JP4108430B2 - オリゴヌクレオチド - Google Patents

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はクローン化ベクター、および繊維状ファージ粒子の表面上で融合ポリペプチドを発現し得るＤＮＡ分子のライブラリーの製造方法に関する。
【０００２】
背景
繊維状バクテリオファージは細菌に感染する一群の関連するウイルスである。これらは、バクテリオファージゲノムを形成するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を包む伸張したカプセルから構成された長く薄い粒子であることから、繊維状という用語が用いられている。Ｆピリ繊維状ファージ（Ｆｆファージ）は、Ｆピリの先端に特異的に吸着することによりグラム陰性細菌のみに感染し、ｆｄ、ｆｌおよびＭ１３を包含する。
Ｆｆファージの成熟カプセルはファージによりコードされる５つの遺伝子産物のコート：ｃｐＶＩＩＩ（カプセルの塊質を形成する遺伝子ＶＩＩＩの主コート蛋白質産物）および４つの副コート蛋白質（カプセルの一端のｃｐＩＩＩおよびｃｐＩＶ並びにカプセルの他端のｃｐＶＩＩおよびｃｐＩＸ）から構成される。カプセルの長さは、特徴的なフィラメント構造を形成する秩序あるヘリックス列の２５００〜３０００コピーのｃｐＶＩＩＩにより形成される。カプセルの端に約５コピーのそれぞれの副コート蛋白質が存在する。遺伝子ＩＩＩにコードされた蛋白質（ｃｐＩＩＩ）は典型的にはカプセルの一端に４〜６コピー存在し、感染の初期相においてその細菌宿主に対するファージの結合の受容体として働く。Ｆｆファージ構造の詳細な総説については、ラシェトら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５０：４０１−４２７（１９８６）およびモデルら、「バクテリオファージ、第２巻」中、アール・カレンダー編、プレナム・プレス、ｐｐ．３７５−４５６（１９８８）を参照することができる。
【０００３】
Ｆｆファージ粒子の集成は高度に複雑な機構を含む。宿主細胞内でファージ粒子が集成されることはなく、これらは寧ろ宿主細胞の膜を介するウイルスゲノムの押出しの際に集成される。押出しの前に、主コート蛋白質ｃｐＶＩＩＩおよび副コート蛋白質ｃｐＩＩＩが合成され、宿主の細胞膜に移される。ｃｐＶＩＩＩおよびｃｐＩＩＩの両者は、成熟粒子へのこれらの組込みの前に宿主細胞膜に定置される。更に、ウイルスゲノムが生産され、ｃｐＶ蛋白質によってコートされる。押出し過程の際に、ｃｐＶコートゲノムＤＮＡはｃｐＶコートを剥され、同時に成熟コート蛋白質により再コートされる。これらの蛋白質の膜から粒子への移動を調節する集成機構は現在では知られていない。
【０００４】
ｃｐＩＩＩおよびｃｐＶＩＩＩ蛋白質の両者は、成熟ファージ粒子の集成のシグナルを与える２つのドメインを含む。第１のドメインは、新たに合成された蛋白質を宿主細胞膜に向ける分泌シグナルである。分泌シグナルはポリペプチドのアミノ末端に局在し、ポリペプチドを標的として少なくとも細胞膜に向かわせる。第２のドメインは、宿主細胞膜との会合および集成の際のファージ粒子との会合のシグナルを与える膜アンカードメインである。ｃｐＶＩＩＩおよびｃｐＩＩＩの両者についてのこの第２のシグナルは、少なくとも膜を渡る疎水性領域からなる。
ｃｐｖＩＩＩは、外側に向いた酸性アミノ末端および膜の内側に向いた塩基性カルボキシ末端による非対称配向で細胞膜のような脂質二重層に一体化することができるため、モデル膜蛋白質として広範に研究されて来た。成熟蛋白質は約５０アミノ酸残基の長さであり、その内１１残基がカルボキシ末端を与え、１９残基が疎水性膜横断領域を与え、残りの残基はアミノ末端を含む。ｃｐＶＩＩＩの分泌シグナル領域については相当な研究が行われ、膜蛋白質合成および膜に対する標的の研究が進行した。しかしながら、ファージ粒子の集成を可能とし得るｃｐＶＩＩＩ膜アンカー領域の構造において許容される変化については殆ど知られていない。
【０００５】
ｃｐＩＩＩの配列の操作により、正常には膜アンカー機能の礎となる疎水性アミノ酸のＣ末端２３アミノ酸残基の伸張は種々の方法で変えることができ、膜と会合する能力は保持されることが示された。しかしながら、このようなアンカー修飾ｃｐＩＩＩ蛋白質は遺伝子ＩＩＩ変異体と遺伝的に相補するその能力を喪失し、機能的集成に対する膜アンカーの必要性が解明されていないことを示している。
Ｆｆファージに基く発現ベクターが記載されており、全ｃｐＩＩＩアミノ酸残基配列が短いポリペプチド「エピトープ」［パルメリら、Ｇｅｎｅ，７３：３０５−３１８（１９８８）およびクイルラら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８−６３８２（１９９０）］または一本鎖抗体ドメインを特定するアミノ酸残基配列の挿入によって修飾された。マカファーティら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）。これらのハイブリッド蛋白質が合成され、粒子当り約５コピーの量（正常なｃｐＩＩＩが通常認められる密度）でファージ粒子上で集成された。しかしながら、これらの発現された融合蛋白質は全ｃｐＩＩＩアミノ酸残基配列を含み、ｃｐＩＩＩのカルボキシ末端膜アンカードメインのみを利用する融合蛋白質を示唆しない。
更に、ファージ粒子のコートへの組込みが機能性で可能なヘテロ二量体分子の集成を可能とするようファージコート蛋白質が加工された発現系は記載されていない。
【０００６】
発明の概略
組換え遺伝子を含む繊維状ファージの表面上でヘテロ二量体組換え遺伝子産物を発現させる新しい表面組込み技術を突き止めた。この発明は、繊維状ファージ複製の集成段階に際して遺伝子産物および遺伝子を結合させる手段として繊維状ファージコート蛋白質膜アンカードメインを使用するものである。
すなわち、繊維状ファージ複製に際し、コート蛋白質はファージゲノムをカプセル化するマトリックスに集成する。（１）組換え繊維状ファージコート蛋白質が存在する場合ファージの集成は中断されず、（２）組換え繊維状ファージコート蛋白質を集成マトリックスに組込むことができ、（３）マトリックスへの組込みが表面接近可能な配向で生起するよう向けることができることをこの度突き止めた。
【０００７】
本発明は、所定の特異性のヘテロ二量体受容体の製造に有利に適用することができる、すなわちこれを使用して予備選択したリガンドに結合する抗体、Ｔ細胞受容体等を製造することができる。
よって、本発明は、ヘテロ二量体受容体および受容体をコードする遺伝子を単離する方法においてヘテロ二量体受容体認識および繊維状ファージ複製の機能の結合を提供するものである。この方法により、組換えゲノムをカプセル化する遺伝子ＶＩＩＩコード蛋白質のマトリックスから構成した繊維状ファージを製造する。組換えゲノムは、ヘテロ二量体受容体ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。ヘテロ二量体受容体は、ヘテロ二量体受容体ポリペプチドの１つへの翻訳の際にペプチド結合により融合した繊維状ファージコート蛋白質の膜アンカードメインを介してカプセル化マトリックスに表面組込みされている。ヘテロ二量体受容体ポリペプチドおよびポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ複製周期の集成段階に際して物理的に結合される。固体支持体に対する受容体コートファージの特異的結合により、組換えゲノムの多様なライブラリーから所望のヘテロ二量体受容体をコードする組換えゲノムを単離する手段が有利に提供される。
【０００８】
１つの態様では、本発明は重鎖および軽鎖ポリペプチドからなる抗体分子を企図し、前記重鎖ポリペプチドはアミノ末端原核分泌シグナルドメインおよびカルボキシ末端繊維状ファージ膜アンカードメインが隣接するＶＨドメインからなり、前記軽鎖ポリペプチドはアミノ末端原核分泌シグナルドメインに融合したＶＬドメインからなる。
他の態様では、本発明は融合ポリペプチドを発現するベクターを企図し、前記ベクターは挿入物ＤＮＡの方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介して機能的に結合した上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列からなり、前記上流の配列は原核分泌シグナルをコードし、前記下流の配列は繊維状ファージ膜アンカーをコードし、前記翻訳可能なＤＮＡ配列は前記融合ポリペプチドの部分としての前記翻訳可能なＤＮＡ配列の発現のための一組のＤＮＡ発現シグナルに機能的に結合している。
【０００９】
Ａ．定義
アミノ酸残基：そのペプチド結合におけるポリペプチドの化学的分解（加水分解）に際して形成されるアミノ酸。ここに記載するアミノ酸残基は好ましくは「Ｌ」異性体形態である。ただし、ポリペプチドが所望の機能的性質を保持する限り、「Ｄ」異性体形態の残基を全ゆるＬアミノ酸残基について置換することができる。ＮＨ２はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基に言及するものである。ＣＯＯＨはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離のカルボキシ基に言及するものである。標準的なポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：３５５２−５９（１９６９）に記載され、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２（ｂ）（２）で採用された）に従い、アミノ酸残基の省略形を次の対応表に示す：
【００１０】
Figure 0004108430
Figure 0004108430
【００１１】
式にここに示した全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の慣用された方向で左から右の方向性を有することを銘記すべきである。更に、「アミノ酸残基」という記載は、対応表に列記したアミノ酸並びに修飾および通常でないアミノ酸、たとえば３７ＣＦＲ１．８２２（ｂ）（４）に列記されたもの（参考によりここに取入れる）を包含するものとして広く定義する。更に、アミノ酸残基配列の始めまたは終りのダッシュは、１以上のアミノ酸残基の更なる配列へのペプチド結合またはＮＨ２のようなアミノ末端基またはアセチルまたはＣＯＯＨのようなカルボキシ末端基に対する共有結合を示すことを銘記すべきである。
ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸および含窒素複素環塩基よりなるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介して糖部分に結合し、その塩基と糖との組合せがヌクレオシドである。ヌクレオシドがペントースの３′または５′位置に結合したリン酸基を含む場合、これはヌクレオチドと言及される。機能的に結合したヌクレオチドの配列は、ここでは典型的には「塩基配列」または「ヌクレオチド配列」およびその文法的に等価なものとして言及し、またここでは式によって表し、その左から右の方向性は５′末端から３′末端への慣用された方向である。
【００１２】
塩基対（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の対合関係。ＲＮＡではチミンをウラシル（Ｕ）で置換する。
核酸：ヌクレオチドの重合体（一本鎖または二本鎖）。
ポリヌクレオチド：一本鎖または二本鎖ヌクレオチドの重合体。ここで使用するように、「ポリヌクレオチド」およびその文法的に等価なものは全範囲の核酸を包含し得る。ポリヌクレオチドは、２以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドの線状の鎖から構成された核酸分子を典型的に言及し得る。正確な大きさは多くの因子に依存し得るが、これは翻って当業界で周知のように使用の最終条件に依存する。本発明はポリヌクレオチドはプライマー、プローブ、ＲＮＡ／ＤＮＡ断片、オリゴヌクレオチドまたは「オリゴス」（比較的短いポリヌクレオチド）、遺伝子、ベクター、プラスミド等を包含する。
【００１３】
遺伝子：そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸。遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡとすることができる。
デュープレックスＤＮＡ：デュープレックスの塩基対に存在する相補的塩基のそれぞれの間の１以上の水素結合により互いに保持された２つの鎖の実質的に相補的なポリヌクレオチドからなる二本鎖核酸分子。塩基対を形成するヌクレオチドはリボヌクレオチド塩基またはデオキシリボヌクレオチド塩基とすることができるため、「デュープレックスＤＮＡ」という記載は、２つのＤＮＡ鎖（ｄｓＤＮＡ）からなるＤＮＡ−ＤＮＡデュープレックスまたは１つのＤＮＡおよび１つのＲＮＡ鎖からなるＲＮＡ−ＤＮＡデュープレックスに言及するものである。
【００１４】
相補的塩基：ＤＮＡまたはＲＮＡが二本鎖構造をとる場合に正常に対合するヌクレオチト。
相補的ヌクレオチド配列：結果的な水素結合により特異的にハイブリダイズする他の一本鎖上のものと十分に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子におけるヌクレオチドの配列。
保存された：ヌクレオチド配列は、予備選択した配列の正確な相補体に非無作為にハイブリダイズする場合、予備選択した（対照）配列に対して保存されたものである。
ハイブリダイゼーション：相補的塩基対の間の水素結合の確立によりデュープレックスまたはヘテロデュープレックスを形成する実質的に相補的なヌクレオチド配列（核酸の鎖）の対合。これは競合的に阻害することのできる２つの相補的なポリヌクレオチドの間の特異的な、すなわち非無作為の相互作用である。
核酸アナログ：Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵとは構造的に異なるが、核酸分子中で正常なヌクレオチドを置換する程十分類似するプリンまたはピリミジンヌクレオチド。
【００１５】
ＤＮＡ相同体：予備選択した保存されたヌクレオチド配列および予備選択したリガンドに結合し得る受容体をコードする配列を有する核酸。
組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子：２つのＤＮＡ断片を機能的に結合することにより製造されるＤＮＡ分子。よって、組換えＤＮＡ分子は、通常は天然には一緒に認められない少なくとも２つのヌクレオチド配列からなるハイブリッドＤＮＡ分子である。共通の生物学的起源を有さない、すなわち進化的に異なるｒＤＮＡは「異種起源」と言われる。
ベクター：細胞中で自己複製し得るｒＤＮＡ分子であり、これにＤＮＡ断片、例えば遺伝子またはポリヌクレオチドが機能的に結合し、付着した断片の複製をもたらすことができる。１以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指向し得るベクターはここでは「発現ベクター」として言及する。特に重要なベクターは、逆転写酵素を使用して製造したｍＲＮＡからｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローン化を可能とするものである。
受容体：受容体は、他の分子に特異的に（非無作為に）結合することのできる蛋白質、糖蛋白質等の分子である。
【００１６】
抗体：抗体という用語はその種々の文法的形態においてここでは免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗体結合部位またはパラトープを含む分子に言及するものである。例示的な抗体分子は、無傷の免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の部分（当業界でＦａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２およびＦ（ｖ）として知られる部分を含む）である。
抗体結合部位：抗体結合部位は、抗原と特異的に結合（免疫反応）する重鎖および軽鎖可変および超可変領域から構成された抗体分子のその構造部分である。免疫反応という用語は、その種々の形態において、抗原性決定基含有分子と全抗体分子またはその一部のような抗体結合部位を含む分子との特異的な結合を意味する。
【００１７】
モノクローナル抗体：モノクローナル抗体という記載は、その種々の文法的形態において、特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部位の１種のみを含む抗体分子の集団に言及するものである。よってモノクローナル抗体は典型的には免疫反応する全ゆる抗原に対して単一の結合親和力を示す。したがってモノクローナル抗体は複数の抗体結合部位を有する抗体分子を含み、それぞれ異なる抗原に対して免疫特異的であり、たとえば二特異的モノクローナル抗体がある。
融合ポリペプチド：少なくとも２つのポリペプチドおよび２つのポリペプチドを１つの連続的なポリペプチドに機能的に結合する結合配列から構成されたポリペプチド。融合ポリペプチド中で結合した２つのポリペプチドは典型的には２つの独立した起源から誘導され、したがって融合ポリペプチドは通常は天然には結合して認められない２つの結合したポリペプチドからなる。
上流：ＤＮＡ転写の方向の反対の方向であり、したがって非コード鎖では５′から３′、ｍＲＮＡでは３′から５′に向う。
下流：配列転写または読出しの方向でＤＮＡ配列にさらに沿うもの、すなわちＤＮＡの非コード鎖に沿う３′から５′方向またはＲＮＡ転写体に沿う５′から３′方向に向うものである。
【００１８】
シストロン：アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ分子のヌクレオチド配列であり、上流および下流のＤＮＡ発現調節要素を含む。
停止コドン：アミノ酸をコードしない代りに蛋白質合成の終了を生起する全ゆるコドン。これらはＵＡＧ、ＵＡＡおよびＵＧＡであり、ノンセンスまたは終止コドンとしても言及される。
リーダーポリペプチド：ポリペプチドのアミノ末端の短い長さのアミノ酸配列であり、内膜に対してポリペプチドを担持するか指向させ、ペリプラズム空間また恐らくその向こうへのその最終的な分泌を確実なものとする。リーダー配列ペプチドは、ポリペプチドが活性となる前に通常は除去される。
リーディングフレーム：翻訳に用いられる隣接するヌクレオチドトリプレット（コドン）の特定の配列。リーディングフレームは翻訳開始コドンの位置に依存する。
【００１９】
Ｂ．繊維状ファージ
本発明は、ヘテロ二量体受容体を形成し得る第１および第２のポリペプチドをコードするゲノムをカプセル化する蛋白質のマトリックスからなる繊維状ファージを企図する。このファージは、第１および第２のポリペプチドの少なくとも１つに融合した繊維状ファージ膜アンカードメインを介してマトリックスに表面組込みされた第１および第２のポリペプチドから構成されるヘテロ二量体受容体を更に含む。ヘテロ二量体受容体はリガンドを結合する能力を有し、したがってリガンド結合ヘテロ二量体受容体として言及される。
好適な態様のヘテロ二量体受容体はエピトープ結合複合体である。すなわち、エピトープを結合し得る第１および第２のポリペプチドの複合体である。好ましくは、第１および第２のポリペプチドは、抗体重鎖および軽鎖ポリペプチドである。
【００２０】
第１および第２のポリペプチドは機能性エピトープ結合複合体（ヘテロ二量体受容体）への自己集成が可能であり、これはその後リガンドに接近し得る様式で外側表面上で発現される、すなわちこれらはファージに表面で組込まれている。よって、エピトープ結合複合体は、典型的にはこの発明のファージの表面上に存在する。典型的には、エピトープ結合複合体は、繊維状ファージ膜アンカードメイン、例えばセクションＣに記載するポリペプチドを含む結合ポリペプチド、および非結合ポリペプチドから構成される。ここにさらに説明するように、好適なのはヘテロ二量体複合体のポリペプチドに融合したｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩ膜アンカードメインを有するファージである。
【００２１】
表面接近可能な様式で受容体がファージに結合するため、ファージを固相アフィニティ吸収体として有利に使用することができる。好適な態様では、アガロース、セルロース、合成樹脂、多糖類等のような固体（水不溶性）マトリックスにファージを結合、好ましくは着脱可能に結合させる。例えば、ファージを収納する形質転換体をカラムに充填保持し、ファージの収納を支持する条件下に維持することができる。ファージにより発現された受容体に結合するリガンドを含有する水性組成物に、その後所定の速度で受容体結合条件下にカラムを通過させて固相受容体−リガンド複合体を形成する。その後カラムを洗浄して非結合物質を除去すると、固相ファージに結合したリガンドが残る。その後受容体−リガンド複合体の解離を促進する緩衝液でカラムを洗浄することによりリガンドを除去して回収することができる。
また、親和力により精製すべきリガンドを含有する水性溶液と精製したファージを混合することができる。このようにして形成した受容体／リガンド結合反応混合物は、ファージ結合受容体−リガンド複合体が生成するのに十分な時間期間の間結合条件下に維持する。その後例えば遠心分離、電気泳動、沈殿等によりファージ結合リガンド（リガンド担持ファージ）を非結合物質から分離して回収する。
【００２２】
この発明のファージは、この発明の診断方法で使用する場合に標識することができる。好適な標識には、ファージゲノムに組込まれた放射性標識核酸、またはファージ粒子の蛋白質成分に組込まれた放射性標識アミノ酸が包含される。標識したファージの調製は、ここに記載するようにファージを生育させることにより慣例に従って調製することができるが、それぞれファージの核酸またはポリペプチドへの組込みのために放射性標識した核酸または放射性標識したアミノ酸を培養培地に含むものとする。例示的な標識は３Ｈチミジン、または３５Ｓメチオニンである。他の同位元素標識および他のヌクレオチドまたはアミノ酸前駆体は当業者に容易に利用可能である。標識したファージは、好ましくはこの発明のリガンド結合検定で検出し得るのに十分な標識を含む、すなわちファージは検出可能に標識される。
【００２３】
Ｃ．ＤＮＡ発現ベクター
本発明のベクターは、繊維状ファージ膜アンカードメインおよび原核分泌シグナルドメインを含む融合ポリペプチドの形態で翻訳可能なＤＮＡ配列を受容して発現するよう適合した組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子である。このベクターは、挿入物ＤＮＡへの方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介して機能的に結合した上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列を含むカセットからなる。上流の翻訳可能な配列は、ここに特定するように分泌シグナルをコードする。下流の翻訳可能な配列は、ここに特定するように繊維状ファージの膜アンカーをコードする。カセットは、好ましくは方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介して挿入物翻訳可能ＤＮＡ配列（挿入物ＤＮＡ）を方向性をもってカセットに挿入する場合に製造される融合ポリペプチドを発現させるＤＮＡ発現調節配列を含む。繊維状ファージ膜アンカーは、好ましくは繊維状ファージ粒子のマトリックスに結合し、これにより融合ポリペプチドをファージ表面上に組込むことのできるｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩコート蛋白質のドメインである。
【００２４】
発現ベクターは、本発明の融合ポリペプチドのような構造遺伝子産物を和合性の宿主中で発現し得ることを特徴とする。
ここで使用するように、「ベクター」という用語は、それが機能的に結合した他の核酸を異なる遺伝的環境の間で移動させることのできる核酸分子に言及するものである。好適なベクターは、それが機能的に結合したＤＮＡ断片中に存在する構造遺伝子産物の自己複製および発現が可能なものである。
ここでＤＮＡ配列または断片について使用するように、「機能的に結合」という記載は、一本鎖または二本鎖形態に拘らず、好ましくは慣用的なホスホジエステル結合によってＤＮＡの鎖に共有結合により接続された配列または断片を意味する。
この発明のカセットが機能的に結合したベクターの選択は、直接には当業界で周知のように所望の機能的性質、例えばベクター複製および蛋白質発現並びに形質転換する宿主細胞に依存するが、これらは組換えＤＮＡ分子を構成する技術に固有の制限である。
【００２５】
好適な態様では、利用するベクターは、原核レプリコン、すなわちこれにより形質転換された細菌宿主細胞のような原核宿主細胞中で染色体外の組換えＤＮＡ分子の自己複製およひ維持を指向する能力を有するＤＮＡ配列を含む。この種のレプリコンは当業界で周知である。更に、原核レプリコンを含むこのような態様は、その発現によって、これにより形質転換された細菌宿主に薬剤耐性のような選択性の利点を与える遺伝子も含む。典型的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。ベクターは、典型的には翻訳可能なＤＮＡ配列の挿入を図る便利な制限部位も含む。例示的なベクターには、バイオラド・ラボラトリイズ（リッチモンド、ＣＡ）から入手可能なプラスミドｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、並びにファルマシア（ピスカタウェイ、ＮＪ）から入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３がある。
【００２６】
方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列、すなわちポリリンカーは、（１）複製および移動のために上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合し、（２）ＤＮＡ配列のベクターへの方向性をもった連結のための部位または手段を与えるＤＮＡ発現ベクターの領域である。典型的には、方向性ポリリンカーは、２以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列または制限部位を特定するヌクレオチドの配列である。制限開裂に際して、２つの部位は付着末端を生成し、これを介して翻訳可能なＤＮＡ配列をＤＮＡ発現ベクターに連結することができる。好ましくは、２つの制限部位は、制限開裂に際して非相補的な付着末端を与え、これにより翻訳可能なＤＮＡ配列のカセットへの方向性をもった挿入を可能とする。１つの態様では、方向性をもった連結手段は、上流の翻訳可能なＤＮＡ配列、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列または両者に存在するヌクレオチドによって与えられる。他の態様では、方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列は、多重方向性クローン化手段を特定するヌクレオチドの配列からなる。方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列が多数の制限部位を特定する場合、これを多重クローン化部位として言及する。
【００２７】
翻訳可能なＤＮＡ配列は、１つのリーディングフレームにポリペプチドをコードする少なくとも８コドンの非中断系列を与える線状系列のヌクレオチドである。
上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は原核分泌シグナルをコードする。分泌シグナルは、グラム陰性細菌のペリプラズム膜を蛋白質の標的とする蛋白質のリーダーペプチドドメインである。
好適な分泌シグナルはｐｅｌＢ分泌シグナルである。エルウィニア・カロトバ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａ）に由来する２つのｐｅｌＢ遺伝子産物変種からの分泌シグナルドメインの予期されるアミノ酸残基配列を、レイら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５４３−５４６（１９８８）により記載されたように表１に示す。特に好適なｐｅｌＢ分泌シグナルも表１に示す。
【００２８】
Figure 0004108430
【００２９】
ｐｅｌＢ蛋白質のリーダー配列は、融合蛋白質の分泌シグナルとして先に使用されている。ベターら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４０−１０４３（１９８８）、サストリーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：５７２８−５７３２（１９８９）、およびムリナックスら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８７：８０９５−８０９９（１９９０）。
この発明で有用なイー・コリ由来の他の分泌ポリペプチドドメインのアミノ酸残基配列も表１に列記する。オリバー、ネイドハード、Ｆ．Ｃ．（編）中、イー・コリおよびサルモネラ・チフィムリウム、アメリカン・ササイアティ・フォー・マイクロバイオロジー、ワシントン、Ｄ．Ｃ．１：５６−６９（１９８７）。
配列番号：５に示すアミノ酸残基配列を有するｐｅｌＢ分泌シグナルをコードする翻訳可能なＤＮＡ配列は、この発明のＤＮＡ発現ベクターに包含するのに好適なＤＮＡ配列である。
【００３０】
下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は繊維状ファージ膜アンカーをコードする。好適な膜アンカーは、繊維状ファージＭ１３、ｆ１、ｆｄ等の等価な繊維状ファージから取得することができる。好適な膜アンカードメインは、遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＶＩＩＩによりコードされるコート蛋白質に認められる。よって、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は、繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩコートポリペプチドの膜アンカードメインに対応する、また好ましくは同一のアミノ酸残基配列をコードする。
繊維状ファージコート蛋白質の膜アンカードメインはコート蛋白質のカルボキシ末端領域の一部であり、脂質二重膜を縦断する疎水性アミノ酸残基の領域、および通常は膜の細胞質面に認められ膜から延在する荷電したアミノ酸残基の領域を含む。
【００３１】
ファージｆ１において、遺伝子ＶＩＩＩコート蛋白質の膜縦断領域は残基Ｔｒｐ−２６乃至Ｌｙｓ−４０からなり、細胞質領域はカルボキシ末端１１残基４１〜５２からなる。オーカワら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：９９５１−９９５８（１９８１）。例示的な膜アンカーはｃｐＶＩＩＩの残基２６〜４０よりなるものとし得る。
よって、好適な膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子ＩＩＩコート蛋白質（ｃｐＩＩＩとしても示される）から誘導される。好適なｃｐＩＩＩ誘導膜アンカーは、配列番号：１６の残基１〜残基２１１に示す配列を有する。遺伝子ＩＩＩコート蛋白質は、典型的には約４〜６コピーのコート蛋白質でファージ粒子の一端にて成熟繊維状ファージ上に存在する。
他の好適な膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、Ｍ１３繊維状ファージ遺伝子ＶＩＩＩコート蛋白質（ｃｐＶＩＩＩとしても示される）から誘導される。好適なｃｐＶＩＩＩ誘導膜アンカーは、配列番号：１７の残基１〜残基５０に示す配列を有する。遺伝子ＶＩＩＩコート蛋白質は、典型的には約２５００〜３０００コピーのコート蛋白質でファージ粒子の大部分に渡って成熟繊維状ファージ上に存在する。
【００３２】
繊維状ファージ粒子の構造、そのコート蛋白質および粒子集成の詳細な記載については、ラチェトら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５０：４０１−４２７（１９８６）による総説およびモデルら「バクテリオファージ：第２巻」中、アール・カレンダー編、プレナム・パブリシング社、ｐｐ．３７５−４５６（１９８８）を参照することができる。
この発明のＤＮＡ発現ベクターのカセットは、翻訳可能なＤＮＡ配列（挿入物ＤＮＡ）の挿入に際して適切な宿主中でこの発明の融合ポリペプチドを発現し得るヌクレオチドの配列を形成するベクターの領域である。ヌクレオチドの発現コンピテント配列はシストロンとして言及する。よって、カセットは、上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合したＤＮＡ発現調節要素からなる。翻訳可能なＤＮＡ配列がその目的に適合したヌクレオチドの配列を介して上流および下流の配列の間に方向性をもって挿入（方向性をもって連結）された場合にシストロンが形成される。得られる３つの翻訳可能なＤＮＡ配列、すなわち上流、挿入および下流の配列は、全て同じリーディングフレームで機能的に結合されている。
【００３３】
ＤＮＡ発現調節配列は、構造遺伝子産物を発現するための一組のＤＮＡ発現シグナルからなり、周知のようにシストロンが構造遺伝子産物を発現することができるようにシストロンに機能的に結合した５′および３′要素の両者を含む。５′調節配列は、転写を開始するプロモーターおよび上流の翻訳可能なＤＮＡ配列の５′末端に機能的に結合したリボソーム結合部位を特定する。
イー・コリにおける遺伝子発現の高いレベルを達成するためには、大量のｍＲＮＡを生成する強力なプロモーターのみならず、ｍＲＮＡが効率的に翻訳されるのを確実にするリボソーム結合部位を使用することが必要である。イー・コリにおいては、リボソーム結合部位は、開始コドン（ＡＵＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長さの配列を含む［シヤインら、Ｎａｔｕｒｅ，２５４：３４（１９７５）］。シャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列と呼ばれる配列ＡＧＧＡＧＧＵは、イー・コリ１６ＳｍＲＮＡの３′末端に相補的である。ｍＲＮＡに対するリボソームの結合およびｍＲＮＡの３′末端の配列は幾つかの因子により影響され得る：
【００３４】
（ｉ）ＳＤ配列と１６ＳｔＲＮＡの３′末端との間の相補性の程度。
（ｉｉ）ＳＤ配列とＡＵＧとの間にある距離および恐らくＤＮＡ配列［ロバーツら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：７６０（１９７９ａ）、ロバーツら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５５９６（１９７９ｂ）、グアレンテら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９：１４２８（１９８０）、およびグアレンテら、Ｃｅｌｌ，２０：５４３（１９８０）］。この距離を系統的に変化させた際のプラスミドにおける遺伝子の発現のレベルを測定することにより至適化が達成される。異なるｍＲＮＡの比較により、位置−２０〜＋１３の統計的に好適な配列があることが示されている（ＡＵＧのＡを位置０とする）［ゴールドら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５（１９８１）］。リーダー配列は翻訳に劇的に影響を与えることが示された（ロバーツら、１９７９ａ，ｂ、前記）。
（ｉｉｉ）リボソーム結合に影響を与えるＡＵＧに後続するヌクレオチド配列［タニグチら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１８：５３３（１９７８）］。
有用なリボソーム結合部位を以下の表２に示す。
【００３５】
Figure 0004108430
【００３６】
３′調節配列は、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合しフレームの合った少なくとも１つの終止（停止）コドンを特定する。
よって、この発明のＤＮＡ発現ベクターは、この発明の融合ポリペプチドを発現し得るシストロンを生成するベクターのカセット部分に翻訳可能なＤＮＡ配列をクローン化する系を提供するものである。
好適な態様では、ＤＮＡ発現ベクターにより、ベクターに存在する２つの別のカセットに２つの翻訳可能なＤＮＡ配列を独立にクローン化（挿入）し、ヘテロ二量体受容体の両者のポリペプチドまたはヘテロ二量体受容体からなるポリペプチドのリガンド結合部分を発現する２つの別のシストロンを形成する系が提供される。２つのシストロンを発現させるＤＮＡ発現ベクターは、ジシストロン性発現ベクターとして言及する。
【００３７】
よって、この発明の好適なＤＮＡ発現ベクターは、先に詳細に説明したカセットに加えて、第２の融合ポリペプチドを発現させる第２のカセットを含む。第２のカセットは、先に特定したように典型的にはカセットのリーディングフレームの少なくとも一つの停止コドンを特定するベクターの下流のＤＮＡ配列に対する方向性をもった連結に適合したヌクレオチドの配列を介してその３′末端で機能的に結合した分泌シグナルをコードする第２の翻訳可能なＤＮＡ配列を含む。第２の翻訳可能なＤＮＡ配列は、前記特定した５′要素を形成するＤＮＡ発現調節配列にその５′末端で機能的に結合させる。第２のカセットは、翻訳可能なＤＮＡ配列（挿入物ＤＮＡ）の挿入に際して、挿入物ＤＮＡによりコードされるポリペプチドとの分泌シグナルの融合体からなる第２の融合ポリペプチドを発現することができる。
【００３８】
好適な態様では、ＤＮＡ発現ベクターは、本発明の教示によりゲノムをカプセル化する繊維状ファージ粒子の形態で便利に操作するよう設計する。この態様では、ＤＮＡ発現ベクターは、適切な遺伝的相補の提示に際してベクターが一本鎖複製形態の繊維状ファージとして複製して繊維状ファージ粒子にパッケージされ得るように繊維状ファージ複製開始点を特定するヌクレオチド配列更に含む。この特徴は、ファージ粒子の集団を構成する他の粒子から粒子およびこれに含まれるベクターが続いて分離されるためにファージ粒子へとパッケージされるＤＮＡ発現ベクターの能力を与えるものである。
繊維状ファージ複製開始点は、周知のように複製の開始、複製の終止および複製により生成される複製形態のパッケージングの部位を特定するファージゲノムの領域である。例えば、ラシェトら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５０：４０１−４２７（１９８６）およびホリウチ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８８：２１５−２２３（１９８６）を参照することができる。
【００３９】
本発明で使用するのに好適な繊維状ファージ複製開始点は、Ｍ１３、ｆ１またはｆｄファージ複製開始点である。特に好適なのは、配列番号：１１７に示され、ショートら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００（１９８８）に記載された配列を有する繊維状ファージ複製開始点である。好適なＤＮＡ発現ベクターは、実施例１に記載するジシストロン性発現ベクターｐＣＯＭＢ８、ｐＣＫＡＢ８、ｐＣＯＭＢ２−８、ｐＣＯＭＢ３、ｐＣＫＡＢ３、ｐＣＯＭＢ２−３およびｐＣＯＭＢ２−３′である。
この発明のベクターを挿入物ＤＮＡを含むものとして操作し、これにより融合ポリペプチドを発現する能力を有するものとし得る限り、１つの態様は挿入物ＤＮＡを含む先に記載したベクターを企図するものである。抗体遺伝子を含む特に好適なベクターは実施例に記載する。
【００４０】
Ｄ．ポリペプチド
他の態様では、本発明は、アミノ末端分泌シグナルドメインおよびカルボキシ末端繊維状ファージコート蛋白質膜アンカードメインが隣接する挿入物ドメインからなるポリペプチドを企図する。
このポリペプチドは、原核分泌シグナルドメインと繊維状ファージ膜アンカードメインとの間に位置する受容体蛋白質のリガンド（エピトープ）結合ドメインを特定するアミノ酸残基配列から構成される受容体ドメインを有する融合ポリペプチドである。すなわち、融合ポリペプチドの挿入物ドメインは受容体のリガンド結合ドメインであり、またリガンド結合受容体ポリペプチドとしても言及するものである。
ポリペプチドが受容体ドメインを有する限り、これはここでは受容体としても言及する。他の好適な態様では、分泌シグナルドメインはここに記載するようにｐｅｌＢ分泌シグナルである。更に、ここに記載するように繊維状ファージｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩ蛋白質から膜アンカードメインを誘導するのが好適である。
【００４１】
好適な態様では、受容体蛋白質は、リガンド結合ヘテロ二量体受容体のポリペプチド鎖である。さらに好ましくは、ヘテロ二量体受容体はエピトープ結合複合体である。
好適なヘテロ二量体受容体には、免疫グロブリン、クラスＩまたはＩＩの主要組織適合性抗原、リンパ球受容体、インテグリン等のヘテロ二量体受容体が包含される。免疫グロブリン（抗体分子）はＦａｂまたはＦｖ断片の形態、または重鎖および軽鎖の可変ドメインの領域を含む抗体分子の他の部分とすることができる。
１つの態様では、この発明のポリペプチドは、アミノからカルボキシ末端の方向で示す式によって表し得るアミノ酸残基配列を有する：
（Ｆ１） ＮＨ２−Ｏ−（Ｕ）ｍ−Ｖ−（Ｘ）ｎ−Ｚ−ＣＯＯＨ
