ES2892925T3 - Métodos para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos - Google Patents

Abstract

Un método para producir un anticuerpo IgG modificado humanizado, quimérico o humano que comprende un dominio de unión a FcRn, que tiene una semivida en sangre prolongada o reducida en comparación con antes de dicha modificación, en el que el método comprende: (a) modificar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo IgG humanizado, quimérico o humano para cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido que puede estar expuesto en la superficie del anticuerpo, en el que dicho al menos un residuo de aminoácido es un residuo de aminoácido en una región variable de la cadena pesada o cadena ligera de dicho anticuerpo, y en el que se logra el cambio de carga de dicho al menos un residuo de aminoácido por sustitución de aminoácidos; (b) cultivar una célula hospedadora para expresar el ácido nucleico; (c) recoger dicho anticuerpo modificado del cultivo de célula hospedadora; y (d) evaluar si dicha semivida se ha prolongado o reducido realizando ensayos cinéticos.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos

Campotécnico

La presente divulgación se refiere a métodos para modificar anticuerpos para controlar la farmacocinética de los anticuerpos en la sangre, a composiciones farmacéuticas que comprenden como principio activo un anticuerpo cuya farmacocinética en sangre está controlada y métodos para producirlas.

Antecedentesdelatécnica

Puesto que los anticuerpos son altamente estables en sangre y tienen pocos efectos adversos, han llamado mucho la atención como productos farmacéuticos. Existen una serie de compuestos farmacéuticos con anticuerpos de tipo IgG disponibles en el mercado y muchos de estos están actualmente en desarrollo (documentos distintos de patente 1 y 2). Se han desarrollado tecnologías para potenciar la función efectora y similares, para producir productos farmacéuticos con anticuerpos de segunda generación. Por ejemplo, son conocidas las tecnologías para potenciar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) a través de sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc de un anticuerpo IgG (documento distinto de patente 3). Además de dichas sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la potenciación de la función efectora, existen informes sobre otras sustituciones de aminoácidos en el dominio Fc, que prolongan la semivida del anticuerpo en sangre (documentos distintos de patente 4 y 5). Prolongar la semivida del anticuerpo en sangre permite la administración de productos farmacéuticos con anticuerpos a dosis reducidas o a intervalos más amplios y, así, da como resultado la proporción de productos farmacéuticos con anticuerpos altamente ventajosos y económicos. Específicamente, se puede prolongar la semivida en sangre modificando el dominio Fc a través de sustituciones de aminoácidos que incrementan la afinidad por el receptor de Fc neonatal conocido como el receptor de rescate de IgG. De forma alternativa, se puede prolongar la semivida en sangre reordenando los dominios CH1, CH2 y CH3 de región constante (documento distinto de patente 6). Sin embargo, las secuencias de aminoácidos de regiones constantes de un anticuerpo IgG se conservan en seres humanos y por lo tanto es mejor mantener el número de sustituciones de aminoácidos artificiales en las regiones constantes al mínimo desde el punto de vista de la antigenicidad.

Las técnicas notificadas para sustituir aminoácidos en regiones variables de anticuerpos IgG incluyen no solo la humanización (documento distinto de patente 7) sino también la maduración de la afinidad para potenciar la actividad de unión usando sustituciones de aminoácidos en regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (documento distinto de patente 8) y la mejora de la estabilidad fisicoquímica a través de sustituciones de aminoácidos en regiones marco conservadas (FR) (documento distinto de patente 9). Por tanto, a diferencia de las regiones constantes, la sustitución de aminoácidos en regiones variables es una técnica general para mejorar la función y las propiedades de un anticuerpo. Puesto que las secuencias de aminoácidos de la CDR de un anticuerpo humanizado derivan de un animal no humano, el riesgo de antigenicidad no se considerará un problema. De forma alternativa, si la secuencia de FR es la misma que la de un anticuerpo humano divulgado públicamente en la base de datos Kabat (http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) o la base de datos IMGT (http://imgt.cines.fr/), el riesgo de antigenicidad se considera bajo. Sin embargo, solo las sustituciones de aminoácidos descritas anteriormente en la región Fc constante están disponibles hasta el momento como métodos para mejorar la semivida de anticuerpos IgG en sangre. No hay informes sobre un método para mejorar la semivida del anticuerpo IgG en sangre usando sustitución de aminoácidos en una región variable en la que el riesgo de antigenicidad sea más bajo. El motivo es que se consideró que la semivida de la IgG en sangre depende fuertemente de su unión al receptor de Fc neonatal, el receptor de rescate y la eliminación de IgG dependiente de antígeno (documento distinto de patente 10), y las regiones variables no tienen una influencia significativa sobre esta semivida en sangre. Mientras tanto, el punto isoeléctrico (pI) de IgG disminuye cuando la IgG se anioniza a través de succinación (documento distinto de patente 11), o el pI de la IgG se incrementa cuando el anticuerpo se cationiza a través de la modificación usando una poliamina (documento distinto de patente 12). Sin embargo, en ambos casos, la semivida en sangre se acorta en lugar de prolongarse. Por tanto, no se ha logrado una mejora de la semivida en sangre cambiando el pI a través de la modificación.

Mientras tanto, la semivida de los minicuerpos (anticuerpos de bajo peso molecular) tales como Fab y scFv es más corta que la de la IgG, que es un anticuerpo completo. Por lo tanto, se puede prolongar la semivida de los minicuerpos en sangre por la modificación usando un polímero tal como polietilenglicol para reducir su excreción renal (documento distinto de patente 13). Además de la modificación con un polímero, también se ha informado de un desplazamiento en el punto isoeléctrico (pI) para modificar la farmacocinética de los minicuerpos en sangre. Por ejemplo, el documento distinto de patente 14 describió que la modificación de Fab anti-Tac con un ácido orgánico disminuyó su pI, dando como resultado una mejora del ABC (área bajo la curva). Por el contrario, los documentos distintos de patente 15 y 16 describieron que la modificación de dsFv anti-Tac con un ácido orgánico disminuyó su pI, dando como resultado una reducción del ABC. El documento distinto de patente 17 demostró que la semivida (t1/2) y el ABC de la toxina anti-Tac-scFv se redujeron cuando disminuyó su pI modificando sus regiones variables a través de sustituciones de aminoácidos. El documento distinto de patente 18 describe que casi no existieron cambios en el ABC de un scFv cuando se disminuyó su pI añadiendo aminoácidos al extremo C terminal. Por tanto, se puede incrementar o disminuir el ABC de un minicuerpo cuando se disminuye su pI por modificación o sustitución de aminoácidos. En consecuencia, no se puede controlar de forma exacta la semivida de los minicuerpos en sangre como se pretendía desplazando el pI.

[Documento distinto de patente 1] Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 2005;23: 1073-1078

[Documento distinto de patente 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. Abril de 2005;59(3):389-96.

[Documento distinto de patente 3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 31 de Agosto de 2005;20(1):17-29. Revisión.

[Documento distinto de patente 4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 1 de enero de 2006;176(1):346-56.

[Documento distinto de patente 5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. Julio de 1997;15(7):637-40.

[Documento distinto de patente 6] Zuckier LS, Chang CJ, Scharff MD, Morrison SL., Chimeric human-mouse IgG antibodies with shuffled constant region exons demonstrate that multiple domains contribute to in vivo half-life., Cancer Res. 1 de septiembre de 1998;58(17):3905-8.

[Documento distinto de patente 7] Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods. Mayo de 2005;36(1):69-83.

[Documento distinto de patente 8] Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lemer RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci USA. 14 de junio de 2005;102(24):8466-71.

[Documento distinto de patente 9] Ewert S, Honegger A, Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering., Methods. Octubre de 2004;34(2): 184-99. Revisión.

[Documento distinto de patente 10] Lobo ED, Hansen RJ, Balthasar JP., Antibody pharmacokinetics and pharmacodynamics., J Pharm Sci. noviembre de 2004;93(11):2645-68. Revisión.

[Documento distinto de patente 11] Yamasaki Y, Sumimoto K, Nishikawa M, Yamashita F, Yamaoka K, Hashida M, TakakuraY., harmacokinetic analysis of in vivo disposition of succinylated proteins targeted to liver nonparenchymal cells via scavenger receptors: importance of molecular size and negative charge density for in vivo recognition by receptors., Pharmacol Exp Ther. Mayo de 2002;301(2):467-77.

[Documento distinto de patente 12] Poduslo JF, Curran GL., olyamine modification increases the permeability of proteins at the blood-nerve and blood-brain barriers., Neurochem. Abril de 1996;66(4): 1599-609.

[Documento distinto de patente 13] Yang K, Basu A, Wang M, Chintala R, Hsieh MC, Liu S, Hua J, Zhang Z, Zhou J, Li M, Phyu H, Petti G, Mendez M, Janjua H, Peng P, Longley C, Borowski V, Mehlig M, Filpula D., Tailoring structure-function and pharmacokinetic properties of single-chain Fv proteins by site-specific PEGylation., Protein Eng. Octubre de 2003;16(10):761-70.

[Documento distinto de patente 14] Kobayashi H, Le N, Kim IS, Kim MK, Pie JE, Drumm D, Paik DS, Waldmann TA, Paik CH, Carrasquillo JA., The pharmacokinetic characteristics of glycolated humanized anti-Tac Fabs are determined by their isoelectric points., Cancer Res. 15 de enero de 1999;59(2):422-30.

[Documento distinto de patente 15] Kim I, Kobayashi H, Yoo TM, Kim MK, Le N, Han ES, Wang QC, Pastan I, Carrasquillo JA, Paik CH., Lowering of pI by acylation improves the renal uptake of 99mTc-labeled anti-Tac dsFv: effect of different acylating reagents., Nucl Med Biol. Noviembre de 2002;29(8):795-801

[Documento distinto de patente 16] Kim IS, Yoo TM, Kobayashi H, Kim MK, Le N, Wang QC, Pastan I, Carrasquillo JA, Paik CH., Chemical modification to reduce renal uptake of disulfide-bonded variable region fragment of anti-Tac monoclonal antibody labeled with 99mTc., Bioconjug Chem. Mayo-junio de 1999;10(3):447-53.

[Documento distinto de patente 17] Onda M, Nagata S, Tsutsumi Y, Vincent JJ, Wang Q, Kreitman RJ, Lee B, Pastan I., Lowering the isoelectric point of the Fv portion of recombinant immunotoxins leads to decreased nonspecific animal toxicity without affecting antitumor activity., Cancer Res. 1 de julio de 2001;61(13):5070-7.

[Documento distinto de patente 18] Pavlinkova G, Beresford G, Booth BJ, Batra SK, Colcher D., Charge-modified single chain antibody constructs of monoclonal antibody CC49: generation, characterization, pharmacokinetics, and biodistribution analysis., Nucl Med Biol. Enero de 1999;26(1):27-34.

[Documento distinto de patente 19] Deen WM, Lazzara MJ, Myers BD., Structural determinants of glomerular permeability., Am J Physiol Renal Physiol. Octubre de 2001;281(4):F579-96.

[Documento distinto de patente 20] Schaeffer RC Jr, Gratrix ML, Mucha DR, Carbajal JM., The rat glomerular filtration barrier does not show negative charge selectivity., Microcirculation. Octubre de 2002;9(5):329-42.

[Documento distinto de patente 21] Goode NP, Shires M, Davison AM., The glomerular basement membrane charge-selectivity barrier: an oversimplified concept?, Nephrol Dial Transplant. Septiembre de 1996;11(9):1714-6.

[Documento distinto de patente 22] Comper WD, Glasgow EF., Charge selectivity in kidney ultrafiltration., Kidney Int. mayo de 1995;47(5): 1242-51.

[Documento distinto de patente 23] Ghetie V, Ward ES. FcRn: the MHC class I-related receptor that is more than an IgG transporten Immunol Today. Diciembre de 1997;18(12):592-8.

[Documento distinto de patente 24] He XY, Xu Z, Melrose J, Mullowney A, Vasquez M, Queen C, Vexler V, Klingbeil C, Co MS, Berg EL. Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin. J Immunol. 15 de enero de 1998;160(2):1029-35.

[Documento distinto de patente 25] Gobburu JV, Tenhoor C, Rogge MC, Frazier DE Jr, Thomas D, Benjamin C, Hess DM, Jusko WJ. Pharmacokinetics/dynamics of 5c8, a monoclonal antibody to CD 154 (CD40 ligand) suppression of an immune response in monkeys. J Pharmacol Exp Ther. Agosto de 1998;286(2):925-30.

[Documento distinto de patente 26] Kashmiri SV, Shu L, Padlan EA, Milenic DE, Schlom J, Hand PH., Generation, characterization, and in vivo studies of humanized anticarcinoma antibody CC49., Hybridoma. Octubre de 1995; 14(5) :461-73.

[Documento distinto de patente 27] Graves SS, Goshom SC, Stone DM, Axworthy DB, Reno JM, Bottino B, Searle S, Henry A, Pedersen J, Rees AR, Libby RT., Molecular modeling and preclinical evaluation of the humanized NR-Lu-13 antibody., Clin Cancer Res. Abril de 1999;5(4):899-908.

[Documento distinto de patente 28] Couto JR, Blank EW, Peterson JA, Ceriani RL., Anti-BA46 monoclonal antibody Mc3: humanization using a novel positional consensus and in vivo and in vitro characterization., Cancer Res. 15 de abril de 1995;55(8): 1717-22.

[Documento distinto de patente 29] Adams CW, Allison DE, Flagella K, Presta L, Clarke J, Dybdal N, McKeever K, Sliwkowski MX. Humanization of a recombinant monoclonal antibody to produce a therapeutic HER dimerization inhibitor, pertuzumab., Cancer Immunol Immunother. 3 de septiembre de 2005;: 1-11 [Documento distinto de patente 30] Binz HK, Amstutz P, Pluckthun A., Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains., Nat Biotechnol. Octubre de 2005;23(10): 1257-68.

Divulgacióndelainvención

[Problemaspararesolverporlainvención]

La presente invención se logró a la vista de las circunstancias anteriores. Un objetivo de la presente divulgación es proporcionar métodos para controlar la semivida en sangre de los polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn, tales como anticuerpos IgG, modificando los polipéptidos a través de sustitución de residuos de aminoácidos expuestos en su superficie; composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn, cuya semivida en sangre se controla por sustituciones de aminoácidos; y métodos para producir las composiciones farmacéuticas.

