in terreno completo RPMI 1640 contenente 3% FBS e il surnatante è stato raccolto 2 volte a settimana. La purificazione degli anticorpi monoclonali è stata eseguita tramite una doppia precipitazione in solfato di ammonio saturo al 30% e 50%, seguito da dialisi in PBS. La purezza di OKT3 è stata valutata tramite gel SDS-PAGE e la quantità di anticorpo è stata determinata attraverso NanoDrop (Thermo Scientific). L’anticorpo è stato quindi congelato a -80°C prima dell’uso.

A scopi comparativi, la misura del segnale del calcio su intere popolazioni di cellule Jurkat è stata eseguita seguendo il protocollo Fluo-4 (Life Technologies). 1x10<6>cellule Jurkat sono state lavate una volta in HBSS e incubate con Fluo-4 (4 ng/µl) per 30 minuti a 37°C. Dopo il lavaggio e la risospensione in HBSS, le cellule vengono trattate con l’anticorpo purificato OKT3 alle concentrazioni di 1, 5 and 10 µg/ml o, in alternativa, utilizzando 50 μl di surnatante prelevato dalla coltura di ibridomi. Come controllo positivo del flusso di calcio, è stata aggiunta Ionomicina (Sigma-Aldrich) 2 μg/ml. Le cellule così trattate sono state quindi analizzate al citofluorimetro.

Per il saggio in micropozzetti aperti secondo la presente invenzione, le cellule Jurkat sono state marcate con Fluo-4 20µM in HBSS, centrifugate e risospese in terreno senza siero (RPMI 1640 con Hepes 25 mM o HBSS) ad una concentrazione di 1.6 x 10<6>cellule/ml in tubi Eppendorf da 1,5 ml utilizzati come serbatoi di ingresso per il sistema a micropozzetti aperti invertiti. Successivamente al deposito delle cellule Jurkat nei micropozzetti (circa 1-10 cellule per micropozzetto) e lavaggio dei canali con HBSS, le soluzioni contenenti Ionomicina (2 µg/ml) o OKT3 (10 µg/ml), vengono fatte fluire in specifici microcanali del sistema a micropozzetti aperti tramite pompa peristaltica. Le immagini sono state acquisite da una camera connessa al microscopio a distanza di 1 minuto ed elaborate da un software sviluppato in linguaggio LabView, quantificando l'andamento dinamico del segnale stesso su ciascuna cellula del campione.

Risultati al citofluorimetro: l'andamento della fluorescenza media del campione a seguito della iniezione di Ionomicina (a) o OKT3 (b) nel campione è stato quantificato al citofluorimetro, ottenendo i risultati riportati in Figura 16. I grafici riportano la variazione della media della intensità di fluorescenza e confermano il funzionamento del modello impiegato.

Variazione di segnale di background in micropozzetti aperti: la variazione del segnale emesso da singole cellule marcate con Fluo-4 in assenza di stimolazione è stata quantificata dopo il caricamento delle cellule nel sistema a micropozzetti aperti. L'analisi ha riportato un incremento di segnale pari al 38%.

Stimolazione con Ionomicina in micropozzetti aperti: la stimolazione con Ionomicina ha fatto riscontrare un incremento medio di segnale, rispetto al valore basale, pari al 193% /- 139% in una serie di 10 esperimenti. L'andamento tipico osservato è quello riportato nella Figura 17 (a). Come osservato anche al citofluorimetro, in caso di stimolazione con Ionomicina, a seguito di un incremento iniziale della fluorescenza, il segnale si assesta poi su valori stabilmente alti.

La stimolazione con OKT3 ha riportato un incremento di picco del segnale, rispetto al valore baseline, pari in media al 178% /- 90% in una serie di 3 esperimenti. L'andamento tipico osservato è quello riportano nella figura 17(b). Come osservato anche al citofluorimetro, in caso di stimolazione con OKT3, a seguito di un incremento iniziale della fluorescenza, il segnale ha raggiunto il valore di picco entro alcuni minuti.

L’esperimento comparativo dimostra come la metodica secondo la presente invenzione consenta di avere dati paragonabili a quelli ottenuti con la metodica di elezione che è la citofluorimetria.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Una regione di scarico (70) compresa in un dispositivo microfluidico (1) che comprende: un contenitore di scarico (12) in collegamento fluidico con detto dispositivo microfluidico (1) tramite almeno un canale di scarico (22) e una porta di uscita (10).
2. La regione di scarico (70) secondo la rivendicazione 1, dove detto dispositivo microfluidico (1) comprende almeno un microcanale (3) e detto canale di scarico (22) emerge da detto almeno un microcanale (3) ed è un sifone.
3. La regione di scarico (70) secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzata dal fatto che il diametro di detto canale di scarico (22) è tale che il sifone esercita una forza capillare sul fluido contenuto in detto microcanale (3).
4. La regione di scarico (70) secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, dove detto canale di scarico (22) è posto sul fondo di detto almeno un microcanale (3) ed è pressoché ortogonale allo stesso e mette in collegamento detto almeno un microcanale (3) con detto contenitore di scarico (12) che è posizionato al di sotto rispetto allo stesso microcanale (3).
5. La regione di scarico (70) secondo una delle rivendicazioni da 1 a 3, dove detta porta di uscita (10) è posta sul fondo di detto almeno un microcanale (3) ed immette in un primo contenitore di scarico (12a), posizionato al di sotto rispetto a detto microcanale (3) e da detto primo contenitore di scarico (12a) emerge detto canale di scarico (22) che immette in detto contenitore di scarico (12).
6. La regione di scarico (70) secondo una delle rivendicazioni da 1 a 5, dove detto canale di scarico (22) ha un’area in sezione trasversale di dimensioni micrometriche, dette dimensioni essendo comprese tra 100 �m e 5mm, preferibilmente tra 500 �m e 2 mm.
7. Un metodo per il carico/scarico di fluidi da un dispositivo microfluidico dove detto metodo comprende: a) Mettere a disposizione un dispositivo microfluidico (1) che comprende una regione di ingresso (8) e una regione di scarico (70) secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6, ove detto dispositivo microfluidico (1) è caricato con almeno un primo fluido; b) Opzionalmente, esercitare una pressione su detto almeno un primo fluido in ingresso in detto dispositivo microfluidico (1); c) Alternativamente, disporre di una regione di scarico (70) dove detto canale di scarico (22) ha un diametro tale da far sì che detto fluido possa passare da detto dispositivo microfluidico a detto canale di scarico per capillarità; caratterizzato dal fatto che, laddove il volume V di detto almeno un primo fluido è minore o uguale al volume di detto contenitore di scarico (12), detto almeno un fluido raggiunge detto contenitore di scarico (12) in maniera unidirezionale.
8. Il metodo per il carico/scarico di fluidi secondo la rivendicazione 7, dove detto metodo comprende altresì: -immettere un secondo o ulteriore fluido attraverso detta regione di ingresso (8) in detto dispositivo microfluidico (1), laddove detto primo, secondo e/o ulteriori fluidi sono indipendentemente uguali o diversi tra loro e sono selezionati nel gruppo che comprende liquidi e gas; -opzionalmente, detto secondo e/o ulteriore fluido sostituisce completamente in detto microcanale (3) o in detto microcanale (3) e in detti micropozzetti aperti invertiti (2), laddove presenti in detto dispositivo microfluidico (1), il fluido immesso in precedenza; caratterizzato dal fatto che detto primo, secondo e/o ulteriore fluido non si mescolano tra loro.