式中、Ｏは分泌シグナルを特定するアミノ酸残基配列を示し、Ｕは第１のスペーサーポリペプチドを示し、Ｖは受容体ドメイン（リガンド結合受容体ポリペプチド）を特定するアミノ酸残基配列を示し、Ｘは第２のスペーサーポリペプチドを示し、Ｚは繊維状ファージコート蛋白質膜アンカーを特定するアミノ酸残基配列を示すが、ただし、ｍは０または１の整数であり（ここでｍが０の場合はＵは存在せず、ｍが１の場合はＵは存在する）、ｎは０または１である（ここでｎが０の場合はＸは存在せず、ｎが１の場合はＸは存在する）。
【００４２】
式（Ｆ１）において、分泌シグナルおよび繊維状ファージコート蛋白質膜アンカーはここに前記した通りである。よって、好適なポリペプチドは、そのアミノ末端で分泌シグナルに機能的に結合しそのカルボキシ末端で膜アンカーに機能的に結合した抗体可変鎖ドメイン誘導ポリペプチドからなる。
この態様の好適なポリペプチドは、可変ドメインとして主として抗体重鎖ポリペプチドよりなる。この点について、「主としてよりなる」とは、ポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドまたはその部分を含有しないことを意味する。特に好適なのは式（Ｆ１）によるポリペプチドであり、この場合前記したようにＺはｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩ膜アンカーを特定する。他の好適な態様では、分泌シグナルはｐｅｌＢ分泌シグナルとする。
ポリペプチドについてここで使用するように、「機能的に結合」という記載は、ポリペプチド断片またはポリペプチドにより表される蛋白質ドメインが、好ましくはポリペプチド中で結合される隣接するアミノ酸の間の慣用されたアミド結合によって単一のポリペプチド重合体へと共有結合により接続されたことを意味する。
【００４３】
１つの態様では、Ｖはヘテロ二量体受容体分子の鎖のリガンド結合ドメインを特定するアミノ酸配列残基であり、好ましくは免疫グロブリン可変領域ポリペプチドである。特に好適なポリペプチドＶはＶＨまたはＶＬポリペプチドである。最も好適なのは、Ｖが免疫グロブリンＶＨポリペプチド（抗体重鎖ポリペプチド）であり、ｍおよびｎの両者がゼロのポリペプチドである。
他の態様では、ＵまたはＸは、ポリペプチドの開裂の部位を特定するプロトロンビン、因子Ｘ等のような前駆体蛋白質に認められるアミノ酸の配列のような蛋白質加水分解開裂部位を特定することができる。開裂部位を有する融合ポリペプチドは、それが付着しているファージ粒子からポリペプチドを精製する手段を与える。
ポリペプチドスペーサーＵおよびＸは、それぞれ約１〜６アミノ酸残基の長さのアミノ酸残基の全ゆる配列を有することができる。典型的には、スペーサー残基はポリペプチド中に存在し、この発明のＤＮＡ発現ベクターを使用するここに開示する方法によりポリペプチドを製造する場合に必要な連続的なリーディングフレームを収容する。
【００４４】
本発明の受容体は、競合的に阻害されるその能力により証明されるように、抗原、ハプテン、酵素基質等のような予備選択したまたは所定のリガンドに特異的な結合部位を有する構造を想定するものである。１つの態様では、この発明の受容体は、予備選択した抗原と特異的に結合して抗原と単離されるべき複合体の結合部位との間の十分に強力な結合を有する複合体を形成する抗原結合部位を形成するリガンド結合ポリペプチドである。受容体が抗原結合ポリペプチドである場合、その親和力または結合力は一般に１０５Ｍ−１より大きく、更に通常は１０６より大きく、好ましくは１０８Ｍ−１より大きい。
他の態様では、対象発明の受容体は基質に結合し、基質からの生成物の形成を触媒する。触媒性受容体のリガンド結合部位のトポロジーは、基質に対するその親和力（結合定数またはｐＫａ）よりその予備選択した活性について恐らくより重要であり、対象触媒性受容体は予備選択した基質について一般に１０３Ｍ−１より大きく、更にに通常は１０５Ｍ−１または１０６Ｍ−１より大きく、好ましくは１０７Ｍ−１より大きい結合定数を有する。
【００４５】
好ましくは対象発明により製造される受容体はヘテロ二量体であり、したがって通常は２つの異なるポリペプチド鎖から構成され、これらは共にいずれかのポリペプチド単独、すなわち単量体としての親和力または結合定数と異なり恐らくより高い予備選択したリガンドに対する結合親和力または結合定数を有する構造を想定するものである。ヘテロ二量体受容体は、リガンド結合ヘテロ二量体受容体としても言及し、リガンドに結合するその能力を内包するものとする。
よって、好適な態様は、第１および第２のポリペプチドからなるリガンド結合ヘテロ二量体受容体を企図する。第１のポリペプチドには、アミノ末端原核分泌シグナルドメインおよびカルボキシ末端繊維状ファージ膜アンカードメインが隣接する。第２のポリペプチドはアミノ末端原核分泌シグナルドメインに融合する。特に好適なリガンド結合ヘテロ二量体受容体は、ここに記載するように原核分泌シグナルを利用するものである。更に、好適なリガンド結合ヘテロ二量体受容体は、ここに記載するようにｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩから誘導された膜アンカーを含む。
【００４６】
リガンド結合ヘテロ二量体受容体は、エピトープ結合複合体として言及し、複合体がリガンド中に存在するエピトープと結合する能力を有することを内包するものとし、ここに記載するように２つのポリペプチドの結合（複合化）によりヘテロ二量体受容体が形成されることを内包するものとする。
異なるポリペプチド鎖の一方または双方は、好ましくは免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域から誘導する。典型的には、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）可変領域からなるポリペプチドを、予備選択したリガンドを結合するために共に用いる。
よって、１つの態様では、第１のポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチドであり第２のポリペプチドが軽鎖ポリペプチドであるリガンド結合ヘテロ二量体受容体を企図する。他の態様では、第１のポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチドであり第２のものが抗体重鎖ポリペプチドであるリガンド結合ヘテロ二量体受容体を企図する。
【００４７】
対象発明により製造される受容体は、単量体並びに多量体形態で活性とすることができ、ホモ体またはヘテロ体とするが、好ましくはヘテロ体とする。例えば、本発明により製造されるＶＨおよびＶＬリガンド結合ポリペプチドは、ヘテロ二量体において有利に組合せていずれかの活性を変調させるかヘテロ二量体に独特の活性を生成することができる。
個々のリガンドポリペプチドをＶＨおよびＶＬとして言及する場合、ヘテロ二量体はＦｖとして言及することができる。しかしながら、ＶＨはＶＨに加えて重鎖不変領域の実質的に全部または一部を含むことができることを理解すべきである。同様に、ＶＬはＶＬに加えて軽鎖不変領域の実質的に全部または一部を含むことができる。重鎖不変領域の一部を含むＶＨおよび軽鎖不変領域の実質的に全部を含むＶＬから構成されるヘテロ二量体はＦａｂ断片という用語とする。Ｆａｂの製造は、Ｆｖと比較してＦａｂに含まれる付加的な不変領域配列がＶＨおよびＶＬ相互作用を安定化し得るため、幾つかの状況において有利たり得る。この種の安定化は、Ｆａｂが抗原に対してより高い親和力を有することを生起し得る。更に、Ｆａｂは当業界でより普通に使用されており、よって検索手順においてＦａｂを特異的に認識するのに利用可能なより多くの市販の抗体がある。
【００４８】
個々のＶＨおよびＶＬポリペプチドは、その天然に存在する長さと等しいか実質的に等しい長さで製造することができる。しかしながら、好適な態様では、ＶＨおよびＶＬポリペプチドが有し得るのは１２５アミノ酸残基未満、更に通常には約１２０アミノ酸残基未満であり、一方正常に有するのは６０アミノ酸残基を越え、通常は約９５アミノ酸残基を越え、更に通常には約１００アミノ酸残基を越える。好ましくは、ＶＨは約１１０〜２３０アミノ酸残基の長さとすることができ、またＶＬは約９５〜約２１４アミノ酸残基の長さとすることができる。Ｆａｂを形成するのに十分に長いＶＨおよびＶＬ鎖が好適である。
アミノ酸残基配列は、関連する特定のイディオタイプに依存して広範に変動し得る。通常、約６０〜７５アミノ酸残基により離間しジスルフィド結合により接続された少なくとも２つのシステインがある。対象発明により製造されるポリペプチドは、通常は免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の可変領域のイディオタイプの実質的なコピーであるが、幾つかの状況によってはポリペプチドは、所望の活性を有利に改良するためのアミノ酸残基配列における無作為の変異を含むことができる。
【００４９】
幾つかの状況においては、ＶＨおよびＶＬポリペプチドの共有架橋結合を与えるのが望ましく、これはカルボキシ末端にシステイン残基を設けることにより達成することができる。ポリペプチドは通常は免疫グロブリン不変領域を含まないものとして調製し得るが、ＤＮＡ合成プライマーの有利な選択の結果として小部分のＪ領域を含むものとし得る。Ｄ領域は、通常はＶＨの転写体に含むものとし得る。
典型的にはＶＨおよびＶＬポリペプチドのＣ末端領域はＮ末端より多様な配列を有し得るが、本戦略に基き、更に修飾して通常に存在するＶＨおよびＶＬ鎖の変動を可能とすることができる。合成ポリヌクレオチドを用いて超可変領域における１以上のアミノ酸を変動させることができる。
【００５０】
Ｅ．ライブラリーを製造する方法
１．一般的合理性
１つの態様では、本発明は、単一のベクター系を使用して遺伝子レパートリーから予備選択したリガンド結合特異性を同時にクローン化し検索する系を提供するものである。この系は、クローン化および検索の方法論の結合を与え、２つの要求性を有する。第１に、イー・コリのような試験管内発現宿主におけるヘテロ二量体受容体のポリペプチド鎖のその発現は、機能性ヘテロ二量体受容体が集成してリガンドに結合する受容体を生成することができるように２つのポリペプチド鎖の同時発現を必要とする。第２に、予備選択したリガンド結合能力についてのライブラリーの単離した構成員のその検索は、発現した受容体分子の結合能力をライブラリーから構成員をコードする遺伝子を単離する便利な手段と相関（結合）させる手段を必要とする。
【００５１】
発現と検索との結合は、細菌細胞のペリプラズムを融合ポリペプチドの標的として機能性受容体の集成を可能とすることと、ファージ集成の際に繊維状ファージ粒子のコートを融合ポリペプチドの標的として意図するライブラリー構成員の便利な検索を可能とすることとの組合せにより達成される。ペリプラズムを標的とすることは、この発明の融合ポリペプチド中の分泌シグナルドメインの存在により与えられる。ファージ粒子を標的とすることは、この発明の融合ポリペプチド中の繊維状ファージコート蛋白質膜アンカードメイン（すなわちｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩ誘導膜アンカードメイン）の存在により与えられる。
本発明は、１つの態様で、ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法を記載するものであり、それぞれのＤＮＡ分子は、繊維状ファージ粒子の表面上で融合ポリペプチドを発現するシストロンからなる。この方法は、（ａ）連結緩衝液中で（ｉ）ポリペプチドコード遺伝子のレパートリーおよび（ｉｉ）融合ポリペプチド発現シストロンを形成するのに適合した線状形態の複数のＤＮＡ発現ベクターを組合せることにより連結混合物を形成し、（ｂ）遺伝子のレパートリーが複数のベクターに機能的に結合（連結）してライブラリーを形成するのに十分な時間期間の間混合物を連結条件に供する工程からなる。
【００５２】
この態様では、ポリペプチドコード遺伝子のレパートリーは二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡの形態であり、レパートリーのそれぞれの構成員は方向性をもった連結に適合した付着末端を有する。更に、複数のＤＮＡ発現ベクターは、それぞれ（ａ）共通のリーディングフレームでポリペプチド遺伝子を方向性をもって受容するよう適合し、（ｂ）それぞれの上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合した上流および下流の付着末端を有する線状ＤＮＡ分子である。上流の翻訳可能なＤＮＡ配列は分泌シグナル、好ましくはｐｅｌＢ分泌シグナルをコードし、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は、この発明のポリペプチドのためここに記載するように繊維状ファージコート蛋白質膜アンカーをコードする。また翻訳可能なＤＮＡ配列も、ここに記載するＤＮＡ発現ベクターについて特定するようにそれぞれ上流および下流のＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する。
このようにして製造したライブラリーは、ここに記載する発現および検索方法によりライブラリーにおいて表されるシストロンの結果的なライブラリーによりコードされる融合ポリペプチドの発現および検索に利用することができる。
【００５３】
２．遺伝子レパートリーの製造
遺伝子レパートリーは異なる遺伝子、好ましくはポリペプチドコード遺伝子（ポリペプチド遺伝子）の集合体であり、天然の供給源から単離することができ、または人工的に生成することができる。好適な遺伝子レパートリーは保存された遺伝子から構成される。特に好適な遺伝子レパートリーは、二量体受容体分子の構成員をコードするいずれかまたは両方の遺伝子から構成される。
本発明を実施するのに有用な遺伝子レパートリーは、少なくとも１０３、好ましくは少なくとも１０４、更にに好ましくは少なくとも１０５、最も好ましくは少なくとも１０７の異なる遺伝子を含む。遺伝子のレパートリーの多様性を評価する方法は当業者に周知である。
【００５４】
よって、１つの態様では、本発明は、予備選択した活性を有する二量体受容体をコードする一対の遺伝子を保存された遺伝子のレパートリーから単離する方法を企図する。更に、クローン化した遺伝子の対の発現および得られる発現した二量体受容体蛋白質の単離も記載する。好ましくは、受容体とし得るのはリガンドに結合し得るヘテロ二量体ポリペプチド、例えば抗体分子またはその免疫学的に活性な部分、細胞受容体、保存された遺伝子の系統群の構成員の１つによりコードされた細胞付着蛋白質、すなわち少なくとも約１０ヌクレオチド長さの保存されたヌクレオチド配列を含む遺伝子である。
【００５５】
二量体受容体の異なるポリペプチド鎖をコードする例示的な保存された遺伝子系統群は、免疫グロブリン、クラスＩまたはＩＩの主要組織適合性複合体抗原、リンパ球受容体、インテグリン等をコードするものである。
幾つかの方法を使用し、保存された遺伝子のレパートリーに属するものとして遺伝子を同定することができる。例えば、サザン、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５）に記載された方法を使用し、低いストリンジェント性条件下でハイブリダイゼーションプローブとして単離した遺伝子を使用し、ゲノムＤＮＡに存在する保存された遺伝子のレパートリーの他の構成員を検出することができる。ハイブリダイゼーションプローブとして使用した遺伝子がゲノムの多数の制限エンドヌクレアーゼ断片にハイブリダイズする場合、その遺伝子は保存された遺伝子のレパートリーの構成員である。
【００５６】
免疫グロブリン
免疫グロブリンまたは抗体分子は、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥのような幾つかの種類の分子を包含する大きな系統群の分子である。抗体分子は典型的には２つの重（Ｈ）および軽（Ｌ）鎖から構成され、図１に示すようにそれぞれの鎖に存在する可変（Ｖ）および不変（Ｃ）領域の両者を備える。ヒトＩｇＧ重鎖およびヒトカッパ軽鎖の説明図をそれぞれ図２および３、４に示す。免疫グロブリンの幾つかの異なる領域は、免疫グロブリンレパートリーを単離するのに有用な保存された配列を含む。例示的な保存された配列を示す広範なアミノ酸および核酸配列データが、カバトら、「免疫学的に興味ある蛋白質の配列」、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ、１９８７により免疫グロブリン分子について編集されている。
【００５７】
Ｈ鎖のＣ領域は特定の免疫グロブリンの種類を特定する。したがって、Ｈ鎖のＣ領域からのここに特定するような保存された配列を選択すると、結果的に選択されたＣ領域の免疫グロブリンの種類の構成員を有する免疫グロブリン遺伝子のレパートリーの調製が与えられる。
ＨまたはＬ鎖のＶ領域は、典型的には保存された配列の長さを含む相対的に低い程度の可変性をそれぞれ含む４つのフレーム構造（ＦＲ）領域からなる。ＶＨ鎖のＦＲ１およびＦＲ４（Ｊ領域）フレーム構造領域由来の保存された配列の使用は好適な例示的な態様であり、ここでは実施例に記載する。フレーム構造領域は典型的には幾つかまたは全ての免疫グロブリンの種類に渡って保存されており、よってこれに含まれる保存された配列は、幾つかの免疫グロブリンの種類を有するレパートリーを調製するのに特に適切である。
【００５８】
主要組織適合性複合体
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、クラスＩ、クラスＩＩまたはクラスＩＩＩのＭＨＣ分子として言及される幾つかのクラスの分子を含む広範な系統群の蛋白質をコードする大きな遺伝子座である。パウルら、「基礎免疫学」中、ラベン・プレス、ＮＹ、ｐｐ．３０３−３７８（１９８４）。
クラスＩのＭＨＣ分子は、保存された系統群を表す多形性群の移植抗原であり、この場合抗原は重鎖および非ＭＨＣコード軽鎖から構成される。重鎖は、Ｎ、Ｃ１、Ｃ２膜および細胞質領域と命名された幾つかの領域を含む。本発明で有用な保存された配列は主としてＮ、Ｃ１およびＣ２領域に認められ、カバトら、前記では「不変種残基」の連続配列として同定されている。
クラスＩＩのＭＨＣ分子は、免疫応答に関与する多形性抗原の保存された系統群からなり、αおよびβ鎖から構成されている。αおよびβ鎖をコードする遺伝子は、ＭＨＣクラスＩＩαまたはβ鎖レパートリーを製造するのに適切な保存された配列を含む幾つかの領域をそれぞれ含む。例示的な保存されたヌクレオチド配列には、Ａ１領域のアミノ酸残基２６〜３０、Ａ２領域の残基１６１〜１７０および膜領域の残基１９５〜２０６（全てα鎖のもの）をコードするものが包含される。保存された配列は、それぞれアミノ酸残基４１〜４５、１５０〜１６２および２００〜２０９をコードするヌクレオチド配列にてβ鎖のＢ１、Ｂ２および膜領域にも存在する。
【００５９】
リンパ球受容体および細胞表面抗原
リンパ球は、Ｔ細胞受容体、Ｔｈｙ−１抗原および多数のＴ細胞表面抗原（モノクローナル抗体ＯＫＴ４（ｌｅｕ３）、ＯＫＴ５／８（ｌｅｕ２）、ＯＫＴ３、ＯＫＴ１（ｌｅｕ１）、ＯＫＴ１１（ｌｅｕ５）、ＯＫＴ６およびＯＫＴ９により特定される抗原を含む）を含む幾つかの系統群の蛋白質をその細胞表面上に含む。パウル、前記、ｐｐ．４５８−４７９。
Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞の表面上に認められる抗原結合分子の系統群について使用される用語である。系統群としてのＴ細胞受容体は、その多様性において免疫グロブリンに類似する多形性結合特異性を示す。成熟したＴ細胞受容体は、それぞれ可変（Ｖ）および不変（Ｃ）領域を有するαおよびβ鎖から構成される。遺伝的機構および機能において免疫グロブリンに対してＴ細胞受容体が有する類似性は、Ｔ細胞受容体が保存された配列の領域を含むことを示す。ライら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５４３−５４６（１９８８）。
例示的な保存された配列には、α鎖のアミノ酸残基８４〜９０、β鎖のアミノ酸残基１０７〜１１５、およびγ鎖のアミノ酸残基９１〜９５および１１１〜１１６をコードするものが包含される。カバトら、前記、ｐ．２７９。
【００６０】
インテグリンおよび付着
細胞付着に関与する付着性蛋白質は、インテグリンと命名された関連する蛋白質の大きな系統群の構成員である。インテグリンはβおよびαサブユニットから構成されるヘテロ二量体である。インテグリン系統群の構成員には、細胞表面糖蛋白質血小板受容体ＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａ、ビトロネクチン受容体（ＶｎＲ）、フィブロネクチン受容体（ＦｎＲ）および白血球付着受容体ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、Ｍｏ−１および６０．３が包含される。ロウスラチら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：４９１−４９７（１９８７）。核酸および蛋白質配列データは、特にＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａ、ＶｎＲおよびＦｎＲのβ鎖の間、ＶｎＲ、Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１、ＦｎＲおよびＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａのαサブユニットの間でこれらの系統群の構成員に存在する保存された配列の領域を示す。スズキら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：８６１４−８６１８，１９８６、ギンスバーグら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：５４３７−５４４０，１９８７。
【００６１】
種々の周知の方法を用いて有用な遺伝子レパートリーを製造することができる。例えば、ＶＨおよびＶＬ遺伝子レパートリーは、抗体生産細胞、すなわちＢリンパ球（Ｂ細胞）、好ましくは脊椎動物の循環系または脾臓に認められるもののような再構成されたＢ細胞の異種起源集団からＶＨおよびＶＬコードｍＲＮＡを単離することにより製造することができる。再構成されたＢ細胞は、その上に隣接して位置する免疫グロブリン遺伝子Ｖ、ＤおよびＪ領域転写体と共に細胞中のｍＲＮＡの存在により証明されるように、免疫グロブリン遺伝子位置転移、すなわち再配置が生起したものである。典型的には、Ｂ細胞は１〜１００ｍｌの血液のサンプルとして集められ、これは通常は１０６Ｂ細胞／ｍｌを含む。
【００６２】
幾つかの場合、予備選択した活性についてレパートリーを偏向させるのが望ましく、例えば種々の段階の年齢、健康状態および免疫応答のいずれか１つにおける脊椎動物からの核酸細胞（起源細胞）を供給源として使用することによる。例えば、再構成したＢ細胞を集める前の健康な動物の繰返し免疫化により、結果的に高い親和力の受容体を製造する遺伝的材料について集積されたレパートリーを取得することができる。ムリナックスら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８７：８０９５−８０９９（１９９０）。逆に、再構成したＢ細胞をその免疫系が先に攻撃されていない健康な動物（すなわち素朴な免疫系）から集めると、結果的に高い親和力のＶＨおよび／またはＶＬポリペプチドの生産に対して偏向していないレパートリーを製造することとなる。
核酸を取得する細胞の集団の遺伝的異種性が大きくなればなる程、本発明の方法により検索するのに利用可能とし得る免疫額的レパートリー（ＶＨおよびＶＬコード遺伝子からなる）の多様性が大きくなることを銘記すべきである。よって、異なる個体、特に免疫学的に有意な年齢の相異を有するものからの細胞、および異なる株、属または種の個体からの細胞を有利に組合せてレパートリーの異種性（多様性）を増加させることができる。
【００６３】
よって、１つの好適な態様では、活性が探索される抗原性リガンド（抗原）、すなわち予備選択した抗原により免疫化または部分的に免疫化した脊椎動物、好ましくは哺乳動物から起源細胞を取得する。免疫化は従来同様に実施することができる。動物における抗体力価をモニターして所望する免疫化の段階を決定することができ、この段階は所望するレパートリーの集積または偏向の量に対応する。部分的に免疫化した動物は典型的には唯一の免疫化を受容し、応答が検出された直後にこれらの動物から細胞を集める。十分に免疫化した動物はピーク力価を示し、これは通常は２〜３週の間隔で宿主動物に抗原を１回以上繰返し注射することにより達成される。通常は最後の攻撃の３〜５日後に脾臓を除去し、脾臓細胞の遺伝的レパートリー（その約９０％が再構成されたＢ細胞である）を標準的な手順を使用して単離する。「分子生物学の現代の手順」、アウスベルら編、ジョン・ウイレイ・アンド・ソンズ、ＮＹを参照することができる。ＶＨおよびＶＬポリペプチドをコードする核酸は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭを生産する細胞から、最も好ましくはＩｇＭおよびＩｇＧ生産細胞から誘導することができる。
【００６４】
免疫グロブリン可変領域遺伝子を多様な集団としてクローン化することのできるゲノムＤＮＡの断片を調製する方法は当業界で周知である。例えば、ヘルマンら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：１８０−１８３（１９８７）、フリシャウフ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：１８３−１９０（１９８７）、フリシャウフ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５２：１９０−１９９（１９８７）、およびジレラらＭｅｔｈｏｄｓ ＩｎＥｎｚｙｍｏｌ，１５２：１９９−２１２（１９８７）を参照することができる。（ここに引用した文献の教示を参考によりここに取入れる。）
所望の遺伝子レパートリーは、可変領域を発現する遺伝子を含むゲノム材料または可変領域の転写体を表すメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のいずれかから単離することができる。非再構成Ｂリンパ球以外からのゲノムＤＮＡを使用する際の困難性は、可変領域をコードする配列を並置することにあり、この場合配列はイントロンによって分離される。適切なエクソンを含むＤＮＡ断片を単離しなければならず、イントロンを切出し、その後適切な順序および適切な方向性でエクソンを接合する。大部分についてこれは困難であるため、再構成したＢ細胞を用いる他の教示が選択方法となり得るが、これはＶ、ＤおよびＪ免疫グロブリン遺伝子領域が位置転移して隣接するようになるため、全可変領域について配列が連続的（イントロンを含まない）となるからである。
【００６５】
ｍＲＮＡを利用する場合、ＲＮａｓｅ阻害条件下に細胞を溶解することとなる。１つの態様では、第１の工程は全細胞ＲＮＡを単離することである。その後オリゴｄＴセルロースカラムへのハイブリダイゼーションによりポリＡ＋ｍＲＮＡを選択することができる。重鎖および／または軽鎖ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在は、その後適切な遺伝子のＤＮＡ一本鎖とのハイブリダイゼーションにより検定することができる。便利には、ＶＨおよびＶＬの不変部分をコードする配列をポリヌクレオチトプローブとして使用することができ、この配列は利用可能な起源から取得することができる。例えば、アーリーとフッド、「遺伝子操作」、セトロウとホラエンダー編、第３巻、プレナム・パブリシング社、ＮＹ（１９８１）、第１５７〜１８８頁、およびカバトら、「免疫学的に興味あるものの配列」、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、ＭＤ（１９８７）を参照することができる。
【００６６】
好適な態様では、全細胞ｍＲＮＡを含有する調製物を、ＶＨおよび／またはＶＬコードｍＲＮＡの存在について最初に集積する。集積は、典型的には全ｍＲＮＡ調製物またはその部分的に精製したｍＲＮＡ生成物を、ここに記載するようにポリヌクレオチド合成プライマーを用いるプライマー延長反応に供することにより行う。ポリヌクレオチド合成プライマーを使用するＶＨおよびＶＬ遺伝子レパートリーを製造する例示的な方法は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２８３６（国際公開番号ＷＯ９０／１４４３０）に記載されている。遺伝子レパートリーを製造する特に好適な方法は、ここに記載するようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして予備選択したオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ反応生成物を形成することによるものである。
【００６７】
好適な態様では、予備選択した抗原に対して単離したＢ細胞を試験管内で免疫化する。試験管内免疫化は、抗原刺激に応答するエピートープ特異的培養Ｂ細胞のクローン展開として特定される。最終結果は免疫グロブリンレパートリーにおける抗原特異的Ｂ細胞の頻度を増加させるものであり、これにより所望の特異性の抗体を発現するクローンを同定するために検索する必要のある発現ライブラリーにおけるクローンの数が減少する。試験管内免疫化の利点は、毒性または弱い免疫原を含む治療的に価値ある無制限の数の抗原に対してヒトモノクローナル抗体を生成することができる点である。例えば、腫瘍関連抗原、リウマチ性因子および組織適合性抗原の多形性抗原決定基に特異的な抗体を製造することができ、これは免疫化した動物中ては顕在化させることはてきないものてある。更に、生体内では通常は抑制されている免疫応答を生成することが可能たり得る。
【００６８】
試験管内免疫化を使用して一次または二次免疫応答のいずれも生起することができる。抗原に対するＢ細胞の最初の露呈に起因する一次免疫応答の結果、エピトープ特異的細胞のクローン展開および低乃至中の見かけの親和力定数（１０６〜１０８Ｍ−１）を有するＩｇＭ抗体の分泌に至る。ヒト培養脾臓および扁桃リンパ球の一次免疫を使用し、細胞、ペプチド、マクロ分子、ハプテンおよび腫瘍関連抗原を含む多様な抗原に対するモノクローナル抗体を製造することができる。免疫化した供与体に由来する記憶Ｂ細胞を培養において刺激し、血清陽性個体から誘導した過敏リンパ球をクローン展開することによって特にウイルス抗原に対して高い親和力のＩｇＧイディオタイプの抗体（＞１０９Ｍ−１）のクローン展開および生産を特徴とする二次免疫応答を生起することもできる。
１つの態様では、末梢血液リンパ球で、抗原特異的Ｂ細胞活性化を下方変調すると見られる種々の細胞溶解細胞を枯渇させる。向リソゾーム性ロイシンのメチルエステルを用いる処理によりリソゾームに富む下位集団（ナチュラルキラー細胞、細胞毒性およびサプレッサーＴ細胞、単球）を最初に除去すると、残余の細胞（Ｂ細胞、Ｔヘルパー細胞、アクセサリー細胞を含む）は試験管内免疫化に際して抗原特異的に応答する。培養における抗体生産を誘導するためのリンホカイン要求性は、活性化され照射されたＴ細胞からの培養上澄により満たされる。
【００６９】
試験管内免疫化に加えて、細胞選別処理（ｐａｎｎｉｎｇ）（免疫親和力吸着）を使用して抗原特異的Ｂ細胞の頻度を更に増加させることができる。固相抗原結合によりＢ細胞下位集団を選択する技術は十分に確立されている。選別処理条件を至適化し、細胞表面部分を含む多様な抗原に対して高い親和力で結合するＢ細胞を選択的に集積することができる。選別処理は単独で、またはいずれかの技術単独で得られるレベル以上に抗原特異的細胞の頻度を増加させるために試験管内免疫化と組合せて使用することができる。Ｂ細胞の集積した集団から構成した免疫グロブリン発現ライブラリーは、抗原特異的抗体クローンを好感して偏向しており、よってより小さく複雑でないライブラリーからの所望の特異性を有するクローンの同定を可能とする。
【００７０】
１つの態様では、供与体末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を重篤な複合型免疫欠損（ＳＣＩＤ）マウスに移し、その後ＳＣＩＤマウスのＢ細胞から重鎖および軽鎖コード核酸を回収する前にＳＣＩＤマウス内で生体内で追加免疫して免疫応答を増加させることができる。例えば、ドチョサルら、Ｎａｔｕｒｅ，３５５：２５８−２６２（１９９２）を参照することができる。この報告では、抗破傷風毒素（ＴＴ）力価を有する供与体からのヒトＰＢＬをＳＣＩＤマウス宿主内で追加免疫した。この結果得られた３７０，０００クローンのライブラリーは、ＴＴに結合できる表面Ｆａｂを発現する２つのファージ粒子を与えた。
３．ポリヌクレオチドプライマーの調製
プライマー、プローブおよびプライマー延長により合成される核酸断片または破片に関してここで使用するように「ポリヌクレオチド」という用語は、２以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド（好ましくは３を越える）から構成される分子として定義する。その正確な大きさは多くの因子に依存し得るが、これは翻って使用の最終条件に依存する。
【００７１】
ここで使用するように「プライマー」という用語は、核酸制限消化物から精製されたか合成的に製造されたかに拘らず、核酸鎖に相補的なプライマー延長生成物の合成を誘導する条件下、すなわちヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等のような重合のための試薬の存在下に適切な温度およびｐＨに置かれた場合に核酸合成の開始の地点として作用し得るポリヌクレオチドに言及するものである。プライマーは最大の効率のために好ましくは一本鎖とするが、その他二本鎖形態とすることができる。二本鎖の場合、延長生成物を調製するのに使用する前にプライマーを最初に処理してこれをその相補的鎖から分離する。好ましくはプライマーはポリデオキシリボヌクレオチドとする。プライマーは、重合のための試薬の存在下に延長生成物の合成を起動するのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは多くの因子に依存し得るが、温度およびプライマーの起源が含まれる。例えば、標的配列の複雑性により、ポリヌクレオチドプライマーは典型的には１５〜２５以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含むことができる。短いプライマー分子は、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために一般により冷たい温度を要求する。
【００７２】
ここで使用するプライマーは、合成または増幅するそれぞれの特異的な配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択する。これは、プライマーがそのそれぞれの鋳型鎖と非無作為にハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映してもしなくてもよい。例えば、プライマー配列の残余を鎖に実質的に相補的として、非相補的なヌクレオチド断片をプライマーの５′末端に付着させることができる。この種の非相補的な断片は、典型的にはエンドヌクレアーゼ制限部位をコードする。また、プライマー配列が合成または増幅される鎖の配列と十分な相補性を有してこれと非無作為にハイブリダイズし、これによりポリヌクレオチド合成条件下で延長生成物を形成する限り、非相補的塩基またはより長い配列をプライマー中に散在させることができる。
【００７３】
本発明のプライマーは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列またはその相補体も含むことができる。例えば、クリーグら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０５７−７０（１９８４）、スツジエルら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０（１９８６）、および「分子クローン化：実験室マニュアル、第２版）、マニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８９）を参照することができる。
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを使用する場合、このプライマーを増幅されるポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズさせ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩまたはイー・コリＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片のような誘導試薬を使用し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの第２のポリヌクレオチド鎖を完成させる。ＲＮＡポリヌクレオチドおよびＤＮＡポリヌクレオチドの生産の間で交番することにより出発ポリヌクレオチドを増幅する。
【００７４】
プライマーは、ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼについての鋳型配列または複製開始部位も含有し得る。典型的なＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼは、リザルジら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１１９７−１２０２（１９８８）により記載されたＱＢレプリカーゼを含む。ＲＮＡ指向性ポリメラーゼは、鋳型配列または複製開始部位を含む少数の鋳型ＲＮＡ鎖から多数のＲＮＡ鎖を製造する。これらのポリメラーゼは、典型的にはクラマーら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８９：７１９−７３６（１９７４）に記載されたように、鋳型鎖の百万倍の増幅を与えるものである。
ポリヌクレオチドプライマーは、例えばホスホトリエステルまたはホスホジエステル法のような全ゆる適切な方法を使用して調製することができ、ナラングら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０（１９７９）、米国特許第４，３５６，２７０号、およびブラウンら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９（１９７９）を参照することができる。
【００７５】
プライマーのヌクレオチド配列の選択は、核酸上における所望の受容体をコードする領域からの距離、使用するいずれかの第２のプライマーに関する核酸上におけるそのハイブリダイゼーション部位、それがハイブリダイズすべきレパートリーにおける遺伝子の数等のような因子に依存する。
ａ．免疫グロブリン遺伝子レパートリーを製造するためのプライマー
ＶＨおよびＶＬ遺伝子レパートリーは、本発明でのその利用の前に別に調製することができる。レパートリーの調製は、典型的にはプライマー延長によって、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）形式でのプライマー延長によって行う。
プライマー延長によりＶＨコードＤＮＡ相同体のレパートリーを製造するため、プライマーのヌクレオチド配列は、ＶＨコード領域に実質的に隣接する部位で複数の免疫グロブリン重鎖遺伝子とハイブリダイズし、これにより機能性（結合し得る）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を取得するように選択する。複数の異なるＶＨコード核酸鎖とハイブリダイズするため、プライマーは、異なる鎖間で保存されたヌクレオチド配列の実質的な相補体でなければならない。この種の部位は、不変領域、いずれかの可変領域フレーム構造領域、好ましくは第３のフレーム構造領域、リーダー領域、プロモーター領域、Ｊ領域等のヌクレオチト配列を含む。
【００７６】
ＶＨコードおよびＶＬコードＤＮＡ相同体のレパートリーを（ＰＣＲ）増幅によって製造すべき場合、増幅すべき核酸のそれぞれのコード鎖について２つのプライマー、すなわちＰＣＲプライマー対を使用しなければならない。第１のプライマーはノンセンス（マイナスまたは相補的）鎖の一部となり、レパートリー内でＶＨ（プラスまたはコード）鎖間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。したがってＶＨコードＤＮＡ相同体を製造するためには、免疫グロブリン遺伝子等のＪ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域内の保存された領域にハイブリダイズする（すなわちこれらに相補的である）ように第１のプライマーを選択する。ＶＬコードＤＮＡ相同体を製造するためには、免疫グロブリン軽鎖遺伝子等のＪ領域または不変領域内の保存された領域にハイブリダイズする（すなわちこれらに相補的である）ように第１のプライマーを選択する。第２のプライマーはコード（プラス）鎖の一部となり、マイナス鎖の間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。したがってＶＨコードＤＮＡ相同体を製造するためには、リーダーまたは第１のフレーム構造領域をコードするその領域におけるようなＶＨコード免疫グロブリン遺伝子の５′末端で保存されたヌクレオチド配列とハイブリダイズするように第２のプライマーを選択する。ＶＨおよびＶＬコードＤＮＡ相同体の両者の増幅において、第２のプライマーの保存された５′ヌクレオチド配列は、ローら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：２１７−２２０（１９８９）により記載されたように、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して外生的に付加した配列に相補的とすることができることを銘記すべきである。第１および第２のプライマーの一方または両方は、エンドヌクレアーゼ認識部位を特定するヌクレオチド配列を含むことができる。この部位は免疫グロブリン遺伝子に対して異種起源とすることができ、増幅されて典型的にはプライマーの５′末端または近傍に認められる。