[Mediospararesolverlosproblemas]

Se han realizado estudios dedicados sobre métodos para controlar la semivida en sangre de polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn a través de sustituciones de aminoácidos. Como resultado, se desarrollaron métodos para controlar la semivida de anticuerpos IgG controlando la carga de superficie a través de la modificación de residuos expuestos en la superficie en las regiones variables de los anticuerpos IgG, polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn. Específicamente, se han descubierto sitios de modificación en regiones variables para controlar la carga de superficie y la semivida de anticuerpos IgG en sangre sin influir en la estructura y función de los anticuerpos. Además, se ha confirmado que los anticuerpos cuya semivida en sangre se controla por la presente invención realmente mantienen su actividad.

Independientemente del tipo de antígeno objetivo, los métodos de la presente divulgación son ampliamente aplicables a polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn, tales como las IgG, que se reciclan por medio de la vía de rescate de FcRn, y cuya vía metabólica principal no es la excreción renal.

La presente divulgación se refiere a métodos para controlar la semivida en sangre de los polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn, tales como anticuerpos IgG, modificando los polipéptidos a través de sustitución de residuos de aminoácidos expuestos en su superficie; composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn, cuya semivida en sangre se controla por sustituciones de aminoácidos; y métodos para producir las composiciones farmacéuticas.

Más específicamente, la presente invención se refiere a lo siguiente:

[1] Un método para producir un anticuerpo IgG modificado humanizado, quimérico o humano que comprende un dominio de unión a FcRn, que tiene semivida prolongada o reducida en sangre en comparación con antes de dicha modificación, en el que el método comprende:

(a) modificar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo IgG humanizado, quimérico o humano para cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido que puede estar expuesto en la superficie del anticuerpo, en el que dicho al menos un residuo de aminoácido es un residuo de aminoácido en una región variable de cadena pesada o cadena ligera de dicho anticuerpo, y en el que el cambio de carga de dicho al menos un residuo de aminoácido se logra mediante sustitución de aminoácido;

(b) cultivar una célula hospedadora para expresar el ácido nucleico,

(c) recoger dicho anticuerpo modificado del cultivo de célula hospedadora; y

(d) evaluar si dicha semivida se ha prolongado o reducido al realizar pruebas cinéticas.

[2] Un método para prolongar o reducir la semivida en sangre de un anticuerpo IgG humanizado, quimérico o humano que comprende un dominio de unión a FcRn, método que comprende cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido que puede exponerse en la superficie del anticuerpo, en el que el residuo de aminoácido cuya carga se cambia es un residuo de aminoácido en una región variable de cadena pesada o cadena ligera de dicho anticuerpo, y en el que el cambio de carga del residuo de aminoácido se logra mediante una sustitución de aminoácido, y comprendiendo dicho método además evaluar si dicha semivida se ha prolongado o reducido en comparación con antes de dicha sustitución al realizar pruebas cinéticas.

Brevedescripcióndelosdibujos

La fig. 1 es un gráfico que muestra la evaluación de la actividad de coagulación para un anticuerpo biespecífico humanizado (A69 humanizado (hA69a), B26 humanizado (hB26-F123e4) y BBA humanizado (hAL-F123j4)). El resultado de la evaluación demuestra que las actividades de coagulación son equivalentes a o mayores que las de los anticuerpos biespecíficos quiméricos.

La fig. 2 es un diagrama que muestra el modelado de anticuerpo para las combinaciones de región variable de cadena H-A69 humanizado (hA69a) y BBA humanizado (hAL-F123j4), y región variable de cadena H-hB26 humanizado (hB26-F123e4) y BBA humanizado (hAL-F123j4). Las cadenas laterales de aminoácidos que pueden cambiar la carga de superficie se muestran resaltadas. La numeración se realizó según el sistema de numeración de base de datos de Kabat (Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH).

La fig. 3 es una fotografía que muestra un resultado de análisis de enfoque isoeléctrico de ATF, hA69-PF, BiAb, hB26-PF, hA69-N97R, hA69-p18, hB26-F123e4 y hB26-p15.

La fig. 4 muestra una curva de calibrado de un marcador de pI y el pI de cada muestra determinado a partir de la curva, que se obtuvieron a partir del análisis de enfoque isoeléctrico de ATF, hA69-PF, BiAb, hB26-PF, hA69-N97R, hA69-p18, hB26-F123e4 y hB26-p15. Los diagramas demuestran que la carga de superficie varía dependiendo de las secuencias de aminoácidos de regiones variables y las diferencias en la carga de superficie que resultan de las modificaciones de aminoácidos desplazan el pI.

La fig. 5 muestra los resultados del análisis de anticuerpos A69 humanizados (hA69a y hA69-N97R; hA69-N97R, hA69-p18 y hA69-PF) con regiones variables no modificadas o modificadas para determinar su actividad de unión al factor IXa de antígeno. Los resultados demuestran que los anticuerpos modificados con puntos isoeléctricos desplazados tienen una actividad de unión comparable a la de los anticuerpos no modificados. La fig. 6 es un gráfico que muestra un resultado del análisis de anticuerpos B26 humanizados (hB26-F123e4 y hB26-p15) con regiones variables no modificadas o modificadas, respectivamente, para determinar su actividad de unión al factor X de antígeno. Los resultados demuestran que el anticuerpo modificado con punto isoeléctrico desplazado tiene una actividad de unión comparable a la del anticuerpo no modificado.

La fig. 7 es un gráfico que muestra las evoluciones temporales de las concentraciones plasmáticas de ATF, hA69-PF, BiAb y hB26-PF.

La fig. 8 muestra la correlación entre el pI y parámetros farmacocinéticos, aclaramiento (CL) y semivida (T1/2), para ATF, hA69-PF, BiAb, hB26-PF, hA69-N97R, hA69-p18, hB26-F123e4 y hB26-p15.

Mejormodoparallevara cabola invención

La presente invención proporciona métodos para el control de la farmacocinética de polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn en sangre. Preferentemente, los métodos de la presente divulgación comprenden cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido que puede estar expuesto en la superficie de dichos polipéptidos. Específicamente, se puede controlar la farmacocinética de estos polipéptidos en sangre desplazando su punto isoeléctrico (pI) cambiando la carga de sus residuos de aminoácidos.

Como se ha descrito anteriormente, la farmacocinética en sangre de minicuerpos tales como scFv y Fab no se puede controlar necesariamente desplazando el pI. Se sabe que la excreción renal es la vía metabólica principal de dichos minicuerpos. Sin embargo, algunos de los documentos distintos de patente 19 a 22 describen que la eficacia de la filtración renal en la excreción renal es menor si la carga de proteína es más negativa, mientras que otros informan de que la carga de proteína no tiene influencia sobre la eficacia de la filtración renal. Además, algunos de los documentos distintos de patente 14 a 18 informan de que la semivida de un minicuerpo en sangre se puede prolongar disminuyendo su pI, mientras que otros informan de que se puede acortar disminuyendo su pI. Las proteínas filtradas a través del riñón se reabsorben por el túbulo proximal. Esta reabsorción se puede llegar a suprimir más cuando la carga de una proteína es más negativa. Esto sugiere que la semivida de un minicuerpo no se puede controlar de forma exacta como se pretende desplazando el pI.

Por otra parte, la vía metabólica principal de los anticuerpos IgG no es la excreción renal debido a que su peso molecular es bastante alto. Se sabe que los anticuerpos IgG con Fc se reciclan por medio de la vía de rescate de FcRn expresada en las células endoteliales de vasos sanguíneos y similares, y por tanto tienen una semivida larga. Se asume que la IgG se metaboliza principalmente en las células endoteliales (documento distinto de patente 23). En consecuencia, se ha especulado con que las moléculas de IgG libres se metabolizan mientras que las moléculas de IgG incorporadas de forma no específica en células endoteliales se reciclan por medio de su unión a FcRn. Las IgG con una disminución en la actividad de unión a FcRn tienen una semivida más corta en sangre, mientras que su semivida en sangre se puede prolongar incrementando su actividad de unión a FcRn (documento distinto de patente 23). En consecuencia, se han llevado a cabo métodos previos para controlar la farmacocinética de las IgG en sangre alterando la actividad de unión a FcRn a través de la modificación de Fc. Por el contrario, el ejemplo 8 en el presente documento demuestran que cuando las IgG comparten el mismo dominio Fc, la semivida de la IgG se correlaciona con el pI mostrando un coeficiente de correlación alto independientemente del tipo de antígeno objetivo, y que la semivida en sangre de dos tipos de anticuerpos frente a diferentes antígenos se puede controlar en realidad modificando los pI de sus regiones variables sin modificar el Fc. Se supone que la tasa de captación de anticuerpo inespecífico por las células endoteliales depende de la interacción fisicoquímica de Coulomb entre una IgG y una superficie celular con carga negativa. Por lo tanto, se cree que una disminución (un incremento) en el pI de IgG reduce (potencia) la interacción de Coulomb, y esto está seguido de una reducción (un incremento) en una captación inespecífica por células endoteliales, lo que da lugar a una disminución (un incremento) en el metabolismo en estas células y, como resultado, se puede controlar la farmacocinética en sangre. Puesto que la interacción de Coulomb entre células endoteliales y la superficie celular con carga negativa es una interacción fisicoquímica, se supone que la interacción no depende del antígeno objetivo. Por tanto, los métodos de la presente divulgación para controlar la farmacocinética en sangre son ampliamente aplicables a polipéptidos tales como IgG arbitrarias que comprenden un dominio de unión a FcRn que se reciclan por medio de la vía de rescate de FcRn y con una vía metabólica principal que no es la excreción renal, independientemente del tipo de antígeno.

Por tanto, los polipéptidos de la presente divulgación que comprenden un dominio de unión a FcRn no se limitan a anticuerpos IgG, sino que pueden ser cualquier proteína que se pueda unir (que tenga actividad o afinidad de unión) a un receptor Fc (FcRn). Por tanto, los polipéptidos de la presente divulgación que comprenden un dominio de unión a FcRn no están particularmente limitados; sin embargo, son preferentemente proteínas que comprenden un dominio Fc de anticuerpo o dominio de tipo Fc. Los polipéptidos de la presente divulgación que comprenden un dominio de unión a FcRn incluyen, por ejemplo, anticuerpos IgG. Además, los polipéptidos de la presente divulgación que comprenden un dominio de unión a FcRn incluyen formas modificadas de anticuerpos (proteínas) siempre que se puedan unir a FcRn. Los ejemplos más preferentes de polipéptidos de la presente divulgación que comprenden un dominio de unión a FcRn son los anticuerpos IgG.

Cuando se usa un anticuerpo IgG como polipéptido que comprende un dominio de unión a FcRn en la presente divulgación, puede ser de cualquier subtipo de IgG o un anticuerpo IgG biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos específicos para dos epítopos diferentes, e incluyen anticuerpos que reconocen diferentes antígenos y los que reconocen epítopos diferentes en un único antígeno. Por otra parte, cuando el anticuerpo es un minicuerpo tal como scFv o Fab, cuya vía metabólica principal es la excreción renal, su farmacocinética en sangre no se puede controlar desplazando el pI, como se ha descrito anteriormente. La presente divulgación es aplicable a cualquier tipo de anticuerpo, siempre que sea una proteína de unión a Fc cuya vía metabólica principal no es la excreción renal, por ejemplo, scFv-Fc, dAb-Fc y proteínas de fusión Fc. Dado que la excreción renal no es la vía metabólica principal de estas moléculas, se puede controlar su farmacocinética en sangre desplazando el pI usando los métodos de la presente divulgación. Las moléculas de anticuerpo para las que la presente divulgación es aplicable pueden ser moléculas similares a anticuerpos. Las moléculas similares a anticuerpos se refieren a moléculas que ejercen sus funciones uniéndose a moléculas objetivo (documento distinto de patente 30) e incluyen, por ejemplo, DARPinas, aficuerpos y avímeros.

En el presente documento, la expresión “se controla la farmacocinética en sangre” indica que la farmacocinética en sangre se desplaza en una dirección deseada cuando se compara entre antes y después de la modificación de un polipéptido que comprende un dominio de unión a FcRn. Específicamente, cuando el propósito es el de prolongar la semivida en sangre, el control de la farmacocinética en sangre significa la prolongación de la semivida en sangre. De forma alternativa, cuando el propósito es reducir la semivida en sangre, el control de la farmacocinética en sangre se refiere a la reducción de la semivida en sangre.

En la presente divulgación, se puede evaluar si la farmacocinética en sangre de un polipéptido que comprende un dominio de unión a FcRn se desplaza en una dirección deseada o si la farmacocinética en sangre se puede controlar de forma exacta como se pretende, llevando a cabo pruebas cinéticas apropiadas, por ejemplo, pruebas que usan ratones, ratas, conejos, perros, monos o similares. Más específicamente, como se usa en el presente documento, “control de la farmacocinética en sangre” incluye el control de cualquier parámetro tal como la semivida en sangre, tiempo de permanencia medio en sangre o aclaramiento en sangre (Pharmacokinetics: Enshu niyoru Rikai (Understanding through Exercises), Nanzando). Por ejemplo, el control de la farmacocinética en sangre se puede evaluar por análisis no compartimental apropiado usando un programa informático de análisis cinético in vivo, WinNonlin (Pharsight), de acuerdo con el manual de instrucciones adjunto.

En el presente documento, la expresión “aminoácidos que pueden estar expuestos en la superficie”, en general, significa aminoácidos que constituyen un polipéptido que comprende un dominio de unión a FcRn y que están presentes en la superficie del polipéptido. Las cadenas laterales de un aminoácido que está presente en la superficie del polipéptido pueden estar en contacto con moléculas de disolvente (típicamente, moléculas de agua). Sin embargo, no toda la cadena lateral tiene que estar en contacto con las moléculas de disolvente. Cuando incluso una porción de las cadenas laterales está en contacto con moléculas de disolvente, se considera que el aminoácido está presente en la superficie del polipéptido. Los expertos en la técnica pueden preparar modelos de homología para polipéptidos y anticuerpos a través del modelado de homología usando un programa informático comercialmente disponible, y así sucesivamente, y también pueden seleccionar residuos apropiados como aminoácidos de superficie usando los modelos.

En la presente divulgación, los “aminoácidos que pueden estar expuestos en la superficie” no están limitados en particular; sin embargo, están preferentemente fuera de un dominio de unión a FcRn de un polipéptido que comprende un dominio de este tipo. Un dominio de unión a FcRn incluye, por ejemplo, dominios Fc y de tipo Fc. Cuando un polipéptido de la presente divulgación que comprende un dominio de unión a FcRn es una IgG, los residuos de aminoácidos cuyas cargas se van a cambiar según la presente invención están presentes preferentemente dentro de las regiones variables de la cadena pesada o ligera del anticuerpo IgG. Específicamente, las regiones variables incluyen regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y regiones marco conservadas (FR).

