CN102459344A

CN102459344A - 抗axl抗体

Info

Publication number: CN102459344A
Application number: CN2010800324176A
Authority: CN
Inventors: 前田敦彦; 宫本创; 仓持太一; 松尾笃; 井川智之; 白岩宙丈; 角田浩行; 橘达彦
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2010-05-14
Publication date: 2012-05-16
Also published as: JPWO2010131733A1; BRPI1011145A2; US20120121587A1; EP2431393B1; JP5669732B2; KR20120024763A; WO2010131733A1; CO6460749A2; MX2011012136A; SG176074A1; MA33405B1; PE20120562A1; WO2010131733A9; ZA201108526B; CA2761891A1; AR076875A1; IL216097A0; TW201041595A; RU2011151069A; EP2431393A1

Abstract

本发明的目的在于：通过将来自小鼠的抗AXL抗体人源化，降低其在人体内的免疫原性。本发明提供可与Anexelekto(AXL)的特定区结合的抗体、以及根据该抗体制作的人源化抗体。本发明的抗AXL抗体具有高的抗肿瘤活性，作为AXL表达量降低剂、抗癌药以及癌症的诊断药是有效的。

Description

抗AXL抗体

技术领域

本发明涉及抗Anexelekto(AXL)抗体、以及以该抗体作为有效成分的抗癌药。

背景技术

Anexelekto(也称作AXL、UFO、ARK或TYRO7。以下称作AXL。)是存在于细胞膜上的受体酪氨酸激酶(非专利文献1)，据报道，其通过与配体Gas6(生长抑制特异性基因6)结合后发生的自身磷酸化，负责向下游分子传递信号(非专利文献2)。

作为AXL的分子功能，暗示其有助于细胞增殖促进、细胞凋亡抑制、细胞迁移、细胞粘着。作为推测上述功能的依据的实验事实是在施行了Gas6蛋白处理的细胞中产生的现象。迄今为止，有人报道了下述实验结果：大鼠血管平滑肌的细胞死亡抑制以及增殖亢进(非专利文献3、4)，小鼠NIH3T3细胞在血清饥饿后的细胞增殖亢进以及细胞死亡抑制(非专利文献5、6)，小鼠心脏成纤维细胞的增殖促进(非专利文献7)，来自人***癌的细胞的增殖促进(非专利文献8)，来自人胃癌的细胞的增殖促进、细胞浸润促进、细胞死亡抑制(非专利文献9)，人和大鼠血管平滑肌细胞的细胞迁移能力亢进(非专利文献10)，小鼠神经细胞的细胞迁移能力亢进(非专利文献11)，小鼠AXL高度表达细胞的细胞聚集(非专利文献12)。

同样，根据Gas6处理后的细胞内信号分子分析，认为PI3K-Akt途径以及MAPK途径发挥由AXL介导的信号传递的下游途径的作用(非专利文献2)。作为确认存在与这些下游途径直接分子间相互作用的实验，采用以AXL的胞内区为诱饵(bait)的酵母双杂交法进行分析，鉴定出GrbB2/PI3K/p55γ/SOCS-1/NcK2/RanBP2/C1-TEN(非专利文献13)。与上述蛋白的相互作用暗示在AXL信号下游存在上述细胞内信号传递途径，同时支持AXL的假想分子功能即参与细胞增殖促进、细胞凋亡抑制、细胞迁移、细胞粘着。而且，AXL还被鉴定为在小鼠成纤维细胞的TNFα诱导细胞死亡被IL-15抑制时高度表达的基因，由通过抑制AXL的表达使TNFα诱导细胞死亡抑制被解除、通过IL-15处理促进IL-15受体和AXL的磷酸化的实验事实还暗示：存在由AXL与IL-15受体的共轭介导的信号传递(非专利文献14)。

有报道称：在过量表达AXL的显性失活体的人神经胶质瘤株中，由Gas6引起的AXL的磷酸化被抑制，在裸鼠中的致瘤性消失(非专利文献15)。但是，关于抗AXL抗体中是否存在抑制磷酸化的抗AXL抗体，则既没有报道也没有暗示，尚不明确。

AXL是单次跨膜型受体酪氨酸激酶，胞外区自N末侧起由两个免疫球蛋白样结构域(分别称作IgD1、IgD2)和两个纤连蛋白III型结构域(分别称作FND1、FND2)构成(非专利文献1)。已知FND在参与细胞间粘着的神经细胞粘着分子或nephrin等分子中表达，但有关AXL中的FND的功能的详细内容则尚不明确(非专利文献16)。

关于被鉴定为保持本来的细胞转化能力的致癌基因的AXL，其成为作为致癌相关分子的分析对象，报道了许多关于蛋白、mRNA量的表达分析。作为人癌组织或人癌细胞中的表达确认事例，在肺癌(非专利文献17)、乳癌(非专利文献18)、卵巢癌(非专利文献19)、甲状腺癌(非专利文献20)、黑素瘤(非专利文献20)、肾癌(非专利文献21)、胃癌(非专利文献9)、神经胶质瘤(非专利文献22)这些癌种类中确认到AXL蛋白的高度表达，由食道癌(非专利文献23)、大肠癌(非专利文献24)、急性骨髓性白血病(非专利文献25)中存在高水平的AXLmRNA暗示了AXL蛋白的高度表达。除上述事实外，有人还报道了：在HUVEC细胞中由RNAi引起的介导AXL抑制的管腔形成抑制(非专利文献26)、由恒定的AXL抑制引起的来自人乳癌的细胞在小鼠体内的肿瘤形成能力降低(非专利文献26)、由恒定的显性失活突变体高度表达引起的人神经胶质瘤细胞在小鼠体内的肿瘤形成能力降低(非专利文献22)，强烈暗示在肿瘤增殖中涉及AXL的分子功能。

有报道称：抗AXL的胞外区的多克隆抗体具有高浸润性乳癌细胞系的迁移抑制作用(专利文献1)。但是，已知在非临床试验中显示出癌细胞迁移抑制作用的药物未必显示出抗肿瘤活性。例如，已知基质金属蛋白酶(以下称作MMP)促进肿瘤的浸润、迁移，所以抑制MMP的酶活性的各种基质金属蛋白酶抑制剂作为抗癌药的候选而受到关注，巴马司他、马立马司他、普啉司他等各种药物已进入临床研究。但在临床上并未确认到抗肿瘤效果(非专利文献27)。

因此，关于与AXL的特定区结合的抗体特别是在体内是否具有抗肿瘤效果、或者该抗体是否具有AXL表达量降低作用、或者该抗体是否具有癌抑制作用，既没有报道也没有暗示，尚不明确。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2004/008147

专利文献2：WO2007/114319

专利文献3：WO2009/041643

非专利文献

非专利文献1：O’Bryan等人，Mol Cell Biol 1991；11：5016-5031.

非专利文献2：Varnum等人，Nature 1995；373：623-626.

非专利文献3：Nakano等人，FEBS Lett 1996；387：78-80.

非专利文献4：Nakano等人，J Biol Chem 1995；270：5702-5705.

非专利文献5：Goruppi等人，Mol Cell Biol 1997；17：4442-4453.

非专利文献6：Bellosta等人，Oncogene 1997；15：2387-2397.

非专利文献7：Stenhoff等人，Biochem Biophys Res Commun 2004；319：871-878.

非专利文献8：Sainaghi等人，J Cell Physiol 2005；204：36-44.

非专利文献9：Sawabu等人，Mol Carcinog 2007；46：155-164

非专利文献10：Fridell等人，J Biol Chem 1998；273：7123-7126

非专利文献11：Allen等人，Mol Cell Biol 2002；22：599-613.

非专利文献12：McCloskey等人，J Biol Chem 1997；272：23285-23291.

非专利文献13：Hafizi等人，Biochem Biophys Res Commun 2002；299：793-800.

非专利文献14：Budagian等人，Embo J 2005；24：4260-4270.

非专利文献15：VajkoczyP等人，Proc Natl Acad Sci USA 2006；103：5799-5804.

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非专利文献18：Meric等人，Clin Cancer Res 2002；8：361-367.

非专利文献19：Sun等人，Oncology 2004；66：450-457.

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非专利文献21：Chung等人，DNA Cell Biol 2003；22：533-540.

非专利文献22：Vajkoczy等人，Proc Natl Acad Sci USA 2006；103：5799-5804.

非专利文献23：Nemoto等人，Pathobiology 1997；65：195-203.

非专利文献24：Craven等人，Int J Cancer 1995；60：791-797.

非专利文献25：Neubauer等人，Blood 1994；84：1931-1941.

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非专利文献29：Pardridge等人，J Pharmacol Exp Ther.1998；286：548-54.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明以提供抗Anexelekto(AXL)抗体、以及以该抗体作为有效成分的抗癌药为课题。更详细而言，本发明的目的在于：通过将来自小鼠的抗AXL抗体人源化，降低其在人体内的免疫原性。

解决课题的方法

本发明人等发现：与AXL结合的某种抗体在体外具有降低AXL表达量的作用、在体内具有抗肿瘤活性。并且还发现：与AXL的其他区结合的抗体相比，与AXL的FND1区结合的抗体具有强的抗肿瘤活性。

另外，本发明人等通过将上述获得的抗AXL抗体人源化，成功获得了人源化抗AXL抗体。

与来自小鼠的抗AXL抗体相比，这些人源化抗体可以期待在人体内的免疫原性得到降低。

即，本发明涉及以下内容。

[1]以下(1)～(6)中任一项所述的、识别AXL的FND1结构域的抗体；

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包含：具有SEQ IDNO：33～37记载的任一个氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：38～48记载的任一个氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：2(H0)记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包含：具有SEQ IDNO：84～89记载的任一个氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：90记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：65(L0)记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体是在(1)～(5)中任一项所述的抗体中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或***而得到的抗体，所得抗体与(1)～(5)中任一项所述的抗体具有同等活性。

[2]以下(1)～(6)中任一项所述的、识别AXL的FND1结构域的人源化抗体；

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包含：具有SEQ IDNO：33～37记载的任一个氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：38～48记载的任一个氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3，并且还包含：具有SEQ ID NO：51记载的氨基酸序列的FR1、具有SEQ ID NO：53记载的氨基酸序列的FR2、具有SEQID NO：109、SEQ ID NO：58记载的任一个氨基酸序列的FR3、具有SEQ ID NO：61记载的氨基酸序列的FR4；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：2(H0)记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包含：具有SEQ IDNO：84～89记载的任一个氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：90记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列的CDR3，并且还包含：具有SEQ ID NO：93记载的氨基酸序列的FR1、具有SEQ ID NO：96记载的氨基酸序列的FR2、具有SEQ ID NO：101记载的氨基酸序列的FR3、具有SEQ ID NO：103记载的氨基酸序列的FR4；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：65(L0)记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

[3][1]或[2]所述的抗体，其中，重链可变区中Kabat编号94位的氨基酸残基为甘氨酸。

[4][1]～[3]中任一项所述的抗体，其中，在重链可变区的氨基酸序列中，具有下述氨基酸残基中的至少一个残基。

(1)重链可变区中Kabat编号31位的氨基酸残基为天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸

(2)重链可变区中Kabat编号40位的氨基酸残基为脯氨酸

(3)重链可变区中Kabat编号41位的氨基酸残基为精氨酸

(4)重链可变区中Kabat编号43位的氨基酸残基为谷氨酰胺或谷氨酸

(5)重链可变区中Kabat编号44位的氨基酸残基为精氨酸

(6)重链可变区中Kabat编号48位的氨基酸残基为异亮氨酸

(7)重链可变区中Kabat编号61位的氨基酸残基为谷氨酸、赖氨酸或精氨酸

(8)重链可变区中Kabat编号62位的氨基酸残基为谷氨酸

(9)重链可变区中Kabat编号64位的氨基酸残基为谷氨酰胺

(10)重链可变区中Kabat编号65位的氨基酸残基为天冬氨酸

(11)重链可变区中Kabat编号73位的氨基酸残基为天冬酰胺

(12)重链可变区中Kabat编号105位的氨基酸残基为谷氨酸或精氨酸

[5][1]～[3]中任一项所述的抗体，其中，在重链可变区的氨基酸序列中，具有下述氨基酸残基中的至少一个残基。

(1)重链可变区中Kabat编号41位的氨基酸残基为精氨酸

(2)重链可变区中Kabat编号43位的氨基酸残基为谷氨酰胺

(3)重链可变区中Kabat编号44位的氨基酸残基为精氨酸

(4)重链可变区中Kabat编号61位的氨基酸残基为精氨酸

(5)重链可变区中Kabat编号73位的氨基酸残基为天冬酰胺

[6][1]～[5]中任一项所述的抗体，其中，在轻链可变区的氨基酸序列中，具有下述氨基酸残基中的至少一个残基。

(1)轻链可变区中Kabat编号17位的氨基酸残基为精氨酸

(2)轻链可变区中Kabat编号24位的氨基酸残基为谷氨酰胺

(3)轻链可变区中Kabat编号27位的氨基酸残基为谷氨酸或精氨酸

(4)轻链可变区中Kabat编号29位的氨基酸残基为丙氨酸

(5)轻链可变区中Kabat编号42位的氨基酸残基为谷氨酸或谷氨酰胺

(6)轻链可变区中Kabat编号45位的氨基酸残基为赖氨酸

(7)轻链可变区中Kabat编号100位的氨基酸残基为精氨酸

(8)轻链可变区中Kabat编号104位的氨基酸残基为缬氨酸

(9)轻链可变区中Kabat编号107位的氨基酸残基为谷氨酸

[7][1]～[5]中任一项所述的抗体，其中，在轻链可变区的氨基酸序列中，具有下述氨基酸残基中的至少一个残基。

(1)轻链可变区中Kabat编号17位的氨基酸残基为精氨酸

(2)轻链可变区中Kabat编号24位的氨基酸残基为谷氨酰胺

(3)轻链可变区中Kabat编号27位的氨基酸残基为精氨酸

(4)轻链可变区中Kabat编号29位的氨基酸残基为丙氨酸

(5)轻链可变区中Kabat编号45位的氨基酸残基为赖氨酸

(6)轻链可变区中Kabat编号100位的氨基酸残基为精氨酸

(7)轻链可变区中Kabat编号104位的氨基酸残基为缬氨酸

(8)轻链可变区中Kabat编号107位的氨基酸残基为谷氨酸

[8][1]～[5]中任一项所述的抗体，该抗体至少具有以下的任一个重链可变区。

(1)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：38记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：34记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：38记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(3)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：35记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：38记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：39记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(5)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：40记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(6)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：41记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(7)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：42记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(8)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：43记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(9)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：44记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(10)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：45记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(11)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：46记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(12)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：36记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：38记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(13)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：37记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：38记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(14)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：47记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

(15)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：48记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3；

[9][1]～[7]中任一项所述的抗体，该抗体选自以下的(1)～(25)。

(1)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；

(2)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(3)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(4)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(5)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(6)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(7)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(8)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(9)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(10)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(11)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(12)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(13)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(14)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(15)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(16)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(17)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(18)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(19)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(20)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(21)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(22)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(23)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(24)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3；

(25)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有分别包含SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，所述轻链可变区具有分别包含SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：91记载的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3。

[10][1]或[2]所述的抗体，该抗体具有SEQ ID NO：2～32中任一个记载的重链可变区和SEQ ID NO：65～83中任一个记载的轻链可变区。

[11][1]所述的抗体，该抗体是具有SEQ ID NO：1记载的重链可变区和SEQ ID NO：64记载的轻链可变区、且具有来自人抗体的恒定区的嵌合抗体；或者该抗体是在该嵌合抗体中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或***而得到的抗体，且与该嵌合抗体具有同等活性。

[12][1]～[11]中任一项所述的抗体，其中，在轻链可变区的氨基酸序列中，Kabat编号42位的氨基酸残基为赖氨酸。

[13]药物组合物，其以[1]～[12]中任一项所述的抗体作为有效成分。

[14]抗癌药，其以[1]～[12]中任一项所述的抗体作为有效成分。

[15][14]所述的抗癌药，其中，癌症为胰脏癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤、大肠癌、***癌、黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫平滑肌瘤、甲状腺癌、干细胞癌、乳癌、膀胱癌、肾癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤或食道癌。

[16][14]所述的抗癌药，其中，癌症为神经胶质瘤、胃癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌、胰腺癌或乳癌。

[17][14]所述的抗癌药，其中，癌症为胰腺癌或乳癌。

本发明还提供以下内容。

[18]癌症的治疗方法，该方法包括给予对象(例如人等哺乳动物)[1]～[12]中任一项所述的抗体的步骤。

[19][1]～[12]中任一项所述的抗体在制备抗癌药中的应用。

由本发明人选择的杂交瘤(保藏号FERM BP-10854)保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。以下记载特定保藏的内容。

(a)保藏机构的名称、地址

名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心

地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)

(b)保藏日：2007年7月5日

(c)保藏号：AXL No.225 #070402(Ax225)(保藏号FERMBP-10854)

该杂交瘤所产生的抗体的重链可变区的氨基酸序列见SEQ IDNO：1、轻链可变区的氨基酸序列见SEQ ID NO：64。该重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列见SEQID NO：33、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：57和SEQ ID NO：60。该轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列见SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：100和SEQ ID NO：102。

本发明的优选抗体的重链可变区和轻链可变区、以及它们的CDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列与SEQID NO的对应关系见以下的表1和表2。

[表1]

重链	可变区全长	CDR1	CDR2	CDR3	FR1	FR2	FR3	FR4
									chH	1	33	38	49	50	52	57	60
H0	2	33	38	49	51	53	58	61
									H9	3	33	38	49	51	53	59	61
H17	4	34	38	49	51	53	59	61
									H18	5	35	38	49	51	53	59	61
H19	6	33	38	49	51	54	59	61
									H20	7	33	38	49	51	55	59	61
H21	8	33	39	49	51	53	59	61
									H22	9	33	40	49	51	53	59	61
H23	10	33	41	49	51	53	59	61
									H24	11	33	42	49	51	53	59	61
H25	12	33	43	49	51	53	59	61
									H26	13	33	44	49	51	53	59	61
H26	13	33	44	49	51	53	59	61
									H26	13	33	44	49	51	53	59	61
H26	13	33	44	49	51	53	59	61
									H26	13	33	44	49	51	53	59	61
H27	14	33	45	49	51	53	59	61
									H28	15	33	46	49	51	53	59	61
H30	16	33	38	49	51	53	59	62
									H31	17	33	44	49	51	54	59	61
H32	18	33	44	49	51	53	59	62
									H33	19	33	44	49	51	54	59	62
H34	20	36	38	49	51	53	59	61
									H35	21	37	38	49	51	53	59	61
H36	22	33	38	49	51	56	59	61
									H37	23	33	47	49	51	53	59	61
H38	24	33	48	49	51	53	59	61
									H39	25	33	38	49	51	53	59	63
H40	26	36	38	49	51	56	59	61
									H41	27	37	38	49	51	56	59	61
H46	28	33	48	49	51	56	59	61
									H47	29	33	47	49	51	56	59	61
H48	30	33	38	49	51	56	59	63
									H49	31	33	48	49	51	56	59	63
H50	32	33	47	49	51	56	59	63

[表2]

轻链	可变区全长	CDR1	CDR2	CDR3	FR1	FR2	FR3	FR4
									chL	64	84	90	91	92	95	100	102
L0	65	84	90	91	93	96	101	103
									L1	66	85	90	91	93	96	101	103
L3	67	86	90	91	93	96	101	103
									L4	68	84	90	91	93	97	101	103
L5	69	84	90	91	93	98	101	103
									L10	70	84	90	91	93	96	101	104
L11	71	85	90	91	93	96	101	104
									L12	72	85	90	91	93	97	101	104
L13	73	85	90	91	93	98	101	104
									L21	83	89	90	91	93	96	101	104
L25	74	84	90	91	94	96	101	103
									L27	75	87	90	91	93	96	101	103
L28	76	84	90	91	93	99	101	103
									L29	77	84	90	91	93	96	101	105
L31	78	87	90	91	93	99	101	103
									L34	79	87	90	91	94	99	101	103
L35	80	87	90	91	93	99	101	105
									L36	81	88	90	91	93	96	101	103
L37	82	87	90	91	94	99	101	105

另外，在上述任一项所述的抗体的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或***、且与该抗体具有同等活性的抗体也包含在本发明的范围内。

本发明中，“具有同等活性的抗体”是指，例如“至少具有同等的结合活性或体内活性的抗体”。具体而言，“在H0和/或L0的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或***、且与H0/L0抗体相比至少具有同等的抗原结合活性或体内活性的抗体”也包含在本发明的范围内。这里，作为体内活性，包括体内试验中的抗肿瘤活性等，具体而言，还包括本申请的实施例6中采用的异种移植(xenograft)小鼠模型试验。

优选本发明的抗体为与AXL的FND1区结合的人源化抗体。即，从另一角度考虑，本发明提供与AXL结合的人源化抗体。

从另外的角度考虑，本发明还提供包含上述本发明的任一种抗体的药物组合物。优选药物组合物为抗癌药。

从另外的角度考虑，本发明还提供包含上述本发明的任一种抗体的AXL表达量降低剂、诊断药。

发明效果

附图说明

图1是显示抗AXL抗体的抗肿瘤活性和结合结构域的图。-：TGI(％)＜30、+：TGI(％)＜60、++：60＝＜TGI(％)。

图2是显示评价Ax225抗体对诱导癌细胞内AXL的分解活性的实验结果的照片。显示出该抗体诱导AXL蛋白的分解。

图3是显示抗AXL抗体对人胰腺癌异种移植小鼠模型的抗肿瘤效果的测定结果的曲线图。

图4是显示人源化Ax225抗体的表达量的图。

图5是显示人源化Ax225抗体的表达量的图。

图6是显示人源化Ax225抗体(H9/L0)的肿瘤增殖抑制效果的曲线图。*号表示p＜0.05。

图7是显示人源化抗AXL抗体(H47/L0、H47/L11、H50/L0、H50/L11)对人胰腺癌异种移植小鼠模型的抗肿瘤效果的曲线图。*号表示p＜0.05。

具体实施方式

<人源化抗体>

作为本发明中的抗体的优选方案之一，可以列举与AXL结合的人源化抗体。人源化(humanized)抗体可以利用已知的方法进行制备。人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体。

