JP4986633B2 - 安定化されたヒトIgG2およびIgG3抗体 - Google Patents
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- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Description
IgG重鎖は、抗原への結合特異性を決定する可変領域および抗体のエフェクター機能発現に関与する定常領域の2つの領域からなる。可変領域は、それを構成する遺伝子の組換えと体細胞変異の導入により、抗原結合部位の配列が構造上異なる。このことが、非常に多くの外来抗原を認識することができるという特徴をもたらす。
たとえば、L235、D265、D270、K322、P331、P329(アルファベットはアミノ酸の一文字表記。数字はKabatらによるEUインデックス(Kabat et. al., Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 Fifth edition)を示す。以下同様。)は、ヒトIgGの補体活性化能に重要な役割を果たしていると考えられており、この部位を他のアミノ酸に置換することによって、CDC活性を低減できる(Esohe E. Idusogie et. al. J. Immunol. 2000, 164:4178-4184, Yuanyuan Xu et. al. J. Biol. Chem. 1994, 269:3469-3474, Brekke, O.H. et. al. Eur. J. Immunol. 1994, 24:2542, Morgan, A., et. al., Immunology 1995, 86:319, Lund, J., et. al., J. Immunol., 1996, 157:4963, Tao, M. H., et. al., J. Exp. Med. 1993, 178:661)。具体的には、D270、K322、P329、P331をAに置換することにより可能である。また、P331をSやGに変換することによっても可能である。
本明細書で使用する用語の定義は以下のとおりである。
また、本発明の抗体の精製された製剤を含有する医薬組成物もまた、本発明の範囲内に含まれる。このような医薬組成物は、好ましくは、抗体に加えて、生理学的に許容され得る希釈剤またはキャリアを含んでおり、他の抗体または抗生物質のような他の薬剤との混合物であってもよい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。或いは、抗体は凍結乾燥(フリーズドライ)し、必要とされるときに上記のような緩衝水溶液を添加することに理再構成して使用してもよい。投与経路は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または配薬を含む非経腸的ルートである。
また、本発明の抗体を含有する組成物もまた、本発明の範囲内に含まれる。組成物は抗体以外に、他の成分たとえば緩衝剤(pH変化を穏やかにすることを目的とし、例えばグルタミン酸ナトリウムが挙げられる)、安定化剤(抗体の化学的あるいは物理的な安定性を高めることを目的とし、例えばグリシンが挙げられる)、界面活性剤(例えば、ポリソルベートが挙げられる)あるいは防腐剤などを含む。組成物は、例えば、水溶液あるいは凍結乾燥である。当該組成物は、例えば、試薬として抗原の分析に使用することができる。本発明のアミノ酸またはドメイン置換が施された抗体は、それが施されていない抗体に比べて凝集体生成が抑制されているため、収率等の観点から効率的に組成物が製造できる。また、抗原分析での分析溶液中において、抗体の凝集が起こりにくいので、精度の高い結果が得られる。
実施例1 抗CD40抗体、IgG1/IgG2定常領域融合体の作製
WO02/088186に記載の抗CD40抗体のうち、ハイブリドーマKM341-1-19(受託番号BP-7759)が産生する抗体(以下、341−1−19抗体)の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体およびハイブリドーマ2105(受託番号BP-8024)が産生する抗体(以下、2105抗体)の軽鎖および重鎖の可変領域を有する抗体を作製した。ハイブリドーマKM341-1-19(受託番号BP-7759)が産生する抗体およびハイブリドーマ2105(受託番号BP-8024)が産生する抗体はアゴニスティック抗体であることが分かっている。
341−1−19 重鎖塩基配列(配列番号:1)
GTCGACGCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGCCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCAGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGGATCC
341−1−19 重鎖アミノ酸配列(配列番号:2)
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
341−1−19 軽鎖塩基配列(配列番号:3)
ACTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACG
341−1−19 軽鎖アミノ酸配列(配列番号:4)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRT
2105抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするDNA並びに重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す。
2105 重鎖塩基配列(配列番号:5)
CTGAACACAGACCCGTCGACTCCCAGGTGTTTCCATTCAGTGATCAGCACTGAACACAGAGGACTCACCATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGG
2105 重鎖アミノ酸配列(配列番号:6)
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK
2105 軽鎖塩基配列(配列番号:7)
CTGCTCAGTTAGGACCCAGAGGGAACCATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTG
2105 軽鎖アミノ酸配列(配列番号:8)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTV
