JPH01144991A

JPH01144991A - 血液凝固第８因子の精製方法

Info

Publication number: JPH01144991A
Application number: JP30726887A
Authority: JP
Inventors: Yoshitaka Tajima; 田嶋　義高; Shuzo Oyama; 大山　周三; Jun Mizuguchi; 水口　純; Akinobu Funatsu; 船津　昭信
Original assignee: KAGAKU OYOBI KETSUSEI RIYOUHOU KENKYUSHO
Current assignee: KAGAKU OYOBI KETSUSEI RIYOUHOU KENKYUSHO
Priority date: 1987-12-02
Filing date: 1987-12-02
Publication date: 1989-06-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、血液凝固第■因子の製造に関し、特に、新規
なモノクロナール抗体を用いた血液凝固第■因子の精製
方法に関する。

１且立１造血液凝固第■因子（以下、Ｆ■と略称する）は、抗血友
病Ａ因子、抗血友病因子、抗血友病グロブリンなどとも
よばれ、第■因子凝固活性タンパク質（Ｆ■−ｐｒｏｃ
ｏａｇｕｌａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ、以下Ｆ■Ｃと略称
する）とフォン・ビルブラント因７−　（以下ｖ〜ＶＦ
と略称する）とから成ることが知られている。

このうち、Ｆ■Ｃは、血液凝固の内因系経路に関与する
血漿蛋白質である。その機能は、分子レベルの血ｊα凝
固のカスケード反応中、ファクター■ａによるファクタ
ーＸの活性化において、コファクターとして作用するこ
とであり、生体における止血反応に本質的に重要である
。

遺伝的なＸ染色体連鎖出血性疾患である血友病Ａは、血
漿中にある生理活性を有するＦＶｊｌＣの遺伝的欠損ま
たは障害に起因するものであることが知られている。し
たがって、血友病Ａ患者の血液凝固障害に基づく出血に
対しては、欠乏するＦ■Ｃの補充によって止血を図るＦ
ＶｆｆｌＣ補充療法が最も合理的でかつ確実な治療法と
して広く臨床的に用いられている。

又、Ｆ■Ｃは、ｖ　ｗ　Ｆと複合体を形成することによ
って、比較的安定に保たれると考えられている。このｖ
　ｗ　Ｆを含む製剤は、常染色体性優性遺伝による出血
性疾患であるフォノ・ビルブランド病の補充療法に臨床
的に利用できる。

現在、ＦＶＩＣ補充療法には、ヒト血漿より精製した濃
１１１Ｆ■製剤が多く用いられている。しかし、ＦＶＩ
Ｃは、血漿中の濃度が極めて低く（約０．１μｇ／！１
１＞、かつ、そ°の性状が生化学的に非常に不安定であ
るために、Ｆ■Ｃの高純度の精製は極めて困難である。

したがって、現在入手可能な血漿由来の濃縮Ｆ■製剤は
、１％以下のＦＶＩＩＣタンパク質（比活性、２単位／
鵬ｇタンパク以下）を含有するものであり、かなり多く
の夾雑タンパク質を含んでいる。このことは、既存の濃
縮Ｆ■製剤を頻回にわたって投与しなければならない血
友病Ａの治療上、重要な問題、特に、濃縮Ｆ■製剤中の
夾雑タンパク質（アロ抗原など）に起因すると推測され
ている免疫異常の問題、さらには、肝炎や後天性免疫不
全症候群（ＡＩＤＳ）等に関与する夾雑ウィルス伝播と
いう副作用の危険性の問題を提起している。近年、加熱
濃縮ＦＷ製剤の臨床応用によって、肝炎ウィルス、ＡＩ
ＤＳウィルス等の伝播は回避できることも報告される様
になったが、未だ、　肝炎発生に関して安全であるとの
確証は得られていない。

したがって、より高度に精製されたＦ■製剤を臨床的に
使用し、夾雑タンパク質の除去はもちろんのこと、混入
ウィルスの伝播の可能性も著しく減することは非常に有
益である。

最近、ヒトＦｖＩＩＩＣＩＩ伝子がクローニングされ、
（Ｊ、　　Ｑｉｔｓｃｈｉｅｒら、　　Ｎ　ａ　ｔ、　
ｕ　ｒ　ｅ　、　　ｕユ、　　１３２６〜３３０　。

１９８４）、さらに、生理活性のあるヒトＦＶＩＣが、
組換えＤＮＡ技術によって発現されている、　（ｗ。

１、　　Ｗｏｏｄら、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　３ＪＪ、
　　３３０〜３３７．　１９８４；　　Ｊ。

Ｊ、Ｔｏｏｌｅら、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　ＩＪＪ、　
　３４２〜３４７．　１９８７；　Ｍ、Ａ。

Ｔｒｕｅｔｔら、　　ＤＮＡ、　　４．　３３３〜３４
９．　１９８５；　　＾。

Ｐａｖｉｒａｎｉら、　　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇＹ
　’２．　３８’）−３９２，１９８７など）。