Los expertos en la técnica pueden seleccionar aminoácidos de superficie apropiados en regiones variables de anticuerpo usando modelos de homología preparados por modelado de homología o similares. Dichos aminoácidos de superficie incluyen, por ejemplo, aminoácidos en H1, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H39, H42, H43, H44, H46, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, H85, H86, H105, H108, H110 y H112 en una región FR de la cadena H, pero no se limitan a estos en la presente divulgación.

Asimismo, los expertos en la técnica también pueden seleccionar aminoácidos de superficie en una región CDR de la cadena H usando modelos de homología. Por ejemplo, el aminoácido en H97 está expuesto en la superficie en casi todos los anticuerpos. Los aminoácidos de superficie en una región FR de la cadena L incluyen, por ejemplo, los aminoácidos en L1, L3, L7, L8, L9, L11, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L38, L39, L41, L42, L43, L45, L46, L49, L57, L60, L63, L65, L66, L68, L69, L70, L74, L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L105, L106, L107 y L108, pero no se limitan a estos en la presente divulgación. Asimismo, los expertos en la técnica también pueden seleccionar aminoácidos de superficie en una región CDR de la cadena L usando modelos de homología.

En los métodos de la presente invención, la “modificación” de un residuo de aminoácido específicamente se refiere a la sustitución del residuo de aminoácido original con un residuo de aminoácido diferente, deleción del residuo de aminoácido original, adición de otro residuo de aminoácido, y así sucesivamente. La modificación significa preferentemente la sustitución del residuo de aminoácido original con un residuo de aminoácido diferente. Específicamente, como se usa en el presente documento, “modificación de la carga de un residuo de aminoácido” incluye preferentemente sustituciones de aminoácidos.

Cuando un polipéptido de la presente divulgación que comprende un dominio de unión a FcRn es un anticuerpo IgG, “cambiar la carga de un residuo de aminoácido” descrito anteriormente incluye, por ejemplo, cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en residuos de aminoácidos en las posiciones 10, 12, 23, 39, 43 y 105 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat en una cadena pesada del anticuerpo IgG. De los residuos de aminoácidos en las posiciones indicadas anteriormente, no es necesario modificar los residuos de aminoácidos distintos de los residuos de aminoácidos cuyas cargas se han modificado siempre que la farmacocinética en sangre se haya controlado como se pretende. Los aminoácidos se pueden modificar para que tengan una carga del mismo tipo que el de los residuos de aminoácidos modificados o para que no tengan carga alguna.

Se sabe que los aminoácidos incluyen aminoácidos con carga. Los aminoácidos conocidos, en general, con una carga positiva (aminoácidos con carga positiva) incluyen la lisina (K), arginina (R) e histidina (H). Los aminoácidos conocidos con una carga negativa (aminoácidos con carga negativa) incluyen ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E). Los aminoácidos distintos de estos son conocidos como aminoácidos sin carga.

Preferentemente, los “residuos de aminoácidos modificados” descritos anteriormente se seleccionan de forma apropiada de residuos de aminoácidos de cualquier grupo (a) o (b) indicado a continuación; sin embargo, los aminoácidos modificados no están particularmente limitados a estos.

(a) ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D)

(b) lisina (K), arginina (R) e histidina (H)

Cuando un residuo de aminoácido original (no modificado) ya tiene una carga, la modificación del aminoácido se lleva a cabo preferentemente en un aminoácido sin carga. Específicamente, la modificación de la presente divulgación incluye:

(1) sustitución de un aminoácido con carga con un aminoácido sin carga;

(2) sustitución de un aminoácido con carga con un aminoácido que lleva una carga opuesta al aminoácido original; y

(3) sustitución de un aminoácido sin carga con un aminoácido con carga.

En los métodos de la presente divulgación, preferentemente, los residuos de aminoácidos en los polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn se modifican para desplazar el punto isoeléctrico (pI). Cuando el número de residuos de aminoácidos que se van a introducir a través de la modificación es de dos o más, algunos de ellos pueden ser residuos aminoacídicos no cargados.

El número de residuos de aminoácidos que se van a modificar en los métodos de la presente invención no está particularmente limitado. Sin embargo, cuando se modifica una región variable del anticuerpo, por ejemplo, solo se modifican preferentemente un número mínimo de los residuos de aminoácidos requeridos para lograr la farmacocinética en sangre controlada como se pretende, de modo que no se reduzca la actividad de unión a antígeno y no se incremente la antigenicidad.

La secuencia de aminoácidos después de la modificación es preferentemente una secuencia humana de modo que no se incremente la antigenicidad; sin embargo, la presente divulgación no se limita a esto. Además, se pueden introducir mutaciones en sitios distintos de aquellos en los que se han realizado modificaciones para desplazar el punto isoeléctrico, de modo que las FR respectivas (FR1, FR2, FR3 y FR4) después de la modificación son secuencias humanas. Se ha informado de un método de este tipo para sustituir cada FR con una secuencia humana en un documento distinto de patente (Ono K et al., Mol Immunol. Abril de 1999; 36(6): 387-395). De forma alternativa, para desplazar el punto isoeléctrico, se puede modificar cada FR en otra FR humana con un punto isoeléctrico diferente (por ejemplo, FR3 se puede sustituir con otra FR humana con un punto isoeléctrico menor). Se ha informado de un método de humanización de este tipo en un documento distinto de patente (Dall'Acqua WF, Methods. Mayo de 2005; 36(1): 43-60).

Aun cuando la farmacocinética en sangre no se puede controlar como se pretende modificando solo un pequeño número de cargas de superficie, se puede obtener un polipéptido deseado que comprende un dominio de unión a FcRn, cuya farmacocinética en sangre está controlada, repitiendo las modificaciones de carga de superficie y la evaluación de la farmacocinética en sangre.

En macacos de la India, el documento distinto de patente 24 informa de una comparación de la farmacocinética en sangre entre EP5C7.g4 quimérico, un anticuerpo quimérico (IgG4), y HuEP5C7.g4, un anticuerpo humanizado (IgG4), ambos de los cuales derivan de un anticuerpo anti-E, P-selectina, en la que se descubrió que las farmacocinéticas eran comparables entre sí. El documento distinto de patente 25 describe una comparación de la farmacocinética en sangre en macacos cangrejero entre ch5d8, un anticuerpo quimérico, y Hu5c8, un anticuerpo humanizado, ambos de los cuales derivan de un anticuerpo anti-CD154, en la que se descubrió que la farmacocinética era comparable entre sí. El documento distinto de patente 26 demuestra que la farmacocinética en sangre en ratones de cCC49, un anticuerpo quimérico, era comparable a la de HuCC49, un anticuerpo humanizado. Además, los documentos distintos de patente 27 y 28 informa de que la farmacocinética y la distribución en sangre de los anticuerpos de ratón eran comparables a las de los anticuerpos humanizados cuando se evaluaron usando ratones. Puesto que tanto los Fc de ratón como los Fc humanos son reactivos con el FcRn de ratón, los hallazgos anteriores sugieren que la farmacocinética y la distribución en sangre de los anticuerpos quiméricos son comparables a las de los anticuerpos humanizados descritos anteriormente. Como se muestra por estos ejemplos, la farmacocinética de los anticuerpos quiméricos en sangre es comparable a la de los anticuerpos humanizados. Específicamente, cuando se humaniza un anticuerpo por un método conocido tal como el descrito en el documento distinto de patente 7, su farmacocinética en sangre es comparable a la de un anticuerpo quimérico. Por tanto, los anticuerpos humanizados con una farmacocinética en sangre que está controlada no se pueden producir por métodos conocidos.

Se pueden producir anticuerpos humanizados cuya farmacocinética en sangre está controlada (específicamente, se prolonga la semivida en sangre o se reduce la farmacocinética en sangre) en comparación con anticuerpos quiméricos desplazando sus pI a través de la modificación de aminoácidos de superficie en el momento de la humanización de anticuerpos quiméricos, usando los métodos descubiertos por la presente invención. La modificación de los aminoácidos de superficie para controlar la farmacocinética en sangre se puede realizar en el momento de la humanización o después de la humanización.

El documento distinto de patente 29 describe que la farmacocinética en sangre de tres tipos de anticuerpos humanizados, trastuzumab, bevacizumab y pertuzumab, obtenidos a través de la humanización usando la misma secuencia de FR de un anticuerpo humano, era casi igual. Específicamente, la farmacocinética en sangre es casi igual cuando se realiza la humanización usando la misma secuencia de FR. La concentración en sangre se puede controlar solo cuando se desplazan los pI de los anticuerpos modificando los aminoácidos de superficie usando los métodos descubiertos por la presente invención, además del método de humanización descrito anteriormente.

Además, se pueden producir anticuerpos humanos, cuya farmacocinética en sangre está controlada (específicamente, se prolonga la semivida en sangre o se reduce la farmacocinética en sangre) en comparación con los anticuerpos humanos originales desplazando los pI de anticuerpos humanos preparados a partir de bibliotecas de anticuerpos humanos o de ratones que producen anticuerpos humanos y similares, a través de la modificación de aminoácidos de superficie.

Los “anticuerpos” de la presente divulgación incluyen los anticuerpos obtenidos introduciendo adicionalmente sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones y similares de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos que ya se han modificado para cambiar las cargas de sus residuos de aminoácidos como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos de la presente divulgación también incluyen los anticuerpos obtenidos cambiando adicionalmente la carga de los residuos de aminoácidos en anticuerpos cuyas secuencias de aminoácidos ya se han modificado por sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos, quimerización, humanización o similares.

Se pueden lograr modificaciones de aminoácidos tales como sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos, y quimerización y humanización, por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Asimismo, las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes y variables de anticuerpos que se usan para producir los anticuerpos de la presente divulgación como anticuerpos recombinantes también se pueden modificar por sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones de aminoácidos, o quimerización, humanización o similares.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser anticuerpos derivados de cualquier animal tal como un ratón, ser humano, rata, conejo, cabra o camello. Además, los anticuerpos pueden ser anticuerpos modificados, por ejemplo, anticuerpos quiméricos y, en particular, anticuerpos humanizados que comprenden sustituciones de aminoácidos en su secuencia. Los anticuerpos también incluyen productos de modificación de anticuerpos unidos a diversas moléculas.

“Anticuerpos quiméricos” son anticuerpos preparados combinando secuencias derivadas de diferentes animales. Los anticuerpos quiméricos incluyen, por ejemplo, anticuerpos que comprenden regiones variables (V) de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo de ratón y regiones constantes (C) de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano. Se pueden preparar anticuerpos quiméricos por métodos conocidos, por ejemplo, por el siguiente procedimiento: un ADN que codifica una región V de anticuerpo se liga con un ADN que codifica una región C de anticuerpo humano; el producto de ligamiento resultante se inserta en un vector de expresión; y la construcción se puede introducir en un hospedador para producir un anticuerpo quimérico.

Los “anticuerpos humanizados” también se denominan anticuerpos humanos remodelados, y se pueden obtener sustituyendo las CDR de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano, por ejemplo, un ratón por las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo humano. Son conocidos los métodos para identificar las CDR (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). También son conocidas las técnicas de recombinación genética generales para el procedimiento anterior (véase la publicación de solicitud de patente europea n.° EP 125023, y el documento WO 96/02576). Por ejemplo, las CDR de un anticuerpo de ratón se determinan por métodos conocidos, y se prepara un ADN de modo que codifique un anticuerpo en el que las CDR están unidas a las regiones marco conservadas (FR) de un anticuerpo humano. A continuación, se puede producir un anticuerpo humanizado por un sistema usando un vector de expresión convencional. Dichos ADN se pueden sintetizar por PCR usando como cebadores varios oligonucleótidos diseñados para comprender porciones que solapan los extremos de ambas regiones CDR y FR (véase el método descrito en el documento WO 98/13388). Se seleccionan FR de anticuerpos humanos unidos por CDR de modo que las CDR pueden formar un sitio de unión a antígeno adecuado. Si es necesario, se pueden modificar los aminoácidos en las FR de una región variable del anticuerpo de modo que las CDR de un anticuerpo humano remodelado pueden formar un sitio de unión a antígeno adecuado (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-856). Los residuos de aminoácidos modificables en las FR incluyen porciones que se unen directamente a un antígeno por medio de enlaces no covalentes (Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), porciones que tienen un impacto o efecto sobre la estructura de la CDR (Chotia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901­ 17) y porciones implicadas en la interacción entre VH y VL (documento EP 239400).

Cuando los anticuerpos de la presente divulgación son anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados, las regiones C de estos anticuerpos derivan preferentemente de anticuerpos humanos. Por ejemplo, Cy1, Cy2, Cy3 y Cy4 se pueden usar para las cadenas H, y Ck y CA se pueden usar para las cadenas L. Mientras tanto, las regiones C de anticuerpos humanos se pueden modificar según se requiera para mejorar el anticuerpo o la estabilidad de producción. Un anticuerpo quimérico de la presente divulgación comprende preferentemente una región variable de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado de la presente divulgación comprende preferentemente CDR de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y regiones FR y C derivadas de un anticuerpo humano. Las regiones constantes de los anticuerpos humanos comprenden secuencias de aminoácidos específicas para cada isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgM, IgA, IgD e IgE. Las regiones constantes usadas para preparar los anticuerpos humanizados de la presente divulgación pueden ser las regiones constantes de anticuerpos de cualquier isotipo. Preferentemente, se usa una región constante de una IgG humana, pero las regiones constantes no están limitadas a esto. Las FR derivadas de un anticuerpo humano, que se usan para preparar anticuerpos humanizados, no están particularmente limitadas, y por tanto se pueden derivar de un anticuerpo de cualquier isotipo.

Las regiones variables y constantes de los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente divulgación se pueden modificar por deleciones, sustituciones, inserciones, y/o adiciones, siempre que los anticuerpos presenten la misma especificidad de unión que la de los anticuerpos originales.

Se espera que los anticuerpos quiméricos y humanizados que usan secuencias derivadas de seres humanos sean útiles cuando se administran a seres humanos con fines terapéuticos o similares, ya que se ha reducido su antigenicidad en el cuerpo humano.

Se pueden usar secuencias conocidas como genes que codifican la cadena H o cadena L de anticuerpos antes de la introducción de mutaciones por métodos de la presente invención (en el presente documento, se pueden denominar simplemente “anticuerpos de la presente divulgación"), o se pueden obtener los genes por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden obtener a partir de una biblioteca de anticuerpos o clonando genes que codifican los anticuerpos a partir de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales.

