CN110655578A - 诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明人发现，在给予了含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子的生物体中，诱导了针对该抗原的免疫应答。此外，本发明人发现，在给予了含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子的生物体中，诱导了针对该抗原的免疫应答的同时，还兼具针对表达该抗原结合分子所结合的抗原的外源生物物种或癌细胞等的损伤作用或生长抑制作用。

Description

诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原结合分子
本申请是国际申请号PCT/JP2012/075043，国际申请日2012年9月28日，中国申请号201280058767.9，发明名称为“诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原结合分子”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明提供含有诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原结合分子作为有效成分的药物组合物或使用该药物组合物的治疗方法。此外，提供含有以下抗原结合分子作为有效成分的药物组合物或使用该药物组合物的治疗方法：在诱导上述免疫应答的同时，兼具针对表达靶抗原的细胞的损伤作用(细胞毒活性)或生长抑制作用(细胞生长抑制活性)的抗原结合分子。
背景技术
迄今尝试开发面向肿瘤细胞的多种治疗疫苗。这是因为，由于存在可被生物体的免疫***识别的、据信在肿瘤细胞和正常细胞之间存在的质的或量的差异，所以认为通过利用这样的差异(新表位(neoepitope))的疫苗所致的主动的、特异性敏化作用刺激的免疫***可识别、排除肿瘤细胞。
为了引起这样的抗肿瘤应答，认为必须满足至少2个条件。第一，肿瘤细胞必须表达正常细胞中不出现的抗原，或者主要在质方面可区别正常细胞和肿瘤细胞的程度的抗原。第二，必须通过疫苗等活化以便免疫***与靶抗原反应。据信肿瘤的免疫疗法中的重大障碍是肿瘤的免疫原性特别是在人体中弱。
近年来，发现了可构成免疫***攻击对象的含有这样的新表位的肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。然而，一般认为，免疫***之所以不能排除表达有这些新表位的肿瘤，不是因为不存在新表位，而是针对这些新表位的免疫应答不充分。
为了以细胞为基础的癌的免疫疗法，开发了两种一般策略。一种是将在体外扩繁的肿瘤反应性T淋巴细胞再次移入患者的过继免疫疗法，另一种是以引起针对肿瘤抗原的新的或更强的免疫应答、导致***性肿瘤应答为目的使用肿瘤细胞的主动免疫疗法。
以主动免疫疗法为基础的肿瘤疫苗通过多种方法制备。为了诱导针对肿瘤抗原的免疫应答，制备了与卡介苗(Bacillus Calmette Guerin)(BCG)这样的免疫刺激佐剂混合的放射线照射肿瘤细胞(非专利文献1)，例如被遗传改变而产生细胞因子的肿瘤细胞(非专利文献2)、异质化的自体肿瘤细胞(非专利文献3)等。然而，肿瘤细胞的免疫原性低，据信其原因并非肿瘤抗原的质的问题，而是其量的问题。
另一方面，已知抗体通过将所结合的抗原交叉提呈给抗原提呈细胞来诱导针对抗原的体液免疫应答(产生针对抗原的抗体)和细胞免疫应答(产生针对抗原的CD8阳性T细胞)，有人报告了可通过给予抗体来诱导针对抗原的获得性免疫(非专利文献4)。最近，在小鼠体内模型中，抗HER2抗体所致的抗肿瘤效果显示，与所给予的抗体的直接的ADCC相比，通过给予抗体诱导的针对HER2抗原的获得性免疫发挥更为重要的作用(非专利文献5)。实际上，在作为针对HER2的IgG1亚类抗体药物的赫赛汀(Herceptin)的临床中，通过给予赫赛汀诱导获得性免疫，确认了针对HER2的体液免疫应答(非专利文献6)。在给予赫赛汀奏效的患者中可见特别是抗HER2抗体效价的上升，所以认为通过给予赫赛汀进行的获得性免疫诱导在抗肿瘤效果中发挥重要作用。
抗体因在血液中的稳定性高、副作用也少而作为药品引人注目(非专利文献7、非专利文献8)。对作为IgG类抗体的效应子功能的抗体依赖性细胞毒活性(以下记为ADCC)、补体依赖性细胞毒活性(以下记为CDC)的研究迄今多有进行，报告了在人IgG类中，IgG1亚类抗体具有最高的ADCC活性、CDC活性(非专利文献9)。此外，启示了作为IgG类抗体介导的靶细胞吞噬作用的抗体依赖性细胞介导性吞噬作用(ADCP)也是抗体的效应子功能之一(非专利文献10、非专利文献11)。由于可使IgG1亚类抗体对肿瘤发挥这些效应子功能，IgG1亚类抗体被用作针对癌抗原的大部分抗体药物。
IgG抗体为了介导ADCC、ADCP活性，IgG抗体的Fc区与杀伤细胞、天然杀伤细胞、活化的巨噬细胞等效应细胞表面上存在的抗体受体(以下记为FcγR)的结合是必要的。在人体中，作为FcγR蛋白家族报告了FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb的同种型，也报告了各自的同种异型(非专利文献12)。
ADCC和ADCP等细胞毒性的效应子功能增强作为有望用于增强抗癌抗体的抗肿瘤效果的手段而引人注目。对于以抗体的抗肿瘤效果为目的的FcγR介导的效应子功能的重要性，使用小鼠模型进行了报告(非专利文献13、非专利文献14)。此外，在人体中的临床效果与FcγRIIIa的高亲和性多型同种异型(V158)和低亲和性多型同种异型(F158)之间观察到关联(非专利文献15)。这些报告启示，具有与特定FcγR的结合优化了的Fc区的抗体介导更强的效应子功能，由此发挥更有效的抗肿瘤效果。抗体针对含有FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb的活化受体、含有FcγRIIb的抑制性受体的各自的亲和性的平衡是优化抗体效应子功能方面重要的要素。由于通过增强针对活化受体的亲和性可赋予抗体介导更强的效应子功能的性质(非专利文献16)，作为增强或提高针对癌抗原的抗体药物的抗肿瘤活性的抗体工程的方法迄今已有种种报告。
业已显示，对于Fc区和FcγR的结合，抗体的铰链区和CH2结构域内的数个氨基酸残基以及与CH2结构域结合的EU编号297位Asn上附加的糖链是重要的(非专利文献9、非专利文献17、非专利文献18)。以该结合处为中心，迄今研究了具有各种FcγR结合特性的Fc区变体，得到具有更高的针对活化FcγR的亲和性的Fc区变体(专利文献1、专利文献2)。例如，Lazar等人通过将人IgG1的EU编号239位Ser、330位Ala、332位Ile分别置换为Asn、Leu、Glu而成功地使人IgG1与人FcγRIIIa(V158)的结合增加至约370倍(非专利文献19、专利文献2)。该改变体与野生型相比，与FcγRIIIa和FcγIIb的结合比(A/I比)为约9倍。此外，Shinkawa等人通过使EU编号297位Asn上附加的糖链的岩藻糖缺失而成功地使与FcγRIIIa的结合增加至约100倍(非专利文献20)。通过这些方法，可大幅提高人IgG1相较于天然型人IgG1的ADCC活性。
如上所述通过抗体工程增强ADCC的方法多有报告，但是迄今使给予抗体对获得性免疫的诱导增强或提高的抗体工程方法没有报告。作为诱导针对癌抗原的获得性免疫的方法，报告了通过使欲诱导获得性免疫的癌抗原融合于与抗原提呈细胞中表达的DEC-205或高甘露糖受体结合的抗体来促进癌抗原摄入抗原提呈细胞中和抗原提呈的方法(非专利文献21)，但是，对于这些方法，并非上述抗HER2抗体那样抗体所结合的靶癌抗原。即，因为是诱导针对融合于抗体自身的癌抗原的获得性免疫的方法，所以抗体自身不能与癌抗原结合，具有不能对癌抗原发挥直接作用的缺点。此外，在该方法中，不仅诱导针对融合于抗体的癌抗原的获得性免疫，而且还诱导针对用于靶向抗原提呈细胞的抗体自身的获得性免疫，因而认为，由于抗药物抗体的出现与效果的减弱相关，故以治疗为目的则该方法是不优选的。
根据以上内容，虽然期望通过给予具有靶抗原结合活性的抗原结合分子来诱导针对该靶抗原的获得性免疫，但是通过这样的方法来增强或提高获得性免疫的工程方法未见报告。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2000/042072
专利文献2：WO2006/019447
非专利文献
非专利文献1：Oettgen，H.F.，and Old，L.J.，The history of cancerimmunotherapy.，Biological Therapy of Cancer(1991)87-119DeVita等编
非专利文献2：Zatloukal K，Schmidt W，Cotten M，Wagner E，Stingl G，Birnstiel ML.，Somatic gene therapy for cancer：the utility oftransferrinfection in generating′tumor vaccines′.，Gene(1993)135，199-207
非专利文献3：Bronte V，Tsung K，Rao JB，Chen PW，Wang M，Rosenberg SA，Restifo NP.，IL-2enhances the function of recombinant poxVirus-based vaccinesin the treatment of established pulmonary metastases.，J.Immunol.(1995)154，5282-5292
非专利文献4：Adams GP，Weiner LM.，Monoclonal antibody therapy ofcancer.，Nat.Biotechnol.(2005)23，1147-1157
非专利文献5：Park S，Jiang Z，Mortenson ED，Deng L，Radkevich-Brown O，YangX，Sattar H，Wang Y，Brown NK，Greene M，Liu Y，Tang J，Wang S，Fu YX.，Thetherapeutic effect of anti-HER2/neu antibody depends on both innate andadaptive immunity.，Cancer Cell(2010)18，160-170(2010)
非专利文献6：Taylor C，Hershman D，Shah N，Suciu-Foca N，Petrylak DP，TaubR，Vahdat L，Cheng B，Pegram M，Knutson KL，Clynes R.Augmented HER-2specificimmunity during treatment with trastuzumab and chemotherapy.，Clin.Caneer Res，(2007)13，5133-43
非专利文献7：Janice M Reichert，Clark J Rosensweig，Laura B Faden&Matthew C Dewitz，Monoclonal antibody successes in the clinic.，Nat.Biotechnol.(2005)23，1073-1078
非专利文献8：Pavlou AK，Belsey MJ.，The therapeutic antibodies marketto2008.，Eur.J.Pharm.Biopharm.(2005)59(3)，389-396
非专利文献9：Clark，M.，Antibody Engineering IgG Effector Mechanisms.，Chemical Immunology(1997)，65，88-110
非专利文献10：Horton HM，Bernett MJ，Pong E，Peipp M，Karki S，Chu SY，Richards JO，Vostiar I，Joyce PF，Repp R，Desjarlais JR，Zhukovsky EA.，Potemt inVitro and in vivo activity of an Fc-engineered anti-CD19monoclonal antibodyagainst lymphoma and leukemia.，CancerRes.(2008)68，8049-8057
非专利文献11：Zalevsky J，Leumg IW，Karki S，Chu SY，Zhukovsky EA，Desjarlais JR，Carmichael DF，Lawrence CE.，The impact of Fc engineering on ananti-CD19 antibody：increased Fcγreceptor affinity enhances B-cell clearingin nonhuman primates.，Blood(2009)113，3735-3743
非专利文献12：Jefferis R，Lund J.，Interaction sites on human IgG-FcforFcgammaR：current models.，Immuno1.Lett.(2002)82，57-65
非专利文献13：Clynes，R.，Yoshizumi，T.，Moroi，Y.，Houghton，A.N.，andRavetch，J.V.，Fc Receptors are required for passiVe and active immunity tomelanoma.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1998)95，652-656
非专利文献14：Clynes RA，Towers TL，Presta LG，Ravetch JV.，Inhibitory Fcreceptors modulate in ViVo cytoxicity against tumor targets.，Nat.Med.(2000)6，443-446
非专利文献15：Cartron G，Dacheux L，Salles G，Solal-Celigny P，Bardos P，Colombat P，Watier H.，Therapeutic actiVity of humanized anti-CD20monoclonalantibody and polymorphism in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene.，Blood(2002)99，754-758
非专利文献16：Nimmerjahn F，Ravetch JV.，Divergent immunoglobulin gsubclass actiVity through selectiVe Fc receptorbinding.，Science(2005)，310，1510-1512
非专利文献17：Greenwood J，Clark M，Waldmann H.，Structural motifsinvolved in human IgG antibody effector functions.，Eur.J.Immunol.23，1098-1104(1993)
非专利文献18：Morgan A，Jones ND，Nesbitt AM，Chaplin L，Bodmer MW，EmtageJS.，The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DRis necessary for C1q，Fc gamma RI and Fc gamma RIII binding.，Immunology(1995)86，319-324
非专利文献19：Lazar GA，Dang W，Karki S，Vafa O，Peng JS，Hyun L，Chan C，Chung HS，Eivazi A，Yoder SC，Vielmetter J，Carmichael DF，Hayes RJ，Dahiyat BI.，Engineered antibody Fc variants with enhancedeffector function.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103，4005-4010
非专利文献20：Shinkawa T，Nakamura K，Yamane N，Shoji-Hosaka E，Kanda Y，Sakurada M，Uchida K，Anazawa H，Satoh M，Yamasaki M，Hanai N，Shitara K.，Theabsence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows thecritical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity.，J.Biol.Chem.(2003)278，3466-3473
非专利文献21：Tsuji T，Matsuzaki J，Kelly MP，Ramakrishna V，Vitale L，HeLZ，Keler T，Odunsi K，Old LJ，Ritter G，Gnjatic S.，Antibody-Targeted NY-ESO-1toMannose Receptor or DEC-205In Vitro Elicits Dual Human CD8+and CD4+T CellResponses with Broad Antigen Specificity.，J.Immunol.(2011)186，1218-1827。
发明内容
发明要解决的课题
本发明鉴于上述情况而完成，其目的在于提供含有下述抗原结合分子作为有效成分的药物组合物或使用该药物组合物的治疗方法：通过给予被外源性生物物种感染的或罹患癌的对象诱导该对象的免疫应答的抗原结合分子。此外，提供含有以下抗原结合分子作为有效成分的药物组合物或使用该药物组合物的治疗方法：在诱导上述免疫应答的同时，兼具针对感染的外源性生物物种或癌细胞的损伤作用(细胞毒活性)或生长抑制作用(细胞生长抑制活性)的抗原结合分子。
解决课题的手段
本发明人发现，在给予了含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域的抗原结合分子的生物体中，诱导了针对抗原的免疫应答，所述抗原结合结构域针对该抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，所述FcRn结合结构域在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性。进一步地，本发明人发现，给予了含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域的抗原结合分子的生物体中，在诱导针对抗原的免疫应答的同时，可兼具针对表达该抗原结合分子所结合的抗原的外源性生物物种或癌细胞等的损伤作用或生长抑制作用，所述抗原结合结构域针对该抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，所述FcRn结合结构域在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性。本发明人基于上述发现明确了，本发明的抗原结合分子作为通过给予被外源性生物物种感染的或罹患癌的对象来诱导该对象的免疫应答的药物组合物有用。此外，本发明人明确了，本发明的抗原结合分子作为通过给予被外源性生物物种感染的或罹患癌的对象而诱导该对象的免疫应答的同时，兼具针对该外源性生物物种或癌细胞的损伤作用或生长抑制作用的药物组合物有用。此外，发现了这些药物组合物的制造方法。
即，本发明更具体地提供以下的[1]～[47]。
[1]诱导针对抗原的免疫应答的药物组合物，其中，该药物组合物包含含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域的抗原结合分子作为有效成分，所述抗原结合结构域对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，所述FcRn结合结构域在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性。
[2][1]的药物组合物，其中，所述离子浓度为钙离子浓度。
[3][2]的药物组合物，其中，所述抗原结合结构域为具有下述特征的抗原结合结构域：与低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性相比，高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高。
[4][1]的药物组合物，其中，所述离子浓度条件为pH条件。
[5][4]的药物组合物，其中，所述抗原结合结构域为具有下述特征的抗原结合结构域：与pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性相比，pH中性范围条件下的抗原结合活性高。
[6][1]～[5]中任一项的药物组合物，其中，所述抗原结合分子为具有针对所述抗原的中和活性的抗原结合分子。
[7][1]～[6]中任一项的药物组合物，其中，所述抗原结合分子为具有针对表达所述抗原的细胞的细胞毒活性的抗原结合分子。
[8][1]～[7]中任一项的药物组合物，其中，所述FcRn结合结构域包含抗体的Fc区。
[9][8]的药物组合物，其中，所述Fc区为下述Fc区：在Fc区的以EU编号表示的位点中，选自257位、308位、428位和434位的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区对应位点的氨基酸不同的Fc区。
[10][8]或[9]的药物组合物，其中，所述Fc区为含有Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
257位氨基酸为Ala，
308位氨基酸为Pro，
428位氨基酸为Leu，和
434位氨基酸为Tyr。
[11][8]～[10]中任一项的药物组合物，其中，所述Fc区的Fcγ受体结合活性具有下述特征：与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG Fc区的Fcγ受体结合活性相比高。
[12][11]的药物组合物，其中，所述Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。
[13][11]或[12]的药物组合物，其中，所述Fc区为下述Fc区：在Fc区中以EU编号表示的位点中，选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。
[14][11]～[13]中任一项的药物组合物，其中，所述Fc区为在Fc区中以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
221位氨基酸为Lys或Tyr中任一个，
222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中任一个，
224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中任一个，
227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中任一个，
231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
233位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
234位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
235位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
236位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
237位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
238位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
239位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中任一个，
243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中任一个，
244位氨基酸为His，
245位氨基酸为Ala，
246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
247位氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中任一个，
249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中任一个，
250位氨基酸为Glu或Gln中任一个，
251位氨基酸为Phe，
254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中任一个，
255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中任一个，
256位氨基酸为Ala、Met或Pro中任一个，
258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中任一个，
260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中任一个，
263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
264位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
265位氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中任一个，
266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
267位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
268位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中任一个，
269位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
270位氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
271位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
272位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
273位氨基酸为Phe或Ile中任一个，
274位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
275位氨基酸为Leu或Trp中任一个，
276位氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
278位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
279位氨基酸为Ala，
280位氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中任一个，
281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中任一个，
282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
283位氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中任一个，
284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中任一个，
285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中任一个，
286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中任一个，
288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中任一个，
290位氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或TITyr中任一个，
291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中任一个，
292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中任一个，
293位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
294位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
295位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
296位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中任一个，
297位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
298位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
299位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
300位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
302位氨基酸为Ile，
303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中任一个，
304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中任一个，
305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中任一个，
311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中任一个，
313位氨基酸为Phe，
315位氨基酸为Leu，
317位氨基酸为Glu或Gln，
318位氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中任一个，
320位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
322位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
323位氨基酸为Ile，
324位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
325位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
326位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
327位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
328位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
329位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
330位氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
331位氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
332位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
333位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中任一个，
334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中任一个，
335位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中任一个，
337位氨基酸为Glu、His或Asn中任一个，
339位氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中任一个，
376位氨基酸为Ala或Val中任一个，
377位氨基酸为Gly或Lys中任一个，
378位氨基酸为Asp，
379位氨基酸为Asn，
380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中任一个，
382位氨基酸为Ala或Ile中任一个，
385位氨基酸为Glu，
392位氨基酸为Thr，
396位氨基酸为Leu，
421位氨基酸为Lys，
427位氨基酸为Asn，
428位氨基酸为Phe或Leu中任一个，
429位氨基酸为Met，
434位氨基酸为Trp，
436位氨基酸为Ile，和
440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中任一个。
[15][11]～[14]的药物组合物，其中，所述天然型Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4中任一个的Fc区。
[16][11]～[15]中任一项的药物组合物，其中，所述Fc区是进行了下述修饰的Fc区：使得Fc区的EU编号297位连接的糖链组成为连接岩藻糖缺失糖链的Fc区比例变高、或附加有平分型N-乙酰葡糖胺(bisecting N-acetylglucosamine)的Fc区比例变高。
[17]诱导生物体的免疫应答的方法，其中，该方法包括将[1]～[16]的抗原结合分子给予该生物体内的步骤。
[18]诱导免疫应答的抗原结合分子的制造方法，其中，该方法包括：对含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子中所含的FcRn结合结构域赋予pH中性范围条件下的FcRn结合活性。
[19][18]的方法，其中，所述离子浓度为钙离子浓度。
[20][19]的方法，其中，所述抗原结合结构域为具有下述特征的抗原结合结构域：与低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性相比，高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高。
[21][18]的方法，其中，所述离子浓度条件为pH条件。
[22][21]的方法，其中，所述抗原结合结构域为具有下述特征的抗原结合结构域：与pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性相比，pH中性范围条件下的抗原结合活性高。
[23][18]～[22]中任一项的方法，其中，所述抗原结合分子为具有针对所述抗原的中和活性的抗原结合分子。
[24][18]～[23]中任一项的方法，其中，所述抗原结合分子为具有针对表达所述抗原的细胞的细胞毒活性的抗原结合分子。
[25][18]～[24]中任一项的方法，其中，所述FcRn结合结构域包含抗体的Fc区。
[26][25]的方法，其中，该方法包括：置换Fc区的以EU编号表示的位点中选自239位、252位、257位、286位、307位、308位、428位和434位的至少一个以上的氨基酸的步骤。
[27][25]或[26]的方法，其中，该方法包括：进行Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸置换的步骤：
257位氨基酸向Ala的置换，
308位氨基酸向Pro的置换，
428位氨基酸向Leu的置换，和
434位氨基酸向Tyr的置换。
[28][25]～[27]中任一项的方法，其中，该方法包括：使所述Fc区的Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG Fc区的Fcγ受体结合活性相比增强的步骤。
[29][28]的方法，其中，所述Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。
[30][28]或[29]的方法，其中，该方法包括置换Fc区中以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸的步骤：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。
[31][28]～[30]中任一项的方法，其中，该方法包括进行Fc区中以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸置换的步骤：
221位氨基酸向Lys或Tyr中任一个的置换，
222位氨基酸向Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个的置换，
223位氨基酸向Phe、Trp、Glu或Lys中任一个的置换，
224位氨基酸向Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个的置换，
225位氨基酸向Glu、Lys或Trp中任一个的置换，
227位氨基酸向Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个的置换，
228位氨基酸向Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个的置换，
230位氨基酸向Ala、Glu、Gly或Tyr中任一个的置换，
231位氨基酸向Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个的置换，
232位氨基酸向Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个的置换，
233位氨基酸向Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
234位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
235位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
236位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
237位氨基酸向Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
238位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
239位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
240位氨基酸向Ala、Ile、Met或Thr中任一个的置换，
241位氨基酸向Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中任一个的置换，
243位氨基酸向Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中任一个的置换，
244位氨基酸向His的置换，
245位氨基酸向Ala的置换，
246位氨基酸向Asp、Glu、His或Tyr中任一个的置换，
247位氨基酸向Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中任一个的置换，
249位氨基酸向Glu、His、Gln或Tyr中任一个的置换，
250位氨基酸向Glu或Gln中任一个的置换，
251位氨基酸向Phe的置换，
254位氨基酸向Phe、Met或Tyr中任一个的置换，
255位氨基酸向Glu、Leu或Tyr中任一个的置换，
256位氨基酸向Ala、Met或Pro中任一个的置换，
258位氨基酸向Asp、Glu、His、Ser或Tyr中任一个的置换，
260位氨基酸向Asp、Glu、His或Tyr中任一个的置换，
262位氨基酸向Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中任一个的置换，
263位氨基酸向Ala、Ile、Met或Thr中任一个的置换，
264位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个的置换，
265位氨基酸向Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
266位氨基酸向Ala、Ile、Met或Thr中任一个的置换，
267位氨基酸向Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
268位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中任一个的置换，
269位氨基酸向Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
270位氨基酸向Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个的置换，
271位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
272位氨基酸向Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
273位氨基酸向Phe或Ile中任一个的置换，
274位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
275位氨基酸向Leu或Trp中任一个的置换，
276位氨基酸向、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
278位氨基酸向Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个的置换，
279位氨基酸向Ala的置换，
280位氨基酸向Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中任一个的置换，
281位氨基酸向Asp、Lys、Pro或Tyr中任一个的置换，
282位氨基酸向Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个的置换，
283位氨基酸向Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中任一个的置换，
284位氨基酸向Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中任一个的置换，
285位氨基酸向Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中任一个的置换，
286位氨基酸向Glu、Gly、Pro或Tyr中任一个的置换，
288位氨基酸向Asn、Asp、Glu或Tyr中任一个的置换，
290位氨基酸向Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个的置换，
291位氨基酸向Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中任一个的置换，
292位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中任一个的置换，
293位氨基酸向Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
294位氨基酸向Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
295位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
296位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中任一个的置换，
297位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
298位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
299位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
300位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个的置换，
301位氨基酸向Asp、Glu、His或Tyr中任一个的置换，
302位氨基酸向Ile的置换，
303位氨基酸向Asp、Gly或Tyr中任一个的置换，
304位氨基酸向Asp、His、Leu、Asn或Thr中任一个的置换，
305位氨基酸向Glu、Ile、Thr或Tyr中任一个的置换，
311位氨基酸向Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中任一个的置换，
313位氨基酸向Phe的置换，
315位氨基酸向Leu的置换，
317位氨基酸向Glu或Gln的置换，
318位氨基酸向His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中任一个的置换，
320位氨基酸向Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
322位氨基酸向Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
323位氨基酸向Ile的置换，
324位氨基酸向Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
325位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
326位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
327位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
328位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
329位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
330位氨基酸向Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
331位氨基酸向Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
332位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
333位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中任一个的置换，
334位氨基酸向Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中任一个的置换，
335位氨基酸向Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
336位氨基酸向Glu、Lys或Tyr中任一个的置换，
337位氨基酸向Glu、His或Asn中任一个的置换，
339位氨基酸向Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中任一个的置换，
376位氨基酸向Ala或Val中任一个的置换，
377位氨基酸向Gly或Lys中任一个的置换，
378位氨基酸向Asp的置换，
379位氨基酸向Asn的置换，
380位氨基酸向Ala、Asn或Ser中任一个的置换，
382位氨基酸向Ala或Ile中任一个的置换，
385位氨基酸向Glu的置换，
392位氨基酸向Thr的置换，
396位氨基酸向Leu的置换，
421位氨基酸向Lys的置换，
427位氨基酸向Asn的置换，
428位氨基酸向Phe或Leu中任一个的置换，
429位氨基酸向Met的置换，
434位氨基酸向Trp的置换，
436位氨基酸向Ile的置换、和
440位氨基酸向Gly、His、Ile、Leu或Tyr中任一个的置换。
[32][28]～[31]中任一项的方法，其中，所述天然型Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4中任一个的Fc区。
[33][28]～[32]中任一项的方法，其中，该方法包括修饰所述Fc区的步骤，使得Fc区的EU编号297位连接的糖链组成为连接岩藻糖缺失糖链的Fc区比例变高、或附加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区比例变高。
[34]诱导免疫应答的药物组合物的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得高钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(b)获得低钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
[35]诱导免疫应答的药物组合物的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得高钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得低钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗体的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
[36]抗原结合分子的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得pH中性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(b)获得pH酸性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
[37]抗原结合分子的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得pH中性范围条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得pH酸性范围条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗体的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
[38][34]～[37]中任一项的方法，其中，所述抗原结合分子为具有针对所述抗原的中和活性的抗原结合分子。
[39][34]～[38]中任一项的方法，其中，所述抗原结合分子为具有针对表达所述抗原的细胞的细胞毒活性的抗原结合分子。
[40][34]～[39]中任一项的方法，其中，所述FcRn结合结构域包含抗体的Fc区。
[41][40]的方法，其中，所述Fc区为下述Fc区：在Fc区的以EU编号表示的位点中，选自257位、308位、428位和434位的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区对应位点的氨基酸不同。
[42][40]或[41]的方法，其中，所述Fc区为含有Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
257位氨基酸为Ala，
308位氨基酸为Pro，
428位氨基酸为Leu，和
434位氨基酸为Tyr。
[43][40]～[42]中任一项的方法，其中，所述Fc区的Fcγ受体结合活性具有下述特征：与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG Fc区的Fcγ受体结合活性相比高。
[44][43]的方法，其中，所述Fcγ受体为FcγRIa、FcγRIIa(R)、FcγRIIa(H)、FcγRIIb、FcγRIIIa(V)或FcγRIIIa(F)。
[45][43]或[44]的方法，其中，所述Fc区为含有Fc区中以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
221位氨基酸为Lys或Tyr中任一个，
222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中任一个，
224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中任一个，
227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中任一个，
231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
233位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
234位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
235位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
236位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
237位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
238位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
239位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中任一个，
243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中任一个，
244位氨基酸为His，
245位氨基酸为Ala，
246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
247位氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中任一个，
249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中任一个，
250位氨基酸为Glu或Gln中任一个，
251位氨基酸为Phe，
254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中任一个，
255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中任一个，
256位氨基酸为Ala、Met或Pro中任一个，
258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中任一个，
260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中任一个，
263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
264位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
265位氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中任一个，
266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
267位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
268位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中任一个，
269位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
270位氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
271位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
272位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
273位氨基酸为Phe或Ile中任一个，
274位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
275位氨基酸为Leu或Trp中任一个，
276位氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Prｏ、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
278位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
279位氨基酸为Ala，
280位氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中任一个，
281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中任一个，
282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
283位氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中任一个，
284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中任一个，
285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中任一个，
286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中任一个，
288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中任一个，
290位氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中任一个，
292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中任一个，
293位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
294位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
295位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
296位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中任一个，
297位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
298位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
299位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
300位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
302位氨基酸为Ile，
303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中任一个，
304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中任一个，
305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中任一个，
311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中任一个，
313位氨基酸为Phe，
315位氨基酸为Leu，
317位氨基酸为Glu或Gln，
318位氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中任一个，
320位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
322位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
323位氨基酸为Ile，
324位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
325位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
326位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
327位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
328位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
329位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
330位氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
331位氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
332位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
333位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中任一个，
334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中任一个，
335位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中任一个，
337位氨基酸为Glu、His或Asn中任一个，
339位氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中任一个，
376位氨基酸为Ala或Val中任一个，
377位氨基酸为Gly或Lys中任一个，
378位氨基酸为Asp，
379位氨基酸为Asn，
380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中任一个，
382位氨基酸为Ala或Ile中任一个，
385位氨基酸为Glu，
392位氨基酸为Thr，
396位氨基酸为Leu，
421位氨基酸为Lys，
427位氨基酸为Asn，
428位氨基酸为Phe或Leu中任一个，
429位氨基酸为Met，
434位氨基酸为Trp，
436位氨基酸为Ile，和
440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中任一个。
[46][43]～[45]中任一项的方法，其中，所述天然型Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4中任一个的Fc区。
[47][43]～[46]中任一项的方法，其中，所述Fc区是进行了下述修饰的Fc区：使得Fc区的EU编号297位连接的糖链组成为连接岩藻糖缺失糖链的Fc区比例变高、或附加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区比例变高。
发明效果
根据本发明，提供通过通常的抗体难以实现的药物组合物及其制造方法，该药物组合物含有通过其向生物体内的给予不仅可以发挥针对靶抗原的药理作用，而且可以诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原结合分子。由此，通过具有靶抗原结合活性、针对靶细胞的细胞毒活性和细胞生长抑制活性，同时诱导针对靶抗原的免疫应答，可实现通常的疫苗难以实现的有效的癌和感染症治疗。
附图说明
图1是示出可溶型人IL-6受体稳态模型中抗小鼠CD4抗体非给予组和给予组中小鼠血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化的图。横轴表示自给予抗小鼠CD4抗体经过的天数，纵轴表示血浆中可溶型人IL-6受体浓度。
图2是示出人IL-6受体免疫耐受正常小鼠模型中普通抗IL-6受体抗体和pH依赖性IL-6受体抗体给予组中小鼠血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化的图。横轴表示自给予抗IL-6受体抗体经过的天数，纵轴表示血浆中可溶型人IL-6受体浓度。黑色圆点表示对照小鼠血浆中可溶型人IL-6受体浓度。空心圆点表示给予了H54/L28-IgG1的小鼠血浆中可溶型人IL-6受体浓度，菱形表示给予了Fv4-IgG1的小鼠血浆中可溶型人IL-6受体浓度。
图3是示出人IL-6受体免疫耐受正常小鼠模型中增强了pH 7.4时的FcRn结合的普通抗IL-6受体抗体和增强了pH 7.4时的FcRn结合的pH依赖性IL-6受体抗体给予组中小鼠血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化的图。横轴表示自给予抗IL-6受体抗体经过的天数，纵轴表示血浆中可溶型人IL-6受体浓度。黑色圆点表示对照小鼠血浆中可溶型人IL-6受体浓度。空心圆点、菱形、空心三角形以及X和黑色四角形分别表示给予了H54/L28-IgG1、Fv4-IgG1、H54/L28-F157和Fv4-F157的小鼠血浆中可溶型人IL-6受体浓度。
图4是示出离子浓度依赖性抗原结合分子对可溶型抗原的溶酶体转移的非限定性作用模型的图。在血浆中的离子浓度条件下(pH中性范围或者高钙离子浓度条件下)，在血浆中与可溶型抗原结合的抗原结合分子(A)通过非特异性胞吞作用等被摄入细胞内(B)之后，经由FcRn结合结构域与转移的酸性内体中表达的FcRn在酸性pH条件下结合，与此同时，在内体内的离子浓度条件下(pH酸性范围或者低钙离子浓度条件下)，抗原解离(C)。解离的抗原转移到溶酶体后被分解(D)，另一方面，解离了抗原的抗原结合分子在与FcRn结合的状态下转移到细胞表面，在血浆中的中性pH条件下从FcRn上解离，返回血浆中(E)。
图5是示出具有pH 7.4的FcRn结合活性的抗原结合分子对可溶型抗原的溶酶体转移的非限定性作用模型的图。在血浆中离子浓度条件下(pH中性范围或者高钙离子浓度条件下)，在血浆中与可溶型抗原结合的抗原结合分子经由FcRn结合结构域在pH中性性条件下与FcRn结合(A)后，通过胞吞作用被摄入到细胞内(B)。转移到酸性内体内的抗原结合分子在内体内的离子浓度条件下(pH酸性范围或者低钙离子浓度条件下)不解离抗原(C)，与抗原结合的抗原结合分子在与FcRn结合的状态下再循环到细胞表面上(D)。
图6是示出增强了pH 7.4时的FcRn结合的离子浓度依赖性抗原结合分子对可溶型抗原的溶酶体转移的非限定性作用模型的图。在血浆中离子浓度条件下(pH中性范围或者高钙离子浓度条件下)，在血浆中与可溶型抗原结合的抗原结合分子经由FcRn结合结构域在pH中性性条件下与FcRn结合(A)后，通过胞吞作用被摄入到细胞内(B)。转移到酸性内体内的抗原结合分子在内体内的离子浓度条件下(pH酸性范围或者低钙离子浓度条件下)解离抗原(C)。解离的抗原转移到溶酶体后被分解(D)，另一方面，解离了抗原的抗原结合分子在与FcRn结合的状态下再循环到细胞表面上(E)。
图7是示出试验1的3只小鼠中Fv4-F157给予个体(#7、8和9)按个体的血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化和小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价变化的图。横轴表示自给予抗IL-6受体抗体经过的天数，左纵轴表示血浆中可溶型人IL-6受体浓度，右纵轴表示作为小鼠抗hsIL-6R抗体的抗体效价指标的ECL值。实线表示血浆中可溶型人IL-6受体浓度，虚线表示ECL值。菱形、空心四角形和三角形分别表示#7、8和9的个体血浆中可溶型人IL-6受体浓度的变化，X、黑色四角形和黑色圆点分别表示#7、8和9的个体中ECL值的变化。
图8是示出试验2的3只小鼠中Fv4-F157给予个体(＃10、11和12)按个体的血浆中可溶型人IL-6受体浓度变化和小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价变化的图。横轴表示自给予抗IL-6受体抗体经过的天数，左纵轴表示血浆中可溶型人IL-6受体浓度，右纵轴表示作为小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价指标的ECL值。实线表示血浆中可溶型人IL-6受体浓度，虚线表示ECL值。菱形、空心四角形和三角形分别表示#10、11和12的个体血浆中的可溶型人IL-6受体浓度，X、黑色四角形和黑色圆点分别表示#10、11和12的个体中ECL值的变化。
图9是示出试验1的3只小鼠中Fv4-F157给予个体(#7、8和9)按个体的小鼠抗hsIL-6R抗体的抗体效价变化和小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价变化的图。横轴表示自给予抗IL-6受体抗体经过的天数，纵轴表示作为小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价和小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价的指标的ECL值。实线表示作为小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价指标的ECL值的变化，虚线表示作为小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价指标的ECL值的变化。菱形、空心四角形和黑色三角形分别表示#7、8和9的个体中作为小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价指标的ECL值的变化，空心四角形、黑色四角形和空心三角形分别表示#7、8和9的个体中作为小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价指标的ECL值的变化。
图10是示出试验2的3只小鼠中Fv4-F157给予个体(＃10、11和12)按个体的小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价变化和小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价变化的图。横轴表示自给予抗IL-6受体抗体经过的天数，纵轴表示作为小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价和小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价的指标的ECL值。实线表示作为小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价指标的ECL值的变化，虚线表示作为小鼠抗hsIL-6R抗体的抗体效价指标的ECL值的变化。菱形、空心四角形和黑色三角形分别表示#10、11和12的个体中作为小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价指标的ECL值的变化，空心四角形、黑色四角形和空心三角形分别表示#10、11和12的个体中小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价指标的ECL值的变化。
图11是示出融合了靶抗原的抗体对癌细胞和抗原提呈细胞的非限定性作用机制模型的图。
