KR20110091598A - 항-ｉｌ-22ｒａ 항체 및 결합 파트너 및 염증에 있어서의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IL-22, IL-20, 또는 IL-20 및 IL-22 폴리펩티드 분자의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화시키는 것에 관한 것이다. IL-20 및 IL-22는 염증 진행 및 인간 질환에 수반되는 시토카인이다. IL-22RA(zcyotr11)는 IL-20 및 IL-22에 대한 통상의 수용체이다. 본 발명은 항-IL-22RA 항체 및 결합 파트너, 뿐만 아니라 그러한 항체 및 결합 펩티드를 사용하여 IL-22 또는 IL-20 및 IL-22를 길항하는 방법을 포함한다.

Description

항-ＩＬ-22ＲＡ 항체 및 결합 파트너 및 염증에 있어서의 사용 방법{ANTI-IL-22RA ANTIBODIES AND BINDING PARTNERS AND METHODS OF USING IN INFLAMMATION}
본 발명은 IL-22, IL-20, 또는 IL-20 및 IL-22 폴리펩티드 분자의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화시키는 것에 관한 것이다. IL-20 및 IL-22는 염증 진행 및 인간 질환에 수반되는 시토카인이다. IL-22RA(zcyotr11)는 IL-20 및 IL-22에 대한 통상의 수용체이다. 본 발명은 항-IL-22RA 항체 및 결합 파트너, 뿐만 아니라 그러한 항체 및 결합 펩티드를 사용하여 IL-22 또는 IL-20 및 IL-22를 길항하는 방법을 포함한다.
시토카인은 많은 세포 유형의 성장 및 분화의 조절을 포함하는 다양한 생물학적 영향을 매개하는 가용성의 작은 단백질이다(예를 들어, Arai et al., Aniiu. Rev.Biocheen. 59: 783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3: 311 (1991); Paul and Seder, Cell 76: 241 (1994) 참조). 시토카인 군을 구성하는 단백질은 인터루킨, 인터페론, 콜로니 자극 인자, 종양 괴사 인자 및 기타 조절 분자를 포함한다. 예를 들어, 인간 인터루킨-17은 인터루킨-6의 발현, 세포내 흡착 분자 1, 인터루킨-8, 과립성 백혈구 마크로파지 콜로니-자극 인자, 및 프로스타글란딘 E2 발현을 자극하는 시토카인이며, CD34+ 조혈 전구체의 뉴트로필로의 우선적 성숙에서 역할을 한다(Yao et al., J. Immunol. 155: 5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996)).
시토카인에 결합하는 수용체는 전형적으로 높은 친화성으로 시토카인에 결합하고 특정 수용체 서브유닛의 세포질 부분을 통해 세포에 대하여 이러한 결합 사건을 도입하는 하나 이상의 통합 막성 단백질로 이루어져 있다. 시토카인 수용체를 그들의 세포외 리간드 결합 도메인에 있어서 유사성을 기초로 하여 몇가지 클래스로 그룹지었다. 예를 들어, 인터페론의 영향에 결합하고 및/또는 도입하는 역할을 하는 수용체 사슬은 특징적인 200 잔기 세포외 도메인을 기초로 하여, 클래스 II 시토카인 수용체 패밀리의 구성원이다.
시토카인 및 그들의 수용체의 설명된 생체내 활성은 다른 시토카인, 시토카인 수용체, 시토카인 작동물질 및 시토카인 길항물질에 대한 임상적 잠재성, 및 필요성을 나타낸다. 예를 들어, 전구염증성 시토카인 패밀리의 설명된 생체내 활성은 전구염증성 분자의 거대한 임상적 잠재성 및 필요성을 나타낸다. 본 발명은 전구염증성 시토카인 IL-20 및 IL-22에 대하여 길항물질을 제공함으로써 이들 필요성을 해결한다. IL-22, IL-20, 또는 IL-20 및 IL-22 모두의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수도 있는 본 발명의 이러한 길항물질은 가용성 IL-22RA 수용체 및 중화 항-IL-22RA 항체를 포함한다. 따라서 본 발명은 관련 조성물 및 방법 뿐 아니라, 염증성 질병에서 사용을 더 제공한다.
다른 발명들 사이에서, 본 발명은 "Zcytorll" 또는 "IL-22RA"로 명명된 가용성 수용체에 대한 신규한 사용을 제공하며, IL-22RA 시토카인 수용체에 대한 항체를 중화하는 것을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 염증성 및 자가면역 질병에 있어서 사용을 위한 가용성 IL-22RA 폴리펩티드 단편 및 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 항-IL-22RA 항체, 및 가용성 IL-22RA 수용체는, 본 발명의 항-IL-22RA 항체를 중화하는 것을 포함하여, 예를 들어 건선, 건선의 관절염, 관절염, 내독소혈증, 염증성 장 질환(IBD), 대장염 및 본원에서 개시된 기타 염증성 상태와 같은 특이적 인간 질병의 치료에 있어서, IL-22 또는 IL-20, 또는 Il-20 및 Il-22 모두의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 사용될 수 있다.
인간 Zcytor11(IL-22RA)을 암호화하는 실례가 되는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1에 의해 제공되어 있고; 암호화된 폴리펩티드는 서열 번호 2에 나타내어 있다. IL-22RA는 IL-20 및 IL-22 모두에 대한 수용체 서브유닛이다. Zcytor11(EL22RA)은 공동 소유의 미국 특허 제5,965,704호, 공동 소유의 WIPO 공보 WO02/12345 및 공동 소유의 WIPO 공보 제 WO 02/072607에 개시되어 있다. IL-22RA(서열 번호 1)를 암호화하는 인간 cDNA 클론의 분석은 약 211 아미노산 잔기(서열 번호 2; 서열 번호 3의 잔기)의 세포외 리간드-결합 도메인, 약 23 아미노산 잔기(서열 번호 2의 잔기 229-251)의 막투과성 도메인, 및 약 313 아미노산 잔기(서열 번호 2의 잔기 252 내지 574)의 세포외 도메인을 포함하여 574 아미노산(서열 번호 2)을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 분자는 서열 번호 2; SEQ ID N0:3의 아미노산 잔기 18-228를 포함하는 시토카인 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 가용성 수용체의 한 구체예에서, 가용성 IL-22R은 중쇄(서열 번호 4에서 대표적으로 나타냄)의 불변 영역으로 융합되어 있다. 당업계 숙련자는 이들 도메인 경계를 어림잡는 것을 인지할 것이다. 도메인의 말단으로부터의 잔기의 결실이 가능하다.
하기에 설명되는 바와 같이, 본 발명은 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 95%이상으로서 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상과 같이 서열 번호 2의 18-228의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하는데, 이것은 또한 서열 번호 3에 나타나 있고, 이때 단리 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합한다. 실례가 되는 폴리펩티드는 아미노산 잔기 서열 번호 3 또는 아미노산 잔기 서열 번호 3을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 IL-22(예를 들어, 서열 번호 6에서 나타낸 바와 같은 인간 IL-22 폴리펩티드 서열)에 결합하는 상기 개시된 바와 같은 단리 폴리펩티드를 제공한다. 인간 IL-22 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5에 나타나 있다. 마우스 IL-22 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 10에 나타나 있으며, 대응 폴리펩티드는 서열 번호 11에 나타나 있다. 본 발명은 또한 IL-20(예를 들어, 서열 번호 8에서 나타낸 바와 같은 인간 IL-20 폴리펩티드 서열; WIPO 공보 제 WO 99/27103)에 결합하는 상기 개시된 바와 같은 단리 폴리펩티드를 제공한다. 인간 IL-20 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7에 나타나 있다.
본 발명은 또한 서열 번호 3의 아미노산 서열의 적어도 15 인접 아미노산 잔기를 포함하는 단리 폴리펩티드 및 에피토프를 제공한다. 실례가 되는 폴리펩티드는 서열 번호 3, 그것의 항원 에피토프, 또는 그것의 기능상의 IL-20 또는 IL-22 결합 단편을 포함하거나, 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 또한 IL-22 또는 IL-20의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하도록 결합하는 상기 개시된 바와 같은 단리 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 변이체 IL-22RA 폴리펩티드를 포함하는데, 이때 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 적어도 70% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 또는 95% 이상의 동일성으로서, 예를 들어, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 동일성을 공유하며, 이때 변이체 폴리펩티드 및 서열 번호 3의 대응 아미노산 서열 간의 어떤 차이점은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 기인한다. 이러한 보존적 아미노산 치환이 본원에 설명되어 있다. 더욱이, 본 발명은 또한 IL-22 또는 IL-20의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하도록 결합하는 상기 개시된 바와 같은 단리 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 이러한 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편을 더 제공한다. 전형적인 항체는 중화 항체, 폴리클론 항체, 쥐과 단일클론 항체, 쥐과 단일클론 항체로부터 유도된 인간화 항체, 및 인간 단일클론 항체를 포함한다. 실례가 되는 항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, 및 최소 인지 유닛을 포함한다. 중화 항체는 IL-22RA에 우선적으로 결합하는데, IL-20 및 IL-22의 IL-22RA와의 이러한 상호작용이 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화되며; IL-20 또는 IL-22의 IL-22RA에 대한 이러한 결합이 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화되는 항-IL-22RA 중화 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 즉, 본 발명의 중화 항-IL-22RA 항체는 각각의 IL-20 또는 IL-22에 결합, 차단, 억제, 감소 또는 길항하거나, IL-20 및 IL-22 모두에 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있다. 본 발명은 담체 및 펩티드, 폴리펩티드 또는 본원에서 설명된 항체를 포함하는 조성물을 더 포함한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물 및 적어도 하나의 이러한 발현 벡터 또는 이러한 발현 벡터를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 본원에서 설명된 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물을 더 포함한다.
본 발명은 또한 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 그것의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체, 또는 항-유전자형 항체 단편을 고려한다. 전형적인 항-유전자형 항체는 서열 번호 3으로 이루어진 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 결합한다.
본 발명은 또한 IL-22RA 폴리펩티드 및 면역글로불린 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 이러한 융합 단백질에서, 면역글로불린 부분은 인간 Fc 단편과 같은 면역글로불린 중쇄 불변 영역일 수도 있다. 본 발명은 이러한 융합 단백질을 암호화하는 단리 핵산 분자를 더 포함한다.
본 발명은 또한 예를 들어, 단량체, 동종이량체, 이종이량체 및 가용성 수용체를 포함하는 다량체 수용체와 같은 IL-22RA 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 폴리클론 및 단일클론 항체를 제공한다. 게다가, 이러한 항체는 IL-22RA 수용체에 대하여 개별적으로 또는 함께, IL-22RA 리간드, IL-22(서열 번호 6), 및 IL-20(서열 번호 8)의 결합을 길항하는데 사용될 수 있다.
더욱이, IL-22 및 IL-20의 과잉 발현 또는 상승조절은 또한 인간 건선, 아노피성 피부염 또는 피부 및 상피 조직의 기타 염증성 질환에 관련된 IL-20과 같은 IL-22를 제안하면서, 인간 건선 장애 및 인간 아토피성 피부염 피부 샘플에서 나타났다. 더욱이, 본원에서 설명되는 바와 같이, 트랜스제닉 마우스에서 IL-20 또는 IL-22의 과잉 발현은 건선 표현형의 지표인 상피 비대 및 면역 세포 연루를 나타내고; 또한 정상 마우스로의 IL-22의 주입은 건선 표현형의 지표인 상피 비대 및 며역 세포 연루를 나타내는데, 이것은 가용성 수용체 길항물질 IL-22RA2(zcytorl6 ; WIPO 공보 제WO01/40467호)에 의해 제거된다. 이러한 생체내 데이터는 전구염증성 IL-22가 건선, 아토피성 피부염 또는 피부 및 상피 조직의 기타 염증성 질환에 관련되어 있음을 제안한다. 이와 같이, IL-22 및 IL-20 활성에 대한 길항물질, 예를 들어, IL-22RA 가용성 수용체 및 그것에 항-사람-IL-22RA 단일클론 및 본 발명의 중화 항체를 포함하는 항체와 같은 것은 염증성 질환 치료적 처리에 있어서, 특히 건선의 치료에 있어서 단독으로 또는 함께 IL-22 및 IL-20 모두에 대한 길항물질로서 특히 유용하다. 더욱이, 예를 들어, IL-22RA 가용성 수용체 및 그것에 항-사람-IL-22RA 단일클론 및 본 발명의 중화 항체를 포함하는 항체와 같은 IL-22 활성에 대한 길항물질은 예를 들어 아토피성 피부염, IBD, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염 및 건선 관절염 성인 호흡 질환(ARD), 감염성 쇼크, 복합 장기 기능상실, 예를 들어, 천식 또는 기관지염과 같은 염증성 폐 소상, 세균성 폐렴, 건선, 습진, 아노피성 및 접촉성 피부염, 및 예를 들어 궤양성 대장염 및 크론병과 같은 염증성 장 질환의 치료에서 IL-22 및 IL-20(개별적으로 또는 동시에)에 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 바와 같이 기타 염증성 질환의 치료적 처리에 유용하다.
1. 개관
다른 발명들 사이에서, 본 발명은 "Zcytorll" 또는 "IL-22RA"로 명명된 가용성 수용체에 대한 신규한 사용을 제공하며, IL-22RA 시토카인 수용체에 대한 항체를 중화하는 것을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 염증성 및 자가면역 질병에 있어서 사용을 위한 가용성 IL-22RA 폴리펩티드 단편 및 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 항-IL-22RA 항체, 및 가용성 IL-22RA 수용체는, 본 발명의 항-IL-22RA 항체를 중화하는 것을 포함하여, 예를 들어 건선, 건선의 관절염, 관절염, 내독소혈증, 염증성 장 질환(IBD), 대장염 및 본원에서 개시된 기타 염증성 상태와 같은 특이적 인간 질병의 치료에 있어서, IL-22 또는 IL-20, 또는 Il-20 및 Il-22 모두의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 사용될 수 있다.
인간 Zcytor11(IL-22RA)을 암호화하는 실례가 되는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1에 의해 제공되어 있고; 암호화된 폴리펩티드는 서열 번호 2에 나타내어 있다. IL-22RA는 IL-20 및 IL-22 모두에 대한 수용체 서브유닛이다. Zcytor11(EL22RA)은 공동 소유의 미국 특허 제5,965,704호, 공동 소유의 WIPO 공보 WO02/12345 및 공동 소유의 WIPO 공보 제 WO 02/072607에 개시되어 있다. IL-22RA(서열 번호 1)를 암호화하는 인간 cDNA 클론의 분석은 약 211 아미노산 잔기(서열 번호 2; 서열 번호 3의 잔기)의 세포외 리간드-결합 도메인, 약 23 아미노산 잔기(서열 번호 2의 잔기 229-251)의 막투과성 도메인, 및 약 313 아미노산 잔기(서열 번호 2의 잔기 252 내지 574)의 세포외 도메인을 포함하여 574 아미노산(서열 번호 2)을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 분자는 서열 번호 2; SEQ ID N0:3의 아미노산 잔기 18-228를 포함하는 시토카인 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 가용성 수용체의 한 구체예에서, 가용성 IL-22R은 중쇄(서열 번호 4에서 대표적으로 나타냄)의 불변 영역으로 융합되어 있다. 당업계 숙련자는 이들 도메인 경계를 어림잡는 것을 인지할 것이다. 도메인의 말단으로부터의 잔기의 결실이 가능하다.
하기에 설명되는 바와 같이, 본 발명은 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 95%이상으로서 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상과 같이 서열 번호 2의 18-228의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리 폴리펩티드를 제공하는데, 이것은 또한 서열 번호 3에 나타나 있고, 이때 단리 폴리펩티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합한다. 실례가 되는 폴리펩티드는 아미노산 잔기 서열 번호 3 또는 아미노산 잔기 서열 번호 3을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 IL-22(예를 들어, 서열 번호 6에서 나타낸 바와 같은 인간 IL-22 폴리펩티드 서열)에 결합하는 상기 개시된 바와 같은 단리 폴리펩티드를 제공한다. 인간 IL-22 폴리펩티드 서열은 서열 번호 5에 나타나 있다. 마우스 IL-22 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 10에 나타나 있으며, 대응 폴리펩티드는 서열 번호 11에 나타나 있다. 본 발명은 또한 IL-20(예를 들어, 서열 번호 8에서 나타낸 바와 같은 인간 IL-20 폴리펩티드 서열; WIPO 공보 제 WO 99/27103)에 결합하는 상기 개시된 바와 같은 단리 폴리펩티드를 제공한다. 인간 IL-20 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7에 나타나 있다.
본 발명은 또한 서열 번호 3의 아미노산 서열의 적어도 15 인접 아미노산 잔기를 포함하는 단리 폴리펩티드 및 에피토프를 제공한다. 실례가 되는 폴리펩티드는 서열 번호 3, 그것의 항원 에피토프, 또는 그것의 기능상의 IL-20 또는 IL-22 결합 단편을 포함하거나, 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 또한 IL-22 또는 IL-20의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하도록 결합하는 상기 개시된 바와 같은 단리 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 변이체 IL-22RA 폴리펩티드를 포함하는데, 이때 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 적어도 70% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 또는 95% 이상의 동일성으로서, 예를 들어, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 동일성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 번호 3의 아미노산 서열과 동일성을 공유하며, 이때 변이체 폴리펩티드 및 서열 번호 3의 대응 아미노산 서열 간의 어떤 차이점은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 기인한다. 이러한 보존적 아미노산 치환이 본원에 설명되어 있다. 더욱이, 본 발명은 또한 IL-22 또는 IL-20의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하도록 결합하는 상기 개시된 바와 같은 단리 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 이러한 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 및 항체 단편을 더 제공한다. 전형적인 항체는 중화 항체, 폴리클론 항체, 쥐과 단일클론 항체, 쥐과 단일클론 항체로부터 유도된 인간화 항체, 및 인간 단일클론 항체를 포함한다. 실례가 되는 항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, 및 최소 인지 유닛을 포함한다. 중화 항체는 IL-22RA에 우선적으로 결합하는데, IL-20 및 IL-22의 IL-22RA와의 이러한 상호작용이 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화되며; IL-20 또는 IL-22의 IL-22RA에 대한 이러한 결합이 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화되는 항-IL-22RA 중화 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 즉, 본 발명의 중화 항-IL-22RA 항체는 각각의 IL-20 또는 IL-22에 결합, 차단, 억제, 감소 또는 길항하거나, IL-20 및 IL-22 모두에 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있다. 본 발명은 담체 및 펩티드, 폴리펩티드 또는 본원에서 설명된 항체를 포함하는 조성물을 더 포함한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물 및 적어도 하나의 이러한 발현 벡터 또는 이러한 발현 벡터를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 본원에서 설명된 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 약학적 조성물을 더 포함한다.
본 발명은 또한 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 그것의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항-유전자형 항체, 또는 항-유전자형 항체 단편을 고려한다. 전형적인 항-유전자형 항체는 서열 번호 3으로 이루어진 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 결합한다.
본 발명은 또한 IL-22RA 폴리펩티드 및 면역글로불린 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 이러한 융합 단백질에서, 면역글로불린 부분은 인간 Fc 단편과 같은 면역글로불린 중쇄 불변 영역일 수도 있다. 본 발명은 이러한 융합 단백질을 암호화하는 단리 핵산 분자를 더 포함한다.
본 발명은 또한 예를 들어, 단량체, 동종이량체, 이종이량체 및 가용성 수용체를 포함하는 다량체 수용체와 같은 IL-22RA 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 폴리클론 및 단일클론 항체를 제공한다. 게다가, 이러한 항체는 IL-22RA 수용체에 대하여 개별적으로 또는 함께, IL-22RA 리간드, IL-22(서열 번호 6), 및 IL-20(서열 번호 8)의 결합을 길항하는데 사용될 수 있다.