このような組換えＤＮＡ技術によるＦ■製剤の開発にお
いても、発現のための宿主である培養動物細胞等に由来
する製剤中の夾雑タンパクの混入は一層厳重に回避せね
ばならないであろう、なぜなら、製剤を頻回投与する必
要のある血友病Ａ患者にとって、製剤中の異種動物由来
の夾雑タンパクは、アレルゲンとなる可能性が高く、重
篤な、あるいは致命的なアレルギー反応を惹起すること
すら子息されるからである。

このような観点からも、Ｆ■（特にＦＶＩＩＩＣ）を高
度に精製することができる技術は、非常に重要である。

′　　　　。

Ｆ■を精製するためには従来より各種の方法が提案され
ており、特に、血漿由来のヒトＦ■Ｃを高度精製すべく
多くの試みがなされている。その中で最も、高純度のＦ
ＶＩＣの生産を可能にしている技術は ■ｖｗＦに対するモノクロナール抗体をマトリックス（
担体）結合させて用いる免疫吸着クロマトグラフィーと
、アミノヘキシル−アガロースクロマトグラフ（−との
組合せ（Ｔ、　Ｓ、　Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、特開昭５８
−１３１９１８号） ■上記と同様の免疫吸着クロマトグラフィーと、陰イオ
ン交換体（Ｍｏｎｏ　Ｑ　ｇｅｔ、　（ｐｈａｒ＋ａａ
ｃｉａ社）など）によるＨＰＬＣの組合せ（Ｌ、０゜Ａｎｄｅｒｓｏｎら、特開昭６１−２０５２
１９　’）■ＣａＣｌ２存在下のゲルろ過と、ＱＡＥセ
ルロースクロマトグラフィーの組合せ、　（Ｐ、　Ｊ、
　Ｆａｙ、　ＰＡＮＳ。

υ、　７２００〜７２０４．１９８２）である。

■、■の方法は、ＦＷＣの生理的存在形態であるＦ　’
Ｊｍ　Ｃ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体に対して、第一段階とし
てマトリックス結合した抗ｖ　ｗ　Ｆモノクロナール抗
体への吸着と、引き続いて行うＣａＣｌ２水溶液による
溶出によって、マＩ・リックス結合した抗ｖｗＦ抗体−
ｖ　ｗ　Ｆ　／　Ｆ　ＩＩ　Ｃ複合体からＦｖｆｆｌＣ
のみを溶離するという原理を基本としたものである。こ
れは、Ｆ■／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体がＣａＣｌ２（または
ＮａＣ１存在下）で解離して遊離のＦＷＣ（又はｖ　ｗ
　Ｆ　）を生じる事実を背景とする。■の方法は出発材
料であるＦＷＣ／　Ｖ　Ｗ　Ｆ複合体に対して、まずＣ
ａＣｌ２存在下でＦＷＣをＦ　Ｖｌｉ　Ｃ／　ｖ　ｗ　
Ｆ複合体から解離させ、ゲルろ過でｖｗＦより低分子Ｉ
のＦＷＣを分離したのち、さらにイオン交換クロマトグ
ラフィーによって精製するものである。いずれの方法に
よっても、最終的に、ｖ　ｗ　Ｆから解離した形のＦＶ
ＩＣのみを得ることを目的としている。

上記のｖ　ｗ　Ｆに対するモノクロナール抗体を用いた
■および■の方法は、固定北枕ｖ　ｗ　Ｆ抗体＝ＶｗＦ
の結合を介して結合したｖ　ｗ　Ｆ　／　Ｆ　ＶＩ　Ｃ
複合体から、ＣａＣ１２（またはＮａＣ１）のごとき塩
を用いることによりｖｗＦとＦＷＩＣとを解離させてＦ
ＷＣを得ようとするものである。しかしながら、そのよ
うな塩によるｖ　ｗ　ＦとＦＶｆｆｉＣの解離は選択的
な・ものではなく、実際には、活性を有するＦＷＣのみ
ならず、ｖ　ｗ　Ｆとの結合能を残し且つ失活したＦＷ
Ｃも解離させてしまう、この活性を有しないＦＷＣの除
去は困難であり、最終製剤中に残存して該製剤の比活性
を減少させることになる。すなわち、最終製剤の比活性
が出発材料中の失活したＦ■（／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体の
含量によって制限を受けることになる。同様のことは、
出発材料であるＦＷＣ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体に対して、
直接、ＣａＣｌ２のごとき塩を適用してＦｖＩＣを該複
合体から解離させようとする前記■の方法についてもあ
てはまる。

さらに、前記■や■のごとき方法においては、ＦＷＣを
溶出させた後に、ｖ　ｗ　Ｆも精製し回収しようとする
時に、ｖ　ｗ　Ｆに対するモノクロナール抗体からｖｗ
Ｆを溶出させるために、強力な抗原＝抗体の結合を切断
できるような変性溶出液の使用が避けられない。この結
果、回収ｖ　ｗ　Ｆの生理活性が少なからず損失すると
いう欠点がある。

加えて、上述したような方法においては組換えＤＮＡ技
術等で生産した遊離のＦＷＣのみを含む材料を直接出発
材料にすることができず、出発材料に制限があることも
大きな欠点である。