图12是示出具有pH中性范围的FcRn结合活性、对靶抗原具有离子浓度依赖性结合活性的抗原结合分子对癌细胞和抗原提呈细胞的非限定性作用机制模型的图。
图13是示出钙依赖性结合抗体的血浆中(Ca2+2mM)和内体内(Ca2+3μM)的与抗原的相互作用方式(i)以及pH和钙依赖性结合抗体在血浆中(pH 7.4、Ca2+2mM)和内体内(pH6.0、Ca2+3μM)的与抗原的相互作用方式(ii)的图。
图14是示出包含人Vk5-2序列的抗体和包含改变了人Vk5-2序列中的糖链附加序列的hVk5-2_L65序列的抗体的离子交换层析的图。实线表示包含人Vk5-2序列的抗体(重链：CIM_H、SEQ ID NO：45，和轻链：hVk5-2、SEQ ID NO：50)的层析图，虚线表示具有hVk5-2_L65序列的抗体(重链：CIM_H(SEQ ID NO：45)、轻链：hVk5-2_L65(SEQ ID NO：53))的层析图。
图15是示出由导入了Ca依赖性地与抗原结合的抗体基因文库的大肠杆菌分离的克隆290的序列信息的氨基酸分布(表示为Library)与设计的氨基酸分布(表示为Design)的关系的图。横轴表示以Kabat编号表示的氨基酸的位点。纵轴表示氨基酸的分布比例。
图16是示出高钙离子浓度条件(1.2mM)下抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RC1IgG_010抗体、6RC1TgG_012抗体和6RC1IgG_019抗体的传感图的图。
图17是示出低钙离子浓度条件(3μM)下抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RC1IgG_010抗体、6RC1IgG_012抗体和6RC1IgG_019抗体的传感图的图。
图18是示出通过X射线晶体结构分析确定的6RL#9抗体的Fab片段的重链CDR3结构的图。(i)是示出钙离子存在的结晶条件下得到的晶体结构的重链CDR3的图，(ii)是示出钙离子不存在的结晶条件下得到的晶体结构的重链CDR3的图。
图19是示出H54/L28-IgG1抗体、FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的正常小鼠血浆中的抗体浓度变化的图。
图20是示出H54/L28-IgG1抗体、FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的正常小鼠血浆中的可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)的浓度变化的图。
图21是示出H54/L28-N434W抗体、FH4-N434W抗体和6RL#9-N434W抗体的正常小鼠血浆中的抗体浓度变化的图。
图22是示出H54/L28-N434W抗体、FH4-N434W抗体和6RL#9-N434W抗体的正常小鼠血浆中的可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)的浓度变化的图。
图23是示出由导入了pH依赖性地与抗原结合的抗体基因文库的大肠杆菌分离的克隆132的序列信息的氨基酸分布(表示为Library)与设计的氨基酸分布(表示为Design)的关系的图。横轴表示以Kabat编号表示的氨基酸的位点。纵轴表示氨基酸分布的比例。
图24是示出抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体的pH 7.4时的传感图的图。横轴表示时间，纵轴表示RU值。
图25是示出抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体的pH 6.0时的传感图的图。横轴表示时间，纵轴表示RU值。
图26是示出抗体非给予组、Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30和H54/L28-mF3给予组的平均血浆中hsIL-6R浓度变化的图。
图27是示出Fv4-mIgG1给予组的各个体的小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价变化的图。
图28是示出Fv4-mIgG2a给予组的各个体的小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价变化的图。
图29是示出Fv4-mF3给予组的各个体的小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价变化的图。
图30是示出Fv4-mFa30给予组的各个体的小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价变化的图。
图31是示出H54/L28-mF3给予组的各个体的小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价变化的图。
图32A是示意性示出小鼠白介素-6受体(Il6ra)基因的基因组DNA结构(1)与***的敲入载体(2)的关系的图。敲入载体具有全长人白介素-6受体(hIL6R)cDNA、hp7序列、加多腺苷酸信号和新霉素抗性基因。
图32B是示意性示出小鼠白介素-6受体基因的基因组DNA(a)与敲入载体(b)发生同源重组产生敲入的基因组DNA(c)的情况的图。还示出通过使重组酶Cre作用于(c)除去新霉素抗性基因盒而完成人白介素-6受体基因敲入等位基因(d)的过程。图中的箭头示出用于检测人白介素-6受体基因的敲入的引物的设定位置。
图33示出对通过人白介素-6受体基因敲入小鼠的确立过程得到的各基因型进行分析的PCR的代表例。
图34是示出人白介素-6受体基因敲入小鼠和野生型小鼠中白介素-6受体的基因表达特性的图。
图35是示出同型和异型的人白介素-6受体基因敲入小鼠和野生型小鼠的血浆中的可溶型人白介素-6受体(hsIL-6R)浓度的测定结果的图。KI/KI，KI/+和+/+分别表示同型敲入小鼠、异型敲入小鼠和野生型。
图36是示出野生型小鼠和同型的人白介素-6受体基因敲入小鼠中的对种特异性白介素-6(配体)的反应性的图。
具体实施方式
以下的定义和详细说明是为了易于理解本说明书中说明的本发明而提供。
氨基酸
本说明书中，以单字母码或三字母码或者该两种方式书写氨基酸，例如表示为Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V。
抗原
本说明书中对抗原无特别限定，只要是可通过诱导生物体的免疫应答而成为该生物体的免疫***的攻击对象的分子，就可以为任何抗原。作为抗原的实例，例如可适宜地列举肿瘤细胞特异性地表达而正常细胞不表达的分子(新表位)。此外，还适宜地列举细菌、病毒等感染生物体的外源性生物物种表达而生物体不表达的分子。所谓“肿瘤细胞特异性地表达而正常细胞不表达”或“感染生物体的外源性生物物种表达而生物体不表达”，表示“肿瘤细胞与正常细胞”或“感染生物体的外源性生物物种与生物体”之间存在分子的质或量的差异。例如，假设是正常细胞也表达、肿瘤细胞表达的量远大于该正常细胞表达的量的分子，那么在本发明中可以说该分子是在肿瘤细胞与正常细胞之间存在分子的量的差异。此外，假设由相同的氨基酸序列构成的多肽在肿瘤细胞和正常细胞中的表达量为相同程度，即便如此，当肿瘤细胞表达的多肽进行了磷酸化等翻译后修饰等，与之相比，正常细胞表达的多肽没有进行这样的修饰等时，在本发明中可以说该分子是在肿瘤细胞与正常细胞之间存在分子的质的差异。
作为该分子，可适宜地列举以下作为肿瘤抗原：ALK受体(多营养因子受体)、多营养因子；KS 1/4胰腺癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；***酸磷酸酯；***特异性抗原(PSA)；黑色素瘤相关抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)；***特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多形性上皮粘蛋白抗原；人乳脂肪球抗原；CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA等结肠直肠肿瘤相关抗原；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD19；人B淋巴瘤抗原-CD20；CD33；神经节苷酯GD2、神经节苷酯GD3、神经节苷酯GM2和神经节苷酯GM3等黑色素瘤特异性抗原；肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)；T抗原、DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的被膜抗原等由病毒诱导的肿瘤抗原；结肠的CEA、5T4癌胚滋养层糖蛋白和***癌胚抗原等癌胚抗原；甲胎蛋白；人肺癌抗原L6和L20等分化抗原；纤维肉瘤抗原；人白血病T细胞抗原-Gp37；拟糖蛋白；鞘脂；EGFR(上皮生长因子受体)等乳癌抗原；NY-BR-16、NY-BR-16和HER2抗原(p185HER2)；多形性上皮粘蛋白(PEM)；恶性人淋巴细胞抗原-APO-1；胎儿红细胞中存在的I抗原等分化抗原；成人红细胞中存在的原内胚层I抗原；移植前的胚；胃癌中存在的I(Ma)；乳腺上皮中存在的M18、M39；骨髓细胞中存在的SSEA-1；VEP8；VEP9；Myl；VIM-D5；结肠直肠癌中存在的D156-22；TRA-1-85(血型H)；睾丸和卵巢癌中存在的SCP-1；结肠癌中存在的C14；肺癌中存在的F3；胃癌中存在的AH6；Y半抗原；胚性癌细胞中存在的Ley；TL5(血型A)；A431细胞中存在的EGF受体；胰癌中存在的E1系列(血型B)；胚性癌细胞中存在的FC10.2；胃癌抗原；腺癌中存在的CO-514(血型Lea)；腺癌中存在的NS-10；CO-43(血型Leb)；A431细胞的EGF受体中存在的G49；结肠癌中存在的MH2(血型ALeb/Ley)；结肠癌中存在的19.9；胃癌粘蛋白；骨髓细胞中存在的T5A7；黑色素瘤中存在的R24；胚性癌细胞中存在的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1：22：25：8以及4～8细胞阶段的胚中存在的SSEA-3和SSEA-4；皮下T细胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；唾液酰Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12变体A；腺癌抗原ART1；副肿瘤性相关脑-睾丸癌抗原(癌神经抗原MA2、副肿瘤性神经抗原)；神经癌腹部抗原2(NOVA2)；血液细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b和MAGE-X2；癌-睾丸抗原(NY-EOS-1)；YKL-40和上述多肽中任一个的片段或对它们进行了修饰的结构等(前述的修饰磷酸基或糖链等)。
作为外源性生物物种的抗原，包括以下生物中表达的分子：炭疽杆菌(Bacillusanthracis)(炭疽杆菌、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、鼠疫耶氏菌(Yersiniapestis)、重型天花(Variola major)(天花)和其他痘病毒、兔热病杆菌(Francisellatularensis)(兔热病)和引起病毒性出血热的病毒、LCM、胡宁病毒(Junin virus)、马丘波病毒(Machupo virus)、瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)和引起拉沙热的病毒等的沙粒病毒(Arenavirus)、引起裂谷热的病毒等的布尼亚病毒(Bunyavirus)和汉坦病毒(Hantavirus)、杯状病毒(Calicivirus)、甲型、乙型和丙型肝炎、西尼罗病毒(West NileVirus)、拉克罗斯(LaCrosse)、加利福尼亚脑炎(Califomia encephalitis)、VEE、EEE、WEE、日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)等病毒性脑炎、科萨努尔森林病毒(Kyasanur ForestVirus)、蜱传出血热病毒(Tickborne hemorrhagic fever virus)、克里米亚刚果出血热病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic fever virus)、蜱传脑炎病毒(Tickborne encephalitis viruses)、黄热病(Yellow fever)、多药抗性TB、流感、其它立克次氏体和狂犬病、黄病毒(Flavirus)、登革热(Dengue)、纤丝病毒(Filovirus)、埃博拉(Ebola)、马尔堡类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Marburg Burkholderia pseudomallei)、Q热病原体(Coxiella burnetii)(Q热)、布鲁氏菌种(Brucella species)(布鲁氏菌病)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、蓖麻毒素(蓖麻(Ricinus communis)来源)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的ε毒素、葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcusenterotoxin B)、斑疹伤寒(Typhus fever)(普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii))、食品和水传播的病原体、腹泻原性大肠杆菌(Diarrheagenic E.coli)、病原性弧菌(Pathogenic Vibrios)、志贺氏菌(Shigella species)、沙门氏菌(Salmonella)、单核细胞增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、穿肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)等细菌；和小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、卡曼环孢子球虫(Cyclospora cayatanensis)、肠兰伯鞭毛虫(Giardia lamblia)、痢疾变形虫(Entamoeba histolytica)、弓形体(Toxoplasma)、微孢子虫(Microsporidia)等原生动物。
作为抗原，可例示如下所述的分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlvS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨蛋白(Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCRI、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子(衰变促进因子)、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxin 1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵胞激素、断裂因子、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生长抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp120V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-p、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、***1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C粘附因子、NCA 90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素-3、神经营养素-4或神经营养素-6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、***特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(TGF-β Pan Specific)、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF 10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK RFN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HVeA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RIICD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a黏附素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达病毒Y相关碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81，CD97，CD98，DDR1，DKK1，EREG、Hsp90，IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL，PCSK9，激肽释放酶原，RON，TMEM16F、SOD1，嗜铬粒蛋白A，嗜铬粒蛋白B、tau，VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1，C1q，C1r，C1s，C2，C2a，C2b，C3，C3a，C3b，C4，C4a，C4b，C5，C5a，C5b，C6，C7，C8，C9，因子B，因子D，因子H，备解素、壳硬蛋白(sclerostin)、血纤蛋白原，血纤蛋白，凝血酶原，凝血酶，组织因子，因子V，因子Va，因子VII，因子VIIa，因子VIII，因子VIIIa，因子IX，因子IXa，因子X，因子Xa，因子XI，因子XIa，因子XII，因子XIIa，因子XIII，因子XIIIa，TFPI，抗凝血酶III，EPCR，血栓调节蛋白、TAPI，tPA，纤溶酶原，纤溶酶，PAI-1，PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、LPA、S1P、乙酰胆碱受体、AdipoR1、AdipoR2、ADP核糖基环化酶-1、α-4/β-7整联蛋白、α-5/β-1整联蛋白、α-v/β-6整联蛋白、αvβ1整联蛋白、血管形成素配体-2、Angptl2、炭疽、钙粘蛋白、碳酸酐酶-IX、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51、CD70、CD72、Claudin 18、艰难梭菌毒素、CS1、δ-样蛋白配体4、DHICA氧化酶、Dickkopf-1配体、二肽基肽酶IV、EPOR、RSV的蛋白F、因子Ia、FasL、叶酸盐受体α、胰高血糖素受体、胰高血糖素-样肽1受体、谷氨酸羧肽酶II、GMCSFR、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、铁调素(Hepcidin)、IL-17受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-3受体、Kit酪氨酸激酶、富亮氨酸α-2-糖蛋白1(LRG1)、溶鞘脂受体、膜糖蛋白OX2、间皮素(Mesothelin)、MET、MICA、MUC-16、髓鞘相关糖蛋白、神经毡蛋白-1、神经毡蛋白-2、Nogo受体、PLXNA1、PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B、PLXNB1、PLXNB2、PLXNB3、PLXNC1、PLXND1编程性细胞死亡配体1、前蛋白转化酶PC9、P-选择素糖蛋白配体-1、RAGE、Reticulon 4、RF、RON-8、SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F、SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SEMA6C、SEMA6D、SEMA7A、志贺样毒素II、1-磷酸-鞘氨醇受体-1、ST2、葡萄球菌脂膜酸、生腱蛋白、TG2、胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal1ymphoprotein)受体、TNF超家族受体12A、跨膜糖蛋白NMB、TREM-1、TREM-2、滋养层糖蛋白、TSH受体、TTR、微管蛋白、ULBP2以及用于激素和生长因子的受体。
表位
表示存在于抗原中的抗原决定簇的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。所以，例如表位可通过其结构来定义。另外，也可以通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位氨基酸残基来规定表位。另外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来规定表位。
线性表位是下述表位，其包含氨基酸一级序列得到识别的表位。线性表位在固有序列中典型地含有至少3个氨基酸，和最普通地含有至少5个、例如约8至约10个、6至20个氨基酸。
与线性表位相对地，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位氨基酸的一级序列并非是被识别表位的单一规定成分(例如，氨基酸的一级序列不需要被规定表位的抗体所识别的表位)。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白的三维结构。例如，蛋白分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链变得并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法包括例如：X射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照Epitope Mapping Protocols inMethods inMolecular Biology(1996)、第66卷、Morris(编)。
结合活性
下述例示了通过含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法，但通过含有针对IL-6受体以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法也可以基于下述例示而适宜实施。
例如，含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别存在于IL-6受体分子中的线性表位，可通过如下所示操作来确认。为了上述目的，合成了包含构成IL-6受体的胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。该肽可化学性地合成。或者，可以利用IL-6受体的cDNA中编码相当于胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。接着，对包含构成胞外结构域的氨基酸序列的线性肽、和含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对IL-6受体表达细胞的结合中的、线性肽造成的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。
另外，还可以如下所述来确认含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别立体结构表位。为了上述目的，制备了表达IL-6受体的细胞。可举出：含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子在与IL-6受体表达细胞接触时强烈地与该细胞结合，但该抗原结合分子与经固定化的包含构成IL-6受体胞外结构域的氨基酸序列的线性肽实质上不结合的情形等。这里，实质上不结合是指，对人IL-6受体表达细胞的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选30％以下、特别优选15％以下的结合活性。
作为测定含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对IL-6受体表达细胞的结合活性的方法，可举出例如：Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。即，可通过以IL-6受体表达细胞为抗原的ELISA或FACS(荧光活化细胞分选(fluorescence activatedcell sorting))的原理来进行评价。
在ELISA形式中，含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对IL-6受体表达细胞的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测多肽复合体添加至固定有IL-6受体表达细胞的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体，检测与细胞结合的被测抗原结合分子。或者在FACS中，制作被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于IL-6受体表达细胞的抗体结合效价(titer)，由此可以比较被测抗原结合分子对IL-6受体表达细胞的结合活性。
被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测出。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置：
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均为BD Biosciences公司的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter公司的商品名)。
例如，作为含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的优选测定方法的一例，可举出以下方法。首先，将表达IL-6受体的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分子用适宜的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接着，通过FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST Software(BD公司)进行分析而得的荧光强度，即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。
含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否与某抗原结合分子共有表位，可通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优选的交叉阻断试验。
具体地，在交叉阻断试验中，包被于微量滴定板的孔上的IL-6受体蛋白在候选竞争抗原结合分子的存在下或不存在下经孵育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IL-6受体蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对包被有IL-6受体蛋白的孔的结合活性越降低。
经由IL-6受体蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶结合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标记物质进行标记。具体地，公知的是放射标记或荧光标记等。
与在候选竞争抗原结合分子复合体的不存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20％、优选至少20-50％、进一步优选至少50％的含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位、或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。
在鉴定含有针对IL-6受体的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位，能够通过比较两抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。
作为这种测定结合活性的方法，例如，在前述ELISA形式中，可通过比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
另外，鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位可通过以下方法来评价。首先，制备表达IL-6受体的细胞和表达在表位中导入了突变的IL-6受体的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，用合适的缓冲液洗涤，向所得细胞悬浮液添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur(BD公司)来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST Software(BD公司)进行分析而得的荧光强度，即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。
本方法中，例如“实质上不与突变IL-6受体表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变IL-6受体的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的FACSCalibur时，所得的荧光强度可以使用CELL QUEST Software进行分析。由多肽复合体存在下和不存在下的几何平均值，通过下述计算式计算该比较值(ΔGeo-Mean)，由此可以求出抗原结合分子的结合造成的荧光强度的增加比例。
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(多肽复合体存在下)/Geo-Mean(多肽复合体不存在下)
将通过分析得到的、反映被测抗原结合分子对突变IL-6受体表达细胞的结合量的几何平均比较值(突变IL-6受体分子ΔGeo-Mean值)、与反映被测抗原结合分子对IL-6受体表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变IL-6受体表达细胞和IL-6受体表达细胞的ΔGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备为相互相同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别IL-6受体中的表位的抗原结合分子被用作对照抗原结合分子。
被测抗原结合分子相对于突变IL-6受体表达细胞的ΔGeo-Mean比较值只要小于被测抗原结合分子相对于IL-6受体表达细胞的ΔGeo-Mean比较值的至少80％、优选50％、进一步优选30％、特别优选15％，则认为“实质上不与突变IL-6受体表达细胞结合”。计算Geo-Mean值(几何平均)的计算式记载于CELL QUEST Software User'sGuide(BDbiosciences公司)。通过对比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。
抗原结合结构域
“抗原结合结构域”只要与目标抗原结合，则可以使用任意结构的结构域。作为这类结构域的实例，可优选举出例如：抗体的重链和轻链的可变区、生物体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸左右的被称为A结构域的组件(WO2004/044011、WO2005/040229)、含有与在细胞膜表达的糖蛋白纤连蛋白中的蛋白结合结构域10Fn3结构域的Adnectin(WO2002/032925)、以构成蛋白A的包含58个氨基酸的3个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域为框架的Affibody(WO1995/001937)、具有含33个氨基酸残基的转角和2个反向平行螺旋以及环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面露出的区域DARPins(DesignedAnkyrin Repeat proteins)(WO2002/020565)、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向扭曲的桶结构的单侧的4个环区域Anticalin等(WO2003/029462)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得性免疫***且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(VLR))的富亮氨酸残基重复(leucine-rich-repeat(LRR))组件反复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片层结构的凹陷区域(WO2008/016854)。作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv 2)”、“Fab”或“F(ab′)2”等。
本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同的表位可以存在于例如包含SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的蛋白中。或者，本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相互不同的表位结合。这里，不同的表位可以存在于例如包含SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的蛋白中。
特异性
特异性是指特异性地结合的分子一方的分子对于其一个或多个结合对象分子以外的分子不显示任何显著性结合的状态。另外，也可以用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位为特异性的情形。另外，抗原结合结构域所结合的表位含有在多个不同的抗原中时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。
抗体
本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制造得到的免疫球蛋白。抗体可从天然存在其的血浆、血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全地合成。作为抗体的实例，优选可举出免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚型。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本发明的抗体中可包含这些同种型中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
制造具有所期望结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示与IL-6受体结合的抗体(抗IL-6受体抗体)的制作方法。与IL-6受体以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示而适宜制作。
抗IL-6受体抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗IL-6受体抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包含：由杂交瘤产生的单克隆抗体、和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体进行了转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。应予说明，本申请发明的单克隆抗体包含“人源化抗体”和“嵌合抗体”。
产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下所示来制作。即，使用IL-6受体蛋白作为敏化抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。接着，通过通常的筛选方法筛选单克隆抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤。
具体地，单克隆抗体的制作例如如下所示地进行。首先，表达其核苷酸序列公开在SEQ ID NO：2中的IL-6受体基因，由此可得到由SEQ ID NO：1表示的IL-6受体蛋白，其用作敏化抗原用于抗体制备。即，将编码IL-6受体的基因序列***公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所期望的人IL-6受体蛋白。为了从培养上清中获得可溶型的IL-6受体，代替由SEQ ID NO：1表示的IL-6受体蛋白，表达了例如，如Mullberg等(J.Immunol.(1994)152(10)，4958-4968)所记载的可溶型IL-6受体、即，由SEQ ID NO：1表示的IL-6受体多肽序列中的第1至357个氨基酸构成的蛋白。另外，纯化的天然IL-6受体蛋白也可以同样地用作敏化抗原。
作为用于免疫哺乳动物的敏化抗原，可使用该纯化IL-6受体蛋白。另外，IL-6受体的部分肽也可以用作敏化抗原。此时，该部分肽也可以根据人IL-6受体的氨基酸序列通过化学合成获得。另外，也可以通过将IL-6受体基因的一部分整合至表达载体并进行表达来获得。进而，还可以使用蛋白分解酶分解IL-6受体蛋白来获得，用作部分肽的IL-6受体肽的区域和大小并不特别限于特定的方案。对于优选的区域，可以从SEQ ID NO：1的氨基酸序列中相当于第20-357个氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为敏化抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体地，可以将8～50、优选10～30个残基的肽用作敏化抗原。
另外，也可以将IL-6受体蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作敏化抗原。为了制造用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作：将编码所期望的两种或更多的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如前所述地***表达载体。融合蛋白的制作方法记载于Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook，J et al.，Molecular Cloning 2nd ed.，9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。用作敏化抗原的IL-6受体的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等中。
作为用该敏化抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性来选择。通常优选使用啮齿类的动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠，或兔、猴等。
按照公知的方法将上述动物用敏化抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过注射将敏化抗原给予至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体地，将用PBS(磷酸缓冲盐水(Phosphate-Buffered Saline))或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的敏化抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该敏化抗原对哺乳动物每4至21日给予数次。另外，敏化抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作敏化抗原时，有时期望将与白蛋白、匙孔
Figure BDA0002222475850000571
血蓝蛋白等载体蛋白结合的该敏化抗原肽进行免疫。
另外，产生所期望抗体的杂交瘤可通过使用DNA免疫，如下所示来制作。DNA免疫是指下述免疫方法：被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，敏化抗原在该免疫动物的生物体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下优越性：
-能够维持如IL-6受体的膜蛋白的结构而赋予免疫刺激
-无需纯化免疫抗原。
为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达IL-6受体蛋白的DNA。编码IL-6受体的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA***适当的表达载体，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予生物体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金粒子用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别IL-6受体的抗体的制作也可以采用国际公开WO2003/104453中记载的方法来制作。
如此将哺乳动物免疫，确认血清中与IL-6受体结合的抗体效价的上升后，从哺乳动物采集免疫细胞用于细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。
作为与前述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物指的是赋予细胞能够在特定培养条件下存活(或死亡)的性质。选择标记物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称为HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称为TK缺陷)等。具有HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会生长。
HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞各自可通过含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5′-溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称为G418抗性的选择标记物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
作为这类骨髓瘤细胞，可优选使用，例如，P3(P3x63Ag8.653)(J.immunol.(1979)123(4)，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7)，511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3)，405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685)，269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2)，1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1)，313-323)、R210(Nature(1979)277(5692)，131-133)等。
基本上，根据公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等，进行前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体地，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施前述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而为了提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂使用。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞为1至10倍。作为用于前述细胞融合的培养液，使用例如适于前述骨髓瘤细胞株的生长的RPMI1640培养液、MEM培养液以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(FCS)等血清补液。
对于细胞融合，将前述免疫细胞和骨髓瘤细胞在前述培养液中以规定量充分混合，将预先加热至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)通常以30至60％(w/v)的浓度添加。通过缓缓混合混合液，形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
这样得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
如此得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标记物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT或TK缺陷的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地生长。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体地，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。接着，可通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，与IL-6受体结合的单克隆抗体可以与细胞表面表达的IL-6受体结合。这类单克隆抗体可通过例如FACS(荧光活化细胞分选(fluorescence activated cell sorting))来筛选。FACS是可以通过用激光分析与荧光抗体接触的细胞并测定各细胞发出的荧光来测定抗体对细胞表面的结合的***。
为了利用FACS来对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达IL-6受体的细胞。优选用于筛选的细胞是强制表达IL-6受体的哺乳动物细胞。作为对照，通过使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞，可以选择性地检测出抗体对细胞表面的IL-6受体的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、而与IL-6受体强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，可以获得产生IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤。
或者，可以基于ELISA的原理来评价抗体对固定化的IL-6受体表达细胞的结合活性。例如，将IL-6受体表达细胞固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定化细胞接触，检测与固定化细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。通过这些筛选选择出的、产生对抗原具有结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释方法等进行克隆。
这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。
按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有相容性的哺乳动物并使其生长，从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于获得高纯度的抗体。
也可以适宜地使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因整合至适当的载体中，导入宿主，由此表达由该基因所编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等确立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3)，767-775)。另外，如下所述的重组抗体的制造方法也是公知的。
例如，由产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IL-6受体抗体的可变区(V区)的cDNA。为此，通常首先从杂交瘤提取总RNA。作为用于从细胞提取mRNA的方法，例如，可使用如下所述的方法：
-胍超离心法(Biochemistry(1979)18(24)，5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1)，156-159)。
提取的mRNA可使用mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience制)等进行纯化。或者还市售有QuickPrep mRNA Purification Kit(GE Healthcare Bioscience制)等这样的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒。使用这种试剂盒，可从杂交瘤获得mRNA。可以由所得mRNA，使用反转录酶来合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工业社制)等合成。另外，为了cDNA的合成和扩增，可以适宜采用使用了SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制)和PCR的5’-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23)，8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8)，2919-2932)。进而，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。
从所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，对于该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列，可以通过公知的方法，例如，双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5’-RACE法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先，将从杂交瘤细胞提取的RNA作为模板来合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。5'-RACE cDNA文库的合成中可适宜地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。
以所得的5’-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的碱基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(RocheDiagnostics)等市售试剂盒来预先确定亚类。
具体地，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用下述引物，其能够扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因。为了扩增IgG的可变区基因，通常，3′侧的引物采用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5′侧的引物则采用5’RACE cDNA文库制作试剂盒所附带的引物。
采用这样扩增得到的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白针对IL-6受体的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如，为了获得针对IL-6受体的抗体时，进一步优选抗体对IL-6受体的结合是特异性的。与IL-6受体结合的抗体可例如如下所述进行筛选；
(1)使包含由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与IL-6受体表达细胞接触的步骤，
(2)检测IL-6受体表达细胞与抗体的结合的步骤，和
(3)选择与IL-6受体表达细胞结合的抗体的步骤。
检测抗体和IL-6受体表达细胞的结合的方法是公知的。具体地，通过如前所述的FACS等方法，可检测出抗体与IL-6受体表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适宜利用IL-6受体表达细胞的固定标本。
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可适宜采用淘选法，其利用了噬菌体载体。从多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库的形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因***噬菌体载体，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原结合的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所期望结合活性的scFv。
得到目标的编码抗IL-6受体抗体的V区的cDNA后，通过识别***该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶，将该cDNA消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现频率低的碱基序列。进而，为了将1拷贝的消化片段以正确方向***载体，优选***能提供粘性末端的限制酶。将如上所述消化的编码抗IL-6受体抗体的V区的cDNA***适当的表达载体，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区)的基因、和编码前述V区的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中***前述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，可在保持有编码所期望抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧适宜地配置消化前述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。
为了制造抗IL-6受体单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因整合至表达载体中。用于表达抗体的表达调控区包含例如增强子和启动子。另外，可以在氨基末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO：3)的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗IL-6受体抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别整合于不同的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体共转化(co-transfect)相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，也可以将编码H链和L链的DNA整合于单一表达载体中，并用其转化宿主细胞(参照国际公开WO 1994/11523)。
用于将分离的抗体基因导入适当的宿主来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达***均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体地，动物细胞可例示下述细胞：
(1)哺乳类细胞：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero、HEK(人胎儿肾)293等
(2)两栖类细胞：非洲爪蟾***等
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。
或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达***。植物细胞的转化中，可以适宜使用进行了愈伤组织培养的细胞。
进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞：
-酵母：酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属
-丝状真菌：黑曲霉菌(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属。
另外，利用原核细胞的抗体基因表达***也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适宜利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。
除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以从导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内***编码乳汁中固有产生的蛋白的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有***了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎，再将该进行了注入的胚胎导入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(Bio/Technology(1994)，12(7)，699-702)。
对人给予本说明书中记载的多肽复合体时，作为该复合体中的抗原结合结构域，可以适宜采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，该基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工修饰。基因重组型抗体包含例如人源化(Humanized)抗体等。这些修饰抗体可使用公知方法适宜制造。
为了制作本说明书中记载的多肽复合体的抗原结合结构域而使用的抗体的可变区通常由被4个框架区域(FR)夹持的3个互补决定区(complementarity-determiningregion；CDR)构成。CDR是实质上决定抗体结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便是在具有不同结合特异性的抗体之间也多显示高度的同一性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体。
人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体地，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体地，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重叠延伸PCR。重叠延伸PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的碱基序列。针对4个FR分别准备引物。通常，对于将小鼠CDR移植到人FR中，选择与小鼠FR同一性高的人FR，在维持CDR功能方面被认为有利。即，通常优选使用下述人FR，其包含与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。
另外，连接的碱基序列被设计为相互框内连接。通过各引物单独地合成人FR。结果得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列被设计为相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR通过小鼠CDR序列而连接。
最终3个CDR和4个FR连接得到的V区基因，通过会与其5′末端和3′末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上所述得到的DNA和编码人抗体C区的DNA以进行框内融合的方式***表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。
通过定性或者定量地测定并评价如上所述制作的人源化抗体对抗原的结合活性，可以适宜地选择人抗体FR，以便通过CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适抗原结合位点的方式来置换FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR导入氨基酸序列的突变。具体地，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分碱基序列的突变。通过这类引物合成的FR中导入了碱基序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸置换的突变型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望性质的突变FR序列(Cancer Res.，(1993)53，851-856)。
此外，将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所期望的人抗体。
进而，使用人抗体文库通过淘选法获得人抗体的技术也是已知的。例如，人抗体的V区以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区序列与所期望的人抗体C区序列框内融合后，***适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适宜表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。
另外，作为获得抗体基因的方法，除了上述之外，还可适宜地使用如Bernasconi等(Science(2002)298，2199-2202)或WO2008/081008中记载的B细胞克隆(各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体(特别是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的表达载体构建用的用途等)的方法。
EU编号和Kabat编号
根据本发明中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute ofHealth，Bethesda，Md.，1987年和1991年)。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表示。
离子浓度条件
金属离子浓度条件
本发明的非限定性的一个方案中，离子浓度是指金属离子浓度。“金属离子”是指属于除了氢以外的碱金属和铜族等第I族、碱土类金属和锌族等第II族、除了硼之外的第III族、除了碳和硅之外的第1V族、铁族和铂族等第VIII族、V、VI和VII族的各A亚族的元素、以及锑、铋、钋等金属元素的离子。金属原子具有释放出原子价电子而形成阳离子的性质，称这为离子化倾向。认为离子化倾向大的金属富有化学活性。
作为本发明中优选的金属离子的实例，可举出钙离子。钙离子参与许多生命现象的调节，钙离子参与骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收缩，白细胞的运动和吞噬等的活化，血小板的变形和分泌等的活化，淋巴细胞的活化，组胺的分泌等肥大细胞的活化，儿茶酚胺α受体或乙酰胆碱受体介导的细胞应答，胞吐作用，递质从神经元末端的释放，神经元的轴浆流等。作为细胞内的钙离子受体，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，其结合模体也大多已知。还熟知例如，钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。
本发明中，在金属离子为钙离子时，作为钙离子浓度条件，可举出低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件。结合活性随钙离子浓度条件而变化是指，低钙离子浓度和高钙离子浓度条件的不同导致抗原结合分子对抗原的结合活性发生变化。可举出例如，高钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性高于低钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。此外还可举出，低钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性高于高钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。
本说明书中，高钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自100μM至10mM之间的浓度。此外，在其他方案中，可以是选自200μM至5mM之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自500μM至2.5mM之间的浓度，在其他的方案中也可以是选自200μM至2mM之间的浓度。进而，还可以是选自400μM至1.5mM之间的浓度。特别优选可举出选自与生物体内血浆中(血中)的钙离子浓度接近的500μM至2.5mM之间的浓度。
本说明书中，低钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自0.1μM至30μM之间的浓度。此外，在其他方案中，可以是选自0.2μM至20μM之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自0.5μM至10μM之间的浓度，在其他的方案中也可以是选自1μM至5μM之间的浓度。进而，还可以是选自2μM至4μM之间的浓度。特别优选可举出选自与生物体内的早期内体内的离子化钙浓度接近的1μM至5μM之间的浓度。
本发明中，低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性意指，抗原结合分子在选自0.1μM至30μM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于选自100μM至10mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。优选意指抗原结合分子在选自0.5μM至10μM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自200μM至5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性，特别优选意指生物体内的早期内体内的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于生物体内的血浆中的钙离子浓度下的抗原结合活性，具体意指抗原结合分子在选自1μM至5μM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自500μM至2.5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。
抗原结合分子对抗原的结合活性是否随金属离子浓度条件而变化可以通过使用例如前述结合活性项目中所记载的公知测定方法来确定。例如，为了确认与低钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性相比高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性变得更高，对低钙离子浓度和高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性进行比较。
进而，本发明中，“低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”的表述也可以表述为抗原结合分子的高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于低钙离子浓度条件下的抗原结合活性。应予说明，本发明中有时也将“低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”记载为“低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”，此外，有时也将“使低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”记载为“使低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”。
本领域技术人员可以适宜选择测定抗原结合活性时的钙离子浓度以外的条件，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合分子和抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片流过作为分析物的抗原，由此可以评价对可溶型抗原的结合活性，在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片流过作为分析物的抗原结合分子，由此可以评价对膜型抗原的结合活性。