더욱이, IL-22 및 IL-20의 과잉 발현 또는 상승조절은 또한 인간 건선, 아노피성 피부염 또는 피부 및 상피 조직의 기타 염증성 질환에 관련된 IL-20과 같은 IL-22를 제안하면서, 인간 건선 장애 및 인간 아토피성 피부염 피부 샘플에서 나타났다. 더욱이, 본원에서 설명되는 바와 같이, 트랜스제닉 마우스에서 IL-20 또는 IL-22의 과잉 발현은 건선 표현형의 지표인 상피 비대 및 면역 세포 연루를 나타내고; 또한 정상 마우스로의 IL-22의 주입은 건선 표현형의 지표인 상피 비대 및 며역 세포 연루를 나타내는데, 이것은 가용성 수용체 길항물질 IL-22RA2(zcytorl6 ; WIPO 공보 제WO01/40467호)에 의해 제거된다. 이러한 생체내 데이터는 전구염증성 IL-22가 건선, 아토피성 피부염 또는 피부 및 상피 조직의 기타 염증성 질환에 관련되어 있음을 제안한다. 이와 같이, IL-22 및 IL-20 활성에 대한 길항물질, 예를 들어, IL-22RA 가용성 수용체 및 그것에 항-사람-IL-22RA 단일클론 및 본 발명의 중화 항체를 포함하는 항체와 같은 것은 염증성 질환 치료적 처리에 있어서, 특히 건선의 치료에 있어서 단독으로 또는 함께 IL-22 및 IL-20 모두에 대한 길항물질로서 특히 유용하다. 더욱이, 예를 들어, IL-22RA 가용성 수용체 및 그것에 항-사람-IL-22RA 단일클론 및 본 발명의 중화 항체를 포함하는 항체와 같은 IL-22 활성에 대한 길항물질은 예를 들어 아토피성 피부염, IBD, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염 및 건선 관절염 성인 호흡 질환(ARD), 감염성 쇼크, 복합 장기 기능상실, 예를 들어, 천식 또는 기관지염과 같은 염증성 폐 소상, 세균성 폐렴, 건선, 습진, 아노피성 및 접촉성 피부염, 및 예를 들어 궤양성 대장염 및 크론병과 같은 염증성 장 질환의 치료에서 IL-22 및 IL-20(개별적으로 또는 동시에)에 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 바와 같이 기타 염증성 질환의 치료적 처리에 유용하다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 하기의 상세한 설명을 참고로 하여 명백해질 것이다. 또한, 각종 참고문헌을 밝히고 있으며 그들 전체가 참고로서 인용되어 있다.
2. 정의
하기 설명에서, 다수의 용어가 광범위하게 사용되어 있다. 하기 정의는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 생산된 단편 및 리게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생산된 단편을 나타낸다. 핵산 분자는 천연 발생 뉴클레오티드(DNA 및 RNA와 같은), 또는 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체(예를 들어, 천연 발생 뉴클레오티드의 α-거울상체 형태), 또는 상기 모두의 조합인 모노머로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 부분 및/또는 피리미딘이나 퓨린 염기 부분의 변경을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어, 할로겐, 알킬 기, 아민, 및 아지도 기를 갖는 하나 이상의 히드록실 기의 치환을 포함하거나, 당은 에테르 또는 에스테르로서 작용화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 부분은 입체적 및 전자적으로 유사한 구조, 예를 들어, 아자-당 및 탄소환 당 유사체로 치환될 수 있다. 염기 부분의 변형의 예는 알킬화 퓨린 및 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘, 또는 기타 주지된 헤테로시클릭 치환기를 포함한다. 핵산 모노머는 포스포디에스테르 결합 또는 그러한 결합의 유사체로써 결합된다. 포스포디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 소위 "펩티드 핵산"을 포함하는데, 이것은 폴리아미드 백본에 부착된 천연-발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
용어 "핵산 분자의 보체"는 기준 뉴클레오티드 서열과 비교하여 상보성 뉴클레오티드 서열 및 역 방위를 갖는 핵산 분자를 나타낸다. 예를 들어, 서열 5' ATGCACGGG 3'은 5'CCCGTGCAT3'에 상보적이다.
용어 "축퇴성 뉴클레오티드 서열"은 폴리펩티드를 암호화하는 기준 핵산 분자와 비교하여 하나 이상의 축퇴성 코돈을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 축퇴성 코돈은 상이한 트리플릿의 뉴클레오티드를 포함하지만, 동일한 아미노산 잔기를 암호화한다(즉, 각각 Asp를 암호화하는 GAU 및 GAC 트리플릿).
용어 "구조 유전자"는 메신저 RNA(mRNA)로 전사되는 핵산 분자를 나타내는데, 그 후 이것은 특이적 폴리펩티드의 아미노산 특징의 서열로 번역된다.
"단리 핵산 분자"는 유기체의 게놈 DNA에 통합되지 않는 핵산 분자이다. 예를 들어, 세포의 게놈 DNA로부터 분리된 성장 인자를 암호화하는 DNA 분자가 단리 DNA 분자이다. 단리 핵산 분자의 다른 예는 유기체의 게놈에 통합되지 않는 화학적으로-합성된 핵산 분자이다. 특정 종으로부터 단리된 핵산 분자는 그 종으로부터의 염색체의 완전한 DNA 분자 보다 더 작다.
"핵산 분자 구성체"는 자연계에 존재하지 않는 배열에 있어서 조합 및 병렬된 핵산의 분절을 함유하도록 사람의 개입을 통해 변형된 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자이다.
"선형 DNA"는 자유 5' 및 3' 말단을 갖는 비-선형 DNA 분자를 나타낸다. 선형 DNA는 효소적 소화 또는 물리적 붕괴에 의해, 플라스미드와 같은 폐쇄 원형 DNA 분자로부터 제조될 수 있다.
"상보성 DNA(cDNA)"는 역 전사 효소에 의해 mRNA 주형으로부터 형성된 단일-가닥 DNA 분자이다. 전형적으로, mRNA의 일부에 대하여 상보적인 프라이머가 역 전사의 개시를 위해 이용된다. 당업계 숙련자는 또한 용어 "cDNA"를 이러한 단일-가닥 DNA 분자 및 그것의 상보성 DNA 가닥으로 이루어진 이중-가닥 DNA 분자를 나타내도록 사용한다. 용어 "cDNA"는 또한 RNA 주형으로부터 합성된 cDNA 분자의 클론을 나타낸다.
"프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 시작 부위에 인접하는, 유전자의 5' 비-암호화 부위에 위치한다. 전사의 개시에 있어서 작용하는 프로모터 내 서열 요소는 종종 일치 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터 요소는 RNA 폴리머라제 결합 자리, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소(DSEs; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7: 551 (1993)), 고리형 AMP 반응 요소(CREs), 혈청 반응 요소(SREs; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)), 글루코코르티코이드 반응 요소(GREs) 및 예를 들어, CRE/ATF와 같은 다른 전사 인자에 대한 결합 자리(O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)), AP2(Ye et al., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)), SP1, cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB; Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993) 및 옥타머 인자(일반적으로, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), and Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303: 1(1994) 참조). 프로모터가 유도성 프로모터라면, 그때 전사율은 유도제에 반응하여 증가한다. 반대로, 전사율이 프로모터가 구조 프로모터라면 유도제에 의해 조절되지 않는다. 억제성 프로모터가 또한 알려져 있다.
"핵심 프로모터"는 TATA 박스 및 전사의 개시를 포함하는 프로모터 작용을 위한 필수적 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이러한 정의에 의해, 핵심 프로모터는 특이적 서열의 부재에 있어서 검출 가능한 활성을 가질 수 있거나 그렇지 않을 수 있어서 활성을 증강시키거나 조직 특이적 활성을 수여할 수 있다.
"조절 요소"는 핵심 프로모터의 활성을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, 조절 요소는 특정 세포, 조직, 또는 소기관에 있어서 배제적으로 또는 우위적으로 전사를 가능하게 하는 세포 인자와 결합하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수도 있다. 이러한 유형의 조절 요소는 일반적으로 "세포-특이적", "조직-특이적", 또는 "소기관-특이적" 방식으로 발현되는 유전자와 관련된다.
"증강인자"는 전사의 시작 부위에 상대적인 증강인자의 거리 또는 방위에 관계없이, 전사의 효율성을 증가시킬 수 있는 조절 요소의 유형이다.
"이종 DNA"는 DNA 분자, 또는 DNA 분자의 집단을 나타내는데, 이것은 제공된 숙주 세포 내에 천연적으로 존재하지 않는다. 특정 숙주 세포에 이종인 DNA 분자는 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(예를 들어, 외인성 DNA)와 결합되면 숙주 세포 종(예를 들어, 내인성 DNA)으로부터 유도된 DNA를 함유할 수 있다. 예를 들어, 전사 프로모터를 포함하는 숙주 DNA 단편에 작동적으로 연결된 폴리펩티드를 암호화하는 비-숙주 DNA 단편을 함유하는 DNA 분자는 이종 DNA 분자로 여겨진다. 역으로, 이종 DNA 분자는 외인성 프로모터로 작동적으로 연결된 내인성 유전자를 포함할 수 있다. 다른 설명과 같이, 야생형 세포로부터 유도된 유전자를 포함하는 DNA 분자는 상기 DNA 분자가 야생형 유전자를 결핍하는 돌연변이 세포로 도입된다면, 이종 DNA인 것으로 여겨진다.
"폴리펩티드"는 천연적 또는 합성적으로 생산된 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 10 아미노산 잔기 이하의 폴리펩티드는 보통 "펩티드"로 나타낸다.
"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 고분자이다. 단백질은 또한 탄수화물 기와 같은 비-펩티드 성분을 포함할 수도 있다. 탄수화물 및 기타 비-펩티드 치환기가 세포에 의해 단백질로 첨가될 수도 있는데, 여기서 단백질이 생산되며, 세포의 유형에 의해 변화할 것이다. 단백질은 본원에서 그들의 아미노산 백본 구조에 관하여 정의되며; 탄수화물 기와 같은 치환기가 일반적으로 명시되지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수도 있다.
비-숙주 DNA 분자에 의해 암호화되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
"클로닝 벡터"는 숙주 세포 내에서 자발적으로 복제하는 능력을 지니는 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파지와 같은 핵산 분자이다. 클로닝 벡터는 전형적으로 벡터의 본질적인 생물학적 기능의 손실없이 확정할 수 있는 방식으로 핵산 분자의 삽입을 가능하게 하는 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인지 부위, 및 클로닝 벡터로 형질전환 된 세포의 동정 및 선택에 있어서 사용상 적합한 마커 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라시클린 내성 및 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
"발현 벡터"는 숙주 세포 내에서 발현된 유전자를 암호화하는 핵산 분자이다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 및 전사 종결자를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 제어 하에서 위치되고, 이러한 유전자는 프로모터"에 작동적으로 연결"되었다고 일컫는다. 이와 유사하게, 조절 요소 및 핵심 프로모터는 조절 요소가 핵심 프로모터의 활성을 조절하는 경우 작동적으로 연결된다.
"재조합 숙주"는 예를 들어 클로닝 벡터나 발현 벡터와 같은 이종 핵산 분자를 함유하는 세포이다. 본 문맥에서, 재조합 숙주의 예는 발현 벡터로부터 IL-22RA를 생산하는 세포이다. 반대로, IL-22RA는 IL-22RA의 "천연의 공급원"인 세포에 의해 생산될 수 있으며, 그것은 발현 벡터를 결핍한다.
"통합 형질전환체"는 재조합 숙주 세포이며, 이기서 이종 DNA가 세포의 게놈 DNA로 통합되었다.
"융합 단백질"은 적어도 2개 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현되는 잡종 단백질이다. 예를 들어, 융합 단백질은 친화성 매트릭스에 결합하는 폴리펩티드로 융합된 IL-22RA 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피를 사용하여 대량의 IL-22RA를 단리하기 위한 수단을 제공한다.
용어 "수용체"는 "리간드"라 불리는 생활성 분자에 결합하는 세포-관련 단백질을 의미한다. 이러한 상호작용은 세포 상 리간드의 영향을 중재한다. 수용체는 막결합이거나, 시토졸 또는 핵일 수 있으며; 단량체(예를 들어, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 베타-아드레날린 작용성 수용체) 또는 다량체(예를 들어, PDGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, IL-3 수용체, GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, 에리스로포이에틴 수용체 및 IL-6 수용체)일 수 있다. 막-결합 수용체는 그것이 전형적으로 신호적 형질전환에 연루되는 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 작동자 도메인을 포함하는 복한-도메인 구조를 특징으로 한다. 특정한 막-결합 수용체에서, 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 작동자 도메인은 완전한 기능적 수용체를 포함하는 분리된 폴리펩티드에 위치되어 있다.
일반적으로, 수용체에 대한 리간드의 결합은 수용체에서 형태상의 변화를 가져오는데, 이것은 작동자 도메인 및 세포 내 다른 분자(들) 간의 상호작용을 야기하며, 이것은 차례로 세포의 물질대사의 변경을 이끈다. 수용체-리간드 상호작용에 종종 연결된 대사 사건은 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 고리 AMP 생산, 세포 칼슘의 동원, 막지질의 동원, 세포 부착, 이노시톨 지질의 가수분해 및 인지질의 가수분해를 포함한다.
"가용성 수용체"는 세포막에 결합되지 않은 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 막투과 및 세포질 도메인, 및 예를 들어 글리코포스포이노시톨(gpi)을 통하여 세포막에 대한 다른 연결을 결핍하는 가장 일반적으로 리간드-결합 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 예를 들어, 폴리펩티드의 정제를 제공하거나 기질에 대한 폴리펩티드의 부착을 위한 자리를 제공하는 친화성 태그, 또는 면역글로불린 불변 영역 서열과 같은 추가적 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 많은 세포-표면 수용체는 단백질 가수분해에 의해 생산되거나 대안적으로 스플라이싱 된 mRNA로부터 번역된 천연 발생의 가용성 대응부를 가진다. 가용성 수용체는 일반적으로 9개 이상의 서브유닛을 포함하지 않고, 바람직하게는 6개 이상의 서브유닛을 포함하지 않으며, 가장 바람직하게는 3개 이상의 서브유닛을 포함하지 않는 다량체 수용체를 갖는 단량체, 동종이량체, 이종이량체, 또는 다량체일 수 있다. 수용체 폴리펩티드는 실질적으로 투과막 및 막에 각각 고정(ancohring) 또는 신호 도입을 제공하는 이들 분절의 충분한 일부를 결핍하고 있는 세포내 폴리펩티드 분절이 없는 것으로 말하여진다. 클래스 I 및 클래스 II 시토카인 수용체의 가용성 수용체는 일반적으로 막투과 도메인 및 세포 내 도메인이 없는 세포외 시토카인 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 대표적인 가용성 수용체는 서열 번호 44 및 서열 번호 45에서 나타내는 바와 같이 CRF2-4(a.k.a., IL-10RB)(젠뱅크 수탁 번호 제Z17227호)에 대한 가용성 수용체; 서열 번호 46에서 나타낸 바와 같은 IL-10RA(젠뱅크 수탁 번호 제U00672 및 NM_001558)에 대한 가용성 수용체; 서열 번호 47에서 나타낸 바와 같이 pDIRS1(a.k.a., IL-20RB)(젠뱅크 수탁 번호 제AY358305호)에 대한 가용성 수용체; 및 서열 번호 3에서 나타낸 바와 같은 IL-22RA(미국 특허 제5,965,704호)에 대한 가용성 수용체를 포함한다. 공지의 클래스 I 또는 클래스 II 시토카인 서열의 어떤 서열이 막투과 도메인 및 세포내 도메인이 없는 세포외 시토카인 결합 도메인을 포함하는 것을 묘사하는 것은 당업계 숙련자의 수준 내에 있다. 더욱이, 유전 코드를 사용하는 당업계 숙련자는 이러한 가용성 수용체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 용이하게 결정할 수 있다.
용어 "분비 신호 서열"은 대형 폴리펩티드의 구성성분으로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통하여 대형 폴리펩티드를 향하게 하는 펩티드("분비 펩티드")를 암호화하는 DNA 서열을 의미한다. 대형 폴리펩티드는 일반적으로 분비 경로를 통하는 통과 중에 분비 펩티드를 제거하도록 절단된다.
"단리 폴리펩티드"는 예를 들어 탄수화물, 지질, 또는 천연의 폴리펩티드와 관련된 기타 단백질성 불순물과 같은 오염성 세포 구성성분이 본질적으로 부재하는 폴리펩티드이다. 전형적으로, 단리 폴리펩티드의 제조는 고도로 정제된 형태, 즉, 적어도 약 80% 순도, 적어도 약 90% 순도, 적어도 약 95% 순도, 95% 이상의 순도로서, 예를 들어 96%, 97%, 또는 98% 이상의 순도와 같거나, 또는 99% 이상의 순도의 폴리펩티드를 포함한다. 단리 폴리펩티드를 포함하는 특정 단백질 제조는 단백질 제조의 나트륨 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 및 겔의 코마지 브릴리언트 블루 염색한 후 단일 띠의 출현에 의하는 한 방법을 나타낸다. 그러나, 용어 "단리"는 예를 들어 이량체 또는 택일적으로 글리코실화 또는 유도체화 형태와 같은 대안적인 물리적 형태의 동일한 폴리펩티드의 존재를 배제하지 않는다.
용어 "아미노-말단의" 및 "카르복실-말단의"는 본원에서 폴리펩티드 내 위치를 표시하는데 사용된다. 본 문맥은 이들 용어가 근접 또는 상대적 위치를 나타내는 폴리펩티드의 특정 서열이나 일부에 관하여 사용되는 것을 허용한다. 예를 들어, 폴리펩티드 내 기준 서열에 대하여 특정 서열 위치된 카르복실-말단은 상기 기준 서열의 카르복실 말단 근처에 위치하지만, 완전한 폴리펩티드의 카르복실 말단에서 필수적인 것은 아니다.
용어 "발현"은 유전자 생산의 생합성을 나타낸다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우에, 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다
본원에서 용어 "스플라이스 변이체"는 유전자로부터 형질전환 된 RNA의 대안적인 형태를 나타내는데 사용된다. 스플라이스 변이체는 전사된 RNA 분자 내, 또는 보다 덜 일반적으로 분리하여 형질전환 된 RNA 분자 사이의 대안적인 스플라이싱 자리의 사용을 통하여 천연적으로 발생하며, 동일한 유전자로부터 형질전환 된 몇개의 mRNA를 야기할 수도 있다. 스플라이스 변이체는 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 본원에서 용어 스플라이스 변이체는 또한 유전자로부터 형질전환된 mRNA의 스플라이스 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드를 나타내는데 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역조절자"는 시토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 공동-자극 분자, 조혈 인자 등, 및 이들 분자의 합성적 유사체를 포함한다.
용어 "상보성/안티-상보성 쌍"은 적절한 조건하에서 비-공유결합적으로 결합되고, 안정한 쌍을 형성하는 비-동일성 부분을 나타낸다. 예를 들어, 비오틴 및 아비딘(또는 스트텝타비딘)은 상보성/안티-상보성 쌍의 원형의 구성원이다. 다른 전형적인 상보성/안티-상보성 쌍은 수용체/리간드 쌍, 항체/항원(또는 헵텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍 등을 포함한다. 상보성/안티-상보성 쌍의 후속적 분해가 바람직한 경우, 상보성/안티-상보성 쌍이 바람직하게는 109M-1 이하의 친화성으로 결합을 가진다.
"안티-유전자형 항체"는 면역글로불린의 가변 영역 도메인과 결합하는 항체이다. 본 문맥에서, 안티-유전자형 항체는 항-IL-22RA 항체의 가변 영역과 결합하고, 따라서, 안티-유전자형 항체는 IL-22RA의 에피토프를 모방한다.
"항체 단편"은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab등과 같은 항체의 일부이다. 구조와 관계없이, 항체 단편은 손상되지 않은 항체에 의해 인지되는 동일한 항체와 결합한다. 예를 들어, 안티-IL-22RA 단일클론 항체 단편은 IL-22RA의 에피토프와 결합한다.
용어 "항체 단편"은 또한 예를 들어, 경쇄 가변 영역, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 경 및 중 가변 영역이 펩티드 링커("scFv 단백질")에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자, 및 고도가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인지 유닛으로 이루어진 폴리펩티드와 같은 특이적 항체에 결합하는 합성적 또는 유전학적으로 조작된 폴리펩티드를 포함한다.
"키메라 항체"는 설치류 항체로부터 유도된 가변 도메인 및 상보성 결정 영역을 함유하는 재조합 단백질인 반면, 상기 항체 분자의 나머지는 인간 항체로부터 유도된다.