【００７７】
存在する場合、制限部位を特定する部分は、典型的にはプライマーの５′末端非起動部分に局在する。第１のプライマーにより特定される制限部位は、典型的には第２のプライマーにより特定される制限部位を認識しない制限酵素によって認識されるものであるよう選択するが、その目的は互いに非相補的であるためにベクターへの方向性をもった挿入を可能とする付着末端を有するＤＮＡ分子の製造を可能とすることである。
１つの態様では、本発明は、プライマーの３′末端に位置する起動領域を有するプライマーを形成する一組のポリヌクレオチドを利用する。起動領域は、典型的には最も３′側（３′末端）の１５〜３０ヌクレオチド塩基である。それぞれのプライマーの３′末端起動部分は、核酸合成を触媒する、すなわちその３′末端からプライマー延長反応を開始するプライマーとして作用することができる。一方または両方のプライマーは、５′末端（最も５′側）非起動部分、すなわちレパートリー鋳型に対するハイブリダイゼーションに関与しない領域を更に含むことができる。
【００７８】
ＰＣＲにおいては、それぞれのプライマーは第２のプライマーと組合せて働き、標的核酸配列を増幅する。ＰＣＲで使用するためのＰＣＲプライマー対の選択は、ここに論ずるように遺伝子レパートリーを製造するための考慮に支配される。すなわち、プライマーは、レパートリーにおいて保存された配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。有用なＶＨおよびＶＬ起動配列を後記する表５〜６および７〜９に示す。
４．遺伝子レパートリーを製造するポリメラーゼ連鎖反応
レパートリー内に含まれるＶＨおよびＶＬ遺伝子をクローン化するのに使用する戦略は、当業界で周知のようにレパートリーを作成する核酸の種類、複雑性および純度に依存し得る。他の因子には、遺伝子が１または複数のレパートリーに含まれているか否か、およびこれらが増幅されるものか、および／または変異誘発されるものか否かが含まれる。
【００７９】
ＶＨおよびＶＬコード遺伝子レパートリーは、ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡのセンス鎖のようなポリヌクレオチドコード鎖から構成される。レパートリーが二本鎖ゲノムＤＮＡの形態である場合、典型的には一本鎖への融解により通常は最初にこれを変性させる。ＰＣＲプライマー対を用いてレパートリーを処理する（接触させる）（対のそれぞれの構成員は予備選択したヌクレオチド配列を有する）ことによりレパートリーをＰＣＲ反応に供する。ＰＣＲプライマー対は、レパートリー内で保存された好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、更に好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることによりプライマー延長反応を開始することができる。ＰＣＲプライマー対の第１のプライマーは、核酸のコードまたはセンス鎖にハイブリダイズするため、ここでは場合により「センスプライマー」として言及する。更に、ＰＣＲプライマー対の第２のプライマーは、核酸の非コードまたはアンチセンス鎖、すなわちコード鎖に相補的な鎖にハイブリダイズするため、ここでは場合により「アンチセンスプライマー」として言及する。
【００８０】
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲプライマー対、好ましくはその所定量とレパートリーの核酸、好ましくはその所定量とをＰＣＲ反応混合物を形成するＰＣＲ緩衝液中で混合することにより行う。ＰＣＲ反応生成物の形成に十分な時間期間の間ポリヌクレオチド合成条件下に混合物を維持し（これは典型的には所定のものである）、これにより複数の異なるＶＨコードおよび／またはＶＬコードＤＮＡ相同体を製造する。
複数の第１のプライマーおよび／または複数の第２のプライマーをそれぞれの増幅で使用することができ、例えば第１のプライマーの１つの分子種を多数の異なる第２のプライマーと対合させて幾つかの異なるプライマー対を形成することができる。また、第１および第２のプライマーの個々の対を使用することができる。いずれの場合も、第１および第２のプライマーの同一または異なる組合せを使用する増幅の増幅生成物を合せて遺伝子ライブラリーの多様性を増加させることができる。
【００８１】
他の戦略では、ゲノムｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖またはｍＲＮＡを逆転写酵素反応に供することにより製造したポリヌクレオチドのようなレパートリーのポリヌクレオチド相補体を与えることによりレパートリーからＶＨおよび／またはＶＬコード遺伝子をクローン化することを目的とする。この種の相補体を製造する方法は当業界で周知である。
全ゆる適切な方法を使用してＰＣＲ反応を行う。一般にこれは緩衝水溶液、すなわちＰＣＲ緩衝液中で生起し、好ましくは７〜９のｐＨ、最も好ましくは約８とする。好ましくは、モル過剰（ゲノム核酸について、通常は約１０６：１のプライマー：鋳型）のプライマーを、鋳型鎖を含有する緩衝液に混合する。プロセスの効率を改良するために大モル過剰が好適である。
【００８２】
ＰＣＲ緩衝液は、デオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰおよびポリメラーゼ（典型的には熱安定性）も含み、プライマー延長（ポリヌクレオチド合成）反応のために全て適切な量とする。得られる溶液は（ＰＣＲ混合物）は、約１〜１０分、好ましくは１〜４分間約９０℃〜１００℃に加熱する。この加熱期間の後に溶液を５４℃に冷却する（これはプライマーハイブリダイゼーションに好適である）。合成反応は、室温からこれを越えるとポリメラーゼ（誘導試薬）が最早効率的に機能しなくなる温度までで生起し得る。よって、例えばＤＮＡポリメラーゼを誘導試薬として使用する場合、温度は一般に約４０℃を越えないものとする。例示的なＰＣＲ緩衝液は次のものからなる：１００マイクロリットルの緩衝液当り５０ｍＭＫＣ１、１０ｍＭトリス−ＨＣ１、ｐＨ８．３、１．５ｍＭＭｇＣ１２、０．００１％（ｗｔ／容量）ゼラチン、２００μＭｄＡＴＰ、２００μＭｄＴＴＰ、２００μＭｄＣＴＰ、２００μＭｄＧＴＰ、および２．５単位サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（米国特許第４，８８９，８１８号）。
【００８３】
誘導試薬は、プライマー延長生成物の合成を達成するように機能し得る全ゆる化合物または系とすることができ、酵素を含む。この目的に適切な酵素には、例えばイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素および他の酵素（熱安定性酵素を含み、適切な様式でヌクレオチドの結合を促進してそれぞれの核酸鎖に相補的なプライマー延長生成物を形成する）が包含される。一般に、合成はそれぞれのプライマーの３′末端で開始し、合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５′方向に進行し、異なる長さの分子を生成する。ただし誘導試薬があれば、これにより５′末端で合成が開始し、前記したのと同じプロセスを使用して前記方向に進行する。
【００８４】
誘導試薬は、ＲＮＡプライマー延長生成物の合成を達成するように機能し得る化合物または系とすることもでき、酵素を含む。好適な態様では、誘導試薬は、Ｔ７ＲＡＮポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとすることができる。これらのポリメラーゼは相補的なＲＮＡポリヌクレオチドを生成する。チャンベリンら、「酵素」、ピー・ボイヤー編、ｐｐ．８７−１０８、アカデミック・プレス、ニューヨーク（１９８２）により記載されたように、ＲＮＡポリメラーゼの高いターンオーバー速度により出発ポリヌクレオチドが増幅される。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの他の利点は、ジョイスら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：７１１−７２２（１９８９）により先に記載されたように、１以上の変異誘発性オリゴデオキシヌクレオチド（ポリヌクレオチド）を用いてｃＤＮＡの一部を置換し、部分的に不整合の鋳型を直接転写することにより、ポリヌクレオチド合成に変異を導入できる点である。転写に基く増幅系は、ギンゲラスら、「ＰＣＲ手順、方法および応用の指針」中、ｐｐ２４５−２５２、アカデミック・プレス社、サンジエゴ、ＣＡ（１９９０）により記載されている。
【００８５】
誘導試薬をＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとし、したがってリボヌクレオチド三リン酸を組込む場合、十分な量のＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰをプライマー延長反応混合物と混合し、得られる溶液を前記したように処理する。
新たに合成された鎖およびその相補的な核酸鎖は、プロセスの後続する工程で使用することのできる二本鎖分子を形成する。
前記論じた第１および／または第２のＰＣＲ反応を有利に使用し、受容体を免疫学的に検出および／または単離するのに有用な予備選択したエピトープを受容体に組込むことができる。これは、予備選択したアミノ酸残基配列を受容体のアミノ酸残基配列に組込む第１および／または第２のポリヌクレオチド合成プライマーまたは発現ベクターを利用することにより行う。
【００８６】
複数の異なるＶＨおよびＶＬコード遺伝子についてのＶＨおよびＶＬコードＤＮＡ相同体をレパートリー内で製造した後、ＤＮＡ分子を典型的には更に増幅する。自己複製ベクターへの組込みのような古典的な技術によりＤＮＡ分子を増幅することができるが、これらをベクターに挿入する前に、これらをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）な供することにより分子を最初に増幅するのが好適である。ＰＣＲは、典型的には熱循環、すなわち下限を約１０℃〜約４０℃とし上限を約９０℃〜約１００℃とする温度範囲内でＰＣＲ反応混合物の温度を上昇または下降させることにより実施する。上昇および下降は連続的とし得るが、好ましくは比較的温度安定性の時間期間のある相によるものとし、それぞれの温度がポリヌクレオチド合成、変性およびハイブリダイゼーションを好感するものとする。
【００８７】
ＰＣＲ増幅法が詳細に記載されているのは、米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、４，８００，１５９号および４，９６５，１８８号、および「ＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅の原理と応用」、エッチ・エルリヒ編、ストックトン・プレス、ニューヨーク（１９８９）、および「ＰＣＲ手順：方法および応用の指針」、イニスら編、アカデミック・プレス、サンジェゴ、カリホルニア（１９９０）を含む少なくとも幾つかのテキストである。
好適な態様では、増幅反応当り１対のみの第１および第２のプライマーを使用する。複数の異なる増幅物から得られる増幅反応生成物（それぞれ複数の異なるプライマー対を使用する）をその後合せる。
ただし本発明は、同時増幅（２対のプライマーを使用する）および多重増幅（約８、９または１０までのプライマー対を使用する）によるＤＮＡ相同体製造も企図する。
【００８８】
好適な態様では、ＰＣＲプロセスは、ＤＮＡ分子のライブラリーを製造するためだけではなく、ライブラリー内の変異を誘導するか、単一の親クローンから多様性を生成し、これにより更に大きい異種性を有するライブラリーを提供するために使用する。第１に、ＰＣＲプロセスは、当業界で周知の多様な因子によりそれ自体固有に変異誘発性であることを銘記すべきである。第２に、前記参照した米国特許第４，６８３，１９５号に記載された多様性を誘導する変異に加えて、ＰＣＲの多様性を誘導する他の変異を用いることができる。例えば、延長生成物に組込まれる異なる量の１以上のヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応混合物を形成することができる。この種の条件下では、ＰＣＲ反応が進行して特定の塩基の欠乏の結果として延長生成物内でヌクレオチド置換体が生成する。同様に、ほぼ等モル量のヌクレオチドを、Ｘ回の繰返しを効率的に行う量で初発ＰＣＲ反応混合物に組込むことができ、その後Ｘを越える繰返し回数、例えば２Ｘにより繰返し混合物を処理する。また、増幅されるレパートリーの核酸中には通常は認められないイノシンのようなヌクレオチド誘導体を反応混合物に組込むことによりＰＣＲ反応に際して変異を誘導することができる。その後の生体内ＤＮＡ合成および宿主細胞中での核酸の複製の際に、ヌクレオチド誘導体は置換ヌクレオチドにより置換され得て、これにより点変異が誘導される。
【００８９】
５．線状ＤＮＡ発現ベクター
ＤＮＡ分子のライブラリーを製造するこの発明の方法で使用するＤＮＡ発現ベクターは、前記したようにポリペプチド遺伝子への方向性をもった連結に適合した２つの（上流および下流の）付着末端を有する線状化したＤＮＡ分子である。
線状ＤＮＡ発現ベクターは、典型的にはこの発明の環状ＤＮＡ発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼ消化し、方向性をもった連結に適合した必要な付着末端を有する線状ＤＮＡ分子を生成する方向性をもった連結に適合したベクターのヌクレオチドの配列内の２つの予備選択した制限部位で切断することにより調製する。方向性をもった連結は、ベクター上または選択したベクターに連結される挿入物ＤＮＡ分子上の２つの（第１および第２の）付着末端の存在に言及するものであるため、単一の分子上の末端は相補的ではない。ベクターの第１の末端は挿入物の第１の末端と相補的であり、ベクターの第２の末端は挿入物の第２の末端と相補的である。
【００９０】
６．遺伝子ライブラリーを生成する連結反応
この発明のＤＮＡ分子のライブラリーを調製するに際し、前記したように連結混合物を調製し、ポリペプチド遺伝子の混合したライブラリーが複数のＤＮＡ発現ベクターに連結（機能的に結合）してライブラリーを形成するのに十分な時間期間の間混合物を連結条件に供する。
連結条件は連結反応を好感するよう選択した条件であり、その際にＤＮＡの隣接する３′ヒドロキシルと５′ホスホリル末端との間にホスホジエステル結合が形成される。連結反応は、好ましくは酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより触媒される。連結条件は、周知のように時間、温度、緩衝液の濃度、連結するＤＮＡ分子の量およびリガーゼの量により変動し得る。好適な連結条件は、ミリリットル（ｍｌ）当り１〜１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼおよび約１〜２マイクログラム（μｇ）のＤＮＡの存在下に摂氏４度（４℃）〜１２℃で１〜２４時間連結混合物を維持することを含む。連結混合物中の連結緩衝液は、典型的には０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０１ＭＭｇＣｌ２、０．０１Ｍジチオスレイトール、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡＴＰおよび０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。他の連結緩衝液も使用することができる。
例示的な連結反応は実施例２に記載する。
【００９１】
７．ジシストロン性遺伝子ライブラリーの調製
特に好適な態様では、本発明は、ジシストロン性ＤＮＡ分子のライブラリーを調製する方法を企図する。ジシストロン性ＤＮＡ分子は、２つの別のシストロンから２つの別のポリペプチドを発現させる能力を有する単一のＤＮＡ分子である。好適な態様では、２つのシストロンは、両者のシストロンが単一のプロモーターの転写調節下にあるようにＤＮＡ分子上の相対的位置で機能的に結合されている。それぞれのジシストロン性分子は、繊維状ファージ粒子の表面上のヘテロ二量体受容体を適切な宿主中で形成することのできる、それぞれ第１および第２のシストロンからの第１および第２のポリペプチドを発現することができる。
【００９２】
ジシトロン性ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法は、次の工程からなる：
（ａ）連結緩衝液中で
（ｉ）ｄｓＤＮＡの形態の第１のポリペプチド遺伝子のレパートリー（それぞれ方向性をもった連結に適合した付着末端を有する）、および
（ｉｉ）線状形態の複数のＤＮＡ発現ベクター（それぞれ（ａ）共通のリーディングフレームで第１のポリペプチド遺伝子を方向性をもって受容するよう適合し、（ｂ）それぞれ上流および下流の翻訳可能なＤＮＡ配列に機能的に結合した上流および下流の第１の付着末端を有する）
を組合せることにより第１の連結混合物を形成する。上流の翻訳可能なＤＮＡ配列はｐｅｌＢ分泌シグナルをコードし、下流の翻訳可能なＤＮＡ配列は織維状ファージコート蛋白質膜アンカーをコードし、翻訳可能なＤＮＡ配列は、それぞれ上流および下流のＤＮＡ発現調節配列に機能的に結合する。
【００９３】
（ｂ）第１のポリペプチド遺伝子をベクターに機能的に結合してそれぞれ第１のポリペプチドを発現する第１のシストロンを有する複数の環状ＤＮＡ分子を生成するのに十分な時間期間の間混合物を連結条件に供する。
（ｃ）複数の環状ＤＮＡ分子をＤＮＡ開裂条件下で処理して線状形態の複数のＤＮＡ発現ベクターを生成する（それぞれ（ｉ）共通のリーディングフレームで第２のポリペプチド遺伝子のレパートリーを方向性をもって受容するよう適合し、（ｉｉ）それぞれ上流および下流のＤＮＡ配列に機能的に結合した上流および下流の第２の付着末端を有する）。上流のＤＮＡ配列は分泌シグナルをコードする翻訳可能な配列であり、下流のＤＮＡ配列はリーディングフレームに少なくとも１つの停止コドンを有し、翻訳可能なＤＮＡ配列はＤＮＡ発現調節配列に機能的に連結する。
【００９４】
（ｄ）連結緩衝液中で
（ｉ）工程（ｃ）で形成した複数のＤＮＡ発現ベクター、および
（ｉｉ）ｄｓＤＡＮの形態の第２のポリペプチド遺伝子のレパートリー（それぞれ複数のＤＮＡ発現ベクターへの方向性をもった連結に適合した付着末端を有する）
を組合せることにより第２の連結混合物を形成し、
（ｅ）第２のポリペプチド遺伝子を前記ベクターに機能的に連結し、それぞれ第２のポリペプチドを発現する第２のシストロンを有する複数の環状ＤＮＡ分子を生成するのに十分な時間期間の間第２の混合物を連結条件に供し、これによりライブラリーを形成する。
好適な態様では、分泌シグナルはｐｅｌＢ分泌シグナルとする。同様に好適なのは、ここに記載するようにｃｐＩＩＩまたはｃｐＶＩＩＩから誘導される繊維状ファージ膜アンカーを使用することである。
前記方法を実施するのに有用なＤＮＡ発現ベクターは、後により詳細に記載するジシストロン性発現ベクターである。
【００９５】
ジシストロン性ＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法を実施するに際し、上流および下流の第１の付着末端が、上流および下流の第２の付着末端と同一のヌクレオチド配列を有さないものとするのが好適である。この態様では、環状ＤＮＡ分子を線状化する処理工程（ｃ）は、典型的には前記第２の末端を生成するのに特異的であるが、第１の末端を形成した部位で環状ＤＮＡ分子を開裂させない制限エンドヌクレアーゼの使用を含む。例示的な好適な第１および第２の末端は、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩにより上流および下流の第１の末端を形成するｐＣＢＡＫ８の開裂により特定され、またＳａｃＩおよびＸｂａＩにより上流および下流の第２の末端を形成するｐＣＢＡＫ８の開裂により特定される末端である。この態様では、４つの末端がそれぞれ別個で非相補的な末端である限り、第１および第２の末端のそれぞれの対で他の対の付着末端を利用することができる。例示としては、ここに記載するベクターｐＣＯＭＢ３、ｐＣＯＭＢ２−３、ｐＣＯＭＢ２−３′、ｐＣＯＭＢ８およびｐＣＯＭＢ２−８上に認められる末端がある。
【００９６】
複数の環状ＤＮＡ分子をＤＮＡ開裂条件下に処理して線状ＤＮＡ分子を形成する方法は一般に周知であり、開裂されるヌクレオチド配列および開裂の機構に依存する。好適な処理は、制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡ分子を開裂させるのに十分な量で所望の開裂位置にてエンドヌクレアーゼ認識部位に特異的な制限エンドヌクレアーゼとＤＮＡ分子とを混合することを含む。制限エンドヌクレアーゼ開裂のための緩衝液、開裂条件および基質濃度は周知であり、利用する特定の酵素に依存する。例示的な制限酵素開裂条件は実施例２に記載する。
関連する態様では、この発明は、単一のシストロンを有するＤＮＡ分子のライブラリーを製造する方法を提供するが、先に記載した方法に従い、工程（ｂ）の完了の後に停止するものである。この種のライブラリーは、それぞれこの発明のポリペプチドを発現するシストロンからなるＤＮＡ分子を含む。
【００９７】
８．ライブラリーの多様性を変化させる方法
本発明は、この発明の繊維状ファージライブラリーのライブラリーの多様性を変化させる方法を提供する。このような方法は一般にライブラリーの多様性を増加させるものであり、これにより所望の結合活性を検索するための可能なエピトープ結合複合体のプールが増加する。また、この方法は、エピトープ結合複合体のクラスを集積することに向けることができる。クラスは、典型的には特定のエピトープを結合する能力または予備選択した抗原または抗原の群に存在するエピトープの系統群により特定される。
ａ．変異によるライブラリー多様性の増加
多様性を増加させる特に好適な方法は、この発明のファージのゲノムによりコードされたエピトープ結合複合体の１以上のポリペプチドのアミノ酸残基配列を変化させるものである。核酸の変異により核酸レベルで変化を便利に導入することができる。この方法は、この発明のポリペプチドをコードする核酸の単一の分子種上で実施することができ、またはこの発明のファージのライブラリーに存在する核酸のライブラリー上で実施することができる。
【００９８】
核酸の変異は種々の手段により行うことができるが、最も便利には本発明のＰＣＲプロセスの際のＰＣＲ反応において行うものとする。ＰＣＲ変異誘発は、一般に周知のように、特定のヌクレオチド配列に対して無作為または指向性とすることができる。無作為の変異誘発を好感する条件下でＰＣＲを行うことは先に記載しており、「エラープローン（誤りがちな）ＰＣＲ」として言及する。同様に、指向性変異誘発は、ヌクレオチド配列の特定の領域への特定の種類の変異を標的とするよう設計されたＰＣＲプライマーの使用を含む。
１つの態様では、この発明は、この発明のエピトープ結合複合体ポリペプチドに存在する抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）のＰＣＲ指向性変異により１以上のエピトープ結合複合体の多様性を増加させることを企図する。ＣＤＲ変異誘発は、ネズミ抗体のＣＤＲ領域にヒト配列を導入することにより抗体を「ヒト化する」一般的な用語で先に記載されている。ヨーロッパ出願番号ＥＰ２３９４００を参照することができる。
【００９９】
よって、この発明は、この発明のＤＮＡベクターに存在するクローン化した免疫グロブリン遺伝子の免疫学的特異性を変化させる変異誘発方法を企図する。この方法は、免疫グロブリン遺伝子の予備選択したＣＤＲ中で指向性変異誘発を与えるものであるが、これは標的ＣＤＲを有するクローン化した免疫グロブリン遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を、ＣＤＲの予備選択した領域を増幅するのに適切なＰＣＲ条件に供することからなる。この方法では、予備選択したＣＤＲ領域から誘導されるがＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列を含む増幅したＰＣＲ生成物を生成する周知のようなＰＣＲプライマー対における第１のプライマーを構成する後記するようなＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ条件にｒＤＡＮ分子を供する。ＰＣＲ増幅条件における第２のオリゴヌクレオチドは、ここに記載するように変異誘発する免疫グロブリン遺伝子から誘導される全ゆるＰＣＲプライマーとすることができる。
【０１００】
好適なのは、後記するようにこの発明のオリゴヌクレオチドを使用する方法である。
したがって、関連する態様では、免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）における変異誘発を誘導するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でプライマーとして有用なオリゴヌクレオチドを企図する。このオリゴヌクレオチドは３′および５′末端を有し、（１）免疫グロブリン遺伝子の第１のフレーム構造領域にハイブリダイズし得るその３′末端のヌクレオチド配列、（２）免疫グロブリン遺伝子の第２のフレーム構造領域にハイブリダイズし得るその５′末端のヌクレオチド配列、および（３）免疫グロブリン遺伝子の第１および第２のフレーム構造領域の間のＣＤＲ領域にＰＣＲの際に変異を導入するよう適合した３′および５′末端の間のヌクレオチド配列からなり、これによりＣＤＲ領域を変異誘発する。
【０１０１】
免疫グロブリン遺伝子が、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の両者上に３つのＣＤＲ領域を有する限り（それぞれ特有のフレーム構造領域により分離される）、標的ＣＤＲに隣接するフレーム構造領域にハイブリダイズするものとして前記５′および３′ヌクレオチド配列を選択することにより特定のＣＤＲに変異を導入するのに前記例を容易に適用し得ることを理解すべきである。よって、前記第１および第２のフレーム構造配列は、重鎖または軽鎖いずれかの上でＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３に隣接する保存された配列とすることができる。例示的で好適なものは、ヒト免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ３である。
対象変異誘発オリゴヌクレオチドの３′および５′末端ヌクレオチド配列の長さは、その長さがハイブリダイズするものとして標的フレーム構造配列に相補的なヌクレオチドの伸長を与える限り、周知のように長さにおいて変動し得る。３′末端ヌクレオチド配列の場合、これは十分な長さとし、またハイブリダイズしてプライマー延長反応を開始する３′ヒドロキシル末端を与えるものとして変異誘発すべきＣＤＲ領域に対して３′に位置する標的フレーム構造領域に相補的でなければならない。５′末端ヌクレオチド配列の場合、これは十分な長さとし、また前記したようにＰＣＲ重複延長反応においてハイブリダイズする手段を与えて完全な免疫グロブリン重鎖または軽鎖を集成するものとして変異誘発すべきＣＤＲ領域に対して５′に位置する標的フレーム構造領域に相補的でなければならない。
【０１０２】
ＣＤＲに隣接するフレーム構造領域は免疫学的技術において十分に特徴付けられており、ここに随所に記載するように公知のヌクレオチド配列またはコンセンサス配列を含むものである。単一の予備選択した免疫グロブリン遺伝子を変異誘発すべき場合、特定のＣＤＲに隣接するフレーム構造特定配列は公知であるか、ヌクレオチド配列決定手順により容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子のレパートリーを変異誘発すべき場合、フレーム構造誘導配列は、ここに随所に記載するように好ましくは保存されたものである。
好ましくは、３′および５′末端ヌクレオチド配列の長さは、それぞれ少なくとも６ヌクレオチドの長さとし、５０以上のヌクレオチドまでの長さとすることができるが、このような長さは正確で再現性のあるハイブリダイゼーションを確実にするのに必要ではない。好適なのは１２〜３０ヌクレオチドの範囲の長さであり、典型的には約１８ヌクレオチドである。
【０１０３】
３′末端ヌクレオチド配列として使用するのに特に好適なフレーム構造特定ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５′−ＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２２）を有する。
５′末端ヌクレオチド配列として使用するのに特に好適なフレーム構造特定ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ−３′（配列番号：１２３）を有する。
ＣＤＲを変異誘発するのに適合し３′および５′末端の間に位置するヌクレオチド配列は、前記方法によって新規な配列を組込み得る限り、全ゆるヌクレオチド配列とすることができる。ただし本アプローチは、変異誘発すべきＣＤＲ領域で無作為または無作為に近いヌクレオチドを特定する冗長な配列の集団を使用することにより単一のＰＣＲ反応で大集団の変異誘発したＣＤＲを生成する手段を提供するものである。
【０１０４】
好適なオリゴヌクレオチドは前記した３′および５′末端の間のヌクレオチド配列からなり、これは式：［ＮＮＲ］ｎにより表され、式中Ｎは独立に全ゆるヌクレオチドとすることができ、ＲはＳ、Ｋまたはそのアナログとすることができ、ここでＳはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、またここでｎは３〜約２４である。好適な態様では、オリゴヌクレオチドは式：
５′−ＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＧＡＧＡ［ＮＮＲ］ｎＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧ−３′（配列番号：１２４）
を有する。例示的な特に好適なものはＲがＳでありｎが１６であるオリゴヌクレオチドであり、この場合オリゴヌクレオチドは冗長なオリゴヌクレオチド配列の大きな集団を表す。
【０１０５】
よって、この発明は、ａ）本発明による繊維状ファージ粒子のライブラリーを調製し、ｂ）ライブラリー中のそれぞれのＤＮＡ発現ベクターに存在する免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を変異させてそれぞれ変異した免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列を含むファージ粒子のライブラリーを形成する工程からなる繊維状ファージ粒子のライブラリーの多様性を増加させる方法を企図する。
ＰＣＲ反応を変異誘発させるための調製物中の核酸を単離するため、調製はライブラリー中のファージ粒子のゲノムを操作することを含み得る。ＰＣＲ反応で使用するためにファージゲノムを単離するファージライブラリーの操作はここに随所に記載する。
１つの態様では、変異は、免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列をエラープローンポリメラーゼ連鎖反応に供することからなる。他の態様では、変異は、ここに記載するようにＣＤＲ指向性オリゴヌクレオチドを使用して免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列のＣＤＲを変異させる方法に免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を供することからなる。
前記ＣＤＲ指向性オリゴヌクレオチドを使用するかエラープローンＰＣＲを使用して多様な複合体の大きなライブラリーを生成する特定のエピトープ結合複合体コード核酸のＣＤＲ領域を変異させる例示的な方法を実施例に記載する。
【０１０６】
ｂ．ライブラリーの集積
本発明は、予備選択したクラスのエピトープ結合複合体についてライブラリーを集積することによりライブラリーの多様性を変化させる方法を記載するものである。このプロセスは、予備選択した抗原に結合し得るライブラリーにおけるこのようなファージ粒子の親和力選択を一般に含む。親和力選択または選別処理のプロセスは実施例に詳細に記載する。
よって、この発明は、ａ）本発明による繊維状ファージ粒子のライブラリーを調製し、ｂ）ライブラリーの構成員がリガンドに結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で調製したライブラリーと予備選択したリガンドとを接触させ、ｃ）非結合ライブラリー構成員から複合体のファージ粒子を単離して予備選択したリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子からなるリガンド集積ライブラリーを形成する工程からなる繊維状ファージ粒子のライブラリーの多様性を変化させる方法を企図する。
【０１０７】
好適な態様では、予備選択したリガンドを固体支持体に固定し、リガンド−ファージ粒子複合体を固相で形成する。この態様は、ｉ）接触工程の後に固体支持体を洗浄して固体支持体から非結合ライブラリー構成員を濯ぎ、ｉｉ）全ゆる固相結合ファージ粒子を固体支持体から溶出させる工程を更に含む。溶出したファージ粒子を集め、これにより集積したライブラリーからなる単離したファージ粒子を形成する。
溶出は、リガンド−エピトープ結合複合体相互作用を破壊する種々の条件下で行うことができる。典型的な条件は高塩または低ｐＨ緩衝液を含む。特に好適なのは約ｐＨ１〜５、好ましくは約ｐＨ２〜３の緩衝液である。また、溶出緩衝液中の過剰量の予備選択したリガンドによる競合によって相互作用を破壊することができる。両者の溶出手順は実施例に記載する。
関連する態様は、変異によるライブラリーの多様性の増加および選別処理によるライブラリーの集積の両者の特徴を組合せて予備選択したリガンドに対するエピトープ結合複合体親和力を「成熟させる」ものである。よって、ライブラリーの多様性を変化させる本方法を使用し、新たな結合特異性および更に可能な結合特暴性を展開することができる。
【０１０８】
当業者に明らかたり得るように、これらの方法の組合せにより種々の方策を構成することができる。たとえば、ライブラリーを単離し、変異誘発（多様化）し、その後特定の結合活性について検索（集積）することができる。また、ライブラリーから特定の活性について集積し、特定のエピトープ結合複合体を変異誘発し、製造したライブラリーを変異誘発により更に集積することができる。
このテーマに関する他の変更様式では、結合価におけるその固有の差異によるｃｐＩＩＩおよびｃｐＶＩＩＩ誘導膜アンカーに基くライブラリー間の差異を利用することができる。ｃｐＩＩＩ誘導膜アンカーを有するファージのライブラリーは典型的にはそれぞれのファージ粒子の表面上にエピトープ結合複合体の１〜４コピーしか含み得ないため、ファージはそれを接近させる比較的「低い」結合価の結合複合体を与える。これに対して、ｃｐＶＩＩＩ誘導膜アンカーを有するファージのライブラリーは、典型的にはそれぞれのファージ粒子の表面上に２０〜１０００コピーのエピトープ結合複合体を含み得て、粒子は比較的「高い」結合価を与える。よって、ｃｐＩＩＩに基くライブラリーは一価として言及し、ｃｐＶＩＩＩに基くライブラリーは多価として言及する。
【０１００】
抗体親和力および結合価の周知の原則を適用し、ｃｐＶＩＩＩに基くライブラリーに認められる多価試薬を使用して単離し得る広い範囲の親和力（１０４〜１０９Ｍ−１の結合定数）と比較して一般により高い親和力結合相互作用（１０６〜１０９Ｍ−１の結合定数）についての検索に際してｃｐＩＩＩに基くライブラリーを集積できることが理解される。したがって、ｃｐＶＩＩＩに基くライブラリーは低〜高のエピトープ結合複合体の広い範囲の親和力を単離するのに有用であるのに対し、ｃｐＩＩＩに基くライブラリーはより狭い範囲の高い親和力のエピートープ結合複合体を単離するのに有用である。
よって、この発明は、ｃｐＶＩＩＩに基くライブラリーの集積により第１の集積したライブラリーを製造することを企図する。したがって、エピトープ結合複合体ポリペプチドをコードする遺伝子をｃｐＩＩＩに基くベクターに移し、その後高い親和力結合相互作用について集積する。１つの態様では、ｃｐＩＩＩに基くベクターに移す前に変異工程を利用することができる。
【０１１０】
他の態様では、新規な親和力を成熟させる能力をここに例として示すが、この場合リガンド末端毒素（ＴＴ）を結合するヘテロ二量体を発現し得るクローン化したＶＨ／ＶＬヘテロ二量体コード遺伝子をＣＤＲ指向性ＰＣＲ変異誘発を使用して変異誘発し、これに起因する変異誘発した核酸集団をｃｐＩＩＩに基くライブラリーに挿入し、異なるリガンド、フルオレセインへの結合について検索する。フルオレセインに結合する高い親和力のエピトープ結合複合体を同定した。
関連する態様では、素朴な（免疫化していない）ライブラリーをｐｃＶＩＩＩに基くライブラリーにクローン化し、抗原プロゲステロンに対する結合について検索した。低い親和力の結合体をｃｐＩＩＩに基くライブラリーにクローン化し、プロゲステロンに結合する３つの高い親和力の結合クローンを同定した。３つのクローンをプールし、プールをエラープローＰＣＲ変異誘発に供し、変異した核酸の得られるライブラリーをｃｐＩＩＩに基くベクターにクローン化し、プロゲステロンに対して検索してプロゲステロンに結合する高い親和力のエピトープ結合複合体を生成した。このようにして高い親和力の複合体を素朴なライブラリーから「成熟」させた。
【０１１１】
よって、本発明は、ａ）繊維状ファージのゲノムを調製し、ｂ）調製したゲノムに存在する免疫グロブリン可変ドメインコードヌクレオチド配列を変異させて変異した免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列を含むファージ粒子のライブラリーを形成し、ｃ）ライブラリーの構成員がリガンドに結合してリガンド−ファージ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で工程（ｂ）で形成したライブラリーと予備選択したリガンドとを接触させ、ｄ）非結合ライブラリー構成員から前記複合体中のファージ粒子を単離して予備選択したリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子からなるリガンド集積ライブラリーを形成する工程からなるこの発明の繊維状ファージによりコードされるエピトープ結合複合体の親和力を成熟させる方法も企図する。
【０１１２】
Ｆ．ファージライブラリー
本発明は、それぞれがこの発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子のライブラリーを企図し、ここでライブラリーは、それぞれこの発明の異なるｒＤＮＡ分子を含む異なる繊維状ファージ粒子の集団の形態である。異なるｒＤＮＡ分子とは、ヌクレオチド塩基配列の点でライブラリーの他のｒＤＮＡ分子と比較した場合に、この発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド塩基配列の点で異なるｒＤＮＡ分子を意味する。
よって、ファージライブラリーは繊維状ファージ、好ましくはｆ１、ｆｄまたはＭ１３繊維状ファージの集団であり、それぞれのファージはこの発明のｒＤＮＡ発現ベクターが中にパッケージされた粒子を有し、ｒＤＮＡはファージのマトリックス蛋白質によりファージ粒子内にカプセル化される。別に言うと、ファージライブラリーは複数の繊維状ファージ粒子を含み、それぞれの異なるファージ粒子はここに記載するようにその表面上に少なくとも１つのエピトープ結合複合体を含む。好適なライブラリーは、少なくとも１０６、好ましくは１０７、更に好ましくは１０８−９のこの発明の異なる融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含むファージ粒子から構成される。異なる融合ポリペプチドとは、アミノ酸残基配列が異なる融合ポリペプチドを意味する。ここに記載するように無作為の組合せまたは変異誘発の方法を利用してライブラリーの多様性を増加させた場合、更に高いライブラリーの多様性も利用可能である。
【０１１３】
パッケージした発現ベクターが、例えばＦａｂを形成するＶＨおよびＶＬポリペプチドのような自己集成受容体の第１および第２のポリペプチドをコードする場合、受容体特異性の多重性を含むか発現するものとしてライブラリーを特徴付けることもできる。よって、ライブラリーは少なくとも１０５、好ましくは少なくとも１０６、更に好ましくは少なくとも１０７の異なる受容体、例えば異なる抗体、Ｔ細胞受容体、インテグリン等を発現する。
ライブラリーの大きさは、多数の因子、特にライブラリーを製造する方法に依存して変動し得る。ここで使用するように、大きさはライブラリーの複雑性または多様性、すなわちライブラリー中の粒子の絶対数より寧ろライブラリーを構成する異なる分子種の数を内包する。
よって、第１および第２のポリペプチドに対応する遺伝子の２つのレパートリーを最初に別にクローン化することによりライブラリーを製造する場合、ジシストロン性ベクターの形態で２つのレパートリーを無作為に組合せた後の得られるラィブラリーの大きさは大きく増加する。例えば、軽鎖および重鎖可変抗体遺伝子レパートリーを考えると、それぞれ１０６の異なる構成員を有する。２つのレパートリーを組合せることにより、理論的には１０１２の可能な異なるジシストロン性ベクター分子種のライブラリーが生成する。
【０１１４】