本发明中，人源化抗体由来自人以外的动物的抗体的互补性决定区(CDR；complementarity determining region)和来自人抗体的构架区(FR；framework region)以及来自人抗体的恒定区(Constant region)构成。优选来自人以外的动物的抗体为由以保藏号FERM BP-10854保藏的杂交瘤(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6，保藏日：2007年7月5日)产生的Ax225抗体(申请号；PCT/JP2008/070739)。关于Ax225抗体的获得方法记载在参考例1中。关于Ax225抗体与AXL的FND1区结合记载在参考例2中。关于Ax225抗体具有降低AXL的表达量的活性记载在参考例3中。

用于制作人源化抗体的常规基因重组方法也是已知的(参照欧州专利申请公开号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。连接所得的DNA和编码人抗体恒定区或人抗体恒定区修饰体的DNA，接着***到表达载体中，再将其导入宿主中，使之产生抗体，从而得到人源化抗体(参照欧州专利申请公开号EP239400、国际专利申请公开号WO96/02576)。

连接有Ax225抗体的CDR区和人抗体的构架区(frameworkregion；FR)的人源化Ax225抗体可以如下制作。首先，设计人源化Ax225抗体的重链(H链)、轻链(L链)的各自的可变区序列，再设计编码这些区的多条合成寡DNA片段。通过装配PCR法连接这些寡DNA片段，制作编码可变区全长的基因。(参照WO98/13388号公报中记载的方法)。

与CDR连接的人抗体的构架区选择CDR形成良好的抗原结合位点的构架区。根据需要，还可以将抗体可变区中的构架区的氨基酸取代、缺失、添加和/或***等。

另外，在上述的CDR序列中，可以将1个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或***等。优选有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或***后的CDR序列在结合活性、中和活性、稳定性、免疫原性和/或药物动力学方面与修饰前的CDR序列具有同等以上的性质。对取代、缺失、添加和/或***的氨基酸数没有特别限定，但优选每1个CDR中有3个氨基酸以内、进一步优选2个氨基酸以内、更优选为1个氨基酸。

氨基酸的取代、缺失、添加和/或***等还可以通过上述方法进行。

对本发明的抗体中使用的恒定区没有特别限定，可以使用任何恒定区。本发明的抗体中使用的恒定区的优选例子有：来自人抗体的恒定区(例如在H链中有Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε、在L链中有Cκ、Cλ等)。作为天然型的人抗体恒定区，特别优选的例子有：来自IgG1、IgG2或IgG4的恒定区。

当本发明的抗体的恒定区来自IgG1时，可以期待通过其ADCC活性或CDC活性增强后述的本发明抗体的抗肿瘤活性。

当本发明的抗体的恒定区来自IgG4时，可以期待降低本发明抗体的副作用。

对于来自人抗体的恒定区，为了降低异质性、增强ADCC活性、延长血浆中半衰期等目的，可以有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或***。这里，1个或多个氨基酸是指例如30个以下的氨基酸，优选为15个以下的氨基酸，进一步优选为10个以下的氨基酸，特别优选为2个以下的氨基酸。

本发明的抗体，只要与AXL(优选FND1区)具有结合活性和/或中和活性即可，不仅包括IgG所代表的二价抗体，还包括一价抗体或IgM所代表的多价抗体。本发明的多价抗体包括：具有完全相同的抗原结合位点的多价抗体、或具有一部分或完全不同的抗原结合位点的多价抗体。本发明的抗体并不限于抗体的全长分子，只要与AXL结合即可，可以是低分子抗体或其修饰物。

低分子抗体是包括全长抗体(whole antibody，例如全长IgG等)的一部分缺失的抗体片段的抗体，只要与AXL具有结合活性和/或中和活性即可，没有特别限定。本发明中，低分子抗体只要包含全长抗体的一部分即可，没有特别限定，但优选包含VH或VL，特别优选为包含VH和VL两者的低分子抗体。此外，本发明的低分子抗体的其他优选例子有：包含抗体的CDR的低分子抗体。低分子抗体中所含的CDR可以包含抗体的全部6个CDR，也可以包含一部分CDR。

本发明中的低分子抗体优选比全长抗体的分子量小，但有时例如形成二聚体、三聚体、四聚体等多聚体等，有时分子量比全长抗体的分子量大。

抗体片段的具体例子例如有：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。低分子抗体的具体例子例如有：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)也包含在本发明的低分子抗体中。

抗体片段例如可以通过用酶处理抗体生成抗体片段而得到。作为生成抗体片段的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶等是公知的。或者，构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后可以使之在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.和Horwitz，A.H.Methods inEnzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.和Skerra，A.Methodsin Enzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods inEnzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.等人，Methods inEnzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。

消化酶切断抗体片段的特定位置，产生下述特定结构的抗体片段。对上述酶解得到的抗体片段应用基因工程方法时，可以使抗体的任意部分缺失。

使用上述消化酶时，所得的抗体片段如下。

木瓜蛋白酶消化：F(ab)2或Fab

胃蛋白酶消化：F(ab’)2或Fab’

纤溶酶消化：Facb

本发明中的低分子抗体只要与AXL具有结合活性和/或中和活性即可，可以包括缺失了任意区的抗体片段。

双抗体(Diabody)是指通过基因融合构建的二价(bivalent)低分子抗体(Holliger P等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)、EP404,097号、WO93/11161号等)。双抗体是由两条多肽链构成的二聚体。通常，就构成二聚物的多肽链而言，各自在同一条链中VL和VH通过接头结合。双抗体中的该多肽链的接头通常短至VL和VH无法相互结合。具体而言，构成接头的氨基酸残基优选2～12个残基，进一步优选3～10个残基，特别是5个残基左右。因此，编码在同一条多肽链上的VL和VH无法形成单链可变区片段，而是与另一单链可变区片段形成二聚体。其结果，双抗体具有两个抗原结合位点。

scFv抗体是VH和VL通过接头等连接形成单链多肽的抗体(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883、Plickthun “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”第113卷，Resenburg和Moore编，Springer Verlag，New York，第269-315页，(1994))。scFv中的H链V区和L链V区可以来自本说明书中记载的任何抗体。对连接V区的肽接头没有特别限定。例如可以使用包含3～25个残基左右的任意单链肽作为接头。具体而言，例如可以使用后述的肽接头等。

两链的V区例如可以按照上述PCR法进行连接。为了利用PCR法连接V区，首先，在下述DNA中，以编码全部或所需的部分氨基酸序列的DNA作为模板。

编码抗体H链或H链V区的DNA序列；以及

编码抗体L链或L链V区的DNA序列。

编码H链和L链的V区的DNA分别利用PCR法进行扩增，所述PCR法使用具有与应扩增的DNA两端的序列对应的序列的一对引物。接着，准备编码肽接头部分的DNA。编码肽接头的DNA也可利用PCR来合成。在此时利用的引物的5’侧添加可与另外合成的各V区的扩增产物连接的核苷酸序列。接着，利用[H链V区DNA]-[肽接头DNA]-[L链V区DNA]的各DNA和装配PCR用的引物进行PCR反应。

装配PCR用的引物包含在[H链V区DNA]的5’侧退火的引物和在[L链V区DNA]的3’侧退火的引物的组合。即，装配PCR用引物是指，可以扩增编码应合成的scFv的全长序列的DNA的引物组。一方面，[肽接头DNA]中添加有可与各V区DNA连接的核苷酸序列。其结果，连接上述DNA，再利用装配PCR用引物，最终以扩增产物的形式生成全长的scFv。暂且制作编码scFv的DNA，按照常规方法可以获取含有上述DNA的表达载体和通过该表达载体转化的重组细胞。其结果，培养所得的重组细胞，使编码该scFv的DNA表达，从而可以获得该scFv。

对所结合的VH和VL的顺序没有特别限定，可以按照任何顺序进行排列，例如包括以下的排列。

[VH]接头[VL]

[VL]接头[VH]

sc(Fv)2是2个VH和2个VL通过接头等连接形成单链的低分子抗体(Hudson等人，J Immunol.Methods 1999；231：177～189)。sc(Fv)2例如可以通过用接头连接scFv来制备。

优选具有以下特征的抗体，所述特征为：2个VH和2个VL以单链多肽的N末端侧为基点，按照VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列，但2个VH和2个VL的顺序并不特别限于上述排列，可以按照任何顺序进行排列。例如也可以举出以下的排列：

[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]

[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]

[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]

[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]

[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]

低分子抗体中的VH或VL的氨基酸序列可以被取代、缺失、添加和/或***。并且，使VH与VL缔合时，只要具有抗原结合活性即可，可以缺失一部分，也可以添加其他多肽。可变区还可以被嵌合化或人源化。

本发明中，连接抗体可变区的接头可以使用能够通过基因工程导入的任意肽接头、或合成化合物接头，例如可以使用ProteinEngineering，9(3)，299～305，1996中公开的接头。

本发明中优选的接头为肽接头。对肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员根据目的可以适当选择。通常为1～100个氨基酸，优选3～50个氨基酸，进一步优选5～30个氨基酸，特别优选为12～18个氨基酸(例如15个氨基酸)。

作为肽接头的氨基酸序列，例如有以下的序列。

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：110)

Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：111)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：112)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：113)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：114)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：115)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：116)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：117)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：112))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：113))n

[n为1以上的整数]等。

关于肽接头的氨基酸序列，本领域技术人员根据目的可以适当选择。例如，决定上述肽接头长度的n通常为1～5，优选1～3，更优选为1或2。

合成化合物接头(化学交联剂)是通常用于交联肽的交联剂，例如有：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)、双(琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)、双(磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基-EGS)、二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(DST)、二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、以及双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂均有销售。

连接4个抗体可变区时，通常需要3个接头。多个接头可以使用相同的接头，也可以使用不同的接头。

本发明的抗体还包括：在本发明抗体的氨基酸序列中添加有1个或多个氨基酸残基的抗体。而且，还包括这些抗体与其他肽或蛋白融合的融合蛋白。关于制作融合蛋白的方法，只要连接编码本发明抗体的多核苷酸和编码其他肽或多肽的多核苷酸使构架一致，再将其导入表达载体中，使之在宿主中表达即可，可以采用本领域技术人员公知的方法。作为用于与本发明抗体融合的其他肽或多肽，例如可以使用：FLAG(Hopp，T.P.等人，BioTechnology(1988)6，1204-1210)、包含6个His(组氨酸)残基的6×His、10×His、流感血凝素(HA)、人c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原片段、lck tag、α-微管蛋白片段、B-tag、蛋白C的片段等公知的肽。作为用于与本发明抗体融合的其他多肽，例如可以使用：GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、HA(流感血凝素)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)等。使市售的编码这些肽或多肽的多核苷酸与编码本发明抗体的多核苷酸融合，再使由此制备的融合多核苷酸表达，从而可以制备融合多肽。

本发明的抗体可以是与聚乙二醇(PEG)或透明质酸等高分子物质、放射性物质、荧光物质、发光物质、酶、毒素等各种分子结合的缀合抗体。这样的缀合抗体可以通过对所得抗体实施化学修饰而得到。需要说明的是，抗体的修饰方法在该领域已经确立(例如US5057313、US5156840)。本发明中的“抗体”也包括这些缀合抗体。