"인간화 항체"는 재조합 단백질인데, 이때 단일클론 항체의 쥐과 상보성 결정 영역은 쥐과 면역글로불린의 중 및 경 가변 사슬로부터 인간 가변 도메인으로 전이되었다. 인간 단백질에 결합하거나 중화하는 바와 같이, 쥐과 항체로부터 유도된 사람의 치료적 사용을 위한 인간화 항체의 구성은 당업계의 기술내에 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료제"는 치료상 유용한 콘쥬게이트를 생산하기 위한 항체 부분으로 콘쥬게이션 되는 분자 또는 원자이다. 치료제의 예는 약물, 독소, 면역조절자, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 또는 염료 및 방사성 동위원소를 포함한다.
"검출가능 표지"는 진단상 유용한 분자를 생산하기 위해 항체 부분에 콘쥬게이션 될 수 있는 분자 또는 원자이다. 검출가능 표지의 예는 킬레이터, 광활성제, 방사성 동위원소, 형광성 제제, 상자성 이온, 또는 기타 마커 부분을 포함한다.
본원에서 용어 "친화성 태그"는 2차 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 위해 제공하거나 기질에 2차 폴리펩티드의 부착을 위한 자리를 제공하기 위해 2차 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 분절을 나타내는데 사용된다. 주요하게는, 항체 또는 다른 특이적 결합제가 이용가능한 어떤 펩티드 또는 단백질이 친화성 태그로서 사용될 수 있다. 친화성 태그는 폴리-히스티딘 관, 단백질 A(Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3 (1991), 글루타티온 S 전이효소(Smith and Johnson, Gene 67: 31 (1988)), Glu-Glu 친화성 태그(Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952(1985)), 기질 P, FLAG 펩티드(Hopp et al., Biotechnology 6: 1204 (1988)), 스트렙타비딘 결합 펩티드, 또는 기타 항원 에피토프 또는 결합 도메인을 포함한다. 일반적으로 문헌[Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95 (1991)]을 참조할 수 있다. 친화성 태그를 암호화하는 DNA 분자는 시판 구입 가능하다(예를 들어, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
"나출 항체"는 항체 단편에 대립되는 것으로서, 전체의 항체인데, 이것은 치료제와 함께 콘쥬게이션되지 않는다. 나출 항체는 키메라 및 인간화 항체와 같은 특정한 재조합 항체뿐 아니라, 폴리클론 및 단일클론 항체 모두를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 구성성분"은 전체 항체 및 항체 단편을 포함한다.
"면역콘쥬게이트"는 치료제 또는 검출가능 표지를 갖는 항체 구성성분의 콘쥬게이트이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 융합 단백질"은 항체 구성성분 및 IL-22RA 폴리펩티드 구성성분을 포함하는 재조합 분자를 나타낸다. 항체 융합 단백질의 예는 IL-22RA 세포외 도메인, 및 Fc 도메인 또는 항원-결합 영역을 포함하는 단백질을 포함한다.
"표적 폴리펩티드" 또는 "표적 펩티드"는 적어도 하나의 에피토프를 포함하고, 그것이 예를 들어 종양 세포, 또는 전염성 제제 항원을 함유하는 세포와 같은 표적 세포 상에서 발현되는 아미노산 서열이다. T 세포는 표적 폴리펩티드 또는 표적 펩티드에 주요한 조직적합성 복합체 분자에 의해 제시되는 펩티드 에피토프를 인지하며 전형적으로는 표적 세포를 용해하거나 표적 세포의 자리에 다른 면역 세포를 모음으로써, 표적 세포를 죽인다.
"항원 펩티드"는 주요한 조직적합성 복합체 분자에 결합하여 MHC-펩티드 복합체를 형성하고, 이것이 T 세포에 의해 인지되고, 그로써 T 세포에 대한 제시에 대하여 세포독성 림프구 반응을 유도하는 펩티드이다. 따라서, 항원 펩티드는 적절한 주요 조직적합성 복합체 분자에 결합하고 예를 들어 항원에 결합하거나 발현하는 표적 세포에 대하여 세포 용해 또는 특이적 시토카인 방출과 같은 세포독성 T 세포를 유도할 수 있다. 항원 펩티드는 항원 제시 세포 또는 표적 세포 상에서 클래스 I 또는 클래스 II 주요 조직적합성 복합체 분자의 문맥에서 결합될 수 있다.
진핵생물에서, RNA 폴리머라제 II는 mRNA를 생산하기 위한 구조 유전자의 전사를 촉매한다. 핵산 분자는 RNA 폴리머라제 II 주형을 함유하도록 명시될 수 있는데, 이때 RNA 전사를 "안티-센스 RNA"라 칭하고 안티-센스 RNA를 암호화하는 핵산 분자를 "안티-센스 유전자"라 칭한다. 안티-센스 RNA 분자는 mRNA 분자에 결합하여, mRNA 전사의 억제를 야기할 수 있다.
"IL-22RA에 대하여 특이적인 안티-센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "IL-22RA 안티-센스 올리고뉴클레오티드"는 (a)IL-22RA 유전자의 일부와 함께 안정한 트리플렉스를 형성할 수 있거나, 또는 (b)IL-22RA 유전자의 mRNA 전사의 일부와 함께 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이다.
"리보자임"은 촉매 센터를 함유하는 핵산 분자이다. 상기 용어는 RNA 효소, 자기-스플라이싱 RNA, 자기-절단 RNA, 및 이들 촉매 작용을 수행하는 핵산 분자를 포함한다. 리보자임을 암호화하는 핵산 분자를 "리보자임 유전자"라 칭한다.
"외부 가이드 서열"은 세포내 mRNA의 특정 종에 대하여 내인성 리보자임, RNase P를 향하게 하여, RNase P에 의해 mRNA의 절단을 야기하는 핵산 분자이다. 회부 가이드 서열을 암호화하는 핵산 분자를 "외부 가이드 서열 유전자"라 칭한다.
용어 "변이체 IL-22RA 유전자"는 서열 번호 3의 변형이 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 나타낸다. 이러한 변이체는 IL-22RA 유전자의 천연-발생 다형성(polymorphism) 및 서열 번호 3의 아미노산 서열의 보존적 아미노산 치호나을 함유하는 합성적 유전자를 포함한다. IL-22RA 유전자의 추가적 변이체 형태는 본원에서 설명된 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 결실을 함유하는 핵산 분자이다. 변이체 IL-22RA 유전자는 예를 들어, 엄격한 조건 하에서, 유전자가 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 보체를 갖는 핵산 분자와 잡종화하는지 여부를 결정함으로써 동정될 수 있다.
대안적으로, 변이체 IL-22RA 유전자는 서열 비교에 의해 동정될 수 있다. 2개의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 최대 대응물에 관하여 배열되는 경우 동일하다면 "100% 아미노산 서열 동일성"을 가진다. 유사하게는, 2개의 뉴클레오티드 서열은 만일 2개의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 잔기가 최대 대응물에 대하여 배열되는 경우 동일하다면 "100% 뉴클레오티드 서열 동일성"을 가진다. 서열 비교는 예를 들어 LASERGENE 바이오인포매틱스 컴퓨팅 슈트에서 포함되는 바와 같은 표준 소프트웨어 프로그램으로서, DNASTAR(Madison, Wisconsin)에 의해 생산되는 것을 사용하여 수행할 수 있다. 최적의 배열을 결정함에 의하여 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하는 다른 방법은 당업계 숙련자에게 주지되어 있다(예를 들어, Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al.(eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins," in Methods in Gene Biotechnology, pages 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), and Bishop(ed.), Guide to Human Genome Computing, 2nd Edition (Academic Press, Inc. 1998)). 서열 동일성을 결정하기 위한 특정한 방법이 하기에 설명되어 있다.
변이체 IL-22RA 유전자 또는 변이체 IL-22RA 폴리펩티드를 동정하기 위해 사용되는 특정 방법에도 관계없이, 변이체 유전자 또는 변이체 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드는 항-IL-22RA 항체에 특이적으로 결합하는 능력을 기능상 특징으로 할 수도 있다. 변이체 IL-22RA 유전자 또는 변이체 IL-22RA 폴리펩티드는 또한 본원에서 설명되는 생물학적 또는 생화학적 분석법을 사용하여, 그것의 리간드, IL-22에 결합하는 능력을 기능상 특징으로 할 수도 있다.
본원에서 용어 "대립성 변이체"는 동일한 염색체 좌를 차지하는 유전자의 임의의 둘 이상의 대안적 형태를 나타내는데 사용된다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 천연적으로 발생하고, 개체 내에서 표현형 다형성을 야기할 수도 있다. 유전자 돌연변이는 침묵(암호화된 폴리펩티드의 불변)일 수 있거나 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수도 있다. 본원에서 용어 대립성 변이체는 또한 유전자의 대립성 변이체에 의해 암호화되는 단백질을 나타내는 데 사용된다.
용어 "오르토로그 (ortholog)" 는 상이한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적인 대응부분인 한 종으로부터 얻어지는 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. 오르토로그들 중의 서열의 차이는 종 분화의 결과이다.
"파라로그 (paralog)" 는 유기체에 의해 만들어진 다르지만 구조적으로는 관련된 단백질들이다. 파라로그는 유전자 복제를 통하여 발생하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, α-글로빈, β-글로빈, 및 미오글로빈은 상호간의 파라로그이다.
본 발명은 IL-22RA 유전자의 기능상 단편을 포함한다. 본 발명의 문맥에서, IL-22RA 유전자의 "기능상 단편"은 본원에서 설명된 도메인인 IL-22RA 폴리펩티드의 일부를 암호화하거나 항-IL-22RA 항체와 적어도 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 나타낸다.
표준 분석법의 부정확성으로 인하여, 폴리머의 분자량 및 분자 길이는 대략적 수치로 이해된다. 이러한 수치가 "약" X 또는 "어림잡아" X로서 표현되는 경우, X의 표준값은 ±10%까지 정확한 것으로 이해될 것이다.
3. IL-22RA 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 제조
인간 IL-22RA 유전자를 암호화하는 핵산 분자는 서열 번호 1을 기초로 하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 인간 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이들 기술은 표진 기술이며 확고히 성립되어 있으며, 상업상 공급장에 의해 이용가능한 클로닝 키트를 사용하여 완성될 수도 있아. 예를 들어, 문헌[Ausubel et al. (eds. ), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons 1995; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv and Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69 : 1408 (1972); Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11", in DNA Cloning: A Practical Approach Vol. I, Glover(ed.), page 49(IRL Press, 1985); Wu(1997) at pages 47-52]를 참조하시오.
인간 IL-22RA 유전자를 암호화하는 핵산 분자는 또한 IL-22RA 유전자 또는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 기초로 한 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 얻어질 수 있다. PCR을 이용하여 라이브러리를 스크리닝하는 일반적인 방법은 예를 들어, 문헌[Yu et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries," in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White(ed.), Humana Press, Inc.,1993]에 의해 제공되어 있다. 더욱이, 관련 유전자를 단리하기 위해 PCR을 사용하는 기술은 예를 들어, 문헌[Preston, "Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members," in Methods in Molecular Biology, Vol.15: PCR Protocols: Currenet Methods and Applications, White(ed.), Human Press, Inc.1993]에 의해 설명되어 있다. 대안으로서, IL-22RA 유전자는 긴 올리고뉴클레오티드 및 본원에서 설명된 뉴클레오티드 서열을 상호간 프라이밍하는 것을 사용하여 핵산 분자를 합성함으로써 얻어질 수 있다(예를 들어, Ausubel(1995) 참조). 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하는 확립된 기술은 길이가 적어도 2 킬로베이스인 DNA 분자를 합성하는 능력을 제공한다(Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131(1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266(1993), Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White(ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), and Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4: 299(1995)). 폴리뉴클리오티드 합성의 개관을 위해, 예를 들어, 문헌[Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA(ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323(1984), and Climie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 633(1990)]을 참조하시오.
4. IL-22RA 유전자 변이체의 제조
본 발명은 DNA 및 RNA 분자를 포함하는 각종 핵산 분자를 제공하는데, 이것은 본원에서 개시된 IL-22RA 폴리펩티드를 암호화한다. 당업계 숙련자는 유전적 코드의 축퇴의 관점에서, 상당한 서열 변이가 이들 폴리뉴클레오티드 분자들 사이에서 가능함을 용이하게 인지할 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한, 서열 번호 3의 수용체 폴리펩티드에 사실상 동종인 적어도 하나의 IL-22RA 수용체 서브유닛을 포함하는 단리된 가용성 단량체, 동종이량체, 이종이량체 및 다량체 수용체 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 본 발명은 서열 번호 1의 축퇴성 뉴클레오티드, 및 그들의 RNA 상당물을 포함하는 IL-22RA 폴리펩티드-암호화 핵산 분자를 고려한다.
표 1은 축퇴성 뉴클레오티드 위치를 나타내는 1-문자 코드를 제시한다. "분해능(resolution)"은 하나의 코드 문자에 의해 나타낸 뉴클레오티드이다. "보체"는 상보성 뉴클레오티드(들)에 관한 코드를 나타낸다. 예를 들어, 코드 Y는 C 또는 T를 나타내고, 그것의 보체 R은 A 또는 G 를 나타내는데, A는 T에 대하여 상보적이고, G는 C에 대하여 상보적이다.
[표 1]
Figure pat00001
주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함하는 축퇴성 코돈이 표 2에서 제시되어 있다.
[표 2]
Figure pat00002
당업자는 얼마간의 모호성이 아미노산을 암호화하는 모든 가능한 코돈을 대표하는 축퇴성 코돈을 결정함에 있어서 도입되는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 세린(WSN)에 대한 축퇴성 코돈은 어떤 상황에 있어서, 아르기닌(AGR)을 암호화하고, 아르기닌(MGN)에 대한 축퇴성 코돈은 어떤 상황에 있어서, 세린(AGY)를 암호화한다. 유사한 관계가 포닐알라닌 및 류신을 암호화하는 코돈간에 존재한다. 따라서, 축퇴성 서열에 포함되는 어떤 폴리뉴클레오티드는 변이체 아미노산 서열을 암호화할 수도 있지만, 당업자는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 참고로 하여 이러한 변이체 서열을 용이하게 동정할 수 있다. 변이체 서열은 본원에서 설명된 바와 같이 기능성을 위해 용이하게 테스트될 수 있다.
상이한 종은 "우위적 코돈 사용"을 제시할 수 있다. 일반적으로 문헌[Grantham et al., Nucl. Acids Res.8: 1893 (1980), Haas et al. Curr. Biol. 6: 315 (1996), Wain-Hobson etal., Gene 13: 355 (1981), Grosjean and Fiers, Gene 18: 199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573 (1982), Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 851 (1994), Kane, Curr. Opina. Biotechnol. 6: 494 (1995), and Makrides, Microbiol. Rev. 60: 512(1996)]을 참조하시오. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "우위적 코돈 사용" 또는 "우위적 코돈"은 특정 종의 세포에서 매우 빈번히 사용되는 단백질 번역 코돈을 나타내는 기술 용어이며, 따라서 각각의 아미노산을 암호화하는 가능한 하나 또는 몇몇의 코돈의 전형들이 유리하다. 예를 들어, 아미노산 트레오닌(Thr)은 ACA, ACC, ACG, 또는 ACT에 의해 암호화될 수도 있지만, 포유동물 세포에서 ACC는 가장 일반적으로 사용되는 코돈이며; 다른 종, 예를 들어, 곤충 세포, 효모, 세균 또는 박테리아에서, 다른 Thr 코돈이 우위적일 수도 있다. 특정 종에 대하여 우위적인 코돈은 당업계 공지된 각종 방법에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 도입될 수 있다. 재조합 DNA로의 우위적 코돈 서열의 도입은 예를 들어, 특정 세포 유형 또는 종에서 보다 효과적인 단백질 번역을 이룸으로써 단백질의 제조를 향상시킬 수 있다. 그러므로, 본원에서 개시된 축퇴성 코돈 서열은 업계에서 일반적으로 사용되고 본원에서 개시된 각종 세포 유형 및 종의 폴리뉴클레오티드의 발현을 최적화하기 위한 주형으로서 작용한다. 우위적 코돈을 함유하는 서열은 각종 종에서 발현을 위해 테스트되고 최적화될 수 있으며, 본원에서 개시된 바와 같은 기능성을 위해 테스트될 수 있다.
IL-22RA-암호화 cDNA는 예를 들어, 완전한 또는 부분의 인간 cDNA를 갖거나 개시된 서열을 기초로 하여 하나 이상의 축퇴성 프로브의 세트를 갖는 프로빙에 의함과 같이, 각종 방법을 이용하여 단리될 수 있다. cDNA는 또한 본원에서 개시된 대표적인 인간 IL-22RA 서열로부터 설계된 프라이머를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 클로닝시킬 수 있다. 또한, cDNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있으며, 관심있는 cDNA의 발현은 IL-22RA 폴리펩티드에 대한 항체를 이용하여 검출될 수 있다.
당업계 숙련자는 서열 번호 1에서 개시된 서열이 단일 대립형질의 인간 IL-22RA를 나타내고, 그 대립형질 변이 및 대안적인 스플라이싱이 발생하는 것임을 인지할 것이다. 이 서열의 대립성 변이체는 표준 방법에 따라서 상이한 개체로부터의 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙함으로써 클로닝할 수 있다. 침묵 돌연변이를 함유하는 변이체 및 돌연변이가 아미노산 서열의 변화를 야기하는 변이체를 포함하는, 본원에서 개시된 뉴클레오티드 서열의 대립성 변이체는 본 발명의 범주 내에 있으며, 본원에서 개시된 아미노산 서열의 대립성 변이체인 단백질과 같다. cDNA 분자는 대안적으로 스플라이싱된 mRNA로부터 생성되는데, 이것은 IL-22RA 폴리펩티드의 특성을 보유하는, 선택적으로 스플라이싱 된 mRNA로부터 생성된 cDNA 분자가 본 발명의 범주 내에 포함되며, 이러한 cDNA 및 mRNA에 의해 암호화된 폴리펩티드와 같다. 이들 서열의 대립성 변이체 및 스플라이스 변이체는 당업계 공지된 표준 과정에 따라서 상이한 개체 또는 조직으로부터 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙함으로써 클로닝 될 수 있다.
상기 논의되는 방법을 이용하여, 당업계 숙련자는 서열 번호 1에 실질적으로 동종인 가용성 IL-22RA 수용체 서브유닛을 포함하거나, 또는 서열 번호 3의 아미노산, 또는 그것의 대립성 변이체를 암호화하고 야생형 IL-22RA 수용체의 리간드-결합 특성을 보유하는 각종 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 또한 본원에서 일반적으로 개시된 바와 같이 추가적 폴리펩티드 분절을 포함할 수도 있다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 단리 핵산 분자는 엄격한 조건 하에서 본원에서 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 대하여 잡종화 할 수 있다. 예를 들어, 이러한 핵산 분자는 엄격한 조건 하에서 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 대하여, 또는 서열 번호 1, 또는 그것의 단편에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 대하여 잡종화 할 수 있다.
일반적으로, 엄격한 조건은 한정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열적 융해 온도(Tm)보다 더 낮은 약 5℃이도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 매칭된 프로브에 대하여 잡종화하는 온도(한정된 이온 강도 및 pH아래서)이다. 잡종화 이후, 핵산 분자를 비-잡종화 핵산 분자를 엄격한 조건, 또는 매우 엄격한 조건 하에서 제거시키기 위해 세척할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); and Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26: 227 (1990))]를 참조하시오. 예를 들어, OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) 및 Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA)과 같은 서열 분석 소프트웨어, 및 인터넷 상 사이트가 주어진 서열을 분석하고 사용자-한정 기준을 기초로 하여 Tm을 계산하기 위한 수단이 이용가능하다. 특정한 폴리뉴클레오티드 잡종을 이용하는 사용을 위한 개조잡종화(adapthybridization) 및 세척 조건에 대하여 당업계 숙련자의 범위 내이다.
