KR20150004856A - Cd3 결합 폴리펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD3에 특이적으로 결합하거나 이와 상호작용하는 단일특이적 및 다중특이적 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이 폴리펩타이드는 항체, 이의 단편, scFv, Fab, 다이-scFv 단일 도메인 항체, 이중항체, 이중 가변 도메인 결합 단백질 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에서, 다중특이적 폴리펩타이드는 T-세포 상의 T-세포 수용체 복합체 및 종양 항원 둘 다에 결합하여 표적-의존적 T-세포 세포독성, 활성화 및 증식을 유도한다.

Description

CD3 결합 폴리펩타이드{CD3 BINDING POLYPEPTIDES}
관련 발명
본 발명은 PCT 출원 제PCT/US12/034575호(출원일: 2012년 4월 20일, 발명의 명칭: "Prostate-Specific Membrane Antigen Binding Proteins And Related Compositions And Methods")에 관한 것으로, 이는 미국 가출원 제61/478,449호(출원일: 2011년 4월 22일)에 대한 우선권을 청구하고 또한 미국 출원 제61/636,557호(이들 세 출원은 그 전문이 참조로 포함됨)에 관한 것이다.
기술분야
본 발명은 CD3에 결합하고 이와 상호작용하는 단일특이적 및 다중특이적 단백질 치료제에 관한 것이다. 이는 항체, 이의 단편, scFv, Fab, 다이-scFv 단일 도메인 항체 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
첨부된 서열 목록
본 명세서과 함께 전자 제출된 텍스트 파일(파일명: "2479_113PC03_SequenceListing_ascii.txt", 크기: 459,722바이트; 작성일: 2013년 4월 16일)의 내용은 그 전문이 참조문헌으로 포함된다.
예컨대 장기 동족이식편 거부반응의 치료에서 자가면역 질환 및 관련 장애의 치료에 항-CD3 단클론성 항체에 의한 인간 T-세포 상의 TCR 복합체의 표적화가 이용되고 제안되었다. 인간 CD3, 예컨대 OKT3에 특이적인 마우스 단클론성 항체(Kung et al. (1979) Science 206: 347-9)는 이러한 치료의 제1 세대이다. OKT3이 강한 면역억제 효능을 갖지만, 이의 임상 사용은 이의 면역원성 및 유사분열촉진 가능성과 관련된 심각한 부작용에 의해 방해된다(Chatenoud (2003) Nature Reviews 3:123-132). 이는 항글로불린 반응을 유도하여, 이의 자체의 신속한 청소(clearance) 및 중화를 촉진한다(Chatenoud et al. (1982) Eur. J. Immunol. 137:830-8). 또한, OKT3은 실험실내 T-세포 증식 및 사이토카인 생성을 유도하고, 생체내 사이토카인의 대규모 방출을 발생시킨다(Hirsch et al. (1989) J. Immunol 142: 737-43, 1989). 사이토카인 방출("사이토카인 스톰"이라고도 칭함)은 결국 열, 오한, 두통, 구역, 구토, 설사, 호흡 곤란, 패혈성 뇌수막염 및 저혈압을 특징으로 하는 "감기 유사" 증상을 발생시킨다(Chatenoud, 2003). 이러한 심각한 부작용은 이식에서의 OKT3의 더 광범위한 사용 및 다른 임상 분야, 예컨대 자가면역으로의 이의 사용의 확장을 제한한다(Id .).
항-CD3 단클론성 항체의 제1 세대의 부작용을 감소시키기 위해, 인간 IgG 서열로의 쥣과 항-CD3 단클론성 항체의 상보성 결정 영역(complementarity-determining region: CDR)의 그래프팅뿐만 아니라, 사이토카인 스톰 발생을 감소시키는 Fc로의 비-FcR-결합 돌연변이로의 도입에 의해 유전 조작된 항-CD3 단클론성 항체의 제2 세대가 개발되었다(Cole et al. (1999) Transplantation 68: 563; Cole et al. (1997) J. Immunol. 159: 3613). 또한 PCT 공보 제WO2010/042904호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)를 참조한다.
CD3을 표적화하는 단일특이적 치료제 이외에, T-세포 및 종양 세포에 선택적으로 결합하는 다중특이적 폴리펩타이드는 암의 치료 및 종양 세포를 향해 T-세포 세포독성을 재지향시키는 기전을 제공한다. 그러나, 이중특이적 또는 다중특이적 T-세포 동원 항체를 설계하는 하나의 문제점은 특이성을 유지시키면서 동시에 다수의 조절 경로에 의해 T-세포 활성화의 조절을 무효화하는 것이다.
개선된 항-CD3 단일특이적 및 다중특이적 분자에 대한 수요가 존재한다. 사이토카인 스톰의 가능성을 감소시키는 CD3 표적화 분자의 Fc 부분에서 이전의 개선이 이루어졌지만, 선행 기술 분자에 비해 반감기가 증가하고, 효과적으로 제조될 수 있고, 개선된 T-세포 결합 및/또는 개선된 재지향된 T-세포 세포독성(암의 치료에 설계된 다중특이적 분자의 경우)을 나타내는 항-CD3 치료제에 대한 수요가 여전히 존재한다.
일 양상에서, 본 발명은 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 결합 도메인과 비교하여 등전점이 감소된 CD3 결합 도메인을 포함하는 CD3 결합 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 VH 및 VL 구역을 포함하고, 각각의 VH 및 VL 구역은 프레임워크(framework) 구역을 포함한다. 결합 도메인 및/또는 폴리펩타이드의 등전점(pI)을 감소시키기 위해, 2개 이상의 아미노산은 프레임워크 구역 내에 중성 아미노산에 의한 양으로 하전된 아미노산의 치환 및/또는 음으로 하전된 아미노산에 의한 중성 아미노산의 치환에 의해 변형될 수 있다. 예를 들면, R 및 T는 S로 치환될 수 있고, Q는 E로 치환될 수 있고, Y는 F로 치환될 수 있고, T는 V로 치환될 수 있다. 일 양태에서, 예를 들어, 면역원성의 위험을 감소시키기 위해, 상기 서열로 치환된 아미노산은 인간 생식선 IgG 서열에서 우세하거나 예를 들어 상응하는 인간 생식선 IgG 서열에서 동일한 또는 근접한 위치에서 인간 생식선 서열에 포함된다. 몇몇 양태에서, 인간 생식선 IgG 서열은 서열 번호 43 또는 44를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 프리힌지(prehinge) 구역 또는 전체 폴리펩타이드의 pI를 감소시키는 프리힌지 구역에서의 변형을 포함한다. 프리힌지 구역은 결합 도메인과 힌지 구역 사이의 접합부에 있다. 예를 들면, 서열 RRT를 갖는 3개의 아미노산 프리힌지 구역은 등전점을 감소시키기 위해 서열 SSS로 대체될 수 있다. 몇몇 양태에서, 프리힌지 구역은 RRT 프리힌지 구역을 갖는 CD3 결합 폴리펩타이드와 비교하여 등전점이 감소된다.
예를 들어, VH 및/또는 VL 구역 및/또는 프리힌지 구역의 프레임워크 구역(들)을 돌연변이시킴으로써 등전점을 감소시키도록 CD3 결합 폴리펩타이드를 설계할 수 있다. 등전점 감소는 0.5 내지 2.5 이상의 단위만큼의 감소일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 항체이고, 예를 들어, 인간화된다. 다른 실시형태에서, 이는 작은 모듈식 면역약학 단백질(small modular immunopharmaceutical protein: SMIP)이다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 단쇄 가변 분획(scFv)을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 이는 다중특이적 또는 이중특이적 폴리펩타이드이다. 예를 들면, CD3 결합 폴리펩타이드는 CD3 결합 도메인 및 종양 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 이중특이적 또는 다중특이적 분자는 T-세포 세포독성을 종양 세포로 재지향시킨다.
본 발명의 다른 실시형태에서, CDS 폴리펩타이드는 동종이합체 또는 이종이합체로서 존재한다.
도 1은 약 200개의 다른 SMIP 폴리펩타이드의 이론상 pI와 비교하여 이전에 생성된 인간화 크리스(Cris)-7 SMIP 폴리펩타이드의 이론상 pI를 도시한 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 CD3 폴리펩타이드보다 높은 pI를 포함하는 CD3 결합 SMIP 폴리펩타이드의 클리핑(clipping)을 예시한다. 도 2a는 정제된 단백질의 저분자량 클립 함량을 정량화하는 SDS에서의 모세관 전기영동이다. 도 2b는 클리핑된 CD3 SMIP 분자의 예시를 포함한다. 도 2b에 도시된 서열은 서열 번호 4의 252-260번 아미노산, 서열 번호 4의 243-252번 아미노산 및 서열 번호 240의 251-260번 아미노산에 상응한다.
도 3은 크리스-7 마우스 VH 및 유래된 인간화 VH 서열의 아미노산 서열 정렬이다. 크리스7 VH 마우스, H1, H2, H3, H4, H5, H6 및 공통 서열은 각각 서열 번호 45, 22, 24, 26, 28, 30, 32 및 229에 상응한다.
도 4는 크리스-7 마우스 VL 및 유래된 인간화 VL 서열의 아미노산 서열 정렬이다. 크리스7 VL 마우스, L1, L2, L3, L4 및 공통 서열은 각각 서열 번호 46, 34, 36, 38, 40 및 230에 상응한다.
도 5는 H3 및 생식선 서열 IGHV1-69*01 및 IGHV3-30*01의 아미노산 서열 정렬이다. H3, IGHV1-69*01, IGHV3-30*01 및 공통 서열은 각각 서열 번호 26, 43, 44 및 331에 상응한다.
도 6은 생식선 서열 IGKV1-5*01 및 L1의 VL 구역의 J 카파 구역의 아미노산 서열 정렬이다. VL 구역(IGKVI-5*01), L1 사슬 및 공통 서열의 J 카파 구역은 각각 서열 번호 232, 34 및 233에 상응한다. IGKJ1*01, IGKJ2*01, IGKJ3*01, IGKJ4*01 및 IGKJ5*01 서열은 각각 서열 번호 234-238에 상응한다.
도 7a 및 도 7b는 DRA209와 비교하여 이론상 pI가 감소한 다양한 CD3 결합 폴리펩타이드 SMIP 분자의 아미노산 서열 정렬을 도시한 것이다. DRA209, DRA219, DRA222, DRA221, DRA223, DRA224, DRA225 및 공통 서열에 기재된 서열은 각각 서열 번호 4의 1-423번 아미노산, 서열 번호 6의 1-423번 아미노산, 서열 번호 8의 1-423번 아미노산, 서열 번호 10의 1-423번 아미노산, 서열 번호 12의 1-423번 아미노산, 서열 번호 14의 1-426번 아미노산, 서열 번호 16 및 서열 번호 239의 1-426번 아미노산에 상응한다.
도 8은 DRA161과 비교하여 pI 변이체 DRA233 및 DRA234의 아미노산 서열 정렬이다. DRA161, DRA233, DRA234 및 공통 서열에 기재된 서열은 각각 서열 번호 240, 18, 20 및 241에 상응한다.
도 9는 어떻게 경험적 pI 값이 결정되는지의 예시이다.
도 10은 DRA209 SMIP 및 scFv의 경험적 pI를 나타내는 그래프이다.
도 11은 pI 변이체 DRA233 및 DRA234와 비교하여 DRA161 SMIP의 경험적 pI를 나타내는 그래프이다.
도 12는 SMIP pI 변이체가 DRA227을 제외하고 DRA209 및 DRA161과 동일하게 T-세포에 결합한다는 것을 나타내는 그래프이다. DRA227 SMIP는 대조군으로서 사용되고, 이것은 CD3 또는 T-세포 결합 도메인을 포함하지 않는다. 각각의 분자 지칭 뒤의 "a" 철자는 특정한 분자가 CHO 세포에서 생성된다는 것을 나타내고, 4자리 숫자는 로트 번호이다.
도 13은 CD3 결합 SMIP 작제물 DRA233 및 DRA234가 (DRA209와 동일한 VH 및 VL을 공유하는) SMIP DRA161보다 덜 단편화된다는 것을 나타내는 비환원 SDS-PAGE의 이미지를 도시한 것이다.
도 14는 CD3 결합 SMIP 작제물 DRA233 및 DRA234가 (DRA209와 동일한 VH 및 VL을 공유하는) SMIP DRA161보다 덜 단편화된다는 것을 나타내는 환원 SDS-PAGE의 이미지를 도시한 것이다.
도 15는 pI 변이체 DRA233 및 DRA234가 주로 발현된 온전체(예를 들어, 클리핑 없음)라는 것을 나타내는 그래프 및 표이다.
도 16은 (정제된) DRA161의 비환원 CE-SDS를 나타내는 이미지이다.
도 17은 DRA234 및 DRA233의 PK 연구의 데이터를 나타낸다.
도 18은 실시예 14에 기재된 DRA233 및 DRA234에 대한 윈논린(WinNonLin) 분석으로부터의 데이터를 제공한다.
도 19는 DRA233 및 DRA234에 대한 PK 예측의 표이다.
도 20은 DRA233(504시간 시점 존재 및 부재) 및 DRA234과 비교하여 DRA161에 대한 PK 매개변수의 표이다.
도 21은 CD19를 표적화하는 상이한 동종이합체 이중특이적 폴리펩타이드 분자를 사용한 표적-의존적 T-세포 증식 검정으로부터의 결과를 도시한 것이다. 도 21A 및 도 21B는 실시예 10에 기재된 각각 CD4+ T-세포 증식 및 CD8+ T-세포 증식에 대한 결과를 나타낸다.
도 22는 CD19를 표적화하는 상이한 이종이합체 이중특이적 폴리펩타이드 분자를 사용한 표적-의존적 T-세포 증식 검정으로부터의 결과를 도시한 것이다. 도 22A 및 도 22B는 실시예 10에 기재된 각각 CD8+ T-세포 증식 및 CD4+ T-세포 증식에 대한 결과를 나타낸다.
도 23은 CD19를 표적화하는 상이한 폴리펩타이드 이종이합체 및 동종이합체를 사용한 재지향된 T-세포 세포독성 검정으로부터의 결과를 도시한 것이다. 도 23A는 동종이합체 이중특이적 폴리펩타이드 TSC129a, TSC233 및 TSC234에 대한 결과를 나타낸다. 도 23B는 이종이합체 이중특이적 폴리펩타이드 TSC127, TSC227 및 TSC228에 대한 결과를 나타낸다.
도 24는 RON을 표적화하는 상이한 이중특이적 폴리펩타이드 동종이합체인 TSC275, TSC277, TSC278 및 TSC279를 사용한 재지향된 T-세포 세포독성 검정으로부터의 결과를 도시한 것이다.
도 25는 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체 및 동종이합체의 T-세포 결합에 대한 결과를 도시한 것이다. 도 25a 및 도 25b는 주카트(Jurkat) 세포에 대한 이중특이적 분자 TSC228(이종이합체) 및 TSC249(동종이합체)의 용량 의존적 결합을 나타낸다.
도 26은 PSMA를 표적화하는 폴리펩타이드 동종이합체에 의한 표적-의존적 T-세포 증식의 결과를 나타낸다. 도 26a는 TSC249에 의한 치료 시 표적 PSMA 항원을 발현하는 C4-2B 세포에 대한 결과를 나타낸다. 도 26b는 TSC249에 의한 치료 시 표적 PSMA 항원을 발현하지 않는 DU-145 세포에 대한 결과를 나타낸다. 도 26c는 단리된 T-세포가 TSC249로 처리될 때의 결과를 나타낸다.
도 27은 PSMA 둘 다를 표적화하는 동종이합체 이중특이적 폴리펩타이드 TSC194 및 TSC249를 사용한 재지향된 T-세포 세포독성 검정으로부터의 결과를 도시한 것이다.
본 발명은 선행 기술 CD3 결합 폴리펩타이드와 비교하여 개선된 특징을 갖는 CD3 결합 폴리펩타이드를 제공한다. 분자의 등전점을 감소시키도록 중쇄 및/또는 경쇄 프레임워크 구역 및/또는 프리힌지 구역에서 아미노산을 변형시킴으로써 등전점 감소를 나타내도록 본 발명의 분자를 설계한다. 일 양태에서, VL 구역의 J 카파 구역에서 변형을 만든다. 몇몇 양태에서, 중성 전하를 갖는 아미노산에 의한 양전하를 갖는 아미노산의 치환 및/또는 음전하를 갖는 아미노산에 의한 중성 전하를 갖는 아미노산의 치환에 의해 변형을 만든다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 CD3 결합 폴리펩타이드는 항-CD3 DRA209 SMIP(서열 번호 4)보다 약 0.5 내지 2.5 단위가 낮은 이론상 pI를 갖는다. 예를 들면, DRA209는 9의 이론상 pI를 갖는 반면, pI 변이체 DA219(서열 번호 6)는 8.4의 이론상 pI를 갖고, DRA221(서열 번호 10)은 8.2의 이론상 pI를 갖고, DRA222(서열 번호 8)는 7.5의 이론상 pI를 갖고, DRA223(서열 번호 12)은 7.2의 이론상 pI를 갖고, DRA224(서열 번호 14)는 6.8의 이론상 pI를 갖는다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 4의 폴리펩타이드보다 적어도 1 pI 단위가 낮은 경험적 등전점을 갖는다.
놀랍게도, pI 변이체가 개선된 반감기를 나타내고 DRA209보다 CHO 세포에서 더 잘 발현하고, 예를 들어, 반감기를 측정하는 방법을 기술한 하기 실시예 4를 참조한다. 더욱이, DRA222 scFv를 포함하는 다중특이적 작제물은 다른 항-CD3 결합 도메인, 예컨대 DRA209 결합 도메인을 갖는 유사한 작제물과 비교하여 개선된 특성을 나타낸다(관련 PCT 공보 제WO2012/145714호 참조).
본 명세서에서 사용된 도입 섹션은 오직 구성 목적이고 기재된 대상(subject matter)을 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 특허, 특허 출원, 기사, 저서 및 논문(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는, 본 명세서에 인용된 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 임의의 목적으로 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 명확히 포함된다. 하나 이상의 포함된 문헌 또는 문헌의 일부가 본 출원에서의 용어의 정의와 모순되는 용어를 정의하는 경우, 본 출원에 나타난 정의가 지배한다.
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 기재되지 않은 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값 및, 적절한 경우, 이의 분획(예컨대, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 "약"은, 달리 기재되지 않은 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "일" 및 "하나"는, 달리 기재되지 않은 한, 열거된 성분의 "하나 이상"을 의미하도록 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 다 또는 임의의 이의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "포함한다" 및 "함유한다"는 동의어로 사용된다. 또한, 각각의 폴리펩타이드가 개별적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 기재된 성분(예를 들어, 도메인 또는 구역) 및 치환의 다양한 조합을 포함하는 폴리펩타이드가 본원에 개시된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 개별적인 폴리펩타이드의 특정한 성분의 선택은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "결합 도메인" 또는 "결합 구역"은 표적 분자, 예컨대 항원, 리간드, 수용체, 기질 또는 억제제(예를 들어, CD3 또는 종양 관련 항원, 예컨대 RON, CD19, CD37 또는 PSMA)를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 능력을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 펩타이드의 도메인, 구역, 부분 또는 자리를 의미한다. 예시적인 결합 도메인은 단쇄 항체 가변 구역(예를 들어, 도메인 항체, sFv, scFv 및 scFab), 수용체 엑토도메인 및 리간드(예를 들어, 사이토카인, 케모카인)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 결합 도메인은 (예를 들어, 가변 중쇄 서열 및 가변 경쇄 서열을 포함하는) 항원 결합 자리 또는 대안적인 프레임워크 구역(FR)(예를 들어, 임의로 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 FR)에 위치한 항체로부터의 3개의 경쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하거나 이들로 이루어진다. 웨스턴 블롯, ELISA, 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝 및 비아코어(BIACORE)(등록상표) 상호작용 분석을 포함하는, 특정한 표적에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 결합 도메인을 확인하기 위한 다양한 검정이 공지되어 있다. 본 명세서에 사용되는 CD3 결합 폴리펩타이드는 "CD3 결합 도메인" 및 임의로 "제2 결합 도메인"을 가질 수 있다. CD3 결합 도메인은 아미노 말단 또는 카복실 말단에 위치할 수 있다. 특정 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 마우스 단클론성 항체(예를 들어, 크리스-7 또는 HuM291)로부터 유래한 인간화 scFv를 포함한다. 예를 들면, CD3 결합 도메인은 마우스 단클론성 항체로부터 유래한 VH 구역 및 VL 구역으로 이루어질 수 있고, VH 및 VL 구역은 링커, 예컨대 (Gly4Ser)3(서열 번호 76) 링커에 연결된다. 다른 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 마우스 단클론성 항체로부터 유래한 인간화 scFv로 이루어지거나, 이로 실질적으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 CD3 결합 도메인은 쥣과 크리스-7 항체 또는 HuM291의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다.
결합 도메인이 시험 샘플에 존재하는 다른 성분에 상당히 결합하지 않으면서 105M-1 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 1/M의 단위를 갖는 특정한 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 표적에 결합하는 경우, 결합 도메인이 표적에 "특이적으로 결합한다". 결합 도메인은 "고친화도" 결합 도메인 및 "저친화도" 결합 도메인으로 분류될 수 있다. "고친화도" 결합 도메인은 적어도 107M-1, 적어도 108M-1, 적어도 109M-1, 적어도 1010M-1, 적어도 1011M-1, 적어도 1012M-1 또는 적어도 1013M-1의 Ka를 갖는 이 결합 도메인을 의미한다. "저친화도" 결합 도메인은 107M-1 이하, 106M-1 이하, 105M-1 이하의 Ka를 갖는 이 결합 도메인을 의미한다. 대안적으로, 친화도는 M의 단위(예를 들어, 10-5M 내지 10-13M)를 갖는 특정한 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로 정의될 수 있다. 종래의 기법을 이용하여 본 개시내용에 따른 결합 도메인 폴리펩타이드 및 단쇄 폴리펩타이드의 친화도를 용이하게 결정할 수 있다(예를 들어, 문헌[Scatchard et al. (1949) Ann. N Y. Acad. Sci. 51:660]; 및 미국 특허 제5,283,173호, 제5,468,614호 또는 등가물 참조).
"CD3"은 T-세포 수용체 복합체의 하위단위인 6개의 사슬의 다중 단백질 복합체로서 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p. 172 및 178, 1999] 참조). 포유동물에서, T-세포 수용체 복합체의 CD3 하위단위는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬 및 CD3ζ 사슬의 동종이합체이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬은 단일 면역글로불린 도메인을 포함하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 매우 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬의 막관통 구역은 음으로 하전되고, 이는 이 사슬이 양으로 하전된 T-세포 수용체 사슬과 결합하는 특징이다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬의 세포내 꼬리는 각각 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 단일 보존된 모티프를 포함하는 반면, 각각의 CD3ζ 사슬은 3개를 갖는다. ITAM이 TCR 복합체의 신호전달 능력에 중요하다고 생각된다. 본 개시내용에 사용된 CD3은 인간, 원숭이, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물을 포함하는 다양한 동물 종 유래일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "보존적 치환"은 하나의 아미노산의 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산에 대한 치환으로서 당해 분야에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 1997년 3월 13일자에 공개된 제WO97/09433호, 10페이지; 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8] 참조). 특정 실시형태에서, 보존적 치환은 세린에 대한 류신 치환을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "유도체"는 예를 들어 글라이코실화, 알킬화, 아실화, 에스터 형성 또는 아마이드 형성에 의한 효소 존재 또는 부재 하의 화학적 또는 생물학적 수단에 의한 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 지칭된 폴리펩타이드 또는 단백질"로부터 유래한" 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 기원을 의미한다. 일 양태에서, 특정한 서열로부터 유래한 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 그 서열 또는 이의 부분과 실질적으로 동일하거나(그 부분은 적어도 10-20개의 아미노산, 적어도 20-30개의 아미노산 또는 적어도 30-50개의 아미노산 또는 적어도 50-150개의 아미노산으로 이루어짐), 그렇지 않으면 서열에서 이의 기원을 갖는 것으로서 당해 분야의 당업자에게 확인 가능한 아미노산 서열을 갖는다. 일 양태에서, 인간화 또는 키메라 결합 도메인은 다른 동물에 의해 생성된 항체의 VH 및/또는 VL로부터 유래한다. 예를 들면, 인간화 결합 도메인 또는 키메라 결합 도메인은 쥣과 항체의 VH 및 VL 구역으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 프레임워크 구역을 변형시킴으로써 쥣과 항체의 인간화를 수행할 수 있다.
다른 폴리펩타이드로부터 유래한 폴리펩타이드는 시작 폴리펩타이드에 비해 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 하나 이상의 아미노산 잔기 삽입 또는 결실을 갖는 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 폴리펩타이드는 천연이 아닌 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변이는 필연적으로 시작 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 일 양태에서, 변이체는 시작 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 약 60% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성의 아미노산 서열을 갖는다. 다른 실시형태에서, 변이체는 시작 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 약 75% 내지 100% 미만, 약 80% 내지 100% 미만, 약 85% 내지 100% 미만, 약 90% 내지 100% 미만, 약 95% 내지 100% 미만의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성의 아미노산 서열을 갖는다.
본 명세서에 사용되는, 달리 제공되지 않은 한, 면역글로불린 분자의 가변 구역에서의 아미노산 잔기의 위치는 카밧(Kabat) 넘버링 관례에 따라 넘버링되고(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)) 및 면역글로불린 분자의 불변 구역에서의 아미노산 잔기의 위치는 EU 명명법에 따라 넘버링된다(Ward et al., 1995 Therap. Immunol. 2:77-94).
본 명세서에 사용되는 용어 "이합체"는 공유 결합(예를 들어, 이황화 결합) 및 다른 상호작용(예를 들어, 정전 상호작용, 염 브릿지, 수소 결합 및 소수성 상호작용)을 포함하는 분자간 힘의 하나 이상의 형태를 통해 서로 결합된 2개의 하위단위로 이루어지고 적절한 조건(예를 들어, 재조합 단백질을 발현하고/하거나, 정제하고/하거나, 저장하기에 적합한 수성 용액 중의 생리학적 조건 또는 비변성 및/또는 비환원 전기영동에 대한 조건) 하에 안정한 생물학적 집합체를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 "이종이합체" 또는 "이종이합체 단백질"은 2개의 상이한 폴리펩타이드로부터 형성된 이합체를 의미한다. 이종이합체는 4개의 폴리펩타이드(즉, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄)로부터 형성된 항체를 포함하지 않는다. 본 발명의 일 양태에서, 이종이합체화 도메인을 포함하는 에머전트(Emergent)의 인터셉터(Interceptor) 플랫폼을 사용하여 이종이합체가 생성된다. 본 명세서에 사용되는 "동종이합체" 또는 "동종이합체 단백질"은 2개의 동일한 폴리펩타이드로부터 형성된 이합체를 의미한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 에머전트의 SMIP, PIMS 또는 스콜피온(Scorpion) 플랫폼을 사용하여 동종이합체가 생성된다.
본 명세서에 사용되는 "힌지 구역" 또는 "힌지"는 (a) 막관통 단백질(예를 들어, I형 막관통 단백질)의 도메인간 구역; 또는 (b) II형 C-렉틴의 스톡(stalk) 구역으로부터 유래한 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 힌지 구역은 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원의 도메인간 구역으로부터 유래할 수 있고; 이 특정한 종류 내의 적합한 힌지 구역은 (ⅰ) 면역글로불린 힌지 구역(예를 들어, 상부 및/또는 코어 구역(들)으로 이루어짐) 또는 야생형 및 변경된 면역글로불린 힌지를 포함하는 이의 기능성 변이체 및 (ⅱ) 면역글로불린 V 유사 또는 면역글로불린 C 유사 도메인을 연결하는 구역(또는 이의 기능성 변이체)을 포함한다.
"야생형 면역글로불린 힌지 구역"은, 항체의 중쇄에서 발견되는, CH1 및 CH2 도메인 사이에 위치하고 연결하는 천연 상부 및 중간 힌지 아미노산 서열(IgG, IgA 및 IgD의 경우) 또는 CH1 및 CH3 도메인 사이에 위치하고 연결하는 것(IgE 및 IgM의 경우)을 의미한다. 특정 실시형태에서, 야생형 면역글로불린 힌지 구역 서열은 인간이고, 인간 IgG 힌지 구역을 포함할 수 있다.
"변경된 야생형 면역글로불린 힌지 구역" 또는 "변경된 면역글로불린 힌지 구역"은 (a) 30% 이하의 아미노산 변경(예를 들어, 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5%까지의 아미노산 치환 또는 결실)을 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 구역 또는 (b) 약 5개의 아미노산(예를 들어, 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 아미노산) 내지 약 120개의 아미노산의 범위의 길이를 갖고(예를 들면, 약 10개 내지 약 40개의 아미노산 또는 약 15개 내지 약 30개의 아미노산 또는 약 15개 내지 약 20개의 아미노산 또는 약 20개 내지 약 25개의 아미노산의 길이를 가짐), 약 30% 이하의 아미노산 변경(예를 들어, 약 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%까지의 아미노산 치환 또는 결실 또는 이의 조합)을 갖고, PCT 공보 제WO2011/090762호 및 제WO2011/090754호에 개시된 IgG 코어 힌지 구역을 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 구역의 부분을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "인간화"는 유전 조작 기술을 이용하여 원래 항체의 항원-결합 특성을 여전히 보유하면서 인간에게 덜 면역원성인 비인간 종(예를 들어, 마우스 또는 래트)으로부터 유래한 항체 또는 면역글로불린 결합 단백질 및 폴리펩타이드를 제조하는 과정을 의미한다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 면역글로불린 결합 단백질 및 폴리펩타이드의 결합 도메인(들)(예를 들어, 경쇄 및 중쇄 가변 구역, Fab, scFv)은 인간화된다. 비인간 결합 도메인은 "재성형(reshaping)"(Verhoeyen, et al., 1988 Science 239:1534-1536; Riechmann, et al., 1988 Nature 332:323-337; Tempest, et al., Bio/Technol 1991 9:266-271), "과키메라화(hyperchimerization)"(Queen, et al., 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033; Co, et al., 1991 Proc Natl Acad Sci USA 88:2869-2873; Co, et al., 1992 J Immunol 148:1149-1154) 및 "비니어링(veneering)"(Mark, et al., "Derivation of therapeutically active humanized and veneered anti-CD18 antibodies. In: Metcalf BW, Dalton BJ, eds. Cellular adhesion: molecular definition to therapeutic potential. New York: Plenum Press, 1994: 291-312)을 포함하는, CDR 그래프팅(Jones et al., Nature 321:522 (1986))으로 공지된 기법 및 이의 변이체를 이용하여 인간화될 수 있다. 비인간 소스로부터 유래한 경우, 항체 또는 면역글로불린 결합 단백질 및 폴리펩타이드의 다른 구역, 예컨대 힌지 구역 및 불변 구역 도메인이 또한 인간화될 수 있다.