本发明的抗体还包括糖链被修饰的抗体。已知通过修饰抗体的糖链可以增强抗体的细胞毒活性。作为糖链被修饰的抗体，例如以下的抗体是公知的：

糖基化修饰的抗体(WO99/54342等)、

添加在糖链中的岩藻糖缺失的抗体(WO00/61739、WO02/31140等))、

含有具等分GlcNAc的糖链的抗体(WO02/79255等)等。

并且，本发明中使用的抗体可以是双特异性抗体(bispecificantibody)。双特异性抗体是指，在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体。本发明中，双特异性抗体可以是识别AXL分子上的不同表位的双特异性抗体，也可以是其中一个抗原结合位点识别AXL、另一个抗原结合位点识别其他物质的双特异性抗体。并且，从另一角度考虑，还可以是其中一个抗原结合位点识别AXL、另一个抗原结合位点识别人效应细胞的抗原的双特异性抗体。作为包含识别AXL的本发明抗体的双特异性抗体的另一个抗原结合位点所结合的抗原，例如有CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD25、CD28、CD33、CD30、CD44、CD44v6、CD52、VEGF、VEGFR、EGF、EGFR、EGFRvIII、HER-2neu、HER-3、HER-4、cMET、EpCAM、IGF-1R、TRAIL-R2、Tie-1、PDGFR-α、NKG2D、CCR5、Gas6、Mer、Tyro3、NCAM、转铁蛋白受体、叶酸结合蛋白、IL-15、IL-15R、CEA、CA125、MUC-1、神经节苷脂GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM2、Sonic Hedgehog(Shh)等。

作为包含识别AXL的本发明抗体的双特异性抗体的另一个抗原结合位点所结合的AXL分子上的不同表位，例如有IgD1、IgD2、FND2等。

用于制备双特异性抗体的方法是公知的。例如，使识别抗原不同的两种抗体结合，可以制作双特异性抗体。进行结合的抗体可以是各自具有H链和L链的1/2分子，也可以是只包含H链的1/4分子。或者，使产生不同单克隆抗体的杂交瘤融合，也可以制作产生双特异性抗体的融合细胞。并且，利用基因工程方法可以制作双特异性抗体。

本发明的抗体，根据后述的产生抗体的细胞或宿主或纯化方法，其氨基酸序列、分子量、等电点或糖链的有无及形态等可以不同。但只要所得抗体与本发明的抗体具有同等功能，即包含在本发明内。例如，有时本发明中记载的氨基酸序列中所含的氨基酸在翻译后会接受修饰(例如，N末端的谷氨酰胺通过焦谷酰胺化(pyroglutamylation)生成焦谷氨酸的修饰是本领域技术人员所熟知的修饰)，即使是这样氨基酸在翻译后被修饰的情形，当然也包含在本发明所记载的氨基酸序列中。使本发明的抗体在原核细胞、例如大肠杆菌中表达时，在原抗体的氨基酸序列的N末端添加有甲硫氨酸残基。本发明的抗体也包含这样的抗体。

本发明的抗AXL抗体等多肽可以利用本领域技术人员公知的方法进行制备。

例如，还可以根据所得的抗AXL抗体的序列，利用本领域技术人员公知的基因重组技术制作抗AXL抗体。具体而言，根据识别AXL的抗体的序列构建编码抗体的多核苷酸，将其导入表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表达即可(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.，MethodsEnzymol.(1989)178，476-496；Pluckthun，A.和Skerra，A.，MethodsEnzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，Methods Enzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods Enzymol.(1986)121，663-669；Bird，R.E.和Walker，B.W.，Trends Biotechnol.(1991)9，132-137)。

载体的例子有：M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，为了亚克隆、切出cDNA时，除上述载体外，例如还有pGEM-T、pDIRECT、pT7等。为了生产本发明的抗体而使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，例如为了在大肠杆菌中表达时，载体除了具有在大肠杆菌中扩增的上述特征外，当以JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌作为宿主时，还必需具有可以在大肠杆菌中高效率表达的启动子、例如lacZ启动子(Ward等人，Nature(1989)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)、araB启动子(Better等人，Science(1988)240，1041-1043)、或T7启动子等。作为这样的载体，除上述载体外，还有pGEX-5X-1(Pharmacia制)、“QIAexpress system”(Qiagen制)、pEGFP或pET(此时，宿主优选表达T7RNA聚合酶的BL21)等。

另外，表达质粒的载体中可以包含用于抗体分泌的信号序列。作为用于抗体分泌的信号序列，当其在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。向宿主细胞中导入载体，例如可以采用氯化钙法、电穿孔法来进行。

除大肠杆菌外，作为用于制备本发明抗体的载体，例如有来自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen社制)或pEF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，第5322页)、pEF、pCDM8)、来自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达***”(Gibco-BRL制)、pBacPAK8)、来自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、来自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、来自逆转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)、来自酵母的表达载体(例如“Pichia表达试剂盒”(Invitrogen制)、pNV11、SP-Q01)、来自枯草杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。

为了在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中表达时，表达质粒的载体必需具有用于在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等人，Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、CMV启动子等，进一步优选具有用于选择转化细胞的基因(例如利用药物(新霉素、G418等)可以判别的耐药基因)。作为具有这样的特性的载体，例如有pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

并且，为了使基因稳定表达、且扩增细胞内的基因拷贝数时，可以列举：向缺失核酸合成途径的CHO细胞中导入携带补偿该途径的DHFR基因的载体(例如pSV2-dhfr(“Molecular Cloning 2nd edition”Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989))等)，之后利用甲氨蝶呤(MTX)使其扩增的方法；为了实现基因的一过性表达时，使用染色体上具有表达SV40T抗原的基因的COS细胞，利用具有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化的方法。作为复制起点，还可以使用来自多瘤病毒、腺病毒、牛***瘤病毒(BPV)等的复制起点。并且，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，表达载体中可以包含氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志物。

由此得到的本发明的抗体，可以将其从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，并纯化成实质上纯粹且均匀的抗体。抗体的分离、纯化可以使用通常抗体的纯化中所使用的分离、纯化方法，对其没有任何限定。例如，可以适当选择、组合层析柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等来分离和纯化抗体。

层析例如有：亲合层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization(蛋白质纯化与鉴定实验指南)：A Laboratory CourseManual.Ed Daniel R.Marshak等人，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1996)。上述层析可以使用液相层析、例如HPLC、FPLC等液相层析来进行。用于亲合层析的柱例如有：蛋白A柱、蛋白G柱。使用蛋白A的柱例如有：Hyper D、POROS、Sepharose FF(GE HealthcareBiosciences)等。本发明还包括利用上述纯化方法进行高度纯化的抗体。

所得抗体与AXL的结合活性的测定，可以采用本领域技术人员公知的方法来进行。例如，作为测定抗体的抗原结合活性的方法，可以使用Biacore、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光抗体法。例如，采用酶免疫测定法时，向包被有抗原的板中加入含有抗体的试样、例如产生抗体的细胞的培养上清或纯化抗体。添加用碱性磷酸酶等酶标记的二次抗体，将板温育、清洗，之后加入对硝基苯基磷酸等酶底物，测定吸光度，从而可以评价抗原结合活性。

<AXL表达量降低剂>

本发明还提供包含抗AXL抗体的AXL表达量降低剂。AXL表达量降低剂是指使表达AXL的细胞内的AXL表达量减少的物质。对表达AXL的细胞没有特别限定，例如有癌细胞(Calu-1、MDA-MB-231、DU-145等)等。

AXL的表达量的减少可以是通过分解AXL等使已经存在的AXL的量减少，也可以是通过抑制AXL的表达使新表达的AXL的量减少。

本发明的包含抗AXL抗体的AXL表达量降低剂还可以表现为使用抗AXL抗体来减少AXL的表达量的方法。并且，本发明的包含抗AXL抗体的AXL表达量降低剂还可以表现为抗AXL抗体在制备AXL表达量降低剂中的应用。

本发明的抗AXL抗体通过降低AXL的表达量，可以期待血管新生抑制效果、肿瘤的增殖抑制效果等效果。

<药物组合物>

本发明的细胞增殖抑制剂或AXL表达量降低剂的给药方法可以通过口服给药、胃肠外给药的任一方法来实施。特别优选为通过胃肠外给药的给药方法，作为所述的给药方法，具体有注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。注射给药的例子有：本发明的药物组合物例如通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等可以进行全身或局部给药。可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。作为给药量，例如可以在0.0001mg～1000mg/kg体重/次的范围内选择给药量。或者，例如可以在每名患者0.001～100000mg/人的范围内选择给药量。但本发明的药物组合物并不限于上述给药量。

本发明的细胞增殖抑制剂或AXL表达量降低剂可以按照常规方法制成制剂(例如Remington’s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)，可以同时含有药学上可接受的载体或添加剂。例如有表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等，但并不限于这些，可以适当使用其它常用的载体。载体具体有：轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。

需要说明的是，本说明书中引用的全部现有技术文献均作为参照而纳入本说明书中。

实施例

以下，利用实施例来具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

[参考例1]Ax225抗体的获取方法

1-1.抗原的制备

向仓鼠卵巢细胞(CHO(dhfr-)细胞)中基因导入融合有人AXL胞外区和小鼠IgG2a的Fc区的融合蛋白(hAXL-ECD-mIgG2aFc)表达载体，利用G418选择法克隆产生hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白的CHO细胞株。将使用无血清培养基(CHO-S-SFM II，GIBCO)回收的产生hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白的CHO细胞株的培养上清添加到用结合缓冲液(20mM的磷酸缓冲液，pH7.0)平衡的蛋白G柱(HiTrap ProteinG HP，GE Healthcare)中。用结合缓冲液清洗非结合蛋白，之后使用洗脱缓冲液(100mM的甘氨酸-HCl，pH2.7)回收hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白组分到分别注入有中和缓冲液(1M的Tris-HCl，pH9.0)的管中，使用截留分子量为10kDa的超滤试剂盒(Centricon(注册商标)，Millipore)，将纯化蛋白的缓冲液置换成磷酸缓冲生理盐水(pH7.35-7.65，TakaraBio)，并浓缩纯化蛋白。使用根据C.N.Pace等人，Prof.Sci.4：2411-2423，(1995)的计算式算出的摩尔吸光系数，由280nm的吸光度算出纯化蛋白的浓度。

