CN101356194B - 对人il-6具有特异性的抗体分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有IL-6抗原决定簇特异性的抗体分子，该抗体分子的治疗用途和所述抗体分子的生产方法。

Description

对人IL-6具有特异性的抗体分子

本发明涉及对IL-6抗原决定簇具有特异性的抗体分子。本发明还涉及该抗体分子的治疗用途和该抗体分子的生产方法。

IL-6是由各种细胞类型产生的多效性多功能细胞因子。最初将其鉴定为诱导B-细胞最终成熟为抗体产生细胞的B-细胞分化因子(BSF-2)(Hirano等，1986Nature 324，73-76)。已经表明IL-6在免疫调节、炎症、造血作用和肿瘤发生中起着重要作用。在免疫***内，IL-6诱导提高多克隆免疫球蛋白含量的B-细胞抗体产生。它还诱导T细胞上的白细胞介素-2(IL-2)受体表达(Nomo等，1987，Immunol.Letters，15，3，249-253)并促进活化T-细胞中的IL-2产生，由此诱导细胞毒性T-细胞的生长和分化(Okada等，1988，J Immunol，141，5，1543-1549)。还已知IL-6能决定单核细胞分化成巨噬细胞(Chomarat P等，2000，Nature Immunol.，6，510-514)。

IL-6的功能不限于免疫应答，因为它在造血作用、血栓形成、破骨细胞形成、肝脏急性期应答引发中起作用，导致C-反应蛋白(CRP)和血清淀粉状蛋白A(SAA)的升高。已知它对于表皮角化细胞、肾系膜细胞、骨髓瘤和浆细胞瘤而言是生长因子(Grossman等，1989，ProtNatl Acad Sci.86，(16)6367-6371；Horii等，1989，J Immunol，143，12，3949-3955；Kawano等，1988，Nature 332，6159，83-85)。通过各种细胞类型来生产IL-6，这些细胞类型包括单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞、表皮角化细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、胶质细胞、软骨细胞、T和B-细胞以及一些肿瘤细胞(Akira等，1990，FASEB J.，4，11，2860-2867)。除了组成型产生IL-6的肿瘤细胞以外，正常细胞不表达IL-6，除非受到适当的刺激。

IL-6是一种糖蛋白，是184个氨基酸的分子，根据翻译后修饰，具有21至28kD的分子量。在一些细胞类型中发现了可变剪接变体(Kishimoto等，1995，Blood，86，4，1243-1254)。IL-6受体(IL-6R)复合物由两个功能不同的膜蛋白构成，两个膜蛋白为80kD IL-6特异性结合链(gp80)和130kD信号转导链(gp130)。尽管IL-6不能直接结合gp130，但可以结合IL-6R，产生IL-6/IL-6R/gp30的高亲和性三元复合物。IL-6R以低亲和性结合IL-6，然而，IL-6R不具有胞内信号转导结构域，因此这种连接单独不能导致细胞激活。相似地，IL-6R的细胞表面表达并不意味着细胞对IL-6刺激有反应。蛋白酶剪切导致可溶性IL-6R(sIL-6R；sgp80)的释放，其可以结合循环的IL-6，并提高IL-6的半衰期。对于细胞激活，IL-6首先结合与IL-6R或sIL-6R结合的细胞；然后杂二聚IL-6/IL-6R复合物与细胞表面糖蛋白gp130相结合。所得到的三元杂合物结合另一个IL-6/IL-6R/gp130，接着发生信号转导(Bravo and Heath 2000，EMBO J.，19，(11)，2399-2411；Boulanger等，2003，Science，300，5628，2101-2104)，因此结合细胞的和可溶性IL-6R都引起细胞激活。将通过结合细胞的IL-6R的IL-6信号传导称为顺式(cis)信号传导，而将通过可溶性IL-6R的细胞激活描述为反式(trans)信号传导。可以通过sIL-6R由IL-6刺激表达gp130但不表达IL-6R的细胞。

已知人IL-6的中和鼠抗体能够干扰人IL-6与IL-6R(位点1)或与gp130(位点2和3)的结合(Kalai等，1997，Eur.J.Biochem.249，690-700；Brakenhoff等，1990，Journal of Immunology，145，561-568；Wendling等，1993，Journal of Rheumatology，29，259-262)。

美国专利US 5,856,135公开了将阻断IL-6结合IL-6R的人IL-6人抗体的重构。这些抗体源自小鼠单克隆抗体SK2，其中将来自小鼠抗体SK2可变区的互补决定区(CDR)移植至人抗体的可变区。

还已知IL-6的中和人自身抗体(Hansen等，Eur.J.Immunol，1995，25，348-354)。

WO2004039826中描述了位点I嵌合鼠/人抗IL-6抗体，用于治疗中。

人源化的抗人IL-6受体单克隆抗体正处于类风湿性关节炎治疗的III期临床试验中(Kishimoto，2005，Annu Rev Immunol.23：1-21)。还报道了相同的抗体在节段性回肠炎的II期研究中是有效的。还在NZB/W F₁小鼠的狼疮样疾病中证明了抗IL-6和抗IL-6R抗体的功效(Fink等，1994，J.Clin.Invest.94，585；Mihara等，1998，Clin.Exp.Immunol.112，397)。将鼠IL-6受体的中和抗体抑制了疾病过继转移模型中的结肠炎(Yamamoto等，2000，Journal ofImmunology，164，4878；Atreya等，2000，Nature Med 6，583)。后一研究还证明了抗受体抗体在结肠炎的IL-10敲除小鼠模型中和在肠炎的TNBS模型中的功效。

我们现已鉴定了一种在体内，例如，在在此所述的体内模型中特别有效的高亲和性中和抗IL-6抗体。

根据Kabat等设计的体系将抗体可变区中的残基按常规编号。该体系列于Kabat等，1987，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest中，US Department of Health and Human Services，NIH，USA(此后称为“Kabat等，(上文)”)。除非另外指出，该编号体系用于本说明书中。

Kabat残基标号并非总是直接对应于氨基酸残基的直线编号。实际的直链氨基酸序列可能含有比对应于结构成分的缩短，或***到结构成分中的严格Kabat编号更少或更多的氨基酸，不管是基础可变结构域结构的框架还是互补决定区(CDR)。对于给定的抗体，可以通过抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性残基的比对来确定残基的正确Kabat编号。

根据Kabat编号体系，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(CDR-H1)，残基50-65(CDR-H2)和残基95-102(CDR-H3)。然而，根据Chothia(Chothia，C.和Lesk，A.M.J.Mol.Biol.，196，901-917(1987))，相当于CDR-H1的环从残基26延伸至残基32。因此，如在此所用的“CDR-H1”包括残基26至35，如结合Kabat编号体系和Chothia的拓扑环定义所描述的。

根据Kabat编号体系，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(CDR-L1)，残基50-56(CDR-L2)和残基89-97(CDR-L3)。

如在此所用的，术语“中和抗体”描述了能够中和IL-6生物信号传导活性的抗体，例如，通过阻断IL-6与gp130受体的位点3结合。

可以使用本领域已知的任何合适的方法来获得本发明中所用的抗体。IL-6多肽或表达多肽的细胞可以用来产生特异性识别IL-6的抗体。IL-6多肽可以是“成熟”多肽或其生物活性片段或衍生物。优选，IL-6多肽是成熟多肽。IL-6多肽可以通过本领域公知的方法从包括表达***的遗传工程化宿主细胞来制备或可以从天然生物来源收集。在本申请中，术语“多肽”包括肽，多肽和蛋白质。这些可交替使用，除非另外指出。在一些情况中，IL-6多肽可以是较大蛋白质的一部分，如融合蛋白，例如，与亲和性标记物融合的。可以获得针对IL-6多肽产生的抗体，其中动物的免疫是必需的，通过将多肽给予动物，优选非人动物，使用公知和常规的方案，参见，例如，Handbook ofExperimental Immunology，D.M.Weir(编辑)，Vol 4，BlackwellScientific Publishers，Oxford，England，1986。可以免疫许多温血动物，如兔子，小鼠，大鼠，绵羊，奶牛或猪。然而，一般优选小鼠，兔子，猪和大鼠。

本发明中所用的抗体包括完整的抗体及其功能活性片段或衍生物，并且可以是，但不限于，单克隆，人源化，完全人源性或嵌合的抗体。

可以通过本领域已知的任何方法如杂交瘤技术(Kohler &Milstein，1975，Nature，256：495-497)，三源杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，Immunology Today，4：72)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，pp77-96，Alan R Liss，Inc.，1985)来制备单克隆抗体。

还可以使用单个淋巴细胞抗体方法来产生本发明中所用的抗体，通过克隆和表达产自选择用于生产特异性抗体的单个淋巴细胞的免疫球蛋白可变区cDNA，通过例如Babcook，J.等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15)：7843-78481；WO92/02551；WO2004/051268和国际专利申请号WO2004/106377中所述的方法。

人源化抗体(其包括CDR-移植抗体)是来自非人物种的抗体分子，具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区(参见，例如，US5,585,089；WO91/09967)。将认识到可能只需要转移CDR的特异性决定残基，而不是整个CDR(参见，例如，Kashmiri等，2005，Methods，36，25-34)。人源化抗体可以任选进一步包括一个或多个源自非人物种的框架残基，而CDR则源自该非人物种。

嵌合抗体是那些由遗传工程化的免疫球蛋白基因编码的抗体，使得其轻链和重链基因由属于不同物种的免疫球蛋白基因区段构成。

还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生本发明中所用的抗体，包括Brinkman等(J.Immunol.Methods，1995，182：41-50)，Ames等(J.Immunol.Methods，1995，184：177-186)，Kettleborough等(Eur.J.Immunol.1994，24：952-958)，Persic等(Gene，1997，1879-18)，Burton等(Advances in Immunology，1994，57：191-280)和WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401和US5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108中公开的那些。

完全人源性抗体是其中两个重链和轻链的可变区和恒定区(如果存在的话)全部是人来源的，或与人来源的序列基本上相同的，但不一定来自相同的抗体那些抗体。完全人源性抗体的实例包括例如通过上述的噬菌体展示方法产生的抗体和通过小鼠产生的抗体，其中鼠免疫球蛋白可变和恒定部分基因已经由人副本替代，例如，如EP0546073 B1，US5,545,806，US5,569,825，US5,625,126，US5,633,425，US5,661,016，US5,770,429，EP0438474B1和EP0463151 B1中所概述的。

在一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性并包括重链的中和抗体，其中该重链的可变结构域包括具有SEQ ID NO：5所示CDR-H1序列的CDR，具有SEQ ID NO：6所示CDR-H2序列的CDR和具有SEQ ID NO：7所示CDR-H3序列的CDR中的至少一个。