より大きい多様性を生成するため、前記したような２つのレパートリーを「混ぜ合せる」能力を評価する実験系を設計した。この系は、ハプテン、パラ−ニトロフェニルホスホンアミデート（ＮＰＮ）により免疫化したマウスから誘導した結合したＦａｂライブラリーを利用するものとした。２２の異なるクローンを単離し、重鎖および軽鎖コード核酸を単離し、配列決定して２２対の内２１が核酸配列のレベルで異なることを決定した。２２のＮＰＮリガンド結合クローンを無作為に再度組合せ（混ぜ合せ）、ＮＰＮに対する結合について再検索した。
元の対が再接合する場合は重鎖および軽鎖はリガンド結合ヘテロ二量体受容体分子を形成し得るのみであると想定すると、モデルにより全組合せの４．６パーセントがリガンド結合組合せを与え得ると予測される。より高い全ゆる百分率は、元の対以外の対合もＮＰＮに結合し得ることを示す。結果は、単離したクローンの２７パーセントがＮＰＮに結合し、混ぜ合せに際してＮＰＮに結合し得る受容体のライブラリーの大きさが５．８倍増加したことを示した。これは、ＮＰＮを結合するクローンに増加が限定されることを示した。無作為に混ぜ合せたライブラリーの他の構成員は、多様な非ＮＰＮのリガンドを結合する能力を有する。よって、混ぜ合せは多様性を増加させることが示された。
【０１１５】
ライブラリーの複雑性は、配列の予め存在するライブラリーのヌクレオチド配列を変異させるここにおける方法を使用して増加させることもできる。発現した融合ポリペプチドについてのアミノ酸残基の差異に関して言えば、無作為の変異を標的とするそれぞれのアミノ酸残基位置につきライブラリーの大きさで潜在的に２０倍の増加があり得る。
例えば、実施例に記載するような抗体遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）指向性変異誘発を使用し、１６アミノ酸残基の線状領域を無作為変異について標的とした。単一の分子種により出発し、２０の異なるアミノ酸を選択する全ての可能な組合せにより１６残基位置の全てを変異させると、理論的には２０１６の異なる分子種、すなわち６×１０２０の異なる分子種が生成し得る。
ここに記載するように、本発明における繊維状ファージの特定の利点は、ファージ粒子中に存在しヘテロ二量体受容体の構成員の一方または両方をコードするＤＮＡ分子を、ファージ粒子の表面の特定の発現した融合ポリペプチドの存在に基いてライブラリーに存在する他のＤＮＡ分子から分離できることである。
【０１１６】
ヘテロ二量体受容体の一方または両方の構成員をコードするＤＮＡ分子の単離（分離）は、ライブラリーを含む他のファージ粒子の集団から意図する単数または複数の遺伝子を含む繊維状ファージ粒子を分離することにより行う。ファージ粒子の分離は、個々のファージ粒子をライブラリー中の他の粒子から物理的に分離して増殖させることを含む。繊維状ファージ粒子を物理的に分離して個々の粒子を生成し、個々の粒子を増殖させて個々の分離した粒子から誘導された子孫ファージの集団を形成する方法は繊維状ファージの技術において周知である。
【０１１７】
好適な分離方法は、ファージ粒子と予備選択したリガンドとの間のリガンド結合特異性によりファージ粒子の表面上で発現したヘテロ二量体を同定することを含む。例示的な好適なものは「選別処理」方法の使用であり、これによりファージ粒子の懸濁物を固相リガンド（抗原）に接触させ、特異的に結合（またはヘテロ二量体が免疫グロブリン可変ドメインを含む場合は免疫反応）させる。結合の後、非結合粒子を固相から洗浄するが、結合したファージ粒子はその表面上にリガンド特異的ヘテロ二量体受容体（ヘテロ二量体）を含むものである。その後結合した粒子は、典型的にはリガンド−受容体相互作用を妨害する水性溶剤を使用することにより、固相からの結合した粒子の溶出によって回収することができる。典型的な溶剤は、高いイオン強度、低いｐＨ、または受容体−リガンド結合相互作用を破壊するのに十分な量の可溶性競合リガンドを有する緩衝液を含む。
【０１１８】
表面発現ヘテロ二量体のリガンド特異性に基いて粒子の集団からファージ粒子を分離する他の方法は、リガンドと架橋結合させることにより溶液相からファージ粒子を沈殿させるものである。例示的な好適な架橋結合および沈殿方法は実施例４ｃに詳細に記載する。
前記粒子分離方法の使用により、この発明のファージライブラリーに存在する繊維状ファージ粒子の集団を検索する手段が提供される。ファージライブラリーに適用されるものとして、予備選択したリガンド結合特異性を有するヘテロ二量体を発現する１以上の粒子について検索を利用してライブラリーを集積することができる。全てがリガンド結合活性の何らかの検出し得る尺度を有するが蛋白質構造、抗原性、リガンド結合親和力または結合力等において異なる多数の分子種のヘテロ二量体を含むようライブラリーを設計する場合、検索方法を利用して順にまず予備選択した結合特異性について集積したライブラリーを製造し、その後１以上の単離したファージ粒子からなる更なる検索により更に集積した第２のライブラリーを製造することができる。リガンド結合活性、抗原性および同様のリガンドと受容体との間の相互作用を測定する方法は周知であり、本発明の必須の特徴ではないため更には論じない。
【０１１９】
よって、１つの態様では、ファージライブラリーは予備選択したリガンド結合特異性について集積した粒子の集団である。
他の態様では、ファージライブラリーは粒子の集団からなり、この場合それぞれの粒子はファージ粒子の表面上にこの発明の少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む。ファージ粒子の表面上に存在する融合ポリペプチドの実際の量は、部分的に融合ポリペプチド中にに存在するコート蛋白質膜アンカーの選択に依存する。
アンカーをｃｐＩＩＩから誘導する場合、典型的にはファージ粒子当り約１〜４の融合ポリペプチドがある。より好適なｃｐＶＩＩＩからアンカーを誘導する場合、生育条件およびここに論ずるような他の因子に依存して粒子表面上には数百の融合ポリペプチドがある可能性がある。ファージ粒子上に存在する融合ポリペプチドの実際の量は、宿主細胞内で合成されるものであるため、ファージ粒子によって「補足される」量を調節することにより調整することができる。
典型的には、この発明のライブラリー中のファージ粒子は、それぞれの粒子の表面上に約１０〜約５００のｃｐＶＩＩＩ誘導融合ポリペプチドを含み、更に好ましくは粒子当り約２０〜５０の融合ポリペプチドである。表面融合ポリペプチドの例示的な量は実施例４ａに記載する電子顕微鏡写真により示され、粒子当り約２０〜２４のｃｐＶＩＩＩ誘導融合ポリペプチドを有する粒子を示す。
【０１２０】
他の態様では、本発明は、単一の粒子の子孫であり、したがって全てが粒子表面上で同じヘテロ二量体を発現するファージ粒子の集団を企図する。この種のファージの集団は同種であり、クローン的に誘導され、したがって大量の特定の融合ポリペプチドを発現する供給源を与える。例示的なクローン的に同種のファージ集団を実施例４に記載する。
この発明のライブラリーの繊維状ファージ粒子は、標準的な繊維状ファージ粒子調製方法により製造され、この発明のＤＮＡ発現ベクター中でのここに記載するような繊維状ファージ複製開始点の存在に依存して（１）一本鎖繊維状ファージ複製形態の製造および（２）複製形態の繊維状ファージ粒子へのパッケージングに必要なシグナルを与える。この種のＤＮＡ分子は、感染性ファージ粒子の製造に必要な繊維状ファージ蛋白質を与える遺伝的相補の導入に際して細菌宿主中に存在する場合にパッケージされ得る。遺伝的相補のための典型的で好適な方法は、この発明のＤＮＡ発現ベクターを含む細菌宿主細胞にヘルパー繊維状ファージを感染させ、これによりファージ粒子集成に必要な要素を与えるものである。例示的なヘルパーレスキュー方法はここでは実施例２に記載するが、ショートら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７５８５−７６００（１９８８）により記載されている。
【０１２１】
宿主細胞からのファージ粒子押出しの過程において繊維状ファージ粒子の表面上に補足されるヘテロ二量体受容体のレベルは、多様な手段により調節することができる。１つの態様では、融合ポリペプチドのレベルは、ポリペプチドを発現する第１および第２のシストロン中で強力なプロモーターを使用することにより調節し、この場合融合ポリペプチドシストロンの転写が、ヘルパーファージ上のｃｐＶＩＩＩ遺伝子の転写の速度より大きい相対速度で生起するようにする。他の態様では、ヘルパーファージはｃｐＶＩＩＩを発現する遺伝子にアンバー変異を有することができ、この場合融合ポリペプチドより野生型でないｃｐＶＩＩＩが宿主細胞中で転写され、これにより押出し過程に際しｃｐＶＩＩＩと比較して融合ポリペプチドの増加した速度を導くものとする。
他の態様では、ファージ粒子表面上のヘテロ二量体受容体の量は、融合ポリペプチドの発現とヘルパーファージの重複感染との間のタイミングを調節することにより調節することができる。発現ベクターを宿主細胞に導入した後、ヘルパーファージの添加前の遅れ時間が長いと、宿主細胞における融合ポリペプチドの増加した蓄積を可能とすることができ、これによりファージ粒子を押出すことにより補足される融合ポリペプチドの量が増加する。
【０１２２】
Ｇ．診断方法
本発明は、サンプル中の予備選択したリガンドまたは抗原の存在について検定する好ましくはキット形態の診断系も記載するものであり、この場合ここに記載する診断方法によりサンプル中のリガンドまたは抗原の存在、および好ましくは量を検出するのが望ましい。
サンプルは組織、組織抽出物、流体サンプルまたは体液サンプル、例えば血液、血漿または血清とすることができる。
診断系は、別にパッケージした試薬として少なくとも１回の検定を行うのに十分な量の本発明による繊維状ファージまたはリガンド結合ヘテロ二量体受容体を含む。
この発明の繊維状ファージ粒子を利用し固相の予備選択したリガンドを検出する例示的な診断系は実施例に記載する。
パッケージした試薬の使用のための指示も典型的には含まれる。
【０１２３】
ここで使用するように、「パッケージ」という用語は、本発明のヘテロ二量体受容体、繊維状ファージまたはファージのライブラリーを固定限界内で保持し得るガラス、プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカーボネート）、紙、ホイル等のような固体マトリックスまたは材料に言及するものである。よって、例えば、パッケージは企図する標識ファージ調製物のミリグラム量を含むのに使用するガラス瓶とすることができ、またはこれはマイクログラム量の企図する受容体またはファージを機能的に固定、すなわちリガンドを結合し得るよう結合したミクロ滴定プレート穴とすることができる。
「使用のための指示」は、典型的には試薬濃度または少なくとも１つの検定方法パラメーター、例えば混合すべき試薬およびサンプルの相対的量、試薬／サンプル混合物の維持時間期間、温度、緩衝液条件等を記載した具体的な表示を含むものである。
【０１２４】
本発明の診断系は、好ましくは予備選択したリガンドと複合したリガンド結合ヘテロ二量体受容体またはファージを含む結合反応複合体の形成をシグナル化し得る標識または表示手段も含む。
「複合体」という用語は、ここで使用するようにファージーリガンドまたは受容体−リガンド反応のような特異的結合反応の生成物に言及するものである。例示的な複合体は免疫反応生成物である。
ここで使用するように、「標識」および「表示手段」という用語は、その種々の文法的形態において、複合体の存在を示す検出可能なシグナルの生成に直接または間接に関与する単一原子および分子に言及するものである。診断方法で使用する発現したポリペプチドまたはファージ粒子に全ゆる標識または表示手段を結合させるか組込むことができる。この種の標識はそれ自体臨床診断化学において周知であり、これらが新規な蛋白質、方法および／または系と共に利用される場合に限り、この発明の一部を構成する。
【０１２５】
標識手段は、抗体または抗原にこれらを変性させることなく化学的に結合して免疫蛍光トレーサーとして有用な蛍光色素（色素）を形成する蛍光標識剤とすることができる。適切な蛍光標識剤には蛍光色素、例えばフルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルクロリド（ＲＢ２００ＳＣ）等がある。免疫蛍光分析技術の記載はデルカ、「免疫蛍光分析」、「道具としての抗体」中、マルカロニスら編、ジョン・ウイレイ・アンド・ソンズ社、ｐｐ．１８０−２３１（１９８２）に認められ、これを参考によりここに取入れる。
好適な態様では、表示群は西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ等のような酵素とする。主たる表示群がＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場合、受容体−リガンド複合体（免疫反応体）が形成したことを視覚化するために付加的な試薬が必要である。ＨＲＰのためのこの種の付加的な試薬には、過酸化水素およびジアミノベンジジンのような酸化色素前駆体が含まれる。グルコースオキシダーゼと共に有用な付加的な試薬は、２，２′−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
【０１２６】
放射性元素も有用な標識剤であり、ここでは例示的に使用する。例示的な放射性標識剤はガンマ線放射を生成する放射性元素である。それ自体ガンマ線を放射する元素、たとえば１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２８Ｉ、１３２Ｉおよび５１Ｃｒは、１つのクラスのガンマ線放射生成放射性元素表示群を代表する。特に好適なのは１２５Ｉである。他の群の有用な標識手段は、それ自体陽電子を放射する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎのような元素である。このように放射された陽電子は、動物の体に存在する電子との遭遇に際してガンマ線を生成する。同様に有用なのは３Ｈの１１１インジウムのようなベータエミッターである。
標識の結合、すなわちポリペプチドおよび蛋白質の標識は当業界で周知である。例えば、蛋白質またはファージは、培養培地の成分として与えた放射性同位元素含有アミノ酸の代謝的取込みにより標識することができる。例えば、ガルフレら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３−４６（１９８１）を参照することができる。活性化した官能基を介する蛋白質接合または共役の技術を特に適用することができる。例えば、アウラメアスら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第８巻補遺、７：７−２３（１９７８）、ロドウェルら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：８８９−８９４（１９８４）および米国特許第４，４９３，７９５号を参照することができる。
【０１２７】
診断系は、好ましくは別のパッケージとして、特異的結合剤も含むことができる。「特異的結合剤」は、本発明の試薬分子種またはこの種の分子種を含む複合体に選択的に結合することができるが、それ自体は本発明のポリペプチドまたはファージではない分子実体である。例示的な特異的結合剤は抗体分子、相補的蛋白質またはその断片、エス・オーレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）蛋白質Ａ等である。好ましくは特異的結合剤は、その分子種が複合体の一部として存在する場合に試薬分子種に結合する。
好適な態様では特異的結合剤を標識する。ただし診断系が標識されていない特異的結合剤を含む場合、その薬剤は典型的には増幅手段または試薬として使用する。これらの態様では、標識した特異的結合剤は、増幅手段が試薬分子種含有複合体に結合する場合に、増幅手段に特異的に結合することができる。
【０１２８】
本発明の診断キットを「ＥＬＩＳＡ」形式で使用して流体サンプル中の予備選択したリガンドの量を検出することができる。「ＥＬＩＳＡ」は、固相に結合した抗体または抗原および酵素−抗原または酵素−抗体接合体を用いてサンプル中に存在する抗原の量を検出して定量する酵素結合免疫吸着検定に言及するものであり、本方法に容易に適用可能である。ＥＬＩＳＡ技術の記載は、１９８２年にロス・アルトス、ＣＡのランゲ・メディカル・パプリケーションにより出版されたディ・ピー・サイテスらによる「基礎および臨床免疫学」の第４版の第２２章、および米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号および第４，０１６，０４３号に認められ、これらを全て参考によりここに取入れる。
よって、幾つかの態様では、本発明のポリペプチドまたはファージを固体マトリックスに固定し、対象診断系のパッケージからなる固体支持体を形成することができる。
【０１２９】
水性媒体からの吸着により典型的には試薬を固体マトリックスに固定するが、蛋白質およびポリペプチドに適用し得る他の固定の様式を使用することができ、これは当業者に周知である。例示的な吸着方法はここに記載する。
有用な固定マトリックスも当業界で周知である。この種の材料は水不溶性であり、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（ピスカタウェイ、ＮＪ）から登録商標セファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）の下で入手可能な架橋結合デキストラン、アガロース、ノース・シカゴ、ＩＬのアボット・ラボラトリイズから入手可能な直径約１ミクロン〜約５ミリメーターのポリスチレンビーズのビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋結合ポリアクリルアミド、ニトロセルロースまたはナイロン基材ウェブ、例えばシート、ストリップまたはパドル、またはチューブ、プレートまたはポリスチレンまたはポリ塩化ビニル製のもののようなミクロ滴定プレートの穴が含まれる。
ここに記載する全ゆる診断系の試薬分子種、標識した特異的結合剤または増幅試薬は溶液中で、液体懸濁物としてまたは実質的に乾燥した粉末として、例えば凍結乾燥形態で提供することができる。表示手段が酵素である場合、酵素の基質も系の別のパッケージで提供することができる。前記したミクロ滴定プレートのような固体支持体および１以上の緩衝液も、この診断検定系における別のパッケージした要素として含むことができる。
診断系に関してここに論ずるパッケージ材料は、診断系において慣用的に利用されているものである。
【０１３０】
Ｈ．検定方法
本発明は、この発明のヘテロ二量体受容体またはファージをリガンド結合試薬として使用してその量が直接または間接にサンプル中の予備選択したリガンドの量に関連する結合反応生成物を形成する生物学的流体サンプルのような水性組成物中に典型的には存在する予備選択したリガンドの存在および好ましくは量を決定する種々の検定方法を企図する。
当業者であれば、この発明の結合試薬を使用してその量がサンプル中のリガンドの量に関連する結合反応生成物を形成することのできる多数の周知の臨床診断化学手順があることを理解しよう。よって、例示的な検定方法をここに記載するが、この発明はこのように限定されるものではない。
【０１３１】
競合または非競合いずれかの種々の異種的およ同種的な手順を、この発明の検定方法を実施するのに用いることができる。
１つの態様では、この発明は、この発明のリガンド結合ヘテロ二量体受容体を結合試薬として使用して受容体が結合する予備選択したリガンドの存在を検出する直接結合検定を企図する。この方法は、ａ）リガンド結合ヘテロ二量体受容体がリガンドに結合してリガンド−受容体複合体を形成するのに十分な結合条件下で予備選択したリガンドに結合するこの発明のリガンド結合ヘテロ二量体受容体と予備選択した抗原を含むと考えられるサンプルとを混合し、ｂ）リガンド−受容体複合体または複合体中のリガンド結合ヘテロ二量体受容体の存在を検出する工程からなる。
結合条件は、受容体のリガンド結合活性を維持するようなものとする。このような条件には、摂氏約４〜５０度の温度範囲、約５〜９のｐＨ値、およびほぼ蒸留水のものからほぼ１モルの塩化ナトリウムのものまでの範囲のイオン強度が含まれる。
【０１３２】
免疫学的技術で周知のように、検出工程は複合または結合試薬（複合体の受容体成分）のいずれかに向けることができる。よって、受容体に特異的な抗体のような二次結合試薬を利用することができる。
また、標識した受容体分子を使用したことにより複合体を検出可能とすることができ、これにより複合体を標識されたものとする。この場合の検出は、複合体中に存在する標識を検出することからなる。
好適な態様では、リガンド結合ヘテロ二量体受容体は、繊維状ファージ粒子上の付着物として、すなわちファージの表面上で与えるものとする。この発明の繊維状ファージを使用する例示的な検定は、実施例においてＥＬＩＳＡ形式で記載する。
他の態様では、例えばここに記載するようにファージの蛋白質または核酸に組込まれた放射性同位元素により繊維状ファージ粒子を検出可能に標識する。この態様では、検出は、複合体中の標識を検出し、これにより複合体中のリガンドの存在を検出することからなる。
【０１３３】
更なる診断方法は架橋結合リガンドに対する繊維状ファージ粒子の多価性を利用するものであり、これにより多価リガンドおよびファージ粒子の凝集物を形成し、沈殿し得る凝集物を生成する。この態様は、免疫沈殿の周知の方法と比較し得るものである。この態様は、サンプルとこの発明の複数のファージ粒子とを混合して結合条件下で結合混合物を形成する工程からなり、その後形成した結合複合体を単離する分離工程を行う。典型的には、凝集物を混合物から除去する遠心分離またはろ過により単離を行う。結合複合体の存在は、検出すべき予備選択したリガンドの存在を示す。
【０１３４】
実施例
以下の実施例はこの発明の範囲を示すことを意図するものであるが、限定するものではない。
１．ファージ粒子上でヘテロ二量体受容体を製造するジシストロン性発現ベクターの構成
直接検索することのできる多数のＦａｂ抗体断片を生成するベクター系を取得するため、バクテリオファージラムダにおける発現ライブラリーを、ヒューセら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）に記載されたようにして先に構成した。このような系は、繊維状ファージ粒子の表面を標的とする発現されたＦａｂを与える設計特徴は含まない。
ベクター系を選択するのに使用した主な評価基準は、直接検索し得る最多数のＦａｂ断片を生成する必要性とした。このような理由のため、発現ベクターを開発する出発点としてバクテリオファージラムダを選択した。第１に、ファージＤＮＡの試験管内パッケージングは、宿主細胞にＤＮＡを再導入する最も効率的な方法であった。第２に、単一ファージプラークのレベルで蛋白質発現を検出するのが可能であった。最後に、ファージライブラリーの検索が典型的に含む非特異的結合についての困難性が少なかった。代替であるプラスミドクローン化ベクターは、それを同定した後のクローンの分析において有利なのみである。ｐＣｏｍｂＶＩＩＩのようなジシストロン性発現ベクターを使用し、これにより切出すべき重鎖、軽鎖またはＦａｂ発現挿入物を含むプラスミドを可能とすることから、この利点は本系では失われなかった。
【０１３５】
ａ．ジシストロン性発現ベクターｐＣＯＭＢの構成
（ｉ）ラムダＺａｐ ＴＭ ＩＩの調製
ラムダＺａｐＴＭＩＩは、６つの独特のクローン化部位、融合蛋白質発現、およびファージミド（ブルースクリプトＳＫ−）の形態で挿入物を迅速に切出す能力を含む元のラムダＺａｐの全ての特徴を維持するが、ＳＡＭ１００変異を欠失し、ＸＬ１−ブルーを含む多くの非ＳｕｐＦ株上での生育を可能とする元のラムダＺａｐ（ＡＴＣＣ＃４０，２９８）の誘導体である。ラムダＺａｐＴＭＩＩは、ショートら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００，１９８８に記載されたように、制限酵素ＮｃｏＩを用いてラムダＺａｐを消化することにより生成する４２５４塩基対（ｂｐ）ＤＮＡ断片に含まれるラムダＳ遺伝子を置換することにより構成した。制限酵素ＮｃｏＩによりベクターを消化した後にラムダｇｔ１０（ＡＴＣＣ＃４０，１７９）から単離したラムダＳ遺伝子を含む４２５４ｂｐＤＮＡ断片を用いてこの４２５４ｂｐＤＮＡ断片を置換した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよび「分子生物学における現代の手順」、アウスベルら編、ジョン・ウィレン・アンド・ソンズ、ＮＹ、１９８７に記載されたもののような標準的な手順を使用し、ラムダｇｔ１０から単離した４２５４ｂｐＤＮＡ断片を元のラムダＺａｐベクターに連結し、ラムダＺａｐＴＭＩＩＩを形成した。
【０１３６】
（ｉｉ）ラムダＨｃ２の調製
イー・コリ宿主細胞中で複数のＶＨコードＤＮＡ相同体を発現するため、ラムダＨｃ２と命名したベクターを構成した。このベクターは次のものを与えた：適切なリーディングフレームでＶＨコードＤＮＡ相同体を配置する能力、シャインら、Ｎａｔｕｒｅ，２５４：３４，１９７５により記載されたリボソーム結合部位、ｐｅｌＢ分泌シグナルと命名されたペリプラズム空間に発現した蛋白質を向けるリーダー配列、公知のエピトープ（エピトープｔａｇ）をコードするポリヌクレオチド配列、および同様にＶＨコードＤＮＡ相同体とエピトープｔａｇをコードするポリペプチドとの間のスペーサー蛋白質をコードするポリペプチド。ラムダＨｃ２は、ヒューセら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）により先に記載されいてる。
【０１３７】
ラムダＨｃ２を調製するため、互いにハイブリダイズし得て図３に示す二本鎖合成ＤＮＡ配列を形成する２０〜４０塩基の一本鎖ポリヌクレオチド断片を設計することにより、前記特徴の全てを含む合成ＤＮＡ配列を構成した。個々の一本ポリヌクレオチド断片を表３に示す。
７０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ２、５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、ミリリットル当り５００マイクログラム（μｇ／ｍｌ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む溶液に１μｌにそれぞれのポリヌクレオチド０．１マイクログラム／マイクロリットル（μｇ／μｌ）および２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加することにより、ポリヌクレオチドＮ２、Ｎ３、Ｎ９−４、Ｎ１１、Ｎ１０−５、Ｎ６、Ｎ７およびＮ８（表３）をキナーゼ処理した。溶液を摂氏３７度（３７℃）に３０分間維持し、溶液を６５℃で１０分間維持することにより反応を停止させた。２０．０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２．０ｍＭＭｇＣｌ２および５０．０ｍＭＮａＣｌを含む１／１０容量の溶液と共に前記キナーゼ処理反応溶液に対して２つの末端ポリヌクレオチド、２０ｎｇのポリヌクレオチドＮ１およびポリヌクレオチドＮ１２を添加した。この溶液を７０℃に５分間加熱し、水の５００ｍｌビーカー中で１．５時間かけて室温、約２５℃に冷却した。この時間期間の間に、１０の全てのポリヌクレオチドがアニールし、図３に示す二本鎖合成ＤＮＡ挿入物を形成した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に４０μｌの前記反応物を添加することにより、個々のポリヌクレオチドを互いに共有結合させて合成ＤＮＡ挿入物を安定化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、その後溶液を６５℃で１０分間維持することによりＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した。５２μｌの前記反応物、１０ｍＭＡＴＰを含む４μｌの溶液および５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを混合することにより末端ポリヌクレオチドをキナーゼ処理した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、その後溶液を６５℃で１０分間維持することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化した。
【０１３８】
Figure 0004108430
【０１３９】
制限酵素ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより予め消化した実施例１ａ（ｉ）に記載したラムダＺａｐＴＭＩＩベクターに完成した合成ＤＮＡ挿入物を直接連結した。ストラタジーン、ラ・ジョラ、カリホルニアから入手可能なギガパックＩＩゴールドパッキング抽出物を使用し、製造業者の指針に従って連結混合物をパッケージした。パッケージした連結混合物をＸＬ１ブルー細胞（ストラタジーン）上にプレート処理した。個々のラムダプラークを抜取り、製造業者（ストラタジーン）により提供されたラムダＺａｐＴＭＩＩについての生体内切出し手順に従って挿入物を切出した。この生体内切出し手順により、クローン化した挿入物はラムダＨｃ２ベクターからファージミドベクターに移動し、操作および配列決定が容易となった。サンガーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３〜５４６７（１９７７）に記載されたサンガーのジデオキシ法を使用し、ＡＭＶ逆転写酵素３５Ｓ−ＡＴＰ配列決定キット（ストラタジーン）における製造業者の指針を使用して挿入物を配列決定することにより、前記クローン化工程の正確性を確認した。ＶＨ発現ベクター（ラムダＨｃ２）における得られた二本鎖合成ＤＮＡ挿入物の配列を図３に示す。ラムダＨｃ２のそれぞれの鎖の配列（頂部および底部）を、それぞれ配列番号：１および配列番号：２として配列中に列記する。得られたラムダＨｃ２発現ベクターを図４に示す。
【０１４０】
（ｉｉｉ）ラムダＬｃ２の調製
イー・コリ宿主細胞中で複数のＶＬコードＤＮＡ相同体を発現するため、シャインら、Ｎａｔｕｒｅ，２５４：３４（１９７５）に記載されたようにリボソーム結合部位を備え、レイら、Ｊ．Ｂａｃ．１６９：４３７９（１９８７）およびベターら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１（１９８８）によりイー・コリにおいてＦａｂ断片を成功裡に分泌させるのに先に使用されたｐｅｌＢ遺伝子リーダー配列を備え、クローン化のための制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリヌクレオチドを更に備える、適切なリーディングフレームにＶＬコードＤＮＡ相同体を位置させる能力を有するラムダＬｃ２と命名したベクターを構成した。ラムダＬｃ２は、ヒューセら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８９）により先に記載されいてる。
互いにハイブリダイズし得て図５に示す二本鎖合成ＤＮＡ配列を形成する２０〜６０塩基の一本鎖ポリヌクレオチド断片を設計することにより、前記特徴の全てを含む合成ＤＮＡ配列を構成した。二本鎖合成ＤＮＡ配列内のそれぞれ個々の一本鎖ポリヌクレオチド断片（０１〜０８）の配列を表４に示す。
【０１４１】
７０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇＣｌ、５ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、５００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む溶液に１μｌ（０．１μｇ／μｌ）のそれぞれのポリヌクレオチドおよび２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加することにより、ポリヌクレオチド０２、０３、０４、０５、０６および０７（表４）をキナーゼ処理した。３７℃で３０分間溶液を維持し、６５℃で１０分間溶液を維持することにより反応を停止させた。２０．０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２．０ｍＭＭｇＣｌおよび１５．０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む１／１０容量の溶液と共に、２０ｎｇのそれぞれの２つの末端ポリヌクレオチド０１および０８を前記キナーゼ反応溶液に添加した。この溶液を７０℃に５分間加熱し、水の５００ｍｌビーカー中で１．５時間かけて室温、約２５℃に冷却した。この時間期間の間に、８つのポリヌクレオチドがアニールして図５に示す二本鎖合成ＤＮＡ挿入物を形成した。５０ｍｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７ｍｌＭｇＣｌ、１ｍｍＤＴＴ、１ｍｍＡＴＰおよび１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に４０μｌの前記反応物を添加することにより、個々のポリヌクレオチドを互いに共有結合させて合成ＤＮＡ挿入物を安定化した。この溶液を３７℃で３０分間維持し、その後６５℃で１０分間溶液を維持することによりＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した。５２μｌの前記溶液、１０ｍＭＡＴＰおよび５単位のポリヌクレオチドキナーゼを含む４μｌの溶液を混合することにより末端ポリヌクレオチドをキナーゼ処理した。この溶液を３７℃で３０分間維持し、その後溶液を６５℃で１０分間維持することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化した。
【０１４２】
Figure 0004108430
【０１４３】
制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩにより予め消化した実施例１（ａ）（ｉ）に記載したラムダＺａｐＴＭＩＩベクターに完成した合成ＤＮＡ挿入物を直接連結した。ギガパックＩＩゴールドパッキング抽出物（ストラタジーン）を使用し、製造業者の指針にしたがって連結混合物をパッケージした。パッケージした連結混合物をＸＬ１ブルー細胞（ストラタジーン）上にプレート処理した。個々のラムダプラークを抜取り、製造業者（ストラタジーン）により提供されたラムダＺａｐＴＭＩＩについての生体内切出し手順にしたがって挿入物を切出した。この生体内切出し手順により、クローン化した挿入物はラムダＬｃ２ベクターからプラスミドファージミドベクターに移動し、操作および配列決定が容易となった。ＡＭＶ逆転写酵素３５Ｓ−ＡＴＰ配列決定キット（ストラタジーン）における製造業者の指針を使用して挿入物を配列決定することにより前記クローン化工程の正確性を確認した。得られたＬｃ２発現ベクター（ラムダＬｃ２）の配列を図７に示す。配列列記中に配列番号：３および配列番号：４としてそれぞれの鎖を別に列記する。得られたＬｃ２ベクターを図６に図示的に示す。
【０１４４】
ラムダＬｃ３と命名したこの発明で使用するのに好適なベクターは前記調製したラムダＬｃ２の誘導体である。図５および配列番号：３に示すように、ラムダＬｃ２は、ＥｃｏＲＩ制限部位に対して３′およびシャイン・ダルガーノリボソーム結合部位に対して５′に位置するＳｐｅＩ制限部位（ＡＣＴＡＧＴ）を含む。図３および４並びに配列番号：１に示すように、ＳｐｅＩ制限部位はラムダＨｃ２にも存在する。以下の実施例１ａ（ｉｖ）に記載するようにラムダＨｃ２およびＬｃ２の部分を共に組合せることにより、ｐＣｏｍｂと命名した結合ベクターを構成した。得られる結合ｐＣｏｍｂベクターは、１つがラムダＨｃ２により与えられ１つがラムダＬｃ２により与えられＥｃｏＲＩ部位が間にある２つのＳｐｅＩ制限部位を含んでいた。２つのＳｐｅＩ制限部位の存在にも拘らず、以下の実施例１ｂに記載するように、ＳｐｅＩおよびＥｃｏｒＩ付着末端を有するＤＮＡ相同体は、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩにより予め消化したｐＣｏｍｂ発現ベクターに成功裡に方向性をもって連結された。Ｌｃ２ベクターにより与えられる３′ＳｐｅＩ部位に対するＥｃｏＲＩ制限部位の近接性により、３′ＳｐｅＩ部位の完全消化が阻害された。よって、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いてｐＣｏｍｂを消化しても、２つのＳｐｅＩ部位の間のＥｃｏＲＩ部位の除去には帰着しない。
【０１４５】
第２のＳｐｅＩ制限部位の存在は、２つの部位の間の領域が除去され得るため、ＳｐｅＩのみで消化したｐＣｏｍｂベクターへの連結には望ましくない可能性がある。したがって、最初にＳｐｅＩによりラムダＬｃ２を消化して線状化したベクターを形成することにより、ラムダＬｃ３と命名した第２のまたは３′ＳｐｅＩ部位を欠失するラムダＬｃ２の誘導体を製造する。末端を埋めて平滑末端を形成し、これらを互いに連結し、結果としてＳｐｅＩ部位を欠失したラムダＬｃ３を得る。ラムダＬｃ３は、以下に記載するように結合ベクターを構成する使用に好適である。
（ｉｖ）ｐＣｏｍｂの調製
前記した生体内切出し手順を使用して発現ベクターラムダＨｃ２またはラムダＬｃ２からファージミドを切出した。ホルメスら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：１９３（１９８１）により記載された方法により、ファージミド含有細胞から二本鎖ＤＮＡを調製した。生体内切出しの結果得られるファージミドは、親ベクターと同様に抗体断片クローン化および発現のための同じヌクレオチド配列を含んでおり、それぞれラムダＨｃ２およびＬｃ２に対応してファージミドＨｃ２およびＬｃ２と命名した。
【０１４６】
ファージミドＨｃ２およびファージミドＬｃ２の部分を組合せることにより製造される結合ファージミドベクターｐＣｏｍｂの構成のため、ファージミドＨｃ２を最初にＳａｃＩにより消化し、ＬａｃＺプロモーターに対して５′に位置する制限部位を除去した。線状化したファージミドをその後Ｔ４ポリメラーゼにより平滑末端として連結した結果、ＳａｃＩ部位を欠失するＨｃ２ファージミドを得た。修飾したＨｃ２ファージミドおよびＬｃ２ファージミドをその後別々にＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩにより制限消化し、結果として５′から３′にＳｃａＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を有するＨｃ２断片および５′から３′にＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩおよびＳａｃＩ制限部位を有するＬｃ２断片を得た。線状化したファージミドをその後そのそれぞれの付着末端で互いに連結し、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｂａＩ、ＮｏｔＩ、ＡｐａＩおよびＳｃａＩの制限部位の線状配列を有する環状化したファージミドであるｐＣｏｍｂを形成した。連結したファージミドベクターをその後適切な細菌宿主に挿入し、抗生物質アンピシリン上で形質転換体を選択した。
【０１４７】
２つのＮｏｔＩ部位の存在について、選択したアンピシリン耐性形質転換体を検索した。得られたアンピシリン耐性結合ファージミドベクターをｐＣｏｍｂと命名し、その図示的構成を図７に示す。得られた結合ベクターｐＣｏｍｂは、２つの融合蛋白質を発現する２つのカセットを有し、５′から３′方向に列記する機能的に結合した次の要素：ＬａｃＺ遺伝子の上流の誘導性ＬａｃＺプロモーターよりなる第１のカセット、ＮｏｔＩ制限部位、リボソーム結合部位、ｐｅｌＢリーダー、スペーサー、５′Ｘｈｏおよび３′ＳｐｅＩ制限部位を境界とするクローン化領域、発現調節停止配列が後続するデカペプチドｔａｇ、発現調製リボソーム結合部位よりなる第２のカセットに対して５′に位置するＥｃｏＲＩ制限部位、ｐｅｌＢリーダー、スペーサー領域、発現調節停止配列および第２のＮｏｔＩ制限部位が後続する５′ＳａｃＩおよび３′ＸｂａＩ制限部位を境界とするクローン化領域についてのヌクレオチド残基配列を有するＤＮＡ分子よりなるものであった。
【０１４８】
ｐＣｏｍｂ２と命名したこの発明での使用に好適な結合ベクターは、ｐＣｏｍｂの調製について前記したようにファージミドＨｃ２およびファージミドＬｃ３の部分を組合せることにより構成する。得られる結合ベクターｐＣｏｍｂ２は、第２のカセット中の第２のＳｐｅＩ制限部位を除去した以外は、ｐＣｏｍｂと同様に２つの融合蛋白質を発現するｐＣｏｍｂと同一の２つのカセットを有するＤＮＡ分子よりなる。
ｂ．バクテリオファージコート蛋白質膜アンカーを有する融合蛋白質を発現させるベクターｐＣｏｍｂＶＩＩＩおよびｐＣｏｍｂＩＩＩの構築
多重エンドヌクレアーゼ制限クローン化部位により、前記調製したｐＣｏｍｂファージミド発現ベクターは、この発明の発現ベクターの調製のための修飾に有用なクローン化運搬体である。その目的のため、ｐＣｏｍｂをＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩにより消化し、その後ホスファターゼ処理を行って線状化したｐＣｏｍｂを製造する。
【０１４９】
（ｉ）ｐＣｏｍｂＶＩＩＩの調製
繊維状バクテリオファージコート蛋白質ＶＩＩＩ（ｃｐＶＩＩＩ）膜アンカードメインおよび付着ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ末端を特定するヌクレオチド配列を有する実施例２ｇで製造したＰＣＲ生成物を線状化したｐＣｏｍｂと混合して連結混合物を形成した。ｃｐＶＩＩＩ膜アンカーコードＰＣＲ断片を対応する付着末端でｐＣｏｍｂファージミド発現ベクターに方向性をもって連結し、この結果としてｐＣｏｍｂＶＩＩＩ（ｐＣｏｍｂ８とも命名）を形成した。ｐＣｏｍｂＶＩＩＩは、配列番号：１１６のヌクレオチド塩基１〜塩基２０８に示すヌクレオチド配列により特定されるカセットを含み、ｃｐＶＩＩＩ膜アンカーに機能的に結合したｐｅｌＢ分泌シグナルを含む。