1-2.制作以保藏号FERM BP-10854保藏的、产生抗AXL抗体的杂交瘤

使用前项制作的抗原(hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白)，如下对4只BALB/c小鼠(雄、免疫开始时6周龄、日本Charles River)和2只MRL/lpr小鼠(雄、免疫开始时6周龄、日本Charles River)进行免疫。初次免疫时，按40μg/头(head)皮下给予用FCA(弗氏完全佐剂H37 Ra(Difco laboratories))乳化的抗原。两周后，按40μg/头皮下给予用FIA(弗氏不完全佐剂(Difco laboratories))乳化的抗原。以后以1周的间隔进行3次加强免疫。通过下项所示的ELISA(酶联免疫吸附测定法)确认相对于抗原的血清抗体效价上升后，以10μg/头静脉内给予用磷酸缓冲生理盐水(不含钙离子、镁离子的磷酸缓冲盐(PBS(-))、日水制药)稀释的抗原，作为最终免疫。最终免疫的3天后，按照使用PEG1500(Roche Diagnostics)的常规方法，将小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8U.1(称作P3U1、ATCC CRL-1597)进行细胞融合。使用含有10％FBS(Invitrogen)的RPMI1640培养基(Invitrogen)(以下称作10％FBS/RPMI1640)培养融合细胞。融合的第2天，将融合细胞悬浮于半流动培养基(StemCells)中，进行杂交瘤的选择培养，同时实施杂交瘤的集落化。在融合后第9天或第10天挑选杂交瘤的集落，向装有HAT选择培养基(10％FBS/RPMI1640，2％(体积)HAT 50×浓缩(大日本制药)，5％(体积)BM-Condimed H1(Roche Diagnostics))的96-孔板的每孔中接种1个集落。培养3～4天后，回收各孔的培养上清，利用下项所示的ELISA测定与上述抗原以及融合有小鼠IgG2a的Fc区的对照蛋白的结合活性，由此选择与人AXL胞外区具有结合活性的杂交瘤。

所选择的杂交瘤上清的结合活性见表3。

[表3]

由本发明人选择的杂交瘤保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。以下记载特定保藏的内容。

(a)保藏机构的名称、地址

名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心

地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番1中央第6(邮政编码305-8566)

(b)保藏日：2007年7月5日

(c)保藏号：AXL No.225#070402(Ax225)(保藏号FERM BP-10854)1-3.与人AXL的结合活性

将用包被缓冲液(100mM的碳酸氢钠，pH9.6，0.02％的叠氮化钠)稀释至1μg/mL的抗原(hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白)或融合有小鼠IgG2a的Fc区的对照蛋白以80μL/孔分别注入96-孔板(Nunc-ImmunoTM 96MicroWell^TM plates MaxiSorp^TM(Nalge NuncInternational))中，之后在4℃下培育一夜以上。用含有0.05％(体积)的Tween(注册商标)20的磷酸缓冲生理盐水(tPBS(-))清洗3次，之后使用稀释缓冲液(BlockingOne的1/5稀释液，Nacalai Tesque)在4℃下封闭该板一夜以上。除去缓冲液后，以80μL/孔向该板中添加用稀释缓冲液稀释的小鼠的抗血清或杂交瘤的培养上清，在室温下培育1小时。用tPBS(-)清洗该板3次后，以80μL/孔添加用稀释缓冲液稀释至1/5000的HRP标记抗小鼠IgG抗体(Stressgen)，在室温下培育1小时。用tPBS(-)清洗该板5次，之后以80μL/孔添加显色底物过氧化物酶底物(Kirkegaad&Perry Laboratories)，在室温下培育20分钟。以80μL/孔添加过氧化物酶终止液(Kirkegaad & Perry Laboratories)，之后使用酶标仪型号3550(Bio-Rad Laboratories)测定405nm的吸光度。

1-4.从杂交瘤培养上清中纯化抗体

用使用低IgG FBS(Invitrogen)作为FBS的HAT选择培养基培养上述得到的杂交瘤。向20-50mL该培养上清的每10mL该培养上清中加入50μL将溶剂置换成清洗缓冲液(20mM的乙酸钠缓冲液、pH5.0)的蛋白G珠粒(Pharmacia)，在4℃下颠倒混合一夜。回收蛋白G珠粒后用清洗缓冲液清洗，之后用洗脱缓冲液(50mM的乙酸钠缓冲液、pH3.3)洗脱抗体，并立即用中和缓冲液(Tris-盐酸缓冲液、pH7.8)中和。使用截留分子量为10kDa的超滤试剂盒(Amicon(注册商标)，Millipore)，将纯化抗体的缓冲液置换成磷酸缓冲生理盐水(pH7.35-7.65，日水制药)并浓缩该纯化抗体，用0.22μm的灭菌滤器(Millipore GV Millipore)灭菌。

[参考例2]与人AXL-FND1、人AXL-IgD2的结合活性

2-1.与人AXL-FND1、人AXL-IgD2的结合活性

就抗AXL单克隆抗体与AXL-纤连蛋白3型结构域1(AXL-FND1)、AXL免疫球蛋白家族结构域2(AXL-IgD2)的结合能力进行试验。

2-2.制备人重组AXL-FND1、人重组AXL-IgD2的表达载体

人重组AXL-FND1如下构建：通过PCR由全长人AXL cDNA(O’Bryan等人，Mol.Cell.Biol.1991；11：5016-5031)(GenBank#NM_021913)扩增相当于第225位～第331位的氨基酸的区，为了表达与GST-tag的融合蛋白，将扩增产物克隆到pET-41a(+)(Novagen)中，构建pET-AXL-FND1。至于其他结构域，则通过PCR扩增相当于第137位～第224位的氨基酸的区AXL-IgD2，为了表达与GST tag的融合蛋白，将扩增产物克隆到pET-41a(+)中。

利用热激法将5μL制作的各载体转化到DH5α(东洋纺，Cat#DNA-903)中，用SOC培养基培养后，在含有卡那霉素的LB板上、在37度下培养一夜，之后选择集落。

2-3.人重组AXL-FND1、人重组AXL-IgD2的纯化

将制作的各集落在20mL含有卡那霉素的LB培养基中、在37度下预培养一夜，之后转移到500mL培养基中，培养至A600＝0.5±0.05，再添加IPTG使达到0.5mM。在37度下培养1小时后集菌，并悬浮于缓冲液A(50mM的Tris-HCl，pH8.0，1mM的EDTA，0.5mM的PMSF，1mM的DTT)中，之后使用液氮反复冷冻融解2次。加入NP-40使达到0.5％，用超声波破碎机破碎(30秒×5)后，以244,000×G的离心力离心30分钟，回收上清。

使用所得的上清，如下纯化人重组AXL-FND1。将可溶化的大肠杆菌上清和谷胱甘肽Sepharose^TM 4B Fast Flow(GE Healthcare)混合，用旋转器在4度下搅拌1小时。以500×G的离心力离心5分钟，舍弃上清，加入缓冲液A，清洗谷胱甘肽Sepharose^TM 4B。重复该清洗操作3次。将人重组AXL-FND1从清洗过的谷胱甘肽Sepharose^TM 4FastFlow转移到微型柱上，使用50mM的Tris-HCl、pH7.5、25mM的谷胱甘肽，从谷胱甘肽Sepharose^TM 4Fast Flow中分离、洗脱该人重组AXL-FND1。其他AXL的各结构域也按照同样的方法进行表达、分离、洗脱。

2-4.利用蛋白质印迹法评价抗AXL抗体与AXL-FND1的结合活性

以从谷胱甘肽Sepharose^TM4 Fast Flow中分离、洗脱的人重组AXL-FND1为首，AXL-IgD1、AXL-IgD2、AXL-FND2、AXL-IgD1+IgD2、AXL-IgD2+FND1、AXL-FND1+FND2通过BIO-RADDc蛋白测定进行蛋白定量，将1μg样品与NuPAGE(注册商标)样品缓冲液(Invitrogen)混合，用NuPAGE(注册商标)10％Bis-Tris凝胶进行电泳。将进行了电泳的凝胶转移到Immobilon^TM-FL(Millipore)PVDF膜上。含有转移蛋白的PVDF膜用Odyssey(注册商标)封闭缓冲液(LI-COR)封闭，之后浸在稀释抗AXL抗体至5μg/mL的一次抗体溶液中，在4度下培育一夜。使用0.1％的TBS-T[含有0.1％Tween-20的TBS(Tris-缓冲盐，TaKaRa)]，用5分钟清洗浸在一次抗体溶液中的、含有转移蛋白的PVDF膜4次。将浸有抗AXL抗体的PVDF膜浸在稀释至80ng/mL的Alexa Fluor(注册商标)680山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen)二次抗体溶液中，在室温下培育1小时。使用0.1％的TBS-T，用5分钟清洗浸在二次抗体溶液中的PVDF膜3次，之后用含有0.01％SDS的TBS-T清洗5分钟，然后用TBS清洗5分钟。使用远红外线成像***Odyssey(注册商标)扫描清洗过的PVDF膜，评价结合性。

2-5.结果

评价结果记载在图1中。

由结果可知：由以保藏号FERM BP-10854保藏的杂交瘤产生的抗AXL抗体(Ax225)识别AXL的FND1(图1)。认为由以保藏号FERMBP-10857保藏的杂交瘤产生的抗AXL抗体(Ax284)识别AXL的FND1和IgD2(图1)。还可知：由以保藏号FERM BP-10850保藏的杂交瘤产生的抗AXL抗体(Ax7)和由以保藏号FERM BP-10851保藏的杂交瘤产生的抗AXL抗体(Ax51)识别AXL的IgD2(图1)。

[参考例3]由Ax225抗体诱导AXL蛋白分解的测定

就抗AXL单克隆抗体在癌细胞内诱导AXL的分解的能力进行试验。将人非小细胞肺癌细胞株Calu-1以4×10⁵细胞/孔的密度接种在6-孔板中，24小时后换成除去了血清的培养基(血清饥饿)，培养一夜。然后，添加上述制作的抗AXL单克隆抗体使达到2μg/mL，另一方面，作为阳性对照，添加重组GAS6(R&D)使达到200ng/mL，在37℃下培育24小时。然后用PBS(-)清洗细胞，使用上述细胞溶解缓冲液从细胞中提取蛋白。经由7％NuPAGE(Invitrogen)分离市售的用抗AXL抗体(SantaCruz^TM)进行了免疫沉淀的细胞溶解产物，通过上述的蛋白质印迹和酪氨酸磷酸化测定进行免疫印迹。

将25μg各蛋白溶液悬浮于NuPAGE-LDS样品缓冲液(Invitrogen)中，在70℃下加热10分钟，使用7％NuPAGE(Invitrogen)在150V下电泳1小时。已电泳的凝胶在NuPAGE-转移缓冲液(Invitrogen)和含有20％(体积)甲醇的该缓冲液中、在30mA下电泳1小时，以电泳的方式转移到0.45μm的聚偏二氟乙烯滤器(Immobilon-FL，Millipore)中。用TBS(50mM Tris-HCl，pH7.6，150mM NaCl)清洗滤器，通过用ODYSSEY封闭缓冲液(Li-COR)培育一夜进行阻断。使用TBST用5分钟清洗滤器4次，用抗AXL抗体(用TBST进行1∶15,000的稀释、SantaCruz)和抗肌动蛋白抗体(用TBST进行1∶5,000的稀释)在室温下培育2小时。使用TBST用5分钟清洗滤器4次，用以TBST进行了1∶10,000的稀释的Alexa680标记抗兔第二抗体(Invitrogen)和以TBST进行了1∶10,000的稀释的IRDye800标记抗山羊第二抗体(Rockland)培育1小时。使用TBST用5分钟清洗3次，再使用TBS用5分钟清洗1次，之后使用红外线成像***ODYSSEY(Li-COR)扫描滤器。