本発明者らは、抗CD40抗体である4D11(IgG4サブクラスを有する)やその変異体である4D11PE(4D11抗体遺伝子の重鎖、軽鎖を含むDNA断片を、BglII、NheIで消化、精製した後、N5KG4PEベクター(IDEC Pharmaceuticals)につなぎ換えて作製した。N5KG4PEはIgG4定常領域に、S228P及びL235E、N5KG4PはS228Pの点変異をそれぞれ含む。)の培養上清をProtein Aカラム(アマシャムバイオサイエンス社)にチャージし0.1Mクエン酸バッファー(pH2.7)により溶出した後37℃で1分間および10分間インキュベートした条件下において、約10%の凝集体が生成するのに対し、4D11の定常領域をIgG1とした4D114D11G1においては、ほとんど凝集体が生じないことを見出している(特願2003−431408)。同様に、IgG2においてもドメインスワップ変異抗体を用いて、低pHにおける凝集体形成抑制にかかわるIgG1の領域を特定するために、ドメインスワップ変異抗体IgG[1/1/2/2]([1/1/2/2]は、左から順にCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインに関して、CH1ドメインはIgG1由来、ヒンジドメインはIgG1由来、CH2ドメインはIgG2由来およびCH3ドメインはIgG2由来であることを意味している。以下同様に解釈する。)、IgG[2/2/1/1]、IgG[2/2/1/2]、IgG[2/2/2/1]、を以下に述べるように作製した。
341G2Ser重鎖全塩基配列(配列番号:15)
ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
341G2Sser重鎖全アミノ酸配列(配列番号:16)
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
341G2Serの軽鎖塩基配列(配列番号17)における、シグナル配列と可変領域の境界は60番目の[アデニン]([A])と61番目のグアニン(G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は372番目のアデニン(A)と373番目の[シトシン]([C])の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
341G2Ser軽鎖全塩基配列(配列番号:17)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
341G2Ser軽鎖全アミノ酸配列(配列番号:18)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2105G2Serの重鎖塩基配列(配列番号19)における、シグナル配列と可変領域の境界は57番目の[チミン]([T])と58番目のグアニン(G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は426番目のアデニン(A)と427番目のグアニン(G)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
2105G2Ser重鎖全塩基配列(配列番号:19)
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
2105G2Ser重鎖全アミノ酸配列(配列番号:20)
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
2105G2Serの軽鎖塩基配列(配列番号21)における、シグナル配列と可変領域の境界は60番目の[アデニン]([A])と61番目のグアニン(G)の間に位置し、可変領域と定常領域の境界は378番目のアデニン(A)と379番目の[シトシン]([C])の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
2105G2Ser軽鎖全塩基配列(配列番号:21)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
2105G2Ser軽鎖全アミノ酸配列(配列番号:22)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
実施例2 ドメインスワップ変異抗CD40抗体、及び、アミノ酸置換変異体抗体の発現・精製
実施例1で作製した発現ベクターDNAをEndoFree Plasmid Kit(キアゲン社)にて調製し、FreeStyleTM 293 Expression System(インビトロジェンライフテクノロジー社)を用いて、メーカー指定のプロトコールに従って発現ベクターを浮遊性293細胞(インビトロジェンライフテクノロジー社)に導入して、一過性発現により各抗体を含む培養上清を得た。孔径0.22μmのメンブランフィルター(MILLIPORE製)で濾過した培養上清(IgGとして約500μg)を抗体精製用アフニティーカラムであるHiTrap rProtein A FF(カラム体積1ml)(アマシャムバイオサイエンス社)にチャージし、PBS(-)で洗浄後20mMクエン酸バッファー(pH3.4)により溶出し、200mMリン酸バッファー(pH7.0)を含むチューブに回収した。
実施例3 抗体溶液の凝集体の含有率の測定
抗体溶液の凝集体含有率は、高速液体クロマトグラフ装置(島津社製)及びTSK−G3000 SWカラム(東ソー社製)と、溶媒として20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl pH7.0を用いて分析を行った。溶出位置をゲルろ過HPLC用分子量マーカー(オリエンタル酵母社)(Cat No.40403701)と比較することで、抗体蛋白の単量体とそれ以上の凝集体のピークを同定して、それぞれのピーク面積から凝集体の含有率を算出した。
実施例4 ドメインスワップ変異抗CD40抗体の安定性の評価
実施例2に示す方法で精製完了した各抗体サンプルの凝集体の含有率は、実施例3の方法で測定したところ、全試料とも0%であった。それら精製した抗体サンプル300μlに対し、200mMクエン酸ナトリウム、50mM NaClから成るバッファー(pH2.7)60μlを添加してpH3.5に調整し、37℃で10分間あるいは60分間インキュベートした後、その低pH処理溶液150μlに対して500mMリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)を37.5μl加えることにより中和した。低pH処理後の抗体溶液の凝集体含有率は、実施例3に示す方法で測定した。
実施例5 IgG2のCH2ドメインの1アミノ酸変異体の作製