【０１５０】
ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端を介してｃｐＶＩＩＩ膜アンカーコードＰＣＲ断片をｐＣｏｍｂ２ファージミド発現ベクターに方向性をもって連結することにより、ｐＣｏｍｂ２−ＶＩＩＩまたはｐＣｏｍｂ２−８と命名したこの発明で使用するのに好適なファージミド発現ベクターを前記したように調製した。ｐＣｏｍｂ２−８は、唯一のＳｐｅＩ制限部位を有していた。
（ｉｉ）ｐＣｏｍｂＩＩＩの調製
配列コードバクテリオファージｃｐＩＩＩ膜アンカードメインを使用し、別のファージミド発現ベクターを構成した。軽鎖の発現のための膜アンカーに対して３′のＬａｃＺプロモーター領域配列を含むｃｐＩＩＩ膜アンカーおよびＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端を特定するＰＣＲ生成物をｃｐＶＩＩＩについて記載したように調製した（その詳細は実施例２ｇに記載する）。唯一のＳｐｅＩ部位を有する線状化したｐＣｏｍｂ２ベクターにその後ｃｐＩＩＩ誘導ＰＣＲ生成物を連結してベクターｐＣｏｍｂ２−３を形成した（同様にｐＣｏｍｂ２−ＩＩＩと命名した）。
【０１５１】
ショートら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７５８３−７６００（１９８８）により記載されストラタジーンから市販されているｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）からの５１塩基対断片の添加により、ｐＣｏｍｂ−ＩＩＩ′またはｐＣｏｍｂ２−３′と命名した付加的な制限酵素クローン化部位を有するこの発明での使用に更に好適なファージミド発現ベクターを、ｐＣｏｍｂ２−３について前記したように調製した。ｐＣｏｍｂ２−３′を調製するため、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限酵素によりｐＣｏｍｂ２−３を最初に消化して線状化したｐＣｏｍｂ２−３を形成した。同じ酵素によりベクターｐブルースクリプトを消化し、制限酵素部位ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｓｔＩ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩを含む５１塩基対断片を放出させた。付着ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ末端を介して５１塩基対断片を線状化したｐＣｏｍｂ２−３ベクターに連結してｐＣｏｍｂ２−３′を形成した。
【０１５２】
ｃ．クロラムフェニコール耐性マーカーを有するｐＣＢＡＫベクターの構築
この発明のベクターにより形質転換された細菌の選択のためにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーセ（ＣＡＴ）のような異なる選択可能マーカー遺伝子を利用するため、ＣＡＴをコードする遺伝子を有するｐＣｏｍｂに基く発現ベクターを開発したが、これをｐＣＢＡＫベクターと命名する。ｐＣＢＡＫベクターはｐＣＢおよびｐＣｏｍｂの部分の組合せることにより調製する。
（ｉ）ｐＣＢの調製
以下に記載するようにｐブルースクリプトファージミドベクター、ｐＢＣＳＫ（−）およびｐＢＳＳＫ（−）（ストラタジーン）を修飾して組合せ、ｐＣＢと命名した第３のベクターを生成した。
クロラムフェニコール耐性選択可能マーカー遺伝子を含むｐＢＣＳＫ（−）をＢｓｔＢＩにより消化し、Ｔ４ポリメラーゼにより平滑末端とした。ＰｖｕＩによる第２の消化により１キロベース（ｋｂ）断片の除去を可能とし、ＣＡＴ選択可能耐性マーカー遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子の上流の誘導性ＬａｃＺプロモーターおよびＣｏｌＥ１開始点領域を保持した２．４ｋｂの線状化したベクターを残した。２．４ｋｂ断片を回収した。ｐＢＳＳＫ（−）ベクターをＡａｔＩＩにより消化し、Ｔ４ポリメラーゼにより平滑末端とした。ＰｖｕＩによる第２の消化により、ｆ１複製開始点を含む８００塩基対（ｂｐ）断片の単離を可能とした。ｐＢＳ誘導８００ｂｐｆ１断片と２．４ｋｂｐＢＣ断片との連結により、ＳａｃＩ部位、ｆ１複製開始点、ＣＡＴ選択可能耐性マーカー遺伝子、ＣｏｌＥ１開始点、Ｔ３およびＴ７プロモーターが隣接する多重クローン化部位（ＭＣＳ）、およびＬａｃＺ遺伝子の上流の誘導性ＬａｃＺプロモーターを含むｐＣＢ前駆体ベクターを生成した。
【０１５３】
その後ＳａｃＩによりｐＣＢ前駆体ベクターを消化し、Ｔ４ポリメラーゼにより平滑末端とした。その後Ｔ４ポリメラーゼ処理ｐＣＢベクターを連結してｐＣＢベクターを形成したが、ＳａｃＩ部位を欠失するものである。
（ｉｉ）ｐＣＢＡＫ０の調製
ＣＡＴ選択可能耐性マーカー遺伝子を含むｐＣＢベクターをＳａｃＩＩおよびＡｐａＩにより消化し、ホスファターゼにより処理して連結を防止して線状化したｐＣＢベクターを形成した。実施例１（ａ）（ｉｖ）で調製したｐＣｏｍｂベクターをＳａｃＩＩおよびＡｐａＩで制限消化し、ＬａｃＺプロモーターに対して５′で開始し第２のＮｏｔＩ部位の３′末端を過ぎて延在するヌクレオチド残基配列を含む断片を放出させた。ＳａｃＩＩおよびＡｐａＩｐＣｏｍｂＤＮＡ断片をその後同様に消化したｐＣＢベクターに方向性をもって連結してファージミド発現ベクターｐＣＢＡＫ０を形成した。好適なｐＣＢＡＫ発現ベクターはｐＣｏｍｂ２により構成される。得られたｐＣＢＡＫ発現ベクターは唯一のＳｐｅＩ制限部位を含んでいた。
【０１５４】
（ｉｉｉ）ｐＣＢＡＫ８の調製
発現した融合蛋白質中にバクテリオファージコート蛋白質膜アンカードメインをコードするｐＣＢＡＫに基くファージミド発現ベクターを調製するため、実施例１ｃ（ｉｉ）で調製したｐＣＢファージミドクローン化ベクターをＳａｃＩＩおよびＡｐａＩによる消化により線状化した。実施例１ｂ（ｉ）で調製したｐＣｏｍｂＶＩＩＩファージミド発現ベクターをＳａｃＩＩおよびＡｐａＩにより制限消化し、ＬａｃＺプロモーターに対して５′で開始し第２のＮｏｔ１部位の３′末端を過ぎて延在するヌクレオチド残基配列を含む断片を形成した。この断片を線状化したｐＣＢクローン化ベクターに方向性をもって連結してファージミド発現ベクターｐＣＢＡＫ８を形成した。
（ｉｖ）ｐＣＢＡＫ３の調製
ｐＣｏｍｂＩＩＩからのＳａｃＩＩおよびＡｐａＩ制限消化断片をＳａｃＩＩおよびＡｐａＩ線状化ｐＣＢクローン化ベクターと方向性をもって連結することにより、ｃｐＩＩＩ膜アンカードメインを有する融合蛋白質を発現するためのファージミド発現ベクターｐＣＢＡＫ３を同様に構成した。
【０１５５】
２．ファージ表面上で抗ＮＰＮヘテロ二量体を発現するためのジシストロン性発現ベクターの構成
この発明を実施するに際し、抗体の重（ＶＨおよびＣＨ１よりなるＦｄ）および軽（カッパ）鎖（ＶＬ、ＣＬ）は、ヘテロ二量体Ｆａｂ分子の集成のためにイー・コリのペリプラズムを最初に標的とする。ファージ表面上での抗体Ｆａｂライブラリーの発現を得るためには、繊維状バクテリオファージコート蛋白質膜アンカーをコードするヌクレオチド残基配列にＦｄまたは軽鎖をコードするヌクレオチド残基配列を機能的に結合させなければならない。膜アンカーを提供するに際してこの発明で使用するのに好適な２つのコート蛋白質はＶＩＩＩおよびＩＩＩである（それぞれｃｐＶＩＩＩおよびｃｐＩＩＩ）。ここに記載する実施例では、この発明の融合蛋白質中のｃｐＶＩＩＩまたはｃｐＩＩＩ膜アンカーにＦｄ鎖をコードするヌクレオチド残基配列を機能的に結合させる方法を記載する。ファージミドベクター中で、翻訳可能なＤＮＡ配列よりなる第１および第２のシストロンを機能的に結合してジシストロン性ＤＮＡ分子を形成する。融合蛋白質、Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩまたはＦｄ−ｃｐＩＩＩ、およびカッパ軽鎖の共働発現のために、ジシストロン性ＤＮＡ分子中のそれぞれのシストロンをＤＮＡ発現調節配列に結合する。
【０１５６】
第１のシストロンは、融合蛋白質、Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩまたはＦｄ−ｃｐＩＩＩに機能的に結合したペリプラズム分泌シグナル（ｐｅｌＢリーダー）をコードする。第２のシストロンは、カッパ軽鎖に機能的に結合した第２のｐｅｌＢリーダーをコードする。ｐｅｌＢリーダーの存在により、細菌細胞質からペリプラズムへの融合蛋白質および軽鎖の共働してはいるが別の分泌が促進される。
前記したプロセスを図８に図示的に示す。簡略には、ファージミド発現ベクターは、Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合体およびカッパ鎖に加えてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）選択可能耐性マーカー遺伝子を担持する。ｆ１ファージ複製開始点は一本鎖ファージミドの生成を促進する。Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合体（ＶＨ、ＣＨ１、ｃｐＶＩＩＩ）および軽鎖（ＶＬ、ＣＬ）をコードするジシストロン性メッセージのイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導発現により重鎖および軽鎖の形成が導かれる。それぞれの鎖はｐｅｌＢリーダー配列によりペリプラズム空間に分配され、これはその後開裂される。重鎖はｃｐＶＩＩＩ膜アンカードメインによって膜中に定置されるのに対し、軽鎖はペリプラズム中に分泌される。軽鎖の存在下に重鎖が集成してＦａｂ分子を形成する。その他膜アンカーを有する軽鎖融合蛋白質により軽鎖が定置され、ｐｅｌＢリーダーにより重鎖がペリプラズムに分泌される場合、同じ結果を達成することができる。
【０１５７】
ヘルパーファージと共にその後イー・コリに感染させると、繊維状バクテリオファージの集成が進行するため、図８および９に示すように繊維状ファージ粒子の全長さに沿ってコート蛋白質ＶＩＩＩが組込まれる。ｃｐＩＩＩを使用する場合はバクテリオファージの尾部で蓄積が起こる。ｃｐＩＩＩに対してｃｐＶＩＩＩ由来の膜アンカーの利用の利点は２倍である。第１に、管状列に集成した約２７００ｃｐＶＩＩＩ単量体よりなる結合部位の多重性が粒子表面に沿って存在する。第２に、構成体はファージの感染性を妨害しない。
ａ．ポリヌクレオチド選択
免疫グロブリン蛋白質ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は高度に可変性である。しかしながら、例えば軽鎖または重鎖のＶ領域ドメインに隣接し、実質的に保存されたヌクレオチド配列、すなわち同じプライマー配列にハイブリダイズし得る配列を含む保存された配列の幾つかの領域がある。したがって、保存された配列にハイブリダイズし、合成したＤＮＡ断片をベクターに機能的に結合するのに適切な制限部位を製造するＤＮＡ相同体に組込むポリヌクレオチド合成（増幅）プライマーを構成した。更に詳しくは、方向性をもった連結手段を含むベクターの領域で上流の翻訳可能なＤＮＡ配列とリーディングフレームを合せてこの発明の発現ベクターに製造する得られるＤＮＡ相同体を挿入することができるようにプライマーを設計する。
【０１５８】
（ｉ）Ｖ Ｈ プライマー
ＶＨ ドメインの増幅のため、ファージミドＨｃ２発現ベクターの独特のＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ部位への方向性をもった連結に適合した付着末端を導入するようにプライマーを設計する。たとえば、ＪＨ領域のｍＲＮＡに相補的であるように３′プライマー（表５〜６のプライマー１２Ａ）を設計した。全ての場合において、保存されたＮ末端領域（アンチセンス鎖）の第１の鎖ｃＤＮＡに相補的であるように５′プライマー（プライマー１〜１０、表５〜６）を選択した。５つの位置で縮退した３２のプライマーの混合物（プライマー１、表５〜６）を用いて最初に増幅を行った。混合プライマーを用いてハイブリドーマｍＲＮＡを増幅することができるが、脾臓由来のｍＲＮＡを増幅する最初の試みは変動する結果を与えた。したがって、混合した５′プライマーを使用する増幅の幾つかの代替を比較した。
【０１５９】
第１の代替は、混合したプライマープールの個々の構成員に対応する多数の独特のプライマー（その８つを表５に示す）を構成するものとした。５つの縮退位置の３つで２つの可能なヌクレオチドのいずれかを組込むことにより、表５の個々のプライマー２〜９を構築した。
第２の代替は、タカハシら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８２：１９３１−１９３５（１９８５）およびオーツカら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）の公開された研究に基き、可変位置の４つでイノシンを含むプライマー（プライマー１０、表５）を構成するものとした。このプライマーは、縮退しておらず、また同時にマーチンら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：８９２７（１９８５）に論じられたように保存されていない位置における不整合の陰性の効果を最小にする利点を有する。しかしながら、イノシンヌクレオチドが存在する結果クローン化ＶＨ領域での望まない配列の組込みに至り得るか否かは知られていなかった。したがって、制限部位の開裂の後に増幅された断片中に残る１つの位置にはイノシンは含まれていなかった。結果として、イノシンはクローン化挿入物中にはなかった。
【０１６０】
ガンマ１重鎖ｍＲＮＡの第１の不変領域ドメインの部分に相補的となるように独特の３′プライマーを含む更なるＶＨ増幅プライマーを設計した（プライマー１６および１７、表５）。これらのプライマーは、ＶＨ由来のアミノ酸および重鎖の第１の不変領域ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ相同体を生成し得る。したがって、これらのＤＮＡ相同体を使用してＦｖより寧ろＦａｂ断片を製造することができる。
ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＡのような免疫グロブリン重鎖の他のクラスの類似する領域にハイブリダイズするように更なる独特の３′プライマーを設計する。特定のクラスのＣＨ１不変領域の特定の領域にハイブリダイズし、異なるクラスの重鎖または軽鎖不変領域によりこのようなＶＨドメインを発現し得る発現ベクターにこのプライマーを使用して増幅したＶＨドメインを移すのに適合した他の３′プライマーも企図する。
【０１６１】
脾臓またはハイブリドーマｍＲＮＡからの増幅の対照として、不変領域ＩｇＧ、重鎖内の高度に保存された領域にハイブリダイズする一組のプライマーを構成した。５′プライマー（プライマー１１、表５）はＣＨ２領域のｃＤＮＡに相補的であるのに対し、３′プライマー（プライマー１３、表５）はＣＨ３領域のｍＲＮＡに対して相補的である。これらのプライマーとその鋳型との間には不整合はないと考えられる。
Ｆａｂの構成のための重鎖Ｆｄ断片の増幅に使用するプライマーを少なくとも表５に示す。８つの別の反応で増幅を行ったが、それぞれ５′プライマー（プライマー２〜９）の１つおよび３′プライマー（プライマー１６）の１つを含むものとした。単一反応で増幅に使用した残余の５′プライマーは、縮退プライマー（プライマー１）または４つの縮退位置でイノシンを取込むプライマー（プライマー１０、表５およびプライマー１７および１８、表６）である。残余の３′プライマー（プライマー１４、表６）を使用してＦｖ断片を構成した。多くの５′プライマーはＸｈｏＩ部位を組込み、ファージミドＨｃ２発現ベクターへのＶＨＤＮＡ相同体の挿入のために３′プライマーはＳｐｅＩ制限部位を取込む（図４）。
ヒト重鎖可変領域を増幅するように設計したＶＨ増幅プライマーを表６に示す。５′重鎖プライマーの１つは縮退ヌクレオチド位置にイノシン残基を含み、単一のプライマーが多数の可変領域配列にハイブリダイズするのを可能とする。種々のＩｇＧｍＲＮＡの不変領域配列にハイブリダイズするように設計したプライマーも表６に示す。
【０１６２】
（ｉｉ）Ｖ Ｌ プライマー
ＶＬＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は高度に可変である。しかしながら、ＪＬ、ＶＬフレーム構造領域およびＶＬリーダー／プロモーターを含むＶＬＣＤＲドメインに隣接する保存された配列の幾つかの領域がある。したがって、保存された配列にハイブリダイズし、ＳａｃＩおよびＸｂａＩにより切断したファージミドＬｃ２ベクターに増幅した断片をクローン化することを可能とする制限部位を組込む増幅プライマーを構成した。
ＶＬＣＤＲドメインの増幅のため、保存されたＮ末端領域において第１の鎖ｃＤＮＡに相補的となるように５′プライマー（表６のプライマー１〜８）を設計した。これらのプライマーによってもＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が導入され、ＶＬＤＮＡ相同体がファージミドＬｃ２発現ベクターにクローン化されるのが可能となった。ＪＬ領域のｍＲＮＡに相補的であり、ファージミドＬｃ２発現ベクターにＶＬＤＮＡ相同体を挿入するのに必要なＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するように３′ＶＬ増幅プライマー（表６のプライマー９）を設計した（図６）。
【０１６３】
カッパまたはラムダｍＲＮＡの不変領域にハイブリダイズするように更なる３′ＶＬ増幅プライマーを設計した（表６のプライマー１０および１１）。これらのプライマーにより、カッパまたはラムダ鎖の不変領域アミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むものとしてＤＮＡ相同体を製造するのが可能となる。これらのプライマーにより、Ｆｖより寧ろＦａｂ断片を製造するのが可能となる。
Ｆａｂの構成のためにカッパ軽鎖配列の増幅に使用するプライマーを少なくとも表６に示す。これらのプライマーによる増幅を５つの別の反応で行ったが、それぞれ５′プライマー（プライマー３〜６および１２）の１つおよび３′プライマー（プライマー１３）をの１つ含むものとした。残余の３′プライマー（プライマー９）を使用してＦｖ断片を構成した。５′プライマーはＳａｃＩ制限部位を含み、３′プライマーはＸｂａＩ制限部位を含む。
ラムダおよびカッパイソタイプの両者のヒト軽鎖可変領域を増幅するように設計したＶＬ増幅プライマーも表６に示す。
表３〜７に示すものを含むここに記載する全てのプライマーおよび合成ポリヌクレオチドは、フンツビレ、アラバマのリサーチ・ジェネティクスから購入したものか、製造業者の指針を使用してアプライド・バイオシステムスＤＮＡ合成装置、モデル３８１Ａにより合成したものとした。
【０１６４】
Figure 0004108430
【０１６５】
Figure 0004108430
【０１６６】
Figure 0004108430
【０１６７】
Figure 0004108430
【０１６８】
Figure 0004108430
【０１６９】
表５に列記した１９のプライマーは配列表に列記したが、次の配列番号により命名した：
（１）＝配列番号：４０
（２）＝配列番号：４１
（３）＝配列番号：４２
（４）＝配列番号：４３
（５）＝配列番号：４４
（６）＝配列番号：４５
（７）＝配列番号：４６
（８）＝配列番号：４７
（９）＝配列番号：４８
（１０）＝配列番号：４９
（１１）＝配列番号：５０
（１２）＝配列番号：５１
（１２Ａ）＝配列番号：５２
（１３）＝配列番号：５３
（１４）＝配列番号：５４
（１５）＝配列番号：５５
（１６）＝配列番号：５６
（１７）＝配列番号：５７
（１８）＝配列番号：５８
表６に「（１）」〜「（４０」として列記した４０のプライマーも、それぞれ配列番号：５９で始まり配列番号：９８までとして配列表に個々に順に列記した。
ｂ．免疫グロブリン可変ドメインをコードする遺伝子のレパートリーの調製
この発明の方法によりヘテロ二量体受容体を調製する際の受容体結合のためのリガンドとしてニトロフェニルホスホンアミデート（ＮＰＮ）を選択した。
スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）をＮＰＮに接合させ、マウスを免疫化して抗ＮＰＮ免疫応答を生成するのに使用するＮＰＮ−ＫＬＨを形成し、これによりリガンド特異的ヘテロ二量体受容体遺伝子の供給源を作成した。
【０１７０】
ジメチルホルムアミド中に２．５ｍｇのＮＰＮを含む２５０μｌの溶液と０．０１モル（Ｍ）リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中に２ｍｇのＫＬＨを含む７５０μｌの溶液とを混合することにより、ＮＰＮ−ＫＬＨ接合物を調製した。回転攪拌棒によりＫＬＨ溶液を攪拌しつつＮＰＮ溶液をＫＬＨ溶液にゆっくり添加することにより、２つの溶液を混合した。その後４℃で１時間同じ攪拌で混合物を維持して接合を進行させた。セファデックスＧ−２５によるゲルろ過により非接合ＮＰＮおよびＫＬＨから、接合したＮＰＮ−ＫＬＨを単離した。単離したＮＰＮ−ＫＬＨは以下に記載するようにマウスに注射した。
１００μｇの接合物を２５０μｌのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に添加することにより、マウスへの注射のためにＮＰＮ−ＫＬＨ接合物を調製した。等容量の完全フロインドアジュバントを添加し、全溶液を５分間乳化した。１２９ＧＩｘ＋マウスに３００μｌの乳化物を注射した。２１ゲージ針を使用して幾つかの部位で皮下に注射した。ＮＰＮ−ＫＬＨによる２回目の免疫を２週間後に行った。この注射物は次のように調製した：５０マイクログラム（μｇ）のＮＰＮ−ＫＬＨを２５０μｌのＰＢＳで希釈し、等容量のミョウバンをＮＰＮ−ＫＬＨ溶液と混合した。２３ゲージ針を使用して５００μｌの溶液をマウスに腹膜内注射した。１か月後、ＰＢＳ中で２００μｌに希釈した５０μｇのＮＰＮ−ＫＬＨ接合物の最終注射をマウスに行った。この注射は、３０ゲージ針を使用して側部尾部静脈で静脈内に行った。この最後の注射の５日後にマウスを屠殺し、その脾臓から全細胞ＲＮＡを単離した。
【０１７１】
チョムクジンスキーら、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７）により記載されたＲＮＡ調製方法を使用し、製造業者の指針に従いＲＮＡ単離キット（ストラタジーン）を使用して、前記したようにＫＬＨ−ＮＰＮにより免疫化した単一のマウスの脾臓から全細胞ＲＮＡを調製した。簡略には、免疫化したマウスから脾臓を除去した直後に、４．０Ｍグアニンイソチオシアネート、ｐＨ７．０の０．２５Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．１Ｍのβ−メルカプトエタノールを含む１０ｍｌの変性溶液中でガラスホモジナイザーを使用して組織をホモジナイズした。ｐＨ４．０で２Ｍの濃度の１ｍｌの酢酸ナトリウムをホモジナイズした脾臓と混合した。ホモジナイズした脾臓を含む変性溶液には予めＨ２Ｏで飽和させた１ｍｌのフェノールも混合した。２ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）混合物をこのホモジネートに添加した。ホモジネートを１０秒間激しく混合し、氷上で１５分間維持した。その後ホモジネートを厚い壁の５０ｍｌポリプロピレン遠心分離チューブ（フィッシャー・サイエンティフィック社、ピッツバーグ、ＰＡ）に移した。この溶液を１０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した。上部ＲＮＡ含有水層を新しい５０ｍｌのポリプロピレン遠心分離チューブに移し、等容量のイソプロピルアルコールと混合した。この溶液を−２０℃で少なくとも１時間維持してＲＮＡを沈殿させた。沈殿したＲＮＡを含む溶液を１０，０００×ｇで２０分間４℃で遠心分離した。ペレット化した全細胞ＲＮＡを集め、前記した３ｍｌの変性溶液に溶解させた。３ｍｌのイソプロピルアルコールを再懸濁した全細胞ＲＮＡに添加して激しく攪拌した。この溶液を−２０℃で少なくとも１時間維持してＲＮＡを沈殿させた。沈殿したＲＮＡを含む溶液を１０，０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離した。７５％エタノールを含む溶液でペレット化したＲＮＡを１回洗浄した。ペレット化したＲＮＡを真空下に１５分間乾燥させ、その後ジメチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理（ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ）Ｈ２Ｏに再懸濁した。
【０１７２】
「分子クローン化：実験室マニュアル」、マニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２）に記載された方法を使用し、長いポリＡ域を含む配列について集積したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を全細胞ＲＮＡから調製した。簡略には、前記したように調製した単一の免疫化したマウス脾臓から単離した全ＲＮＡの半分を１ｍｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏに再懸濁し、６５℃で５分間維持した。１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタンヒドロクロリド）、１Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ｐＨ７．５の２．０ｍＭエチレンジアミン二ナトリウム四酢酸（ＥＤＴＡ）、および０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）よりなる１ｍｌの２×高塩装填緩衝液を再懸濁したＲＮＡに添加し、混合物を室温に冷却した。０．１Ｍ水酸化ナトリウムおよび５ｍＭＥＤＴＡを含む溶液でオリゴｄＴを洗浄した後にＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏでカラムを平衡化するとにより予め調製したオリゴｄＴ（コラボラティブ・リサーチタイプ２またはタイプ３）カラムにその後混合物を装填した。殺菌したポリプロピレンチューブに溶出物を集め、溶出物を６５℃で５分間加熱した後に同じカラムに再装填した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５の１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含む２ｍｌの高塩装填緩衝液を用いてその後オリゴｄＴカラムを洗浄した。５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳよりなる２ｍｌの１×中塩緩衝液を用いてその後オリゴｄＴカラムを洗浄した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、ｐＨ７．５、のｍＭＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＤＳよりなる１ｍｌの緩衝液を用いてメッセンジャーＲＮＡをオリゴｄＴカラムから溶出させた。フェノール／クロロホルムでこの溶液を抽出した後に１００％クロロホルムで一回抽出することによりメッセンジャーＲＮＡを精製した。エタノール沈殿によりメッセンジャーＲＮＡを濃縮し、ＤＥＰＣＨ２Ｏに再懸濁した。
前記プロセスにより単離したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、複数の異なるＶＨコードポリヌクレオチド、すなわち約１０４を越える異なるＶＨコード遺伝子を含み、類似する数のＶＬコード遺伝子を含む。よって、ｍＲＮＡ集団は可変領域コード遺伝子のレパートリーを表す。
【０１７３】
ｃ．ＤＮＡ相同体の調製
ＰＣＲ増幅のための調製に際し、プライマー延長反応によるｃＤＮＡ合成のための鋳型として前記調製したｍＲＮＡを使用する。典型的な５０μｌ転写反応物中で、水中の５〜１０μｇの脾臓ｍＲＮＡを５００ｎｇ（５０．０ｐｍｏｌ）の３′ＶＨプライマー（プライマー１２Ａ、表５〜６）と６５℃で５分間最初にハイブリダイズ（アニール）させる。その後、１．５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、８ｍＭＭｇＣｌ２、５０ｍＭＮａＣｌおよび２ｍＭスペルミジンに混合物を調整する。モロニーネズミロイケミアウィルス逆転写酵素（ストラタジーン）２６単位を添加し、溶液を１時間３７℃に維持する。
逆転写反応の生成物（約５μｇのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）、３００ｎｇの３′ＶＨプライマー（表５〜６のプライマー１２Ａ）、３００ｎｇのそれぞれの５′ＶＨプライマー（表５〜６のプライマー２〜１０）、２００ｍＭのｄＮＴＰの混合物、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１５ｍＭＭｇＣｌ２、０．１％ゼラチンおよび２単位のサーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（ペルキン・エルマー・シータス、エメリービレ、カリホルニア）を含む１００μｌ反応物中でＰＣＲ増幅を行う。反応混合物にミネラルオイルを重層し、４０サイクルの増幅に供する。それぞれの増幅サイクルは、９２℃で１分間の変性、５２℃で２分間のアニール、および７２℃で１．５分間のプライマー延長（伸長）によるポリヌクレオチド合成を含む。増幅したＶＨコードＤＮＡ相同体含有サンプルは、その後フェノール／クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１ｍＭＥＤＴＡ中で−７０℃で保存する。
【０１７４】
独特の５′プライマー（２〜９、表５）を使用し、脾臓ｍＲＮＡからの効率的なＶＨコードＤＮＡ相同体合成および増幅をアガロースゲル電気泳動により示されるように行う。増幅したｃＤＮＡ（ＶＨコードＤＮＡ相同体）は、予期される大きさ（３６０ｂｐ）の主要バンドとして認められた。それぞれの反応における増幅したＶＨコードポリヌクレオチド断片の量は類似しており、これらのプライマーの全ては増幅を開始するに際してほぼ同等に効率的であったことを示す。これらのプライマーによる増幅の収率および質は再現性がある。
イノシンを含むプライマーによっても脾臓ｍＲＮＡから増幅されたＶＨコードＤＮＡ相同体が再現性良く合成され、他の増幅されるｃＤＮＡに類似する強度の予期される大きさの断片の製造が導かれる。イノシンが存在しても効率的なＤＮＡ相同体合成および増幅が可能であり、この種のプライマーが複数のＶＨコードＤＮＡ相同体を精製するのに有用であることを明らかに示す。不変領域プライマー（プライマー１１および１３、表５）から取得した増幅生成物はより強く、恐らく鋳型とプライマーとの間の相同性の程度が高いために増幅がより効率的であることを示す。前記手順に従い、それぞれ異なる５′プライマーを用いて行った８つの増幅の生成物からＶＨコード遺伝子ライブラリーを構成する。それぞれのプライマー延長反応からの生成物の等しい部分を混合し、その後混合した生成物を使用してＶＨコードＤＮＡ相同体含有ベクターのライブラリーを生成する。
【０１７５】
ＶＬのＤＮＡ相同体も前記したように調製した精製したｍＲＮＡから調製する。ＰＣＲ増幅のための調製に際し、前記例により調製したｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。典型的な５０μｌ転写反応では、水中の５〜１０μｇの脾臓ｍＲＮＡを３００ｎｇ（５０．０ｐｍｏｌ）の３′ＶＬプライマー（プライマー１４、表５）と６５℃で５分間最初にアニールさせる。その後、１．５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、８ｍＭＭｇＣｌ２、５０ｍＭＮａＣｌおよび２ｍＭスペルミジンに混合物を調整する。モロニーネズミロイケミアウィルス逆転写酵素（ストラタジーン）２６単位を添加し、溶液を１時間３７℃に維持する。前記したように製造した約５μｇのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、３００ｎｇの３′ＶＬプライマー（表５のプライマー１４）、３００ｎｇの５′ＶＬプライマー（表５のプライマー１６）、２００ｍＭのｄＮＴＰの混合物、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１５ｍＭＭｇＣｌ２、０．１％ゼラチンおよび２単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１００μｌ反応物中でＰＣＲ増幅を行う。反応混合物にミネラルオイルを重層し、４０サイクルの増幅に供する。それぞれの増幅サイクルは、９２℃で１分間の変性、５２℃で２分間のアニール、および７２℃で１．５分間の伸長によるポリヌクレオチド合成を含む。増幅したサンプルは、その後フェノール／クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１ｍＭＥＤＴＡ中で−７０℃で保存する。
【０１７６】
ｄ．ＤＮＡ発現ベクターへのＤＮＡ相同体の挿入
ＶＨ配列において集積した発現ライブラリーを調製するため、同じ一組の５′プライマーを使用するが３′プライマーとしてプライマー１２Ａ（表５）を用いて、ＶＨ配列において集積したＤＮＡ相同体を実施例２ｃにしたがって調製する。得られるＰＣＲ増幅生成物（２．５μｇ／３０μｌの１５０ｍＭＮａＣｌ、８ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６ｍＭＭｇＳＯ４、１ｍＭＤＴＴ、２００μｇ／ｍｌＢＳＡ）を制限酵素ＸｈｏＩ（１２５単位）およびＳｐｅＩ（１２５単位）により３７℃で消化する。増幅反応の生成物の混合物を必要とするクローン化実験では、それぞれの反応混合物の等容量（５０μｌ、１〜１０μｇ濃度）を増幅の後で制限消化の前に組合せた。「分子クローン化実験室マニュアル」、マニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２）に記載された標準的な電気泳動溶出技術を使用し、１％アガロースゲル上でＶＨ相同体を精製する。消化したＰＣＲ増幅脾臓ｍＲＮＡのゲル電気泳動の後、約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を含むゲルの領域を切出し、透析膜に電気泳動溶出し、エタノール沈殿し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１ｍＭＥＤＴＡを含むＴＥ溶液に再懸濁して５０ｎｇ／μｌの最終濃度とした。得られるＶＨＤＮＡ相同体は、ベクターラムダＨｃ２への方向性をもった連結に適合した付着末端を有するポリペプチド遺伝子のレパートリーを表す。これらの調製したＶＨＤＮＡ相同体は、以下に記載するように調製する線状化したラムダＨｃ２発現ベクターに方向性をもった連結によりその後直接挿入する。
【０１７７】
２５０単位のそれぞれの制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（両者ともベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ製）および製造業者により推奨された緩衝液を含む溶液に１００μｇのこのＤＮＡを混合することにより、ＤＮＡ相同体を挿入するためにラムダＨｃ２発現ＤＮＡベクターを調製する。この溶液を３７で１．５時間維持する。溶液を６５℃で１５分間加熱して制限エンドヌクレアーゼを不活性化させる。溶液を３０℃に冷却し、製造業者の仕様に従って２５単位の熱失活性（ＨＫ）ホスファターゼ（エピセンター、マジソン、ＷＩ）およびＣａＣｌ２をこれに混合する。この溶液を３０℃で１時間維持する。フェノールおよびクロロホルムの混合物で溶液を抽出することによりＤＮＡを精製し、その後エタノール沈殿を行う。ここでラムダＨｃ２発現ベクターは、前記例で調製したＶＨＤＮＡ相同体への連結のための準備が整う。３モルのＶＨＤＮＡ相同体挿入物と各モルのＨｃ２発現ベクターとを５℃で一夜連結することにより、前記調製したＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限消化ラムダＨｃ２発現ベクターにこれらの調製したＶＨＤＮＡ相同体をその後直接挿入する。ギガパックＩＩボールド（ストラタジーン）を用いてＤＮＡをパッケージした後に約３．０×１０５のプラーク形成単位が得られ、その５０％が組換え体である。製造業者の仕様にしたがってギガパック・ゴールドＩＩパッケージ抽出物（ストラタジーン）を使用し、ＶＨＤＮＡ相同体を含む連結混合物をパッケージする。得られるラムダＨｃ２発現ライブラリーをその後ＸＬ１ブルー細胞に形質転換する。
【０１７８】
ＶＬ配列において集積したライブラリーを調製するため、実施例２ｃにしたがってＶＬ配列において集積したＰＣＲ増幅生成物を調製する。これらのＶＬＤＮＡ相同体を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩにより消化し、ＶＨＤＮＡ相同体について前記したように消化したＶＬＤＮＡ相同体を１％アガロースゲル上で精製し、方向性をもった連結に適合したＶＬポリペプチド遺伝子のレパートリーを形成する。ラムダＨｃ２について記載したように制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩにより予め消化したラムダＬｃ２発現ベクターに調製したＶＬＤＮＡ相同体をその後方向性をもって連結する。ＶＬＤＮＡ相同体を含む連結混合物をパッケージし、前記したようにラムダＬｃ２発現ライブラリーを形成し、ＸＬ１ブルー細胞上にプレート処理するのに準備が整ったものとする。
【０１７９】
ｅ．同一の発現ベクター上におけるＶ Ｈ およびＶ Ｌ ＤＮＡ相同体のランダムな結合
重鎖および軽鎖を発現する２つのシストロンを発現するベクターを含むライブラリーの構成は２つの工程で行う。第１の工程では、記載したようにＮＰＮ−ＫＬＨで免疫化したマウスから得た遺伝子レパートリーを使用し、別の重鎖および軽鎖ライブラリーをそれぞれ発現ベクターラムダＨｃ２およびラムダＬｃ２で構成する。第２の工程では、それぞれのベクターに存在する非対称ＥｃｏＲＩ部位でこれら２つのライブラリーを組合せる。この結果クローンのライブラリーが得られ、そのそれぞれは潜在的に重鎖および軽鎖を同時発現する。実際の組合せは無作為であり、親動物のＢ細胞集団に存在する組合せを必ずしも反映しない。
前記免疫化（実施例２ｂ）の結果得られる脾臓ｍＲＮＡを単離して使用し、ラムダＨｃ２発現ベクターを使用してＶＨ遺伝子配列の一次ライブラリーを生成する。一次ライブラリーは１．３×１０６のプラーク形成単位（ｐｆｕ）を含み、デカペプチドｔａｇの発現について検索してＶＨおよびＣＨ１（Ｆｄ）配列を発現するクローンの百分率を決定することができる。このペプチドの配列は、ベクターへのＦｄ（またはＶＨ）断片のクローン化に続く発現のためのフレームにあるのみである。ライブラリーのクローンの少なくとも８０％が、デカペプチドｔａｇの免疫検出に基くＦｄ断片を発現する。
【０１８０】
重鎖と同様の様式で構成した軽鎖ライブラリーは２．５×１０６の構成員を含む。抗カッパ鎖抗体を使用するプラーク検索は、ライブラリーに含まれる６０％が軽鎖挿入物を発現することを示す。挿入物の百分率が小さいのは、ＳａｃＩおよびＸｂａＩによる開裂の後のベクターの不完全な脱リン酸化に起因する。
一旦取得したならば、２つのライブラリーを使用してこれらをＥｃｏＲＩ部位で交差させることにより結合ライブラリーを構成する。交差を行うため、それぞれのライブラリーからＤＮＡを最初に精製する。
【０１８１】
実施例２ｄで調製したラムダＬｃ２ライブラリーを増幅し、「分子クローン化：実験室マニュアル」、マニアティスら編、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２）に記載された手順を使用して増幅したファージストックから５００μｇのラムダＬｃ２発現ライブラリーファージＤＮＡを調製する。エンドヌクレアーゼ製造業者により供給された２００μｌの緩衝液中に１００単位のＭＬｕＩ制限エンドヌクレアーゼ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）を含む溶液中に３７℃で１．５時間、５０μｇのこの増幅した発現ライブラリーファージＤＮＡを維持する。その後フェノールおよびクロロホルムの混合物により溶液を抽出する。その後ＤＮＡをエタノール沈殿し、１００μｌの水に再懸濁する。製造業者により特定された成分を含む最終容量２００μｌの緩衝液中で、この溶液を１００単位の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ベーリンガー）と混合する。この溶液を３７℃で１．５時間維持し、その後フェノールおよびクロロホルムの混合物によりこの溶液を抽出する。ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ＤＮＡをＴＥに再懸濁する。
【０１８２】
実施例２ｄで調製したラムダＨｃ２発現ライブラリーを増幅し、前記詳述した方法を使用して５００μｇのラムダＨｃ２発現ライブラリーファージＤＮＡを調製する。エンドヌクレアーゼ製造業者により供給された２００μｌの緩衝液中に１００単位のＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ（ベーリンガー）を含む溶液中で３７℃で１．５時間、５０μｇのこの増幅したライブラリーファージＤＮＡを維持する。０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５により飽和したフェノールおよびクロロホルムの混合物を用いてその後溶液を抽出する。その後ＤＮＡをエタノール沈殿させ、１００μｌの水に再懸濁する。製造業者により特定された成分を含む最終容量２００μｌの緩衝液中で、この溶液を１００単位の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ベーリンガー）と混合する。この溶液を３７℃で１．５時間維持し、その後フェノールおよびクロロホルムの混合物によりこの溶液を抽出する。ＤＮＡをエタノール沈殿させ、ＤＮＡをＴＥに再懸濁する。