本发明的抗原结合分子中，只要低钙离子浓度条件的抗原结合活性弱于高钙离子浓度条件的抗原结合活性，则低钙离子浓度条件下的抗原结合活性和高钙离子浓度条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的低钙离子浓度条件的KD(Dissociation constant：解离常数)和高钙离子浓度条件的KD之比KD(Ca 3μM)/KD(Ca2mM)的值为2以上，进一步优选KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值为10以上，进一步优选KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值为40以上。KD(Ca 3μM)/KD(Ca 2mM)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。此外，也可规定KD(Ca3μM)/KD(Ca 1.2mM)的值。即，KD(Ca3μM)/KD(Ca 1.2mM)的值为2以上，进一步优选KD(Ca3μM)/KD(Ca1.2mM)的值为10以上，进一步优选KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2mM)的值为40以上。对KD(Ca 3μM)/KD(Ca 1.2mM)的值上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制备，就可以为400、1000、10000等任何值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD(解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)。KD(解离常数)和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、流式细胞仪等。
此外，作为示出本发明的抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性和高钙浓度条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可优选使用例如解离速率常数kd(Dissociation rate constant：解离速率常数)。代替KD(解离常数)而使用kd(解离速率常数)来作为示出结合活性之比的指标时，相对于抗原的低钙浓度条件下的kd(解离速率常数)和高钙浓度条件下的kd(解离速率常数)之比kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。Kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速率常数)，在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(Apparent dissociation rate constant：表观解离速率常数)。kd(解离速率常数)和表观kd(表观解离速率常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式细胞仪等。应予说明，本发明中，在测定不同钙离子浓度下的抗原结合分子的抗原结合活性时，钙浓度以外的条件优选为相同。
例如，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获得：
(a)获得低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤，和
(c)选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤。
进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得：
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体或其文库与抗原接触的步骤，
(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体置于低钙浓度条件下的步骤，和
(c)对在前述步骤(b)中发生解离的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
此外，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得：
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤，
(b)选择在前述步骤(a)中与抗原不结合的抗原结合结构域或抗体的步骤，
(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗体在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤，和
(d)对在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得：
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与固定有抗原的柱接触的步骤，
(b)将在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗体在低钙浓度条件下从柱洗脱的步骤，和
(c)对在前述步骤(b)中被洗脱的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得：
(a)在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库通过固定有抗原的柱的步骤，
(b)对在前述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗体进行回收的步骤，
(c)使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗体在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤，和
(d)对在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包含以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得：
(a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤，
(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体的步骤，
(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗体置于低钙浓度条件下的步骤，和
(d)对前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的标准的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
应予说明，前述步骤可以重复2次以上。所以，根据本发明可提供通过上述筛选方法中进一步包括将(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法而获得的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体。(a)～(c)或(a)～(d)的步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
本发明的筛选方法中，低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为0.1μM～30μM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出0.5μM～10μM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出生物体内的早期内体内的离子化钙浓度，具体可举出1μM～5μM下的抗原结合活性。另外，高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为100μM～10mM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出200μM～5mM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出生物体内的血浆中的离子化钙浓度，具体可举出0.5mM～2.5mM时的抗原结合活性。
抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜决定。抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可以作为KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparentdissociation constant：表观解离常数)、解离速率kd(Dissociation rate：解离速率常数)、或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速率常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、FACS等。
本发明中，选自高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤、与选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。
只要高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性，则高钙浓度条件下的抗原结合活性与低钙浓度条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选高钙浓度条件下的抗原结合活性是低钙浓度条件下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。
通过前述筛选方法筛选得到的本发明的抗原结合结构域或抗体可以是任意的抗原结合结构域或抗体，例如，可以筛选上述抗原结合结构域或抗体。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗体，也可以筛选氨基酸序列被置换的抗原结合结构域或抗体。
文库
根据一个方案，本发明的抗原结合结构域或抗体可以由文库获得，该文库主要由多种抗原结合分子形成，所述多种抗原结合分子的序列相互不同，并且其抗原结合结构域中含有至少一个离子浓度条件使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸残基。作为离子浓度的实例，优选可举出金属离子浓度或氢离子浓度。
本说明书中，“文库”是指多种抗原结合分子或含有抗原结合分子的多种融合多肽、或编码它们的序列的核酸、多核苷酸。文库中所含的多种抗原结合分子或含有抗原结合分子的多种融合多肽的序列并非单一的序列，而是序列相互不同的抗原结合分子或含有抗原结合分子的融合多肽。
本说明书中，序列相互不同的多种抗原结合分子的记载中的“序列相互不同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列相互不同。即，文库中的相互不同的序列的数量反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被视为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库为106至1012，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至1014。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体颗粒的实际数目通常比文库大小大10至10000倍。该过量倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至10000个。所以，本发明中的“序列相互不同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列相互不同，更具体意指序列相互不同的抗原结合分子存在106至1014个分子、优选107至1012个分子、进一步优选108至1011个分子、特别优选108至1012。
此外，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库这一记载中的术语“多种”，对于例如本发明的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒来说，通常是指这些物质的2种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面相互不同，则表示该物质存在2种以上。作为实例，可举出氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的突变体氨基酸。例如，当除了柔性残基以外或除了露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸以外，序列实质上相同，优选为相同序列的本发明的2个以上的抗原结合分子存在时，则本发明的抗原结合分子存在多个。在其他实施例中，当除了编码柔性残基的碱基以外或除了编码露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸的碱基以外实质上相同、优选为相同的序列的本发明的2个以上的多核苷酸分子存在时，则本发明的多核苷酸分子存在多个。
进而，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库的记载中的“主要由...形成”的表述反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合分子对抗原的结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的数量。具体地，优选表现出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在104个分子。此外，更优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在105个分子的文库中获得。进一步优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在106个分子的文库中获得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在107个分子的文库中获得。还优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在108个分子的文库中获得。其它表现中，也可适宜地表现为文库中的序列不同的独立克隆的数量中的抗原结合分子对抗原的结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的比例。具体地，本发明的抗原结合结构域可以由表现出这种结合活性的抗原结合分子占文库中序列不同的独立克隆的数量的0.1％至80％、优选0.5％至60％、更优选1％至40％、进一步优选2％至20％、特别优选4％至10％的文库中获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表现。此外，病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表现。
抗原结合结构域的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸
通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可用任意方法制备，例如，在金属离子为钙离子浓度的情形中，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库导入能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、或者在特定位置导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的文库等)等。
如前所述，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，例如，在金属离子为钙离子时，只要是形成钙结合模体的氨基酸即可，则不论其种类如何。钙结合模体是本领域技术人员所周知的，并且有详细记载(例如Springer等(Cell(2000)102，275-277)、Kawasaki和Kretsinger(Protein Prof.(1995)2，305-490)、Moncrief等(J.Mol.Evol.(1990)30，522-562)、Chauvaux等(Biochem.J.(1990)265，261-265)、Bairoch和Cox(FEBS Lett.(1990)269，454-456)、Davis(New Biol.(1990)2，410-419)、Schaefer等(Genomics(1995)25，638～643)、Economou等(EMBO J.(1990)9，349-354)、Wurzburg等(Structure.(2006)14，6，1049-1058))。即，本发明抗原结合分子中可以含有ASGPR，CD23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等任意的公知钙结合模体。作为这种钙结合模体的优选实例，除了上述之外，还可举出SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所述的抗原结合结构域中所含的钙结合模体。
此外，作为抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，也可优选使用具有金属螯合作用的氨基酸。作为具有金属螯合作用的氨基酸的实例，优选可举出例如：丝氨酸(Ser(S))、苏氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gln(Q))、天冬氨酸(Asp(D))和谷氨酸(Glu(E))等。
含有前述氨基酸的抗原结合结构域的位置并不限于特定的位置，只要是使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可变区或轻链可变区中的任意位置。即，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在其他非限定性方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的CDR3中含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它非限定性方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的CDR3的以Kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
此外，在本发明的非限定性的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在其他方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR1中含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR1的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
此外，在其他非限定性方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR2中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，提供下述文库，该文库主要由轻链的CDR2的以Kabat编号表示的50位含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
进而在其他非限定性方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR3中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR3的以Kabat编号表示的92位含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
此外，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库作为本发明的不同方案来获得，该文库主要由选自上述记载的轻链的CDR1、CDR2和CDR3中的2个或3个CDR含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。进而，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一者以上含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
在特别优选的实施方案中，理想的是抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列具有人的种系框架序列。因此，在本发明的一个方案中，若框架序列完全为人的序列，则认为在给予人(例如疾病的治疗)时，本发明的抗原结合分子基本或完全不会引起免疫原性反应。根据上述含义，本发明的“含有种系序列”意指本发明的框架序列的一部分与任意的人的种系框架序列的一部分相同。例如，在本发明的抗原结合分子的重链FR2的序列为多个不同的人的种系框架序列的重链FR2序列组合得到的序列时，该抗原结合分子也是本发明的“含有种系序列”的抗原结合分子。
作为框架的实例，优选可举出例如：V-Base(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中所包括的、现在已知的完全人型框架区域的序列。这些框架区域的序列能够适宜用作本发明的抗原结合分子中所含的种系序列。种系序列可基于其相似性来分类(Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227，776-798)Williams和Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23，1456-1461)和Cox等(Nat.Genetics(1994)7，162-168))。可以从分类为7个亚类的Vκ、分类为10个亚类的Vλ、分类为7个亚类的VH中适宜选择合适的种系序列。
完全人型VH序列并不仅限于下述，优选可举出例如：VH1亚类(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2亚类(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3亚类(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4亚类(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5亚类(VH5-51)、VH6亚类(VH6-1)、VH7亚类(VH7-4、VH7-81)的VH序列等。它们也记载于公知文献(Matsuda等(J.Exp.Med.(1998)188，1973-1975))等中，本领域技术人员可以基于它们的序列信息适宜设计本发明的抗原结合分子。也可优选使用它们以外的完全人型框架或框架的亚区域(sub-region)。
完全人型VK序列并不仅限于下述，优选可举出例如：分类为Vk1亚类的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18；分类为Vk2亚类的A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11；分类为Vk3亚类的A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25；分类为Vk4亚类的B3；分类为Vk5亚类的B2(本说明书中也称为Vk5-2)；分类为VK6亚类的A10、A14、A26等(Kawasaki等(Eur.J.Immunol.(2001)31，1017-1028)、Schable和Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374，1001-1022)和Brensing-Kuppers等(Gene(1997)191，173-181))。
完全人型的VL序列并不仅限于下述，优选可举出例如：分类为VL1亚类的V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22；分类为VL1亚类的V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19；分类为VL3亚类的V3-2、V3-3、V3-4；分类为VL4亚类的V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6；分类为VL5亚类的V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等(Genome Res.(1997)7，250-261))。
通常这些框架序列根据一个或更多氨基酸残基的区别而相互不同。这些框架序列可以与本发明的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用。作为与本发明的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用的完全人型框架的实例，并不仅限于此，另外还可举出：KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如，前述的Kabat等(1991)和Wu等(J.Exp.Med.(1970)132，211-250))。
本发明并不受特定理论的束缚，认为种系序列的使用有望排除大多数个体中有害免疫应答的一个理由如下所述。通常的免疫应答中产生的亲和性成熟步骤的结果造成免疫球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的CDR的附近，对框架区域的残基也造成影响。这些框架的突变在种系基因中不存在，而成为患者的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人群暴露于种系基因所表达的框架序列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些种系框架在患者中的免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性种系基因的集合中选择。
为了制作本发明的、前述框架序列中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的抗原结合分子，可以适宜地采用位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。
例如，通过将被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的轻链可变区、与被制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，由此可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，可优选举出例如：将SEQ IDNO：4(Vk5-2)所述的轻链可变区序列所代表的属于Vk5-2家族的轻链可变区序列和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合而成的文库。
此外，也可以进行设计，以使前述被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的轻链可变区的序列中含有作为该氨基酸残基以外的残基的各种氨基酸。本发明中，这样的残基也被称为柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入SEQ ID NO：4(Vk5-2)所述的轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可举出表1或表2所述的氨基酸残基：
[表1]
Figure BDA0002222475850000831
[表2]
Figure BDA0002222475850000841
本说明书中，柔性残基是指在与公知和/或天然抗体或抗原结合结构域的氨基酸序列进行比较时，具有在该位置上出现的数个不同氨基酸的轻链和重链可变区上的氨基酸为超变的位置上存在的氨基酸残基的改变。超变的位置一般存在于CDR区域。一个方案中，在确定公知和/或天然抗体的超变位置时，Kabat，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年和1991年)所提供的数据是有效的。此外，因特网上的多个数据库(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http：//www.bioinf.org.uk/abs/index.html)中提供有收集的大量人轻链和重链的序列以及其配置，这些序列及其配置的信息对于确定本发明中的超变位置有用。根据本发明，当氨基酸在某位置具有优选约2至约20、优选约3至约19、优选约4至约18、优选5至17、优选6至16、优选7至15、优选8至14、优选9至13、优选10至12个可能的不同的氨基酸残基的多样性时，可以说该位置是超变的。在数个实施方案中，某氨基酸位置可以具有优选至少约2、优选至少约4、优选至少约6、优选至少约8、优选约10、优选约12个可能的不同氨基酸残基的多样性。
此外，通过将前述导入有使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，优选可举出例如：将SEQ ID NO：5(Vk1)、SEQ IDNO：6(Vk2)、SEQ ID NO：7(Vk3)、SEQ ID NO：8(Vk4)等种系的特定残基置换为使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基而成的轻链可变区序列和制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有轻链的CDR1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有轻链CDR2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性的其它实例，还例示有轻链CDR3中所含的氨基酸残基。
如前所述，作为该氨基酸残基为轻链CDR1中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR1中的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基为轻链CDR2中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR2中的以Kabat编号表示的50位氨基酸残基。进而，作为该氨基酸残基为轻链CDR3中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR3中的以Kabat编号表示的92位氨基酸残基。此外，这些氨基酸残基只要可形成钙结合模体、和/或使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可将这些氨基酸的二个以上组合含有。此外，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，也可以以含有其结合模体的方式来设计轻链CDR1、CDR2和/或CDR3。例如，为了上述目的，可以适宜使用钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。
在将前述导入有使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的轻链可变区和制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合时，和前述相同地，也可以进行设计以使该轻链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可举出表1或表2所述的氨基酸残基。
作为进行组合的重链可变区的实例，优选可举出随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适宜组合公知的方法。在本发明的非限定性的一个方案中，基于用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因构建的免疫文库可优选用作随机可变区文库。
此外，在本发明的非限定性的一个方案中，将基因组DNA中的V基因或重构功能性V基因的CDR序列，用包含适当长度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组置换而成的合成文库也可优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的CDR3的基因序列的多样性，因而也可仅置换CDR3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子的露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，基于抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出表面和/或可与抗原接触的位置，通常为其CDR。露出于表面的位置优选使用InsightlI程序(Accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法(例如，Lee和Richards(J.Mol.Biol.(1971)55，379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16，548-558))来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选可举出SYBYL Biopolymer Module软件(Tripos Associates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4)，377-386和J.Mol.Model.(1995)1，46-53)中。
进而，在本发明的一个非限定性方案中，由来源于正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且其组成成分由不含偏差的抗体序列即天然(naive)序列构成的天然文库也可特别优选用作随机可变区文库(Gejima等(Human Antibodies(2002)11，121-129)和Cardoso等(Scand.J.Immunol.(2000)51，337-344))。本发明中记载的包含天然序列的氨基酸序列是指从上述天然文库中获得的氨基酸序列。
本发明的一个方案中，通过将被选择作为预先含有“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的框架序列的重链可变区、和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区组合，可以由含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库获得本发明的抗原结合结构域。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，可优选举出例如：将SEQ ID NO：9(6RL#9-IgG1)或SEQ ID NO：10(6KC4-1#85-IgG1)所述的重链可变区序列和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区组合而得的文库。此外，也可以通过代替制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区，而从具有种系序列的轻链可变区中适宜选择来制作。可优选举出例如：将SEQ ID NO：9(6RL#9-IgG1)或SEQ ID NO：10(6KC4-1#85-IgG1)所述的重链可变区序列和具有种系序列的轻链可变区组合而得的文库。
此外，也可以进行设计，以使前述被选择作为预先含有“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的框架序列的重链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入SEQ ID NO：9(6RL#9-IgG1)所述的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，除了重链CDR1和CDR2的全部氨基酸残基之外，可举出重链CDR3的以Kabat编号表示的95位、96位和/或100a位以外的CDR3的氨基酸残基。或者作为导入SEQ ID NO：10(6KC4-1#85-IgG1)所述的重链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，除了重链CDR1和CDR2的全部氨基酸残基之外，还可举出重链CDR3的以Kabat编号表示的95位和/或101位以外的CDR3的氨基酸残基。
此外，通过将前述导入有“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的重链可变区和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区或具有种系序列的轻链可变区组合，也可以制作包含多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，优选可举出例如：将重链可变区的特定残基置换为使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区序列和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区或具有种系序列的轻链可变区组合而得的文库。作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有重链的CDR1中所含的氨基酸残基。另外，作为该氨基酸残基的非限定性实例，还例示有重链的CDR2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的其它非限定性实例，还例示有重链的CDR3中所含的氨基酸残基。作为该氨基酸残基为重链的CDR3中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出重链可变区的CDR3中的以Kabat编号表示的95位、96位、100a位和/或101位氨基酸。此外，这些氨基酸残基只要可形成钙结合模体、和/或使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可将这些氨基酸的二个以上组合含有。
在将前述导入有使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的重链可变区和制作作为随机可变区序列文库的轻链可变区或具有种系序列的轻链可变区组合时，与前述相同地，也可以进行设计以使该重链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。此外，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸残基以外的重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3的氨基酸序列，也可优选使用随机可变区文库。在使用种系序列作为轻链可变区时，可举出例如SEQ ID NO：5(Vk1)、SEQ IDNO：6(Vk2)、SEQ ID NO：7(Vk3)、SEQ ID NO：8(Vk4)等种系序列作为非限定性实例。
作为前述使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸，只要形成钙结合模体，则任意的氨基酸均可适宜使用，作为这种氨基酸，具体可举出具有供电子性的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，优选可例示丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。
氢离子浓度条件
此外，在本发明的一个方案中，离子浓度条件是指氢离子浓度条件或pH条件。本发明中，将质子即氢原子的原子核的浓度条件与氢指数(pH)的条件视为相同含义。水溶液中的氢离子的活性量用aH+表示时，则pH定义为-log10aH+。水溶液中的离子强度若(例如与10-3相比)低，则aH+大致与氢离子强度相等。例如25℃、1个大气压下的水的离子积为Kw＝aH+aOH＝10-14，因而对纯水来说，aH+＝aOH＝10-7。此时的pH＝7为中性，pH小于7的水溶液为酸性、pH大于7的水溶液为碱性。
本发明中，使用pH条件来作为离子浓度条件时，作为pH条件，可举出高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件，与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件。结合活性随pH条件而变化是指，高氢离子浓度或低pH(pH酸性范围)和低氢离子浓度或高pH(pH中性范围)的条件的不同导致抗原结合分子的抗原结合活性变化。可举出例如，pH中性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性高于pH酸性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的情形。此外还可举出，pH酸性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性高于pH中性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的情形。
本说明书中，pH中性范围并不特别限于统一的数值，优选可从pH6.7至pH10.0之间选择。此外，在其它方案中，可以从pH6.7至pH9.5之间选择。此外，在不同的方案中，可以从pH 7.0至pH9.0之间选择，在其它方案中，可以从pH 7.0至pH8.0之间选择。特别优选可举出与生物体内血浆中(血中)的pH接近的pH 7.4。
本说明书中，pH酸性范围并不特别限于统一的数值，优选可从pH4.0至pH6.5之间选择。此外，在其它方案中，可以从pH4.5至pH6.5之间选择。此外，在不同的方案中，可以从pH5.0至pH6.5之间选择，在其它方案中，可以从pH5.5至pH6.5之间选择。特别优选可举出与生物体内的早期内体内的离子化钙浓度接近的pH5.8。
本发明中，抗原结合分子的高氢离子浓度或低pH(pH酸性范围)条件下的抗原结合活性若比低氢离子浓度或高pH(pH中性范围)条件下的抗原结合活性低，则意指抗原结合分子在选自pH4.0至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH6.7至pH10.0之间的pH下的抗原结合活性弱。优选意指抗原结合分子在选自pH4.5至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH6.7至pH9.5之间的pH下的抗原结合活性弱，更优选意指抗原结合分子在选自pH5.0至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH 7.0至pH9.0之间的pH下的抗原结合活性弱。此外，优选意指抗原结合分子在选自pH5.5至pH6.5之间的pH下的抗原结合活性比在选自pH 7.0至pH8.0之间的pH下的抗原结合活性弱。特别优选意指生物体内的早期内体内的pH下的抗原结合活性比生物体内的血浆中的pH下的抗原结合活性弱，具体意指抗原结合分子在pH5.8下的抗原结合活性比在pH 7.4下的抗原结合活性弱。
抗原结合分子的抗原结合活性是否随pH条件而变化可以使用例如前述结合活性项目中记载的公知测定方法来确定。即，利用该测定方法测定不同pH条件下的结合活性。例如，为了确认与pH酸性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性相比，pH中性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性变高，对pH酸性范围和pH中性范围条件下的抗原结合分子的抗原结合活性进行比较。
进而在本发明中，“高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低”的表述也可以表述为抗原结合分子的低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高。应予说明，本发明中有时也将“高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低”记载为“高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合能力弱”，此外，有时也将“使高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低”记载为“使高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合能力弱”。
本领域技术人员可以适宜选择测定抗原结合活性时的氢离子浓度或pH以外的条件，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合分子和抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片流过作为分析物的抗原，由此可以评价对可溶型抗原的结合活性，在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片流过作为分析物的抗原结合分子，由此可以评价对膜型抗原的结合活性。
本发明的抗原结合分子中，只要高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性弱，则高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的KD(Dissociation constant：解离常数)和低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的KD之比KD(pH5.8)/KD(pH 7.4)的值为2以上，进一步优选KD(pH5.8)/KD(pH 7.4)的值为10以上，进一步优选KD(pH5.8)/KD(pH 7.4)的值为40以上。KD(pH5.8)/KD(pH 7.4)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以为400、1000、10000等任意的值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD(解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)。KD(解离常数)和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、流式细胞仪等。
此外，作为示出本发明的抗原结合分子在高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可优选使用例如，解离速率常数kd(Dissociation rate constant：解离速率常数)。代替KD(解离常数)而使用kd(解离速率常数)来作为示出结合活性之比的指标时，相对于抗原的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的kd(解离速率常数)与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的kd(解离速率常数)之比kd(pH酸性范围条件下)/kd(pH中性范围条件下)的值优选为2以上、进一步优选为5以上、进一步优选为10以上、更优选为30以上。Kd(pH酸性范围条件下)/kd(pH中性范围条件下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速率常数)，在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd(Apparent dissociation rate constant：表观解离速率常数)。kd(解离速率常数)和表观kd(表观解离速率常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式细胞仪等。应予说明，本发明中，在测定不同氢离子浓度即pH下的抗原结合分子的抗原结合活性时，氢离子浓度即pH以外的条件优选为相同。
例如，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获得：
(a)获得pH酸性范围条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得pH中性范围条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤，和
(c)选择pH酸性范围条件下的抗原结合活性比pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤。
进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得：
(a)使pH中性范围条件下的抗原结合结构域或抗体或其文库与抗原接触的步骤，
(b)将在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体置于pH酸性范围条件的步骤，和
(c)对在前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
此外，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(d)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得：
(a)在pH酸性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤，
(b)选择在前述步骤(a)中与抗原不结合的抗原结合结构域或抗体的步骤，
(c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗体在pH中性范围条件下与抗原结合的步骤，和
(d)对在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(c)的筛选方法来获得：
(a)在pH中性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与固定有抗原的柱接触的步骤，
(b)将在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗体在pH酸性范围条件从柱洗脱的步骤，和
(c)对在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得：
(a)在pH酸性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库通过固定有抗原的柱的步骤，
(b)对在前述步骤(a)中不与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗体进行回收的步骤，
(c)使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗体在pH中性范围条件与抗原结合的步骤，和
(d)对在前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
进而，作为本发明提供的一个方案的高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体可以通过包括以下步骤(a)～(d)的筛选方法来获得：
(a)在pH中性范围条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤，
(b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体的步骤，
(c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗体置于pH酸性范围条件下的步骤，和
(d)对在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的标准的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
应予说明，前述步骤可以重复2次以上。所以，根据本发明可提供通过上述筛选方法中进一步包括将(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法而获得的pH酸性范围条件下的抗原结合活性低于pH中性范围条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体。(a)～(c)或(a)～(d)的步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
本发明的筛选方法中，高氢离子浓度条件或低pH即pH酸性范围下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是pH为4.0～6.5之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的pH，可举出pH为4.5～6.6之间的抗原结合活性。作为其它的优选pH，可举出pH为5.0～6.5之间的抗原结合活性，进而可举出pH为5.5～6.5之间的抗原结合活性。作为更优选的pH，可举出生物体内的早期内体内的pH，具体可举出pH5.8下的抗原结合活性。此外，低氢离子浓度条件或高pH即pH中性范围下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是pH为6.7～10之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的pH，可举出pH为6.7～9.5之间的抗原结合活性。作为其它的优选pH，可举出pH为7.0～9.5之间的抗原结合活性，进而可举出pH为7.0～8.0之间的抗原结合活性。作为更优选的pH，可举出生物体内的血浆中的pH，具体可举出pH为7.4下的抗原结合活性。
抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜决定。抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可以作为KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparentdissociation constant：表观解离常数)、解离速率kd(Dissociation rate：解离速率常数)或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速率常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、FACS等。
本发明中，选择低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的步骤，与选择高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性比低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性低的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。
只要低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高，则低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性与高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性为高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。
通过前述筛选方法筛选得到的本发明的抗原结合结构域或抗体可以是任意的抗原结合结构域或抗体，例如，可以筛选上述抗原结合结构域或抗体。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗体，也可以筛选氨基酸序列被置换的抗原结合结构域或抗体。
通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可用任意方法制备，例如，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制作得到的抗体或文库、向这些抗体或文库导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、在特定位置导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而成的文库等)等。
作为从由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制作得到的抗原结合结构域或抗体中获得低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件下的抗原结合活性比高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件下的抗原结合活性高的抗原结合结构域或抗体的方法，优选可举出例如：将如WO2009/125825中所述的抗原结合结构域或抗体中的氨基酸的至少一个置换为侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变的抗原结合分子或抗体、或者在抗原结合结构域或抗体中***侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的抗原结合分子或抗体。
导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变的位置没有特别限定，只要与置换或***前相比，pH酸性范围下的抗原结合活性变得比pH中性范围下的抗原结合活性弱(KD(pH酸性范围)/KD(pH中性范围)的值变大，或kd(pH酸性范围)/kd(pH中性范围)的值变大)，则可以是任意位点。例如，在抗原结合分子为抗体时，优选可举出抗体的可变区或CDR等。本领域技术人员可以适宜确定置换为侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的氨基酸的数目或***的氨基酸的数目，可以被侧链的氨基酸为pKa为4.0-8.0的1个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸所置换，可以***侧链的pKa为4.0-8.0的1个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸，可以被侧链的氨基酸为pKa为4.0-8.0的2个以上的多个氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸所置换，可以***侧链的pKa为4.0-8.0的2个以上的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸。另外，除了置换为侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸或***侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸以外，也可以同时进行其它的氨基酸的缺失、添加、***和/或置换等。置换为侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸或***侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸，可以通过本领域技术人员公知的丙氨酸扫描的丙氨酸置换为组氨酸等而成的组氨酸等扫描等方法随机地进行，从随机地导入了侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的置换或***的突变的抗原结合结构域或抗体中，可以选择与突变前相比KD(pH酸性范围)/KD(pH中性范围)或kd(pH酸性范围)/kd(pH中性范围)的值变大的抗原结合分子。
如前所述，作为进行了突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸、并且pH酸性范围下的抗原结合活性比pH中性范围下的抗原结合活性低的抗原结合分子的优选实例，优选可举出例如：突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的pH中性范围下的抗原结合活性与突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的pH中性范围下的抗原结合活性同等的抗原结合分子。本发明中，突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的抗原结合分子具有与突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的抗原结合分子同等的抗原结合活性是指，将突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的抗原结合分子的抗原结合活性作为100％时，突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的抗原结合分子的抗原结合活性为至少10％以上、优选50％以上、进一步优选80％以上、更优选90％以上。突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸后的pH 7.4下的抗原结合活性可以比突变为其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸前的pH 7.4下的抗原结合活性变高。通过置换为或***其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸而使抗原结合分子的抗原结合活性变低时，可以通过抗原结合分子中的1个或多个氨基酸的置换、缺失、添加和/或***等来使抗原结合活性与其侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的置换或***前的抗原结合活性同等。本发明中也包括如上述的侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的置换或***后进行1个或多个氨基酸的置换、缺失、添加和/或***而使结合活性变得同等的抗原结合分子。
进而，抗原结合分子为含有抗体恒定区的物质时，作为pH酸性范围下的抗原结合活性比pH中性范围下的抗原结合活性低的抗原结合分子的优选的其它方案，可举出将抗原结合分子中所含的抗体恒定区进行了改变的方法。作为改变后的抗体恒定区的具体例，优选可举出例如：SEQ ID NO：11、12、13或14所述的恒定区。
使抗原结合结构域的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的氨基酸
通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可以用任意方法制备，例如，在离子浓度条件为氢离子浓度条件或pH条件时，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库导入侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变而得的抗体或文库(侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库或在特定位置导入了侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸(例如组氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的突变而成的文库等)等。
此外，作为本发明的非限定性的一个方案，通过将导入有“使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，也可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。
作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有轻链的CDR1中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性实例，例示有轻链CDR2中所含的氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基的非限定性的其它实例，还例示有轻链CDR3中所含的氨基酸残基。
如前所述，作为该氨基酸残基为轻链CDR1中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR1中的以Kabat编号表示的24位、27位、28位、31位、32位和/或34位氨基酸残基。此外，作为该氨基酸残基为轻链CDR2中所含氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR2中的以Kabat编号表示的50位、51位、52位、53位、54位、55位和/或56位氨基酸残基。进而，作为该氨基酸残基为轻链CDR3中所含的氨基酸残基的非限定性实例，可举出：轻链可变区的CDR3中的以Kabat编号表示的89位、90位、91位、92位、93位、94位和/或95A位氨基酸残基。此外，这些氨基酸残基只要可使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化，则这些氨基酸残基可单独含有，也可以将这些氨基酸的二个以上组合含有。
在将前述导入有“使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”的轻链可变区和制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合时，和前述相同地，也可以进行设计以使该轻链可变区的序列中含有柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随氢离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。例如，作为导入轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可举出表3或表4所述的氨基酸残基。此外，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的氨基酸残基和柔性残基以外的轻链可变区的氨基酸序列，作为非限定性实例优选可使用：Vk1(SEQ ID NO：5)、Vk2(SEQ ID NO：6)、Vk3(SEQ ID NO：7)、Vk4(SEQ ID NO：8)等种系序列。
[表3]
Figure BDA0002222475850001021
(位置表示Kabat编号)。
[表4]
Figure BDA0002222475850001031
(位置表示Kabat编号)。
作为前述使抗原结合分子的抗原结合活性随氢离子浓度条件而变化的氨基酸残基，还可适宜使用任意的氨基酸残基，作为这种氨基酸残基，具体可举出侧链的pKa为4.0-8.0的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，除了组氨酸或谷氨酸等天然氨基酸之外，优选可例示组氨酸类似物(US20090035836)或m-NO2-Tyr(pKa 7.45)、3，5-Br2-Tyr(pKa7.21)或3，5-I2-Tyr(pKa 7.38)等非天然氨基酸(Bioorg.Med.Chem.(2003)11(17)，3761-2768)。此外，作为该氨基酸残基的特别优选的实例，可举出侧链的pKa为6.0-7.0的氨基酸。作为这种具有供电子性的氨基酸，优选可例示组氨酸。
为了改变抗原结合结构域的氨基酸，可适宜采用位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法。此外，作为置换为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸突变方法，还可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35，225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11)，6353-6357)。还可优选使用例如：包含作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制基因tRNA上连接有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译***(Clover Direct(Protein Express))等。
作为进行组合的重链可变区的实例，优选可举出随机可变区文库。随机可变区文库的制作方法适宜组合公知的方法。在本发明的非限定性的一个方案中，基于用特定抗原免疫的动物、感染疾病患者或接种疫苗而使血中抗体效价上升的人、癌患者、自身免疫疾病的淋巴细胞来源的抗体基因构建的免疫文库可优选用作随机可变区文库。
此外，在本发明的非限定性的一个方案中，与前述相同地，将基因组DNA中的V基因或重构功能性V基因的CDR序列，用包含适当长度的编码密码子组的序列的合成寡核苷酸组置换而成的合成文库也可优选用作随机可变区文库。此时，由于观察到重链的CDR3的基因序列的多样性，因而也可仅置换CDR3的序列。抗原结合分子的可变区中产生氨基酸的多样性的基准是，抗原结合分子的露出于表面的位置的氨基酸残基具有多样性。露出于表面的位置是指，基于抗原结合分子的结构、结构总体和/或模型化结构，判断为可以露出于表面和/或可与抗原接触的位置，通常为其CDR。露出于表面的位置优选使用InsightII程序(Accelrys)之类的计算机程序，使用来自抗原结合分子的三维模型的坐标来确定。露出于表面的位置可使用本技术领域公知的算法(例如，Lee和Richards(J.Mol.Biol.(1971)55，379-400)、Connolly(J.Appl.Cryst.(1983)16，548-558))来确定。露出于表面的位置的确定可使用由适于蛋白建模的软件和抗体得到的三维结构信息来进行。作为可用于上述目的的软件，优选可举出SYBYL Biopolymer Module软件(Tripos Associates)。通常或优选地，在算法需要使用者输入大小参数时，计算中使用的探针的“大小”设定为半径约1.4埃以下。进而，使用个人电脑用软件的露出于表面的区域和面积的确定方法记载于Pacios(Comput.Chem.(1994)18(4)，377-386和J.Mol.Model.(1995)1，46-53)中。
进而，在本发明的一个非限定性方案中，由来源于正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且其组成成分由不含偏差的抗体序列即天然序列构成的天然文库也可特别优选用作随机可变区文库(Gejima等(Human Antibodies(2002)11，121-129)和Cardoso等(Scand.J.Immunol.(2000)51，337-344))。
FcRn
与属于免疫球蛋白超家族的Fcγ受体不同，FcRn特别是人FcRn在结构上与主要组织相容性复合体(MHC)I类的多肽结构类似，与I类的MHC分子具有22至29％的序列同一性(Ghetie等，Immunol.Today(1997)18(12)，592-598)。FcRn表达为异源二聚体，其由与可溶性p或轻链(β2微球蛋白)复合而成的跨膜α或重链构成。如MHC那样，FcRn的α链包含3个胞外结构域(α1、α2、α3)，短的胞质结构域将蛋白锚定于细胞表面。α1和α2结构域与抗体的Fc区中的FcRn结合结构域相互作用(Raghavan等(Immunity(1994)1，303-315)。
FcRn在哺乳动物的母体胎盘或卵黄囊中表达，其参与IgG从母体向胎儿的转移。此外，表达有FcRn的啮齿类新生儿的小肠中，FcRn参与母体IgG从所摄取的初乳或乳中穿过刷状边缘上皮的移动。FcRn在大量种类的大量的其它组织以及各种内皮细胞系中表达。其也在人成年血管内皮、肌肉血管系和肝窦毛细血管中也有表达。FcRn被认为与IgG结合，将其再循环至血清中，由此起到维持IgG的血浆中浓度的作用。通常，FcRn对IgG分子的结合严格地为pH依赖性，最佳结合在小于7.0的pH酸性范围内观察到。