実施例4で341-G2Ser抗体の定常領域のCH2ドメインをIgG1としたドメインスワップ変異抗体IgG[2/2/1/2]において、ほとんど凝集体が生じないことを見出したので、更に凝集体形成抑制に寄与しているアミノ酸残基を絞り込むために、341G2Ser抗体のCH2ドメイン内に存在するIgG1とIgG4間で異なるアミノ酸残基6箇所(KabatらによるEUインデックスにより示される274、296、300、309、327、339番目)に注目して、IgG2のアミノ酸残基からIgG1のアミノ酸残基に変換した各変異体(341-G2Ser[Q274K](274番目のGln残基をLysへ変換、以下同様)、341-G2Ser[F296Y]、341-G2Ser[F300Y]、341-G2Ser[V309L]、341-G2Ser[G327A]、341-G2Ser[T339A])を作製した。抗CD40抗体の341-G2Ser発現ベクター(N5KG2Ser-341)のDNAを鋳型として、GeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(プロメガ社)を用いた部位特異的変異導入法により、定常領域のアミノ酸置換体をコードする各種の変異DNAを調製した。変異導入用オリゴヌクレオチド(5’末端リン酸化済み)としては、Q274K:AGACCCCGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT G(配列番号23)、F296Y:CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTTCC(配列番号24)、F300Y:AGTTCAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGC(配列番号25)、V309L:GCGTCCTCAC CGTTCTGCAC CAGGACTGG(配列番号26)、G327A:AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCTCC(配列番号27)、T339A:GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC C(配列番号28)の各オリゴヌクレオチドを用いた。目的の変異導入用オリゴヌクレオチドと上記キット付属のSelection Oligonucleotideを鋳型DNAとアニーリングさせて変異導入鎖を合成した後、GeneEditorTM Antibiotic Selection Mix存在下では変異体のみが増殖することを利用して変異体を選択した。より具体的には、dsDNAテンプレートをアルカリ条件下(0.2M NaOH、0.2mMEDTA(最終濃度))室温で5分間インキュベートした後、2M酢酸アンモニウム(pH4.6)を10分の1容量加えて中和してからエタノール沈殿により回収した。6種類に変異体ごとに別のチューブ中で、アルカリ変性処理した鋳型DNAに、変異導入用オリゴヌクレオチドと新しい抗生物質耐性獲得用Selection Oligonucleotide(Top Select Oligo、5’末端リン酸化)、及び、キット添付のアニーリングバッファーを加えた後、75℃で5分間保温し、37℃にゆっくり下げることによりアニーリングを行なった。次に、変異鎖の合成と連結のために、キット付属のSynthesis 10×buffer、T4 DNA Polymerase、及びT4 DNA ligaseを加えて、37℃で90分反応を行なった。GeneEditorTM Antibiotic Selection Mix存在下でコンピテントセルBMH 71-18 mutSに形質転換して培養した形質転換体大腸菌よりプラスミドDNAを調製し、更にそのDNAによりコンピテントセルJM109を形質転換後、GeneEditorTM Antibiotic Selection Mixを含むLBプレートに播種した。各変異体について、プレートに生じた形質転換体を培養して、プラスミドDNAを精製してDNA塩基配列を解析した。DNA塩基配列の結果、目的とするアミノ酸変異が導入された6種類の抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。それら抗CD40抗体の1アミノ酸置換変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG2Ser-341-Q274K、N5KG2Ser-341-F296Y、N5KG2Ser-341-F300Y、N5KG2Ser-341-V309L、N5KG2Ser-341-G327A、N5KG2Ser-341-T339Aと命名した。
実施例6 1アミノ酸変異体の凝集体形成抑制評価
実施例5の1アミノ酸変異体の抗体発現ベクターを用いて、実施例2に従って発現、精製し、実施例4に従って低pH処理を行い、実施例3に従って、凝集体の含有率を測定した。
実施例7
実施例6に示したように、341G2Ser抗体のCH2ドメインの1アミノ酸置換体を用いた検討から、凝集体の生成が一部分抑制される変異体(341-G2Ser[F300Y]、341-G2Ser[V309L]、及び341-G2Ser[T339A])が見出せたので、更に凝集体形成抑制を促進するために、その3箇所の1アミノ酸変異のいずれか2つ、或は全て組み合わせて有する変異体を作製した。作製した変異体は、341-G2Ser[F300Y/V309L](300番目のアミノ酸残基であるFをY、更に309番目のVをLへ変換、以下同様)、341-G2Ser[F300Y/T339A]、341-G2Ser[V309L/T339A]、341-G2Ser[F300Y/V309L/T339A](300番目のFをY、309番目のVをL、及び339番目のTをAへ変換)の4種類である。変異体発現ベクターの作製法は、複数箇所の変異導入を行なうために、新たに作製したより長い変異導入用オリゴヌクレオチド、或はそれらオリゴヌクレオチドを2つ以上同時に鋳型となるベクターDNAにアニーリングさせた以外は、実施例5のGeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(プロメガ社)による部位特異的変異導入法に従って実施した。変異導入用オリゴヌクレオチドとしては、341-G2Ser[F300Y/V309L]作製にはF300YV309L:AGTTCAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TCTGCACCAG GACTGG (配列番号29)を、341-G2Ser[F300Y/T339A]作製には実施例5で用いたF300Y及びT339Aを、341-G2Ser[V309L/T339A]作製にはV309L及びT339Aを、341-G2Ser[F300Y/V309L/T339A]作製にはF300YV309L及びT339Aを使用した。実施例5で示した部位特異的変異導入法を行い、得られた各変異抗体発現ベクターの候補プラスミドDNAについてDNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された4種類の抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。それら抗CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG2Ser-341-F300Y/V309L、N5KG2Ser-341-F300Y/T339A、N5KG2Ser-341-V309L/T339A、N5KG2Ser-341-F300Y/V309L/T339Aと命名した。
