JP5314033B2 - 突然変異IgGFcフラグメントと融合した単一IFN−ベータ - Google Patents
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Description
本発明は、肺を通じて、経口的に、又は皮下的に取り込まれて送達され得る、突然変異IgG Fcドメインと融合した単一IFN−ベータ(以下、sIFNベータ−IgGFcmutと称する)に関する。本発明のsIFNベータ−IgGFcmutは、循環系の中でなおも高い血清レベル及び半減期を維持しつつ、Fcエフェクター作用を低下させ、良好な生体活性を示す。
T250Q及び/又はM428L、
M252Y、S254T、T256E、H433K及び/又はN434F、
E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S及び/又はP331S、
E333A及び/又はK322A。
1.RP−HPLC
HPLC: Agilent 1100 Seriesシステム(Agilent Technologies)
カラム: Aquapore BU−300 30x2.1mm(Brownlee 0711−0062)
溶媒A: 水中0.1%TFA
溶媒B: 90%アセトニトリル中0.1%TFA
勾配(Gradient): ProtC4
15μl注入する。タンパク質を、最終体積が100μlとなるように溶媒Aに溶解する。
ゲル: NuPage 4−12% Bis−Tris(Invitrogen NP0322)
緩衝剤: NuPage MES SDS 泳動緩衝剤(Invitrogen NP0002)及び10x濃縮サンプル緩衝剤を使用する。還元条件にするため、10mMのDTTを添加する。
泳動条件: 200Vで40分間泳動する。
10μlを充填する。タンパク質を、最終体積が20μlとなるように10xサンプル緩衝剤に溶解する。95℃で5分間加熱する。0.1%クーマシーブルー、30%メタノール、10%酢酸中で、45分間染色する。30%メタノール、10%酢酸中で脱染色する。
ゲル: pH3〜10 IEFゲル(Invitrogen ECC6655A)
緩衝剤: IEF Anode緩衝剤(Invitrogen LC5300)、IEF Cathode緩衝剤(Invitrogen LC5310)、IEF pH3〜10 サンプル緩衝剤(Invitrogen LC5311)
泳動条件: 100vで1時間、200vで1時間、400vで1時間とする。
30%メタノール、10%酢酸で30分間2回固定する。0.1%クーマシーブルー、30%メタノール、10%酢酸中で、45分間染色する。30%メタノール、10%酢酸中で脱染色する。
ブロッキング溶液: PBS/0.1%、Triton X100、5%ミルク
洗浄溶液: PBS/0.1%、TritonX100
抗体溶液: 洗浄溶液で抗体を希釈する。
ECLによるウエスタンブロッティング: 試薬に付属している手順に従う。
抗Fc抗体=ヤギ抗ヒトIgG、FcフラグメントHRP(1,000x希釈)(Jackson 109−036−098)
抗IFN−ベータ=
一次抗体=抗IFN−ベータ−mab 117.1 0.1μg/ml
二次抗体=ヤギ抗マウスIgG HRP(1,000x希釈)(Dako P0447)
N−グリコシダーゼF(Roche 11 365 193 001)
リン酸緩衝剤pH7.5/10%アセトアミド中に10μgのsIFNベータ−IgGFcmutを添加する。これに5UのPNGase Fを添加して、37℃で一昼夜インキュベーションする。
試料を、4MグアニジンHCL、10mM DTT中で、56℃で1時間インキュベーションする。
200ピコモルを充填する。シークエンシングの前に、試料をProsobカートリッジ(ABI 402052)に充填する(Prosorbカートリッジは、シークエンシングに適したマトリックス(PVDF膜)上に希釈したタンパク質試料を迅速に濃縮及び洗浄するために設計されている)。
装置:
Microgradient 140C HPLC (Applied Biosystems)と接続したModel 494 Prociseマイクロシークエンシングシステム。
