DE19629143A1 - Vorrichtung zum Separieren von Mikroobjekten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Separieren von einzelnen biologischen Mikroobjekten, insbesondere von biologischen Objekten. Die Objekte sind hierbei auf einem festen planaren Träger nebeneinander angeordnet. Mit diesem Verfahren können aus einer sehr großen Zahl von Mikroobjekten (z. B. 10⁵ bis 10⁶) einzelne Objekte räumlich abgetrennt und ausgesondert werden. Voraus­ setzung für dieses Separierverfahren ist die vorherige Erkennung und Selektion der betreffenden Objekte aufgrund signifikanter analytischer Eigenschaften (z. B. durch Fluoreszenzspektroskopie oder durch radioaktive Markierung). Unter "Mikroobjekt Querabmessung 50 µm zu verstehen. Unter "biologischen Objekten" werden im Rahmen der vorliegenden Anmeldung vor allem (lebende) biologische Zellen verstanden.

Die Separation von biologischen Zellen mit Pipetten ist grundsätzlich bekannt. Hierbei handelt es sich um Verfahren, die von Pasteurpipetten Gebrauch machen. In J. A. Benson, J. Exp. Biol. 170, 203 (1992) wird die Separation von Zellen im Größenbereich zwischen 50 und 100 µm beschrieben, die von einer Pipette mit einem Durchmesser von 0,5 mm räumlich aus einer Population getrennt werden.

Zur Separation einzelner biologischer Objekte lassen sich Objekte mit optischen Methoden, wie der optischen Pinzette (Optical Tweezer) in einer wäßrigen Lösung bewegen (K. Schütze, A. Clement-Sengewald, Nature, 667 (Vol. 368) 1994). Aufgrund der geringen Kraftübertragung ist diese Methode auf Objekte beschränkt, die sich frei in der Lösung bewegen können. Da sich die sortierten wie die unsortierten Objekte in der gleichen Lösung befinden, ist eine getrennte Kultivierung nur mit zusätzlichem Aufwand erzielbar. Für eine getrennte Kultivierung müssen diese Zellen mit einer anderen Methode wie z. B. mit Nadeln abgetrennt werden. Mit Mikromanipulatoren bewegte Nadeln, an denen die Zellen adherieren, werden auch als alleinige Methode eingesetzt. Hierbei werden die Zellen direkt berührt und könnten somit mechanisch belastet werden. Auch hier ist die Manipulation auf schwach adherierende Objekte begrenzt.

Zur Separierung einer großen Zahl (< 10⁵), in einer Flüssigkeit dispergierter, biologischer Objekte geeignete Trenn- bzw. Sortierapparate sind kommerziell erhältlich. Während bei der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS = Fluorescence activated Cell Sorter) elektrostatische Prinzipien zur räumlichen Separation zum Einsatz kommen, arbeitet der magnetisch aktivierte Zellsortierer (MACS = Magnetic activated Cell Sorter) mit magnetischen Kräften. Hierbei liegen die Zellen jedoch nicht auf einem planaren Träger nebeneinander. Überdies haben beide Methoden den Nachteil, daß sich einzelne Objekte nur eingeschränkt (FACS) oder überhaupt nicht getrennt voneinander ab sondern lassen (MACS).