在另一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性并包括重链的中和抗体，其中该重链可变结构域的CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3中的至少两个选自以下：SEQ ID NO：5所示的CDR-H1序列，SEQ ID NO：6所示的CDR-H2序列，SEQ ID NO：7所示的CDR-H3序列。例如，抗体可以包括其中CDR-H1具有SEQ ID NO：5所示序列和CDR-H2具有SEQ IDNO：6所示序列的重链。或者，抗体可以包括其中CDR-H1具有SEQ IDNO：5所示序列和CDR-H3具有SEQ ID NO：7所示序列的重链，或抗体可以包括其中CDR-H2具有SEQ ID NO：6所示序列和CDR-H3具有SEQ IDNO：7所示序列的重链。为了避免疑惑，可以理解包括所有的排列。

在另一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性并包括重链的中和抗体，其中该重链的可变区包括SEQ ID NO：5所示的CDR-H1序列，SEQ ID NO：6所示的CDR-H2序列和SEQ ID NO：7所示的CDR-H3序列。

在一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性并包括轻链的中和抗体，其中该轻链的可变结构域包括具有SEQ ID NO：8所示CDR-L1序列的CDR，具有SEQ ID NO：9所示CDR-L2序列的CDR和具有SEQ ID NO：10所示CDR-L3序列的CDR中的至少一个。

在另一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性并包括轻链的中和抗体，其中该轻链可变结构域的CDR-L1，CDR-L2和CDR-L3中的至少两个选自以下：SEQ ID NO：8所示的CDR-L1序列，SEQ ID NO：9所示的CDR-L2序列，SEQ ID NO：10所示的CDR-L3序列。例如，抗体可以包括其中CDR-L1具有SEQ ID NO：8所示序列和CDR-L2具有SEQ IDNO：9所示序列的轻链。或者，抗体可以包括其中CDR-L1具有SEQ IDNO：8所示序列和CDR-L3具有SEQ ID NO：10所示序列的轻链，或抗体可以包括其中CDR-L2具有SEQ ID NO：9所示序列和CDR-L3具有SEQ IDNO：10所示序列的轻链。为了避免疑惑，可以理解包括所有的排列。

在另一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性并包括轻链的中和抗体，其中该可变结构域包括SEQ ID NO：8所示的CDR-L1序列，SEQ ID NO：9所示的CDR-L2序列和SEQ ID NO：10所示的CDR-L3序列。

将认识到可以对本发明提供的CDR进行一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失，而不会显著改变抗体结合IL-6和中和IL-6活性的能力。本领域技术人员可以容易地测试任何氨基酸置换、添加和/或缺失的影响，例如，通过使用实施例中所述的方法来测定IL-6结合和中和。因此，在一个实施例中，本发明提供了对人IL-6具有特异性并包括一个或多个选自CDRH-1(SEQ ID NO：5)、CDRH-2(SEQ ID NO：6)、CDRH-3(SEQ ID NO：7)、CDRL-1(SEQ ID NO：8)、CDRL-2(SEQ ID NO：9)和CDRL-3(SEQ ID NO：10)的CDR的抗体，其中一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸由另一个氨基酸来替代。

本发明的抗体分子优选分别包括互补轻链或互补重链。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的抗体包括重链和轻链，其中重链的可变结构域包括SEQ ID NO：5所示的CDR-H1序列，SEQ IDNO：6所示的CDR-H2序列和SEQ ID NO：7所示的CDR-H3序列，并且其中轻链的可变结构域包括SEQ ID NO：8所示的CDR-L1序列，SEQ ID NO：9所示的CDR-L2序列和SEQ ID NO：10所示的CDR-L3序列。

在一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性并包括重链和轻链的抗体，其中重链的可变结构域包括SEQ ID NO：5所示的CDR-H1序列，SEQ ID NO：6所示的CDR-H2序列和SEQ ID NO：7所示的CDR-H3序列，并且其中轻链的可变结构域包括SEQ ID NO：8所示的CDR-L1序列，SEQ ID NO：9所示的CDR-L2序列和SEQ ID NO：10所示的CDR-L3序列，其中一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸由另一个氨基酸来替代。

在一个实施方案中，本发明的抗体包括重链，其中重链的可变结构域包括SEQ ID NO：2中所示的序列。

在另一个实施方案中，本发明的抗体包括重链，其中重链的可变结构域包括具有至少60％SEQ ID NO：2中所示序列的同一性或相似性的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包括重链，其中重链的可变结构域包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQ ID NO：2中所示序列的同一性或相似性的序列。

如在此所用的“同一性”表示在比对序列的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基相同。如在此所用的“相似性”表示在比对序列的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基属于相似的类型。例如，用亮氨酸替代异亮氨酸或缬氨酸。通常可以相互替代的其他氨基酸包括，但不限于：

-苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸(具有芳香侧链的氨基酸)；

-赖氨酸，精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；

-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；

-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和

-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。

可以容易地计算出同一性和相似性的程度(ComputationalMolecular Biology(计算分子生物学)，Lesk，A.M.编辑，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics andGenome Projects(生物计算。信息学和基因组计划)，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data(序列数据的计算机分析)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology(分子生物学中的序列分析)vonHeinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M Stockton Press，New York，1991)。

在一个实施方案中，本发明的抗体包括轻链，其中该轻链的可变结构域包括SEQ ID NO：4中所示的序列。

在另一个实施方案中，本发明的抗体包括轻链，其中该轻链的可变结构域包括具有至少60％SEQ ID NO：4中所示序列的同一性或相似性的序列。在一个实施方案中，本发明的抗体包括轻链，其中该轻链的可变结构域包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQ ID NO：4中所示序列的同一性或相似性的序列。

在一个实施方案中，本发明包括重链和轻链，其中该重链的可变结构域包括SEQ ID NO：2中所示的序列和其中该轻链的可变结构域包括SEQ ID NO：4中所示的序列。

在本发明的另一个实施方案中，包括重链和轻链，其中该重链的可变结构域包括具有至少60％SEQ ID NO：2中所示序列的同一性或相似性的序列，而该轻链的可变结构域包括具有至少60％SEQ ID NO：4中所示序列的同一性或相似性的序列。优选，抗体包括重链和轻链，其中该重链的可变结构域包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQID NO：2中所示序列的同一性或相似性的序列，而该轻链的可变结构域包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQ ID NO：4中所示序列的同一性或相似性的序列。

在一个实施方案中，本发明的抗体是大鼠抗体，其中重链的可变结构域包括SEQ ID NO：2中所示的序列，并且轻链的可变结构域包括SEQ ID NO：4中所示的序列。在此将该大鼠抗体称为“132E09”或“供体”抗体。SEQ ID NO：1和2中各自提供了大鼠抗体132E09的重链可变结构域的完整核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和4中各自提供了大鼠抗体132E09的轻链可变结构域的完整核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO：5、6、7、8、9和10中所示的CDR源自大鼠抗体132E09。

在一个实施方案中，本发明的抗体是CDR-移植抗体。如在此所用的，术语“CDR-移植抗体”指的是如下的抗体，其中重链和/或轻链含有一个或多个来自供体抗体(例如，大鼠抗体)并移植入受体抗体(例如，人抗体)的重链和/轻链可变结构域框架的CDR(包括，如果需要，一个或多个修饰的CDR)。对于综述，参见Vaughan等，NatureBiotechnology，16，535-539，1998。优选，一个或多个CDR获自大鼠抗体132E09(SEQ ID NO：5、6、7、8、9和10)。在一个不是转移完整CDR的实施方案中，只有一个或多个来自上述任一CDR的特异性决定残基被转移至人抗体框架(参见，例如，Kashmiri等，2005，Methods，36，25-34)。在一个实施方案中，只有来自上述一个或多个CDR的特异性决定残基被转移至人抗体框架。在另一个实施方案中，只有来自上述每个CDR的特异性决定残基被转移至人抗体框架。

将CDR或特异性决定残基移植时，考虑产生CDR的供体抗体的类别/类型，可以使用任何合适的受体可变区框架序列。优选，本发明的CDR-移植抗体具有至少一个包括人受体框架区的可变结构域以及一个或多个源自上述供体抗体的CDR。因此，提供了中和CDR-移植抗体，其中可变结构域包括人受体框架区和非人(优选，大鼠)供体CDR。

可用于本发明中的人框架的实例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等，上文)。例如，KOL和NEWM可以用于重链，REI可以用于轻链，而EU、LAY和POM可以用于重链和轻链。或者，可以使用人种系序列；这些序列在：http://vbase.mrccpe.cam.ac.uk/可获得。

在本发明的CDR-移植抗体中，受体重链和轻链不是必需要源自相同的抗体，如果需要，可以包括复合链，其具有源自不同链的框架区。

用于本发明的CDR-移植抗体重链的优选框架区源自人亚组VH3序列1-43-72和JH4(显示于图2中；SEQ ID NO：19和20)。因此，提供了包括至少一个非人供体CDR的中和CDR-移植抗体，其中重链框架区源自人亚组序列1-43-72和JH4。人JH4的序列如下：(YFDY)WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：20)。YFDY基序是CDR-H3的一部分并且不是框架4的一部分(Ravetch，JV.等，1981，Cell，27，583-591)。供体序列是图2中所示的132E09 VH序列(SEQ ID NO：2)，并且供体CDR(SEQ ID NO：5、6和7)是带下划线的。

用于本发明CDR-移植抗体轻链的优选框架区源自人种系亚组VK1序列2-1-(1)012和JK2，显示于图2中(SEQ ID NO：21和22)。因此，提供了包括至少一个非人供体CDR的中和CDR-移植抗体，其中轻链框架区源自人亚组序列VK1 2-1-(1)012和JK2。JK2序列如下：(YT)FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO：22)。YT基序是CDR-L3的一部分并且不是框架4的一部分(Hieter，PA.等，1982，J.Biol.Chem.，257，1516-1522)。供体序列是图2中所示的132E09VL序列(SEQ ID NO：4)，供体CDR(SEQ ID NO 8、9和10)是带下划线的。

此外，在本发明的CDR-移植抗体中，框架区不需要具有与受体抗体完全相同的序列。例如，可以将稀有残基改变成对于受体链类别或类型而言更常出现的残基。或者，可以改变受体框架区中选定的残基，使得它们对应于供体抗体中相同位置上发现的残基(参见，Reichmann等，1998，Nature，332，323-324)。应当保持这样的改变至恢复供体抗体亲和性所必需的最小化。选择受体框架区中可能需要改变的残基的方案列于WO91/09967中。

优选，在本发明的CDR-移植抗体分子中，如果受体重链具有人VH3序列1-43-72和JH4，那么重链的受体框架区除了一个或多个CDR以外，至少在位置49还包括供体残基(根据Kabat等，(上文))。因此，提供了CDR-移植抗体，其中至少重链可变结构域位置49的残基是供体残基。