"면역글로불린 불변 구역" 또는 "불변 구역"은 하나 이상의 불변 구역 도메인의 일부 또는 전부에 상응하거나 이로부터 유래한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 의미하도록 본 명세서에 정의된 용어이다. 일 양태에서, 불변 구역은 소스 항체의 모든 불변 구역 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 불변 구역은 IgG CH2 및 CH3 도메인, 예를 들면 IgG1 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 몇몇 양태에서, 불변 구역은 CH1 도메인을 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 불변 하위구역을 구성하는 불변 구역 도메인은 인간이다. 몇몇 양태에서, 본 개시내용의 융합 단백질의 불변 구역 도메인은 몇몇 Fc 수용체(예컨대, FcRn, 신생 Fc 수용체)에 결합하는 능력을 보유하고 생체 내 비교적 긴 반감기를 보유하면서 항체 의존적 세포 중재 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 및 보체 활성화 및 보체 의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC)의 최소 효과기 기능을 갖거나 이 기능이 결여된다.
다른 변형에서, 본 개시내용의 융합 단백질은 ADCC 및 CDC 중 하나 또는 둘 다의 이러한 효과기 기능을 보유하는 불변 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 결합 도메인은 인간 IgG 불변 구역(예를 들면, IgG1)에 융합되고, 불변 구역은 하나 이상의 돌연변이된 하기 아미노산을 갖는다: 234번 위치에서의 류신(L234), 235번 위치에서의 류신(L235), 237번 위치에서의 글라이신(G237), 318번 위치에서의 글루타메이트(E318), 320번 위치에서의 라이신(K320), 322번 위치에서의 라이신(K322) 또는 임의의 이의 조합(EU에 따른 넘버링). 예를 들어, 임의의 하나 이상의 이 아미노산은 알라닌으로 변경될 수 있다. 추가의 양태에서, IgG Fc 도메인, 예컨대 IgG1은 예를 들어 알라닌으로 돌연변이된(즉, 각각 L234A, L235A, G237A, E318A, K320A 및 K322A) (EU 넘버링에 따라) 각각 L234, L235, G237, E318, K320 및 K322, 및 임의로 또한 N297A 돌연변이(즉, CH2 도메인의 글라이코실화를 실질적으로 제거)를 갖는다.
본 명세서에 사용되는 용어 "작은 모듈식 면역약학 단백질" 또는 "SMIP"는 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제2003/0133939호, 제2003/0118592호 및 제2005/0136049호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 일반적으로 개시된 단백질 스캐폴드를 의미하도록 사용된다. 실시예 및 본 명세서의 개시내용에 걸쳐 기재된 "SMIP 분자"는 SMIP 스캐폴딩, 예를 들어 아미노 말단으로부터 카복실 말단의 순서로, 제1 결합 도메인, 힌지 구역 및 면역글로불린 불변 구역을 포함하는 결합 단백질인 것으로 이해되어야 한다. "CD3 특이적 SMIP 분자"는 SMIP 스캐폴딩을 포함하는 CD3-결합 단백질인 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "PIMS"는 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제2009/0148447호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 일반적으로 개시된 단백질 스캐폴드를 의미하도록 사용된다. 실시예 및 본 명세서의 개시내용에 걸쳐 기재된 "PIMS 분자"는 PIMS 스캐폴딩, 예를 들어 아미노 말단으로부터 카복실 말단의 순서로, 면역글로불린 불변 구역, 힌지 구역 및 제1 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질인 것으로 이해되어야 한다. "CD3 특이적 PIMS 분자"는 PIMS 스캐폴딩을 포함하는 CD3-결합 단백질인 것으로 이해되어야 한다.
"Fc 구역" 또는 "Fc 도메인"은 세포 상의 항체 수용체 및 보체의 C1q 성분에 대한 결합을 담당하는 소스 항체의 부분에 상응하거나 이로부터 유래한 폴리펩타이드 서열을 의미한다. Fc는 단백질 결정을 용이하게 형성하는 항체의 단편인 "단편 결정질"을 나타낸다. 원래 단백질분해 소화로 기술되는 명확한 단백질 단편은 면역글로불린 단백질의 전체 일반 구조를 정의할 수 있다. 문헌에 원래 정의된 것처럼, Fc 단편은 이황화 결합 중쇄 힌지 구역, CH2 및 CH3 도메인으로 이루어진다. 그러나, 더 최근에 상기 용어는 CH3, CH2 및 이러한 제2 사슬과 이황화 결합 이합체를 형성하기에 충분한 힌지의 적어도 일부로 이루어진 단쇄에 적용된다. 면역글로불린 구조 및 기능의 검토를 위해, 문헌[Putnam, The Plasma Proteins, Vol. V (Academic Press, Inc., 1987), pp. 49-140; 및 Padlan, Mol. Immunol. 31:169-217, 1994]을 참조한다. 본 명세서에 사용되는 용어 Fc는 천연 서열의 변이체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 "등전점" 또는 pI는 순전하가 0인 pH이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "인터셉터"는 PCT 공보 제WO2011/090762호 및 제WO2011/090754호에 일반적으로 개시된 단일특이적 또는 다중특이적 이종이합체 단백질 스캐폴드를 의미하도록 사용된다. 본 명세서에 기재된 인터셉터 분자는 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 CD3 결합 단백질인 것으로 이해되어야 하고, 각각의 폴리펩타이드 사슬은 면역글로불린 이종이합체화 도메인을 포함한다. 계면의 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 상이하다. 일 양태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 CH1 도메인 또는 이의 유도체를 포함한다. 다른 실시형태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 CL 도메인 또는 이의 유도체를 포함한다. 일 양태에서, CL 도메인은 Cκ 또는 Cλ 동형단백질 또는 이의 유도체이다.
본 명세서에 사용되는 II형 C-렉틴의 "스톡 구역"은 C형 렉틴 유사 도메인(CTLD; 예를 들어, 천연 살해 세포 수용체의 CTLD와 유사)과 막관통 도메인 사이에 위치한 II형 C-렉틴의 세포외 도메인의 부분을 의미한다. 예를 들어, 인간 CD94 분자(진뱅크(GenBank) 수탁 번호 AAC50291.1, PRI 1995년 11월 30일)에서, 세포외 도메인은 34-179번 아미노산 잔기에 상응하고, CTLD는 61-176번 아미노산 잔기에 상응한다. 따라서, 인간 CD94 분자의 스톡 구역은 막과 CTLD 사이에 발견되는 34-60번 아미노산 잔기를 포함한다(문헌[Boyington et al., Immunity 10:75, 1999] 참조; 다른 스톡 구역의 설명에 대해, 또한 문헌[Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:753, 1992; 및 Figdor et al., Nature Rev. Immunol. 2:77, 2002] 참조). 이 II형 C-렉틴은 스톡 구역과 막관통 구역 또는 CTLD 사이에 6개 내지 10개의 접합 아미노산을 또한 가질 수 있다. 다른 예에서, 233개의 아미노산 인간 NKG2A 단백질(진뱅크 수탁 번호 P26715.1, PRI 2010년 6월 15일)은 71-93번 아미노산 범위의 막관통 도메인 및 94-233번 아미노산 범위의 세포외 도메인을 갖는다. CTLD는 119-231번 아미노산으로 이루어지고, 스톡 구역은 99-116번 아미노산을 포함하고, 이는 5개 및 2개의 아미노산의 접합에 의해 플랭킹된다. 다른 II형 C-렉틴, 및 이의 세포외 리간드-결합 도메인, 도메인간 또는 스톡 구역 및 CTLD는 당해 분야에 공지되어 있다(각각 인간 CD23, CD69, CD72, NKG2A 및 NKG2D의 서열 및 이의 설명에 대해 예를 들어, 진뱅크 수탁 번호 NP_001993.2; AAH07037.1, PRI 2006년 7월 15일; NP_001773.1, PRI 1010년 6월 20일; AAL65234.1, PRI 2002년 1월 17일; 및 CAA04925.1, PRI 2006년 11월 14일 참조).
본 명세서에 사용되는 막관통 단백질(예를 들어, I형 막관통 단백질)의 "도메인간 구역"은 2개의 인접한 도메인 사이에 위치한 막관통 단백질의 세포외 도메인의 부분을 의미한다. 도메인간 구역의 예는 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원의 인접한 Ig 도메인을 연결하는 구역(예를 들어, IgG, IgA, IgD 또는 IgE로부터의 면역글로불린 힌지 구역; CD2의 IgV 및 lgC2 도메인을 연결하는 구역; 또는 CD80 또는 CD86의 IgV 및 IgC 도메인을 연결하는 구역)을 포함한다. 도메인간 구역의 다른 예는 I형 시알산-결합 Ig 유사 렉틴인 CD22의 비-lg 및 lgC2 도메인을 연결하는 구역이다.
II형 C-렉틴의 스톡 구역"으로부터 유래한" 또는 막관통 단백질 도메인간 구역(예를 들어, 면역글로불린 힌지 구역)"으로부터 유래한" 폴리펩타이드 구역은 약 5개 내지 약 150개의 아미노산 서열 중 전부 또는 적어도 일부가 (ⅰ) 야생형 스톡 구역 또는 도메인간 구역 서열; (ⅱ) 야생형 스톡 구역 또는 도메인간 구역 서열의 단편; (ⅲ) (ⅰ) 또는 (ⅱ)와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드; 또는 (ⅳ) 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 또는 임의의 이의 조합(예를 들면, 하나 이상의 변경은 치환이거나, 하나 이상의 돌연변이는 오직 1개의 결실을 포함함)을 갖는 (ⅰ) 또는 (ⅱ)를 포함하는 이 아미노산 서열을 의미한다. 몇몇 양태에서, 스톡 구역의 유도체는 야생형 스톡 구역 서열, 예컨대 NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72 또는 CD94의 약 8개 내지 약 20개, 약 10개 내지 약 25개 또는 약 15개 내지 약 25개의 아미노산으로부터 유래한 것과 비교하여 단백질분해 개열에 더 저항이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "접합 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 폴리펩타이드의 2개의 인접한 구역 또는 도메인 사이의, 예컨대 힌지와 인접한 면역글로불린 불변 하위구역 사이의 또는 힌지과 인접한 결합 도메인 사이의 또는 2개의 면역글로불린 가변 도메인을 연결하는 펩타이드 링커와 인접한 면역글로불린 가변 도메인 사이의 하나 이상(예를 들어, 약 2-10개)의 아미노산 잔기를 의미한다. 접합 아미노산은 폴리펩타이드의 작제물 설계(예를 들어, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자의 작제 동안 제한 효소 자리의 사용으로부터 생기는 아미노산 잔기)로부터 생길 수 있다. 결합 도메인과 힌지 구역 사이의 접합 아미노산은 본 명세서에서 프리힌지 구역이라 칭하고, 예를 들어 코딩 뉴클레오타이드 서열로 제한 자리를 부가하여 생길 수 있다. 일 양태에서, 프리힌지 구역은 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 15개의 아미노산으로 이루어진다. DRA209 및 DRA161의 프리힌지 구역 서열은 쥣과 크리스-7 또는 인간 면역글로불린 생식선 서열의 일부가 아니다. DRA209 및 DRA161의 프리힌지 구역은 아미노산 서열 RRT이지만, DRA219, DRA221, DRA222, DRA223, DRA224, DRA225, DRA228, DRA229, DRA233, DRA234, TSC249, TSC250, TSC251, TSC252, TSC295, TSC296, TSC301 및 TSC302의 경우 이것은 SSS이다. 본 발명의 결합 분자는 프리힌지 구역을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 구절 "CH3과 CH1 또는 CL 사이의 링커"는 CH3 도메인(예를 들어, 야생형 CH3 또는 돌연변이된 CH3)의 C 말단과 CH1 도메인 또는 CL 도메인(예를 들어, Ck)의 N 말단 사이의 하나 이상(예를 들어, 약 2-12개)의 아미노산 잔기를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "필요로 하는 환자"는 본 명세서에 제공된 CD3 결합 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 이의 조성물에 의한 치료 또는 경감에 수정 가능한 질환, 장애 또는 병증의 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "펩타이드 링커"는, 생성된 폴리펩타이드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 구역을 포함하는 항체와 동일한 표적 분자에 특이적 결합 친화도를 보유하도록, 중쇄 가변 구역을 경쇄 가변 구역에 연결하고, 2개의 하위결합 도메인의 상호작용에 적합한 스페이서 기능을 제공하는 아미노산 서열을 의미한다. 특정 실시형태에서, 링커는 5개 내지 약 35개의 아미노산, 예를 들면, 약 15개 내지 약 25개의 아미노산으로 이루어진다.
본 명세서에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는"은 당해 분야에 널리 공지된 경로를 이용하여 투여될 때 대부분의 대상체에서 알레르기 또는 다른 심각한 부작용을 생성하지 않는 분자 집합체 및 조성물을 의미한다. 연방 또는 주 정부의 규제 기간에 의해 허가되거나 미국 약전 또는 동물, 더 특히 인간에서의 사용에 대해 다른 일반적으로 인정되는 약전에 수록된 분자 집합체 및 조성물은 "약제학적으로 허용되는" 것으로 생각된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "프로모터"는 전사를 개시하는 RNA 중합효소를 결합시키는 데 관여하는 DNA의 구역을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "핵산", "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이들의 중합체를 의미한다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 천연 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다. 달리 기재되지 않은 한, 특정한 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열 및 명확히 표시된 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기에 치환된 서열을 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환을 성취할 수 있다(Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; Cassol et al. (1992); Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98). 용어 핵산은 게놈에 의해 코딩된 유전자, cDNA 및 mRNA와 상호교환되어 사용된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "핵산", "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), 뉴클레오타이드 유사체사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체, 및 이의 유도체, 단편 및 동족체를 포함하도록 의도된다.
용어 "발현"은 핵산에 의해 코딩된 생성물의 생합성을 의미한다. 예를 들어, 관심 대상의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분절의 경우, 발현은 mRNA로의 핵산 분절의 전사 및 하나 이상의 폴리펩타이드로의 mRNA의 번역을 포함한다.
용어 "발현 단위" 및 "발현 카세트"는 본 명세서에서 상호교환되어 사용되고 관심 대상의 폴리펩타이드를 코딩하고 숙주 세포에서 핵산 분절의 발현을 제공할 수 있는 핵산 분절을 의미한다. 발현 단위는 통상적으로, 모두 작업 가능한 구성의, 전사 프로모터, 관심 대상의 폴리펩타이드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임 및 전사 종결자를 포함한다. 전사 프로모터 및 종결자 이외에, 발현 단위는 다른 핵산 분절, 예컨대 인핸서 또는 폴리아데닐화 신호 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "발현 벡터"는 하나 이상의 발현 단위를 포함하는 선형 또는 원형의 핵산 분자를 의미한다. 하나 이상의 발현 단위 이외에, 발현 벡터는 추가의 핵산 분절, 예컨대, 하나 이상의 복제 기원 또는 하나 이상의 선택 가능한 마커 등을 또한 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나 둘 다의 구성요소를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 스콜피온은 다중특이적 결합 단백질 스캐폴드를 의미하기 위해 사용되는 용어이다. 다중특이적 결합 단백질 및 폴리펩타이드는 예를 들면 PCT 출원 공보 제WO2007/146968호, 미국 특허 출원 공보 제2006/0051844호, PCT 출원 공보 제WO2010/040105호, PCT 출원 공보 제WO2010/003108호 및 미국 특허 제7,166,707호에 개시되어 있다. 스콜피온 폴리펩타이드는 2개의 결합 도메인(도메인은 동일한 또는 상이한 표적에 특이적으로 결합하도록 설계될 수 있음), 2개의 링커 및 면역글로불린 불변 하위구역을 포함한다. 스콜피온 분자에 대한 링커는 PCT 출원 공보 제WO2010/003108호에 기재되어 있다. 몇몇 양태에서, 링커 서열은 약 2-45개의 아미노산 또는 2-38개의 아미노산 또는 5-45개의 아미노산이다. 몇몇 양태에서, 링커는 항체 힌지 구역(예를 들어, IgG로부터의) 또는 C-렉틴 스톡 구역이다. 스콜피온 단백질은 2개의 동일한, 이황화 결합된 스콜피온 폴리펩타이드를 포함하는 동종이합체 단백질이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "서열 동일성"은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 또는 2개 이상의 폴리펩타이드 서열 사이의 관계식을 의미한다. 하나의 서열에서의 위치는 비교자 서열의 상응하는 위치에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기에 의해 점유될 때, 이 서열은 그 위치에서 "동일하다"고 일컬어진다. "동일한" 위치의 수를 생성하기 위해 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 서열 둘 다에서 발생하는 위치의 수를 결정함으로써 "서열 동일성" 백분율을 계산한다. 이후, "동일한" 위치의 수를 비교 윈도우에서의 위치의 전체 수로 나누고 100을 곱해 "서열 동일성의 백분율을 생성한다. 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 "서열 동일성"의 백분율을 결정한다. 핵산 서열에 대한 비교 윈도우는 예를 들면 적어도 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개 또는 1000개 이상의 길이의 핵산일 수 있다. 폴리펩타이드 서열에 대한 비교 윈도우는 예를 들면 적어도 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 300개 이상의 길이의 아미노산일 수 있다. 비교를 위한 서열을 최적으로 정렬하기 위해, 비교 윈도우에서의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 부분은 부가 또는 결실이라 칭하는 갭을 포함할 수 있는 반면, 기준 서열을 일정하게 유지시킨다. 최적 정렬은, 심지어 갭을 가져도, 기준 서열과 비교자 서열 사이의 "동일한" 위치의 가장 큰 가능한 수를 생성시키는 정렬이다. 2004년 9월 1일에 국립 생물화학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)로부터 구입 가능한 프로그램 "BLAST 2 서열"의 버전을 이용하여 2개의 서열 사이의 "서열 동일성" 백분율을 결정할 수 있고, 이 프로그램은 프로그램 BLASTN(뉴클레오타이드 서열 비교의 경우) 및 BLASTP(폴리펩타이드 서열 비교의 경우)를 도입하고, 이 프로그램은 칼린(Karlin) 및 알츌(Altschul)의 알고리즘에 기초한다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). "BLAST 2 서열"을 이용할 때, 2004년 9월 1일에 디폴트 매개변수인 매개변수는 워드 크기(3), 오픈 갭 패널티(11), 연장 갭 패널티(1), 갭 드롭오프(50), 예상 값(10) 및 매트릭스 옵션(이것으로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 다른 필요한 매개변수에 사용될 수 있다. 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열은 2개의 서열이 서로에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 경우 "실질적으로 유사한 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 동일성"을 갖는 것으로 생각된다.
본 명세서에 사용되는 "폴리펩타이드" 또는 "폴리펩타이드 사슬"은 공유 결합된 아미노산의 단일, 선형 및 인접 배열이다. 이는 비선형 방식으로, 예컨대 사슬간 이황화 결합을 통해 함께 연결하는 2개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하지 않는다(예를 들어, 경쇄가 이황화 결합을 통해 중쇄와 연결된 반 면역글로불린 분자). 폴리펩타이드는 하나 이상의 사슬간 이황화 결합을 갖거나 형성할 수 있다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드와 관련하여, 서열 번호로 표시된 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기에 대한 언급은 이러한 잔기의 번역후 변형을 포함한다.
"단백질"은 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 비펩타이드 성분, 예컨대 탄수화물 기를 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비펩타이드 치환기는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 부가될 수 있고 세포 유형에 따라 변한다. 단백질은 본 명세서에서 이의 아미노산 골격 구조의 면으로 정의되고; 치환기, 예컨대 탄수화물 기는 일반적으로 표시되지 않았지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
용어 "아미노 말단"(N 말단) 및 "카복실 말단"(C 말단)은 본 명세서에서 폴리펩타이드 내의 위치를 의미하도록 사용된다. 문맥이 허용하는 한, 이 용어는 근접 또는 관련 위치를 의미하기 위해 특정한 서열 또는 폴리펩타이드의 부분과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 폴리펩타이드 내의 기준 서열에 대한 특정한 서열 위치한 카복실 말단은 기준 서열의 카복실 말단에 근접하게 위치하지만, 반드시 완전한 폴리펩타이드의 카복실 말단에 있는 것은 아니다.
"T-세포 수용체"(TCR)는, CD3을 따라, 일반적으로 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 분자에 결합하는 항원을 인식하는 것을 담당하는 T-세포의 표면 상에 발견되는 분자이다. 이는 대부분의 T-세포에서 고가변 α 및 β 사슬의 이황화 결합 이종이합체로 이루어진다. 다른 T-세포에서, 가변 γ 및 δ 사슬로 이루어진 대안적인 수용체가 발현된다. TCR의 각각의 사슬은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이고, 1개의 N 말단 면역글로불린 가변 도메인, 1개의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 구역 및 C 말단에서의 짧은 세포질 꼬리를 보유한다(문헌[Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (5th Ed.), Editor: Saunders, Philadelphia, 2003; Janeway et al., Immunobiology : The Immune System in Health and Disease, 4th Ed., Current Biology Publications, p148, 149 및 172, 1999] 참조). 본 개시내용에 사용되는 TCR은 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유동물을 포함하는 다양한 동물 종 유래일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "TCR 복합체"는 CD3 사슬과 다른 TCR 사슬과의 결합에 의해 형성된 복합체를 의미한다. 예를 들어, TCR 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬, CD3ζ 사슬의 동종이합체, TCRα 사슬 및 TCRβ 사슬로 이루어질 수 있다. 대안적으로, TCR 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬, 2개의 CD3ε 사슬, CD3ζ 사슬의 동종이합체, TCRγ 사슬 및 TCRδ 사슬로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "TCR 복합체의 성분"은 TCR 사슬(예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ), CD3 사슬(예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε 또는 CD3ζ) 또는 2개 이상의 TCR 사슬 또는 CD3 사슬에 의해 형성된 복합체(예를 들어, TCRα 및 TCRβ의 복합체, TCRγ 및 TCRδ의 복합체, CD3ε 및 CD3δ의 복합체, CD3γ 및 CD3ε의 복합체 또는 TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ 및 2개의 CD3ε 사슬의 하위 TCR 복합체)를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "항체 의존적 세포 중재 세포독성" 및 "ADCC"는 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 단구 세포, 예컨대 자연 살해(NK) 세포 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합 항체(또는 FcγR에 결합할 수 있는 다른 단백질)를 인식하고 후속하여 표적 세포의 용해를 발생시키는 세포 중재 과정을 의미한다. 원칙적으로, 활성화 FcγR을 갖는 임의의 효과기 세포는 ADCC를 중재하도록 촉발될 수 있다. ADCC를 중재하는 1차 세포는 FcγRIII만을 발현하는 NK 세포인 반면, 단핵구는 활성화, 편재화 또는 분화의 상태에 따라 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현할 수 있다. 조혈 세포에서 FcγR 발현의 검토를 위해, 예를 들어 문헌[Ravetch et al., 1991, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92]을 참조한다.
폴리펩타이드 또는 단백질과 관련하여 본 명세서에 사용되는 용어 "ADCC 활성을 갖는"은 폴리펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 면역글로불린 힌지 구역 및 예컨대 IgG(예를 들어, IgG1)로부터 유래한 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 면역글로불린 불변 하위구역을 포함하는 것)이 Fc 수용체를 발현하는 세포용해 면역 효과기 세포(예를 들어, NK 세포)에서 세포용해 Fc 수용체(예를 들어, FcγRIII)의 결합을 통해 항체 의존적 세포 중재 세포독성(ADCC)을 중재할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "보체 의존적 세포독성" 및 "CDC"는 정상 혈청("보체")에서의 성분이, 항체 또는 표적 항원에 결합된 다른 C1q-보체-결합 단백질과 함께, 표적 항원을 발현하는 표적 세포의 용해를 나타내는 과정을 의미한다. 보체는 이의 효과를 발휘하기 위해 정돈된 서열로 및 일제히 작용하는 혈청 단백질의 그룹으로 이루어진다.
본 명세서에 사용되는 용어 "전통적인 보체 경로" 및 "전통적인 보체 시스템"은 동의어이고, 보체의 활성화에 대한 특정한 경로를 의미한다. 전통적인 경로는 개시에 항원-항체 복합체를 요하고, 정돈된 방식으로, C1 내지 C9라 칭하는 9개의 주요 단백질 성분의 활성화를 포함한다. 활성화 과정에서의 여러 단계를 위해, 생성물은 후속 단계를 촉매화하는 효소이다. 이 케스케이드는 비교적 작은 초기 신호에 의해 다량의 보체의 증폭 및 활성화를 제공한다.
폴리펩타이드 또는 단백질의 언급 시 본 명세서에 사용되는 용어 "CDC 활성을 갖는"은 폴리펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 면역글로불린 힌지 구역 및 예컨대 IgG(예를 들어, IgG1)로부터 유래한 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 면역글로불린 불변 하위구역을 포함하는 것)이 C1q 보체 단백질의 결합 및 전통적인 보체 시스템의 활성화를 통해 보체 의존적 세포독성(CDC)을 중재할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "재지향된 T-세포 세포독성" 및 "RTCC"는 세포독성 T-세포가 세포독성 T-세포 및 표적 세포 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있는 다중특이적 단백질을 사용하여 표적 세포로 동원되고 이에 의해 표적 세포에 대해 표적-의존적 세포독성 T-세포 반응이 발생하는 T-세포 중재 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "치료", "치료하는" 또는 "경감시키는"은 치료학적 치료 또는 예방적/예방학적 치료를 의미한다. 치료를 받는 개인에서 질환의 적어도 하나의 증상이 개선되거나 치료가 개인에서 진행성 질환의 악화를 지연시키거나 추가의 관련 질환의 개시를 방지할 수 있는 경우 치료는 치료학적이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "형질전환", "형질감염" 및 "형질도입"은 세포로의 핵산(예를 들어, 뉴클레오타이드 중합체)의 전달을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "유전자 형질전환"은 세포로의 DNA, 특히 재조합 DNA의 전달 및 편입을 의미한다. 전달된 핵산은 발현 벡터를 통해 세포에 도입될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "변이체" 또는 "변이체들"은 기준 핵산 또는 폴리펩타이드와 다르지만, 이의 필수 특성을 보유하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 일반적으로, 변이체는 기준 핵산 또는 폴리펩타이드와 전체적으로 밀접하게 유사하고, 많은 구역에서, 동일하다. 예를 들면, 변이체는 활성 부분 또는 전장 기준 핵산 또는 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 나타낼 수 있다.
용어 "경쇄 가변 구역"("경쇄 가변 도메인" 또는 "VL"로도 칭함) 및 "중쇄 가변 구역"("중쇄 가변 도메인" 또는 "VH"로도 칭함)은 각각 항체 경쇄 및 중쇄로부터의 가변 결합 구역을 의미한다. 가변 결합 구역은 "상보성 결정 영역"(CDR) 및 "프레임워크 구역"(FR)으로 공지된 별개의 잘 한정된 하위구역으로 이루어진다. 일 양태에서, FR은 인간화된다. 용어 "CL"은 "면역글로불린 경쇄 불변 구역" 또는 "경쇄 불변 구역", 즉 항체 경쇄로부터의 불변 구역을 의미한다. 용어 "CH"는 "면역글로불린 중쇄 불변 구역" 또는 "중쇄 불변 구역"을 의미하고, 이는 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD, IgG) 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인(IgE, IgM)으로 항체 동형단백질에 따라 추가로 분열 가능하다. "Fab"(분획 항원 결합)는 항원에 결합하는 항체의 일부이고, 사슬간 이황화 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 CH1 도메인 및 가변 구역을 포함한다.
본 개시내용은 특히 결합 도메인, 특히 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 및 단백질을 제공한다. 본 개시내용의 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 및 단백질은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 면역글로불린 불변 하위구역(들), 링커 펩타이드(들), 힌지 구역(들), 면역글로불린 이종이합체화 도메인(들), 면역글로불린 이합체화 도메인(들), 하나 이상의 접합 아미노산, 태그(들) 등. 개시된 폴리펩타이드 및 단백질의 이 성분이 본 명세서에 추가로 자세히 기재되어 있다.
추가로, 본 명세서에 개시된 CD3 결합 폴리펩타이드 및 단백질은 임의의 다양한 상이한 포맷의 항체 또는 융합 단백질의 형태일 수 있다(예를 들어, 융합 단백질은 SMIP 단백질, PIMS 단백질, 스콜피온 단백질 또는 인터셉터 단백질의 형태일 수 있다).
몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 제2 결합 도메인을 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, CD3 결합 도메인, 힌지 구역, 불변 구역 및 제2 결합 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 제2 결합 도메인, 힌지 구역, 불변 구역 및 CD3 결합 도메인을 포함한다.
CD3 결합 단백질은 본 발명에 따르면 일반적으로 (a) 본 명세서에 기재된 CD3 결합 도메인을 포함하는 적어도 하나의 CD3 결합 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 특정한 변형에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 (b) CD3 결합 도메인에 대한 힌지 구역 카복실 말단 및 (c) 면역글로불린 불변 구역(예를 들어, SMIP 폴리펩타이드)을 추가로 포함한다. 추가의 변형에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 (d) 면역글로불린 불변 하위구역에 대한 제2 힌지 구역 카복실 말단 및 (e) 제2 힌지 구역에 대한 제2 결합 도메인 카복실 말단(예를 들어, 스콜피온 폴리펩타이드)을 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 CD3 결합 도메인과 함께 프레임워크 구역, 프리힌지 구역 및 힌지 구역을 포함한다.
몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 42와 비교하여 3개 이상의 변형 아미노산을 포함하고, 예를 들어 변형은 예를 들어 프레임워크 및/또는 프리힌지 구역에서 중성 아미노산에 의한 양으로 하전된 아미노산의 치환 및/또는 음으로 하전된 아미노산에 의한 중성 아미노산의 치환이다. 몇몇 양태에서, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 3-5개 또는 3-10개의 아미노산은 중성 아미노산에 의한 양으로 하전된 아미노산의 치환 및/또는 음으로 하전된 아미노산에 의한 중성 아미노산의 치환에 의해 VH 및/또는 VL의 프레임워크 구역에서 변형된다.
본 발명의 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 예를 들어 프리힌지 구역 또는 전체 폴리펩타이드의 pI를 감소시키는 프리힌지 구역에서의 변형을 포함한다. 프리힌지 구역은 결합 도메인과 힌지 구역 사이의 접합부에 있다. 예를 들면, 서열 RRT를 갖는 3개의 아미노산 프리힌지 구역은 서열 SSS 또는 SST로 대체되어 등전점을 감소시킬 수 있다. 몇몇 양태에서, 프리힌지 구역은 RRT 프리힌지 구역을 갖는 CD3 결합 폴리펩타이드와 비교하여 등전점이 감소된다.
일 양태에서, 면역원성의 위험을 감소시키기 위해, 아미노산은 예를 들어 상응하는 인간 생식선 IgG 서열에서 동일한 또는 근접한 위치에서 인간 생식선 서열에 포함되거나 인간 생식선 IgG 서열에서 우세한 서열로 치환된다. 몇몇 양태에서, 인간 생식선 IgG 서열은 서열 번호 43 또는 44를 포함한다.
몇몇 양태에서, 적어도 하나의 아미노산 변형은 크리스-7 VL Jk 구역 마우스 서열 LQIT(서열 번호 252)와 비교하여 VL 구역의 J 카파(Jk) 구역 내에 있다. 몇몇 양태에서, Jk 구역은 예를 들어 LQIT(서열 번호 252) 대신에 아미노산 서열 VEIK(서열 번호 253)를 포함한다.
몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 힌지 구역 및 불변 구역을 포함하고, 예를 들어 CD3 결합 폴리펩타이드는 (a) CD3 결합 도메인에 대한 힌지 구역 아미노 말단 및 (b) 힌지 구역에 대한 면역글로불린 불변 구역 아미노 말단(예를 들어, PIMS 폴리펩타이드)을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, CD3 결합 도메인, 힌지 구역 및 불변 구역을 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 불변 구역, 힌지 구역 및 CD3 결합 도메인을 포함한다.
통상적으로, 상기 포맷(SMIP, 스콜피온 또는 PIMS)의 CD3 결합 폴리펩타이드는 면역글로불린 불변 구역 및/또는 힌지 구역(예를 들어, IgG CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 불변 구역 및 IgG 힌지 구역)을 통해 통상적으로 이황화 결합을 통해 동종이합체화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정 실시형태에서, 2개의 동일한 CD3 결합 폴리펩타이드는 동종이합체화하여 이합체 CD3 결합 단백질을 형성한다.
다른 실시형태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 제2의, 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬에서 상이한 이종이합체화 도메인과 이종이합체화할 수 있는 이종이합체화 도메인을 추가로 포함한다. 특정한 변형에서, 이종이합체화에 대한 제2 폴리펩타이드 사슬은 제2 결합 도메인을 포함한다. 따라서, 본 발명의 특정 실시형태에서, 2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬(하나의 사슬은 CD3 결합 도메인을 포함하고 제2 사슬은 임의로 제2 결합 도메인을 포함함)은 이합체화하여 1개 내지 4개의 결합 도메인과 이종이합체 단백질을 형성한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, CD3 결합 도메인, 힌지 구역, 불변 구역, 이종이합체화 도메인 및 임의로 제2 결합 도메인을 포함한다.
몇몇 양태에서, 제2 결합 도메인은 표적 분자에 결합하거나 이와 상호작용하고, CD3 결합 폴리펩타이드는 T-세포 세포독성을 유도한다. 이는 비이합체, 이종이합체 또는 동종이합체 포맷일 수 있다. 몇몇 양태에서, 제2 결합 도메인은 종양 관련 항원에 결합하거나 이와 상호작용한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 T-세포가 종양 세포를 용해시키도록 유도하고/하거나, 종양 근처에서 다클론성 T-세포 활성화 및 증식을 유도한다.
본 발명의 항-CD3 결합 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 결합 특이성을 보유하는 기능성 항체 단편 또는 단편의 유도체를 포함하는 항체 또는 항체 유도체이거나 이를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 가변 중쇄 및/또는 경쇄 도메인을 포함하는 융합 단백질 및 다른 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 28, 30, 32, 38 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 구역 서열 또는 VL 구역 서열을 포함하는 CD3 결합 도메인을 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 22, 24, 26, 28, 30 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 구역 및 서열 번호 38 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 구역을 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 28, 30 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 구역 및 서열 번호 34, 36, 38 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 구역을 포함한다. 몇몇 양태에서, VH 구역은 서열 번호 28을 포함하고, VL 구역은 서열 번호 34를 포함하거나; VH 구역은 서열 번호 28을 포함하고, VL 구역은 서열 번호 38을 포함하거나; VH 구역은 서열 번호 26을 포함하고, VL 구역은 서열 번호 38을 포함하거나; VH 구역은 서열 번호 26을 포함하고, VL 구역은 서열 번호 34를 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 CD3 결합 도메인을 포함하고, 중쇄 CDR3은 서열 번호 51을 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 49을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열 번호 50을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 51을 포함하는 CDR3 및 서열 번호 52를 포함하는 경쇄 CDR1, 서열 번호 53을 포함하는 CDR2 및 서열 번호 54를 포함하는 CDR3을 포함한다.
몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 이합체화된 단쇄 폴리펩타이드를 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 포함하고, 각각의 단쇄 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 제1 결합 도메인, N 말단 링커, 면역글로불린 불변 구역, C 말단 링커 및 본 발명의 CD3 결합 도메인을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 이합체화된 단쇄 폴리펩타이드를 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 포함하고, 각각의 단쇄 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 본 발명의 CD3 결합 도메인, N 말단 링커, 면역글로불린 불변 구역, C 말단 링커 및 제1 결합 도메인을 포함한다. 몇몇 양태에서, N 말단 링커는 면역글로불린 힌지 구역을 포함하거나, 이로 실질적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 다중특이적 결합 단백질은, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 제1 결합 도메인, N 말단 링커, 면역글로불린 불변 구역, C 말단 링커 및 CD3 결합 도메인을 포함하는 단쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, CD3 결합 도메인, N 말단 링커, 면역글로불린 불변 구역, C 말단 링커 및 제1 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 포함한다.
본 발명은 링커 도메인을 통해 제2 결합 도메인에 연결된 제1 결합 도메인(예를 들어, 링커를 통해 다른 scFv에 연결된 scFv)을 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 펩타이드 링커 도메인을 통해 CD3 결합 도메인(VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 배향으로)에 연결된 제1 결합 도메인(VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH 배향으로)을 포함하는 다중특이적 결합 단백질을 포함한다. 몇몇 양태에서, scFv-링커-scFv 포맷에서의 이중특이적 단백질은 본 명세서에 개시된 가변 도메인(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 항체로부터 T-세포 항원(예컨대 CD3)으로 유래한 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인을 포함할 수 있다. scFv 도메인을 분리시키는 링커는 ((Gly4)Ser)n을 포함할 수 있고, n = 1-5(서열 번호 74-78)이다. 일 양태에서, 링커는 ((Gly4)Ser)3(서열 번호 76)이다. 링커는 또한 약 8-12개의 아미노산을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 이 포맷에서의 본 발명의 단백질("이중특이적 단쇄 항체")은 Fc 구역을 포함하지 않고, 그 결과 Fc 관련 효과기 기능을 갖지 않는다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 유형의 결합 도메인 또는 도메인들을 포함하는 폴리펩타이드를 실질적으로 포함한다. 이는 항체, 이의 단편, scFv, Fab, 다이-scFv 단일 도메인 항체, 이중항체, 이중 가변 도메인 결합 단백질 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명에 포함된 폴리펩타이드의 추가의 유형이 본 명세서에 기재되어 있다.
몇몇 양태에서, VH 및 VL 도메인은 scFv로서 사용되고, scFv 및 VH/VL이 표적에 결합하는 방식으로 다른 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열에 부착/융합된다. 몇몇 양태에서, 본 명세서에 기재된 VH 및 VL 도메인은 항체 또는 이의 단편에 사용된다. 예를 들어, VH 및 VL 도메인은 항체에서 VH 및 VL 도메인에 대한 천연 위치로 편입된다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 CD3 결합 폴리펩타이드는 예를 들어 본 명세서에 기재된 VL 사슬 및 VH 사슬을 갖는 항체이다.
본 발명의 일 양태에서, 다중특이적 단백질은 전체 항체보다는 scFv 이합체 또는 이중항체이다. 이중항체 및 scFv 이합체는 오직 가변 도메인을 사용하여 Fc 구역 없이 작제될 수 있다. 이중항체는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬에서, 그러나 동일한 사슬에서 2개의 도메인 사이에 쌍 지음을 허용하기에 너무 짧은 펩타이드 링커를 사용하여, 발현되어 도메인이 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍 짓도록 하고 2개의 항원 결합 자리를 생성하는 2가, 이중특이적 항체이다(예를 들어, 문헌[Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 이러한 항체 결합 부분은 당해 분야에 공지되어 있다(Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)).
본 발명의 일 양태에서, 다중특이적 단백질은 이황화 안정화 이중항체이다. 예를 들면, 다중특이적 항체는 각각의 2의 특이성을 위해 1개의 결합 자리를 갖는 공유 결합된 이종이합체 복합체를 생성하도록 동시 발현된 2개의 명확한 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이 양태에서, 각각의 Fv는 VLA-VHB(제1 사슬) 및 VLB-VHA(제2 사슬) 구성으로 1개의 사슬 상의 VL 파트너와 제2 사슬 상의 VH 파트너의 연결에 의해 형성된다. 이는 2개의 대안적인 카복시 말단 이종이합체화 도메인: 1개의 사슬 상의 VEPKSC(서열 번호 254)와 다른 사슬 상의 FNRGEC(서열 번호 255)의 쌍 지음 또는 반대로 하전된 코일링된 코일 도메인의 쌍 지음에 의해 안정화될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Moore et al., 2011, Blood. 117:4542-4551]을 참조한다. 이 양태에서, 다중특이적 결합 단백질은 제1 결합 도메인 VL에 연결된 CD3 결합 도메인 VH를 갖는 제1 사슬을 포함할 수 있고, 제2 사슬은 제1 결합 도메인 VH에 연결된 CD3결합 도메인 VL을 포함하고, 2개의 사슬은 C 말단에서 이황화 결합을 통해 연결된다. 예를 들면, 본 명세서에 개시된 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는 공지된 항체로부터 유래한 가변 중쇄 및 경쇄를 사용하여 이황화 안정화 이중항체를 설계할 수 있다.
다른 실시형태에서, 다중특이적 결합 단백질은 제1 결합 자리(예를 들어, 종양 항원) 및 특이성을 갖는 TCR 복합체를 결합시킬 수 있는 이중 가변 도메인 결합 단백질이다. 이러한 양태에서, 재조합 단백질은 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 상기 폴리펩타이드 사슬은 VD1-(X1)n-VD2-C--(X2)n을 포함하고, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 링커(예를 들어, 약 10개 내지 20개의 길이의 아미노산의 폴리펩타이드 링커)이고, X2는 Fc 구역을 나타내고, n은 0 또는 1이다. 예를 들면, 미국 특허 제8,258,268호를 참조한다.
본 발명의 일 양태에서, 다중특이적 결합 단백질은 1개, 2개, 3개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은 VH1-VL2를 포함하는 제1 사슬, CH2-CH3-VL1-VH2를 포함하는 제2 사슬 및 CH2-CH3을 포함하는 제3 사슬을 갖는 다중특이적 단백질을 포함한다. 이러한 양태에서, VH1 및 VL1은 제1 결합 도메인의 가변 도메인에 상응할 수 있고, VH2 및 VL2는 항-CD3 가변 도메인에 상응할 수 있다. 대안적으로, VH1 및 VL1은 항-CD3 가변 도메인에 상응할 수 있고, VH2 및 VL2는 제1 결합 도메인의 가변 도메인에 상응할 수 있다.
다른 실시형태에서, 다중특이적 결합 단백질은 상이한 단쇄 폴리펩타이드를 포함하는 이합체화된 단쇄 폴리펩타이드 사슬(이종이합체)로 이루어진다. 이러한 포맷("다중특이적 이종이합체")에서, 각각의 폴리펩타이드 사슬은 결합 도메인, N 말단 링커, 불변 구역, C 말단 링커 및 임의로 다른 결합 도메인을 포함하고, 이종이합체화 도메인을 추가로 포함한다. 특정한 변형에서, 이종이합체화에 대한 제2 폴리펩타이드 사슬은 추가의 결합 도메인을 포함한다. 따라서, 본 발명의 특정 실시형태에서, 이종이합체 재조합 단백질은 2개, 3개 또는 4개의 결합 상이한 결합 도메인을 포함할 수 있다. 몇몇 예 및 관련 방법에 대해 PCT 공보 제WO2011/090762호를 참조한다.
상기 표시된 바대로, 본 개시내용의 CD3 결합 폴리펩타이드는 CD3에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 몇몇 변형에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 41에 도시된 바대로 아미노산 서열을 갖는 단쇄 Fv(scFv)와 CD3에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 특정 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 (ⅰ) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 CDR을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 구역(VH) 및 (ⅱ) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 CDR을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 구역(VL)을 포함한다. 적합한 CD3 결합 도메인은 쥣과 단클론성 항체 크리스-7로부터 유래한 VL 및 VH 구역을 갖는 것을 포함한다(Reinherz, E. L. et al. (eds.), Leukocyte typing II., Springer Verlag, New York, (1986). 몇몇 이러한 양태에서, LCDR3은 서열 번호 54에 기재된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, HCDR3은 서열 번호 51에 기재된 아미노산 서열을 갖고; LCDR1 및 LCDR2는 임의로 각각 서열 번호 52 및 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열을 갖고, HCDR1 및 HCDR2는 임의로 각각 서열 번호 49 및 서열 번호 50에 기재된 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 양태에서, 예를 들어, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열 번호 52, 53 및 54에 기재된 아미노산 서열을 갖고/갖거나, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열 번호 49, 50 및 51에 기재된 아미노산 서열을 갖는다.
본 개시내용의 결합 도메인이 유래할 수 있는 예시적인 항-CD3 항체는 크리스-7 단클론성 항체(Reinherz, E. L. et al. (eds.), Leukocyte typing II., Springer Verlag, New York, (1986))
(VL =
Figure pct00001
Figure pct00002
(서열 번호 46) 및
VH =
Figure pct00003
Figure pct00004
(서열 번호 45)); HuM291(Chau et al. (2001) Transplantation 71:941-950)
(VL =
Figure pct00005
Figure pct00006
(서열 번호 72) 및
VH =
Figure pct00007
Figure pct00008
(서열 번호 73)); BC3 단클론성 항체(Anasetti et al. (1990) J. Exp. Med. 172: 1691); OKT3 단클론성 항체(Ortho muliicenier Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313:337) 및 이의 유도체, 예컨대 OKT3 ala-ala(OKT3 AA-FL 또는 OKT3 FL이라고도 칭함), 234번 및 235번 위치에서 알라닌 치환을 갖는 인간화된 Fc 변이체(Herold et al. (2003) J. Clin. Invest. 11:409); 비실리주맙(visilizumab)(Carpenter et al. (2002) Blood 99:2712), G19-4 단클론성 항체(Ledbetter et al., 1986, J. Immunol. 136:3945) 및 145-2C11 단클론성 항체(Hirsch et al. (1988) J. Immunol. 140: 3766)를 포함한다. 예시적인 항-TCR 항체는 BMA031 단클론성 항체이다(Borst et al. (1990) Human Immunology 29: 175-188).
몇몇 양태에서, 결합 도메인은 관심 대상의 표적에 특이적인 VH 및 VL 구역을 포함하는 단쇄 Fv 분획(scFv)이다. 특정 실시형태에서, VH 및 VL 구역은 인간이다.
본 발명의 일 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 DRA209 SMIP보다 적어도 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5 이상의 단위가 낮은 경험적 및/또는 이론상 pI를 갖는다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 CD3 결합 폴리펩타이드는 DRA209 SMIP보다 약 0.25 내지 약 2.5, 0.5 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.0, 약 0.5 내지 약 1.5, 약 0.5 내지 약 1.25, 약 0.5 내지 약 1.0, 약 0.5 내지 약 0.75, 약 0.75 내지 약 1.0, 약 0.75 내지 약 1.25, 약 0.75 내지 약 1.5, 약 0.75 내지 약 2.0, 약 1.0 내지 약 1.5, 약 1.0 내지 약 2.0 또는 약 1.0 내지 약 2.5의 단위가 낮은 경험적 및/또는 이론상 pI를 갖는다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 CD3 폴리펩타이드는 약 8.9, 8.8, 8.7, 8.6, 8.5, 8.4, 8.3, 8.2, 8.1, 8, 7.5, 7.25, 7.0 또는 6.75 미만의 경험적 또는 이론상 pI를 갖는다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 CD3 폴리펩타이드는 약 8.9, 8.8, 8.7, 8.6, 8.5, 8.4, 8.3, 8.2, 8.1, 8, 7.5, 7.25, 7.2 7.0, 6.8 또는 6.75인 경험적 또는 이론상 pI를 갖는다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 CD3 폴리펩타이드는 약 7.9 내지 약 8.7, 7.9 내지 약 8.6, 8.0 내지 약 8.6, 8.0 내지 약 8.5, 8.0 내지 약 8.4, 8.0 내지 약 8.3, 8.0 내지 약 8.2, 8.0 내지 약 8.1, 약 8.1 내지 약 8.6, 약 8.2 내지 약 8.6, 약 8.3 내지 약 8.6, 약 8.4 내지 약 8.6, 약 8.5 내지 약 8.6, 약 8.5 내지 약 8.3, 약 8.4 내지 약 8.2 또는 약 8.3 내지 약 8.1인 경험적 또는 이론상 pI를 갖는다.
특정 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 41의 scFv와 비교하여 적어도 약 0.25, 0.5, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5 이상의 단위만큼 pI(경험적 및/또는 이론상)가 감소한 scFv이거나 이를 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 41의 scFv보다 약 0.25 내지 약 2.5, 0.5 내지 약 2.5, 약 0.5 내지 약 2.0, 약 0.5 내지 약 1.5, 약 0.5 내지 약 1.25, 약 0.5 내지 약 1.0, 약 0.5 내지 약 0.75, 약 0.75 내지 약 1.0, 약 0.75 내지 약 1.25, 약 0.75 내지 약 1.5, 약 0.75 내지 약 2.0, 약 1.0 내지 약 1.5, 약 1.0 내지 약 2.0 또는 약 1.0 내지 약 2.5 단위가 낮은 pI(경험적 및/또는 이론상)가 감소한 scFv이거나 이를 포함한다. 이러한 scFv는 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20 내에 포함된 scFv 또는 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20 내에 포함된 scFv의 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5% 또는 100% 동일한 scFv를 포함한다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 CD3 결합 도메인은 서열 번호 41과 약 80% 내지 약 99%, 약 82% 내지 약 99%, 약 84% 내지 약 99%, 약 86% 내지 약 99%, 약 88% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%, 약 92% 내지 약 99%, 약 94% 내지 약 99%, 약 96% 내지 약 99%, 약 97% 내지 약 99%, 약 98% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 97%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 93%, 약 90% 내지 약 91%, 약 95% 내지 약 96%, 약 96% 내지 약 97%, 약 97% 내지 약 98%, 약 96% 내지 약 97% 또는 약 96% 내지 약 98% 동일하다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 CD3 결합 도메인은 서열 번호 41의 변이체이고, 아미노산 서열에서의 하나 이상의 아미노산은 결합 도메인의 pI를 감소시키도록 돌연변이된다. 돌연변이는 결합 도메인의 pI를 감소시키기 위한 다른 아미노산(들)에 의한 아미노산(들)의 치환, 결합 분자의 pI를 감소시키기 위한 아미노산(들)의 삽입 및/또는 결합 도메인의 pI를 감소시키기 위한 아미노산(들)의 결실을 포함한다. 일 양태에서, 돌연변이는 치환이다. 몇몇 양태에서, 돌연변이(들)는 가변 사슬(들)의 프레임워크 구역 내에 있다. 몇몇 양태에서, 변이체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 아미노산의 돌연변이를 갖는다.
일 양태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 28, 30, 32, 38 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 scFv이거나 이를 포함한다. 다른 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 22, 24, 26, 28, 30 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 구역 및 서열 번호 38 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 구역을 포함한다. 다른 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 28, 30 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 구역 및 서열 번호 34, 36, 38 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 구역을 포함한다. 다른 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 28 및 34를 포함한다. 다른 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 28 및 38을 포함한다. 다른 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 26 및 38을 포함한다. 다른 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 26 및 34를 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 도메인은 서열 번호 38 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 구역 및 서열 번호 22, 24, 26, 28, 30 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 구역을 포함한다. 추가의 양태에서, 각각의 CDR은 관심 대상의 표적(예를 들어, CD3)에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체 또는 이의 단편 또는 유도체와 비교하여 1개, 2개 또는 3개 이하의 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다.
몇몇 양태에서, CD3 결합 도메인은 T-세포 상에 T-세포 수용체 복합체의 CD3ε 하위단위에 결합하거나 이와 상호작용한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 도메인은 크리스-7 또는 HuM291 단클론성 항체와 CD3ε에 대한 결합에 대해 경쟁한다.
몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 T-세포 수용체 복합체의 내재화를 유도한다.
몇몇 변형에서, 결합 도메인은 펩타이드 링커에 의해 연결된 면역글로불린 VL 및 VH 구역을 포함하는 단쇄 Fv(scFv)이다. VL 및 VH 구역을 연결하기 위한 펩타이드 링커의 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이 특정 분야 내에 다수의 간행물이 존재한다. 널리 사용되는 펩타이드 링커는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 74) 아미노산 서열(Gly4Ser)3(서열 번호 76)의 3개의 반복부로 이루어진 15합체이다. 몇몇 양태에서, 펩타이드 링커는 서열 번호 74-78 중 임의의 하나를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 적절한 링커 서열을 다양화하고 선택하기 위해 다른 링커가 사용되고 파지 디스플레이 기술 및 선택적 감염성 파지 기술이 사용된다(Tang et al., J. Biol. Chem. 271, 15682-15686, 1996; Hennecke et al., Protein Eng. 11, 405-410, 1998). 특정 실시형태에서, VH 및 VL 구역은 화학식 (Gly4Ser)n을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 링커에 의해 연결되고, n = 1-5이다(각각 서열 번호 74-78). 무작위 돌연변이를 통해 단순한 링커(예를 들어, (Gly4Ser)n)를 최적화하여 다른 적합한 링커를 얻을 수 있다.
특정 실시형태에서, 결합 도메인은 인간화 면역글로불린 VL 및/또는 VH 구역을 포함한다. 면역글로불린 VL 및 VH 구역을 인간화하는 기법이 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제2006/0153837호에 기재되어 있다.
"인간화"는, 원래 분자의 항원-결합 특성을 완전히 보유하면서, 덜 면역원성인 항체를 발생시키는 것으로 예상된다. 원래 항체의 모든 항원-결합 특성을 보유하기 위해, 이의 항원 결합 자리의 구조는 "인간화" 버전에서 재생성되어야 한다. 중요한 프레임워크 잔기를 보유하거나 보유하지 않으면서 비인간 CDR만을 인간 가변 프레임워크 도메인 및 불변 구역에 그래프팅함으로써(Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1539 (1988)) 또는 (리간드-결합 특성을 보존하기 위해) 전체 비인간 가변 도메인을 재조합하지만, (항원성을 감소시키기 위해) 이를 노출된 잔기의 신중한 대체를 통해 인간 유사 표면으로 "클로킹(cloaking)"함으로써(Padlan, Molec. Immunol. 28:489 (1991)) 이를 성취할 수 있다.
실질적으로, CDR 그래프팅에 의한 인간화는 비인간 항체의 CDR만을 인간 가변 구역 프레임워크 및 인간 불변 구역에 재조합하는 것을 포함한다. 이론상, 이는 면역원성을 실질적으로 감소시키거나 제거해야 한다(동종이인자형 또는 유전자형 차이가 존재하는 경우 제외). 그러나, 원래 항체의 몇몇 프레임워크 잔기가 또한 보존될 필요가 있는 것으로 보고되었다(Reichmann et al., Nature, 332:323 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10,029 (1989)).
보존될 필요가 있는 프레임워크 잔기는 컴퓨터 모델링을 통한 확인에 수정 가능하다. 대안적으로, 중요한 프레임워크 잔기는 공지된 항원-결합 자리 구조를 비교함으로써 잠재적으로 확인될 수 있다(Padlan, Molec. Immunol., 31(3): 169-217 (1994), 본 명세서에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨).
항원 결합에 잠재적으로 영향을 미치는 잔기는 몇몇 그룹에 해당한다. 제1 그룹은 항원 자리 표면과 인접하여, 따라서 항원과 직접 접촉할 수 있는 잔기를 포함한다. 이 잔기는 아미노 말단 잔기 및 CDR에 인접한 것을 포함한다. 제2 그룹은 항체에서 CDR 또는 다른 펩타이드 사슬을 접촉시킴으로써 CDR의 구조 또는 상대 정렬을 변경하는 잔기를 포함한다. 제3 그룹은 가변 도메인의 구조 통합성에 영향을 미치는 묻힌 측쇄를 갖는 아미노산을 포함한다. 이 그룹에서의 잔기는 일반적으로 동일한 위치(상기 [Padlan, 1994] 문헌)에서 발견되지만, 확인된 이의 위치가 넘버링 시스템에 따라 상이할 수 있다(문헌[Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., Pub. No. 91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991] 참조).
본 명세서에 기재된 몇몇 예가 항체가 아닌 scFv, SMIP, 스콜피온 및 인터셉터 분자의 인간화를 포함하지만, 당해 분야에서 인간화 항체에 대한 지식은 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 적용 가능하다.
특정 실시형태에서, 힌지는 야생형 인간 면역글로불린 힌지 구역이다. 특정한 다른 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 융합 단백질 작제물 설계의 일부로서 야생형 면역글로불린 힌지 구역의 아미노 말단 또는 카복실 말단에서 부가될 수 있다. 예를 들어, 힌지 아미노 말단에서의 추가의 접합 아미노산 잔기는 "RT", "RSS", "TG" 또는 "T"일 수 있거나, 힌지 카복실 말단에서 "SG"일 수 있거나, 힌지 결실은 카복실 말단에서 첨가된 "SG"를 갖는 ΔΡ와 같은 부가와 조합될 수 있다.
특정 실시형태에서, 힌지는 야생형 면역글로불린 힌지 구역에서의 하나 이상의 시스테인 잔기가 하나 이상의 다른 아미노산 잔기(예를 들어, 세린 또는 알라닌)로 치환된 변경된 면역글로불린 힌지이다.
예시적인 변경된 면역글로불린 힌지는 1개, 2개 또는 3개의 상이한 아미노산 잔기(예를 들어, 세린 또는 알라닌)에 의해 치환된 야생형 인간 IgG1 힌지에서 발견된 1개, 2개 또는 3개의 시스테인 잔기를 갖는 면역글로불린 인간 IgG1 힌지 구역을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 변경된 면역글로불린 힌지는 다른 아미노산(예를 들어, 세린 또는 알라닌)으로 치환된 프롤린을 추가로 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 변경된 인간 IgG1 힌지는 다른 아미노산 잔기(예를 들어, 세린, 알라닌)에 의해 치환된 야생형 인간 IgG1 힌지 구역의 3개의 시스테인에 대한 프롤린 위치한 카복실 말단을 추가로 가질 수 있다. 일 양태에서, 코어 힌지 구역의 프롤린은 치환되지 않는다.
특정 실시형태에서, 힌지 폴리펩타이드는 야생형 면역글로불린 힌지 구역, 예컨대 야생형 인간 IgG1 힌지, 야생형 인간 IgG2 힌지 또는 야생형 인간 IgG4 힌지와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열이거나 이를 포함한다.
추가의 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드에 존재하는 힌지는 면역글로불린 힌지에 기초하거나 이로부터 유래하지 않는 힌지(즉, 야생형 면역글로불린 힌지 또는 변경된 면역글로불린 힌지가 아님)일 수 있다. 이러한 힌지의 예는 막관통 단백질의 도메인간 구역 또는 II형 C-렉틴의 스톡 구역으로부터 유래한 약 5개 내지 약 150개의 아미노산의 펩타이드, 예를 들면 약 8개 내지 25개의 아미노산의 펩타이드 및 약 7개 내지 18개의 아미노산의 펩타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 도메인간 또는 스톡 구역 힌지는 7개 내지 18개의 아미노산을 갖고 α-나선 코일링된 코일 구조를 형성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 도메인간 또는 스톡 구역 힌지는 0개, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 시스테인을 포함한다. 예시적인 도메인간 또는 스톡 구역 힌지는 도메인간 또는 스톡 구역의 펩타이드 단편, 예컨대 CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D의 스톡 구역으로부터 10개 내지 150개의 아미노산 단편이다.
특정 실시형태에서, 힌지 서열은 약 5개 내지 150개의 아미노산, 5개 내지 10개의 아미노산, 10개 내지 20개의 아미노산, 20개 내지 30개의 아미노산, 30개 내지 40개의 아미노산, 40개 내지 50개의 아미노산, 50개 내지 60개의 아미노산, 5개 내지 60개의 아미노산, 5개 내지 40개의 아미노산, 8개 내지 20개의 아미노산 또는 10개 내지 15개의 아미노산을 갖는다. 힌지는 주로 가요성일 수 있지만, 또한 더 경질인 특성을 제공하거나 주로 최소 β 시트 구조를 갖는 α-나선 구조를 포함할 수 있다. 힌지의 길이 또는 서열은 힌지가 직접적으로 또는 간접적으로(다른 구역 또는 도메인, 예컨대 이종이합체화 도메인을 통해) 연결된 결합 도메인의 결합 친화도 및 힌지가 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 Fc 구역 부분의 하나 이상의 활성에 영향을 미칠 수 있다.
특정 실시형태에서, 힌지 서열은 혈장 및 혈청에서 안정하고 단백질분해 개열에 저항이다. IgG1 상부 힌지 구역에서의 제1 라이신은 단백질분해 개열을 최소화하도록 돌연변이될 수 있고, 예를 들면 라이신은 메티오닌, 트레오닌, 알라닌 또는 글라이신으로 치환될 수 있거나 결실된다.
본 발명의 몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 제2 폴리펩타이드 사슬과 이종이합체를 형성할 수 있고, (a) 면역글로불린 불변 구역에 대한 바로 아미노 말단(예를 들어, CH2 도메인에 대한 아미노 말단(여기서, 면역글로불린 불변 구역은 CH2 및 CH3 도메인을 포함함) 또는 CH3 도메인에 대한 아미노 말단(여기서, 면역글로불린 구역은 CH3 및 CH4 도메인을 포함함))에서, (b) 결합 도메인(예를 들어, scFv)과 면역글로불린 이종이합체화 도메인 사이에 위치하고 이를 연결하면서, (c) 면역글로불린 이종이합체화 도메인과 면역글로불린 불변 구역 사이에 위치하고 이를 연결하면서(예를 들어, 면역글로불린 불변 구역은 CH2 및 CH3 도메인 또는 CH3 및 CH4 도메인을 포함함), (d) 면역글로불린 불변 구역과 결합 도메인 사이에 위치하고 이를 연결하면서, (e) 폴리펩타이드 사슬의 아미노 말단에서 또는 (f) 폴리펩타이드 사슬의 카복실 말단에서 힌지 구역을 포함한다. 본 명세서에 기재된 힌지 구역을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 상이한 폴리펩타이드 사슬과 연결되어 본 명세서에 제공된 동종이합체 또는 이종이합체 단백질을 형성할 수 있고, 형성된 이합체는 이의 표적 특이성 및/또는 이의 특이적 표적 결합 친화도를 보유하는 결합 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 다른 폴리펩타이드 사슬과 이종이합체를 형성하는 폴리펩타이드에 존재하는 힌지는 면역글로불린 힌지, 예컨대 야생형 면역글로불린 힌지 구역 또는 이의 변경된 면역글로불린 힌지 구역일 수 있다. 특정 실시형태에서, 이종이합체 단백질의 하나의 폴리펩타이드 사슬의 힌지는 이종이합체의 다른 폴리펩타이드 사슬의 상응하는 힌지와 동일하다. 다른 특정 실시형태에서, 하나의 사슬의 힌지는 (예를 들어, 이의 길이 및/또는 서열에서) 다른 사슬과 다르다. 상이한 사슬에서의 상이한 힌지는 힌지가 연결된 결합 도메인의 결합 친화도의 상이한 조작을 허용하여, 이종이합체는 다른 결합 도메인의 표적에 걸쳐 하나의 결합 도메인의 표적에 결합할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 이종이합체 단백질은 하나의 사슬에서 CD3- 또는 TCR-결합 도메인 및 다른 사슬에서 제2 결합 도메인(예컨대, 종양 항원 결합 도메인)을 갖는다. 2개의 사슬에서의 2개의 상이한 힌지를 갖는 것은 이종이합체가 첫째로 종양 항원에 결합하고 이후 둘째로 CD3 또는 다른 TCR 성분에 결합하게 한다. 따라서, 이종이합체는 종양 항원 발현 세포(예를 들어, PSMA 발현 종양 세포)에 CD3+ T-세포를 동원할 수 있어서, 결국 종양 항원 발현 세포를 손상시키거나 파괴시킬 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 예시적인 힌지 구역은 하기 표 1 및 표 2에 도시되어 있다.