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の重鎖をコードする塩基配列並びに重鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 重鎖塩基配列(配列番号:30)
ATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATCGAGAGACCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATCGTGATTATGTAGGATCTGTGAAAAGTCGAATAATCATCAACCCAGACACATCCAACAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTATATATTACTGTACAAGAGCACAGTGGCTGGGAGGGGATTACCCCTACTACTACAGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号30における、シグナル配列と可変領域の境界は60番目のアデニン(A)と61番目のシトシン(C)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 重鎖アミノ酸配列(配列番号:31)
MSVSFLIFLPVLGLPWGVLSQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRDLEWLGRTYYRSKWYRDYVGSVKSRIIINPDTSNNQFSLQLNSVTPEDTAIYYCTRAQWLGGDYPYYYSMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号31における、シグナル配列と可変領域の境界は20番目のセリン(S)と21番目のグルタミン(Q)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の軽鎖をコードする塩基配列並びに軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 軽鎖塩基配列(配列番号:32)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号32における、シグナル配列と可変領域の境界は60番目のアデニン(A)と61番目のグアニン(G)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
341-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 軽鎖アミノ酸配列(配列番号:33)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号33における、シグナル配列と可変領域の境界は20番目のグリシン(G)と21番目のグルタミン酸(E)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
実施例8 341G2Serの変異体の凝集体形成抑制評価
実施例7の341G2Serの変異体発現ベクターを用いて、実施例2に従って発現、精製し、実施例4に従って低pH処理を行い、実施例3に従って凝集体の含有率を測定し低pHにおける安定性を評価した。
実施例9 2105G2Serの低pHによる凝集体形成抑制の検証
341G2Serと同じく2105G2Serについても、CH2ドメインの3つのアミノ酸をIgG1のアミノ酸に変換したF300YV309LT339Aの変異を持つIgG2の定常領域を持たせた場合、低pH条件下での凝集体形成が抑制可能であるか検討した。N5KG2Ser-341-F300Y/V309L/T339Aの軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含むDNA断片をBglII、NheIで消化することにより切り出し、その代わりに2105の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を挿入した。得られた2105抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG2Ser-2105-F300YV309LT339Aと命名した。
2105-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]のH鎖全長をコードするDNA並びにH鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
2105-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 重鎖塩基配列(配列番号:34)
ATGGAGTTGGGACTGAGCTGGATTTTCCTTTTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCTTGGTGCATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATAGGCTATTTCGGGGAGTTAGGTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号34における、シグナル配列と可変領域の境界は57番目のチミン(T)と58番目のグアニン(G)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
2015-G2Ser [F300Y/V309L/T339A] 重鎖アミノ酸配列(配列番号:35)
MELGLSWIFLLAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSLVHADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDRLFRGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号35における、シグナル配列と可変領域の境界は19番目のシステイン(C)と20番目のグルタミン酸(E)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
2105-G2Ser [F300Y/V309L/T339A]の軽鎖をコードする塩基配列並びに軽鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
2105-G2Ser[F300YV309LT339A] 軽鎖塩基配列(配列番号:36)
ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCCACTGGCTCACTTTCGGCGGGGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号36における、シグナル配列と可変領域の境界は60番目のアデニン(A)と61番目のグアニン(G)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
2105-G2Ser[F300YV309LT339A] 軽鎖アミノ酸配列(配列番号:37)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSHWLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号37における、シグナル配列と可変領域の境界は20番目のグリシン(G)と21番目のグルタミン酸(E)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
同発現ベクター、及び、対象としてN5KG2Ser-2105とN5KG1-2105の各発現ベクターを用いて、実施例2の方法で抗体を発現・精製し、実施例4及び実施例3の方法で、低pHの安定性を調べた。
実施例10 抗CD40抗体のRamos細胞に対する結合活性
実施例2で作製したドメインスワップ変異抗体および実施例5で作製した変異体抗体が、もとの抗体と同等の結合活性を示すかどうか調べるために、CD40を発現するRamos[ATCC]細胞への結合活性を測定した。
実施例11 Ramos細胞における抗CD40抗体によるCD95発現促進
341-1-19、2105はアゴニスト抗体として知られている。抗体の持つアゴニスト活性が、定常領域の構造変化による影響を調べた。Ramos細胞は、CD40リガンドを添加することにより、CD95の発現上昇が観察される。この細胞に、抗体を添加することにより、CD95の発現が上昇するかを指標に、抗体のアゴニスト活性を評価した。
実施例12 抗CD40抗体、IgG1/IgG3定常領域融合体の作製
WO02/088186に記載の抗CD40抗体のうち、4D11抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を用いて抗体を作製した。なお、これら2つの抗体はアンタゴニストとして作用することが分かっている。
4D11 重鎖塩基配列(配列番号:38)
ATATGTCGACGAGTCATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC
4D11 重鎖アミノ酸配列(配列番号:39)
MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTVSSAS
4D11 軽鎖塩基配列(配列番号:40)
AGATCTTAAGCAAGTGTAACAACTCAGAGTACGCGGGGAGACCCACTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACG
4D11 軽鎖アミノ酸配列(配列番号:41)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRT
IgG2抗体と同様に、IgG3抗体においてもドメインスワップ変異抗体を用いて、低pHにおける凝集体形成抑制にかかわるIgG1の領域を特定するために、ドメインスワップ変異抗体IgG[1/1/3/3]([1/1/3/3]は、左から順にCH1ドメイン、ヒンジドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメインに関して、CH1ドメインはIgG1由来、ヒンジドメインはIgG1由来、CH2ドメインはIgG3由来およびCH3ドメインはIgG3由来であることを意味している。以下同様に解釈する。)、IgG[3/3/1/1]、IgG[3/3/1/3]、IgG[3/3/3/1]、を以下に述べるように作製した。
IgG[1/1/3/3]は、N5KG1-Val Lark(IDEC Pharmaceuticals:以下N5KG1と略記)を鋳型として、プライマーlinkH: gggtacgtcctcacattcagtgatcag(配列番号9)、13ch1-R: GTCTTCGTGGCTCACGTCCACCACCACGCA(配列番号42)で98℃1秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。同時に、抗体発現ベクターN5KG3(IDEC Pharmaceuticals, US Patent 6001358、「G3」は、重鎖定常領域がIgG3由来であることを示す(以下、同様)。)を鋳型として、プライマー13ch1: TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC(配列番号43)、linkH2: tgatcatacgtagatatcacggc(配列番号12)を用いて、98℃1秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を15回行った。増幅したDNA断片をPCR purification kitで精製し、2つの精製DNA断片を等量混合したのち、98℃1秒、60℃30秒、72℃30秒の反応を5回行い、プライマーlinkH、linkH2を加えて、15回反応した。増幅したDNA断片をNheI、BamHIで切断し、N5KG1ベクターのIgG1定常領域と置き換えた。この発現ベクターをN5KG1133と名づけた。
実施例13 IgG3のCD40抗体の発現・精製、及び精製品の凝集体含有率の測定
作製した発現ベクターDNAを実施例2に従って発現を行い、得られた培養上清(IgGとして約300μg)を抗体精製用アフニティーカラムであるHiTrap rProtein G HP(カラム体積1ml)(アマシャムバイオサイエンス社)にチャージし、PBS(-)で洗浄後20 mMクエン酸バッファー(pH2.7)により溶出し、200mMリン酸バッファー(pH7.0)を含むチューブに回収した。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表5に示した。4D11-G3抗体は凝集体の含量が20%以上であるのに対して、定常領域のCH3領域をIgG1に変換したドメインスワップ変異抗体(4D11-G[3311]、及び4D11-G[3331])においては、凝集体の割合が非常に少なく、IgG1レベルまで改善することが見出された。
実施例14 IgG3とIgG1のドメインスワップ変異抗CD40抗体の低pH安定性の評価
4D11-G[3331]において抗体精製用アフニティーカラム精製後の凝集体の生成が顕著に抑制されることが示されたので、さらに低pH安定性を調べる目的で、実施例13の4D11-G[3331]及び4D11-G[3311]ドメインスワップ変異抗体の精製抗体を用いて、実施例4に従って低pH処理後、実施例3に従って凝集体の含有率を測定した。
実施例15 IgG3のCH3定常領域1アミノ酸変異体の作製