优选，在根据本发明的CDR-移植抗体分子中，如果受体轻链具有人亚组VK1序列2-1-(1)012和JK2，那么轻链的受体框架区中没有使用供体残基，并且只转移了一个或多个CDR。

供体残基是来自供体抗体的残基，即，最初产生CDR的抗体，在本发明的情况中，是大鼠抗体132E09。

因此，本发明提供了其中重链可变区包括gH13序列(图2；SEQ IDNO：11)的抗体。

在本发明的一个实施方案中，抗体包括重链，其中该重链的可变结构域包括具有至少60％SEQ ID NO：11中所示序列的同一性或相似性的序列。优选，抗体包括重链，其中该重链的可变结构域包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQ ID NO：11中所示序列的同一性或相似性的序列。

此外，本发明提供了其中轻链可变区包括gL10(图2；SEQ IDNO：13)的抗体。

在本发明的一个实施方案中，抗体包括轻链，其中该轻链的可变结构域包括具有至少60％SEQ ID NO：13中所示序列的同一性或相似性的序列。优选，抗体包括轻链，其中该轻链的可变结构域包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQ ID NO：13中所示序列的同一性或相似性的序列。

优选，根据本发明的CDR-移植抗体包含包括gH13序列(SEQ IDNO：11)的重链和包括gL10序列(SEQ ID NO：13)的轻链。

在本发明的一个实施方案中，抗体包括重链和轻链，其中该重链的可变结构域包括具有至少60％SEQ ID NO：11中所示序列的同一性或相似性的序列，并且该轻链的可变结构域包括具有至少60％ SEQ IDNO：13中所示序列的同一性或相似性的序列。优选，抗体包括重链和轻链，其中该重链的可变结构域包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQ ID NO：11中所示序列的同一性或相似性的序列，其中该轻链的可变结构域包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQ ID NO：13中所示序列的同一性或相似性的序列。

本发明的抗体分子可以包括具有全长重链和轻链或其片段的完整抗体分子，并且可以是，但不限于，Fab，修饰的Fab，Fab’，F(ab’)₂，Fv，单域抗体，scFv，二价、三价或四价抗体，Bis-scFv，双抗，三抗，四抗和上述任一的抗原决定部位结合片段(参见，例如，Holliger和Hudson，2005，Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair和Lawson，2005，Drug Design Reviews-Online 2(3)，209-217)。形成和制造这些抗体片段的方法是本领域已知的(参见，例如，Verma等，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)。用于本发明中的其他抗体片段包括国际专利申请WO2005/003169，WO2005/003170和WO2005/003171中所述的Fab和Fab’片段。多价抗体可以包括多重特异性或可以是单特异性的(参见，例如，WO92/22853和WO05/113605)。

本发明抗体分子的恒定区结构域，如果存在，可以考虑该抗体分子被提议的功能，特别是可能需要的效应物功能来进行选择。例如，恒定区结构域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。特别地，打算将抗体分子用于治疗用途并且需要抗体效应分子时，可以使用人IgG恒定区结构域，尤其是IgG1和IgG3同型。或者，打算将抗体分子用于治疗目的但不需要抗体效应物功能时，例如对于简单阻断IL-6活性，可以使用IgG2和IgG4同型。将认识到还可以使用这些恒定区结构域的序列变体。例如，可以使用Angal等，Molecular Immunology，1993，30(1)，105-108中所述的将位置241的丝氨酸变为脯氨酸的IgG分子。特别优选的是包括这种改变的IgG4恒定结构域。本领域技术人员还可以理解抗体可以经受各种翻译后修饰。这些修饰的类型和程度通常取决于用来表达抗体的宿主细胞系以及培养条件。这样的修饰可以包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮基哌嗪形成、天冬氨酸异构化和天冬酰胺脱酰胺中的变化。常见的修饰是由于羧肽酶的作用而失去羧基端碱性残基(如赖氨酸或精氨酸)(如Harris，RJ，Journal ofChroma tography 705：129-134，1995)。因此，SEQ ID NO：16的抗体重链的C-端赖氨酸可以不存在。

在优选的实施方案中，本发明提供的抗体是对人IL-6具有特异性的中和抗体，其中重链恒定区包括人IgG4恒定区，其中位置241的丝氨酸已经由脯氨酸替代，如Angal等，上文中所述的。因此，本发明提供了其中重链包括SEQ ID NO：16所示序列或由SEQ ID NO：16所示序列构成的抗体。优选，轻链恒定区是cκ。

在一个实施方案中，本发明提供了其中重链包括SEQ ID NO：16所示序列或由SEQ ID NO：16所示序列构成和轻链包括SEQ ID NO：18所示序列或由SEQ ID NO：18所示序列构成的抗体。

在本发明的一个实施方案中，抗体包括重链，其中该重链包括具有至少60％SEQ ID NO：16中所示序列的同一性或相似性的序列。优选，抗体包括重链，其中该重链包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQID NO：16中所示序列的同一性或相似性的序列。

在本发明的一个实施方案中，抗体包括轻链，其中该轻链包括具有至少60％SEQ ID NO：18中所示序列的同一性或相似性的序列。优选，抗体包括轻链，其中该轻链包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQID NO：18中所示序列的同一性或相似性的序列。

在本发明的一个实施方案中，抗体包括重链和轻链，其中该重链包括具有至少60％SEQ ID NO：16中所示序列的同一性或相似性的序列，而该轻链包括具有至少60％SEQ ID NO：18中所示序列的同一性或相似性的序列。优选，抗体包括重链和轻链，其中该重链包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQ ID NO：16中所示序列的同一性或相似性的序列，而该轻链包括具有至少70％、80％、90％、95％或98％SEQ ID NO：18中所示序列的同一性或相似性的序列。

本发明还提供了根据本发明的抗体结合的人IL-6的特异性区域或抗原决定部位，特别是包括CDR-H1(SEQ ID NO：5)、CDR-H2(SEQID NO：6)、CDR-H3(SEQ ID NO：7)、CDR-L1(SEQ ID NO：8)、CDR-L2(SEQ ID NO：9)或CDR-L3(SEQ ID NO：10)任一的抗体，例如，抗体132E09，或包括重链可变区序列gH13(SEQ ID NO：11)和/或轻链可变区序列gL10(SEQ ID NO：13)的抗体。

可以通过本领域已知的任何合适的抗原决定部位作图方法结合本发明提供的任一种抗体来鉴定这种人IL-6多肽的特异性区域或抗原决定部位。这样的方法的实例包括筛选源自结合本发明抗体的IL-6的不同长度的肽，使用可以特异性结合含有抗体识别的抗原决定部位序列的抗体的最小片段。可以通过合成或通过IL-6多肽的蛋白水解消化来产生IL-6肽。例如，可以通过质谱分析来鉴定结合抗体的肽。在另一个实施例中，NMR光谱学可以用来鉴定本发明抗体结合的抗原决定部位，如在此的实施例中所述的。一定鉴定出，可以使用结合本发明抗体的抗原决定片段，如果需要，作为免疫原来获得结合相同抗原决定部位的其他中和抗体。

在一个实施例中，本发明抗体结合的人IL-6的抗原决定部位至少包括人IL-6的氨基酸残基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169(根据Boulanger等的残基编号，Science，300，2101-2104)。在一个实施例中，本发明抗体结合的人IL-6的抗原决定部位包括氨基酸残基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169以及一个或多个选自C44、S53、A58、V96、Q152、Q154、N155、W157、T163、L165和E172的残基。

在一个实施例中，本发明抗体结合的人IL-6的抗原决定部位包括氨基酸残基C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169和E172。

在一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性的中和抗体，其结合成熟人IL-6的抗原决定部位，其包括氨基酸残基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169。

在一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性的中和抗体，其结合成熟人IL-6的抗原决定部位，其包括氨基酸残基S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169以及一个或多个选自C44，S53，A58，V96，Q152，Q154，N155，W157，T163，L165和E172的残基。

在一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性的中和抗体，其结合成熟人IL-6的抗原决定部位，其包括氨基酸残基C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169和E172。

将认识到也可以基于未加工的IL-6前体的氨基酸编号来进行上述残基的编号(Swiss Prot登录号P05231)。使用该编号，根据Boulanger等(上文)的上述编号的残基，如C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169和E172分别变成C72、S75、C78、S81、A86、E121、V124、R132、F133、E134、T177、K178、Q180、A181、Q182、N183、Q184、W185、Q187、T191、L193、S197和E200。

优选，本发明的抗体阻断gp130受体与人IL-6的位点3的结合。

交叉阻断本发明的抗体与IL-6结合的抗体可以相似地用于中和IL-6活性中。因此，本发明还提供了对人IL-6具有特异性的中和抗体，其交叉阻断上述任一种抗体与人IL-6的结合和/或被那些抗体中任一种交叉阻断以免结合IL-6。在一个实施方案中，这样的抗体结合与上述抗体相同的抗原决定部位。在另一个实施方案中，交叉阻断中和抗体结合与上述抗体结合的抗原决定部位相连和/或重叠的抗原决定部位。在另一个实施方案中，本发明这一方面的交叉阻断中和抗体不结合与本发明抗体相同的抗原决定部位或与所述抗原决定部位相连和/或重叠的抗原决定部位。

可以使用本领域任何合适的方法来鉴定交叉阻断抗体，例如，使用竞争ELISA或BIAcore，其中交叉阻断抗体与人IL-6的结合可防止本发明的抗体的结合，或反之亦然。

在一个实施方案中，提供了对人IL-6具有特异性的中和抗体，其交叉阻断抗体132E09或其重链包括序列gH13(SEQ ID NO：11)的抗体或其轻链包括序列gL10(SEQ ID NO：13)的抗体或包括CDR-H1(SEQID NO：5)、CDR-H2(SEQ ID NO：6)、CDR-H3(SEQ ID NO：7)、CDR-L1(SEQ ID NO：8)、CDR-L2(SEQ ID NO：9)或CDR-L3(SEQ ID NO：10)任一个的抗体与人IL-6的结合。在一个实施方案中，本发明所提供的交叉阻断抗体抑制80％或更高，85％或更高，90％或更高，或95％或更高的132E09或其重链包括序列gH13(SEQ ID NO：11)的抗体或其轻链包括序列gL10(SEQ ID NO：13)的抗体或包括CDR-H1(SEQ ID NO：5)、CDR-H2(SEQ ID NO：6)、CDR-H3(SEQ ID NO：7)、CDR-L1(SEQ IDNO：8)、CDR-L2(SEQ ID NO：9)或CDR-L3(SEQ ID NO：10)任一个的抗体与人IL-6的结合。