Ferner sind unter dem Namen "Ablative Photodecomposition" Verfahren bekannt, bei denen mit gepulsten UV-Lasern, insbesondere mit Excimer-Lasern ein gezielter Materialabtrag bei Polymeren erfolgt. Diese Verfahren können im weitesten Sinne als Ätzverfahren angesehen werden. Ein ähnliches Verfahren, bei dem jedoch ein kontinuierlich betriebener UV-Laser verwendet wird, wird in dem US-Patent 5 211 805 beschrieben. Dieses Verfahren soll sich zur industriellen Bearbeitung von technischen Polymeren und zur biomedizinischen Behandlung von biolo­ gischem Gewebe eignen. Hiermit ist ein Sortierprinzip verwandt, das mit Laser­ strahlen die auf einem Träger befindlichen unerwünschten biologischen Objekte mit hohen Strahlungsdosen zerstört, während die selektierten (erwünschten) Ob­ jekte zurück bleiben (US 4 624 915). Dieser Prozeß ist verhältnismäßig aufwendig, um einzelne Objekte aus großen Populationen zu selektieren.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht in der räumlichen Separation einzelner Mikroobjekte, insbesondere von bekannten biologischen Zellen, die nebeneinander mit einer hohen Belegungsdichte auf einem planaren Träger ausgebracht sind und auf diesem Träger adherieren. Dabei soll die Überlebens­ fähigkeit der biologischen Objekte in der Regel gewährt bleiben; d. h. die biologischen Objekte sollen durch den Abtrennprozeß nicht geschädigt bzw. beein­ trächtigt werden.

Diese Aufgabe wird, ausgehend von einer Vorrichtung mit einem verfahrbaren Pipettensystem, das mit einer Druckerzeugungsvorrichtung zum Ansaugen und Ausspülen der biologischen Objekte verbunden ist, erfindungsgemäß dadurch ge­ löst, daß das Pipettensystem in einem Mikromanipulator angeordnet ist und eine im wesentlichen vertikal angeordnete Mikrokapillare mit einer lichten Weite von 1 µm bis 50 µm, vorzugsweise 5 µm bis 20 µm aufweist.

"Im wesentlichen vertikal" bedeutet dabei, daß eine Abweichung von ± 20° zugelassen werden kann. Als Druckerzeugungsvorrichtung dient hier im ein­ fachsten Fall eine Pumpe oder Kolbenspritze.

Vorzugsweise besteht die Mikrokapillare aus einem zylindrischen Glasrohr und ist vorteilhaft rechtwinklig abgebogen. Dabei kann ebenfalls eine Abweichung vom rechten Winkel um ca. ± 200 akzeptiert werden.

Um problemlos verschiedene Öffnungsdurchmesser bei gleichem Ausgangsdurch­ messer der Kapillaren im Herstellungsprozeß zu realisieren, werden Kapillaren aus unterschiedlichen Materialien, wie Borosilikatglas, Aluminiumsilikatglas, oder Hämatokritglas eingesetzt.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Mikromanipulator und die Pumpe so gesteuert sind, daß bei einer Unterdruckeinstellung in einem Arbeitsgang mehrere biologische Objekte nacheinander von der Mikrokapillare angesaugt und anschließend im nächsten Arbeitsgang mit einer Überdruckeinstellung nacheinander wieder ausgespült werden.

Im Hinblick auf den Transfer von Bakterien besteht das aktuelle Substrat und das Zielsubstrat zweckmäßig aus einem mit Agar oder Agarose beschichteten Träger.

Alternativ kann aber als Zielsubstrat auch eine Mikrotiterplatte eingesetzt werden.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand eines in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. Die Zeichnung zeigt den prinzipiellen Auf­ bau der Transfervorrichtung an einem Mikroskoparbeitsplatz. Die erfindungsge­ mäße Vorrichtung kann für die Separation von Mikroobjekten wie etwa von Polymerbeads im Rahmen der kombinatorischen Chemie oder von Bakterien im Rahmen der Molekularbiologie eingesetzt werden. Exemplarisch wird hier der Einsatz der Vorrichtung zur Sortierung von Bakterien beschrieben.

Für den Transfer der Bakterien werden Mikrokapillaren aus einem Spezialglas ver­ wendet, die durch einen Ziehprozeß im geschmolzenen Zustand hergestellt werden. Für die zu beschreibenden Experimente wurden Borosilikatglasröhrchen (Fa. Hilgenberg, Malsfeld, GER) mit einem Ausgangsdurchmesser von 1.6 mm einge­ setzt. In einem dreistufigen Ziehprozeß mit einem handelsüblichen Pipetten­ ziehgerät (DMZ Universalpuller, Fa. Zeitz-Instrumente, München, GER) wurden Kapillaren mit einer im Endbereich der Kapillare zylindrischen Pipettenform (d. h. nicht wie sonst üblich zu einer sich verjüngenden Spitze ausgezogen!) mit einem Öffnungsdurchmesser von ca. 6 µm an dem aufgeschmolzenen Ende hergestellt. Auf der anderen Seite bleibt der Ausgangsdurchmesser unverändert erhalten. Für die Reproduzierbarkeit des Transferprozesses insbesondere des Ausspülprozesses hat sich diese Pipettenform bewährt. Alternativ kann die Kapillare auch aus einem Aluminiumsilikatglas oder Hämatokritglas hergestellt werden.