Figure pct00009
Figure pct00010
특정 실시형태에서, 본 발명의 CD3 결합 폴리펩타이드 또는 단백질은 "면역글로불린 이합체화 도메인" 또는 "면역글로불린 이종이합체화 도메인"을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "면역글로불린 이합체화 도메인" 또는 "면역글로불린 이종이합체화 도메인"은 제2 폴리펩타이드 사슬의 제2 면역글로불린 도메인과 상호작용하거나 연결되는 폴리펩타이드 사슬의 면역글로불린 도메인을 의미하고, 제1 및 제2 면역글로불린 이종이합체화 도메인의 상호작용은 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 이종이합체화(즉, "이종이합체" 또는 "이종이합체 단백질"이라고도 칭하는 2개의 상이한 폴리펩타이드 사슬 사이의 이합체의 형성)에 실질적으로 기여하거나 이를 효과적으로 촉진한다. 제1 폴리펩타이드 사슬의 면역글로불린 이종이합체화 도메인 및/또는 제2 폴리펩타이드 사슬의 면역글로불린 이종이합체화 도메인의 부재 하에 제1 폴리펩타이드 사슬과 제2 폴리펩타이드 사슬 사이의 이합체화의 통계학적으로 유의적인 감소가 있는 경우 면역글로불린 이종이합체화 도메인 사이의 상호작용은 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 이종이합체화에 "실질적으로 기여하거나 이를 효과적으로 촉진한다". 특정 실시형태에서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬이 동시 발현될 때, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 적어도 60%, 적어도 약 60% 내지 약 70%, 적어도 약 70% 내지 약 80%, 적어도 80% 내지 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%는 서로 이종이합체를 형성한다. 대표적인 면역글로불린 이종이합체화 도메인은, 예컨대 본 명세서에 제공된 야생형 면역글로불린 CH1 및 CL 도메인 및 변경된(또는 돌연변이된) 면역글로불린 CH1 및 CL 도메인을 포함하여, 면역글로불린 CH1 도메인, 면역글로불린 CL 도메인(예를 들어, Cκ 또는 Cλ 동형단백질) 또는 이의 유도체를 포함한다.
2개의 동일하지 않은 폴리펩타이드 사슬로부터 이종이합체를 형성하는 것이 바람직한 경우 이합체화/이종이합체화 도메인을 사용할 수 있고, 여기서 폴리펩타이드 사슬 중 하나 또는 둘 다는 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 특정한 이종이합체의 하나의 폴리펩타이드 사슬 구성원은 결합 도메인을 포함하지 않는다. 상기 표시된 바대로, 본 개시내용의 이종이합체 단백질은 각각의 폴리펩타이드 사슬에서 면역글로불린 이종이합체화 도메인을 포함한다. 이종이합체의 폴리펩타이드 사슬에서의 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 서로 다르고, 따라서 다르게 변형되어 사슬 둘 다의 이종이합체화를 촉진하고 사슬 중 어느 하나의 동종이합체화를 최소화할 수 있다. PCT 공보 제WO2011/090762호에 도시된 것처럼, 본 명세서에 제공된 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 상이한 폴리펩타이드 사이의 효과적인 이종이합체화를 허용하고 생성된 이종이합체 단백질의 정제를 수월하게 한다.
본 명세서에 제공된 것처럼, 본 개시내용에 따른 2개의 상이한 단쇄 폴리펩타이드(예를 들어, 1개의 짧은 것 및 1개는 긴 것)의 이종이합체화를 촉진하는 데 유용한 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 면역글로불린 CH1 및 CL 도메인, 예를 들면, 인간 CH1 및 CL 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 야생형 CH1 도메인, 예컨대 야생형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM CH1 도메인이다. 추가의 양태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 PCT 공보 제WO2011/090762호의 각각 서열 번호 114, 186-192 및 194에 기재된 야생형 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM CH1 도메인이다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 특정 실시형태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 본 명세서의 서열 번호 80과 동일한 제WO2011/090762호의 서열 번호 114에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH1 도메인이다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨).
추가의 양태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 변경된 면역글로불린 CH1 도메인, 예컨대 변경된 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 IgD, IgE 또는 IgM CH1 도메인이다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 변경된 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM CH1 도메인이다. 다른 추가의 양태에서, 야생형 면역글로불린 CL 도메인(예를 들어, 인간 CL)과 이황화 결합을 형성하는 데 관여하는 야생형 CH1 도메인(예를 들어, 인간 CH1)의 시스테인 잔기는 변경된 면역글로불린 CH1 도메인에서 결실되거나 치환되어 이황화 결합은 변경된 CH1 도메인과 야생형 CL 도메인 사이에 형성되지 않는다.
특정 실시형태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 야생형 CL 도메인, 예컨대 야생형 Cκ 도메인 또는 야생형 Cλ 도메인이다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 각각 본 명세서의 서열 번호 81 및 82와 동일한 제WO2011/090762호의 각각 서열 번호 112 및 113에 기재된 야생형 인간 Cκ 또는 인간 Cλ 도메인이다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 추가의 양태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 변경된 면역글로불린 CL 도메인, 예컨대 변경된 Cκ 또는 Cλ 도메인, 예를 들면 변경된 인간 Cκ 또는 인간 Cλ 도메인이다.
특정 실시형태에서, 야생형 면역글로불린 CH1 도메인(예를 들어, 인간 CH1)과 이황화 결합을 형성하는 데 관여하는 야생형 CL 도메인(예를 들어, 인간 CL)의 시스테인 잔기는 변경된 면역글로불린 CL 도메인에서 결실되거나 치환된다. 이러한 변경된 CL 도메인은 이의 아미노 말단에서 아미노산 결실을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 Cκ 도메인은 WO2011/090762호의 서열 번호 141에 기재되어 있고(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨, 본 명세서의 서열 번호 83임), 여기서 야생형 인간 Cκ 도메인의 제1 아르기닌 및 마지막 시스테인은 둘 다 결실된다. 특정 실시형태에서, 야생형 인간 Cκ 도메인의 마지막 시스테인만이 변경된 Cκ 도메인에서 결실되는데, 왜냐하면 이의 카복실 말단에서 아르기닌을 갖고 다른 도메인(예를 들어, 면역글로불린 하위구역, 예컨대 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 하위구역)을 갖는 변경된 Cκ 도메인의 아미노 말단을 연결하는 링커에 의해 야생형 인간 Cκ 도메인으로부터 결실된 제1 아르기닌이 제공될 수 있기 때문이다. 예시적인 Cλ 도메인은 제WO2011/090762호의 서열 번호 140에 기재되어 있고(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨, 본 명세서의 서열 번호 84임), 여기서 야생형 인간 Cλ 도메인의 제1 아르기닌은 결실되고, CH1 도메인에서 시스테인과 이황화 결합을 형성하는 데 관여하는 시스테인은 세린에 의해 치환된다.
추가의 양태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 Cκ-Cκ 계면에서 사슬간 수소 결합 네트워크를 형성하는 데 관여할 수 있는 위치에서 야생형 Cκ 도메인과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변경된 Cκ 도메인이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 상이한 아미노산에 의해 치환된 N29번, N30번, Q52번, V55번, T56번, S68번 또는 T70번 위치에서 하나 이상의 아미노산을 갖는 변경된 인간 Cκ 도메인이다. 아미노산의 넘버링은 제WO2011/090762호의 서열 번호 141에 기재된 변경된 인간 Cκ 서열에서의 이의 위치에 기초한다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨, 본 명세서의 서열 번호 83임). 특정 실시형태에서, 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 N29번, N30번, V55번 또는 T70번 위치에서 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 갖는 변경된 인간 Cκ 도메인이다. 상기 기재된 위치에서 치환기로서 사용된 아미노산은 알라닌, 또는 벌크 측쇄 모이어티를 갖는 아미노산 잔기, 예컨대 아르기닌, 트립토판, 티로신, 글루타메이트, 글루타민 또는 라이신일 수 있다. 상기 기재된 위치(예를 들어, N30)에서 야생형 인간 Cκ 서열의 아미노산 잔기를 치환하는 데 사용될 수 있는 추가의 아미노산 잔기는 아스파르테이트, 메티오닌, 세린 및 페닐알라닌을 포함한다. 예시적인 변경된 인간 Cκ 도메인은 제WO2011/090762호의 서열 번호 142-178에 기재되어 있다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 변경된 인간 Cκ 도메인은 CH1 도메인과의 이종이합체화를 촉진하지만, 다른 Cκ 도메인과의 동종이합체화를 최소화하는 것이다. 대표적인 변경된 인간 Cκ 도메인은 제WO2011/090762호의 서열 번호 160(N29W V55A T70A), 161(N29Y V55A T70A), 202(T70E N29A N30A V55A), 167(N30R V55A T70A), 168(N30K V55A T70A), 170(N30E V55A T70A), 172(V55R N29A N30A), 175(N29W N30Y V55A T70E), 176(N29Y N30Y V55A T70E), 177(N30E V55A T70E), 178(N30Y V55A T70E), 838(N30D V55A T70E), 839(N30M V55A T70E), 840(N30S V55A T70E) 및 841(N30F V55A T70E)에 기재되어 있다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨).
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 Cκ 도메인에서의 돌연변이 이외에 또는 이에 대안적으로, 폴리펩타이드 이종이합체의 면역글로불린 이종이합체화 도메인(예를 들어, 면역글로불린 CH1 및 CL 도메인) 둘 다는 돌연변이를 가져서 생성된 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 돌열변이된 자리에서 아미노산 잔기 사이에 염 브릿지(즉, 이온 상호작용)를 형성한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 이종이합체의 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 돌연변이된 Cκ 도메인과 조합된 돌연변이된 CH1 도메인일 수 있다. 돌연변이된 CH1 도메인에서, 야생형 인간 CH1 도메인의 68번 위치에서의 발린(V68)은 음전하를 갖는 아미노산 잔기(예를 들어, 아스파르테이트 또는 글루타메이트)에 의해 치환되는 반면, 제1 아르기닌 및 마지막 시스테인이 결실된 돌연변이된 인간 Cκ 도메인의 29번 위치에서의 류신(L29)은 양전하를 갖는 아미노산 잔기(예를 들어, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘)에 의해 치환된다. 생성된 돌연변이된 CH1 도메인의 음전하를 갖는 아미노산 잔기와 생성된 돌연변이된 Cκ 도메인의 양전하를 갖는 아미노산 잔기 사이의 전하-전하 상호작용은 염 브릿지를 형성하고, 이는 돌연변이된 CH1 도메인과 Cκ 도메인 사이의 이종이합체 계면을 안정화시킨다. 대안적으로, 야생형 CH1의 V68은 양전하를 갖는 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있는 반면, 제1 아르기닌 및 마지막 시스테인이 결실된 돌연변이된 인간 Cκ 도메인의 L29는 음전하를 갖는 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있다. V68이 음전하 또는 양전하를 갖는 아미노산에 의해 치환된 예시적인 돌연변이된 CH1 서열은 제WO2011/090762호의 서열 번호 844 및 845에 기재되어 있다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). L29가 음전하 또는 양전하를 갖는 아미노산에 의해 치환된 예시적인 돌연변이된 Cκ 서열은 제WO2011/090762호의 서열 번호 842 및 843(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
인간 CH1 도메인의 V68 및 인간 Cκ 도메인의 L29 이외의 위치는 CH1 도메인의 V68 및 Cκ 도메인의 L29에서의 돌연변이 이외에 또는 이에 대안적으로서 아미노산 사이의 이온 상호작용을 생성하기 위해 반대 전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 이러한 위치는 무작위 돌연변이유발, CH1-Cκ 쌍의 결정 구조의 분석을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 확인될 수 있어서, CH1-Cκ 계면에서의 아미노산 잔기를 확인하고, 일련의 기준(예를 들어, 이온 상호작용에 관여하는 성향, 잠재적 파트너 잔기에 대한 근접성 등)을 이용하여 CH1-Cκ 계면에서 아미노산 잔기 사이의 적합한 위치를 추가로 확인할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드 이종이합체는 오직 한 쌍의 면역글로불린 이종이합체화 도메인을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 이종이합체의 제1 사슬은 면역글로불린 이종이합체화 도메인으로서 CH1 도메인을 포함할 수 있고, 제2 사슬은 면역글로불린 이종이합체화 도메인으로서 CL 도메인(예를 들어, Cκ 또는 Cλ)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제1 사슬은 면역글로불린 이종이합체화 도메인으로서 CL 도메인(예를 들어, Cκ 또는 Cλ)을 포함할 수 있고, 제2 사슬은 면역글로불린 이종이합체화 도메인으로서 CH1 도메인을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바대로, 제1 사슬 및 제2 사슬의 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 본 개시내용의 이종이합체 단백질를 형성하도록 연결될 수 있다.
다른 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 이종이합체 단백질은 2쌍의 면역글로불린 이종이합체화 도메인을 가질 수 있다. 예를 들어, 이종이합체의 제1 사슬은 2개의 CH1 도메인을 포함할 수 있고, 제2 사슬은 제1 사슬에서 2개의 CH1 도메인과 연결된 2개의 CL 도메인을 가질 수 있다. 대안적으로, 제1 사슬은 2개의 CL 도메인을 포함할 수 있고, 제2 사슬은 제1 사슬에서 2개의 CL 도메인과 연결된 2개의 CH1 도메인을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 사슬은 CH1 도메인 및 CL 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩타이드 사슬은 제1 폴리펩타이드 사슬의 각각 CH1 도메인 및 CL 도메인과 연결된 CL 도메인 및 CH1 도메인을 포함한다.
이종이합체 단백질이 오직 하나의 이종이합체화 쌍(예를 들어, 각각의 사슬에서의 하나의 면역글로불린 이종이합체화 도메인)을 포함하는 양태에서, 각각의 사슬의 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 이 사슬의 면역글로불린 불변 하위구역에 대한 아미노 말단에 위치할 수 있다. 대안적으로, 각각의 사슬에서의 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 이 사슬의 면역글로불린 불변 하위구역에 대한 카복실 말단에 위치할 수 있다.
이종이합체 단백질이 2개의 이종이합체화 쌍(예를 들어, 각각의 사슬에서의 2개의 면역글로불린 이종이합체화 도메인)을 포함하는 양태에서, 각각의 사슬에서의 면역글로불린 이종이합체화 도메인 둘 다는 이 사슬의 면역글로불린 불변 하위구역에 대한 아미노 말단에 위치할 수 있다. 대안적으로, 각각의 사슬에서의 면역글로불린 이종이합체화 도메인 둘 다는 이 사슬의 면역글로불린 불변 하위구역에 대한 카복시 말단에 위치할 수 있다. 추가의 양태에서, 각각의 사슬에서의 하나의 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 이 사슬의 면역글로불린 불변 하위구역에 대한 아미노 말단에 위치할 수 있고, 각각의 사슬의 다른 면역글로불린 이종이합체화 도메인은 이 사슬의 면역글로불린 불변 하위구역에 대한 카복시 말단에 위치할 수 있다. 즉, 이 양태에서, 면역글로불린 불변 하위구역은 각각의 사슬의 2개의 면역글로불린 이종이합체화 도메인 사이에 위치한다.
본 명세서에 표시된 바대로, 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 CD3 결합 폴리펩타이드(예를 들어, 작은 모듈식 면역약학 단백질(SMIP), 동종이합체 이중특이적(예를 들어, 스콜피온), 이종이합체 단일특이적 및 다중특이적 치료제(예를 들어, 인터셉터)는 각각의 폴리펩타이드 사슬에서 면역글로불린 불변 구역을 포함한다. 용어 "불변 구역"은 본 명세서에서 불변 하위구역 및 면역글로불린 불변 구역과 상호 교환되어 사용된다. 면역글로불린 불변 구역의 포함은 대상체에게 투여 후 순환으로부터 2개의 CD3 결합 폴리펩타이드 사슬로부터 형성된 동종이합체 및 이종이합체 단백질의 청소를 느리게 할 수 있다.
돌연변이 또는 다른 변경에 의해, 면역글로불린 불변 구역은 이합체 폴리펩타이드 효과기 기능(예를 들어, ADCC, ADCP, CDC, 보체 고정 및 Fc 수용체에 대한 결합)의 비교적 쉬운 조절이 추가로 가능하게 하고, 이 기능은 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 치료하고자 하는 질환에 따라 증가하거나 감소할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드 동종이합체 및 이종이합체의 폴리펩타이드 사슬 중 하나 또는 둘 다의 면역글로불린 불변 구역은 하나 이상의 이 효과기 기능을 중재할 수 있다.
다른 실시형태에서, 하나 이상의 이 효과기 기능은 상응하는 야생형 면역글로불린 불변 구역과 비교하여 본 개시내용의 폴리펩타이드 동종이합체 및 이종이합체의 폴리펩타이드 사슬 중 하나 또는 둘 다의 면역글로불린 불변 구역에서 감소하거나 부재한다. 예를 들면, 이는 예를 들어 상응하는 야생형 면역글로불린 불변 구역과 비교하여 효과기 기능이 감소하거나 없는 면역글로불린 불변 구역을 갖기 위해, 재지향된 T-세포 세포독성(RTCC)을 발생시키도록 설계된, 단일특이적 CD3 결합 폴리펩타이드 및 제2 결합 도메인을 포함하는 CD3 결합 폴리펩타이드에 특히 유용하다. 일 양태에서, 불변 구역은 보체를 고정하도록 변형된다. 불변 구역은 하나 이상의 Fcγ 수용체, 예컨대 CD16, CD32 및 CD64에 결합하지 않도록 또한 변형될 수 있다.
본 개시내용의 CD3 결합 폴리펩타이드에 존재하는 면역글로불린 불변 하위구역은 CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인 또는 이들의 임의의 조합 일부 또는 전부로부터 유래하거나 이로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 불변 하위구역은 CH2 도메인, CH3 도메인, CH2 및 CH3 도메인 둘 다, CH3 및 CH4 도메인 둘 다, 2개의 CH3 도메인, CH4 도메인, 2개의 CH4 도메인 및 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 일부를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 불변 구역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD 또는 이들의 임의의 조합 CH2 및 CH3 도메인; IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM 또는 이들의 임의의 조합 면역글로불린 CH3 도메인; 또는 IgE, IgM 또는 이의 조합의 면역글로불린 CH3 및 CH4 도메인을 포함한다. 몇몇 양태에서, 불변 구역은 CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 실질적으로 이루어진다.
본 개시내용의 CD3 결합 폴리펩타이드의 면역글로불린 불변 구역을 형성할 수 있는 CH2 도메인은 특정한 면역글로불린 종류 또는 하위종류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 또는 IgD) 및 다양한 종(인간, 마우스, 래트 및 다른 포유동물 포함)으로부터의 야생형 면역글로불린 CH2 도메인 또는 이의 변경된 면역글로불린 CH2 도메인일 수 있다. 몇몇 양태에서, 불변 구역은 효과기 기능을 감소시키거나 제거하고/하거나, 보체를 감소시키거나 고정시키지 않고/않거나, Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키거나 이에 결합하지 않도록 변형된다. 몇몇 양태에서, Fcγ 수용체는 CD16, CD32 및 CD64로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, CH2 도메인은 PCT 공보 제WO2011/090762호의 각각 서열 번호 115, 199-201 및 195-197에 기재된 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 또는 IgD의 야생형 인간 면역글로불린 CH2 도메인, 예컨대 야생형 CH2 도메인이다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 특정 실시형태에서, CH2 도메인은 제WO2011/090762호의 서열 번호 115에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH2 도메인이다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨, 본 명세서의 서열 번호 85임). 몇몇 양태에서, 불변 구역은 서열 번호 55의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함한다.
특정 실시형태에서, CH2 도메인은 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환(예를 들어, 알라닌에 대한 아스파라긴)을 포함하는 변경된 면역글로불린 CH2 구역(예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)이다. 이러한 아미노산 치환은 이 자리에서 글라이코실화를 감소시키거나 제거하고 FcγR 및 C1q에 대한 효과적인 Fc 결합을 무효화한다. 297번 위치에서의 Ala에 대한 Asn 치환을 갖는 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인의 서열은 제WO2011/090762호의 서열 번호 324에 기재되어 있다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨, 본 명세서의 서열 번호 86임).
특정 실시형태에서, CH2 도메인은 234번 내지 238번 위치에서 적어도 하나의 치환 또는 결실을 포함하는 변경된 면역글로불린 CH2 구역(예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)이다. 예를 들어, 면역글로불린 CH2 구역은 234번, 235번, 236번, 237번 또는 238번 위치, 234번 및 235번 위치, 234번 및 236번 위치, 234번 및 237번 위치, 234번 및 238번 위치, 234-236번 위치, 234번, 235번 및 237번 위치, 234번, 236번 및 238번 위치, 234번, 235번, 237번 및 238번 위치, 236-238번 위치에서의 치환, 또는 234-238번 위치에서의 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 임의의 다른 조합을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 변경된 CH2 구역은 234-238번 위치에서, 예를 들면 236번 위치 또는 237번 위치 중 하나에서 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산 결실을 포함할 수 있고, 다른 위치는 치환된다. 상기 언급된 돌연변이(들)는 변경된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 이종이합체의 항체 의존적 세포 중재 세포독성(ADCC) 활성 또는 Fc 수용체-결합 능력을 감소시키거나 제거한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 234-238번 위치에서의 아미노산 잔기는 하나 이상의 알라닌 잔기로 대체된다. 추가의 양태에서, 234-238번 위치에서의 오직 하나의 아미노산 잔기가 결실되고, 234-238번 위치에서의 하나 이상의 남은 아미노산은 다른 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 세린)으로 치환될 수 있다.
다른 특정 실시형태에서, CH2 도메인은 253번, 310번, 318번, 320번, 322번 및 331번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변경된 면역글로불린 CH2 구역(예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)이다. 예를 들어, 면역글로불린 CH2 구역은 253번, 310번, 318번, 320번, 322번 또는 331번 위치, 318번 및 320번 위치, 318번 및 322번 위치, 318번, 320번 및 322번 위치에서의 치환, 또는 253번, 310번, 318번, 320번, 322번 및 331번 위치에서의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아미노산의 임의의 다른 조합을 포함할 수 있다. 상기 기재된 돌연변이(들)는 변경된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 이종이합체의 보체 의존적 세포독성(CDC)을 감소시키거나 제거한다.
다른 특정 실시형태에서, 297번 위치에서의 아미노산 치환 이외에, 변경된 CH2 구역(예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)은 234-238번 위치에서의 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 추가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 CH2 구역은 234번 및 297번 위치, 234번, 235번 및 297번 위치, 234번, 236번 및 297번 위치, 234-236번 및 297번 위치, 234번, 235번, 237번 및 297번 위치, 234번, 236번, 238번 및 297번 위치, 234번, 235번, 237번, 238번 및 297번 위치, 236-238번 및 297번 위치에서의 치환, 또는 297번 위치 이외의 234-238번 위치에서의 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 변경된 CH2 구역은 234-238번 위치, 예컨대 236번 위치 또는 237번 위치에서의 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 추가의 돌연변이(들)는 변경된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 이종이합체의 항체 의존적 세포 중재 세포독성(ADCC) 활성 또는 Fc 수용체-결합 능력을 감소시키거나 제거한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 234-238번 위치에서의 아미노산 잔기는 하나 이상의 알라닌 잔기로 대체된다. 추가의 양태에서, 234-238번 위치에서의 오직 하나의 아미노산 잔기가 결실되고, 234-238번 위치에서의 하나 이상의 남은 아미노산은 다른 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 세린)으로 치환될 수 있다.
특정 실시형태에서, 234-238번 위치에서의 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산 치환 이외에, 본 개시내용의 융합 단백질에서의 돌연변이된 CH2 구역(예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)은 보체 고정에 포함된 하나 이상의 위치(예를 들어, I253, H310, E318, K320, K322 또는 P331 위치)에서 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 (예를 들어, 알라닌으로 치환된) 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이된 면역글로불린 CH2 구역의 예는 234번, 235번, 237번(존재하는 경우), 318번, 320번 및 322번 위치에서의 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 마우스 IgG2a CH2 구역을 포함한다. 예시적인 돌연변이된 면역글로불린 CH2 구역은 L234, L235, G237, E318, K320 및 K322에서 알라닌 치환을 갖는 마우스 IGHG2c CH2 구역이다.
다른 추가의 양태에서, 297번 위치에서의 아미노산 치환 및 234-238번 위치에서의 추가의 결실(들) 또는 치환(들) 이외에, 변경된 CH2 구역(예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)은 253번, 310번, 318번, 320번, 322번 및 331번 위치에서 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 추가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 CH2 구역은 (1) 297번 위치에서의 치환, (2) 234-238번 위치에서의 하나 이상의 치환 또는 결실 또는 이의 조합, 및 I253, H310, E318, K320, K322 및 P331 위치에서의 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 아미노산 치환, 예컨대 E318, K320 및 K322 위치에서의 1개, 2개, 3개의 치환을 포함할 수 있다. 상기 기재된 위치에서의 아미노산은 알라닌 또는 세린으로 치환될 수 있다.
특정 실시형태에서, 면역글로불린 CH2 구역 폴리펩타이드는 (ⅰ) 297번 위치의 아스파라긴에서의 아미노산 치환 및 234번, 235번, 236번 또는 237번 위치에서의 하나의 아미노산 치환; (ⅱ) 297번 위치의 아스파라긴에서의 아미노산 치환 및 234-237번 위치의 2개에서의 아미노산 치환; (ⅲ) 297번 위치의 아스파라긴에서의 아미노산 치환 및 234-237번 위치의 3개에서의 아미노산 치환; (ⅳ) 297번 위치의 아스파라긴에서의 아미노산 치환, 234번, 235번 및 237번 위치에서의 아미노산 치환 및 236번 위치에서의 아미노산 결실; (v) 234-237번 위치의 3개에서의 아미노산 치환 및 318번, 320번 및 322번 위치에서의 아미노산 치환; 또는 (vi) 234-237번 위치의 3개에서의 아미노산 치환, 236번 위치에서의 아미노산 결실 및 318번, 320번 및 322번 위치에서의 아미노산 치환을 포함한다.
297번 위치의 아스파라긴에서의 아미노산 치환을 갖는 예시적인 변경된 면역글로불린 CH2 구역은 L234, L235, G237 및 N297에서의 알라닌 치환 및 G236에서의 결실을 갖는 인간 IgG1 CH2 구역(제WO2011/090762호의 서열 번호 325, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨), V234, G236 및 N297에서의 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG2 CH2 구역(제WO2011/090762호의 서열 번호 326, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨), F234, L235, G237 및 N297에서의 알라닌 치환 및 G236의 결실을 갖는 인간 IgG4 CH2 구역(제WO2011/090762호의 서열 번호 322, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨), F234 및 N297에서의 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG4 CH2 구역(제WO2011/090762호의 서열 번호 343, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨), L235 및 N297에서의 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG4 CH2 구역(제WO2011/090762호의 서열 번호 344, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨), G236 및 N297에서의 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG4 CH2 구역(제WO2011/090762호의 서열 번호 345, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨) 및 G237 및 N297에서의 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG4 CH2 구역(제WO2011/090762호의 서열 번호 346, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 상기 기재된 아미노산 치환 이외에, 변경된 CH2 구역(예를 들어, 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인)은 상기 기재된 위치 이외의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, P233은 변경된 IgG2 CH2 구역에서 E233으로 변경될 수 있다(예를 들어, 제WO2011/090762호의 서열 번호 326 참조, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 추가로 또는 대안적으로, 특정 실시형태에서, 변경된 CH2 구역은 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 면역글로불린 CH2 구역 내 어디든, 예컨대 힌지를 통해 CH2 구역을 다른 구역(예를 들어, 결합 도메인 또는 면역글로불린 이종이합체화 도메인)과 연결하여 생성된 야생형 면역글로불린 CH2 구역의 N 또는 C 말단에 있을 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 폴리펩타이드에서의 변경된 CH2 구역은 야생형 면역글로불린 CH2 구역, 예컨대 야생형 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 마우스 IgG2a(예를 들어, IGHG2c)의 CH2 구역과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열이거나 이를 포함한다.
본 개시내용의 CD3 결합 폴리펩타이드에서의 변경된 면역글로불린 CH2 구역은 다양한 종(인간, 마우스, 래트 및 다른 포유동물 포함)으로부터의 다양한 면역글로불린 동형단백질, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 및 IgD의 CH2 구역으로부터 유래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 융합 단백질에서의 변경된 면역글로불린 CH2 구역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 또는 마우스 IgG2a(예를 들어, IGHG2c)의 CH2 구역으로부터 유래할 수 있고, 이의 서열은 제WO2011/090762호의 서열 번호 115, 199, 201 및 320에 기재되어 있다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨).
특정 실시형태에서, 변경된 CH2 도메인은 235번, 318번, 320번 및 322번 위치에서의 알라닌 치환(즉, L235A, E318A, K320A 및 K322A 치환을 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인) 및 임의로 N297 돌연변이(예를 들어, 알라닌으로의)를 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인이다(제WO2011/090762호의 서열 번호 595, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 다른 특정 실시형태에서, 변경된 CH2 도메인은 234번, 235번, 237번, 318번, 320번 및 322번 위치에서의 알라닌 치환(즉, L234A, L235A, G237A, E318A, K320A 및 K322A 치환을 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인) 및 임의로 N297 돌연변이(예를 들어, 알라닌으로의)를 갖는 인간 IgG1 CH2 도메인이다(제WO2011/090762호의 서열 번호 596, 상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨).
특정 실시형태에서, 변경된 CH2 도메인은 면역학적 활성, 예컨대 ADCC, ADCP, CDC, 보체 고정, Fc 수용체 결합 또는 임의의 이의 조합을 증대시키는 당해 분야에 공지된 돌연변이를 갖는 변경된 인간 IgG1 CH2 도메인이다.
본 개시내용의 CD3 결합 폴리펩타이드의 면역글로불린 불변 구역을 형성할 수 있는 CH3 도메인은 다양한 종(인간, 마우스, 래트 및 다른 포유동물 포함)의 특정한 면역글로불린 종류 또는 하위종류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, SgA2, IgD, IgE, IgM)로부터의 야생형 면역글로불린 CH3 도메인 또는 이의 변경된 면역글로불린 CH3 도메인일 수 있다. 특정 실시형태에서, CH3 도메인은 야생형 인간 면역글로불린 CHS 도메인, 예컨대 제WO2011/090762호의 각각 서열 번호 116, 208-210, 204-207 및 212에 기재된 인간 IgG1, IgG2, IgG3, SgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM의 야생형 CH3 도메인이다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 특정 실시형태에서, CH3 도메인은 제WO2011/090762호의 서열 번호 116에 기재된 야생형 인간 IgG1 CH3 도메인이다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 특정 실시형태에서, CH3 도메인은 변경된 인간 면역글로불린 CH3 도메인, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체의 야생형 CH3 도메인에 기초하거나 이로부터 유래한 변경된 CH3 도메인이다. 예를 들어, 변경된 CH3 도메인은 H433 및 N434 위치(위치는 EU 넘버링에 따라 넘버링됨)에서 1개 또는 2개의 돌연변이를 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인일 수 있다. 이러한 위치에서의 돌연변이는 보체 고정에 포함될 수 있다. 다른 특정 실시형태에서, 변경된 CH3 도메인은 F405 또는 Y407 위치에서의 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 갖는 인간 IgG1 CH3 도메인일 수 있다. 이 위치에서의 아미노산은 다른 CH3 도메인과 상호작용하는 데 관여한다. 특정 실시형태에서, 변경된 CH3 도메인은 이의 마지막 라이신이 결실된 변경된 인간 IgG1 CH3 도메인일 수 있다. 이 변경된 CH3 도메인의 서열은 제WO2011/090762호의 서열 번호 761에 기재되어 있다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨).