ドメインスワップ変異体を用いた解析結果から、ProteinGを用いたアフィニティー精製においてはIgG3の凝集形成に関与するのは、主にCH3であることが解ったため、CH3ドメイン内に存在するIgG1とIgG3間で異なるアミノ酸残基6箇所(KabatらによるEUインデックスにより示される356、358、392、397、422、435番目)に注目して、IgG3のアミノ酸残基からIgG1のアミノ酸残基に変換した各変異体(4D11-G3[E356D](356番目のE残基をDへ変換、以下同様)、4D11-G3[M358L]、4D11-G3[N392K]、4D11-G3[M397V]、4D11-G3[I422V]、4D11-G3[R435H])を作製した。
実施例16 4D11-G3の変異体の凝集体形成抑制評価
IgG3のアミノ酸残基からIgG1のアミノ酸残基に変換した各変異体(4D11-G3[E356D]、4D11-G3[M358L]、4D11-G3[N392K]、4D11-G3[M397V]、4D11-G3[I422V]、4D11-G3[R435H])について、各発現ベクターDNAを実施例2に従って発現を行い、得られた培養上清(IgGとして約500μg)から、実施例13に従って精製を実施した。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表7に示した。表7に示すように、4D11-G[N392K]、及び4D11-G[M397V])においては、4D11-G3抗体、及び、他の1アミノ酸残基変異体の凝集体の含量が20%以上であるのに対して、10%前後と凝集体の割合が減少することが見出された。
実施例17 4D11-G3の変異体の凝集体形成抑制評価(2)
実施例16に示したように、IgG3抗体の定常領域の1アミノ酸置換体を用いた検討から、凝集体の生成が一部分抑制される変異体(4D11-G3[N392K]及び4D11-G3[M397V]が見出せたので、更に凝集体形成抑制効果を高めることを目的に、この2箇所のアミノ酸変異をあわせ持つ変異体(4D11-G3[N392KM397V])を作製した。変異体発現ベクターの作製法は、実施例5のGeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(プロメガ社)による部位特異的変異導入法に従って、変異導入用オリゴヌクレオチド(5’末端リン酸化済み)としては、N392KM397V:GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCC(配列番号54)のオリゴヌクレオチドを用いた。得られた変異抗体発現ベクターの候補プラスミドDNAについてDNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。抗CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG3-4D11-N392KM397Vと命名した。
実施例18 4D11-G3の変異体の凝集体形成抑制評価(3)
実施例13及び実施例14において、IgG3重鎖のCH3ドメインをIgG1重鎖のCH3ドメインに、あるいはIgG3重鎖のCH2ドメインおよびCH3ドメインをIgG1重鎖のCH2ドメインおよびCH3ドメインに、置換することによって抗体の安定性を改善することができることが確認できたことから、更に凝集体形成抑制に寄与しているアミノ酸残基を絞り込むために、IgG3抗体のCH2ドメイン内に存在するIgG1とIgG3間で異なるアミノ酸残基の中で、さらに実施例6で示したIgG2の凝集体形成抑制に関与することが判明したアミノ酸残基2箇所(KabatらによるEUインデックスにより示される300、309番目)に注目して、4D11-G[3331]のアミノ酸残基からIgG1のアミノ酸残基に変換した各変異体を作製した。作製した変異体は、4D11-G[3331][F300Y](ドメインスワップ変異体4D11-G[3331]の300番目のアミノ酸残基であるFをYへ変換、以下同様)、4D11-G[3331][T339A]、4D11-G[3331][F300YT339A](300番目のFをY、及び339番目のTをAへ変換)の3種類である。変異体発現ベクターの作製法は、4D11-G[3331][F300YT339A]の場合に2種類のオリゴヌクレオチドを同時に鋳型となるベクターDNAにアニーリングさせた以外は、実施例5のGeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System(プロメガ社)による部位特異的変異導入法に従って実施した。変異導入用オリゴヌクレオチドとしては、4D11-G[3331][F300Y]作製にはG3_F300Y:CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC(配列番号55)を、4D11-G[3331][T339A]作製にはG3_ T339A :GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGACAGCC C(配列番号56)を、341-G2Ser[V309L/T339A]作製にはG3_F300Y及びG3_ T339Aを使用した。実施例5で示した部位特異的変異導入法を行い、得られた各変異抗体発現ベクターの候補プラスミドDNAについてDNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された3種類の抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。それら抗CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG[3331]-4D11-F300Y、N5KG[3331]-4D11-T339A、N5KG[3331]-4D11-F300YT339Aと命名した。
実施例19 アミノ酸置換変異体抗体の発現・精製、及び精製品の凝集体含有率の測定
実施例17及び18で作製した発現ベクターDNAを実施例2に従って発現を行い、得られた培養上清(IgGとして約300μg)から、実施例13で示した抗体精製用アフニティーカラムであるHiTrap rProtein G HPによる精製を実施した。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表8に示した。4D11-G3抗体は凝集体の含量が30%程度であるのに対して、いずれの変異体とも凝集体は検出されなかった。
実施例20 アミノ酸置換変異体抗体の低pH安定性の評価
4D11-G[3331]にCH2ドメイン内にアミノ酸置換を加えた変異体3種類について、低pH安定性を確認した。実施例19の精製抗体を用いて、実施例4に従って低pH処理後、実施例3に従って凝集体の含有率を測定した。
実施例21 IgG3の定常領域アミノ酸変異体の作製