可替换地或另外，根据本发明这一方面的中和抗体可以被本发明的任一抗体交叉阻断以免与人IL-6结合。因此，还提供了对人IL-6具有特异性的中和抗体分子，其被抗体132E09或其重链包括序列gH13(SEQ ID NO：11)的抗体或其轻链包括序列gL10(SEQ ID NO：13)的抗体或包括CDR-H1(SEQ ID NO：5)、CDR-H2(SEQ ID NO：6)、CDR-H3(SEQ ID NO：7)、CDR-L1(SEQ ID NO：8)、CDR-L2(SEQ ID NO：9)或CDR-L3(SEQ ID NO：10)任一个的抗体交叉阻断以免结合人IL-6。在一个实施方案中，本发明这一方面所提供的中和抗体80％或更高，85％或更高，90％或更高，或95％或更高被132E09或其重链包括序列gH13(SEQ ID NO：11)的抗体或其轻链包括序列gL10(SEQ ID NO：13)的抗体或包括CDR-H1(SEQ ID NO：5)、CDR-H2(SEQ ID NO：6)、CDR-H3(SEQ ID NO：7)、CDR-L1(SEQ ID NO：8)、CDR-L2(SEQ ID NO：9)或CDR-L3(SEQ ID NO：10)任一个的抗体抑制以免结合人IL-6。

本发明的抗体分子优选对于人IL-6具有高结合亲和性，优选微微摩尔。可以使用本领域已知的任何合适方法来测量亲和性，包括在此的实施例中所述的BIAcore。优选，使用在此的实施例中所述的重组人IL-6来测量亲和性。优选，根据本发明的抗体分子对于人IL-6具有低于500pM的亲和性。优选，根据本发明的抗体分子对于人IL-6具有低于50pM的亲和性。因此，在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约1至约500pM的亲和性。在一个实施方案中，本发明的抗体分子具有约1至约50pM的亲和性。优选，本发明的抗体分子对于人IL-6具有约1至约20pM的亲和性。在一个实施方案中，本发明的抗体对于人IL-6具有8至12pM的亲和性。将认识到可以使用本领域已知的任何合适方法来改变本发明提供的抗体的亲和性。因此，本发明还涉及本发明抗体分子的变体，其对于人IL-6具有提高的亲和性。通过各种亲和力成熟方案可以获得这样的变体，这些方案包括使CDR突变(Yang等，J.Mol.Biol.，254，392-403，1995)、链改组(Marks等，Bio/Technology，10，779-783，1992)、使用大肠杆菌的增变株(Low等，J.Mol.Biol.250，359-368，1996)、DNA改组(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol，8，724-733，1997)、噬菌体展示(Thompson等，J.Mol.Biol.，256，77-88，1996)和有性PCR(Crameri等，Nature，391，288-291，1998)。Vaughan等(上文)讨论了这些亲和力成熟的方法。

本发明的抗体分子优选中和IL-6活性，例如，在实施例中所述的体外和体内测定中。在一个实施方案中，这些抗体与人IL-6的位点3结合。

在一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性的中和抗体，其能够在低于100pM的浓度下抑制0.038nM人IL-650％的活性，所述抑制活性是基于IL-6诱导的T1165细胞增殖来测量的。在一个实施方案中，抑制50％IL-6的抗体浓度为低于50pM，更优选低于20pM。优选，测定中所用的人IL-6是人重组IL-6。在一个实施方案中，中和抗体是人源化或完全人源性抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性的中和抗体，其能够在低于1nM的浓度下抑制3.84nM人IL-650％的活性，所述抑制活性是基于HUVEC应答人IL-6和sIL-6R的MCP-1产生所测量的。优选，测定中所用的人IL-6是人重组IL-6。在一个实施方案中，中和抗体是人源化或完全人源性抗体。

如果需要，根据本发明的抗体可以与一个或多个效应分子缀合。将认识到，在一个实施方案中，效应分子可以包括单个效应分子或两个或多个这样的分子，使得连接形成可以与本发明的抗体连接的单个部分。在希望获得与效应分子连接的抗体片段的情况下，可以通过标准化学或重组DNA方法来制备，其中将抗体片段直接或通过偶联剂与效应分子连接。将这样的效应分子与抗体缀合的技术是本领域公知的(参见，Hellstrom等，Controlled Drug Delivery(受控药物递送)，第2版，Robinson等编辑，1987，pp.623-53；Thorpe等，1982，Immunol.Rev.，62：119-58和Dubowchik等，1999，Pharmacology andTherapeutics，83，67-123)。特定的化学方法包括，例如，WO93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476和WO 03031581中所述的那些。或者，在效应分子是蛋白质或多肽的情况下，可以使用重组DNA方法实现连接，例如，如在WO86/01533和EP0392745中所述的。

如在此所用的术语效应分子包括，例如，抗肿瘤剂，药物，毒素，生物活性蛋白，例如，酶，其他抗体或抗体片段，合成或天然产生的聚合物，核酸及其片段，例如，DNA，RNA及其片段，放射性核素，特别是放射性碘化物，放射性同位素，螯合金属，纳米颗粒和受体基团，如荧光化合物或可以通过NMR或ESR光谱学检测的化合物。

效应分子的实例可以包括细胞毒素或细胞毒性剂，包括对细胞有害(例如，杀伤)的任何试剂。实例包括combrestatin、海兔毒素、埃博霉素、癌基因抑活药、maytansinoid、根瘤菌素、软海绵素、杆孢菌素、哈米特林、紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、足叶乙甙、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普卡霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、肾上腺糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素，及其类似物或同系物。

效应分子还包括，但不限于，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)，烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺、thioepa chlorambucil、美法仑、卡氮芥(BSNU)和环己亚硝脲(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类(例如，柔红霉素(之前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，更生霉素(之前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素、氨茴霉素(AMC)、刺孢霉素或duocarmycin)以及抗有丝切割剂(例如，长春新碱和长春花碱)。

其他效应分子可以包括螯合的放射性核素，如¹¹¹In和⁹⁰Y、Lu¹⁷⁷、铋²¹³、锎²⁵²、铱¹⁹²和钨¹⁸⁸/铼¹⁸⁸；或药物，如但不限于，烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶I抑制剂、taxoid和苏拉明。

其他效应分子包括蛋白质、肽和酶。目标酶包括，但不限于，蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。目标蛋白质、多肽和肽包括，但不限于，免疫球蛋白，毒素，如相思豆毒素、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白质，如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子或组织血纤维蛋白溶酶原激活剂、血栓形成剂或抗血管生成剂，例如，血管他丁或内皮他丁，或生物反应调节剂，如淋巴因子、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、神经生长因子(NGF)或其他生长因子和免疫球蛋白。

其他效应分子可以包括例如可用于诊断中的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性核素、正电子发射金属(用于正电子发射断层扫描中)以及非放射性顺磁性金属离子。对于可以与抗体缀合用作诊断剂的金属离子，总地参见美国专利US 4,741,900。合适的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基包括抗生物素蛋白链菌素、抗生物素蛋白和生物素；合适的荧光物质包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯和藻红蛋白；合适的发光物质包括鲁米诺；合适的生物发光物质包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性核素包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In和⁹⁹Tc。

在另一实施例中，效应分子可以提高抗体在体内的半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或促进抗体穿过内皮屏障递送至免疫***。合适的这种类型的效应分子的实例包括聚合物、白蛋白、白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，如在WO05/117984(05年12月15日公开)中所述的。

在效应分子是聚合物的情况下，通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如，任选取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化亚烷基聚合物或支链或直链多糖，例如，同-或杂-多糖。

可以存在于上述合成聚合物上的特定任选的取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。

合成聚合物的特定实例包括任选取代的直链或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任选取代的聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

特定的天然存在的聚合物包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。

如在此所用的“衍生物”旨在包括反应性衍生物，例如，巯基选择性反应基团，如马来酰亚胺等。反应基团可以直接或通过连接物区段与聚合物连接。将认识到在一些情况中，这种基团的残基构成产物的一部分，作为抗体片段与聚合物之间的连接基团。

按照需要，聚合物的大小可以不同，但通常为500Da至50000Da的分子量范围，优选5000至40000Da，更优选20000至40000Da。特别地，可以基于产物的预期用途来选择聚合物大小，例如，定位于某些组织如肿瘤的能力或延长循环半衰期(对于综述，参见Chapman，2002，Advanced Drug Delivery Reviews，54，531-545)。因此，例如，在打算使产物离开循环并渗透组织的情况下，例如，用于肿瘤的治疗中，可以有利地使用小分子量的聚合物，例如，具有约5000Da的分子量。对于其中产物保留在循环中的应用，可以有利地使用较高分子量的聚合物，例如，具有20000Da至40000Da的分子量。

特别优选的聚合物包括聚亚烷基聚合物，如聚(乙二醇)，或尤其是，甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，并且尤其是具有约15000Da至约40000Da的分子量。

在一个实施例中，将用于本发明中的抗体与聚(乙二醇)(PEG)部分连接。在一个特定实施例中，抗体是抗体片段，并且可以通过位于该抗体片段中的任何可利用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能团连接PEG分子，例如这些基团为任何游离的氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基。这样的氨基酸可以在抗体片段中天然存在或可以使用重组DNA方法工程化至片段中(参见，例如，US5,219,996；US5,667,425；WO98/25971)。在一个实施例中，本发明的抗体分子是修饰的Fab片段，其中修饰是在其重链的C-端添加一个或多个氨基酸，使得可以连接效应分子。优选，附加的氨基酸形成含有一个或多个半胱氨酸的效应分子可以与其连接的修饰铰链区。可以使用多个位点来连接两个或多个PEG分子。

优选，通过位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸的巯基共价连接PEG分子。每个与修饰抗体片段连接的聚合物分子可以共价连接到位于该片段中的半胱氨酸残基的硫原子上。共价连接通常是二硫键，或特别是，硫-碳键。在巯基用作连接点的情况下，可以使用适当激活的效应分子，例如，巯基选择性衍生物，如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。激活的聚合物可以用作如上所述的聚合物修饰的抗体片段制备中的原料。激活的聚合物可以是含有巯基反应基团的任何聚合物，如α-卤代羧酸或酯，例如，碘乙酰胺，酰亚胺，例如，马来酰亚胺，乙烯砜或二硫化物。这样的原料可购得(例如，Nektar，之前为ShearwaterPolymers Inc.，Huntsville，AL，USA)或可以使用常规化学方法从可购得的原料制备。特定的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可从Nektar，之前为Shearwater；Rapp Polymere；和SunBio获得)和M-PEG-SPA(可从Nektar，之前为Shearwater获得)。