アミノ酸解析は、真空下窒素中の気相加水分解により実行される。1mg/mlのフェノールを含む6N HCl中で、112℃で24時間処理(Atmosphere)する。アルファアミノ駱酸(AAbA)を、内部標準として加水分解産物中に含ませる。試料を2回解析する。加水分解したアミノ酸を、Waters ACCQ. Tag化学パッケージを使用して定量する。
これは、カラム前誘導体化技術である。AA誘導体をRP−HPLCで分画し、そして蛍光検出により定量する。A3レベルの較正が得られる(20、50、及び100ピコモル)。
i)タンパク質加水分解:
反応バイアル集合(assembly)( Waters WAT007363)
試料チューブ(Waters WAT007571)
Pico. Tag ワークステーション(Waters WAT007370)
HPLC: Agilent 1090 Seriesシステム(Agilent Technologies)
検出器: FLD G1321A Agilent 1100シリーズ(Agilent Technologies)
励起: 250nm
放射: 395nm
カラム: AccQ.Tag C184μm 3.9x150mm(Waters WAT052825)
溶媒A: 900ml H2O+90ml AccQ.Tag Eluent A Concentrate (WAT052890)
溶媒B: 水中60%アセトニトリル(Baker 9017)
マススペクトロメトリー解析は、リニアモードで操作するVoyager DE−PRO MALDI−TOFマススペクトロメーター(Applied Biosystems)で実行された。エネルギー吸収分子として、シナピン酸を使用した。精製されたタンパク質試料を、1mg/mlの濃度の0.1%TFA溶液中に懸濁した。試料標的上に、1mgのタンパク質をスポットした。該タンパク質液滴上に1μlの飽和シナピン酸溶液(H2O+0.1%TFA中50%アセトニトリル)を重層し、室温で感想させた。ABIの較正標準を使用して、各解析において質量較正を行った。
HPLC: Waters Alliance 2695
移動相: 最終pH7.5の5OmMリン酸ナトリウム+NaCl 500mM
カラム: 室温のSuperdex 200 10/300GL。カラムは、垂直に使用しなければならない。
流速: 500μL/分〜750μL/分(圧力は最高で210psi)
オートサンプラー: 5℃のWaters Alliance 2695
検出: Waters Fluorescence 2475(Empower Softwareのエミュレーション474を用いる)を、励起波長280nm、放射波長348nm、ウインドウ18nm、ゲイン100, 減衰1で使用する。
本発明の好ましいタンパク質は、コンパウンド1と称される、sIFNベータ−IgGFcmutである。コンパウンド1において、1つのサブユニット(IFNベータ−Fcmut腕部、配列番号8)は、IFN−βと、ヒトIgG1 Fcドメインの突然変異Fcドメインとの融合産物である。他のサブユニット(Fcmut腕部、配列番号3)は、前記第一のサブユニットのFc部分単独と同一である。両サブユニット中に存在するFc部分の配列は、イムノグロブリンエフェクター機能を低下させるべく、「G1M(non−1)マーカー」アロタイプの5つのアミノ酸を置換することにより改変されている(図1、3及び4)。比較のために、本明細書中で「コンパウンド2」と称される、WO 2005/001025に開示される、IFN−ベータのモノマー−ダイマータンパク質が調製される。コンパウンド2は、IFN−ベータとFcドメインとの間に8アミノ酸のリンカー配列を含み、異なるIgG1アロタイプと比較して、Fcドメインにおいて1つだけ突然変異(即ち、EUインデックス位置表記でN297E)を含む(図4)。
