KR20070035482A - 인터로킨-6 안타고니스트를 활성성분으로 함유하는내이장해 치료제 - Google Patents

Abstract

IL-6 안타고니스트, 바람직하기는 항-IL-6R 항체를 활성성분으로 함유하는 내이장해 치료 및/또는 예방제.

내이장해 치료제, IL-6 안타고니스트, 감각신경성 난청

Description

인터로킨-6 안타고니스트를 활성성분으로 함유하는 내이장해 치료제 {THERAPEUTIC AGENT FOR AURIS INTERNA DISORDER CONTAINING IL-6 ANTAGONIST AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은, 내이장해(內耳障害)에 대한 치료 및/또는 예방제에 관한 것이다. 본 발명의 치료 및/또는 예방제는, 인터로킨(interleukin)-6(IL-6) 안타고니스트를 포함해서 이루어진다.

난청 중 미로성(달팽이관성) 또는 후미로성(後迷路性; 제8뇌신경성) 때문에 생기는 난청을 감각신경성 난청이라 부른다. 감각신경성 난청의 원인으로는 여러 가지 가 있는바, 예를 들면 메니에르병(Meniere's disease), 약물성 내이장해(아미노글리코시드계나 시스프라틴 등의 항암제에 의한 내이장해), 바이러스성 내이염, 화농성 내이염, 측두골 골절, 청신경 종양이 포함된다. 또한 돌발성 난청, 노인성 난청, 소음난청도 감각신경성 난청에 포함된다. 소음난청은, 체인 톱, 내연기관, 중기, 총, 비행기로부터 발생하는 큰 소음에 의해 내이가 손상되는 결과가 야기되고, 사격이나 스노 모빌, 비행기 여행, 록 콘서트 등과도 관련된다.

감각신경성 난청의 원인으로는 여러 가지를 생각할 수 있으나, 내이의 급성면역반응이 영속적인 청력저하(hearing loss)를 야기한다는 것이 알려져 있 다(Satoh H et al., Laryngoscope. 2002, Sep;112(9):1627-34). KLH(keyhole limpet hemocyanin)을 내이 또는 지주막 하에 주입함에 따라 일어난 달팽이관에서의 면역반응에서는, TNF-α 및 IL-lβ가 발현되어 있어서, TNF-α가 달팽이관 질환을 악화시킨다는 것 및, TNF-α 저해제에 의해 청력 저하를 부분적으로 억제할 수 있다는 것이 보고되어 있다(동 문헌). 그러나, 지금까지는 감각신경성 난청에 대한 IL-6의 기여에 대해서는 보고된 바가 없다.

비-특허문헌 1; Satoh H. et al., Laryngoscope. 2002 Sep; 112(9):1627-34.

본 발명의 목적은 내이장해 치료 및/또는 예방을 위한 신규한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 예의 연구를 한 결과, IL-6이 감각신경성 난청의 병인에 관여하고, 또 IL-6 안타고니스트가 감각신경성 난청에 치료 효과를 갖는다는 것을 알게 되었다.

따라서, 본 발명은 IL-6 안타고니스트를 활성성분으로 함유하는 내이장해 치료 및/또는 예방제를 제공한다.

상기 내이장해에는, 예를 들면 감각신경성 난청으로서, 이 감각신경성 감청은 예를 들어 메니에르병, 약물성 내이장해, 바이러스성 내이염, 화농성 내이염, 측두골 골절 또는 청신경 종양에 기인하는 감각신경성 난청이거나, 또는 돌발성 난청, 노인성 난청 또는 소음난청이다.

선택적으로, 상기 내이장해는 예를 들면 전정 장해로서, 이 전정 장해는 예를 들면 메니에르병, 전정(前庭) 신경염 또는 약물성 내이장해에 기인하는 전정 장해이다.

상기 IL-6 안타고니스트는, 예를 들면 IL-6 수용체에 대한 항체이다. 이 IL-6 수용체 항체는 예를 들면 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체로서, 바람직하기는 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체, 또는 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체일 수 있다. 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는, 예를 들면 PM-1 항체이고, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는, 예를 들면 MR16-1 항체이다.

상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 바람직하기는 재조합 항체이다. 이 재조합 항체는, 예를 들면 키메라항체, 인간형화 항체 또는 인간항체이다. 이 인간형화 항체는 예를 들면 인간형화 PM-1 항체이다.

본 발명은 또, 다음과 같이 기재할 수 있다.

[1] 내이장해 치료 및/또는 예방제를 제조하기 위한 IL-6 안타고니스트의 용도.

[2] 상기 내이장해가 감각신경성 난청인 [1]에 기재된 용도.

[3] 상기 감각신경성 난청이 메니에르병, 약물성 내이장해, 바이러스성 내이염, 화농성 내이염, 측두골 골절 또는 청신경 종양에 기인하는 감각신경성 난청인 [2]에 기재된 용도.

[4] 상기 감각신경성 난청이 돌발성 난청, 노인성 난청 또는 소음난청인 [2]에 기재된 용도.

[5] 상기 내이장해가 전정 장해인 [1]에 기재된 용도.

[6] 상기 전정 장해가 메니에르병, 전정신경염 또는 약물성 내이장해에 기인하는 전정 장해인 [5]에 기재된 용도.

[7] 상기 IL-6 안타고니스트가 IL-6 수용체에 대한 항체인 [1] ~ [6] 중 어느 하나에 기재된 용도.

[8] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 [7]에 기재된 용도.

[9] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 [8]에 기재된 용도.

[10] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 [8]에 기재된 용도.

[IL] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 재조합 항체인 [7] ~ [10] 중 어느 하나에 기재된 용도.

[12] 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 PM-1 항체인 [9]에 기재된 용도.

[13] 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 MR16-1 항체인 [l0]에 기재된 용도.

[14] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간 항체인 [7] ~ [13] 중 어느 하나에 기재된 용도.

[15] 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-l 항체인 [14]에 기재된 용도.

본 발명은 또 아래와 같이 기재될 수 있다.

[1] IL-6 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하는 내이장해의 치료 및/또는 예방방법.

[2] 상기 내이장해가 감각신경성 난청인 [1]에 기재된 방법.

[3] 상기 감각신경성 난청이 메니에르병, 약물성 내이장해, 바이러스성 내이염, 화농성 내이염, 측두골 골절 또는 청신경 종양에 기인하는 감각신경성 난청인 [2]에 기재된 방법.

[4] 감각신경성 난청이 돌발성 난청, 노인성 난청 또는 소음난청인 [2]에 기재된 방법.

[5] 상기 내이장해가 전정 장해인 [1]에 기재된 방법.

[6] 상기 전정 장해가 메니에르병, 전정신경염 또는 약물성 내이장해에 기인하는 전정 장해인 [5]에 기재된 방법.

[7] 상기 IL-6 안타고니스트가 IL-6 수용체에 대한 항체인 [l] ~ [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[8] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 [7]에 기재된 방법.

[9] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 [8]에 기재된 방법.

[10] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 [8]에 기재된 방법.

[11] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 재조합 항체인 [7] ~ [10] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[12] 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 PM-1 항체인 [9] 에 기재된 방법.

[13] 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체가 MR16-1 항체인 [10]에 기재된 방법.

[14] 상기 IL-6 수용체에 대한 항체가 IL-6 수용체 l에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간 항체인 [7] ~ [13] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[15] 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체가 인간형화 PM-1 항체인 [14]에 기재된 방법.

도 1은 실시예 1의 결과를 나타낸 것으로, 3종류의 주파수에 의해 만든 마우스의 난청모델에서, 본 발명의 항-IL-6R 인간형화 항체(MR16-1) 투여군 및 마우스 면역글로불린 G 투여 대조군에 대한 청력 역치(hearing threshold level)의 저하(dB)를 나타낸 그래프이다.

도 2는 SD 래트에 음향부하를 행한 후의 달팽이관에서의, 여러 종류의 시토킨의 시간에 따른 변화를 나타내는, 실시예 2의 RT-PCR의 결과를 나타내는 전기영동도이다.

도 3은 SD 래트에 음향부하를 행한 후의 달팽이관에서의, TNFα의 시간에 따 른 변화를 나타내는, 실시예 2에서의 정량적 RT-PCR의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 SD 래트에 음향부하를 행한 후의 달팽이관에서의, IL-6의 시간에 따른 변화를 나타내는, 실시예 2에서의 정량적 RT-PCR의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 SD 래트에 음향부하를 행한 후의 달팽이관에서의, IL-1β의 시간에 따른 변화를 나타내는, 실시예 2에서의 정량적 RT-PCR의 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 실시예 2에서, 음향부하 6시간 후의 SD 래트의 조직에서, Vectastein ABC kit를 사용해서 항-마우스 IL-6 항체를 이용하여 IL-6을 검출한 결과를 나타낸 도면대용 사진이다.

도 7은 실시예 2에서, 음향부하 6시간 후의 SD 래트의 조직에서, Vectastein ABC kit를 사용해서 항-마우스 IL-6 항체를 이용하여 IL-6을 검출한 결과를 나타낸 도면대용 사진이다.

도 8은 C57BL/6J 마우스에 124dB의 과대음을 2시간 부하한 후, 본 발명의 MR16-1(참고예 4에서 제조한 항-IL-6 R 인간형화 항체) 또는 래트 IgG(대조)를 투여한 후의 내이 코르티 기관에서의 총 STAT3, Erk 및 Akt, 및 인산화 STAT3, Erk 및 Akt의 발현을 측정한 결과를 나타낸 전기영동도이다.