观察到AXL的印迹在暴露于Ax225抗体中后减弱(图2)。即，上述Ax225抗体可以诱导AXL蛋白的分解。

[参考例4]测定抗AXL抗体对人胰腺癌异种移植小鼠模型的抗肿瘤效果

1.人胰腺癌异种移植小鼠模型的制作

使用HBSS调整从大日本制药株式会社(现为大日本住友制药株式会社)获取的人胰腺癌细胞株PANC-1使达到5×10⁷细胞/mL。将200μL上述细胞悬浮液(1×10⁷细胞/小鼠)移植到从日本Charles River株式会社购入的CAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB-nu/nu)小鼠的腹股沟部皮下。当肿瘤容积(体积)的平均值达到约210mm³时，将小鼠供给该实验。

2.抗体的制备和给药

使用PBS调整Ax225抗体使达到2mg/mL，以20mg/kg对人胰腺癌异种移植小鼠的腹腔内给药，每周2次，给药2周。作为阴性对照，同样地给予PBS。作为阳性对照，使用生理盐水调整Gemzar(日本Eli Lilly株式会社)使达到12mg/mL，以120mg/kg进行腹腔内给药，每周2次，给药2周。

3.抗肿瘤效果的评价

关于人胰腺癌异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效果，通过与最终给药起4天后的阴性对照组的肿瘤增殖量进行比较，作为肿瘤增殖抑制效果来计算(图3)。

肿瘤增殖抑制效果(％)＝(1-抗体处理组的肿瘤增殖量/对照组的肿瘤增殖量)×100

4.统计处理

肿瘤容积(体积)以平均值±标准偏差表示。进行统计分析时，使用SAS Preclinical Package 5.0版，利用LSD法实施对照组与处置组的比较。具有95％的可信度(*；p＜0.05)，有显著性。

5.结果

Ax225抗体抑制肿瘤的增殖，具有抗肿瘤效果(图3)。

[参考例5]测定抗AXL抗体对人胰腺癌异种移植小鼠模型的抗肿瘤效果(2)

1.人胰腺癌异种移植小鼠模型的制作

使用HBSS调整从大日本制药株式会社(现为大日本住友制药株式会社)获取的人胰腺癌细胞株PANC-1使达到5×10⁷细胞/mL。将200μL上述细胞悬浮液(1×10⁷细胞/小鼠)移植到从日本Charles River株式会社购入的CAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB-nu/nu)小鼠的腹股沟部皮下。当肿瘤容积(体积)的平均值达到约270mm³时，将小鼠供给该实验。

2.抗体的制备和给药

使用PBS调整Ax225抗体以及与Ax225抗体同样地获得且表位与Ax225抗体不同的抗AXL抗体使达到2mg/mL，以20mg/kg对人胰腺癌异种移植小鼠的腹腔内给药，每周2次，给药2周。作为阴性对照，同样地给予PBS。作为阳性对照，使用生理盐水调整Gemzar(日本Eli Lilly株式会社)使达到12mg/mL，以120mg/kg进行腹腔内给药，每周2次，给药2周。

3.抗肿瘤效果的评价

关于在人胰腺癌异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效果，通过与最终给药起4天后的阴性对照组的肿瘤增殖量进行比较，作为肿瘤增殖抑制效果来计算。

4.结果

肿瘤增殖抑制效果见图1。肿瘤增殖抑制效果(％)低于30％时记作“-”，达到30％以上时记作“+”，达到60％以上时记作“++”。

该结果显示：与FND-1结合的抗体，即使在肿瘤容积(体积)的平均值达到约270mm³时才开始给药，也显示出60％以上的TGI活性。与FND-1结合的抗AXL抗体在体内具有如此显著的抗肿瘤效果，这是通过本研究新发现的，完全出乎意料。

[实施例1]嵌合抗体的制作

<嵌合抗体表达载体的制作>

为了制作融合有人IgG1恒定区和Ax225抗体可变区的嵌合Ax225抗体，对于合成寡DNA的H链、L链分别设计两种有义链、反义链，使编码人IgG1恒定区的cDNA(H链：人γ1、L链：人κ)的5’末端与编码Ax225抗体的可变区的cDNA的3’末端融合。以下，记作H链有义融合引物(A)、H链反义融合引物(B)、L链有义融合引物(C)、L链反义融合引物(D)。混合各合成寡DNA，通过装配PCR制作编码嵌合Ax225抗体的基因。在表达通过装配PCR得到的嵌合抗体的第1阶段，使用在Ax225cDNA的H链5’末端添加有限制酶切位点和Kozak序列的有义链(E)和上述(B)、在Ax225cDNA的H链3’末端区域添加有限制酶切位点的反义链(F)和上述(A)、在Ax225cDNA的L链5’末端区域添加有限制酶切位点和Kozak序列的有义链(G)和上述(D)、在Ax225cDNA的L链3’末端区域添加有限制酶切位点的反义链(H)和上述(C)这4种组合，按照以下条件通过PCR法来实施。在98℃下加热包含附带的PCR缓冲液、dNTPs、PrimeSTAR、编码A x225H链或L链的cDNA和1合成寡DNA的反应混合物1分钟，之后实施30次由98℃下10秒、55℃下10秒、72℃下1分钟构成的PCR反应循环。第2次的PCR以通过第1次的PCR反应扩增的基因片段为模板来进行，H链使用以(E)(B)和(F)(A)的组合扩增的片段的混合物作为模板，而L链使用以(G)(D)和(H)(C)的组合扩增的片段的混合物作为模板。H链的引物使用(E)和(F)、L链的引物使用(G)和(H)。在98℃下加热1分钟后，实施30次由98℃下10秒、55℃下10秒、72℃下1分30秒构成的PCR反应循环。

利用动物细胞表达载体克隆所得的扩增片段。关于各DNA片段的核苷酸序列，使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(AppliedBiosystems)，通过DNA测序仪ABI PRISM 3730xL DNA测序仪或ABIPRISM 3700 DNA测序仪(Applied Biosystems)，按照附录说明书记载的方法进行确定。

<嵌合抗体的表达、纯化>

将来自人胚肾癌细胞的FreeStyle^TM 293-F细胞(Invitrogen)悬浮于FreeStyle^TM 293表达培养基(Invitrogen)中，以1×10⁶细胞/mL的细胞密度向125mL烧瓶(CORNING)中各接种30mL。向制备的质粒DNA混合液(总计30μg)中加入Opti-MEM I减血清培养基(Invitrogen)使达到1mL。另外，向60μL 293fectin(Invitrogen)中加入Opti-MEM I减血清培养基(Invitrogen)使达到1mL，之后与质粒DNA混合液混合。混合液在室温下静置20分钟，之后添加到细胞悬浮液中。在37℃、8％CO₂培养箱内培养3～6天。回收培养上清，之后以约2000g的离心力在室温下离心5分钟以除去细胞，再通过0.22μm滤器MILLEX(注册商标)-GV(Millipore)。各样品使用前一直在4℃下保存。使用蛋白ASepharose(GE Healthcare)从该上清中纯化抗体。使用ND-1000分光光度计(NanoDrop)测定280nm的吸光度，按照Pace等人的方法(ProteinScience(1995)4：2411-2423)算出浓度。

[实施例2]Ax225抗体的人源化

<使用Biacore测定亲和性>

为了进行人源化Ax225抗体的筛选，使用Biacore通过下述方法实施与AXL-FND1的结合活性评价。

2-1.制备人重组AXL-FND1的表达载体

人重组AXL-FND1如下构建：通过PCR由全长人AXL cDNA(O’Bryan等人，Mol.Cell.Biol.1991；11：5016-5031)(GenBank#NM_021913)扩增相当于第225位～第331位的氨基酸的区，为了表达与GST-tag的融合蛋白，将扩增产物克隆到pET-41b(+)(Novagen)中，构建pET-AXL-FND1。

利用热激法将5μL制作的各载体转化到BL21-CodonPlus(DE3)RIPL(Strategene，Cat#230280)中，用SOC培养基培养后，在含有卡那霉素的LB板上、于37度下培养一夜，之后选择集落。

2-2.人重组AXL-FND1的纯化

将制作的各集落在含有卡那霉素的3mL MagicMedia(Invitrogen)培养基中、于37度下预培养3小时，之后转移到500mL培养基中，在25度下培养一夜后集菌，然后悬浮于缓冲液A(20mM Tris-HCl(pH8)，10mM EDTA，30mM NaCl，蛋白酶抑制剂混合物(completeMini，不含EDTA(Roche)))中，之后加入溶菌酶溶液，使终浓度达到2mg/mL，在冰上培育1小时，之后加入Triton-X100使终浓度达到0.5％、以及NaCl使终浓度达到100mM，在冰上培育10分钟。用超声波破碎机破碎(30秒×5)后，以244,000×G的离心力离心20分钟，回收上清。

使用所得的上清，如下纯化人重组AXL-FND1。用PBS清洗谷胱甘肽Sepharose^TM 4B Fast Flow(GE Healthcare)，之后与可溶化的大肠杆菌上清混合，在4℃下结合一夜。回收谷胱甘肽Sepharose^TM 4B FastFlow，用30mL清洗缓冲液(20mM Tris-HCl(pH8)，500mM NaCl，1％Triton-X100，蛋白酶抑制剂混合物)重复清洗操作4次。将谷胱甘肽SeDharose^TM 4B Fast Flow转移到柱上，再用5mL清洗缓冲液进行清洗操作。使用5mL洗脱缓冲液(100mM的Tris-HCl(pH8)，20mM的谷胱甘肽，120mM的NaCl)重复洗脱操作3次，得到人重组AXL-FND1，从谷胱甘肽Sepharose^TM 4B Fast Flow中分离、洗脱。

2-3.通过使用了蛋白A的Biacore进行的亲和性分析

使用Biacore T100(BIACORE)，进行人源化AXL抗体的抗原抗体反应的动力学分析(速度論的解析)。将rec-Protein A(Zymed)(以下记作蛋白A)固定在传感器芯片上，使各种抗体与其结合，再以抗原作为分析物流经该芯片，测定抗体与抗原的相互作用。抗原使用调整成各种浓度的人重组AXL-FND1(2-2中制备。以下记作GST-FND1)。由测定中得到的传感图算出动力学参数、即结合速度常数k_a(1/Ms)和解离速度常数k_d(1/s)，根据该值算出K_D(M)。使用Biacore T100评估软件(BIACORE)算出各参数。

利用胺偶联法将约3000RU的蛋白A固定在CM5(BIACORE)上，由此制作传感器芯片。使用制作的传感器芯片，进行与蛋白A结合的抗体与GST-FND1的相互作用的动力学分析。运行缓冲液使用HBS-EP+，流速为30μL/分钟。使用运行缓冲液调整各抗体至1μg/mL，使其与蛋白A结合2分钟。用作分析物的GST-FND1用HBS-EP+调整至0.5μg/mL、2.0μg/mL。测定中，首先使各种目标人源化AXL抗体或嵌合AXL抗体或小鼠AXL抗体与蛋白A结合，再使分析物溶液与其发生相互作用达2分钟，之后切换成HBS-EP+(BIACORE)，测定解离相2分钟。解离相的测定结束后，用30μL的10mM甘氨酸-HCl(pH2.0)清洗，使传感器芯片再生。以该结合、解离、再生作为分析的一个循环。所有实验均在25℃下进行。