コンパウンド1の生産に使用される発現ベクターC370(図11;C370ベクターの配列は、配列番号12に記載される)は、双方向性マウスCMVプロモーター(IE1及びIE2)を含む。IFN−ベータをコードする配列は、ヒトゲノムDNAに由来するものであった。IgG1重鎖cDNAクローン(「G1M(non−1)マーカー」アロタイプ)は、ヒト脾臓cDNAライブラリーに由来するMGC/Image共同体クローンから取得されるものであった。突然変異ヒトIgG1 Fcドメイン(IgGFcmut)は、「G1M(non−1)マーカー」アロタイプに由来するFcドメインを含むPEAK8プラスミドからPCRにより取得されるものであった。ここで該Fcドメインは、Quik change II突然変異生成システム(Stratagene)を使用する2つの工程において突然変異したものであった。幾つかの単アミノ酸置換をFcドメインに導入することにより、ADCC/CDCを媒介するのに重要なアミノ酸を突然変異させた(図2〜4)。第一の工程において、配列番号1の117LLGG120(即ちEUインデックスの234LLGG237)アミノ酸をコードする配列を、117AEGA120に突然変異させた。第二の工程において、配列番号1のA213(EUインデックスのA330)及びP214(EUインデックスのP331)アミノ酸をコードする配列を、S213及びS214に突然変異させた。sIFNベータ−IgGFmutのFc腕部とフレームを合わせた同種シグナルペプチド配列を含んで、IFN−ベータをコードするcDNAを、オーバーラッピングPCR(overlapping PCR)により作製し、そしてIE1プロモーターの下流をサブクローニングした。他の突然変異sIFNベータ−IgGFmutのFc腕部の配列をコードする配列と融合したマウスIgk軽鎖のシグナルペプチド配列をコードするcDNAをPCRにより作製し、IE2プロモーターの下流をサブクローニングした(図11)。
それから、組換えPCRによりIFNベータ−Fmut腕部融合遺伝子を作製し、これをCHO細胞内で高いレベルで恒常的に発現する発現ベクターにクローニングした。最終的なベクターC370は、マウス双方向性CMVプロモーターを含む。
ステーブルトランスフェクションの水準を保証するために、トランスフェクション用プラスミドDNAを調製した。DH5α細菌(Invitrogen, Cat. #18265−017)を、供給元のプロトコルに従って、オリジナルプラスミドDNAを用いて形質転換し、アンピシリン100μg/mlの選択圧下で選択した。単一コロニーを拾い;細胞をアンピシリン100μg/mlを含む1mlのLB中で細胞を一昼夜培養して、それから100mlの培養で一昼夜増幅した。プラスミドは、Nucleobond PC 500 EFキット(Macherey−Nagel, Cat. #740550)のプロトコルに従って単離した。単離したプラスミドの水準は、OD260nm及びOD280nmを測定し、そしてOD260nm/OD280nmの比率が1.8を超えていることを測定することにより評価した。プラスミドの同一性は、4つの制限酵素を独立した反応で用いるDNA消化により評価した。Fcmut腕部及びIFNベータ−Fmut腕部のコード領域は、トランスフェクションに先立って両方向からシークエンシングされた。更に、プラスミドDNAは、元のベクターを切断する適切な酵素を用いて直鎖にされた。本ベクターC370は、ClaI(1.255 μg/μl)を用いて直鎖化された。
前記CHO−S細胞は、Invitrogenから入手した。トランスフェクションしていないCHO−S細胞は、L−グルタミン(Sigma, Cat. #G7513)を4.5mM添加したProCHO5培地(Bio Whittaker, Cat. #12−7660)中で培養した。トランスフェクションは、前記培地中で行った。選択において、4.5mMのL−グルタミン及び10μg/mlのピューロマイシン(Sigma, Cat. #P−7255)を添加したProCHO5培地を使用した。130rpmで振盪するT75フラスコ又はErlenmeyer(135 ml)フラスコ中で懸濁条件下の前記細胞株を培養し、これを5%CO2を含む37℃インキュベーター中でインキュベーションした。基本的に、週2〜3回の頻度で、0.2x106生存細胞/ウェルに希釈して、細胞を継代した。
通常、バイアル当り5〜10x106生存細胞の密度で細胞を凍結した。必要な量の細胞を遠心分離し、それから0.5mlのProCHO5培地に再懸濁した。次に、DMSO(Sigma)を15%添加した0.5mlのProCHO5凍結培地(Bio Whittaker, Cat. #12−768E)を添加した。この細胞を−80℃で凍結し、それから窒素で冷却した保存タンクに移した。
トランスフェクションの前日に、4.5mMのL−グルタミンを添加したProCHO5培地中で培養していたCHO−S細胞を、0.7x106生存細胞/mlに希釈した。トランスフェクションは、12mlnのCHO−S及び10μg(8μl)のC370を用いて、エレクトロポレーションにより実行した。