본 발명의 치료제는, 달팽이관(cochlea)의 조직장해, 즉 내이성 감각신경성 난청에서의 청력 저하의 진행 억제에 효과를 갖는다. 특히 본 발명의 치료제는, 감각신경성 난청에서의 고주파수 영역의 청력 저하 억제에 효과를 갖는다. 감각신경성 난청과 마찬가지로 유모세포(hair cell)의 장해와 관련되는 질환으로는 전정기관 장해를 들 수 있다. 감각신경성 난청에서는 달팽이관이 장해가 되어 있는 것으로, 달팽이관과 전정기관은 다른 감각을 담당하고 있으나, 구조상은 어느 쪽이나 유모세포, 지지세포가 림프액에 싸여 유사한 조직구축과 그의 물리적 특성으로 생리적 기능을 담당하고 있다. 즉, 유모세포가 음의 진동을 감지했는가 또는 가속에 의한 림프액의 움직임을 감지했는가의 차이를 근거로 하여 다른 감각을 유사한 메카니즘으로 감지하는 구조로 되어 있다. 달팽이관 및 전정기관의 장해는 모두 기능저하로 연결되고, 약제에 대한 감수성도 극히 유사하다. 따라서, 본 발명의 치료제는 감각신경성 난청, 전정기관 장해 등의 내이장해의 치료에 유용하다.

IL-6은 B 세포자극인자 2 (BSF2) 또는 인터페론 β2로도 불리는 시토킨(cytokine)이다. IL-6은, B-임파구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되었고(Hirano, T. et al., Nature(1986) 324, 73-76), 그 후 여러 가지 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 시토킨인 것이 밝혀졌다(Akira, S. et al., Adv. in Immunology(1993) 54, 1-78). IL-6은 T-임파구계 세포의 성숙을 유도한다는 것이 보고되어 있다(Lotz, M. et al., J. Exp. Med.(1988) 167, 1253-1258).

IL-6은 세포상에서 2종의 단백질을 매개로 그 생물학적 활성을 전달한다. 하나는 IL-6이 결합하는 분자량 약 80kD의 리간드결합성 단백질의 IL-6 수용체이다(Taga, T. et al., J. Exp. Med.(1987) 166, 967-981; Yamasaki, K. et al., Science(1987) 241, 825-828). IL-6 수용체는 세포막을 관통해서 세포막 상에 발현하는 막결합형 외에, 주로 그 세포외 영역으로 된 가용성 IL-6 수용체로도 존재한다.

또 하나는 비-리간드 결합성 시그널 전달과 관계되는 분자량 약 130kD의 막단백질 gp130이다. IL-6과 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성한 후, gp130와 결합함으로써 IL-6의 생물학적 활성이 세포 내로 전달되도록 한다(Taga, T. et al., Cell(1989) 58, 573-581).

IL-6 안타고니스트는 IL-6의 생물학적 활성의 전달을 저해하는 물질이다. 지금까지는 IL-6에 대한 항체(항-IL-6 항체), IL-6 수용체에 대한 항체(항-IL-6 수용체 항체), gp130에 대한 항체(항-gp130 항체), IL-6 개변체, IL-6 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드 등이 알려져 있다.

항-IL-6 수용체 항체에 관해서는 몇 가지 보고가 있다(Novick, D. et a1., Hybridoma(1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. et al, Hybridoma(1993) 12, 621-630, 국제특허출원공개 WO95-09873호, 프랑스 특허출원 FR 2694767호, 미국특허 US521628호). 그들 중 하나의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)인, 마우스항체 PM-1(Hirata, Y. et a1., J. Immunology(1989) 143, 2900-2906)을 인간항체에 이식함으로써 얻어진 인간형화 PM-1 항체가 알려져 있다(국제특허출원공개 WO92-19759호).

상기 IL-6 안타고니스트는 바람직하기는 IL-6 수용체에 대한 항체로서, 보다 더 바람직하기는 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날(monoclonal) 항체 또는 마우 스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체이다. 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체로는 PM-1 항체가 예시될 수 있고, 또 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체로는 MR 16-1 항체를 들 수 있다. 상기의 항체는 바람직하기는, 키메라항체, 인간형화 항체 또는 인간항체로서, 예를 들면 인간형화 PM-1 항체이다. 인간형화 항체는, 인간화 항체 또는 재구성(reshaped) 인간 항체로도 불리는 개변 항체(altered antibody)이다.

본 발명에서 사용되는 IL-6 안타고니스트는 내이장해의 치료 및/또는 예방을 위해 유용한 것이라면, 그 유래나 종류 및 형상을 묻지 않는다.

IL-6 안타고니스트는, IL-6에 의한 시그널 전달을 차단하고, IL-6의 생물학적 활성을 저해하는 물질이다. IL-6 안타고니스트는, 바람직하기는 IL-6, IL-6 수용체 및 gp130의 어느 결합에 대한 저해작용을 가진 물질이다. IL-6 안타고니스트로는, 예를 들면 항-IL-6 항체, 항-IL-6 수용체 항체, 항-gp130 항체, IL-6 개변체, 가용성 IL-6 수용체 개변체 또는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드 및, 이들과 동일한 활성을 나타내는 저분자량 물질을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항-IL-6 항체는, 공지의 수단을 이용해서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항-IL-6 항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체로는, 하이브리도마에 의해 생산되는 것 및 유전자공학적 수법으로 항체유전자를 포함한 발현벡터로 형질변환된 숙주에 의해 생산되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6과 결합함으로써, IL-6의 IL-6 수용체에의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성 의 세포 내로의 전달을 차단하게 된다.

이와 같은 항체로는, MH166(Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol.(1988) 18, 951-956)이나 SK2 항체(Sato, K. et al.,제 21회 일본면역학회 총회 학술기록(1991) 21, 166) 등을 들 수 있다.

항-IL-6 항체생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지기술을 사용하여 하기와 같이 만들 수 있다. 즉, IL-6을 감작항원으로 사용하고, 이를 통상적인 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상적인 세포융합법으로 공지의 모(parent)세포와 융합시켜, 통상적인 스크리닝법으로 모노클로날 항체-생산세포를 스크리닝함으로써 만들 수 있다.

구체적으로는, 항-IL-6 항체는 다음과 같은 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체취득의 감작항원으로 사용되는 인간 IL-6은, Eur. J. Biochem(1987) 168, 543-550, J. Immunol.(1988) 140, 1534-1541, 또는 Argic. Biol. Chem.(1990) 54, 2685-2688에 개시된 IL-6 유전자/아미노산 배열을 이용함으로써 얻어진다.

IL-6의 유전자배열을 공지의 발현벡터계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질변환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양 상청 중에서 목적하는 IL-6 단백질을 공지된 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6 단백질을 감작항원으로 사용할 수 있다. 또, IL-6 단백질과 다른 단백질과의 융합단백질을 감작항원으로 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항-IL-6 수용체 항체는, 공지의 수단을 이용해서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항-IL-6 수용체 항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유 래의 모노클로날 항체로는, 하이브리도마에 의해 생산되는 것 및, 유전자공학적 수법으로 항체유전자를 포함한 발현벡터로 형질변환된 숙주에 의해 생산되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6 수용체와 결합함으로써 IL-6의 IL-6 수용체에의 결합을 저해해서 IL-6의 생물학적 활성이 세포 내 전달되는 것을 차단한다.

이와 같은 항체로는, MR16-1 항체(Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1993) 90, 11924-11928), PM-1 항체(Hirata, Y. et al., J. Immunol.(1989) 143, 2900-2906), 또는 AUK12-20 항체, AUK64-7 항체 또는 AUK146-15 항체(국제특허출원공개번호 WO 92-19759) 등을 들 수 있다. 이들 중에서 특히 바람직한 항체로는 PM-1 항체를 들 수 있다.

한편, PM-1 항체생산 하이브리도마 세포계는 PM-1로서, 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키현 츠쿠바시 동1쵸메 1번 1 중앙 제6)에, 평성 원년(1989 년) 7월 12일에 FERM BP-2998로 부다페스트조약에 기해 국제기탁이 되어 있다. 또, MR16-1 항체생산 하이브리도마 세포계는, 래트-마우스 하이브리도마 MR16-1로서, 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키현 츠쿠바시 동 1쵸메 1번 1 중앙 제 6)에, 평성 9년(1997 년) 3월 13일에, FERM BP-5875로 부다페스트조약에 기해 국제기탁이 되어 있다.

항-IL-6 수용체 모노클로날 항체 생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지기술을 사용하여 하기와 같이 만들 수 있다. 즉, IL-6 수용체를 감작항원으로 사용하여, 이를 통상적인 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상적인 세포융합법으로 공지의 모세포와 융합시켜, 통상적인 스크리닝법으로 모노클로날 항체 생산세포를 스크리닝함으로써 만들 수 있다.

구체적으로는, 항-IL-6 수용체 항체를 만들려면 다음과 같이 하면 된다. 예를 들면, 항체취득의 감작항원으로 사용되는 인간 IL-6 수용체는, 유럽특허출원공개 EP 325474호, 마우스 IL-6 수용체는 일본 특허출원공개번호 일본국 특개평 3-155795호 공보에 개시된 IL-6 수용체 유전자/아미노산 배열을 이용함으로써 얻을 수 있다.

IL- 6 수용체 단백질은 두 종류가 있다: 세포막 상에 발현되어 있는 IL-6 수용체 및 세포막으로부터 이탈해 있는 IL-6 수용체(가용성 IL-6 수용체)(Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). 가용성 IL-6 수용체 항체는 세포막에 결합되어 있는 IL-6 수용체의 실질적으로 세포 외 영역으로 구성되어 있는바, 막관통(transmembrane) 영역 또는 막관통 영역과 세포내 영역이 결손되어 있다는 점에서 막결합형 IL-6 수용체와 차이가 있다.

IL-6 수용체 단백질은 본 발명에서 사용되는 항-IL-6 수용체 항체생산의 감작항원으로 사용될 수 있는 한, 어떤 IL-6 수용체를 사용하여도 좋다.

IL-6 수용체의 유전자배열을 공지의 발현 벡터계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질변환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양 상청 중에서 목적으로 하는 IL-6 수용체 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6 수용체 단백질을 감작항원으로 사용할 수 있다. 또, IL-6 수용체가 발현되어 있는 세포나, IL-6 수용체 단백질과 다른 단백질과의 융합단백질을 감작항원으로 이용할 수 있다.