以含有SEQ ID NO：15所示信号序列的多肽作为前体的人FcRn在生物体内(SEQ IDNO：16中记载了含有信号序列的该多肽)与人β2-微球蛋白形成复合体。如以下参考实施例所示，与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn是通过使用通常的重组表达手法来制造的。可以评价本发明的Fc区对这种与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn的结合活性。本发明中，若无特别记载，人FcRn是指能够与本发明的Fc区结合的形态，作为实例，可举出人FcRn与人β2-微球蛋白的复合体。
FcRn结合结构域
本发明的一个方案中，提供诱导针对抗原的免疫应答的药物组合物，其中，所述药物组合物包含含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域的抗原结合分子作为有效成分，所述抗原结合结构域对所述抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，所述FcRn结合结构域在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性。
本发明的抗原结合分子具有FcRn结合结构域。对于FcRn结合结构域，只要抗原结合分子在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性，就无特别限定，此外，也可以是直接或间接地对FcRn具有结合活性的结构域。作为这样的结构域，例如，可适宜地列举直接具有FcRn结合活性的IgG型免疫球蛋白的Fc区、白蛋白、白蛋白结构域3、抗FcRn抗体、抗FcRn肽、抗FcRn支架(Scaffold)分子等，或者间接具有FcRn结合活性的与IgG或白蛋白结合的分子等。作为抗FcRn支架(Scaffold)，以与FcRn结合为特征的先前记载的抗原结合结构域的任何结构的结构域均可使用。本发明中优选在pH酸性范围和pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的结构域。该结构域如果预先是在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的结构域，则可适宜地直接使用。该结构域在pH中性范围条件下的FcRn结合活性不存在或弱的情况下，可改变抗原结合分子中的氨基酸以赋予FcRn结合活性。此外，也可以改变预先在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的结构域中的氨基酸，以提高FcRn结合活性。对于FcRn结合结构域的氨基酸改变，可通过比较氨基酸改变前与改变后在pH中性范围条件下的FcRn结合活性来发现所需的改变。
此外，本发明的另一个方案中，FcRn结合结构域也可适宜地使用在低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件下具有FcRn结合活性的结构域。该结构域如果是预先在高钙离子浓度条件下具有FcRn结合活性的结构域，则可适宜地直接使用。该结构域在高钙离子浓度条件下的FcRn结合活性不存在或弱的情况下，可改变抗原结合分子中的氨基酸以赋予FcRn结合活性。此外，也可以改变预先在高钙离子浓度条件下具有FcRn结合活性的结构域中的氨基酸，以提高FcRn结合活性。对于FcRn结合结构域的氨基酸改变，可通过比较氨基酸改变前与改变后在高钙离子浓度条件下的FcRn结合活性来发现目标改变。遵照以前述在离子浓度条件项目中列举的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的筛选方法和制作方法为标准的方法，可以获得。作为这样的FcRn结合结构域的实例，可列举抗FcRn抗体、抗FcRn肽、抗FcRn支架(Scaffold)分子等。
FcRn结合结构域优选为直接与FcRn结合的区。作为FcRn结合结构域的优选实例，可列举抗体的Fc区。然而，可与白蛋白或IgG等具有FcRn结合活性的多肽结合的区可以经由白蛋白或IgG等间接与FcRn结合。因此，作为本发明的FcRn结合区，可适宜地使用与具有FcRn结合活性的多肽结合的区。Fc区包含抗体重链恒定区来源的氨基酸序列。Fc区是从以EU编号表示的大约216位氨基酸的木瓜蛋白酶切割位点的铰链区N末端开始，包含该铰链、CH2和CH3结构域的抗体重链恒定区的一部分。
对于本发明的FcRn结合结构域与FcRn特别是人FcRn的结合活性，如前述结合活性项目中所述，可通过本领域技术人员公知的方法测定，pH以外的条件可由本领域技术人员适宜地确定。抗原结合分子的抗原结合活性和人FcRn结合活性可作为KD(Dissociationconstant：解离常数)、表观KD(Apparent dissociation constant：表观解离常数)、解离速率kd(Dissociation rate：解离速率)或表观KD(Apparent dissociation：表观解离速率)等进行评价。它们可通过本领域技术人员公知的方法测定。例如可使用Biacore(GEhealthcare)、斯卡查德图、流式细胞仪等。
测定FcRn结合结构域的FcRn结合活性时pH以外的条件可由本领域技术人员适宜地选择，无特别限定。例如，可如WO2009/125825的记载在MES缓冲液、37℃条件下测定。此外，本发明的FcRn结合结构域的FcRn结合活性测定可通过本领域技术人员公知的方法进行，例如可使用Biacore(GE Healthcare)等测定。对于FcRn结合结构域与FcRn的结合活性的测定，可通过向固定有FcRn结合结构域或包含FcRn结合结构域的本发明的抗原结合分子或者FcRn的芯片分别流过FcRn或者FcRn结合结构域或包含FcRn结合结构域的本发明抗原结合分子作为分析物进行评价。
作为本发明的抗原结合分子所含的FcRn结合结构域与FcRn具有结合活性的条件的pH酸性范围，通常指pH 4.0～pH 6.5。优选指pH5.5～pH 6.5，特别优选指与生物体内的早期内体内的pH接近的pH5.8～pH 6.0。此外，作为本发明抗原结合分子所含的FcRn结合结构域与FcRn具有结合活性的条件的pH中性范围，通常指pH 6.7～pH 10.0。pH中性范围优选为通过pH 7.0～pH 8.0内的任意pH值所表示的范围，优选从pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0中选择，特别优选为与生物体内的血浆中(血中)pH接近的pH7.4。人FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性在pH 7.4低而致使难以评价结合亲和性的情况下，可使用pH 7.0代替pH 7.4。作为测定条件中使用的温度，FcRn结合结构域与FcRn的结合亲和性可在10℃～50℃的任意温度下进行评价。为了测定FcRn结合结构域与人FcRn的结合亲和性，优选使用15℃～40℃的温度。更优选地，诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35℃中任一者的20℃～35℃的任意温度也同样用于测定FcRn结合结构域与FcRn的结合亲和性。25℃的温度是本发明方案的一个非限定性实例。
根据The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671，天然型人IgG1的人FcRn结合活性在pH酸性范围(pH6.0)为KD 1.7μM，但在pH中性范围基本不能检测到活性。因此，在优选方案中，可使用包括pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD 20μM或更强、pH中性范围的人FcRn结合活性与天然型人IgG同等的抗原结合分子在内的，在pH酸性范围具有人FcRn结合活性的本发明的抗原结合分子。在更优选的方案中，可使用包括pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD 2.0μM或更强的抗原结合分子在内的本发明的抗原结合分子。在进一步更优选的方案中，可使用pH酸性范围的人FcRn结合活性为KD 0.5μM或更强的抗原结合分子。上述KD值可通过The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671中记载的方法(将抗原结合分子固定在芯片上，作为分析物流过人FcRn)确定。
本发明中优选在pH酸性范围具有FcRn结合活性的Fc区。该结构域若为预先在pH酸性范围具有FcRn结合活性的Fc区，则可直接使用。该结构域在pH酸性范围的FcRn结合活性不存在或弱的情况下，可通过改变抗原结合分子中的氨基酸来获得具有所需的FcRn结合活性的Fc区，也适宜地通过改变Fc区中的氨基酸来获得具有pH酸性范围的所需FcRn结合活性或该活性增强的Fc区。这样的带来所需结合活性的Fc区氨基酸改变可通过比较氨基酸改变前与改变后pH酸性范围的FcRn结合活性来发现。利用与前述用于改变抗原结合活性的方法相似的位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492))或重叠延伸PCR等公知方法，本领域技术人员可实施适宜的氨基酸改变。
本发明的抗原结合分子所含的具有pH酸性范围的FcRn结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体而言，可通过改变作为起始Fc区使用的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸来获得具有pH酸性范围的FcRn结合活性或该活性增强的FcRn结合结构域。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。对于向其它氨基酸的改变，只要可具有pH酸性范围的FcRn结合活性或者提高酸性范围的人FcRn结合活性，就可以改变任意位置的氨基酸。抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，优选包含带来pH酸性范围的FcRn结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。作为可实现这样的改变的氨基酸，例如可适宜地列举WO 2000/042072中记载的以EU编号表示的238位、252位、253位、254位、255位、256位、265位、272位、286位、288位、303位、305位、307位、309位、311位、312位、317位、340位、356位、360位、362位、376位、378位、380位、382位、386位、388位、400位、413位、415位、424位、433位、434位、435位、436位、439位和/或447位氨基酸。同样地，作为可实现这样的改变的氨基酸，例如还可适宜地列举WO2002/060919中记载的以EU编号表示的251位、252位、254位、255位、256位、308位、309位、311位、312位、385位、386位、387位、389位、428位、433位、434位和/或436位氨基酸。此外，作为可实现这样的改变的氨基酸，还可列举WO 2004/092219中记载的以EU编号表示的250位、314位和428位氨基酸。此外，作为可实现这样的改变的氨基酸，例如可适宜地列举WO2010/045193中记载的以EU编号表示的251位、252位、307位、308位、378位、428位、430位、434位和/或436位氨基酸。通过这些氨基酸的改变，增强IgG型免疫球蛋白Fc区在pH酸性范围的FcRn结合。
本发明中，优选在pH中性范围具有FcRn结合活性的Fc区。该结构域如果为预先在pH中性范围具有FcRn结合活性的Fc区，就可直接使用。该结构域在pH中性范围的FcRn结合活性不存在或弱的情况下，可通过改变抗原结合分子中的氨基酸来获得具有所需FcRn结合活性的Fc区，也可适宜地通过改变Fc区中的氨基酸来获得具有pH中性范围的所需FcRn结合活性或该活性增强的Fc区。这样的带来所需结合活性的Fc区的氨基酸改变可通过比较氨基酸改变前与改变后的pH中性范围的FcRn结合活性来发现。利用与前述用于改变抗原结合活性的方法相同的位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492))或重叠延伸PCR等公知的方法，本领域技术人员可实施适宜的氨基酸改变。
本发明的抗原结合分子所含的具有pH中性范围的FcRn结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体而言，可通过改变作为起始Fc区使用的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸来获得具有pH中性范围的FcRn结合活性或该活性增强的FcRn结合结构域。作为用于改变的优选IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。向其它氨基酸的改变只要具有pH中性范围的FcRn结合活性或提高中性范围的人FcRn结合活性，就可改变任意位置的氨基酸。抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，优选包含带来pH中性范围的FcRn结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。pH中性范围条件的对于FcRn的KD值可如前述通过The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671中记载的方法(将抗原结合分子固定到芯片上，作为分析物流过人FcRn)确定。
作为用于改变的优选IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。向其它氨基酸的改变只要具有pH中性范围的FcRn结合活性或提高中性范围的人FcRn结合活性，就可改变任意位置的氨基酸。抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，优选包含带来pH中性范围的FcRn结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。以制作加入了这样的改变的Fc区为目的，将表5示出的各种变异导入到VH3-IgG1(SEQ ID NO：17)中，进行了评价。分别包含制作的重链和轻链L(WT)(SEQ ID NO：18)的改变体(IgG1-F1～IgG1-F1052)根据参考实施例1中记载的方法进行表达和纯化。
抗体与人FcRn的结合根据实施例3-3中记载的方法进行分析。即，将改变体在使用Biacore的中性条件下(pH 7.0)的人FcRn结合活性示出于表5(表5-1～表5-33)。
[表5-1]
变体 KD (M) 氨基酸改变位点
F1 8.10E-07 N434W
F2 3.20E-06 M252Y/S254T/T256E
F3 2.50E-06 N434Y
F4 5.80E-06 N434S
F5 6.80E-06 N434A
F7 5.60E-06 M252Y
F8 4.20E-06 M252W
F9 1.40E-07 M252Y/S254T/T256E/N434Y
F10 6.90E-08 M252Y/S254T/T256E/N434W
F11 3.10E-07 M252Y/N434Y
F12 1.70E-07 M252Y/N434W
F13 3.20E-07 M252W/N434Y
F14 1.80E-07 M252W/N434W
F19 4.60E-07 P257L/N434Y
F20 4.60E-07 V308F/N434Y
F21 3.00E-08 M252Y/V308P/N434Y
F22 2.00E-06 M428L/N434S
F25 9.20E-09 M252Y/S254T/T256E/V308P/N434W
F26 1.00E-06 I332V
F27 7.40E-06 G237M
F29 1.40E-06 I332V/N434Y
F31 2.80E-06 G237M/V308F
F32 8.00E-07 S254T/N434W
F33 2.30E-06 S254T/N434Y
F34 2.80E-07 T256E/N434W
F35 8.40E-07 T256E/N434Y
F36 3.60E-07 S254T/T256E/N434W
F37 1.10E-06 S254T/T256E/N434Y
F38 1.00E-07 M252Y/S254T/N434W
F39 3.00E-07 M252Y/S254T/N434Y
F40 8.20E-08 M252Y/T256E/N434W
F41 1.50E-07 M252Y/T256E/N434Y
[表5-2]
F42 1.00E-06 M252Y/S254T/T256E/N434A
F43 1.70E-06 M252Y/N434A
F44 1.10E-06 M252W/N434A
F47 2.40E-07 M252Y/T256Q/N434W
F48 3.20E-07 M252Y/T256Q/N434Y
F49 5.10E-07 M252F/T256D/N434W
F50 1.20E-06 M252F/T256D/N434Y
F51 8.10E-06 N434F/Y436H
F52 3.10E-06 H433K/N434F/Y436H
F53 1.00E-06 1332V/N434W
F54 8.40E-08 V308P/N434W
F56 9.40E-07 1332V/M428L/N434Y
F57 1.10E-05 G385D/Q386P/N389S
F58 7.70E-07 G385D/Q386P/N389S/N434W
F59 2.40E-06 G385D/Q386P/N389S/N434Y
F60 1.10E-05 G385H
F61 9.70E-07 G385H/N434W
F62 1.90E-06 G385H/N434Y
F63 2.50E-06 N434F
F64 5.30E-06 N434H
F65 2.90E-07 M252Y/S254T/T256E/N434F
F66 4.30E-07 M252Y/S254T/T256E/N434H
F67 6.30E-07 M252Y/N434F
F68 9.30E-07 M252Y/N434H
F69 5.10E-07 M428L/N434W
F70 1.50E-06 M428L/N434Y
F71 8.30E-08 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434W
F72 2.00E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434Y
F73 1.70E-07 M252Y/M428L/N434W
F74 4.60E-07 M252Y/M428L/N434Y
F75 1.40E-06 M252Y/M428L/N434A
F76 1.00E-06 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434A
F77 9.90E-07 T256E/M428L/N434Y
F78 7.80E-07 S254T/M428L/N434W
[表5-3]
F79 5.90E-06 S254T/T256E/N434A
F80 2.70E-06 M252Y/T256Q/N434A
F81 1.60E-06 M252Y/T256E/N434A
F82 1.10E-06 T256Q/N434W
F83 2.60E-06 T256Q/N434Y
F84 2.80E-07 M252W/T256Q/N434W
F85 5.50E-07 M252W/T256Q/N434Y
F86 1.50E-06 S254T/T256Q/N434W
F87 4.30E-06 S254T/T256Q/N434Y
F88 1.90E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434W
F89 3.60E-07 M252Y/S254T/T256Q/N434Y
F90 1.90E-08 M252Y/T256E/V308P/N434W
F91 4.80E-08 M252Y/V308P/M428L/N434Y
F92 1.10E-08 M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434W
F93 7.40E-07 M252W/M428L/N434W
F94 3.70E-07 P257L/M428L/N434Y
F95 2.60E-07 M252Y/S254T/T256E/M428L/N434F
F99 6.20E-07 M252Y/T256E/N434H
F101 1.10E-07 M252W/T256Q/P257L/N434Y
F103 4.40E-08 P238A/M252Y/V308P/N434Y
F104 3.70E-08 M252Y/D265A/V308P/N434Y
F105 7.50E-08 M252Y/T307A/V308P/N434Y
F106 3.70E-08 M252Y/V303A/V308P/N434Y
F107 3.40E-08 M252Y/V308P/D376A/N434Y
F108 4.10E-08 M252Y/V305A/V308P/N434Y
F109 3.20E-08 M252Y/V308P/Q311A/N434Y
F111 320E-08 M252Y/V308P/K317A/N434Y
F112 6.40E-08 M252Y/V308P/E380A/N434Y
F113 3.20E-08 M252Y/V308P/E382A/N434Y
F114 3.80E-08 M252Y/V308P/S424A/N434Y
F115 6.60E-06 T307A/N434A
F116 8.70E-06 E380A/N434A
F118 1.40E-05 M428L
F119 5.40E-06 T250Q/M428L
[表5-4]
F120 6.30E-08 P257L/V308P/M428L/N434Y
F121 1.50E-08 M252Y/T256E/V308P/M428L/N434W
F122 1.20E-07 M252Y/T256E/M428L/N434W
F123 3.00E-08 M252Y/T256E/V308P/N434Y
F124 2.90E-07 M252Y/T256E/M428L/N434Y
F125 2.40E-08 M252Y/S254T/T256E/V308P/M428L/N434Y
F128 1.70E-07 P257L/M428L/N434W
F129 2.20E-07 P257A/M428L/N434Y
F131 3.00E-06 P257G/M428L/N434Y
F132 2.10E-07 P257I/M428L/N434Y
F133 4.10E-07 P257M/M428L/N434Y
F134 2.70E-07 P257N/M428L/N434Y
F135 7.50E-07 P257S/M428L/N434Y
F136 3.80E-07 P257T/M428L/N434Y
F137 4.60E-07 P257V/M428L/N434Y
F139 1.50E-08 M252W/V308P/N434W
F140 3.60E-08 S239K/M252Y/V308P/N434Y
F141 3.50E-08 M252Y/S298G/V308P/N434Y
F142 3.70E-08 M252Y/D270F/V308P/N434Y
F143 2.00E-07 M252Y/V308A/N434Y
F145 5.30E-08 M252Y/V308F/N434Y
F147 2.40E-07 M252Y/V308I/N434Y
F149 1.90E-07 M252Y/V308L/N434Y
F150 2.00E-07 M252Y/V308M/N434Y
F152 2.70E-07 M252Y/V308Q/N434Y
F154 1.80E-07 M252Y/V308T/N434Y
F157 1.50E-07 P257A/V308P/M428L/N434Y
F158 5.90E-08 P257T/V308P/M428L/N434Y
F159 4.40E-08 P257V/V308P/M428L/N434Y
F160 8.50E-07 M252W/M428I/N434Y
F162 1.60E-07 M252W/M428Y/N434Y
F163 4.20E-07 M252W/M428F/N434Y
F164 3.70E-07 P238A/M252W/N434Y
F165 2.90E-07 M252W/D265A/N434Y
[表5-5]
F166 1.50E-07 M252W/T307Q/N434Y
F167 2.90E-07 M252W/V303A/N434Y
F168 3.20E-07 M252W/D376A/N434Y
F169 2.90E-07 M252W/V305A/N434Y
F170 1.70E-07 M252W/Q311A/N434Y
F171 1.90E-07 M252W/D312A/N434Y
F172 2.20E-07 M252W/K317A/N434Y
F173 7.70E-07 M252W/E380A/N434Y
F174 3.40E-07 M252W/E382A/N434Y
F175 2.70E-07 M252W/S424A/N434Y
F176 2.90E-07 S239K/M252W/N434Y
F177 2.80E-07 M252W/S298G/N434Y
F178 2.70E-07 M252W/D270F/N434Y
F179 3.10E-07 M252W/N325G/N434Y
F182 6.60E-08 P257A/M428L/N434W
F183 2.20E-07 P257T/M428L/N434W
F184 2.70E-07 P257V/M428L/N434W
F185 2.60E-07 M252W/I332V/N434Y
F188 3.00E-06 P257I/Q311I
F189 1.90E-07 M252Y/T307A/N434Y
F190 1.10E-07 M252Y/T307Q/N434Y
F191 1.60E-07 P257L/T307A/M428L/N434Y
F192 1.10E-07 P257A/T307A/M428L/N434Y
F193 8.50E-08 P257T/T307A/M428L/N434Y
F194 1.20E-07 P257V/T307A/M428L/N434Y
F195 5.60E-08 P257L/T307Q/M428L/N434Y
F196 3.50E-08 P257A/T307Q/M428L/N434Y
F197 3.30E-08 P257T/T307Q/M428L/N434Y
F198 4.80E-08 P257V/T307Q/M428L/N434Y
F201 2.10E-07 M252Y/T307D/N434Y
F203 2.40E-07 M252Y/T307F/N434Y
F204 2.10E-07 M252Y/T307G/N434Y
F205 2.00E-07 M252Y/T307H/N434Y
F206 2.30E-07 M252Y/T307I/N434Y
[表5-6]
F207 9.40E-07 M252Y/T307K/N434Y
F208 3.90E-07 M252Y/T307L/N434Y
F209 1.30E-07 M252Y/T307M/N434Y
F210 2.90E-07 M252Y/T307N/N434Y
F211 2.40E-07 M252Y/T307P/N434Y
F212 6.80E-07 M252Y/T307R/N434Y
F213 2.30E-07 M252Y/T307S/N434Y
F214 1.70E-07 M252Y/T307V/N434Y
F215 9.60E-08 M252Y/T307W/N434Y
F216 2.30E-07 M252Y/T307Y/N434Y
F217 2.30E-07 M252Y/K334L/N434Y
F218 2.60E-07 M252Y/G385H/N434Y
F219 2.50E-07 M252Y/T289H/N434Y
F220 2.50E-07 M252Y/Q311H/N434Y
F221 3.10E-07 M252Y/D312H/N434Y
F222 3.40E-07 M252Y/N315H/N434Y
F223 2.70E-07 M252Y/K360H/N434Y
F225 1.50E-06 M252Y/L314R/N434Y
F226 5.40E-07 M252Y/L314K/N434Y
F227 1.20E-07 M252Y/N286E/N434Y
F228 2.30E-07 M252Y/L309E/N434Y
F229 5.10E-07 M252Y/R255E/N434Y
F230 2.50E-07 M252Y/P387E/N434Y
F236 8.90E-07 K248I/M428L/N434Y
F237 2.30E-07 M252Y/M428A/N434Y
F238 7.40E-07 M252Y/M428D/N434Y
F240 7.20E-07 M252Y/M428F/N434Y
F241 1.50E-06 M252Y/M428G/N434Y
F242 8.50E-07 M252Y/M428H/N434Y
F243 1.80E-07 M252Y/M428I/N434Y
F244 1.30E-06 M252Y/M428K/N434Y
F245 4.70E-07 M252Y/M428N/N434Y
F246 1.10E-06 M252Y/M428P/N434Y
F247 4.40E-07 M252Y/M428Q/N434Y
[表5-7]
F249 6.40E-07 M252Y/M428S/N434Y
F250 2.90E-07 M252Y/M428T/N434Y
F251 1.90E-07 M252Y/M428V/N434Y
F252 1.00E-06 M252Y/M428W/N434Y
F253 7.10E-07 M252Y/M428Y/N434Y
F254 7.50E-08 M252W/T307Q/M428Y/N434Y
F255 1.10E-07 M252W/Q311A/M428Y/N434Y
F256 5.40E-08 M252W/T307Q/Q311A/M428Y/N434Y
F257 5.00E-07 M252Y/T307A/M428Y/N434Y
F258 3.20E-07 M252Y/T307Q/M428Y/N434Y
F259 2.80E-07 M252Y/D270F/N434Y
F260 1.30E-07 M252Y/T307A/Q311A/N434Y
F261 8.40E-08 M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
F262 1.90E-07 M252Y/T307A/Q311H/N434Y
F263 1.10E-07 M252Y/T307Q/Q311H/N434Y
F264 2.80E-07 M252Y/E382A/N434Y
F265 6.80E-07 M252Y/E382A/M428Y/N434Y
F266 4.70E-07 M252Y/T307A/E382A/M428Y/N434Y
F267 3.20E-07 M252Y/T307Q/E382A/M428Y/N434Y
F268 6.30E-07 P238A/M252Y/M428F/N434Y
F269 5.20E-07 M252Y/V305A/M428F/N434Y
F270 6.60E-07 M252Y/N325G/M428F/N434Y
F271 6.90E-07 M252Y/D376A/M428F/N434Y
F272 6.80E-07 M252Y/E380A/M428F/N434Y
F273 6.50E-07 M252Y/E382A/M428F/N434Y
F274 7.60E-07 M252Y/E380A/E382A/M428F/N434Y
F275 4.20E-08 S239K/M252Y/V308P/E382A/N434Y
F276 4.10E-08 M252Y/D270F/V308P/E382A/N434Y
F277 1.30E-07 S239K/M252Y/V308P/M428Y/N434Y
F278 3.00E-08 M252Y/T307Q/V308P/E382A/N434Y
F279 6.10E-08 M252Y/V308P/Q311H/E382A/N434Y
F280 4.10E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/N434Y
F281 9.20E-08 M252Y/V308P/E382A/M428F/N434Y
F282 2.90E-08 M252Y/V308P/E382A/M428L/N434Y
[表5-8]
F283 1.00E-07 M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y
F284 1.00E-07 M252Y/V308P/M428Y/N434Y
F285 9.90E-08 M252Y/V308P/M428F/N434Y
F286 1.20E-07 S239K/M252Y/V308P/E382A/M428Y/N434Y
F287 1.00E-07 M252Y/V308P/E380A/E382A/M428F/N434Y
F288 1.90E-07 M252Y/T256E/E382A/N434Y
F289 4.80E-07 M252Y/T256E/M428Y/N434Y
F290 4.60E-07 M252Y/T256E/E382A/M428Y/N434Y
F292 2.30E-08 S239K/M252Y/V308P/E382A/M428I/N434Y
F293 5.30E-08 M252Y/V308P/E380A/E382A/M428I/N434Y
F294 1.10E-07 S239K/M252Y/V308P/M428F/N434Y
F295 6.80E-07 S239K/M252Y/E380A/E382A/M428F/N434Y
F296 4.90E-07 M252Y/Q311A/M428Y/N434Y
F297 5.10E-07 M252Y/D312A/M428Y/N434Y
F298 4.80E-07 M252Y/Q311A/D312A/M428Y/N434Y
F299 9.40E-08 S239K/M252Y/V308P/Q311A/M428Y/N434Y
F300 8.30E-08 S239K/M252Y/V308P/D312A/M428Y/N434Y
F301 7.20E-08 S239K/M252Y/V308P/Q311A/D312A/M428Y/N434Y
F302 1.90E-07 M252Y/T256E/T307P/N434Y
F303 6.70E-07 M252Y/T307P/M428Y/N434Y
F304 1.60E-08 M252W/V308F/M428Y/N434Y
F305 2.70E-08 M252Y/T256E/V308P/E382A/N434Y
F306 3.60E-08 M252W/V308P/E382A/N434Y
F307 3.60E-08 S239K/M252W/V308P/E382A/N434Y
F308 1.90E-08 S239K/M252W/V308P/E382A/M428Y/N434Y
F310 9.40E-08 S239K/M252W/V308P/E382A/M428I/N434Y
F311 2.80E-08 S239K/M252W/V308P/M428F/N434Y
F312 4.50E-07 S239K/M252W/E380A/E382A/M428F/N434Y
F313 6.50E-07 S239K/M252Y/T307P/M428Y/N434Y
F314 3.20E-07 M252Y/T256E/Q311A/D312A/M428Y/N434Y
F315 6.80E-07 S239K/M252Y/M428Y/N434Y
F316 7.00E-07 S239K/M252Y/D270F/M428Y/N434Y
F317 1.10E-07 S239K/M252Y/D270F/V308P/M428Y/N434Y
F318 1.80E-08 S239K/M252Y/V308P/M428I/N434Y
[表5-9]
F320 2.00E-08 S239K/M252Y/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y
F321 3.20E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/N434Y
F322 9.20E-08 S239K/M252Y/D270F/T307P/V308P/N434Y
F323 2.70E-08 S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N434Y
F324 2.80E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/N434Y
F325 2.10E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
F326 7.50E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/N434Y
F327 6.50E-08 S239K/M252Y/T256E/D270F/T307Q/Q311A/N434Y
F328 1.90E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/M428I/N434Y
F329 1.20E-08 S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/N434Y
F330 3.60E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/N434Y
F331 3.00E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/P387E/N434Y
F333 7.40E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/L309E/Q311A/N434Y
F334 1.90E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/M428I/N434Y
F335 1.50E-08 S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/M428I/N434Y
F336 1.40E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y
F337 5.60E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
F338 7.70E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/M428I/N434Y
F339 1.90E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/M428I/N434Y
F343 3.20E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/M428L/N434Y
F344 3.00E-08 S239K/M252Y/V308P/M428L/N434Y
F349 1.50E-07 S239K/M252Y/V308P/L309P/M428L/N434Y
F350 1.70E-07 S239K/M252Y/V308P/L309R/M428L/N434Y
F352 6.00E-07 S239K/M252Y/L309P/M428L/N434Y
F353 1.10E-06 S239K/M252Y/L309R/M428L/N434Y
F354 2.80E-08 S239K/M252Y/T307Q/V308P/M428L/N434Y
F356 3.40E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/L309E/P387E/N434Y
F357 1.60E-08 S239K/M252Y/T256E/D270F/V308P/N325G/M428I/N434Y
F358 1.00E-07 S239K/M252Y/T307Q/N434Y
F359 4.20E-07 P257V/T307Q/M428I/N434Y
F360 1.30E-06 P257V/T307Q/M428V/N434Y
F362 5.40E-08 P257V/T307Q/N325G/M428L/N434Y
F363 4.10E-08 P257V/T307Q/Q311A/M428L/N434Y
F364 3.50E-08 P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y
[表5-10]
F365 5.10E-08 P257V/V305A/T307Q/M428L/N434Y
F367 1.50E-08 S239K/M252Y/E258H/D270F/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
F368 2.00E-08 S239K/M252Y/D270F/V308P/N325G/E382A/M428I/N434Y
F369 7.50E-08 M252Y/P257V/T307Q/M428I/N434Y
F372 1.30E-08 S239K/M252W/V308P/M428Y/N434Y
F373 1.10E-08 S239K/M252W/V308P/Q311A/M428Y/N434Y
F374 1.20E-08 S239K/M252W/T256E/V308P/M428Y/N434Y
F375 5.50E-09 S239K/M252W/N286E/V308P/M428Y/N434Y
F376 9.60E-09 S239K/M252Y/T256E/D270F/N286E/V308P/N434Y
F377 1.30E-07 S239K/M252W/T307P/M428Y/N434Y
F379 9.00E-09 S239K/M252W/T256E/V308P/Q311A/M428Y/N434Y
F380 5.60E-09 S239K/M252W/T256E/N286E/V308P/M428Y/N434Y
F381 1.10E-07 P257V/T307A/Q311A/M428L/N434Y
F382 8.70E-08 P257V/V305A/T307A/M428L/N434Y
F386 3.20E-08 M252Y/V308P/L309E/N434Y
F387 1.50E-07 M252Y/V308P/L309D/N434Y
F388 7.00E-08 M252Y/V308P/L309A/N434Y
F389 1.70E-08 M252W/V308P/L309E/M428Y/N434Y
F390 6.80E-08 M252W/V308P/L309D/M428Y/N434Y
F391 3.60E-08 M252W/V308P/L309A/M428Y/N434Y
F392 6.90E-09 S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y
F393 1.20E-08 S239K/M252Y/N286E/V308P/N434Y
F394 5.30E-08 S239K/M252Y/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
F395 2.40E-08 S239K/M252Y/T256E/V308P/N434Y
F396 2.00E-08 S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
F397 4.50E-08 S239K/M252Y/D270F/T307Q/Q311A/P387E/M428I/N434Y
F398 4.40E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y
F399 6.50E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/T307Q/V308P/M428I/N434Y
F400 6.10E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/Q311A/M428I/N434Y
F401 6.90E-09 S239K/M252Y/D270F/N286E/V308P/P387E/M428I/N434Y
F402 2.30E-08 P257V/T307Q/M428L/N434W
F403 5.10E-08 P257V/T307A/M428L/N434W
F404 9.40E-08 P257A/T307Q/L309P/M428L/N434Y
F405 1.70E-07 P257V/T307Q/L309P/M428L/N434Y
[表5-11]
F406 1.50E-07 P257A/T307Q/L309R/M428L/N434Y
F407 1.60E-07 P257V/T307Q/L309R/M428L/N434Y
F408 2.50E-07 P257V/N286E/M428L/N434Y
F409 2.00E-07 P257V/P387E/M428L/N434Y
F410 2.20E-07 P257V/T307H/M428L/N434Y
F411 1.30E-07 P257V/T307N/M428L/N434Y
F412 8.80E-08 P257V/T307G/M428L/N434Y
F413 1.20E-07 P257V/T307P/M428L/N434Y
F414 1.10E-07 P257V/T307S/M428L/N434Y
F415 5.60E-08 P257V/N286E/T307A/M428L/N434Y
F416 9.40E-08 P257V/T307A/P387E/M428L/N434Y
F418 6.20E-07 S239K/M252Y/T307P/N325G/M428Y/N434Y
F419 1.60E-07 M252Y/T307A/Q311H/K360H/N434Y
F420 1.50E-07 M252Y/T307A/Q311H/P387E/N434Y
F421 1.30E-07 M252Y/T307A/Q311H/M428A/N434Y
F422 1.80E-07 M252Y/T307A/Q311H/E382A/N434Y
F423 8.40E-08 M252Y/T307W/Q311H/N434Y
F424 9.40E-08 S239K/P257A/V308P/M428L/N434Y
F425 8.00E-08 P257A/V308P/L309E/M428L/N434Y
F426 8.40E-08 P257V/T307Q/N434Y
F427 1.10E-07 M252Y/P257V/T307Q/M428V/N434Y
F428 8.00E-08 M252Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F429 3.70E-08 M252Y/P257V/T307Q/N434Y
F430 8.10E-08 M252Y/P257V/T307Q/M428Y/N434Y
F431 6.50E-08 M252Y/P257V/T307Q/M428F/N434Y
F432 9.20E-07 P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428V/N434Y
F433 6.00E-08 P257V/T307Q/Q311A/N325G/N434Y
F434 2.00E-08 P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428Y/N434Y
F435 2.50E-08 P257V/T307Q/Q311A/N325G/M428F/N434Y
F436 2.50E-07 P257A/T307Q/M428V/N434Y
F437 5.70E-08 P257A/T307Q/N434Y
F438 3.60E-08 P257A/T307Q/M428Y/N434Y
F439 4.00E-08 P257A/T307Q/M428F/N434Y
F440 1.50E-08 P257V/N286E/T307Q/Q311A/N325G/M428L/N434Y
[表5-12]
F441 1.80E-07 P257A/Q311A/M428L/N434Y
F442 2.00E-07 P257A/Q311H/M428L/N434Y
F443 5.50E-08 P257A/T307Q/Q311A/M428L/N434Y
F444 1.40E-07 P257A/T307A/Q311A/M428L/N434Y
F445 6.20E-08 P257A/T307Q/Q311H/M428L/N434Y
F446 1.10E-07 P257A/T307A/Q311H/M428L/N434Y
F447 1.40E-08 P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y
F448 5.30E-08 P257A/N286E/T307A/M428L/N434Y
F449 5.70E-07 S239K/M252Y/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y
F450 5.20E-07 S239K/M252Y/T307P/L309E/N325G/M428Y/N434Y
F451 1.00E-07 P257S/T307A/M428L/N434Y
F452 1.40E-07 P257M/T307A/M428L/N434Y
F453 7.80E-08 P257N/T307A/M428L/N434Y
F454 9.60E-08 P257I/T307A/M428L/N434Y
F455 2.70E-08 P257V/T307Q/M428Y/N434Y
F456 3.40E-08 P257V/T307Q/M428F/N434Y
F457 4.00E-08 S239K/P257V/V308P/M428L/N434Y
F458 1.50E-08 P257V/T307Q/V308P/N325G/M428L/N434Y
F459 1.30E-08 P257V/T307Q/V308P/Q311A/N325G/M428L/N434Y
F460 4.70E-08 P257V/T307A/V308P/N325G/M428L/N434Y
F462 8.50E-08 P257A/V308P/N325G/M428L/N434Y
F463 1.30E-07 P257A/T307A/V308P/M428L/N434Y
F464 5.50E-08 P257A/T307Q/V308P/M428L/N434Y
F465 2.10E-08 P257V/N286E/T307Q/N325G/M428L/N434Y
F466 3.50E-07 T256E/P257V/N434Y
F467 5.70E-07 T256E/P257T/N434Y
F468 5.70E-08 S239K/P257T/V308P/M428L/N434Y
F469 5.60E-08 P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y
F470 5.40E-08 T256E/P257T/V308P/N325G/M428L/N434Y
F471 6.60E-08 P257T/V308P/N325G/E382A/M428L/N434Y
F472 5.40E-08 P257T/V308P/N325G/P387E/M428L/N434Y
F473 4.50E-07 P257T/V308P/L309P/N325G/M428L/N434Y
F474 3.50E-07 P257T/V308P/L309R/N325G/M428L/N434Y
F475 4.30E-08 T256E/P257V/T307Q/M428L/N434Y
[表5-13]
F476 5.50E-08 P257V/T307Q/E382A/M428L/N434Y
F477 4.30E-08 P257V/T307Q/P387E/M428L/N434Y
F480 3.90E-08 P257L/V308P/N434Y
F481 5.60E-08 P257T/T307Q/N434Y
F482 7.00E-08 P257V/T307Q/N325G/N434Y
F483 5.70E-08 P257V/T307Q/Q311A/N434Y
F484 6.20E-08 P257V/V305A/T307Q/N434Y
F485 9.70E-08 P257V/N286E/T307A/N434Y
F486 3.40E-07 P257V/T307Q/L309R/Q311H/M428L/N434Y
F488 3.50E-08 P257V/V308P/N325G/M428L/N434Y
F490 7.50E-08 S239K/P257V/V308P/Q311H/M428L/N434Y
F492 9.80E-08 P257V/V305A/T307A/N325G/M428L/N434Y
F493 4.90E-07 S239K/D270F/T307P/N325G/M428Y/N434Y
F497 3.10E-06 P257T/T307A/M428V/N434Y
F498 1.30E-06 P257A/M428V/N434Y
F499 5.20E-07 P257A/T307A/M428V/N434Y
F500 4.30E-08 P257S/T307Q/M428L/N434Y
F506 1.90E-07 P257V/N297A/T307Q/M428L/N434Y
F507 5.10E-08 P257V/N286A/T307Q/M428L/N434Y
F508 1.10E-07 P257V/T307Q/N315A/M428L/N434Y
F509 5.80E-08 P257V/T307Q/N384A/M428L/N434Y
F510 5.30E-08 P257V/T307Q/N389A/M428L/N434Y
F511 4.20E-07 P257V/N434Y
F512 5.80E-07 P257T/N434Y
F517 3.10E-07 P257V/N286E/N434Y
F518 4.20E-07 P257T/N286E/N434Y
F519 2.60E-08 P257V/N286E/T307Q/N434Y
F521 1.10E-08 P257V/N286E/T307Q/M428Y/N434Y
F523 2.60E-08 P257V/V305A/T307Q/M428Y/N434Y
F526 1.90E-08 P257T/T307Q/M428Y/N434Y
F527 9.40E-09 P257V/T307Q/V308P/N325G/M428Y/N434Y
F529 2.50E-08 P257T/T307Q/M428F/N434Y
F533 1.20E-08 P257A/N286E/T307Q/M428F/N434Y
F534 1.20E-08 P257A/N286E/T307Q/M428Y/N434Y
[表5-14]
F535 3.90E-08 T250A/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F538 9.90E-08 T250F/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F541 6.00E-08 T250I/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F544 3.10E-08 T250M/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F549 5.40E-08 T250S/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F550 5.90E-08 T250V/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F551 1.20E-07 T250W/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F552 1.10E-07 T250Y/P257V/T307Q/M428L/N434Y
F553 1.70E-07 M252Y/Q311A/N434Y
F554 2.80E-08 S239K/M252Y/S254T/V308P/N434Y
F556 1.50E-06 M252Y/T307Q/Q311A
F559 8.00E-08 M252Y/S254T/N286E/N434Y
F560 2.80E-08 M252Y/S254T/V308P/N434Y
F561 1.40E-07 M252Y/S254T/T307A/N434Y
F562 8.30E-08 M252Y/S254T/T307Q/N434Y
F563 1.30E-07 M252Y/S254T/Q311A/N434Y
F564 1.90E-07 M252Y/S254T/Q311H/N434Y
F565 9.20E-08 M252Y/S254T/T307A/Q311A/N434Y
F566 6.10E-08 M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y
F567 2.20E-07 M252Y/S254T/M428I/N434Y
F568 1.10E-07 M252Y/T256E/T307A/Q311H/N434Y
F569 2.00E-07 M252Y/T256Q/T307A/Q311H/N434Y
F570 1.30E-07 M252Y/S254T/T307A/Q311H/N434Y
F571 8.10E-08 M252Y/N286E/T307A/Q311H/N434Y
F572 1.00E-07 M252Y/T307A/Q311H/M428I/N434Y
F576 1.60E-06 M252Y/T256E/T307Q/Q311H
F577 1.30E-06 M252Y/N286E/T307A/Q311A
F578 5.70E-07 M252Y/N286E/T307Q/Q311A
F580 8.60E-07 M252Y/N286E/T307Q/Q311H
F581 7.20E-08 M252Y/T256E/N286E/N434Y
F582 7.50E-07 S239K/M252Y/V308P
F583 7.80E-07 S239K/M252Y/V308P/E382A
F584 6.30E-07 S239K/M252Y/T256E/V308P
F585 2.90E-07 S239K/M252Y/N286E/V308P
[表5-15]
F586 1.40E-07 S239K/M252Y/N286E/V308P/M428I
F587 1.90E-07 M252Y/N286E/M428L/N434Y
F592 2.00E-07 M252Y/S254T/E382A/N434Y
F593 3.10E-08 S239K/M252Y/S254T/V308P/M428I/N434Y
F594 1.60E-08 S239K/M252Y/T256E/V308P/M428I/N434Y
F595 1.80E-07 S239K/M252Y/M428I/N434Y
F596 4.00E-07 M252Y/D312A/E382A/M428Y/N434Y
F597 2.20E-07 M252Y/E382A/P387E/N434Y
F598 1.40E-07 M252Y/D312A/P387E/N434Y
F599 5.20E-07 M252Y/P387E/M428Y/N434Y
F600 2.80E-07 M252Y/T256Q/E382A/N434Y
F601 9.60E-09 M252Y/N286E/V308P/N434Y
F608 G236A/S239D/I332E
F611 2.80E-07 M252Y/V305T/T307P/V308I/L309A/N434Y
F612 3.60E-07 M252Y/T307P/V308I/L309A/N434Y
F613 S239D/A330L/I332E
F616 S239D/K326D/L328Y
F617 7.40E-07 S239K/N434W
F618 6.40E-07 S239K/V308F/N434Y
F619 3.10E-07 S239K/M252Y/N434Y
F620 2.10E-07 S239K/M252Y/S254T/N434Y
F621 1.50E-07 S239K/M252Y/T307A/Q311H/N434Y
F622 3.50E-07 S239K/M252Y/T256Q/N434Y
F623 1.80E-07 S239K/M252W/N434W
F624 1.40E-08 S239K/P257A/N286E/T307Q/M428L/N434Y
F625 7.60E-08 S239K/P257A/T307Q/M428L/N434Y
F626 1.30E-06 V308P
F629 3.90E-08 M252Y/V279L/V308P/N434Y
F630 3.70E-08 S239K/M252Y/V279L/V308P/N434Y
F633 2.40E-08 M252Y/V282D/V308P/N434Y
F634 3.20E-08 S239K/M252Y/V282D/V308P/N434Y
F635 4.50E-08 M252Y/V284K/V308P/N434Y
F636 4.80E-08 S239K/M252Y/V284K/V308P/N434Y
F637 1.50E-07 M252Y/K288S/V308P/N434Y
[表5-16]
F638 1.40E-07 S239K/M252Y/K288S/V308P/N434Y
F639 2.70E-08 M252Y/V308P/G385R/N434Y
F640 3.60E-08 S239K/M252Y/V308P/G385R/N434Y
F641 3.00E-08 M252Y/V308P/Q386K/N434Y
F642 3.00E-08 S239K/M252Y/V308P/Q386K/N434Y
F643 3.20E-08 L235G/G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F644 3.00E-08 G236R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F645 3.30E-08 S239K/M252Y/V308P/L328R/N434Y
F646 3.80E-08 S239K/M252Y/N297A/V308P/N434Y
F647 2.90E-08 P238D/M252Y/V308P/N434Y
F648 P238D
F649 1.20E-07 S239K/M252Y/N286E/N434Y
F650 1.70E-07 S239K/M252Y/T256E/N434Y
F651 1.80E-07 S239K/M252Y/Q311A/N434Y
F652 2.40E-07 P238D/M252Y/N434Y
F654 3.20E-08 L235K/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F655 3.40E-08 L235R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F656 3.30E-08 G237K/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F657 3.20E-08 G237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F658 3.20E-08 P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F659 3.00E-08 P238R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F660 3.10E-08 S239K/M252Y/V3o8P/P329K/N434Y
F661 3.40E-08 S239K/M252Y/V308P/P329R/N434Y
F663 6.40E-09 S239K/M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
F664 3.90E-08 M252Y/N286A/V308P/N434Y
F665 2.00E-08 M252Y/N286D/V308P/N434Y
F666 2.10E-08 M252Y/N286F/V308P/N434Y
F667 3.00E-08 M252Y/N286G/V308P/N434Y
F668 4.00E-08 M252Y/N286H/V308P/N434Y
F669 3.50E-08 M252Y/N286I/V308P/N434Y
F670 2.10E-07 M252Y/N286K/V308P/N434Y
F671 2.20E-08 M252Y/N286L/V308P/N434Y
F672 2.40E-08 M252Y/N286M/V308P/N434Y
F673 2.30E-08 M252Y/N286P/V308P/N434Y
[表5-17]
F674 3.20E-08 M252Y/N286Q/V308P/N434Y
F675 5.10E-08 M252Y/N286R/V308P/N434Y
F676 3.20E-08 M252Y/N286S/V308P/N434Y
F677 4.70E-08 M252Y/N286T/V308P/N434Y
F678 3.30E-08 M252Y/N286V/V308P/N434Y
F679 1.70E-08 M252Y/N286W/V308P/N434Y
F680 1.50E-08 M252Y/N286Y/V308P/N434Y
F681 4.90E-08 M252Y/K288A/V308P/N434Y
F682 8.20E-08 M252Y/K288D/V308P/N434Y
F683 5.00E-08 M252Y/K288E/V308P/N434Y
F684 5.10E-08 M252Y/K288F/V308P/N434Y
F685 5.30E-08 M252Y/K288G/V308P/N434Y
F686 4.60E-08 M252Y/K288H/V308P/N434Y
F687 4.90E-08 M252Y/K288I/V308P/N434Y
F688 2.80E-08 M252Y/K288L/V308P/N434Y
F689 4.10E-08 M252Y/K288M/V308P/N434Y
F690 1.00E-07 M252Y/K288N/V308P/N434Y
F691 3.20E-07 M252Y/K288P/V308P/N434Y
F692 3.90E-08 M252Y/K288Q/V308P/N434Y
F693 3.60E-08 M252Y/K288R/V308P/N434Y
F694 4.70E-08 M252Y/K288V/V308P/N434Y
F695 4.00E-08 M252Y/K288W/V308P/N434Y
F696 4.40E-08 M252Y/K288Y/V308P/N434Y
F697 3.10E-08 S239K/M252Y/V308P/N325G/N434Y
F698 2.20E-08 M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F699 2.30E-08 S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F700 5.20E-08 M252Y/V308P/L328E/N434Y
F705 7.10E-09 M252Y/N286E/V308P/M428I/N434Y
F706 1.80E-08 M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
F707 5.90E-09 M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
F708 4.10E-09 M252Y/N286E/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y
F709 2.00E-08 S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
F710 1.50E-08 P238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/M428I/N434Y
F711 6.50E-08 S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
[表5-18]
F712 6.00E-08 P238D/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
F713 2.00E-08 P238D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F714 2.30E-07 P238D/M252Y/N325S/N434Y
F715 2.30E-07 P238D/M252Y/N325M/N434Y
F716 2.70E-07 P238D/M252Y/N325L/N434Y
F717 2.60E-07 P238D/M252Y/N325I/N434Y
F718 2.80E-07 P238D/M252Y/Q295M/N434Y
F719 7.40E-08 P238D/M252Y/N325G/N434Y
F720 2.40E-08 M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y
F721 1.50E-08 M252Y/T307Q/V308P/Q311A/M428I/N434Y
F722 2.70E-07 P238D/M252Y/A327G/N434Y
F723 2.80E-07 P238D/M252Y/L328D/N434Y
F724 2.50E-07 P238D/M252Y/L328E/N434Y
F725 4.20E-08 L235K/G237R/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F726 3.70E-08 L235K/P238K/S239K/M252Y/V308P/N434Y
F729 9.20E-07 T307A/Q311A/N434Y
F730 6.00E-07 T307Q/Q311A/N434Y
F731 8.50E-07 T307A/Q311H/N434Y
F732 6.80E-07 T307Q/Q311H/N434Y
F733 3.20E-07 M252Y/L328E/N434Y
F734 3.10E-07 G236D/M252Y/L328E/N434Y
F736 3.10E-07 M252Y/S267M/L328E/N434Y
F737 3.10E-07 M252Y/S267L/L328E/N434Y
F738 3.50E-07 P238D/M252Y/T307P/N434Y
F739 2.20E-07 M252Y/T307P/Q311A/N434Y
F740 2.90E-07 M252Y/T307P/Q311H/N434Y
F741 3.10E-07 P238D/T250A/M252Y/N434Y
F744 9.90E-07 P238D/T250F/M252Y/N434Y
F745 6.60E-07 P238D/T250G/M252Y/N434Y
F746 6.00E-07 P238D/T250H/M252Y/N434Y
F747 2.80E-07 P238D/T250I/M252Y/N434Y
F749 5.10E-07 P238D/T250L/M252Y/N434Y
F750 3.00E-07 P238D/T250M/M252Y/N434Y
F751 5.30E-07 P238D/T250N/M252Y/N434Y
[表5-19]
F753 1.80E-07 P238D/T250Q/M252Y/N434Y
F755 3.50E-07 P238D/T250S/M252Y/N434Y
F756 3.70E-07 P238D/T250V/M252Y/N434Y
F757 1.20E-06 P238D/T250W/M252Y/N434Y