En lo que respecta a las bibliotecas de anticuerpos, muchas bibliotecas de anticuerpos ya son bien conocidas y puesto que los métodos para producir bibliotecas de anticuerpos son conocidos, los expertos en la técnica pueden obtener de forma apropiada bibliotecas de anticuerpos. Por ejemplo, con respecto a las colecciones de fagos de anticuerpos, se puede hacer referencia a la bibliografía tal como Clackson et al, Nature 1991, 352: 624-8; Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97; Waterhouses et al, Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6; Griffiths et al, EMBO J.

1994, 13: 3245-60; Vaughan et al, Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14; y la publicación de patente japonesa Kohyo n.° H20-504970 (publicación de fase nacional japonesa no examinada correspondiente a una publicación internacional no japonesa). Además, se pueden usar métodos conocidos tales como métodos que usan células eucariotas como bibliotecas (documento WO95/15393) y métodos de presentación en ribosomas. Además, también son conocidas las técnicas para obtener anticuerpos humanos, por selección usando bibliotecas de anticuerpos humanos. Por ejemplo, se pueden expresar regiones variables de anticuerpos humanos en la superficie de fagos como anticuerpos monocatenarios (scFv) usando métodos de presentación en fagos, y se pueden seleccionar fagos que se unen a antígenos. El análisis genético de los fagos seleccionados puede determinar las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de anticuerpos humanos que se unen a los antígenos. Una vez que se revelan las secuencias de ADN de los scFv que se unen a los antígenos, se pueden producir vectores de expresión adecuados en función de estas secuencias para obtener anticuerpos humanos. Estos métodos ya son bien conocidos, y se puede hacer referencia a los documentos WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438 y WO95/15388.

En cuanto a los métodos para obtener genes que codifican anticuerpos a partir de hibridomas, se pueden usar técnicas conocidas, que implican el uso de antígenos deseados o células que expresan los antígenos deseados como antígenos sensibilizantes, usando estos para realizar las inmunizaciones según los métodos de inmunización convencionales, fusionando las células inmunitarias así obtenidas con células originales conocidas por métodos de fusión celular habituales, cribando las células productoras de anticuerpos monoclonales (hibridomas) por métodos de cribado habituales, sintetizando los ADNc de regiones variables de anticuerpo (regiones V) a partir de los ARNm de los hibridomas obtenidos usando una transcriptasa inversa y uniéndolos a los ADN que codifican las regiones constantes de anticuerpo deseado (regiones C).

Más específicamente, sin limitarse particularmente a los siguientes ejemplos, los antígenos sensibilizantes para obtener los genes de anticuerpo mencionados anteriormente que codifican las cadenas H y cadenas L incluyen tanto antígenos completos con inmunogenicidad como antígenos incompletos que comprenden haptenos y similares que no muestran inmunogenicidad. Por ejemplo, se pueden usar proteínas de longitud completa y péptidos parciales de proteínas de interés. Además, se sabe que las sustancias compuestas de polisacáridos, ácidos nucleicos, lípidos y similares se pueden convertir en antígenos. Por tanto, no existen limitaciones particulares sobre los antígenos de los anticuerpos de la presente divulgación. Se pueden preparar antígenos por métodos conocidos por los expertos en la técnica, y se pueden preparar, por ejemplo, por los métodos que usan baculovirus (por ejemplo, véase el documento WO98/46777). Se pueden producir hibridomas, por ejemplo, por el método de Milstein et al. (G. Kohler y C. Milstein, Metods Enzymol. 1981, 73: 3-46). Cuando la inmunogenicidad de un antígeno es baja, se puede unir a una macromolécula que tenga inmunogenicidad, tal como albúmina, y a continuación usarse para la inmunización. Además, al unir los antígenos a otras moléculas en caso necesario, se pueden convertir en antígenos solubles. Cuando se usan moléculas transmembranarias tales como receptores como antígenos, se pueden usar porciones de las regiones extracelulares de los receptores como fragmentos o se pueden usar células que expresan moléculas transmembranarias en su superficie celular como inmunógenos.

Se pueden obtener células productoras de anticuerpos inmunizando animales usando los antígenos sensibilizantes adecuados descritos anteriormente. De forma alternativa, se pueden preparar células productoras de anticuerpos por inmunización in vitro de linfocitos que pueden producir anticuerpos. Se pueden usar diversos mamíferos como animales para la inmunización, en la que, en general, se usan roedores, lagomorfos y primates. Los ejemplos de dichos animales incluyen ratones, ratas y hámsteres para roedores, conejos para lagomorfos y monos incluyendo macacos cangrejeros, macacos de la India, Papio hamadryas y chimpancés para primates. Además, también son conocidos animales transgénicos que llevan repertorios de genes de anticuerpos humanos, y se pueden obtener anticuerpos humanos usando estos animales (véase el documento WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56). En lugar de usar dichos animales transgénicos, por ejemplo, se pueden obtener los anticuerpos humanos deseados que tienen actividad de unión a antígenos deseados sensibilizando linfocitos humanos in vitro con los antígenos deseados o células que expresan los antígenos deseados, y a continuación fusionando los linfocitos sensibilizados con células de mieloma humano tales como U266 (véase la solicitud de patente japonesa Kokoku n.° H1-59878 (solicitud de patente japonesa examinada y aprobada publicada para oposición)). Además, se pueden obtener anticuerpos humanos deseados inmunizando animales transgénicos que llevan un repertorio completo de genes de anticuerpos humanos, con los antígenos deseados (véanse los documentos WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO96/34096 y WO96/33735).

La inmunización animal se puede llevar a cabo diluyendo y suspendiendo apropiadamente un antígeno sensibilizante en solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución salina fisiológica o similares, y formando una emulsión mezclando un coadyuvante en caso necesario, seguido de una inyección intraperitoneal o subcutánea en los animales. Después de eso, el antígeno sensibilizante mezclado con adyuvante incompleto de Freund se administra preferentemente varias veces cada de cuatro a 21 días. Se puede confirmar la producción de anticuerpos midiendo la valoración del anticuerpo objetivo en el suero del animal usando métodos convencionales.

Se pueden fusionar células productoras de anticuerpos de linfocitos o animales inmunizados con un antígeno deseado con células de mieloma usando agentes de fusión convencionales (por ejemplo, polietilenglicol) para generar hibridomas (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103). Cuando se requiera, se pueden cultivar y hacer crecer células de hibridoma, y se puede medir la especificidad de unión de los anticuerpos producidos a partir de estos hibridomas usando métodos de análisis conocidos tales como inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA) y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Después de esto, se pueden subclonar hibridomas que producen anticuerpos en los que se ha determinado la especificidad, afinidad o actividad de interés por métodos tales como dilución limitante.

A continuación, se pueden clonar los genes que codifican los anticuerpos seleccionados a partir de hibridomas o células productoras de anticuerpos (linfocitos sensibilizados y similares) usando sondas que se pueden unir específicamente a los anticuerpos (por ejemplo, oligonucleótidos complementarios para las secuencias que codifican las regiones constantes de los anticuerpos). También es posible la clonación a partir de ARNm usando RT-PCR. Las inmunoglobulinas se clasifican en cinco clases diferentes, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Estas clases se dividen además en varias subclases (isotipos) (por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; e IgA-1 e IgA-2). Las cadenas H y cadenas L usadas en la presente divulgación para producir anticuerpos no están particularmente limitadas y pueden derivar de anticuerpos que pertenecen a cualquiera de estas clases o subclases; sin embargo, las IgG son particularmente preferentes.

En el presente documento, es posible modificar genes que codifican la cadena H y genes que codifican la cadena L usando técnicas de ingeniería genética. Los anticuerpos modificados genéticamente tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados que se han modificado artificialmente para disminuir la antigenicidad heteróloga frente a seres humanos, y similares, se pueden producir de forma apropiada en caso necesario para anticuerpos tales como anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de hámster, anticuerpos de ovejas y anticuerpos de camello. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos compuestos de regiones variables de la cadena H y cadena L de un anticuerpo de mamífero no humano tal como anticuerpo de ratón, y regiones constantes de la cadena H y cadena L de un anticuerpo humano. Se pueden obtener uniendo los ADN que codifican regiones variables de un anticuerpo de ratón a los ADN que codifican las regiones constantes de un anticuerpo humano, incorporándolos en un vector de expresión, e introduciendo el vector en un hospedador para la producción de los anticuerpos. También se puede obtener un anticuerpo humanizado, que también se denomina un anticuerpo humano remodelado, como sigue: Se sintetiza una secuencia de ADN diseñada para unir las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo de un mamífero no humano, tal como un ratón, por PCR a partir de varios oligonucleótidos producidos de modo que tienen porciones solapantes en los extremos de la secuencia. Se puede unir el ADN obtenido a un ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano. Se puede incorporar el ADN unido en un vector de expresión y se puede introducir el vector en un hospedador para producir el anticuerpo (véanse los documentos EP239400 y WO96/02576). Se seleccionan FR de anticuerpos humanos que están unidas por medio de las CDR de modo que las CDR formen un sitio de unión a antígeno favorable. En caso necesario, se pueden sustituir aminoácidos en las regiones marco conservadas de las regiones variables de anticuerpo de modo que las CDR de un anticuerpo humano remodelado formen un sitio de unión a antígeno apropiado (K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53:851-856).

Además de la humanización descrita anteriormente, se pueden modificar los anticuerpos para mejorar sus propiedades biológicas, por ejemplo, actividad de unión a un antígeno. Las modificaciones en la presente invención se pueden llevar a cabo usando métodos tales como mutagénesis dirigida a sitio (véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), mutagénesis de PCR y mutagénesis de casetes. En general, los anticuerpos mutantes cuyas propiedades biológicas se han mejorado muestran una homología y/o similitud de secuencia de aminoácidos de un 70 % o mayor, más preferentemente de un 80 % o mayor, y aún más preferentemente de un 90 % o mayor (por ejemplo, 95 % o mayor, 97 %, 98 %, 99 % y así sucesivamente), en comparación con las secuencias de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo original. En el presente documento, homología y/o similitud de secuencia se define como la relación de residuos de aminoácidos que son homólogos (mismo residuo) o similares (residuos de aminoácidos clasificados en el mismo grupo en función de las propiedades generales de las cadenas laterales de aminoácidos) a los residuos del anticuerpo original, después de que se haya maximizado el valor de homología de secuencia por alineación de secuencias e introducción de huecos, en caso necesario. En general, los residuos de aminoácidos naturales se clasifican en grupos en función de las características de sus cadenas laterales: (1) hidrófobos: alanina, isoleucina, valina, metionina y leucina; (2) hidrófilos neutros: asparagina, glutamina, cisteína, treonina y serina; (3) ácidos: ácido aspártico y ácido glutámico; (4) básicos: arginina, histidina y lisina; (5) residuos que afectan a la orientación de la cadena: glicina y prolina; y (6) aromáticos: tirosina, triptófano y fenilalanina.

Generalmente, un total de seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR; regiones hipervariables) presentes en las regiones variables de la cadena H y cadena L interaccionan para formar el/los sitio(s) de unión a antígeno de un anticuerpo. Se sabe que incluso una de estas regiones variables tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque la afinidad será menor que cuando se incluyen todos los sitios de unión. Por lo tanto, los genes de anticuerpo de la presente divulgación que codifican las cadenas H y cadenas L solo tienen que codificar las porciones de fragmentos que tienen cada uno de los sitios de unión a antígeno de las cadenas H y cadenas L, y los polipéptidos codificados por estos genes solo tienen que mantener la actividad de unión a los antígenos deseados.

Las regiones variables de la cadena pesada se componen habitualmente de tres regiones CDR y cuatro regiones FR como se ha descrito anteriormente. En la presente invención, se pueden seleccionar de forma apropiada residuos de aminoácidos preferentemente sometidos a “modificación” de entre los residuos de aminoácidos situados en las regiones CDR o regiones FR. En general, la modificación de los residuos de aminoácidos en las regiones CDR puede reducir la actividad de unión a antígenos. Por lo tanto, en la presente invención, los residuos de aminoácidos sometidos a “modificación” no están limitados particularmente, pero es preferente que se seleccionen de forma apropiada de entre los residuos de aminoácidos situados en las regiones FR. Se pueden seleccionar incluso residuos de aminoácidos en las CDR, siempre que se haya confirmado que las modificaciones de estos residuos no reduzcan la actividad de unión.

Además, las secuencias que se pueden usar como FR de regiones variables de los anticuerpos de organismos tales como seres humanos o ratones, se pueden obtener de forma apropiada por los expertos en la técnica usando bases de datos públicas.

La presente divulgación también se refiere a polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn cuya farmacocinética en sangre está controlada por un método de la presente invención.

Preferentemente, la presente divulgación proporciona anticuerpos humanizados cuya farmacocinética en sangre está controlada por un método de la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos humanos son anticuerpos humanizados que comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR) derivadas de un animal no humano, regiones estructurales (FR) derivadas de un ser humano y regiones constantes humanas, con al menos un residuo de aminoácido en las CDR o FR, que pueden estar expuestas en la superficie del anticuerpo, tienen una carga diferente de la del residuo de aminoácido correspondiente en las CDR o FR de tipo silvestre, y cuyas regiones variables derivan de un anticuerpo del animal no humano y cuya farmacocinética en sangre está controlada en comparación con los anticuerpos quiméricos correspondientes que tienen las mismas regiones constantes.

La “región constante humana” descrita anteriormente se refiere preferentemente a una región que comprende un dominio Fc humano de tipo silvestre; sin embargo, puede ser un Fc modificado.

La presente divulgación también se refiere a métodos para producir polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn, cuya farmacocinética en sangre está controlada usando los métodos de la presente invención. Específicamente, la presente divulgación proporciona métodos para producir polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn, cuya farmacocinética en sangre está controlada. La presente divulgación también incluye polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn, que se producen por los métodos de la presente invención.

Preferentemente, los métodos de producción de la presente divulgación son métodos para producir polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn, cuya farmacocinética en sangre está controlada, y que comprenden: (a) modificar los ácidos nucleicos que codifican los polipéptido que comprenden un dominio de unión a FcRn para cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido que puede estar expuesto en la superficie de los polipéptidos;

(b) cultivar las células hospedadoras para expresar los ácidos nucleicos; y

(c) recoger los polipéptidos que comprenden un dominio de unión a FcRn de los cultivos de células hospedadoras.

La expresión “modificar los ácidos nucleicos” en los métodos mencionados anteriormente de la presente invención se refiere a modificar los ácidos nucleicos de modo que correspondan a los residuos de aminoácidos introducidos por las “modificaciones” de la presente invención. Más específicamente, se refiere a modificar los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos originales (premodificados) a los ácidos nucleicos que codifican los residuos de aminoácidos que se van a introducir por la modificación. Generalmente, quiere decir realizar una manipulación génica o un tratamiento de mutación que daría como resultado al menos una inserción, deleción o sustitución de nucleótidos en un ácido nucleico original de modo que se formen codones que codifican los residuos de aminoácidos de interés. Más específicamente, los codones que codifican los residuos de aminoácidos originales se sustituyen con codones que codifican los residuos de aminoácidos que se van a introducir por la modificación. Dichas modificaciones de ácidos nucleicos se pueden realizar de forma adecuada por los expertos en la materia usando técnicas conocidas tales como mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis de PCR.