【０１８３】
制限消化したＨｃ２およびＬｃ２発現ライブラリーを互いに連結する。その目的のため、連結キット（ストラタジーン）で供給された試薬を使用し、１μｇのＨｃ２および１μｇのＬｃ２ファージライブラリーＤＮＡよりなるＤＮＡ混合物を１０μｌ反応物中で調製する。ＤＮＡ混合物を４５℃に５分間加温し、再アニールし得た全ゆる付着末端を融解する。その後混合物を０℃に冷却して再連結を防止する。バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（エキソヌクレアーゼ耐性検定で決定したものとして０．０２単位と等価な０．１ウエイス単位）を、１μｌの５ｍＭＡＴＰおよび１μｌの１０×バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５０ｍＭＭｇＣｌ２、５０ｍＭＤＴＴおよび５００μｇ／ｍｌＢＳＡを混合することにより１０×緩衝液を調製する）と共に冷却したＤＮＡ溶液に混合して連結混合物を形成する。４℃で１６時間の連結の後、ギカパック・ゴールドＩＩパッケージ抽出物を用いて１μｌの連結したファージＤＮＡをパッケージし、製造業者の指針に従って調製したＸＬ１ブルー細胞上にプレート処理し、ＮＰＮ免疫化マウスから誘導した重鎖および軽鎖を発現し得るジシストロン性発現ベクターのラムダファージライブラリーを形成する。取得したクローンの一部を使用して組合せの有効性を決定する。
【０１８４】
ｆ．抗ＮＰＮ反応性ヘテロ二量体生成ジスシトロン性ベクターの選択
前記実施例２ａで調製した結合Ｆａｂ発現ライブラリーを検素し、ＮＰＮに対する親和力を有するクローンを同定した。軽鎖および重鎖断片を同時発現するファージクローンの頻度を決定するために、軽鎖、重鎖および結合ライブラリーの複製***を前記したように軽鎖および重鎖発現について検索した。約５００組換えファージのこの検討において、約６０％が軽鎖および重鎖蛋白質を同時発現した。
３つの全てのライブラリー、軽鎖、重鎖および結合したものを検索し、これらがＮＰＮに結合する抗体断片を発現する組換えファージを含むか否かを決定した。典型的な手順では、３０，０００のファージをＸＬ１ブルー細胞上にプレート処理し、１２５Ｉ標識ＢＳＡに共役したＮＰＮに対する結合についてニトロセルロースによる複製***を検索した。ボルトンら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：５２９−５３４（１９７３）により記載されたクロラミンＴ法に従ってＢＳＡをヨウ素化した。軽鎖ライブラリー由来の８０，０００の組換えファージおよび重鎖ライブラリー由来のより少数のものの複製検索では、抗原に結合するクローンは何ら同定されなかった。これに対して、Ｆａｂ発現ライブラリー由来の同様な数のクローンの検索では、ＮＰＮに結合する多くのファージプラークが同定された。この観察は、軽鎖と組合せた多くの重鎖が抗原に結合する条件下同じ重鎖または軽鎖単独では起こらないことを示す。したがって、ＮＰＮの場合、それぞれ特定の軽鎖および重鎖と組合せた場合にのみ抗原に結合する多くの重鎖および軽鎖があると考えられる。
【０１８５】
多数のクローンを検索する能力を評価し、結合ライブラリーにおける抗原結合クローンの頻度のより定量的な予測を得るため、百万のファージプラークを検索し、抗原に結合する約１００のクローンを同定した。ＮＰＮに結合すると考えられた６つのクローンについて、６つの陽性および約２０の周囲のバクテリオファージプラークを含むプレートの領域を選択し、それぞれのプラークを抜取り、再プレート処理し、複製***により検索した。予期されたように、２０のファージの内ほぼ１つが抗原に特異的に結合した。陰性と考えられたプレート処理したファージの領域の核は再プレート処理の際に陽性ではなかった。
【０１８６】
ＮＰＮと反応したファージの１つであるクローン２ｂを生体内切出し手順に従って切出したが、この場合２００μｌのファージストックおよび２００μｇのＣＬ１ブルーのＦ＋誘導体（Ａ６００＝１．００）（ストラタジーン）を１μｌのＭ１３ｍｐ８ヘルパーファージ（１×１０１０ｐｆｕ／ミリリットル（ｍｌ））と混合し、３７℃で１５分間維持した。ルリア・ベータニ（ＬＢ）培地中で４時間維持し、７０℃で２０分間加熱してＸＬ１ブルー細胞を熱失活させた後、ファージミドをＸＬ１ブルー細胞に再感染させ、アンピシリンを含むＬＢプレートにプレート処理した。この手順によりクローン化挿入物がラムダＺａｐＩＩベクターからプラスミドベクターに変換され、容易な操作および配列決定（ストラタジーン）が可能となった。製造業者の指針に従って配列決定キットを使用し（ＵＳバイオケミカル社、クリーブランド、オハイオ）、サンガーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６３−５４６７（１９７７）に記載されたサンガーのジデオキシ法を使用し、ＶＨおよびＶＬの一部をコードするファージミドＤＮＡをＤＮＡ配列決定によりその後決定した。クローン２ｂＦｄ鎖のヌクレオチド残基配列を配列番号：９９として配列列記に列記する。カッパ軽鎖可変および不変領域のヌクレオチド残基配列は、それぞれ配列番号：１００および配列番号：１０１として配列列記に列記する。
【０１８７】
ｇ．繊維状ファージコート蛋白質膜アンカーをコードするＤＮＡ配列の調製
ｃｐＶＩＩＩ膜アンカー：ｃｐＶＩＩＩをコードする遺伝子を単離する供給源として、市販のバクテリオファージベクターＭ１３ｍｐ１８（ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュー・ジャージー）を使用した。配列番号：１０２として配列表に列記したｃｐＶＩＩＩの膜アンカードメインをコードする遺伝子の配列をＰＣＲ増幅により修飾し、制限エンドヌクレアーゼ部位ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＩ部位の前の２つの停止コドンを組込んだ。ｃｐＶＩＩＩの膜アンカードメインの対応するアミノ酸残基配列を配列番号：１７に列記する。
修飾したｃｐＶＩＩＩを調製するため、Ｍ１３ｍｐ１８からの複製形態ＤＮＡを最初に単離した。簡略には、２ｍｌのＬＢ（ルリア・ベータニ培地）中、５０μｌのＦ′エピゾームを担持する細菌株の培養物（ＪＭ１０７、ＪＭ１０９またはＴＧ１）に単一プラークから誘導した１０分の１懸濁物のバクテリオファージ粒子を混合した。一定攪拌しつつ混合物を３７℃で４〜５時間インキュベートした。その後混合物を１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、感染した細菌をペレット化した。上澄を除去した後、１００μｌの氷***液Ｉ中で激しくボルテックス処理することによりペレットを再懸濁した。溶液Ｉは、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴＡおよび２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を混合し、１５分間オートクレーブすることにより調製した。
【０１８８】
細菌懸濁物に対して２００μｌの新たに調製した溶液ＩＩを混合し、チューブを迅速に５回反転させた。溶液ＩＩは０．２ＮＮａＯＨおよび１％ＳＤＳを混合することにより調製した。細菌懸濁物、１５０μｌの氷***液ＩＩＩを混合し、倒立位置で１０秒間穏やかにチューブをボルテックス処理し、粘稠な細菌溶解物に溶液ＩＩＩを分散させた。溶液ＩＩＩは、６０ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム、１１．５ｍｌの氷酢酸および２８．５ｍｌの水を混合することにより調製した。その後得られた細菌溶解物を氷上に５分間保存し、その後ミクロ遠心中で１２，０００×ｇで５分間４℃で遠心分離した。得られた上澄を回収し、新しいチューブに移した。上澄に対して等容量のフェノールクロロホルムを添加し、混合物をボルテックス処理した。その後混合物をミクロ遠心中で１２，０００×ｇで２分間遠心分離した。得られた上澄を新しいチューブに移し、２容量のエタノールを用いて室温で二本鎖バクテリオファージＤＮＡを沈殿させた。混合物を室温に２分間放置した後、混合物を遠心分離してＤＮＡをペレット化させた。上澄を除去し、ペレット化した複製形態ＤＮＡを２５μｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６および１０ｍＭＥＤＴＡ（ＴＥ）に再懸濁した。
【０１８９】
二本鎖Ｍ１３ｍｐ１８複製形態ＤＮＡをその後ＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーＡＫ５（配列番号：１０３）およびＡＫ６（配列番号：１０４）（その配列は以下の表７に列記する）をＰＣＲ反応で使用し、ｃｐＶＩＩＩ膜アンカードメインの成熟遺伝子を増幅し、２つのクローン化部位ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩを組込んだ。ＰＣＲ反応のため、１ｎｇのＭ１３ｍｐ１８複製形態ＤＮＡを含む２μｌを、０．５ｍｌミクロ遠心チューブ中で市販品を購入した（プロメガ・バイオテク、マジソン、ウイスコンシン）１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液と混合した。ＤＮＡ混合物に対して８μｌのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の２．５ｍＭ溶液を混合し、結果として２００マイクロモル（μＭ）の最終濃度とした。３μｌ（６０ピコモル（ｐＭ）と等価）の５′前方ＡＫ５プライマーおよび３μｌ（６０ｐＭ）の３′後方ＡＫ６プライマーをＤＮＡ溶液に混合した。この混合物に７３μｌの滅菌水および１μｌ／５単位のポリメラーゼ（プロメガ・バイオテク）を添加した。２滴のミネラルオイルを混合物の頂部に載置し、繰返し４０回のＰＣＲ増幅をサーモサイクラー中で行った。この増幅サイクルは５２℃で２分間、７２℃で１．５分間および９１℃で２分間よりなるものとした。Ｍ１３ｍｐ１８含有サンプルから得たＰＣＲ修飾ｃｐＶＩＩＩ膜アンカードメインＤＮＡ断片をジーン・クリーン（ＢＩＯ１０１、ラ・ジョラ、カリホルニア）により精製し、フェノール／クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽出し、その後エタノール沈殿させ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１ｍＭＥＤＴＡ中で−７０℃で保存した。
【０１９０】
Figure 0004108430
【０１９１】
Ｆ：前方プライマー
Ｂ：後方プライマー
１：５′から３′：ＣＨ１３′末端について重複する配列に二本下線を付す。ＳｐｅＩ制限部位配列に一本下線を付す。ｃｐＶＩＩＩについて重複する配列に二本下線を付す
２：ＥｃｏＲＩ制限部位配列に一本下線を付す
３：ＸｈｏＩ制限部位配列に下線を付す
４：５′から３′：ｃｐＶＩＩＩについて重複する配列に二本下線を付す。ＳｐｅＩ制限部位配列に一本下線を付す。ＣＨ１３′末端について重複する配列に二本下線を付す
５：５′から３′：ＳｐｅＩ制限部位配列に一本下線を付す。ｃｐＩＩＩの５′末端を有する重複配列に二本下線を付す
６：５′から３′：ＮｈｅＩ制限部位配列に一本下線を付す。ｃｐＩＩＩの３′末端を有する重複配列に二本下線を付す
７：５′から３′：ｃｐＩＩＩの３′末端を有する重複配列に二本下線を付す。ＮｈｅＩ制限配列は位置４のヌクレオチド残基「Ｇ」で開始し、更に５残基＝ＧＣＴＡＧＣ延在する
８：ＥｃｏＲＩ軽減部位配列に一本下線を付す
９：ＬａｃＺを増幅するための他の後方プライマー。ＥｃｏＲＩ制限部位配列に一本下線を付す。
【０１９２】
修飾したｃｐＶＩＩＩ膜アンカードメインの増幅を確認するため、ＰＣＲ精製ＤＮＡ生成物を１％アガロースゲル中で電気泳動した。ｃｐＶＩＩＩの予期される大きさは約１５０塩基対であった。修飾ｃｐＶＩＩＩＤＮＡ断片を含むアガロース中の領域を前記したようにアガロースから単離した。単離した修飾ｃｐＶＩＩＩＤＮＡ断片の配列を配列番号：１１１として列記する。その後単離したｃｐＶＩＩＩＤＮＡ断片と実施例２ｉに後記するように同様に調製した修飾Ｆｄの断片とを混合し、融合蛋白質Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩをコードするＤＮＡ断片の形成を図った。
ｃｐＩＩＩ膜アンカー：ｃｐＩＩＩの膜アンカードメインをコードする遺伝子を単離する供給源としてもＭ１３ｍｐ１８ファージを使用した（その配列を配列番号：１１２として配列表に列記する）。膜アンカードメインｃｐＩＩＩのアミノ酸残基配列を配列番号：１６に列記する。Ｍ１３ｍｐ１８複製形態ＤＮＡを前記したように調製し、ＬａｃＺプロモーターをコードする配列に対して５′に位置するｃｐＩＩＩ膜アンカードメインの成熟遺伝子、オペレーターおよび軽鎖発現を調節するｃａｐ結合部位よりなるＤＮＡ断片の構成のための２つのＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。増幅反応において制限部位ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩを生成し、それぞれ断片の５′および３′末端に位置するものとした。２つの別のＰＣＲ増幅の生成物を組合せることによりこの断片を生成する手順を以下に記載する。
【０１９３】
表７に列記するプライマー対Ｇ−３（Ｆ）（配列番号：１０７）およびＧ−３（Ｂ）（配列番号：１０８）を前記行ったように第１のＰＣＲ反応で使用し、ｃｐＩＩＩ膜アンカー遺伝子を増幅させ、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ制限部位を断片に組込んだ。増幅したＰＣＲ断片は、重鎖およびｃｐＩＩＩコードドメインの間に並置した４つのグリセリン残基および１つのセリンから構成される５つのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列も含むものとした。一旦発現されると、通常の二次構造を欠失する５つのアミノ酸の配列は、ＦａｂおよびｃｐＩＩＩドメインの間の相互作用を最小にするように働いた。それぞれ断片の５′および３′末端のＳｐｅＩおよびＮｈｅＩ部位を有する得られたＰＣＲ修飾ｃｐＩＩＩＤＮＡ断片は、前記したように確認し精製した。ＰＣＲ修飾ｃｐＩＩＩ膜アンカードメインＤＮＡ断片の配列を配列番号：１１３として配列表に列記する。表７に列記したプライマー対Ｌａｃ−Ｆ（配列番号：１０９）およびＬａｃ−Ｂ（配列番号：１１０）を使用する第２のＰＣＲ増幅は、５′ＮｈｅＩ部位および３′ＥｃｏＲＩ部位を有するＬａｃＺプロモーター、オペレーターおよびＣａｐ結合部位を増幅するＭ１３ｍｐ１８複製形態鋳型ＤＮＡの別の画分上で行った。この増幅のために使用するプライマーは、ｃｐＩＩＩ遺伝子断片の３′末端および増幅したｃｐＩＩＩ断片に対して３′のＮｈｅＩ部位の一部と重複する増幅した断片の５′末端上のＮｈｅＩ部位を組込むように設計した。ＰＣＲ生成物の反応および精製は前記したように行った。５′ＮｈｅＩおよび３′ＥｃｏＲＩ制限部位を有する得られたＰＣＲ修飾ｃｐＩＩＩＤＮＡ断片の配列を配列番号：１１４として配列表に列記する。
【０１９４】
ｃｐＩＩＩ膜アンカーおよびＬａｃＺプロモーター領域を構成するのに使用する他のＬａｃ−Ｂプライマーは表１０に示すようにＬａｃ−Ｂ′とした。第２のＰＣＲ増幅においてＬａｃ−Ｂに代えてＬａｃ−Ｆと共にＬａｃ−Ｂ′を使用した以外は、前記したようにして増幅反応を行った。配列番号：１１４のヌクレオチド位置１〜ヌクレオチド位置１７２として増幅反応からの生成物を配列表に列記する。Ｌａｃ−Ｂ′を使用すると結果的に３′末端の２９ヌクレオチドを欠失するＬａｃＺ領域が得られたが、Ｌａｃ−ＦおよびＬａｃ−Ｂプライマーを用いて製造したより長い断片と機能的に等価であった。
【０１９５】
プライマー対６−３（Ｆ）および６−３（Ｂ）およびＬａｃ−ＦおよびＬａｃ−Ｂを使用する第１および第２のＰＣＲ増幅の生成物をその後ｃｐＩＩＩ膜アンカー重複およびＮｈｅＩ制限部位に対応するヌクレオチドにて組換え、Ｇ３−Ｆ（配列番号：１０７）およびＬａｃ−Ｂ（配列番号：１１０）プライマー対を使用する第２回のＰＣＲに供し、次のもの：５′ＳｐｅＩ制限部位、全成熟ｃｐＩＩＩ蛋白質のアミノ酸残基１９８に対応するヌクレオチド残基配列で開始するｃｐＩＩＩＤＮＡ膜アンカードメイン、アミノ酸残基番号１１２で膜アンカーにより与えられる内生停止部位、ＮｈｅＩ制限部位、ＬａｃＺプロモーター、オペレーターおよびＣａｐ結合部位配列、および３′ＥｃｏＲＩ制限部位よりなる組換えＰＣＲＤＮＡ断片生成物を形成した。その後組換えＰＣＲ修飾ｃｐＩＩＩ膜アンカードメインＤＮＡ断片をＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩにより制限消化し、実施例１ａ（ｉｖ）で調製した唯一のＳｐｅＩ部位を有するｐＣｏｍｂ２ファージミド発現ベクターに方向性をもって連結するためのＤＮＡ断片を製造し、ｐＣｏｍｂ２−ＩＩＩ（ｐＣｏｍｂ２−ＩＩＩとしても言及する）ファージミド発現ベクターを実施例１ｂ（ｉｉ）に記載したように形成した。
【０１９６】
ｈ．抗ＮＰＮコードＶ Ｈ ＤＮＡ断片の単離
Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩＤＮＡ融合生成物を形成するためにＰＣＲ修飾ｃｐＶＩＩＩ膜アンカードメインと組換える修飾Ｆｄ断片を調製するため、実施例２ｆで調製したクローン２ｂを鋳型として使用して前記したようにＰＣＲ増幅を行った。プライマーＨｃ３（配列番号：１０５）およびＡＫ７（配列番号：１０６）（その配列を表７に列記する）をＰＣＲで使用してクローン２ｂのＦｄ部分を増幅し、ｃｐＶＩＩＩ重複配列に沿ってＸｈｏＩおよびＳｐｅＩクローン化部位を組込んだ。増幅したＰＣＲ修飾Ｆｄ生成物を精製し、電気泳動して前記したように１％アガロースから単離した。Ｆｄ断片の大きさは６８０塩基対であった。
【０１９７】
ｉ．融合蛋白質Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩの部分をコードするＤＮＡ断片の調製
前記調製したヌクレオチド配列と重複するｃｐＶＩＩＩを含む精製したＰＣＲ修飾ＦｄＤＮＡ断片を、その後ＰＣＲ修飾ｃｐＶＩＩＩ膜アンカー断片と混合して混合物を形成した。混合物中の断片をその相補的領域で組換えた。末端プライマー対ＡＫ６（配列番号：１０４）およびＨｃ３（配列番号：１０５）（表７）を使用し、組換えＰＣＲ断片を含む混合物をその後前記したように第２回のＰＣＲ増幅に供した。ＰＣＲ増幅の対応する生成物を前記したようにアガロースゲル上で精製し電気泳動した。ＰＣＲ生成物は約８３０塩基対（Ｆｄ＝６８０＋１５０）であることを決定し、ＦｄとｃｐＶＩＩＩとの融合を確認した。５′から３′方向でフレームの合ったＦｄ配列とｃｐＶＩＩＩ配列とを結合するＰＣＲ生成物の配列を配列番号：１１５として列記する。その後ｐＣＢＡＫ８−２ｂジシストロン性ファージミド発現ベクターの構成のため、実施例２ｊに記載するようにＦｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合生成物を方向性をもった連結で使用した。
【０１９８】
ｊ．ｐＣＡＢＫ８−２ｂジシストロン性発現ベクターの構成
Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合蛋白質とカッパ軽鎖との共働発現のためのファージミドベクターを構成するため、実施例２ｆで調製したＮＰＮ結合ライブラリーから単離したクローン２ｂファージミド発現ベクターに前記実施例２ｉで調製したＰＣＲ増幅Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合生成物を最初に連結した。連結のため、Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩＰＣＲ融合生成物をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩにより最初に制限消化した。クローン２ｂファージミドベクターを同様に消化し、結果としてクローン化およびデカペプチド領域を除去した。ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限消化により生成した付着末端で消化したクローン２ｂに、消化したＦｄ−ｃｐＶＩＩＩ断片を混合して連結した。連結の結果、Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩポリペプチド融合蛋白質をコードするヌクレオチド残基配列と、リボソーム結合部位、ｐｅｌＢリーダー配列およびクローン２ｂに既に存在するカッパ軽鎖をコードするヌクレオチド残基配列を有する第２のカセットとの機能的結合を得て、元のクローン２ｂファージミド発現ベクターにおいてジシストロン性ＤＮＡ分子を形成した。
【０１９９】
その後ジシストロン性ＤＮＡ分子を含むファージミドによりイー・コリ株ＴＧ１を形質転換し、元のクローン２ｂがアンピシリン選択可能耐性マーカー遺伝子を含むため、形質転換体をアンピシリン上で選択した。イー・コリの高効率電気形質転換のため、ＴＧ１細胞の１：１００容量の一夜培養物を１リットルのＬブロス（１％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種した。細胞懸濁物を激しく振盪しながら３７℃に維持して６００ｎｍの吸光度を０．５〜１．０とした。その後最初に氷中でフラスコを１５〜３０分間冷却し、その後冷却したローター中で４０００×ｇで１５分間遠心分離して細菌をペレット化することにより、対数増殖期の細胞懸濁物を回収した。得られる上澄を除去し、合計１リットルの冷却した水に細菌細胞ペレットを再懸濁して細胞懸濁物を形成した。遠心分離および再懸濁手順を更に２回繰返し、最後の遠心分離の後に細胞ペレットを２０ｍｌの冷却した１０％グリセリンに再懸濁した。その後再懸濁した細胞懸濁物を遠心分離して細胞ペレットを形成した。得られた細胞ペレットを再懸濁して冷却し、１０％グリセリン中で２〜３ｍｌの最終容量とし、結果として１〜３×１０１０細胞／ｍｌの細胞濃度とした。電気形質転換手順のため、４０μｌの調製した細胞懸濁物を１〜２μｌのファージミドＤＮＡと混合して細胞−ファージミドＤＮＡ混合物を形成した。得られた混合物を混合し、１分間氷上に載置した。エレクトロポレーション装置、例えばジーンパルサーを２５ｕＦおよび２．５ｋＶに設定した。パルス調節器を２００オームに設定した。冷却した０．２ｃｍのエレクトロポレーションキュベットに細胞−ＤＮＡ混合物を移した。その後キュベットを冷却した安全隔室に置き、前記設定で１回パルス処理した。パルス処理した混合物にその後１ｍｌのＳＯＣ培地を混合し、パスツールピペットを用いて細胞を再懸濁した（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母エキス、１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＭｇＳＯ４および２０ｍＭグルコースを混合することによりＳＯＣ培地を調製した）。その後細胞懸濁物を１７×１００ｍｍポリプロピレンチューブに移し、３７℃で１時間維持した。維持期間の後、選択可能マーカー遺伝子を与えるファージミドを含むアンピシリン耐性コロニーの選択のため、形質転換ＴＧ１細胞をその後アンピシリンＬＢプレート上にプレート処理した。
【０２００】
アンピシリン耐性コロニーを選択し、正確な挿入物の大きさおよびＦａｂの発現について分析した。簡略には、ファージミドＤＮＡの単離のために選択したコロニーのＤＮＡ小調製物を調製した。それぞれの小調製物から単離したファージミドＤＮＡをＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩにより制限消化し、１％アガローゲル上で消化物を電気泳動した。８３０ｂｐ断片がゲル上で見られたものとしてクローンＡＫ１６を選択し、消化したクローン２ｂへのＦｄ−ｃｐＶＩＩＩＰＣＲ融合生成物の挿入を確認した。
その後クローンＡＫ１６ファージミドをＸｈｏＩおよびＸｂａＩにより制限消化し、Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合蛋白質、軽鎖の発現のためのリボソーム結合部位およびｐｅｌＢリーダー、スペーサー領域および２ｂカッパ軽鎖をコードするジシストロン性ＤＮＡ分子のヌクレオチド残基配列をアガロースゲル電気泳動により単離した。単離したジシストロン性ＤＮＡ断片をその後実施例１ｃ（ｉｉ）で調製したＸｈｏＩおよびＸｂａＩ制限消化ｐＣＢＡＫ０発現ベクターに連結し、ｐＣＢＡＫ８−２ｂと命名したジシストロン性ファージミド発現ベクターを形成した。
【０２０１】
得られたｐＣＢＡＫ８−２ｂ発現ベクターは、次の要素：ｆ１繊維状ファージ複製開始点、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ選択可能耐性マーカー遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子の上流の誘導性ＬａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼプロモーターが隣接する多重クローン化部位、およびジシストロン性ＤＮＡ分子（第１のカセットは、リボソーム結合部位、ｐｅｌＢリーダーおよびＦｄ−ｃｐＶＩＩＩＤＮＡ融合生成物よりなり、第２のリボソーム結合部位、第２のｐｅｌＢリーダーおよびカッパ軽鎖よりなる第２のカセットに機能的に結合する）をコードするヌクレオチド残基配列よりなるものであった。
ｋ．ｐＣＢＡＫ３−２ｂジシストロン性発現ベクターの構成
Ｆｄ−ｃｐＩＩＩ融合蛋白質とカッパ軽鎖との共働発現のためのファージミドベクターを構成するため、５′ＳｐｅＩおよび３′ＥｃｏＲＩ制限部位を有する実施例２ｇで調製したＬａｃＺプロモーター領域断片およびＰＣＲ増幅および組換えｃｐＩＩＩ膜アンカーを、実施例１ａ（ｉｖ）で調製した予めＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩにより消化したｐＣｏｍｂ２ファージミド発現ベクターに最初に方向性をもって連結してｐＣｏｍｂ２−３（ｐＣｏｍｂ２−ＩＩＩとも呼ぶ）ファージミドベクターを形成した。ベクターの構成の詳細については実施例１ｂ（ｉｉ）を参照することができる。アンピシリン耐性ベクターが好適な場合にはこの発明ではこのベクターを使用する。よって、唯一のＳｐｅＩ制限部位を有する得られたｐＣｏｍｂ２−３ベクターは、重鎖（Ｆｄ）−ｃｐＩＩＩ融合生成物および軽鎖蛋白質の別の発現を指向する別のＬａｃＺプロモーター／オペレーター配列を含んでいた。発現した蛋白質は、膜上での機能的集成のためのｐｅｌＢリーダー配列によりペリプラズム空間を指向する。ベクターにおけるファージＦ１遺伝子間領域の包含により、ヘルパーファージの補助によって一本鎖ファージミドのパッケージングが可能となる。ヘルパーファージ重複感染の使用により２つの形態のｃｐＩＩＩの発現が導かれる。よって、正常なファージ形態形成は、Ｆａｂ−ｃｐＩＩＩ融合体について図８に図示的に示すように、ウイルス粒子への組込みについてＦａｂ−ｃｐＩＩＩ融合体とヘルパーファージの天然型ｃｐＩＩＩとの間の競合によって攪乱される。
【０２０２】
この発明で使用するクロラムフェニコール耐性ベクターを製造するため、得られたｐＣｏｍｂ２−３ファージミドベクターをその後ＳａｃＩＩおよびＡｐａＩにより制限消化し、単離した断片を形成した。発現調節配列およびｃｐＩＩＩ配列を含む得られた単離断片を、実施例１ｃ（ｉｉ）で調製した同様に消化したｐＣＢＡＫ０ファージミドベクターに方向性をもって連結し、ｐＣＢＡＫ３ファージミド発現ベクターを形成した。このベクターはＦｄおよびカッパ軽鎖配列を欠失していた。
融合蛋白質およびカッパ軽鎖の発現のためのクロラムフェニコール耐性ファージミド発現ベクターｐＣＢＡＫ３−２ｂをその後構成した。簡略には、前記調製したｐＣＢＡＫ３ファージミド発現ベクターをＸｈｏＩおよびＳｐｅＩにより最初に消化し、線状化したｐＣＢＡＫ３ファージミド発現ベクターを形成した。ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ部位を含む実施例２ｈで調製したＰＣＲ増幅および修飾Ｆｄ断片を次にＸｈｏＩおよびＳｐｅＩにより制限消化した。ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ制限消化ｐＣＢＡＫ３ファージミド発現ベクターに、得られたＦｄ断片をその後付着末端を介して方向性をもって連結し、ＰＣＲ修飾Ｆｄ断片がｃｐＩＩＩをコードするヌクレオチド残基配列にフレームが合って機能的に結合した第２のファージミド発現ベクターを形成した。イー・コリ株ＸＬ１ブルー（ストラタジーン）をその後前記Ｆｄ−ｃｐＩＩＩを含むファージミドベクターにより形質転換した。ファージミドをコードするＦｄ−ｃｐＩＩＩを含む形質転換体をクロラムフェニコール上で選択した。クロラムフェニコール耐性クローンからファージミドＤＮＡを単離し、ＳａｃＩおよびＸｂａＩにより制限消化し、以下に調製するＳａｃＩおよびＸｂａＩ軽鎖断片を方向性をもって連結する線状化したファージミド発現ベクターを形成した。
【０２０３】
実施例２ａに記載した元の結合ライブラリーから単離したファージミドクローン２ｂをＳａｃＩおよびＸａｂＩにより制限消化し、カッパ軽鎖をコードするヌクレオチド残基配列を単離した。Ｆｄ−ｃｐＩＩＩを含む前記調製したＳａｃＩおよびＸｂａＩ制限消化ファージミド発現ベクターに単離したカッパ軽鎖配列をその後方向性をもって連結し、ファージミド発現ベクターｐＣＢＡＫ３−２ｂを形成した。得られたベクターは、Ｆｄ−ｃｐＩＩＩ融合蛋白質とカッパ軽鎖との共働発現のためのジシストロン性ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を含んでいた。得られたファージミド発現ベクターは、次の要素：ｆ１繊維状ファージ複製開始点、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ選択可能耐性マーカー遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子の上流の誘導性ＬａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７ポリメラーゼプロモーターが隣接する多重クローン化部位、およびジシストロン性分子（第１のカセットは、第２のＬａｃＺ、第２のリボソーム結合部位、およびカッパ軽鎖に機能的に結合した第２のｐｅｌＢリーダーよりなる第２のカセットに機能的に結合するＦｄ−ｃｐＩＩＩに機能的に結合したｐｅｌＢリーダーおよび第１のリボソーム結合部位よりなる）をコードするヌクレオチド残基配列よりなるものであった。
【０２０４】
その後ファージミド発現ベクターｐＣＢＡＫ３−２ｂによりＸＬ１ブルー細胞を形質転換した。クロラムフェニコール耐性ファージミドを含む形質転換したコロニーを前記したように選択し、実施例２ｊに記載したようにＦａｂの正確な大きさの挿入物および発現について分析した。ｐＣＢＡＫ３−２ｂファージミドベクターにおける挿入物およびＦａｂの発現の確認の後、ＸＬ１ブルー細胞をその後形質転換し、実施例３および４に記載したようにＦａｂ抗体の発現のために誘導した。
Ｆａｂ−ｃｐＩＩＩ融合体の発現、分泌および検索の結果より、免疫系同様に親和力並びに特異性に基くクローンの分類が可能となるため、Ｆａｂ−ｃｐＶＩＩＩ融合体により与えられる多価表示に対するＦａｂ−ｃｐＩＩＩ融合体により与えられる一価表示の利点が明らかとなった。バーバスら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されたようなｐＣｏｍｂ３を使用する弱い結合クローン７Ｅに対する強い結合クローン１０Ｃの２５３倍の集積。ファージ表面上で４〜５コピーのペプチドを示したファージ上のペプチドライブラリーの研究により、多価性は中程度の親和力のペプチド（１０−６Ｍ）を示すファージを高い親和力のペプチド（１０−９Ｍ）から分離するのを妨害することが示されている。クウィルラら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８−６３８２（１９９０）。多価性は、高親和力Ｆａｂを担持するファーシと低親和力Ｆａｂを担持するものとを識別する能力を低減させるキレート効果を導く。
【０２０５】
この糸の使用は、実施例６により、またパーソンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：２４３２−２４３６（１９９１）により記載され先に特徴付けられた（５０００クローン当り１つの結合体）ヒト結合抗破傷風毒素Ｆａｂライブラリーを分類することにより更に示された。元はラムダファージベクター系中のライブラリーを、重鎖および軽鎖の元の対合を保持するｐＣｏｍｂ２−３において再構成した。ライブラリーの大きさ、１０７クローンは、元のラムダファージライブラリーより１０倍大きかった。１回繰返しの選別処理の後、拾った１３または５７のクローンが破傷風毒素結合体であると決定され、これは１０３倍の集積を示した。３回目の選別の後、ファージ収率は２００倍に増加し、特定のファージの集積が示された。よって全てのクローンが抗原特異的結合体である。よって１０８の構成員の大きな結合ライブラリーがこの系を使用して接近可能となる。実施例６〜８に記載する変異誘発によって更に大きなライブラリーが達成される。
【０２０６】
３．ファージ表面上での抗ＮＰＮヘテロ二量体の発現
ファージ表面上のＮＰＮに対して向けられた抗体Ｆａｂの発現のため、それぞれ実施例２ｊおよび２ｋで調製したファージミドベクターｐＣＢＡＫ８−２ｂおよびｐＣＢＡＫ３−２ｂによりＸＬ１ブルー細胞を別に形質転換した。３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレート上で形質転換体を選択した。それぞれのファージミド形質転換について抗生物質耐性コロニーを選択し、ファージミドおよびＦ′エピゾームのそれぞれの抗生物質選択のために３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むスーパーブロス（次のもの：２０ｇの３［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、６０ｇトリプトン、４０ｇ酵母エキス、および２リットルの水（１０ｍＮａＯＨにより７．０にｐＨを調整）を混合することによりスーパーブロスを調製した）中で３７℃で液体培養により生育させた。抗生物質耐性形質転換ＸＬ１ブルー細胞をスーパーブロス中で０．４の光学密度（ＯＤ６００）に希釈した。インデューサー、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度１ｍＭとして細菌懸濁物に混合し、混合物を３７℃で１時間維持し、ＬａｃＺプロモーターから融合蛋白質およびカッパ軽鎖の発現を誘導した。その後１の形質転換細菌細胞に対して１０〜２０のヘルパーファージの比率で、Ｒ４０８またはＶＣＳＭ１３（ストラタジーン）とするヘルパーファージを誘導した細菌懸濁物に混合し、ファージミドＤＮＡのセンス鎖のコピーの生成を開始させた。その後ヘルパーファージを含む混合物を３７℃で更に２時間維持し、ｃｐＶＩＩＩまたはｃｐＩＩＩのバクテリオファージ膜アンカードメインに融合した発現した抗ＮＰＮＦａｂ抗体がバクテリオファージ粒子の表面に組込まれた繊維状バクテリオファージの集成を図った。その後細菌懸濁物を遠心分離し、結果として細菌細胞ペレットおよびファージを含有する上澄を得た。上澄を除去して集め、ｃｐＶＩＩＩまたはｃｐＩＩＩによりファージ粒子に定置した機能性抗ＮＰＮＦａｂ分子の存在について以下に記載するように検定した。
【０２０７】
４．繊維状ファージの表面上の抗ＮＰＮヘテロ二量体の存在および機能を確認 する検定
ａ．電子顕微鏡
機能性Ｆａｂ分子を局在化させるため、コロイド状金で標識した抗原に対する結合を検討した。固相上に固定したフォームバー（ポリサイエンス社、ワーリントン、ペンシルバニア）被覆グリッド上に実施例３で調製したファージ含有上澄および細菌細胞をスポットした。幾つかの実験では、グリッドを細胞で被覆しその場でファージを感染させた。その後ｐＨ７．２のＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりグリッドをブロックし、洗浄し、標識した免疫反応複合体を形成するのに十分な時間期間の間ＢＳＡ−ＮＰＮハプテン接合体で被覆した２〜７ナノメーター（ｎｍ）のコロイド状金粒子と共にインキュベートした。グリッドを洗浄して過剰の金粒子を除去し、ウラニルアセテート中で陰性染色し、電子顕微鏡により視覚化した。
繊維状ファージおよびファージを生産する透過性とした細胞の検討により、ファージまたは露呈した細菌膜の特異的標識が明らかとなった。ファージは、粒子当り１〜２４コピーの抗原結合部位を含むことが認められた。ヘルパーファージ単独または無傷のイー・コリの両者とも抗原により標識されなかった。バックグラウンドの非特異的結合は極めて低かった。イー・コリ表面から出現する繊維状ファージ粒子は、図９に示すように抗原により標識された。
クローン２ｂ、ｐＣＢＡＫ３−２ｂとの融合相手としてｃｐＩＩＩを利用する関連ファージ表面発現ベクターの生成により、柱状部ではなくファージ頭部に対する特異的抗原標識が明らかとなった。さらに、ｃｐＩＩＩ融合体として発現したヒト抗破傷風ＦａｂはＢＳＡ−ＮＰＮ抗原には結合しなかった。
【０２０８】
ｂ．ファージＥＬＩＳＡ
ミクロ滴定プレートをＮＰＮ−ＢＳＡ接合体（０．１ｍｌ、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２中１μｇ／ｍｌ）により被覆し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡによりブロックした。実施例３で調製したｐＣＢＡＫ８−２ｂ誘導ファージ（０．１ｍｌ）の一連の２倍希釈物を予備被覆したミクロ滴定プレートに添加し、周囲温度で３時間または４℃で１６時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗カッパアルカリ性ホスファターゼ接合体（フィッシャ・バイオテク、ピッツバーグ、ペンシルバニア）を添加し（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１／１０００に希釈した０．１ｍｌ）、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ中で洗浄し、基質を添加した（０．１ｍｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ２を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．５中の１ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルホスフェート）。シグナルの展開のために３７℃でインキュベートした後、４００ｎｍの光学密度を測定した。０から５ｍｇ／穴までの範囲の増加する量の遊離のＮＰＮハプテンの添加により競合検定を行った。
ＥＬＩＳＡ検定により機能性抗体Ｆａｂの存在が確認された。抗マウスカッパ鎖酵素接合体をプローブとしたＮＰＮ抗原被覆プレート上での２部位ＥＬＩＳＡにおいて、ｐＣＢＡＫ８−２ｂ構成体を担持する細胞のヘルパーファージ感染から生成したファージ上澄は、ファージ含有抗体の一連の２倍希釈物により予期された滴定曲線を示した。２部位ＥＬＩＳＡの結果を図１０に示す。この検定で生成するシグナルのためには、ファージ粒子は（ｉ）機能的に会合したＦｄおよびカッパ鎖を有しかつ（ｉｉ）多価でなければならない。増加する濃度の遊離のハプテンの存在下でプレートに対する結合を阻害することにより、粒子の特異性を評価した。生成したファージ粒子はＥＬＩＳＡの固相に対する結合を示し、図１１に示すようにハプテンの添加により阻害することができた。検定で５ｎｇの遊離のＮＰＮハプテンを使用した場合に完全な阻害が達成された。ヘルパーファージはＥＬＩＳＡにおいてシグナルを与えなかった。これらの結果は、抗体重鎖および軽鎖ポリペプチドが機能的に集成し、ファージ粒子の表面上に存在してエピトープを含む予備選択したリガンド部分に結合できるエピトープ結合複合体を形成することを示す。
【０２０９】
ｃ．ファージの抗原特異的沈殿
実施例３で調製したｐＣＢＡＫ８−２ｂジシストロン性発現ベクターによりＸＬ１ブルーからのファージ上澄を形質転換し、（１ｍｌ）を４℃で１８時間ＢＳＡ−ＮＰＮ接合体（１０μｌ、２ｍｇ／ｍｌ）とインキュベートした。その後ベンチトップ遠心分離機による３０００ｒｐｍの遠心分離により混合物をペレット化し、沈殿の出現に注目した。対照としてヘルパーファージを使用した。冷却したＰＢＳ（５×３ｍｌ／洗浄）中でペレットを繰返し洗浄した後ＬＢ（０．５ｍｌ）に再懸濁した。可溶化した沈殿物を新鮮なＸＬ１ブルー細胞（一夜培養物の０．５ｍｌ）に添加し、３７℃で１時間インキュベートし、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天上に画分をプレート処理した。コロニーを無作為に選択した。ニトロセルロース上のコロニー***物をリゾチームにより処理して細胞壁を消化し、クロロホルムで手短に処理して外膜を破壊し、ＰＢＳ中のＢＳＡ１％でブロックし、１２５Ｉ標識ＢＳＡ−ＮＰＮ抗原と共にインキュベートした。ＰＢＳ（０．０５％ツイーン２０を含む）中で幾度か洗浄した後、洗浄し乾燥したフィルターにフィルムを−７０℃で一夜露呈し、その後オートラジオグラフを現像した。