본 발명은 또한 서열 번호 3의 폴리펩티드, 또는 그들의 오르토로그에 대하여 실질적으로 유사한 서열을 갖는 단리 IL-22RA 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서 용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 서열 번호 3에서 나타낸 서열, 또는 그들의 오르토로그에 대하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 예를 들어 96%, 97%, 98%와 같은 적어도 95%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 나타내는데 사용된다. 예를 들어, 변이체 및 오르토로그 IL-22RA 수용체는 면역 반응을 발생시키고 인간 IL-22RA에 대하여 상호-반응성 항체를 불러일으키는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 인간화되고, 본원에서 설명되는 바와 같이 변형될 수 있으며, 건선, 건선 관절염, IBD, 대장염, 내독소혈증을 치료하기 위해 치료적으로, 및 본원에서 설명된 기타 치료적 적용에 있어서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 2가지 기준을 사용하여 동정될 수 있는 IL-22RA 변이체 핵산 분자를 고려한다: 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 암호화된 폴리펩티드 간의 유사성의 결정, 및 잡종화 분석법. 이러한 IL-22RA 변이체는 (1)엄격한 세척 조건 하에서 서열 번호 1(또는 그것의 보체)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 이용하는 잡종화를 유지하고, 이때 세척 조건은 55-65℃에서 0.1% SDS를 포함하는 0.5x - 2x SSC에 상당하며, (2)서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99%와 같이 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함한다. 대안적으로, IL-22RA 변이체는 (1)매우 엄격한 세척 조건 하에서 서열 번호 1(또는 그것의 보체)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산분자를 이용하는 혼성화를 유지하는데, 이때 세척 조건은 50-65℃에서 0.1% SDS를 포함하는 0.1x - 0.2x SSC에 상당하며, (2) 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상과 같이 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자로서 특징을 가질 수 있다.
서열 동일성%는 전통적인 방법에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌[Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603(1986), and Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915(1992)]을 참조하시오. 간단히 말해, 2개의 아미노산 서열이 10의 갭 오프닝 패널티, 1의 갭 연장 패널티를 사용하는 배열 스코어, 및 표 3(아미노산은 표준 1-문자 코드에 의해 나타냄)에서 나타내는 바와 같이 Henikoff and Henikoff(ibid.)의 "BLOSUM62" 스코어링 매트릭스를 최적화하기 위해 배열된다. 그 후 동일성%는 ([동일한 짝의 총 수]/[더 긴 서열의 길이 +2개의 서열을 배열하기 위해 더 긴 서열로 도입된 갭의 수])(100)으로서 계산된다.
[표 3]
Figure pat00003
당업계 숙련자는 2개의 아미노산 서열을 배열하는데 이용가능한 많은 확립된 알고리즘이 있음을 인식한다. Pearson 및 Lipman의 "FASTA" 유사성 탐색 알고리즘은 본원에서 개시된 아미노산 서열 및 추정상의 IL-22RA의 아미노산 서열에 의해 공유된 동일성의 수준을 조사하기 위한 적합한 단백질 배열 방법이다. FASTA 알고리즘은 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), and by Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63(1990)]에 의해 설명된다. 간단히 말해, FASTA는 우선 의문의 서열(예를 들어, 서열 번호 2 또는 서열 번호 3) 및 가장 높은 밀도의 동일성(만일 ktup 변수가 1이라면) 또는 동일성의 쌍(만일 ktup=2)을 갖는 테스트 서열에 의해 공유되는 영역을 동정함으로써 서열 유사성을 특징짓는데, 이때 보존적 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실을 고려하지 않는다. 이어서 가장 높은 밀도의 동일성을 갖는 10개의 영역은 아미노산 치환 매트릭스를 사용하여 모든 짝지어진 아미노산의 동일성을 비교함으로써 다시 스코어링되고, 상기 영역의 말단은 가장 높은 스코어에 도움이 되는 유일한 그들 잔기를 포함하기 위해 "정돈"된다. "컷오프" 값(서열의 길이 및 ktup 값을 기초로 한 미리 결정된 공식에 의해 계산됨 )보다 더 큰 스코어를 갖는 몇몇 영역이 존재한다면, 그 후 정돈된 개시 영역은 상기 영역이 결합되어 캡을 포함하는 어림의 배열을 형성할 수 있는지 여부를 결정하도록 조사된다. 최종적으로, 2개의 아미노산 서열의 가장 높은 스코어링 영역은 니들만-운치-셀러 알고리즘(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26 : 787 (1974))의 변형을 사용하여 배열되는데, 이것은 아미노산 삽입 및 결실을 허용한다. FASTA 분석에 대한 실례가 되는 파라미터는 ktup=1, 갭 오프닝 패널티=10, 갭 연장 패널티=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62이다. 이들 파라미터는 [Appendix 2 of Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63(1990)]에서 설명되는 바와 같이, 스코어링 매트릭스 파일("SMATRIX")를 변형시킴으로써 FASTA 프로그램으로 도입될 수 있다.
FASTA는 또한 상기 개시된 비율을 사용하여 핵산 분자의 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 비교를 위해, ktup 값은 상기 설명된 바와 같이 다른 파라미터 세트와 함께, 1 내지 6, 바람직하게는 3 내지 6, 가장 바람직하게는 3으로 다양할 수 있다.
본 발명은 본원에서 개시된 아미노산 서열과 비교하여, 보존적 아미노산 변화를 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들어, 변이체가 얻어질 수 있는데, 이것은 서열 번호 3의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하고, 이때 알킬 아미노산은 IL-22RA 아미노산 서열에서 알킬 아미노산에 대하여 치환되거나, 방향족 아미노산IL-22RA 아미노산 서열에서 방향족 아미노산에 대하여 치환되거나, 황-함유 아미노산이 IL-22RA 아미노산 서열에서 황-함유 아미노산에 대하여 치환되거나, 히드록시-함유 아미노산이 IL-22RA 아미노산 서열에서 히드록시-함유 아미노산에 대하여 치환되거나, 산성 아미노산이 IL-22RA 아미노산 서열에서 산성 아미노산에 대하여 치환되거나, 염기성 아미노산이 IL-22RA 아미노산에서 염기성 아미노산에 대하여 치환되거나, 또는 2염기성 모노카르복시 아미노산이 IL-22RA 아미노산 서열에서 2염기성 모노카르복시 아미노산에 대하여 치환된다. 공통의 아미노산 중에서, 예를 들어, "보존적 아미노산 치환"이 하기 군 각각에서 아미노산 사이의 치환에 의해 예시된다:(1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘. BLOSUM62 표는 500 군 이상의 관련 단백질의 고도로 보존된 영역을 대표하는, 단백질 서열 분절의 약 2,000 국소 복합 배열로부터 유도된 아미노산 치환 매트릭스이다. 따라서, BLOSUM62 치환 빈도는 본 발명의 아미노산 서열로 도입될 수 있는 보존적 아미노산 치환을 한정하는데 사용될 수 있다. 단지 화학적 특성(상기 논의되는 바와 같이)을 기초로 한 아미노산 치환을 설계하는 것이 가능할지라도, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 바람직하게는 -1 이상의 BLOSUM62 값에 의해 대표되는 치환을 나타낸다. 예를 들어, 아미노산 치환은 치환이 0, 1, 2, 또는 3의 BLOUSUM62 값을 특징으로 한다면 보존적이다. 이 시스템에 따라서, 바람직한 보존적 아미노산 치환은 적어도 1(예를 들어, 1, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 하는 반면, 보다 바람직한 보존적 아미노산 치환은 적어도 2(예를 들어, 2 또는 3)의 BLOUSUM62 값을 특징으로 한다. IL-22RA의 특정 변이체는 대응 아미노산 서열(예를 들어, 서열 번호 3)에 대하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99%와 같은 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는데, 이때 아미노산 서열의 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 기인한다.
IL-22RA 유전자에서 보존적 아미노산 변화가 도입될 수 있는데, 예를 들어, 서열 번호 1에 열거된 뉴클레오티드에 대하여 뉴클레오티드를 치환함에 의한다. 이러한 "보존적 아미노산" 변이체는 올리고뉴클레오티드-표적된 돌연변이유발, 링커-스캐닝 돌연변이유발, 폴리머라제 연쇄 반응 등을 사용하는 돌연변이유발에 의해 얻어질 수 있다(Ausubel (1995); and McPherson (ed.), Directed Mutagenesis:A Practical Approach (IRL Press 1991)). 변이체 IL-22RA 폴리펩티드는 항-IL-22RA 항체에 특이적으로 결합하는 능력에 의해 동정될 수 잇다.
본 발명의 단백질은 또한 비-천연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 비-천연 발생 아미노산은 제한없이, trans-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, cis-4-히드록시프롤린, trans-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, allo-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸호모시스테인, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복시산, 데히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, tert-류신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다. 비-천연 발생 아미노산 잔기를 단백질로 통합하기 위한 몇가지 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 시험관 내 시스템이 이용될 수 있는데, 이때 무의미 돌연변이는 화학적으로 아미노아실화 된 억제자 tRNA를 사용하여 억제된다. 아미노산 및 아미노아실화 tRNA를 합성하기 위한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 무의미 돌연변이를 함유하는 플라스미드의 전사 및 번역은 전형적으로 E. Coli S30 추출물 및 상업적으로 이용가능한 효소 및 기타 시약을 포함하는 세포-부재 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예를 들어, 문헌[Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol.202: 301 (1991), Chung et al., Science 259: 806 (1993), and Chung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 10145(1993)]을 참조하시오.
두번째 방법에서, 번역은 돌연변이 된 mRNA 및 화학적으로 아미노아실화 된 억제자 tRNA의 마이크로주입에 의해 제노푸스(Xenopus) 난모세포에서 수행한다(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991 (1996)). 세번째 방법에서, E. Coli 세포를 치환되는 천연 아미노산의 부재하에서(예를 들어, 페닐알라닌) 그리고 비-천연 발생 아미노산(들)(예를 들어, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재 하에서 배양시킨다. 비-천연 발생 아미노산은 그것의 천연 대응물의 위치에서 단백질로 통합된다. 문헌[Koide et al., Biochem. 33: 7470 (1994)]을 참조하시오. 천연 발생 아미노산 잔기는 시험관 내 화학적 변형에 의해 비-천연 발생 종으로 변경될 수 있다. 화학적 변형은 치환의 범위를 더 확장하기 위해 부위-표적된 돌연변이유발과 함께 결합될 수 있다(Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395 (1993)).
제한된 수의 비-보존적 아미노산, 유전적 코드에 의해 암호화되지 않은 아미노산, 비-천연 발생 아미노산, 및 자연법칙에 어긋나는(unnatural) 아미노산이 IL-22RA 아미노산 잔기에 대하여 치환될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드에서 본질적인 아미노산은 예를 들어, 부위-표적된 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발과 같은, 당업계 공지된 방법에 따라서 동정도리 수 있다(Cunningham and Wells, Science 244: 1081(1989), Bass et al., Proc.Nat'l Acad. Sci. USA88:4498(1991), Coombs and Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering," in Proteins: Analysis and Design, Angeletti(ed.), pages 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). 후자의 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이는 분자의 모든 잔기에 도입되고, 결과의 돌연변이 분자는 분자의 활성에 있어서 중요한 아미노산 잔기를 동정하기 위해 생물학적 활성에 관하여 테스트된다. 또한, 문헌[Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699 (1996)]를 참조하시오.
서열 분석법은 IL-22RA 리간드 결합 영역을 더 한정하는데 사용될 수 있으나, IL-22RA 결합 활성(예를 들어 리간드 IL-22, 또는 항-IL-22RA 항체에 대한 IL-22RA의 결합과 같은 것)에서 역할을 하는 아미노산은 또한 추정의 접촉 자리 아미노산의 돌연변이와 결합하여, 핵자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 라벨링과 같은 기술에 의해 결정되는 바와 같이, 구조의 물리적 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[de Vos et al., Science 255: 306 (1992), Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899 (1992),and Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59 (1992)]을 참조하시오.
복합 아미노산 치환은 예를 들어, [Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53 (1988)) or Bowie and Sauer(Proc.Nat'l Acad. Sci. USA86: 2152 (1989))]에 의해 개시되는 바와 같이, 공지의 방법인 돌연변이유발 및 스크리닝을 사용하여 이루어지고 테스트될 수 있다. 요약하면, 이들 저자들은 폴리펩티드의 2개 이상의 위치에서 동시에 무작위화하는 방법, 기능적 폴리펩티드에 대하여 선택하는 방법, 및 이어서 각 위치에서 허용가능한 치환기의 스펙트럼을 결정하기 위해 돌연변이화 폴리펩티드를 서열화하는 방법을 개시한다. 사용될 수 있는 다른 방법은 파지 디스플레이를 포함한다(예를 들어, Lowman et al., Biochem. 30: 10832 (1991), Ladner et al.,미국 특허 제5,223,409호, Huse, 국제 공개공보 제 WO92/06204호, 및 region-directed mutagenesis (Derbyshire et al., Gene 46: 145 (1986) 및 Ner et al., DNA 7: 127, (1988)). 더욱이, 비오틴이나 FITC로 표지된 IL-22RA가 IL-22RA 리간드의 발현 클로닝을 위해 사용될 수 있다.
개시된 IL-22RA 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 변이체는 또한 [Stemmer, Nature 370: 389 (1994), Stemmer, Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994), 및 국제 공개공보 WO97/20078호]에 의해 개시된 바와 같은 DNA 셔플링을 통해 생성될 수 있다. 요약하면, 변이체 DNA 분자는 모체 DNA의 무작위 단편화 한 후 무작위로 도입된 점 돌연변이를 야기하는 PCR을 다시모아서 사용함으로써 시험관 내 동종 재조합에 의해 생성된다. 이 기술은 예를 들어, 상이한 종으로부터의 대립성 변이체나 DNA 분자와 같은 모체 DNA 분자의 패밀리를 사용하여 변형시켜서, 과정에 있어서 추가적 변이성을 도입할수 있다. 원하는 활성을 위한 선별 또는 스크리닝 후 돌연변이의 추가적 반복 및 분석은 바람직한 돌연변이를 위해 선별함으로써 서열의 신속한 "진화"를 제공하는 반면에 동시에 해로운 변화에 대하여 선별한다.
본원에서 개시된 바와 같은 돌연변이유발 방법은 숙주 세포에서 클로닝 되고, 돌연변이 된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위한 고-작업처리량, 자동화 스크리닝 방법과 결합될 수 있다. 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이화 DNA 분자, 또는 항-IL-22RA 항체와 결합하는 폴리펩티드는 숙주 세포로부터 제거될 수 있으며 현대적 장비를 사용하여 신속하게 시퀸싱될 수 잇다. 이들 방법은 관심있는 폴리펩티드의 개개의 아미노산 잔기의 중요성의 신속한 결정을 허용하고, 알려지지 않은 구조의 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 IL-22RA 폴리펩티드의 "기능적 단편" 및 이러한 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 핵산 분자의 관례적인 검출 분석법은 IL-22RA 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 기능상 단편을 얻도록 수행될 수 있다. 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 분자는 일련의 온상의(nested) 결실을 얻기 위해 Bal31 뉴클레아제와 함께 소화될 수 있다. 이어서 단편을 적절한 리딩 프레임의 발현 벡터로 삽입시키고, 발현된 폴리펩티드를 항-IL-22RA 항체와 결합하는 능력을 위해 단리시키고 테스트시킨다. 엑소뉴클레아제 소화에 대한 하나의 대안은 올리고뉴클레오티드-표적된 돌연변이유발을 사용하여 원하는 단편의 제조를 구체화 하기 위해 결실 또는 정지 코돈을 도입하는 것이다. 대안적으로, IL-22RA 유전자의 특정 단편은 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 합성될 수 있다.
인터페론의 말단 중 하나 또는 둘 모두에서 절단의 연구에 의해 예증되는 이러한 일반적 접근법은 문헌[Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66: 507(1995)]에 의해 요약되었다. 더욱이, 단백질의 기능상 분석을 위한 표준 기술은 예를 들어, 문헌[Treuter etal., Molec. Gen. Genet. 240 113 (1993), Content et al.,"Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon,"in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon. Systems, Cantell (ed. ), pages 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, "The EGF Receptor, "in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) pages 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270: 25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995), and Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30: 1 (1996)]에 의해 설명되어 있다.
본원에서 개시된 특정 서열의 분석법은 표 4에서 제시된 일련의 예증적인 기능상 단편을 제공한다. 본원에서 개시되나, 표 4에서 도시하지 않은 뉴클레오티드 암호화 추가 인간 IL-22RA 기능상 변이체 도메인은 서열 번호 1과 관련하여 결정될 수 있다. 이러한 기능상 단편은 예를 들어, 각각 서열 번호 1의 하기 뉴클레오티드 서열: 서열 번호 1의 뉴클레오티드 85-381, 206-717, 및 85-717 및 서열 번호 2 및 서열 번호 3에서 나타낸 바와 같이 그에 의해 암호화되는 대응 아미노산 서열을 포함한다.
[표 4]
Figure pat00004
본원 발명은 또한 본원에 개시된 아미노산 서열과 비교하였을 때, 아미노산 변형를 갖는 IL-22RA 유전자의 기능적 단편을 포함한다. 변이체 IL-22RA 유전자는 상기에 논의된 바와 같이, 개시된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 이용하여 동일성 수준을 결정하는 것에 의해서 구조에 기초하여 동정될 수 있다. 구조에 기초하여 변이체 유전자를 동정하는 다른 방법은 유효한 변이체 IL-22RA 유전자를 암호화하는 핵산 분자가 서열 번호 1과 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화할 수 있는지를 결정하는 것이다.
본원 발명은 또한 IL-22RA 폴리펩티드의 기능적 단편, 항원성 에피토프, IL-22RA 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분 및 이러한 기능적 단편, 항원성 에피토프, IL-22RA 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분을 암호화하는 핵산 분자의 사용을 포함한다. 이러한 단편은 IL-22 또는 IL-20 및 IL-22 모두에 결합하여, 이들의 활성을 차단, 저해, 감소, 길항작용 또는 중화시키는 항체 및 결합 파트너의 생성에 사용하기 위한 폴리펩티드를 생성하는데 사용된다. 본원에 정의된 "기능적" IL-22RA 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 IL-20 또는 IL-22의 염증, 증식 또는 분화 활성을 차단, 저해, 감소, 길항작용 또는 중화하는 능력, 분화된 세포 기능을 감소 또는 저해하는 능력, 또는 항-IL-22RA 항체, 세포, IL-20 또는 IL-22에 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 한다. 앞서 기재된 바와 같이, IL-22RA는 본원에 개시된 클래스 II 시토카인 수용체 구조 및 도메인을 특징으로 한다. 따라서, 본원 발명은 (a) 상기에 기재된 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자; 및 (b) 하나 이상의 도메인을 포함하는 기능적 단편을 포함하는 융합 단백질을 사용하는 것을 더 포함한다. 융합 단백질의 다른 폴리펩티드 부분은 또 다른 클래스 II 시토카인 수용체(IL-10R, IL-13R, IL-20RA, IL-20RB, IL-10RB(CRF2-4), LL-22RA2), 또는 융합 단백질의 분비를 촉진하는 비-천연 및/또는 비-관련 분비 신호 펩티드에 의해서 제공될 수 있다.
본원 발명은 또한 본원에 기재된 IL-22RA 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분을 포함하는 폴리펩티드 단편 또는 펩티드를 제공한다. 이러한 단편 또는 펩티드는 전체 단백질이 면역원으로 사용될 때 항체 반응을 유발하는 단백질의 일부에 해당하는 "면역원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 면역원성 에피토프-함유 펩티드는 표준 방법을 사용하여 동정될 수 있다(예를 들어, Geysen 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81: 3998 (1983)참조).