在一个实施方案中，抗体是修饰的Fab片段或双Fab，其是PEG化的，即，具有与其共价连接的PEG(聚(乙二醇))，例如，根据EP0948544或EP1090037中所述的方法[还可以参见“Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnical and BiomedicalApplications”(聚(乙二醇)化学、生物技术和生物医药应用)，1992，J.Milton Harris(编辑)，Plenum Press，New York，“Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications”(聚(乙二醇)化学和生物应用)，1997，J.Milton Harris和S.Zalipsky(编辑)，Amercian Chemical Society，Washington DC和“Bioconjugation Protein Coupling Techniques for theBiomedical Sciences”(生物医药科学的生物缀合蛋白偶联技术)，1998，M.Aslam和A.Dent，Grove Publishers，New York；Chapman，A.2002，Advanced Drug Delivery Reviews 2002，54：531-545]。在一个实施例中，PEG与铰链区的半胱氨酸连接。在一个实施例中，PEG修饰的Fab片段具有共价连接修饰铰链区中的单个巯基的马来亚酰胺基团。赖氨酸残基可以共价连接马来亚酰胺基团，并且赖氨酸残基上的每个胺基可以连接具有大约20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，与Fab片段连接的PEG的总分子量可以为大约40,000Da。

在一个实施方案中，本发明提供了对人IL-6具有特异性的中和抗体分子，其是修饰的Fab片段，具有包括SEQ ID NO：11所示序列的重链和包括SEQ ID NO：13所示序列的轻链，并且在其重链的C-端具有含有至少一个半胱氨酸残基的修饰铰链区，效应分子可以与其相连。优选，效应分子是PEG，并使用(WO98/25971和WO2004072116)中所述的方法来连接，借此使赖酰氨-马来亚酰胺基团与重链C-端的半胱氨酸残基连接，并且使赖酰氨残基的每个氨基与具有约20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)残基共价连接。因此，与抗体的PEG连接的总分子量为大约40,000Da。

在另一个实施例中，可以使用国际专利申请WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171中所述的方法使效应分子与抗体片段连接。

本发明还提供了编码本发明抗体分子的重链和/或轻链的分离DNA序列。优选，DNA序列编码本发明抗体分子的重链或轻链。本发明的DNA序列可以包括合成DNA，例如，通过化学方法、cDNA、基因组DNA或其任意组合来产生。

通过本领域技术人员公知的方法来获得编码本发明抗体分子的DNA序列。例如，如果需要，可以从测定的DNA序列或基于相应的氨基酸序列合成编码一部分或全部抗体重链和轻链的DNA序列。

本领域技术人员可以广泛获得编码受体框架序列的DNA，并可以基于已知的氨基酸序列来容易地合成。

分子生物学的标准技术可以用来制备编码本发明抗体分子的DNA序列。可以使用寡核苷酸合成技术来完全或部分地合成所需的DNA序列。如果合适，可以使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)。

合适DNA序列的实例提供于SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3；SEQ IDNO：12；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17。SEQ ID NO：15中的核苷酸1-57和SEQ ID NO：17中的核苷酸1-60编码来自鼠抗体B72.3的信号肽序列(Whittle等，1987，Protein Eng.1(6)499-505)，将其切割来获得本发明的中和抗体分子。因此，本发明还提供了编码本发明抗体重链的分离DNA序列，其包括SEQ ID NO：15的核苷酸58-2008。本发明还提供了编码本发明抗体轻链的分离DNA序列，其包括SEQ ID NO：17的核苷酸61-705。

本发明还涉及包括一个或多个本发明DNA序列的克隆或表达载体。因此，提供了包括一个或多个编码本发明抗体的DNA序列的克隆或表达载体。优选，克隆或表达载体包括两个DNA序列，分别编码本发明抗体分子的轻链和重链。优选，根据本发明的载体包括SEQ IDNO：15和17的序列。SEQ ID NO：15中的核苷酸1-57和SEQ ID NO：17的核苷酸1-60编码来自鼠抗体B72.3的信号肽序列，最优选将其切割来获得本发明的中和抗体分子。

可以用来构建载体的一般方法、转染方法和培养方法是本领域技术人员公知的。在这方面，参考“Current Protocols in MolecularBiology”(分子生物学通用实验方案)，1999，F.M.Ausubel(编辑)，Wiley Interscience，New York和Cold Spring HarborPublishing生产的Maniatis Manual。

还提供了包括一个或多个克隆或表达载体的宿主细胞，这些载体包括一个或多个编码本发明抗体的DNA序列。可以使用任何合适的宿主细胞/载体***来表达本发明抗体分子的DNA编码序列。可以使用细菌，例如，大肠杆菌和其他微生物***，或还可以使用真核生物，例如哺乳动物的宿主细胞表达***，参见Verma等，1998，Journal ofImmunological Methods，216，165-181。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO、NSO、骨髓瘤或杂交瘤细胞。合适表达***的实例包括WO87/04462中所述的谷氨酰胺合酶表达***。

本发明还提供了生产根据本发明的抗体分子的方法，包括在适于从编码本发明抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养含有本发明载体的宿主细胞，并分离抗体分子。

抗体分子可以只包括重链或轻链多肽，在该情况下，只需要使用重链或轻链多肽编码序列来转染宿主细胞。对于包括重链和轻链两者的产物的生产，可以用两种载体转染细胞系，第一种载体编码轻链多肽，而第二种载体编码重链多肽。或者，可以使用单个载体，该载体包括编码轻链和重链多肽的序列。

因为本发明的抗体可用于治疗和/或预防病理状况，所以本发明还提供了药物或诊断组合物，其包含本发明的抗体分子和一种或多种药物学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。因此，提供了本发明的抗体用于制备药物的用途。通常作为无菌药物组合物的一部分来提供组合物，该药物组合物通常包括药物学上可接受的载体。本发明的药物组合物可以另外包括药物学上可接受的助剂。

本发明还提供了制备药物或诊断组合物的方法，包括加入并混合本发明的抗体分子和一种或多种药物学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

抗体分子可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分或可以伴随其他活性成分，包括其他抗体成分，例如，抗-TNF、抗-IL-1β、抗-T细胞、抗-IFN γ或抗-LPS抗体，或非抗体成分，如黄嘌呤。

药物组合物优选包括治疗有效量的本发明的抗体。如在此所用的术语“治疗有效量”指的是治疗、缓解或预防目标疾病或病症需要的治疗剂的量，或呈现出可检测治疗或预防效果需要的治疗剂的量。对于任何抗体，最初可以在细胞培养物测定或动物模型中估算治疗有效量，所述动物模型通常为啮齿动物、兔子、狗、猪或灵长类动物。动物模型还可以用来确定合适的浓度范围和给药途径。然后这样的信息可以用来确定人体内的有用剂量和给药途径。

对于人患者的确切治疗有效量将取决于病态的严重程度，受治疗者的一般健康，受治疗者的年龄、体重和性别，饮食，给药的时间和频率，药物组合，反应敏感性以及对治疗的耐受性/应答。该用量可以通过常规实验来确定，并且在临床医师判断的范围内。通常，治疗有效量为0.01mg/kg至50mg/kg，优选0.1mg/kg至20mg/kg。药物组合物通常可以呈现为含有预定含量的本发明的活性剂/剂的单位剂型。

可以将组合物单独给药于患者或可以与其他活性剂、药物或激素联合给药(例如，同时、按次序或分开)。

本发明的抗体分子的施用剂量取决于待治疗病症的性质、存在的炎症的程度以及抗体分子是预防使用还是用于治疗已有的病症。

给药频率将取决于抗体分子的半衰期及其效果的持续时间。如果抗体分子具有短的半衰期(例如，2至10小时)，则每天可能需要给予一剂或多剂。或者，如果抗体分子具有长的半衰期(例如，2至15天或2至30天)，则可能只需要每天一次，每周一次或甚至每1个月或2个月一次给药。

药物学上可接受的载体自身应当不会诱导对接受组合物的个体有害的抗体产生并且应当是没有毒性的。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒粒子。

可以使用药物学上可接受的盐，例如，无机酸盐，如氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐，如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。

治疗组合物中的药物学上可接受的载体可以另外含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这样的组合物中可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质。这样的载体能够将药物组合物配制成片剂、丸剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，用于被患者摄取。

给药的优选形式包括适于非肠道给药的形式，例如，通过注射或灌输，例如，通过快速浓注或连续灌输。在产品是用于注射或灌输的情况下，可以采用油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。或者，抗体分子可以是干燥形式，在使用前用合适的无菌液体重构。

一旦配制，本发明的组合物就可以直接给药于受治疗者。待治疗的患者可以是动物。然而，优选组合物适于给药于人受治疗者。

可以通过多种给药途径来给予本发明的药物组合物，包括，但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、脊髓内、鞘内、心室内、经过真皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠、局部、舌下、***内或直肠途径。无针注射器也可以用来给予本发明的药物组合物。通常，可以将治疗组合物制成注射剂，如液体溶液或悬浮液。还可以制备适于在注射之前在液体载体中溶解或悬浮的固体形式。

通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射，或递送至组织的细胞间隙来实现组合物的直接递送。还可以将组合物给药至损伤中。剂量治疗可以是单剂量计划或多剂量计划。

将认识到组合物中的活性成分是抗体分子。因而，它将易于在胃肠道中降解。因此，如果要使用胃肠道途径来给予组合物，组合物将需要含有保护抗体以免降解，但一旦从胃肠道吸收便可释放抗体的成分。

药物学上可接受载体的全面讨论可在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mark Publishing Company，N.J.1991)中获得。

还设想可以通过使用基因治疗来给予本发明的抗体。为了实现这一目标，将合适DNA成分控制下的编码抗体分子重链和轻链的DNA序列引入到患者中，使得从该DNA序列表达并就地装配抗体链。

本发明还提供了用于控制炎症疾病的抗体分子。优选，抗体分子可以用来减轻炎症过程或预防炎症过程。

还提供了根据本发明的抗体分子用于治疗和/或预防由IL-6介导的或与提高的IL-6水平相关的病理性疾病。本发明进一步提供了根据本发明的抗体分子在制造治疗和/或预防由IL-6介导的或与提高的IL-6水平相关的病理性疾病药物中的用途。优选，病理性疾病选自感染(病毒、细菌、真菌和寄生物)、与感染相关的内毒素休克、关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、全身发作幼年型特异性关节炎(JIA)、***性红斑狼疮(SLE)、哮喘、骨盆炎症疾病、阿尔茨海默氏病、节段性回肠炎、溃疡性结肠炎、过敏性肠综合征、卡斯尔曼氏病、强直性脊椎炎、皮肌炎、葡萄膜炎、海绵体炎、乳糜泻、胆囊病、藏毛病、腹膜炎、牛皮癣、脉管炎、外科手术粘连、中风、I型糖尿病、莱姆关节炎、脑膜炎、免疫介导的中枢和外周神经***的炎症疾病(如多发性硬化和格-巴二氏综合征)、其他自体免疫疾病、腮腺炎、外伤(外科手术)、移植物抗宿主疾病、移植排异、癌症(实体肿瘤，如黑素瘤、肝母细胞瘤、肉瘤、鳞状上皮细胞癌、移行细胞癌、卵巢癌和血液性恶性疾病，特别是急性骨髓性白血病、慢性脊髓性白血病、胃癌和结肠癌)、心脏病(包括缺血性疾病，如心肌梗塞以及动脉粥样硬化)、血管内血凝固、骨吸收、烧伤患者、骨质疏松、牙周病和胃酸过少。