인간 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 포함한 플라즈미드 pIBIBSF2R을 함유하 는 E. coli는, 평성 원년(1989년) 1월 9일자로 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키 쓰쿠바시 동1쵸메 1번 1 중앙 제6)에, HB10l-pIBIBSF2R로서, 수탁번호 FERM BP-2232로 부다페스트조약에 기해 국제기탁이 되어 있다.

본 발명에서 사용되는 항-gp130 항체는, 공지의 수단을 이용해서 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항-gp130 항체로서는, 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체로는 하이브리도마에 의해 생산되는 것 및, 유전자공학적 수법으로 항체유전자를 포함한 발현벡터로 형질변환한 숙주에 의해 생산되는 것이 있다. 이 항체는 gp130와 결합함으로써, IL-6/IL-6 수용체 복합체가 gp130에 결합되는 것을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포 내로의 전달을 차단한다.

이와 같은 항체로는, AM64 항체(일본국 특개평 (Kokai) 3-219894호 공보), 4Bl1 항체 및 2H4 항체(US 5571513), B-S12 항체 및 B-P8 항체(일본국 특개평 8-291199 호 공보) 등을 들 수 있다.

항-gp130 모노클로날 항체 생산 하이브리도마는, 기본적으로는 공지기술을 사용하여 다음과 같이 만들 수 있다. 즉, gp130을 감작항원으로 사용하여, 이를 통상적인 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상적인 세포융합법으로 공지의 모세포와 융합시켜, 통상적인 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체생산세포를 스크리닝함으로써 만들 수 있다.

구체적으로는, 모노클로날 항체는 다음과 같이 만들 수 있다. 예를 들면, 항 체취득의 감작항원으로 사용되는 gp130은, 유럽 특허출원 EP411946에 개시된 gp130 유전자 서열/아미노산 서열을 이용함으로써 얻을 수 있다.

gp130의 유전자배열을 공지의 발현벡터계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질변환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양 상청 중에서 목적하는 gp130 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 gp130 수용체 단백질을 감작항원으로 사용할 수 있다. 선택적으로, gp130가 발현되어 있는 세포나 gp130 단백질과 다른 단백질의 융합단백질을 감작항원으로 이용하여도 좋다.

감작항원에서 면역되는 포유동물은 세포융합에 사용하는 모세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하므로, 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면 마우스, 래트, 햄스터 등이 사용되지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

동물을 감작항원으로 면역하는 것은 공지의 방법에 따라 실행된다. 예를 들면 일반적 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강 내 또는 피하에 주사함으로써 실행된다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것을 소망에 따라 통상의 보조액(adjuvant), 예를 들면 프로인드(Freund's) 완전 보조액을 적당량 혼합하고 유화시킨 후 포유동물에 4 ~ 21일 마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또, 적당한 담체를 감작항원 면역시에 사용할 수 있다.

이와 같이 면역하고, 혈청 중에 소망하는 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물로부터 면역세포를 꺼내어 세포융합을 겪게 한다. 세포융합되는 바람직한 면역세포로는, 특히 비장세포를 들 수 있다.

상기 면역세포와 융합되는 다른 쪽 모세포로서의 포유동물의 골수종 세포는, 이미 공지의 여러 가지 세포계, 예를 들면 P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immuno1.(1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D. H. et a1., Cell(1976) 8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et a1., Nature (1978) 276, 269-270), F0(de St. Groth, S. F. et a1., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et a1., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 적절히 사용된다.

상기 면역세포와 골수종 세포의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 밀스테인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준해서 실행할 수 있다.

보다 구체적으로는, 상기 세포융합은 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재 하에 통상적인 영양배양액 중에서 실시된다. 융합촉진제로는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 다시 소망에 따라 융합효율을 높이기 위해 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가해서 사용할 수도 있다.

면역세포와 골수종 세포의 사용비율은, 예를 들면, 골수종 세포에 대해 면역세포를 1 ~ 10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 이용하는 배양액으로서는, 예를 들면, 상기 골수종 세포계의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이 종류의 세포배양에 쓰이는 통상적인 배양액이 사용될 수 있고, 또한 송아지 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보조액을 병용할 수도 있다.

세포융합은, 상기 면역세포와 골수종 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액, 예를 들면 평균분자량 1000 ~ 6000 정도의 PEG 용액을 통상 30 ~ 60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)를 형성한다. 계속해서, 적당한 배양액을 순서대로 첨가하고, 원심분리하여 상청을 제거하는 조작을 되풀이함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거할 수 있다.

상기 하이브리도마는, 통상적인 선택배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포키산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유한 배양액)에서 배양함으로써 선택한다. 당해 HAT 배양액에서의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하기에 충분한 기간인, 일반적으로 수일 ~ 수주 간 계속한다. 그 다음, 통상적인 한계희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 클로닝을 실행한다.

또, 인간 이외의 동물에 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 외에, 인간 임파구를 인비트로에서 소망하는 항원단백질 또는 항원 발현세포에서 감작하고, 감작 B 임파구를 인간 골수종 세포인 예를 들면 U266과 융합시켜, 원하는 항원 또는 항원발현세포에의 결합활성을 갖는 원하는 인간항체를 얻을 수도 있다(일본특허공보 1-59878호 참조). 그리고, 인간항체 유전자의 레퍼터리를 갖는 트랜스제닉 동물에 항원 또는 항원발현세포를 투여하여 상기의 소망하는 인간항체를 얻을 수 있다(국제특허출원공개 번호 WO 93/12227, WO 92/ 03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조)

이와 같이 구성된 모노클로날 항체-생산 하이브리도마는, 통상적인 배양액 중에서 계대배양 할 수 있고, 또 액체질소 중에서 장기 보존될 수 있다.

당해 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 취득하는 데에는, 당해 하이브리도마를 통상적인 방법으로 배양하여 그 배양 상청으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이와 적합성이 있는 포유동물에 투여해서 증식시켜 그 복수(ascite)로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻기에 적합하고, 한편 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.

예를 들면, 항-IL-6 수용체 항체생산 하이브리도마는 일본국 특개평 3-139293에 개시된 방법을 사용하여 구성될 수 있다. 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(이바라키현 츠쿠바시 동1쵸메 1번 1 중앙 제6)에, 평성 원년(1989년) 7월 12일에, FERM BP-2998로 부다페스트조약에 기해 국제기탁 된 PM-l 항체생산 하이브리도마를 BALB/c 마우스의 복강 내에 주입하여 복수를 얻고, 이 복수로부터 PM-l 항체를 정제하는 방법이나, 본 하이브리도마를 적당한 배지, 예를 들면 10% 송아지 태아 혈청, 5% BM-Condimed HI(Boehringer Mannheim 제품) 함유 RPMI1640 배지, 하이브리도마 SFM 배지(GIBCO-BRL 제품), PFHM-II 배지(GIBCO-BRL 제품) 등에서 배양하여, 그 배양 상청으로부터 PM-l 항체를 정제하는 방법으로 실행할 수 있다.

본 발명에는, 모노클로날 항체로서, 항체유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 조립한 후 이를 숙주에 도입하는 재조합 유전자 기술을 이 용하여 생산한 재조합 항체를 이용할 수 있다(예를 들면, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, published in the United Kingdom by MACMIILAN PUBLISHERS LTD. 1990 참조).

구체적으로는, 목적으로 하는 항체의 가변(V)영역을 코드하는 mRNA는 하이브리도마와 같은 항체-생산 세포로부터 단리된다. mNA의 단리는, 공지의 방법인 예를 들면 구아니진 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem.(1987) 162, 156-159) 등으로 전(全)RNA를 제조하고, 그리고 나서 mRNA 정제키트(Pharmacia 제품) 등을 사용해서 전 RNA로부터 mRNA를 제조한다. 또, QuickPrep mRNA 정제 키트(Pharmacia 제품)를 이용함으로써 mRNA를 직접 제조할 수도 있다.

이와 같이 얻어진 mRNA으로부터 역전사 효소를 이용해서 항체 V 영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 등을 이용해서 실행할 수 있다. 또, cDNA의 합성 및 증폭을 실행하려면 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech 제품) 및 PCR을 이용한 5'-RACE 법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989) 17, 2919-2932)을 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA와 연결한다. 그리고, 이에 의해 재조합 벡터를 작성하고, E. coli 등으로 도입해서 콜로니를 선택하여 소망하는 재조합 벡터를 제조한다. 목적으로 하는 DNA의 염기배열을 공지의 방법, 예를 들면 디옥시법으로 확인한다.

목적으로 하는 항체의 V 영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이를 소망하는 항체정상영역(C 영역)을 코드하는 DNA에 결찰시키고 이를 발현벡터에 병합시킨다. 또는, 항체의 V 영역을 코드하는 DNA를 항체 C 영역의 DNA를 포함한 발현벡터에 병합시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체를 제조함에는, 뒤에 설명되듯이 항체유전자를 발현제어영역, 예를 들면 인핸서나 프로모터의 제어 하에서 발현되도록 발현벡터에 병합시킨다. 다음에, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환해서 항체를 발현시킬 수 있다.

본 발명에서는, 인간에 대한 이종항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로서 인위적으로 개변한 유전자재조합 항체, 예를 들면 키메라(Chimeric) 항체, 인간형화(Humanized) 항체, 인간(human)항체를 사용될 수 있다. 이들 개변항체는 기존의 방법을 이용해서 제조할 수 있다.

키메라 항체는, 상기와 같이 해서 얻은 항체 V 영역을 코드하는 DNA를 인간항체 C 영역을 코드하는 DNA에 연결하고, 이를 발현벡터에 병합해서 숙주에 도입하여 생산함으로써 얻어지게 된다(유럽특허출원 EP 125023, 국제특허출원 WO 92-19759호 참조). 이 기존의 방법을 이용해서, 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다.