대조적으로, 폴리펩티드 단편 또는 펩티드는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 분자 영역인 "항원성 에피토프"를 포함할 수 있다. 어떤 에피토프는 아미노산의 선형 또는 연속적인 스트레치로 구성되어 있으며, 이러한 에피토프의 항원성은 변성제에 의해서 방해되지 않는다. 단백질 에피토프를 모방할 수 있는 상대적으로 짧은 합성 펩티드가 단백질에 대한 항체 생산을 자극하기 위해서 사용될 수 있다는 것이 당업계에 알려져 있다(예를 들어, Sutcliffe등, Science 219: 660 (1983)참조). 따라서, 본원 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드, 항원성 펩티드, 에피토프, 및 폴리펩티드는 본원에 기재된 폴리펩티드와 결합하는 항체를 발생시키고, 중화하고, IL-22 및 IL-20(각각 또는 동시에)에 결합하여, 이들의 활성을 차단, 저해, 감소, 길항작용 또는 중화시킬 수 있는 항-IL-22RA 단일클론 항체를 동정하고 스크리닝하기에 유용하다. 본원 발명의 이러한 중화 단일클론 항체는 IL-22RA 항원성 에피토프에 결합할 수 있다. Hopp/Woods 친수성 프로파일은 서열 번호 3내에서 가장 항원 가능성을 갖는 영역을 결정하는데 사용될 수 있다(Hopp 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 및 Triquer등, Protein Engineering 11: 153-169, 1998). 프로파일은 슬라이딩 6-잔기 윈도우에 기초한다. 매복된 G, S, 및 T 잔기 및 노출된 H, Y, 및 W 잔기는 무시되었다. 당업자가 IL-22RA 중의 이들 영역을 결정하였다. 더욱이, DNASTAR Protean 프로그램(DNASTAR, Inc., Madison, WI)를 사용하여 Janeson-Wolf 플롯에 의해서 추정되는, 서열 번호 3 내의 IL-22RA 항원성 에피토프는 바람직한 항원성 에피토프로 기능하였고, 당업자에 의해서 결정될 수 있다. 이러한 항원성 에피토프는 (1) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1(Pro) 내지 6(Asp); (2) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 26(Ser) 내지 32(Pro); (3) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 41(Lys) 내지 47(Asp); (4) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 49(Val) 내지 62(Cys); (5) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 42(Lys) 내지 62(Cys); (6) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 84(Ala) 내지 97(Ser); (7) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 103(Thr) 내지 108(Asp); (8) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 130(Arg) 내지 135(His); (9) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 164(Gly) 내지 166(Lys); (10) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 175(Tyr) 내지 179(Glu); (11)서열 번호 3의 아미노산 잔기 193(Lys) 내지 196(Ala); (12)서열 번호 3의 아미노산 잔기 203(Lys) 내지 209(Thr)를 포함한다. 다음 펩티드를 포함하는 추가의 에피토프가 CnBr을 사용하여 절단된 비-감소 전장 인간 IL-22RA로부터 유효하게 생성될 수 있다. 펩티드 6(서열 번호 56), 펩티드 7(서열 번호 57); 펩티드 8(서열 번호 58); 펩티드 9(서열 번호 59); 펩티드 10(서열 번호 60); 및 펩티드 11(SEQ ID NO :61). 시스테인은 펩티드 7(서열 번호 57) 및 10(서열 번호 60) 사이에 가능한 결합을 생성하는 이황결합이다. 특히, SEQ ID N0:56은 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1(Pro) 내지 92(Met)에 상응하고; 서열 번호 57은 서열 번호 3의 아미노산 잔기 93(Thr) 내지 120(Met)에 상응하고; 서열 번호 58은 서열 번호 3의 아미노산 잔기 121(Ile) 내지 160(Met)에 상응하고, 서열 번호 59는 서열 번호 3의 아미노산 잔기 161(His) 내지 185(Met)에 상응하고, 서열 번호 60은 서열 번호 3의 아미노산 잔기 186(Ile) 내지 199(Met)에 상응하며, 서열 번호 61은 서열 번호 3의 아미노산 잔기 200(Cys) 내지 211(Thr)에 상응한다. 더욱이, 리간드-수용체 결합에 중요한 서열 번호 2의 잔기 (및 서열 번호 3의 상응하는 잔기)는 서열 번호 2 (및 서열 번호 3의 상응하는 잔기)의 Tyr-60, 및 Phe-164, Tyr-93, Arg-112, Lys-210, 및 Glu-211을 포함한다. 더욱이, 리간드-수용체 결합을 유도하는데 있어서 중요한 서열 번호 2의 제1의 잔기 (및 서열 번호 3의 상응하는 잔기)는 서열 번호 2(및 서열 번호 3의 상응하는 잔기)의 Tyr-60, 및 Phe-164를 포함하고, 제2의 잔기는 서열 번호 2의 잔기 (및 서열 번호 3의 상응하는 잔기)의 Tyr-93, Arg-112, Lys-210, 및 Glu-211을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 항원성 에피토프에 대한 본원 발명의 중화항체는 예를 들어, IL-22RA 및 IL-20 또는 IL-22(각각 또는 함께)를 이용하는 리간드-수용체 결합에 중요한 서열 번호 2(및 서열 번호 3의 상응하는 잔기)를 함유할 수 있다.
항원성 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 개시된 아미노산 서열의 적어도 4 내지 10개의 아미노산, 적어도 10 내지 15개의 아미노산, 또는 약 15 내지 약 30개의 아미노산을 함유할 수 있다. 이러한 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 개시된 바와 같이 IL-22RA 폴리펩티드를 단편화하는 것에 의해서, 또는 화학 펩티드 합성에 의해서 생산될 수 있다. 더욱이, 에피토프는 랜덤 펩티드 라이브러리의 파지 디스플레이로 선택될 수 있다(예를 들어, Lane and Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268(1993), 및 Cortese등, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616(1996)을 참조하시오). 에피토프를 동정하는 표준 방법 및 에피토프를 포함하는 작은 펩티드로부터 항체를 생산하는 표준 방법이 예를 들어, Mole, "Epitope Mapping", Methods in Molecular Biology, Vol.10, Manson(ed.), 105-116(The Human Press, Inc. 1992), Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman(eds.), 60-84페이지(Cambridge University Press 1995), 및 Coligan 등(eds.), Current Protocls in Immunology, 9.3.1-9.3.5 및 9.4.1-9.4.11(John Wiley & Sons 1997).
변이체 및 융합 단백질을 포함하는 어떤 IL-22RA 폴리펩티드의 경우에, 당업자는 상기 표 1 및 2에 제시된 정보를 사용하여 변이체를 암호화하는 전체 축중 폴리뉴클레오티드 서열을 용이하게 생성할 수 있다. 더욱이, 당업자는 본원에 기재된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 기초하여 IL-22RA 변이체를 생성하기 위해서 표준 소프트웨어를 사용할 수 있다.
5. IL-22RA 폴리펩티드의 생산
전장 폴리펩티드; 가용성 단량체, 동종이량체, 이종이량체, 및 다량체 수용체; 전장 수용체; 수용체 단편(예를 들어, 리간드 결합 단편 및 항원성 에피토프), 기능성 단편, 및 융합 단백질을 포함하는 본원 발명의 폴리펩티드는 종래의 기술에 따라 재조합 숙주 세포내에서 생산될 수 있다. IL-22RA 유전자를 발현하기 위해서, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 발현 벡터에서 전사를 조절하는 조절서열에 작동가능하게 결합하여야만 하고 그 다음, 숙주 세포에 도입되어야만 한다. 발현벡터는, 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절서열에 추가하여 번역 조절서열 및 발현 벡터를 운반하는 세포의 선택에 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다.
진핵 세포에 있어서 외래 단백질의 생산에 적합한 발현 벡터는 (1) 박테리아 복제 개시점을 암호화하는 원핵 DNA 요소 및 박테리아 숙주에서 발현벡터의 성장 및 선택을 허용하는 항원성 내성 마커; (2) 프로모터와 같은 전사 개시를 조절하는 진핵 DNA 요소 및 (3) 전사 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사 과정을 조절하는 DNA 요소를 함유한다. 상기에 논의된 대로, 발현 벡터는 또한 이종성 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하는 분비 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, IL-22RA 발현 벡터는 IL-22RA 유전자 및 어떤 분비 유전자로부터 유래된 분비 서열을 포함할 수 있다.
본원 발명의 IL-22RA 단백질은 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주세포의 예는 아프리카 사바나 원숭이 신장 세포(Vero; ATCC CRL 1587), 인간 배아 신장세포(293-HEK; ATCC CRL 1573), 갓 태어난 햄스터 신장 세포(BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), 개의 신장 세포(MDCK; ATCC CCL 34), 차이니스 햄스터 난소 세포(CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44(Chasin 등, Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986), 래트 뇌하수체 세포(GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 래트 간암세포(H-4-II-E; ATCC CRL 1548) SV40-형질전환된 원숭이 신장 세포(COS-1; ATCC CRL 1650) 및 쥐과 배아세포(NIH-3TC; ATCC CRL 1658)을 포함한다.
포유동물 숙주의 경우에, 전사 및 번역 조절 신호는 예를 들어, 아데노바이러스, 소의 파필로마 바이러스, 원숭이 바이러스 등과 같은 포유동물 바이러스 공급원으로부터 유래될 수 있으며, 조절 신호는 높은 발현 수준을 갖는 특정 유전자와 연관되어 있다. 적합한 전사 및 번역 조절 서열은 또한 예를 들어, 액틴, 콜라겐, 미오신, 및 메탈로티오네인 유전자와 같은 포유동물 유전자로부터 얻어질 수 있다.
전사 조절 서열은 RNA합성 개시를 지시하기에 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 적합한 진핵 프로모터는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터(Hamer등, J.Molec.Appl.Genet.1:273(1982)), 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터(McKnight, Cell 31 :355(1982)), SV40 초기 프로모터(Benoist등, Nature 290:304(1981)), 라우스 육종 바이러스 프로모터(Gorman 등, Proc.Nat'l Acad.Sci. USA79:6777(1982)), 사이토메갈로바이러스 프로모터(Foecking 등, Gene 45:101(1980)), 및 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터(일반적으로, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," Protein Engineering:Principles and Practice, Cleland 등(eds.), 163-181 페이지(John Wiley & Sons, Inc. 1996))을 포함한다.
대안으로, 원핵 프로모터가 진핵 프로모터에 의해서 조절되는 경우에, 박테리아파지 T3와 같은 원핵 프로모터가 포유동물 세포에서 IL-22RA 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다(Zhou 등, Mol. Cell. Biol.10:4529(1990), 및 Kaufman 등, Nucl. Acids Res. 19:4485(1991)).
어떤 구체예에서, IL-22RA 가용성 수용체 폴리펩티드, 또는 IL-22RA 폴리펩티드의 단편을 암호화하는 DNA 서열은 발현벡터내에서 그것의 발현에 필요한 다른 유전자 서열(일반적으로 전사 프로모터 및 터미네이터를 포함한다)과 작동가능하게 연결된다. 벡터는 또한 일반적으로 하나 이상의 선택 마커를 함유하고 하나 이상의 복제 개시점을 포함한다. 그러나, 당업자라면 어떤 시스템내에서 선택 마커는 별도의 벡터로 제공될 수 있고, 외인성 DNA의 복제는 숙주 세포 게놈으로의 통합에 의해서 제공될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 당업자의 관점에서 프로모터, 터미네이터, 선택 마커, 벡터 및 다른 요소의 선택은 통상적인 설계에 해당한다. 많은 이러한 요소들이 문헌에 개시되어 있고 상업적 판로를 통해 입수 가능하다. 가용성 수용체 복합체의 다수의 성분들이 각각의 발현 벡터에 코-트랜스펙션될 수 있거나 또는 하나의 발현 벡터에 함유될 수 있다. 단백질 복합체의 다수의 성분들을 발현하는 이러한 기술은 당업계에 이미 공지된 기술이다.
발현 벡터는 인산칼슘 트랜스펙션, 리포솜-매개 트랜스펙션, 마이크로발사-매개 송달, 전기영동 등을 포함하는 다양한 표준 기술을 사용하여 숙주세포에 도입될 수 있다. 트랜스펙션된 세포가 선택되고 증식하여 숙주 세포 게놈에 안정하게 통합된 발현벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 벡터를 진핵세포로 도입하는 기술 및 우세한 선택 마커를 사용하여 이러한 안정한 형질전환체를 선택하는 기술은 예를 들어, Ausubel(1995) 및 Murray(ed.), Gene Transfer and Expression Protocols(Humana Press 1991)에 개시된다.
예를 들어, 하나의 적당한 선택마커는 항원성 네오마이신에 내성을 제공하는 유전자이다. 이 경우에, G-418 등과 같은 네오마이신형 약제의 존재하에서 선택이 이루어진다. 선택 시스템은 또한 관심의 유전자의 발현 수준을 증가시키는 데 사용될 수 있으며 이 과정은, "증폭"으로 지칭된다. 증폭은 낮은 수준의 선택제의 존재하에서 트랜스펙턴트를 배양하는 단계 및 선택제의 양을 증가시키는 것에 의해서 도입된 유전자 생산물을 높은 수준으로 생산하는 세포를 선택하는 단계에 의해서 수행된다. 적합한 증폭가능한 선택마커는 디히드로폴레이트 환원제(DHFR)이고, 이것은 메토트렉세이트에 내성을 부여한다. 다른 약물 내성 유전자(예를 들어, 히그로마이신 내성, 복합 약물 내성, 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제)가 또한 사용될 수 있다. 또는, 그린 형광단백질과 같은 변형된 표현형, 또는 CD4, CD8, 클래스 I MHC와 같은 세포 표면 단백질, 태반 알칼리성 포스파타아제를 도입하는 마커를 사용하고, FACS 선별 또는 자기 비드 분리 기술과 같은 수단에 의해서 트랜스펙션되지 않은 세포로부터 트랜스펙션된 세포를 선별할 수 있다.
IL-22RA 폴리펩티드는 또한 바이러스 송달 시스템을 사용하여 배양 포유동물 세포에 의해서 생산될 수 있다. 이러한 목적에 사용되는 대표적인 바이러스는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 백신 바이러스 및 아데노바이러스 의존 바이러스(AAV)를 포함한다. 이종성 핵산 송달에 있어서 현재 가장 연구가 많이 되어 있는 유전자 전달 벡터는 아데노바이러스, 이중 가닥 DNA 바이러스이다(Becker등, Meth. Cell Biol. 43:161(1994), 및 Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)참조). 아데노바이러스 시스템의 이점으로는 상대적으로 큰 DNA 삽입체의 수용, 높은 적정량으로 증식할 수 있는 능력, 다양한 포유동물 세포 유형을 감염시킬 수 있는 능력, 상이한 프로모터를 함유하는 많은 이용가능한 벡터의 사용을 가능하게 하는 그것의 적응성이 있다.
아데노바이러스 게놈 부분을 제거하는 것에 의해서, 이종성 DNA의 더 큰 삽입체(7kb이하)가 함유될 수 있다. 이들 삽입체는 직접적으로 결합시키는 것에 의해서 또는 코-트랜스펙션 플라스미드를 사용하는 동종 재조합에 의해서 바이러스 DNA 에 통합될 수 있다. 바이러스 벡터로부터 필수 E1 유전자를 제거하는 것이 또한 가능한데, 필수 E1 유전자가 숙주 세포에 의해서 제공되지 않는다면 바이러스 벡터의 복제능력이 결여된다. 아데노바이러스 벡터-감염 인간 293세포(ATCC 번호. CRL-1573, 45504, 45505)는 상대적으로 높은 세포 밀도로 예를 들어, 부착세포로서 또는 현탁배양에서 증식하여 유의한 양의 단백질을 생산할 수 있다(Garnier 등, Cytotechnol.15:145(1994)).
IL-224A는 조류, 균류, 곤충, 효모, 또는 식물세포와 같은 다른 고등 진핵세포에서 또한 발현될 수 있다. 바큘로바이러스 시스템이 클론된 IL-22RA 유전자를 곤충 세포로 도입하는 효과적인 수단을 제공한다. 적당한 발현 벡터는 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 다수의 핵폴리헤드론형성 바이러스(AcMNPV)에 기초하고, 초파리 열충격 단백질(hsp) 70프로모터, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 다수의 핵폴리헤드론형성 바이러스의 매우 초기 유전자 프로모터(ie-1) 및 지연된 초기 39K 프로모터, 바큘로바이러스 p10 프로모터, 및 초파리 메탈로티오네인 프로모터와 같은 잘 알려진 프로모터를 함유한다. 재조합 바큘로바이러스를 제조하는 제2의 방법은 Luckow(Luckow 등, J. Viral. 67:4566(1993))에 의해 개시된 트랜스포손-기초 시스템을 이용하는 것이다. 전달 벡터를 이용하는 이 시스템은 BAC-to-BAC 키트로서 판매된다(Life Technologies, Rockville, MD). 이 시스템은 IL-22RA 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 를 E.coli에 보유되어 있는 바큘로바이러스 게놈으로 전달하는 Tn7 트랜스포손을 함유하는 전달 벡터, PFASTBAC(Life Technologies)를 이용한다(거대 플라스미드로서 "바크미드"로 지칭된다). Hill-Perkins and Possee, J.Gen.Viral 71:971 (1990), Bonning 등, J.Gen.Virol.75:1551(1994), 및 Chazenbalk, 및 Rapoport, J. Biol.Chem.270:1543 (1995)을 참조하시오. 더욱이, 전달 벡터는 발현 IL-2RA 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단에 에피토프 태그(예를 들어, Glu-Glu 에피토프 태그(Grussenmeyer 등, Proc.Nat'l Acad. Sci.82:7952(1985))를 암호화하는 DNA를 이용한 인-프레임 융합을 포함할 수 있다. 당업계에 알려진 기술을 사용하여, IL-22RA 유전자를 함유하는 전달 벡터로 E.coli를 형질전환시키고, 재조합 바큘로바이러스를 나타내는 단절된 lacZ 유전자를 함유하는 바크미드에 대해서 스크리닝한다. 그 다음, 통상적인 기술을 사용하여 재조합 바큘로바이러스 게놈을 함유하는 바크미드 DNA를 분리한다.
어떤 PFASTBAC 벡터는 상당한 정도로 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리헤드린 프로모터가 제거되고, 바큘로바이러스 염기성 단백질 프로모터(Pcor, p6.9 또는 MP 프로모터로 알려짐)로 치환될 수 있는데, 이것은 바큘로바이러스 감염 초기에 발현되고 분비 단백질 발현에 이점을 나타낸다(Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990), Bonning 등, J. Gen. Virol. 75: 1551 (1994), 및 Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1995) 참조). 이러한 전달 벡터 구조체에서, 염기성 단백질 프로모터의 짧은 버전 또는 긴 버전이 사용될 수 있다. 더욱이, 천연 IL-22RA 분비 신호 서열이 곤충 단백질에서 유래된 분비 신호 서열로 교체된 전달 벡터가 제조될 수 있다. 예를 들어, 엑디스테로이드 글루코실트랜스퍼라제(EGT), 허니비 밀레틴(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), 또는 바큘로바이러스 gp67(PharMingen:San Diego, CA)에서 얻은 분비 신호 서열을 사용하여 구조체에서, 천연 IL-22RA 분비 신호 서열을 대체할 수 있다.
재조합 바이러스 또는 바크비드가 숙주 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용된다. 적당한 곤충 숙주 세포는 IPLB-Sf-21로부터 유래된 세포주, 스포돕테라 플루기페르다(Spodoptera frugiperda) pupal 난소 세포주(Sf9(ATCC CRL 1711), Sf2lAE, 및 Sf21(Invitrogen Corporation;San Diego, CA)) 및 초파리 쉬나이더-2 세포, 및 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 유래의 HIGH FIVEO 세포주(Invitrogen)(미국 특허 제 5,300,435)를 포함한다. 상업적으로 입수 가능한 무혈청 배지를 사용하여 세포를 증식시키고 유지시킬 수 있다. 적당한 배지는 Sf900IITM(Life Technologies) 또는 Sf9 세포에 대한 ESF921TM(발현 시스템); 및 Ex-Cell0405TM(JRH Biosciences, Lenexa, KS) 또는 트리코플루시아 니(T.ni) 세포에 대한 Express FiveOTM(Life Technologies)이다. 재조합 바이러스를 사용하는 경우에, 세포는 일반적으로 약 2-5x105 세포의 접종 밀도 내지 1-2x106 세포의 밀도로 증식하고, 이때 0,1 내지 10, 더욱 일반적으로는 거의 3의 감염다중도(MOI)로 재조합 바이러스 스톡을 첨가한다.
바큘로바이러스 시스템에서 재조합 단백질을 생산하는 확립된 기술은 Bailey 등, "Manipulation of Baculovirus Vectors," Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray(ed.), 147-168(The Humana Press, Inc. 1991), Patel 등, "The baculovirus expression system", DNA Cloning 2: Expression Systems, 제2판, Glover 등(eds.), 205-244(Oxford University Press 1995), Ausubel(1995), 16-37 내지 16-57, Richardson(ed.), Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press, Inc. 1995), 및 Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", Protein Engineering:Principles and Practice, Cleland 등(eds.), 183-218(John Wiley & Sons, Inc. 1996)에서 제공된다.