优选，病理性疾病是类风湿性关节炎或***性红斑狼疮(SLE)。

本发明还提供了根据本发明的抗体分子用于治疗或预防疼痛。

本发明进一步提供了根据本发明的抗体分子在制造治疗或预防疼痛的药物中的用途。

本发明的抗体分子可以用于需要降低IL-6在人体或动物体内作用的任何治疗中。IL-6可以在体内循环或可以以不良的高水平存在于体内的特定部位，例如炎症部位。

优选将本发明的抗体分子用于控制炎症疾病。

本发明还提供了治疗患有由IL-6介导的疾病或处于由IL-6介导的疾病风险中的人或动物受治疗者的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的抗体分子给药于受治疗者。

本发明的抗体分子还可以用于诊断，例如，体内诊断，以及用于涉及IL-6的疾病状态的成像中。

通过以下只是说明性的实施例来进一步描述本发明，实施例将参照附图，其中：

图1显示了240.gl重链(图2a；SEQ ID NO：11)和轻链(图2b；SEQ ID NO：13)序列的嫁接设计。符号(|)突出显示了供体：受体：嫁接的框架序列之间的差异。CDR是单下划线的。这些按照Kabat来限定，除了CDR-H1，其包括Kabat和Chothia限定。带双下划线的序列是嫁接物中保留的供体框架残基。

图2a显示了240.gl IgG4重链的翻译序列，显示了内含子/外显子边界。

图2b显示了240.gl轻链的翻译序列，显示了内含子/外显子边界。

图3a显示了抗体240.gl对人重组的、人哺乳动物衍生的、恒河猴、弥猴和鼠I -6诱导的T1165细胞增殖的抑制。

图3b显示了抗体240.gl对HUVEC中人重组IL-6和sIL-6R诱导的MCP-1产生的抑制。

图3c显示了抗体240.gl对HUVEC中IL-17诱导的内源IL-6和sIL-6R诱导的MCP-1产生的抑制。

图4.通过给予CA030-240.gl(位点3抗体)体内中和小鼠中hIL-6诱导的SAA，n＝7-8/组，除了PBS，n＝6。使用Bonferroni post测试通过ANOVA进行统计学分析，与IL-6单独相比较，^**P＜0.01。

DNA操作和一般方法

将大肠杆菌菌株INVαF’(Invitrogen)用于转化和常规培养生长。DNA限制和修饰酶获自Roche Diagnostics Ltd.和New EnglandBiolabs。使用Maxi Plasmid纯化试剂盒(QIAGEN，目录号12165)进行质粒制备。使用ABI Prism Big Dye终止测序试剂盒(目录号4304149)进行DNA测序反应并在ABI 3100自动化测序仪(AppliedBiosystems)上运行。使用AutoAssembler(Applied Biosystems)程序分析数据。从INVITROGEN获得寡核苷酸。在Entelechon构建合成基因。使用装配ELISA测定Fab和IgG的浓度。

实施例1：132E09的分离

以两周的间隔皮下注射重组人IL-6(Peprotech)来免疫大鼠，最初用弗氏完全佐剂，随后用弗氏不完全佐剂。最后一次免疫后一至两周收集脾脏，并制备单细胞悬浮液。在照射的鼠胸腺瘤EL4细胞和兔子T细胞调节的培养基存在下在96孔微量滴定平板中培养免疫大鼠的淋巴细胞一周。在ELISA中筛选上清液中人IL-6特异性抗体的存在。进一步在DS1细胞系测试中筛选阳性中和人IL-6的生物作用的能力(Bock等，1993，Cytokine，5，480-489)。

根据选择淋巴细胞抗体方法(Babcook等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，7843-7848；WO92/02551)从阳性微量滴定平板孔中分离分泌具有合适结合特征的抗体的单个B细胞，并且通过逆转录PCR从单个大鼠B细胞克隆重链和轻链可变区基因。以重组IgG形式表达可变区来证实结合，并选择132E09用于人源化和进一步的研究。将大鼠可变区序列登记为CA030_00240。

V-区序列显示于SEQ ID NO：1至4中。

实施例2：132E09的CDR-嫁接

设计一系列人源化VL和VH区，其中将CDR超变区加上来自132E09的不同数量框架残基嫁接至人V-区受体框架上。

设计十个嫁接的VL区(gL1-10)并通过寡核苷酸装配和PCR突变来构建基因。还使用两个不同的框架区，VH3 1-43-72和VH3 1-3 3-21，总共构建了13个嫁接的VH区(gH1-13)。将轻链嫁接的序列亚克隆至人轻链表达载体pKH10.1中，其含有编码人C-κ恒定区的DNA(Km3异型)。将重链嫁接的序列亚克隆至人γ-4表达载体pVhg4P FL中，其含有编码人γ-4恒定区的DNA，该恒定区含有铰链稳定突变S241P(Angal等，上文)。将质粒共转染至CHO细胞中并在IL-6结合和体内测试中筛选产生的抗体的活性。使用Lipofectamine^TM2000程序根据制造商的说明(InVitrogen，目录号11668)进行CHO细胞的转染。

产生的13个重链嫁接中，两个只在位置49含有单个框架供体残基(Ala)，并使用两个不同的重链框架来产生这些。VH3 1-33-21嫁接在CHO细胞中表达很差并且显示出降低的IL-6亲和性。相反，使用VH3 1-43-72框架的嫁接表达很好并且保留了供体抗体的亲和性。结合只转染CDR了的轻链嫁接gL10来选择这种只包括单个供体框架残基的重链嫁接。

图1显示了供体大鼠序列132E09和受体人框架之间的比对。重链受体框架是人生殖系序列VH3 1-33-72，具有来自人JH-区生殖系JH4该位置的框架4。轻链受体框架是人生殖系序列VK1 2-1-(1)012，具有来自人JK-区生殖系JK2该位置的框架4。gH13和gL10的嫁接序列显示于图1中(SEQ ID NO：11、12、13和14)。将该嫁接的抗体称为CA030_00240.gl。作为如上所述的在位置241包括丝氨酸至脯氨酸置换的完整IgG4来产生这。完整翻译的重链和轻链序列各自显示于图2a和2b中。SEQ ID NO：16中提供了重链的氨基酸序列，而SEQ ID NO：18中为轻链。SEQ ID NO：15和17中各自提供了重链和轻链的DNA编码序列。SEQ ID NO：15和图2a中的核苷酸1-57编码了来自鼠抗体B72.3VH的信号肽序列，而SEQ ID NO：17和图2b中的核苷酸1-60编码了来自鼠抗体B72.3VL的信号肽序列。

鼠抗体B72.3描述于Whittle等中，1987，Protein Eng.1(6)499-505。

实施例3：结合亲和性

CA030_00240.gl结合亲和性测量

BIAcore技术实时监控了生物分子之间的结合而不需要标记。相互作用物之一，称为配体，直接固定或捕获于固定的表面上，而另一个，称为分析物，在溶液中流过捕获的表面。传感器检测传感器表面上的物质改变，因为分析物结合配体在表面上形成复合物。这对应于聚集过程。用缓冲液替代分析物时，监控解离过程。在亲和性BIAcore测试中，配体是CA030_00240.gl完整IgG4，并且分析物是人IL-6。

仪器

Biacore3000，Biacore AB，Uppsala，Sweden

传感器芯片

CM5(研究级)，目录号：BR-1001-14，Biacore AB，Uppsala，Sweden。

将芯片保存在4℃。

BIA标准化溶液

70％(w/w)甘油。BIAmaintenance试剂盒目录号的一部分：BR-1002-51，Biacore AB，Uppsala，Sweden。将BIAmaintenance试剂盒保存在4℃。

胺偶联试剂盒

目录号：BR-1000-50，Biacore AB，Uppsala，Sweden。

乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)。在蒸馏水中制成75mg/mL并以200μL等份存储在-70℃。

N-羟基琥珀酸亚胺(NHS)。在蒸馏水中制成11.5mg/mL并以200μL等份存储在-70℃。

1M盐酸乙醇胺-NaOH pH8.5。以200μL等份存储在-70℃。

缓冲液

跑胶缓冲液：HBS-EP(0.01M HEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20)。目录号：BR-1001-88，Biacore AB，Uppsala，Sweden。缓冲液存储在4℃。

固定缓冲液：醋酸盐5.0(10mM醋酸钠pH5.0)。目录号：BR-1003-51，Biacore AB，Uppsala，Sweden。缓冲液存储在4℃。

配体捕获

Affinipure F(ab’)₂片段山羊抗人IgG，Fc片段特异性的。JacksonImmunoResearch Inc(Pennsylvania，USA)，目录号：109-006-098。试剂存储在4℃。

分析物

重组人IL-6(R&D Systems Europe Ltd，Abingdon，Oxon。目录号206-IL-050，批号A131402A)，存储在-70℃，并且对于每次实验融化一次。

通过CHO细胞的瞬时转染产生重组弥猴IL-6和重组恒河猴IL-6。以非纯化且非定量的细胞培养物上清液来使用该材料。

再生溶液

用蒸馏水从11.6M储液(BDH，Poole，England。目录号：101254H)通过稀释制备40mM HCl。

用蒸馏水从50mM储液通过稀释制备5mM NaOH。

目录号：BR-1003-58，Biacore AB，Uppsala，Sweden。

测试方法

使用BIAcore 3000(BIAcore AB)进行BIA(生物分子相互作用分析)。通过胺偶联化学性质将Affinipure F(ab’)₂片段山羊抗人IgG，Fc片段特异性的(Jackson ImmunoResearch)固定于CM5传感器芯片上至≈5000应答单位(RU)的捕获水平。将HBS-EP缓冲液(10mMHEPES pH7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％表面活性剂P20，BIAcoreAB)用作跑胶缓冲液，使用10μl/min的流速。通过固定的抗人IgG-Fc将10μl 4μg/mL的CA030_240.gl注射液用于捕获。随着30μl/min流速的不同浓度的CA030_240.gl来滴定人IL-6。通过10μL 40mM HCl注射液，接着5μL 5mM 10μL/min流速的NaOH注射液来再生表面。