예를 들면, 키메라 PM-1 항체의 L사슬 및 H사슬의 V 영역을 코드하는 DNA를 포함한 플라즈미드는, 각각 pPM-k3 및 pPM-h1 이라 명명되고, 이 플라즈미드를 갖는 E coli는 National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited(Ferguson Building, Craibst one Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9 YA, United Kingdom)에 1991년 2월 12일에, 각각 NCIMB 40366 및 NCIMB 40362로서 부다페스트조약에 따라 국제기탁이 되어 있다.

인간형화 항체는, 재구성 인간항체라고도 불리는, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스의 항체의 상보성 결정영역(CDR)을 인간 항체의 상보성 결정영역에 이식한 것으로, 이와 같은 항체의 제조를 위한 일반적인 재조합 DNA 기술도 알려져 있다(유럽 특허출원 EP 125023, 국제특허출원 WO 92-19759 참조).

구체적으로는, 마우스항체의 CDR와 인간항체의 프레임워크 영역(FR; framework region)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 만든 몇 개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법으로 합성한다. 얻어진 DNA를 인간항체 C 영역을 코드하는 DNA에 결찰시키고, 다음 발현벡터에 병합하고, 이를 숙주에 도입해서 생산시켜줌으로써 얻어지게 된다(유럽특허출원 EP 239400, 국제특허출원 WO 92-19759 참조).

CDR를 매개로 결찰되는 인간항체의 FR은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택되게 된다. 필요에 따라, 재구성 인간항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록, 항체의 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환할 수 있다(Sato, K. et al., Cancer Res.(1993) 53, 851-856).

키메라 항체와 인간형화 항체에는 인간항체 C 영역이 사용된다. 인간항체 C 영역으로는, Cγ를 들 수 있고, 예를 들면, Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4를 사용할 수 있다. 또, 항체 또는 항체의 생산의 안정성을 개선하기 위해 인간항체 C 영역을 변형할 수 있다.

키메라 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간항체 유래의 C 영역으로 이루어지고, 인간형화 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과 인간항체 유래의 프레임워크 영역 및 C 영역으로 이루어지고, 인체 내에서의 항원성이 저하되어 있기 때문에, 본 발명에 사용되는 항체로서 유용하다.

본 발명에 사용되는 인간형화 항체의 바람직한 구체적인 예로는, 인간형화 PM-1 항체를 들 수 있다(국제특허출원공개 번호 WO 92-19759 참조).

또, 인간항체의 취득방법으로는 먼저 설명한 방법 외에, 인간항체 라이브러리를 이용해서, 팬닝(panning)에 의해 인간항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간항체의 가변영역을 단일 사슬 항체(scFv)로서 파아지(phage) 디스플레이법에 의해 파아지의 표면에 발현시켜, 항원에 결합되는 파아지를 선택할 수도 있다. 선택한 파아지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합되는 인간항체의 가변영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수 있다. 항원에 결합되는 scFv의 DNA 배열이 밝혀지면, 당해 배열을 적당한 발현벡터를 만들어 인간항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 널리 알려진 것으로, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388를 참고로 할 수 있다.

상기와 같이 구축한 항체유전자는, 공지의 방법으로 발현시키고 취득할 수 있다. 포유류 세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현되는 항체유전자, 그 3' 하류방향에 폴리 A 시그널을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그를 포함한 벡터에 의해 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터/인핸서로서는, 인간 거대세포 바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter /enhancer)를 들 수 있다.

또, 기타 본 발명에서 사용되는 항체 발현에 사용될 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 시미안바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서 또는 인간 신장인자 1(HEF1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용할 수 있다.

예를 들면, SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mulligan 등의 방법(Mulligan, R. C. et al., Nature(1979) 277, 108-114), 또 HEF1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mizushima et al.의 방법(Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322)에 따라 용이하게 실시할 수 있다.

E. coli의 경우, 상용되는 유용한 프로모터와, 항체분비를 위한 시그널 배열 및, 발현시키는 항체유전자를 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터로는, lacZ 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우, Ward et al. 방법(Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터를 사용하는 경우, Better et al.의 방법(Better, M. et al. Science(1988) 240, 1041-1043)에 따르면 된다.

항체분비를 위한 시그널 배열로는, E. coli의 외질에 생산시키는 경우, pelB 시그널배열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)을 사용하면 좋다. 외질에 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 리폴드(refold) 해서 사용한다(예를 들면, W096/30394를 참조).

복제기원으로는, SV40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스(BPV) 등에 유래한 것을 이용할 수가 있고, 또, 숙주세포계에서 유전자 복제수의 증폭을 위해, 발현벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제(APH) 유전자, 티미진 키나제(TK) 유전자, E. coli 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Ecogpt) 유전자, 디히드로폴레이트 리덕타제(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위해 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체제조를 위한 생산계는 인비트로 및 인비보 생산계가 있다. 인 비트로 생산계로는, 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.

진핵세포를 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포, 또는 진균세포를 이용하는 생산계가 있다. 동물세포로는, (1) 포유류 세포인 예를 들면, CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero 등, (2) 양생류 세포인 예를 들면, 제노푸스 난모세포, 또는 (3) 곤충세포인 예를 들면, sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물세포로는 담배(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있는바, 이를 캘러스배양하면 좋다.

진균세포로는, 효모, 예를 들면 사카로미세스(Saccharomyces)속인 예를 들어 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면 아스페길루스(Aspergillus)속인 예를 들어 아스페길루스 니거(AspergiILus niger) 등이 알 려져 있다.

원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 이용하는 생산계가 있다. 세균세포로는 E. coli, 바실루스 서브틸리스가 알려져 있다.

이들 세포에 목적으로 하는 항체유전자를 형질변환으로 도입해서, 형질변환된 세포를 인비트로에서 배양함으로써 항체를 얻는다. 배양은 공지의 방법으로 실행한다. 예를 들면, 배양액으로서 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있고, 송아지 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보충액을 병용할 수도 있다. 또, 항체유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등에 도입함으로써, 인비보에서 항체를 생산할 수 있다.

한편, 인비보 생산계는 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계가 포함된다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 이용하는 생산계 등이 있다.

포유동물로는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등이 이용될 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또, 곤충으로는 누에가 이용될 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 예를 들면 담배가 이용될 수 있다.

이들 동물 또는 식물에 항체유전자를 도입해서, 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 생산시켜 회수한다. 예를 들면, 항체유전자를 염소 β 카제인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 중간에 삽입해서 융합유전자로 제조한다. 항체유전자가 삽입된 융합유전자를 포함한 DNA 단편을 염소의 배아에 주입하고, 이 배아를 암컷 염소에 도입한다. 배아를 수용한 염소에서 태어나는 트 랜스제닉 염소 또는 그 자손이 생산하는 유즙으로부터 소망하는 항체를 얻는다. 트랜스제닉 염소에서 생산되는 소망하는 항체를 함유하는 유즙의 양을 증가시키기 위해, 호르몬을 트랜스제닉 염소에 적절하게 사용할 수 있다(Ebert, K. M. et al., Bio/Technology(1994) 12, 699-702).

또, 누에를 이용하는 경우, 목적하는 항체유전자가 삽입된 바쿨로바이러스를 누에에 감염시켜, 이 누에의 체액에서 소망하는 항체를 얻는다(Maeda, S. et al., Nature(1985) 315, 592-594). 그리고, 담배를 이용하는 경우, 목적하는 항체유전자를 식물발현용 벡터인, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 Agrobacterium tumefaciens와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 Nicotiana tabacum에 감염시켜, 담배의 잎으로부터 소망하는 항체를 얻는다(Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994) 24, 131-138).

앞에서 설명한 바와 같이 인비보 또는 인비트로의 생산계에서 항체를 생산하는 경우, 항체 중사슬(H 사슬) 또는 경사슬(L 사슬)을 코드하는 DNA를 각각 발현벡터에 병합시켜 숙주를 동시 형질변경시키거나, 또는 H사슬 및 L사슬을 코드하는 DNA를 단일의 발현벡터에 병합시켜 숙주를 형질변경시킬 수 있다(국제특허출원공개번호 WO 94-11523 참조).

본 발명에서 사용되는 항체는, 본 발명에 적절히 사용될 수 있는 한 항체의 단편이나 그것의 변형물일 수 있다. 예를 들면, 항체의 단편으로서, Fab, F(ab')₂, Fv 또는 H 사슬와 L 사슬의 Fv를 적당한 링커로 결찰시킨 단일사슬 Fv(scFv)를 들 수 있다.

구체적으로는, 항체를 효소, 예를 들면 파파인이나 펩신으로 처리해서 항체 단편을 생성시키거나, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축해서, 이를 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(예를 들면, Co, M.S. et al., J. Immunol.(1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in Enzymo1ogy(1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology(1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology(1989) 121, 663-66, Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991) 9, 132-137 참조).

scFv는 항체의 H사슬의 V 영역과 L사슬의 V 영역을 연결함으로써 얻을 수 있다. 이 scFv에서, H사슬의 V 영역과 L사슬의 V 영역은 링커(linker), 바람직하기는 펩티드 링커를 매개로 연결된다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1988) 85, 5879-5883). scFv에서의 H사슬의 V 영역 및 L사슬의 V 영역은, 상기 항체로서 기재된 것의 어느 것에 유래한 것이어도 좋다. V 영역을 연결하는 펩티드 링커로는, 예를 들면 12-19 아미노산 잔기로 된 임의의 단일 사슬 펩티드가 쓰인다.

scFv를 코드하는 DNA는, 상기 항체의 H사슬 또는, H사슬의 V 영역을 코드하는 DNA, 및 L사슬 또는 L사슬의 V 영역을 코드하는 DNA를 주형으로 하고, 그들의 배열 중의 소망하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 부분을, 그 양단을 규정하는 프라이머 1쌍을 이용해서 PCR 법으로 증폭한 다음, 다시 펩티드 링커 부분을 코드하 는 DNA 및 그 양단을 각각 H사슬, L사슬과 연결되도록 규정하는 프라이머 쌍을 조합해서 증폭함으로써 얻어진다.

또, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 만들어지면, 그들을 함유하는 발현벡터 및 당해 발현벡터에 의해 형질변환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있고, 또 그 숙주를 이용해서 통상적인 방법으로 scFv를 얻을 수 있다.

이들 항체의 단편은, 상기와 마찬가지로 해서 그 유전자를 취득하고 발현시켜, 숙주에 의해 생산시킬 수 있다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들 항체의 단편도 포함된다.

변형된 항체로서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합된 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들 항체 변형물도 포함된다. 이와 같은 항체 변형물을 얻는 데에는, 얻어진 항체를 화학적으로 변형시킴으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다.

상기와 같이 생산, 발현된 항체는, 세포 내외, 숙주로부터 분리해서 균일해지기까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해 실행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 이용하는 칼럼으로는, 예를 들면, 단백질 A 칼럼, 단백질 G 칼럼을 들 수 있다. 단백질 A 칼럼에 이용하는 담체로서, 예를 들면 Hyper D, POROS, Sepharose F.F. 등을 들 수 있다. 기타, 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용할 수 있고, 어떤 한정이 있는 것은 아니다.

예를 들면, 상기 친화성 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피, 필터, 한외 여과, 염석, 투석 등을 적의 선택해서 조합하면, 본 발명에서 사용되는 항체를 분리해서 정제할 수 있다. 크로마토그래피로는, 예를 들면, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는 HPLC(High performance liquid chromatography)에 적용할 수 있다. 또, 역상 HPLC(reverse phase HPLC)를 이용하여도 좋다.

상기에서 얻어진 항체의 농도측정은 흡광도의 측정 또는 ELISA 등에 의해 실행할 수 있다. 즉, 흡광도의 측정에 의한 경우에는, PBS(-)에서 적당하게 희석한 후, 280nm의 흡광도를 측정해서, 1mg/ml를 1.35 OD로 해서 산출한다. 또, ELISA에 의한 경우는 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 0.lM 탄산수소염 완충액(pH 9.6)에서 1㎍/ml로 희석한 염소 항-인간 IgG(TAG 제품) 100㎕를 96-웰 플레이트(Nunc 제품)에 가해, 4℃에서 밤새 배양하여 항체를 고정화한다. 블로킹을 한 후, 적절히 희석한 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 함유한 샘플, 또는 표품(標品)으로서 인간 IgG(CAPPEL 제품) 100㎕를 첨가하여, 실온에서 1시간 배양한다.

세정 후, 5000 배 희석한 알칼리성 포스파타제-표지된 항-인간 IgG(BID SOURCE 제품) 100㎕를 가하고, 실온에서 1시간 배양한다. 세정 후, 기질용액을 가하고 배양한 후, MICROP LATE READER Model 3550(Bio-Rad 제품)을 이용해서 405 nm에서의 흡광도를 측정해서, 목적하는 항체의 농도를 산출한다.

본 발명에서 사용되는 IL-6 개변체는, IL-6 수용체와의 결합활성을 갖고, 또한 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 개변체는 IL-6 수용체에 대해 IL-6과 경합적으로 결합하지만, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때문에 IL-6에 의한 시그널 전달을 차단한다.

IL-6 개변체는, IL-6의 아미노산 배열의 아미노산 잔기를 치환함으로써 변이를 도입해서 만들어진다. IL-6 개변체의 기초로 되는 IL-6은 그 유래를 묻지 않으나, 항원성 등을 고려하면 바람직하기는 인간 IL-6이다.

구체적으로는, IL-6의 아미노산 배열을 공지의 분자 모델링 프로그램, 예를 들면 WHATIF(Vriend et al., J. Mol. Graphics(1990) 8, 52-56)를 이용해서 그 2차구조를 예측하고, 다시 치환되는 아미노산 잔기의 전체에 미치는 영향을 평가함으로써 실행된다. 적절한 아미노산 잔기를 결정한 후, 인간 IL-6 유전자를 코드 염기배열을 포함한 벡터를 주형으로 해서, 통상 실행되는 PCR법으로 아미노산이 치환되도록 변이를 도입함으로써, IL-6 개변체를 코드하는 유전자가 얻어진다. 이를 필요에 따라 적당한 발현벡터에 조립, 상기 재조합 항체의 발현, 생산 및 정제방법에 준해서 IL-6 개변체를 얻을 수 있다.

IL-6 개변체의 구체적인 예로는, Brakenhoff et al., J. Biol. Chem.(1994) 269, 86-93, 및 Savino et al., EMBO J.(1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648, W0 96-17869에 개시되어 있다.

본 발명에서 사용되는 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는, 각각 IL-6 수용체 또는 IL-6과의 결합활성을 갖고, 또한 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 IL-6 수용체 또는 IL-6에 결합되고, 이들을 포착함으로써 IL-6의 IL-6 수용체에의 결합을 특이적으로 저해한다. 그 결과, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않기 때 문에 IL-6에 의한 시그널 전달을 차단한다.

IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는, IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에서 IL-6과 IL-6 수용체와의 결합과 관계되는 영역의 일부 또는 전부의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드이다. 이와 같은 펩티드는, 통상 10 ~ 80, 바람직하기는 20 ~ 50, 보다 더 바람직하기는 20 ~ 40개의 아미노산 잔기로 이루어진다.

IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는, IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에서, IL-6과 IL-6 수용체와의 결합과 관계되는 영역을 특정하고, 그 일부 또는 전부의 아미노산 서열을 통상 알려진 방법인, 예를 들면 유전자공학적 수법 또는 펩티드합성법으로 만들 수 있다.

1L-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 유전자공학적 수법으로 만드는 데에는, 소망하는 펩티드를 코드하는 DNA 배열을 발현벡터에 조립, 상기 재조합 항체의 발현, 생산 및 정제방법에 준해서 얻을 수 있다.

IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 펩티드 합성법으로 만드는 데에는, 펩티드 합성에서 통상 쓰이고 있는 방법인 예를 들면 고상합성법 또는 액상합성법을 이용할 수 있다.

구체적으로는, 속 의약품의 개발 제14권 펩티드 합성(감수 야지마 지메이(矢島 治明), 일본국 경천서점 1991년)에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 고상합성법으로, 예를 들면 합성되어질 펩티드의 C 말단에 대응하는 아미노산을 유기용매에 불용성인 지지체에 결합시켜, α-아미노기 및 측쇄작용기를 적절한 보호기로 보 호한 아미노산을 C 말단으로부터 N 말단 방향의 순서대로 1 아미노산씩 축합시키는 반응과 수지상에 결합된 아미노산 또는 펩티드의α-아미노기의 당해 보호기를 이탈시키는 반응을 교대로 반복함으로써 펩티드 사슬을 신장시키는 방법이 쓰일 수 있다. 고체상 펩티드 합성법은, 사용되는 보호기의 종류에 따라 Boc법과 Fmoc법으로 대별된다.

목적으로 하는 펩티드를 합성한 후, 탈보호 반응 및 펩티드 사슬의 지지체로부터의 절단반응을 실시한다. 펩티드 사슬의 절단반응을 위해, Boc법에서는 불화수소 또는 트리플오로메탄 슬폰산을, 또 Fmoc법에서는 TFA를 통상적으로 이용할 수 있다. Boc법에서는, 예를 들면 불화수소 중에서 상기 보호펩티드 수지를 아니솔의 존재 하에서 처리한 다음, 보호기를 제거하고 펩티드를 지지체로부터 절단하여 회수한다. 이를 동결건조함으로써 거친(crude) 펩티드가 얻어진다. 한편, Fmoc법에서는, 예를 들면 TFA 중에서 상기와 같은 조작으로 탈보호반응 및 펩티드 사슬의 지지체로부터의 절단반응을 실행할 수 있다.

얻어진 거친 펩티드는, HPLC에 적용하여 분리, 정제할 수 있다. 그 용출에 있어, 단백질의 정제에 통상 쓰이는 물-아세토니트릴계 용매를 사용해서 최적조건 하에서 실시하면 된다. 얻어진 크로마토그래피의 프로파일의 피크에 해당하는 분획을 수집하고 동결건조한다. 이와 같이 해서 정제한 펩티드 분획에 대해, 질량스펙트럼 분석에 의한 분자량 해석, 아미노산조성 분석, 또는 아미노산 서열 해석 등으로 동정한다.

IL-6 부분 펩티드 및 IL-6 수용체 부분 펩티드의 구체적인 예는, 일본국 특 개평 2-188600, 일본국 특개평 7-324097, 일본국 특개평 8-311098 및 미국 특허 공보 US 5210075에 개시되어 있다.

본 발명에서 사용되는 IL-6 안타고니스트의 IL-6 시그널 전달저해 활성은, 통상 쓰이는 방법으로 평가할 수 있다. 구체적으로는, IL-6-의존성 인간 골수종주(S6B45, KPMM2), 인간 렌너트 T-임파종 세포계 KT3, 또는 IL-6-의존성 세포 MH60.BSF2를 배양해서, 이에 IL-6을 첨가하고, IL-6 안타고니스트가 공존하는 상태에서 IL-6 의존성 세포로의 ³H-티미딘의 병합을 사용함에 의해 활성을 측정할 수 있다.

또, IL-6 수용체 발현세포인 U266를 배양하고, ¹²⁵I 표지 IL-6을 첨가하고, 동시에 IL-6 안타고니스트를 첨가함으로써, IL-6 수용체 발현세포에 결합된 ¹²⁵I 표지 IL-6을 측정한다. 상기 분석 시스템에서, IL-6 수용체 안타고니스트가 존재하는 군 이외에, IL-6 안타고니스트를 함유하지 않는 음성 대조군을 만들고, 양자에서 얻어진 결과를 비교하여 IL-6 안타고니스트의 IL-6 저해 활성을 평가한다.