효모 세포를 포함하는 균류 세포가 본원에 기재된 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. 이러한 관점에서 특정 관심의 효모 종은 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 피키가 파스토리스(Pichia pastoris), 및 피키아 메타노리카(Pichia methanolica)를 포함한다. 효모에서의 발현에 적당한 프로모터는 GAL1(갈락토스), PGK(포르포글리세레이트 키나제), ADH(알콜 디히드로게나제), AOXI(알콜 옥시다제), HIS4(히스티디놀 디히드로게나제)등의 프로모터를 포함한다. 다양한 효모 클로닝 벡터가 설계될 수 있고 용이하게 구입할 수 있다. 이들 벡터는 YIp-기초 벡터(YIp5), YRp 벡터(YRp17), YEp 벡터(YEp13) 및 YCp 벡터(YCp19)를 포함한다. 외래 DNA로 사카로미세스 세레비지에(S.cerevisiae) 세포를 형질전환시켜서 이로부터 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법은 Kawasaki, 미국 특허 제4,599,311호, Kawasaki 등, 미국 특허 제4,931,373호, Brake, 미국 특허 제4,870,008호, Welch 등, 미국 특허 제5,037,743호 및 Murray 등, 미국 특허 제4,845,075호에 기재되어 있다. 선택 마커, 일반적으로는 약물 내성 또는 특정 영양분(예를 들어, 루신)의 부재하에서 증식하는 능력으로 측정된 표현형에 의해서 형질전환된 세포를 선택한다. 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 사용하기 위한 적당한 벡터 시스템은 Kawasaki등(미국 특허 제4,931,373호)에 기재된 POT1 벡터 시스템이고, 이 시스템은 글루코스 함유 배지에서의 증식에 의해서 형질전환된 세포가 선택되도록 한다. 효모에서의 사용에 적합한 추가의 프로모터 및 터미네이터는 해당효소 유전자(Kawasaki, 미국 특허 제4,599,311호, Kingsman 등, 미국 특허 제4,615,974호 및 Bitter, 미국 특허 제4,977, 092호) 및 알콜 디히드로게나제 유전자로부터 얻은 것들이다. 미국 특허 제4,990,446호, 제5,063,154호, 제5,139,936호 및 제4,661,454호를 참조하시오.
한세누라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 크루이베로미세스 프래질리스(Kluyveromyces fragilis), 우스티라고 마이디스(Ustilago maydis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타노리카(Pichia methanolica), 피키아 구일레르몬디(Pichia guillermondii) 및 칸디다 말토사(Candida maltosa)를 포함하는 다양한 효모에 대한 형질전환 시스템이 당업계에 공지되어 있다. Gleeson 등, J. Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986) 및 Cregg, 미국 특허 제4,882,279호를 참조하시오. McKnight 등, 미국 특허 제4,935,349호의 방법에 따라서, 아스퍼질러스(Aspergillus) 세포가 이용될 수 있다. 아크레모니움 크리소제넘(Acremonium chrysogenum)을 형질전환시키는 방법이 Sumino 등, 미국 특허 제5,162,228호에 기재되어 있다. 누로스포라(Neurospora)를 형질전환시키는 방법이 Lambowitz, 미국 특허 제4,486,533호에 기재되어 있다.
예를 들어, 재조합 단백질을 생산하기 위해 숙주로서 피키아 메타노리카(Pichia methanolica)를 사용하는 것이 Raymond, 미국 특허 제5,716,808호, Raymond, 미국 특허 제5,736,383호, Raymond 등, Yeast 14: 23 (1998) 및 국제공개 WO97/17450호, WO97/17451호, WO98/02536호 및 WO98/02565호에 개시되어 있다. 피키아 메타노리카(P. methanolica)를 형질전환시키는데 사용하는 DNA 분자는 일반적으로 이중-가닥, 원형 플라스미드로서 제조되고, 바람직하게는 형질전환 전에 선형화되어진다. 피키아 메타노리카(P. methanolica)에서 폴리펩티드를 생산하는 경우에, 플라스미드내의 프로모터 및 터미네이터는 피키아 메타노리카(P. methanolica) 알콜 이용 유전자(AUG1 또는 AUG2)와 같은 피키아 메타노리카(P. methanolica)의 프로모터 및 터미네이터일 수 있다. 다른 유용한 프로모터는 디히드로아세톤 신타아제(DHAS), 포르메이트 디히드로게나아제(FMD), 및 카탈라제(CAT)유전자의 것들을 포함한다. 숙주 염색체로의 DNA 통합을 촉진하기 위해서는, 플라스미드 전체 발현 단편이 숙주 DNA 서열 양 말단에 플랭킹되도록 하는 것이 바람직하다. 피키아 메타노리카(P. methanolica)에서의 사용에 적합한 선택마커는 피키아 메타노리카(P. methanolica) ADE2 유전자이고, 이 유전자는 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제(AIRC; EC 4.1.1.21)를 암호화하고, 아데닌의 부재하에서도 ade2 숙주 세포가 증식될 수 있도록 한다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 대규모, 산업적 공정의 경우에, 메탄올 이용 유전자(AUG1 및 AUG2) 모두가 결실되어 있는 숙주 세포가 이용될 수 있다. 분비 단백질의 생산에 있어서, 숙주 세포는 액포 프로테아제 유전자(PEP4 및 PRB1)가 결실되어 있다. 삽입체의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 함유하는 플라스미드의 피키아 메타노리카(P. methanolica) 세포로의 도입을 촉진하기 위해서 전기영동이 사용된다. 2.5 내지 4.5 kV/cm, 바람직하게는 3.75 kV/cm의 필드 강도 및 1 내지 40 밀리초, 가장 바람직하게는 약 20밀리초의 시간 상수(t)를 갖는 급격하게 감소하는, 펄스 전기필드를 사용하는 전기영동에 의해서 피키아 메타노리카(P. methanolica)를 형질전환하였다.
발현벡터는 또한 식물 원형질체, 완전한 식물조직, 또는 분리된 식물세포에 도입될 수 있다. 식물 조직에 발현벡터를 도입하는 방법은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 마이크로발사-매개 송달, DNA 주사, 전기영동 등을 사용하여 식물 조직을 직접 감염시키거나 공동 배양하는 것을 포함한다. 예를 들어, Horsch 등, Science 227:1229(1985), Klein 등, Biotechnology 10: 268 (1992) 및 Miki 등, "Procedures for Introducing Foregin DNA into Plants", Methods in Plant Molecular Biology and Biochemistry, Glick 등 (eds.) 67-88(CRC Press, 1993)을 참조하시오.
또는, IL-22RA유전자는 원핵 숙주세포에서 발현될 수 있다. 원핵 숙주에서 IL-22RA 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 당업자에게 잘 알려져 있으며 T4, T3, Sp6 및 T7 폴리머라제를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 PR 및 PL 프로모터, trp, recA, 열충격, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA, 및 E.coli의 lacZ 프로모터, 비. 서브틸리스(B.subtilis)의 프로모터, 바실러스(Bacillus)의 박테리오파지 프로모터, 스트렙토미세스(Streptomyces) 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 bla 프로모터, 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자 CAT 프로모터를 포함한다. 원핵 프로모터는 Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987), Watson 등, Molecular Biology of the Gene, 4판. (Benjamin Cummins 1987), 및 Ausubel 등의 저서(1995)에 개관되어 있다.
적합한 원핵 숙주는 E. coli 및 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilus)를포함한다. E.coli 의 적합한 균주는 BL21 (DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3) pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH1OB, DHlOB/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, 및ER1647을 포함한다(예를 들어, Brown(ed.), Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991)참조). 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilus)의 적합한 균주는 BR151, YB886, MI119, MI120, 및 B170을 포함한다(예를 들어, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", DNA Cloning: A Practical Approach, Glover(ed.)(IRL Press 1985)참조).
E.coli 와 같은 박테리아에서 IL-22RA 폴리펩티드를 발현하는 경우에, 폴리펩티드는 세포질, 특히 비가용성 과립에 보유될 수 있거나 또는, 박테리아 분비 서열에 의해서 주변세포질 공간에 위치할 수 있다. 전자에 경우에 세포는 용해되고, 과립은 회수되어 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 우레아를 사용하여 변성된다.그 다음, 변성제를 희석시키는 것에 의해서(예를 들어, 우레아 용액에 대해서 투석하고, 환원되고 산화된 글루티온과 조합하고 이어서, 완충생리식염수에 대해서 투석한다) 변성된 폴리펩티드가 재폴딩되어 이량체화된다. 후자의 경우에, 주변세포질 공간의 성분들이 방출되도록 세포를 파괴(예를 들어, 초음파처리 또는 삼투 쇼크)시켜서 단백질을 다시 회수함으로써 변성 및 재폴딩이 필요하지 않게 되는 방식으로 주변세포질로부터 가용성이면서 기능적인 형태의 폴리펩티드가 다시 얻어질 수 있다.
원핵 숙주에서 단백질을 발현하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(Williams 등,"Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", DNA Cloning 2: Expression Systems, 제2판, Glover등(eds.), 15(Oxford University Press 1995), Ward 등, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," Monoclonal Antibodies:Prizciples and Applications, 137(Wiley-Liss, Inc. 1995), 및 Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria", Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland 등(eds.), 101(John Wiley & Sons, Inc. 1996)참조).
박테리아, 효모, 곤충, 및 식물 세포내로 발현 벡터를 도입하는 표준 방법이 예를 들어, Ausubel(1995)에 의해 제공된다.
포유동물 세포 시스템으로 생산된 외인성 단백질을 발현하고 회수하는 일반적인 방법이 예를 들어, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", Protein Engineering Principles and Practice, Cleland 등 (eds.), 163(Wiley-Liss, Inc. 1996)에 제공된다. 박테리아 시스템에 의해서 생산된 단백질을 회수하는 표준 기술은 예를 들어, Grisshammer 등, "Purification of over-produced proteins from E. coli cells", DNA Cloning 2:Expression Systems, 제2판, Glover 등(eds.), 59-92(Oxford University Press 1995)에 개시된다. 바큘로바이러스 시스템으로부터 재조합 단백질을 분리하는 확립된 방법은 Richardson(ed.), Baciiloiirtis Expression Protocols(The Humana Press, Inc. 1995)에 개시된다.
대안으로, 본원 발명의 폴리펩티드는 전체 고상 합성, 부분적인 고상 방법, 단편 응축 또는 전통적인 용액 합성에 의해서 합성될 수 있다. 이들 합성 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963), Stewart 등,"Solid Phase Peptide Synthesis"(제2판), (Pierce Chemical Co.1984), Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3(1986), Atherton 등, Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press 1989), Fields and Colowick, "Solid-Phase PeptideSynthesis", Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), 및 Lloyd-Williams등, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins(CRC Press,Inc. 1997)참조). "천연 화학 리게이션" 및 "발현된 단백질 리게이션"과 같은 전체 화학 합성 전략에서의 변형 또한 일반적이다(Dawson등, Science 266:776(1994), Hackeng 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845(1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir 등, Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 6705 (1998) 및 Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)참조).
본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 서열 번호 3의 적어도 6개, 적어도 9개, 또는 적어도 15개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함한다. 일예로, 폴리펩티드는 서열 번호 3의 적어도 6개, 적어도 9개, 또는 적어도 15개의 연속적인 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 이들 아미노산 서열의 20, 30, 40, 50, 100, 또는 그 이상의 연속적인 잔기들을 포함한다. 이러한 펩티드 및 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자는 폴리머라제 사슬 반응 프라이머 및 프로브로서 유용하다.
더욱이, IL-22RA 폴리펩티드 및 그것의 단편은 고등 진핵세포에서 단량체, 동종이량체, 이종이량체, 또는 다량체로서 발현될 수 있다. 이러한 세포는 적어도 하나의 IL-22RA 폴리펩티드("IL-22RA-포함 수용체" 또는 "IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드")를 포함하는, IL-22RA 단량체, 동종이량체, 이종이량체 및 다량체 수용체 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있거나 또는, 스크리닝 시스템에서 분석 세포로서 사용될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, IL-22RA 세포외 도메인을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 배양 세포에 의해서 생산되고, 세포는 천연 리간드, IL-22 및 천연 리간드의 작동물질 및 길항물질을 포함하는 수용체에 대한 리간드를 스크리닝하는데 사용된다. 이 방법을 요약하면, 수용체를 암호화하는 cDNA 또는 유전자를 그것의 발현에 필요한 다른 유전적 요소(예를 들어, 전사 프로모터)와 조합시키고, 결과의 발현벡터를 숙주 세포에 삽입한다. DNA를 발현하고 기능적 수용체를 생산하는 세포를 선택하여 다양한 스크리닝 시스템에 사용한다. 단량체, 동종이량체, 이종이량체 및 다량체 수용체 복합체의 각 성분이 동일한 세포에서 발현될 수 있다. 더욱이, 단량체, 동종이량체, 이종이량체 및 다량체 수용체 복합체의 성분들은 트랜스멤브레인 도메인 또는 다른 멤브레인 융합 부분에 융합되어서 상기에 개시된 바와 같은 복합체 회합 및 트랜스펙턴트의 스크리닝을 허용한다.
본 발명의 IL-20 및 IL-22 길항물질 폴리펩티드 및 항체를 분석하기 위해서, IL-22RA-함유 수용체 또는 IL-20 또는 IL-22에 결합하는 것으로 알려진 다른 수용체(예를 들어, IL-22RA/CRF2-4; 및 IL-20RA, IL-20RB, IL-22RA/IL-20RB, 또는 IL-20RA/IL-20RB를 발현하는 세포)의 발현 및 수용체-매개 신호의 전달에 있어서 적합한 포유동물 세포는 IL-22RA(또는 IL-20RA)와 기능적 복합체를 형성할 수 있는 다른 수용체 서브유닛을 발현하는 세포를 포함한다. 이들 서브유닛은 인터페론 수용체 패밀리 또는 다른 클래스 II 또는 클래스 I 시토카인 수용체의 것들을 포함하며, CRF2-4(진뱅크 수탁 번호 Z17227), IL-10R(진뱅크 수탁 번호 U00672 및 NM_001558), IL-22RA(미국 특허 제5,965,704호), zcytor7(IL-20RA)(미국 특허 제5,945,511호), IL-20RA/EL-20RB(WIPO 공개 WO01/46232호) 및 IL-9R이 그 예이다. 발현될 수용체로서 동일한 종에서 얻어진 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 세포는 그것의 증식에 있어서 외부에서 공급된 조혈 성장 인자에 의존성이다. 이러한 유형에 해당하는 바람직한 세포주는 인간 TF-1 세포주(ATCC 수탁 번호 CRL-2003) 및 AML-193 세포주(ATCC 수탁 번호 CRL-9589)이고, 이들은 GM-CSF-의존성 인간 백혈병 세포주 및 BaF3(Palacios and Steinmetz, Cell 41:727-734(1985))(IL-3 의존성 쥐과 프리-B세포주)이다. 다른 세포주는 BHK, COS-1 및 CHO 세포를 포함한다. 적당한 숙주 세포는 요구되는 수용체 서브유닛 또는 원하는 세포 반응에 필요한 세포 성분을 생산하기 위해서 유전자 조작될 수 있다. 이 방법의 이점은 어떤 종으로부터 얻어진 수용체 서브유닛도 발현하도록 세포주가 유전자 조작될 수 있고, 이에 의해서 종 특이성으로부터 기인하는 잠재적인 한계를 극복할 수 있다는 것이다. 인간 수용체 cDNA의 종 오르토로그가 클로닝될 수 있고, 동일한 종에서 얻은 세포주내에서(예를 들어, BaF3 세포주의 마우스 cDNA) 사용될 수 있다. 따라서, GM-CSF 또는 IL-3과 같은 하나의 조혈 성장 인자에 의존적인 세포주가 유전자 조작되어서 IL-22와 같은 IL-22RA 수용체를 통해 작용하는 다른 시토카인에 의존적으로 될 수 있다.
기능적 수용체를 발현하는 세포가 스크리닝 분석에 사용된다. 다양한 적합한 분석법이 당업계에 알려져 있다. 분석은 표적 세포에서 생물학적 반응의 검출에 기초한다. 이러한 분석은 세포 증식 분석이다. 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 세포를 배양하고, 예를 들어, 트리티움표지 티미딘의 삽입을 측정하는 것에 의해서 또는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, (1983))의 대사 분해에 기초한 비색 분석에 의해서 세포 증식을 검출한다. 다른 분석 포맷은 수용체 유전자를 발현하도록 더 유전자 조작된 세포를 사용한다. 수용체 유전자는 수용체-결합 경로에 반응하는 프로모터 요소에 연결되어 있고, 분석으로 수용체 유전자의 전사 활성을 검출한다. 이러한 관점에서 바람직한 프로모터는 혈청 반응 요소, 또는 SRE이다. 예를 들어, Shaw등, Cell 56: 563-572, (1989) 참조. 바람직한 수용체 유전자는 루시페라제 유전자이다(de Wet 등, Mol. Cell. Biol. 7: 725, (1987)). 루시페라제 유전자 발현은 당업계에 공지된 방법을 사용하는 루미네센스에 의해서 검출된다(Baumgartner 등, J. Biol. Chem. 269: 29094-29101 (1994); Schenbom and Goiffin, Promega Notes 41: 11, 1993). 예를 들어, Promega Corp., Madison, WI로부터 루시페라제 활성 분석 키트를 입수할 수 있다. 이 유형의 표적 세포주가 화학제, 세포-조정 배양 배지, 균류 브로스, 토양 샘플, 물 샘플 등의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포-조정 배지 샘플 뱅크를 표적 세포상에서 분석하여 리간드를 생산하는 세포를 동정할 수 있다. 그 다음, 양성세포를 사용하여 포유동물 발현 벡터에서 cDNA 라이브러리를 생산하고, 이것을 풀로 나누고, 숙주 세포를 트랜스펙션하고 발현시킨다. 그 다음, 풀을 연속적으로 나누고, 다시 트랜스펙션하고, 계대배양하고, 양성 세포를 다시 분석하여 리간드를 암호화하는 클론된 cDNA를 분리하는 것에 의해서 트랜스펙션된 세포에서 얻은 배지 샘플을 분석한다.
몇몇의 IL-20 반응 세포주가 당업계에 알려져 있거나 또는 예를 들어, Baf3/DIRSl/cytoR11 세포주(WIPO 공개 WO02/072607호)가 제조될 수 있다. 더욱이, 몇몇 IL-22 반응 세포주 및 IL-22 수용체 서브유닛을 발현하는 것이 알려져 있다(Dumontier 등, J. Immunol. 164: 1814-1819, 2000; Dumoutier, L. 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000; Xie MH 등, J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; Kotenko SV 등, J. Biol. Chem. 276: 2725-2732, 2001). 예를 들어, 다음 세포가 IL-22에 반응한다: TK-10(Xie MH 등, 상기참조)(인간 신장 암종); SW480 (ATCC 번호 CCL-228)(인간 결장 선암종); HepG2(ATCC 번호 HB-8065)(인간 간암); PC12(ATCC 번호 CRL-1721)(쥐과 뇌세포 모델; 래트 크롬친화세포종); 및 MES13 (ATCC 번호 CRL-1927)(쥐과 신장 혈관사이 세포주). 더욱이, IL-22RA(IL-22 수용체)를 발현하는 어떤 세포주는 또한 IL-22 에 반응하는 세포주에 대한 후보물이다:A549(ATCC 번호 CCL-185)(인간 허파 암종); G-361(ATCC 번호. CRL-1424)(인간 흑색종); 및 Caki-1(ATCC 번호 HTB-46)(인간 신장 암종). 더욱이, IL-22-반응성 세포주 예를 들어, 본원에 기재된 Baf3/cytoRll/CRF2-4 세포주가 제조될 수 있다(WIPO 공개 WO02/12345호). 이들 세포는 IL-22RA의 IL-20 또는 IL-22 길항물질 또는 항염증 인자로서의 기능성을 평가하기 위한 분석에 사용될 수 있다.