口の、・を本発明は、前述したような従来技術の欠点を克服したＦ
■の精製方法を得ることを目的とする。

本発明行は、このために努力を重ねた結果、活性を有す
るＦＷＣのみに特異的に結合し、かつ、その結合性が特
定の金属イオンの存在濃度に依存するようなモノクロナ
ール抗体を確立し、このモノクロナール抗体を利用する
ことによってＦ■を高度にｔ＃製することができる方法
を見出した。かくして、本発明に従えば、活性を有する
ＦＷＣに対して特異的な結合性を有し且つ該結合性が２
価または３価の金属の陽イオンの存在する濃度に依存す
るモノクロナール抗体を適当な担体に固定化して吸着体
とし；　ＦＷＣまたはくおよび）ＦＷＣ／　ｖｗＦ複合
体を含有する出発材料を前記Ｍ属陽イオンの非存在下ま
たは低濃度下に前記吸着体に適用してＦＷＣまたは（お
よび）ＦＷＣ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体を前記モノクロナー
ル抗体に結合させ：前記金属陽イオンを高濃度で含有す
る溶液を用いて前記ＦＶＩＩＩＣまたはくおよび）ＦＷ
Ｃ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体を前記モノクロナール抗体がら
溶離させる工程を含むことを特徴とするＦ■の精製方法
が提供される。

本発明によるＦ■の精製方法は、ＦＶｒｆｉＣのみを精
製して回収する場合に適用されるのみならず、ＦＷＣお
よびｖｗＦのそれぞれを精製して回収する場合、あるい
は、ＦＷＣ／　ｖ　ｗ　Ｆ　複合体として回収する場合
にも適用される。

本発明において用いるモノクロナール抗体は、後述する
ように、常法に従い、精製Ｆ■を免疫したマウスの肺臓
細胞とマウスミエローマ細胞のハイブリドーマから誘導
されたものである。この抗Ｆ■Ｃモノクロナール抗体は
、市販されているような従来より入手できる抗ＦＶＩＣ
モノクロナール抗体とは異なり、活性を有するＦＷＣの
みに特異的に結合し、しかも、この結合性は、Ｃ＆イオ
ンのごとき２価または３価の金属の陽イオンの非存在下
（または低イオン濃度下）では発揮されるが、そのよう
な＆属イオンの高濃度下では消失するという特性を有す
る。

したがって、本発明の方法においては、当該モノクロナ
ール抗体を適当な担体（マトリックス）に固定化して吸
着体とし、Ｃａイオンのごとき金属陽イオンの非存在下
または低濃度下において（Ｃａイオンの場合、０．０２
Ｍ以下、好ましくは０．００５Ｍ以下）ＦＶＩＩＩＣを
含む出発材料（Ｆ　＊　Ｃ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体として
ＦＷＣが存在するものを含む）を該吸着体に適用すれば
、抗ＦＷＣ抗体−Ｆ■Ｃの結合が生じることにより出発
材料が吸着体に吸着される。この抗ＦＶＩＩ［Ｃ抗体−
ＦＷＣの結合は、２価または３価の金属陽イオン（例え
ば、Ｍｇ、＾ｌ、　Ｍｎ、　Ｃｏ）を高濃度で含有する
溶液を用いることにより解離される。

例えば、本発明に従えば、０．１〜１．０Ｍの濃度のＣ
ａイオン水溶液または適当な緩衝液によって抗ＦＶＩＣ
抗体−ＦＶＩＣ結合が確実に解離されて、ＦＶＩＣまた
はＦＷＣ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体がモノクロナール抗体固
定化吸着体から溶出される。

上述したように、活性を有するＦＷＣのみに特異的に結
合し、かつ、金属イオン（ＰＡえばＣａイオン）の存在
下でのＦＭＩＣの微細なコンフォメーション変化に対し
て、結合性の変化するモノクロナール抗体を利用して、
免疫吸着クロマトグラフィーを行う本発明による精製法
では、■Ｆ■Ｃを精製し回収する場合において、出発材
料中のＦＶｆｆｌＣがｖｗＦと複合体を形成しているが
否かには無関係であり、遊離のＦＶＩＣのみをよむ材料
を直接出発材料にすることもできる。■活性を有するＦ
ＷＣとのみ結合しうるモノクロナール抗体を使用するた
め、出発材料中に含まれる失活したＦＷＣすらも選択的
に除去することができ、より比活性の高い高純度のＦ１
４Ｃを得ることができる。■Ｆ■Ｃ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合
体を含む材料を用いた場合、高純度ＦＶＩＩＣのみなら
ず、活性を損なわずに精製されたｖｗＦの回収を行うこ
とができる。このようにして得られるｖ　ｗ　Ｆは、フ
ォノ・ビルブランド病の治療の目的にも有効に使用でき
る他、組換えＤＮＡ技術で発現されたＦＷＣの安定化剤
としても利用し得る。

本発明を利用した高純度ＦＶＩｆｉＣ，ｖｗＦまたは、
ＦＷＣ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体の精製方法の諸工程の一例
を以下に示す。