ＢＳＡ−ＮＰＮの存在下にファージを含む抗体により沈殿が得られたが、ヘルパーファージでは得られなかった。さらに、粒子は、Ｆ′エピゾームを担持する細菌細胞による続くインキュベートに際して感染性を保持し、単一の可溶化した沈殿物から４×１０５のコロニーを生成した。
【０２１０】
更に、ＤＮＡ制限分析を実施し、重鎖および軽鎖挿入物の存在を決定した。クローンのＤＮＡ制限分析により、Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合構成体およびカッパ鎖挿入物について予期されたように、１．４ｋｂのＸｈｏＩおよびＸｂａＩ断片の存在が明らかとなった。
これらの結果は、抗原特異性および多価性についての更なる証拠を与える。免疫学的パラメーターを与えることに加えて、この沈殿は抗原特異的ファージ粒子の容易な集積の可能性を与えるものである。原則的に、特異的抗体を含むファージは抗原（これは細胞表面マーカー、細菌並びに合成分子とすることができる）による沈殿によって高度に集積することができる。洗浄した抗原−抗体沈殿物は過剰の抗原の添加により可溶化することができ、生存しているファージが回収される。希な種類の回収のためには、固定化した抗原を使用することができるが、これは異なる親和力溶出の道を開くものである。
【０２１１】
特定された結合特異性のクローンの集積について固定化した抗原の有用性を示すため、選別処理実験を行った。ｃｐＶＩＩＩ融合体として抗破傷風Ｆａｂを発現するアンピシリン耐性ファージミドを構成した。ヘルパーファージによるこのクローンのレスキューにより、そのコート上で抗破傷風Ｆａｂを示すアンピシリン耐性ファージミドをコードするファージが製造された。破傷風特異性をコードするこれらのファージをＮＰＮハプテンコードファージと混合し（１：１００）、破傷風毒素により被覆したミクロ滴定プレートに結合させた。１時間の維持期間の後、プレートを十分に洗浄し、その後低いｐＨの緩衝液を用いてファージを溶出した。対数増殖期のＸＬ１ブルー細胞への感染およびアンピシリンおよびクロラムフェニコール上への画分のその後のプレート処理により、集積の直接定量を行った。１，０００を越えるコロニーの検討により、溶出したファージから誘導したアンピシリン耐性コロニーが、クロラムフェニコール耐性コロニーを２７対１で越えることが示された。したがって、選別処理によって抗破傷風Ｆａｂを示すファージが２７００倍に集積された。この結果は、百万分の１で存在する特定の特異性のクローンが、２回繰返しの選別処理の後には非特異的クローンに対して優勢となり得ることを示唆する。
【０２１２】
５．ファージ表面に沿って結合抗体Ｆａｂライブラリーを集成させる利点
１０８〜９の構成員のライブラリーを生成し、予備選択した結合活性により結合Ｆａｂのライブラリーから選択する強力な技術を示す。ここに記載するベクターでは、ＰＣＲ生成抗体断片を挿入するための制限クローン化部位は、ラムダベクターについて先に記載したように保持されている。抗体Ｆｄおよびカッパ鎖をコードする遺伝子のレスキューは、ｆ１複製開始点の利用により媒介され、ヘルパーファージの同時感染に際してベクターの陽性鎖の合成およびパッケージングが導かれる。「成熟」ウィルス粒子は、ペリプラズム空間へと内膜を通過すると共に一本鎖ＤＮＡの周りに主コート蛋白質を取込むことにより集成するため、ファージミドベクターに担持される遺伝的情報が補足されるのみならず、粒子の長さに沿って機能性Ｆａｂの幾つかのコピーも取込まれる。Ｆ′エピゾームを担持する宿主細胞への後続する感染に際して、適切な抗生物質上でのコロニーの選択を可能とする耐性がファージミドにより与えられる。要は、抗原認識単位がその生産のための指示に結合されていることである。
【０２１３】
検索により容易に接近可能なのは構成員の約０．１〜１％のみであったため、先に結合させた系の全ての力を完全には利用できていなかった。ファージミド／Ｍ１３の系では、類似する大きさのライブラリーが生成され、親和力選択を介して全ての構成員に接近する。更に、一価Ｆａｂを生成したラムダベクターとは異なり、この系は多価粒子を生成し、よってより広い範囲の親和力の補足を可能とするものである。
独特のファージミド制限部位はＦｄおよびカッパ鎖の組換えを可能とし、鎖置換または混ぜ合せを可能とする。織維状一本鎖ＤＮＡのレスキューにより、意図するクローンの遺伝的作成物の迅速な配列決定および分析が可能となる。実際、ＤＮＡ配列決定または変異誘発の前の抗原選択により抗体特異性をコードするファージを集積し得ると考えることができる。選択が後続する変異の反復プロセスを更に展開する選択枝により、胚系統配列から高い親和力の抗体を迅速に生成することが可能となり得る。このプロセスは自動化することができる。自然を模倣する系の潜在力は別として、ファージミド／Ｍ１３系によりヒトにおける抗体応答のより完全な吟味が可能となり得て、これにより有用な治療および診断試薬を生成することができる。
【０２１４】
重鎖の膜定置およびペリプラズムにおけるカッパ鎖の区画化が、この機能性二量体蛋白質を発現する鍵である。この系の潜在力は抗体に何ら限定されず、全ゆる蛋白質認識系または多数の構成員を含む系の組合せに拡張することができる。例えば、高結合力マトリックスにおけるリガンドとエフェクター系との共役が今や可能である。同様に、リガンドのライブラリーを受容体のライブラリーに対して分類することができる。
６．抗破傷風毒素をコードする重鎖のＣＤＲ３領域の無作為化した変異誘発
ａ．縮退オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ変異誘発
破傷風毒素抗原（ＴＴ）を最早認識しないが新たな抗原を認識して特異的に結合し得る変化した特異性のこの発明の変異誘発したヘテロ二量体を得るため、公知のヌクレオチド配列によりコードされる重鎖断片のＣＤＲ３領域のみを無作為化する方法を開発した。このアプローチを図示的に図１２に示すが、ここで白いブロックで示す変化するフレーム構造領域（１〜４）および斜線ブロックで示す相補性決定領域（ＣＤＲ）（１〜３）および第１の不変領域（ＣＨ１）よるなるファージミドクローン内の代表的な重鎖断片をＰＣＲの２つの別の繰返しに供する。第１のＰＣＲ増幅反応では、フレーム構造１で開始しフレーム構造３の３′末端に延在する重鎖の５′末端を増幅する。第２のＰＣＲ増幅反応では、黒いボックスで示すＣＤＲ３領域を無作為に変異誘発させる。保存されたフレーム構造領域３および４の配列の間に挟まれて連続する縮退領域を用いて合成したオリゴヌクレオチドプライマーのプールを使用することによりこれを行う。それぞれ無作為化したＣＤＲ３領域を有する第２の増幅から得られた増幅生成物はフレーム構造３の３′末端にその５′末端を有し、生成物の３′末端はＣＨ１領域の３′末端に延在する。
【０２１５】
縮退オリゴヌクレオチドプライマーのプールは、第１のＰＣＲ反応生成物の生成物の３′末端に相補的で重複し得る５′末端を有する生成物の増幅を結果的に与えるように設計した。よって、２つの別のＰＣＲ反応生成物をプールし、２つの生成物の間の重複領域を延在して無作為化したＣＤＲ３領域を有する重鎖を結果的に与える第３のＰＣＲ反応に供する。
この発明での使用のための重鎖ＤＮＡ鋳型は、ペルソンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：２４３２−２４３６（１９９１）に記載されたように、ラムダＨｃ２およびＬｃ２ライブラリーから誘導されたヒト結合抗破傷風毒素（ＴＴ）Ｆａｂライブラリー由来のクローン（重鎖および軽鎖断片を含む７Ｅと命名したファージミドベクター）において利用可能であった。半合成結合ライブラリーを生成するため、バーバスら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）により実施例２ｋにおいて抗ＮＰＮについて記載したように、重鎖−ｃｐＩＩＩ膜アンカー融合蛋白質（Ｆｄ−ｃｐＩＩＩ）および可溶性軽鎖の発現のためのｐＣｏｍｂ２−３′ジシストロン性発現ベクター中でクローン７Ｅを構成した。
【０２１６】
ファージミドベクターｐＣｏｍｂ２−３′を実施例１ｂ（ｉｉ）に記載したように調製した。ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化ｐＣｏｍｂ２−３′ベクターへの連結により、７Ｅラムダクローン由来の重鎖および軽鎖の元の対合を維持した。ｃｐＩＩＩ膜アンカー配列を置換するため、ＬａｃＺプロモーター配列およびＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化により欠失させたｐｅｌＢリーダー、ｐＣｏｍｂ３由来のＳｐｅＩ−ＳａｃＩ断片（実施例１ｂ（ｉｉ）のように調製）を、クローン７Ｅ由来の重鎖および軽鎖配列を含むｐＣｏｍｂ２−３′ベクターに連結した。以後ｐＣ３−ＴＴ７Ｅとして言及する得られたファージミドクローンを、実施例３でファージ表面上の抗ＮＰＮヘテロ二量体について記載したように最初に発現させ、その後実施例４ｃで抗ＮＰＮについて記載したようにＴＴ被覆プレート上で選別処理することにより検索した。クローンｐＣ３−ＴＴ７Ｅは１０−７ＭのオーダーのＴＴに対するＫｄを示し、バーバスら、前記に記載されたように非特異的ファージに対して１０３倍集積された。
【０２１７】
重鎖のＣＤＲ３領域の無作為変異誘発のための鋳型ＤＮＡとして重鎖および軽鎖配列の両者を有するクローンｐＣ３−ＴＴ７Ｅを使用し、ここに記載するように抗原結合特異性を変化させた。実施例１ａ（ｉｉ）に記載したように重鎖の配列を決定した。図１２に示すように２つの別のＰＣＲ反応を行った。
第１のＰＣＲ反応の結果、フレーム構造領域１の開始であり、長さ約４００塩基対のＣＤＲ３に対して５′に位置するフレーム構造領域３の末端に延在するｐＣ３−ＴＴ７Ｅクローンにおける重鎖断片の領域の増幅が与えられた。この領域を増幅するため、以下のプライマー対を使用した。ヌクレオチト配列５′−Ｇ−ＣＡＡ−ＴＡＡ−ＡＣＣ−ＣＴＣ−ＡＣＴ−ＡＡＡ−ＧＧＧ−３′（配列番号：１１８）を有し、領域５′に対応する重鎖の非コード鎖にハイブリダイズされ、フレーム構造１の開始を含む５′アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーＦＴ３Ｘ。ヌクレオチド配列５′−ＴＣＴ−ＣＧＣ−ＡＣＡ−ＡＴＡ−ＡＴＡ−ＣＡＣ−ＧＧＣ−３′（配列番号：１１９）を有し、フレーム構造３領域の３′末端に対応する重鎖のコード鎖にハイブリダイズされる３′センスオリゴヌクレオチトプライマーＢ７ＥＦＲ３。オリゴヌクレオチドプライマーはリサーチ・ジェネティクス（フンストビレ、ＡＬ）で合成されたものである。１μｇのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマーＦＴＸ３およびＢ７ＥＦＲ３、８μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、１μｌＴａｑポリメラーゼ、１０ｎｇの鋳型ｐＣＥ−ＴＴ７Ｅ、および市販品を購入した（プロメガ・バイオテク）１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液を含む１００μｌの反応物中でＰＣＲ反応を行った。２滴のミネラルオイルを混合物の頂部に載置し、サーモサイクラー中で３５回繰返しのＰＣＲ増幅を行った。増幅サイクルは９４℃で１分間の変性、５０℃で１分間のアニール、その後の７２℃で２分間の延長よりなるものとした。得られたＰＣＲ増幅生成物をその後実施例１ｄに記載したようにゲル精製し、第２のＰＣＲ反応の生成物と共に重複延長ＰＣＲ反応で使用し（両者とも後記する）、図１２に示すように変異誘発したＣＤＲ３領域を含む再構成した重鎖へと２つの生成物を組換えた。この増幅からのＤＮＡの全収量は約３μｇ／１００μｌであった。
【０２１８】
第２のＰＣＲ反応の結果、フレーム構造領域３の３′末端から長さ約３９０塩基対のＣＨ１領域の末端に延在する重鎖の増幅が得られた。この領域を増幅するために次のプライマーを使用した。７ＥＣＤＲ３と命名した５′アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマープールは、式５′−ＧＴＧ−ＴＡＴ−ＴＡＴ−ＴＧＴ−ＧＣＧ−ＡＧＡ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＮＮＳ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＣＡＡ−ＧＧＧ−ＡＣＣ−ＡＣＧ−３′により表されるヌクレオチド配列を有していた（ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴとすることができ、ＳはＣまたはＧであり（配列番号：１２０）、またプライマープールの５′末端はオリゴヌクレオチドプライマーＢ７３ＦＲ３の相補的ヌクレオチド配列により表されるフレーム構造３の３′末端に相補的であり、プライマープールの３′末端はフレーム構造４の５′末端に相補的である）。プライマープールの２つの特定の末端の間の領域は、長さ１６アミノ酸残基の変異誘発したＣＤＲ３領域の多様な集団を最終的にコードする４８マーＮＮＳ縮退によって表した。パーソンら、前記により記載されたようにヌクレオチド配列５′−ＧＣＡＴＧＴＡＣＴＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧ−３′（配列番号：１２１）を有する３′センスオリゴヌクレオチドプライマーＣＧ１Ｚは、ＣＨ１の３′末端に対応する重鎖のコード鎖にハイブリダイズした。前記したように１μｇのそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー７ＥＣＤＲ３およびＣＧ１Ｚを含む１００μｌ反応物中で第２のＰＣＲ反応をｐＣ３−ＴＴ７Ｅ上で行った。得られたＰＣＲ増幅生成物をその後前記したようにゲル精製した。この第２のＰＣＲ変異誘発増幅からのＤＮＡの全収量は約３μｇ／１００μｌであった。
【０２１９】
その後第１および第２のＰＣＲ反応からの１００ナノグラムのゲル精製生成物を、最終ＰＣＲ反応におけるプライマー対としての１μｇのそれぞれのＦＴＸ３およびＣＧ１Ｚオリゴヌクレオチドと混合し、図１２に示すように重複延長により完全な重鎖断片を形成した。ＰＣＲ反応混合物は、前記したように１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌＴａｑポリメラーゼおよび３μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰも含むものとした。ＰＣＲ反応は前記したように行った。十分な量の増幅生成物を得るため、１５の同一のＰＣＲ反応を行った。フレーム構造１で開始しＣＨ１の末端に延長し無作為に変異誘発したＣＤＲ３領域を有する得られた重鎖断片は、長さ約７９０塩基対であった。１５の反応からの重鎖断片増幅生成物を最初にプールし、その後ファージミドライブラリーへのその組込みの前に、前記したようにゲル精製した。それぞれの増幅からの全収量は約３μｇ／１００μｌであり、よって全プールした収量は約４５μｇの増幅した変異誘発重鎖を含んでいた。
【０２２０】
ｂ．ファージミドライブラリー構築
実施例６ａで調製した得られたゲル精製重鎖断片を、その後実施例２ｄに記載したように制限酵素ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩにより消化した。変異誘発していない鎖断片を除去して線状ベクターを形成するために同じ制限酵素で予め消化したｐＣ３−ＴＴ７Ｅファージミドベクタークローンに挿入する前に、得られた消化した重鎖断片をその後ゲル精製した。変異誘発したＣＤＲ３領域を有する環状化したベクターを形成するための変異誘発したＣＤＲ３領域を有する６４０ｎｇの重鎖ＸｈｏＩＳｐｅＩ断片の２μｇの線状化したｐＣ３−ＴＴ７Ｅファージミドベクターへの連結は、１５０μｌの反応容量でＢＲＬリガーゼ緩衝液中で１０単位のＢＲＬリガーゼ（ガイサーズブルグ、ＭＤ）を使用して室温で一夜行った。５つの別の連結反応を行い、変異誘発したＣＤＲ３領域を有するファージライブラリーの大きさを増加させた。よって、５つの連結反応について増幅した変異誘発重鎖の全量は３．２μｇであった。連結反応の後、２μｌの２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲン、１５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および３００μｌのエタノールの混合物により、環状化したＤＮＡを−２０℃で２時間沈殿させた。その後４℃で１５分間のミクロ遠心分離によりＤＮＡをペレット化した。冷却した７０％エタノールによりＤＮＡペレットを洗浄して真空下に乾燥した。ペレットを１０μｌの水に再懸濁し、実施例２ｋに記載したように３００μｌのイー・コリＸＨ１ブルー細胞にエレクトロポレーションにより形質転換してファージライブラリーを形成した。ここに記載する変異誘発および形質転換手順からの全収量は約５×１０７形質転換体であった。単一の停止コドンＴＡＧが抑制されるため、イー・コリからのＸＬ１−ブルー細胞を宿主として選択した。
【０２２１】
形質転換の後、ヘテロ二量体発現が誘導されたファージを単離するため、フルオレセインのような標的抗原上での続く選別処理につき、３ｍｌのＳＯＣ培地（ＳＯＣは、２０ｇバクトトリプトン、５ｇ酵母エキスおよび０．５ｇＮａＣｌを１リットルの水中で混合し、ｐＨを７．５に調整し、Ｆｄ−ｃｐＩＩＩおよび軽鎖ヘテロ二量体の発現を誘導するために使用する直前に２０ｍｌのグルコースを混合することにより調製した）を混合し、培養物を２２０ｒｐｍで１時間３７℃で振盪し、その時間の後２０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１０ｍｌのＳＢ（ＳＢは、リットル当り３０ｇトリプトン、２０ｇ酵母エキスおよび１０ｇモップス緩衝液を混合しｐＨを７に調整して調製した）および混合物を３００ｒｐｍで更なる時間振盪した。５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１００ｍｌＳＢに得られた混合物を混合し、１時間振盪し、その時間の後にヘルパーファージＶＣＳＭ１３（１０１２ｐｆｕ）を混合し、混合物をさらに２時間振盪した。この時間の後、７０μｇ／ｍｌカナマイシンを混合し、３０℃で一夜維持した。低い温度ほど、結果的にファージの表面状でより良好なヘテロ二量体組込みが得られた。遠心分離（ＪＡ１０ローター中４℃で４０００ｒｐｍで１５分）により上澄を清浄化した。４％８ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール８０００および３％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌの混合によりファージを沈殿させ、氷上に３０分間維持し、その後遠心分離（ＪＡ１０ローター中４℃で９０００ｒｐｍで２０分）を行った。ファージ粒子を２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、３分間ミクロ遠心分離して残渣をペレット化し、新鮮なチューブに移し、後記するようにその後の検索のために−２０℃で保存した。
【０２２２】
滴定し得るコロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定するため、ファージ（パッケージしたファージミド）をＳ中で希釈し、１μｌを使用して１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＳＢ中で生育させた５０μｌの新鮮な（ＯＤ６００＝１）イー・コリＸＬＩブルー細胞に感染させた。ファージおよび細胞を室温で１５分間維持し、その後ＬＢ／カルベニシリンプレートに直接プレート処理した。
ｃ．ファージ表面上での抗フルオレセインヘテロ二量体の選択
１）変異誘発ＣＤＲ３領域を有するファージライブラリーの多重選別処理
変異誘発したＣＤＲ３領域を備える重鎖断片を有する実施例６ｂで製造したファージライブラリーを、５０μｇ／ｍｌフルオレセイン−ＢＳＡ接合体で被覆したミクロ滴定プレート上でここに記載するように選別処理し、抗フルオレセインヘテロ二量体を検索した。「抗体：実験室マニュアル」、ハルロウら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリイ、１９８８に記載された方法によりフルオレセインをＢＳＡに接合させた。
【０２２３】
使用した選別処理手順は、元はパルムレイとスミス（パルムレイら、Ｇｅｎｅ，７３：３０−５−３１８）により記載されたものの改変である。０．１Ｍビカーボネート、ｐＨ８．６中で前記調製した２５μｌの５０μｇ／ｍｌＴＴ抗原を用い、ミクロ滴定プレート（コスター３６９０）の２〜４の穴を４℃で一夜被覆した。穴を水により２回洗浄し、ＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにより穴を完全に満たしてプレートを３７℃で１時間維持することによりブロックした。ブロック溶液を振盪して出した後、前記調製したファージライブラリー（典型的には１０１１ｃｆｕ）をそれぞれの穴に混合し、プレートを３７℃で２時間維持した。
ファージを除去し、プレートを水で１回洗浄した。その後１時間の間室温でＴＢＳ／ツイーン（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．５％ツイーン２０）により穴を１０回洗浄したが、この場合洗浄はピペットで上下させて穴を洗浄することよりなるものとし、それぞれの回ごとに穴が洗浄の間は完全にＴＢＳ／ツイーンにより満たされたままとなるようにした。蒸留水によりプレートを更に１回洗浄し、５０μｌの溶出緩衝液（０．１ＭＨＣｌ、固体グリシンでｐＨ２．２に調整、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを含む）をそれぞれの穴に添加した後室温で１０分間維持することにより付着ファージを溶出させた。溶出緩衝液をピペットで数回上下させ、除去し、使用した５０μｌの溶出緩衝液当り３μｌの２Ｍトリス塩基を用いて中和した。
【０２２４】
溶出したファージを使用し、２ｍｌの新鮮な（ＯＤ６００＝１）イー・コリＸＬ１ブルー細胞に室温で１５分間感染させ、その時間の後に２０μｌ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１０ｍｌのＳＢを混合した。プレート処理のために２０、１０および１／１０μｌの画分を培養物から除去し、プレートから溶出されたファージ（パッケージされたファージミド）の数を決定した。培養物を３７℃で１時間振盪し、その後これを５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む１００ｍｌのＳＢに添加し、１時間振盪した。その後ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（１０１２ｐｆｕ）を添加し、培養物を更に２時間振盪した。この時間の後に、７０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加し、培養物を３７℃で一夜インキュベートした。ファージ調製および更なる選別処理を前記したように繰返した。
【０２２５】
それぞれの回の選別処理の後、ファージの百分率収量を決定したが、この場合％収量−（溶出したファージの数／装填したファージの数）×１００とした。実施例６ｂに記載したように選択プレート上で滴定することにより、初発ファージ投入比率をそれぞれの回の選別処理について約１０１１ｃｆｒと決定した。前記したように２ｍｌの対数増殖期ＸＬ１ブルー細胞に感染させ、画分を選択プレート上でプレート処理することにより最終ファージ出力比率を決定した。
酸による溶出の代替として、ＰＢＳ中で希釈した５０μｌの１０−５Ｍフルオレセインの溶液を混合し、その後３７℃で１時間の維持期間を設けることにより、ミクロ滴定プレートの穴に結合したファージを溶出させた。その後溶液を上下にピペット処理して穴を洗浄した。得られた溶出物を前記したように感染のために２ｍｌの新鮮なイー・コリＸＬＩブルー細胞に移し、ファージ調製および更なる選別処理を図った。後続する回の選別処理において、１０−６Ｍフルオレセインを用いてファージを溶出させた。
酸またはフルオレセイン単独を用いる選別処理および溶出の４回の連続的繰返しでフルオレセイン被覆穴に特異的に結合したファージの量の結果を以下の表８に示す。いずれの溶出手順によっても、フルオレセインに特異的に結合するヘテロ二量体を発現するファージの比較し得る収量が達成された。これらのデータにより、この発明で記載したＣＤＲ３領域の変異誘発の結果、最初はＴＴに特異的に結合したヘテロ二量体がフルオレセインに特異的に結合するものに変化することが確認される。
【０２２６】
Figure 0004108430
【０２２７】
対照ファージによるこの表面への非特異的結合は、穴当り１０４〜１０５ファージの間で変動した。以下の２）に記載するように可溶性Ｆａｂの製造およびＥＬＩＳＡによるフルオレセインへの結合の確認により、それぞれ酸溶出およびフルオレセイン溶出ライブラリーについて、形質転換したコロニーから無作為に選択した６０の内の８つの反応性クローンおよび形質転換したコロニーから無作為に選択した４０の内の３８つの反応性クローンが明らかとなった。
２）フルオレセインへの結合特異性を特徴付けるための可溶性ヘテロ二量体の調製
前記したようにファージの表面上で発現される変異誘発したヘテロ二量体の特異性を更に特徴付けるため、酸溶出およびフルオレセイン溶出ファージの両者からの可溶性Ｆａｂヘテロ二量体を調製し、フルオレセイン被覆プレート上でのＥＬＩＳＡにおいて、可溶性フルオレセイン−ＢＳＡの増加する濃度を用いる競合ＥＬＩＳＡにより、また蛍光消光検定により分析した。後者の検定は、「フルオレセインハプテン、免疫学的プローブ」、イー・ダブリュ・ボス編、ＣＲＣプレス社、ｐｐ５２−５４，１９８４に記載されたように行った。
【０２２８】
可溶性ヘテロ二量体を調製するため、陽性クローンからファージミドＤＮＡを単離し、ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで消化した。これらの酵素による消化によって和合性の付着末端が生成した。遺伝子ＩＩＩ部分を欠失する４．７ｋｂＤＮＡ断片をゲル精製（０．６％アガロース）して自己連結した。イー・コリＸＬ１ブルーの形質転換により、ｃｐＩＩＩ断片を欠失する形質転換体を単離した。１．６ｋｂ断片を生成する筈であるＸｈｏＩ−ＸｂａＩ消化によるｃｐＩＩＩ断片の除去についてクローンを検討した。０．２のＯＤ６００が達成されるまで、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンおよび２０ｍＭＭｇＣｌ２を含む１００ｍｌＳＢ中で３７℃でクローンを生育させた。ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加し、培養物を３０℃で一夜生育させた（３７℃での生育はヘテロ二量体収量の軽い減少を与えるのみである）。ＪＡ１０ローター中４℃で１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離することにより細胞をペレット化した。３４μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む４ｍｌＰＢＳ中に細胞を再懸濁し、氷上での超音波処理（５０％負荷で２〜４分）により溶解させた。ＪＡ２０ローター中４℃で１５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離することにより残渣をペレット化した。後記するようにＥＬＩＳＡ分析のために上澄を直接使用し、−２０℃で保存した。多数のクローンの検討のために、１０ｍｌの培養物で分析のための十分なヘテロ二量体が与えられた。この場合、２ｍｌの緩衝液中で超音波処理を行った。
【０２２９】
前記調製した可溶性ヘテロ二量体をＥＬＩＳＡにより検定した。この検定のため、１μｇ／穴のフルオレセイン−ＢＳＡ溶液をミクロ滴定プレートの個々の穴に混合し、４℃で一夜維持し、蛋白質溶液を穴の壁に付着させた。維持期間の後、ＰＢＳにより穴を１回洗浄し、その後３％ＢＳＡの溶液と共に維持し、穴上の非特異的部位をブロックした。プレートを３７℃で１時間維持し、その時間の後にプレートを反転させ、振盪してＢＳＡ溶液を除去した。前記調製した可溶性ヘテロ二量体をそれぞれの穴にその後混合し、３７℃で１時間維持して免疫反応生成物を形成した。維持期間の後、ＰＢＳを用いて穴を１０回洗浄し、非結合可溶性抗体を除去し、その後１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で希釈したアルカリ性ホスファターゼと接合した二次ヤギ抗ヒトＦＡＢと共に維持した。穴を３７℃で１時間維持し、その後ＰＢＳにより穴を１０回洗浄し、その後ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）による展開を行った。
【０２３０】
前記ＥＬＩＳＡで決定した免疫反応性ヘテロ二量体をその後競合ＥＬＩＳＡにより分析し、変異誘発したヘテロ二量体の親和力を決定した。可溶性ヘテロ二量体の存在下に混合した濃度で１０−９Ｍ〜１０−５Ｍの濃度範囲の増加する濃度の可溶性フルオレセイン−ＢＳＡを用いて前記したようにＥＬＩＳＡを行った。結合の最大阻害は１０−６Ｍ遊離抗体で達成され、最大の２分の１阻害は約１０−７Ｍ遊離抗原で得られた。全てのクローンから発現した抗体は、フルオレセインおよび酸溶出の両者につきフルオレセイン−ＢＳＡ接合体について１０−７〜１０−８Ｍの範囲のおよその解離定数（Ｋｄ）を有していた。真のＫｄはフルオレセイン消光検定で決定した。フルオレセイン溶出後のクローンからのファージ上で発現した抗体はフルオレセインに対してより高い親和力を有していた（酸溶出抗体について１０−７Ｍ対１０−６Ｍ）。親クローン７Ｅは検定の検出可能限界内で消光を示さず、１０−５Ｍ未満の遊離のフルオレセインに対する親和力を示唆した。フルオレセインに対する抗体の最も強い結合体の親和力（１０−７Ｍ）は、クランツら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：１３１３−１３２２（１９８３）により示されたように、遊離のフルオレセインに対する免疫化したマウスの二次応答の平均Ｋｄ（１０−７Ｍ）に接近した。
よって、この発明の変異誘発したヘテロ二量体は、フルオレセインを特異的に認識して結合する。更に実験を行い、変異誘発したヘテロ二量体は、変異誘発していないヘテロ二量体が元は結合したＴＴを最早認識しないことを確認した。フルオレセイン消光検定も行い、変異誘発したヘテロ二量体の結合の特異性を確認した。酸またはフルオレセイン単独により溶出したファージから調製した可溶性ヘテロ二量体は、前記したアプローチのいずれによってもフルオレセインの結合において同等に有効であった。ここに記載したヘテロ二量体の重鎖のＣＤＲ３領域の変異誘発の発明の結果、ＴＴからフルオレセインへの結合特異性の変化が与えられた。
【０２３１】
ｄ．選択した抗フルオレセインヘテロ二量体の配列分析
代表的な番号のフルオレセイン−ＢＳＡ結合クローンの変異した重鎖の完全なヌクレオチド配列を決定した。ＣＤＲ３領域の外側にはＰＣＲ誘導変異は認められなかった。重鎖ＣＤＲ３領域の予期されるアミノ酸配列を、括弧内に示す対応する配列番号と共に図１３に示す。酸溶出処方から回収した７つのクローンはコンセンサス配列を示さなかった。酸溶出クローンにおけるコンセンサス挙動の欠如には、フルオレセインおよびＢＳＡよりなる更に複雑なエピトープのその認識が寄与している可能性があるが、これはフルオレセインおよびフルオレセイン−ＢＳＡに対する更に異なる親和力に反映される。
【０２３２】
逆に、フルオレセインによって単離したクローンはコンセンサス配列の高い選択を示した。配列決定した１０のクローンの内、異なる配列が認められたのは３のみであった。全てのクローンが、アミノ酸残基位置９５のグリシンおよび位置１０１のアスパラギン酸を有していた。アミノ酸残基位置は、カバトら、「免疫学的に興味ある蛋白質の配列」、ＵＳデパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービス（１９８７）に記載されたようにカバト番号系に基く。全ての３２の可能なコドンを製造する合成手順により与えられたグリシン残基をコードする両者の可能なコドンを使用した。天然の抗体では、位置１０１のアスパラギン酸残基は、フレーム構造領域３（ＦＲ３）の位置９４のアルギニン残基と塩橋を形成することにより構造的な役割を果たしている。よって、人工的な選択過程が、動物に認められるものを反映する構造的意義の相互作用を反復した。
【０２３３】
更に、１０のクローンから発現した９の半合成抗体は、直接隣接するループの中央付近にセリン−アルギニン−プロリンのトリプレット配列またはアルギニン残基のアミノ末端側で除去された１残基を含んでいたが、これらの残基の２つについてのコドン使用が異なっていた。クローンＦ３１はこの中央構造を欠失していた。全ての配列は、３２の可能なコドンの３つによりコードされるアルギニン残基に富んでいた。１０の異なるＣＤＲ３配列内のアルギニンの存在と、同様に合成において３つの可能なコドンによりコードされるロイシンおよびセリンとの比較により、アルギニン−ロイシン−セリン比率は２９：１６：１５であることが明らかとなった。アルギニンの選択に対するこの偏向は、フルオレセインのジシストロン性特徴の結果たり得る。
【０２３４】
異なるコドンが使用されていることを突き止めたことは、クローン的選択は抗原−抗体合体のレベルで起こり、ＤＮＡへのヌクレオチド組込みの何らかの予期しない偏向によるものではないという提案を支持する。
７．抗破傷風毒素をコードする軽鎖のＣＤＲ３領域の無作為化した変異誘発
ａ．縮退オリゴヌクレオチドによるＰＣＲ変異誘発
実施例６に記載したような重鎖の無作為変異誘発に類似する手順に従い、抗破傷風毒素特異的ファージミドクローンｐＣ３−ＴＴ７Ｅの軽鎖断片のＣＤＲ３領域を無作為化し、フルオレセインに対する特異性を有する抗体を製造した。反応に使用したオリゴヌクレオチドプライマー以外は、実施例６ａに記載したようにＰＣＲ増幅を行った。
【０２３５】
第１のＰＣＲ反応の結果、ベクターの５′ＥｃｏＲＩ部位からＣＤＲ３領域の５′末端に延在するｐＣ３−ＴＴ７Ｅクローン中の軽鎖断片の領域の増幅を得た。この領域を増幅するために次のプライマーを使用した：ヌクレオチド配列５′−ＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＴＣＧ−３′（配列番号：１２６）を有し、ベクターのＥｃｏＲＶ部位に対応する軽鎖の非コード鎖にハイブリダイズする５′アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーＫＥＦ、ヌクレオチド配列５′−ＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣ−３′（配列番号：１２７）を有し、ＣＤＲ３の５′末端に対応する重鎖のコード鎖にハイブリダイズする３′センスオリゴヌクレオチドプライマーＫＶ１２Ｂ。ＰＣＲ増幅は実施例６ａに記載したように行った。その後得られたＰＣＲ生成物を実施例１ｄに記載したようにゲル精製し、第２のＰＣＲ反応の生成物と共に重複延長ＰＣＲ反応で使用し（両者とも後記する）、図１２に示すように変異誘発したＣＤＲ３領域を含む再構成した重鎖に２つの生成物を組換えた。
【０２３６】
第２のＰＣＲ反応の結果、ＣＤＲ３領域の５′末端からＣＨ１領域の末端に延在する軽鎖の増幅が得られた。この領域を増幅するために次のプライマーを使用した。ＫＶ５Ｒ３と命名した５′アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマープールは、式５′−ＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣ−３′（配列番号：１２８）により表されるヌクレオチド配列を有していた（ここでＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴとすることができ、ＫはＧまたはＴであり、またプライマープールの５′末端はＣＤＲ３の５′末端に相補的であり、プライマープールの３′末端はＣＤＲ３の３′末端およびフレーム構造４の５′末端に相補的である）。プライマープールの２つの特定の末端の間の領域は、ＣＤＲ３領域の非変異誘発５′および３′末端を境界とする長さ５アミノ酸の内部変異誘発したＣＤＲ３領域の多様な集団を最終的にコードする１５マー縮退によって表した。ヌクレオチド配列５′−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧ−３′（配列番号：１２９）を有する３′センスオリゴヌクレオチドプライマーＴ７Ｂは、ベクターのＴ７領域に対応する軽鎖のコード鎖にハイブリダイズした。第２のＰＣＲ反応は、ＫＶ５ＲおよびＴ７Ｂプライマーを用いて実施例６ａに記載したようにｐＣ３−ＴＴ７Ｅ上で行った。得られたＰＣＲ増幅生成物をその後前記したようにゲル精製した。
【０２３７】
第１および第２のＰＣＲ反応からの５００ナノグラムのゲル精製生成物を、その後最終ＰＣＲ反応においてプライマー対としての１μｇのＫＥＦおよびＴ７Ｂオリゴヌクレオチドプライマーのそれぞれと混合し、図１２に示すように重複延長により完全な軽鎖断片を形成した。ＰＣＲ増幅は実施例６ａに記載したように行った。十分な量の増幅生成物を得るため、５つの同一のＰＣＲ反応を行った。５′ＥｃｏＲＶ部位で開始しＴ７領域に延在する得られた軽鎖断片は、５つの内部アミノ酸無作為変異誘発ＣＤＲ３を有していた。
【０２３８】
ｂ．ファージミドライブラリー構築
実施例７ａで調製した得られたゲル精製軽鎖断片を、その後実施例２ｄに記載したように制限酵素ＳａｃＩおよびＸｂａＩにより消化した。変異誘発していない軽鎖断片を除去して線状ベクターを形成するために同じ制限酵素で予め消化したｐＣ３−ＴＴ７Ｅファージミドベクタークローンに連結する前に、得られた軽鎖断片をその後ゲル精製した。変異誘発したＣＤＲ３領域を有する環状化したベクターを形成するための４５０ｎｇの軽鎖増幅生成物の１．４μｇの線状化したｐＣ３−ＴＴ７Ｅファージミドベクターへの連結は、実施例６ｂに記載したように行った。５つの別の連結反応を行い、内部変異誘発したＣＤＲ３領域を有するファージライブラリーの大きさを増加させた。連結反応の後、環状化したＤＮＡを沈殿させ、実施例６ｂに記載したようにイー・コリＸＬＩブルーに形質転換し、ファージライブラリーを形成した。ここに記載する変異誘発および形質転換手順からの全収量は、約２×１０７形質転換体であった。重鎖変異誘発形質転換体について記載したようにファージを単離した。
【０２３９】
ｃ．ファージ表面上での抗フルオレセインヘテロ二量体の選択および選択した 抗体の配列分析
ＣＤＲ３領域に５つの内部変異誘発アミノ酸を有する軽鎖断片を有する実施例７ｂで製造したファージライブラリーを実施例６ｃに記載したように選別処理した。１０１１のファージ投入による連続的な選別処理およびハプテン溶出の３回繰返しによりフルオレセイン被覆穴に特異的に結合したファージの数は、０．７５×１０６、１×１０６および２．４×１０７であった。よって形質転換、ファージ調製、選別処理および溶出の繰返しサイクルの結果、フルオレセインに特異的に結合するヘテロ二量体の顕著な集積が与えられた。フルオレセインに対する結合特異性を特徴付けるため、実施例６ｂ２）に記載したように可溶性Ｆａｂを調製した。実施例６ｄに記載したように７つのクローンを配列分析のために選択した。配列分析の結果を図１４に示す。軽鎖ＣＤＲ３の変異した領域は、カバトアミノ酸免疫グロブリン軽鎖位置の９２〜９６に渡る。出発クローンｐＣ３−ＴＴ７Ｅ由来のこの領域の配列はＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（配列番号：１４８）であった。変異させてフルオレセインにより選択した７つの抗体の内、クローンＰ２、Ｐ２１、Ｐ２３、Ｐ２８およびＰ１９からのその５つがアミノ酸残基Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（配列番号：１４９）を有していたが、それぞれ独特のヌクレオチド配列からの翻訳の結果であった。独特のヌクレオチド配列から誘導されたＰ１５およびＰ１１クローンからの２つの残余の抗体も独特のアミノ酸配列を有していた。よって、大半の変異誘発した軽鎖が合成において可能なコドンによりコードされる同じアミノ酸配列を有していたことから、人工的な選択過程は、動物では自然な選択の過程から得られる構造的意義の相互作用を反復していた。
【０２４０】
重鎖および軽鎖の両者のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の無作為変異誘発に帰着するようにプライマーを設計できるため、ＣＤＲ領域の変異誘発はＣＤＲ３領域に限定されるものではない。６つの全てのＣＤＲ領域の変異の結果、動物で得ることができるものを越える例外的に多様なライブラリーが得られる。全てのＣＤＲにおける無作為化を得るため、重鎖ＣＤＲを出発クローンから最初に無作為化し、その後最良の抗体結合体の選択を行うことができる。軽鎖のＣＤＲ上での第２の変異誘発工程を行うことができ、得られたライブラリーを選択した重鎖結合体と混合することができる。また、全てのＣＤＲを同時に無作為化することができ、この結果重鎖および軽鎖ライブラリーを得て、これらをその後組合せて予備選択した抗原に対する選択に供するものとする。
よって、実施例６および７により、免疫グロブリン遺伝子の重および軽相補性決定領域（ＣＤＲ）を変異誘発する本発明による方法が示され、またこれに有用なオリゴヌクレオチドが示された。
【０２４１】
８．素朴な結合免疫グロブリンライブラリーからの抗体の試験管内選択および成熟