使用BIA评价软件(3.2版本)按照标准方法分析背景底物结合曲线。从拟合算法测定动力学参数。

该研究中使用了一批CA030_240.gl。在20nM或低于20nM的人IL-6浓度测量亲和性。测定的CA030_240.gl的亲和性值在9.02-10.50pM范围内，平均±s.e.m.为9.76±0.74pM(表1.1)。使用固定于BIAcore芯片上的人IL-6是不可能测量亲和性的，因为固定IL-6导致了天然构象的丧失。

因为不可能定量弥猴或恒河猴IL-6，因此也不可能测定它们与CA030_00240.gl相互作用的真实动力学参数。然而，结合感应图的目测表明CA030_00240.gl结合这些非人灵长类动物的IL-6，具有与人IL-6相似的亲和性。

表1.1：CA030_240.gl对人IL-6的亲和性

参照	ka(M-1s-1)	kd(s-1)	Kd(M)	Kd pM
10017474/39-51	7.31E+05	7.68E-06	1.05E-11	10.5
10017474/39-51	8.52E+05	7.68E-06	9.02E-12	9.02

实施例5：体外中和测定

使用两种不同的测定来确定抗体CA030_00240.gl(此后缩写成240.gl)的功效。第一种使用了鼠IL-6依赖性细胞系，称为T1165，应答鼠、恒河猴、弥猴和人IL-6而增殖。这种IL-6向细胞表面IL-6受体的直接信号传导，连同称为gp130的信号传导受体亚基称为顺式信号传导。第二种测定使用了用人IL-6加可溶性IL-6受体(IL-6R)刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，读出的是单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的产生。在该测定中，IL-6通过外源加入或可以通过用细胞因子白细胞介素-17(IL-17)刺激HUVEC来产生。这两种测定变型称为反式信号传导，因为HUVEC没有表达IL-6R，并且只有当外源加入IL-6和可溶性IL-6R两者时才能应答即产生MCP-1。

使用这些不同的测定，可以产生240.gl针对人(重组的和天然的)、恒河猴、弥猴和鼠IL-6的ND50(50％中和剂量)值。

材料

培养基

T1165培养基-RPMI1640，补充了10％胎牛血清、青霉素(100单位/ml)、链霉素(50μg/ml)、谷氨酰胺(2mM)和10ng/ml人重组IL-6，R&D systems，UK。

HUVEC培养基-大血管内皮细胞基础培养基(LVECBM)TCSCellworks，UK，大血管内皮细胞生长补充剂TCS Cellworks，UK和抗生素补充剂TCS Cellworks，UK。

在PBS中以6.83mg/ml的浓度在内部产生CA 03000240.gl。

人IL-6R&D systems，UK，人哺乳动物衍生的IL-6(用人IL-610017108/67的CHO转染内部衍生的)，恒河猴IL-6(用恒河猴IL-610017108/67的CHO转染内部衍生的)，弥猴IL-6(用弥猴IL-610017108/67的CHO转染内部衍生的)，鼠IL-6R&D systems，UK。抗人MCP-1捕获抗体(555055)和抗人MCP-1检测抗体(554664)和人重组MCP-1(890225)，BD Biosciences，CA。抗生物素蛋白链菌素-HRP(AMDEX)Amersham bioscience，UK。凝血酶Merck Biosciences，Darmstadt，Germany。sIL-6R R&D systems，UK。人IL-17 R&D systems，UK。

T1165测试-CellTiter 96

AQueous Promega，CA。

TM Blue(Serologicals，GA)。

使用T1165细胞的IL-6依赖性增殖来测量240.gl活性

在使用前4天将T1165细胞融化，并在补充10％FCS、抗生素、谷氨酰胺和10ng/ml人IL-6的RPMI 1640中培养。使用锥虫蓝排除来监控细胞生活力，只使用至少90％视为活的细胞。在使用前，将细胞在不存在人IL-6的RPMI 1640中洗涤两次。然后将细胞计数并以5×10⁴细胞/孔的密度分配至96孔平板中。在分开的平板中，在1ng/ml(0.038nM)固定浓度的人重组的、人哺乳动物衍生的(也称为人CHOIL-6)、恒河猴、弥猴或鼠IL-6的存在下孵育连续稀释的240.gl。然后将预先混合的240.gl和IL-6的混合物转移至含有T1165细胞的孔中，将其在潮湿的5％CO₂大气中在37℃孵育48小时。在孵育的最后六个小时中，加入20ml CellTiter 96

AQueous来测定增殖细胞的数量。将240.gl对T1165细胞的IL-6依赖性增殖的抑制表示为只用IL-6处理的孔减去含有细胞但不含有IL-6的对照孔的抑制百分比。

可以在图3a中看到240.gl针对人重组的、人哺乳动物衍生的、恒河猴、弥猴和鼠IL-6诱导的细胞系T1165增殖的活性。240.gl有效地抑制了人重组的、人哺乳动物衍生的、恒河猴、弥猴IL-6活性，但没有抑制鼠IL-6活性。

人重组IL-6的ND50为1.1±0.5ng/ml(7.26±3.3pM)。人哺乳动物衍生的IL-6的ND50为3.6±2.4ng/ml(23.76±15.84pM)。恒河猴IL-6的ND50为2.2±1.1ng/ml(14.52+7.26pM)。弥猴IL-6的ND50是5.4±1.1ng/ml(35.64±7.26pM)。

使用IL-6和可溶性 IL-6受体诱导HUVEC中的MCP-1产生来测量240.gl活性

将HUVEC(TCS Cellworks，UK)生长于大血管内皮细胞基础培养基(LVECBM)中，并在培养物中传代不超过五次。在使用前使细胞生长直至75％汇合。使用胰蛋白酶/EDTA使细胞分离，在新鲜LVECBM中重悬浮并洗涤一次。然后将细胞计数并以2×10⁴细胞/孔的密度分配至96孔平底平板中。然后将细胞在潮湿的5％CO₂大气中在37℃培养过夜。第二天，将细胞在补充生物素化的凝血酶(3U/ml)的新鲜培养基中洗涤，并放在一边。在分开的平板中，在人重组IL-6(50ng/ml；3.84nM)和500ng/ml(10.15nM)固定浓度的sIL-6R存在下孵育连续稀释的240.gl。此外，还用刺激HUVEC产生IL-6的人重组IL-17(25ng/ml；1.18nM)和500ng/ml(10.15nM)固定浓度的sIL-6R孵育了240.gl。然后将预先混合的240.gl和IL-6/sIL-6R或IL-17/sIL-6R复合物转移至含有HUVEC的孔中，将其在潮湿的5％CO₂大气中在37℃孵育24小时。孵育阶段后，收集无细胞上清液并通过夹层ELISA测定人MCP-1水平(下文中给出实验方案)。将240.gl对IL-6/sIL-6R或IL-17/sIL-6R诱导的MCP-1产生的抑制表示为用IL-6/sIL-6R或IL-17/sIL-6R处理的孔减去含有细胞但不含有刺激物的对照孔的抑制百分比。此外，加入对照以表明在不存在sIL-6R情况下细胞对加入人IL-6的应答。

MCP-1 ELISA

用2μg/ml浓度的抗MCP-1捕获抗体覆盖Nunc Maxisorp平板。将平板在+4℃孵育过夜，然后在PBS加0.1％吐温20(洗涤缓冲液)中洗涤两次。将平板在PBS加5％牛血清白蛋白中阻断1小时。然后用洗涤缓冲液将平板洗涤四次，并加入标准品和样品。将平板在室温孵育两小时。然后将平板洗涤并加入浓度为1mg/ml的生物素化抗-MCP-1抗体。将平板再孵育2小时，然后洗涤四次。然后加入1∶5000稀释度的抗生物素蛋白链菌素-HRP，并将平板孵育30分钟。将平板洗涤最后四次并加入TMB底物。在630nm进行比色读数，在492nm进行背景读数。在Genesis II软件上使用四参数逻辑曲线拟合从标准曲线产生MCP-1浓度。

可以在图3b中看到HUVEC中240.gl针对人重组IL-6和sIL-6R诱导的反式信号传导的活性。240.gl有效地抑制了人重组IL-6和sIL-6R诱导的HUVEC的MCP-1产生。ND50为64±62ng/ml(422±409pM)。

可以在图3c中看到HUVEC中240.gl针对IL-17诱导的内源IL-6和sIL-6R诱导的顺式信号传导的活性。240.gl有效地抑制了IL-17诱导的内源IL-6和sIL-6R诱导的HUVEC的MCP-1产生。ND50为93±70ng/ml(614±462pM)。

结论

240.gl能够中和人重组的、人哺乳动物衍生的、恒河猴和弥猴IL-6在IL-6顺式信号传导测定中的生物活性，但不能中和鼠IL-6。此外，240.gl可以中和重组或内源IL-6诱导的IL-6反式信号传导。

实施例6：体内活性

已知IL-6诱导急性期蛋白。在小鼠中，最突出的急性期蛋白是血\清淀粉状蛋白A(SAA)。人IL-6能够作用于鼠受体，因此可以将人IL-6注射至小鼠中，并测量血清中的SAA产生。

给Balb/c小鼠s.c.注射位点3特异性抗hIL-6抗体，CA030_240.gl完整IgG4。24小时后，给小鼠腹膜内注射30μg/kg的hIL-6(Peprotech目录号200-06，批号0203B16)。20小时后，通过心脏穿刺采血，并收集血清，用于通过ELISA(Tridelta，批号22KT022)来确定血清淀粉状蛋白A(SAA)。如图4中所述的，CA030_240.gl抑制了hIL-6的SAA诱导，注意到在0.3、0.1和0.03mg/kg的剂量，SAA在统计学上显著降低。

n＝7-8/组，除了PBS n＝6。使用Bonferroni post测试通过ANOVA进行统计学分析，与IL-6单独相比较。^**P＜0.01。

两个进一步的实验证实了0.3和0.1mg/kg剂量的CA030_240.gl显著抑制了IL-6(30μg/kg)诱导的SAA。

实施例7：CA030_00240.gl抗原决定部位作图

使用NMR技术将人IL-6上CA030_00240.gl识别的抗原决定部位作图，使用240.gl作为Fab’片段。这需要在大肠杆菌中表达人IL-6，并用¹⁵N/¹³C/²H稳定同位素来统一标记。对于游离的IL-6，获得完整的序列特异性主链共振分配，并使用3D TROSY HNCO光谱检测了通过CA030_00240.gl的Fab’片段的结合诱导的这些信号位置的改变。

重组IL-6的表达和纯化：

从含有蛋白成熟形式的编码序列的大肠杆菌表达载体(pET3d)制备人IL-6。在Tuner(DE3)pLysS细胞中表达蛋白，获得高产量的不溶性产物。从生长于合适标记的富集培养基(Celtone)上的细胞制备¹⁵N、¹⁵N/¹³C和¹⁵N/¹³C/²H标记的IL-6样品。