IgG3とIgG1のドメインスワップ変異抗体と各種アミノ酸変異体の安定性改善に関する解析結果を総合的に考慮して、IgG3抗体の安定性を最も改善できる抗体として4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]を作製し、その評価を行なった。4D11-G3 [N392KM397V][R435H]は、IgG3抗体の392番目のアミノ酸残基であるNをKに、397番目のアミノ酸残基であるMをVに、そして435番目のアミノ酸残基であるRをHに変換した3アミノ酸残基の変異体である。また、4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]は、4D11-G3 [N392KM397V][R435H]に加えて、更に300番目のアミノ酸残基のFをYに変換した4アミノ酸残基変異体である。ただし、両変異体ともR435Hのアミノ酸残基の変異は、抗体蛋白質のProteinAによる精製を可能とするために導入した(Ito S et. al., Exp Clin Immunogenet. 1990, 7(2):91-100.)。変異体発現ベクターの作製法は、実施例12に示したN5KG3−R435H発現ベクターDNAを鋳型とした以外は、実施例5のGeneEditorTM in vitro Site-Directed Mutagenesis System( プロメガ社)による部位特異的変異導入法に従って実施した。変異導入用オリゴヌクレオチドとしては、4D11-G3 [N392KM397V][R435H]作製にはN392KM397V:GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCC(配列番号57)を、4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]作製にはG3_F300Y:CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC (配列番号58)及びN392KM397Vの複数のオリゴヌクレオチドを同時に鋳型となるベクターDNAにアニーリングさせた。実施例5で示した部位特異的変異導入法を行い、得られた各変異抗体発現ベクターの候補プラスミドDNAについてDNA塩基配列解析による選択を実施して、目的とするアミノ酸変異が導入された2種類の抗CD40抗体変異体の発現ベクターを取得した。それら抗CD40抗体の変異体蛋白を発現するプラスミドDNAをN5KG3-4D11-[N392KM397V][R435H]、N5KG3-4D11-[F300Y][N392KM397V][R435H]、と命名した。
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]の重鎖をコードする塩基配列並びに重鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 重鎖塩基配列(配列番号:59)
ATGGATCTCATGTGCAAGAAAATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCGGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTACTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGCGGCTCCATCAGCAGTCCTGGTTACTACGGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGAGTATCTATAAAAGTGGGAGCACCTACCACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCTGTGTATTACTGTACGAGACCTGTAGTACGATATTTTGGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGTTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCAAGGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGATACCCTTATGATTTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCTGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号59における、シグナル配列と可変領域の境界は78番目のシトシン(C)と79番目のシトシン(C)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 重鎖アミノ酸配列(配列番号:60)
MDLMCKKMKHLWFFLLLVAAPRWVLSQLQLQESGPGLLKPSETLSLTCTVSGGSISSPGYYGGWIRQPPGKGLEWIGSIYKSGSTYHNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCTRPVVRYFGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKLREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号60における、シグナル配列と可変領域の境界は26番目のセリン(S)と27番目のグルタミン(Q)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]の軽鎖をコードする塩基配列並びに重鎖のアミノ酸配列を以下に示す。
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 軽鎖塩基配列(配列番号:61)
ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTTCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAATTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号61における、シグナル配列と可変領域の境界は66番目のチミン(T)と67番目のグアニン(G)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H] 軽鎖アミノ酸配列(配列番号:62)
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARCAIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号62における、シグナル配列と可変領域の境界は22番目のシステイン(C)と23番目のアラニン(A)の間に位置する(遺伝子配列予測ソフトウェア(Signal P ver.2)を使用)。
実施例22 4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]抗体の精製品の凝集体形成抑制評価