■まず、本発明によって得た、活性に特異的であり、か
つ高濃度金属イオン（例えばＣａイオン）存在下でのＦ
ＷＣの微細なコンフォメーション変化に対して結合性を
失う性質を有するモノクロナール抗体を７トリツクス（
担体）に固定化したカラムに、該金属イオンの非存在下
または低イオン濃度の条件下で、ＦＷＣ，Ｆ■／　ｖ　
ｗ　Ｆ複合体のいずれか、又は両者を含む出発材料を適
用する。出発材料としては、例えば、血漿、クリオプレ
シピテート溶解物、濃縮Ｆ■調製剤どＦＷＣを含む血液
由来の両分、及び、組換えＤＮＡ技術により生産された
ＦＷＣを含む材料などがこれにあたる。

■次に、カラムに非特異的に結合した夾雑タンパク質を
除去するために、適切な洗浄用緩衝液でカラムを充分洗
浄する。ここまでの工程で、失活した、あるいは活性を
有しないＦＷＣも除去される。

■ｖ　ｗ　Ｆの分離精製も必要とされる場合には、その
後、Ｆ　ｖｇｉＣ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体の解離を促すよ
うな高濃度の塩（例えば、０．１５〜３．０Ｍ、好まし
くは０゜８〜１．０ＭのＮａＣＩ）を含む溶液で、さら
にカラムを洗浄すると、ｖ　ｗ　Ｆを高純度に含む溶出
液を回収することができる。■最後に、カラムに結合し
ている活性を有するＦＶＩＣを高濃度の金属イオン（０
゜１〜１．０１４のＣａイオン、好ましくは、０．２〜
０．５ＭのＣａイオン）を含む溶液で溶出させる。溶出
液中には、高純度のＦＷＣが含まれる。■溶離したＦＷ
Ｃまたはｖ　ｗ　Ｆを含む溶液の脱塩、緩衝液置換は透
析やゲルろ過の方法によって容易に行うことができる。

■濃縮のためには、既知の方法である限外ろ適法や凍結
乾燥法、アミノへキシルアガロースクロマトグラフィー
などの方法を用いることができる。

もし、最終的に、Ｆ■／　Ｖ　Ｗ　Ｆ複合体の形で分離
精製を行いたい場合には、■の工程を省くことによって
、目的を達することができる。

以下、本発明の特徴をさらに明らかにするため、実施例
に沿って本発明を説明する。

実施例Ｉ　　　　Ｆ　　＝。

プールしたヒト血漿を冷融解後、得られたクリオプレシ
ピテートから、０．１Ｍグリシン−２単位／ｍｌヘパリ
ン溶液でＦ■を抽出した。最終濃度が、０．５×になる
ようにポリエチレングリコール４０００を添加後、ｐｉ
（６，５，５℃で３０分間冷処理を行い、冷不溶性タン
パクを沈澱除去し、上清を得た（Ｅ、　Ｊ。

ｔ（ｅｒｓｈｇｏｌｄら、　　Ｊ、　　Ｌａｂ、　　１
４ｅｄ、　　ＬＺ、　　２３〜３２．　１９６６；Ｊ、
　　Ｎｅｗｎ＋ａｎら、　　Ｂｒ、　　Ｊ、　　Ｉｌａ
ｅｍａｔ、　　、７４．　１〜２０　１９７１；Ｌ、　
Ｔｈｏｒｅｌｌら、　Ｔｈｒｏ＋５ｂｓｉｓ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　’３５４３１〜４５０、１９８４）、　　さ
らに、その上清に、８単位／＋１ヘパリンを添加後、５
℃、１時間冷処理し、冷不溶性タンパクをさらに除去し
、上清を得た。あらかじめ、０、０４Ｍ　トリス塩酸緩
衝液（ｐｌ（６，８）で、平衡化しておいたＤＨＡＥ−
ＴＯＹＯＰＥＡＬ　（東洋曹達社製）に、その上清を展
開、吸着後、最終濃度０．５Ｍ　ＮａＣｌの塩濃度勾配
溶出法により、Ｆ■を含む両分を溶出した。

この両分に、最終濃度が１２％となるようにポリエチレ
ングリコール４０００を添加したのち、ｐＨ６，５に調
整し、遠心後、Ｆ■を高純度に含む沈澱を得た。

この沈澱を、０．１Ｍリジン塩酸塩およびＱ、　１５Ｍ
　ＮａＣ１を含む０．０２Ｍイミダゾール緩ｉ液、ｐＨ
６，８で溶解後、マウスの免疫およびモノクロナール抗
体のスクリーニングのためのラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）に用いる抗原として使用した。

■　−ロー　　　　　−。

ハイブリドーマの調製においては、まず、精製Ｆ■を用
いて、Ｂａ１ｂ／ｃマウスを高度免疫した。免疫方法は
、文献等（ｔ（、Ｐ、　Ｍｕｌｌｅｒら、　Ｂｌｏｏｄ
　述。