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 이종이합체를 형성하는 CD3 결합 폴리펩타이드는 소위 "구멍에 손잡이(knob-into-hole)" 돌연변이를 포함하는 CH3 쌍을 포함한다(문헌[Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 26:649-58, 2005; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-21, 1966] 참조). 더 구체적으로, 돌연변이는 각각의 폴리펩타이드 사슬의 2개의 CH3 도메인의 각각에 도입될 수 있어서, CH3/CH3 연결에 필요한 입체 상보성은 이 2개의 CH3 도메인이 서로 쌍을 짓도록 강제한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 이종이합체의 하나의 단쇄 폴리펩타이드에서의 CH3 도메인은 T366W 돌연변이(더 큰 아미노산에 의해 작은 아미노산을 치환하는 "손잡이" 돌연변이)를 포함할 수 있고, 폴리펩타이드 이종이합체의 다른 단쇄 폴리펩타이드에서의 CH3 도메인은 Y407A 돌연변이(더 작은 아미노산에 의해 큰 아미노산을 치환하는 "구멍" 돌연변이)를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 구멍에 손잡이 돌연변이는 (1) 하나의 CH3 도메인에서의 T366Y 돌연변이 및 다른 CH3 도메인에서의 Y407T 돌연변이 및 (2) 하나의 CH3 도메인에서의 T366W 돌연변이 및 다른 CH3 도메인에서의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 포함한다.
본 개시내용의 CD3 결합 폴리펩타이드의 면역글로불린 불변 구역을 형성할 수 있는 CH4 도메인은 IgE 또는 IgM 분자로부터의 야생형 면역글로불린 CH4 도메인 또는 이의 변경된 면역글로불린 CH4 도메인일 수 있다. 특정 실시형태에서, CH4 도메인은 야생형 인간 면역글로불린 CH4 도메인, 예컨대 제WO2011/090762호의 각각 서열 번호 213 및 214에 기재된 인간 IgE 및 IgM 분자의 야생형 CH4 도메인이다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 특정 실시형태에서, CH4 도메인은 변경된 인간 면역글로불린 CH4 도메인, 예컨대 IgE 또는 IgM Fc 구역과 연관된 것으로 공지된 면역학적 활성을 증가시키거나 감소시키는 돌연변이를 갖는, 인간 IgE 또는 IgM 분자의 CH4 도메인에 기초하거나 이로부터 유래한 변경된 GH4 도메인이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 CD3 결합 폴리펩타이드의 면역글로불린 불변 구역은 CH2, CH3 또는 CH4 도메인의 조합(즉, CH2, CH3 및 CH4로부터 선택되는 1개 초과의 불변 구역 도메인)을 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린 불변 하위구역은 CH2 및 CH3 도메인 또는 CH3 및 CH4 도메인을 포함할 수 있다. 다른 특정 실시형태에서, 면역글로불린 불변 구역은 2개의 CH3 도메인을 포함하고 CH2 또는 CH4 도메인을 포함하지 않을 수 있다(즉, 오직 2개 이상의 CH3). 면역글로불린 불변 하위구역을 형성하는 다수의 불변 구역 도메인은 동일한 면역글로불린 분자 또는 동일한 종류 또는 하위종류 면역글로불린 분자에 기초하거나 이로부터 유래할 수 있다. 특정 실시형태에서, 면역글로불린 불변 하위구역은 IgG CH2CH3(예를 들어, IgG1 CH2CH3, IgG2 CH2CH3 및 IgG4 CH2CH3)이고, 인간(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4) CH2CH3일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 면역글로불린 불변 하위구역은 (1) 야생형 인간 IgG1 CH2 및 CH3 도메인, (2) N297A 치환을 갖는 인간 IgG1 CH2(즉, CH2(N297A)) 및 야생형 인간 IgG1 CH3 또는 (3) 인간 IgG1 CH2(N297A) 및 마지막 라이신이 결실된 변경된 인간 IgG1 CH3을 포함한다.
대안적으로, 다수의 불변 구역 도메인은 상이한 면역글로불린 분자 또는 상이한 종류 또는 하위종류 면역글로불린 분자에 기초하거나 이로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 면역글로불린 불변 하위구역은 인간 IgM CH3 도메인 및 인간 IgG1 CH3 도메인 둘 다를 포함한다. 면역글로불린 불변 하위구역을 형성하는 다수의 불변 구역 도메인은 함께 직접적으로 연결되거나 하나 이상(예를 들어, 약 2-10개)의 아미노산을 통해 서로 연결될 수 있다.
예시적인 면역글로불린 불변 하위구역은 제WO2011/090762호의 서열 번호 305-309, 321, 323, 341, 342 및 762에 기재되어 있다(상기 서열은 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨).
특정 실시형태에서, 동종이합체 또는 이종이합체의 CD3 결합 폴리펩타이드 사슬 둘 다의 면역글로불린 불변 구역은 서로에 동일하다. 다른 특정 실시형태에서, 이종이합체 단백질의 하나의 폴리펩타이드 사슬의 면역글로불린 불변 하위구역은 이종이합체의 다른 폴리펩타이드 사슬의 면역글로불린 불변 하위구역과 다르다. 예를 들어, 이종이합체 단백질의 하나의 면역글로불린 불변 하위구역은 "손잡이" 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함할 수 있고, 이종이합체 단백질의 다른 면역글로불린 불변 하위구역은 "구멍" 돌연변이를 갖는 CH3 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇 양태는 예를 들어 T-세포 세포독성을 세포 표면 단백질을 갖는 세포, 예를 들어, 암의 치료를 위해 종양 항원을 발현하는 종양 세포에 대해 재지향시키기 위해 (ⅰ) 인간 T-세포 상의 TCR 복합체(예를 들어, CD3) 및 (ⅱ) 세포 표면 단백질을 표적화하는 이중특이적 또는 다중특이적 결합 분자를 사용하는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, CD3 결합 단백질은 CD3 이외의 표적에 결합하는 하나 이상의 추가의 결합 도메인(예를 들어, 제2 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 이 다른 표적 분자는 예를 들어 종양 관련 항원을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 하나 이상의 추가의 결합 도메인은 하나 이상의 하기 종양 항원에 결합하거나 이와 상호작용한다: RON, c-Met, CEACAM-6, PSMA, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, STEAP-2, PSCA, PSA, PAP, ALCAM(CD166), PECAM-1, EphA2, CD151, CA-125/MUC16, MUC-1, MAGE-1, TROP2, IGF1R, TGFBR2, GHRHR, GHR, IL-6R, gp130, TNFR2, OSMRβ, 패치드(Patched)-1, 프리즐드(Frizzled), 로보(Robo)1, LTβR, CD19, CD25, CD26, CD27, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD63, CD80, CD81, CD86, CD100, CD151, CXCR4, CCR5, HER-2/ErbB1, HER-3/ErbB3, HER-4/ErbB4, EGFR/ErbB1, EGFRvIII 동형단백질, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5b, MUC7, βhCG, 루이스(Lewis)-Y, 강글리오사이드 GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, 글로보(Globo) H, 퓨코실 GM1, 폴리 SA, GD2, 탄산무수화효소 IX(MN/CA IX), 소닉 헤지호그(Shh), Wue-1, 혈장 세포 항원, (막 결합) IgE, 흑색종 황산 콘드로이틴 프로테오글라이칸(MCSP), CCR8, TNF-알파 전구체, 메소텔린, A33 항원, Ly-6; 데스모글레인 4, E-카데린 네오에피토프, 태아 아세틸콜린 수용체, CA19-9 마커, 뮐러(Muellerian) 억제 물질(MIS) 수용체 II형, sTn(시알릴화 Tn 항원; TAG-72), FAP(섬유아세포 활성화 항원), 엔도시알린, LG, SAS, BCMA, TWEAKR/Fn14, FGFR4, VEGFR1, VEGFR2, SSX1 및 SSX2.
특정 실시형태에서, CD3 결합 도메인은 종양 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위해 T-세포의 동원을 위해 TCR 결합 도메인에 결합한다. 특정 실시형태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 TCR 복합체 또는 이의 성분(예를 들어, TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ 및 CD3ε)에 특이적으로 결합하는 CD3 결합 도메인 및 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 다른 결합 도메인을 포함할 수 있다.
PSMA는 매우 제한된 전립선암 관련 세포 막 항원이다. 전립선 암 세포에서, PSMA는 정상 전립선 상피보다 1000배 높게 발현된다(Su et al., Cancer Res. 1995 44:1441-1443). PSMA의 발현은 전립선암 진행으로 증가하고 통상적으로 전이성 질환, 호르몬 불응성 사례 및 더 높은 등급의 병변에서 가장 높다(Israeli et al., Cancer Res. 1994, 54:1807-1811; Wright et al., Urologic Oncology : Seminars and Original Investigations 1995 1:18-28; Wright et al., Urology 1996 48:326-332; Sweat et al., Urology 1998 52:637-640). 추가로, PSMA는 방광암, 췌장암, 흑색종, 폐암 및 신장암을 포함하는 다양한 다른 고형 종양의 신생맥관구조(neovasculature)뿐만 아니라, 정상 신생맥관구조에서 풍부하게 발현된다(Chang et al., Urology 2001 57:801-805; Divgi et al., Clin. Cancer Res. 1998 4:2729-3279). PSMA를 표적화하기 위한 결합 도메인은 PCT 공보 제WO2012/145714호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 것을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 양태에서, PSMA 결합 도메인은 (ⅰ) 서열 번호 212의 1-107번 및 124-243번 아미노산; (ⅱ) 서열 번호 226의 1-107번 및 124-243번 아미노산; 또는 (ⅲ) 서열 번호 216의 1-107번 및 124-243번 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 단백질 또는 분자는 서열 번호 212, 214, 216 및 226으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 PSMA 결합 도메인은, 제WO2012/145714호의 서열 번호 19, 21, 30, 31, 34 또는 35의 아미노산 서열을 포함하여, PSMA 결합 도메인을 포함하여 PCT 공보 제WO2012/145714호에 또한 기재되어 있거나, 제WO2012/145714호의 서열 번호 5 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 사슬 및 서열 번호 2, 25 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 사슬을 포함한다.
RON(recepteur d'origine Nantaise, MST1R로도 공지됨)은 배아 발생에 필수적이고 또한 염증 반응에서 중요한 역할을 하는 수용체 유형 단백질 티로신 키나제이다(Camp et al. Ann. Surg. Oncol. 12:273-281 (2005)). RON은 상피 유래 세포 유형에서 대부분 발현되고, RON이, 다수의 다른 수용체 유형 티로신 키나제와 같이, 악성 상피암의 진행에 역할을 할 수 있다는 것이 제시되었다(Wang et al. Carcinogenesis 23:1291-1297(2003)). RON의 활성화는 발암성 활성, 예컨대 세포 증식, 아폽토시스의 억제 및 세포 사망률에 관여된 하향 신호전달 경로를 개시한다. RON은 대장암, 유방암, 난소암 및 췌장암에서의 이의 신호전달 특성 및/또는 RON의 과발현으로 인해 특히 상피암에 대한 치료학적 표적을 나타낸다.
RON을 표적화하기 위한 결합 도메인은 실시예 섹션에 기재된 것 및 PCT 공보 제WO2011/090761호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 것을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 몇몇 양태에서, 항-RON 결합 도메인은 (a) i. 서열 번호 87의 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호 88의 CDR2 아미노산 서열 및 서열 번호 89의 CDR3 아미노산 서열; 또는 ii. 서열 번호 90의 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호 91의 CDR2 아미노산 서열 및 서열 번호 92의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인; 또는 (b) i. 서열 번호 93의 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호 94의 CDR2 아미노산 서열 및 서열 번호 95의 CDR3 아미노산 서열; 또는 ii. 서열 번호 96의 CDR1 아미노산 서열, 서열 번호 97의 CDR2 아미노산 서열 및 서열 번호 98의 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인; 또는 (c) (a)의 VL 및 (b)의 VH을 포함한다. 일 양태에서, VL 도메인은 임의의 하나의 서열 번호 99 또는 100의 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 임의의 하나의 서열 번호 101, 102 및 103의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, VL 및 VH 도메인은 인간화된다. 특정 실시형태에서, 인간화 VL은 임의의 하나의 서열 번호 104, 105 및 106의 아미노산 서열을 포함하고, 인간화 VH 도메인은 임의의 하나의 서열 번호 107-111의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, 항-RON 결합 도메인은 임의의 하나의 서열 번호 99 및 100의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 임의의 하나의 서열 번호 101, 102 및 103의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 몇몇 양태에서, 항-RON 결합 도메인은 임의의 하나의 서열 번호 104, 105 및 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 임의의 하나의 서열 번호 107-111의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
몇몇 양태에서, RON 결합 도메인은 서열 번호 187과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나 서열 번호 188과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, RON 결합 도메인은 (ⅰ) 서열 번호 187(여기서, 43번 아미노산(알라닌)은 다른 아미노산, 예를 들어, 라이신(A43K) 또는 트레오닌(A43T)으로 치환됨), (ⅱ) 서열 번호 188(여기서, 38번 아미노산(글루타민) 및/또는 113번 아미노산(글루타민)은 다른 아미노산, 예를 들어 글루탐산 및/또는 아르기닌으로 치환됨, 예컨대 Q38R 및/또는 Q113E) 또는 (ⅲ) 임의의 이의 조합을 포함한다. 몇몇 양태에서, 항-RON/항-CD3 이중특이적 분자는 임의의 하나의 서열 번호 186, 190, 192 또는 194와 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 항-RON/항-CD3 이중특이적 분자를 코딩하는 핵산을 제공하고, 핵산은 임의의 하나의 서열 번호 185, 189, 191 또는 193과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
CD19는 가장 악성인 B 세포를 포함하는 B 세포의 표면 상에 발견된다. B 세포 관련 질환, 백혈병 및 림프종을 억제하거나 치료하기 위해 CD19를 표적화하는 것을 이용할 수 있다.
몇몇 양태에서, CD19 결합 도메인은 서열 번호 196의 1-111번 아미노산과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 서열 번호 196의 128-251번 아미노산과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, 항-CD19/항-CD3 이중특이적 분자는 임의의 하나의 서열 번호 196, 198, 200, 202, 204 또는 206과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 항-CD19/항-CD3 이중특이적 분자를 코딩하는 핵산을 제공하고, 핵산은 임의의 하나의 서열 번호 195, 197, 199, 201, 203 또는 206과 적어도 90%, 92%, 94%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
HER2는 인간 ErbB2로도 공지되어 있다. HER2의 과발현(유전자 증폭으로 인해 자주지만 불균일하게)은 또한 유방암, 난소암 및 위, 자궁내막, 침샘, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 및 방광의 암종을 포함하는 다른 암종에서 관찰된다. HER2를 표적화하기 위한 결합 도메인은 PCT 공보 제WO2009/055074호(본 명세서에서 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 것을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 186, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204 또는 206과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 양태에서, CD3 결합 폴리펩타이드는 이종이합체의 일부이다. 몇몇 양태에서, 이종이합체는 단쇄 쌍이 서열 번호 210 및 247, 서열 번호 210 및 218, 서열 번호 210 및 220, 서열 번호 208 및 249, 서열 번호 208 및 222 또는 서열 번호 208 및 224, 서열 번호 212 및 218, 서열 번호 216 및 222, 서열 번호 228 및 226 또는 서열 번호 214 및 218로부터 선택되는 쌍과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단쇄 폴리펩타이드의 쌍을 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 CD3 결합 폴리펩타이드을 코딩하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 또는 본 명세서에 기재된 이합체 또는 이종이합체 CD3 결합 단백질의 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 본 발명의 핵산은 서열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 27, 29, 31, 37 및 39에 제공된 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 동일한 구역을 갖는 핵산 또는 동일한 또는 유사한 폴리펩타이드를 코딩하는 코딩 구역을 포함하는 핵산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 핵산은 서열 번호 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 27, 29, 31, 37 및 39에 제공된 폴리펩타이드 코딩 폴리뉴클레오타이드와 적어도 80%, 통상적으로 적어도 약 90%, 더 통상적으로 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98%의 동일성을 갖는다. 본 발명의 핵산은 또한 상보성 핵산을 포함한다. 몇몇 경우에, 서열은 정렬될 때 완전히 상보성(미스매치 없음)이다. 다른 경우에, 서열에서 약 20% 이하의 미스매치가 존재할 수 있다. 본 발명의 몇몇 양태에서 본 발명의 이종이합체 CD3 결합 단백질의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬 둘 다를 코딩하는 핵산이 제공된다. 본 명세서에서 제공된 핵산 서열은 코돈 최적화, 축퇴성 서열, 침묵 돌연변이 및 특정한 숙주에서 발현을 최적화하기 위한 다른 DNA 기술에서 이용될 수 있고, 본 발명은 이러한 서열 변형을 포함하다.
분자를 벡터에 위치시킴으로써 원하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 번식된다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하고/하거나 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 발현 벡터를 포함한다. 플라스미드를 포함하는 바이러스 및 비바이러스 벡터를 사용한다. 플라스미드의 선택은 번식이 바람직한 세포 유형 및 번식의 목적에 따라 달라진다. 특정한 벡터는 다량의 원하는 DNA 서열을 증폭하고 만드는 데 유용하다. 다른 벡터는 배양에서 세포에서의 발현에 적합하다. 여전히 다른 벡터는 전체 동물 또는 사람에서 세포에서의 운반 및 발현에 적합하다. 적절한 벡터의 선택은 당해 분야의 기술 내에 있다. 많은 이러한 벡터는 상업적으로 구입 가능하다. 통상적으로 벡터에서의 개열된 제한 효소 자리에 대한 DNA 결찰 부착에 의해 벡터로 부분 또는 전장 폴리뉴클레오타이드를 삽입한다. 대안적으로, 원하는 뉴클레오타이드 서열을 생체내 상동성 재조합에 의해 삽입할 수 있다. 통상적으로, 원하는 뉴클레오타이드 서열의 플랭크 상의 벡터에 대한 상동성의 구역을 부착함으로써 이를 성취한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 결찰에 의해 또는 상동성의 구역 및 원하는 뉴클레오타이드 서열의 부분 둘 다를 포함하는 프라이머를 사용한 중합효소 사슬 반응에 의해 상동성의 구역을 부가한다.
발현을 위해, 발현 카세트 또는 시스템을 이용할 수 있다. 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 발현하기 위해, 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동적으로 연결된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 숙주 세포에 도입한다. 본 발명은 본 발명의 핵산 및/또는 발현 벡터, 예를 들어 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 것을 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 이외에, 발현 벡터는 번역 조절 서열 및 발현 벡터를 운반하는 세포의 선택에 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 유전자 생성물은 예를 들어 박테리아, 효모, 곤충, 양서류 및 포유동물 시스템을 포함하는 임의의 편리한 발현 시스템에서 발현된다. 발현 벡터에서, 폴리펩타이드 코딩 폴리뉴클레오타이드는 원하는 발현 특성을 얻기 위해 적절한 대로 조절 서열에 연결된다. 이는 프로모터, 인핸서, 종결자, 오퍼레이터, 리프레서(repressor) 및 인듀서(inducer)를 포함할 수 있다. 프로모터는 조절될 수 있거나(예를 들어, 스테로이드 유도성 pIND 벡터로부터의 프로모터(인비트로젠)), 또는 구성적(예를 들어, CMV, SV40, 신장 인자 또는 LTR 서열로부터의 프로모터)일 수 있다. 이는 벡터에 대한 결찰을 위해 상기 기재된 기법을 이용하여 원하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된다. 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 이용할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 일반적으로 유도성 또는 구성적일 수 있는 전사 및 번역 개시 구역을 제공하고, 여기서 코딩 구역은 전사 개시 구역 및 전사 및 번역 종결 구역의 전사 제어 하에 작동적으로 연결된다.
발현 카세트("발현 단위")는 다양한 벡터, 예를 들어, 플라스미드, BAC, YAC, 박테리오파지, 예컨대 람다, P1, M13, 등, 식물 또는 동물 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 기반 벡터, 아데노바이러스 벡터) 등에 도입될 수 있고, 벡터는 보통 발현 벡터를 포함하는 세포의 선택을 제공하는 능력을 특징으로 한다. 벡터는 특히 플라스미드 또는 바이러스로서 염색체외 유지를 제공하거나 숙주 염색체로의 통합을 제공할 수 있다. 염색체외 유지가 바람직한 경우, 기원 서열은 저카피수 또는 고카피수일 수 있는 플라스미드의 복제에 제공된다. 매우 다양한 마커, 특히 독소, 더 특히 항생제에 대해 보호하는 것이 선택에 이용 가능하다. 선택된 특정한 마커는 숙주의 성질에 따라 선택되고, 몇몇 경우에, 상보성이 영양요구성 숙주와 이용될 수 있다. DNA 작제물의 도입은 예를 들어 접합, 박테리아 형질전환, 칼슘 침전된 DNA, 전기영동, 융합, 형질감염, 바이러스 벡터에 의한 감염, 유전자총법 등을 포함하는 임의의 편리한 방법을 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명 내에 사용하기 위한 단백질을 편리한 기법에 따라 유전 조작 숙주 세포에서 제조할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 외인성 DNA로 형질전환되거나 형질감염되고 배양물 중에 성장할 수 있고, 박테리아, 진균 세포 및 배양된 더 고차의 진핵생물 세포(다세포 유기체의 배양된 세포 포함), 특히 배양된 포유동물 세포를 포함하는 세포 유형이다. 클로닝된 DNA 분자를 조작하고 다양한 숙주 세포로 외인성 DNA를 도입하는 기법은 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning : A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), 및 Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed., John Wiley & Sons, 1999)]에 개시되어 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 2개의 동일한 CD3 결합 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 동종이합체 CD3 결합 단백질의 재조합 발현을 위해, 발현 벡터는 일반적으로 프로모터에 작동적으로 연결된 CD3 결합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분절을 포함한다. 상이한 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 이종이합체 CD3 결합 단백질의 재조합 발현을 위해, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 전체 이종이합체 단백질의 발현을 위해 숙주 세포에서 별개의 벡터로부터 동시 발현될 수 있다. 대안적으로, 이종이합체 CD3 결합 단백질의 발현을 위해, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 전체 이종이합체 단백질의 발현을 위해 숙주 세포에서 동일한 벡터에서의 별개의 발현 단위로부터 동시 발현된다. 발현 벡터(들)는 종래의 기법에 의해 숙주 세포로 전달되고, 형질감염된 세포는 이후 종래의 기법에 의해 배양되어 코딩된 폴리펩타이드(들)를 생성하여 상응하는 CD3 결합 단백질을 생성한다.
재조합 단백질을 숙주 세포의 분비 경로로 지향시키기 위해, 분비 신호 서열(리더 서열로도 공지됨)은 발현 벡터에 제공된다. 분비 신호 서열은 재조합 단백질의 네이티브 형태의 것일 수 있거나, 다른 분비된 단백질로부터 유래하거나 신생 합성될 수 있다. 분비 신호 서열은 폴리펩타이드 코딩 DNA 서열에 작동적으로 연결되고, 즉 2개의 서열은 정확한 리딩 프레임에서 연결되고 숙주 세포의 분비 경로로 새로 합성된 폴리펩타이드를 지향시키도록 위치한다. 분비 신호 서열은 관심 대상의 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열에 대한 5'에 보통 위치하지만, 특정한 신호 서열은 관심 대상의 DNA 서열 어디에도 위치할 수 있다(예를 들어, 웰치(Welch) 등의 미국 특허 제5,037,743호; 홀란드(Holland) 등의 미국 특허 제5,143,830호 참조). 특정한 변형에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 분비 신호 서열은 아미노산 서열 MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(서열 번호 79)을 갖는다.
배양된 포유동물 세포는 본 발명 내의 사용을 위해 재조합 단백질의 생성에 적합한 숙주이다. 포유동물 숙주 세포에 외인성 DNA를 도입하는 방법은 인산칼슘 중재 형질감염(Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), 전기영동(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), DEAE-덱스트란 중재 형질감염(상기 아우수벨(Ausubel) 등의 문헌) 및 리포솜 중재 형질감염(Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993)을 포함한다. 배양된 포유동물 세포에서의 재조합 폴리펩타이드의 생성은 예를 들어, 레빈슨(Levinson) 등의 미국 특허 제4,713,339호; 하겐(Hagen) 등의 미국 특허 제4,784,950호; 팔미터(Palmiter) 등의 미국 특허 제4,579,821호; 및 린골드(Ringold)의 미국 특허 제4,858,134호에 개시되어 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 예는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(Vero; ATCC CRL 1587), 인간 배아 신장 세포(293-HEK; ATCC CRL 1573), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), 개과 신장 세포(MDCK; ATCC CCL 34), 중국 햄스터 난소 세포(CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44; CHO DXB11(Hyclone(유타주 로간)); 또한 예를 들어 문헌[Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)] 참조), 래트 뇌하수체 세포(GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 래트 간세포암 세포(H-4-II-E; ATCC CRL 1548) SV40 형질전환된 원숭이 신장 세포(COS-1; ATCC CRL 1650) 및 쥣과 배아 세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다. 추가의 적합한 세포주는 당해 분야에 공지되어 있고 공공 보관센터, 예컨대 미국 미생물 보존 기관(American Type Culture Collection: 미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 이용 가능하다. SV-40 또는 거대세포 바이러스로부터의 프로모터와 같은 강한 전사 프로모터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,956,288호를 참조한다. 다른 적합한 프로모터는 메탈로티오네인 유전자로부터의 것(미국 특허 제4,579,821호 및 제4,601,978호) 및 아데노바이러스 주요 후기 프로모터를 포함한다.
외래 DNA가 삽입된 배양된 포유동물 세포를 선택하기 위해 약물 선택이 일반적으로 이용된다. 이러한 세포는 보통 "형질감염체"라 칭한다. 선택적 물질의 존재 하에 배양되고 관심 대상의 유전자를 이의 자손으로 전달할 수 있는 세포는 "안정한 형질감염체"라 칭한다. 예시적인 선택 가능한 마커는 네오마이신 유형 약물, 예컨대 G-418 등의 존재 하에 선택이 수행되는 항생제 네오마이신에 대한 내성을 코딩하는 유전자; 마이코페놀산/잔틴의 존재 하에 숙주 세포 성장을 허용하는 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제에 대한 gpt 유전자; 및 제오신, 블레오마이신, 블라스토시딘 및 하이그로마이신에 대한 내성을 제공하는 마커를 포함한다(예를 들어, 문헌[Gatignol et al., Mol. Gen. Genet. 207:342, 1987; Drocourt et al., Nucl. Acids Res. 18:4009, 1990] 참조). "증폭"이라 불리는 과정인 관심 대상의 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 선택 시스템을 또한 이용할 수 있다. 낮은 수준의 선택적 물질의 존재 하에 형질감염체를 배양하고 이후 도입된 유전자의 높은 수준의 생성물을 제조하는 세포를 선택하는 선택적 물질의 양을 증가시킴으로써 증폭을 수행한다. 예시적인 증폭 가능한 선택 가능한 마커는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 다이하이드로엽산환원효소이다. 다른 약물 내성 유전자(예를 들어, 히그로마이신 내성, 다중 약물 내성, 퓨로마이신, 아세틸트랜스퍼라제)를 또한 사용할 수 있다.
곤충 세포, 식물 세포 및 조류 세포를 포함하는 숙주로서 다른 더 고차의 진핵생물 세포를 또한 사용할 수 있다. 식물 세포에서 유전자를 발현하기 위한 벡터로서의 아그로박테리움 리조젠스(Agrobacterium rhizogenes)의 사용은 문헌[Sinkar et al., J. Biosci . ( Bangalore ) 11:47-58, 1987]에 검토되어 있다. 상기 문헌에서의 곤충 세포의 형질전환 및 외래 폴리펩타이드의 생성은 구아리노(Guarino) 등의, 미국 특허 제5,162,222호 및 WIPO 공보 제WO 94/06463호에 개시되어 있다.
곤충 세포는 아우토그라파 칼리포니카 핵 다면체 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcNPV)로부터 보통 유래하는 재조합 바큘로바이러스로 감염될 수 있다. 문헌[King and Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide (Chapman & Hall, London); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors : A Laboratory Manual (Oxford University Press., New York 1994); 및 Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology (Richardson ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1995)]을 참조한다. 재조합 바큘로바이러스는 또한 문헌[Luckow et al. (J. Virol. 67:4566-4579, 1993)]에 기재된 트랜스포존(transposon) 기반 시스템의 사용을 통해 제조될 수 있다. 운반 벡터를 이용하는 이 시스템은 키트 형태(BAC-TO-BAC 키트; 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재))로 상업적으로 구입 가능하다. 운반 벡터(예를 들어, PFASTBAC1; 라이프 테크놀로지스)는 "바크미드(bacmid)"라 칭하는 큰 플라스미드로서 이. 콜라이에서 유지되는 바큘로바이러스 게놈으로 관심 대상의 단백질을 코딩하는 DNA를 이동시키기 위해 Tn7 트랜스포존을 포함한다. 문헌[Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 -976, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-1556, 1994; 및 Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543-1549, 1995]을 참조한다. 또한, 운반 벡터는 상기 개시된 친화도 태그 또는 폴리펩타이드 연장을 코딩하는 DNA와의 인프레임 융합을 포함할 수 있다. 당해 분야에 공지된 기법을 이용하여, 단백질 코딩 DNA 서열을 포함하는 운반 벡터는 이. 콜라이 숙주 세포로 형질전환되고, 세포는 재조합 바큘로바이러스를 나타내는 간섭된 lacZ 유전자를 포함하는 바크미드에 대해 스크리닝된다. 재조합 바큘로바이러스 게놈을 포함하는 바크미드 DNA를 일반 기법을 이용하여 단리하고, 스포돕테라 프루지페르다 세포, 예컨대 Sf9 세포를 형질감염시키도록 사용한다. 이후, 관심 대상의 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 제조한다. 당해 분야에 통상 이용되는 방법에 의해 재조합 바이러스 스톡을 만든다.