Además, los ácidos nucleicos de la presente divulgación normalmente son portados por (se insertan en) vectores adecuados y a continuación se introducen en células hospedadoras. Estos vectores no están limitados particularmente siempre que los ácidos nucleicos insertados se mantengan de forma estable. Por ejemplo, cuando se usa E. coli como hospedador, el vector de clonación es preferentemente el vector pBluescript (Stratagene) y similares, pero se pueden usar varios vectores comercialmente disponibles. Los vectores de expresión son particularmente útiles como vectores para producir los polipéptidos de la presente divulgación. Los vectores de expresión no están limitados particularmente, siempre que puedan expresar polipéptidos en tubos de ensayo, E. coli, células cultivadas u organismos individuales. Por ejemplo, los vectores preferentes incluyen el vector pBEST (Promega) para la expresión en tubos de ensayo, el vector pET (Invitrogen) para E. coli, el vector pME18S-FL3 (n.° de acceso GenBank AB009864) para células cultivadas y el vector pME18S (Mol. Cell Biol. 8: 466-472 (1998)) para organismos individuales. La inserción de un ADN de la presente divulgación en vectores se puede realizar por métodos estándar tales como reacciones con ligasas usando sitios de enzimas de restricción (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Sección 11.4-11.11).

Las células hospedadoras mencionadas anteriormente no están limitadas particularmente, y se pueden usar diversas células hospedadoras, dependiendo del propósito. Las células usadas para expresar los polipéptidos incluyen células bacterianas (por ejemplo, Streptococcus, Staphilococcus, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis), células fúngicas (por ejemplo, levaduras y Aspergillus), células de insectos (por ejemplo, Drosophila S2 y Spodoptera SF9), células animales (por ejemplo, CHO, COS, HeLa, C127, 3^t 3, BHK, HEK293 y células de melanoma de Bowes) y células vegetales. Se pueden introducir vectores en células hospedadoras usando métodos conocidos tales como el método de precipitación de fosfato de calcio, método de electroporación (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Sección 9.1-9.9), método de lipofección y método de microinyección.

Para secretar polipéptidos expresados en células hospedadoras en la luz del retículo endoplásmico, espacio periplásmico o entorno extracelular, se pueden incorporar señales de secreción adecuadas en los polipéptidos de interés. Estas señales pueden ser intrínsecas o exógenas a los polipéptidos de interés.

Cuando se secretan los polipéptidos de la presente divulgación en el medio de cultivo, los polipéptidos producidos por los métodos mencionados anteriormente se puede recoger recogiendo el medio. Cuando los polipéptidos de la presente divulgación se producen dentro de células, en primer lugar, se lisan las células y a continuación se recogen estos polipéptidos.

Los polipéptidos de la presente divulgación se pueden recoger y purificar a partir de cultivos celulares recombinantes usando métodos conocidos, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía con lectina.

La presente divulgación se refiere a composiciones (agentes farmacéuticos) que comprenden polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos IgG) que comprenden un dominio de unión a FcRn, cuya farmacocinética en sangre está controlada por los métodos de la presente divulgación, y vehículos farmacéuticamente aceptables.

En la presente divulgación, las composiciones farmacéuticas normalmente se refieren a los agentes farmacéuticos para tratar o evitar, o probar y diagnosticar enfermedades.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, dichas composiciones farmacéuticas se pueden usar por vía parenteral, como inyecciones que son soluciones o suspensiones estériles que incluyen las composiciones junto con agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, dichas composiciones se pueden formular como dosis unitarias que cumplen los requisitos para la preparación de productos farmacéuticos combinando de forma apropiada las composiciones con medios o vehículos farmacéuticamente aceptables, específicamente con agua estéril, solución salina fisiológica, un aceite vegetal, emulsionante, suspensión, tensioactivo, estabilizante, agente saborizante, excipiente, vehículo, conservante, aglutinante o similares. En dichas preparaciones, la cantidad de principio activo se ajusta de modo que se pueda obtener una dosis apropiada que entre dentro de un intervalo predeterminado.

Se pueden formular composiciones estériles para inyección usando vehículos tales como agua destilada para inyectables, de acuerdo con protocolos estándar para formulación.

Las soluciones acuosas para inyección incluyen, por ejemplo, solución salina fisiológica y soluciones isotónicas que contienen dextrosa u otros coadyuvantes (por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio). Se pueden usar en combinación solubilizantes apropiados, por ejemplo, alcoholes (etanol y similares), polialcoholes (propilenglicol, polietilenglicol y similares), tensioactivos no iónicos (polisorbato 80™, HCO-50 y similares).

Los aceites incluyen aceites de sésamo y soja. Se pueden usar benzoato de bencilo y/o alcohol bencílico en combinación como solubilizantes. También se pueden combinar tampones (por ejemplo, tampón fosfato y tampón acetato de sodio), agentes calmantes (por ejemplo, clorhidrato de procaína), estabilizantes (por ejemplo, alcohol bencílico y fenol), y/o antioxidantes. En general, las inyecciones preparadas se cargan en ampollas apropiadas. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se administran preferentemente por vía parenteral. Por ejemplo, las composiciones pueden ser inyecciones, composiciones transnasales, composiciones transpulmonares o composiciones transdérmicas. Por ejemplo, dichas composiciones se pueden administrar por vía sistémica o local por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea o similares. Los métodos de administración se pueden seleccionar de forma apropiada considerando la edad y los síntomas del paciente. La dosis de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un polinucleótido que codifica un anticuerpo puede ser, por ejemplo, de 0,0001 a 1000 mg/kg para cada administración. De forma alternativa, la dosis puede ser, por ejemplo, de 0,001 a 100.000 mg por paciente. Sin embargo, las dosis de la presente divulgación no están limitadas a los intervalos descritos anteriormente. Las dosis y los métodos de administración varían dependiendo del peso, edad y síntomas de un paciente, y similares. Los expertos en la técnica pueden seleccionar las dosis y métodos de administración apropiados considerando los factores descritos anteriormente. La presente divulgación también proporciona ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que comprenden polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos humanizados) que comprenden un dominio de unión a FcRn, cuya farmacocinética en sangre está controlada por los métodos de la presente divulgación. Además, los vectores que llevan estos ácidos nucleicos se engloban por la presente divulgación.

La presente divulgación también proporciona células hospedadoras que llevan los ácidos nucleicos descritos anteriormente. Las células hospedadoras no están limitadas particularmente e incluyen, por ejemplo, E. coli y células de diversos animales. Las células hospedadoras se pueden usar, por ejemplo, como sistema de producción para producir y expresar los anticuerpos o los polipéptidos de la presente divulgación. Los sistemas de producción in vitro e in vivo están disponibles para sistemas de producción de polipéptidos. Los sistemas de producción que usan células eucariotas o células procariotas son ejemplos de sistemas de producción in vitro.

Las células eucariotas que se pueden usar como célula hospedadora incluyen, por ejemplo, células animales, células vegetales y células fúngicas. Las células animales incluyen células de mamífero tales como CHO (J. Exp. Med. (1995) 108: 945), COS, HEK293, 3T3, mieloma, BHK (riñón de cría de hámster), HeLa y Vero; células de anfibios tales como ovocitos de Xenopus laevis (Valle, et al. (1981) Nature 291: 338-340); y células de insecto tales como Sf9, Sf21 y Tn5. En la expresión de los anticuerpos de la presente divulgación, se pueden usar de forma adecuada CHO-DG44, CHO-DX11B, células COS7, células HEK293 y células BHK. Entre las células animales, las células CHO son particularmente preferentes para la expresión a gran escala. Se pueden introducir vectores en una célula hospedadora por, por ejemplo, métodos con fosfato de calcio, métodos con DEAE-dextrano, métodos que usan liposomas catiónicos-DOTAP (Boehringer-Mannheim), métodos de electroporación o métodos de lipofección. Las células vegetales incluyen, por ejemplo, células derivadas de Nicotiana tabacum y lenteja de agua (Lemna menor) conocido como sistema de producción de proteínas. Los callos se pueden cultivar a partir de estas células para producir los anticuerpos de la presente divulgación. Los sistemas de producción de proteínas conocidos son los que usan células fúngicas incluyendo células de levadura, por ejemplo, células del género Saccharomyces (tales como Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe); y células de hongos filamentosos, por ejemplo, género Aspergillus (tal como Aspergillus niger). Estas células se pueden usar como hospedador para producir los anticuerpos de la presente divulgación.

Se pueden usar células bacterianas en sistemas de producción procariotas. Los ejemplos de células bacterianas incluyen Bacillus subtilis así como E. coli descritos anteriormente. Se pueden usar dichas células para producir los anticuerpos de la presente divulgación.

Cuando se produce un anticuerpo usando una célula hospedadora de la presente divulgación, el polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente divulgación se puede expresar cultivando la célula hospedadora transformada con un vector de expresión que contiene el polinucleótido. Se puede realizar el cultivo usando métodos conocidos. Por ejemplo, cuando se usan células animales como hospedador, se pueden usar DMEM, MEM, RPMI 1640 o IMDM como medio de cultivo, y se pueden usar con o sin complementos de suero tales como FBS o suero fetal bovino (FCS). El pH preferente es de aproximadamente 6 a 8 durante el cultivo. El cultivo se realiza típicamente a una temperatura de aproximadamente 30 a 40 °C durante aproximadamente de 15 a 200 horas. El medio se intercambia, se oxigena o se agita, según sea necesario.

Por otra parte, se pueden usar sistemas de producción que usan animales o plantas como sistemas para producir polipéptidos in vivo. Por ejemplo, se introduce un polinucleótido de interés en un animal o planta y se produce el polipéptido en el cuerpo del animal o vegetal y después se recoge. Los “hospedadores” de la presente divulgación incluyen dichos animales y plantas.

Los animales que se van a usar para sistemas de producción incluyen mamíferos e insectos. Se pueden usar mamíferos tales como cabras, cerdos, ovejas, ratones y reses (Vicki Glaser SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). De forma alternativa, los mamíferos pueden ser animales transgénicos.

Por ejemplo, se puede preparar un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente divulgación como gen de fusión con un gen que codifica un polipéptido producido específicamente en la leche, tal como el gen p-caseína de cabra. Se inyectan fragmentos de polinucleótidos que contienen el gen de fusión en embriones de cabra, que a continuación se trasplantan en cabras hembra. Se puede obtener el anticuerpo deseado a partir de leche producida por las cabras transgénicas nacidas de las cabras que recibieron los embriones, o de sus crías. Se pueden administrar hormonas apropiadas a las cabras transgénicas para incrementar el volumen de leche que contiene el anticuerpo producido por las cabras (Ebert et al., Bio/Technology 12: 699-702 (1994)).

También se pueden usar insectos tales como gusanos de seda para producir los anticuerpos de la presente divulgación. Se pueden usar baculovirus que llevan un polinucleótido que codifica un anticuerpo de interés para infectar gusanos de seda y se puede obtener el anticuerpo de interés de los fluidos corporales de los gusanos de seda (Susumu et al., Nature 315: 592-594 (1985)).

Las plantas usadas para producir los anticuerpos de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, tabaco. Cuando se usa tabaco, se inserta un polinucleótido que codifica un anticuerpo de interés en un vector de expresión vegetal, por ejemplo, pMON 530, y a continuación se introduce el vector en una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. A continuación, se usan las bacterias para infectar el tabaco tal como Nicotiana tabacum, y se puede obtener el anticuerpo deseado de las hojas (Ma et al., Eur. J. Immunol. 24: 131-138 (1994)). De forma alternativa, se infecta una lenteja de agua (Lemna menor) con bacterias similares y, a continuación, se clona. Se puede obtener el anticuerpo deseado de las células de lenteja de agua clonada (Cox KM et al. Nat. Biotechnol. Diciembre de 2006; 24(12): 1591-1597).

Se puede aislar el anticuerpo resultante del interior o del exterior (tal como el medio y la leche) de células hospedadoras, y se purifica como un anticuerpo homogéneo y sustancialmente puro. Los métodos para aislar y purificar los anticuerpos no se limitan a ningún método específico y se puede usar cualquier método estándar para aislar y purificar polipéptidos. Los anticuerpos se pueden aislar y purificar, seleccionando o combinando de forma apropiada, por ejemplo, columnas de cromatografía, filtración, ultrafiltración, precipitación por sales, precipitación con disolvente, extracción con disolvente, destilación, inmunoprecipitación, electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, enfoque isoeléctrico, diálisis, recristalización y otros.

Las cromatografías incluyen, por ejemplo, cromatografías de afinidad, cromatografías de intercambio iónico, cromatografías hidrófobas, filtraciones en gel, cromatografías en fase inversa y cromatografías de adsorción (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Estas cromatografías se pueden llevar a cabo usando cromatografías de fase líquida tales como HPLC y FPLC. Los ejemplos de columnas de cromatografía de afinidad incluyen columnas de proteína A y columnas de proteína G. Los ejemplos de las columnas de proteínas A incluyen Hyper D, POROS y Sepharose F. F. (Pharmacia).

Se puede modificar libremente un anticuerpo y se pueden eliminar porciones peptídicas de él tratando el anticuerpo con una enzima modificadora de proteínas apropiada antes o después de la purificación del anticuerpo, según sea necesario. Dichas enzimas modificadoras de proteínas incluyen, por ejemplo, tripsinas, quimotripsinas, lisil endopeptidasas, proteína cinasas y glucosidasas.

Los métodos descritos anteriormente para producir polipéptidos de la presente divulgación que comprenden un dominio de unión a FcRn, cuya farmacocinética en sangre está controlada, que comprenden cultivar células hospedadoras de la presente divulgación y recoger los polipéptidos de los cultivos celulares, también se proporcionan preferentemente.

Ejemplos

A continuación en el presente documento, se describe específicamente la presente invención con referencia a los ejemplos, pero no se interpreta como limitada a los mismos.

[Ejemplo 1] Humanización de anticuerpo biespecífico

Se humanizó un anticuerpo biespecífico que consistía en la combinación de VH-anticuerpo A69 anti-Factor IXa, VH-anticuerpo B26 anti-Factor X y cadena L híbrida (BBA), que se descubrió que era el más eficaz para acortar el tiempo de coagulación sanguínea en la solicitud de patente japonesa n.° 2005-112514, como se describe a continuación.