トランスフェクションの48時間後、細胞を計数し、遠心分離により培地を除去し、それから細胞を選択培地(L−グルタミン4.5mM及びピューロマイシン10μg/mlを添加したProCHO5)中で0.5x106生存細胞/mlに希釈した。培地は、2日置きに交換した。期間中、細胞密度をモニタリングし、生存細胞の数が0.1x106生存細胞/mlを下回ったときは、細胞をより小さい体積にまとめた。あるいは、生存細胞の数が増大したときは、細胞を0.4〜0.5x106生存細胞/mlに希釈した。この手順を、プールの生存率が90%に達するまで繰り返した。取得されたプールの生産率(タイター及び1日の細胞あたりのピコグラム(pcd))、及び生体活性(バイオアッセイ)が試験され、これらを単離プロトクローン(protoclone)に直接使用する。
ステーブルトランスフェクション細胞のプールを、0.3%(v/v)の0.5%フェノールレッド溶液(Sigma, Cat. #P0290)を添加した選択培地で、ウェルあたり(70μl)1個の細胞が含まれるように希釈し、これを、Multidrop分注ロボット(Thermo Labsystems)を用いて、384ウェルにプレーティングした。播種の2週間後、単一のプロトクローンを拾い、これを選択剤を含まない適切な培地200μlに懸濁し、これを96ウェルに再播種した。Beckman Biomek 2000ロボットを用いて、細胞を、1週間に1回20倍に希釈した。
前記培養プロトクローンを、0.3%(v/v)のフェノールレッド溶液を添加した適切な培地で、0.4細胞/ウェル(70μl)の濃度に希釈し、これを、Multidrop分注ロボットを用いて384ウェルにプレーティングした。播種の4、5日後、各ウェル中の増殖を検鏡し、単一のクローンのみ増殖しているウェルにマークを付けた。クローン性を確認するために、増殖細胞を有するウェルの数を計数し、これがプレート全体の33%未満となるように維持した。培養の15日後、選択されたクローンを24ウェルプレートに移し、これを増殖させ、それから、定量Biacoreアッセイを用いて最初のプロトクローンのそれぞれにおける6つのクローンの生産性を更に解析した。T75フラスコ中で、タイター及び特定の生産性(Specific productivity)を、24時間ごとに評価した。最良のクローンを4つ選択し、更に振盪フラスコ実験において解析した。あるいは、Biacore法に代えて、RP−HPLC及びSE−HPLCを、解析法として使用する場合がある。
タンパク質濃度及び特定の生産性を、24時間ごとに測定した。このために、細胞を、10mlの新鮮な培地(60rpmで攪拌するT75フラスコ中)中に0.8x106生存細胞/mlで再懸濁した。24時間後、細胞を計数し、1mlの培養液を回収し、IFN−β特異的Biacoreアッセイに供した。特定の生産性(1日の細胞あたりのピコグラム(pcd)で表される)は、タイター(mg/l)/期間の始まりから終わりまでの間の平均細胞密度/期間の長さ(1日)として、計算した。攪拌フラスコ実験において、pcdは、所定の期間にわたるIVCの機能として計算した。
培養上澄を、ウェスタンブロット解析に供した。簡単に述べると、タンパク質試料を厚さ1mmの8〜18%濃度勾配アクリルアミドゲルを使用して、4℃で交流(30mA)のSDS−PAGEで分離し、その後、これをPVDF膜に転写した。抗IFNβ又はFcモノクローナル抗体を、エピトープ検出に使用した。
RNeasy MiniKitのプロトコル(Qiagen, Cat. #74104)に従い、8x106細胞からRNAを単離した。製造者のプロトコルに従い、NorthemMax(登録商標)−Gly kit(Ambion, Cat. #1946)を使用して、ノザンブロットを実行した。ウェルあたり100ngのRNAをウェルに注入し、これをアガロースゲル電気泳動(1%アガロース)により分離し、それからTurboblotterキット(Schleicher & Schuell, Cat. #10416328)を使用して、これをBrightStar−Plus膜(Ambion, Cat. #10102)に転写した。10μgのRNAラダー(Invitrogen, Cat. #15620−016)をサイズマーカーとして使用した。UV架橋(Strataリンカー)によりRNAを不動化し、そして焼き固めた(10分、70℃)。供給者のプロトコルに従い、DIG Northern Starter Kit (Roche, Cat. #2039672)を使用して、DIGを用いたプローブ標識及びハイブリダイゼーション(68℃)を実行した。ハイブリダイゼーションには、100ng/mlのRNAプローブを使用した。T3 RNAポリメラーゼを用いる標準的なインビトロ転写プロトコルを使用して、プローブを調製した。