단백질 생성을 위해, 재조합 바이러스는 숙주 세포, 통상적으로 가을 멸강충(fall armyworm), 스포돕테라 프루지페르다(예를 들어, Sf9 또는 Sf21 세포) 또는 트라이코플루시아 니(Trichoplusia ni)(예를 들어, HIGH FIVE 세포; 인비트로젠(미국 캘리포니아주 칼스바드 소재))로부터 유래한 세포주를 감염시키도록 사용된다. 일반적으로 문헌[Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology , Principles & Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 1994)]을 참조한다. 또한 미국 특허 제5,300,435호를 참조한다. 세포를 성장시키고 유지시키기 위해 혈청 비함유 배지를 사용한다. 적합한 배지 제제는 당해 분야에 공지되어 있고, 상업용 제공업자로부터 얻을 수 있다. 재조합 바이러스 스톡이 0.1 내지 10, 더 통상적으로 3 근처의 감염다중도(multiplicity of infection: MOI)로 첨가되는 때에 거의 2-5x105개 세포의 접종 밀도로부터 1-2x106개 세포의 밀도로 세포를 성장시킨다. 이용된 절차는 일반적으로 구입 가능한 실험실 매뉴얼(예를 들어, 상기 킹 및 포세(King and Possee)의 문헌; 상기 오레일리(O'Reilly) 등의 문헌; 상기 리차드슨(Richardson)의 문헌 참조)에 기재되어 있다.
효모 세포를 포함하는 진균 세포를 본 발명 내에 또한 사용할 수 있다. 이와 관련하여 특히 관심 대상의 효모 종은 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica)를 포함한다. 에스. 세레비시아에 세포를 외인성 DNA로 형질전환하고 이로부터 재조합 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 예를 들어 가와사키(Kawasaki)의 미국 특허 제4,599,311호; 가와사키 등의 미국 특허 제4,931,373호; 브레이커(Brake)의 미국 특허 제4,870,008호; 웰치 등의 미국 특허 제5,037,743호; 및 머레이(Murray) 등의 미국 특허 제4,845,075호에 개시되어 있다. 선택 가능한 마커, 보통 약물 내성 또는 특정한 영양소(예를 들어, 류신)의 부재 하에 성장하는 능력에 의해 결정된 표현형에 의해 형질전환된 세포를 선택한다. 사카로마이세스 세레비시아에에서 사용하기 위한 예시적인 벡터 시스템은 가와사키 등(미국 특허 제4,931,373호)에 의해 개시된 POT1 벡터 시스템이고, 이는 형질전환된 세포가 글루코스 포함 배지에서의 성장에 의해 선택되게 한다. 효모에서 사용하기에 적합한 프로모터 및 종결자는 당분해 효소 유전자(예를 들어, 가와사키의 미국 특허 제4,599,311호; 킹스만(Kingsman) 등의 미국 특허 제4,615,974호; 및 비터(Bitter)의 미국 특허 제4,977,092호 참조) 및 알코올 탈수소효소 유전자로부터 유래한 것이다. 또한 미국 특허 제4,990,446호; 제5,063,154호; 제5,139,936호; 및 제4,661,454호를 참조한다. 한세눌라 폴리모르파(Hansenula Polymorpha), 치조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카, 피치아 구일레르몬디(Pichia guillermondii) 및 칸디다 말토사(Candida maltosa)를 포함하는 다른 효모에 대한 형질전환 시스템은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986]; 크레그(Cregg)의 미국 특허 제4,882,279호; 및 문헌[Raymond et al., Yeast 14:11-23, 1998]을 참조한다. 맥나이트(McKnight) 등의 미국 특허 제4,935,349호의 방법에 따라 아스퍼질루스 세포를 사용할 수 있다. 아크레모니움 크리조게눔(Acremonium chrysogenum)을 형질전환하는 방법은 수미노(Sumino) 등의 미국 특허 제5,162,228호에 개시되어 있다. 뉴로스포라(Neurospora)를 형질전환하는 방법은 람보위치(Lambowitz)의 미국 특허 제4,486,533호에 개시되어 있다. 피치아 메타놀리카에서의 재조합 단백질의 생성은 미국 특허 제5,716,808호; 제5,736,383호; 제5,854,039호; 및 제5,888,768호에 개시되어 있다.
박테리아 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스(Bacillus) 및 다른 속의 균주를 포함하는 원핵생물 숙주 세포는 또한 본 발명 내에 유용한 숙주 세포이다. 이 숙주를 형질전환하고 이 내에 클로닝된 외래 DNA 서열을 발현하는 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 상기 샘브룩 및 러셀(Sambrook and Russell)의 문헌 참조). 박테리아, 예컨대 이. 콜라이에서 재조합 단백질을 발현할 때, 단백질은 통상적으로 불용성 과립으로서 세포질에 보유되거나 박테리아 분비 서열에 의해 주변세포질 공간으로 지향될 수 있다. 전자의 경우에, 세포를 용해시키고 과립을 회수하고 예를 들어 구아니딘 아이소티오사이아네이트 또는 유레아를 사용하여 변성시킨다. 이후, 변성된 단백질을 재폴딩하고, 변성제를 희석함으로써, 예컨대 유레아의 용액 및 환원된 및 산화된 글루타티온의 조합에 대한 투석, 이어서 완충 식염수 용액에 대한 투석에 의해 이합체화할 수 있다. 대안에서, 단백질을 가용성 형태의 세포질로부터 회수하고 변성제의 사용 없이 단리할 수 있다. 단백질은 예를 들어 인산염 완충 식염수 중의 수성 추출물로서 세포로부터 회수된다. 관심 대상의 단백질을 포획하기 위해, 추출물을 크로마토그래피 배지, 예컨대 부동화 항체 또는 헤파린-세파로스 칼럼에 직접 적용한다. (예를 들어, 음파처리 또는 삼투 쇼크에 의해) 세포를 파괴하여 주변세포질 공간의 내용물을 방출하고 단백질을 회수하여, 변성 및 재폴딩에 대한 필요성을 제거함으로써 가용성 및 기능성 형태로 분비된 단백질을 주변세포질 공간으로부터 회수할 수 있다. 공지된 방법에 따라 박테리아 숙주 세포에서 단쇄 항체를 포함하는 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988; 및 Pantoliano et al., Biochem. 30:10117-10125, 1991]을 참조한다.
종래의 절차에 따라 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 영양소 및 다른 성분을 포함하는 배양 배지 중에 형질전환된 또는 형질감염된 숙주 세포를 배양한다. 제한 배지 및 복합 배지를 포함하는 다양한 적합한 배지가 당해 분야에 공지되어 있고, 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함한다. 배지는 필요한 바대로 성장 인자 또는 혈청으로서 이러한 성분을 또한 포함할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로 예를 들어 발현 벡터 상에 보유되거나 숙주 세포로 동시 형질감염된 선택 가능한 마커에 의해 보충되는 필수 영양소 결핍 또는 약물 선택에 의해 외인성으로 첨가된 DNA를 포함하는 세포에 대해 선택된다.
종래의 단백질 정제 방법, 통상적으로 크로마토그래피 기법의 조합에 의해 CD3 결합 단백질을 정제할 수 있다. 일반적으로 문헌[Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988); Scopes, Protein Purification : Principles and Practice (Springer-Verlag, New York 1994)]을 참조한다. 부동화 단백질 A 또는 단백질 G 상에 친화도 크로마토그래피에 의해 면역글로불린 Fc 구역을 포함하는 단백질을 정제할 수 있다. 추가의 정제 단계, 예컨대 겔 여과를 이용하여 원하는 수준의 순도를 얻거나 탈염, 완충제 교환 등을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 CD3 결합 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 단일특이적 CD3 결합 폴리펩타이드를 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염을 앓고 있는 환자에게 투여한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 발명의 단일특이적 CD3 결합 폴리펩타이드를 장기 이식을 막 받으려는 대상체에게 투여한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 종양 항원, 예컨대 암의 과발현을 특징으로 하는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 종양 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 치료학적 유효량의 CD3 결합 단백질을 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 양태에서, CD3 결합 단백질은 대상체에서 종양 항원 발현 세포에 대해 재지향된 T-세포 세포독성(RTCC)을 유도한다.
상기 방법의 특정한 변형에서, 장애는 암이다. 다른 변형에서, 장애는 자가면역 질환이다. 본 발명은 또한 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 조성물 또는 CD3 결합 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 자가면역 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 치료 방법의 각각의 양태에서, 치료가 추구되는 질환 또는 장애의 관리와 관련된 종래의 방법론과 일치하는 방식으로 CD3 결합 단백질을 전달한다. 본 명세서의 개시내용에 따라, 유효량의 CD3 결합 단백질을 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하기에 충분한 조건 하에 및 시간 동안 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여한다.
투여를 위해, CD3 결합 단백질을 약제학적 조성물로서 제제화한다. CD3 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라 제제화할 수 있고, 이에 의해 치료학적 분자는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합물로 합해진다. 조성물은 이의 투여가 수혜 환자에 의해 관용될 수 있는 경우 "약제학적으로 허용되는 담체"라 칭해진다. 무균 인산염 완충 식염수는 약제학적으로 허용되는 담체의 일례이다. 다른 적합한 담체는 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 19th ed. 1995)] 참조) 제제는 바이러스 표면 상의 단백질 손실 등을 방지하기 위해 하나 이상의 부형제, 보존제, 가용화제, 완충제, 알부민을 추가로 포함할 수 있다.
CD3 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여한다. 본 발명의 방법에 따라, CD3 결합 단백질을 예를 들어 근육내, 피하, 정맥내, 심방내, 관절내, 비경구, 비강내, 폐내, 경피성, 흉막내, 척추강내 및 경구 투여 경로를 포함하는 다양한 투여 방식에 의해 대상체에게 투여할 수 있다. 예방 및 치료 목적을 위해, 예를 들어, 단일 볼루스 전달로, 연장된 시간 기간에 걸쳐 연속 전달(예를 들어, 연속 경피 전달)을 통해 또는 반복 투여 프로토콜로(예를 들어, 시간별, 일별 또는 주별 기준으로) 대상체에게 투여할 수 있다.
분자 또는 조성물의 "치료학적 유효량(또는 유효 용량)" 또는 "유효량(또는 유효 용량)"은 통계학적으로 유의적인 질환 진행 감소 또는 통계학적으로 유의적인 장기 기능 개선과 같은 장애의 하나 이상의 증상의 경감에서 통계학적으로 유의적인 효과를 생성하는 양이다. 치료하고자 하는 병증의 성질 및 중증도, 환자 속성 등을 고려하여 허용 기준에 따라 임상의가 정확한 용량을 결정한다. 용량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 병용을 언급할 때, 치료학적 유효 용량은 순차적으로 또는 동시에(예를 들어, 동일한 제제에서 또는 별개의 제제에서 동시적으로) 투여되든지, 치료학적 효과를 발생시키는 활성 성분의 조합 양을 의미한다.
이 문맥에 있어서 유효 용량의 결정은 통상적으로 동물 모델 연구, 이어서 인간 임상 실험에 기초하고, 모델 대상체에서 대상체 장애의 발생 또는 중증도를 유의적으로 감소시키는 유효 용량 및 투여 프로토콜을 투여함으로써 지도된다. 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 자리, 환자의 생리학적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지의 여부, 투여되는 다른 약제, 치료가 예방적 또는 치료학적인지의 여부, 및 조성물 그 자체의 비활성(specific activity) 및 개인에서 원하는 반응을 발생시키는 이의 능력을 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 변한다. 일반적으로, 환자는 인간이지만, 몇몇 질환에서, 환자는 비인간 포유동물일 수 있다. 통상적으로, 예를 들어 안정성 및 효율을 최적화하기 위해 최적 치료학적 반응을 제공하도록 용량 섭생을 조정한다.
실시예
실시예 1: 이론상 pI 가 감소한 항- CD3 SMIP 분자의 설계 및 작제
L1, L2, H1, H2 및 H3(도 3 및 도 4 참조)은 결합 및 활성을 위해 이전에 작제되고 분석된 인간화 크리스-7의 중쇄 및 경쇄이다. SMIP DRA209(서열 번호 3 및 4; IgG4 AA ADCC-CDC 눌 Fc) 및 SMIP DRA161(IgG4 AA N297A Fc)을 만들기 위해 H3L1을 사용하였다. 이 작제물이 선행 기술에서의 OKT3 및 다른 항-CD3 치료제에 비해 개선된 특징을 나타내지만, 작제물은 다른 SMIP 분자와 비교하여 CHO 세포(도 2a 및 도 2b 참조)에서 발현될 때 유의적으로 더 짧은 반감기, 더 높은 이론상 pI(도 1 참조) 및 결합 도메인 또는 프리힌지 구역에서의 "클리핑"을 나타낸다.
결합 도메인 및/또는 프리힌지 구역의 pI를 감소시키도록 항-CD3 pI 변이체를 설계하였다. 항-CD3 pI 변이체를 만들기 위해, 새로운 중쇄 및 경쇄(L3, L4, H4, H5 및 H6)를 순서화하고 블루 헤론(Blue Heron)에 의해 합성하였다. 표 3 및 도 3 및 도 4를 참조한다.
Figure pct00011
H4는 H3과 비교하여 2점 돌연변이를 갖는다. 하나의 돌연변이는 양전하 잔기(Q로 K를)를 대체하고, 다른 돌연변이는 음전하(E로 Q를)를 도입한다. (양전하를 제거하거나 음전하를 도입함으로써) 단백질의 pI를 감소시키도록 전하 둘 다를 설계하였다. 돌연변이를 친화도의 손실을 피하도록 프레임워크 서열에서 수행하고, 도입된 새로운 잔기는 면역원성의 위험을 피하기 위해 이 위치에서 생식선 서열에 존재하는 것으로 검증되었다. 이미 인간화된 결합 도메인의 pI를 감소시키기 위한 가이드로서 생식선 서열을 사용하여, 생식선 서열에서 우세한 아미노산을 부가하도록 아미노산 치환을 만들 수 있다. 이 아미노산은 생식선 서열에서 동일한 위치에서 또는 근접한 위치에서 존재할 수 있다. 도 5를 참조한다.
DRA209 및 DRA161과 비교하여 더 낮은 pI를 생성하는 방식으로 (DRA209 및 DRA161과 비교하여) 중쇄 서열을 "재인간화"함으로써 H5를 설계하였다. IGHV1-3*01 중쇄 생식선 서열의 VH1 프레임워크와 비교하여 중쇄를 설계함으로써 이를 수행하였다.
DRA209 및 DRA161와 비교하여 더 낮은 pI를 생성하는 방식으로 (DRA209 및 DRA161과 비교하여) 중쇄 서열을 "재인간화"함으로써 H6을 설계하였다. 즉, H6을 설계하기 위해 사용되는 시작 서열은 이미 인간화된 서열이기보다는 생식선 서열이다. 구체적으로, IGHV3-21*01 중쇄 서열의 VH3 프레임워크를 사용하여 중쇄를 설계함으로써 이를 수행하였다.
L3은 L1과 비교하여 6점 돌연변이를 갖고, RW를 LL(LL이 LW보다 생식선 서열에서 더 흔하므로 LL을 사용함)에 대해 돌연변이(즉, 양전하 잔기, R 내지 L을 대체)하고, J 카파(Jk) 구역의 일부(LQIT; 서열 번호 252)를 Jk4 서열(VEIK; 서열 번호 253)로 대체하였다. Jk4는 크리스-7 H_CDR3 서열에 기초하여 더 우수한 일치 Jk 구역이다. 도 6을 참조한다. 다시, 프레임워크 구역에서 돌연변이만을 수행하고, 도입된 새로운 잔기는 면역원성의 위험을 피하기 위해 생식선 서열에서의 이 위치에서 존재하는 것으로 검증되었다.
DRA209 및 DRA161과 비교하여 더 낮은 pI를 생성하는 방식으로 (DRA209 및 DRA161과 비교하여) 중쇄 서열을 "재인간화"함으로써 H4를 설계하였다. 가이드로서 IGKV3-11*01 경쇄 서열의 Vk3의 프레임워크를 사용하여 L4를 재인간화하였다.
모든 새로운 경쇄 및 중쇄는 이론상 계산에 기초하여 더 낮은 pI를 갖는 것으로 예상된다. 서열을 함께 준비(서열이 부착됨)하도록 돕기 위해 벡터 NTI(인비트로젠)를 사용하였다. NCBI 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)로부터 생식선 서열을 얻었다.
그외 DRA209 및 DRA161과 동일한 SMIP 분자의 프리힌지 구역에서 치환된 아미노산을 포함하는 변이체를 작제하였다. 프리힌지 구역은, 예를 들어 제한 자리를 코딩 뉴클레오타이드 서열로 부가하여 생길 수 있는, 결합 도메인을 힌지 구역에 연결하는, 짧은 아미노산 서열이다.
제조된 하나의 변이체는 PCR 돌연변이유발에 의해 SSS를 갖는 DRA209의 프리힌지 구역에서 RRT 서열을 대체하는 것을 수반하였다. 2개의 양으로 하전된 잔기(아르기닌)를 제거하기 위해 이를 의도적으로 수행하였다. 본 발명자들은 이 변화가 단백질의 pI 감소로 번역된다는 것을 실험적으로 나타낸다. 이 작제물은 여전히 H3L1 조합을 갖고 DRA219의 새로운 명칭을 부여하였다. 양으로 하전된 잔기(2개의 아르기닌)를 제거하는 것과 별도로, 이 SSS 돌연변이는 또한 더 새로운 pI 변이체 작제물의 용이한 어셈블리를 허용하는 XhoI 제한 자리를 도입한다.
DRA209로서 동일한 Fc 꼬리를 사용하여, 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 SMIP 작제물을 작제하기 위해 H 및 L의 하기 조합을 이용하였다: a) H4L1(IgG4 AA ADCC-CDC 눌 FC를 가짐; 본 명세서에서 DRA222라고도 칭함; 서열 번호 7 및 8), b) H4L3(IgG4 AA ADCC-CDC 눌 Fc를 가짐; 본 명세서에서 DRA221라고도 칭함; 서열 번호 9 및 10), c) H3L3(IgG4 AA ADCC-CDC 눌 Fc를 가짐; 본 명세서에서 DRA223라고도 칭함; 서열 번호 11 및 12), d) H5L4(IgG4 AA ADCC-CDC 눌 Fc를 가짐; 본 명세서에서 DRA224라고도 칭함; 서열 번호 13 및 14) 및 e) H6L4(IgG4 AA ADCC-CDC 눌 Fc를 가짐; 본 명세서에서 DRA225라고도 칭함; 서열 번호 15 및 16). 도 7a 및 도 7b를 참조한다.
모든 이 작제물을 HEK 세포로 형질감염시켜 실험실내 결합 연구를 위한 단백질을 생성하였다. 명확한 발현을 갖지 않는 DRA225 작제물을 제외하고 모든 작제물은 원하는 단백질을 발현하였다. 모든 다른 작제물은 (ⅰ) 다양한 정도로 CD3에 결합하고(약간의 최고의 결합을 갖는 DRA222) 및 (ⅱ) 모 분자, DRA209보다 더 낮은 pI를 갖는 것으로 발견되었다. 측정된 pI가 표 4에서 확인된다.
Figure pct00012
DRA219, DRA221, DRA222, DRA223 및 DRA224는 모두 인간 혼합된 림프구 반응(mixed lymphocyte reaction: MLR; 데이터 비도시)을 억제하고, 억제의 양은 CD3에 결합하는 이의 측정된 능력과 상관된다.
DRA219(H3L1 IgG4 AA ADCC-CDC 눌 FC; 서열 번호 5 및 6) 및 DRA222(서열 번호 7 및 8) 둘 다는 CD3에 대한 결합을 보유하고, 더 낮은 측정된 pI를 갖고, 상이한 Fc 꼬리(IgG4 AA N297A)를 코딩하는 pEE12.4 벡터로 추가로 클로닝되어 각각 2개의 추가의 작제물 - DRA233(H3L1; 서열 번호 17 및 18) 및 DRA234(H4L1; 서열 번호 19 및 20)을 생성하였다. 더욱이, DRA219 및 DRA222를 CHO에서 발현을 위해 pEE12.4 벡터로 클로닝하고 각각 DRA228 및 DRA229라 칭했다. 실질적으로 DRA219는 DRA228에 동등하고, DRA222는 DRA229에 동등하다. 이후, 모든 작제물(DRA228, DRA229, DRA233 및 DRA234)을 CHO 세포로 형질감염시켜 결합 연구, 단백질 규명 및 PK 연구를 위한 단백질을 생성하였다. 도 8을 참조한다.
AKTA 정제기 HPLC 시스템을 사용하여 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 세포 상청액으로부터 단백질을 정제하였다. 예비 충전된 POROS A 칼럼(라이프 테크놀로지스)을 실험실내 제조를 위해 사용하고, 예비 충전된 MabSuRe 단백질 A 칼럼(지이 헬스케어(GE Healthcare))을 생체내 재료를 위해 사용하였다. 샘플을 PBS의 존재 하에 장입하고 시트르산염 완충제로 용리하였다. 용리제를 트리스(TRIS) 완충제로 중화시켰다.
모세관 등전 집중법을 베크만(Beckman) PA 800 기기에서 수행하고 정제된 단백질의 등전점(pI)을 결정하기 위해 사용하였다. 표준 베크만 cIEF 프로토콜에 따라 분석을 수행하였다. 파말라이트(Pharmalyte) 3-10 양성전해질(지이 헬스케어), 캐소드 및 애노드 안정화제 및 합성 펩타이드 pI 마커(베크만)이 보충된 cIEF 겔(베크만) 중의 3M 유레아의 용액 중에 샘플을 제조하였다. 샘플을 천연 모세관(베크만)에 도입하고, 이후 양극액 용액 중에 모세관 입구를 침지하고, 음극액 용액 중에 출구를 침지하고 15분 동안 모세관에 걸쳐 25kV 전기 전위를 인가함으로써 집중시켰다. 집중 후, 280㎚에서의 흡광도를 측정하는 고정된 파장 검출기에 걸쳐 모든 분리된 성분을 통과시키는 화학 수단에 의해 샘플을 부동화하였다. 합성 펩타이드 pI 마커에 대한 결과로 구성된 표준 곡선으로부터 모든 샘플에 대해 등전점(pI)을 계산하였다. 도 9-11을 참조한다. 작제물은 하기 측정된 pI를 갖는다: DRA228 = 8.4; DRA229 = 7.5; DRA233 = 8.6; DRA234 = 8.0인 반면, DRA161 = 9.2 및 DRA209 = 8.8. 따라서, 발현된 모든 pI 변이체는 이의 각각의 모 작제물, DRA161 또는 DRA209보다 낮은 pI를 가졌다.
실시예 2: 항- CD3 SMIP 분자는 T-세포에 결합한다
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 표준 밀도 구배 원심분리를 이용하여 새로운 전혈로부터 단리하고 0.2% BSA로 PBS 중에 3회 세척하였다. 세포를 200,000개의 PBMC/웰로 96웰 플레이트 U 바닥 플레이트 중에 평판 배양하고 30분 동안 얼음에서 도 12에 도시된 바와 같은 nM 농도에서 50㎕의 항체로 표지화하였다. 플레이트를 3회 세척하고 항-CD5-APC와 함께 F(ab')2 염소 항-hu IgG Fc-PE의 최적 농도를 포함하는 50㎕의 항체 칵테일과 30분 동안 표지화하였다. 플레이트를 3회 세척하고 4℃에서 밤새 PBS 중의 120㎕의 1% 파라폼알데하이드 중에 고정하였다. 모든 항체 항온처리 및 세척을 얼음에서 차가운 PBS, 0.2% BSA, 2nM EDTA로 수행하였다. BD LSRII 분석기를 사용하여 샘플을 유세포 분석기에 의해 분석하였다. 각각의 웰에 60마이크로리터를 수집하였다. T-세포(FCS 대 SSC, CD5+ 세포)에 그래프팅함으로써 플루조(Flowjo) 소프트웨어를 사용하여 수집된 샘플을 수집하였다. PE 채널 상의 평균 형광 강도(MFI)가 그래프에 도시되어 있다. DRA227 SMlP를 오직 대조군으로서 사용하고, CD3 또는 T-세포 결합 도메인을 포함하지 않고, pI를 감소시키도록 변형되지 않았다. 도 12를 참조한다. CD3 및 DRA228 및 DRA229에 결합한 모든 시험된 pI 변이체는 이의 모 작제물과 매우 유사한 결합 활성을 보유하였다.
실시예 3: PI 가 감소한 항- CD3 SMIP 분자는 CHO 세포에서 더 잘 발현된다
크기 배제 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제된 단백질의 고분자량 응집물 함량을 평가하였다. HPLC 시스템은 4개 펌프(quaternary pump), 용매 탈기기, DAD 및 온도 제어 오토샘플러가 구비된 애질런트(Agilent) 1200 시리즈이다. 크로마토그래피 분리를 위해 pH 7.2에서의 200mM 인산칼슘 및 250mM 염화칼슘의 실행 완충제 중에 평형화된 토소(Tosoh) TSKgel G3000SWxI 칼럼을 사용하였다. 용매 유속은 1㎖/분이고, 샘플 주입 질량은 50㎍이다. 280㎚의 파장에서 애질런트 DAD 검출기로 칼럼 유출물을 모니터링하였다.
SDS - PAGE: 변성 황산 도데실 나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 정제된 단백질의 통합성을 평가하였다. 샘플을 노벡스(Novex) 샘플 완충제(인비트로젠)로 준비하고, 85℃에서 3분 동안 가열하여 4-20% 노벡스 트리스-글라이신 겔(인비트로젠)로 장입 전에 완전 변성을 보장하였다. 가열 단계 전에 노벡스 환원 물질을 첨가하여 샘플을 임의로 환원시켰다. 단백질을 부동화하고 트리스-글라이신 완충제(인비트로젠, 10X 스톡으로부터)가 충전된 전기영동 챔버 중에 110분 동안 겔에 걸쳐 125V를 인가함으로써 분리시켰다. 심플리블루 세이프 스테인(SimplyBlue Safe Stain)(인비트로젠)으로 염색함으로써 단백질 밴드를 가시화하였다. 도 13 내지 도 14를 참조한다. 시험된 pI 변이체는 이의 모 분자, DRA161과 비교하여 클리핑 감소를 나타냈다.
CE - SDS: SDS에서의 모세관 전기영동을 베크만 PA 800 기기에서 수행하고, 정제된 단백질의 저분자량 클립 함량을 정량화하도록 사용하였다. 샘플을 50% SDS 샘플 완충제(베크만) 중에 1mg/㎖ 농도로 제조하고, 85℃에서 3분 동안 가열하여 분석 전에 완전 변성을 보장한다. 샘플을 SDS 겔 완충제(베크만)로 충전된 베어-융합(bare-fused) 실리카 모세관으로 동전기적으로 주입(20초 동안 10kV)하고 30분 동안 모세관(역극성)에 걸쳐 15kV의 전압을 인가함으로써 분리시켰다. 검출기 윈도우에서 220㎚ 및 280㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 도 15-16를 참조한다. 이는 예를 들어 때때로 본 명세서에서 "클리핑"이라 불리는 더 낮은 명확한 단백질분해로 인해 pI 변이체의 단백질의 품질이 모 분자보다 우수하다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 항- CD3 SMIP pI 변이체 분자는 반감기 증가를 나타낸다
암컷 BALB/c 마우스에 0시에 200㎍의 DRA234 또는 DRA233을 포함하는 200㎕의 PBS를 정맥내로(IV) 주사하였다. 각 시점에 그룹마다 3마리의 마우스에 주사하였다. 마취된 마우스를 주사 후 표시된 시점에서 심장 천자를 통해 방혈하고, 혈청을 하기 기재된 바대로 수집하였다. 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)을 이용하여 DRA234 및 DRA233의 혈청 농도를 결정하였다. 윈논린(상표명) 프로페셔널 소프트웨어(v5.3)를 이용하고 IV 볼루스 투여 및 희박한 샘플링을 위한 예비 컴파일링된 모델 201을 적용하여 비구획 분석에 각각의 단백질에 대한 약동학적 성향 매개변수를 예측하였다.
0시간에, 마우스에 200㎍(약 10㎎/㎏)의 DRA233 또는 DRA234를 포함하는 200㎕의 PBS를 IV 주사하였다. 각 시점에 그룹마다 3마리의 마우스에 주사하였다. 마취된 마우스를 심장 천자를 통해 방혈하고, 혈청을 주사 후 t = 15분 및 2시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 168시간, 336시간 및 504시간에 수집하였다. 특이적 샌드위치 ELISA를 이용하여 각각의 단백질에 대한 혈청 농도를 결정하였다. 결과는 시간에 따른 평균 혈청 농도(㎍/㎖ 단위)±SD로서 표시된다. 데이터가 선형(A) 및 로그(B) 포맷으로 도시되어 있다. 도 17을 참조한다.
항약물 항체(ADA)를 포획하기 위해 플레이트에 코팅된 DRA161(DRA233 및 DRA234의 원래 형태) 및 결합 ADA를 검출하기 위해 항-마우스 IgG(H&L) HRP로, 샌드위치 ELISA를 이용하여 ADA를 검출하였다. 과산화효소 기질을 사용하여 결합 복합체를 측정하고, 형광 플레이트 판독기에서 결과를 판독하였다. 결과는 혈청 희석에 대한 평균 형광 단위(FU)로 표시된다. ADA의 수준은 DRA233에 대해 504시간에 명확히 보이고, 가능한 낮은 수준이 336시간에 시작하지만; 임의의 DRA234 샘플 중에 ADA인 것으로 나타나지 않는다(데이터 비도시).
504시간으로부터의 데이터에서 및 이것 없이 모든 DRA233 PK 시점에서 시간에 따른 평균 혈청 농도 프로필을 작도하였다. DRA234에 대한 시간에 따른 혈청 농도 프로필이 도 18c에서 확인된다. 결과는 관찰된 데이터 세트로 표시되고, 예측된 값을 윈논린(상표명) 소프트웨어에 의해 계산하였다. Rsq 값 및 Rsq 조정 값은 말단 제거 단계 동안, HL_람다 z의 예측에 이용된 시점을 조정하기 전에 및 조정한 후 적합도 통계(goodness of fit statistics)이다. DRA233에 대한 근사치 반감기는 항약물 항체의 검출 가능한 수준 없이 유일한 시점을 이용하여 95시간이고 DRA234에 대해 84시간이었다. 도 18을 참조한다.
표 포맷으로 윈논린 프로그램으로부터의 PK 예측치: 균일한 질량의 IV 볼루스 투여에 대해 희박한 샘플링 및 예비 컴파일링된 모델 201을 사용하여 비구획 분석을 적용하여, 윈논린(상표명) 프로페셔널(v5.3) 소프트웨어를 사용하여 약동학적 분석을 수행하였다. 0시간에서 마지막 측정 가능한 농도(Tlast)까지의 혈청 농도 하 면적-시간 곡선(AUC)은 선형/로그 보간 계산 방법으로 선형 사다리꼴을 이용하여 예측되었다. 하기 약동학적 성향 매개변수가 예측되었다: 최대 관찰된 혈청 농도(Cmax), 마지막 측정 가능한 농도에서의 농도(Clast), 최대 관찰된 혈청 농도에 도달하는 시간(Tmax), 겉보기 말단 제거 반감기(HL 람다 z), 마지막 측정 가능한 농도에 대한 투약 시간으로부터의 AUC(AUCall), 무한으로 외삽된 시간에 의한 투약으로부터의 AUG(AUCINF_obs), 혈청 청소(CI_obs), 말단 단계에 기초한 분포의 용적(Vz_obs) 및 평균 체류 시간(MRT). 도 19 및 도 20을 참조한다. 이 실시예는 시험된 pI 변이체가 모 분자, DA161과 비교하여 마우스에서 더 긴 생체내 혈청 반감기 및 더 느린 청소를 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 이중특이적 동종이합체 분자 - 항- CD3 및 항- PSMA
표준 기법을 이용하여 이중특이적 CD3 및 PSMA 결합 동종이합체를 작제하였다. 이 작제물, TSC249, TSC250, TSC251, TSC252, TSC295, TSC296, TSC301 및 TSC302는 표 5에 기재되어 있다. N 말단 scFv 결합 도메인의 삽입을 제한 효소 HindIII 및 XhoI 또는 AgeI 및 XhoI로 모 주형 및 scFv 삽입체의 분해를 통해 수행하고, 원하는 단편을 확인하고 아가로스 겔 정제 및 결찰에 의해 단리하였다. C 말단 scFv 결합 도메인의 삽입을 제한 효소 EcoRI 및 NotI로 모 주형 및 scFv 삽입체의 분해를 통해 수행하고, 원하는 단편을 확인하고 아가로스 겔 정제 및 결찰에 의해 단리하였다.