본 발명에 의해서 제공된 추가의 스크리닝 방법은 혼성 수용체 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 이들 혼성 폴리펩티드는 2개의 일반적인 클래스에 속한다. 첫번째 클래스에서, IL-22RA의 세포내 도메인은 제2의 수용체의 리간드-결합 도메인에 연결된다. 혼성 수용체 폴리펩티드의 두번째 클래스는 제2의 수용체의 세포외 도메인, 바람직하게는 조혈 시토카인 수용체, 및 트랜스멤브레인 도메인과 함께 IL-22RA의 세포외(리간드-결합) 도메인(SEQ ID NO:3)을 포함한다. 두번째 클래스에 해당하는 본원 발명 수용체의 혼성 IL-22RA 단량체, 동종이량체, 이종이량체 및 다량체는 제2의 수용체에 의해서 형질도입된 신호에 반응할 수 있는 것으로 알려져 있다. 이와 함께, 이들 혼성 수용체의 2가지 클래스는 IL-22 또는 IL-20을 검출하기 위한 분석법의 개발에 있어서 반응성 세포 유형의 동정을 가능하게 한다. 더욱이, IL-22 또는 IL-20의 존재하에서 이들 세포를 사용하는 것에 의해 경쟁형 분석에서 본원 발명의 가용성 수용체 길항물질을 분석할 수 있다. 이러한 분석에서, 본원 발명의 가용성 수용체의 존재하에서 IL-22 또는 IL-20 증식 또는 신호 트랜스덕션 활성의 감소로 길항물질 활성이 증명된다. 더욱이, IL-22RA-가용성 수용체 결합 분석, 세포-기초 분석은 또한 가용성 수용체가 IL-22 또는 IL-20에 결합, 이들의 활성을 차단, 저해, 감소, 길항작용 또는 중화할 수 있는지를 평가하는데 사용될 수 있다.
6. IL-22RA 융합 단백질 및 접합체의 생산
IL-22RA 유사체 중 일반적인 클래스는 본원에 기재된 아미노산 서열의 돌연변이에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 변이체이다. IL-22RA 유사체 및 그것의 단편의 다른 일반적인 클래스는 하기에 기재된 바와 같이, 항-유전형 항체에 의해서 제공된다. 더욱이, 항-유전형의 가변성 도메인을 포함하는 재조합 항체가 유사체로서 사용될 수 있다(예를 들어, Monfardini 등, Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420(1996)). 항-유전형 IL-22RA 항체의 가변성 도메인은 IL-22RA를 모방하기 때문에, 이들 도메인은 IL-22RA 결합 활성을 제공할 수 있다. 항-유전형 촉매 항체를 생산하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(Joron 등, Ann.N Y Acad. Sci. 672: 216 (1992), Friboulet 등, Appl. Biochem. Biotechnol. 47: 229 (1994) 및 Avalle 등, Ann. N Y Acad. Sci. 864: 118 (1998)).
IL-22RA 유사체를 동정하는 또 다른 방법은 조합 라이브러리를 사용하는 것에 의해서 제공된다. 파지 디스플레이 및 다른 조합 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 예를 들어, Kay 등, Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, 미국 특허 제5,783,384호, Kay 등, 미국 특허 제5,747,334호 및 Kauffman 등, 미국 특허 제5,723,323호에 의해서 제공된다.
IL-22RA 폴리펩티드는 생체내 및 생체외 용도를 모두 갖는다. 일예로서, IL-22RA의 가용성 형태가 세포 배양배지에 첨가되어서 배양 세포에 의해서 생산된 IL-22RA 리간드의 효과를 저해할 수 있다.
IL-22RA의 융합 단백질은 재조합 숙주에서 IL-22RA를 발현하는데 그리고, 생산된 IL-22RA를 분리하는데 사용할 수 있다. 하기에 기재된 바와 같이, 특정 IL-22RA 융합 단백질은 또한 진단 및 치료 용도를 갖는다. 어떤 유형의 융합 단백질은 재조합 숙주세포로부터 IL-22RA 폴리펩티드를 유도하는 펩티드를 포함한다. IL-22RA 폴리펩티드를 진핵 숙주세포의 분비 경로로 유도하기 위해서, 분비 신호 서열(신호 펩티드, 리더 서열, 프리프로 서열 또는 프리서열로 지칭됨)이 IL-22RA 발현 벡터에서 제공된다. 분비 신호 서열이 IL-22RA로부터 유래될 수 있으며, 적합한 신호 서열이 또한 다른 분비 단백질로부터 유래되거나 새로이 합성될 수 있다. 분비 신호 서열은 IL-22RA-암호화 서열에 작동가능하게 연결되어, 2개의 서열이 올바른 리딩 플레임내에서 연결되고 위치하여 새로이 합성된 폴리펩티드를 숙주세포의 분비 경로로 유도되도록 한다. 어떤 신호 서열은 관심의 뉴클레오티드 서열의 어디에도 위치할 수 있지만, 분비 신호 서열은 일반적으로 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한다(Welch 등, 미국 특허 제5,037,743호; Holland 등, 미국 특허 제5,143,830호).
포유동물 세포에 의해서 생산된 IL-22RA의 분비 신호 서열 또는 다른 단백질(예를 들어, 미국 특허 제5,641,655호에 기재된 조직-형태 플라스미노겐 활성제 신호서열)이 재조합 포유동물 숙주에서 IL-22RA를 발현하기에 유용하지만, 효모 세포에서의 발현에 있어서는 효모 신호 서열이 바람직하다. 적합한 효모 신호 서열의 예는 효모 교배 페로몬 α-인자(MFα1 유전자에 의해서 암호화됨), 인버타제(SUC2 유전자에 의해서 암호화됨), 또는 산성 포스파타제(PHO5 유전자에 의해서 암호화됨)으로부터 유래된 것들이다. Romanos 등, "Expression of Cloned Genes in Yeast", DNA Cloning 2: A Practical Approach, 제2판, Glover and Hames(eds.), 123-167(Oxford University Press 1995)참조하시오.
IL-22RA 가용성 수용체 폴리펩티드는 예를 들어, 서열 번호 3, 또는 비-인간 수용체의 상응하는 영역을 함유하는 폴리펩티드와 같은 세포외 도메인을 암호화하는 절단된 DNA를 발현시키는 것 의해서 제조된다. 세포외 도메인 폴리펩티드는 실질적으로 트랜스멤브레인 및 세포내 폴리펩티드 단편이 없는 형태로 제조된다. 숙주 세포로부터 수용체 도메인의 방출을 유도하기 위해서, 수용체 DNA는 t-PA 분비 펩티드와 같은 분비 펩티드를 암호화하는 제2의 DNA 단편에 연결된다. 분비 수용체 도메인의 정제를 촉진하기 위해서, 폴리-히스티딘 태그, 서브스턴스 P, FlagTM 펩티드와 같은 C-말단 연장물(Hopp 등, Biotechnology 6: 1204-1210, (1988); Eastman Kodak Co., New Haven, CT로부터 입수 가능) 또는 항체 또는 다른 특정 결합제가 부착할 수 있는 다른 폴리펩티드 또는 단백질이 수용체 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 더욱이, 세포외 시토카인 결합 도메인으로부터 얻어진 IL-22RA 항원성 에피토프는 상기에 기재된 방법으로 제조된다.
다른 구체예에서, IL-224A의 수용체 세포외 도메인 또는 다른 클래스 I 또는 II 시토카인 수용체 성분은 면역글로불린 중쇄 항상 영역(2개의 항상 영역 도메인 및 힌지 영역을 함유한다. 그러나, 가변 영역은 결여되어 있다), 전형적으로는 Fc 단편과 융합되어 발현될 수 있다(Sledziewski, AZ 등, 미국 특허 제6,018,026호 및 제5,750,375호 참조). 본 발명의 가용성 IL-22RA 폴리펩티드는 이러한 융합을 포함한다. 이러한 융합은 서열 번호 4로 제시된다. 이러한 융합은 전형적으로 다량체 분자(Fc 부분이 서로 이황화 결합되어서 2개의 수용체 폴리펩티드가 서로 폐쇄된 근접부위에 배열된다)로서 분비된다. 이러한 유형의 융합은 특이적으로 리간드를 적정화하는 것에 의해서 생체외에서 신호를 차단, 저해 또는 감소하도록 생체외 분석 툴로서, 용액으로부터 동족 리간드를 친화성 정제하는 것에 사용될 수 있으며, 또한 이들을 비경구적으로 투여하여 순환 리간드에 결합시켜서 이를 순환으로부터 배제시키는 것에 의해서 생체내에서 길항물질로서 사용될 수 있다. 리간드를 정제하기 위해서, 수용체-리간드 결합을 촉진하는 조건하에서(일반적으로는 거의 생리학적 온도, pH, 및 이온 강도), 리간드(예를 들어, 세포 조정 배지 또는 조직 추출물)를 함유하는 샘플에 IL-22RA-Ig 키메라를 첨가한다. 그 다음, 키메라-리간드 복합체를 단백질 A를 사용하는 혼합물에 의해서 분리하고, 이것을 고체 지지체(예를 들어, 불용성 수지 비드)상에 고정시킨다. 그 다음, 염 또는 pH 구배와 같은 전통적인 화학 기술을 사용하여 리간드를 용출시킨다. 다른 방법에서, 상기에 기재된 대로 결합 및 용출시키면서, 키메라 그 자체를 고체 지지체에 결합시킬 수 있다. 키메라를 생체내에서 사용하여 혈청 아미로이드 A(SAA), C-반응성 단백질(CRP) 등과 같은 빠른 상반응을 포함하는 염증 반응을 조절할 수 있다. 결합 친화성을 갖는 키메라가 비경구적으로(예를 들어, 근육내, 피하 또는 정맥내 주사) 투여된다. 순환 분자가 리간드에 결합하고 정상적인 생리 과정에 의해서 순환에서 제거된다. 분석에서의 사용의 경우에, 키메라는 Fc 영역을 통해 지지체에 결합하고 ELISA 포맷에서 사용된다.
본원 발명의 항-IL-22RA 및 결합 파트너의 분리를 보조하기 위하여, 리간드 결합 수용체(또는 항체, 보체/항-보체쌍의 원소) 또는 그것의 결합 단편, 및 상업적으로 이용가능한 바이오센서 기구(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)를 사용하는 분석 시스템이 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 수용체, 항체, 보체/항-보체쌍의 원소 또는 단편이 수용체 칩의 표면상에 고정된다. 기구의 사용은 Kalsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 및 Cunningham 및 Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993에 기재되어 있다. 수용체, 항체, 원소 또는 단편은 아민 또는 술프히드릴 화학을 사용하여 유동세포내의 골드 필름에 부착되어 있는 덱스트란 섬유에 공유결합으로 부착된다. 세포에 시험 샘플을 통과시킨다. 리간드, 에피토프, 또는 보체/항-보체쌍의 반대 원소가 샘플내에 존재한다면, 그것은 고정된 수용체, 항체 또는 원소에 각각 결합하여, 배지의 굴절율의 변화를 초래하며, 이것은 골드 필름의 표면 플라스몬 공명에서의 변화로 검출될 수 있다. 이 시스템은 온-앤드-오프 율의 측정을 가능하게 하며 이로부터 결합 친화성이 계산될 수 있고, 결합 화학량론을 평가할 수 있다. 또는, SELDI 기술(Ciphergen, Inc., Palo, Alto, CA)를 사용하여 리간드/수용체 결합이 분석될 수 있다. 더욱이, 상기에 기재된 BIACORE 기술이 상이한 단일클론 항체가 IL-22RA 폴리펩티드의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위한 경쟁 실험에 사용될 수 있으며, 그 자체로, IL-22 또는 IL-20 및 IL-22 모두에 결합하여, 이를 차단, 저해, 감소, 길항작용 또는 중화하는 본원 발명의 중화 항체의 에피토프 맵핑을 돕는데 사용될 수 있다.
리간드 결합 수용체 폴리펩티드는 당업계에 알려진 다른 분석 시스템내에서 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 결합 친화성을 결정하기 위한 Scatchard 분석(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) 및 열량측정 분석(Cunningham 등, Science 253: 545-48, 1991; Cunningham 등, Science 245: 821-25, 1991)을 포함한다.
본원 발명은 또한 다양한 다른 폴리펩티드 융합 및 하나 이상의 폴리펩티드 융합을 포함하는 관련 다량체 단백질을 제공한다. 예를 들어, 가용성 IL-22RA 수용체를 융합체로서 이량화 단백질로 제조할 수 있다는 것이 미국 특허 제5,155,027호 및 제5,567,584호에 기재되어 있다.
이러한 관점에서 바람직한 이량화 단백질은 면역글로불린 항상 영역 도메인(예를 들어, IgGγ1) 및 인간 κ 경쇄를 포함한다. 면역글로불린 가용성 IL-22RA 융합체는 다양한 다량체 IL-22RA 수용체 유사체를 생산하도록 유전적으로 조작된 세포에서 발현될 수 있다. 보조 도메인이 가용성 IL-22RA 수용체에 융합되어서 이들을 특정 세포, 조직, 또는 거대분자(예를 들어, 콜라겐, 또는 IL-22RA 리간드, IL-22 또는 IL-20을 발현하는 세포)에 표적화 할 수 있다. IL-22RA 폴리펩티드는 둘 이상의 부분(예를 들어, 정제용 친화성 태그 및 표적 도메인)에 융합될 수 있다. 폴리펩티드 융합물은 또한 특히 도메인들 사이에 하나 이상의 절단 부위를 포함할 수 있다. Tuan 등, Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996.
박테리아 세포에서, 독성을 감소시키고, 안정성을 증가시키고, 발현된 단백질의 회수를 향상시킬 수 있도록 융합 단백질로서 이종성 단백질을 발현시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, IL-22RA 는 글루타티온 S-트랜스퍼라제 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제 융합 단백질은 전형적으로 가용성이고, 글루타티온 고정 칼럼상에서 E.coli 용해물로부터 용이하게 정제될 수 있다. 유사한 방법에서, 말토스 결합 단백질을 포함하는 IL-22RA 융합 단백질이 아밀로스 수지 컬럼을 사용하여 분리될 수 있고, 절단된 단백질 A 유전자의 C-말단을 포함하는 융합 단백질이 IgG-세파로스를 사용하여 정제될 수 있다. 박테리아 세포에서 융합 단백질로서 이종성 폴리펩티드를 발현하는 확립된 기술이 Williams 등, "Expression of Foreign Proteins in E.coli Using Plasmid Vecotors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies", DNA cloning 2: A Practical Approach, 제2판, Glover and Hames(Eds.), 15-58(Oxford University Press 1995)에 기재되어 있다. 또한, 상업적으로 이용가능한 발현 시스템이 입수 가능하다. 예를 들어, PINPOINT Xa 단백질 정제 시스템(Promega Corporation; Madison, WI)이 아비딘을 포함하는 수지를 이용한 발현동안에 비오티닐화되는 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 분리 방법에 사용된다.
원핵 또는 진핵 세포 중 하나에 의해서 발현된 이종성 폴리펩티드의 분리에 유용한 펩티드 태그는 폴리히스티딘 태그(니켈-킬레이팅 수지에 대해 친화성을 갖는다), c-myc 태그, 칼모듈린 결합 단백질(칼모듈린 친화성 크로마토그래피로 분리됨), 서브스턴스 P, RYIRS 태그(항-RYIRS 항체와 결합), Glu-Glu 태그, 및 FLAG 태그(항-FLAG 항체와 결합)를 포함한다. 예를 들어, Luo 등, Arch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti 등, Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996) 및 Zheng등, Gene 186:55(1997). 이러한 펩티드 태그를 암호화하는 핵산 분자는 예를 들어, Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO)으로부터 입수 가능하다.
다른 유형의 융합 단백질은 IL-22RA 폴리펩티드 및 면역글로불린 중쇄 항상 영역(2개의 항상 영역 도메인 및 힌지 영역을 함유한다. 그러나, 가변 영역은 결여되어 있다), 전형적으로는 Fc 단편을 포함한다. 일예로서, Chang 등, 미국 특허 제 5,723,125 는 인간 인터페론 및 인간 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 융합 단백질을 기재한다. 인터페론의 C-말단은 펩티드 링커 부분에 의해서 Fc 단편의 N-말단에 연결된다. 펩티드 링커의 한 예는 우선적으로 면역학적으로 불활성인 T세포 불활성 서열을 포함하는 펩티드이다. 펩티드 링커의 대표적인 펩티드 링커는 아미노산 서열: GGSGG SGGGG SGGGG S(서열 번호 9)를 갖는다. 융합 단백질에서, Fc 부분은 인간 γ4 사슬이고, 이것은 용액에서 안정하고 보체 활성화 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않는다. 따라서, 본원 발명으로 IL-22RA 부분 및 인간 Fc 단편을 포함하는 IL-22RA 융합 단백질이 기대되고, IL-22RA 부분의 C-말단은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드와 같은 펩티드 링커를 통해 Fc 단편의 N-말단에 부착된다. IL-22RA 부분은 IL-22RA 분자 또는 그것의 단편일 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 및 Fc 단편(예를 들어, 인간 Fc 단편)(서열 번호 4)을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, IL-22RA 융합 단백질은 IgG 서열, IgG 서열의 아미노 말단에 공유결합으로 연결되어 있는 IL-22RA 부분, 및 IL-22RA 부분의 아미노 말단에 공유결합으로 연결되어 있는 신호 펩티드를 포함하고, IgG 서열은 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인의 순서로 구성되어 있다. 따라서, IgG 서열은 CH1 도메인이 결여되어 있다. IL-22RA 부분은 상기에 기재된 바와 같이, IL-22RA 활성(예를 들어, IL-22RA 리간드와 결합하는 능력)을 나타낸다. 항체 및 비항체 부분을 포함하는 융합 단백질을 생산하는 일반적인 방법은 LaRochelle 등, EP 742830에 기재되어 있다(WO95/21258).
IL-22RA 부분 및 Fc 부분을 포함하는 융합단백질은 예를 들어, 생체외 분석 툴로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플내의 IL-22RA 리간드의 존재는 IL-22RA 면역글로불린 융합 단백질을 사용하여 검출될 수 있고, IL-22RA 부분은 리간드와의 결합에 사용되고, 및 단백질 A 또는 항-Fc 항체와 같은 거대분자는 융합 단백질을 고체 지지체에 결합시키는데 사용된다. 이러한 시스템은 IL-22RA 리간드(예를 들어, IL-22 또는 IL-20 및 IL-22 모두)의 그들의 수용체와의 결합을 방해하는 작동물질 및 길항물질을 식별하는데 사용될 수 있다.
항체 융합 단백질의 다른 예는 항-결합 도메인 및 IL-22RA 세포외 도메인을 포함하는 IL-22RA 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 분자는 IL-22RA 결합 활성의 이익을 위해 특정 조직을 표적화하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 다양한 다른 폴리펩티드 융합을 더 제공한다. 예를 들어, 생물학적 기능을 부여하는 도메인의 일부분 또는 전체는 본원 발명의 IL-22RA 사이에서 시토카인 수용체 부류의 다른 원소에서 얻은 기능적으로 등가인 도메인과 교환된다. 폴리펩티드 융합은 재조합 숙주세포에서 발현되어 다양한 IL-22RA 융합 유사체를 생산할 수 있다. IL-22RA 폴리펩티드는 정제용 친화성 태그 및 표적 도메인과 같은 2 이상의 부분 또는 도메인에 융합될 수 있다. 폴리펩티드 융합은 특히 도메인 사이에, 하나 이상의 절단 부위를 포함한다. 예를 들어, Tuan 등, Connective Tissue Research 34: 1 (1996)참조.
당업자에게 잘 알려진 방법으로 융합 단백질의 각 성분을 제조하고 이들을 화학적으로 결합시키는 것에 의해서 융합단백질이 제조될 수 있다. 또는, 적당한 리딩 프레임내에 융합 단백질의 양 성분들을 암호화하는 폴리펩티드가 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있고 본원에 개시된 방법으로 발현될 수 있다. 융합 단백질의 효소적 및 화학적 절단을 위한 일반적인 방법은 예를 들어, Ausubel(1995) 16-19 내지 16-25에 기재되어 있다.
IL-22RA 결합 도메인은 핵자기공명, 결정학, 전자회절, 또는 광친화성 표지와 같은 기술에 의해서 측정되는, IL-22RA 리간드 작동물질의 추정되는 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 결합되어 있는 구조의 물리적 분석에 의해서 더 특성화될 수 있다. 예를 들어, de Vos 등, Science 255: 306 (1992), Smith 등, J. Mol. Biol. 224: 899 (1992), 및 Wlodaver 등, FEBS Lett. 309: 59 (1992)참조하시오.