하기 실시예와 같이, 항-IL-6 수용체 항체에 의해 내이장해의 치료효과가 인정된 점에서, 항IL-6 수용체 항체 등의 IL-6 안타고니스트는 내이장해의 치료제로서 유용하다는 것이 시사되고 있다.

본 발명에서의 치료대상은 포유동물이다. 치료대상인 포유동물은 바람직하기는 인간이다.

본 발명의 내이장해 치료/예방제는, 경구적으로 또는 비경구적으로 전신 또 는 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 점적(点滴) 등의 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 흉강 내 주사, 복강 내 주사, 피하주사, 좌약, 장세척, 경구성 장용제 등을 선택할 수가 있고, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 유효투여량은, 1회에 대해 체중 1kg 당 0.0lmg ~ 100mg의 범위에서 선택된다. 또는, 환자당 1 ~ 100Omg, 바람직하기는 5 ~ 50mg의 투여량을 선택할 수 있다.

바람직한 투여량, 투여방법은, 예를 들면 항-IL-6 리셉터 항체의 경우에는, 혈중에 프리(free)의 항체가 존재할 정도의 양이 유효투여량이므로, 구체적인 예로는, 체중 1kg 당 1개월(4주간)에 0.5mg ~ 40mg, 바람직하기는 lmg ~ 20mg을 1회에서부터 수회로 나누어, 예를 들면 2회/주, 1회/주, 1회/2주, 1회/4주 등의 투여 스케쥴로 점적 등의 정맥 내 주사, 피하주사 등의 방법으로 투여하는 방법 등이다. 투여 스케줄은, 병상의 관찰 및 혈액검사치의 동향을 관찰하면서 2회/주 또는 1회/주로부터 1회/2주, 1회/3주, 1회/4주와 같이 투여간격을 늘여가는 등으로 조정할 수도 있다.

본 발명의 내이장해의 치료 및/또는 예방제는, 투여경로에 따라 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 함유할 수 있다. 이와 같은 담체 및 첨가물의 예로서, 물, 의약적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복시비닐 폴리머, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시 전분 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 크산검, 아라비아 고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아린산, 인 간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토스, 약제학적으로 허용가능한 계면활성제 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물은, 제형에 따라 상기 중에서 적절히 선택하거나 또는 조합시켜 선택될 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

(실시예)

이하, 실시예 및 참고예를 가지고 본 발명을 구체적으로 설명하는바, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1.

실험방법

(1) 음향부하 전의 마우스의 청력측정

4주령 C57BL/6J 수컷 마우스에 대해, 음향부하 전날에 청성뇌간반응(聽性腦幹反應; ABR)에 의한 청력측정을 실행하였다. 측정 전에는 키라딘(Xyladine) 및 케타민(Ketamine)의 복강 내 주사로 충분한 심도의 마취를 실시하고, 측정 중 필요에 따라 케타민에 의한 추가마취를 시행하였다.

(청성뇌간반응) 상기 소음 조건에서 소음유발 난청의 정도를 알기 위해, 청성뇌간반응(ABR)의 역치 쉬프트를 시험하였다. ABR의 측정은, PowerLab system(모델 : PowerLob2/20, ADInstruments CastleHill, Australia)의 Scope 소프트웨어 1개의 파형저장(waveform storing) 및 자극 조절(stimulus control)을 이용해서 실행하고, EEG의 기록은 세포외 증폭기 Digital Biomap system(모델: BAL-1, Tucker-Davis Technologies FL/USA)을 이용해서 실행하였다. 음 자극은, 마우스의 외이도에 삽입된 커플러형 스피커(모델: ESlspc, BioResearch Center 나고야 /일본)로 발 생시켰다. 파열음 자극 0.1ms 상승/하강 시간(코사인게이트) 및 1ms 평탄 세그먼트(segment)를 발생시키고, 또 진폭은 음 발생기 및 감쇠 실시간 프로세서 및 프로그램성 감쇠기(모델: RP2.1 and PA5, Tucker-Davis Technologies FL/USA)로 특정시켰다. 음 레벨의 보정은 Sound Level Meter(모델: LA-5111, Ono Sokki 요코하마/일본)을 이용해서 실행하였다. 기록을 위해 스테인레스 침상(針狀) 전극을 왼쪽 귀 및 오른쪽 귀의 정상부 및 공동(空洞) 측부에 설치하였다. 일반적으로, ABR 파형은, 50-5000Hz 밴드패스필터 세팅을 이용해서 40,000Hz의 샘플링 속도로 12.8ms에 대해 기록하고, 9Hz의 주파수에서의 256 자극으로부터의 파형을 평균화하였다. ABR파형은 최고진폭으로부터 아래로 5-dB SPL 간격으로, 파형이 눈으로 볼 수 없을 때까지 기록하였다. 역치 측정을 위해 부여한 음의 주파수는 4kHz, 12kHz 및 20kHz의 3종류로 해서, 각각의 청력 역치를 측정하였다.

(2) 난청모델의 생성

음향부하장치(음파발생기로서 RION Audiometry AA67N의 마스킹 소음을 이용하고, 증폭기로서 SONY SRP-P150, FOSTEX D-1405에 의해 증폭한 후에, 직경 약 12cm인 스피크로 밀폐공간 내에 부하하는 장치) 내에, 스피커 바로 아래 1cm에 정치(淨置)한 금속메쉬제의 높이 3cm의 케이지에 마우스를 넣었다. 케이지는 마찬가지 성상의 금망에 의해 방사상으로 구분하고, 동시에 4마리의 마우스를 별개의 방에 넣었다. 다음 음향부하장치 내에 124 ± 1db의 음압이 걸리도록 미리 설정(CASELA 사 CEL-231에 의해 2시간의 부하 중에 복수회 측정)해 둔 조건에서, 2시간 강대음(强大音)을 부하하였다. 음향은 4kHz SPL의 옥타브 밴드 소음을 이용하였 다. 또, 음향장치 내에 온도계를 두어, 음향부하 전후의 온도를 측정하였다.

(3) 약제투여

상기 (2)의 작성 후, 동물을 A 및 B의 2 군으로 나누어, 신속하게 래트 IgG 2mg/body 또는 MR16-1(참고예 4에서 조제한 항-IL-6R 인간형화 항체) 2mg/body를 각각의 군에 투여하였다. 투여에 관해서는, 맹험시험(盲驗試驗)으로 하고, (4)의 청력측정을 끝낼 때까지 시험자에게는 각 군에서의 투여내용을 알리지 않았다.

(4) 청력 역치 측정

상기 (1)과 마찬가지 요령으로, 음향부하 및 약물투여로부터 1주간 후에 청력측정을 실행하였다. 측정 후의 마우스는 충분한 마취 심도를 확인한 후, 머리를 자르고 측두골(側頭骨)을 적출하여 고정한 후, 조직학적 고찰용으로 보존하였다.

(5) 결과의 해석

각 개체의 상기 (4)에서 얻은 청력과, 상기 (1)에서 얻은 처치 전의 청력 차이를 취해, 청력 역치 저하도(dB)를 산출하였다. MR 16-1 투여군과 대조군 각각에서 각 주파수별로 평균 청력 역치 저하(dB)를 산출하였다.

결과

상기 (4)에서 마취를 할 때 1마리가 사망하여 청력 측정이 불가능하게 되었기 때문에 제외하였다. 청력 역치도가 얻어진 동물의 수는 MR16-1-투여군에서 n=4, IgG-투여군에서 n=2이었다. 또, 음향부하장치 내의 온도는, 부하 전에는 25℃, 부하 후에는 27℃ 이었다. 결과를, 아래의 표 1 및 도 1에 나타내었다.

처리주파수	IgG 투여대조군	MR 16-1 투여군	역치변화의 차이
4kHz 12kHz 20kHz	22.5 35 55	37.5 27.5 28.8	-15 +7.5 +26.3

고찰

음향외상은 음압이라고 하는 물리적 외력으로서, 당 실험에서 이용한 모델은 달팽이관의 물리적 조직-손상 모델이라고 생각될 수 있다. 당 실험에서는 4kHz의 주파수를 중심으로 한 과대음이 부하되었다. 달팽이관에서 음을 지각하는 센서는 주파수에 따라 공간적으로 분포해 있고(tonotropic), 콘트롤 군에서의 청력 저하는 4kHz에서 중요하고, 그곳에서 떨어져 고주파수 영역으로 됨에 따라 작아지게 되는 것은, 4kHz의 영역에 과대음을 부하하였기 때문에 이 영역에 가까울수록 조직장해가 커지기 때문이라고 설명될 수 있다.

한편, IL-6 리셉터 항체 투여군에서는, 12 kHz, 20 kHz와, 과대음이 부하되어 조직장해를 직접 받은 부위에서 떨어질수록, 콘트롤 군에 비해 청력저하가 억제되어 있다. 이상으로부터 IL-6 리셉터 항체는 달팽이관의 조직장해, 즉 내이성 감각신경성 난청에서의 청력 저하의 공간적인 진행 억제에 효과를 갖거나, 또는 감각신경성 난청에서의 고주파수 영역에서의 청력 저하의 억제에 효과를 갖는다고 생각될 수 있다.

실시예 2. 음향외상 후의 달팽이관에서의 염증성 시토킨의 발현

3 ~ 4 주령 수컷 SD 래트를 이용해서 실시예 1과 마찬가지 방법으로 난청모델을 만들었다. 음향부하 직후, 3시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 3일 후, 5일 후, 7일 후, 28일 후에, 각각의 래트로부터 측두골을 적출하였다. 달팽이관 내의 림프액을 누출하지 않도록 유지하면서, 달팽이관만을 적출해서, 각종 염증성 시토킨의 발현을 RT-PCR법으로 측정하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2로부터 알 수 있듯이, 음향외상(音響外傷) 모델의 달팽이관에서는 TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-1 리셉터 안타고니스트 (IL-1RA), IL-6의 발현이 상승해 있었다. 한편, IL-12 p40 및 GM-CSF의 발현은 인정되지 않았다.