Figure pct00013
실시예 6: 이중특이적 동종이합체 분자 - 항- CD3 및 항- RON
표준 기법을 이용하여 CD3 및 RON 결합 동종이합체 둘 다를 갖는 이중특이적 분자를 작제하였다. 이 작제물, TSC275, TSC277, TSC278 및 TSC279는 표 6에 기재되어 있다. TSC275는, RON 결합 도메인의 일부인, 각각 서열 번호 187 및 188인 hu4C04의 VL 및 VH 사슬을 포함한다. TSC277, TSC278 및 TSC279은 표 6에 표시된 돌연변이/치환을 제외하고 TSC275와 동일하다.
Figure pct00014
실시예 7: 이중특이적 동종이합체 분자 - 항- CD3 및 항- CD19
표준 기법을 이용하여 CD3 및 CD19 결합 동종이합체 둘 다를 갖는 이중특이적 분자를 작제하였고, 예를 들어, PCT 공보 제WO2007/146968호를 참조한다. 이 작제물, TSC233, TSC234, TSC235, TSC240, TSC241 및 TSC242는 표 7에 기재되어 있다. TSC233은, CD19 결합 도메인의 일부인, HD37의 VL(서열 번호 196의 1-111번 아미노산) 및 VH(서열 번호 196의 128-251번 아미노산) 사슬을 포함한다.
Figure pct00015
실시예 8: 이중특이적 이종이합체 분자 - 항- CD3 및 항- CD19
표 8에 표시된 바대로 아미노산 서열을 코딩하는 핵산의 동시 형질감염을 수행함으로써 PCT 공보 제WO2011/090762호에 기재된 것과 유사하게 CD19 결합 도메인 및 CD3 결합 도메인을 포함하는 상이한 이종이합체 이중특이적 분자를 작제하였다. 2개의 상이한 폴리펩타이드 사슬(1개의 폴리펩타이드 사슬은 면역글로불린 CH1 이종이합체화 도메인을 포함하고, 다른 폴리펩타이드 사슬은 면역글로불린 CL 이종이합체화 도메인을 포함함)을 동시 발현시킴으로써 이종이합체를 만들었다.
Figure pct00016
TSC049는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: HD37(항-CD19) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 CM. TSC096은 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: HD37(항-CD19) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 Cκ(YAE). TSC125는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: 크리스7(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 CH1. TSC218은 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: DRA221(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 CH1. TSC219는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: DRA222(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 CM. TSC220은 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: DRA224(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 CM. TSC221은 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: DRA221(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 Cκ(YAE). TSC222는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: DRA222(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 Cκ(YAE). TSC223은 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: DRA224(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgGI CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 Cκ(YAE).
실시예 9: 이중특이적 이종이합체 분자 - 항- CD3 및 항- PSMA
표 9에 표시된 바대로 아미노산 서열을 코딩하는 핵산의 동시 형질감염을 수행함으로써 PCT 공보 제WO2011/090782호에 기재된 것과 유사하게 PSMA 결합 도메인 및 CD3 결합 도메인을 포함하는 상이한 이종이합체 이중특이적 분자를 작제하였다. 2개의 상이한 폴리펩타이드 사슬(1개의 폴리펩타이드 사슬은 면역글로불린 CH1 이종이합체화 도메인을 포함하고, 다른 폴리펩타이드 사슬은 면역글로불린 CL 이종이합체화 도메인을 포함함)을 동시 발현시킴으로써 이종이합체를 만들었다. 몇몇 PSMA 결합 도메인은 PCT 공보 제WO2011/090761호에 기재되어 있다.
Figure pct00017
"인간화 107-1A4 VL-VH#2 scFv" 및 "인간화 107-1A4 VL-VH#1 scFv"는 항-인간-PSMA 107-1A4 단클론성 항체에 기초한 인간화 scFv이고, 또한 PCT 공보 제WO2011/090761호에 기재되어 있다. "인간화 107-1A4 VL-VH#2 scFv" 및 "인간화 107-1A4 VL-VH#1 scFv"는 각각 서열 번호 216의 및 226의 1-243번 아미노산에 상응한다.
TSC192는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: 인간화 107-1A4(항-PSMA) VL-VH#2 scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 Cκ(YAE). TSC195는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: 인간화 107-1A4(항-PSMA) VL-VH#2 scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 CH1. TSC193은 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: 인간화 107-1A4(항-PSMA) VL-VH#1 scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 Cκ(YAE).
TSC219는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: DRA222(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 CH1. TSC222는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: DRA222(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3 및 인간 Cκ(YAE). TSC254는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: 인간화 107-1A4(항-PSMA) VL-VH#1 scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3, 링커 및 인간 CH1. TSC258은 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 하기를 포함한다: DRA222(항-CD3) scFv, 인간 IgG1 SCC-P 힌지, 인간 IgG1 CH2, 인간 IgG1 CH3, 링커 및 인간 Cκ(YAE).
실시예 10: CD19 를 표적화하는 폴리펩타이드 이종이합체 및 동종이합체에 의한 표적-의존적 T-세포 증식
표적-의존적 T-세포 활성화 및 증식을 유도하는 데 있어서의 상이한 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체 분자의 유효성을 비교하기 위해, 공통 항-CD19 결합 도메인(HD37) 및 3개의 상이한 항-CD3 결합 도메인(TSC129a의 경우 크리스7, TSC233의 경우 DRA221로부터의 scFv 결합 도메인(서열 번호 10의 1-244번 아미노산), TSC234의 경우 DRA222로부터의 scFv 결합 도메인(서열 번호 8의 1-244번 아미노산))을 갖는 3개의 상이한 동종이합체 이중특이적 분자(TSC129a, TSC233 및 TSC234(각각 서열 번호 245, 196 및 198))를 비교하였다. 추가로, 3개의 상이한 항-CD3 결합 도메인(TSC127의 경우 크리스7, TSC227의 경우 DRA221로부터의 scFv 결합 도메인(서열 번호 10의 1-244번 아미노산) 및 TSC228의 경우 DRA222로부터의 scFv 결합 도메인(서열 번호 8의 1-244번 아미노산))을 갖는 3개의 상이한 이종이합체 이중특이적 분자(TSC127, TSC227, TSC228)를 또한 비교하였다.
다우디 버킷(Daudi Burkitt) 림프종 세포(CD19+)를 ATCC(미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 얻고 제공된 프로토콜에 따라 배양하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 혈액으로부터 표준 피콜 구배를 이용하여 단리하였다. 단리된 세포를 식염수 완충제 중에 세척하였다. 제조업자의 프로토콜을 이용하여 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)(독일 베르기슈 글라트바흐)으로부터의 팬(Pan) T-세포 분리 키트 II를 사용하여 이 PBMC로부터 T-세포를 추가로 단리하였다.
단리된 T-세포 집단을 카복시플루오레세인 다이아세테이트 숙신이미딜 에스터(CFSE)로 표지화함으로써 증식을 평가하였다. CFSE 표지화된 T-세포를 33,000개의 종양 세포/웰로 100,000개의 T-세포/웰에서 U 바닥 96웰 플레이트에서 평판 배양하여, 대략 3:1의 T-세포 대 종양 세포 비율을 성취하였다. 1nM 내지 5fM 범위의 시험 분자의 농도를 10% 인간 또는 소 혈청, 피부르산나트륨 및 비필수 아미노산이 보충된 RPMI 1640 배지에서 전체 200㎕/웰 중에 세포 혼합물에 첨가하였다. 플레이트를 습윤 항온처리기에서 37℃, 5% C02에서 항온처리하였다. 3일 후, 세포를 유세포 분석을 위해 항체로 표지화하였다. 세포를 표지화하고 이의 원래의 플레이트에서 세척하여 운반 동안 세포 손실을 최소화하고, 0.2% 소 혈청 알부민으로 식염수 완충제 중에 모든 표지화을 수행하였다. 우선, 세포를 실온에서 15분 동안 100㎍/㎖의 인간 IgG와 예비 항온처리하였다. 이후, 세포를 하기 염료 표지화된 항체의 혼합물(전체 용적 50㎕)과 40분 동안 항온처리하였다: CD5-PE, CD4-APC, CD8-퍼시픽 블루(Pacific Blue), CD25-PE-Cy7, 및 7-아미노 악티노마이신 D(이하 7AAD). 플레이트를 2회 세척하고, 80 내지 120㎕의 용적 중에 재현탁시키고, BD LSRII 유세포 분석기에서 즉시 실행하여 각각의 웰의 함량의 80%를 얻었다. 샘플 파일을 플루조 소프트웨어(FlowJo software)를 이용하여 분석하여, 활성화된, 살아 있는 CD4+ 또는 CD8+ T-세포(각각 7AAD-, CD5+ CD25+ CD4+ 또는 7AAD-CD5+ CD25+ CD8+)에서 순차적으로 순위 매김으로써 이의 CFSE 프로필에 따라 적어도 하나의 세포 분열을 겪은 세포의 수 및 백분율을 계산하였다. 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어를 이용하여 평균 값 및 표준 편차를 계산하였다. 마이크로소프트 엑셀 또는 그래프패드 프리즘을 이용하여 그래프를 작도하였다.
전체 T-세포로 치료된 다우디 세포로부터의 살아 있는 CD4+ 및 CD8+ 집단의 분석은 표적 CD19 항원을 디스플레이하는 다우디 세포의 존재 하에 세포의 전체 수 및 증식 세포 백분율 둘 다의 유의적인 증가를 나타냈다(도 21 및 도 22).
동종이합체 이중특이적 폴리펩타이드(TSC129a, TSC233, TSC234)의 경우, CD4+ 세포와 CD8+ 세포 사이에 증식은 필적하였다(도 21). CD4+ 세포와 CD8+ 세포 사이에 TSC129a 및 TSC234에 의해 유도된 증식은 필적하였고(도 21), 이는 DRA222로부터의 pI 변이체 항-CD3 scFv 결합 도메인이 모 크리스7 결합 도메인과 실질적으로 동등한 활성을 갖는다는 것을 제시한다. TSC233에 의해 유도된 T-세포 증식의 프로필은 TSC129a 및 TSC234와 약간 다르고, CD4+ 증식 유도가 감소하고(도 21A), CD8+ 증식 유도가 약간 증가하였다(도 21B). 이는 DRA221로부터의 pI 변이체 항-CD3 scFv 결합 도메인이 활성에서 모 크리스7 결합 도메인과 완전히 동일하지 않다는 것을 제시한다.
이종이합체 이중특이적 폴리펩타이드(TSC127, TSC227, TSC228)의 경우, 증식은 CD8+ T-세포의 경우 다우디 세포의 존재 하에 CD4+ T-세포보다 높았다(도 22). CD4+ 세포와 CD8+ 세포 사이에 TSC127 및 TSC228에 의해 유도된 증식은 필적하였고(도 22), 이는 DRA222로부터의 pI 변이체 항-CD3 scFv 결합 도메인이 모 크리스7 결합 도메인과 실질적으로 동일한 활성을 갖는다는 것을 제시한다. TSC227에 의해 유도된 T-세포 증식의 프로필은 TSC127 및 TSC228과 약간 다르고, CD4+ 증식 유도가 감소하고, CD8+ 증식 유도가 필적하였다. 다시, 이는 DRA221로부터의 pI 변이체 항-CD3 scFv 결합 도메인이 활성에서 모 크리스7 결합 도메인과 완전히 동일하지 않다는 것을 제시한다.
실시예 11: CD19 를 표적화하는 폴리펩타이드 이종이합체 및 동종이합체에 의한 재지향된 T-세포 세포독성
표적-의존적 T-세포 세포독성을 유도하는 데 있어서의 상이한 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체 분자의 유효성을 비교하기 위해, 공통 항-CD19 결합 도메인(HD37) 및 3개의 상이한 항-CD3 결합 도메인(TSC129a의 경우 크리스7, TSC233의 경우 DRA221로부터의 scFv 결합 도메인(서열 번호 10의 1-244번 아미노산), TSC234의 경우 DRA222로부터의 scFv 결합 도메인(서열 번호 8의 1-244번 아미노산))을 갖는 3개의 상이한 동종이합체 이중특이적 분자(TSC129a, TSC233 및 TSC234(각각 서열 번호 245, 196 및 198))를 비교하였다. 추가로, 3개의 상이한 항-CD3 결합 도메인(TSC127의 경우 크리스7, TSC227의 경우 DRA221로부터의 scFv 결합 도메인(서열 번호 10의 1-244번 아미노산) 및 TSC228의 경우 DRA222로부터의 scFv 결합 도메인(서열 번호 8의 1-244번 아미노산))을 갖는 3개의 상이한 이종이합체 이중특이적 분자(TSC127, TSC227, TSC228)를 또한 비교하였다.
다우디 버킷 림프종 세포(CD19+)를 ATCC(미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 얻고 제공된 프로토콜에 따라 배양하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 혈액으로부터 표준 피콜 구배를 이용하여 단리하고 식염수 완충제 중에 세척하였다. 제조업자의 프로토콜을 이용하여 밀테니 바이오텍(독일 베르기슈 글라트바흐)으로부터의 팬 T-세포 분리 키트 II를 사용하여 PBMC로부터 T-세포를 추가로 단리하였다.
51Cr 방출 검정에 의해 세포독성을 평가하였다. 대략 5×106개의 다우디 세포를 0.3mCi의 51Cr로 처리하고, 37℃에서 75분 동안 항온처리하였다. 75분 후, 세포를 배지(RPMI + 10% FBS)로 3회 세척하고 11.5㎖의 배지 중에 재현탁하였다. 이 현탁액으로부터 50㎕를 96웰 U 바닥 플레이트(대략 20,000개의 세포/웰)에 분산시켰다. 500pM 내지 0.1pM 범위의 이중특이적 분자의 농도를 다우디 세포에 첨가하여, 전체 용적이 웰당 100㎕가 되게 하였다. 표적 세포를 15분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 100㎕의 단리된 T-세포(대략 200,000개)를 첨가하여 T-세포 대 표적 세포 비율이 10:1이 되게 하였다. 50㎕의 0.8% NP-40을 표적 세포를 포함하는 대조군 웰에 첨가하고, 15분 동안 정치시키고, 이후 100㎕의 배지를 첨가하여 전체 용해 대조군을 제공하였다.
플레이트를 4시간 동안 항온처리한 후, 1500rpm에서 3분 동안 스피닝하고 25㎕의 상청액을 각각의 웰로부터 96웰 루마(Luma) 샘플 플레이트의 상응하는 웰로 옮겼다. 샘플 플레이트를 화학 안전 후드 하에 18시간 동안 공기 건조시키고 이후 표준 프로토콜을 이용하여 탑카운트 섬광 카운터(Topcount scintillation counter)에서 방사성을 판독하였다.
세포독성 데이터의 분석은 T-세포 및 항-CD19 지향된 이중특이적 분자의 존재 하에 다우디 세포에 의한 T-세포 지향된 세포독성을 나타낸다(도 23).
동종이합체 이중특이적 폴리펩타이드(TSC129a, TSC233, TSC234)의 경우, TSC129a와 TSC234 사이에 관찰된 세포독성이 필적하였고(도 23A), 이는 DRA222 pI 변이체가 모 크리스7 결합 도메인과 동일한 활성을 갖는다는 것을 제시한다. 약간의 세포독성 감소가 TSC233에 의해 관찰되었고, 이는 DRA221 pI 변이체가 모 크리스7 결합 도메인보다 더 적은 활성을 갖는다는 것을 제시한다.
이종이합체 이중특이적 폴리펩타이드(TSC127, TSC227, TSC228)의 경우, TSC127와 TSC228 사이에 관찰된 세포독성이 필적하였고(도 23B), 이는 DRA222 scFv 결합 도메인 pI 변이체가 모 크리스7 결합 도메인과 동일한 활성을 갖는다는 것을 제시한다. 약간의 세포독성 감소가 TSC227에 의해 관찰되었고, 이는 DRA221 scFv 결합 도메인 pI 변이체가 모 크리스7 결합 도메인보다 더 적은 활성을 갖는다는 것을 제시한다.
실시예 12: RON 을 표적화하는 폴리펩타이드 동종이합체에 의한 재지향된 T-세포 세포독성
표적-의존적 T-세포 세포독성을 유도하는 데 있어서의 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체 분자의 유효성을 비교하기 위해, 공통 항-CD3 결합 도메인(DRA222로부터의 scFv 결합 도메인(서열 번호 8의 1-244번 아미노산))을 갖는 4개의 상이한 동종이합체 이중특이적 분자(TSC275, TSC277, TSC278 및 TSC279) 및 동일한 항-RON 결합 도메인의 4개의 변이체(TSC275의 경우 hu4C04 scFv, TSC277의 경우 hu4C04 scFv(A43K/Q240E), TSC278의 경우 hu4C04 scFv(A43T) 및 TSC279의 경우 hu4C04 scFv(Q 65R))를 비교하였다.
MDA-MB-453 유방암 세포(RON+)를 ATCC(미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 얻고 ATCC에 의해 제공된 프로토콜에 따라 배양하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 혈액으로부터 표준 피콜 구배를 이용하여 단리하고 식염수 완충제 중에 세척하였다. 제조업자의 프로토콜을 이용하여 밀테니 바이오텍(독일 베르기슈 글라트바흐)으로부터의 팬 T-세포 분리 키트 II를 사용하여 PBMC로부터 T-세포를 추가로 단리하였다.
51Cr 방출 검정에 의해 세포독성을 평가하였다. 대략 5×106개의 다우디 세포를 0.3mCi의 51Cr로 처리하고, 37℃에서 75분 동안 항온처리하였다. 75분 후, 세포를 배지(RPMI + 10% FBS)로 3회 세척하고 11.5㎖의 배지 중에 재현탁하였다. 이 현탁액으로부터 50㎕를 96웰 U 바닥 플레이트(대략 20,000개의 세포/웰)에 분산시켰다. 10nM 내지 0.005fM 범위의 이중특이적 분자의 농도를 다우디 세포에 첨가하여, 전체 용적이 웰당 100㎕가 되게 하였다. 표적 세포를 15분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 100㎕의 단리된 T-세포(대략 100,000개)를 첨가하여 T-세포 대 표적 세포 비율이 5:1이 되게 하였다. 50㎕의 0.8% NP-40을 표적 세포를 포함하는 대조군 웰에 첨가하고, 15분 동안 정치시키고, 이후 100㎕의 배지를 첨가하여 전체 용해 대조군을 제공하였다.
플레이트를 24시간 동안 항온처리한 후, 1500rpm에서 3분 동안 스피닝하고 25㎕의 상청액을 각각의 웰로부터 96웰 루마 샘플 플레이트의 상응하는 웰로 옮겼다. 샘플 플레이트를 화학 안전 후드 하에 18시간 동안 공기 건조시키고 이후 표준 프로토콜을 이용하여 탑카운트 섬광 카운터에서 방사성을 판독하였다.
세포독성 데이터의 분석은 T-세포 및 항-RON 지향된 이중특이적 분자의 존재 하에 MDA-MB-453 세포에 의해 T-세포 지향된 세포독성을 나타냈다(도 24).
동종이합체 이중특이적 폴리펩타이드(TSC275, TSC277, TSC278 및 TSC279)의 경우, 관찰된 세포독성이 일반적으로 필적하였고(도 24), 이는 ORN196 결합 도메인 내의 돌연변이가 전체 활성에 유의적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다. 그러나, 다른 3개의 변이체와 비교하여 TSC278에 대해 약간 더 낮은 최대 용해가 관찰되었다(도 24). 10pM과 10nM의 농도 사이에 최대 용해가 관찰되었다.
실시예 13: 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체 및 동종이합체의 T-세포 결합
항-CD19 x 항-CD3 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체의 온-세포 결합 특징인, T-세포에 대한 결합에서 pI 변이체 CD3 결합 도메인(DRA222에서 발견된 scFv(서열 번호 8의 1-244번 아미노산))을 특징으로 하는 이중특이적 폴리펩타이드 분자의 유효성을 비교하기 위해, TSC228(실시예 8, 표 8에 기재됨)을 항-PSMA x 항-CD3 이중특이적 폴리펩타이드 동종이합체 TSC249(실시예 5, 표 5에 기재됨)와 비교하고, 2개의 독립 실험에서 비교하였다.
주카트(CD3+) T-세포 백혈병 세포를 ATCC(미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 얻고 ATCC에 의해 제공된 프로토콜에 따라 배양하였다. 5×105개의 주카트 세포를 30분 동안 4℃에서 250nM 내지 0,125nM(TSC249) 또는 125nM 내지 1pM(TSC228)의 농도에서 순차적으로 희석된 이중특이적 분자 TSC228 또는 TSC249와 항온처리함으로써 결합을 평가하였다. 세포를 3회 세척하고 이후 다른 30분 동안 4℃에서 염소 항-인간 IgG-FITC(1:200 희석)와 항온처리하였다. 이후, 세포를 다시 3회 세척하고, 1% 파라폼알데하이드 중에 고정하고, FACS-Calibur 기기에서 판독하였다.
플루조 v7.5(트리 스타, 인크.(Tree Star, Inc), 오레곤주 애쉬랜드)에서의 FSC 고, SSC 고 서브세트의 분석은 주카트 세포에 대한 이중특이적 분자 TSC228 및 TSC249의 용량 의존적 결합을 나타낸다(각각 도 25a 및 도 25b). 오직 하나의 항-CD3 결합 도메인을 보유하는 TSC228 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체는 2개의 항-CD3 결합 도메인을 보유하는 TSC249 이중특이적 폴리펩타이드 동종이합체(EC50 = 1.9nM)보다 더 낮은 겉보기 친화도(EC50 = 24.5nM)로 결합하였다. 이는 TSC249 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체가 약간의 결합도로 결합한다는 것을 제시한다.
실시예 14: PSMA 를 표적화하는 이중특이적 폴리펩타이드 동종이합체에 의한 표적-의존적 T-세포 증식
표적-의존적 T-세포 활성화 및 증식을 유도하는 데 있어서의 상이한 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체 분자의 유효성을 결정하기 위해, 항-PSMA 결합 도메인(hu107-1A4) 및 항-CD3 결합 도메인(DRA222로부터의 scFv(서열 번호 8의 1-244번 아미노산))을 갖는 동종이합체 이중특이적 분자(TSC249, 실시예 5, 표 5 참조)를 PSMA를 발현하는 전립선암 세포주, PSMA를 발현하지 않는 전립선암 세포주 및 존재하는 표적 세포가 없는 T-세포에서 시험하였다.
C4-2B 전립선 암종 세포(PSMA+)를 MD 앤더슨 암 센터(텍사스주 휴스톤)로부터 얻고 제공된 프로토콜에 따라 배양하였다. DU-145 전립선 암종 세포(PSMA-)를 ATCC(미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 얻고 제공된 프로토콜에 따라 배양하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 혈액으로부터 표준 피콜 구배를 이용하여 단리하고 식염수 완충제 중에 추가로 세척하였다. 제조업자의 프로토콜을 이용하여 밀테니 바이오텍(독일 베르기슈 글라트바흐)으로부터의 팬 T-세포 분리 키트 II를 사용하여 이 PBMC로부터 T-세포를 추가로 단리하였다.
단리된 T-세포 집단을 카복시플루오레세인 다이아세테이트 숙신이미딜 에스터(CFSE)로 표지화함으로써 증식을 평가하였다. 3회 개별 실험을 동시에 설정하였다. CFSE 표지화된 T-세포를 TSC249 분자 단독과 혼합하고; CFSE 표지화된 T-세포를 DU-145 세포 및 TSC249 분자와 혼합하고; CFSE 표지화된 T-세포를 C4-2B 세포 및 TSC249 분자와 혼합하였다. CFSE 표지화된 T-세포를 33,000개의 종양 세포/웰로 100,000개의 T-세포/웰에서 U 바닥 96웰 플레이트에서 평판 배양하여, 3:1의 근사한 T-세포 대 종양 세포 비율을 성취하였다. 20nM 내지 5fM 범위의 시험 분자의 농도를 10% 인간 또는 소 혈청, 피부르산나트륨 및 비필수 아미노산이 보충된 RPMI 1640 배지에서 전체 200㎕/웰 중에 세포 혼합물에 첨가하였다. 플레이트를 습윤 항온처리기에서 37℃, 5% C02에서 항온처리하였다. 3일 후, 세포를 유세포 분석을 위해 항체로 표지화하였다. 세포를 표지화하고 이의 원래의 플레이트에서 세척하여 운반 동안 세포 손실을 최소화하고, 0.2% 소 혈청 알부민으로 식염수 완충제 중에 모든 표지화을 수행하였다. 우선, 세포를 실온에서 15분 동안 100㎍/㎖의 인간 IgG와 예비 항온처리하였다. 이후, 세포를 하기 염료 표지화된 항체의 혼합물(전체 용적 50㎕)과 40분 동안 항온처리하였다: CD5-PE, CD4-APC, CD8-퍼시픽 블루, CD25-PE-Cy7, 및 7-아미노 악티노마이신 D(이하 7AAD). 플레이트를 2회 세척하고, 80 내지 120㎕의 용적 중에 재현탁시키고, BD LSRII 유세포 분석기에서 즉시 실행하여 각각의 웰의 함량의 80%를 얻었다. 샘플 파일을 플루조 소프트웨어를 이용하여 분석하여, 활성화된, 살아 있는 CD4+ 또는 CD8+ T-세포(각각 7AAD-, CD5+ CD25+ CD4+ 또는 7AAD- CD5+ CD25+ CD8+)에서 순차적으로 순위 매김으로써 이의 CFSE 프로필에 따라 적어도 하나의 세포 분열을 겪은 세포의 수 및 백분율을 계산하였다. 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어를 이용하여 평균 값 및 표준 편차를 계산하였다. 마이크로소프트 엑셀 또는 그래프패드 프리즘을 이용하여 그래프를 작도하였다.
전체 T-세포로 처리된 C4-2B 세포로부터의 살아 있는 CD4+ 및 CD8+ 집단의 분석은 TSC249에 의한 처리 시 표적 PSMA 항원을 발현하는 C4-2B 세포의 존재 하에 세포의 전체 수 둘 다의 유의적인 증가를 나타냈다(도 26a). 이 증가는 TSC249에 의한 처리 후 표적 PSMA 항원을 발현하지 않는 DU-145 세포의 존재 하에 볼 수 없었다(도 26b). 마지막으로, 단리된 T-세포가 TSC249로 처리될 때 이 증가를 또한 볼 수 없었다(도 26c). 이는 표적 항원을 발현하는 종양 세포의 존재 하에 TSC249에 의해 유도된 T-세포 증식의 표적-의존적 성질을 확인시켜준다.
실시예 15: CD3 및 PSMA 의 이중특이적 표적화의 생체내 시험
생체내 종양 성장을 억제하는 데 있어서의 항-CD3 및 항-PSMA 이중특이적 분자의 유효성을 확인하기 위해, PSMA 지향된 분자를 임의의 하나 이상의 하기를 이용하여 평가할 수 있다.
피하 종양의 종양 그래프팅의 예방 또는 예방적 치료: 배양된, PSMA 발현 종양 세포주(예컨대, LNCaP, LNCaP C4-2, LNCaP C4-2B, VCaP, CWR22Rv1, LAPC4, MDA-PCa-2b, LuCaP 23.1, LuCaP 58, LuCaP 70, LuCaP 77)를 인간 림프구(인간 말초 혈액 단핵 세포 또는 정제된 T-세포)와 혼합하고 면역결핍 마우스(예컨대, SCID, NOD/SCID 등)에 피하로 주사하였다. 항-PSMA 이중특이적 분자를 주사일 및 몇일 후에 정맥내 주사하였다. 종양 용적에 의해 평가된 종양 생육의 용량 의존적 억제는 각각의 분자가 생체내 PSMA 발현 종양에 대한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
이전에 확립된 피하 종양의 치료학적 치료 또는 회귀: 배양된, PSMA 발현 종양 세포주(예컨대, LNCaP, LNCaP C4-2, LNCaP C4-2B, VCaP, CWR22Rv1, LAPC4, MDA-PCa-2b, LuCaP 23.1AI, LuCaP 58, LuCaP 70 및 LuCaP 77)를 면역결핍 마우스(예컨대, SCID, NOD/SCID 등)에 피하로 주사하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 종양이 확립된 성장(통상적으로 약 200㎣의 용적)의 징후를 나타낼 때 연구를 개시한다. 인간 림프구(인간 말초 혈액 단구 세포 또는 정제된 T-세포)를 주사일에 항-PSMA 이중특이적 분자와 함께 정맥내 주사하였다. 항-PSMA 이중특이적 분자를 몇일 후에 주사하였다. 종양 용적에 의해 평가된 종양 성장의 용량 의존적 억제는 각각의 분자가 생체내 PSMA 발현 종양에 대한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
경골내 종양의 종양 그래프팅의 예방 또는 예방적 치료: 배양된, PSMA 발현 종양 세포주(예컨대, LNCaP C4-2, LNCaP C4-2B, VCaP, CWR22Rv1, LAPC4, MDA-PCa-2b, LuCaP 23.1, LuCaP 58, LuCaP 70, LuCaP 77)를 인간 림프구(인간 말초 혈액 단구 세포 또는 정제된 T-세포)와 혼합하고, 면역결핍 마우스(예컨대, SCID, NOD/SCID 등)에 경골내 주사하였다. 항-PSMA 이중특이적 분자를 주사일 및 몇일 후에 정맥내 주사하였다. 혈청 바이오마커, 방사선 사진술, 형광 영상화, 중량 감소 및 종양 용적의 다른 프록시 측정에 의해 평가된 종양 성장의 용량 의존적 억제는 각각의 분자가 생체 내 PSMA 발현 종양에 대한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
이전에 확립된 경골내 종양의 치료학적 치료 또는 회귀: 배양된, PSMA 발현 종양 세포주(예컨대, LNCaP C4-2, LNCaP C4-2B, VCaP, CWR22Rv1, LAPC4, MDA-PCa-2b, LuCaP 23.1AI, LuCaP 58, LuCaP 70 및 LuCaP 77)를 면역결핍 마우스(예컨대, SCID, NOD/SCID 등)에 경골내 주사하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 종양이 확립된 성장(통상적으로 약 200㎣의 용적)의 징후를 나타낼 때 연구를 개시한다. 인간 림프구(인간 말초 혈액 단구 세포 또는 정제된 T-세포)를 주사일에 항-PSMA 이중특이적 분자와 함께 정맥내 주사하였다. 항-PSMA 이중특이적 분자를 몇일 후에 주사하였다. 혈청 바이오마커, 방사선 사진술, 형광 영상화, 중량 감소 및 종양 용적의 다른 프록시 측정에 의해 평가된 종양 성장의 용량 의존적 억제는 각각의 분자가 생체내 PSMA 발현 종양에 대한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
실시예 16: PSMA 를 표적화하는 폴리펩타이드 이종이합체 및 동종이합체에 의한 재지향된 T-세포 세포독성
표적-의존적 T-세포 세포독성을 유도하는 데 있어서의 상이한 이중특이적 폴리펩타이드 이종이합체 분자의 유효성을 비교하기 위해, 공통 항-PSMA 결합 도메인(hu107-1A4) 및 2개의 상이한 항-CD3 결합 도메인(TSC194의 경우 크리스7 scFV, TSC249의 경우 DRA222로부터의 scFv)을 갖는 2개의 상이한 동종이합체 이중특이적 분자(TSC194, TSC249)를 비교하였다. TSC194는 동종이합체 이중특이적((huVL-VH#2 107-1A4 scFv-Fc-크리스7 scFv)(서열 번호 250 및 251)이다.