１００（１〜１００６．　１９８１；　　Ｆ、　　Ｒｏ
ｔｂｌａｔら、　　Ｊ、　　Ｌａｂ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　ＩＪｕ、　７９３〜８０５．１
９８３）に、記載されている方法に準じた。すなわち、
精製Ｆ■（２８ｔｌ）と完全フロイント・アジュバント
との混液をマウスの腹腔内に投与し、つづいて、精製Ｆ
■と不完全フロイント・アジュバントとの混液を、２週
間ごとに、４回腹腔内投与した。さらに１０日後、アジ
ュバントなしに、精製Ｆ■（２８Ｕ）を、尾静脈に投与
した。３日後、マウス膵臓細胞と、マウス・ミエローマ
細胞（Ｐ３ｔｌｌ　）とを、ポリエチレングリコール４
０００存在下で、常法どうりに、１４胞融合を行った（
Ｋｏｈｌｅｒら、　Ｎａｔ、ｕｒｅ　出、　４９５．１
９７５）、　　生成したハイブリドーマを、９６ウエル
　プレート４枚に、まき込み、ＨＡＴ選択培地で、約１
週間培養し、ハイブリドーマのみを選択培養した。その
後、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　　１６４
０培地と培地交換しハイブリドーマをコンフルエントに
なるまで培養した。その培養上清を、ＲＩＡ、およびＦ
■抑制物質活性測定法により、スクリーニングし、目的
とするモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを
選択した。

（１）ＲＩＡによるスクリーニング ■精製Ｆ■のコーティングＲＩＡ用フレキシブル・アッセイプレート（９６ウエル
、ファルコン製）に、５０μ又／ウエルづつ添加し、４
℃、−夜装置した。　　０．１５Ｍ　）ｆａｃＩ、０．
１πウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略す）、０．１
％　Ｔｗｅｅｎ　２０および０．１Ｘ　ＮａＬを含む０
．０ＸＭす７１ｔｌｌｉ液、ｐｌ！７．２でプレートを
５回洗浄した。この洗浄は各スデップに移る前に必ず実
施した。

■ウシ血清アルブミンによるブロッキング０．１５Ｍ　
ＮａＣｌおよび０．ＩＸ　ＮａＮ３を含ｔｒ　Ｏ，ＯＩ
Ｍ！Ｊ　：／　酸ＭＹｆｔ液ｐｌ（７，２（以下、ｐＢ
ｓと略す）ニＢＳＡを溶解し、最終濃度１％とした。

この溶液を各ウェルに１００μ９添加した、３７°Ｃ１
２時間インキュベートした。

■ハイブリドーマ培養上清の添加培養上清をＰＢＳで１０倍希釈した溶液を各ウェルに添
加し、４℃、−夜装置した。

■１２８１−ヒツジ抗マウスＩｇＧ＋２５１−ヒツジ抗マウＸ　ＴｇＧ　５０ＭＭ　（２０
，０００ｃｐｍ）を、各ウェルに添加し、３７℃、２時
間インキュベートした。

■測定 γ−カウンターを用いて、各ウェルの放射活性を測定し
な。

対照として精製Ｆ■の代わりに、ヒトＩｇＧ、またはヒ
トフィブリノーゲン、またはヒトフィブロネクチンを、
それぞれ、プレートにコーティングし、同時にスクリー
ニングを行った。培養上清がこれらの抗原を用いたＲＩ
Ａ法で陰性であり、精製Ｆ■に対してのみ陽性を示した
ものを、陽性ハイブリドーマとした。この陽性ハイブリ
ドーマについて、さらに、下記に示す方法Ｆ■抑制物質
活性を測定した。

（２）Ｆ■抑制物質活性測定Ｆ■抑制物質活性測定は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ法（Ｃ。

Ｋａｓｐｅｒら、　　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、　　Ｄｉａｔ
、ｈｅｓ、　　ｌｌａｅｍｏｒｈ、　３Ｊ。

８６９〜８７２．１９７５）に準じて、各ハイブリドー
マの培養上清を、スクリーニングした。

■各ハイブリドーマ培養上清を、５６℃、３０分間イン
キュベートした。

■バルビタールＭ衝液で、５倍希釈した正常人血漿と、
加熱後の培養上清を同量、混合し、３７℃、２時間イン
キュベートした。

■混合溶液０．１１に、活性化リン脂質溶液と第■因子
欠乏血漿をそれぞれ、０．１１添加し、３７℃、３分間
インキュベートした。

００．０２５Ｍ　ＣａＣ１ｚ　０．１ｍｌを添加し、凝
固時間を測定した。

■コントロールよりも、凝固時間が、１０秒以上延長す
るものを陽性とした。

ＲＩＡ、Ｆ■抑制物質活性測定結果より、５個の陽性ハ
イブリドーマセルライン（Ｎｏ、　３１３．４７１゜４
７３、４０９．５６２）を同定した。

（３）クローニング抗ＦＶＩＣ抗体を産生ずるこれらの５個のハイブリドー
マについて、他のモノクローナル抗体を産生する細胞及
びモノクローナル抗体を産生じない細胞を確実に除去す
るために、２回のクローニングを行った。クローニング
は、限界希釈法により行った。すなわち、各ハイブリド
ーマの希釈浮遊液を、各ウェル化り理論上１個の細胞に
なるように、９６ウエル・プレートに添加した。１０〜
１４日後、各ウェルの培養上清を、前に示したＦ■抑制
物質活性測定法により、スクリーニングし、陽性ハイブ
リドーマセルラインを選択した。クローニングをさらに
確実にするために、再クローニングを実施した。