In der Zeichnung ist die Apparatur für den Transferprozeß schematisch dargestellt. Die Mikrokapillare 1 wird in einer Spannzange 2 gehaltert, die an dem Mikro­ manipulator 3 montiert ist, der eine dreidimensionale Positionierung im µm-Be­ reich ermöglicht. Solche Manipulatoren sind kommerziell erhältlich. Die Mikro­ kapillare 1 ist über einen Schlauch 4 mit einer handelsüblichen Kolbenspritze 5 verbunden, mit deren Hilfe der Kapillareninnendruck eingestellt wird. Der Druck wird mit einem Druckmesser 6 bestimmt. Sowohl der Mikromanipulator 3 als auch die Spritze 5 werden mit Schrittmotoren, die hier nicht dargestellt sind, fernbe­ dient. Der gesamte Vorgang des Ansaugens und der Separation einer Bakterie (Pickvorgang) unterliegt der visuellen Kontrolle, die durch die Beobachtung mit einer 40fachen Vergrößerung im Phasenkontrast ermöglicht wird. Von dem Mi­ kroskop sind hier nur das Objektiv 7 und der Beleuchtungskondensor 8 dargestellt. Im Hinblick auf den erforderlichen Arbeitsabstands des Kondensors 8 von ca. 22 mm zum Objekt wird die Mikrokapillare 1 über den Erweichungspunkt erhitzt und in der Weise umgebogen, das sie nahezu einen 90° Winkel bildet und damit platzsparend unterhalb des Kondensors 8 positioniert werden kann. Auf diese Weise kann die Beobachtung des Transferprozesses ungestört stattfinden. Für die hohe räumliche Auflösung des Transferprozesses in der Größe des Pipettendurch­ messers (hier 6 µm) ist es wichtig, daß die Pipette senkrecht auf das zu pickende Objekt trifft. Dabei kann eine Abweichung von maximal ± 20° toleriert werden. Damit bildet sich kein Wasserfilm zwischen Kapillarenwand und Agarsubstrat, der umliegende Objekte beim Transferprozeß in Mitleidenschaft ziehen könnte. Zur Vorbereitung des Pickens wird über einen Unterdruck aus einem Vorratsgefäß eine Pufferlösung in die Kapillare 1 eingesogen. Hierbei reicht es aus, daß nur der verjüngte Teil der Kapillare mit der Pufferlösung gefüllt ist.