1.発現
60mgのコンパウンド1を生産するために、5Lスケールのバイオリアクター中で、一般的培養プロセスを実行した。使用する細胞株(クローン)はCHO−Sであり、これを、「ボーラス流加培養」法(単一添加物を用いたバッチ培養)中、無血清条件下で培養した。所望の量を生産するには、これを2回行う必要がある。
−温度=37℃、細胞密度が最大になったときは32℃に下げる。
−攪拌=100rpm、最初のボーラス添加後、120〜130rpmに上げる。
−最高pH=7.3.CO2インキュベーションにより、アルカリ化を制御した。
PO2=飽和濃度の50%とした。
生産される他の形態からsIFNベータ−IgGFcmutタンパク質を効果的に単離する精製プロトコルが開発された。最初のCHOプールの培養により生産される材料を用いて、精製プロセスが構築された。これを直接スケールアップし、プロトクローンから細胞培養上澄を精製するのに使用した。
−「遊離Fcダイマー」(Fcmut腕部/Fcmut腕部)
−「sIFNベータ−IgGFcmut」(Fcmut腕部/IFNベータ−Fcmut腕部ヘテロダイマー)
−「IFN−ベータダイマー」(IFNベータ−Fcmut腕部/IFNベータ−Fcmut腕部ホモダイマー)。
53mlのMab Select Sure (GE Healthcare)を充填したカラムをPBSで平衡化した後、線流速を35cm/hまで低下させることにより、カラム上に一昼夜前記試料を注入した。それから、アウトプットシグナルがベースラインまで後退するまで、該カラムをPBSで洗浄した。100%の0.1Mグリシン(pH2.7)を用いて、溶出は単一の工程で行われた。溶出ピークがプールされ、1mg/mlの濃度に相当するA[280]=1.38AUをもたらすモル吸光係数110230を使用するUVにより定量された。
G25の緩衝剤交換工程の後、タンパク質の内容を定量し、そして該溶液を、Blue Sepharose 6 Fast Flowゲル(GE Healthcare)に注入した。これを2回並行して行った。sIFNベータ−IgGFcmutはこの媒体と容易に結合するが、遊離Fcダイマーの殆どは、フロースルー分画に回収される。
Blue Sepharose工程で得られた溶出物を、50mMのトリス(pH8.5)で緩衝剤交換し、これをQ Sepharose Fast Flowカラムに注入した。50mMのトリス(pH8.5)で洗浄した後、0.5MのNaCl+50mMのトリス(pH8.5)に達する塩勾配を適用した。sIFNベータ−IgGFcmutを含む強い主要なピークを回収し、UV−光度分析により定量した。
前記タンパク質溶液は、サイズ排除クロマトグラフィーに付された。高い分解能を維持するために、注入する体積を最小にし、故に、複数回の注入が必要であった。前記タンパク質を50mMトリス+500mM NaCl+10%グリセロール(pH7.5)中で製剤化する旨が明記されていたので、ゲル濾過に使用された緩衝剤は、50mMトリス(pH7.5)+500mMNaClであった。所望のタンパク質中に凝集物やIFN−ベータダイマーが入り込まないように、鋭いピークの中央部分のみを回収した。それから、カットオフが10kDaのCentriprepフィルターを用いて前記タンパク質を1mg/mlにまで濃縮し、10%グリセロールを添加した。最後に、この溶液を、0.22μm膜で滅菌し、分注した。バイアルを、−80℃で保存した。
実施例1及び2に従い、コンパウンド1を発現するプールの生産が実行された。トランスフェクション及び選択の後、IFN−βを測定するために開発されたBiacoreアッセイを用いて、前記分子の発現を試験した。
4.1.使用されるバッチ