1-1. Búsqueda por homología de anticuerpos humanizados

Usando una base de datos construida obteniendo datos de secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanos a partir de la base de datos Kabat divulgada públicamente (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) y la base de datos IMGT (http://imgt.cines.fr/), se llevó a cabo la búsqueda por homología por separado para la región variable de la cadena H-A69 de ratón (secuencia de aminoácidos; SEQ ID NO: 15), región variable de la cadena H-B26 de ratón (secuencia de aminoácidos; SEQ ID NO: 16) y región variable de la cadena L-BBA de ratón (secuencia de aminoácidos; SEQ ID NO: 17). Los resultados confirmaron que tienen homologías altas para las secuencias de anticuerpos humanos mostradas a continuación y, por tanto, se decidió que se iban a usar como regiones marco conservadas (a continuación en el presente documento abreviadas como FR) de los anticuerpos humanizados. (1) región variable de la cadena H-A69: KABATID-000064 (base de datos Kabat)

(Kipps et al., J. Clin. Invest. 1991; 87:2087-2096)

(2) región variable de la cadena H-B26: N.° de acceso EMBL AB063872 (base de datos IMGT) (datos no publicados)

(3) región variable de la cadena L-BBA: KABATID-024300 (base de datos Kabat)

(Welschof et al., J. Immunol. Method 1995; 179:203-214)

Se prepararon anticuerpos humanizados en los que se injertaron regiones determinantes de la complementariedad (a continuación en el presente documento abreviadas como CDR) de cada anticuerpo de ratón en las FR de los anticuerpos humanos (1)-(3).

Además, se usó la búsqueda por homología en Internet divulgada públicamente por NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para buscar secuencias señal secretoras de anticuerpos humanos que sean altamente homólogas para los anticuerpos humanos de (4)-(6). Se usaron las siguientes secuencias señal secretoras obtenidas por la búsqueda.

(4) región variable de la cadena H-A69: N.° de acceso de GenBank AF062257

(5) región variable de la cadena H-B26: N.° de acceso de GenBank AAC18248

(6) región variable de la cadena L-BBA: N.° de acceso de GenBank AAA59100

1-2. Construcción del vector de expresión génica de anticuerpo humanizado

Se prepararon doce oligoADN sintéticos de aproximadamente 50 bases a partir de una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de una secuencia señal secretora a una región variable del anticuerpo, de modo que aproximadamente 20 bases de su extremo 3' se hibridan entre sí. Se diseñaron los oligoADN sintéticos de modo que los nucleótidos 5'-terminales codifican una secuencia humana, los nucleótidos 3'-terminales codifican una secuencia de ratón o todos los nucleótidos codifican secuencias humanas. Además, se prepararon un cebador que se hibrida con el extremo 5' de un gen de la región variable del anticuerpo y que tiene la secuencia de escisión Xhol, y un cebador que se hibrida con el extremo 3' de un gen de la región variable del anticuerpo, que tiene la secuencia de escisión Sfil y que codifica también la secuencia del extremo 5' de un intrón.

Se mezcló 1 pl de cada uno de los oligoADN sintéticos preparados a 2,5 pM, y se añadieron 1x tampón Takara Ex Taq, dNTP 0,4 mM y 0,5 unidades de Takara Ex Taq (todos de Takara) para preparar 48 pl de una solución de reacción. Después de calentar esto a 94 °C durante 5 minutos, se realizaron 2 ciclos de reacción a 94 °C durante 2 minutos, 55 °C durante 2 minutos y 72 °C durante 2 minutos para montar y alargar cada uno de los oligoADN sintéticos. A continuación, se añadió 1 pl (10 pM cada uno) de cebadores que se hibridan con el extremo 5' y con el extremo 3' del gen del anticuerpo, y se amplificaron los genes de la región variable del anticuerpo por 35 ciclos de reacción a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, y 72 °C durante 1 min y después con reacción a 72 °C durante 5 minutos. Después de la PCR, la cantidad total de la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Se purificaron los fragmentos amplificados que tenían el tamaño de interés (aproximadamente 400 pb) usando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones, y se eluyeron con 30 pl de agua estéril. Se clonaron estos fragmentos usando el sistema de vectores pGEM-T Easy (Promega) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones. Se determinó la secuencia de nucleótidos de cada uno de los fragmentos de ADN usando el kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator (Applied Biosystems) y el secuenciador de ADN ABI PRISM 3730xL o el secuenciador de ADN ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones. El plásmido insertado con el fragmento de la región variable de la cadena H y el plásmido insertado con el fragmento de la región variable de la cadena L, de los que se confirmó que cada uno tenía una secuencia génica de la región variable del anticuerpo humanizado correcta, se digirieron con Xhol y Sfil, y EcoRI, respectivamente. A continuación, se sometió la solución de reacción a electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Se purificaron los fragmentos de ADN que tenían el tamaño de interés (aproximadamente 400 pb) usando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones, y se eluyeron con 30 |jl de agua estéril. A continuación, se prepararon los vectores de expresión para células animales como sigue. Para expresar preferencialmente la IgG4 cuyas cadenas H son de combinación heteróloga, se usó una IgG4 sustituida con aminoácido con porción CH3 en referencia a la técnica de “botones en ojales” (knobs-into-holes) de IgG1 (Merchant AM et al., Nature Biotechnology, Vol.16, págs. 677-681 (1998)). Además, para promover la formación del dímero de la cadena H, también se introdujo una sustitución de aminoácidos (-ppcpScp— > -ppcpPcp-) a la bisagra. Se preparó el vector de expresión de cadena H de A69 humanizado insertando un fragmento génico de la región variable de cadena H del anticuerpo A69 humanizado en un vector de expresión preparado insertando el gen de la región constante con sustitución de Y349C y T366W a pCAGGS que comprende un promotor de p-actina de pollo (Niwa et al., Gene vol. 108, págs. 193-199 (1991)). Además, se preparó un vector de expresión de cadena H de B26 humanizado insertando un fragmento génico de región variable de cadena H del anticuerpo B26 humanizado en un vector de expresión preparado insertando el gen de la región constante con sustitución de E356C, T366S, L368A e Y407V a pCAGGS. Se digirió el plásmido (pCAG-gKADN) preparado insertando una región constante de cadena L de anticuerpo de tipo silvestre en pCAGGS con EcoRI para preparar un vector de expresión insertado con un fragmento génico de la región variable de cadena L del anticuerpo BBA humanizado. Se realizó una reacción de ligamiento usando el kit de ligamiento rápido de ADN (Roche Diagnostics) y se transformó la cepa DH5a de E. coli (TOYOBO).

1-3. Expresión del anticuerpo biespecífico humanizado

Se expresó el anticuerpo biespecífico humanizado de acuerdo con el siguiente método. Se suspendió la cepa HEK293H derivada de células de carcinoma renal fetal humano (Invitrogen) en medio DMEM (Invitrogen) que contenía suero bovino fetal al 10 % (Invitrogen), y se sembraron 10 ml de esto a una densidad celular de 5-6 x 1o5 células/ml en cada placa usada para células adhesivas (10 cm de diámetro, CORNING) y se cultivó durante un día en una incubadora con CO2 (37 °C, CO2 al 5 %). A continuación, se retiró el medio por succión, y se añadieron 6,9 ml de medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) que contenía suero bovino fetal al 1 % (Invitrogen). Se mezcló la solución de mezcla de ADN plasmídico preparada en el ejemplo 1-2 (total de 13,8 jg ) con 20,7 j l de polietilenimina 1 jg/ml (Polisciences Inc.) y 690 j l de medio CHO-S-SFMII, se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos, a continuación se añadieron las células a las células en cada placa y se incubó en una incubadora con CO2 (37 °C, CO2 al 5 %) durante 4-5 horas. A continuación, se añadieron 6,9 ml de medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) que contenía suero bovino fetal al 1 % (Invitrogen) y a continuación se incubaron las células en una incubadora con CO2 durante 3 días. Se recuperó el sobrenadante de cultivo, a continuación se retiraron las células por centrifugación (aproximadamente a 2000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente) y se esterilizó la solución pasándola a través de un filtro MILLEX®-GV de 0,22 jm (Millipore). Se almacenó la muestra a 4 °C hasta su uso.

1-4. Purificación del anticuerpo biespecífico humanizado

Se añadieron 100 j l de rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) al sobrenadante de cultivo obtenido de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1-2, y se mezcló la solución por inversión a 4 °C durante 4 horas o más. Se transfirió la solución a un recipiente de filtro de 0,22 jm, Ultrafree®-MC (Millipore) y, después de lavar 3 veces con 500 j l de TBS que contenía Tween® 20 al 0,01 %, se suspendió la resina rProtein A Sepharose™ en 100 j l de solución de acetato de sodio 50 mM que contenía Tween® 20 al 0,01 % a pH 3,3 y se dejó en reposo durante 2 minutos. A continuación, se eluyó el anticuerpo y se neutralizó inmediatamente el eluato añadiendo 6,7 j l de Tris-HCl 1,5 M, pH 7,8.

1-5. Cuantificación de la concentración de anticuerpo biespecífico humanizado

Se determinó la concentración de anticuerpo usando los siguientes dos tipos de métodos.

Se ajustó anti-IgG humana de cabra (Biosource International) a 1 jg/ml con un tampón de recubrimiento y se inmovilizó en una placa Nunc-Immuno (Nunc). Después del bloqueo con un tampón de diluyente (D.B.), se añadió una muestra del sobrenadante de cultivo diluida de forma adecuada con D.B. Además, como patrón para calcular la concentración de anticuerpo, se añadió de forma similar IgG4 humana (anticuerpo anti-TF humanizado, véase el documento WO 99/51743) diluida con D.B. en una serie de dilución triple hasta once fases partiendo de 2000 ng/ml. Después de tres lavados, se hizo reaccionar una fosfatasa alcalina anti-IgG humana de cabra (Biosource International). Después de cinco lavados, se desarrolló el color usando sustrato de fosfatasa Sigma 104® (Sigma-Aldrich) como sustrato y se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de absorbancia Modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories) con una longitud de onda de referencia de 655 nm. Usando el programa informático Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), se calculó la concentración de IgG humana en el sobrenadante de cultivo a partir de la curva patrón.

Además, se cuantificó la concentración de anticuerpo usando el chip sensor CM5 (BIACORE) en el que se había inmovilizado la proteína A, con Biacore 1000 o Biacore Q (BIACORE). Más específicamente, se preparó un chip sensor con proteína A inmovilizada de acuerdo con el protocolo del fabricante haciendo reaccionar un chip sensor activado con una solución de proteína A (SIGMA) diluida a 50 jg/ml con solución de acetato de sodio acuosa 10 mM (pH 4,0, BIACORE) a 5 jl/min durante 30 minutos y realizando a continuación una operación de bloqueo. Se usó este chip sensor para medir la concentración del sobrenadante de cultivo y el producto purificado usando BIAcore 1000 (BIACORE). Se usó el tampón HBS-EP (BIACORE) para la inmovilización del chip sensor y para las medidas de concentración. Como patrón para las medidas de concentración, se usó anticuerpo IgG4 humanizado (anticuerpo anti-factor tisular humanizado, véase el documento WO 99/51743) diluido con tampón HBS-EP en una serie de dilución doble hasta seis fases comenzando a 4000 ng/ml.

1-6. Evaluación de la actividad de coagulación sanguínea de anticuerpo biespecífico humanizado

Para determinar si un anticuerpo biespecífico corrige la capacidad de coagulación de sangre hemofílica A, se examinaron los efectos del anticuerpo biespecífico sobre el tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) usando plasma deficitario en factor VIII. Se calentó una solución mezclada que comprende 50 pl de una solución de anticuerpo a diversas concentraciones, 50 pl de plasma deficitario en factor VIII (Biomerieux) y 50 pl de reactivo TTPa (Dade Behring) a 37 °C durante 3 minutos. Se inició la reacción de coagulación añadiendo 50 pl de CaCl2 20 mM (Dade Behring) a esta solución mezclada. Se midió el tiempo requerido para la coagulación con KC10A (Amelung) conectado con CR-A (Amelung).

Usando una curva de calibrado proporcionada definiendo el tiempo de coagulación de plasma deficitario en factor VIII como en el 0 % y el del plasma normal como en el 100 %, se calculó la actividad de tipo factor VIII (%) de un anticuerpo biespecífico a partir del tiempo de coagulación medido cuando se añadió el anticuerpo biespecífico. 1-7. Preparación de anticuerpo biespecífico humanizado que retiene la actividad de coagulación sanguínea Para los anticuerpos biespecíficos humanizados que habían reducido su capacidad de coagulación sanguínea en la evaluación de la actividad de coagulación sanguínea descrita anteriormente, se modificaron los aminoácidos de sus FR de anticuerpo humano para incrementar sus actividades. Específicamente, se introdujeron mutaciones en la región variable del anticuerpo humanizado usando un kit de mutagénesis dirigida a sitio QuikChange (Stratagene) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones. Se confirmó que el plásmido con el fragmento con inserción de región variable de la cadena H y el plásmido con inserción de fragmento de la región variable de la cadena L tienen las secuencias génicas de la región variable del anticuerpo humanizado de interés y se digirieron con Xhol y Sfil, y EcoRI respectivamente. Se sometió la solución de reacción a electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Se purificaron los fragmentos de ADN que tenían el tamaño de interés (aproximadamente 400 pb) usando un kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones y se eluyeron con 30 pl de agua estéril. A continuación, se prepararon los vectores de expresión para células animales de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1-2. Se preparó un anticuerpo biespecífico humanizado de acuerdo con el método descrito en los ejemplos 1-3, 1-4 y 1-5 y se evaluó la actividad de coagulación sanguínea de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1-6.

Al repetir las modificaciones de aminoácidos de las secuencias de FR y la evaluación de la capacidad de coagulación sanguínea, se obtuvo un anticuerpo biespecífico humanizado (A69 humanizado (hA69a)/B26 humanizado (hB26-F123e4)/BBA humanizado (hAL-F123j4)) que tenía el mismo nivel de actividad que el anticuerpo biespecífico quimérico (A69/B26/BBA) (Fig. 1). Cada una de las secuencias de la región variable del anticuerpo se indica en las siguientes SEQ ID NO.