F758 1.40E-06 P238D/T250Y/M252Y/N434Y
F759 L235K/S239K
F760 L235R/S239K
F761 1.10E-06 P238D/N434Y
F762 3.60E-08 L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F763 3.50E-08 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F764 6.30E-07 P238D/T307Q/Q311A/N434Y
F765 8.50E-08 P238D/M252Y/T307Q/L309E/Q311A/N434Y
F766 6.00E-07 T307A/L309E/Q311A/N434Y
F767 4.30E-07 T307Q/L309E/Q311A/N434Y
F768 6.40E-07 T307A/L309E/Q311H/N434Y
F769 4.60E-07 T307Q/L309E/Q311H/N434Y
F770 3.00E-07 M252Y/T256A/N434Y
F771 4.00E-07 M252Y/E272A/N434Y
F772 3.80E-07 M252Y/K274A/N434Y
F773 3.90E-07 M252Y/V282A/N434Y
F774 4.00E-07 M252Y/N286A/N434Y
F775 6.20E-07 M252Y/K338A/N434Y
F776 3.90E-07 M252Y/K340A/N434Y
F777 3.90E-07 M252Y/E345A/N434Y
F779 3.90E-07 M252Y/N361A/N434Y
F780 3.90E-07 M252Y/Q362A/N434Y
F781 3.70E-07 M252Y/S375A/N434Y
F782 3.50E-07 M252Y/Y391A/N434Y
F783 4.00E-07 M252Y/D413A/N434Y
F784 5.00E-07 M252Y/L309A/N434Y
F785 7.40E-07 M252Y/L309H/N434Y
F786 2.80E-08 M252Y/S254T/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F787 8.80E-08 M252Y/S254T/T307Q/L309E/Q311A/N434Y
F788 4.10E-07 M252Y/N315A/N434Y
[表5-20]
F789 1.50E-07 M252Y/N315D/N434Y
F790 2.70E-07 M252Y/N315E/N434Y
F791 4.40E-07 M252Y/N315F/N434Y
F792 4.40E-07 M252Y/N315G/N434Y
F793 3.30E-07 M252Y/N315I/N434Y
F794 4.10E-07 M252Y/N315K/N434Y
F795 3.10E-07 M252Y/N315L/N434Y
F796 3.40E-07 M252Y/N315M/N434Y
F798 3.50E-07 M252Y/N315Q/N434Y
F799 4.10E-07 M252Y/N315R/N434Y
F800 3.80E-07 M252Y/N315S/N434Y
F801 4.40E-07 M252Y/N315T/N434Y
F802 3.30E-07 M252Y/N315V/N434Y
F803 3.60E-07 M252Y/N315W/N434Y
F804 4.00E-07 M252Y/N315Y/N434Y
F805 3.00E-07 M252Y/N325A/N434Y
F806 3.10E-07 M252Y/N384A/N434Y
F807 3.20E-07 M252Y/N389A/N434Y
F808 3.20E-07 M252Y/N389A/N390A/N434Y
F809 2.20E-07 M252Y/S254T/T256S/N434Y
F810 2.20E-07 M252Y/A378V/N434Y
F811 4.90E-07 M252Y/E380S/N434Y
F812 2.70E-07 M252Y/E382V/N434Y
F813 2.80E-07 M252Y/S424E/N434Y
F814 1.20E-07 M252Y/N434Y/Y436I
F815 5.50E-07 M252Y/N434Y/T437R
F816 3.60E-07 P238D/T250V/M252Y/T307P/N434Y
F817 9.80E-08 P238D/T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
F819 1.40E-07 P238D/M252Y/N286E/N434Y
F820 3.40E-07 L235K/S239K/M252Y/N434Y
F821 3.10E-07 L235R/S239K/M252Y/N434Y
F822 1.10E-06 P238D/T250Y/M252Y/W313Y/N434Y
F823 1.10E-06 P238D/T250Y/M252Y/W313F/N434Y
F828 2.50E-06 P238D/T250V/M252Y/I253V/N434Y
[表5-21]
F831 1.60E-06 P238D/T250V/M252Y/R255A/N434Y
F832 2.60E-06 P238D/T250V/M252Y/R255D/N434Y
F833 8.00E-07 P238D/T250V/M252Y/R255E/N434Y
F834 8.10E-07 P238D/T250V/M252Y/R255F/N434Y
F836 5.00E-07 P238D/T250V/M252Y/R255H/N434Y
F837 5.60E-07 P238D/T250V/M252Y/R255I/N434Y
F838 4.30E-07 P238D/T250V/M252Y/R255K/N434Y
F839 3.40E-07 P238D/T250V/M252Y/R255L/N434Y
F840 4.20E-07 P238D/T250V/M252Y/R255M/N434Y
F841 1.10E-06 P238D/T250V/M252Y/R255N/N434Y
F843 6.60E-07 P238D/T250V/M252Y/R255Q/N434Y
F844 1.30E-06 P238D/T250V/M252Y/R255S/N434Y
F847 3.40E-07 P238D/T250V/M252Y/R255W/N434Y
F848 8.30E-07 P238D/T250V/M252Y/R255Y/N434Y
F849 3.30E-07 M252Y/D280A/N434Y
F850 2.90E-07 M252Y/D280E/N434Y
F852 3.30E-07 M252Y/D280G/N434Y
F853 3.20E-07 M252Y/D280H/N434Y
F855 3.20E-07 M252Y/D280K/N434Y
F858 3.20E-07 M252Y/D280N/N434Y
F860 3.30E-07 M252Y/D280Q/N434Y
F861 3.20E-07 M252Y/D280R/N434Y
F862 3.00E-07 M252Y/D280S/N434Y
F863 2.70E-07 M252Y/D280T/N434Y
F867 2.80E-07 M252Y/N384A/N389A/N434Y
F868 2.00E-08 G236A/S239D/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y
F869 G236A/S239D
F870 7.30E-08 L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
F871 7.10E-08 L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y
F872 1.30E-07 L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y
F873 1.20E-07 L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y
F875 4.80E-07 M252Y/N434Y/Y436A
F877 8.30E-07 M252Y/N434Y/Y436E
F878 1.90E-07 M252Y/N434Y/Y436F
[表5-22]
F879 9.20E-07 M252Y/N434Y/Y436G
F880 3.90E-07 M252Y/N434Y/Y436H
F881 3.10E-07 M252Y/N434Y/Y436K
F882 1.30E-07 M252Y/N434Y/Y436L
F883 2.10E-07 M252Y/N434Y/Y436M
F884 4.00E-07 M252Y/N434Y/Y436N
F888 4.80E-07 M252Y/N434Y/Y436S
F889 2.20E-07 M252Y/N434Y/Y436T
F890 1.10E-07 M252Y/N434Y/Y436V
F891 1.70E-07 M252Y/N434Y/Y436W
F892 7.10E-08 M252Y/S254T/N434Y/Y436I
F893 9.80E-08 L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436I
F894 9.20E-08 L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436I
F895 2.10E-08 L235K/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y
F896 2.00E-08 L235R/S239K/M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N315E/N434Y
F897 9.70E-08 M252Y/N315D/N384A/N389A/N434Y
F898 1.70E-07 M252Y/N315E/N384A/N389A/N434Y
F899 1.10E-07 M252Y/N315D/G316A/N434Y
F900 1.70E-07 M252Y/N315D/G316D/N434Y
F901 1.30E-07 M252Y/N315D/G316E/N434Y
F902 2.20E-07 M252Y/N315D/G316F/N434Y
F903 2.30E-07 M252Y/N315D/G316H/N434Y
F904 1.00E-07 M252Y/N315D/G316I/N434Y
F905 1.30E-07 M252Y/N315D/G316K/N434Y
F906 1.50E-07 M252Y/N315D/G316L/N434Y
F907 1.30E-07 M252Y/N315D/G316M/N434Y
F908 1.50E-07 M252Y/N315D/G316N/N434Y
F909 1.30E-07 M252Y/N315D/G316P/N434Y
F910 1.40E-07 M252Y/N315D/G316Q/N434Y
F911 1.30E-07 M252Y/N315D/G316R/N434Y
F912 1.20E-07 M252Y/N315D/G316S/N434Y
F913 1.10E-07 M252Y/N315D/G316T/N434Y
F914 1.50E-07 M252Y/N315D/G316V/N434Y
F915 2.30E-07 M252Y/N315D/G316W/N434Y
[表5-23]
F917 2.50E-07 M252Y/N286S/N434Y
F918 2.80E-07 M252Y/D280E/N384A/N389A/N434Y
F919 3.30E-07 M252Y/D280G/N384A/N389A/N434Y
F920 2.50E-07 M252Y/N286S/N384A/N389A/N434Y
F921 1.20E-07 M252Y/N286E/N384A/N389A/N434Y
F922 5.90E-08 L235K/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I
F923 6.00E-08 L235R/S239K/M252Y/N286E/N434Y/Y436I
F924 3.40E-08 L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I
F925 3.20E-08 L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I
F926 1.10E-07 L235K/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436I
F927 1.00E-07 L235R/S239K/M252Y/S254T/N434Y/Y436I
F928 2.90E-08 M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I
F929 2.90E-08 M252Y/S254T/T307Q/Q311A/N434Y/Y436I
F930 1.40E-07 P238D/T250V/M252Y/N286E/N434Y
F931 1.20E-07 P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436I
F932 3.20E-07 T250V/M252Y/N434Y
F933 3.00E-07 L234R/P238D/T250V/M252Y/N434Y
F934 3.10E-07 G236K/P238D/T250V/M252Y/N434Y
F935 3.20E-07 G237K/P238D/T250V/M252Y/N434Y
F936 3.20E-07 G237R/P238D/T250V/M252Y/N434Y
F937 3.10E-07 P238D/S239K/T250V/M252Y/N434Y
F938 1.60E-07 L235K/S239K/M252Y/N434Y/Y436V
F939 1.50E-07 L235R/S239K/M252Y/N434Y/Y436V
F940 1.50E-07 P238D/T250V/M252Y/N434Y/Y436V
F941 1.20E-08 M252Y/N286E/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
F942 4.20E-08 L235K/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
F943 4.00E-08 L235R/S239K/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
F944 1.70E-07 T250V/M252Y/N434Y/Y436V
F945 1.70E-08 T250V/M252Y/V308P/N434Y/Y436V
F946 4.30E-08 T250V/M252Y/T307Q/Q311A/N434Y/Y436V
F947 1.10E-08 T250V/M252Y/T307Q/V308P/Q311A/N434Y/Y436V
F954 5.30E-07 M252Y/N434Y/H435K/Y436V
F957 7.70E-07 M252Y/N434Y/H435N/Y436V
F960 8.00E-07 M252Y/N434Y/H435R/Y436V
[表5-24]
Figure BDA0002222475850001361
[表5-25]
Figure BDA0002222475850001371
[表5-26]
Figure BDA0002222475850001381
[表5-27]
Figure BDA0002222475850001391
[表5-28]
Figure BDA0002222475850001401
[表5-29]
Figure BDA0002222475850001411
[表5-30]
Figure BDA0002222475850001421
[表5-31]
Figure BDA0002222475850001431
[表5-32]
Figure BDA0002222475850001441
[表5-33]
Figure BDA0002222475850001442
本发明的非限定性的一个方案中，适宜地使用Fc区氨基酸以EU编号表示的位点中选自257位、308位、428位和434位的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区对应位点的氨基酸不同的Fc区。作为这样的Fc区的非限定性的一个实例，可列举含有Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
257位氨基酸为Ala，
308位氨基酸为Pro，
428位氨基酸为Leu，和
434位氨基酸为Tyr。
Fcγ受体
Fcγ受体是说可与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体Fc区结合的受体，实质上指Fcγ受体基因编码的蛋白家族的任意成员。对于人，该家族包括：包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)，和包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)，以及任何未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但不限于此。FcγR包括人、小鼠、大鼠、兔和猴来源的，但不限于此，可以是任何生物来源。小鼠FcγR类包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但不限于此。作为这样的Fcγ受体的适宜实例，可列举人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)和/或FcγRIIIb(CD16)。FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQID NO：19(NM_000566.3)和20(NP_000557.1)，FcγRIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：21(BC020823.1)和22(AAH20823.1)，FcγRIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：23(BC146678.1)和24(AAI46679.1)，FcγRIIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：25(BC033678.1)和26(AAH33678.1)，以及FcγRIIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：27(BC128562.1)和28(AAI28563.1)(括号内是RefSeq登录号)。Fcγ受体是否具有与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体Fc区结合的活性，除了上文记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选(增强的发光接近均质测定(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay))或利用表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE法等确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010)。
此外，“Fc配体”或“效应配体”是与抗体Fc区结合形成Fc/Fc配体复合体的任意生物来源的分子，优选指多肽。Fc配体与Fc的结合优选引起一种或更多种的效应子功能。Fc配体包括Fc受体、FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、C1q、C3、甘露多糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌(staphylococcus)的蛋白A、葡萄球菌的蛋白G和病毒的FcγR，但不限于此。Fc配体还包括是与FcγR同源的Fc受体家族的Fc受体同源物(FcRH)(Davis等，(2002)ImmunologicalReviews 190，123-136)。Fc配体还可包括与Fc结合的未发现的分子。
对于包括FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)以及包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)，与IgG的Fc部分结合的α链和具有向细胞内传递活化信号的ITAM的共有γ链缔合。另一方面，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)自身的胞质结构域中不包含ITAM。这些受体在巨噬细胞或肥大细胞、抗原提呈细胞等众多免疫细胞上表达。这些受体通过与IgG的Fc部分结合而传递的活化信号促进巨噬细胞的吞噬能力或炎症性细胞因子的产生、肥大细胞的脱粒、抗原提呈细胞的机能亢进。上述具有传递活化信号的能力的Fcγ受体在本发明中也称为活化型Fcγ受体。
另一方面，FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)自身的胞质结构域包含传递抑制型信号的ITIM。B细胞中，通过FcγRIIb与B细胞受体(BCR)的交联抑制来自BCR的活化信号，从而抑制BCR的抗体产生。巨噬细胞中，通过FcγRIII与FcγRIIb的交联抑制吞噬能力或炎症性细胞因子的产生能力。上述具有传递抑制信号的能力的Fcγ受体在本发明中也称为抑制型Fcγ受体。
Fcγ受体结合活性
本发明的某一方案中，提供诱导免疫应答的药物组合物，其中，所述药物组合物包含含有FcRn结合结构域的抗原结合分子作为有效成分，该FcRn结合结构域含有Fc区的人Fcγ受体结合活性与人IgG的Fc对人Fcγ受体的结合活性相比高的Fc区。
Fc区的人Fcγ受体结合活性，对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中任一个的人Fcγ受体的结合活性，与人IgG的Fc对这些人Fcγ受体的结合活性相比是否高，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选(增强的发光接近均质测定)或利用表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE法等确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010)。
ALPHA筛选是通过使用供体和受体两种珠的ALPHA技术基于下述原理实施。仅当与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子发生生物学相互作用，两种珠接近的状态时，检测到发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周围的氧转变成激发态的单线态氧。单线态氧扩散到供体珠周围，一旦到达接近的受体珠，则引起珠内的化学发光反应，最终发光。在与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不到达受体珠，因此不发生化学发光反应。
例如，包含生物素标记的Fc区的抗原结合分子与供体珠结合，带谷胱甘肽S转移酶(GST)标签的Fcγ受体与受体珠结合。在竞争的具有改变Fc区的抗原结合分子不存在下，具有野生型Fc区的多肽复合体与Fcγ受体发生相互作用，产生520-620nm的信号。具有不带标签的改变Fc区的抗原结合分子与具有野生型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体间的相互作用。通过定量竞争的结果所表现出的荧光减少可确定相对结合亲和性。使用Sulfo-NHS-生物素等将抗体等抗原结合分子生物素化是公知的。作为使Fcγ受体带有GST标签的方法，可适宜地采用将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸在保持于有效连接有框内融合而成的融合基因的载体的细胞等中表达，并利用谷胱甘肽柱纯化的方法等。所得信号通过例如使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad公司、San Diego)等软件拟合于利用非线性回归分析的单位点竞争(one-site competition)模型来适宜地分析。
将观察相互作用的物质的一方(配体)固定到传感器芯片的金薄膜上，从传感器芯片的背面照射光使得在金薄膜与玻璃的界面上发生全反射，那么反射光的一部中形成反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流过传感器芯片表面使配体与分析物结合，那么固定的配体分子的质量增加，传感器芯片表面的溶剂折射率变化。取决于该折射率的变化，SPR信号的位置发生移位(反之，若结合解离，则信号的位置恢复)。Biacore***将上述移位的量即传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据表示(传感图)。由传感图的曲线求得动力学：结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由该常数之比求得亲和性(KD)。BIACORE法中也可适宜地使用抑制测定法。抑制测定法的实例记载于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010。
测定本发明的抗原结合分子所含的Fc区与Fcγ受体的结合活性的pH条件可适宜使用pH酸性范围或pH中性范围条件。作为测定本发明的抗原结合分子所含的Fc区与Fcγ受体的结合活性的条件的pH中性范围，通常指pH 6.7～pH 10.0。优选为通过pH 7.0～pH 8.0的任意pH值所表示的范围，优选选自pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0，特别优选为与生物体内的血浆中(血中)pH接近的pH 7.4。本发明中，作为本发明的抗原结合分子所含的Fc区与Fcγ受体具有结合活性的条件的pH酸性范围，通常指pH 4.0～pH6.5。优选指pH5.5～pH6.5，特别优选指与生物体内的早期内体内pH接近的pH5.8～pH6.0。作为用于测定条件的温度，Fc区与人Fcγ受体的结合亲和性可在10℃～50℃的任意温度下进行评价。优选地，为了确定人Fc区与Fcγ受体的结合亲和性，使用15℃～40℃的温度。更优选地，诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34和35℃中任一个的20℃～35℃的任意温度也同样地用于确定Fc区与Fcγ受体的结合亲和性。25℃的温度是发明的方案的一个非限定性实例。
本说明书中，Fc区的人Fcγ受体结合活性，对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中任一个的人Fcγ受体的结合活性，与人IgG的Fc区对这些人Fcγ受体的结合活性相比高，是指，例如基于上述分析方法，与作为对照的含有人IgG的Fc区的抗原结合分子的结合活性相比，含有被检Fc区的抗原结合分子的结合活性显示105％以上、优选110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特别优选150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％以上、250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上的结合活性。
Fc区的Fcγ受体结合活性与天然型Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fc区可通过改变天然型Fc区氨基酸来制作。这里提及的天然型Fc区是指EU编号297位的糖链为岩藻糖连接型的复合型糖链的天然型Fc区。Fc区的Fcγ受体结合活性与天然型Fc区的Fcγ受体结合活性相比是否高可适宜地使用前述结合活性项目中记载的方法实施。
本发明中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区氨基酸序列不同的氨基酸序列。起始Fc区的修饰改变体ガ只要可在pH中性范围与人Fcγ受体结合，就可使用任何Fc区作为起始结构域。作为起始Fc区的实例，可适宜地列举人IgG抗体的Fc区、即EU编号297位的糖链为岩藻糖连接型的复合型糖链的天然型Fc区。此外，将已加入改变的Fc区作为起始Fc区并加入进一步的改变而成的Fc区也适宜作为本发明的Fc区使用。起始Fc区可指多肽自身、含有起始Fc区的组合物或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可包括抗体项目中概述的由重组产生的公知的IgG抗体Fc区。起始Fc区的来源没有限定，可由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，可适宜地列举选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类的生物。在其他方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩或人获得。优选地，起始Fc区可由人IgG1获得，但不限于IgG的特定类别。这是指可适宜使用人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区作为起始Fc区。同样地，本说明书中，是指可将来自前述任意生物的IgG的任意类或亚类的Fc区作为优选起始Fc区使用。天然存在的IgG变体或***作的类型的实例记载于公知文献(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6)，685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4)，460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4)，195-202、WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635和WO2006/105338)，但不限于此。
作为改变的实例，包括一个以上的变异，例如置换成与起始Fc区氨基酸不同的氨基酸残基的变异、向起始Fc区氨基酸***一个以上的氨基酸残基或从起始Fc区氨基酸缺失一个以上的氨基酸等。优选地，改变后的Fc区氨基酸序列包含含有非天然存在的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这样的变体与起始Fc区必然具有不足100％的序列同一性或相似性。在优选实施方案中，变体具有与起始Fc区氨基酸序列约75％～不足100％的氨基酸序列同一性或相似性，更优选约80％～不足100％、更优选约85％～不足100％、更优选约90％～不足100％、最优选约95％～不足100％的同一性或相似性的氨基酸序列。本发明的非限定性的一个方案中，起始Fc区与本发明的改变Fc区之间存在至少一个氨基酸的差异。起始Fc区与改变Fc区的氨基酸的不同可适宜地通过特别是前述的以EU编号特定的氨基酸残基位置的特定氨基酸的不同来规定。
为了改变Fc区氨基酸，可适宜地采用位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。此外，作为置换为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法，也可采用多种公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35，225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11)，6353-6357)。例如，也可适宜地使用非天然氨基酸与终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制基因tRNA连接的tRNA的无细胞翻译***(CloverDirect(Protein Express))等。
本发明的抗原结合分子所含的具有pH中性范围的Fcγ受体结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体而言，通过改变作为起始Fc区使用的人IgG型免疫球蛋白氨基酸来获得具有pH中性范围的Fcγ受体结合活性的Fc区。作为用于改变的优选IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。作为人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区的合适实例，可适宜地使用人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。这些Fc区的结构域记载于SEQ ID NO：11(RefSeq登录号AAC82527.1的N末端添加A)、12(RefSeq登录号AAB59393.1的N末端添加A)、13(RefSeq登录号CAA27268.1)、14(RefSeq登录号AAB59394.1的N末端添加A)。此外，将具有以某特定同种型的抗体作为起始Fc区改变而成的Fc区的抗原结合分子作为被检物使用的情况下，通过将具有该特定同种型IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子作为对照使用，验证含有该改变Fc区的抗原结合分子所致的对Fcγ受体结合活性的效果。如上述，适宜地选择含有验证为Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
对于向其它氨基酸的改变，只要具有pH中性范围的Fcγ受体结合活性或提高中性范围的对Fcγ受体结合的结合活性，就可改变任意位置的氨基酸。抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为人Fc区的情况下，优选包含带来pH中性范围的Fcγ受体结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。作为用于增强pH中性范围条件下的Fcγ受体结合活性的氨基酸改变，例如在WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260和WO2006/023403等中有报告。
作为可实现这样的改变的氨基酸，例如可列举以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。通过这些氨基酸的改变，增强IgG型免疫球蛋白Fc区的pH中性范围的Fcγ受体结合。
为了用于本发明，作为特别优选的改变，例如可列举Fc区的以EU编号表示的：
221位氨基酸为Lys或Tyr中任一个，
222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中任一个，
224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中任一个，
227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中任一个，
231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
233位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
234位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
235位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
236位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
237位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
238位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
239位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中任一个，
243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中任一个，
244位氨基酸为His，
245位氨基酸为Ala，
246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
247位氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中任一个，
249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中任一个，
250位氨基酸为Glu或Gln中任一个，
251位氨基酸为Phe，
254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中任一个，
255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中任一个，
256位氨基酸为Ala、Met或Pro中任一个，
258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中任一个，
260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中任一个，
263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
264位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
265位氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中任一个，
266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
267位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
268位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中任一个，
269位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
270位氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
271位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
272位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
273位氨基酸为Phe或Ile中任一个，
274位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
275位氨基酸为Leu或Trp中任一个，
276位氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
278位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
279位氨基酸为Ala，
280位氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中任一个，
281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中任一个，
282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
283位氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中任一个，
284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中任一个，
285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中任一个，
286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中任一个，
288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中任一个，
290位氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中任一个，
292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中任一个，
293位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
294位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
295位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
296位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中任一个，
297位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
298位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
299位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
300位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
302位氨基酸为Ile，
303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中任一个，
304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中任一个，
305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中任一个，
311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中任一个，
313位氨基酸为Phe，
315位氨基酸为Leu，
317位氨基酸为Glu或Gln，
318位氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中任一个，
320位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
322位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
323位氨基酸为Ile，
324位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
325位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
326位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
327位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
328位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
329位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
330位氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
331位氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
332位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
333位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中任一个，
334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中任一个，
335位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中任一个，
337位氨基酸为Glu、His或Asn中任一个，
339位氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中任一个，
376位氨基酸为Ala或Val中任一个，
377位氨基酸为Gly或Lys中任一个，
378位氨基酸为Asp，
379位氨基酸为Asn，
380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中任一个，
382位氨基酸为Ala或Ile中任一个，
385位氨基酸为Glu，
392位氨基酸为Thr，
396位氨基酸为Leu，
421位氨基酸为Lys，
427位氨基酸为Asn，
428位氨基酸为Phe或Leu中任一个，
429位氨基酸为Met，
434位氨基酸为Trp，
436位氨基酸为Ile，
440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中任一个。此外，对改变的氨基酸数量没有特别限定，可仅改变一处的氨基酸，也可改变二处以上的氨基酸。作为二处以上的氨基酸改变的组合，例如可列举表6(表6-1～表6-3)记载的这样的组合。
[表6-1]
Figure BDA0002222475850001591
[表6-2]
F243L/V264I S239D/N297D/I332E
H268D/A330Y S239D/S298A/I332E
H268E/A330Y S239D/V264I/I332E
K246H/I332E S239E/N297D/I332E
L234D/I332E S239E/V264I/I332E
L234E/I332E S239N/A330L/I332E
L234G/I332E S239N/A330Y/I332E
L234I/I332E S239N/S298A/I332E
L234I/L235D S239Q/V264I/I332E
L234Y/I332E V264E/N297D/I332E
L235D/I332E V264I/A330L/I332E
L235E/I332E V264I/A330Y/I332E
L235I/I332E V264I/S298A/I332E
L235S/I332E Y296D/N297D/1332E
L328A/I332D Y296E/N297D/I332E
L328D/I332D Y296H/N297D/I332E
L328D/I332E Y296N/N297D/I332E
L328E/I332D Y296Q/N297D/I332E
L328E/I332E Y296T/N297D/I332E
L328F/I332D D265Y/N297D/T299L/I332E
L328F/I332E F241E/F243Q/V262T/V264E
L328H/I332E F241E/F243R/V262E/V264R
L328I/I332D F241E/F243Y/V262T/V264R
L328I/I332E F241L/F243L/V262I/V264I
L328M/I332D F241R/F243Q/V262T/V264R
L328M/I332E F241S/F243H/V262T/V264T
L328N/I332D F241W/F243W/V262A/V264A
L328N/I332E F241Y/F243Y/V262T/V264T
L328Q/I332D I332E/A330Y/H268E/A327A
L328Q/I332E N297D/I332E/S239D/A330L
L328T/I332D N297D/S298A/A330Y/I332E
L328T/I332E S239D/A330Y/I332E/K326E
L328V/I332D S239D/A330Y/I332E/K326T
L328V/I332E S239D/A330Y/I332E/L234I
L328Y/I332D S239D/A330Y/I332E/L235D
[表6-3]
L328Y/I332E S239D/A330Y/I332E/V240I
N297D/I332E S239D/A330Y/I332E/V264T
N297E/I332E S239D/A330Y/I332E/V266I
N297S/I332E S239D/D265F/N297D/I332E
P227G/I332E S239D/D265H/N297D/I332E
P230A/E233D S239D/D265I/N297D/I332E
Q295E/I332E S239D/D265L/N297D/I332E
R255Y/I332E S239D/D265T/N297D/I332E
S239D/I332D S239D/D265V/N297D/I332E
S239D/I332E S239D/D265Y/N297D/I332E
S239D/I332N S239D/I332E/A330Y/A327A
S239D/I332Q S239D/I332E/H268E/A327A
S239E/D265G S239D/I332E/H268E/A330Y
S239E/D265N S239D/N297D/I332E/A330Y
S239E/D265Q S239D/N297D/I332E/K326E
S239E/I332D S239D/N297D/I332E/L235D
S239E/I332E S239D/V264I/A330L/I332E
S239E/I332N S239D/V264I/S298A/I332E
S239E/I332Q S239E/V264I/A330Y/I332E
S239N/I332D F241E/F243Q/V262T/V264E/I332E
S239N/I332E F241E/F243R/V262E/V264R/I332E
S239N/I332N F241E/F243Y/V262T/V264R/I332E
S239N/I332Q F241R/F243Q/V262T/V264R/I332E
S239Q/1332D S239D/I332E/H268E/A330Y/A327A
S239Q/I332E S239E/V264I/S298A/A330Y/I332E
S239Q/I332N F241Y/F243Y/V262T/V264T/N297D/I332E
S267E/L328F G236D/S267E
S239D/S267E
。
糖链被修饰的Fc区
作为本发明提供的Fc区，也可包括进行了下述修饰的Fc区，使得与该Fc区连接的糖链组成为连接岩藻糖缺失糖链的Fc区比例变高、或附加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区比例变高。已知若从与抗体Fc区连接的N-糖苷结合的复合型糖链还原末端的N-乙酰葡糖胺除去岩藻糖残基，则对FcγRIIIa的亲和性增强(非专利文献20)。已知含有这样的Fc区的IgG1抗体的下述ADCC活性增强，所以含有该Fc区的抗原结合分子也可用作本发明的药物组合物所含的抗原结合分子。作为从与抗体Fc区连接的N-糖苷结合的复合型糖链还原末端的N-乙酰葡糖胺除去了岩藻糖残基的抗体，例如下述抗体是公知的：
糖基化修饰的抗体(WO1999/054342等)，
糖链附加的岩藻糖缺失的抗体(WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)，
具备具有平分型GlcNAc的糖链的抗体(WO2002/079255等)是公知的。这些抗体的制造方法可适用于抗原结合分子的制造方法，所述抗原结合分子包含进行了下述修饰的改变Fc区，使得与本发明的Fc区连接的糖链组成为岩藻糖缺失糖链的Fc区比例变高、或附加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区比例变高。
抗原结合分子
本发明中，含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的分子以表示的最广泛的含义使用，具体而言，只要它们显示抗原结合活性，就可包括各种分子类型。例如，作为抗原结合结构域与Fc区结合的分子的实例，可列举抗体。抗体可包括单一的单克隆抗体(包括激动抗体和拮抗抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。另外作为抗体片段使用的情况，可适宜地列举抗原结合结构域和抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2、scFv和Fv)。现有的稳定α/β桶蛋白结构域等立体结构域作为支架(基础)使用、仅其一部分结构为了构建抗原结合结构域而文库化的支架分子也包括在本发明的抗原结合分子中。
本发明的抗原结合分子可包含介导FcRn结合和Fcγ受体结合的Fc区的至少一部分。例如，在非限定性的一个方案中，抗原结合分子可为抗体或Fc融合蛋白。融合蛋白是指包含含有第一氨基酸序列的多肽的嵌合多肽，该含有第一氨基酸序列的多肽与在天然情况下其不天然连接的具有第二氨基酸序列的多肽连接。例如，融合蛋白可包括非免疫球蛋白多肽，该非免疫球蛋白多肽包含：编码Fc区的至少一部分(例如，赋予FcRn结合的Fc区部分或赋予Fcγ受体结合的Fc区部分)的氨基酸序列，和例如编码受体的配体结合结构域或配体的受体结合结构域的氨基酸序列。氨基酸序列可在一起转移到融合蛋白中的各自的蛋白中存在，或它们通常可在同一蛋白中存在，进入融合多肽中的新的重组。融合蛋白例如可通过化学合成，或通过制作以所需的关系编码肽区的的多核苷酸，将其表达的基因重组方法来制作。
本发明的各结构域可通过多肽键直接连接，也可经由接头连接。作为接头，可使用通过基因工程导入而得到的任意肽接头或合成化合物接头(例如，Protein Engineering(1996)9(3)，299-305)中公开的接头等，本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可根据目的适宜地选择，优选的长度为5个氨基酸以上(上限没有特别限定，通常30个氨基酸以下，优选20个氨基酸以下)，特别优选15个氨基酸。
例如，肽接头的情况，可适宜地列举：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：29)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：30)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：31)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：32)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：33)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：34)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：35)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：36)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：31))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：32))n
[n为1以上的整数]等。但是，本领域技术人员可根据目的适宜地选择肽接头的长度或序列。
合成化学物接头(化学交联剂)是常用于肽的交联的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂有市售。
连接各结构域的接头使用多个的情况下，可全部使用同种的接头，也可使用不同种的接头。
此外，除了上述记载中例示的接头之外，也可适宜地使用例如具有His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等肽标签的接头。此外，也可适宜地利用通过氢键、二硫键、共价键、离子相互作用或这些键的组合相互连接的性质。例如，利用抗体的CH1与CL间的亲和性，或利用异源Fc区缔合时以前述双特异性抗体为来源的Fc区。此外，也可适宜地利用结构域间形成的二硫键。
为了将各结构域通过肽键连接，将编码该结构域的多核苷酸框内连接。作为将多核苷酸框内连接的方法，限制性片段的连接或融合PCR、重叠PCR等方法是公知的，在本发明的抗原结合分子的制作中也可适宜地单独或组合使用这些方法。本发明中，用语“被连接”、“被融合”、“连接”或“融合”可互换使用。这些用语是指通过包括上述化学结合手段或重组方法在内的全部手段连接两个以上的多肽等组分或成分以形成一个结构。框内融合是指，在两个以上的组分或成分为多肽时，通过以维持该多肽的正确阅读框的方式连接而将用于形成长的阅读框的两个以上的阅读框单位连接。将二分子的Fab用作抗原结合结构域的情况下，作为该抗原结合结构域与Fc区不经由接头而通过肽键框内连接的作为本发明的抗原结合分子的抗体可作为本申请的适宜的抗原结合分子使用。
中和活性
本发明的一个方案中，提供诱导免疫应答的药物组合物，其中，该药物组合物包含含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域、具有针对抗原的中和活性的抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合结构域的抗原结合活性随离子浓度条件而变化，该FcRn结合结构域具有pH中性范围的FcRn结合活性。一般地，中和活性是指抑制病毒或毒素等对细胞具有生物学活性的配体的该生物学活性的活性。即，具有中和活性的物质指与该配体或该配体所结合的受体结合而抑制该配体与受体的结合的物质。因中和活性而与配体的结合被阻断的受体不能发挥通过该受体的生物学活性。抗原结合分子为抗体的情况下，这样的具有中和活性的抗体一般称为中和抗体。某被检物的中和活性可通过在该被检物的存在或不存在下的条件之间比较配体存在下的生物学活性来测定。
例如，被认为是IL-6受体的主要配体的配体可适宜地列举SEQ ID NO：37所表示的IL-6。作为其氨基末端形成胞外结构域的I型膜蛋白的IL-6受体与因IL-6诱导而二聚化的gp130受体一起形成异四聚体(HEINRICH等(Biochem.J.(1998)334，297-314))。由于该异四聚体的形成，与gp130受体缔合的Jak被活化。Jak进行自身磷酸化和受体的磷酸化。受体和Jak的磷酸化位点对于Stat3等具有SH2的属于Stat家族的分子或MAP激酶、PI3/Akt、其它的具有SH2的蛋白或衔接头发挥结合位点的作用。接着，与gp130受体结合的Stat因Jak而磷酸化。磷酸化的Stat形成二聚体转移到核内，调节靶基因的转录。Jak或Stat也可经由其它类的受体参与信号级联。不受控制的IL-6的信号级联在自身免疫疾病的病况或炎症、多发性骨髓瘤或***癌等癌中被观察到。可作为癌基因起作用的Stat3在许多癌中稳态性活化。***癌和多发性骨髓瘤中，来自IL-6受体的信号级联与来自上皮生长因子受体(EGFR)家族成员的信号级联之间存在交叉(crosstalk)(Ishikawa等(J.Clin.Exp.Hematopathol.(2006)46(2)，55-66))。
这样的细胞内的信号级联由于各细胞种类而不同，因此各作为目标的靶细胞可设定适宜的靶分子，并不限于上述因子。通过测定生物体内信号的活化，可评价中和活性。此外，以对生物体内信号级联下游存在的靶基因的转录诱导作用为指标，也可检测生物体内信号的活化。靶基因转录活性的变化可通过报道基因测定(reporter assay)的原理检测。具体而言，在靶基因的转录因子或启动子区下游配置GFP(绿色荧光蛋白(GreenFluorescence Protein))或萤光素酶等报道基因，测定该报道基因活性，从而可将转录活性变化作为报道基因活性来测定。生物体内信号的活化的测定试剂盒可适宜使用市售试剂盒(例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等)。
此外，通常作为测定作用于在促进细胞生长方向上起作用的信号级联的EGF受体家族等的受体配体的中和活性的方法，可通过测定靶细胞的生长活性来评价中和抗体的中和活性。例如，作为评价或测定基于抗HB-EGF抗体对例如HB-EGF等其生长因EGF家族生长因子而受到促进的细胞的生长的中和活性的抑制效果的方法，可适宜地使用以下方法。作为在试管内评价或测定该细胞生长抑制活性的方法，可使用以活细胞对培养基中添加的[3H]标记的胸苷的摄入作为DNA复制能力的指标进行测定的方法。作为更简便的方法，可使用在显微镜下测量将台盼蓝等染料排除到细胞外的能力的染料排除法或MTT法。后者利用：活细胞具有将四唑鎓盐MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑)转变为蓝色的甲
Figure BDA0002222475850001661
(formazan)产物的能力。更具体而言，向被检细胞培养液中与配体一起添加被检抗体，经过一定时间后，将MTT溶液加入培养液中静置一定时间，从而使MTT被摄入到细胞中。结果，黄色化合物MTT因细胞内的线粒体内的琥珀酸脱氢酶转变成蓝色化合物。使该蓝色生成物溶解显色后，通过测定其吸光度作为活细胞数的指标。除了MTT以外，MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂也已有市售(nacalai tesque等)，可适宜地使用。测定活性时，将作为对照抗体的与抗HB-EGF抗体具有相同的同种型的抗体但不具有该细胞生长抑制活性的结合抗体、和抗HB-EGF抗体相同地使用，通过抗HB-EGF抗体显示与对照抗体相比强的细胞生长抑制活性，可判定活性。
作为用于评价活性的细胞，例如也可适宜地使用作为其生长因HB-EGF而受促进的细胞的、卵巢癌细胞RMG-1细胞株或用连接有编码人EGFR胞外结构域与小鼠GCSF受体胞内结构域框内融合而成的融合蛋白hEGFR/mG-CSFR的基因以表达的载体转化的小鼠Ba/F3细胞等。如此，本领域技术人员可通过适宜地选择用于评价活性的细胞而用于前述细胞生长活性的测定。
细胞毒活性
本发明的一个方案中，提供诱导免疫应答的药物组合物，其中，该药物组合物包含含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域、具有针对表达抗原的细胞的细胞毒活性的抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合结构域的抗原结合活性随离子浓度条件而变化，该FcRn结合结构域具有pH中性范围的FcRn结合活性。本发明中细胞毒活性可列举例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)活性、补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity：CDC)活性等。本发明中，CDC活性是指补体***的细胞毒活性。另一方面，ADCC活性是指，特异性抗原结合分子附着于表达抗原的细胞的表面抗原时，表达Fcγ受体的细胞(免疫细胞等)经由Fcγ受体与其Fc部分结合，赋予靶细胞损伤的活性。目标抗原结合分子是否具有ADCC活性或是否具有CDC活性可通过公知方法进行测定(例如，Current protocols in Immunology，第7章.Immunologicstudies in humans，Coligan等编(1993)等)。
具体而言，首先实施效应细胞、补体溶液、靶细胞的制备。
(1)效应细胞的制备
从由CBA/N小鼠等摘出的脾在RPMI1640培养基(Invitrogen)中分离脾细胞。可通过将用在包含10％胎牛血清(FBS、HyClone)的相同培养基洗涤的该脾细胞浓度制备成5×106/ml，来制备效应细胞。
(2)补体溶液的制备
可通过用含10％FBS的培养基(Invitrogen)将Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)稀释至10倍，来制备补体溶液。
(3)靶细胞的制备
可通过将表达抗原的细胞在含有0.2mCi的51Cr-铬酸钠(GE Healthcare Bio-Sciences)以及10％FBS的DMEM培养基中于37℃培养1小时，对该靶细胞进行放射性标记。放射性标记后，可通过将用含10％FBS的RPMI1640培养基洗涤3次的细胞浓度制备成2×105/ml，来制备该靶细胞。
ADCC活性或CDC活性可通过下文所述方法测定。测定ADCC活性时，使96孔U底板(Becton Dickinson)中加入的各50μl的靶细胞和抗原结合分子在冰上反应15分钟。然后，将加入100μl效应细胞的该板在二氧化碳培养箱内静置4小时。抗体终浓度可设定为例如0或10μg/ml等的浓度。静置后，由各孔回收的100μl上清的放射活性使用γ计数器(COBRAIIAUTO-GAMMA，型号D5005，PackardInstrument Company)测定。可利用测定值基于(A-C)/(B-C)×100的算式计算细胞毒活性(％)。A表示各试样的放射活性(cpm)，B表示加入了1％NP-40(nacalai tesque)的试样的放射活性(cpm)，C表示包含仅靶细胞的试样的放射活性(cpm)。
另一方面，在测定CDC活性时，使96孔平底板(Becton Dickinson)加入的各50μl的靶细胞和抗原结合分子在冰上反应15分钟。然后，将加入了100μl补体溶液的该板在二氧化碳培养箱内静置4小时。抗体终浓度可设定为例如0或3μg/ml等的浓度。静置后，由各孔回收的100μl上清的放射活性利用γ计数器测定。细胞毒活性可与ADCC活性的测定相似地计算。
免疫应答
本发明的非限定性的一个方案中，提供诱导针对抗原的免疫应答的药物组合物，其中，该药物组合物包含含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域的抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合结构域对前述抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，该FcRn结合结构域具有pH中性范围的FcRn结合活性。
是否诱导了免疫应答，可通过测定给予了包含抗原结合分子作为有效成分的诱导针对前述抗原的免疫应答的药物组合物的生物体的应答反应来评价。作为生物体的应答反应，主要可列举细胞免疫(诱导识别与MHC I类结合的抗原的肽片段的细胞毒性T细胞)和体液免疫(诱导与抗原结合的抗体的产生)两种免疫应答。作为评价体液免疫的诱导(免疫应答)的方法，可列举在体内评价针对抗原的抗体的产生的方法。
通过本发明的诱导免疫应答的药物组合物是否诱导了体液免疫，可通过检测由给予了该药物组合物的生物体分离的末梢血中该生物体来源的针对成为该药物组合物所含的抗原结合分子的靶标的抗原的抗体来评价。针对抗原的抗体效价的测定方法可通过应用使用本领域技术人员公知的ELISA、ECL、SPR的、与给予分子特异性结合的分子的测定方法来实施(J Pharm Biomed Anal.2011Jul 15；55(5)：878-88)。
通过本发明的诱导免疫应答的药物组合物是否获得了细胞免疫，可通过检测由给予了该药物组合物的生物体分离的末梢血中的具有表达成为该药物组合物所含的抗原结合分子靶标的抗原特异性的CD8的记忆型表型的T细胞亚组来评价。作为表达CD8的细胞的具有记忆型表型的群为异质细胞群。即，包括应答抗原而快速***的中央记忆细胞(central memory cell)和显示细胞毒性等效应子功能的记忆的效应记忆细胞(effectormemory cell)。这些亚组相互不排斥。即，细胞可能快速***，但也可能损伤提呈抗原的靶细胞。将作为这样的表达抗原特异性CD8的细胞的具有记忆型表型的T细胞亚组扩大培养而产生的细胞因子的检测试剂盒(Cytokine Secretion Assay-Cell Enrichment andDetection Kit(Miltenyi Biotec))已有市售，同时提供用于分离这样的抗原特异性的该群的的方案。通过使用这样的试剂盒，可使抗原特异性中央记忆细胞和效应记忆T细胞二者高效地在试管内生长。可刺激这些T细胞亚组的生长的抗原提呈细胞可从由前述给予了诱导免疫应答的药物组合物的生物体获得的末梢血分离。此外，用抗原进行脉冲刺激的树突细胞或用抗原转染的树突细胞(Overes等(J.Immunother.(2009)32，539-551))可作为抗原提呈细胞使用。
药物组合物
在另一观点中，本发明提供诱导针对抗原的免疫应答的药物组合物，其中，该药物组合物包含含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域的抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合结构域对前述抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，该FcRn结合结构域具有pH中性范围的FcRn结合活性。此外，本发明的一个不同方案中，涉及包含该抗原结合分子作为有效成分的诱导针对前述抗原的免疫应答的细胞生长抑制剂或抗癌剂。本发明的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂优选给予罹患外源性生物物种感染症或癌的对象或存在复发可能性的对象。
此外，本发明的一个方案中，可以是含有对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子在包含该抗原结合分子作为有效成分的诱导针对前述抗原的免疫应答的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂的制造中的用途。
此外，本发明的另一方案中，可以是诱导针对抗原的免疫应答的方法，该方法包括给予包含含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域的抗原结合分子作为有效成分的药物组合物、细胞生长抑制剂和抗癌剂的步骤，该抗原结合结构域对前述抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，该FcRn结合结构域在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性。
此外，本发明的另一方案中，可以是用于诱导针对抗原的免疫应答的抗原结合分子，该抗原结合分子含有对前述抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域。
此外，本发明的另一方案中，可以是用于制造诱导针对抗原的免疫应答的药物组合物、细胞生长抑制剂和抗癌剂的方法，该方法包括使用含有对前述抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子的步骤。
本发明中，“包含含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域和在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的抗原结合分子作为有效成分”是指包含该抗原结合分子作为主要活性成分，非旨在限制该抗原结合分子的含有率。此外，本发明可提供除了未结合抗原的抗原结合分子之外还包含预先结合抗原的抗原结合分子作为有效成分的诱导针对该抗原的免疫应答的药物组合物、细胞生长抑制剂和抗癌剂，本发明也可提供包括给予未结合抗原的抗原结合分子以及预先结合抗原的抗原结合分子的诱导针对抗原的免疫应答的方法。
此外，本发明的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂中可视需要掺混多种抗原结合分子。例如，通过制成与同一抗原结合的多种本发明的抗原结合分子的混合物，强化针对表达该抗原的细胞的免疫应答的诱导作用或细胞毒活性或中和活性，从而可提高对以表达该抗原的细胞为病因的疾病的治疗效果。或者，通过给予除了含有与作为治疗对象疾病的病因的细胞所表达的某抗原结合的抗原结合结构域的本发明的抗原结合分子之外，还掺混了含有与作为相同疾病的病因的细胞所表达的其它抗原结合的抗原结合结构域的本发明的抗原结合分子的本发明的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂，可提高该疾病的治疗效果。