コンパウンド1を、前記元の緩衝剤:5OmMリン酸ナトリウム+NaCl 500mM+10%グリセロール(pH7.5)で1:2に希釈した。試験に供されるタンパク質は、0.66mg/mlであった。
SE−HPLCによる熱安定性:
−1週間40℃
−1ヶ月5℃
−25℃で1ヶ月25℃
1サイクル及び5サイクル凍結/融解(−20℃)後の安定性を、SE−HPLCで測定した。
t=0の時点で、試料は、sIFNベータ−IgGFcmutの濃度は98.5%以上で、HMWは2%未満であった。
試料を試験濃度に希釈し、4℃で少なくとも24時間保管して平衡化する。それから、t=0時点でのSECプロフィールを測定した後、試料を少なくとも1日−20℃で保管し、それから+4℃で(少なくとも1日)溶解して、これをSECで解析する。
試料を試験濃度まで希釈し、これを4℃で少なくとも24時間保管して平衡化する。それから、t=0時点でのSECプロフィールを測定した後、試料を少なくとも1日−20℃で保管し、それから+4℃で(少なくとも1日)溶解して、これと同じ手順でこのサイクルを5回繰り返して凍結/融解する。最後に、5回目の融解の終了時(及び少なくとも24時間4℃の再平衡化の時点)試料をSECにより解析する。
タンパク質を、50mMリン酸ナトリウム+500mM NaCl+10%グリセロール(pH7.5)からなる緩衝剤(予備調製)中で、−80℃で保存した。該パッチは、1.32mg/mlの濃度のコンパウンド1を含んでいた。保存緩衝液中のこのバッチについて、安定性及びF/T試験を行った。
5.1.導入
IFN−β1a(参照調製物3MIU/mL、11μg/mL)と比較して、IFN−β−Fcヘテロダイマータンパク質の2つの調製物、コンパウンド1及びコンパウンド2の生物学的挙動を、抗ウイルス性(WISHA/SV、図5)及び抗増殖性(WISH細胞、図6)、及びレポーター遺伝子アッセイ(pMx−LucでトランスフェクションしたサルVera細胞)の観点から評価した。
5.2.1抗ウイルスアッセイ
IFN−β−Fcヘテロダイマータンパク質の抗ウイルス活性を、WISH細胞(羊膜)にIFN−β分子が及ぼす、水疱性口内炎ウイルス(VSV; Rubinstein et al. 1981)による細胞変性作用(CPE)に対する防御効果を測定することにより研究された。
MEM+5%FBS中のWISH細胞を、9つ連続で1:2に希釈していったIFN−β試料(40ng/mLで開始する)を含む96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェル中に、1x104細胞の密度で播種して、細胞を、37℃、5%CO2で、72時間インキュベーションした。このインキュベーション時間の最後に、細胞をMTTで染色し、マルチウェル走査型分光光度計により、各ウェル中の光学密度(595nmのO.D.)を測定した。
レポーター遺伝子アッセイ(RGA)は、IFN−β活性をモニタリングするための高度に特異的かつ高感度のインビトロバイオアッセイとして開発された。内性的IFN−α及びIFN−βが欠損しているVero細胞(アフリカミドリザル腎臓細胞、ATCC, CCL 81)に、IFN−α/β誘導性マウスMx1プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を担持するpMx−Lucプラスミドを用いてステーブルトランスフェクションした。IFN−βによるLuc誘導性に基づき、1つのクローンを選択した(Canosi et al. 1996)。
−コンパウンド1:0.94mg/ml IFN−β−Fc=0.26mg/mL IFN−β、
−コンパウンド2:1.10mg/ml IFN−β−Fc=0.31mg/mL IFN−β。
使用される細胞の種類に拘らず、sIFNβ−IgGFcmut(コンパウンド1)は、EUインデックスの位置表記で297がNからAに突然変異しているモノマー−ダイマータンパク質(コンパウンド2;図5〜7)、及びヒト組換えIFN−β調製物と比較可能な生体活性を示した。
コンパウンド1及びコンパウンド2のタイターは、理論に基づいて計算され、そしてIFN−βのタイター決定に現在利用されている標準的な方法(VSV−WISH)を使用して決定された。その結果を、表2にまとめる。
IFN−β(22kD)において、MIUからμgへの変換係数は3.66である。ゆえに、1MIUは、3.66μgに対応する。