(1) VH de anticuerpo A69 humanizado (hA69a) SEQ ID NO: 1 (secuencia de nucleótidos), SEQ ID NO: 2 (secuencia de aminoácidos)

(2) VH de anticuerpo B26 humanizado (hB26-F123e4) SEQ ID NO: 3 (secuencia de nucleótidos), SEQ ID NO: 4 (secuencia de aminoácidos)

(3) VL de anticuerpo BBA humanizado (hAL-F123j4) SEQ ID NO: 5 (secuencia de nucleótidos), SEQ ID NO: 6 (secuencia de aminoácidos)

[Ejemplo 2] Selección de sitios de modificación de aminoácido en regiones variables para aislar un anticuerpo biespecífico

Se prepararon modelos de región Fv de anticuerpo para los anticuerpos A69 y B26 humanizados por modelado de homología usando el programa informático MOE (Chemical Computing Group Inc.) para confirmar los residuos de aminoácidos expuestos en la superficie de las regiones variables de estos anticuerpos. Los modelos se muestran en la fig. 2. Un análisis detallado de los modelos sugirió que entre los aminoácidos expuestos en la superficie en las secuencias de FR distintas de CDR, los que estaban en las posiciones H10, H12, H23, H39, H43 y H105 (de acuerdo con la numeración Kabat; Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH) eran aminoácidos candidatos que se podían modificar para desplazar el punto isoeléctrico sin reducción de la actividad. Se seleccionó el aminoácido en H97 como aminoácido expuesto en la superficie en las CDR.

[Ejemplo 3] Modificación de las secuencias de aminoácidos de región variable del anticuerpo A69 humanizado y forma modificada del mismo, y anticuerpo B26 humanizado

Se modificaron los aminoácidos de las regiones variables de la cadena H de los anticuerpos A69 y B26 humanizados para desplazar los puntos isoeléctricos de los anticuerpos. Específicamente, se introdujeron mutaciones en las regiones variables de la cadena H del anticuerpo A69 humanizado (hA69a; secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1) y anticuerpo B26 humanizado (hB26-F123e4; secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3) preparados usando un kit de mutagénesis dirigida a sitio QuikChange (Stratagene) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se digirieron los plásmidos con fragmento de la región variable de la cadena H insertado, que se había confirmado que tenían la secuencia del gen de la región variable de anticuerpo humanizado de interés, con Xhol y Sfil, y a continuación las mezclas de reacción se sometieron a electroforesis usando gel de agarosa al 1 %. Se purificaron los fragmentos de ADN que tenían el tamaño de interés (aproximadamente 400 pb) usando un kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) de acuerdo con el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y a continuación se eluyeron usando 30 pl de agua estéril. Se insertaron los fragmentos de ADN en un plásmido de expresión que llevaba la región constante de tipo silvestre por el método descrito en el ejemplo 1-2 para construir vectores de expresión de cadena H. Los residuos de aminoácidos modificados en los anticuerpos respectivos y sus SEQ ID se muestran en la tabla 1. Se prepararon (hA69-N97R, hA69-p18), y anticuerpo B26 humanizado (hB26-F123e4) y su forma modificada (hB26-p15). Se expresaron un anticuerpo A69 humanizado (hA69a) y sus formas modificadas (hA69-N97R, hA69-p18) usando una combinación de vectores de expresión de cadena H (la región variable es hA69-N97R, hA69-p18) y un vector de expresión de cadena L (la región variable es hAL-F123j4; SEQ ID NO: 6) de acuerdo con el ejemplo 1-3. Mientras tanto, se expresaron un anticuerpo B26 humanizado (hB26-F123e4) y su forma modificada (hB26-p15) usando una combinación de vectores de expresión de cadena H (la región variable es hB26-F123e4, hB26-p15) y un vector de expresión de cadena L (la región variable es B26-VL; la secuencia de aminoácidos se describe en el documento WO2005/035756 (SEQ ID NO: 18)) de acuerdo con el ejemplo 1-3. Se purificaron los anticuerpos a partir de sobrenadantes de cultivo por el método descrito en el ejemplo 1-4.

Tabla 1

[Ejemplo 4] Establecimiento de una línea celular que expresa un anticuerpo biespecífico derivado de anticuerpos A69 o B26 humanizados

Para preparar un anticuerpo biespecífico humanizado, se estableció una línea celular de expresión de anticuerpo por el procedimiento descrito a continuación.

Se amplificó una región constante de la cadena H por PCR usando un gen de la región constante de la cadena H de IgG4 humana de tipo silvestre como molde y usando un cebador 5'-terminal diseñado de modo que la secuencia de nucleótidos que codifica dos aminoácidos (Ala-Ser) en el lado N terminal de la región constante de la cadena H será una secuencia de reconocimiento Nhel (GCTAGC) y un cebador que se hibrida en el extremo 3' y que lleva un sitio de reconocimiento Notl. A continuación, se ligaron los fragmentos amplificados al vector pBluescriptKS+ (TOYOBO) digerido con Nhel y NotI (ambos de Takara) para preparar pBCH4 (que comprende un gen de región constante de IgG4). Se realizó la PCR usando cebadores que son complementarios de la secuencia de nucleótidos 5'-terminal de las regiones variables de la cadena H del anticuerpo de cadena H-A69 humanizado (hA69-PFL: SEQ ID NO: 11) y anticuerpo de cadena H-B26 humanizado (hB26-PF: SEQ ID NO: 12) y que tienen una secuencia de Kozak (CCACC) y una secuencia de reconocimiento de EcoRI, y un cebador en la secuencia de nucleótidos 3'-terminal que tiene una secuencia de reconocimiento Nhel. Se digirieron los productos de PCR obtenidos con EcoRI y Nhel (ambos de Takara) y se insertaron en pBCH4 también digerido con EcoRI y Nhel, y a continuación se unieron las regiones variables y las regiones constantes. Se digirió el vector preparado para el anticuerpo de cadena H-A69 humanizado con EcoRI y Notl (ambos de Takara), y a continuación se clonó en el vector de expresión de célula animal pCXND3 digerido con EcoRI y Notl. El procedimiento para la construcción del vector pCXND3 se describe a continuación.

Se escindió DHFR-AE-rVH-PM 1-f (véase el documento WO92/19759) en los sitios de restricción EcoRI y Smal para separar la cadena principal del vector del gen de cadena H de anticuerpo. Solo se recuperó la cadena principal del vector y, a continuación, se clonó en él un adaptador EcoRI-NotI-BamHI (Takara). El vector resultante se denominó pCHOI. Se clonó la región de expresión génica DHFR derivada de pCHOI en pcXN (Niwa et al., Gene 108: 193-200 (1991)) en el sitio de restricción Hindlll. El vector resultante se denominó pCXND3. Además, se digirió el vector preparado para el anticuerpo de cadena H-B26 humanizado con EcoRI y Notl (ambos de Takara), y a continuación se clonó en el vector de expresión de célula animal pCXZD1 digerido con EcoRI y Notl. El vector pCXZD1 es un vector de expresión obtenido de pCXND3 sustituyendo el gen de resistencia a neomicina por el gen de resistencia a zeocina. Además, se preparó un vector de expresión de cadena L insertando la región variable de cadena L del anticuerpo de cadena L-BBA humanizado (hAL-s8; SEQ ID NO: 8) en un plásmido (pCAG-gKADN) que tiene una región constante de cadena L insertada de acuerdo con los ejemplos 1-2. Se linealizaron los tres tipos preparados de vectores de expresión con enzimas de restricción y después se introdujeron en células CHO-Dg 44 para establecer una línea celular que expresa anticuerpos.

Se preparó una línea celular de expresión estable por el procedimiento descrito a continuación. Se introdujeron genes por electroporación usando GenePulserXcell (Bio-Rad). Se combinó cada vector de expresión de anticuerpo con 0,75 ml de células CHO suspendidas en PBS (1 x 107 células/ml). Se enfriaron las mezclas en hielo durante diez minutos, se transfirieron a cubetas y se pulsaron a 1,5 kV y 25 pFD. Después de un periodo de restauración de diez minutos a temperatura ambiente, se suspendieron las células electroporadas en 40 ml de medio CHO-S-SFMII (Invitrogen) que contenía 1x suplemento de HT (Invitrogen). Se diluyó la suspensión 10 veces con el mismo medio y se alicuotó en placas de cultivo de 96 pocillos a 100 pl/pocillo. Después de 24 horas de cultivo en una incubadora de CO2 (CO2 al 5 %), se añadieron geneticina y zeocina (ambas de Invitrogen) a 0,5 mg/ml y 0,6 mg/ml, respectivamente. Se cultivaron las células durante dos semanas. Se realizaron secuencialmente cultivos de expansión para colonias de transformantes resistentes a fármacos. Se usó una línea celular de expresión alta establecida para el cultivo a gran escala para obtener el sobrenadante de cultivo.

[Ejemplo 5] Separación y purificación de homodímeros de anticuerpo humanizado y un anticuerpo biespecífico humanizado

Usando el método descrito a continuación, se purificó el anticuerpo biespecífico a partir de los sobrenadantes de cultivo obtenidos en el ejemplo 4. Se cargaron los sobrenadantes de cultivo en una columna rProtein A Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences; 50 mm D.I. X 9,9 cm H. = 194,3 ml de resina) equilibrada con un tampón de equilibrio (tampón de fosfato de sodio 20 mmol/l, NaCl 150mol/l, pH 7,0). Después del lavado con el tampón de lavado 1 (tampón de fosfato de sodio 20 mmol/l, NaCl 150mol/l, pH 7,0) y el tampón de lavado 2 (tampón de acetato de sodio 50 mmol/l, pH 6,0), se eluyó la columna con 50 mmol/l de ácido acético. Inmediatamente después de la elución, se ajustó el pH a 6,3 añadiendo 1,5 mol/l de Tris-HCl (pH 7,8).

Se cargó la solución purificada resultante en una columna SP TOYOPEARL 650M (Tosoh; 26 mm D.I. X 22,3 cm H. = 118,3 ml de resina) equilibrada con disolvente A (10 mmol/l de tampón de fosfato de sodio, pH 6,3). Se separaron los anticuerpos en función de sus cargas de superficie usando las soluciones y gradientes indicados a continuación. Disolvente A: 20 mmol/l de tampón acetato de sodio (pH 6,0)

Disolvente B: 20 mmol/l de tampón acetato de sodio, 1 mol/l de NaCl (pH 6,0)

Caudal: 10 ml/min (113 cm/h); 5,3 ml/min (60 cm/h) solo en el momento de elución

Gradiente: 0 —> 15 % B en etapas 3 volúmenes de columna (VC) 15 -► 35 % B gradiente 6 VC

35 -► 50 % B gradiente 10 VC

50 -► 100 % B gradiente 3 VC

100 % B en etapas 4 VC

Se obtuvieron dos tipos de homodímeros (hA69-PF y hB26-PF) y un único tipo de heterodímero, el anticuerpo biespecífico BiAb, recogiendo las fracciones eluidas de los tres picos detectados por separado.

[Ejemplo 6] Análisis de anticuerpos preparados por enfoque isoeléctrico

El ATF es un anticuerpo monoclonal obtenido previamente contra el factor tisular humano y es un anticuerpo humanizado que comprende la región constante de IgG4 humana. El origen de ATF se describe en detalle en el documento WO99/051743. Las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables de cadena H y cadena L se muestran en SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente. Se analizaron hA69-PF, BiAb y hB26-PF preparados en el ejemplo 5; hA69-N97R, hA69-p18, hB26-e y hB26-p15 preparados en el ejemplo 3; y ATF por enfoque isoeléctrico para evaluar los cambios en la carga de superficie debidos a lo siguiente: diferencias en las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables y modificaciones de aminoácidos.

ATF, hA69-PF, BiAb, hB26-PF y el anticuerpo A69 humanizado hA69-N97R y una forma modificada del mismo, hA69-p18, así como el anticuerpo B26 humanizado hB26-F123e4 y una forma modificada del mismo, hB26-p15, se sometieron a enfoque isoeléctrico, como se describe a continuación. Usando PhastSystem Cassette (Amersham Bioscience), se dejó que el gel Phast-Gel Dry IEF (Amersham Bioscience) se hinchara durante aproximadamente 30 minutos en la solución de hinchamiento indicada a continuación.

Agua Milli-Q 1,5 ml

Pharmalyte 5-8 para IEF (Amersham Bioscience) 50 pl

Pharmalyte 8-10,5 para IEF (Amersham Bioscience) 50 pl

Se llevó a cabo la electroforesis en PhastSystem (Amersham Bioscience) usando el gel hinchado de acuerdo con el programa indicado a continuación. Se cargaron las muestras en el gel en la etapa 2. El marcador de pI es un kit de calibración para pI (Amersham Bioscience).

Etapa 1:2000 V 2,5 mA 3,5 W 15 °C 75 Vh

Etapa 2: 200 V 2,5 mA 3,5 W 15 °C 15Vh

Etapa 3: 2000 V 2,5 mA 3,5 W 15 °C 410 Vh

Después de electroforesis, se fijó el gel con un 20 % de TCA y, a continuación, se tiñó con plata usando una proteína del kit de tinción de plata (Amersham Bioscience) de acuerdo con el protocolo adjunto en el kit. Después de la tinción, se calcularon los pI de las muestras a partir de los pI conocidos del marcador de pI. El resultado del análisis de enfoque isoeléctrico se muestra en la fig. 3. La curva de calibrado de pI frente a movilidad preparada usando el marcador de pI y los pI calculados a partir de la curva se muestran en la fig. 4. Se calcularon los pI en función de la movilidad de las bandas principales ya que cada muestra presentó heterogeneidad de carga derivada de anticuerpo.

El resultado mostró que se cambiaron las cargas de superficie debido a las diferencias en las secuencias de aminoácidos de las regiones variables y que se desplazaron los pI debido al cambio en la carga de superficie a través de modificaciones de aminoácidos. Los pI fueron los siguientes: aproximadamente 9,2 para hB26-PF, aproximadamente 8,7 para BiAb, aproximadamente 8,0 para hA69-PF, aproximadamente 7,2 para ATF, aproximadamente 8,9 para hA69-N97R, aproximadamente 8,5 para hA69-p18, aproximadamente 8,7 para hB26-F123e4 y aproximadamente 9,0 para hB26-pl5. Se obtuvieron hA69-N97R, hA69-p18 y hA69-PF modificando la misma región variable de anticuerpo humanizado. Se pudo lograr un desplazamiento del pI de aproximadamente un 0,9 en hA69-PF en comparación con hA69-N97R y se pudo lograr un desplazamiento del pI de aproximadamente 0,3 en hB26-p15 en comparación con hB26-F123e4. El examen descrito anteriormente demuestra que el pI se puede desplazar dependiendo de la secuencia de aminoácidos de una región variable así como por la modificación de un aminoácido de superficie en H10, H12, H23, H39, H43, H97 o H105 en una región variable seleccionada para cambiar su carga.