다음에, 정량적 RT-PCR법으로 TNF-α, IL-6, IL-1β 발현의 시간에 따른 변화를 측정하였다. 정량적 RT-PCR는, 내재성 콘트롤(reference gene)로서 18S rRNA를 사용하고, △△Ct 법으로 결과를 해석하였다. 그 결과를 도 3 ~ 도 5에 나타내었다. 도 3 ~ 도 5로부터 알 수 있듯이, 음향외상 후 24시간 미만의 조기에 발현량의 피크를 나타낸 TNF, IL-lβ, IL-6의 발현이 인정되었다.

또, 음향부하 후 6시간의 조직을 사용하여, 동결된 절편을 면역조직학적으로 염색하였다. 사용된 동물은 SD 래트였고, 실시예 1과 마찬가지 방법으로 난청모델을 작성하고, 소음부하 후 6시간 후에 머리를 잘랐다. 신속하게 측두골을 적출해서, 4% 파라포름 알데히드에서 6시간을 고정하고, 0.5 mol/ℓ EDTA 액으로 탈미네랄화하여 얻은 검체를 액체질소를 이용해서 급속동결시켜, 저온유지장치(CM3000, Leica사 제품)를 이용해서 7㎛ 두께로 자름으로써 동결절편을 얻었다. 이 절편을 면역조직학적으로 염색하였다. 염색에는 Vectastein ABC kit을 사용하고, DAB 용액을 이용해서 발색시켰다. 염색 대조로서, 1차 항체를 가하지 않고 실행한 염색을 채용하였다. 결과를 도 6 ~ 도 7에 나타내었다. 도 6 ~도 7에서 알 수 있듯이, 음향부하 6시간 후의 달팽이관에서는, 달팽이관 바깥쪽 벽과 코르티기관 바로 아래의 기저막에 IL-6의 발현이 나타났다..

실시예 3. IL -6 안타고니스트의 전신투여에 의한 약효의 확인

실시예 1과 마찬가지로, 수컷 C57BL/6J 마우스에 124dB의 과대음을 2시간 부하하고, 직후에 MR16-1 2mg/body 또는 래트 IgG 2mg/body를 복강 내에 투여하였다. 항체를 투여하고 8시간 후에 측두골을 적출하여, 양측 내이를 적출해서 코르티기관을 분석하고, 제1 회전(apex), 제2 회전(basal)으로 나누어 각각을 좌우로부터 회수해서 합쳤다. Western blot법으로, 총 STAT3, Erk 및 Akt, 그리고 인산화 STAT3, Erk 및 Akt의 발현을 측정하였다. 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 알 수 있듯이, 대조군에서 강하게 인정되는 인산화 STAT3, 인산화 Erk, 인산화 Akt의 시그널이 MR16-1 투여군에서는 억제되었다. 이 결과로부터, 전신투여된 MR16-1이 달팽이관 내에서 약효를 발현하는 것이 확인되었다.

이 결과와 실시예 2의 결과에 따라, 실시예 1에 나타난 MR16-1 복강 내 투여에 의한 청력 저하 억제의 작용 메카니즘에, 음향외상 후 조기에 달팽이관 내에서 발현하는 IL-6 시그널의 MR16-1에 의한 억제효과가 기여하고 있다고 생각된다.

참고예 1. 인간 가용성 IL-6 수용체의 제조

Yamasaki 등의 방법(Yamasaki, K. et al., Science(1988) 241, 825-828)에 따라 얻어진 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA를 포함한 플라즈미드 pBSF2R.236을 이용해서, PCR법으로 가용성 IL-6 수용체를 작성하였다. 플라즈미드 pBSF2R.236을 제한효소 Sph I로 소화해서, IL-6 수용체 cDNA를 얻고, 이를 mp18(Amersham 제품)에 삽입하였다. IL-6 수용체 cDNA에 정지코돈을 도입하도록 디자인한 합성 올리고프라이머를 이용해서, 인 비트로 Mutagenesis 시스템(Amersham 제품)를 이용한 PCR법으로 IL-6 수용체 cDNA에 변이를 도입하였다. 이 조작에 의해 정지코돈이 아미노산 345의 위치에 도입되어, 가용성 IL-6 수용체를 코드하는 cDNA가 얻어졌다.

가용성 IL-6 수용체 cDNA를 CRO 세포에서 발현하기 위해, 플라즈미드 pSV(Pharmaeia 제품)와 연결시켜, 플라즈미드 pSVL344를 얻었다. dhfr의 cDNA를 포함한 플라즈미드 pECEdhfr에 Hind III-Sal I로 절단한 가용성 IL-6 수용체 cDNA를 삽입해서, CHO 세포발현 플라즈미드 pECEdhfr344를 얻었다.

10㎍의 플라즈미드 pECEdhfr344를 dhfr-CRO 세포계 DXB-11 (Urlaub, G. et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA(1980) 77, 4216-4220)에 칼슘포스페이트 침강법(Chen, C. et al., Mol. Cell. Biol.(1987) 7, 2745-2751)으로 트랜스펙트 하였다. 트랜스펙트된 CHO 세포를 1mM 글루타민, 10% 투석 FCS, 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신을 포함한 뉴클레오티드-프리 αMEM 선택배양액에서 3주간 배양하였다.

선택된 CHO 세포를 한계희석법으로 스크리닝해서 단일의 CHO 세포클론을 얻었다. 이 CHO 세포클론을 20 nM ~ 200 nM 농도의 메토트렉세이트(methotrexate)에서 증폭시켜, 인간 가용성 IL-6 수용체를 생산하는 CHO 세포계 5E27을 얻었다. CRO 세포계 5E27을 5% FBS를 함유한 이스코브-변형된 둘베코 배양액 (IMDM, Gibco 제품)에서 배양하였다. 배양 상청을 회수하여, 배양 상청 중의 가용성 IL-6 수용체의 농도를 ELISA에서 측정하였다. 그 결과, 배양 상청 중에는 가용성 IL-6 수용체가 존재하는 것이 확인되었다.

참고예 2. 항-인간 IL -6 항체의 조제

10㎍의 재조합 IL-6 (Hirano, T. et al., Immunol. Lett.(1988) 17, 41)을 프로인드 완전 보조액(Freund's complete adjuvant)과 함께 BALB/c 마우스를 면역하고, 혈청 중에 항-IL-6 항체가 검출되기까지 1주간 마다 이를 반복하였다. 국부 림프절로부터 면역세포를 추출하여, 폴리에틸렌 글리콜 1500을 이용해서 골수종 세포계 P3U1와 융합시켰다. 하이브리도마를 HAT 배양액을 이용하는 Oi et al.의 방법(Selective Methods in Cellular Immunology, W.H.Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980)에 따라 선택하여, 항-인간 IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마를 수립하였다.

항-인간 IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마는 아래와 같이 해서 IL-6 결합 분석을 행하였다. 즉, 유연한 폴리비닐제의 96-웰 마이크로 플레이트(Dynatech Laboratories, Inc. 제, Alexandria, VA)를 0.1M의 탄산염-탄산수소염완충액(pH 9.6) 중에서 100㎕의 염소 항-마우스 Ig(10㎕/ml, Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음, 플레이트를 100㎕의 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 포함한 PBS로 실온에서 2시간 처리하였다.

이를 PBS로 세정한 후, 100㎕의 하이브리도마 배양 상청을 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 세정하여, 2000 cpm/0.5 ng/웰이 되도록 ¹²⁵I 표지 재조합 IL-6을 각 웰에 첨가하고, 세정한 후 각 웰의 방사능을 감마 카운터(Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)로 측정하였다. 216 하이브리도마 클론 중, 32 하이브리도마 클론이 IL-6 결합 분석에서 양성이었다. 이들 클론 중에서 안정한 MH166.BSF2가 최종적으로 얻어졌다. 상기 하이브리도마가 생산하는 항-IL-6 항체 MH166은 IgG1κ의 서브타입을 갖는다.

이어, IL-6 의존성 마우스 하이브리도마 클론 MH60.BSF2를 이용해서 MH166 항체에 의한 하이브리도마의 증식에 관한 중화활성을 조사하였다. MH60.BSF2 세포를 1 x 10⁴/200㎕/웰이 되도록 분배하고, 여기에 MH166 항체를 함유하는 샘플을 첨가하고 48시간 배양하고, 0.5μCi/웰의 ³H-티미진(New England Nuclear, Boston, MA)을 첨가한 후 다시 6시간 계속 배양하였다. 세포를 글래스 필터 페이어 상에 놓고, 자동 수확기(Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan)로 처리하였다. 대조로서 토끼 항-IL-6 항체를 이용하였다.

그 결과, MH166 항체는 IL-6에 의해 유도되는 MH60.BSF2 세포의 ³H-티미딘의 병합을 용량 의존적으로 저해하였다. 이에 의해, MH166 항체는 IL-6의 활성을 중화하는 것이 분명해졌다.

참고예 3. 항-인간 IL-6 수용체 항체의 제조

Hirata et al.의 방법(Hirata, Y. et al. J. Immunol.(1989) 143, 2900-2906)에 의해 작성한 항-IL-6 수용체 항체 MT18을 CNBr로 활성화시킨 세파로스 4B(Pharmacia Fine Chemicals 제품, Piscataway, NJ)와 첨부한 처방에 따라 결합시켜, IL-6 수용체(Yamasaki, K. et al., Science(1988) 241, 825-828)를 정제하였다. 인간 골수종 세포계 U266을 1% 디기토닌(Wako Chemicals 제품), 10mM 트리에탄올아민(pH 7.8) 및 0.15M NaCl를 함유한 1mM p-파라-아미노페닐 메탄슬포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드(Wako Chemicals 제품)(디기토닌 완충액)으로 가용화하고, 세파로스 4B 비즈(bead)와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하였다. 그 후, 비즈를 디기토닌 완충액에서 6회 세정하여 면역화에 사용하기 위해 부분정제된 IL-6 수용체를 제조하였다.