7.1.導入
IFN−β融合タンパク質は後退Fc部分を有しているため、抗体に関連するエフェクター作用:抗体依存性細胞傷害(ADCC)及び補体依存性細胞傷害(CDC)を引き起こす可能性を有する。
コンパウンド1及びコンパウンド2は、ヒトIgG1と比較して、CD64(FcγRI)との結合能力の低下を示す。
ヒトIFN−βにヒトとほぼ同レベルで応答する唯一の動物であるサルにおいて、薬物動態/薬力学(PK/PD)試験を実行した。
コンパウンド1は、Fcγ受容体及びC1qとの結合を低下させるための幾つかの突然変異を含む。これらの突然変異がコンパウン1のPK/PD能力を変化させるか否かをチェックするために、ヒトIFN−ベータに応答する唯一の動物種であるサルにおけるインビボ研究を実行した。第一の群は、参照として、皮下投与により55 pMol/kgのRebif(登録商標)の投与を受けた。第二のサル群はコンパウンド2の投与を受け、一方第三のサル群はコンパウンド1の投与を受け、これらはいずれも、138pMol/kgの用量が肺に沈着するように吸入投与されたものである。IFN−β、コンパウンド1及びコンパウンド2は、ネオプテリンと共に、血清レベルが測定された。非コンパートメント解析に従い、投与前に既に存在していた濃度を差し引いた後、PK及びPD解析を実行する。
皮下経路で55pMol/kgのRebif(登録商標)を投与した後のIFNβの血清レベル、平均沈着用量が138pMol/kgとなるように吸入経路で投与した後のコンパウンド1の血清レベル、そして平均沈着用量が138pMol/kgとなるように吸入経路で投与した後のコンパウンド2の血清レベルの平均血清プロフィールを、図10に示す。コンパウンド1及びコンパウンド2の平均沈着用量が138pMol/kgとなるように吸入投与した後、平均Cmaxは、中央時間の8時間において、22.51+7.43pMol/L(コンパウンド2)及び16.36+6.94pMol/Lであり、これらは、Rebif(登録商標)の平均Cmaxが、中央tmaxの3時間の時点で1.40±1.10pMol/Lに達したことと対比されるべきである。AUClastは、コンパウンド2において886+393h.pMol/Lであり、コンパウンド1において505+322h.pMol/Lであり、これらは、Rebifの平均AUClastが12.5+20.0h.pMol/Lであったことと対比されるべきである。
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- 2つのサブユニットを含む突然変異IgG Fcドメインと融合した単一IFN−ベータ(single IFN−beta)を含むタンパク質であり、第一のサブユニットがIFN−ベータタンパク質と連結していない突然変異IgG Fc腕部を含み、第二のサブユニットが単一IFN−ベータタンパク質と連結した突然変異IgG Fc腕部を含み、該第一のサブユニットが、配列番号3の配列からなり、該第二のサブユニットが、配列番号8の配列からなる、前記タンパク質。
- 請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号4の配列若しくは配列番号9の配列を含み、又はこれらの配列からなる、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号12の配列を含み、又はこの配列からなる、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項2〜4のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項5に記載のベクターを用いて形質転換した宿主細胞。
- CHO細胞である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 請求項1に記載のタンパク質を含む医薬組成物。
- 医薬として使用される請求項8に記載の医薬組成物。
- 多発性硬化症治療用の医薬を調製するための、請求項9に記載の医薬組成物の使用。
- 請求項1に記載のタンパク質の製造方法であって、請求項6又は7のいずれかに記載の宿主細胞の培養、及び前記タンパク質の単離を含む方法。
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