[Ejemplo 7] Evaluación de los anticuerpos humanizados A69 y B26 y formas modificadas de los mismos para determinar su actividad de unión

Se evaluaron las funciones del anticuerpo A69 humanizado y su forma modificada por el ensayo de sus actividades de unión al antígeno de Factor IXa, como se describe a continuación. Se evaluaron el anticuerpo A69 humanizado (hA69a) y su forma modificada, hA69-N97R, por el siguiente procedimiento. Se alicuotó (100 pl/pocillo) el factor IXap (Enzyme Research Laboratories) diluido a 1 pg/ml con un tampón de recubrimiento (bicarbonato de sodio 100 mM (pH 9,6), azida de sodio al 0,02 %) en una placa de Nunc-Immuno (una placa MaxiSorp™ de 96 MicroWell™ Nunc-Immuno™ (Nalge Nunc International)), y a continuación se incubó la placa durante la noche a 4 °C. Después de lavar tres veces con PBS(-) que contenía Tween(R) 20, se bloqueó la placa con un tampón diluyente (Tris-HCl 50 mM (pH 8,1), seroalbúmina bovina al 1 %, MgCl21 mM, NaCl 0,15 M, Tween(R) 20 al 0,05 %, azida de sodio al 0,02 %) a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la retirada del tampón, se añadieron los anticuerpos purificados diluidos con el tampón de diluyente a la placa a 100 pl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de que se lavara la placa tres veces, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con fosfatasa (BIOSOURCE) diluido a 1/4000 con el tampón de diluyente a 100 pl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar la placa cinco veces, se añadió un sustrato cromogénico (Sigma) a 100 pl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se midió la absorbancia a 405 nm (referencia a 655 nm) usando el lector de microplacas Modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories).

Se evaluaron los anticuerpos modificados (hA69-N97R, hA69-p18 y hA69-PF) usados en el ejemplo 8 por el siguiente procedimiento. Después de que se alicuotara (100 pl/pocillo) el factor IXa (Enzyme Research Laboratories) diluido a 1 pg/ml con un tampón de recubrimiento (tampón de carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9,6) en una placa de Nunc-Immuno (una placa MaxiSorp™ de 96 MicroWell™ Nunc-Immuno™ (Nalge Nunc International)), se incubó la placa a 4 °C durante la noche o durante un período más largo. Después de lavar tres veces con PBS que contenía Tween(R) 20 al 0,05 %, se añadió un tampón de diluyente (solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 (pH 8,0) (Sigma), seroalbúmina bovina al 1 %, azida de sodio al 0,02 %) a la placa a 200 pl/pocillo. A continuación, se bloqueó la placa a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la retirada del tampón, se añadieron los anticuerpos purificados diluidos con el tampón de diluyente a 100 pl/pocillo. A continuación, se incubó la placa durante la noche a 4 °C. Después de lavar la placa tres veces, se añadió anti-IgG4 humana de ratón marcado con fosfatasa alcalina (Southern Biotechnology)) diluido a 1/500 con el tampón de diluyente a 100 pl/pocillo. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante dos horas. Después de lavar la placa cinco veces, se añadió el sistema de sustratos de fosfatasa BluePhos Microwell (Kirkegaard & Perry Laboratories) como sustrato a 100 pl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. Se midió la absorbancia a 650 nm usando el lector de microplacas Vmax (Molecular Devices). Como se muestra en la fig. 5, los resultados demuestran que los anticuerpos en los que se había modificado la región variable para cambiar la carga de superficie mostraron una actividad de unión comparable a la de los anticuerpos originales antes de la modificación.

Además, se evaluaron las funciones del anticuerpo B26 humanizado hB26-F123e4 y su forma modificada, hB26-p15, por el ensayo de sus actividades de unión al antígeno de Factor X. Se alicuotó (100 pl/pocillo) el factor X (Enzyme Research Laboratories) diluido a 1 pg/ml con un tampón de recubrimiento (bicarbonato de sodio 100 mM (pH 9,6), azida de sodio al 0,02 %) en una placa de Nunc-Immuno (una placa MaxiSorp™ de 96 MicroWell™ Nunc-Immuno™), y a continuación se incubó la placa durante la noche a 4 °C. Después de lavar tres veces con PBS(-) que contenía Tween(R) 20, se bloqueó la placa con un tampón diluyente (Tris-HCl 50 mM (pH 8,1), seroalbúmina bovina al 1 %, MgCh 1 mM, NaCl 0,15 M, Tween(R) 20 al 0,05 %, azida de sodio al 0,02 %) a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la retirada del tampón, se añadieron los anticuerpos purificados diluidos con el tampón de diluyente a 100 pl/pocillo a la placa. Se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de que se lavara la placa tres veces, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con fosfatasa alcalina (BIOSOURCE) diluido a 1/4000 con el tampón de diluyente a 100 pl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar la placa cinco veces, se añadió un sustrato cromogénico (Sigma) a 100 pl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se midió la absorbancia a 405 nm (referencia a 655 nm) usando el lector de microplacas Modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories). Como se muestra en la fig. 6, los resultados demostraron que el anticuerpo en el que se había modificado la región variable para cambiar la carga de superficie mostraron una actividad de unión comparable a la del anticuerpo original antes de la modificación.

Los hallazgos descritos anteriormente demuestran que las modificaciones de las regiones variables realizadas en los ejemplos no tienen influencia sobre la actividad de unión a antígeno de los anticuerpos.

[Ejemplo 8] Evaluación de los anticuerpos preparados para determinar la farmacocinética

8-1. Prueba de farmacocinética usando ratones

Se obtuvo el ATF como un anticuerpo monoclonal frente al factor tisular humano y es un anticuerpo humanizado que comprende las regiones constantes de la IgG4 humana. El origen de ATF se describe en detalle en el documento WO99/051743. Las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables de cadena H y cadena L se muestran en SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente. Se evaluaron HA69-PF, BiAb y hB26-PF preparados en el ejemplo 5, hA69-N97R, hA69-p18, hB26-e y hB26-p15 preparados en el ejemplo 3, y ATF para determinar la cinética in vivo en ratones (C57BL/6J; Charles River Japón, Inc.). Se administraron por vía intravenosa ATF, hA69-PF, BiAb y hB26-PF una vez a 5 mg/kg a los ratones (C57BL/6J; Charles River Japón, Inc.). Se extrajo sangre antes de la administración y 15 minutos, dos horas, ocho horas, y uno, dos, cuatro, siete, 11, 14, 21 y 28 días después de la administración. Se centrifugó de inmediato la sangre extraída a 4 °C y 15.000 rpm durante 15 minutos para obtener plasma. Se almacenó el plasma separado en un congelador a -20 °C o menos hasta su uso. Asimismo, se administraron por vía intravenosa hA69-N97R, hA69-p18, hB26-F123e4 y hB26-p15 una vez a 1 mg/kg a ratones (C57BL/6J; Charles River, Japón, Inc.). Se extrajo sangre antes de la administración y 15 minutos, dos horas, ocho horas, y uno, dos, cinco, siete, nueve, 14, 21 y 28 días después de la administración. Se centrifugó de inmediato la sangre extraída a 4 °C y 15.000 rpm durante 15 minutos para obtener plasma. Se almacenó el plasma separado en un congelador a -20 °C o menos hasta su uso.

8-2. Medida de la concentración plasmática por ELISA

Se determinaron las concentraciones plasmáticas en ratones por ELISA. Se prepararon muestras de plasma de curvas de calibrado de concentraciones plasmáticas 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, y 0,1 pg/ml. Se alicuotaron muestras de curvas patrón y muestras de plasma de ratón que se van a someter a prueba en inmunoplacas (placas MaxiSorp Nunc-Immuno (Nalge nunc International) inmovilizadas con un F(ab')2 anti-IgG humana (específico de cadena ^y) (Sigma). Se dejaron las muestras en reposo a temperatura ambiente durante una hora, y a continuación se hicieron reaccionar con BIOT anti-IgG humana de cabra (Southern Biotechnology Associates) y conjugado de estreptavidinafosfatasa alcalina (Roche Diagnostics) sucesivamente. Se llevó a cabo el desarrollo de color usando el sistema de sustratos de fosfatasa BluePhos Microwell (Kirkegaard & Perry Laboratories) como sustrato. Se midió la absorbancia a 650 nm usando un lector de microplaca. Se calcularon las concentraciones plasmáticas en ratones a partir de la absorbancia en la curva de calibración usando el programa informático de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Las evoluciones temporales de las concentraciones plasmáticas de ATF, hA69-PF, BiAb y hB26-PF se muestran en la fig. 7.

8-3. Método para calcular los datos farmacocinéticos

Se evaluaron los datos obtenidos sobre las evoluciones temporales de las concentraciones plasmáticas por un análisis independiente del modelo usando el programa informático de análisis farmacocinético WinNonlin (Pharsight) para calcular los parámetros farmacocinéticos (aclaramiento (CL), semivida (T1/2)). Se calculó la T1/2 a partir de las concentraciones plasmáticas en los tres últimos puntos o en la fase terminal seleccionada automáticamente por WinNonlin. Los parámetros farmacocinéticos determinados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

Además, las gráficas de aclaramiento (CL) y semivida (T1/2) de anticuerpo con relación al pI se muestran en la fig. 8. Aunque los anticuerpos respectivos usados comparten las mismas secuencias de la región constante, cada uno del aclaramiento (CL) y semivida (T1/2) están estrechamente correlacionados con pI. Esto demuestra que, como el pI es menor, el aclaramiento es menor y la semivida en sangre es más prolongada. Por tanto, se puede controlar la semivida en sangre por los valores de pI incluso cuando los anticuerpos comparten las mismas secuencias de la región constante. En consecuencia, se sugiere que se puede prolongar la semivida en sangre disminuyendo el pI o se puede reducir incrementando el pI. En este ejemplo, se demuestra que la semivida en sangre se pudo prolongar realmente disminuyendo el pI a través de la modificación de los aminoácidos de superficie (los sitios de modificación se muestran en la tabla 3) en las regiones variables de hA69-N97R. Se puede reducir la semivida en sangre incrementando el pI a través de la modificación de los aminoácidos de superficie (los sitios de modificación se muestran en la tabla 4) en las regiones variables de hB26-F123e4. Estos hallazgos sugieren que se puede controlar la farmacocinética de las IgG en sangre cambiando las cargas de los aminoácidos de superficie (por ejemplo, en las posiciones H10, H12, H23, H39, H43, H97 y H105) en sus regiones variables a través de modificaciones.

Tabla 3

Nombre H1 H12 H23 H27 H43 H97 H103 L99 hA69-N97R Pyr(Q) K K G Q R Q G hA69-p18 Pyr(Q) K K G E N E G hA69-PF E V T Y E L E Q ^{* * *} * *

Tabla 4

Nombre H1 H9 H10 H28 H37 H39 H43 H103 L99 hB26-F123e4 Pyr(Q) P D M A Q Q Q G hB26-p15 Pyr(Q) P D M A K K R G hB26-PF E A Q T V Q K R Q * * * *

En las tablas 3 y 4 anteriores, Pyr(Q) representa un residuo de glutamina N terminal, que se supone que está piroglutamilado. Puesto que el grupo amino N terminal está protegido, no existe una diferencia significativa de carga entre Pyr(Q) y E. Además, los sitios de la sustitución de aminoácidos que da como resultado un desplazamiento de pI están indicados por un asterisco.

Se ha descubierto que la semivida en sangre de una IgG se pudo prolongar o reducir disminuyendo o incrementando el pI de la IgG a través de la sustitución de aminoácidos de superficie en las regiones variables, respectivamente.

De acuerdo con un documento distinto de patente (Nat Biotechnol. 1997; 15: 637-640) en la farmacocinética en sangre en ratones, se pudo prolongar la semivida en sangre (T1/2) aproximadamente en 1,5 veces incrementando la afinidad por FcRn a través de la modificación de aminoácidos en el Fc en la región constante. Además, se ha descubierto que, disminuyendo el pI a través de la modificación de aminoácidos de superficie en regiones variables, se pudo prolongar la semivida en sangre (T1/2) aproximadamente en 1,5 veces en la comparación entre hA69-N97R y hA69-PF que comparten las mismas secuencias de la región constante. Además, cuando se compara hA69-N97R con hA69-PF y ATF, la T1/2 de ATF con el pI menor es mayor aproximadamente en 2,1 veces que la de hA69-N97R. Por tanto, se puede prolongar adicionalmente la semivida de hA69-N97R en sangre disminuyendo su pI a través de la modificación adicional de aminoácidos de superficie en las regiones variables de hA69-N97R. Cuando los anticuerpos usados en este ejemplo se comparan entre sí, la semivida en sangre es diferente aproximadamente en 2,4 veces entre hB26-PF con el pI mayor y ATF con el pI menor. En consecuencia, se espera que el control de la farmacocinética en sangre a través de modificaciones de aminoácidos en regiones variables sea más eficaz en comparación con técnicas de control previas. Además, se desea que el número de sustituciones de aminoácidos introducidos artificialmente en regiones constantes sea más pequeño desde el punto de vista de la antigenicidad. Por

Claims (2)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un anticuerpo IgG modificado humanizado, quimérico o humano que comprende un dominio de unión a FcRn, que tiene una semivida en sangre prolongada o reducida en comparación con antes de dicha modificación, en el que el método comprende:

(a) modificar un ácido nucleico que codifica un anticuerpo IgG humanizado, quimérico o humano para cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido que puede estar expuesto en la superficie del anticuerpo, en el que dicho al menos un residuo de aminoácido es un residuo de aminoácido en una región variable de la cadena pesada o cadena ligera de dicho anticuerpo, y en el que se logra el cambio de carga de dicho al menos un residuo de aminoácido por sustitución de aminoácidos;

(b) cultivar una célula hospedadora para expresar el ácido nucleico;

(c) recoger dicho anticuerpo modificado del cultivo de célula hospedadora; y

(d) evaluar si dicha semivida se ha prolongado o reducido realizando ensayos cinéticos.

2. Un método para prolongar o reducir la semivida en sangre de un anticuerpo IgG humanizado, quimérico o humano que comprende un dominio de unión a FcRn, comprendiendo dicho método cambiar la carga de al menos un residuo de aminoácido que puede estar expuesto en la superficie del anticuerpo, en el que el residuo de aminoácido cuya carga se cambia es un residuo de aminoácido en una región variable de la cadena pesada o cadena ligera de dicho anticuerpo, y en el que el cambio de la carga del residuo de aminoácido se logra mediante una sustitución de aminoácidos y comprendiendo dicho método además evaluar si dicha semivida se ha prolongado o reducido en comparación con antes de dicha sustitución realizando ensayos cinéticos.