此外，视需要，本发明的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂可包封到微囊(羟基甲基纤维素、明胶、聚甲基丙烯酸甲酯等微囊)中，制成胶体药物递送***(脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊等)(参见″Remington′s Pharmaceutical Science16th edition″，Oslo Ed.(1980)等)。此外，将药剂制成缓释性药剂的方法也是公知的，该方法可适用于本发明的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂(J.Biomed.Mater.Res.(1981)15，267-277、Chemtech.(1982)12，98-105、美国专利第3773719号、欧州专利公开公报EP58481号·EP133988号、Biopolymers(1983)22，547-556)。
本发明的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂可通过经口、非经口给予的任一种方式给予患者。优选非经口给予。作为这样的给予方法，具体而言，可列举注射给予、经鼻给予、经肺给予、经皮给予等。作为注射给予的实例，例如通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等***或局部给予本发明的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂。此外，可根据患者的年龄、症状选择适宜的给予方法。作为给予量，例如对于一次给予，可在每1kg体重0.0001mg～1000mg的范围内选择给予量。或者，例如可在每个患者0.001mg/机体～100000mg/机体的范围内选择给予量。然而，本发明的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂并不限于这些给予量。
本发明的药物组合物、细胞生长抑制剂或抗癌剂可根据一般方法配制(例如，Remington′s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)，可同时包含药学上可接受的载体或添加剂。例如可列举表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、助悬剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。此外，不限于此，还可适宜地使用其它的载体。具体而言，作为载体可列举轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二甲基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧化乙烯氢化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
需说明的是，本发明记载的氨基酸序列中所含的氨基酸存在进行翻译后修饰的情况(例如，N末端的谷酰胺的焦谷氨酰化所致的向焦谷氨酸的修饰是本领域技术人员熟知的修饰)，勿庸赘言，这样氨基酸进行了翻译后修饰的情况也包括在本发明记载的氨基酸序列中。
药物组合物的制造方法
本发明的非限定性的一个方案中，提供诱导免疫应答的抗原结合分子的制造方法，该方法包括对含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子所含的FcRn结合结构域赋予在pH中性范围条件下的FcRn结合活性。
本发明的制造方法中，在含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子所含的FcRn结合结构域在pH中性范围条件下的FcRn结合活性弱或不能确认的情况下，通过对FcRn结合结构域赋予在pH中性范围条件下的FcRn结合活性，可产生本发明的抗原结合分子。
例如，作为FcRn结合结构域使用含有抗FcRn抗体的重链可变区和轻链可变区的抗原结合结构域的情况下，按照前述抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的获得方法，可获得在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域。此外，作为FcRn结合结构域使用在pH中性范围条件下的FcRn结合活性弱或不能确认的Fc区的情况下，通过改变抗原结合分子所含的Fc区的氨基酸，可获得含有具有所需FcRn结合活性的Fc区的抗原结合分子。带来这样的所需结合活性的Fc区氨基酸改变可通过比较氨基酸改变前与改变后pH中性范围的FcRn结合活性来发现。利用与前述用于改变抗原结合活性的手法同样的位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492))或重叠延伸PCR等公知方法，本领域技术人员可实施合适氨基酸的改变。
本发明的抗原结合分子所含的在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区可通过任意方法获得，具体而言，通过改变作为起始Fc区使用的人IgG型免疫球蛋白氨基酸，可获得在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性或该活性增强的FcRn结合结构域。作为用于改变的优选IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。对于向其它氨基酸的改变，只要在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性，或者提高中性范围条件下的人FcRn结合活性，还可改变任意位置的氨基酸。抗原结合分子含有人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，优选包含带来pH中性范围条件下的FcRn结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。pH中性范围条件的对FcRn的KD值可通过前述The Journal of Immunology(2009)182：7663-7671记载的方法(将抗原结合分子固定在芯片上，作为分析物流过人FcRn)确定。
作为用于改变的优选IgG型免疫球蛋白Fc区，例如可列举人IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4以及它们的改变体)的Fc区。对于向其它氨基酸的改变，只要在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性或者提高中性范围条件下的人FcRn结合活性，还可改变任意位置的氨基酸。抗原结合分子包含人IgG1的Fc区作为Fc区的情况下，优选包含带来pH中性范围条件下对FcRn的结合与人IgG1的起始Fc区的结合活性相比增强的效果的改变。作为加入了这样的改变的Fc区，可列举前述表5所列举那样的置换了氨基酸而具有pH中性范围的结合活性的改变Fc区。
本发明的非限定性的一个方案中，提供诱导免疫应答的药物组合物的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得高钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(b)获得低钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
此外，本发明的非限定性的另一方案中，提供诱导免疫应答的药物组合物的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得高钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得低钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗体的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
此外，本发明的非限定性的一个方案中，提供抗原结合分子的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得pH中性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(b)获得pH酸性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
此外，本发明的非限定性的另一方案中，提供抗原结合分子的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得pH中性范围条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得pH酸性范围条件下抗体对抗原的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗体的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
作为本发明的非限定性的一个方案中的抗原结合结构域，可适宜地列举构成抗体片段文库的多种抗原结合结构域。此外，作为本发明的非限定性的一个方案中的抗体，可适宜地列举预先单克隆化的一群的抗体群体等。这些文库或抗体的制作方法记载于前述抗体项目中。
例如，作为获得本发明的非限定性的一个方案的、高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件的抗原结合活性相比低的抗原结合结构域的步骤，可适宜地列举包括以下步骤(a)～(c)的获得抗原结合结构域的步骤：
(a)在pH中性范围条件下使抗原结合结构域的文库与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域的文库置于pH酸性范围条件的步骤，和
(c)分离在前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤。
例如，作为获得本发明的非限定性的一个方案的、低钙离子浓度条件的抗原结合活性与高钙离子浓度条件的抗原结合活性相比低的抗原结合结构域的步骤，可适宜地列举包括以下步骤(a)～(c)的获得抗原结合结构域的步骤：
(a)在高钙离子浓度条件下使抗原结合结构域的文库与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域的文库置于低钙离子浓度条件的步骤，和
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤。
此外，作为获得本发明的非限定性的一个方案的、高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件的抗原结合活性相比低的抗原结合结构域的步骤，可适宜地列举包括以下步骤(a)～(c)的获得抗原结合结构域的步骤：
(a)在pH中性范围条件下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域在pH酸性范围条件下由柱洗脱的步骤，和
(c)分离前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域的步骤。
此外，作为获得本发明的非限定性的一个方案的、低钙离子浓度条件的抗原结合活性与高钙离子浓度条件的抗原结合活性相比低的抗原结合结构域的步骤，可适宜地列举包括以下步骤(a)～(c)的获得抗原结合结构域的步骤：
(a)在高钙离子浓度条件下使抗原结合结构域的文库与固定有抗原的柱接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域在低钙离子浓度条件下由柱洗脱的步骤，和
(c)分离前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域的步骤。
此外，作为获得本发明的的非限定性的一个方案的、高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件的抗原结合活性相比低的抗原结合结构域的步骤，可适宜地列举包括以下步骤(a)～(d)的获得抗原结合结构域的步骤：
(a)在pH酸性范围条件下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱的步骤，
(b)回收前述步骤(a)中不与柱结合而洗脱的抗原结合结构域的步骤，
(c)使前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域在pH中性范围条件下与抗原结合的步骤，和
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤。
此外，作为获得本发明的非限定性的一个方案的、低钙离子浓度条件的抗原结合活性与高钙离子浓度条件的抗原结合活性相比低的抗原结合结构域的步骤，可适宜地列举包括以下步骤(a)～(d)的获得抗原结合结构域的步骤：
(a)在低钙离子浓度条件下使抗原结合结构域的文库通过固定有抗原的柱的步骤，
(b)回收前述步骤(a)中不与柱结合而洗脱的抗原结合结构域的步骤，
(c)使前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域在高钙离子浓度条件下与抗原结合的步骤，和
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤。
例如，作为获得本发明的非限定性的一个方案的、高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件的抗原结合活性相比低的抗体的步骤，可适宜地列举包括以下步骤(a)～(c)的获得抗体的步骤：
(a)获得pH酸性范围条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得pH中性范围条件下抗体的抗原结合活性的步骤，和
(c)选择pH酸性范围条件的抗原结合活性与pH中性范围条件的抗原结合活性相比低的抗体的步骤。
例如，作为获得本发明的非限定性的一个方案的、低钙离子浓度条件的抗原结合活性与高钙离子浓度条件的抗原结合活性相比低的抗体的步骤，可列举包括以下步骤(a)～(c)的获得抗体的步骤：
(a)获得低钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得高钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤，和
(c)选择低钙离子浓度条件的抗原结合活性与高钙离子浓度条件的抗原结合活性相比低的抗体的步骤。
此外，作为获得本发明的非限定性的一个方案的、高氢离子浓度或低pH即pH酸性范围条件的抗原结合活性与低氢离子浓度或高pH即pH中性范围条件的抗原结合活性相比低的抗体的步骤，可适宜地列举包括以下步骤(a)～(d)的获得抗体的步骤：
(a)在pH中性范围条件下使抗体与抗原接触的步骤，
(b)获得前述步骤(a)中与抗原结合的抗体的步骤，
(c)将前述步骤(b)中获得的抗体置于pH酸性范围条件的步骤，知
(d)选择前述步骤(c)中抗原结合活性与前述步骤(b)中选择的标准相比弱的抗体的步骤。
此外，作为获得本发明的非限定性的一个方案的、低钙离子浓度条件的抗原结合活性与高钙离子浓度条件的抗原结合活性相比低的抗体的步骤，可适宜地列举包括以下步骤(a)～(d)的获得抗体的步骤：
(a)在高钙离子浓度条件使抗体与抗原接触的步骤，
(b)获得前述步骤(a)中与抗原结合的抗体的步骤，
(c)将前述步骤(b)中获得的抗体置于低钙离子浓度条件的步骤，和
(d)选择前述步骤(c)中抗原结合活性与前述步骤(b)中选择的标准相比弱的抗体的步骤。
此外，前述步骤可重复2次以上。因此，本发明提供通过上述筛选方法中还包括将(a)～(c)或(a)～(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法获得的、pH酸性范围条件的抗原结合活性与pH中性范围条件的抗原结合活性相比低的抗原结合结构域或抗体。(a)～(c)或(a)～(d)的步骤的重复次数无特别限定，通常10次以内。
前述步骤中，对于高氢离子浓度条件或低pH即pH酸性范围的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性，只要是pH 4.0～6.5间的抗原结合活性就没有特别限定，可列举作为优选pH的pH 4.5～6.5间的抗原结合活性。可列举作为另外的优选pH的pH 5.0～6.5间的抗原结合活性，以及pII 5.5～6.0间的抗原结合活性。可列举作为更优选pII列举的生物体内的早期内体内pH、具体而言pH 5.8的抗原结合活性。此外，对于低氢离子浓度条件或高pH即pH中性范围的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性，只要是pH 6.7～10间的抗原结合活性就没有特别限定，可列举作为优选pH的pH 6.7～9.5间的抗原结合活性。可列举作为另外的优选pH的pH 7.0～9.5间的抗原结合活性以及pH7.0～8.0间的抗原结合活性。可列举作为更优选pH列举的生物体内的血浆中pH、具体而言pH 7.4的抗原结合活性。
前述步骤中，对于低钙浓度条件下抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性，只要是离子化钙浓度0.1μM～30μM间的抗原结合活性就没有特别限定，可列举作为优选离子化钙浓度的0.2μM～20μM间的抗原结合活性。在另一方案中，可列举0.5μM～10μM间的抗原结合活性。可列举作为更优选离子化钙浓度列举的生物体内的早期内体内离子化钙浓度、具体而言1μM～5μM的抗原结合活性，以及2μM～4μM的抗原结合活性。此外，对于高钙浓度条件下抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性，只要是离子化钙浓度100μM～10mM间的抗原结合活性就没有特别限定，可列举作为优选离子化钙浓度的200μM～5mM间的抗原结合活性。在又一不同方案中，还可列举500μM～2.5mM间的抗原结合活性，在另一方案中，还可列举200μM～2mM间的抗原结合活性。在一不同方案中，还可列举400μM～1.5mM间的抗原结合活性。可列举作为更优选离子化钙浓度列举的生物体内的血浆中的离子化钙浓度、具体而言0.5mM～2.5mM的抗原结合活性。
pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域、和Fcγ受体结合活性与EU编号297位的糖链连接岩藻糖的天然型Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的改变Fc区以及含有该FcRn结合结构域和改变Fc区的Fc区的制造方法，可通过前述FcRn结合结构域和FcRn结合结构域项目中记载的方法获得。编码各结构域的多核苷酸可通过该项目中后述那样公知的基因重组方法获得。
本发明的各结构域可通过多肽键直接连接，也可经由接头连接。作为接头，可使用通过基因工程可导入的任意肽接头或合成化合物接头(例如，Protein Engineering(1996)9(3)，299-305)中公开的接头等，本发明中优选肽接头。肽接头长度无特别限定，本领域技术人员可根据目的适宜地选择，优选长度为5个氨基酸以上(上限没有特别限定，通常为30个氨基酸以下，优选20个氨基酸以下)，特别优选15个氨基酸。
例如，肽接头的情况下，可适宜地列举：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：29)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：30)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：31)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：32)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：33)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：34)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：35)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：36)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：31))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：32))n
[n为1以上的整数]等。但是，本领域技术人员可根据目的适宜地选择肽接头的长度或序列。
合成化学物接头(化学交联剂)是常用于肽的交联的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂有市售。
连接各结构域的接头使用多个的情况下，可全部使用同种的接头，也可使用不同种的接头。
此外，除了上述记载中例示的接头之外，也可适宜地使用例如具有His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等肽标签的接头。此外，也可适宜地利用通过氢键、二硫键、共价键、离子相互作用或这些键的组合相互连接的性质。例如，利用抗体的CH1与CL间的亲和性，或利用异源Fc区缔合时以前述双特异性抗体为来源的Fc区。此外，也可适宜地利用结构域间形成的二硫键。
为了将各结构域通过肽键连接，将编码该结构域的多核苷酸框内连接。作为将多核苷酸框内连接的方法，限制性片段的连接或融合PCR、重叠PCR等方法是公知的，在本发明的抗原结合分子的制作中也可适宜地单独或组合使用这些方法。
分离编码各结构域的多核苷酸的方法也可适宜地采用公知方法。例如，从展示来自包含多个抗原结合结构域的文库的目标抗原结合结构域的噬菌体，通过利用文库制作时使用的引物或具有文库构建时使用的噬菌体载体的序列的引物等的PCR，可分离编码抗原结合结构域的多核苷酸序列。此外，为了获得编码抗体可变区的基因，利用使用了可变区基因扩增用引物的5′-RACE法是简便的。首先，以从杂交瘤细胞提取的RNA为模板合成cDNA，获得5′-RACE cDNA文库。5′-RACE cDNA文库的合成中可适宜地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售试剂盒。
以得到的5′-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。可以以公知抗体基因序列为基础设计小鼠抗体基因扩增用引物。这些引物为各免疫球蛋白的亚类不同的碱基序列。因此，亚类最好预先利用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(RocheDiagnostics)等市售试剂盒确定。
具体而言，例如以获得编码小鼠IgG的基因为目的时，可利用可扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的K链和λ链的基因的引物。为了扩增IgG的可变区基因，一般3′侧的引物可利用退火到相当于接近可变区的恒定区的一部分的引物。另一方面，5′侧的引物可利用5′RACE cDNA文库制作试剂盒附带的引物。
在确定如前述分离的本发明的抗原结合结构域或抗体的多核苷酸序列之后，制作包含与编码具有pH中性范围的FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸框内连接而成的融合基因的多核苷酸。制作的包含融合基因的多核苷酸可与合适的表达载体有效连接以在所需细胞中表达。
“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”在本说明书中以同义使用，这样的称谓可包括细胞或细胞系的所有后代。如此，例如，“转化体”和“转化细胞”这样的用语包括与继代数无关的来源于它们的原代对象细胞和培养物。此外，可以理解，由于故意或偶发的突变，所有后代中DNA的内容不会完全准确地相同。也可包括最初的转化细胞中筛选的具有实质上相同的功能或生物学活性的变体的后代。对于意在不同称谓的记载的情况，根据该记载的前后关系，这样的意图应是明白的。
言及编码序列的表达时的调控序列是指在特定宿主生物中用于表达有效连接的编码序列而必需的DNA碱基序列。例如原核生物中适宜的控制序列包括启动子、视情形而定的操纵基因序列、核糖体结合位点以及可能未充分理解的其它序列。真核细胞中，为了表达编码序列而利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子是公知的。
关于核酸，“有效连接”是指该核酸存在与其它核酸序列的功能关系。例如，前序列(presequence)或分泌前导肽的DNA在作为与某多肽的分泌相关的前体蛋白表达的情况下，与该多肽的DNA有效连接。启动子或增强子在其影响某编码序列的转录的情况下与该序列有效连接。或者，核糖体结合位点在其位于使翻译容易的位置的情况下与编码序列有效连接。通常，“有效连接”是指连接的DNA序列连续，在分泌前导肽的情况下指连续位于阅读框内。然而，增强子没有连续的必要。连接是在合适的限制性位点通过连接作用实现。在这样的位点不存在的情况下，合成寡核苷酸衔接头或接头根据历来的惯例使用。还可通过前述重叠延伸PCR方法制作连接的核酸。
“连接”是在两个核酸片段间形成磷酸二酯键的方法。为了连接两个片段，必须使片段末端相互配对。视情形而定，该末端在内切核酸酶消化后即具有配对性。然而，为了适合连接，首先，需要将通常在内切核酸酶消化后形成的粘末端转变成平头末端。为了形成平头末端，将DNA在合适的缓冲液中于15℃、在4种脱氧核糖核苷三磷酸存在下用约10单位的DNA聚合酶I或T4 DNA聚合酶的Klenow片段处理至少15分钟。接着，对DNA进行苯酚氯仿提取和乙醇沉淀、或硅纯化(silica purification)从而纯化。将待连接的DNA片段以等摩尔量加入溶液中。该溶液中，除了ATP、连接酶缓冲剂之外，T4 DNA连接酶这样的连接酶包含每0.5μg DNA约10单位。在将DNA连接到载体上时，载体首先通过适当的限制性内切核酸酶的消化作用而成线状。通过将线状化的片段接着用细菌碱性磷酸酶或小牛肠道的磷酸酶处理，预防连接步骤期间该片段的自我连接。
对于包含编码本发明的抗原结合分子的多核苷酸的表达载体的制作、该表达载体向细胞内的导入、该细胞中该多核苷酸的表达和从该细胞的培养液获得表达的抗原结合分子的方法，可根据前述抗体项目中记载的方法实施。
应予说明，本说明书中引用的全部现有技术文献作为参照结合到本说明书中。
实施例
以下通过实施例更详细地说明本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
(实施例1)人IL-6受体免疫耐受小鼠模型的制作
IL-6受体在配体IL-6为生长因子的骨髓瘤中高表达，所以抗人IL-6受体抗体在人骨髓瘤的免疫缺陷小鼠异种移植模型中发挥抗肿瘤效果，这是已知的(Eur.J.Immunol.22，1989-93(1992))。通过将抗IL-6受体抗体给予小鼠，如果可诱导小鼠抗IL-6受体抗体的产生，那么该抗IL-6受体抗体诱导获得性免疫，该抗IL-6受体抗体显示作为癌疫苗有用是可能的。
然而，在作为抗肿瘤模型使用的免疫缺陷小鼠中，小鼠的免疫功能不起作用，所以不可能诱导获得性免疫。此外，即使将可溶型人IL-6受体给予正常小鼠，短期内小鼠也针对作为异物的人IL-6受体产生小鼠抗人IL-6受体抗体。因此，作为评价抗人IL-6受体抗体对小鼠抗人IL-6受体抗体产生的影响(针对人IL-6受体的获得性免疫)的***，正常小鼠不能够直接使用。
另一方面，人的临床中，抗体分子的靶抗原为人抗原，所以人针对自身的靶抗原免疫耐受。人的临床中，通过给予针对靶抗原的抗体来诱导针对靶抗原的自身抗体的产生的情况下，推定免疫耐受被破坏。
因此，就给予小鼠的抗体在该小鼠中是否能够诱导针对靶人抗原的获得性免疫而言，为了进行假定人的临床的评价，确立评价以下的试验***是必要的：小鼠变成近于对靶人抗原免疫耐受的状态(仅将靶人抗原单独给予小鼠时，小鼠不产生针对靶人抗原的抗体)，通过给予针对靶抗原的抗体破坏该近于免疫耐受的状态而诱导针对靶抗原的自身抗体的产生。
于是，为了不因将靶人抗原给予小鼠而在该小鼠中产生针对靶人抗原的自身抗体，构建用抗小鼠CD4抗体除去足够量的因抗原提呈而诱导抗体产生所必需的CD4阳性T细胞的试验***。
作为将靶人抗原可溶型人IL-6受体的血浆中浓度维持在稳态(约20ng/mL)的模型，构建以下试验模型。通过在正常小鼠(C57BL/6J小鼠，Charles River Japan)的背部皮下埋入填充有可溶型人IL-6受体的注入泵(MINI-OSMOTIC PUMP 2004型，alzet)，制作将血浆中可溶型人IL-6受体浓度维持在稳态的动物模型。
试验在2组(每组N＝4)中实施。为了抑制模拟免疫耐受的组的小鼠产生针对可溶型人IL-6受体的小鼠抗体，将单克隆抗小鼠CD4抗体(R&D)在其尾静脉以20mg/kg单次给予，然后，第10天类似地给予1次(以下称为抗小鼠CD4抗体给予组)。另一组作为对照组即未给予单克隆抗小鼠CD4抗体的抗小鼠CD4抗体非给予组使用。然后，将填充有92.8μg/mL的可溶型人IL-6受体注入泵埋入小鼠背部皮下。通过将注入泵埋入后经时采集的血液在采集后立即于4℃、15,000rpm离心15分钟，得到血浆。将分离的血浆在实施测定以前保存于设定为-20℃以下的冷藏库。可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)的血浆中浓度通过以下方法测定。
小鼠的血浆中hsIL-6R浓度通过电化学发光法测定。将制成为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/mL的hsIL-6R校准曲线试样和稀释50倍以上的小鼠血浆测定试样与用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)和Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody(R&D)以及托珠单抗混合，在37℃反应1晚。托珠单抗终浓度制备成333μg/mL。然后，将反应液分配到MA400 PR Streptavidin Plate(MesoScale Discovery)。进而在洗涤于室温反应了1时间的反应液后，分配Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。然后立刻用SECTORPR400 reader(Meso Scale Discovery)进行测定。根据校准曲线的反应，用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)计算hsIL-6R浓度。由该方法测定的正常小鼠中按个体的血浆中hsIL-6R浓度变化示于图1。
结果，抗小鼠CD4抗体非给予组的所有小鼠中，在注入泵埋入小鼠背部皮下14天后，可见血浆中hsIL-6R浓度降低。即，小鼠抗人IL-6受体抗体产生，则引起血浆中hsIL-6R浓度降低，因此，这些组中，显示小鼠抗人IL-6受体抗体产生。另一方面，抗小鼠CD4抗体给予组的所有小鼠中，未观察到血浆中hsIL-6R浓度降低。即，在作为注入泵有效期的28天期间，维持大体固定(约20ng/mL)的血浆中hsIL-6R浓度，由此显示小鼠抗人IL-6受体抗体未产生。
由上述结果确认，由于预先给予抗小鼠CD4抗体，单独给予作为靶抗原的人IL-6受体在正常小鼠中未诱导获得性免疫。之后的实施例中，抗小鼠CD4抗体给予模型作为评价抗人IL-6受体抗体给予对针对人IL-6受体的获得性免疫的诱导的***使用。
(实施例2)人IL-6受体免疫耐受正常小鼠模型中普通抗IL-6受体抗体和pH依赖性抗人IL-6受体抗体的获得性免疫诱导效果的比较
为了诱导针对靶抗原的获得性免疫，抗原提呈细胞摄入到细胞内的靶抗原在该细胞中的溶酶体中适度分解后，需要通过与MHC I类或MHC II类结合对该靶抗原的肽片段进行抗原提呈。认为抗原提呈的肽越多，诱导越强的免疫，因此，作为增强对针对靶抗原的获得性免疫的诱导的方法，考虑将更多的靶抗原送入抗原提呈细胞的细胞内的方法。
通常，如果抗原被非特异性地摄入到抗原提呈细胞中，那么为了直接从内体转移到溶酶体，存在对肽片段进行抗原提呈的可能性。然而，普通IgG抗体与抗原结合的情况下，IgG抗体通过与FcRn结合而从内体内再循环到细胞表面(血浆中)，所以认为与抗体结合的抗原也不转移到溶酶体而再循环到细胞表面(血浆中)。因此，通过给予普通IgG抗体，抑制了靶抗原的分解。认为，结果，抗原提呈细胞中被溶酶体适度分解的靶抗原的肽片段未进行抗原提呈，针对靶抗原的获得性免疫的诱导反而降低。于是，具有在血浆中的pH 7.4与靶抗原结合、在内体内酸性条件下的pH 5.0-pH 6.5解离抗原的pH依赖性结合活性的IgG抗体(WO2009/125825)能够在抗原提呈细胞的酸性内体内解离靶抗原，所以认为存在这样的可能性：通过利用该IgG抗体，仅靶抗原转移到抗原提呈细胞的溶酶体，而该靶抗原的肽片段进行抗原提呈，解离了抗原的IgG抗体通过与FcRn结合而从内体内再循环到细胞表面(血浆中)不进行抗原提呈。
于是，利用实施例1中确立的人IL-6受体免疫耐受正常小鼠模型，验证普通抗人IL-6受体IgG抗体和pH依赖性抗人IL-6受体IgG抗体的获得性免疫诱导效果。作为普通抗人IL-6受体IgG抗体，使用由WO2009/125825记载的H54-IgG1(SEQ ID NO：38)和L28-CK(SEQID NO：39)构成的H54/L28-IgG1。作为pH依赖性抗人IL-6受体IgG抗体，使用由VH3-IgG1(SEQ ID NO：17)和VL3-CK(SEQ ID NO：40)构成的Fv4-IgG1。抗体的制备利用参考实施例1中记载的方法实施。
利用由人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg系32+/+小鼠，JacksonLaboratories(Methods Mol.Biol.(2010)602，93-104)确立的人IL-6受体免疫耐受小鼠模型，验证H54/L28-IgG1和Fv4-IgG1的获得性免疫诱导效果。将H54/L28-IgG1和Fv4-IgG1给予人IL-6受体免疫耐受小鼠模型。具体而言，与实施例1同样地进行注入泵埋入的3天后，将抗人IL-6受体抗体在其尾静脉以1mg/kg单次给予。在给予抗人IL-6受体抗体后进行经时采血。通过将采集的血液立即于4℃、15,000rpm离心15分钟，得到血浆。分离的血浆在实施测定以前保存于设定为-20℃以下的冷藏库中。血浆中hsIL-6R浓度通过与实施例1中记载的方法相同的方法测定。
对照(抗人IL-6受体抗体非给予组)、H54/L28-IgG1和Fv4-IgG1给予后，各组的平均血浆中hsIL-6R浓度变化示于图2。对照的所有动物中，与实施例1同样地血浆中hsIL-6R浓度维持大体固定，所以显示小鼠抗人IL-6受体抗体未产生。给予H54/L28-IgG1的组中，与对照相比，可见所有动物的血浆中hsIL-6R浓度的大幅上升，上升的状态持续28天。认为这是因为：hsIL-6R非特异性地被摄入到细胞中，则直接在溶酶体分解，与此相对，与IgG抗体结合的hsIL-6R通过FcRn而作为抗体抗原复合体再循环到血浆中，所以hsIL-6R的清除率降低，与之相伴，血浆中hsIL-6R浓度上升。该上升的状态持续28天，所以，与对照同样，显示给予H54/L28-IgG1的组中未诱导小鼠抗人IL-6受体抗体的产生。给予了Fv4-IgG1的组的所有动物中，与对照相比，血浆中hsIL-6R浓度上升，但是与给予H54/L28-IgG1的组相比，血浆中hsIL-6R浓度上升的程度明显降低。这是因为，pH依赖性结合抗体在内体内解离抗原，所以抑制hsIL-6R的清除率降低，与之相伴，血浆中hsIL-6R浓度的上升也受到抑制。根据该结果认为，pH依赖性结合抗体与普通抗体相比，促进更多的靶抗原在抗原提呈细胞的内体中解离，从而促进靶抗原向溶酶体的转移。然而，因为hsIL-6R浓度上升的状态持续28天，所以与H54/L28-IgG1同样，显示Fv4-IgG1不诱导小鼠抗人IL-6受体抗体的产生。
由该结果可知，利用普通IgG抗体和在抗原提呈细胞的内体内解离抗原向溶酶体转移的pH依赖性结合IgG抗体，不能够诱导针对靶抗原的获得性免疫。
(实施例3)人IL-6受体免疫耐受人FcRn转基因小鼠模型中pH依赖性IL-6受体结合和pH 7.4的FcRn结合增强对获得性免疫诱导效果的影响
(3-1)概述
普通IgG1抗体或pH依赖性结合IgG1抗体不能诱导针对靶抗原的获得性免疫，这在实施例2中得到确认。另一方面，作为增强T细胞表位肽的免疫原性的方法，最近报告了通过将T细胞表位肽与Fc融合，进而增强该Fc部分在pH 7.4的FcRn结合，使T细胞表位肽更向溶酶体转移的方法(J.Immunol.181，7550-61(2008))。FcRn在抗原提呈细胞中表达，所以通过增强Fc部分在pH 7.4的FcRn结合，可促进T细胞表位肽的抗原提呈。然而，该方法公开的将抗原肽直接与Fc融合而成的分子不能作为抗原结合分子与癌抗原结合，所以该分子不能对癌细胞发挥直接作用。此外，增强Fc部分在pH 7.4的FcRn结合的方法虽然在体外增强T细胞表位肽的免疫原性，但是在体内反而减弱免疫原性，在体内不显示效果。如此，增强了pH7.4的FcRn结合的Fc与靶抗原直接融合而成的分子显示以下结果：由于不显示靶抗原结合活性，所以不能够对靶抗原直接作用，此外在体内增强FcRn结合反而减弱免疫原性。
基于实施例2和迄今的报告，通过给予对普通IgG1抗体(H54/L28-IgG1)导入增强pH 7.4的FcRn结合的改变而成的抗体(H54/L28-F 157)和对pH依赖性结合IgG1抗体(Fv4-IgG1)导入增强pH7.4的FcRn结合的改变而成的抗体(Fv4-F157)，验证了是否能够针对靶抗原诱导获得性免疫。
(3-2)抗体的制作
作为增强了FcRn结合的普通抗人IL-6受体IgG抗体，使用由H54-F157(SEQ ID NO：41)和L28-CK(SEQ ID NO：39)构成的H54/L28-F157。作为增强了FcRn结合的pH依赖性抗人IL-6受体IgG抗体，使用由VH3-F157(SEQ ID NO：42)和VL3-CK(SEQ ID NO：40)构成的Fv4-F157。抗体的制备利用参考实施例1中记载的方法实施。
(3-3)对人FcRn的亲和性的测定
为了确定实施例2中制作的Fv4-IgG1和Fv4-F157的Fc部分(分别称为IgG1和F157)在pH 7.0对人FcRn的亲和性，通过以下所示方法测定由VH3-IgG1(SEQ ID NO：17)和L(WT)-CK(SEQ ID NO：18)构成的VH3/L(WT)-IgG1和由VH3-F157(SEQ ID NO：42)和L(WT)-CK(SEQID NO：18)构成的VH3/L(WT)-F157对人FcRn的亲和性。
利用Biacore T100(GE Healthcare)，进行人FcRn与抗体的动力学分析。在传感器芯片CM4(GE Healthcare)上通过胺偶联法固定适量的蛋白L(ACTIGEN)，使目标抗体捕获于此。接着，注射FcRn稀释液和作为空白的运行缓冲液，使人FcRn与传感器芯片上捕获的抗体相互作用。运行缓冲液使用50mmol/L磷酸钠、150mmol/L NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.0，FcRn的稀释也使用各自的缓冲液。传感器芯片的再生使用10mmol/L甘氨酸-HCl，pH1.5。测定均在25℃实施。以从通过测定得到的传感图算出的作为动力学参数的结合速率常数ka(1/Ms)和解离速率常数kd(1/s)为基础计算各抗体对人FcRn的KD(M)(亲和性)。各参数的计算使用Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)。
IgG1和F157对人FcRn的亲和性示于表7。确认F157对人FcRn的亲和性与IgG1相比提高约600倍。
[表7]
对人FcRn的亲和性
IgG1 8.8E-05
F157 1.5E-07
。
(3-4)抗体给予试验中抗原(可溶型人IL-6受体)的血浆中浓度变化
接下来，在试验1中使用由人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg系32+/+小鼠，Jackson Laboratories，Methods Mol.Biol.(2010)602，93-104)确立的人IL-6受体免疫耐受小鼠模型。将H54/L28-F157和Fv4-F157给予人IL-6受体免疫耐受小鼠模型。具体而言，与实施例1同样地进行注入泵埋入的3天后，将抗人IL-6受体抗体在其尾静脉以1mg/kg单次给予(各组的个体数为3)。在给予小鼠抗人IL-6受体抗体后进行经时采血。此外，在试验2中，在同样地给予仅Fv4-F157后，进行经时采血。通过将采集的血液立即于4℃、15,000rpm离心15分钟，得到血浆。分离的血浆在实施测定以前保存于设定为-20℃以下的冷藏库中。血浆中hsIL-6R浓度通过与实施例1中记载的方法相同的方法测定。
除了试验1的H54/L28-F157和Fv4-F157以及试验2的Fv4-F157的给予后各组的平均血浆中hsIL-6R浓度变化，还将实施例2中得到的对照(抗体非给予组)、H54/L28-IgG1和Fv4-IgG1给予后各组的平均血浆中hsIL-6R浓度变化示于图3。在H54/L28-F157的给予组中可见与H54/L28-IgG1的给予组同样的血浆中hsIL-6R浓度上升，但是该上升是一时的，13天后血浆中hsIL-6R浓度降低至与对照同等的水平。此后维持与对照同等的水平28天，所以可知，与H54/L28-IgG1一样，显示小鼠抗人IL-6受体抗体未产生，仅增强pH 7.4的FcRn结合不能诱导针对靶抗原的获得性免疫。这与以下内容并不矛盾：如J.Immunol.(2008)181，7550-7561中所报告的，使T细胞表位肽与增强了pH 7.4的FcRn结合的Fc区融合而成的分子不能够增强针对T细胞表位肽的获得性免疫的诱导。与此相比，Fv4-F157的给予组中可见给予抗体后血浆中hsIL-6R浓度急剧降低，给予1天后hsIL-6R浓度降低至检测限以下(1.56ng/mL以下)。
不局限于特定的理论，但上述现象可如下说明。认为针对靶抗原的获得性免疫的增强取决于通过给予的抗体而摄入到抗原提呈细胞中的靶抗原的量。摄入的靶抗原的量可通过血浆中的靶抗原浓度降低多少来评价。摄入到细胞中后，pH依赖性结合抗体(Fv4-IgG1)虽然在酸性内体内解离靶抗原，但是，与靶抗原结合的pH依赖性结合抗体摄入到细胞的过程非特异性地依赖于胞饮，摄入速度慢，所以血浆中靶抗原浓度不降低至与对照相比低的水平(图4)。另外，仅增强pH 7.4的FcRn结合的抗体(H54/L28-F157)虽然利用pH 7.4的FcRn结合主动地摄入到细胞内，但是，在靶抗原与抗体结合的状态，即作为抗体与靶抗原的复合体，大部分直接通过FcRn本来的功能而再循环到细胞表面，所以血浆中的靶抗原浓度不降低至与对照相比低的水平(图5)。与此相比，藉由pH 7.4的FcRn结合主动地摄入到细胞内的增强了pH7.4的FcRn结合的pH依赖性结合抗体(Fv4-F157)在内体内解离靶抗原，所以将抗原送入溶酶体的同时，解离了靶抗原的抗体可通过FcRn本来的功能而再循环到细胞表面，再次与靶抗原结合，同样地再次将靶抗原送入溶酶体(图6)。通过重复该循环，认为增强了pH 7.4的FcRn结合的pH依赖性结合抗体单独即可将血浆中的靶抗原的浓度降低至与对照相比低得多的水平。
试验1和试验2中给予Fv4-F157的6只小鼠按个体的血浆中hsIL-6R浓度分别示于图7和图8。给予Fv4-F157的6只小鼠中，#7、#8、#10这3只小鼠中13天以后hsIL-6R浓度上升，恢复至与对照同等的水平，之后维持与对照同等的水平28天。另一方面，在剩余的#9、#11、#12这3只小鼠中，hsIL-6R浓度不恢复，之后也维持该低值直至28天，所以认为，在这3只小鼠中，小鼠抗人IL-6受体抗体产生，人IL-6受体被从血浆中除去。因此，通过以下所示方法测定给予了Fv4-F157的6只小鼠中小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价。
(3-4)抗体给予试验中小鼠的针对抗原(可溶型人IL-6受体)的小鼠抗体
(小鼠抗人IL-6受体抗体)的抗体效价变化
小鼠血浆中小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价通过电化学发光法测定。首先，将人IL-6受体分配到MA100 PR Uncoated Plate(Meso Scale Discovery)，在4℃静置1晚，从而制作人IL-6受体固定化板。将分配有50倍稀释的小鼠血浆测定试样的人IL-6受体固定化板在4℃静置1晚。然后，洗涤使经SULFO-TAG NHS Ester(Meso ScaleDiscovery)进行了钌标记的抗小鼠IgG(完整分子)(Sigma-Aldrich)在室温反应了1小时的该板。向该板分配Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)后，立刻通过SECTOR PR 400reader(MesoScale Discovery)进行测定。
Fv4-F157给予组中小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价变化示于图7和图8。结果，hsIL-6R浓度恢复至与对照同等水平的#7、#8、#10这3只小鼠中，未见小鼠抗人IL-6受体抗体的抗体效价上升，但是hsIL-6R浓度维持在低值至第28天的#9、#11、#12这3只小鼠中，可见小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价上升。由上述结果发现，通过将作为增强了FcRn结合的pH依赖性抗人IL-6受体IgG抗体的Fv4-F157给予人IL-6受体免疫耐受正常小鼠模型，可诱导3/6例中针对靶抗原人IL-6受体的获得性免疫。由此发现，即使将普通IgG抗体(H54/L28-IgG1)、与靶抗原pH依赖性地结合的IgG抗体(Fv4-IgG1)或只增强了pH 7.4的FcRn结合的IgG抗体(H54/L28-IgG1)体内给予，也不能够诱导针对靶抗原的获得性免疫，只有与靶抗原pH依赖性地结合且增强了pH 7.4的FcRn结合的IgG抗体(Fv4-F157)可诱导针对靶抗原的获得性免疫。
(3-5)抗体给予试验中小鼠的针对给予的抗体(Fv4-F157)的小鼠抗体
(小鼠抗Fv4-F157抗体)的抗体效价变化
通过将靶抗原与增强了pH 7.4的FcRn结合的Fc直接融合而成的分子作为药物使用的上述方法(J.Immunol.(2008)181，7550-7561)，假设可产生针对靶抗原的抗体，针对靶抗原的抗体也与药物本身结合，因此，涉及作为抗药物抗体起作用而减弱药物作用。因此认为，使用靶抗原与药物直接融合而成的分子(例如J.Immunol.(2008)181，7550-7561或J.Immunol.(2011)，186，1218-1227记载的分子)意味着诱导针对靶抗原的抗体产生，即诱导减弱药物作用的针对药物本身的抗药物抗体，故而不优选。
增强了FcRn结合的pH依赖性抗人IL-6受体IgG抗体(Fv4-F157)是具有与靶抗原人IL-6受体pH依赖性地结合的活性的药物，并非直接融合了靶抗原的分子。因此，如图7和图8所示，存在Fv4-F157诱导针对靶抗原人IL-6受体的抗体产生，但是针对药物本身(Fv4-F157)的抗药物抗体未产生的可能性。于是，通过以下所示方法测定给予Fv4-F157的6只小鼠中小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价。
小鼠血浆中抗Fv4-F157抗体的抗体效价通过电化学发光法测定。首先，将抗人IL-6受体抗体分配到MA100 PR Uncoated Plate(Meso Scale Discovery)，在4℃静置1晚，从而制作抗人IL-6受体抗体固定化板。将分配有50倍稀释的小鼠血浆测定试样的抗人IL-6受体抗体固定化板在4℃静置1晚。然后，洗涤使经SULFO-TAG NHS Ester(Meso ScaleDiscovery)进行了钌标记的抗小鼠IgG(完整分子)(Sigma-Aldrich)在室温反应了1小时的该板。向该板分配Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)后，立刻通过SECTOR PR400reader(MesoScale Discovery)进行测定。
Fv4-F157给予组中小鼠抗Fv4-F157抗体的抗体效价变化和小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价变化示于图9和图10。Fv4-F157给予组中，与小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)有没有产生无关，任意小鼠中均未见小鼠抗Fv4-F157抗体的产生。由此认为，增强了pH 7.4的FcRn结合的pH依赖性抗人IL-6受体IgG抗体(Fv4-F157)诱导针对靶抗原(人IL-6受体)的抗体产生，另一方面，不诱导针对药物本身(Fv4-F157)的抗体产生，所以增强了pH 7.4的FcRn结合的pH依赖性(抗人IL-6受体)IgG抗体作为诱导针对靶抗原的获得性免疫的药物极为有用。
作为历来诱导针对癌抗原的获得性免疫的方法，报告了使用使欲诱导获得性免疫的癌抗原和与抗原提呈细胞上表达的受体结合的抗体融合而成的药物分子的方法(J.Immunol.(2011)186，1218-1227)。这样的药物分子不能够直接与癌抗原结合以发挥作用(图11)。因此，这样的药物分子不会如历来的抗体药物那样显示针对癌抗原的功能抑制作用或针对癌细胞的直接细胞毒活性作用。此外，对于这样的分子，药物分子整体被摄入到抗原提呈细胞中分解，所以药物分子的肽片段被提呈给MHC II类和MHC I类。因此认为，不仅诱导针对癌抗原的体液免疫和细胞免疫，而且诱导针对药物本身的体液免疫，容易涉及减弱抗药物抗体的产生所致的效果，故不优选(图11)。
与此相比，本实施例中发现的pH 7.4的FcRn结合增强、且pH依赖性地与靶癌抗原结合的抗体可直接与癌抗原结合以发挥作用(图12)。因此，可如历来的抗体药物那样显示针对癌抗原的功能抑制作用或针对癌细胞的直接细胞毒活性作用。此外，这样的抗体在酸性内体内解离靶癌抗原，抗体本身再循环到细胞表面，从而靶癌抗原被选择性分解，靶抗原的肽片段被提呈给MHC II类和MHC I类，所以可不诱导针对抗体本身的抗药物抗体产生，而选择性地针对癌抗原诱导体液免疫和细胞免疫(图12)。
(实施例4)人IL-6受体敲入小鼠中pH依赖性IL-6受体结合和pH 7.4的FcRn结合增强对针对内源人IL-6受体的获得性免疫的诱导效果的影响
(4-1)概述
如实施例3所示，通过将对普通IgG1抗体(H54/L28-IgG1)导入增强pH 7.4的FcRn结合的改变而成的抗体(H54/L28-F157)给予人IL-6受体免疫耐受人FcRn转基因小鼠模型，未诱导该小鼠中针对靶抗原的获得性免疫，但是通过将对pH依赖性结合IgG1抗体(Fv4-IgG1)导入增强pH 7.4的FcRn结合的改变而成的抗体(Fv4-F157)给予该小鼠，诱导了相同小鼠中针对靶抗原的获得性免疫。
然而，前述模型是诱导针对从外部给予的人抗原的获得性免疫的模型，在研究前述获得性免疫的诱导在临床上的应用时，对于完全免疫耐受的内源抗原，优选确认破坏其免疫耐受，诱导获得性免疫。
于是，利用表达人IL-6受体的人IL-6受体敲入小鼠免疫耐受内源人IL-6受体这一事实，验证通过给予该小鼠前述抗体是否可针对内源人IL-6受体诱导获得性免疫。
(4-2)抗体的制作
作为增强了小鼠FcRn结合的普通抗人IL-6受体抗体，制作包含H54-mF3(SEQ IDNO：124)和L28-mCK(SEQ ID NO：125)的H54/L28-mF3。作为pH依赖性抗人IL-6受体IgG抗体，制作包含VH3-mIgG1(SEQ ID NO：126)和VL3-mCK(SEQ ID NO：127)的Fv4-mIgG1以及包含VH3-mIgG2a(SEQ ID NO：128)和VL3-mCK(SEQ ID NO：127)的Fv4-mIgG2a。作为增强了小鼠FcRn结合的pH依赖性抗人IL-6受体IgG抗体，制作包含VH3-mF3(SEQ ID NO：129)和VL3-mCK(SEQ ID NO：127)的Fv4-mF3以及包含还增强小鼠FcγR结合的VH3-mFa30(SEQ ID NO：130)和VL3-mCK(SEQ ID NO：127)的Fv4-mFa30。这些抗体利用参考实施例1中记载的方法制备。
(4-3)对小鼠FcRn和小鼠FcγR的亲和性的测定
利用根据(3-3)所示方法测定的值，确定作为制作的Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30的Fc部分的mIgG1、mIgG2a、mF3和mFa30在pH 7.0对小鼠FcRn的亲和性。
FcγR的胞外结构域通过以下方法制备。首先，基于NCBI中登录的序列信息，通过本领域技术人员公知的方法合成FcγR的胞外结构域基因。具体而言，制作编码在作为mFcγRI以NCBI登录号NP_034316(版本号NP_034316.1)、作为mFcγRII以NCBI登录号NP_034317(版本号NP_034317.1)、作为FcγRIII以NCBI登录号NP_034318(版本号NP_034318.2)、作为FcγRIV以NCBI登录号NP_653142(版本号NP_653142.2)表示的各多肽C末端附加有His标签而成的FcγR的胞外结构域的各基因。
制作将所得基因片段***到动物细胞表达载体中而成的表达载体。将该表达载体瞬时导入人胎儿肾癌细胞来源的FreeStyle293细胞(Invitrogen)，使表达靶蛋白的转化细胞的培养上清通过0.22μm过滤器得到培养上清。各FcγR的胞外结构域原则上通过下述4个纯化步骤从所得培养上清纯化：第1步骤为离子交换柱层析(第1步骤)、对于His标签的亲和柱层析(HisTrap HP)(第2步骤)、凝胶过滤柱层析(Superdex200)(第3步骤)、无菌过滤(第4步骤)。作为第1步骤的离子交换柱层析的柱，mFcγRI的纯化中使用Q Sepharose HP，mFcγRII和mFcγRIV的纯化中使用SP Sepharose FF，mFcγRIII的纯化中使用SP SepharoseHP。此外，第3步骤之后的纯化中，作为溶剂使用D-PBS(-)，但在mFcγRIII的纯化中使用含有0.1M精氨酸的D-PBS(-)。含有纯化的FcγR的胞外结构域的溶液在280nm的吸光度利用分光光度计测定。利用通过PACE等方法算出的吸光系数，从前述吸光度的测定值计算纯化的FcγR的胞外结构域的浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
各改变抗体与如前述那样制备的Fcγ受体胞外结构域的相互作用利用BiacoreT100(GE Healthcare)、Biacore T200(GE Healthcare)、Biacore A100、Biacore 4000进行分析。运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度为25℃，测定该相互作用。使用通过胺偶联法将Protein L(ACTIGEN或BioVision)固定于Series S Sensor Chip CM5(GEHealthcare)或Series S Sensor Chip CM4(GE Healthcare)而得的芯片。
比较使运行缓冲液稀释的Fcγ受体的胞外结构域作用于捕获有各改变抗体的传感器芯片而测定的该各结构域与该各抗体的结合量。不过，因为Fcγ受体的胞外结构域的结合量取决于传感器芯片上捕获的抗体量，所以比较用各抗体的捕获量除以Fcγ受体的胞外结构域的结合量而得的修正值。此外，通过使10mM甘氨酸-HCl、pH1.5反应，重复使用洗涤传感器芯片上捕获的抗体而再生的传感器芯片。
此外，根据以下的动力学分析方法，计算各改变抗体对Fcγ受体的胞外结构域的KD值。在上述传感器芯片上捕获目标抗体，使运行缓冲液稀释的Fcγ受体的胞外结构域与其相互作用，相对于由此得到的传感图，通过用Biacore Evaluation Software将测定结果在1∶1Langmuir结合模型中进行全局拟合，计算结合速率常数ka(L/mol/s)、解离速率常数kd(1/s)。从该计算值确定解离常数KD(mol/L)。
mIgG1、mIgG2a、mF3和mFa30对小鼠FcRn的亲和性示于表8，对小鼠FcγR的亲和性示于表9。
[表8]
变体名 KD(M)
IgG1 未检测
mIgG2a 未检测
mF3 1.5E-09
mFa30 3.5E-09
。
[表9]
Figure BDA0002222475850001991
(4-4)抗体给予试验中抗原(可溶型人IL-6受体)的血浆中浓度变化
接下来，从给予了Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30和H54/L28-mF3的人IL-6受体敲入小鼠(参考实施例25)进行经时采血。通过将采集的血液立刻在4℃、15,000rpm离心15分钟，得到血浆。分离的血浆在实施测定以前保存于设定为-20℃以下的冷藏库中。血浆中hsIL-6R浓度通过实施例1中记载的方法相同的方法测定。
抗体非给予组、Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30和H54/L28-mF3给予组的平均血浆中hsIL-6R浓度变化示于图26。Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a的给予组的血浆中可见hsIL-6R浓度上升。另一方面，增强了小鼠FcRn结合的Fv4-mF3、H54/L28-mF3和增强了对小鼠FcRn和小鼠FcgR的结合的Fv4-mFa30的给予组的血浆中，与抗体非给予组相比，可见hsIL-6R浓度显著降低。
(4-5)抗体给予试验中小鼠的针对抗原(可溶型人IL-6受体)的小鼠抗体(小鼠抗 人IL-6受体抗体)的抗体效价变化
小鼠的血浆中抗hsIL-6R抗体效价通过电化学发光法测定。将稀释至50倍的小鼠血浆试样与制备成30μg/mL的抗Fv4独特型抗体混合，在室温反应1小时。该独特型抗体如下得到：将用Fv4-M73(WO2009/125825)免疫兔而得的血清通过离子交换树脂纯化后，在固定有Fv4-M73的柱上进行亲和纯化，然后在人固定化柱上吸附。向前述混合溶液中添加50μg/mL含有1μg/mL用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin and Biotinylation Kits(Pierce)生物素化的hsIL-6R、2μg/mL用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的SULFO-抗小鼠IgG(H+L)抗体(BECKMAN COULTER)的溶液，混合，在4℃反应1晚。此时，为了防止测定试样中所含的给予被检物与hsIL-6R结合而检测针对给予被检物的ADA，将过量的抗Fv4独特型抗体预先添加到试样中。然后，将前述反应液分配到MA400PRStreptavidinPlate(Meso Scale Discovery)。进一步在25℃反应1小时后，向洗涤了的各孔分配ReadBuffer T(×4)(Meso Scale Discovery)，立刻用SECTOR PR 400reader(Meso ScaleDiscovery)测定各孔中反应液的吸光度。
抗体非给予组、Fv4-mIgG1、Fv4-mIgG2a、Fv4-mF3、Fv4-mFa30和H54/L28-mF3给予组各个体的小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价变化示于图27～图31。结果，在给予未增强小鼠FcRn结合的Fv4-mIgG1和Fv4-mIgG2a，以及增强了小鼠FcRn结合但是不与人IL-6受体pH依赖性地结合的H54/L28-mF3的组的任意个体中，均未见小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价上升。另一方面，在给予增强了小鼠FcRn结合的pH依赖性结合抗体Fv4-mF3和除增强小鼠FcRn结合之外还增强了小鼠FcgR结合的pH依赖性结合抗体Fv4-mFa30的组中，确认存在可见小鼠抗人IL-6受体抗体(抗hsIL-6R抗体)的抗体效价上升的个体。
由以上显示，具有与靶抗原pH依赖性地结合的活性、且增强了pH 7.4的FcRn结合的抗原结合分子针对免疫耐受的内源靶抗原也能够诱导获得性免疫。据此，认为这样的分子针对自身癌抗原也可诱导获得性免疫，所以极有望作为癌治疗药。
(参考实施例1)
抗体表达利用以下方法进行。将悬浮于含有10％Fetal BovineSerum(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)的人胎儿肾癌细胞来源的HEK293H株(Invitrogen)以5～6×105细胞/mL的细胞密度接种于贴壁细胞用培养皿(直径10em，CORNING)，每皿10mL。将该细胞在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内培养一昼夜后，向抽吸除去培养基的该培养皿添加6.9mL的CHO-S-SFM-II(Invitrogen)培养基。制备的质粒通过脂质转染法导入到细胞。通过离心(约2000g、5分钟、室温)从回收的培养上清除去细胞。进一步通过使培养上清通过0.22μm过滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)进行灭菌，得到培养上清。利用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，通过本领域技术人员公知的方法从所得培养上清纯化表达的抗体。对于纯化抗体的浓度，从利用分光光度计测定的280nm的吸光度值，使用通过Protein Science(1995)4，2411-2423中记载的方法算出的吸光系数计算抗体浓度。
(参考实施例2)与钙离子结合的人种系序列的探索
(2-1)钙依赖性地与抗原结合的抗体
钙依赖性地与抗原结合的抗体(钙依赖性抗原结合抗体)是与抗原的相互作用随钙浓度而变化的抗体。钙依赖性抗原结合抗体据信经由钙离子与抗原结合，所以形成抗原侧表位的氨基酸是可螯合钙离子的负电荷氨基酸或可成为氢键受体的氨基酸。根据形成这样的表位的氨基酸的性质，可靶向通过导入组氨酸制作的pH依赖性地与抗原结合的结合分子以外的表位。此外，如图13所示，通过使用兼具钙依赖性地和pH依赖性地与抗原结合的性质的抗原结合分子，认为可制作可分别靶向具有广泛性质的各种表位的抗原结合分子。于是认为，如果构建含有与钙结合的模体的分子集合(Ca文库)，从该分子集合获得抗原结合分子，则可有效获得钙依赖性抗原结合抗体。
(2-2)人种系序列的获得
作为含有与钙结合的模体的分子集合的实例，考虑该分子为抗体的实例。换言之，考虑含有与钙结合的模体的抗体文库是Ca文库的情况。
迄今尚未报告通过含有人种系序列的抗体与钙离子结合。于是，为了确定含有人种系序列的抗体是否与钙离子结合，以由Human Fetal Spleen Poly RNA(Clontech)制备的eDNA为模板克隆含有人种系序列的抗体的种系序列。将克隆的DNA片段***动物细胞表达载体中。得到的表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定，其序列号示于表10。将编码SEQ ID NO：5(Vk1)、SEQ ID NO：6(Vk2)、SEQ ID NO：7(Vk3)、SEQ ID NO：8(Vk4)以及SEQ ID NO：43(Vk5)的多核苷酸通过PCR法与编码天然型κ链恒定区(SEQ ID NO：44)的多核苷酸连接而得的DNA片段掺入到动物细胞表达用载体中。此外，将编码SEQ IDNO：46(Vk1)、SEQ ID NO：47(Vk2)、SEQ ID NO：48(Vk3)、SEQ ID NO：49(Vk4)以及SEQ IDNO：45(Vk5)的多核苷酸通过PCR法与编码SEQ ID NO：11所表示的IgG1的C末端2个氨基酸缺失的多肽的多核苷酸连接而得的DNA片段掺入到动物细胞表达用载体中。制作的改变体序列通过本领域技术人员公知的方法确认。
[表101
轻链种系序列 重链可变区序列 轻链可变区序列
Vk1 46 5
Vk2 47 6
Vk3 48 7
Vk4 49 8
Vk5 45 43
。
(2-3)抗体的表达和纯化
将***有获得的5种含有人种系序列的DNA片段的动物细胞表达载体导入动物细胞中。抗体的表达利用以下方法进行。将人胎儿肾细胞来源的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293Expression Medium培养基(Invitrogen)，以1.33x106细胞/mL的细胞密度接种于6孔板，每孔3mL。制备的质粒通过脂质转染法导入细胞中。在CO2培养箱(37度、8％CO2、90rpm)中进行4天培养。利用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，使用本领域技术人员公知的方法，从通过上述得到的培养上清纯化抗体。利用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。通过利用PACE法计算的吸光系数，从得到的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(2-4)含有人种系序列的抗体的钙离子结合活性评价
评价纯化的抗体的钙离子结合活性。作为钙离子与抗体结合的评价指标，通过差示扫描量热法(DSC)测定热变性中间温度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。热变性中间温度(Tm值)是稳定性的指标，如果通过钙离子的结合而稳定蛋白，那么热变性中间温度(Tm值)与钙离子未结合的情况相比高(J.Biol.Chem.(2008)283，37，25140-25149)。通过评价抗体溶液中随钙离子浓度而变化的抗体Tm值变化，评价钙离子与抗体的结合活性。纯化的抗体进行以20mMTris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2(pH 7.4)或20mM Tris-HCl、150mM NaCl，3μM CaCl2(pH 7.4)的溶液作为外部溶液的透析(EasySEP、TOMY)处理。以利用透析中所用的溶液制备成约0.1mg/mL的抗体溶液作为被检物，在20℃～115℃以240℃/小时的升温速度进行DSC测定。基于得到的DSC变性曲线计算的各抗体Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)示于表11。
[表11]
Figure BDA0002222475850002031
结果，含有hVk1、hVk2、hVk3、hVk4序列的抗体Fab结构域的Tm值不随含有该Fab结构域的溶液中的钙离子浓度而变动。另一方面，含有hVk5序列的抗体Fab结构域的Tm值随含有该Fab结构域的抗体溶液中的钙离子浓度而变动，所以显示hVk5序列与钙离子结合。
(2-5)hVk5-2序列的钙结合评价
参考实施例2的(2-2)中，除了Vk5-2(K链恒定区SEQ ID NO：44与SEQ ID NO：43融合而得的SEQ ID NO：50)之外，还得到分类为Vk5-2的Vk5-2变体1(SEQ ID NO：51)和Vk5-2变体2(SEQ ID NO：52)。也评价了这些变体的钙结合活性。将Vk5-2、Vk5-2变体1和Vk5-2变体2的DNA片段分别掺入动物细胞用表达载体中。得到的表达载体碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。对于分别掺入有Vk5-2、Vk5-2变体1和Vk5-2变体2的DNA片段的动物细胞用表达载体，与掺入以表达重链CIM_H(SEQ ID NO：45)的动物表达用载体一起通过参考实施例2的(2-3)中记载的方法导入动物细胞中，纯化抗体。评价纯化的抗体的钙离子结合活性。纯化的抗体进行以20mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2(pH7.5)或20mM Tris-HCl、150mM NaCl(pH7.5)的溶液(表12中记为钙离子浓度0mM)作为外部溶液的透析(EasySEP、TOMY)处理。以利用透析中所用的溶液制备成约0.1mg/mL的抗体溶液作为被检物，在20℃～115℃以240℃/小时的升温速度进行DSC测定。基于得到的DSC变性曲线计算的各抗体Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)示于表12。
[表12]
Figure BDA0002222475850002041
结果，含有Vk5-2、Vk5-2变体1和Vk5-2变体2的序列的抗体Fab结构域的Tm值随含有该Fab结构域的抗体溶液中的钙离子浓度而变动，所以显示具有分类为Vk5-2的序列的抗体与钙离子结合。
(参考实施例3)人Vk5(hVk5)序列的评价
(3-1)hVk5序列
Kabat数据库中，作为hVk5序列仅登录有hVk5-2序列。以下，hVk5和hVk5-2以同义使用。WO2010/136598中记载，hVk5-2序列在种系序列中的存在比例为0.4％。其他报告中也记述hVk5-2序列在种系序列中的存在比例为0～0.06％(J.Mol.Biol.(2000)296，57-86、Proc.Natl.Acad.Sci.(2009)106，48，20216-20221)。如上述，hVk5-2序列是在种系序列中出现频率低的序列，所以认为，从由人种系序列构成的抗体文库或通过免疫表达人抗体的小鼠获得的B细胞获得与钙结合的抗体是没有效率的。于是，考虑了设计含有人hVk5-2序列的Ca文库的可能性，但已报告的合成抗体文库(WO2010/105256或WO2010/136598)中不包括hVk5序列。此外，hVk5-2序列的物性未见报告，该可能性的实现是未知的。
(3-2)糖链非附加型hVk5-2序列的构建、表达和纯化
hVk5-2序列具有在20位(Kabat编号)的氨基酸附加N型糖链的序列。蛋白上附加的糖链中存在异质性，所以从物质的均一性观点出发期望不附加糖链。于是，制作20位(Kabat编号)的Asn(N)残基置换成Thr(T)残基的改变体hVk5-2_L65(SEQ ID NO：53)。氨基酸的置换通过利用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)的本领域技术人员公知的方法进行。将编码改变体hVk5-2_L65的DNA掺入动物表达用载体中。掺入有制作的改变体hVk5-2_L65DNA的动物表达用载体与掺入以表达作为重链的CIM_H(SEQ ID NO：45)的动物表达用载体一起通过参考实施例2中记载的方法导入动物细胞中。导入的动物细胞中表达的含有hVk5-2_L65和CIM_H的抗体通过参考实施例2中记载的方法纯化。
(3-3)含有糖链非附加型hVk5-2序列的抗体的物性评价
获得的含有改变序列hVk5-2_L65的抗体与用于改变的含有原始hVk5-2序列的抗体相比，其异质性是否减少利用离子交换层析进行分析。离子交换层析方法示于表13。分析的结果，如图14所示，糖链附加位点改变的hVk5-2_L65显示与原始hVk5-2序列相比异质性减少。
[表13]
接下来，含有异质性减少的hVk5-2_L65序列的抗体是否与钙离子结合，利用参考实施例2中记载的方法评价。结果，如表14所示，含有糖链附加位点改变了的hVk5-2_L65的抗体Fab结构域的Tm值也随抗体溶液中的钙离子浓度变化而变动。即，含有糖链附加位点改变了的hVk5-2_L65的抗体Fab结构域显示与钙离子结合。
[表14]
Figure BDA0002222475850002062
(参考实施例4)含有hVk5-2序列的CDR序列的抗体分子的钙离子结合活性的评价
(4-1)含有hVk5-2序列的CDR序列的改变抗体的制作、表达和纯化
hVk5-2_L65序列是人Vk5-2序列的框架内存在的糖链附加位点的氨基酸改变了的序列。参考实施例3中改变糖链附加位点也显示与钙离子结合，但是，框架序列是种系序列从免疫原性的观点出发通常是期望的。于是，研究了是否可将抗体的框架序列置换成维持该抗体的钙离子结合活性、同时未附加糖链的种系序列的框架序列。
将编码化学合成的hVk5-2序列的框架序列改变成hVk1、hVk2、hVk3和hVk4序列的序列(分别为CaVk1(SEQ ID NO：54)、CaVk2(SEQ ID NO：55)、CaVk3(SEQ ID NO：56)、CaVk4(SEQ ID NO：57))的多核苷酸通过PCR法与编码天然型K链恒定区(SEQ ID NO：44)的多核苷酸连接而得的DNA片段掺入动物细胞表达用载体中。制作的改变体序列通过本领域技术人员公知的方法确认。如上述制作的各质粒与掺入有编码CIM_H(SEQ ID NO：45)的多核苷酸的质粒一起通过参考实施例2中记载的方法导入动物细胞中。从如上述导入的动物细胞的培养液纯化表达的所需抗体分子。