BALB/c 마우스를 3 x l0⁹ 개의 U266 세포로부터 얻은 상기 부분정제 IL-6 수용체에서 매 10일마다 4회 면역하고, 그 후 통상적인 방법으로 하이브리도마를 작성하였다. 성장-양성 웰로부터의 하이브리도마 배양 상청을 아래의 방법으로 IL-6 수용체에 대한 결합활성을 시험하였다. 5 x 10⁷개의 U266 세포를 ³⁵S-메티오닌(2.5 mCi)으로 표지하고, 상기 디기토닌 완충액으로 가용화하였다. 가용화된 U266 세포를 0.04 ml 용량의 세파로스 4 B 비즈와 결합시킨 MT18 항체와 혼합하고, 그 후, 디기토닌 완충액에서 6회 세정하고, 0.25ml의 디기토닌 완충액(pH 3.4)으로 ³⁵S-메티오닌 표지 IL-6 수용체를 용출시켜, 0.025ml의 1M Tris(pH 7.4)로 중화하였다.

0.05ml의 하이브리도마 배양 상청을 0.01ml의 단백질 G 세파로스(Phramacia 제품)와 혼합하였다. 세정한 후, 세파로스를 상기에서 조제한 0.005ml의 ³⁵S 표지 IL-6 수용체 용액과 함께 배양하였다. 용액 침강물질을 SDS-PAGE로 분석하여, IL-6 수용체와 반응하는 하이브리도마 배양 상청을 조사하였다. 그 결과, 반응 양성 하이브리도마 클론 PM-1(FERM BP-2998)을 수립하였다. 하이브리도마 PM-1로부터 생산된 항체는 IgG1의 서브타입을 갖는다.

하이브리도마 PM-1이 생산하는 항체의 인간 IL-6 수용체에 대한 IL-6의 결합 저해 활성을 인간 골수종 세포계 U266을 이용해서 조사하였다. 인간 재조합 IL-6을 E. coli로부터 조제하고(Hirano, T. et al., Immunol. Lett.(1988) 17, 41-45), 볼튼-헌터 시약(New England Nuclear, Boston, MA)으로 ¹²⁵I 로 표지하였다(Taga, T. et al., J. Exp. Med.(1987) 166, 967-981).

4x10⁵개의 U266 세포를 1시간 동안 70%(v/v)의 하이브리도마 PM-1의 배양 상청 및 14,000 cpm의 ¹²⁵I 표지 IL-6과 함께 배양하였다. 70㎕의 샘플을 400㎕의 마이크로퓨지 폴리에틸렌 튜브에 300㎕의 FCS 상에 층상화하고, 원심분리 한 후, 세포의 방사능을 측정하였다.

그 결과, 하이브리도마 PM-1이 생산하는 항체는, IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해하는 것을 알게 되었다.

참고예 4. 항-마우스 IL-6 수용체 항체의 제조

Saito, et al., J. Immunol.(1991) 147, 168-173에 기재된 방법으로, 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 제조하였다.

마우스 가용성 IL-6 수용체를 생산하는 CHO 세포를 10% FCS를 함유하는 IMDM 배양액에서 배양하고, 그 배양 상청으로부터 항-마우스 IL-6 수용체 항체 RS12(상기 Saito, et a1 참조)를 Affigel 10 겔(Biorad 제품)에 고정된 친화성 칼럼을 이용해서 마우스 가용성 IL-6 수용체를 정제하였다.

얻어진 마우스 가용성 IL-6 수용체 50㎍을 프로인트 완전 보조액과 혼합하고, 위스터 래트의 복부에 주사하였다. 2주 후부터 프로인트 불완전 보조액으로 추가 면역하였다. 45일째에 래트 비장세포를 수확하여, 약 2 x 10⁸ 개를 1 x 10⁷ 개의 마우스 골수종 세포 P3U1와 50%의 PEG1500(Boehringer Mannheim 제품)을 갖도록 통상적인 방법으로 세포융합시킨 후, HAT 배지에서 하이브리도마를 스크리닝하였다.

토끼 항-래트 IgG 항체(Cappel 제품)를 코팅한 플레이트에 하이브리도마 배양 상청을 첨가한 후, 마우스 가용성 IL-6 수용체를 반응시켰다. 이어서, 토끼 항- 마우스 IL-6 수용체 항체 및 알칼리성 포스파타제-표지 양 항-토끼 IgG에 의한 ELISA 법으로 마우스 가용성 IL-6 수용체에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하였다. 항체의 생산이 확인된 하이브리도마 클론은 2회의 서브스크리닝을 실행하여, 단일의 하이브리도마 클론을 얻었다. 이 클론을 MR16-1이라 이름붙였다.

이 하이브리도마에 의해 생산된 항체의 마우스 IL-6의 정보전달에서의 중화활성을 MH60.BSF2 세포(Matsuda, T. et al., J. Immunol.(1988) 18, 951-956)를 이용한 ³H-티미딘 병합으로 조사하였다. 96-웰 플레이트에, MH60.BSF2 세포를 1 x 10⁴ 개/200㎕/웰이 되도록 제조하였다. 이 플레이트에 10pg/ml의 마우스 IL-6과 MR16-1 항체 또는 RS12 항체를 12.3 ~ 1000ng/ml를 첨가해 37℃, 5% C0₂에서 44시간 배양한 후, 1μCi/웰의 ³H-티미딘을 첨가하였다. 4시간 후에 ³H-티미딘의 병합을 측정하였다. 그 결과 MR16-1 항체는 MH60. BSF2 세포에 의한 ³H-티미딘 병합을 억제하였다.

따라서, 하이브리도마 MR16-1(FERM BP-5875)에 의해 생산된 항체는 IL-6의 IL-6 수용체에 대한 결합을 저해한다는 것을 알게 되었다.

Claims (45)

1. IL-6 안타고니스트를 활성성분으로 포함하는 내이장해 치료 및/또는 예방제.
2. 제1항에 있어서, 상기 내이장해는 감각신경성 난청인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
3. 제2항에 있어서, 상기 감각신경성 난청은 메니에르병, 약물성 내이장해, 바이러스성 내이염, 화농성 내이염, 측두골 골절 또는 청신경 종양에 기인하는 감각신경성 난청인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
4. 제2항에 있어서, 상기 감각신경성 난청은 돌발성 난청, 노인성 난청 또는 소음난청인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
5. 제1항에 있어서, 상기 내이장해는 전정기관 장해인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
6. 제5항에 있어서, 상기 전정기관 장해는 메니에르병, 전정기관 신경염 또는 약물성 내이장해에 기인하는 전정기관 장해인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 안타고니스트는 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
8. 제7항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
9. 제8항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
10. 제8항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 재조합 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
12. 제9항에 있어서, 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
13. 제10항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는 MR16- 1 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 IL-6 수용체에 대한 키메라항체, 인간형화 항체 또는 인간항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
15. 제14항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체는 인간형화 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방제.
16. 내이장해의 치료 및/또는 예방제를 제조하기 위한 IL-6 안타고니스트의 용도.
17. 제16항에 있어서, 상기 내이장해는 감각신경성 난청인 것을 특징으로 하는 용도.
18. 제17항에 있어서, 상기 감각신경성 난청은 메니에르병, 약물성 내이장해, 바이러스성 내이염, 화농성 내이염, 측두골 골절 또는 청신경 종양에 기인하는 감각신경성 난청인 것을 특징으로 하는 용도.
19. 제17항에 있어서, 상기 감각신경성 난청은 돌발성 난청, 노인성 난청 또는 소음난청인 것을 특징으로 하는 용도.
20. 제16항에 있어서, 상기 내이장해는 전정기관 장해인 것을 특징으로 하는 용도.
21. 제20항에 있어서, 상기 전정기관 장해는 메니에르병, 전정기관 신경염 또는 약물성 내이장해에 기인하는 전정기관 장해인 것을 특징으로 하는 용도.
22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 안타고니스트는 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
23. 제22항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
24. 제23항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
25. 제23항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 재조합 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
27. 제24항에 있어서, 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
28. 제25항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는 MR 16-1 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 IL-6 수용체에 대한 키메라항체, 인간형화 항체 또는 인간항체인 것을 특징으로 하는 용도.
30. 제29항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체는 인간형화 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
31. IL-6 안타고니스트를 개체에 투여하는 것을 포함하는 내이장해 치료 및/또는 예방방법.
32. 제31항에 있어서, 상기 내이장해는 감각신경성 난청인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 감각신경성 난청은 메니에르병, 약물성 내이장해, 바이러스성 내이염, 화농성 내이염, 측두골 골절 또는 청신경 종양에 기인하는 감각신경성 난청인 치료 및/또는 예방방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 감각신경성 난청은 돌발성 난청, 노인성 난청 또는 소음난청인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
35. 제31항에 있어서, 상기 내이장해는 전정기관 장해인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 전정기관 장해는 메니에르병, 전정기관 신경염 또는 약물성 내이장해에 기인하는 전정기관 장해인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 안타고니스트는 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 IL-6 수용체에 대한 모노 클로날 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
40. 제38항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
41. 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 재조합 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
42. 제39항에 있어서, 상기 인간 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는 PM-1 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
43. 제40항에 있어서, 상기 마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체는 MR 16-1 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 항체는 IL-6 수용체에 대한 키메라 항체, 인간형화 항체 또는 인간항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 IL-6 수용체에 대한 인간형화 항체는 인간형화 PM-l 항체인 것을 특징으로 하는 치료 및/또는 예방방법.

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