C4-2B 세포(PSMA+)를 MD 앤더슨으로부터 얻고 RPMI-1640 배지(라이프 테크놀로지스(캘리포니아주 칼스바드 소재))와 함께 10% FBS 중에 공개된 배양 조건에 따라 배양하였다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 혈액으로부터 표준 피콜 구배를 이용하여 단리하고 식염수 완충제 중에 세척하였다. 제조업자의 프로토콜을 이용하여 밀테니 바이오텍(독일 베르기슈 글라트바흐)으로부터의 팬 T-세포 분리 키트 II를 사용하여 PBMC로부터 T-세포를 추가로 단리하였다.
51Cr 방출 검정에 의해 세포독성을 평가하였다. 대략 5×106개의 C4-2 세포를 0.3mCi의 51Cr로 처리하고, 37℃에서 75분 동안 항온처리하였다. 75분 후, 세포를 배지(RPMI + 10% FBS)로 3회 세척하고 11.5㎖의 배지 중에 재현탁하였다. 이 현탁액으로부터 50㎕를 96웰 U 바닥 플레이트(대략 20,000개의 세포/웰)에 분산시켰다. 500pM 내지 0.2pM 범위의 이중특이적 분자의 농도를 C4-2 세포에 첨가하여, 전체 용적이 웰당 100㎕가 되게 하였다. 표적 세포를 15분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 100㎕의 단리된 T-세포(대략 200,000개)를 첨가하여 T-세포 대 표적 세포 비율이 10:1이 되게 하였다. 50㎕의 0.8% NP-40을 표적 세포를 포함하는 대조군 웰에 첨가하고, 15분 동안 정치시키고, 이후 100㎕의 배지를 첨가하여 전체 용해 대조군을 제공하였다.
플레이트를 4시간 동안 항온처리한 후, 1500rpm에서 3분 동안 스피닝하고 25㎕의 상청액을 각각의 웰로부터 96웰 루마 샘플 플레이트의 상응하는 웰로 옮겼다. 샘플 플레이트를 화학 안전 후드 하에 18시간 동안 공기 건조시키고 이후 표준 프로토콜을 이용하여 탑카운트 섬광 카운터에서 방사성을 판독하였다.
세포독성 데이터의 분석은 T-세포가 T-세포 및 항-PSMA 지향된 이중특이적 분자의 존재 하에 C4-2 세포에 의한 세포독성을 지향한다는 것을 나타낸다(도 27). 동종이합체 이중특이적 폴리펩타이드(TSC194, TSC249)의 경우, TSC194와 TSC249 사이에 관찰된 세포독성이 필적하였고(표 10), 이는 DRA222 항-CD3 scFv 결합 도메인 pI 변이체가 모 크리스7 결합 도메인과 동등한 활성을 갖는다는 것을 제시한다.
Figure pct00018
SEQUENCE LISTING <110> EMERGENT PRODUCT DEVELOPMENT SEATTLE, LLC <120> CD3 Binding Polypetides <130> WO2013/158856 <140> PCT/US2013/037135 <141> 2013-04-18 <150> US 61/799,849 <151> 2013-03-15 <150> US 61/718,635 <151> 2012-10-25 <150> US 61/636,557 <151> 2012-04-20 <160> 255 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Signal peptide <400> 1 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcg 60 cgagga 66 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Signal peptide <400> 2 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly 20 <210> 3 <211> 1434 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DRA209 (H2 L1 with IgG4 AA ADCC-CDC null Fc) <400> 3 caggtccagc tggtgcagtc tgggggcgga gtggtgcagc ctgggcggtc actgaggctg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agatctacga tgcactgggt aaggcaggcc 120 cctggaaagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcagtgctta tactaattac 180 aatcagaaat tcaaggacag gttcacaatc 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cccggacaaa ggcttgagtg gatgggatac attaatccta gcagtgctta tactaattac 240 aatcagaaat tcaaggacag agtcaccatt accagggaca catccgcgag cacagcctac 300 atggagctga gcagcctgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagaccccaa 360 gtccactatg attacaacgg gtttccttac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcc 420 tcaggtggag gcggttcagg cggaggtgga tccggcggtg gcggatcggg tggcggcgga 480 tctgaaattg tgttgacaca gtctccagcc accctgtctt tgtctccagg ggaaagagcc 540 accctctcct gcagtgccag ctcaagtgta agttacatga actggtacca acagaaacct 600 ggccaggctc ccaggctcct catctatgac tcatccaaac tggcttctgg catcccagcc 660 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 720 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tggagtcgta acccacccac tttcggcgga 780 gggaccaagg tggagatcaa atcctcgagt gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca 840 tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgcg ggtgcaccgt cagtcttcct cttcccccca 900 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 960 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 1020 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1080 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggcgt acgcgtgcgc ggtctccaac 1140 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1200 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1260 acctgcctgg tcaaaggctt ctatccaagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1320 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1380 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1440 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1500 ggtaaatcta gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 1560 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaatt acttctatcc cagagaggcc 1620 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgccaca 1680 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagcg agctgacgct gagcaaagca 1740 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 1800 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtga 1830 <210> 224 <211> 589 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSC223 <400> 224 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val 130 135 140 Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 145 150 155 160 Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr 165 170 175 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ser Ser 180 185 190 Lys Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly 225 230 235 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp 245 250 255 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala 260 265 270 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 275 280 285 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 290 295 300 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 305 310 315 320 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 325 330 335 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 340 345 350 Ala Tyr Ala Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 355 360 365 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 370 375 380 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 385 390 395 400 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 405 410 415 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 420 425 430 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 435 440 445 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 450 455 460 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 465 470 475 480 Gly Lys Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 485 490 495 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 500 505 510 Asn Tyr Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 515 520 525 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Ala Thr Glu Gln Asp Ser 530 535 540 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Glu Leu Thr Leu Ser Lys Ala 545 550 555 560 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 565 570 575 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 580 585 <210> 225 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSC254 <400> 225 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60 gatatccaga tgacccagtc tccatccgcc atgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120 atcacttgcc gggcgagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtttca gcagaaacca 180 gggaaagttc ctaagctccg catccattct ggatctactt tgcaatcagg ggtcccatct 240 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagaa tttactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag catattgaat acccgtggac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa acgaggtggc ggagggtctg ggggtggcgg atccggaggt 420 ggtggctctg aggtccagct ggtacagtct ggggctgagg tgaagaagcc tggggctaca 480 gtgaagatct cctgcaaggc ttctggatac acattcactg actactacat gcactgggtg 540 caacaggccc ctggaaaagg gcttgagtgg atgggatatt ttaatcctta taatgattat 600 actagatacg cagagaagtt ccagggcaga gtcaccataa ccgcggacac gtctacagac 660 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgca 720 agatcggatg gttactacga tgctatggac tactggggtc aaggaaccac agtcaccgtc 780 tcctcgagtg agcccaaatc ttctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 840 gaagccgcgg gtgcaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 900 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 960 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1020 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1080 tggctgaatg gcaaggcgta cgcgtgcgcg gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1140 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1200 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1260 tatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1320 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1380 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1440 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gttcttccct gaatacaccg 1500 aactctgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 1560 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga gccggtgacg 1620 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 1680 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 1740 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 1800 tga 1803 <210> 226 <211> 580 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSC254 <400> 226 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Arg Ile 35 40 45 His Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser 130 135 140 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His Trp Val 145 150 155 160 Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro 165 170 175 Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr 180 185 190 Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 195 200 205 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly 210 215 220 Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Ala Tyr Ala Cys Ala Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser Leu Asn Thr Pro 465 470 475 480 Asn Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 485 490 495 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 500 505 510 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 515 520 525 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 530 535 540 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 545 550 555 560 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 565 570 575 Asp Lys Lys Val 580 <210> 227 <211> 1845 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSC258 <400> 227 atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcg 60 cgaggacagg tccagctggt ggagtctggg ggcggagtgg tgcagcctgg gcggtcactg 120 aggctgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttactagat ctacgatgca ctgggtaagg 180 caggcccctg gacaaggtct ggaatggatt ggatacatta atcctagcag tgcttatact 240 aattacaatc agaaattcaa ggacaggttc acaatcagcg cagacaaatc caagagcaca 300 gccttcctgc agatggacag cctgaggccc gaggacaccg gcgtctattt ctgtgcacgg 360 ccccaagtcc actatgatta caacgggttt ccttactggg gccaagggac tcccgtcact 420 gtctctagcg gtggcggagg gtctgggggt ggcggatccg gaggtggtgg ctctgcacaa 480 gacatccaga tgacccagtc tccaagcagc ctgtctgcaa gcgtggggga cagggtcacc 540 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagccgggc 600 aaggccccca aaagatggat ttatgactca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 660 ttcagtggca gtgggtctgg gaccgactat accctcacaa tcagcagcct gcagcccgaa 720 gatttcgcca cttattactg ccagcagtgg agtcgtaacc cacccacgtt cggagggggg 780 accaagctac aaattacatc ctcgagtgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc 840 ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggt gcaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 900 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 960 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1020 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1080 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggcgtacg cgtgcgcggt ctccaacaaa 1140 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1200 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1260 tgcctggtca aaggcttcta tccaagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1320 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1380 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1440 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1500 tcttccctga atacaccgaa ctctaggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 1560 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaattacttc 1620 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 1680 caggagagtg ccacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcgagctg 1740 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 1800 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtga 1845 <210> 228 <211> 592 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSC258 <400> 228 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr 145 150 155 160 Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Gln Ile Thr Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val 260 265 270 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 275 280 285 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 290 295 300 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 305 310 315 320 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 325 330 335 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Ala Tyr Ala 340 345 350 Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 355 360 365 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 370 375 380 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 405 410 415 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 420 425 430 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 435 440 445 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 450 455 460 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Ser 465 470 475 480 Leu Asn Thr Pro Asn Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile 485 490 495 Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val 500 505 510 Cys Leu Leu Asn Tyr Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 515 520 525 Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Ala Thr Glu 530 535 540 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Glu Leu Thr Leu 545 550 555 560 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr 565 570 575 His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu 580 585 590 <210> 229 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence from Figure 3 <220> <221> misc_feature <223> Xaa is a position that was not a consensus in Figure 3 with Ala and Phe being equally prevalent at that position and Val occuring in 1 out of 7 of the sequences <220> <221> misc_feature <222> (68)..(68) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 229 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Xaa Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 230 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence from Figure 4 <400> 230 Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp 35 40 45 Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr 100 105 <210> 231 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence from Figure 5 <220> <221> misc_feature <223> This is the consensus seqeunce from figure 5. X represents where there was no consequence, so X could equally be one of the amino acids shown in that position in the other sequences <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (54)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (57)..(58) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (74)..(74) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 231 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Xaa Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Xaa Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 232 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKV1-5*01 <400> 232 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser 85 90 95 <210> 233 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence from Figure 6 <220> <221> misc_feature <223> This is the consensus seqeunce from figure 6. X represents where there was no consequence, so X could equally be one of the amino acids shown in that position in the other sequences <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (53)..(53) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (55)..(55) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 233 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Xaa Ala Ser Xaa Ser Ile Ser Xaa Trp 20 25 30 Leu Xaa Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Xaa Xaa Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 85 90 <210> 234 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKJ1*01 <400> 234 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 235 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKJ2*01 <400> 235 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 236 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKJ3*01 <400> 236 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10 <210> 237 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKJ4*01 <400> 237 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 238 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IGKJ5*01 <400> 238 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 239 <211> 423 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Figure 7 consensus sequence <400> 239 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr 145 150 155 160 Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Ala Tyr Ala Cys 340 345 350 Ala Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 420 <210> 240 <211> 478 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DRA161 <400> 240 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr 145 150 155 160 Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Gln Ile Thr Arg Arg Thr Ser Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 420 425 430 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 241 <211> 478 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence of Figure 8 <400> 241 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr 145 150 155 160 Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Gln Ile Thr Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 420 425 430 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 242 <211> 1800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSC125 <400> 242 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60 caggtccagc tggtgcagtc tgggggcgga gtggtgcagc ctgggcggtc actgaggctg 120 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agatctacga tgcactgggt aaggcaggcc 180 cctggaaagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gcagtgctta tactaattac 240 aatcagaaat tcaaggacag gttcacaatc agcgcagaca aatccaagag cacagccttc 300 ctgcagatgg acagcctgag gcccgaggac accggcgtct atttctgtgc acggccccaa 360 gtccactatg attacaacgg gtttccttac tggggccaag ggactcccgt cactgtctct 420 agcggtggcg gagggtctgg gggtggcgga tccggaggtg gtggctctgc acaagacatc 480 cagatgaccc agtctccaag cagcctgtct gcaagcgtgg gggacagggt caccatgacc 540 tgcagtgcca gctcaagtgt aagttacatg aactggtacc agcagaagcc cggcaaggcc 600 cccaaaagat ggatttatga ctcatccaaa ctggcttctg gagtccctgc tcgcttcagt 660 ggcagtgggt ctgggaccga ctataccctc acaatcagca gcctgcagcc cgaagatttc 720 gccacttatt actgccagca gtggagtcgt aacccaccca cgttcggagg ggggaccaag 780 ctacaaatta cacgctcgag tgagcccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 840 tgcccagcac ctgaagccgc gggtgcaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 900 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 960 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 1020 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1080 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggcg tacgcgtgcg cggtctccaa caaagccctc 1140 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1200 tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1260 gtcaaaggct tctatccaag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1320 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1380 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1440 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatct 1500 agagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 1560 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc ggtgacggtg 1620 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 1680 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 1740 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagtttga 1800 <210> 243 <211> 579 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSC125 mature protein <400> 243 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr 145 150 155 160 Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala 180 185 190 Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Gln Ile Thr Arg Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val 260 265 270 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 275 280 285 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 290 295 300 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 305 310 315 320 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 325 330 335 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Ala Tyr Ala 340 345 350 Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 355 360 365 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 370 375 380 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 405 410 415 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 420 425 430 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 435 440 445 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 450 455 460 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser 465 470 475 480 Arg Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 485 490 495 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 500 505 510 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 515 520 525 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 530 535 540 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 545 550 555 560 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 565 570 575 Lys Lys Val <210> 244 <211> 2310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSC129a DNA <400> 244 atggaagcac cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 180 caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct 240 gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 300 cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgccagc aaagtactga ggatccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggtggcg gtggttcggg cggtggtggg 420 tcgggtggcg gcggagctag ccaggttcag ctgcagcagt ctggggctga gctggtgagg 480 cctgggtcct cagtgaagat ttcctgcaag gcttctggct atgcattcag tagctactgg 540 atgaactggg tgaagcagag gcctggacag ggtcttgagt ggattggaca gatttggcct 600 ggagatggtg atactaacta caatggaaag ttcaagggta aagccactct gactgcagac 660 gaatcctcca gcacagccta catgcaactc agcagcctag catctgagga ctctgcggtc 720 tatttctgtg caagacggga gactacgacg gtaggccgtt attactatgc tatggactac 780 tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcgagtgagc ccaaatcttc tgacaaaact 840 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcgggtg caccgtcagt cttcctcttc 900 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 960 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1020 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1080 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggcgtacgc gtgcgcggtc 1140 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1260 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat ccaagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1440 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1500 tctccgggtc agaggcacaa caattcttcc ctgaatacag gaactcagat ggcaggtcat 1560 tctccgaatt ctcaggtcca gctggtgcag tctgggggcg gagtggtgca gcctgggcgg 1620 tcactgaggc tgtcctgcaa ggcttctggc tacaccttta ctagatctac gatgcactgg 1680 gtaaggcagg cccctggaaa gggtctggaa tggattggat acattaatcc 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tttactctca ccatcagcag cctgcagcct 300 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag catattgaat acccgtggac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa acgaggtggc ggagggtctg ggggtggcgg atccggaggt 420 ggtggctctc aggtccagct ggtacagtct ggggctgagg tgaagaagcc tggggcttca 480 gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggatac acattcactg actactacat gcactgggtg 540 cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggatatt ttaatcctta taatgattat 600 actagatacg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatga ccagggacac gtctatcagc 660 acagcctaca tggagctgag cagcctgaga tctgacgaca cggccgtgta ttactgtgca 720 agatcggatg gttactacga tgctatggac tactggggtc aaggaaccac agtcaccgtc 780 tcctcgagtg agcccaaatc ttctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 840 gaagccgcgg gtgcaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 900 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 960 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1020 gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1080 tggctgaatg gcaaggcgta cgcgtgcgcg gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1140 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1200 ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1260 tatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1320 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1380 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1440 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtcagaggca caacaattct 1500 tccctgaata caggaactca gatggcaggt cattctccga attctcaggt ccagctggtg 1560 cagtctgggg gcggagtggt gcagcctggg cggtcactga ggctgtcctg caaggcttct 1620 ggctacacct ttactagatc tacgatgcac tgggtaaggc aggcccctgg aaagggtctg 1680 gaatggattg gatacattaa tcctagcagt gcttatacta attacaatca gaaattcaag 1740 gacaggttca caatcagcgc agacaaatcc aagagcacag ccttcctgca gatggacagc 1800 ctgaggcccg aggacaccgg cgtctatttc tgtgcacggc cccaagtcca ctatgattac 1860 aacgggtttc cttactgggg ccaagggact cccgtcactg tctctagcgg tggcggaggg 1920 tctgggggtg gcggatccgg aggtggtggc tctgcacaag acatccagat gacccagtct 1980 ccaagcagcc tgtctgcaag cgtgggggac agggtcacca tgacctgcag tgccagctca 2040 agtgtaagtt acatgaactg gtaccagcag aagcccggca aggcccccaa aagatggatt 2100 tatgactcat ccaaactggc ttctggagtc cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg 2160 accgactata ccctcacaat cagcagcctg cagcccgaag atttcgccac ttattactgc 2220 cagcagtgga gtcgtaaccc acccacgttc ggagggggga ccaagctaca aattacacga 2280 taa 2283 <210> 251 <211> 740 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSC194 mature protein <400> 251 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Arg Ile 35 40 45 His Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ile Glu Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val 115 120 125 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 130 135 140 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Phe Asn Pro 165 170 175 Tyr Asn Asp Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr 180 185 190 Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser 195 200 205 Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly 210 215 220 Tyr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 245 250 255 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Ala Tyr Ala Cys Ala Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gln Arg His Asn Asn Ser 465 470 475 480 Ser Leu Asn Thr Gly Thr Gln Met Ala Gly His Ser Pro Asn Ser Gln 485 490 495 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser 500 505 510 Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser Thr 515 520 525 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 530 535 540 Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 545 550 555 560 Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu 565 570 575 Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala 580 585 590 Arg Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln 595 600 605 Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 610 615 620 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 625 630 635 640 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys 645 650 655 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 660 665 670 Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser 675 680 685 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 690 695 700 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 705 710 715 720 Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 725 730 735 Gln Ile Thr Arg 740 <210> 252 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 252 Leu Gln Ile Thr 1 <210> 253 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VEIK <400> 253 Val Glu Ile Lys 1 <210> 254 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254 Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5 <210> 255 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5

Claims (67)

  1. 서열 번호 41의 아미노산 서열을 갖는 결합 도메인과 비교하여 등전점이 감소된 CD3 결합 도메인을 포함하는, CD3 결합 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 결합 도메인은 VH 구역 및 VL 구역을 포함하고, 상기 VH 구역 및 상기 VL 구역은 프레임워크(framework) 구역을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 2개 이상의 아미노산은, 양으로 하전된 아미노산을 중성 아미노산으로 치환하고/하거나 중성 아미노산을 음으로 하전된 아미노산으로 치환함으로써, VH 및/또는 VL의 프레임워크 구역 내에서 변형된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프레임워크 구역의 변형된 아미노산은 상응하는 인간 생식선 IgG 서열 내에 포함된 아미노산으로 치환된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인간 생식선 IgG 서열은 서열 번호 43을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 인간 생식선 IgG 서열은 서열 번호 44를 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프리힌지(prehinge) 구역을 더 포함하는, CD3 결합 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 프리힌지 구역은 RRT 프리힌지 구역을 갖는 CD3 결합 폴리펩타이드과 비교하여 등전점이 감소된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  9. 프레임워크 구역, 프리힌지 구역 및 힌지 구역을 갖는 CD3 결합 도메인을 포함하는 CD3 결합 폴리펩타이드로서,
    상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 42와 비교하여 3개 이상의 변형 아미노산을 갖고, 상기 변형은 상기 프레임워크 및/또는 프리힌지 구역 내의 중성 아미노산에 의한 양으로 하전된 아미노산의 치환 및/또는 음으로 하전된 아미노산에 의한 중성 아미노산의 치환인 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 적어도 2개 이상의 아미노산은, 양으로 하전된 아미노산을 중성 아미노산으로 치환하고/하거나 중성 아미노산을 음으로 하전된 아미노산으로 치환함으로써, VH 및/또는 VL의 프레임워크 구역 내에서 변형된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  11. 제3항 또는 제9항에 있어서, 적어도 4개 이상의 아미노산은, 양으로 하전된 아미노산을 중성 아미노산으로 치환하고/하거나 중성 아미노산을 음으로 하전된 아미노산으로 치환함으로써, VH 및/또는 VL의 프레임워크 구역 내에서 변형된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  12. 제3항 또는 제9항에 있어서, 3개 내지 5개의 아미노산은, 양으로 하전된 아미노산을 중성 아미노산으로 치환하고/하거나 중성 아미노산을 음으로 하전된 아미노산으로 치환함으로써, VH 및/또는 VL의 프레임워크 구역 내에서 변형된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  13. 제3항 또는 제9항에 있어서, 3개 내지 10개의 아미노산은, 양으로 하전된 아미노산을 중성 아미노산으로 치환하고/하거나 중성 아미노산을 음으로 하전된 아미노산으로 치환함으로써, VH 및/또는 VL의 프레임워크 구역 내에서 변형된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  14. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드 프리힌지 구역은 아미노산 서열 SSS 또는 SST를 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 힌지 구역 및 불변 구역을 더 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 4의 폴리펩타이드보다 적어도 1 pI 단위가 낮은 경험적 등전점을 갖는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  17. 제1항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 인간화 항체, 단쇄 Fv(scFv) 또는 SMIP인 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  18. 제15항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 상기 CD3 결합 도메인, 상기 힌지 구역 및 상기 불변 구역을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  19. 제15항에 있어서, 상기 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 상기 불변 구역, 상기 힌지 구역 및 상기 CD3 결합 도메인을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  20. 제15항에 있어서, 상기 결합 폴리펩타이드는 제2 결합 도메인을 더 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 상기 CD3 결합 도메인, 상기 힌지 구역, 상기 불변 구역 및 상기 제2 결합 도메인을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  22. 제20항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 상기 제2 결합 도메인, 상기 힌지 구역, 상기 불변 구역 및 상기 CD3 결합 도메인을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  23. 제15항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 이종이합체화 도메인을 더 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  24. 제23항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는, 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 상기 CD3 결합 도메인, 상기 힌지 구역, 상기 불변 구역 및 상기 이종이합체화 도메인을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 제2 결합 도메인을 더 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 표적 분자에 결합하거나 표적 분자와 상호작용하고, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 T-세포 세포독성을 유도하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 종양 관련 항원에 결합하거나 종양 관련 항원과 상호작용하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  28. 제27항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 T-세포가 종양 세포를 용해시키도록 유도하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  29. 제27항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 종양 근처에서 다클론성 T-세포 활성화 및 증식을 유도하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 관련 항원은 RON, c-Met, CEACAM-6, PSMA, EpCAM, CEA, PCTA-1, STEAP-1, STEAP-2, PSCA, PSA, PAP, ALCAM(CD166), PECAM-1, EphA2, CD151, CA-125/MUC16, MUC-1, MAGE-1, TROP2, IGF1 R, TGFBR2, GHRHR, GHR, IL-6R, gp130, TNFR2, OSMRβ, 패치드(Patched)-1, 프리즐드(Frizzled), 로보(Robo)1, LTβR, CD25, CD26, CD27, CD30, CD33, CD44, CD44v6, CD63, CD80, CD81, CD86, CD100, CD151, CXCR4, CCR5, HER-2/ErbB1, HER-3/ErbB3, HER-4/ErbB4, EGFR/ErbB1, EGFRvIII 동형단백질, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5b, MUC7, βhCG, 루이스(Lewis)-Y, 강글리오사이드 GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, 글로보(Globo) H, 퓨코실(fucosyl) GM1, 폴리 SA, GD2, 탄산무수화효소 IX(MN/CA IX), 소닉 헤지호그(Shh), Wue-1, 혈장 세포 항원, (막-결합) IgE, 흑색종 황산 콘드로이틴 프로테오글라이칸(MCSP), CCR8, TNF-알파 전구체, 메소텔린, A33 항원, Ly-6; 데스모글레인 4, E-카데린 네오에피토프, 태아 아세틸콜린 수용체, CA19-9 마커, 뮐러 억제 물질(MIS) 수용체 II형, sTn(시알릴화 Tn 항원; TAG-72), FAP(섬유아세포 활성화 항원), 엔도시알린, LG, SAS, BCMA, TWEAKR/Fn14, FGFR4, VEGFR1, VEGFR2, SSX1 및 SSX2로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 결합 도메인은 T-세포 상의 T-세포 수용체 복합체의 CD3ε 하위단위에 결합하거나 해당 CD3ε 하위단위와 상호작용하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 T-세포 수용체 복합체의 내재화를 유도하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 결합 도메인은 쥣과 크리스(Cris)-7 단클론성 항체 또는 HuM291로부터 유래한 인간화 CD3 결합 도메인인 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  34. 제33항에 있어서, 상기 CD3 결합 도메인은 쥣과 크리스-7 항체 또는 HuM291의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  35. 제1항에 있어서, 상기 CD3 결합 도메인은 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 38 및 서열 번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 구역 서열 또는 VL 구역 서열을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  36. 제1항에 있어서, 상기 CD3 결합 도메인은 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30 및 서열 번호 32로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 구역 및 서열 번호 38 및 서열 번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 구역을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  37. 제1항에 있어서, 상기 CD3 결합 도메인은 서열 번호 28, 서열 번호 30 및 서열 번호 32로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 구역 및 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38 및 서열 번호 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 구역을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  38. 제2항에 있어서, 상기 VH 구역은 서열 번호 28을 포함하고, 상기 VL 구역은 서열 번호 34를 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  39. 제2항에 있어서, 상기 VH 구역은 서열 번호 28을 포함하고, 상기 VL 구역은 서열 번호 38을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  40. 제2항에 있어서, 상기 VH 구역은 서열 번호 26을 포함하고, 상기 VL 구역은 서열 번호 38을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  41. 제9항 및 제14항에 있어서, 상기 VH 구역은 서열 번호 26을 포함하고, 상기 VL 구역은 서열 번호 34를 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  42. 제1항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18 및 서열 번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  43. 제1항에 있어서, 상기 CD3 결합 도메인은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 중쇄 CDR3은 서열 번호 51을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  44. 제43항에 있어서, 상기 중쇄 CDR1은 서열 번호 49를 포함하고, CDR2는 서열 번호 50을 포함하며, CDR3은 서열 번호 51을 포함하고, 경쇄 CDR1은 서열 번호 52를 포함하며, CDR2는 서열 번호 53을 포함하고, CDR3은 서열 번호 54를 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  45. 제15항에 있어서, 상기 불변 구역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD 또는 이들의 임의의 조합의 CH2 및 CH3 도메인; IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM 또는 이들의 임의의 조합 면역글로불린 CH3 도메인; 또는 IgE, IgM 또는 이들의 조합의 면역글로불린 CH3 및 CH4 도메인을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  46. 제15항에 있어서, 상기 불변 구역은 CH2 및 CH3을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  47. 제15항에 있어서, 상기 불변 구역은 CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 실질적으로 이루어진 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 구역은 효과기(effector) 기능을 감소시키거나 제거하도록 변형된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  49. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 구역은 보체를 고정하지 않도록 변형된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  50. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불변 구역은 Fcγ 수용체에 결합하지 않도록 변형된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  51. 제50항에 있어서, 상기 Fcγ 수용체는 CD16, CD32 및 CD64로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  52. 제15항에 있어서, 상기 불변 구역은 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 임의의 하나의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산.
  54. 서열 번호 5, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 27 및 서열 번호 37로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는 단리된 핵산.
  55. 제53항 또는 제54항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  56. 제32항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  57. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 CD3 결합 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  58. 암 또는 자가면역 장애를 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 제57항의 조성물 또는 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항의 CD3 결합 폴리펩타이드를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  59. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD3 결합 폴리펩타이드는 이합체를 형성하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  60. 제59항에 있어서, 상기 이합체는 동종이합체 또는 이종이합체인 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  61. 제3항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산 변형은 크리스-7 VL Jk 구역 마우스 서열 LQIT(서열 번호 252)와 비교하여 VL 구역의 J 카파(Jk) 구역 내에 있는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  62. 제61항에 있어서, 상기 Jk 구역은 아미노산 서열 VEIK(서열 번호 253)를 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  63. 제25항에 있어서, 상기 제2 결합 도메인은 서열 번호 212의 1-107번 및 124-243번 아미노산; 서열 번호 226의 1-107번 및 124-243번 아미노산; 서열 번호 216의 1-107번 및 124-243번 아미노산; 및 서열 번호 196의 1-111번 및 128-251번 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  64. 제1항에 있어서, 상기 결합 폴리펩타이드는 서열 번호 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 186, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204 또는 206과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  65. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 이종이합체의 일부인 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  66. 제65항에 있어서, 상기 이종이합체는 단쇄 폴리펩타이드의 쌍을 포함하고, 상기 단쇄 쌍은 서열 번호 210 및 247, 서열 번호 210 및 218, 서열 번호 210 및 220, 서열 번호 208 및 249, 서열 번호 208 및 222 또는 서열 번호 208 및 224, 서열 번호 212 및 218, 서열 번호 216 및 222, 서열 번호 228 및 226 또는 서열 번호 214 및 218로부터 선택되는 쌍과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
  67. 제1항에 있어서, 상기 CD3 결합 도메인은 서열 번호 41과 약 90% 내지 약 99% 동일한 것인 CD3 결합 폴리펩타이드.
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