（４）マウス腹水からの抗Ｆ■Ｃ抗体の精製このように
して得られた５種のセルラインを、あらかじめ、ブリス
タン投与されていたマウスの腹腔内に投与した。８〜１
４日後、マウス腹腔から、腹水を採取した。採取した腹
水は、遠心により沈澱物を除去し、次いで最終濃度１８
％　Ｎａ２３０ｎによる塩析で、　　ＩｇＧ画分を沈澱
として得た。０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８，２で、
Ｉｇ（ｉ沈澱を溶解し、同様の！！衝液に対して透析後
、水で５倍希釈した。あらかじめＯ、０１Ｍリン酸緩衝
液で平衡化したＤＥ＾Ｅ−３ｅｐｈａｃｅｌ　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製）に、ＩｇＧ画分を展開、吸着後、最
終濃度０．３Ｍ　ＮａＣ１の塩濃度勾配溶出法によりＩ
ｇＧ画分を、溶出した。

■　　　　ロー（＋　＞　ＩｇＧサブクラスの決定抗Ｆ■抗体のＩｇＧサブクラスを、オフタロニー法によ
り同定した。抗原として、５０倍濃縮した各セルライン
の培養上清を用い、抗体として、各１ｇＧサブクラス（
ＩｇＧ＋、　ＩｇＧｇ−、ＩｇＧ２ｂ、　ＩｇＧｉ）に
特異的な抗マウスＩｇＧ家兎血清を用いた。

その結果、ハイブリドーマ・セルライン５６２゜４７３
により産生された抗体は、ＩｇＧ＋であり、セルライン
３１３．４７１．４０９により産生された抗体は、Ｉｇ
Ｇ２＊であった。

（２）Ｆ■抑制物質活性各セルラインのマウス腹水より精製したモノクローナル
抗体について、Ｂｅｔｈｅｓｄａ法によりＦ■抑制物質
活性を測定した。

上記抗体のうち、セルライン５６２により産生された抗
体のみが、Ｆ■抑制物質活性を示し、１７９ＲＵ／鵬ｇ
であった。

本発明で得たモノクロナール抗体の、活性を有するＦＶ
ＩＩＩＣに対する結合の特異性を、ＥＬＩＳＡ法を用い
て測定した。モノクロナール抗体は、本発明で得たＮｏ
、　５６２及び、対照として市販の２種の抗ＦＶＩＡＣ
モノクロナール抗体（Ｂｉｏｓｃｏｔ社製、ＥＳ１１２
゜ＵＳＩ＋４　’）を測定に用いた。ＥＬＩＳＡ法によ
るＦ■Ｃ抗原量の測定のための試料としては、失活した
Ｆ■Ｃのみを含む試料として正常ヒト血清、また、本来
の活性を有するＦＶ［ｌＩＣを含む試料として、新たに
クエン酸採血した同一人のヒト血漿を用いな。

正常ヒト血漿中のＦｖＩｃは、血液凝固反応過程中に、
トロンピン、活性型第Ｘ因子、活性型プロティンＣによ
って特異的に消化され、その後、経時的にその活性を消
失する（　Ｄ、　Ｅａｔｏｎら、旧ｏｃｈｅ■−１ｓｔ
ｒｙ、　２５．５０５〜５１２　（１９８６）　）、し
たがって、血清中では、Ｆ■Ｃ活性はほとんど検出され
ず、Ｆ■Ｃ抗原性のみが残存することが知られている。

（Ｊ、Ｅ、Ｂｒｏｗｎら、　Ｊ、　　Ｌａｂ、　　Ｃｌ
１ｎ、　　Ｍｅｄ、、　　１０１゜７９３〜８０５　（
１９８３））ここで試料として用いた血清及び血漿のＦ■Ｃ活性は、
Ｆ■因子欠乏血漿を用いた活性化部分的トロンボプラス
チン時間法により、血清で０．０１２５単位／ｍ＋以下
、血漿で０．６単位／■ｌであった。

ＥＬＩＳＡ法による、モノクロナール抗体と試料中のＦ
■Ｃ抗原との反応性の測定は、次の如く行った。

■モノクロナール抗体のコーティング９６ウエルのマイクロタイタープレートに、ｏ、１５Ｍ
　ＮａＣｌを含む１０＋ｓＭリン酸Ｍ街液（以下ＰＢＳ
と略す）で５０Ｍｇ／層ｌに調整された各モノクロナー
ル抗体溶液を、５０μＪ！　／’）ｘル分注し、４℃１
６時間放置し、モノクロナール抗体をプレートに結合さ
せた。

■洗浄添加したモノクロナール抗体溶液をマイクロタイタープ
レートから吸引除去したのち、０．１％７ｙｅＰｎ−２
０を含むＰＢＳ　（以下ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと略す）で
プレートを５回洗浄し、最終的にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを
吸引除去した。

■ブロッキング４ｘウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　（
以下ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−Ｂ３Ａと略す）１００μＪｌ
を各ウェルに添加し、３７℃４時間インキュベートした
。