(4-2)含有hVk5-2序列的CDR序列的改变抗体的钙离子结合活性的评价
钙离子是否与含有除hVk5-2序列以外的种系序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)的框架序列和hVK5-2序列的CDR序列的改变抗体结合，通过参考实施例2中记载的方法评价。评价结果示于表15。各改变抗体Fab结构域的Tm值显示随抗体溶液中的钙离子浓度变化而变动。因此，含有除hVk5-2序列的框架序列以外的框架序列的抗体也显示与钙离子结合。
[表15]
Figure BDA0002222475850002071
此外，作为改变以含有除hVk5-2序列以外的种系序列(hVk1、hVk2、hVk3、hVk4)的框架序列和hVK5-2序列的CDR序列的各抗体Fab结构域的热稳定性指标的热变性温度(Tm值)与用于改变的含有原始hVk5-2序列的抗体Fab结构域的Tm值相比增加，这是明显的。由该结果发现，含有hVk1、hVk2、hVk3、hVk4的框架序列和hVk5-2序列的CDR序列的抗体不仅具有与钙离子结合的性质，而且从热稳定性的观点来看也是优异的分子。
(参考实施例5)人种系hVk5-2序列中存在的钙离子结合位点的鉴定
(5-1)hVk5-2序列的CDR序列中的变异位点的设计
如参考实施例4中记载，含有将hVk5-2序列的CDR部分导入其它种系的框架序列而得的轻链的抗体也显示与钙离子结合。该结果启示，hVk5-2中存在的钙离子结合位点存在于CDR中。作为与钙离子结合、即螯合钙离子的氨基酸，可列举负电荷氨基酸或可成为氢键受体的氨基酸。于是，评价了含有hVk5-2序列的CDR序列中存在的Asp(D)残基或Glu(E)残基置换成Ala(A)残基的变异hVk5-2序列的抗体是否与钙离子结合。
(5-2)hVk5-2序列的Ala置换体的制作以及抗体的表达和纯化
制作含有hVk5-2序列的CDR序列中存在的Asp和/或Glu残基改变成Ala残基的轻链的抗体分子。如参考实施例3中记载，未附加糖链的改变体hVk5-2_L65维持钙离子结合，所以认为，从钙离子结合性观点来看与hVk5-2序列同等。本参考实施例中以hVk5-2_L65作为模板序列进行氨基酸置换。制作的改变体示于表16。氨基酸的置换通过QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)、PCR或In fusion Advantage PCR cloning kit(TAKARA)等本领域技术人员公知的方法进行，构建氨基酸置换了的改变轻链的表达载体。
[表16]
Figure BDA0002222475850002091
得到的表达载体的碱基序列通过本领域技术人员公知的方法确定。通过将制作的改变轻链的表达载体与重链CIM_H(SEQ ID NO：45)的表达载体一起瞬时导入人胎儿肾癌细胞来源的HEK293H株(Invitrogen)或FreeStyle293细胞(Invitrogen)，使抗体表达。利用rProteinA SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare)，通过本领域技术人员公知的方法从得到的培养上清纯化抗体。利用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。通过利用由PACE法计算的吸光系数，从得到的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(5-3)含有hVk5-2序列的Ala置换体的抗体的钙离子结合活性评价
得到的纯化抗体是否与钙离子结合通过参考实施例2中记载的方法确定。其结果示于表17。通过将hVk5-2序列的CDR序列中存在的Asp或Glu残基置换成不能参与钙离子结合或螯合的Ala残基，显示存在其Fab结构域的Tm值不随抗体溶液的钙离子浓度变化而变动的抗体。因Ala置换而Tm值不变动的置换位点(32位和92位(Kabat编号))显示对于钙离子与抗体的结合特别重要。
[表17]
Figure BDA0002222475850002101
(参考实施例6)含有具有钙离子结合模体的hVkl序列的抗体的钙离子结合活性评价
(6-1)具有钙离子结合模体的hVkl序列的制作以及抗体的表达和纯化
由参考实施例4中记载的Ala置换体的钙结合活性结果显示，hVk5-2序列的CDR序列中Asp或Glu残基对于钙结合重要。于是，评价是否仅将30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)残基导入其它种系的可变区序列也能够与钙离子结合。具体而言，制作作为人种系序列的hVk1序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)残基置换成hVk5-2序列的30位、31位、32位、50位和92位(Kabat编号)残基的改变体LfVkl_Ca(SEQ ID NO：66)。即，确定含有仅导入hVk5-2序列中这5个残基的hVk1序列的抗体是否能够与钙结合。改变体的制作与参考实施例5同样地进行。使得到的含有轻链改变体LfVk1_Ca和轻链hVk1序列的LfVk1(SEQ ID NO：67)与重链CIM_H(SEQ ID NO：45)一起表达。抗体的表达和纯化通过与参考实施例4相同的方法实施。
(6-2)含有具有钙离子结合模体的人hVk1序列的抗体的钙离子结合活性的评价
如上述得到的纯化抗体是否与钙离子结合通过参考实施例2中记载的方法确定。其结果示于表18。含有具有hVk1序列的LfVk1的抗体Fab结构域的Tm值不随抗体溶液中的钙浓度变化而变动，另一方面，含有LfVk1_Ca的抗体序列的Tm值随抗体溶液中的钙浓度变化而变化1℃以上，所以显示含有LfVk1_Ca的抗体与钙结合。由上述结果显示，对于钙离子结合，hVk5-2的CDR序列并非全部是需要的，仅在构建LfVk1_Ca序列时导入的残基就已足够。
[表18]
Figure BDA0002222475850002111
(参考实施例7)为了有效获得Ca浓度依赖性地与抗原结合的结合抗体的、钙离子结合模体导入可变区中的抗体分子组(Ca文库)的设计
作为钙结合模体，可适宜地列举例如hVk5-2序列或其CDR序列以及30位、31位、32位、50位、92位(Kabat编号)残基。此外，与钙结合的蛋白所具有的EF手模体(钙调蛋白等)或C型凝集素(ASGPR等)也属于钙结合模体。
Ca文库由重链可变区和轻链可变区构成。重链可变区使用人抗体序列，轻链可变区中导入钙结合模体。作为导入了钙结合模体的轻链可变区的模板序列，选择hVk1序列。含有在hVk1序列中导入了钙结合模体之一的hVk5-2的CDR序列的LfVk1_Ca序列的抗体如参考实施例5所示，显示与钙离子结合。模板序列中出现多种氨基酸，扩大了构成文库的抗原结合分子的多样性。多种氨基酸出现的位置选择为在与抗原相互作用的可能性高的可变区的表面露出的位置。具体而言，选择30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位和96位(Kabat编号)作为这样的柔性残基。
接下来，设定出现的氨基酸残基的种类及其出现频率。分析Kabat数据库(KABAT，E.A.ET AL.：′Sequences of proteins of immunological interest′，vol.91，1991，NIHPUBLICATION)中登录的hVk1和hVk3的序列中的柔性残基中氨基酸的出现频率。基于分析结果，从各位置出现频率高的氨基酸选择Ca文库中出现的氨基酸的种类。此时，也选择根据分析结果确定为出现频率低的氨基酸，以免氨基酸性质失之偏颇。此外，选择的氨基酸的出现频率以Kabat数据库的分析结果作为参考而设定。
通过考虑如以上那样设定的氨基酸和出现频率，作为Ca文库，设计含有钙结合模体、重视在该模体以外的各残基中含有多种氨基酸那样的序列的多样性的Ca文库。表1和2示出Ca文库的详细设计(各表中的位置表示Kabat编号)。此外，对于表1和2中记载的氨基酸的出现频率，在以Kabat编号表示的92位为Asn(N)的情况下，94位可以不为Ser(S)而是Leu(L)。
(参考实施例8)Ca文库の制作
以由人PBMC制作的多腺苷酸化RNA或市售人多腺苷酸化RNA等为模板，通过PCR法扩增抗体重链可变区的基因文库。就抗体轻链可变区部分而言，如参考实施例7中记载，设计提高维持钙结合模体且可钙浓度依赖性地与抗原结合的抗体的出现频率的抗体可变区轻链部分。此外，作为柔性残基中除导入钙结合模体的残基以外的氨基酸残基，参考天然人抗体中氨基酸出现频率的信息((KABAT，E.A.ET AL.：′Sequences of proteins ofimmunological interest′，vol.91，1991，NIH PUBLICATION)，设计使天然人抗体序列中出现频率高的氨基酸均等分布的抗体轻链可变区的文库。将如此制作的抗体重链可变区的基因文库和抗体轻链可变区的基因文库的组合***噬菌粒载体中，构建展示由人抗体序列构成的Fab结构域的人抗体噬菌体展示文库(Methods Mol Biol.(2002)178，87-100)。
确认由导入了抗体基因文库的大肠杆菌分离的抗体基因部分的序列。得到的290种克隆的序列的氨基酸分布和设计的氨基酸分布示于图15。
(参考实施例9)Ca文库所含的分子的钙离子结合活性评价
(9-1)Ca文库所含的分子的钙离子结合活性
如参考实施例3所示，显示与钙离子结合的hVk5-2序列是在种系序列中出现频率低的序列，所以认为，从通过免疫表达由人种系序列构成的抗体文库或人抗体的小鼠获得的B细胞获得与钙结合的抗体是没有效率的。于是，在参考实施例8中构建了Ca文库。评价构建的Ca文库中是否存在显示钙结合的克隆。
(9-2)抗体的表达和纯化
将Ca文库所含的克隆导入动物细胞表达用质粒。抗体表达利用以下方法进行。将人胎儿肾细胞来源的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293ExpressionMedium培养基(Invitrogen)，以1.33x106细胞/mL的细胞密度接种于6孔板，每孔3mL。制备的质粒通过脂质转染法导入细胞。在CO2培养箱(37℃、8％CO2、90rpm)中进行4天培养。利用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(AmershamBiosciences)，使用本领域技术人员公知的方法，从通过上述得到的培养上清纯化抗体。利用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。通过利用由PACE法计算的吸光系数，从得到的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(9-3)获得的抗体的钙离子结合评价
如上述得到的纯化抗体是否与钙离子结合通过实施例6中记载的方法确定。其结果示于表19。Ca文库所含的多个抗体的Fab结构域的Tm随钙离子浓度而变动，显示包括与钙离子结合的分子。
[表19]
Figure BDA0002222475850002141
(参考实施例10)Ca依赖性地与IL-6受体结合的抗体的获得
(10-1)通过珠淘选从文库获得Ca依赖性地与抗原结合的抗体片段
自构建的Ca依赖性地与IL-6受体结合的抗体文库的最初选择通过仅浓缩具有抗原(IL-6受体)结合能力的抗体片段来实施。
由携带有构建的噬菌体展示用噬菌粒的大肠杆菌进行噬菌体产生。通过向进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5MNaCl/10％PEG沉淀噬菌体群，将该群用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，通过向噬菌体文库液中添加BSA和CaCl2，制备成终浓度为4％BSA、1.2mM钙离子。作为淘选方法，参照作为通用方法的利用固定在磁珠上的抗原的淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2)，2-9；J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2)，191-203；Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20；Mol.Cell Proteomics(2003)2(2)，61-9)。作为磁珠，使用NeutrAvidin包被珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-包被的)或Streptavidin包被珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。
具体而言，通过向制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。添加BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。用1mL的1.2mM CaCl2/TBST(含有1.2mM CaCl2的TBST)洗涤珠3次后，用1mL的1.2mM CaCl2/TBS(含有1.2mM CaCl2的TBS)再洗涤2次。然后，将添加了0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温悬浮15分钟后，立刻用磁力架(magnetic stand)分离珠，回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌ER2738株中。通过在37℃缓慢进行1小时上述大肠杆菌的搅拌培养，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x225mm板。接着，通过从接种的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，制备噬菌体文库液。
第2次淘选中，以抗原结合能力或Ca依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。
具体而言，在以抗原结合能力为指标进行浓缩时，通过向制备的噬菌体文库液中加入40pmol生物素标记抗原，使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。用1mL的1.2mM CaCl2/TBST洗涤珠3次，用1.2mM CaCl2/TBS洗涤2次。然后，将添加了0.5mL 1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温悬浮15分钟后，立刻用磁力架分离珠，回收噬菌体溶液。通过向回收的噬菌体溶液中加入5μL100mg/mL胰蛋白酶，切割不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白(辅助噬菌体来源的pIII蛋白)，使不展示Fab的噬菌体丧失感染大肠杆菌的能力。将回收的噬菌体溶液添加到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌ER2738株中。通过在37℃缓慢进行1小时上述大肠杆菌的搅拌培养，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm板。接着，通过从接种的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，回收噬菌体文库液。
在以Ca依赖性结合能力为指标进行浓缩时，通过向制备的噬菌体文库液中加入40pmol生物素标记抗原，使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。用1mL 1.2mM CaCl2/TBST和1.2mMCaCl2/TBS洗涤珠。然后，将添加了0.1mL 2mM EDTA/TBS(含有2mM EDTA的TBS)的珠在室温悬浮后，立刻用磁力架分离珠，回收噬菌体溶液。通过向回收的噬菌体溶液加入5μL 100mg/mL胰蛋白酶，切割不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白(辅助噬菌体来源的pIII蛋白)，使不展示Fab的噬菌体丧失感染大肠杆菌的能力。将回收的噬菌体溶液添加到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌ER2738株中。通过在37℃缓慢进行1小时上述大肠杆菌的搅拌培养，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x 225mm板。接着，通过从接种的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，回收噬菌体文库液。
(10-2)通过噬菌体ELISA进行评价
按照常规方法(Methods Mol.Biol.(2002)178，133-145)，从由上述方法得到的大肠杆菌的单菌落回收含有噬菌体的培养上清。
添加了BSA和CaCl2的含有噬菌体的培养上清按照以下顺序进行ELISA。用含有生物素标记抗原的100μLPBS包被StreptaWell 96微量滴定板(Roche)一晚。通过用PBST洗涤该板的各孔除去抗原后，用250μL 4％BSA-TBS封闭该孔1小时以上。通过将向除去了4％BSA-TBS的各孔中加入了制备的培养上清的该板在37℃静置1小时，使噬菌体展示的抗体与各孔中存在的抗原结合。向用1.2mM CaCl2/TBST洗涤的各孔中加入1.2mM CaCl2/TBS或1mMEDTA/TBS，将该板在37℃静置孵育30分钟。用1.2mM CaCl2/TBST洗涤后，将用离子化钙浓度为1.2mM的TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)添加到各孔中的板孵育1小时。用1.2mM CaCl2/TBST洗涤后，添加了TMB single溶液(ZYMED)的各孔中溶液的显色反应在通过添加硫酸而终止后，通过450nm的吸光度测定该显色。
对于实施了上述噬菌体ELISA的克隆，进行利用特异性引物扩增的基因的碱基序列分析。噬菌体ELISA、序列分析的结果示于以下的表20。
[表20]
文库 Ca文库 Ca文库
浓缩指标 抗原结合能力 依赖性抗原结合能力
淘选次数 2 2
试验的克隆数 85 86
ELISA阳性 77 75
ELISA阳性克隆序列种类 74 72
Ca依赖性结合克隆序列种类 13 47
。
(10-3)抗体的表达和纯化
噬菌体ELISA的结果，将判断为存在Ca依赖性抗原结合能力的克隆导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达利用以下方法进行。将人胎儿肾细胞来源的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293 Expression Medium培养基(Invitrogen)，以1.33x106细胞/mL的细胞密度接种于6孔板，每孔3mL。制备的质粒通过脂质转染法导入细胞中。在CO2培养箱(37度、8％CO2、90rpm)中进行4天培养。利用rProtein A SepharoseTM FastFlow(Amersham Biosciences)，使用本领域技术人员公知的方法，从通过上述得到的培养上清纯化抗体。利用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。通过利用由PACE法计算的吸光系数，从得到的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(10-4)获得的抗体对人IL-6受体的Ca依赖性结合能力的评价
为了判断参考实施例9中获得的抗体6RC1IgG_010(重链SEQ ID NO：90、轻链SEQID NO：91)、6RC1IgG_012(重链SEQ ID NO：92、轻链SEQ ID NO：93)和6RC1TgG_019(重链SEQID NO：94、轻链SEQID NO：95)对人IL-6受体的结合活性是否是Ca依赖性的，利用BiacoreT100(GE Healthcare)进行这些抗体与人IL-6受体的相互作用分析。作为不具有对人IL-6受体的Ca依赖性结合活性的对照抗体，使用托珠单抗(重链SEQ ID NO：96、轻链SEQID NO：97)。作为高钙离子浓度和低钙离子浓度条件，分别在1.2mM和3μM的钙离子浓度的溶液中进行相互作用分析。在通过胺偶联法固定了适量蛋白A/G(Invitrogen)的Sensor chipCM5(GE Healthcare)上，捕获目标抗体。运行缓冲液使用2种缓冲液：20mM ACES、150mMNaCl、0.05％(w/v)Tween20、1.2mM CaCl2(pH 7.4)或20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、3μM CaCl2(pH 7.4)。人IL-6受体的稀释也使用各自的缓冲液。测定全部在37℃实施。
在使用作为对照抗体的托珠单抗抗体、6RC1IgG_010抗体、6RC1IgG_012抗体和6RC1TgG_019抗体进行抗原抗体反应的相互作用分析时，通过以5μL/分的流速注射IL-6受体的稀释液和作为空白的运行缓冲液3分钟，使IL-6受体与传感器芯片上捕获的托珠单抗抗体、6RC1IgG_010抗体、6RClIgG_012抗体和6RC1TgG_019抗体相互作用。然后，通过以30μL/分的流速注射10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)30秒，使传感器芯片再生。
通过该方法测定的高钙离子浓度时的传感图示于图16。
关于低钙离子浓度条件下托珠单抗抗体、6RC1IgG_010抗体、6RC1TgG_012抗体和6RC1TgG_019抗体的传感图也通过同样的方法获得。低钙离子浓度时的传感图示于图17。
由上述结果观察到，对于6RC1IgG_010抗体、6RClIgG_012抗体和6RC1IgG_019抗体，通过将缓冲液中的钙离子浓度由1.2mM设为3μM，IL6受体结合能力大幅降低。
(参考实施例11)使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得Ca依赖性地与IL-6受体结合的抗体
(11-1)天然人抗体噬菌体展示文库的制作
将由人PBMC制作的多腺苷酸化RNA或市售的人多腺苷酸化RNA等作为模板，按照本领域技术人员公知的方法，构建由展示相互不同的人抗体序列的Fab结构域的多个噬菌体构成的人抗体噬菌体展示文库。
(11-2)通过珠淘选从文库获得Ca依赖性地与抗原结合的抗体片段
从构建的天然人抗体噬菌体展示文库中进行的最初的挑选如下实施：仅浓缩具有抗原(IL-6受体)结合能力的抗体片段，或浓缩以Ca浓度依赖性抗原(IL-6受体)结合能力为指标的抗体片段。以Ca浓度依赖性抗原(IL-6受体)结合能力为指标的抗体片段的浓缩如下实施：使用会螯合Ca离子的EDTA，从在Ca离子存在下与IL-6受体结合的噬菌体文库中洗脱噬菌体。作为抗原，使用经生物素标记的IL-6受体。
由携带构建的噬菌体展示用噬菌粒的大肠杆菌产生噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体群用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，在噬菌体文库液中添加BSA和CaCl2，以使终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度。作为淘选方法，参考了作为常规方法的使用固定于磁珠的抗原的淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2)，2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2)，191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2)，61-9)。作为磁珠，使用NeutrAvidin包被珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-包被的)或Streptavidin包被珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。
具体地，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl2/TBS(含有1.2mM CaCl2的TBS)洗涤1次。然后，在浓缩具有IL-6受体结合能力的抗体片段时，通过利用常规方法的洗脱，在以Ca浓度依赖性的IL-6受体结合能力作为指标来浓缩抗体片段时，通过由悬浮于2mM EDTA/TBS(含有2mM EDTA的TBS)中的珠洗脱，来回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
第2次以后的淘选中，以Ca依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl2/TBST和1.2mM CaCl2/TBS洗涤。然后将加入有0.1mL的2mM EDTA/TBS的珠在室温悬浮后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。以Ca依赖性结合能力为指标的淘选重复进行数次。
(11-3)基于噬菌体ELISA的评价
通过由上述的方法得到的大肠杆菌的单克隆，按照常法(Methods Mol.Biol.(2002)178，133-145)，回收含有噬菌体的培养上清。
在含有噬菌体的培养上清中加热BSA和CaCl2，以使终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度，按照以下步骤进行ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μL PBS包被一晚。用PBST洗涤该板的各孔，由此将抗原除去后，将该孔用250μL的4％BSA-TBS封闭1小时以上。在除去了4％BSA-TBS的各孔中，加入制备的培养上清，将该板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示的抗体与各孔中存在的抗原结合。在用1.2mMCaCl2/TBST进行了洗涤的各孔中，加入1.2mM CaCl2/TBS或1mM EDTA/TBS，将该板在37℃静置30分钟，进行孵育。在用1.2mM CaCl2/TBST进行洗涤后，将通过终浓度4％的BSA和离子化钙浓度为1.2mM的TBS进行了稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham PharmaciaBiotech)添加至各孔中，将板孵育1小时。用1.2mMCaCl2/TBST洗涤后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而停止后，通过450nm的吸光度测定该显色。
作为上述噬菌体ELISA的结果，将被判断具有Ca依赖性抗原结合能力的抗体片段作为模板，利用特异性引物进行扩增，并对所扩增的基因的碱基序列进行分析。
(11-4)抗体的表达和纯化
将噬菌体ELISA的结果判断为具有Ca依赖性抗原结合能力的克隆导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293Expression Medium培养基(Invitrogen)中，以1.33×106细胞/mL的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3mL。将制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。在CO2培养箱(37度、8％CO2、90rpm)中进行4天培养。使用rProtein ASepharoseTM Fast Flow(AmershamBiosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(参考实施例12)获得的抗体对人IL-6受体的Ca依赖性结合能力的评价
为了判断参考实施例11中获得的抗体6RL#9-IgG1(重链(SEQ ID NO：98上连接有来源于IgG1的恒定区的序列)、轻链(SEQ ID NO：99))、和FH4-IgG1(重链SEQ ID NO：100、轻链SEQ ID NO：101))对人IL-6受体的结合活性是否为Ca依赖性的，使用Biacore T100(GEHealthcare)来进行这些抗体和人IL-6受体的抗原抗体反应的动力学分析。作为对人IL-6受体不具有Ca依赖性结合活性的对照抗体，使用WO2009/125825中记载的H54/L28-IgG1(重链SEQ ID NO：102、轻链SEQ ID NO：103)。作为高钙离子浓度和低钙离子浓度条件，分别在2mM和3μM的钙离子浓度的溶液中进行抗原抗体反应的动力学分析。在用胺偶联法固定有适量的蛋白A(Invitrogen)的Sencor Chip CM4(GE Healthcare)上，捕获目标抗体。运行缓冲液使用10mM ACES、150mMNaCl、0.05％(w/v)Tween20、2mM CaCl2(pH 7.4)或10mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、3μmol/L CaCl2(pH 7.4)这2种缓冲液。人IL-6受体的稀释中也使用各自的缓冲液。测定均在37℃下实施。
在使用了H54L28-IgG1抗体的抗原抗体反应的动力学分析之际，以流速20μL/分注入IL-6受体的稀释液和作为空白的运行缓冲液3分钟，由此使捕获于传感器芯片上的H54L28-IgG1抗体与IL-6受体相互作用。然后，以流速20μL/分流过10分钟运行缓冲液，观察到IL-6受体的解离后，以流速30μL/分注入10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)30秒钟，由此使传感器芯片再生。根据测定所得的传感图，计算作为动力学参数的结合速率常数ka(1/Ms)和解离速率常数kd(1/s)。使用这些值，计算H54L28-IgG1抗体对人IL-6受体的解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T100Evaluation Software(GE Healthcare)。
在使用了FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的抗原抗体反应的动力学分析之际，以流速5μL/分注入IL-6受体的稀释液和作为空白的运行缓冲液15分钟，由此使捕获于传感器芯片上的FH4-IgG1抗体或6RL#9-IgG1抗体与IL-6受体相互作用。然后，以流速30μL/分注入10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)30秒钟，由此使传感器芯片再生。根据测定所得的传感图，使用稳态亲和性模型计算解离常数KD(M)。各参数的计算中使用了Biacore T 100EvaluationSoftware(GE Healthcare)。
通过该方法确定的2mM CaCl2存在下的各抗体与IL-6受体的解离常数KD示于表21：
[表21]
抗体 H54/L28-IgG1 FH4-IgG1 6RL#9-IgG1
kD(M) 1.9E-9 5.9E-7 2.6E-7
。
对于Ca浓度为3μM的条件下的H54/L28-IgG1抗体的KD，可以用与2mM Ca浓度存在下相同的方法来计算。Ca浓度为3μM的条件下，FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体基本未观察到对IL-6受体的结合，因而难以通过上述方法来计算KD。但通过使用下述式1(BiacoreT100 Software Handbook，BR-1006-48，AE 01/2007)，可以预测Ca浓度为3μM的条件下的这些抗体的KD：
(式1)
Req＝C x Rmax/(KD+C)+RI
上述(式1)中各项的意思如下述表示：
Req(RU)：稳态结合水平(Steady state binding levels)
Rmax(RU)：分析物的表面结合能力(Analyte binding capacity of thesurface)
RI(RU)：试样中的容积折射率贡献(Bulk refractive index contribution inthe sample)
C(M)：分析物浓度(Analyte concentration)
KD(M)：平衡解离常数(Equilibrium dissociation constant)。
使用了上述(式1)的、Ca浓度为3μmol/L时的各抗体与IL-6受体的解离常数KD的预测估算结果示于表22。表22中的Req、Rmax、RI、C是基于测定结果估计的值。
[表22]
抗体 H54/L28-IgG1 FH4-IgG1 6RL#9-IgG1
Req(RU) 5 10
Rmax(RU) 39 72
RI(RU) 0 0
C(M) 5E-06 5E-06
KD(M) 2.2E-9 3.4E-05 3.1E-05
。
由上述结果预测：对于FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体，通过将缓冲液中的CaCl2浓度从2mM减少至3μM，对IL-6受体的KD将分别上升约60倍、约120倍(亲和性降低60倍、120倍以上)。
表23中汇总了H54/L28-IgG1、FH4-IgG1、6RL#9-IgG1这3种抗体在2mM CaCl2存在下和3μM CaCl2存在下的KD值和KD值的Ca依赖性。
[表23]
抗体 H54/L28-IgG1 FH4-IgG1 6RL#9-IgG1
KD(M)(2mM CaCl<sub>2</sub>) 1.9E-9 5.9E-7 2.6E-7
KD(M)(3μM CaCl<sub>2</sub>) 2.2E-9 3.4E-5以上 3.1E-5以上
Ca依赖性 约1倍 约60倍以上 约120倍以上
。
未观察到Ca浓度的不同所致的H54/L28-IgG1抗体对IL-6受体的结合的不同。另一方面，在低浓度的Ca条件下，观察到FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体对IL-6受体的结合的显著减弱(表23)。
(参考实施例13)所得抗体的钙离子结合评价
接着，作为抗体的钙离子结合的评价指标，通过差示扫描量热法(DSC)测定了热变性中间温度(Tm值)(MicroCal VP-Capillary DSC、MicroCal)。热变性中间温度(Tm值)是稳定性的指标，如果通过钙离子结合而使蛋白稳定时，热变性中间温度(Tm值)与未结合钙离子时相比变高(J.Biol.Chem.(2008)283，37，25140-25149)。通过评价对应于抗体溶液中钙离子浓度变化的抗体Tm值的变化，对抗体的钙离子结合活性进行评价。将经纯化的抗体进行以20mM Tris-HCl、150mM NaCl、2mM CaCl2(pH 7.4)或20mM Tris-HCl、150mM NaCl，3μMCaCl2(pH 7.4)的溶液作为外部溶液的透析(EasySEP、TOMY)处理。将使用透析中所用的溶液制备为约0.1mg/mL的抗体溶液作为被检物，从20℃至115℃以240℃/小时的升温速度进行DSC测定。基于所得DSC的变性曲线，计算各抗体的Fab结构域的热变性中间温度(Tm值)，将其示于表24。
[表24]
Figure BDA0002222475850002251
由表24的结果表明：显示钙依赖性结合能力的FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的Fab的Tm值随钙离子浓度变化而改变，未显示钙依赖性结合能力的H54/L28-IgG1抗体的Fab的Tm值不随钙离子浓度变化而改变。FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体的Fab的Tm值的改变表明：钙离子与这些抗体结合，稳定了Fab部分。上述结果表明，钙离子与FH4-IgG1抗体和6RL#9-IgG1抗体结合，而H54/L28-IgG1抗体未与钙离子结合。
(参考实施例14)通过X射线晶体结构分析鉴定6RL#9抗体的钙离子结合位点
(14-1)X射线晶体结构分析
如参考实施例13所示，热变性温度Tm值的测定暗示了6RL#9抗体与钙离子结合。但是，6RL#9抗体的哪个位点与钙离子结合却无法预测，因而通过使用X射线晶体结构分析的方法来特定与钙离子相互作用的6RL#9抗体的序列中的残基。
(14-2)6RL#9抗体的表达和纯化
对用于X射线晶体结构分析而表达的6RL#9抗体进行纯化。具体地，将以能够分别表达6RL#9抗体的重链(SEQ ID NO：98上连接有来源于IgG1的恒定区的序列)和轻链(SEQID NO：99)的方式制备的动物表达用质粒瞬时地导入动物细胞中。在以最终细胞密度为1×106细胞/mL的方式悬浮于FreeStyle 293Expression Medium培养基(Invitrogen)中的800mL来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)中，通过脂质体转染法导入制备的质粒。将导入了质粒的细胞在CO2培养箱(37℃、8％CO2、90rpm)中培养5天。根据使用了rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)的本领域技术人员公知的方法，从如上所述得到的培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm下的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(14-3)从6RL#9抗体纯化Fab片段
使用分子量截留大小为10000MWCO的超滤膜，将6RL#9抗体浓缩至21mg/mL。使用L-半胱氨酸4mM、EDTA 5mM、20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)，制备稀释至5mg/mL的2.5mL的该抗体的试样。加入0.125mg的木瓜蛋白酶(Roche Applied Science)，将进行了搅拌的该试样在35℃静置2小时。静置后，进一步向该试样加入溶解有1片Protease Inhibitor CocktailMini，EDTA-free(Roche Applied Science)的10mL的25mM MES缓冲液(pH6)，在冰中静置，由此终止木瓜蛋白酶的蛋白酶反应。接着，将该试样添加至用25mM MES缓冲液pH6进行了平衡的1mL大小的阳离子交换柱HiTrap SP HP(GE Healthcare)，该阳离子交换柱在下游串联连接有1mL大小的ProteinA载体柱HiTrap MabSelect Sure(GE Healthcare)。通过在同一缓冲液中线性地使NaCl浓度提高至300mM进行洗脱，可得到6RL#9抗体的Fab片段的纯化流分。接着，将所得纯化流分通过5000MWCO的超滤膜浓缩至0.8mL左右。向用含有50mM NaCl的100mM HEPES缓冲液(pH 8)进行了平衡的凝胶过滤柱Superdex 200 10/300 GL(GEHealthcare)中添加浓缩液。结晶用的纯化6RL#9抗体的Fab片段使用相同缓冲液从柱上洗脱。应予说明，上述全部柱操作均在6至7.5℃的低温下实施。
(14-4)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶
预先在常规条件设定下得到6RL#9Fab片段的晶种。接着，将以达到5mM的方式加入有CaCl2的纯化6RL#9抗体的Fab片段使用5000MWCO的超滤膜浓缩至12mg/mL。接着，通过悬滴蒸汽扩散法，实施如前所述浓缩的试样的结晶。作为贮液，使用含有20-29％的PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)。在载玻片上，相对于0.8μl的贮液和0.8μl的前述浓缩试样的混合液，加入在含有29％PEG4000和5mM CaCl2的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)中进行了破碎的前述晶种被稀释到100-10000倍的稀释系列溶液0.2μl，由此制备结晶滴(crystallization drop)。将该结晶滴在20℃静置2天至3天，对由此得到的薄板状的结晶测定X射线衍射数据。
(14-5)6RL#9抗体的Fab片段在Ca不存在下的结晶
纯化6RL#9抗体的Fab片段使用5000MWCO的超滤膜浓缩至15mg/ml。接着，通过悬滴蒸汽扩散法，实施如前所述浓缩的试样的结晶。作为贮液，使用含有18-25％的PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)。在载玻片上，相对于0.8μl的贮液和0.8μl的前述浓缩试样的混合液，加入在含有25％PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)中进行了破碎的在Ca存在下所得的6RL#9抗体的Fab片段的结晶被稀释至100-10000倍的稀释系列溶液0.2μl，由此制备结晶滴。将该结晶滴在20℃静置2天至3天，对由此得到的薄板状的结晶测定X射线衍射数据。
(14-6)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的X射线衍射数据的测定
将浸渍于含有35％PEG4000和5mM CaCl2的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)溶液中的6RL#9抗体的Fab片段的在Ca存在下所得的一个单晶，通过使用带有微小尼龙环的针除去外部溶液，由此将该单晶在液氮中冷冻。使用高能加速器研究机构的放射光线设施PhotonFactory的光束线BL-17A，测定前述冷冻结晶的X射线衍射数据。应予说明，测定中通过时常将冷冻结晶置于-178℃的氮气流中而维持冷冻状态。使用安装于光束线上的CCD探测器Quantum315r(ADSC)，将结晶以每次1°进行旋转的同时，收集总计180幅衍射图像。晶格常数的确定、衍射斑索引编辑(diffraction spot indexing)和衍射数据的处理通过程序Xia2(CCP4 Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4 SoftwareSuite)来进行。最终得到直至分辨率
Figure BDA0002222475850002281
的衍射强度数据。本结晶属于空间群P212121，晶格常数
Figure BDA0002222475850002283
α＝90°、β＝90°、γ＝90°。
(14-7)6RL#9抗体的Fab片段在Ca不存在下的结晶的X射线衍射数据的测定
将浸渍于含有35％PEG4000的100mM HEPES缓冲液(pH7.5)的溶液中的、6RL#9抗体的Fab片段的在Ca不存在下得到的一个单晶，使用带有微小尼龙环的针除去外部溶液，从而将该单晶在液氮中冷冻。使用高能加速器研究机构的放射光线设施Photon Factory的光束线BL-5A，测定前述冷冻结晶的X射线衍射数据。应予说明，测定中通过时常将冷冻结晶置于-178℃的氮气流中而维持冷冻状态。使用安装于光束线上的CCD探测器Quantum210r(ADSC)，将结晶以每次1°进行旋转的同时，收集总计180幅衍射图像。晶格常数的确定、衍射斑索引编辑(diffraction spot indexing)、和衍射数据的处理通过程序Xia2(CCP4Software Suite)、XDS Package(Walfgang Kabsch)以及Scala(CCP4 Software Suite)来进行。最终得到直至分辨率
Figure BDA0002222475850002284
的衍射强度数据。本结晶属于空间群P212121，晶格常数
Figure BDA0002222475850002285
Figure BDA0002222475850002286
α＝90°、β＝90°、γ＝90°，与Ca存在下的结晶是同型。
(14-8)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的结构分析
通过使用程序Phaser(CCP4 Software Suite)的分子置换法，确定6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的结构。基于所得晶格的大小和6RL#9抗体的Fab片段的分子量，预测非对称单元中的分子数目是一个。基于一级序列上的同源性，将从PDB代码：1ZA6的结构坐标中取出的A链112-220位和B链116-218位氨基酸残基部分作为CL和CH1区的考察用模型分子。接着，将从PDB代码：1ZA6的结构坐标中取出的B链1-115位氨基酸残基部分作为VH区的考察用模型分子。最后，将从PDB代码：2A9M的结构坐标中取出的轻链3-147位氨基酸残基作为VL区的考察用模型分子。按照该顺序，由旋转函数和平移函数确定各考察用模型分子的晶格内的取向和位置，由此得到6RL#9抗体的Fab片段的初期结构模型。通过进行相对于该初期结构模型使VH、VL、CH1、CL的各结构域运动的刚体精修(rigid bodyrefinement)，相对于的反射数据的晶体学可信度因子R值为46.9％、自由R值为48.6％。进而，通过使用程序Refmac5(CCP4Software Suite)的结构精修、和参照以使用实验性确定的结构因子Fo和由模型计算得到的结构因子Fc和相位计算得到的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图的同时重复模型修正而在程序Coot(Paul Emsley)上进行，由此进行模型精修。最后，基于以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将Ca离子和水分子整合至模型中，由此使用程序Refmac5(CCP4 Software Suite)进行精修。通过使用分辨率
Figure BDA0002222475850002293
的21020个反射数据，最终相对于3440个原子的模型的晶体学可信度因子R值为20.0％、自由R值为27.9％。
(14-9)6RL#9抗体的Fab片段在Ca不存在下的结晶的X射线衍射数据的测定
6RL#9抗体的Fab片段在Ca不存在下的结晶的结构使用作为同型的Ca存在下结晶的结构来确定。从6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶的结构坐标中除去水分子和Ca离子分子，进行使VH、VL、CH1、CL的各结构域运动的刚体精修。相对于
Figure BDA0002222475850002292
的反射数据的晶体学可信度因子R值为30.3％、自由R值为31.7％。进而，通过使用程序Refmac5(CCP4Software Suite)的结构精修、和参照以使用实验性确定的结构因子Fo和由模型计算得到的结构因子Fc和相位计算得到的2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图的同时重复模型修正而在程序Coot(Paul Emsley)上进行，由此进行模型精修。最后，基于以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将水分子整合至模型中，由此使用程序Refmac5(CCP4 Software Suite)进行精修。通过使用分辨率的18357个反射数据，最终相对于3351个原子的模型的晶体学可信度因子R值为20.9％、自由R值为27.7％。
(14-10)6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在或不存在下的结晶的X射线衍射数据的比 较
对6RL#9抗体的Fab片段在Ca存在下的结晶和Ca不存在下的结晶的结构进行比较时，在重链CDR3观察到大的变化。通过X射线晶体结构分析确定的6RL#9抗体的Fab片段的重链CDR3的结构示于图18。具体地，在Ca存在下的6RL#9抗体的Fab片段的结晶中，重链CDR3环部分的中心部分存在有钙离子。认为钙离子与重链CDR3的95位、96位和100a位(Kabat编号)相互作用。认为在Ca存在下，对于与抗原结合重要的重链CDR3环通过与钙结合而稳定，成为最适于与抗原结合的结构。钙与抗体的重链CDR3结合的实例迄今尚未有报告，钙与抗体的重链CDR3结合的结构是新结构。
由6RL#9抗体的Fab片段的结构表明的存在于重链CDR3中的钙结合模体也能够成为参考实施例7所述那样的Ca文库设计的新要素。即，参考实施例7中是在轻链可变区中导入钙结合模体，但是，例如，可考虑含有6RL#9抗体的重链CDR3、且在包括轻链的其它CDR中含有柔性残基的文库。
(参考实施例15)使用噬菌体展示技术从人抗体文库获得Ca依赖性地与IL-6结合的抗体
(15-1)天然人抗体噬菌体展示文库的制作
将由人PBMC制作的多腺苷酸化RNA或市售的人多腺苷酸化RNA等作为模板，按照本领域技术人员公知的方法，构建由展示相互不同的人抗体序列的Fab结构域的多个噬菌体构成的人抗体噬菌体展示文库。
(15-2)通过珠淘选从文库获得Ca依赖性地与抗原结合的抗体片段
从构建的天然人抗体噬菌体展示文库的最初的挑选如下实施：仅浓缩对抗原(IL-6)具有结合能力的抗体片段。抗原使用生物素标记的IL-6。
由携带有构建的噬菌体展示用噬菌粒的大肠杆菌进行噬菌体产生。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5MNaCl/10％PEG，并将由此沉淀的噬菌体群用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。接着，向噬菌体文库液中添加BSA和CaCl2以使终浓度为4％BSA和1.2mM钙离子浓度。作为淘选方法，参考了作为常规方法的使用固定于磁珠的抗原的淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2)，2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2)，191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2)，61-9)。作为磁珠，使用NeutrAvidin包被珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-包被的)或Streptavidin包被珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。
具体地，制备的噬菌体文库液中加入250pmol的生物素标记抗原，由此使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温下结合15分钟。将珠用1.2mM CaCl2/TBST(含有1.2mM CaCl2的TBST)洗涤3次后，进一步用1mL的1.2mM CaCl2/TBS(含有1.2mM CaCl2的TBS)洗涤2次。然后，加入有0.5mL的1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温下悬浮15分钟后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。回收的噬菌体溶液添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此制备噬菌体文库液。
第2次以后的淘选中，以Ca依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。具体地，在制备的噬菌体文库液中加入40pmol的生物素标记抗原，由此使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。加入用BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。将珠用1mL的1.2mM CaCl2/TBST与1.2mM CaCl2/TBS洗涤。然后将加入有0.1mL的2mM EDTA/TBS的珠在室温悬浮后，立即使用磁力架将珠分离，回收噬菌体溶液。回收的噬菌体溶液中加入100mg/mL胰蛋白酶5μL，由此将未展示Fab的噬菌体的pIII蛋白(来源于辅助噬菌体的pIII蛋白)切断，未展示Fab的噬菌体丧失对大肠杆菌的感染能力。将从经胰蛋白酶处理的噬菌体溶液回收的噬菌体添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌菌株TG1中。在37℃缓慢地进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm×225mm的板上。接着，从接种的大肠杆菌的培养液中回收噬菌体，由此回收噬菌体文库液。以Ca依赖性结合能力为指标的淘选重复3次。
(15-3)基于噬菌体ELISA的评价
从通过由上述的方法得到的大肠杆菌的单克隆，按照常规方法(MethodsMol.Biol.(2002)178，133-145)，回收含有噬菌体的培养上清。
以终浓度4％BSA和1.2mM钙离子浓度的方式加入有BSA和CaCl2的含有噬菌体的培养上清通过以下步骤进行ELISA。将StreptaWell 96微量滴定板(Roche)用含有生物素标记抗原的100μL的PBS包被一晚。将该板的各孔用PBST洗涤从而除去抗原后，将该孔用250μL的4％BSA-TBS进行1小时以上的封闭。在除去了4％BSA-TBS的各孔中，加入制备的培养上清，将该板在37℃静置1小时，由此使噬菌体展示的抗体与各孔中存在的抗原结合。在用1.2mMCaCl2/TBST进行了洗涤的各孔中，加入1.2mM CaCl2/TBS或1mM EDTA/TBS，将该板在37℃静置30分钟，进行孵育。在用1.2mM CaCl2/TBST进行洗涤后，将通过终浓度为4％BSA和1.2mM离子化钙浓度的TBS进行了稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)添加至各孔中，将板孵育1小时。用1.2mM CaCl2/TBST洗涤后，添加TMB single溶液(ZYMED)，各孔中的溶液的显色反应通过添加硫酸而停止后，通过450nm的吸光度测定该显色。
使用分离的96个克隆进行噬菌体ELISA，由此得到对IL-6具有Ca依赖性结合能力的6KC4-1#85抗体。作为上述噬菌体ELISA的结果，将被判断具有Ca依赖性抗原结合能力的抗体片段作为模板，利用特异性引物进行扩增，并对所扩增的基因的碱基序列进行分析。6KC4-1#85抗体的重链可变区的序列记载于SEQ ID NO：10，轻链可变区的序列记载于SEQID NO：104。编码6KC4-1#85抗体的重链可变区(SEQ ID NO：10)的多核苷酸通过PCR法，与编码来源于IgG1的序列的多核苷酸连接，将连接得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中，构建表达SEQ ID NO：105所示重链的载体。通过PCR法将编码6KC4-1#85抗体的轻链可变区(SEQ ID NO：104)的多核苷酸与编码天然型K链的恒定区(SEQ ID NO：44)的多核苷酸连接，将由此得到的DNA片段整合至动物细胞表达用载体中。制作的改变体的序列通过本领域技术人员公知的方法确认。
(15-4)抗体的表达和纯化
将噬菌体ELISA的结果判断为对抗原具有Ca依赖性结合能力的克隆6KC4-1#85导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达使用以下的方法进行。将来源于人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F细胞株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293Expression Medium培养基(Invitrogen)中，以1.33×106细胞/mL的细胞密度向6孔板的各孔中各接种3mL。将制备的质粒通过脂质体转染法导入细胞。在CO2培养箱(37度、8％CO2、90rpm)中进行4天培养。使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)，用本领域技术人员公知的方法从上述中所得培养上清中纯化抗体。使用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。通过PACE法算出吸光系数，使用该吸光系数由所得测定值计算抗体浓度(ProteinScience(1995)4，2411-2423)。
(参考实施例16)6KC4-1#85抗体的钙离子结合评价
评价从人抗体文库获得的钙依赖性抗原结合抗体6KC4-1#85抗体是否与钙结合。在离子化钙浓度不同的条件下，测定的Tm值是否发生变化通过参考实施例2中所述的方法来评价。
6KC4-1#85抗体的Fab结构域的Tm值示于表25。如表25所示，6KC4-1#85抗体的Fab结构域的Tm值随钙离子浓度而变化，因而可知6KC4-1#85抗体与钙结合。
[表25]
(参考实施例17)6KC4-1#85抗体的钙离子结合位点的鉴定
如参考实施例16所示，6KC4-1#85抗体显示与钙离子结合，但6KC4-1#85不具有由hVk5-2序列的研究所明确的钙结合模体。因此，为了确认钙离子是与6KC4-1#85抗体的重链结合、与其轻链结合抑或是与两者结合，评价了钙离子对于分别与不结合钙离子的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体(重链序列GC_H(SEQ ID NO：106)、轻链序列GC_L(SEQ ID NO：107))的重链和轻链进行了交换的修饰抗体的结合。根据参考实施例2所示的方法测定的修饰抗体的Tm值示于表26。结果，具有6KC4-1#85抗体的重链的修饰抗体的Tm值随钙离子浓度而变化，认为通过6KC4-1#85抗体的重链与钙结合。
[表26]
Figure BDA0002222475850002351
因此，为了进一步鉴定钙离子是与6KC4-1#85抗体的重链的哪个残基进行结合，将存在于6KC4-1#85抗体的CDR中的Asp(D)残基置换为无法参与钙离子的结合或螯合的Ala(A)残基，制得改变重链(6_H1-11(SEQ ID NO：108)、6_H1-12(SEQ ID NO：109)、6_H1-13(SEQ ID NO：110)、6_H1-14(SEQ ID NO：111)、6_H1-15(SEQ ID NO：112))和改变轻链(6_L1-5(SEQ ID NO：113)和6_L1-6(SEQ ID NO：114))。从导入了含有改变抗体基因的表达载体的动物细胞的培养液中，按照参考实施例15所述的方法纯化改变抗体。纯化的改变抗体的钙结合按照参考实施例2所述的方法进行测定。测定结果示于表27。如表27所示，通过将6KC4-1#85抗体的重链CDR3的95位或101位(Kabat编号)置换为Ala残基，6KC4-1#85抗体丧失钙结合能力，因而认为该残基对于和钙结合是重要的。由6KC4-1#85抗体的改变抗体的钙结合性所表明的6KC4-1#85抗体的重链CDR3的环根部附近存在的钙结合模体也可以成为参考实施例7中所述Ca文库的设计中的新要素。即，参考实施例7中是在轻链可变区中导入有钙结合模体，但是，例如，可考虑含有6KC4-1#85抗体的重链CDR3、且在包括轻链的其它CDR中含有柔性残基的文库。
[表27]
Figure BDA0002222475850002361
(参考实施例18)使用正常小鼠评价Ca依赖性结合抗体对抗原的血浆中滞留性的影响
(18-1)使用正常小鼠的体内试验
对于正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)，单独给予hsIL-6R(可溶型人IL-6受体：参考实施例21中制作)或同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体，然后评价hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的体内动力学。将hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或者hsIL-6R与抗人IL-6受体抗体的混合溶液在尾静脉以10mL/kg单次给予。作为抗人IL-6受体抗体，使用前述的H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1。
混合溶液中的hsIL-6R浓度均为5μg/mL，但抗人IL-6受体抗体浓度根据每个抗体而不同，H54/L28-IgG1为0.1mg/mL，6RL#9-IgG1和FH4-IgG1为10mg/mL，此时，相对于hsIL-6R，由于抗人IL-6受体抗体充分量过量地存在，因而认为hsIL-6R大部分与抗体结合。在给予后15分、7小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天时进行采血。将采集的血液立即在4℃、12000rpm下离心15分钟，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冰箱中。
(18-2)通过ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度
小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度通过ELISA法测定。首先，将抗人IgG(γ-链特异性)F(ab′)2Fragment 0f Antibody(SIGMA)分配于Nunc-Immuno Plate，MaxiSoup(Nalge nunc International)，在4℃静置1晚，由此制作抗人IgG固定化板。将血浆中浓度为0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01μg/mL的校准曲线试样和经100倍以上稀释的小鼠血浆测定试样各自分配于抗人IgG固定化板中，将该板在25℃孵育1小时。然后，与生物素化抗人IL-6R抗体(R&D)在25℃反应1小时后，与Streptavidin-PolyHRP80(StereospecificDetection Technologies)在25℃反应0.5小时。使用TMB One Component HRP MicrowellSubstrate(BioFX Laboratories)作为底物，进行显色反应。通过1N-硫酸(ShowaChemical)将显色反应终止后，使用酶标仪测定显色液在450nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，以校准曲线的吸光度为基准，算出小鼠血浆中浓度。通过该方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的H54/L28-IgG1、6RL#9-IgG1、FH4-IgG1的血浆中抗体浓度的变化示于图19。
(18-3)通过电化学发光法测定血浆中的hsIL-6R浓度
小鼠的血浆中hsIL-6R浓度通过电化学发光法测定。将调整为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/mL的hsIL-6R校准曲线试样和经50倍以上稀释的小鼠血浆测定试样、与用SULFO-TAGNHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)和Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody(R&D)以及托珠单抗(重链SEQ ID NO：96、轻链SEQ ID NO：97)溶液的混合液在4℃下反应1晚。为了使样品中的游离Ca浓度降低，使样品中基本全部的hsIL-6R从6RL#9-IgG1或FH4-IgG1解离，并成为与添加的托珠单抗结合的状态，此时的测定缓冲液中含有10mM EDTA。然后，将该反应液分配于MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)中。进而将在25℃反应1小时的板的各孔洗涤后，在各孔中分配Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)。立即使用SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)对反应液进行测定。hsIL-6R浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的反应算出。通过前述方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的血浆中hsIL-6R的浓度变化示于图20。
结果，hsIL-6R单独给予显示出非常快的消除，与之相对，同时给予没有与hsIL-6R的Ca依赖性结合的普通抗体H54/L28-IgG1时，hsIL-6R的消除大幅变慢。与之相对，同时给予具有与hsIL-6R的100倍以上的Ca依赖性结合的6RL#9-IgG1或FH4-IgG1时，hsIL-6R的消除大幅加速。与同时给予H54/L28-IgG1时相比，同时给予6RL#9-IgG1和FH4-IgG1的情形中，一天后的血浆中的hsIL-6R浓度分别降低39倍和2倍。由此确认，钙依赖性结合抗体可以加速抗原从血浆中的消除。
(参考实施例19)Ca依赖性抗原结合抗体的抗原消除加速效果的提高研究(抗体制作)
(19-1)关于IgG抗体对FcRn的结合
IgG抗体通过与FcRn结合而具有长的血浆中滞留性。IgG和FcRn的结合仅在酸性条件下(pH6.0)被观察到，而在中性条件下(pH 7.4)基本观察不到该结合。IgG抗体被非特异性地摄入细胞，但通过在内体内的酸性条件下与内体内的FcRn结合而返回到细胞表面上，在血浆中的中性条件下从FcRn解离。向IgG的Fc区导入突变而丧失在酸性条件下与FcRn的结合时，变得无法从内体内再循环至血浆中，因而抗体的血浆中滞留性显著受损。
作为改善IgG抗体的血浆中滞留性的方法，报告有提高酸性条件下对FcRn的结合的方法。通过向IgG抗体的Fc区导入氨基酸置换来使酸性条件下的FcRn结合提高，IgG抗体从内体内再循环至血浆中的效率上升。结果IgG抗体的血浆中滞留性改善。认为导入氨基酸置换时重要的是不能提高中性条件下的对FcRn的结合。中性条件下与FcRn结合的IgG抗体即使可在内体内的酸性条件下通过与FcRn结合而返回至细胞表面上，在中性条件下的血浆中，IgG抗体也不会从FcRn解离而不会被再循环至血浆中，因此认为反而会损害IgG抗体的血浆中滞留性。
例如，如Dall′Acqua等(J.Immunol.(2002)169(9)，5171-5180)中所记载，据报告通过导入给予小鼠的氨基酸置换，在中性条件下(pH7.4)确认到对小鼠FcRn的结合的IgG1抗体的血浆中滞留性变差。此外，如Yeung等(J.Immunol.(2009)182(12)，7663-7671)、Datta-Mannan等(J.Biol.Chem.(2007)282(3)，1709-1717)、Dall′Acqua等(J.Immunol.(2002)169(9)，5171-5180)中所记载，通过导入氨基酸置换而使酸性条件下(pH6.0)的人FcRn结合提高的IgG1抗体改变体同时还观察到中性条件下(pH 7.4)对人FcRn的结合。据报告，给予食蟹猴的该抗体的血浆中滞留性未改善，未观察到血浆中滞留性的变化。因此，在提高抗体功能的抗体工程技术中，人们专注于通过在不使中性条件下(pH 7.4)的人FcRn结合增加的情形下使酸性条件下的人FcRn结合增加，来改善抗体的血浆中滞留性。即，通过向其Fc区导入氨基酸置换而增加了中性条件下(pH 7.4)的人FcRn结合的IgG1抗体的优点迄今为止尚无报告。
Ca依赖性地与抗原结合的抗体会加速可溶型抗原的消除，一个抗体分子具有多次反复与可溶型抗原结合的效果，因而极其有用。作为进一步提高该抗原消除加速效果的方法，验证了增强中性条件下(pH7.4)的FcRn结合的方法。
(19-2)具有中性条件下的FcRn结合活性的Ca依赖性人IL-6受体结合抗体的制备
通过向具有钙依赖性抗原结合能力的FH4-IgG1、6RL#9-IgG1、以及用作对照的不具有钙依赖性抗原结合能力的H54/L28-IgG1的Fc区导入氨基酸突变，制作具有中性条件下(pH 7.4)的FcRn结合的改变体。氨基酸突变的导入通过使用PCR的本领域技术人员公知的方法来进行。具体地，制作相对于IgG1的重链恒定区将以EU编号表示的434位氨基酸Asn置换为Trp的FH4-N434W(重链SEQ ID NO：115、轻链SEQ ID NO：101)、6RL#9-N434W(重链SEQID NO：116、轻链SEQ ID NO：99)和H54/L28-N434W(重链SEQ ID NO：117、轻链SEQ ID NO：39)。使用QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)，利用所附说明书记载的方法，制作***有编码该氨基酸经置换的变体的多核苷酸的动物细胞表达载体。抗体的表达、纯化、浓度测定按照参考实施例11中记载的方法来实施。
(参考实施例20)使用正常小鼠评价Ca依赖性结合抗体的消除加速效果
(20-1)使用正常小鼠的体内试验
对向正常小鼠(C57BL/6J小鼠、Charles River Japan)单独给予hsIL-6R(可溶型人IL-6R：参考实施例20中制作)、或同时给予hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体后的hsIL-6R和抗人IL-6受体抗体的体内动力学进行评价。将hsIL-6R溶液(5μg/mL)、或者hsIL-6R与抗人IL-6受体抗体的混合溶液在尾静脉以10mL/kg单次给予。作为抗人IL-6受体抗体，使用了上述H54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W。
混合溶液中的hsIL-6R浓度均为5μg/mL，抗人IL-6受体抗体的浓度根据每个抗体而不同，H54/L28-N434W制备为0.042mg/mL，6RL#9-N434W制备为0.55mg/mL，FH4-N434W制备为1mg/mL。此时，相对于hsIL-6R，由于抗人IL-6受体抗体充分量过量地存在，因而认为hsIL-6R的大部分与抗体结合。在给予后15分、7小时、1天、2天、4天、7天、14天、21天、28天时进行采血。将采集的血液立即在4℃、12000rpm下离心15分钟，由此得到血浆。分离的血浆直至实施测定为止，保存在设定为-20℃以下的冷藏库中。
(20-2)通过ELISA法测定正常小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体的浓度
小鼠血浆中的抗人IL-6受体抗体浓度通过与参考实施例18同样的ELISA法来测定。通过该方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的H54/L28-N434W、6RL#9-N434W、FH4-N434W抗体的血浆中抗体浓度的变化示于图21。
(20-3)通过电化学发光法测定血浆中hsIL-6R浓度
小鼠的血浆中hsIL-6R浓度用电化学发光法测定。将配制为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/mL的hsIL-6R校准曲线试样和经50倍以上稀释的小鼠血浆测定试样、与用SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)进行了钌标记的Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D)和Biotinylated Anti-human IL-6R Antibody(R&D)的混合液在4℃下反应1晚。为了使样品中的游离Ca浓度降低，使样品中基本全部的hsIL-6R从6RL#9-N434W或FH4-N434W解离，并成为以游离体存在的状态，此时的测定缓冲液含有10mMEDTA。然后，将该反应液分配于MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)中。进而将在25℃反应1小时的板的各孔洗涤后，在各孔中分配Read Buffer T(×4)(MesoScale Discovery)。立即使用SECTOR PR 400reader(Meso Scale Discovery)对反应液进行测定。hsIL-6R浓度是使用分析软件SOFTmax PRO(Molecular Devices)，根据校准曲线的反应算出。通过前述方法测定的静脉内给予后的正常小鼠中的血浆中hsIL-6R的浓度变化示于图22。