結合免疫グロブリンライブラリーの方法を使用して非免疫成体マウスからモノクローナル抗体を取得し、これにより（ｉ）予備選択した特異性について素朴な結合抗体ライブラリーに接近し、（ｉｉ）無作為変異誘発により選択した抗体結合部位の親和力を増加させる原理を確立した。実施例１ｂ（ｉ）で調製した多価表示ベクターｐＣｏｍｂ８を用いて非免疫化成体Ｂａｌｂ／ｃマウスの骨髄から、繊維状ファージの表面上でＩｇμおよびｋ軽鎖断片を発現する結合Ｆａｂライブラリーを調製した。プロゲステロンに特異的な約１０４〜１０５Ｍ−１の結合定数を有する低親和力Ｆａｂを示すファージを、そのハプテンに結合する能力によってライブラリーから単離した。一価ファージ表示ベクターｐＣｏｍｂ３で発現した重鎖および軽鎖可変領域の無作為変異誘発をエラープローンＰＣＲにより行った。プロゲステロンに対する改良した親和力を有するクローンをその後選択した。よって、ここに記載するように、非免疫化供給源からの所望の特性を有する抗体を選択し、２つのベクターｐＣｏｍｂ８およびｐＣｏｍｂ３を使用することにより親和力成熟を達成し、これにより遺伝子ライブラリーから特定の抗体を取得し免疫化をバイパスする道を開くものとする。
【０２４２】
ここに記載する発明は３つの必須の特徴を有する：（ｉ）多価ファージ発現系の使用によって素朴なライブラリーから低親和力Ｆａｂに最初に接近する能力、（ｉｉ）エラープローンＰＣＲによるその後の親和力成熟および（ｉｉｉ）軽鎖の喪失による人工的結合の高いバックグラウンドを回避するため成熟過程の際の一本鎖構成体の使用。具体的に使用した場合、これらの方法により素朴なライブラリーから抗体の選択および親和力成熟を行うことが可能となる。
ａ．ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成
３匹の非免疫化成体オス（６月齢）Ｂａｌｂ／ｃＢｙＪマウス（スクリップ・ブリーディング・コロニー）を使用し、ＰＢＳ中の４％ウシ胎児血清中で５×１０７の骨髄細胞を調製した。表面ＩｇＧ陽性細胞を枯渇させるため、ラット抗マウスＩｇＧ２ｂ（０．１ｍｌ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ（０．１ｍｌ）およびウサギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（０．１ｍｌ）と共に調製物を周囲温度で３０分間維持した。細胞をペレット化し、ＰＢＳにより洗浄し、９ｍｌＰＢＳに再懸濁した。ウサギ相補体を添加し（１ｍｌ）、３７℃で３０分間維持した。細胞をペレット化し、実施例２ｂに記載したように全ＲＮＡを単離した。スーパースクリプトキット（ＢＲＬ）を使用し、全ＲＮＡをそれぞれ次のプライマーを用いるμおよびｋ鎖のｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した：Ｉｇμ、５′−ＡＴＴＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＴ−３′（配列番号：１５１）（ＳｐｅＩ制限部位配列に下線を付す）およびｋ、５′−ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ−３′（配列番号：１５２）（ＸｂａＩ制限部位に下線を付す）。
【０２４３】
簡略には、７μｇの全ＲＮＡを６０ｐｍｏｌのプライマーと混合し、７０℃で１０分間加熱し、氷上で直ちに冷却した。２μｌのＲＮａｓｅ阻害剤、１０μｌの５×合成緩衝液、８μｌのｄＮＴＰ混合物（２００μＭのそれぞれのＮＴＰの最終濃度を与えるものとする）、５μｌの０．１ＭＤＴＴ、および１μｌのＢＲＬスーパースクリプトＲＴ（２００Ｕ／μｌ）を混合し、ＤＥＰＣ処理水で反応物を５０μｌとした。室温で１０分間反応を進行させ、その後４２℃で５０分間とした。９０℃で５分間維持することにより反応を停止し、その後氷上に１０分間載置し、その後１μｌのＲＮａｓｅＨを混合し、３７℃で２０分間維持した。表５〜６に示すように重鎖についてＶＨ１〜９およびμ鎖プライマーおよび軽鎖についてＶＬ３〜７およびｋ鎖プライマーを使用し、実施例２に記載したように１００μｌの反応混合物中でＰＣＲ増幅を行った。
【０２４４】
ｂ．素朴な免疫グロブリンμ／ｋライブラリー構成
ＰＣＲ増幅μ鎖およびｋ鎖ＤＮＡをそれぞれＸｈｏＩ−ＳｐｅＩおよびＳａｃＩ−ＸｂａＩにより開裂させた。得られたμ鎖ＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ断片を実施例１ｂ（ｉ）で調製したｐＣｏｍｂ８ファージミドベクターに挿入し、μ鎖−ｃｐＶＩＩＩ融合ライブラリーを生成した。イー・コリＸＬ１ブルーへの形質転換およびファージ製造は主として実施例６に記載したように実施した。その後ｋ軽鎖ＳａｃＩ−ＸｂａＩ断片を重鎖Ｆｄμ−ｃｐＶＩＩＩ融合ライブラリーにクローン化した。
重鎖Ｆｄ断片とｃｐＶＩＩＩとの融合を可能とするｐＣｏｍｂ８ベクターにＩｇμＦｄおよびｋ軽鎖断片をその後クローン化することにより、５×１０６構成員の結合ライブラリーを確立した。Ｆａｂ抗体断片はファージ表面上で高いコピー数で表示されるため、非選択および非起動レパートリーに認められると予期される低親和力抗体に接近するためにこのベクターを選択した。
【０２４５】
ｃ．プロゲステロンに特異的な低親和力抗体の選択
前記調製した組換えファージミドをＭ１３ファージ粒子にパッケージし、プロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム−ＢＳＡ被覆ＥＬＩＳＡ穴上で５回の選別処理を実施例６に記載したように行った。簡略には、５０μｌの１００μｇ／ｍｌプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムＢＳＡ接合体（シグマ＃Ｐ４７７８）（ＰＢＳ中）を用いて４℃でミクロ滴定プレートの穴を被覆した。穴を２回水で洗浄し、ＰＢＳ中の１％ｗ／ｖＢＳＡで完全に満たしてプレートを３７℃で１時間維持することによりブロックした。ブロック溶液を振落し、ＰＢＳ−ＢＳＡ（０．１％ｗ／ｖ）中の５０μｌのファージライブラリー（典型的には１０１１ｃｆｕ）をそれぞれの穴に混合し、プレートを３７℃で２時間維持した。ファージの洗浄工程、溶出、および複製は主として実施例６ａ１）に記載したように行った。
【０２４６】
第１および第３の繰返しの後に溶出したファージを、実施例２ｆに記載したように細菌コロニー***により抗プロゲステロンＦａｂの発現について分析した。プロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシムＨＲＰ接合体を用い、プロゲステロン結合についてコロニーをプローブ処理した。４−クロロナフトールを使用してフィルターを展開した。対応する軽鎖のないＩｇμＦｄ ｃｐＶＩＩＩ融合体を発現するファージミドにより起こる誤動作を排除するために注意を払った。恐らく不対合重鎖上で示される疎水性部分のため、これらの重鎖のみのファージはＢＳＡ、ＨＲＰ、ニワトリ卵リゾチームのような未反応抗原と非特異的反応した。
【０２４７】
ウエスタンブロットで最も強いシグナルを生成するこのようなコロニーを更に検討し、後続する分析のために３つのクローンＰｇＡ１１、ＰｇＢ６およびＰｇＦ１を単離した。最初の２つは第１回の選別処理で出現したものであり、後者は第３回の選択の後に単離したものである。実施例６ｃ２）に記載したようにその可溶性形態で生産されるこれらの全てのＦａｂは、プロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム−ＢＳＡおよびプロゲステロン−１１α−ヘミスクシニル−ＢＳＡに特異的に結合した。更に、３つのＦａｂの全ては、チトクロームＣのエピトープに対して顕著な交差反応性を示した。プロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム−ＢＳＡについてのその見かけの結合定数は、それぞれＰｇＡ１１について１０４Ｍ−１、ＰｇＦ１およびＰｇＢ６について３×１０４Ｍ−１および１０５Ｍ−１と決定された。これらの結合定数は、２〜５×１０８Ｍ−１の親和力を有する抗プロゲステロンモノクローナル抗体について報告されたものより遥かに低い。クローンＰｇＢ６およびＰｇＦ１は、密接に関連するＶＨおよびＶＬ遺伝子の同じ組合せを利用していた。これらＶＨ遺伝子の両者は２つの密接に関連するが別個の胚系統遺伝子と同一であったが、素朴なレパートリーから予期されるように、体性変異の証拠はなかった。その密接に関連するＶＬ遺伝子についての真の胚系統遺伝子は未だ知られていない。両者のＶＨ遺伝子は異なるＤおよびＪ断片に接続していたため、クローンＰｇＢ６およびＰｇＦ１は同じ起源ではあり得ず、２つの独立するクローン化の事態から選択された筈であり、プロゲステロン結合についてのこの特定の組合せの潜在的重要性を示している。ＰｇＡ１１により使用されるＶＬおよびＶＨ遺伝子は、他の２つのクローンとは密接に関連していない。
よって、これは、多価表示ベクターを使用することにより、ホスホリルコリンおよびニトロフェノールのようなハプテンに対する一次免疫応答について観察されたものと比較し得る親和力で素朴な結合レパートリーからＦａｂを単離することができることを示した。更に、結合ライブラリーの手法により、生体内では選択され得ないＶ遺伝子またはＶ遺伝子の組合せを生成することができる。
【０２４８】
ｄ．ＰＣＲ指向性変異誘発による親和力成熟
より高い親和力を有する抗体の選択を導く体性変異の過程を模倣するため、ＶＬおよびＶＨ領域の両者で無作為変異を生成し、ハプテンプロゲステロンに対する増加した親和力を有する抗体をその後選択した。エラープローンＰＣＲにより特定的に唯一Ｖ領域を変異の標的とするため、次の要素のフレームの合った融合体を含むｐＣｏｍｂ２−３ファージミドベクター中で一本鎖融合プラスミドＦｖ−ｃｐＩＩＩを構成した：分泌のためのｐｅｌＢリーダー配列、実施例６ａで記載したように可撓性ペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドに結合したＶＨおよびＶＬリーディングフレーム、およびｃｐＩＩＩ部分。一本鎖ベクターの使用により、Ｉｇ重鎖のみを発現するファージによる非特異的結合についての望ましくない選択による困難性が更に克服される。
【０２４９】
膜アンカーｃｐＩＩＩとの一本鎖重鎖および軽鎖（縮退したＦＶ）融合体を調製するため、唯一のＳｐｅＩ制限部位を有する実施例１ｂ（ｉｉ）で調製したプラスミドｐＣｏｍｂ２−３を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＮｈｅＩで消化して再連結し、これにより軽鎖クローン化カセットを除去した。２つのオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド配列５′−ＴＣＧＡＧＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＣＴＡＡＡＴＣＴＡＣＴＧＡＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣＡ−３′（配列番号：１５３）を有する５′アンチセンスプライマーおよびヌクレオチド配列５′−ＣＴＡＧＴＧＡＣＴＴＴＧ ＡＧＣＴＣＡＧＴＡＧＡＴＴＴＡＣＡＴＴＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＴＴＣ−３（配列番号：１５４）を有する３′センスプライマーよりなる１５アミノ酸リンカー配列をコードする合成ＤＮＡリンカーを、ファージミドＳｃｐＣｏｍｂ２−３を形成するＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ消化裁頭ｐＣｏｍｂ２−３ベクターに挿入した。制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＳａｃＩ（ＧＡＧＣＴＣ）の内部認識配列に下線を付す。プロゲステロン結合体のＶＨおよびＶＬ断片を、その後２つの別の反応で実施例２ｇに記載したようにＰＣＲにより増幅した。
【０２５０】
第１のＰＣＲ増幅では、前記列記した配列番号：１５３に対応するプライマーおよびヌクレオチド配列５′−ＡＴＴＴＧＧＧＡＡＧＧＡＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＧＭＲＧＡＧＡＣ−３′（配列番号：１５５）（ここでＭはＡまたはＣであり、ＲはＡまたはＧである）を有するオリゴヌクレオチドを使用して重鎖断片を増幅した。軽鎖断片は、前記列記した配列番号：１５４に対応するプライマーおよびヌクレオチド配列５′−ＧＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧ−３′（配列番号：１５６）を有するオリゴヌクレオチドを用いて別に増幅した。ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）およびＳｐｅＩ（ＡＣＴＡＧＴ）の内部認識配列に下線を付す。ＶＨおよびＶＬＰＣＲ断片をそれぞれＸｈｏＩ−ＸｂａＩおよびＳａｃＩ−ＳｐｅＩにより消化し、その後ＳｃｐＣｏｍｂ２−３に挿入した。
【０２５１】
ｅ．可溶性Ｆａｂおよびプロゲステロンに特異的な一本鎖融合抗体の発現および検出
Ｆａｂ製造のため、プロゲステロン結合体ＰｇＡ１１、ＰｇＢ６およびＰｇＦ１をコードするファージミドの遺伝子ＶＩＩＩ部分を制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩにより切出し、その後ＴＡＡ停止コドン（下線）をコードする合成リンカーにより置換した。リンカーは、オリゴヌクレオチド５′−ＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＧＡＧＴＡＡＧ−３′（配列番号：１５７）および５′ＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＡＡ−３′（配列番号：１５８）により形成した。イー・コリ細胞を３回の凍結融解サイクルにより破壊した以外は、抗体Ｆａｂ断片の製造および検出は主として実施例６ｃ２）に記載したように行った。可溶性抗体断片を製造するため、ＶＨ−リンカー−ＶＬ融合体をＳｃｐＣｏｂｍ２−３ファージミドからＸｈｏＩおよびＳｐｅＩにより切出し、ｐＦ１２６０の誘導体である発現ベクターｐＴＡＣ０１（ファルマシア）にサブクローン化した。ｐＴＡＣ０１ベクターは誘導性ｔａｃプロモーター、分泌のためのｐｅｌＢリーダー配列を有し、挿入した一本鎖融合構成体と免疫学的検出のためにｔａｇとして実施例１ａに記載したデカペプチド配列とのフレームの合った融合を可能とした。一本鎖融合抗体断片の発現および検出は、アルカリ性ホスファターゼに接合した抗デカペプチド抗体をＥＬＩＳＡに使用した以外は前記した通りとした。
３つの一本鎖融合クローンを検索手順により選択し、ＳｃｐＣｏｍｂ２−３−ＰｇＦ１、−ＰｇＢ６および−ＰｇＡ１１と命名した。これらの得られたプラスミドを以下に記載するようにエラープローンＰＣＲ変異誘発に供した。
【０２５２】
ｆ．エラープローンＰＣＲによる重鎖および軽鎖の標的変異誘発
前記調製した等量の未消化ＰｇＦ１、ＰｇＢ６およびＰｇＡｌｌＳｃｐＣｏｍｂ２−３を混合し、直列的に希釈した。１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇおよび０．０１ｎｇの混合物を次の反応条件下に３５サイクルの増幅（９４℃で１分、５０℃で２分、７２℃で１分）に別々に供した：５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、６．５ｍＭＭｇＣｌ２、０．５ｍＭＭｎＣｌ２、０．０１％ゼラチン、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭのそれぞれｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．１ｍＭｄＩＴＰ、Ｍ１３逆配列プライマー、５′−ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３′（配列番号：１５９）およびｃｐＩＩＩ部分に相補的な後方プライマー５′−ＧＡＣＡＧＧＡＧＧＴＴＧＡＧＧＣＡＧＧＴ−３′（配列番号：１６０）を１００μＭで使用する。エラープローンＰＣＲの基本的方法は、レウングら、Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：１１−１５（１９８９）により最初に記載されており、これを参考によりここに取入れる。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の忠実性を減少させる条件下で、変異誘発すべきＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅した。レウングら、前記により示されたように、ＰＣＲ増幅で使用する試薬ＭｕＣｌ２およびｄＡＴＰの濃度の結果、それぞれ１．０％および１．４％の変異頻度が与えられた。よって、ｄＡＴＰ濃度が減少するにつれて変異の頻度が増加した。
【０２５３】
全ての鋳型希釈物のＰＣＲ反応物をプールし、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩによる消化の前にフェノールで処理した。ゲル精製し消化したＰＣＲ断片をＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ消化ＳｃｐＣｏｍｂ２−３プラスミドに連結して戻した。連結生成物をイー・コリＸＬブルーにエレクトロポレーションし、１０６の形質転換体を生成した。ファージをＢＳＡの非存在下に選別処理した以外は、ファージ製造および選別の後続する工程は実施例６に記載したように実施した。
よって、変異した抗プロゲステロン一本鎖ファージミド抗体のライブラリーが確立され、プロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム−ＢＳＡにより選別処理され、溶出したｃｆｕの数を表れた一本鎖抗体のハプテンに対する相対的な親和力の尺度とした。第３回の選別処理の後、変異していない集団に対して溶出したファージミドの収量の５０〜１００倍の増加が銘記された。親クローンと比較して個々の変異体は選別処理の後に収量で１０〜３００倍の増加を示し、変異体が増加した親和力の抗体結合部位をコードしていたことを示す。ＳｃＰｇＢ６−１、−２、−３および−４と命名した４つの最良の変異体を、ハプテン接合のその親和力の決定および配列分析のために選択した。
【０２５４】
ｇ．変異誘発一本鎖融合抗プロゲステロン抗体の親和力の決定
前記選択した４つの最良の変異体、ＳｃＰｇＢ６−１、−２、−３および−４から調製した可溶性抗体断片の結合定数を、実施例６ｃ２）に記載したように競合ＥＬＩＳＡにより決定した。簡略には、ＰＢＳ中の５０μｌの１００μｇ／ｍｌプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム−ＢＳＡ接合体により４℃でミクロ滴定プレートの穴を被覆した。穴を水で２回洗浄し、ＰＢＳ中の１％ｗ／ｖＢＳＡにより３７℃で１時間ブロックした。Ｆａｂまたは一本鎖融合体上澄をＰＢＳ−ＢＳＡ（０．１％ｗ／ｖ）中のプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）−オキシム−ＢＳＡと混合し、穴の中で３７℃で２時間維持した。ＰＢＳ−ツイーン（０．０５％ｖ／ｖ）によりプレートを洗浄し、ヤギ抗マウスｋ鎖アルカリ性ホスファターゼ接合体（サザン・バイオテク）またはアルカリ性ホスファターゼに接合させたマウス抗デカペプチドモノクローナル抗体を混合し、３７℃で１時間維持した。前記したようにプレートを洗浄し、基質を混合した（０．１ｍｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ２を含む０．１Ｍトリス、ｐＨ９．４中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート）。２５℃で６０〜１８０分維持した後、４０５ｎｍの吸光度を読取った。見かけの親和力は、競合ＥＬＩＳＡにおける最大の結合の５０％を阻害するのに必要なハプテン濃度の逆数として決定した。これは親和力の密接な近似であり、結合活性の順位付けを可能とした。
【０２５５】
競合ＥＬＩＳＡにより決定したプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキメチル）−オキシム−ＢＳＡに対する変異したＳｃ抗体の親和力は、ＳｃＰｇＢ６−１について親ＳｃＰｇＢ６の３０倍、またＳｃＰｇＢ６−３およびＳｃＰｇＢ６−４の両者について約１３倍増加した。興味あることに、最も少ない変異を有するクローンが、最も高い親和力を示した。変異体Ｓｃ抗体についての交差反応性パターンは、ＳｃＰｇＢ６−１がチトクロームＣに対するその反応性の大半を喪失した以外は、変化しなかった。ハプテンに対する免疫応答の広範な研究で、１桁の大きさの親和力の増加は特定の単一のアミノ酸置換に帰することができたが、これはＳｃ抗プロゲステロン抗体の結合部位の唯１または２のアミノ酸交換のためにハプテン−接合体に対するその増加した親和力が与えられることを意味する。単一のアミノ酸交換のみの変異体は回収されていないので、ハプテン−接合体に対する増強された親和力を与えた臨界的な残基は同定できなかった。更に、３つの変異体の全てに共通するアミノ酸置換は認められず、異なる残基を変化させることにより３−（Ｏ−カルボキシメチル）−プロゲステロンの増加した親和力を与えることができることが示唆された。ＶＨＣＤＲ２におけるＳｅｒ６４からＰｒｏ６４への置換は、変異体ＳｃＰｇＢ６−３およびＳｃＰｇＢ６−４で共通である。両者の変異体はハプテン−接合体に対する類似する親和力を示すが、多数のアミノ酸交換が２つの変異体のＶＬおよびＶＨ領域で生起したため、抗原結合についてのその残基の重要性の評価は明らかに行うことはできない。
【０２５６】
ｂ．核酸配列決定
シーカナーゼ２．０（ユナイティド・ステート・バイオケミカル）を使用し、重鎖および軽鎖の可変領域の全ヌクレオチド配列を二本鎖ＤＮＡから決定した。ＤＮＡ配列決定により、４つの全ての変異体クローン、ＳｃＰｇＢ６−１、−２、−３および−４はＳｃＰｇＢ６に由来し、ＳｃＰｇＢ６−１およびＳｃＰｇＢ６−２は同一であることが明らかとなった。このＰＣＲ手順により得られる変異の優勢な種類はＡ−Ｇ／Ｔ−Ｃヌクレオチド交換（６８％）であったが、Ｔ−Ｇ／Ａ−Ｃ、Ｇ−Ａ／Ｃ−Ｔ、Ｔ−Ａ／Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ／Ｃ−ＧまたはＣ−Ａ／Ｇ−Ｔ交換がほぼ同じ頻度で起っていた。平均より高い変異頻度のＤＮＡ配列、すなわち変異のホットスポットが観察された。さらに、３つの変異体クローンは塩基対変化の数が異なっていた。ＶＨおよびＶＬ領域についての変異頻度はＳｃＰｇＢ６−１について１．５％、ＳｃＰｇＢ６−３について２．１％およびＳｃＰｇＢ６−４について４．１％であり、これは変異体のＣＤＲおよびフレーム構造領域において多重アミノ酸置換を導くものであった。
【０２５７】
要約すると、この発明は、素朴なライブラリーからのハプテンに対する特定の抗体の選択および親和力成熟の原理を企図するものである。試験管内選択および変異誘発系は、免疫系の複雑性と比較して極めて単純であるが、幾つかの共通の特徴が存在する：（ｉ）素朴な結合ライブラリーから選択される抗体の親和力は、ハプテンに対する一次免疫応答からの抗体と同じオーダーの大きさに達することができる、（ｉｉ）生体内または試験管内で変異を生成する機構は異なるが、変異のホットスポットが認められた、（ｉｉｉ）試験管内での１回の変異および選択の後の親和力の増加は、ハプテンに対する一次から二次免疫応答への移行について観察されるのと同じオーダーの大きさである、（ｉｖ）場合により生体内で認められるように、変化した交差反応性を有する変異した抗体結合部位が回収された。
結合抗体の手法を最初に記載したが、これを使用して効率的に生体内の膨大な抗体レパートリーに踏込むことができるか否かは疑問であった。本発明は、生体内では決して選択され得ない抗体鎖の組合せに接近して展開することができることを示す。よって、今や生体内抗体応答の多様性を分子クローン化技術により越えることができるとも考えられる。
前記したものは本発明の説明として意図するものであり、限定するものではない。この発明の真の精神および範囲から逸脱することなく多数の変更および改変を行うことができる。
説明の中に挿入しなかった配列を以下に示す。
【０２５８】
〔配列表〕
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【図面の簡単な説明】
添付図面はこの開示の一部をなすものである。
【図１】 基本的な構造特徴を示す免疫グロブリン分子の説明図を示す。重鎖上の丸く囲んだ領域は可変領域（ＶＨ）を表し、その領域の生物学的に活性な（リガンド結合）部分を含むポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードする遺伝子は、本発明の方法によって製造する。
【図２Ａ】 ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１サブクラス）の重（Ｈ）鎖の説明図。左のＮ末端から右のＣ末端へと番号を付ける。４つのドメインの存在が銘記され、それぞれ約６０アミノ酸残基に渡る鎖間ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）を含む。記号ＣＨＯは炭水化物を示す。重（Ｈ）鎖（ＶＨ）のＶ領域は、３つの超可変ＣＤＲ（図示せず）を有する点でＶＬに類似する。
【図２Ｂ】 ヒト軽（カッパ）鎖（パネル１）の説明図。左のＮ末端から右のＣ末端へと番号を付ける。ＶＬおよびＣＬ ドメインの同じ番号のアミノ酸残基に鎖間ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）が渡っていることが銘記される。
パネル２は、ＶＬドメインにおける相補性決定領域（ＣＤＲ）の位置を示す。ＣＤＲの外側の断片はフレーム構造断片（ＦＲ）である。
【図３】 ラムダＨｃ２発現ベクターを製造するラムダＺａｐに挿入した二本鎖合成ＤＮＡの配列を示す。二本鎖合成ＤＮＡの調製は実施例１ａ（ｉｉ）に記載した。このベクターがＶＨコードＤＮＡ相同体を発現するのに必要な種々の特徴には、シャイン・ダルガーノリボソーム結合部位、モウバら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２７，１９８０により記載されたようにペリプラズムに対して発現した蛋白質を向けるリーダー配列、およびＶＨ相同体を発現ベクターに機能的に結合させるのに使用する種々の制限酵素部位が含まれる。またＶＨ発現ベクター配列は、可変領域重鎖（ＶＨ骨格）に典型的に認められるアミノ酸をコードする短い核酸配列も含む。このＶＨ骨格は直ぐ上流にあり、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩクローン化部位に機能的に結合したＶＨＤＮＡ相同体として適切な読取り状態にある。二本鎖合成ＤＮＡ挿入物の頂部および底部鎖の配列は、それぞれ配列番号：１および配列番号：２として列記する。合成ＤＮＡ挿入物は、制限酵素Ｎｏｔ１およびＸｈｏＩにより消化したラムダＺａｐＩＩに方向性をもって連結してラムダＨｃ２発現ベクターを形成する。
【図４】 細菌発現ベクターラムダＨｃ２（ＶＨ発現ベクター）の主要な特徴を示す。図３からの合成ＤＮＡ配列は、ラムダＺａｐＩＩ由来のＴ３ポリメラーゼプロモーターに沿って頂部に示す。ラムダＺａｐＩＩにおける挿入物の方向性を示す。ＶＨＤＮＡ相同体はＸｈｏＩおよびＳｐｅＩクローン化部位に挿入する。リードスルー転写により、クローン化部位の丁度３′に位置するデカペプチドエピトープが生成する。
【図５】 ラムダＺａｐに挿入してラムダＬｃ２発現ベクターを生成する二本鎖合成ＤＮＡの配列を示す。ＶＬコード相同体をこのベクターが発現するのに必要な種々の特徴は図３に記載した。ＶＬコードＤＮＡ相同体は、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ制限部位でＬｃ２配列に機能的に結合させる。二本鎖合成ＤＮＡ挿入物の頂部および底部鎖の配列は、それぞれ配列番号：３および配列番号：４として列記する。合成ＤＮＡは、制限酵素ＳａｃＩおよびＮｏｔＩにより消化したラムダＺａｐＩＩに方向性をもって連結してラムダＬｃ２発現ベクターを形成する。
【図６】 細菌発現ベクターＬｃ２（ＶＬ発現ベクター）の主要な特徴を示す。図５からの合成ＤＮＡ配列は、ラムダＺａｐＩＩに由来のＴ３ポリメラーゼプロモーターに沿って頂部に示す。ラムダＺａｐＩＩにおける挿入物の方向性を示す。ＶＬＤＮＡ相同体はＳａｃＩおよびＸｈｏＩクローン化部位に挿入する。
【図７】 ファージミド発現ベクターの形態でジシストロン性発現ベクター、ｐＣｏｍｂを示す。ｐＣｏｍｂを製造するため、製造業者の指針（ストラタジーン、ラ・ジョラ、カリホルニア）に従って生体内切出し手順を使用し、発現ベクター、ラムダＨｃ２およびラムダＬｃ２からファージミドを最初に切出す。ｐＣｏｍｂ発現ベクターは、ＶＨコードまたはＶＬコードＤＮＡ相同体を含まないラムダＨｃ２およびラムダＬｃ２から調製する。生体内切出し手順により、ラムダＨｃ２およびＬｃ２ベクターからファージミドベクターへとクローン化した挿入物が移動した。得られたファージミドは、親ベクター同様抗体断片クローン化および発現について同一のヌクレオチド配列を含有していた。Ｈｃ２およびＬｃ２ファージミド発現ベクターをＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩにより別々に制限消化した。ＳｃａＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端を介して線状化したファージミドを連結し、ジシストロン性（結合）ベクター、ｐＣｏｍｂを形成した。
【図８】 ｐＣＢＡＫ８−２ｂファージミドベクター、Ｆａｂ集成体のための経路およびファージコートへの組込みの説明図。Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合ポリペプチドおよびカッパ鎖をコードするヌクレオチド残基配列に加えて、ベクターはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）マーカー遺伝子を担持する。ｆ１ファージ複製開始点により一本鎖ファージミドの生成が促進される。Ｆｄ−ｃｐＶＩＩＩ融合物（ＶＨ、ＣＨ１、ｃｐＶＩＩＩ）および軽鎖（ＶＬ、ＶＣ）をコードするジシストロン性メッセージのイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導発現により重鎖および軽鎖の形成を導く。それぞれの鎖は ｐｅｌＢ標的配列によってペリプラズム空間に配送され、その後開裂される。ｃｐＶＩＩＩ融合物によって重鎖が膜中に定置するが、軽鎖はペリプラズム中に分泌される。軽鎖の存在下で重鎖が集成してＦａｂ分子を形成する。ｃｐＶＩＩＩを介してＦａｂはファージ粒子に組込まれる（黒いドット）。
【図９】 繊維状ファージの表面に沿ってＮＰＮ−ＢＳＡ接合体により被覆した５〜７ｎｍのコロイド状金粒子の電子顕微鏡的位置を示し、細菌細胞から出現したファージからのものである。パネル９ＡはＢＳＡ−ＮＰＮ抗原により被覆したコロイド状金粒子で特異的に標識した細菌細胞の表面から出現する繊維状ファージを示す。
パネル９Ｂは、成熟繊維状ファージの一部を示し、その長さ方向に抗原結合部位の標識が示されている。
【図１０】 実施例４ｂに記載したようにバクテリオファージ粒子の表面に付着したＦａｂ抗体の存在および機能について検定する２部位ＥＬＩＳＡの結果を示す。ファージ表面上でのＦａｂ抗体の発現のため、ファージミド発現ベクター、ｐＣＢＡＫ８−２ｂによりＸＬ１ブルー細胞を形質転換した。誘導因子、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの最終濃度で１時間細菌懸濁物と混合した。その後ヘルパーファージを細菌懸濁物と混合し、ファージミドＤＮＡのセンス鎖のコピーを生成した。２時間の維持時間の後、バクテリオファージ粒子を含む細菌上澄をＥＬＩＳＡでの検定のために集めた。
ＮＰＮ被覆プレートに対するＮＰＮ−Ｆａｂ発現バクテリオファージ粒子の特異的滴定可能な結合を示した。ヘルパーファージ単独では結合は検出されなかった。
【図１１】 増加する量の遊離のハプテンの添加により、ＮＰＮ抗原被覆プレートに対するＮＰＮ−Ｆａｂ発現バクテリオファージの阻害を示す。検定は図１０に記載したように行った。５ｎｇの添加した遊離のＮＰＮハプテンにより結合の完全な阻害が認められた。
【図１２】 結合特異性の変化に帰着する重鎖断片のＣＤＲ３領域を変異誘発する過程を図示的に示す。オリゴヌクレオチドプライマーは黒い棒により示した。過程は実施例６に記載した。
【図１３】 開始および選択クローンのＣＤＲ３領域の重鎖のアミノ酸配列および対応する配列番号、および遊離のフルオレセインおよびＦＩ−ＢＳＡに対するクローンの親和力を示す。アステリスクは競合ＥＬＩＳＡにより決定したおよそのＫｄを示す。
【図１４】 開始および選択クローンのＣＤＲ３領域の軽鎖のアミノ酸配列および対応する配列番号、および遊離のフルオレセインおよびＦＩ−ＢＳＡに対するクローンの親和力を示す。アステリスクは競合ＥＬＩＳＡにより決定したおよそのＫｄを示す。

Claims (3)

  1. 相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異誘発した繊維状ファージが発現した免疫グロブリンヘテロ二量体のライブラリーを製造する方法であって、
    （ｉ）鋳型免疫グロブリン重鎖可変ドメイン遺伝子及び鋳型免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン遺伝子からなる群から選ばれる鋳型免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子のＣＤＲ部分を増幅する工程、ただし前記鋳型免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子はフレーム構造領域と、前記ＣＤＲ部分を有し、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードし、前記増幅は前記ＣＤＲ部分の予備選択されたヌクレオチド領域を変異するためにＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドを用いたポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）により行われ、増幅されたＣＤＲ変異免疫グロブリン遺伝子断片のライブラリーを形成し、前記ＰＣＲプライマーオリゴヌクレオチドは３’及び５’末端を有し、かつ：
    ａ）前記選択された鋳型免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子の第１のフレーム構造領域に前記３’末端でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、
    ｂ）前記選択された鋳型免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子の第２のフレーム構造領域に前記５’末端でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、および
    ｃ）次の式：［ＮＮＳ］ｎ及び［ＮＮＫ］ｎ
    からなる群から選択された前記３’および５’末端の間のヌクレオチド配列（式中Ｎは独立に任意のヌクレオチドであり、ＳはＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、ｎは３〜２４である）を有し、前記３’および５’末端ヌクレオチド配列は６〜５０ヌクレオチドの長さを有し、またはこれに相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドを含み；
    （ｉｉ）工程（ｉ）で形成された、増幅されたＣＤＲ変異免疫グロブリン遺伝子断片のライブラリーの各構成員を、挿入すべき前記断片に対応する前記免疫グロブリン遺伝子部分を欠失した免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子を含むジシストロン性ファージミド発現ベクターに挿入する工程であって、但し該ジシストロン性ファージミド発現ベクターは、前記重鎖可変ドメインをカルボキシ末端繊維状ファージ膜ｃｐＩＩＩ又はｃｐＶＩＩＩアンカードメインとの融合蛋白質として発現する第１カセットと、前記軽鎖可変ドメインを発現する第２カセットを有し、
    該第１カセットは、第１リボゾーム結合部位、該第１リボゾーム結合部位の下流に連結された第１原核分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列、該第１原核分泌シグナルコード化ＤＮＡ配列の下流に連結された重鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列、及び該重鎖可変ドメインコード化ＤＮＡ配列の下流に連結されたカルボキシ末端繊維状ファージ膜ｃｐＩＩＩ又はｃｐＶＩＩＩアンカードメインをコードするＤＮＡ配列から成り、
    前記第２カセットは、第２リボゾーム結合部位、該第２リボゾーム結合部位の下流に連結された第２原核分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列、及び該第２原核分泌シグナルコード化ＤＮＡ配列の下流に連結された軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ配列から成り、
    且つこのベクターは、挿入の際、該ベクターがコードする重鎖及び軽鎖可変ドメインポリペプチドを発現することができ、それによって増幅されたＣＤＲ変異免疫グロブリン遺伝子断片を含むジシストロン性発現ベクターのライブラリーを形成する工程；及び
    （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で形成されたジシストロン性発現ベクターのライブラリー中の前記免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現して、繊維状ファージの表面で前記コードされた重鎖及び軽鎖可変ドメインポリペプチドを組み立て、繊維状ファージ発現免疫グロブリンヘテロ二量体を形成し、ＣＤＲで変異誘発した繊維状ファージが発現した免疫グロブリンヘテロ二量体のライブラリーを製造する工程を含む方法。
  2. 変化した抗原結合特異性を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異誘発した繊維状ファージが発現した免疫グロブリンヘテロ二量体を製造する方法であって、
    （１）請求項１に記載の工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に従って、ＣＤＲで変異誘発した繊維状ファージが発現した免疫グロブリンヘテロ二量体のライブラリーを製造する工程であって、ただし、当該工程（ｉ）において、該鋳型免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子は、それぞれ重鎖及び軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードし、該ポリペプチドは第１の抗原に対して予備選択された抗原結合特異性を有しており、且つ、該ＰＣＲによる増幅は、前記ＣＤＲ部分の予備選択されたヌクレオチド領域を変異して前記予備選択された抗原結合特異性を変化させることを特徴とする、前記免疫グロブリンヘテロ二量体のライブラリーを製造する工程；及び
    （２）上記工程（１）で形成されたＣＤＲで変異誘発した繊維状ファージが発現した免疫グロブリンヘテロ二量体のライブラリーの構成員を予備選択された第２抗原と免疫反応させ、ただしこの第２抗原は前記第１抗原とは異なるものであり、変化した抗原結合特異性を有するＣＤＲで変異誘発した繊維状ファージが発現した免疫グロブリンヘテロ二量体を選択する工程を含む方法。
  3. 予備選択された抗原に対して変化した免疫反応性を有する可溶性の相補性決定領域（ＣＤＲ）で変異誘発した免疫グロブリンヘテロ二量体を製造する方法であって、
    （１）請求項１に記載の工程（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）に従って、ＣＤＲで変異誘発した繊維状ファージが発現した免疫グロブリンヘテロ二量体のライブラリーを製造する工程であって、ただし、当該工程（ｉ）において、該鋳型免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子のそれぞれは、予備選択された抗原と免疫反応性の重鎖及び軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードしており、且つ、該ＰＣＲによる増幅は、前記ＣＤＲ部分の予備選択されたヌクレオチド領域を変異して前記予備選択された抗原に対する前記免疫グロブリンヘテロ二量体の免疫反応性を変化させることを特徴とする、前記免疫グロブリンヘテロ二量体のライブラリーを製造する工程；
    （２）変化した免疫反応性を有する免疫グロブリンヘテロ二量体を単離するために、上記工程（１）で形成されたＣＤＲで変異誘発した繊維状ファージが発現した免疫グロブリンヘテロ二量体のライブラリーの構成員を前記予備選択された抗原と免疫反応させる工程；
    （３）上記工程（２）で免疫反応した繊維状ファージが発現した免疫グロブリンヘテロ二量体を単離する工程；
    （４）上記工程（３）で単離した免疫グロブリンヘテロ二量体の可溶性の形態のものを製造する工程；及び
    （５）上記工程（４）で調製した免疫グロブリンヘテロ二量体の可溶性の形態のものをアッセイして、前記予備選択された抗原に対して変化した免疫反応性を有する免疫グロブリンヘテロ二量体を同定する工程を含む方法。
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