■洗浄 ■の操作と同様にＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄を行っ
た。

■試料添加試料である血清又は、血漿をＰＢＳで段階希釈した溶液
を、各々、Ｉ　ＯＯノｔλ／ウェルづつ添加したのち、
４°Ｃ１６時間放置した。

■洗浄 ■の操作と同様に、Ｉ’ＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄を
行った。

■第２次抗体の添加及び発色ヘルオキシダーゼを結合させた市販の抗Ｆ■Ｃモノクロ
ナール抗体（ｌｌｙｂｒｉｔｅｃｈ社製、１７１−Ｆ８
）を、ＰＩＩＳ−Ｔｗｅｅｎ−１１ＳＡ中に含む溶液を
、各ウェルに　１００μλづつ添加し、３７°Ｃ２時間
インキュベートした。２と同様の洗浄操作を施したのち
、次に、０．１Ｍクエン酸−０，２Ｍリン酸２ナトリウ
ム水溶液５０鴎ｌ中０−フエニルジアミンＩＯＢ、及び
５ｘ過酸化水素水７５μλを含む溶液を、各ウェルに１
００μλづつ添加し、室温で３０分間反応させ、４９２
ｎｍの吸光度を測定した。その結果（図１）、本発明で
得た抗Ｆ■Ｃモノクロナール抗体Ｎｏ、５６２（図１の
Ｃ参照）は、対照に用いた抗Ｆ■Ｃモノクロナール抗体
（図１のＡおよびＢ参照）と異なり、血漿中のＦ■Ｃと
のみ特異的に結合し、血清中のＦＶＩＩＣとは反応しな
かった。

すなわち、Ｎｏ、　５６２は活性を有するＦＶＩＩＩＣ
とのみと反応することが示唆された。加えて、別の実験
より、Ｎｏ、　５６２は、０ｊ５１４　ＣａＣｌ２存在
下でゲルろ過を施し、Ｆ■Ｃ／　ｖ　ｗ　Ｆ複合体より
解離した精製Ｆ■Ｃとも、定量的に結合することが示さ
れた。

本発明で得た抗ＦＶＩＣモノクロナール抗体の結合性が
、Ｆ■Ｃのコンフォメーションに特異的であることを示
すために、実施例［ｍｌで示したＥＬｊＳＡ法を用いて
以下の実験を行った。

市販の濃縮Ｆ■製剤（コンファク１−Ｆ８）を試料とし
て、最終Ｆ■Ｃ活性が１単位／ｍｌ又は０．２５単位／
ｍｌとなるように、０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む５０ｍ
Ｍ）リスｈ１衝液（ｐＨ７，４）で希釈した。

同時に、それぞれの溶液中のＣ＆イオン濃度が５ｍＭか
ら３５０＋＊ＭとなるようにＣａＣｌ２を添加した試料
（バッファー）も用意した。それらの溶液を試料として
、実施例［ｒＶ］のＥＬＩＳＡ法によってＦ■Ｃｔ’Ａ
原量の測定を行った。ただし、実施例［ＩＶ］のＥＬＩ
ＳＡ法の５の操作の前、及び、６の操作の前に、生理食
塩水で２回プレートを洗浄する操作を加えた。

その結果（図２）、抗Ｆ■Ｃモノクロナール抗体Ｎｏ、
　５６２は、Ｃａイオン濃度の増加に伴ってＦ［Ｃに対
する結合性が減少し、７５ｍＭ以上のＣａイオン存在下
では、その結合性がほとんど消失した６文献（Ｄ、Ｅａ
ｔｏｎら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５　５０５
〜５１２　　（１９８６））によると、高濃度Ｃａイオ
ンの存在は、トロンビンによるＦ■Ｃの消化反応を完全
に阻害することが知られている０本実験でＮｏ、　５６
２のＦＭＩＣに対する結合性が消失したＣａイオン濃度
は、トロンビンによるＦＭＩＣの消化反応が完全に阻害
される時のＣａイオン濃度とほぼ一致する。また、高濃
度Ｃａイオン（例えば０．３Ｍ　ＣａＣｌ２）を含有す
る中性緩衝液中で、ＦＶＩＣの活性は比較的安定に保持
される。

以上の事実も考慮すると、本実験の結果は、高濃度Ｃａ
イオンによってもたらせられたＦＶＩＩＣのコンフォメ
ーション変化に対応して、モノクロナール抗体Ｎｏ、　
５６２の結合性が減少したことを示すと考えられる。す
なわち、Ｎｏ、　５６２は、Ｃａイオン非存在下または
低Ｃａイオン濃度下でのＦ■Ｃのコンフォメーションを
特異的に認識するモノクロナール抗体であると解釈され
る。

Ｎｏ、　５６２モノクロナ一ル抗体は、実施例［ＩＶ］
［■］で示したように、活性を有するＦＶＩＩＣとのみ
特異的に結合し、かつ、その特異的結合性は、高濃度Ｃ
ａイオン存在下で消失する。したがって、Ｎ。