结果，在同时给予具有pH 7.4下的FcRn结合活性而不具有针对hsIL-6R的Ca依赖性结合活性的H54/L28-N434W抗体时，与单独给予hsIL-6R的情形相比，hsIL-6R的消除大幅变慢。与之相对，同时给予对hsIL-6R具有100倍以上的Ca依赖性结合、且具有pH 7.4下的FcRn结合的6RL#9-N434W抗体或FH4-N434W抗体时，与单独给予hsIL-6R的情形相比，hsIL-6R的消除加速。与单独给予hsIL-6R的情形相比，同时给予6RL#9-N434W抗体或FH4-N434W抗体时，给予后一天的血浆中hsIL-6R浓度分别降低3倍和8倍。结果确认到，通过对钙依赖性地与抗原结合的抗体赋予pH 7.4下的FcRn结合活性，可以进一步加速抗原从血浆中的消除。
与对hsIL-6R不具有Ca依赖性结合的H54/L28-IgG1抗体相比，对hsIL-6R具有100倍以上的Ca依赖性结合活性的6RL#9-IgG1抗体或FH4-IgG1抗体被确认到使hsIL-6R的消除增大的效果。对hsIL-6R具有100倍以上的Ca依赖性结合、且具有pH 7.4下的FcRn结合的6RL#9-N434W抗体或FH4-N434W抗体被确认到与单独给予hsIL-6R相比也加速hsIL-6R的消除。这些数据暗示，与pH依赖性地与抗原结合的抗体相同地，Ca依赖性地与抗原结合的抗体也在内体内将抗原解离。
(参考实施例21)制备可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)
作为抗原的人IL-6受体的重组人IL-6受体如以下制备。Mullberg等(J.Immunol.(1994)152，4958-4968)中报告的包含N末端侧第1位至第357位氨基酸序列的可溶型人IL-6受体(以下称为hsIL-6R)的CHO稳定表达株通过本领域技术人员公知的方法构建。通过培养该表达株，表达hsIL-6R。通过Blue Sepharose 6FF柱层析、凝胶过滤柱层析从所得到的培养上清纯化hsIL-6R。在最终步骤中，将作为主峰洗脱的流分用作最终纯化品。
(参考实施例22)pH依赖性结合抗体文库的设计
(22-1)pH依赖性结合抗体的获得方法
WO2009/125825中，通过向抗原结合分子导入组氨酸，公开了性质在pH中性区域和pH酸性区域变化的pH依赖性抗原结合抗体。公开的pH依赖性结合抗体通过将所期望的抗原结合分子的氨基酸序列的一部分置换为组氨酸的改变来获得。为了不用预先获得欲改变的对象抗原结合分子而更有效地获得pH依赖性结合抗体，考虑从将组氨酸导入可变区(更优选为可能参与抗原结合的位置)的抗原结合分子群(称为His文库)中获得与所期望的抗原结合的抗原结合分子的方法。从His文库得到的抗原结合分子与从普通抗体文库得到的相比，组氨酸高频率地出现，因而认为可有效地获得具有所期望性质的抗原结合分子。
(22-2)以能够有效地获得pH依赖性地与抗原结合的结合抗体的方式设计将组氨 酸残基导入可变区的抗体分子群(His文库)
首先，在His文库中选择导入组氨酸的位置。WO2009/125825中公开了，通过将IL-6受体抗体、IL-6抗体和IL-31受体抗体的序列中的氨基酸残基置换为组氨酸，来制作pH依赖性抗原结合抗体。进而，通过将抗原结合分子的氨基酸序列置换为组氨酸，制作了具有pH依赖性抗原结合能力的、抗蛋白溶菌酶抗体(FEBS Letter 11483，309，1，85-88)和抗铁调素抗体(WO2009/139822)。在IL-6受体抗体、IL-6抗体、IL-31受体抗体、蛋白溶菌酶抗体和铁调素抗体中导入组氨酸的位置示于表28。表28所示的位置可被列举为能够控制抗原和抗体的结合的候补位置。进而，除了表28中所示的位置以外，认为与抗原接触的可能性高的位置也适合作为导入组氨酸的位置。
[表28]
Figure BDA0002222475850002431
在由重链可变区和轻链可变区构成的His文库中，重链可变区使用人抗体序列，轻链可变区中导入有组氨酸。作为在His文库中导入组氨酸的位置，选择上述列举的位置以及可能参与抗原结合的位置、即轻链的30位、32位、50位、53位、91位、92位和93位(Kabat编号，Kabat EA et al.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)。另外，作为导入组氨酸的轻链可变区的模板序列，选择Vk1序列。使多个氨基酸在模板序列中出现，以提高构成文库的抗原结合分子的多样性。对于使多个氨基酸出现的位置，选择与抗原相互作用的可能性高的露出于可变区的表面的位置。具体地，选择轻链的30位、31位、32位、34位、50位、53位、91位、92位、93位、94位和96位(Kabat编号，Kabat EA etal.1991.Sequence of Proteins of Immunological Interest.NIH)来作为这种柔性残基。
接着，设定出现的氨基酸残基的种类及其出现频率。对登录于Kabat数据库(KABAT，E.A.ET AL.：′Sequences of proteins of immunological interest′，vol.91，1991，NIH PUBLICATION)的hVk1和hVk3的序列中的柔性残基的氨基酸的出现频率进行分析。基于分析结果，从在各位置出现频率高的氨基酸中选择可在His文库出现的氨基酸的种类。此时，为了避免氨基酸的性质失之偏颇，也选择在分析结果中判定为出现频率低的氨基酸。此外，选择的氨基酸的出现频率参考Kabat数据库的分析结果进行设定。
通过考虑如上所述设定的氨基酸和出现频率，作为His文库，设计了以各CDR中必须包含1个组氨酸的方式固定的His文库1与较His文库1更重视序列多样性的His文库2。His文库1和His文库2的详细设计示于表3和表4(各表中的位置表示Kabat编号)。此外，对于表3和表4中记载的氨基酸的出现频率，在以Kabat编号表示的92位为Asn(N)时，94位可以排除Ser(S)。
(参考实施例23)制作用于获得pH依赖性地与抗原结合的抗体的人抗体噬菌体展示文库(His文库1)
以由人PBMC制得的多腺苷酸化RNA或市售的人多腺苷酸化RNA等作为模板，通过PCR法扩增抗体重链可变区的基因文库。设计为参考实施例22中记载的His文库1的抗体轻链可变区的基因文库使用PCR法进行扩增。将如此制作的抗体重链可变区的基因文库和抗体轻链可变区的基因文库的组合***噬菌粒载体，构建展示由人抗体序列构成的Fab结构域的人抗体噬菌体展示文库。作为构建方法，参考了(Methods Mol Biol.(2002)178，87-100)。在构建上述文库时，使用了连接噬菌粒的Fab和噬菌体pIII蛋白的接头部分、以及在辅助噬菌体pIII蛋白基因的N2结构域和CT结构域之间***有胰蛋白酶切断序列的噬菌体展示文库的序列。对从导入有抗体基因文库的大肠杆菌分离的抗体基因部分的序列进行确认，得到132个克隆的序列信息。设计的氨基酸分布和确认的序列中氨基酸的分布示于图23。构建了包含与设计的氨基酸分布对应的多种序列的文库。
(参考实施例24)pH依赖性地与IL-6R结合的抗体的获得
(24-1)通过珠淘选从文库获得pH依赖性地与抗原结合的抗体片段
自构建的His文库1的最初选择通过仅浓缩具有抗原(IL-6R)结合能力的抗体片段来实施。
由携带有构建的噬菌体展示用噬菌粒的大肠杆菌进行噬菌体产生。通过向进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG沉淀噬菌体群，将该群用TBS稀释，从而得到噬菌体文库液。通过向噬菌体文库液中添加BSA和CaCl2，制备成终浓度4％BSA、1.2mM钙离子。作为淘选方法，参照作为通用方法的利用固定在磁珠上的抗原的淘选方法(J.Immunol.Methods.(2008)332(1-2)，2-9、J.Immunol.Methods.(2001)247(1-2)，191-203、Biotechnol.Prog.(2002)18(2)212-20、Mol.Cell Proteomics(2003)2(2)，61-9)。作为磁珠，使用NeutrAvidin包被珠(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-包被的)或Streptavidin包被珠(Dynabeads M-280Streptavidin)。
具体而言，通过向制备的噬菌体文库液中加入250pmol生物素标记抗原，使该噬菌体文库液在室温与抗原接触60分钟。加入BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。用1mL 1.2mM CaCl2/TBST(含有1.2mM CaCl2、0.1％Tween20的TBS)洗涤珠3次后，用1mL 1.2mM CaCl2/TBS(pH7.6)再洗涤2次。然后，将添加了0.5mL 1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温悬浮15分钟后，立刻用磁力架分离珠，回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体溶液添加到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌ER2738株中。通过在37℃缓慢进行1小时上述大肠杆菌的搅拌培养，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x225mm板。接着，通过从接种的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，制备噬菌体文库液。
在第2次以后的淘选中，以抗原结合能力或pH依赖性结合能力为指标进行噬菌体的浓缩。具体而言，通过向制备的噬菌体文库液中加入40pmol生物素标记抗原，使噬菌体文库在室温与抗原接触60分钟。添加BSA封闭的磁珠，使抗原和噬菌体的复合体与磁珠在室温结合15分钟。用1mL 1.2mM CaCl2/TBST和1.2mM CaCl2/TBS洗涤珠多次。此后，以抗原结合能力为指标进行浓缩时，将添加了0.5mL1mg/mL胰蛋白酶的珠在室温悬浮15分钟后，立刻用磁力架分离珠，回收噬菌体溶液。以pH依赖性抗原结合能力为指标进行浓缩时，将添加了0.1mL 50mM MES/1.2mM CaCl2/150mM NaCl(pH5.5)的珠在室温悬浮后，立刻用磁力架分离珠，向回收的噬菌体溶液中加入5μL 100mg/mL胰蛋白酶，从而切割不展示Fab的噬菌体的pIII蛋白(辅助噬菌体来源的pIII蛋白)，使不展示Fab的噬菌体丧失感染大肠杆菌的能力。将回收的噬菌体添加到对数生长期(OD600为0.4-0.7)的10mL大肠杆菌ER2738株中。通过在37℃缓慢进行1小时上述大肠杆菌的搅拌培养，使噬菌体感染大肠杆菌。将感染的大肠杆菌接种于225mm x225mm板。接着，通过从接种的大肠杆菌的培养液回收噬菌体，回收噬菌体文库液。以抗原结合能力或pH依赖性结合能力为指标的淘选重复2次。
(24-2)通过噬菌体ELISA进行评价
按照常规方法(Methods Mol.Biol.(2002)178，133-145)，从由上述方法得到的大肠杆菌的单菌落回收含有噬菌体的培养上清。
添加有终浓度4％BSA和钙离子浓度1.2mM的BSA和CaCl2的含有噬菌体的培养上清按照以下顺序进行ELISA。用含有生物素标记抗原的100μL PBS包被StreptaWell 96微量滴定板(Roche)一晚。通过用PBST(含有0.1％Tween20的PBS)洗涤该板的各孔除去抗原后，用250μL4％BSA-TBS封闭该孔1小时以上。通过将向除去了4％BSA-TBS的各孔中加入了制备的培养上清的该板在37℃静置1小时，使噬菌体展示的抗体与各孔中存在的抗原结合。向用1.2mM CaCl2/TBST洗涤的各孔中加入1.2mM CaCl2/TBS(pH7.6)或1.2mM CaCl2/TBS(pH5.5)，将该板在37℃静置孵育30分钟。用1.2mM CaCl2/TBST洗涤后，将用制成4％BSA和离子化钙浓度1.2mM的TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(Amersham Pharmacia Biotech)添加到各孔中的板孵育1小时。用1.2mM CaCl2/TBST洗涤后，添加了TMB single溶液(ZYMED)的各孔中溶液的显色反应在通过添加硫酸而停止后，通过450nm的吸光度测定该显色。
以抗原结合能力为指标进行浓缩时，对于实施了2次淘选的克隆，在实施噬菌体ELISA时，抗原特异性地ELISA阳性的为96个克隆中的17个克隆，所以分析实施了3次淘选的克隆。另一方面，以pH依赖性抗原结合能力为指标进行浓缩时，对于实施了2次淘选的克隆，在实施噬菌体ELISA时，ELISA阳性的为94个克隆中的70个克隆，所以分析实施了2次淘选的克隆。
对于实施了上述噬菌体ELISA的克隆，分析利用特异性引物扩增的基因的碱基序列。
噬菌体ELISA和序列分析的结果示于以下的表29。
[表29]
文库 His文库-1 His文库-1
浓缩指标 抗原结合能力 pH依赖性抗原结合能力
淘选次数 3 2
试验的克隆数 80 94
ELISA阳性 76 70
ELISA阳性克隆序列种类 30 67
pH依赖性结合克隆序列种类 22 47
。
通过同样的方法，从天然人抗体噬菌体展示文库获得具有pH依赖性抗原结合能力的抗体。以抗原结合能力为指标进行浓缩时，88个克隆的评价中获得13种的pH依赖性结合抗体。此外，以pH依赖性抗原结合能力为指标进行浓缩时，83个克隆评价中获得27种pH依赖性结合抗体。
由以上结果确认，与天然人抗体噬菌体展示文库相比，由His文库1得到的具有pH依赖性抗原结合能力的克隆的变种多。
(24-3)抗体的表达和纯化
噬菌体ELISA的结果，将判断为存在pH依赖性抗原结合能力的克隆导入动物细胞表达用质粒中。抗体的表达利用以下方法进行。将人胎儿肾细胞来源的FreeStyle 293-F株(Invitrogen)悬浮于FreeStyle 293 Expression Medium培养基(Invitrogen)，以1.33x106细胞/mL的细胞密度接种6孔板，每孔3mL。制备的质粒通过脂质转染法导入细胞中。在CO2培养箱(37度、8％CO2、90rpm)中进行4天培养。利用rProtein A SepharoseTM FastFlow(Amersham Biosciences)，使用本领域技术人员公知的方法，由通过上述得到的培养上清纯化抗体。利用分光光度计测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。通过利用由PACE法计算的吸光系数，由得到的测定值计算抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
(24-4)获得的抗体对人IL-6受体的pH依赖性结合能力的评价
为了判断(24-3)中获得的抗体6RpH#01(重链SEQ ID NO：118、轻链SEQ ID NO：119)、6RpH#02(重链SEQ ID NO：120)、轻链SEQ ID NO：121)和6RpH#03(重链SEQ ID NO：122)、轻链SEQ ID NO：123)的人IL-6受体结合活性是否是pH依赖性的，利用Biacore T100(GE Healthcare)分析这些抗体与人IL-6受体的相互作用。作为不具有对人IL-6受体的pH依赖性结合活性的对照抗体，使用托珠单抗(重链SEQ ID NO：60、轻链SEQ ID NO：61)。作为中性范围pH和酸性范围pH条件，分别在pH 7.4和pH 6.0的溶液中分析抗原抗体反应的相互作用。在通过胺偶联法固定有适量蛋白A/G(Invitrogen)的Sensor chip CM5(GEHealthcare)上，分别捕获300RU左右的目标抗体。运行缓冲液使用2种缓冲液：20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、1.2mM CaCl2(pH 7.4)或20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、1.2mM CaCl2(pH6.0)。人IL-6受体的稀释也使用各自的缓冲液。测定全部在37℃实施。
在使用作为对照抗体的托珠单抗抗体、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体进行抗原抗体反应的相互作用分析时，通过以5μL/分的流速注射IL-6受体的稀释液和作为空白的运行缓冲液3分钟，使IL-6受体与传感器芯片上捕获的托珠单抗抗体、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体相互作用。然后，通过以30μL/分的流速注射10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)30秒，使传感器芯片再生。
通过前述方法测定的pH 7.4时的传感图示于图24。此外，通过同样的方法获得的pH 6.0条件下的传感图示于图25。
由前述结果观察到，对于6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体，通过将缓冲液中的pH由pH 7.4设为pH 6.0，IL6受体结合能力大幅降低。
(参考实施例25)人IL-6受体敲入小鼠的制作
(25-1)敲入载体的构建
使用克隆有小鼠白介素-6基因(Il6ra)的基因组区的大肠杆菌人工染色体(BAC)克隆。在该BAC上的小鼠Il6ra基因的靶区中，利用Red/ET***(GeneBridges)，通过同源重组***以人白介素-6受体基因的编码序列(GeneBank#NM_000565_)、hp7序列、加多腺苷酸信号、loxP序列、新霉素耐性(neo)基因盒和loxP的顺序连接的DNA片段。此时，以使BAC上的小鼠Il6ra基因的外显子1上存在的翻译起始位点和人IL6R基因的翻译起始位点一致的方式***，且小鼠Il6ra基因外显子1内部的翻译起始位点以后的碱基序列缺失仅40个碱基对。此外，耐药性基因neo附加有pgk基因的启动子，在ES细胞内表达neo基因。然而，预测neo基因抑制在上游导入的hIL6R基因表达的可能性。于是，之后以能够除去neo基因的方式在neo基因的两侧配置loxP序列(ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGT TAT(SEQ ID NO：131))。通过使Cre作用和重组，形成除去loxP序列之间***的neo基因的结构。接下来，为了使敲入载体可线状化，将限制酶NotI识别序列(GCGGCCGC)与氨苄青霉素抗性基因一起***BAC上小鼠Il6ra基因的5′侧上游的区。
(25-2)向ES细胞的导入
通过电穿孔向ES细胞(129SvEv小鼠来源)中导入上述hIL6R敲入载体，通过G418进行选择培养后，通过PCR法从所得的耐药性克隆筛选同源重组体。用NotI使60μg敲入载体线性化，在苯酚/氯仿提取后，进行乙醇沉淀，溶解于PBS后使用。
将筛选中使用的ES细胞在96孔板中培养，每孔用200μl PBS溶液洗涤2次后，加入以下组成的细胞溶解缓冲液(5μl 10xLA缓冲液II(用于TAKARA LA Taq)、5μl 5％NP-40、4μl蛋白酶K(TAKARA)(20mg/ml)、36μl蒸馏水)，在55℃处理2小时，接着在95℃处理15分钟使蛋白酶K失活，作为PCR样品。
对于PCR反应混合物，将1μl样品、2.5μl的10xLA缓冲液II、2.5μl的25mM MgCl2、4μl的dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各包含2.5mM)、各0.2μl的引物(各50μM)、0.25μl的LA Taq(TAKARA)和14.35μl的蒸馏水混合，使总量为25μl。此外，PCR条件设为：94℃预加热5分钟，35个循环的98℃10秒、68℃3分30秒的扩增循环，以及68℃再加热7分钟的条件。
作为引物，使用P6Ra1(正向)5′-ACAGGGCCTTAGACTCACAGC-3′(SEQ ID NO：132)和hRLI6 11638R(反向)5′-AACTTGCTCCCGACACTACTGG-3′(SEQ ID NO：133)。对于引物，将P6Ral配置在敲入载体上的同源臂的5′上游侧的小鼠Il6ra基因组区中，将hRLI611638R配置在hIL6R cDNA内(参照图32)。在发生了同源重组的ES细胞的样品中，扩增了约2.2kb的条带。
(3)敲入小鼠的制作
通过胰蛋白酶处理使同源重组ES克隆悬浮，在ES细胞培养基中洗涤。通过以48小时间隔腹腔内给予5IU的马绒毛膜***(eCG)和人绒毛膜***(hCG)，使实施了超***处理的C57BL/6J(B6)雌性小鼠与同谱系的雄性小鼠交配。以确认了雌性小鼠的阴栓(plug)的那天作为0.5天，妊娠2.5天灌注子宫和输卵管，回收8细胞期至桑椹期的胚胎。将回收的胚胎在37℃培养一晚，将发育成胚泡的胚胎作为宿主胚胎注入10～15个ES细胞。将注入后的胚胎移植到假妊娠2.5天龄的ICR系受体雌性的子宫内，17天后得到后代。通过区别将ES细胞注入胚泡得到的后代的毛色，得到重组ES细胞(野生色)和宿主胚泡来源的细胞(黑色)混合存在的嵌合小鼠。雄性嵌合小鼠在性成熟后与B6雌性小鼠交配，以从下代小鼠的尾提取的基因组DNA为模板通过PCR法确认敲入等位基因向下代小鼠的遗传。PCR通过上述同源重组ES细胞的筛选时所利用的方法实施。结果，得到检测出2.2kb的信号的个体，确认这些个体中遗传了敲入等位基因。
(4)neo基因的除去
通过向经确认遗传了敲入等位基因的个体的繁殖所得到的受精卵的前核显微注入重组酶Cre表达载体，除去neo基因盒。即，通过使Cre瞬时表达，诱导敲入等位基因中配置的2处loxP之间的重组，除去neo基因盒。将显微注入Cre表达载体后的受精卵移植到假妊娠0.5天的ICR系受体雌性的输卵管内，在19天后得到后代。neo基因盒的除去，利用由后代断乳后采集的尾提取的基因组DNA通过PCR法确认。
对于PCR反应液组成，将1μl样品、12.5μl的2xGC缓冲液I、4μl的dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各含2.5mM)、各0.25μl引物(各50μM)、0.25μl的LA Taq(TAKARA)和6.75μl蒸馏水混合，使总量为25μl。此外，PCR条件设为：94℃预加热4分钟，35个循环的94℃30秒、62℃30秒、72℃3分钟的扩增循环，以及72℃再加热7分钟。
引物的设定位置示于图32B。作为引物，使用mRLI6 10355(5′-TCTGCAGTAGCCTTCAAAGAGC-3′(SEQ ID NO：134))和mRLI611166R(5′-AACCAGACAGTGTCACATTCC-3′(SEQ ID NO：135))。通过PCR反应，在除去neo盒前的个体的样品中，检测到作为敲入等位基因来源的扩增产物的4.2kb和野生型等位基因来源的0.8kb的信号，与此相比，在除去了neo盒的个体的样品中，检测到约2.7kb和野生型等位基因来源的0.8kb的信号(图33)。
(6)确认人IL6R和小鼠IL6ra的表达
(6-1)通过使用组织RNA的RT-PCR法确认
使用纯合子的敲入小鼠和野生型小鼠的组织RNA通过RT-PCR法分析人IL6R和小鼠IL6ra的表达。由肝、脾、胸腺、肾、心脏和肺制备组织RNA。以各1μg的组织RNA为模板，通过SuperScript II First Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)，使用Oligo dT(20)引物进行逆转录反应，从而合成cDNA。通过以合成的cDNA为模板进行PCR，检测人IL6R和小鼠IL6ra。对于人IL6R的检测，使用在位于作为敲入等位基因中hIL6R基因的***位置的翻译起始位点的上游侧的5′非翻译区设定的正向引物6RIK-s1(5′-CCCGGCTGCGGAGCCGCTCTGC-3′(SEQ ID NO：136))和人IL6R特异性反向引物RLI6-a1(5′-ACAGTGATGCTGGAGGTCCTT-3′(SEQ ID NO：137))的组合来实施。另一方面，对于小鼠IL6ra的检测，使用上述正向引物6RIK-s1和小鼠IL6ra特异性反向引物6RLIcA2(5′-AGCAACACCGTGAACTCCTTTG-3′(SEQ IDNO：138))的组合实施。对于PCR反应液组成，将12.5μl样品、12.5μl的2xGC缓冲液I、4μl的dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各含2.5mM)、各0.25μl的引物(各50μtM)、0.25μl的LA Taq(TAKARA)和6.75μl蒸馏水混合，使总量为25μl。此外，PCR条件设为：94℃预加热2分钟，30个循环的94℃30秒、62℃30秒、72℃1分钟的扩增循环，以及72℃再加热5分钟。人IL6R的扩增产物检测为880bp，小鼠IL6ra的扩增产物检测为846bp，在纯合子的hIL6R敲入小鼠的各组织中仅检测到人IL6R，未检测到小鼠IL6ra。此外，没有从野生型小鼠的各组织检测到人IL6R，仅检测到小鼠IL6ra(图34)。由该结果确认，正如所设计的，得到敲入载体发生同源重组、表达人IL6R而非小鼠IL6ra的小鼠。
(6-2)血浆中人IL-6R浓度的测定
在异氟烷吸入麻醉下剖腹，由腹部大静脉采集血液，使用Quantikin Human IL-6sR Immunoassay Kit (R&D Systems)测定由上述血液分离的血浆中的可溶型人IL-6R浓度。结果，血浆中可溶型hIL-6R浓度在同型敲入小鼠中定量为22.1±5.0ng/ml，在异型敲入小鼠中定量为11.5±4.1ng/ml。此外，在野生型小鼠的血浆中未检测到可溶型hIL-6R(图35)。同型敲入小鼠中的浓度与对人报告的血中浓度同等(Blood(2008)112，3959-3969)。
(6-3)种特异性配体反应性的确认
以4μg/kg体重对同型敲入小鼠和野生型小鼠腹腔内给予小鼠IL-6或人IL-6，6小时后采血，使用SAA ELISA Kit(Invitrogen)定量血中的血清淀粉样蛋白A(SAA)浓度。作为给予用的IL-6溶剂，使用向磷酸缓冲生理盐水(PBS)中添加小鼠血浆至0.5％而得的溶液，制备仅给予溶剂的对照组。结果，同型敲入小鼠可见仅与人IL-6反应而血浆SAA水平上升，但未见对小鼠IL-6的反应性(图36)。另一方面，野生型小鼠可见与人IL-6和小鼠IL-6反应而血浆SAA水平上升(图36)。已知，小鼠IL-6ra与小鼠IL-6和人IL-6结合，而人IL-6R与人IL-6结合却不与小鼠IL-6结合，本实验的结果与该认识一致。因此明确的是，同型敲入小鼠中，如所设计的，不表达小鼠IL6ra，而是表达人IL6R并起作用。
本发明的通过敲入等位基因转录的hIL6R基因的mRNA是不被剪接掉的结构，所以不会受到NMD机制的分解，但是，另一方面，已知不被剪接掉的基因的表达量变低。然而，本发明的hIL6R敲入小鼠中，血中的可溶型hIL-6R浓度与健康人的血中浓度同等，还确认了与给予的人IL-6充分反应而产生SAA。这显示，与加多腺苷酸信号一起***的hp7有助于由于是不被剪接掉的结构而原本应当降低的hIL6R表达量的稳定。
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Claims (47)

1.诱导针对抗原的免疫应答的药物组合物，其中，所述药物组合物包含含有抗原结合结构域和FcRn结合结构域的抗原结合分子作为有效成分，所述抗原结合结构域对所述抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，所述FcRn结合结构域在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性。
2.权利要求l的药物组合物，其中，所述离子浓度为钙离子浓度。
3.权利要求2的药物组合物，其中，所述抗原结合结构域为具有下述特征的抗原结合结构域：与低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性相比，高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高。
4.权利要求1的药物组合物，其中，所述离子浓度条件为pH条件。
5.权利要求4的药物组合物，其中，所述抗原结合结构域为具有下述特征的抗原结合结构域：与pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性相比，pH中性范围条件下的抗原结合活性高。
6.权利要求l～5中任一项的药物组合物，其中，所述抗原结合分子为具有针对所述抗原的中和活性的抗原结合分子。
7.权利要求l～6中任一项的药物组合物，其中，所述抗原结合分子为具有针对表达所述抗原的细胞的细胞毒活性的抗原结合分子。
8.权利要求1-7中任一项的药物组合物，其中，所述FcRn结合结构域包含抗体的Fc区。
9.权利要求8的药物组合物，其中，所述Fc区为下述Fc区：在Fc区的以EU编号表示的位点中，选自257位、308位、428位和434位的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区对应位点的氨基酸不同的Fc区。
10.权利要求8或9的药物组合物，其中，所述Fc区为含有Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
257位氨基酸为Ala，
308位氨基酸为Pro，
428位氨基酸为Leu，和
434位氨基酸为Tyr。
11.权利要求8～10中任一项的药物组合物，其中，所述Fc区的Fc γ受体结合活性具有下述特征：与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fc γ受体结合活性相比高。
12.权利要求11的药物组合物，其中，所述Fc γ受体为Fc γ RIa、Fc γ RIIa(R)、Fcγ RIIa(H)、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa(V)或Fc γ RIIIa(F)。
13.权利要求11或12的药物组合物，其中，所述Fc区为下述Fc区：在Fc区中以EU编号表示的位点中，选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区对应位点的氨基酸不同的Fc区：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。
14.权利要求11～13中任一项的药物组合物，其中，所述Fc区为在Fc区中以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
221位氨基酸为Lys或Tyr中任一个，
222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中任一个，
224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中任一个，
227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中任一个，
231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
233位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
234位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
235位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
236位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
237位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
238位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
239位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
24l位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中任一个，
243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中任一个，
244位氨基酸为His，
245位氨基酸为Ala，
246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
247位氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中任一个，
249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中任一个，
250位氨基酸为Glu或Gln中任一个，
251位氨基酸为Phe，
254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中任一个，
255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中任一个，
256位氨基酸为Ala、Met或Pro中任一个，
258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中任一个，
260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中任一个，
263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
264位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
265位氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中任一个，
266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
267位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
268位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中任一个，
269位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
270位氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
271位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
272位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
273位氨基酸为Phe或Ile中任一个，
274位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
275位氨基酸为Leu或Trp中任一个，
276位氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
278位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
279位氨基酸为Ala，
280位氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中任一个，
281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中任一个，
282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
283位氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中任一个，
284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中任一个，
285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中任一个，
286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中任一个，
288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中任一个，
290位氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中任一个，
292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中任一个，
293位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
294位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
295位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
296位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr或Val中任一个，
297位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
298位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
299位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
300位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
302位氨基酸为Ile，
303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中任一个，
304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中任一个，
305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中任一个，
311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中任一个，
313位氨基酸为Phe，
315位氨基酸为Leu，
317位氨基酸为Glu或Gln，
318位氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中任一个，
320位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
322位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
323位氨基酸为Ile，
324位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
325位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
326位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
327位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
328位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
329位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
330位氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
331位氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
332位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
333位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中任一个，
334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中任一个，
335位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中任一个，
337位氨基酸为Glu、His或Asn中任一个，
339位氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中任一个，
376位氨基酸为Ala或Val中任一个，
377位氨基酸为Gly或Lys中任一个，
378位氨基酸为Asp，
379位氨基酸为Asn，
380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中任一个，
382位氨基酸为Ala或Ile中任一个，
385位氨基酸为Glu，
392位氨基酸为Thr，
396位氨基酸为Leu，
421位氨基酸为Lys，
427位氨基酸为Asn，
428位氨基酸为Phe或Leu中任一个，
429位氨基酸为Met，
434位氨基酸为Trp，
436位氨基酸为Ile，和
440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中任一个。
15.权利要求11～14中任一项的药物组合物，其中，所述天然型Fc区为：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4中任一个的Fc区。
16.权利要求11～15中任一项的药物组合物，其中，所述Fc区是进行了下述修饰的Fc区：使得Fc区的EU编号297位连接的糖链组成为连接岩藻糖缺失糖链的Fc区比例变高、或附加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区比例变高。
17.诱导生物体的免疫应答的方法，其中，该方法包括将权利要求1～16的抗原结合分子给予该生物体内的步骤。
18.诱导免疫应答的抗原结合分子的制造方法，其中，该方法包括：对含有抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子中所含的FcRn结合结构域赋予pH中性范围条件下的FcRn结合活性。
19.权利要求18的方法，其中，所述离子浓度为钙离子浓度。
20.权利要求19的方法，其中，所述抗原结合结构域为具有下述特征的抗原结合结构域：与低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性相比，高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高。
21.权利要求18的方法，其中，所述离子浓度条件为pH条件。
22.权利要求21的方法，其中，所述抗原结合结构域为具有下述特征的抗原结合结构域：与pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性相比，pH中性范围条件下的抗原结合活性高。
23.权利要求18～22中任一项的方法，其中，所述抗原结合分子为具有针对所述抗原的中和活性的抗原结合分子。
24.权利要求18～23中任一项的方法，其中，所述抗原结合分子为具有针对表达所述抗原的细胞的细胞毒活性的抗原结合分子。
25.权利要求18～24中任一项的方法，其中，所述FcRn结合结构域包含抗体的Fc区。
26.权利要求25的方法，其中，该方法包括：置换Fc区的以EU编号表示的位点中选自239位、252位、257位、286位、307位、308位、428位和434位的至少一个以上的氨基酸的步骤。
27.权利要求25或26的方法，其中，该方法包括：进行Fc区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸置换的步骤：
257位氨基酸向Ala的置换，
308位氨基酸向Pro的置换，
428位氨基酸向Leu的置换，和
434位氨基酸向Tyr的置换。
28.权利要求25～27中任一项的方法，其中，该方法包括：使所述Fc区的Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fc γ受体结合活性相比增强的步骤。
29.权利要求28的方法，其中，所述Fc γ受体为Fc γ RIa、Fc γ RIIa(R)、Fc γRIIa(H)、Fc γ RIIb、Fc γ RIIIa(V)或Fc γ RIIIa(F)。
30.权利要求28或29的方法，其中，该方法包括置换Fc区中以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸的步骤：221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位和440位。
31.权利要求28～30中任一项的方法，其中，该方法包括进行Fc区中以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸置换的步骤：
221位氨基酸向Lys或Tyr中任一个的置换，
222位氨基酸向Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个的置换，
223位氨基酸向Phe、Trp、Glu或Lys中任一个的置换，
224位氨基酸向Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个的置换，
225位氨基酸向Glu、Lys或Trp中任一个的置换，
227位氨基酸向Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个的置换，
228位氨基酸向Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个的置换，
230位氨基酸向Ala、Glu、Gly或Tyr中任一个的置换，
231位氨基酸向Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个的置换，
232位氨基酸向Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个的置换，
233位氨基酸向Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
234位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
235位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
236位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
237位氨基酸向Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
238位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
239位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
240位氨基酸向Ala、Ile、Met或Thr中任一个的置换，
241位氨基酸向Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中任一个的置换，
243位氨基酸向Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中任一个的置换，
244位氨基酸向His的置换，
245位氨基酸向Ala的置换，
246位氨基酸向Asp、Glu、His或Tyr中任一个的置换，
247位氨基酸向Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中任一个的置换，
249位氨基酸向Glu、His、Gln或Tyr中任一个的置换，
250位氨基酸向Glu或Gln中任一个的置换，
251位氨基酸向Phe的置换，
254位氨基酸向Phe、Met或Tyr中任一个的置换，
255位氨基酸向Glu、Leu或Tyr中任一个的置换，
256位氨基酸向Ala、Met或Pro中任一个的置换，
258位氨基酸向Asp、Glu、His、Ser或Tyr中任一个的置换，
260位氨基酸向Asp、Glu、His或Tyr中任一个的置换，
262位氨基酸向Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中任一个的置换，
263位氨基酸向Ala、Ile、Met或Thr中任一个的置换，
264位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个的置换，
265位氨基酸向Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
266位氨基酸向Ala、Ile、Met或Thr中任一个的置换，
267位氨基酸向Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
268位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中任一个的置换，
269位氨基酸向Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
270位氨基酸向Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个的置换，
271位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
272位氨基酸向Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
273位氨基酸向Phe或Ile中任一个的置换，
274位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
275位氨基酸向Leu或Trp中任一个的置换，
276位氨基酸向、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
278位氨基酸向Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个的置换，
279位氨基酸向Ala的置换，
280位氨基酸向Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中任一个的置换，
281位氨基酸向Asp、Lys、Pro或Tyr中任一个的置换，
282位氨基酸向Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个的置换，
283位氨基酸向Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中任一个的置换，
284位氨基酸向Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中任一个的置换，
285位氨基酸向Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中任一个的置换，
286位氨基酸向Glu、Gly、Pro或Tyr中任一个的置换，
288位氨基酸向Asn、Asp、Glu或Tyr中任一个的置换，
290位氨基酸向Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个的置换，
291位氨基酸向Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中任一个的置换，
292位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中任一个的置换，
293位氨基酸向Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
294位氨基酸向Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
295位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
296位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中任一个的置换，
297位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
298位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
299位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
300位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个的置换，
301位氨基酸向Asp、Glu、His或Tyr中任一个的置换，
302位氨基酸向Ile的置换，
303位氨基酸向Asp、Gly或Tyr中任一个的置换，
304位氨基酸向Asp、His、Leu、Asn或Thr中任一个的置换，
305位氨基酸向Glu、Ile、Thr或Tyr中任一个的置换，
311位氨基酸向Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中任一个的置换，
313位氨基酸向Phe的置换，
315位氨基酸向Leu的置换，
317位氨基酸向Glu或Gln的置换，
318位氨基酸向His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中任一个的置换，
320位氨基酸向Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
322位氨基酸向Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
323位氨基酸向Ile的置换，
324位氨基酸向Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
325位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
326位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
327位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
328位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
329位氨基酸向Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
330位氨基酸向Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
331位氨基酸向Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
332位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
333位氨基酸向Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中任一个的置换，
334位氨基酸向Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中任一个的置换，
335位氨基酸向Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个的置换，
336位氨基酸向Glu、Lys或Tyr中任一个的置换，
337位氨基酸向Glu、His或Asn中任一个的置换，
339位氨基酸向Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中任一个的置换，
376位氨基酸向Ala或Val中任一个的置换，
377位氨基酸向Gly或Lys中任一个的置换，
378位氨基酸向Asp的置换，
379位氨基酸向Asn的置换，
380位氨基酸向Ala、Asn或Ser中任一个的置换，
382位氨基酸向Ala或Ile中任一个的置换，
385位氨基酸向Glu的置换，
392位氨基酸向Thr的置换，
396位氨基酸向Leu的置换，
421位氨基酸向Lys的置换，
427位氨基酸向Asn的置换，
428位氨基酸向Phe或Leu中任一个的置换，
429位氨基酸向Met的置换，
434位氨基酸向Trp的置换，
436位氨基酸向Ile的置换，和
440位氨基酸向Gly、His、Ile、Leu或Tyr中任一个的置换。
32.权利要求28～3l中任一项的方法，其中，所述天然型Fc区是：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4中任一个的Fc区。
33.权利要求28～32中任一项的方法，其中，该方法包括修饰Fc区的步骤，使得Fc区的EU编号297位连接的糖链组成为连接岩藻糖缺失糖链的Fc区比例变高、或附加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区比例变高。
34.诱导免疫应答的药物组合物的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得高钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(b)获得低钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤，(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
35.诱导免疫应答的药物组合物的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得高钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得低钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗体的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
36.抗原结合分子的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得pH中性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(b)获得pH酸性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
37.抗原结合分子的制造方法，其中，该方法包括以下(a)～(f)的步骤：
(a)获得pH中性范围条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(b)获得pH酸性范围条件下抗体的抗原结合活性的步骤，
(c)选择(a)中得到的抗原结合活性高于(b)中得到的抗原结合活性的抗体的步骤，
(d)将编码(c)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的FcRn结合结构域的多核苷酸连接的步骤，
(e)将导入了有效连接有(d)中得到的多核苷酸的载体的细胞进行培养的步骤，和
(f)由(e)中培养的细胞的培养液回收抗原结合分子的步骤。
38.权利要求34～37中任一项的方法，其中，所述抗原结合分子为具有针对所述抗原的中和活性的抗原结合分子。
39.权利要求34～38中任一项的方法，其中，所述抗原结合分子为具有针对表达所述抗原的细胞的细胞毒活性的抗原结合分子。
40.权利要求34～39中任一项的方法，其中，所述FcRn结合结构域包含抗体的Fc区。
41.权利要求40的方法，其中，所述Fc区为下述Fc区：在Fc区的以EU编号表示的位点中，选自257位、308位、428位和434位的至少一个以上的氨基酸与天然型Fc区对应位点的氨基酸不同的Fc区。
42.权利要求40或41的方法，其中，所述Fc区为含有Fc区的以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
257位氨基酸为Ala，
308位氨基酸为Pro，
428位氨基酸为Leu，和
434位氨基酸为Tyr。
43.权利要求40～42中任一项的方法，其中，所述Fc区的Fc γ受体结合活性具有下述特征：与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fc γ受体结合活性相比高。
44.权利要求43的方法，其中，所述Fc Y受体为Fc γ RIa、Fc γ RIIa(R)、Fc γ RIIa(H)、Fcγ RIIb、Fc γ RIIIa(V)或Fc γ RIIIa(F)。
45.权利要求43或44的方法，其中，所述Fc区为含有Fc区中以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fc区：
221位氨基酸为Lys或Tyr中任一个，
222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中任一个，
224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个，
225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中任一个，
227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中任一个，
231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个，
233位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
234位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
235位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
236位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
237位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
238位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
239位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中任一个，
243位氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中任一个，
244位氨基酸为His，
245位氨基酸为Ala，
246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
247位氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中任一个，
249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中任一个，
250位氨基酸为Glu或Gln中任一个，
251位氨基酸为Phe，
254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中任一个，
255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中任一个，
256位氨基酸为Ala、Met或Pro中任一个，
258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中任一个，
260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中任一个，
263位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
264位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
265位氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Val、Trp或Tyr中任一个，
266位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个，
267位氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
268位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中任一个，
269位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
270位氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
271位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
272位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
273位氨基酸为Phe或Ile中任一个，
274位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
275位氨基酸为Leu或Trp中任一个，
276位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
278位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
279位氨基酸为Ala，
280位氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中任一个，
281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中任一个，
282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个，
283位氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中任一个，
284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中任一个，
285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中任一个，
286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中任一个，
288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中任一个，
290位氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个，
291位氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中任一个，
292位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中任一个，
293位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
294位氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
295位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
296位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中任一个，
297位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
298位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
299位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
300位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个，
301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个，
302位氨基酸为Ile，
303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中任一个，
304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中任一个，
305位氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中任一个，
311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中任一个，
313位氨基酸为Phe，
315位氨基酸为Leu，
317位氨基酸为Glu或Gln，
318位氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中任一个，
320位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
322位氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
323位氨基酸为Ile，
324位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
325位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
326位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
327位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
328位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
329位氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
330位氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
331位氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
332位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个，
333位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中任一个，
334位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中任一个，
335位氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个，
336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中任一个，
337位氨基酸为Glu、His或Asn中任一个，
339位氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中任一个，
376位氨基酸为Ala或Val中任一个，
377位氨基酸为Gly或Lys中任一个，
378位氨基酸为Asp，
379位氨基酸为Asn，
380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中任一个，
382位氨基酸为Ala或Ile中任一个，
385位氨基酸为Glu，
392位氨基酸为Thr，
396位氨基酸为Leu，
421位氨基酸为Lys，
427位氨基酸为Asn，
428位氨基酸为Phe或Leu中任一个，
429位氨基酸为Met，
434位氨基酸为Trp，
436位氨基酸为Ile、和
440位氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中任一个。
46.权利要求43～45中任一项的方法，其中，所述天然型Fc区为：EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4中任一个的Fc区。
47.权利要求43～46中任一项的方法，其中，所述Fc区是进行了下述修饰的Fc区：使得Fc区的EU编号297位连接的糖链组成为连接岩藻糖缺失糖链的Fc区比例变高、或附加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区比例变高。
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