<各构架序列的选定>

为了进行Ax225抗体的人源化，比较Ax225抗体的可变区序列和人的种系序列。其中，作为人源化模板的FR序列汇总在表4中。作为进行了人源化的可变区，H链以表4记载的包含FR1、FR2、FR3(2)、FR4的序列作为H0(SEQ ID NO：2)。L链以包含FR1、FR2、FR3、FR4的序列作为L0(SEQ ID NO：65)。需要说明的是，CDR、FR的确定按照Kabat编号来进行。

需要说明的是，据报道，在H链FR3的序列中，Kabat编号第94位的残基对CDR3的立体结构有重大影响(Morea等人，J.Mol.Biol.1998；275：269-294)。虽然Ax225的该残基为甘氨酸(G)(SEQ ID NO：57)，但如表4的FR3(1)(SEQ ID NO：109)所示，在进行人源化时选择的种系序列中该残基为精氨酸(R)，由此可知：通过人源化该残基被取代成精氨酸，预测其活性降低。于是，在H链第94位残留有Ax225的序列，使用所述残基为甘氨酸的FR3(2)的序列(SEQ ID NO：58)。

[表4]

<人源化Ax225可变区H0和L0的制作>

为了制作在人源化模板序列的FR区中移植有Ax225抗体的CDR区的人源化Ax225抗体的可变区，分别设计H链、L链的合成寡DNA。混合各合成寡DNA，通过装配PCR制成编码人源化Ax225的可变区的基因，以H链为H0、L链为L0。装配PCR使用KOD-Plus(TOYOBO)来进行，按照以下条件通过PCR法来实施。将包含附带的PCR缓冲液、dNTPs、MgSO₄、KOD-Plus和10pmol合成寡DNA的反应混合物在94℃下加热5分钟后，进行2次由94℃下2分钟、55℃下2分钟、68℃下2分钟构成的PCR反应循环，之后添加10pmol在可变区的5’末端添加有限制酶切位点和Kozak序列的引物和10pmol在3’末端添加有限制酶切位点的引物，进行35次由94℃下30秒、55℃下30秒、68℃下1分钟构成的PCR反应循环，得到扩增片段。利用动物细胞表达载体克隆所得的扩增片段，将其与恒定区连接。

这里，作为来自IgG抗体的H链C末端序列的异质性，有人报道了：由C末端氨基酸的赖氨酸残基的缺失和C末端的2个氨基酸甘氨酸和赖氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化(Anal Biochem.2007Jan 1；360(1)：75-83.)。作为降低上述异质性的方法，已知有使H链C末端的2个氨基酸、即EU编号第446位的甘氨酸和第447位的赖氨酸缺失的方法(专利文献4；WO2009/041613)。即使在人源化Ax225抗体中，也希望不存在来自H链C末端序列的异质性，所以使用人IgG1的EU编号第446位的甘氨酸和第447位的赖氨酸缺失的IgG1序列(SEQ ID NO：106)作为恒定区序列。另一方面，L链使用天然型人κ链(SEQ ID NO：107)作为恒定区序列。

<找出维持活性所必需的氨基酸残基>

如上所述，预测存在于Ax225的H链中的Kabat编号第94位的甘氨酸在与AXL的结合中发挥重要作用。

于是，为了评价该残基对活性的影响，制作将嵌合抗体H链(chH：SEQ ID NO：1)的Kabat编号第94位的残基取代成作为人种系序列的精氨酸的修饰体(H6：SEQ ID NO：108)。突变体的制作通过进行使用PCR的装配PCR来进行。具体而言，合成根据包含修饰位点的氨基酸序列设计的有义链和反义链的寡DNA。分别组合包含修饰位点的有义链寡DNA和与***有将被修饰的基因的载体结合的反义链寡DNA、包含修饰位点的反义链寡DNA和与***有将被修饰的基因的载体结合的有义链寡DNA，使用PrimeSTAR(TAKARA)进行PCR，由此制作5’末端侧和3’末端侧的2个包含修饰位点的片段。通过装配PCR连接这2个片段，由此制作各突变体。将所制作的突变体***到可以在动物细胞中表达***基因的表达载体中，所得表达载体的核苷酸序列通过本领域技术人员公知的方法来确定。

按照实施例1的方法进行chH/L0(H链chH/SEQ ID NO：1、L链L0/SEQ ID NO：65)和H6/L0(H链H6/SEQ ID NO：108、L链L0/SEQ IDNO：65)的表达和纯化。需要说明的是，两者中除chH和H6的Kabat编号第94位以外的序列完全相同，可以只评价该残基的影响。

使用Biacore进行的chH/L0和H6/L0的亲和性评价结果见表5。与chH/L0相比，确认到H6/L0的亲和性大幅降低。由此显示：为了Ax225抗体和人源化Ax225抗体与AXL-FND1结合，优选H链Kabat编号第94位的残基为甘氨酸，精氨酸是不适合的。

[表5]

<亲和性提高的H链可变区H9的制作>

虽然H0/L0的H链即H0(SEQ ID NO：2)的Kabat编号第73位的氨基酸残基为苏氨酸(T)，但根据立体结构模型进行考察时，通过将该残基取代成作为Ax225抗体的序列的天冬酰胺(N)，期待可以提高亲和性。

于是，将存在于H0(SEQ ID NO：2)的FR3中的Kabat编号第73位的苏氨酸(T)取代成天冬酰胺(N)，制作H9(SEQ ID NO：3)。突变体的制作通过进行使用了PCR的装配PCR来进行。具体而言，首先，合成根据包含修饰位点的氨基酸序列设计的有义链和反义链的寡DNA。分别组合包含修饰位点的有义链寡DNA和与***有将被修饰的基因的载体结合的反义链寡DNA、包含修饰位点的反义链寡DNA和与***有将被修饰的基因的载体结合的有义链寡DNA，使用PrimeSTAR(TAKARA)进行PCR，从而制作5’末端侧和3’末端侧的2个包含修饰位点的片段。通过装配PCR连接这2个片段，由此制作各突变体。将所制作的突变体***到可以在动物细胞中表达***基因的表达载体中，所得表达载体的核苷酸序列通过本领域技术人员公知的方法来确定。抗体的制作和纯化按照实施例1的方法进行。

按照实施例2记载的方法进行H9/L0的亲和性测定，结果见表6。与H0/L0相比，确认到H9/L0的亲和性提高。

[表6]

[实施例3]改变等电点的突变位点的鉴定

<突变位点的鉴定>

作为控制抗体的血浆中半衰期的方法之一，已知有修饰暴露在抗体分子表面的氨基酸残基，控制抗体分子表面电荷的方法(专利文献2和专利文献3)。具体而言，已知通过降低抗体所具有的等电点(pI)的值，可以延长抗体的血浆中半衰期。反之，已知通过提高抗体的等电点，血浆中半衰期缩短，抗体的组织分布性提高(非专利文献28和29)。

根据以上所述，等电点发生变化的人源化Ax225抗体通过延长血浆中半衰期或提高组织分布性，可以期待更强的抗肿瘤活性。于是，进行在不影响人源化Ax225抗体的与抗原的结合活性或其立体结构的情况下，通过调节抗体分子表面的电荷可以控制抗体的药物动力学的氨基酸残基的鉴定。具体而言，对于H9/L0(H链H9/SEQ ID NO：3、L链L0/SEQ ID NO：65)的可变区，利用Biacore进行的不使亲和性大幅降低、而可以改变等电点的突变位点的探索。

使用人源化Ax225抗体的立体结构模型，筛选不大幅降低与AXL的结合、而使可变区的等电点发生变化的突变位点，结果发现了几个突变位点。H链、L链中降低等电点的修饰见表7、表8(用于降低H链的等电点的修饰位点)和表9(用于降低L链的等电点的修饰位点)；H链、L链中提高等电点的修饰见表10、表11(用于提高H链的等电点的修饰位点)和表12(用于提高L链的等电点的修饰位点)。各修饰体的制作、纯化按照实施例1中记载的方法进行。

利用Biacore进行的各修饰体的亲和性评价按照实施例2中记载的方法进行。如表13～表15所示，与H9/L0的亲和性相比，各修饰体的亲和性没有出现大幅降低。需要说明的是，各修饰体的H链和L链的SEQ ID NO也见表13～表15。

[表7]

[表8]

表8是表7的延续。

[表9]

[表10]

[表11]

表11是表10的延续。

[表12]

[表13]

[表14]

[表15]

[实施例4]导入抑制脱酰胺化反应的突变

尽管药物中使用的抗体是由来自单一的抗体产生细胞的克隆得到的单克隆抗体，但也存在异质性。已知这样的抗体的异质性源自氧化、脱酰胺化等修饰，在长期保存中或暴露于热应力、光应力这样的应力条件下异质性会增加(参考文献：Heterogeneity of MonoclonalAntibodies：Journal of pharmaceutical sciences，第97卷，No.7，2426-2447)。但是，在开发抗体作为药物时，其蛋白的理化性质、其中均匀性和稳定性极为重要，希望降低目标物质的异质性，且尽可能是单一物质。

脱酰胺化反应是指，在天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)的侧链中非酶解引起的、存在于天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链中的酰胺变成羧酸的反应。保存中发生的脱酰胺化反应源自上述异质性，所以希望尽可能地抑制异质性。另外，据报道脱酰胺化反应特别容易在天冬酰胺(N)和甘氨酸(G)相邻的位点(…NG…)发生(Geiger等人、J.Biol.Chem.1987；262：785-794)。由于L0(SEQ ID NO：65)的CDR1中存在天冬酰胺(N)与甘氨酸(G)相邻的序列，所以认为通过该位点的氨基酸取代可以抑制脱酰胺化反应。

通过氨基酸取代来抑制脱酰胺化反应具体如下进行。认为通过将存在于L0(SEQ ID NO：65)的Kabat编号29位的甘氨酸(G)取代成丙氨酸(A)可以抑制脱酰胺化反应。于是，制作将存在于L0(SEQ ID NO：65)的Kabat编号29位的甘氨酸(G)取代成丙氨酸(A)的L36(SEQ IDNO：81)。同样，认为通过将存在于L11(SEQ ID NO：71)的Kabat编号29位的甘氨酸(G)取代成丙氨酸(A)可以抑制脱酰胺化反应。于是，制作将存在于L11(SEQ ID NO：71)的Kabat编号29位的甘氨酸(G)取代成丙氨酸(A)的L21(SEQ ID NO：83)。使用上述修饰体制作H9/L36(H链：H9/SEQ ID NO：3、L链：L36/SEQ ID NO：81)、H36/L36(H链：H36/SEQ ID NO：22、L链：L36/SEQ ID NO：81)、H32/L21(H链：H32/SEQ ID NO：18、L链：L21/SEQ ID NO：83)。需要说明的是，这些修饰体的制作、纯化按照实施例1中记载的方法进行。

按照实施例2记载的方法实施所制作的修饰体的亲和性测定。结果见表16。与H9/L0相比，所有修饰体的亲和性均没有显著降低，认为可以抑制脱酰胺化反应。

[表16]

[实施例5]发现提高抗体表达量的突变位点

作为制备抗体药物的方法，通常采用使用哺乳动物细胞构建产生目标抗体的稳定表达株的方法。这里，稳定表达株所产生的抗体的表达量是关系到抗体药物的生产成本的重要要素，所以希望抗体的表达量足够高。