4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]について、発現ベクターDNAを実施例2に従って発現を行い、得られた培養上清(IgGとして約400μg)から、実施例2に示した方法でHiTrap rProtein A FFを用いて精製を行なった。精製後の各抗体サンプルの凝集体の含有率を表10に示した。実施例10や実施例13に示したように、4D11-G3抗体の凝集体の含量が20%以上であるのに対して、これら変異体においては、IgG1抗体並に凝集体の割合が1%以下に減少し、大幅に凝集体の生成が抑制されることが見出された。
実施例23 4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]抗体の低pH安定性の評価
4D11-G3 [N392KM397V][R435H]、及び4D11-G3[F300Y][N392KM397V][R435H]抗体について、低pH安定性を確認した。実施例15の精製抗体を用いて、実施例4に従って低pH処理後、実施例3に従って凝集体の含有率を測定した。
実施例24 抗CD40抗体のRamos細胞に対する結合活性
実施例12および13で作製したドメインスワップ変異抗体および1アミノ酸置換変異体抗体が、もとの抗体と同等の結合活性を示すかどうか調べるために、CD40が発現するRamos[ATCC]細胞への結合活性を測定した。
実施例25 Ramos細胞における抗CD40抗体によるCD95発現抑制
4D11およびKM281-1-10はアンタゴニスト抗体として知られている。抗体の持つアンタゴニスト活性が、定常領域の構造変化による影響を調べた。Ramos細胞は、CD40リガンドを添加することにより、CD95の発現上昇が観察される。このとき、抗体を添加することにより、CD95の発現上昇が抑制できるかどうかを指標に、抗体のアンタゴニスト活性を評価した。
ヒトIgG3重鎖定常領域には多型が存在し、以下がコンセンサス配列である。本発明の変異を下記コンセンサス配列(配列番号63)に適用した重鎖定常領域を有する抗体も本発明に含まれる。下記配列中、例えば下線を付した300番目のF、399番目のT、392番目のN、397番目のMおよび435番目のRを変異させることにより、本発明の安定化抗体を得ることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
Claims (23)
- ヒトIgG2重鎖の定常領域において、KabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFからYへの置換、309番目のVからLへの置換および339番目のTからAへの置換から選ばれる少なくとも1つの置換を有するIgG重鎖。
- 重鎖定常領域にKabatらによるEUインデックスにより示される331番目のPのSへの置換を含む、請求項1に記載のIgG重鎖。
- 請求項1または2に記載のIgG重鎖を含む、モノクローナル抗体。
- ハイブリドーマKM341-1-19(受託番号FERM BP-7759)が産生するモノクローナル抗体の重鎖の可変領域を有する請求項1〜3のいずれか1項に記載のIgG重鎖。
- 請求項4に記載のIgG重鎖およびハイブリドーマKM341-1-19(受託番号FERM BP-7759)が産生するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
- 配列番号2で示されるアミノ酸配列の21番目から148番目のアミノ酸配列を含むIgG重鎖の可変領域を有する請求項1〜5のいずれか1項に記載のIgG重鎖。
- 請求項6に記載のIgG重鎖および配列番号4で示されるアミノ酸配列の21番目から124番目のアミノ酸配列を含むIgG軽鎖の可変領域を有する軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
- 配列番号31で示されるポリペプチドの21番目から474番目のアミノ酸配列からなる請求項2に記載のIgG重鎖。
- 請求項8に記載のIgG重鎖および配列番号33で示されるポリペプチドの21番目から231番目のアミノ酸配列からなる軽鎖を含むモノクローナル抗体。
- 配列番号30で示されるポリヌクレオチド。
- 請求項10に記載のポリヌクレオチドを有する発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターを含む宿主。
- 請求項12に記載の宿主から産生される請求項4に記載のIgG重鎖。
- 請求項13に記載のIgG重鎖及び配列番号32で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主から産生されるモノクローナル抗体の軽鎖、からなるモノクローナル抗体。
- ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFからYへの置換、309番目のVからLへの置換および339番目のTからAへの置換から選ばれる少なくとも1つの置換を行なう工程を含む、IgG重鎖の製造方法。
- 請求項15に記載の製造方法を含むモノクローナル抗体の製造方法。
- 配列番号30で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からIgG重鎖を取得する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。
- 配列番号30で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号32で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
- 配列番号34で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からIgG重鎖を取得する工程を含む、IgG重鎖の製造方法。
- 配列番号34で示されるポリヌクレオチドおよび配列番号36で示されるポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
- 請求項3に記載のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主を培養液中で培養し、該培養物及び/または該宿主からモノクローナル抗体を取得する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
- ヒトIgG2重鎖の定常領域におけるKabatらによるEUインデックスにより示される300番目のFからYへの置換、309番目のVからLへの置換および339番目のTからAへの置換から選ばれる少なくとも1つの置換を行なうことを特徴とする、モノクローナル抗体の凝集抑制方法。
- 請求項5、7、9および14のいずれか1項に記載のモノクローナル抗体を含む組成物。
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