Nun wird das zu pickende Objekt bzw. die von dem Substrat 9 zu separierende Bakterie 10 durch eine koordinatengesteuerte Bewegung des Mikroskopverschiebe­ tisches unterhalb der Kapillare 1 positioniert. Hierbei wird der Kapillaren­ innendruck auf -300 mbar gegenüber Umgebungsdruck eingestellt. Unter gleich­ zeitiger Mikroskopbeobachtung wird die Kapillare 1 direkt über der zu pickenden Bakterie 10 auf das Agarosesubstrat 9 aufgesetzt. Anschließend wird die Mikrokapillare 1 über die Höhenverstellung am Mikromanipulator 3 angehoben und als Resultat bleibt im Mikroskopbild die leere Substratfläche zurück. Zum Ausspülen der Bakterie 10 wird entweder die Mikrokapillare 1 oder der Verschiebetisch zu einer entsprechenden Stelle auf dem Zielsubstrat gefahren. Hierbei wird der Innendruck auf +100 mbar erhöht. Während die Kapillare 1 auf das Zielsubstrat (hier die Randzone auf dem Substrat 9) aufgesetzt wird, findet der Ausspülprozeß statt. Nachdem die Kapillare 1 wiederum von dem Zielsubstrat abgehoben wurde, wird die ausgespülte Bakterie im Phasenkontrastbild des Mikroskops erneut sichtbar. Auf diese Weise wurden in vier Beispielen jeweils 10 Bakterien von einem Ausgangssubstrat auf ein Zielsubstrat, das Nährstoff enthielt, übertragen. Nach einer Anwachszeit von einigen Tagen bildeten sich in 50-60% der Fälle aus den einzelnen Bakterien Kolonien. In einem Test der Vitalitätsrate der Ausgangspopulation wurde ein Wert von 60% bestimmt, so daß hiermit der Transferprozeß als sehr schonend angesehen werden kann. Alternativ können die Bakterien können in eine Flüssigkeit z. B. PBS-Puffer ausgebracht werden. Diese Flüssigkeit kann sich in den Vertiefungen (Wells) von handelsüblichen 96- oder 384-Mikrotiterplatten befinden.

Neben dem unmittelbar nacheinander stattfindenden Pick- und Ausspülprozeß wurden auch mehrere Bakterien hintereinander in einem Arbeitsgang gepickt und entsprechend nacheinander am Zielsubstrat wieder ausgespült. Zu diesem Zweck werden der Mikromanipulator 3 und die Spritze 5 so gesteuert, daß bei einer gleichbleibenden Unterdruckeinstellung einzelne Bakterien nacheinander aufge­ pickt werden. Hierbei werden die Bakterien aufgesogen, indem die Kapillare 1 nacheinander auf die Substratstellen abgesenkt wird, die die zu pickenden Bakterie tragen. Anschließend werden bei einer gleichbleibenden Überdruckeinstellung die Bakterien ausgespült, indem die Kapillare nacheinander auf verschieden Stellen des Substrates abgesenkt wird.

Diese Prozedur ist vergleichsweise zeitsparend, da die Wege zwischen den zu sortierenden Objekten optimiert werden können und auch die Druckeinstellung in der Kapillare jeweils nur einmal vorgenommen werden muß. Der Vorteil in der Verwendung von Bakterien besteht in der einfachen Amplifizierung durch regu­ läres Anwachsen. Darüber hinaus können mit Hilfe der Polymerase Chain Reac­ tion (PCR) können aus einzeln sortierten Bakterien die Gensequenzen amplifiziert werden, die für die spezifische Eigenschaft der Bakterien verantwortlich sind.

Claims (7)

1. Vorrichtung zum Transfer von Mikroobjekten, insbesondere von biologi­ schen Objekten, von einem aktuellen Substrat (9) zu einem Zielsubstrat, mit einem verfahrbaren Pipettensystem, das mit einer Druckerzeugungs­ vorrichtung zum Ansaugen und Ausspülen der biologischen Objekte ver­ bunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Pipettensystem in einem Mikromanipulator (3) angeordnet ist und eine im wesentlichen vertikal angeordnete Mikrokapillare (1) mit einer lichten Weite von 1 µm bis 50 µm, vorzugsweise 5 µm bis 20 µm aufweist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikro­ kapillare (1) aus einem zylindrischen Glasrohr besteht.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapillare (1) annähernd rechtwinklig abgebogen ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapillare (1) aus Borosilikatglas, Aluminiumsilikatglas, oder Hämatokritglas besteht.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikromanipulator (3) und die Druckerzeugungsvorrichtung so gesteuert sind, daß bei einer Unterdruckeinstellung in einem Arbeitsgang mehrere biologische Objekte nacheinander von der Mikrokapillare (1) angesaugt und anschließend im nächsten Arbeitsgang mit einer Überdruckeinstellung nacheinander wieder ausgespült werden.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das aktuelle Substrat (9) und das Zielsubstrat aus einem mit Agar oder Agarose beschichteten Träger besteht.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielsubstrat aus einer Mikrotiterplatte besteht.