于是，为了评价Ax225抗体的人源化对抗体表达量的影响，按照实施例1的方法表达下述这4种抗体：嵌合抗体chH/chL(H链chH/SEQ ID NO：1、L链chL/SEQ ID NO：64)、仅H链进行了人源化的H0/chL(H链H0/SEQ ID NO：2、L链chL/SEQ ID NO：64)、仅L链进行了人源化的chH/L0(H链chH/SEQ ID NO：1、L链L0/SEQ ID NO：65)、两条链均进行了人源化的H0/L0(H链H0/SEQ ID NO：2、L链L0/SEQ ID NO：65)。

<使用Biacore-Q进行培养上清中的抗体浓度定量>

使用Biacore-Q(BIACORE)，按照以下方法进行培养上清中的抗体浓度的定量。

利用胺偶联法将约5000RU的重组蛋白A固定在CM5(GEHealthcare)上，由此制作传感器芯片。运行缓冲液使用HBS-EP、再生用缓冲液使用10mM的甘氨酸-HCl(pH1.5)，流速为5μL/分钟。为了制作标准曲线，将利用实施例1的方法表达、纯化的嵌合抗体或人源化抗体调整成2000、1000、500、250、125、62.5ng/mL的各浓度。

回收的培养上清用HBS-EP进行适当稀释，调整成与标准曲线上正好吻合的抗体浓度。将调整的培养上清和用于制作标准曲线的样品供给Biacore-Q，通过利用BIACORE Q Control Software on COM1进行测定和分析，算出培养上清中的抗体浓度。

结果发现：通过将L链人源化，Ax225抗体的表达量提高2～3倍(图4)。

<提高抗体表达量的突变位点的鉴定>

由立体结构模型推测：存在于L链FR2中的、Kabat编号42位的残基对表达量有很大贡献。具体而言，推测通过将Kabat编号42位的残基取代成赖氨酸(K)可以提高表达量。需要说明的是，该推测与下述事实并不矛盾：嵌合抗体的L链(chL/SEQ ID NO：64)的Kabat编号42位的残基为谷氨酰胺(Q)，而人源化抗体的L链(L0/SEQ ID NO：65)的该残基为赖氨酸(K)。

这里，为了评价L链的Kabat编号42位的残基对表达量的影响，按照实施例1记载的方法进行H32/L11(H链H32/SEQ ID NO：18、L链L11/SEQ ID NO：71)和H32/L12(H链H32/SEQ ID NO：18、L链L12/SEQ ID NO：72)的表达，进行培养上清中的抗体浓度的测定。这里，使用的两种L链即L11和L12的差异在于：在L11中上述的Kabat编号第42位的残基为赖氨酸(K)，而在L12中该残基被取代成谷氨酸(E)。需要说明的是，两者中除Kabat编号第42位以外的序列完全相同，可以只评价该残基的影响。

结果见图5。确认到：Kabat编号第42位为赖氨酸的H32/L11与该残基为谷氨酸的H32/L12相比表达量提高约3倍。由此显示：通过将Kabat编号第42位的残基取代成赖氨酸，可以大幅提高表达量(图5)。

[实施例6]测定人源化Ax225抗体对人胰腺癌异种移植小鼠模型的抗肿瘤效果(1)

6-1.人胰腺癌异种移植小鼠模型的制作

从大日本制药株式会社(现为大日本位友制药株式会社)获取的人胰腺癌细胞株PANC-1用HBSS调整成2.5×10⁷细胞/mL。将200μL上述细胞悬浮液(5×10⁶细胞/小鼠)接种在从日本Charles River株式会社购入的CAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB-nu/nu)小鼠的腹股沟部皮下。当肿瘤体积达到约240mm³时，将小鼠供给该实验。

6-2.抗体的制备和给药

用PBS调整抗体使达到1mg/mL，以10mg/kg对人胰腺癌异种移植小鼠的腹腔内给药，每周1次，给药2周。作为阴性对照，同样地给予PBS。

6-3.抗肿瘤效果的评价

关于在人胰腺癌异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效果，通过与最终给药起7天后的阴性对照组的肿瘤增殖量进行比较，作为肿瘤增殖抑制效果来计算。

6-4.统计处理

肿瘤体积以平均值±标准偏差表示。统计分析中，使用SASPreclinical Package 5.0版，利用LSD法实施对照组和处置组的比较。具有95％的可信度(*；p＜0.05)，有显著性。

6-5.结果

如图6所示，人源化Ax225抗体(H9/L0)与小鼠抗体和嵌合抗体一样，与PBS给药组相比显示出显著的肿瘤增殖抑制效果。

[实施例7]测定人源化抗AXL抗体对人胰腺癌异种移植小鼠模型的抗肿瘤效果(2)

7-1.人胰腺癌异种移植小鼠模型的制作

从大日本制药株式会社(现为大日本住友制药株式会社)获取的人胰腺癌细胞株PANC-1用HBSS调整成2.5×10⁷细胞/mL。将200μL上述细胞悬浮液(5×10⁶细胞/小鼠)接种在从日本Charles River株式会社购入的CAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB-nu/nu)小鼠的腹股沟部皮下。当肿瘤体积达到约200mm³时，将小鼠供给该实验。

7-2.抗体的制备和给药

用组氨酸缓冲液(20mM的组氨酸-HCl，150mM的NaCl，pH 6.0)调整抗体使达到1mg/mL，以10mg/kg对人胰腺癌异种移植小鼠的尾静脉内给药，每周1次，给药2周。作为阴性对照，同样地给予组氨酸缓冲液。

7-3.抗肿瘤效果的评价

关于在人胰腺癌异种移植小鼠模型中的抗肿瘤效果，通过比较最终给药起7天后的各抗体给药组的肿瘤体积和阴性对照组的肿瘤体积，来比较肿瘤增殖抑制效果。

7-4.统计处理

7-5.结果

如图7所示，与组氨酸缓冲液给药组相比，抗体给药组显示出显著的肿瘤增殖抑制效果。

产业实用性

本发明人成功地获得了人源化抗AXL抗体。本发明的抗AXL抗体具有高的抗肿瘤活性，作为抗癌药和癌症的诊断药是有效的。

Claims

1.以下(1)～(6)中任一项所述的、识别AXL的FND1结构域的抗体：

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：2即H0记载的重链可变区；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：65即L0记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

2.以下(1)～(6)中任一项所述的、识别AXL的FND1结构域的人源化抗体：

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：2即H0记载的重链可变区；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：65即L0记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

3.权利要求1或2所述的抗体，其中，重链可变区中Kabat编号94位的氨基酸残基为甘氨酸。

4.权利要求1～3中任一项所述的抗体，其中，在重链可变区的氨基酸序列中，具有下述氨基酸残基中的至少一个残基：

(2)重链可变区中Kabat编号40位的氨基酸残基为脯氨酸

(3)重链可变区中Kabat编号41位的氨基酸残基为精氨酸

(5)重链可变区中Kabat编号44位的氨基酸残基为精氨酸

(6)重链可变区中Kabat编号48位的氨基酸残基为异亮氨酸

(8)重链可变区中Kabat编号62位的氨基酸残基为谷氨酸

(9)重链可变区中Kabat编号64位的氨基酸残基为谷氨酰胺

(10)重链可变区中Kabat编号65位的氨基酸残基为天冬氨酸

(11)重链可变区中Kabat编号73位的氨基酸残基为天冬酰胺

(12)重链可变区中Kabat编号105位的氨基酸残基为谷氨酸或精氨酸。

5.权利要求1～3中任一项所述的抗体，其中，在重链可变区的氨基酸序列中，具有下述氨基酸残基中的至少一个残基：

(1)重链可变区中Kabat编号41位的氨基酸残基为精氨酸

(2)重链可变区中Kabat编号43位的氨基酸残基为谷氨酰胺

(3)重链可变区中Kabat编号44位的氨基酸残基为精氨酸

(4)重链可变区中Kabat编号61位的氨基酸残基为精氨酸

(5)重链可变区中Kabat编号73位的氨基酸残基为天冬酰胺。

6.权利要求1～5中任一项所述的抗体，其中，在轻链可变区的氨基酸序列中，具有下述氨基酸残基中的至少一个残基：

(1)轻链可变区中Kabat编号17位的氨基酸残基为精氨酸

(2)轻链可变区中Kabat编号24位的氨基酸残基为谷氨酰胺

(3)轻链可变区中Kabat编号27位的氨基酸残基为谷氨酸或精氨酸

(4)轻链可变区中Kabat编号29位的氨基酸残基为丙氨酸

(6)轻链可变区中Kabat编号45位的氨基酸残基为赖氨酸

(7)轻链可变区中Kabat编号100位的氨基酸残基为精氨酸

(8)轻链可变区中Kabat编号104位的氨基酸残基为缬氨酸

(9)轻链可变区中Kabat编号107位的氨基酸残基为谷氨酸。

7.权利要求1～5中任一项所述的抗体，其中，在轻链可变区的氨基酸序列中，具有下述氨基酸残基中的至少一个残基：

(1)轻链可变区中Kabat编号17位的氨基酸残基为精氨酸

(2)轻链可变区中Kabat编号24位的氨基酸残基为谷氨酰胺

(3)轻链可变区中Kabat编号27位的氨基酸残基为精氨酸

(4)轻链可变区中Kabat编号29位的氨基酸残基为丙氨酸

(5)轻链可变区中Kabat编号45位的氨基酸残基为赖氨酸

(6)轻链可变区中Kabat编号100位的氨基酸残基为精氨酸

(7)轻链可变区中Kabat编号104位的氨基酸残基为缬氨酸

(8)轻链可变区中Kabat编号107位的氨基酸残基为谷氨酸。

8.权利要求1～5中任一项所述的抗体，该抗体至少具有以下的任一个重链可变区：

(15)重链可变区，其中包含具有SEQ ID NO：33记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：48记载的氨基酸序列的CDR2、以及具有SEQ ID NO：49记载的氨基酸序列的CDR3。

9.权利要求1～7中任一项所述的抗体，该抗体选自以下的(1)～(25)：

10.权利要求1或2所述的抗体，该抗体具有SEQ ID NO：2～32中任一个记载的重链可变区和SEQ ID NO：65～83中任一个记载的轻链可变区。

11.权利要求1所述的抗体，该抗体是具有SEQ ID NO：1记载的重链可变区和SEQ ID NO：64记载的轻链可变区、且具有来自人抗体的恒定区的嵌合抗体；或者该抗体是在该嵌合抗体中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或***而得到的抗体，且与该嵌合抗体具有同等活性。

12.权利要求1～11中任一项所述的抗体，其中，在轻链可变区的氨基酸序列中，Kabat编号42位的氨基酸残基为赖氨酸。

13.药物组合物，其以权利要求1～12中任一项所述的抗体作为有效成分。

14.抗癌药，其以权利要求1～12中任一项所述的抗体作为有效成分。

15.权利要求14所述的抗癌药，其中，癌症为胰脏癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤、大肠癌、***癌、黑素瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫平滑肌瘤、甲状腺癌、干细胞癌、乳癌、膀胱癌、肾癌、神经胶质瘤、成神经细胞瘤或食道癌。

16.权利要求14所述的抗癌药，其中，癌症为神经胶质瘤、胃癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌、胰腺癌或乳癌。

17.权利要求14所述的抗癌药，其中，癌症为胰腺癌或乳癌。