使用公知的程序从转化的大肠杆菌细胞纯化IL-6。最初，将从1升培养基中收获的细胞重悬浮于40mL缓冲液A中[100mM KC1，2mM DTT，10mM Tris-HCl pH8.5，25％(w/v)蔗糖，溶解的蛋白酶抑制剂片(Boehringer)]。加入10mL缓冲液B[300mM Tris-HCl pH8.5，100mMEDTA，4mg/ml溶菌酶]并将悬浮液在冰上孵育10-30分钟，偶尔搅拌一下。然后加入50ml缓冲液C[1M LiCl，20mM EDTA，0.5％(v/v)NP-40]，并将悬浮液通过20,000psi的弗氏压碎器(French Press)两次。然后将匀浆在16,000g rpm 4℃离心15分钟，并保留沉淀。将沉淀重悬浮于40ml缓冲液D中[10mM Tris-HCl pH8.5，0.1mM EDTA，0.5M LiCl，0.5％(v/v)NP-40，1mM DTT，溶解的蛋白酶片]，并与之前一样通过弗氏压碎器和离心。重复该过程。然后将沉淀重悬浮于40ml缓冲液E中[10mM Tris-HCl pH8.5，0.1mM EDTA，0.5％(v/v)NP-40，1mM DTT，溶解的蛋白酶片]，并与之前一样通过弗氏压碎器和离心。重复该过程。将最后的沉淀溶解于6mL 6M GuHCl，50mM Tris-HCl pH8.0中，并在48,000g在4℃离心30分钟。保留上清液，并通过分光光度来定量溶解的IL-6。

将溶解的IL-6稀释于2.5mg/mL的5M GuHCl，50mM NaCl，50mMTris-HCl，2mM GSH，0.2mM GSSG，1mM EDTA，pH8.0，并在25℃孵育1小时。然后将样品进一步以逐滴的方式稀释至250μg/mL的50mMNaCl，50mM Tris-HCl，2mM GSH，0.2mM GSSG，1mM EDTA，pH8.0并在25℃孵育3小时。通过在30,000g在4℃离心30分钟来除去该阶段中形成的任何沉淀。将澄清的物质对50mM Tris-HCl，10％(v/v)甘油，pH9.0渗析，在4℃持续最少16小时，换两次缓冲液。渗析后，通过在30,000g在4℃离心30分钟来澄清溶液。保留上清液，并装载于8mL monoQ(Amersham Biosciences)离子交换柱上，并用线性梯度的氯化钠(0-1.0M)洗脱。通过SDS-PAGE鉴定含有再折叠的IL-6的级分，然后合并并稀释于25mM磷酸钠，100mM NaCl，0.01％(w/v)NaN₃，pH6.5中。

产生CA030_00240.gl的Fab’片段，纯化并配制于25mM磷酸钠，100mM NaCl，0.01％(w/v)NaN₃，pH6.5中。制备IL-6和CA030_00240.glFab’片段的1∶1复合物，通过混合等摩尔量浓度为0.2-0.6mM的蛋白质用于NMR分析。

NMR光谱

对0.35ml蛋白样品和pH6.5的25mM磷酸钠、100mM氯化钠和0.01％(w/v)叠氮化钠缓冲液(95％H₂O和5％D₂O)中的复合物进行NMR实验。制备¹⁵N/¹³C/²H标记的IL-6和未标记的CA030_00240.gl Fab’片段的1∶1复合物，通过混合等摩尔量的蛋白质来获得0.1mM的终浓度，用于NMR分析。于25℃对于游离IL-6和对于IL-6：CA030_00240.glFab’片段的复合物，在装配了三重共振(¹⁵N/¹³C/¹H)冷冻探针的800MHzBruker Avance分光计上获取NMR数据。使用标准HNCACB、CBCA(CO)NH和HNCO光谱(Wittekind，M.和Mueller，L.(1993)J Magn Reson，系列B 101(2)，201；Grzesiek，S.和Bax，A.(1993)J Biomol NMR3(2)，185-204；Muhandiram，D.R.和Kay，L.E.(1994)J MagnReson，系列B 103(3)，203；Grzesiek，S.和Bax，A.(1992)J MagnReson 96(2)，432)来制备游离IL-6的完整序列特异性主链共振分配(¹⁵N，¹³C和¹H)，使用0.9mM ¹⁵N/¹³C均匀标记的样品。

使用3D TROSYHNCO光谱检测由CA030_00240.gl Fab’片段结合诱导的IL-6主链信号位置的改变(Salzmann，M.等(1998)Proc NatlAcad Sci USA 95(23)，13585-13590)。表1中提供了用于所有3DNMR实验的典型获取参数。

使用NMRPipe处理所有光谱(Delaglio，F.等，(1995)J BiomolNMR 6(3)，277-293)，使用线性预测将3D数据的¹⁵N维度中的有效获取时间延长至约30ms。在所有维度中使用中等的分辨率增强，使用位移正弦平方函数。使用Sparky进行光谱的分析(Goddard，T.D.和Kneller，D.G.SPARKY 3.In.，加利福尼亚大学，旧金山)。

Fab结合数据的分析：

使用最小位移方法(Farmer，B.T.等，(1996)Nat Struct MolBiol 3(12)，995；Muskett，F.W.等，(1998)J Biol Chem 273(34)，21736-21743)来测定由CA030_00240.gl Fab’片段结合引起的IL-6NMR信号位置的改变。最初，在它们中心挑选出游离IL-63DHNCO光谱和结合g132E09Fab的IL-63D TROSYHNCO光谱中的所有峰。对于复合物和游离蛋白质光谱之间的温度差异来校正¹⁵N和¹H化学位移值(对于¹⁵N未-0.8ppm，对于¹H为-0.05ppm)(Baxter，N.J.和Williamson，M.P.(1997)J Biomol NMR 9(4)，359-369)。通过使用Microsoft Excel来计算¹⁵N、¹³C和¹H结合的化学位移差异来获得游离和Fab结合的IL-6之间峰位置的最小改变，用于将游离蛋白质的HNCO光谱中的每个指定峰与Fab复合物的TROSY-HNCO光谱中观察到的所有峰相比较。根据以下公式(公式1)来定义结合的酰胺质子、氮和碳化学位移差异(Δδ)，其中Δδ_HN、Δδ_N和Δδ_C对应于比较的HNCO峰对之间的¹H、¹⁵N和¹³C位移的差异，并且α_N和α_C是说明酰胺质子、酰胺氮和碳化学位移范围差异需要的0.2和0.33的换算系数。对于每个单独的HNCO峰，按照最低可能的结合的位移值(Δδ)来获得Fab结合诱导的最小位移。

$\mathrm{\Δ\δ}=\sqrt{{\left(\mathrm{\Δ}{\mathrm{\δ}}_{\mathrm{HN}}\right)}^2+{(\mathrm{\Δ}{\mathrm{\δ}}_N\·{\mathrm{\α}}_N)}^2+{(\mathrm{\Δ}{\mathrm{\δ}}_C\·{\mathrm{\α}}_C)}^2}$ (公式1)

为了鉴定IL-6上的Fab结合位点(抗原决定部位)，将结合的最小位移对蛋白质序列的柱状图用来揭示含有显著紊乱信号的IL-6片段。如果对于单个氨基酸的合并的化学位移改变的大小超过了所有氨基酸合并的化学位移改变的平均极限值加该平均值的一个标准偏差，选择这些残基进一步评价为Fab结合位点中可能接触的残基。最后在高分辨率的IL-6结构上检测候选结合位点残基的位置(Xu，G.Y.等(1997)J Mol Biol 268(2)，468-481)，并且只有位于蛋白质表面的残基被认为是Fab结合可利用的。

使用两个不同的极限来鉴定Fab结合的残基，平均最小位移+1SD(0.143)和平均最小位移+2SD(0.213)。发现抗体的结合位点包括Trp157的关键位点3信号残基(Boulanger等，2003，Science，300，2101-2104)。使用上文中Boulanger等所用的氨基酸编号，发现抗体240gl至少结合以下的残基(平均+2SD(0.213))S47、C50、E93、R104、F105、E106、T149、K150、A153、Q156、Q159和S169。抗体可以结合以下所有的残基(平均+1SD(0.143))C44、S47、C50、S53、A58、E93、V96、R104、F105、E106、T149、K150、Q152、A153、Q154、N155、Q156、W157、Q159、T163、L165、S169和E172。

将认识到还可以基于未加工的IL-6前体的氨基酸编号来将相同的残基编号(Swiss Prot登录号P05231)。使用该编号，抗体240g.l至少结合以下的残基S75、C78、E121、R132、F133、E134、T177、K178、A181、Q182、Q187和S197。抗体可以结合以下所有的残基C72、S75、C78、S81、A86、E121、V124、R132、F133、E134、T177、K178、Q180、A181、Q182、N183、Q184、W185、Q187、T191、L193、S197和E200。

表1：NMR实验的基础参数

使用14ppm的扫描宽度和85ms的获取时间来获得直接的¹H测定(F3或F2)。

当然可以理解只是通过实施例描述了本发明，而决不意味着限制，并且可以进行细节的改变，而在此后权利要求的范围内。本发明每个实施方案的优选特征加以必要的改变同样适用于其他各个实施方案。本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均在此引入作为参考，如同每个出版物具体并单独表示在此引入作为参考一样，好象全部列出一样。

Claims (10)

1.对人IL-6具有特异性并具有包括序列gH13即SEQ ID NO：11的重链和包括序列gL10即SEQ ID NO：13的轻链的中和抗体。

2.对人IL-6具有特异性并具有SEQ ID NO：16所示序列的重链和SEQ ID NO：18所示序列的轻链的中和抗体。

3.编码根据权利要求1或2的抗体的重链和轻链的分离DNA序列。

4.根据权利要求3的分离DNA序列，其中所述编码重链的DNA序列包括SEQ ID NO：12所示的序列，并且所述编码轻链的DNA序列包括SEQ ID NO：14所示的序列。

5.包括一个或多个根据权利要求3或4的DNA序列的克隆或表达载体。

6.包括一个或多个根据权利要求5的克隆或表达载体的宿主细胞。

7.对人IL-6具有结合特异性的抗体的生产方法，包括培养权利要求6的宿主细胞并分离抗体。

8.药物组合物，包含权利要求1或2的抗体，结合一种或多种药物学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

9.根据权利要求8的药物组合物，另外包含其他活性成分。

10.根据权利要求1或2的抗体或根据权利要求8或权利要求9的药物组合物，用于治疗或预防由IL-6介导的，或与提高的IL-6水平相关的病理性疾病。

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