、５６２を用いた免疫吸着クロマトグラフィーを応用す
れば、原理的に活性を有するＦ■Ｃのみのｖｒ製が可能
であり、かつ、その溶出時に活性を良く保持させること
のできる高濃度塩化カルシウム溶液を使用することがで
きる。このことは比活性の高い、高純度のＦ■製剤の調
製を可能とする。又、出発材料としては、前述した如く
、ＦＶＩＣを含む血漿等の血液由来の両分、さらには、
組換えＤＮＡ技術などの応用により培養細胞から産生さ
れたＦＶＩＣを含む材料を用いることができる。

この方法を用いたＦ■Ｃの精製の一例を以下に示す。

市販の濃縮Ｆ■製剤（コンファクトｐｅ）を出発材料と
して、抗Ｆ■Ｃモノクロナール抗体Ｎｏ。

５６２を用いた免疫吸着クロマトグラフィーを次の如く
行った。

■モノクロナール抗体のマトリックスへの固定化モノク
ロナール抗体の固定化に用いるマトリックスとしては、
蛋白質、とくにＦ■自体に対して高度の親和性をもたな
い物質、例えばガラスピーズ、アガロース及びその誘導
体が望ましい６本実験では、交叉結合アガロースゲルで
あるセファロースＣＬ２Ｂ’　ＣＰｈａｒｍａｃｉａ社
製）をマトリックスとして、Ｊ、　Ｔ’ｏｒａｔｈらの
方法（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ｐｌｆ
ｌ、５３〜５６．１９７３＞に準じて、Ｎｏ、　５６２
モノクロナ一ル抗体を固定化した。調製した免疫吸着体
には、ゲル１鱈当り１．８＋ｗｇのモノクロナール抗体
を結合させた。

■免疫吸着クロマトグラフィー以下の操作は、すべて室温で行った。

■で調整した免疫吸着体（ゲル容積１４ｍ１）をカラム
に充填し、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，２ｍＭ　ＮａＣ１ａ
、５％グリセロール、０．１ｍＭフッ化フェニルメチル
スルホニル及び、０．０５％ＮａＮ３を含む５ｈＭイミ
ダゾール桜街液ｐＨ６，８（以下イミダゾール緩衝液と
略す）で平衡（ヒした０次に、２５単位／■ｌのＦ■Ｃ
を含むコンファクトＦＯＩＯ１をカラムに適用して、活
性を有するＦ■Ｃのみを免疫吸着体に吸着させた。その
後、イミダゾールｗＬ衝液で、カラムを十分洗浄したの
ち、さらに３Ｍ　ＮａＣ１を含むイミダゾール）！　Ｗ
ｒ　液で洗浄を行なった。

その後、再びイミダゾールｊＩＩＦｒ液で十分カラムを
洗浄したのち、０．３５ＭＣλＣ１２を含むイミダゾー
ルｖ１衝液をカラムに流して、Ｆ■Ｃを溶出した。

以上のクロマトグラフィーの溶離パターンを図３に示し
た。！＆終的に回収されたＦ■Ｃの活性量は、免疫吸着
体に結合したＦ■Ｃの活性量の約９０χであり、比活性
で、出発材料に対して約５００倍以上精製された。

上清製された。

４．［Ｋ面の簡惟な麦明図１は、本発明において用いる抗ＦＷＣモノクロナール
抗体の特異性を市販の抗Ｆ■Ｃモノクロナール抗体と比
較して示すグラフである。

（２１２は、本発明において用いる抗Ｆ■Ｃモノクロナ
ール抗体の活性Ｆ■Ｃに対する特異性がＣａイオンイ虚
度に依存することを示すグラフである。

図３は、本発明の方法に従いＦ■Ｃを精製するときのク
ロマ（・グラフィーの溶離パターンを示すものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）活性を有するＦVIIIＣに対して特異的な結合性を
有し且つ該結合性が２価または３価の金属の陽イオンの
存在する濃度に依存するモノクロナール抗体を適当な担
体に固定化して吸着体とし；ＦVIIIＣまたは（および）
ＦVIIIＣ／ｖｗＦ複合体を含有する出発材料を前記金属
陽イオンの非存在下または低濃度下に前記吸着体に適用
してＦVIIIＣまたは（および）ＦVIIIＣ／ｖｗＦ複合体
を前記モノクロナール抗体に結合させ；前記金属陽イオ
ンを高濃度で含有する溶液を用いて前記ＦVIIIＣまたは
（および）ＦVIIIＣ／ｖｗＦ複合体を前記モノクロナー
ル抗体から溶離させる工程を含むことを特徴とする血液
凝固第VIII因子の精製方法。
（２）前記金属陽イオンがＣａイオンであり、０．０２
Ｍ以下のＣａイオン濃度下においてＦVIIIＣまたは（お
よび）ＦVIIIＣ／ｖｗＦ複合体を含有する出発材料を前
記吸着体に適用し、また、０．１〜１．０ＭのＣａイオ
ン濃度を有する溶液を用いてＦVIIIＣまたは（および）
ＦVIIIＣ／ｖｗＦ複合体の前記モノクロナール抗体から
の溶離を行う特許請求の範囲第（１）項に記載の方法。