또한, 본 발명은 화학적으로 변형된 IL-22RA 조성물을 고려하는데, 여기서는 IL-22RA 폴리펩티드가 폴리머와 결합된다. 전형적인 IL-22RA 폴리펩티드는, 아미노산 잔기 서열 번호 3으로 구성된 폴리펩티드와 같은, 기능성 트랜스멤브레인 도메인을 결여하고 있는 가용성 폴리펩티드이다. 전형적으로, 폴리머는 수용성이며, 이로써 IL-22RA 콘쥬게이트는 생리학적 환경과 같은 수성 환경에서 침전하지 않는다. 적합한 폴리머의 예는 아실화를 위한 활성 에스테르나 알킬화를 위한 알데히드와 같은 단일 반응기를 갖도록 변형된 것이다. 이런 방식으로 중합도가 조절될 수 있다. 반응성 알데히드의 예는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 또는 모노-(C1-C10)-알콕시, 또는 이들의 아릴옥시 유도체(예를 들어, Harris, 등, 미국 특허 제5,252,714호 참조). 중합체는 분지될 수도 있고 분지되지 않을 수도 있다. 또한, 폴리머의 혼합물을 사용하여 IL-22RA 콘쥬게이트를 생성할 수 있다..
치료용으로 사용되는 IL-22RA 콘쥬게이트는 약학적으로 허용되는 수용성 폴리머 부분을 포함할 수 있다. 적합한 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시-PEG, 모노-(C1-C10)-알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 폴리-(N-비닐피롤리돈)PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데히드, 비스-숙신이미딜 카르보네이트 PEG, 프로필렌 글리콜호모폴리머, 프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 다른 탄수화물-기제 폴리머들을 포함한다. 적합한 PEG는, 예를 들어 5,000, 12,000, 20,000 및 25,000을 포함하여, 약 600 내지 약 60,000의 분자량을 가질 수 있다.
IL-22RA 콘쥬게이트의 한 예는 IL-22RA 부분과 이 IL-22RA 부분의 N-말단에 부착된 폴리알킬 옥시드 부분을 포함한다. PEG가 한 적합한 폴리알킬 옥시드이다. 예로서, IL-22RA는 "PEG화"(PEGylation)라고 공지된 과정에 의해 PEG로 변형될 수 있다. IL-22RA의 PEG화는 본 분야에 공지된 PEG화 반응들 중 어느 것에 의해서도 수행될 수 있다(예를 들어, EP 0 154 316호, Delgado 등, Critical Reviews in ther-apeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharma-cokinet. 27: 290 (1994) 및 Francis 등, Int J Hematol 68:1(1998) 참조). 예를 들어, PEG화는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자를 사용한 아실화 반응이나 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 다른 접근법으로, IL-22RA 콘쥬게이트는 활성화된 PEG의 축합에 의해 형성되는데, 여기서는 PEG의 말단 히드록시 또는 아미노기가 활성화된 링커로 대체된다(예를 들어, Karasiewicz 등 미국 특허 제5,382,657호 참조).
아실화에 의한 PEG화는 전형적으로 IL-22RA 폴리펩티드와 PEG의 활성 에스테르 유도체의 반응을 필요로 한다. 활성화된 PEG 에스테르의 예는 N-히드록시숙신이미드로 에스테르화된 PEG이다. 본원에 사용된 용어 "아실화"는 IL-22RA와 수용성 폴리머 사이에 아미드, 카르바메이트, 우레탄 등의 결합을 포함한다. 아실화에 의해서 PEG화된 IL-22RA를 제조하는 방법은 전형적으로 (a) 하나 이상의 PEG 기가 IL-22RA에 부착하는 조건 하에서 IL-22RA 폴리펩티드와 PEG(PEG의 알데히드 유도체의 반응성 에스테르와 같은)를 반응시키는 단계와 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함한다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적 반응조건은 공지된 파라미터와 원하는 결과에 의거하여 결정될 것이다. 예를 들어, PEG:IL-22RA의 비가 클수록 폴리PEG화된 IL-22RA 생성물의 퍼센트도 커진다.
아실화에 의한 PEG화의 생성물은 전형적으로 리신 ε-아미노기가 아실 결합기에 의해 PEG화된 폴리PEG화 IL-22RA 생성물이다. 연결 결합의 예는 아미드이다. 전형적으로, 결과의 IL-22RA는 최소 95% 모노-, 디-, 또는 트리-페길화될 것이며, 반응조건에 따라서는 더 높은 PEG화도를 갖는 일부 종들이 형성될 수도 있다. PEG화된 종들은 투석, 한외여과, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 표준정제법을 사용하여 콘쥬게이트되지 않는 IL-22RA 폴리펩티드로부터 분리될 수 있다.
알킬화에 의한 PEG화는 일반적으로 환원제의 존재하에 PEG의 말단 알데히드 유도체와 IL-22RA를 반응시키는 것을 포함한다. PEG기는 -CH2-NH기에 의해 폴리펩티드에 부착될 수 있다.
또한, 본 발명의 항-IL-22RA 항체 또는 항체 단편이 본 분야의 방법 및 본원에 설명된 방법을 사용하여 PEG화될 수 있다.
모노PEG화된 생성물을 생성하기 위한 환원 알킬화에 의한 유도체화는 유도체화에 이용할 수 있는 상이한 종류의 일차 아미노기들의 상이한 반응성이 갖는 이점을 이용한다. 전형적으로, 이 반응은 단백질의 리신 잔기의 ε-아미노기와 N-말단 잔기의 α-아미노기 사이의 pKa 차이가 갖는 이점을 이용하는 것을 허용하는 pH에서 수행된다. 그러한 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 알데히드와 같은 반응기를 함유하는 수용성 폴리머의 부착이 조절된다. 폴리머와의 콘쥬게이트는 리신 측쇄 아미노기와 같은 다른 반응기의 유의한 변형 없이 단백질의 N-말단에서 우세하게 발생한다. 본 발명은 IL-22RA 모노폴리머 콘쥬게이트의 실질적으로 균질한 제조를 제공한다.
모노폴리머 IL-22RA 콘쥬게이트 분자의 실질적으로 균질한 집단을 생성하기 위한 환원 알킬화는 (a) IL-22RA의 아미노 말단에서 α-아미노기의 선택적 변형을 허용하는 적합한 pH에서 환원 알킬화 조건 하에 IL-22RA 폴리펩티드와 반응성 PEG를 반응시키는 단계와 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함한다. 반응성 알킬화에 사용된 환원제는 수용액에서 적합해야 하며 환원 알킬화의 초기 과정에서 형성된 Schiff 염기만을 환원시킬 수 있어야 한다. 전형적인 환원제는 나트륨 보로히드리드, 나트륨 시아노보로히드리드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 피리딘 보란을 포함한다.
모노폴리머 IL-22RA 콘쥬게이트의 실질적으로 균질한 집단을 위한 환원 알킬화 반응조건은 IL-22RA의 N-말단에 수용성 폴리머 부분의 선택적 부착을 허용하는 것들이다. 그러한 반응조건은 일반적으로 리신 아미노기와 N-말단의 α-아미노기 사이의 pKa 차이를 제공한다. 또한, pH가 사용되는 폴리머 대 단백질의 비에 영향을 미친다. 일반적으로, pH가 낮을 경우, 단백질에 대하여 더 과량의 폴리머가 바람직한데, 이것은 N-말단 α-기의 반응성이 적어서 더 많은 폴리머가 최적 조건을 달성하는데 필요하기 때문이다. 만일 pH가 더 높을 경우에는 더 반응성인 기가 이용될 수 있기 때문에 폴리머:IL-22RA는 그만큼 클 필요가 없다. 전형적으로, pH는 3 내지 9, 또는 3 내지 6의 범위에 들어갈 것이다. 이 방법은 IL-22RA-포함 동종이량체, 이종이량체 또는 다량체의 가용성 수용체 콘쥬게이트를 제조하는데 이용될 수 있다.
고려할 또 다른 요인은 수용성 폴리머의 분자량이다. 일반적으로, 폴리머의 분자량이 높을수록 단백질에 부착될 수 있는 폴리머 분자의 수가 적어진다. PEG화 반응을 위한 전형적인 분자량은 약 2kDa 내지 약 100kDa, 약 5kDa 내지 약 50kDa, 또는 약 12kDa 내지 약 25kDa이다. 수용성 폴리머 대 IL-22RA의 몰비는 일반적으로 1:1 내지 100:1의 범위이다. 전형적으로, 폴리PEG화를 위한 수용성 폴리머 대 IL-22RA의 몰비는 1:1 내지 20:1이고, 모노PEG화를 위한 몰비는 1:1 내지 5:1이다.
폴리펩티드와 수용성 폴리머 부분을 포함하는 콘쥬게이트를 생성하는 일반적인 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Karasiewicz 등, 미국 특허 제5,382,657호, Greenwald 등, 미국 특허 제5,738,846호, Nieforth 등 Clin. Pharmacol. Ther. 59: 636 (1996), Monkarsh 등, Anal. Biochem. 247: 434 (1997) 참조. 이 방법은 IL-22RA-포함 동종이량체, 이종이량체 또는 다량체의 가용성 수용체 콘쥬게이트를 제조하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 본원에 설명된 가용성 수용체나 항체와 같은, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 고려한다. 그러한 조성물은 담체를 더 포함할 수 있다. 담체는 종래의 유기 담체 또는 무기 담체일 수 있다. 담체의 예는 물, 완충액, 알콜, 프로필렌 글리콜, 마크로골, 참기름, 옥수수기름 등을 포함한다.
7. IL-22RA 폴리펩티드의 분리
본 발명의 폴리펩티드는 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산의 오염에 관하여, 최소 약 80% 순도, 최소 약 90% 순도, 최소 약 95% 순도, 또는 95% 이상, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 순도로 정제될 수 있으며, 감염원 및 발열원을 함유하지 않는다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 99.9% 이상 순수한 제약학적으로 순수한 상태로 정제될 수 있다. 어떤 제제에서 정제된 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드를 실질적으로 함유하지 않는다.
분류 및/또는 종래의 정제 방법을 사용하여 천연 공급원(예를 들어, 인체조직 공급원)으로부터 정제된 IL-22RA, 합성 IL-22RA 폴리펩티드, 및 재조합 숙주 세포로부터 정제된 재조합 IL-22RA 폴리펩티드와 융합 IL-22RA 폴리펩티드의 제제를 얻을 수 있다. 일반적으로, 황산암모늄 침전 및 산 또는 카오트로프 추출이 샘플의 분류에 사용될 수 있다. 전형적인 정제 단계는 히드록시아파타이트, 크기배제, FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 적합한 크로마토그래피 매질은 유도체화된 덱스트란들, 아가로스, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 특수 실리카 등을 포함한다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 적합하다. 전형적인 크로마토그래피 매질은 페닐, 부틸, 또는 옥틸기로 유도체화된 매질, 예를 들어 페닐-Sepharose FF(Pharmacia), Toyopearl 부틸(Toso Haas, 펜실베니아 몽고메리빌), 옥틸-Sepharose(Pharmacia) 등; 또는 폴리아크릴 수지, 예를 들어 Amberchrom CG 71 (Toso Haas) 등을 포함한다. 적합한 고체 지지체는 유리 비드, 실리카-기제 수지, 셀룰로스 수지, 아가로스 비드, 가교결합된 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 가교결합된 폴리아크릴 아미드 수지 등을 포함하며, 이들은 이들이 사용되는 조건 하에서 불용성이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 탄수화물 부분들에 의한 단백질의 부착을 허용하는 반응기로 변형될 수 있다.
커플링 화학의 예는 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 술프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카르보디이미드 커플링 화학을 위한 카르복실 및 아미도 유도체를 포함한다. 이들 및 다른 고체 매질들이 본 분야에 잘 공지되어 있으며 널리 사용되고 있고 상업적 공급자로부터 입수 가능하다. 폴리펩티드 분리 및 정제를 위한 특정한 방법의 선택은 루틴 설계의 문제이며 선택된 지지체의 특성에 의해 일부 결정된다. 예를 들어, Affinity Chromatography:Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology 1988), Doonan Protein Purification Protocols(The Humana Press 1996).
IL-22RA의 분리 및 정제에서 추가의 변형이 당업자에 의해 고안될 수 있다. 예를 들어, 하기 설명된 대로 얻어진 항-IL-22RA 항체를 사용하여 면역친화성 정제에 의해 다량의 단백질을 분리할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 특정한 성질의 개척에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 고정형 금속이온 흡착(IMAC) 크로마토그래피를 사용하여 폴리히스티딘 태그를 포함하는 것들을 포함하는, 히스티딘-부화 단백질을 정제할 수 있다. 간단히 말해, 먼저 이가 금속이온으로 겔을 충전하여 킬레이트를 형성한다(Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1 (1985)). 사용된 금속이온에 따라 히스티딘-부화 단백질들이 상이한 친화성으로 이 매트릭스에 흡착되며, 경쟁 용출, pH 저하 또는 강한 킬레이트제의 사용에 의해 용출될 것이다. 다른 정제 방법은 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화 단백질의 정제를 포함한다(M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182: 529 (1990)). 본 발명의 추가의 구체예 내에서, 정제를 용이하게 하기 위해 관심의 폴리펩티드와 친화성 태그(예를 들어, 말토스-결합 단백질, 면역글로불린 도메인)의 융합체가 구성될 수 있다. 더욱이, IL-22RA 세포외 도메인의 리간드-결합 특성이, 예를 들어 IL-22RA-포함 가용성 수용체의 정제를 위해, 예를 들어 친화성 크로마토그래피를 사용하여 개척될 수 있으며, 여기서는 IL-22 리간드가 칼럼에 결합되고, 표준 크로마토그래피법을 사용하여 IL-22RA-포함 수용체가 결합된 후 용출된다.
또한, IL-22RA 폴리펩티드 또는 이들의 단편이 상기 설명된 대로 화학적 합성을 통해 제조될 수 있다. IL-22RA 폴리펩티드는 단량체 또는 다량체일 수 있고; 글리코실화 또는 비-글리코실화; PEG화 또는 비-PEG화될 수 있으며; 그리고 초기의 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.
8. IL-22RA 단백질에 대한 항체의 생성
예를 들어, 항원 공급원으로서 IL-22RA 발현 백터나 천연 공급원으로부터 분리된 IL-22RA의 생성물을 사용하여 IL-22RA에 대한 항체가 얻어질 수 있다. 특히, 유용한 항-IL-22RA 항체는 IL-22RA와 특이적으로 결합한다. 항체가 다음 두 가지 특성, 즉 (1) 항체는 결합 활성의 역치 수준으로 IL-22RA와 결합한다,및 (2) 항체는 IL-22RA와 관련된 폴리펩티드와 유의한 정도로 교차반응하지 않는다, 중 적어도 하나를 나타내는 경우, 항체는 특이적으로 결합되는 것으로 간주된다.
제1 특징과 관련하여, 항체는 그들이 IL-22RA 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프와 106M-1 이상, 바람직하게는 107M-1 이상, 더 바람직하게는 108M-1 이상, 그리고 가장 바람직하게는 109M-1 이상의 결합 친화성(Ka)으로 결합하는 경우 특이적으로 결합한다. 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 Scatchard 분석(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660 (1949))에 의해 당업자에 의해서 쉽게 측정될 수 있다. 제2 특징과 관련하여, 항체는 관련된 폴리펩티드 분자들과, 예를 들어 그들이 IL-22RA를 검출하기는 하지만 표준 웨스턴 블롯 분석을 사용했을 때 현재 공지된 폴리펩티드는 아닌 경우에는 유의한 정도로 교차반응하지 않는다.
항-IL-22RA 항체는 항원성 IL-22RA 에피토프를 지닌 펩티드 및 폴리펩티드를 사용하여 생성될 수 있다. 본 발명의 항원성 에피토프를 지닌 펩티드 및 폴리펩티드는 서열 번호 3 또는 본원에 개시된 다른 아미노산 서열에 함유된 최소 9개, 또는 15 내지 약 30개의 연속된 아미노산을 함유한다. 그러나, 또한, 30 내지 50개의 아미노산, 또는 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열까지의 및 전체 아미노산 서열을 포함하는 어떤 길이를 함유하는, 본 발명의 아미노산 서열의 더 큰 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 IL-22RA와 결합하는 항체를 유도하는데 유용하다. 에피토프를 지닌 펩티드의 아미노산 서열은 수성 용매에서 실질적인 용해성을 제공하도록 선택되는 것이 바람직하다(즉, 이 서열은 상대적으로 친수성인 잔기를 포함하며 소수성 잔기는 전형적으로 회피된다). 또한, 프롤린 잔기를 함유하는 아미노산 서열이 항체 생성에 바람직할 수 있다.
예로서, IL-22RA에 있는 잠재적 항원 부위가 Jameson-Wolf 방법(Jameson 및 Wolf, CABIOS 4:181, (1988))을 사용하여, LASERGENE(DNASTAR; 위스콘신 매디슨)의 PROTEAN 프로그램(버전 3.14)에 의해 확인되었다. 이 분석에서는 디폴트 파라미터가 사용되었다.
Jameson-Wolf 방법은 단백질 구조 예측을 위한 6개의 메이저 서브루틴을 조합함으로써 잠재적인 항원 결정인자를 예측한다. 간단히 말해서, 먼저 Hopp-Woods 방법(Hopp 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78: 3824, (1981))을 사용하여 최대 국소 친수성의 영역을 나타내는 아미노산 서열을 확인했다(파라미터: 7개 잔기의 평균). 두번째 단계에서, Emini의 방법(Emini 등, J. Virology 55: 836 (1985))을 사용하여 표면 확률을 계산했다(파라미터: 표면 결정 역치(0.6)=1). 세번째 단계에서, Karplus-Schultz 방법(Karplus 및 Schutz, Naturwissenschaften 72: 212 (1985))을 사용하여 백본 사슬 유연성을 예측했다(파라미터: 유연성 역치(0.2)=1). 이 분석의 네번째 및 다섯번째 단계에서는, Chou-Fasman(Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition," Prediction of Protein Struc-ture and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), pages 549-586 (Plenum Press 1990), 및 Garnier-Robson(Gamier 등, J. Mol. Biol. 120: 97 (1978))의 방법을 사용하여 데이타에 2차 구조 예측을 적용했다(Chou-Fasman 파라미터: 입체구조표 = 64 단백질; α 영역 역치 = 103; β 영역 역치 = 105; Garnier-Robson 파라미터: α 및 β 결정 상수 = 0). 여섯번째 서브루틴에서, 유연성 파라미터와 친수도/용매 접근성 인자를 조합하여 표면 등고선 값을 측정하고, 이것을 "항원지수"라고 했다. 마지막으로, 피크 브로드화 기능을 항원지수에 적용하였는데, 이것은 내부 영역에 상대적인 표면 영역의 이동성으로부터 유도된 추가 자유 에너지를 고려하여 각 피크 값의 20, 40, 60 또는 80%를 추가함으로써 주 표면 피크의 폭을 넓히는 것이다. 그러나, 나선 영역은 보다 덜 유연한 경향이 있기 때문에, 이 계산은 나선 영역에 남아 있는 어떤 주 피크에는 적용되지 않았다.
이 분석의 결과는 서열 번호 3의 아미노산 서열이 적합한 항원 펩티드를 제공할 것임을 나타냈으며, Hopp/Woods 친수성 프로파일을 사용하여 서열 번호 3 내에서 가장 항원성일 가능성을 갖는 영역들을 측정할 수 있다(Hopp 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 및 Triquer 등, Protein Engineering 11: 153-169, 1998). 이 프로파일은 슬라이딩 6-잔기 윈도우에 기초한다. 묻혀 있는 G, S, 및 T 잔기와 노출된 H, Y, 및 W 잔기는 무시되었다. 더욱이, 예를 들어 DNASTAR Protean 프로그램(DNASTAR Inc., 위스콘신 매디슨)을 사용하여, Jameson-Wolf 플롯에 의해 예측된 서열 번호 3 내에 있는 IL-22RA 항원성 에피토프가 바람직한 항원성 에피토프로서 작용하며, 당업자에 의해 측정될 수 있다. 그러한 항원성 에피토프는 (1) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 1(Pro)에서 6(Asp); (2) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 26(Ser)에서 32(Pro); (3) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 41(Lys)에서 47(Asp); (4) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 49(Val)에서 62(Cys); (5) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 41(Lys)에서 62(Cys); (6) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 84(Ala)에서 97(Ser); (7) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 103 (Thr)에서 108(Asp);(8) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 130(Arg)에서 135(His); (9) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 164(Gly) 에서 166(Lys); (10) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 175(Tyr)에서 179(Glu); (11) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 193(Lys)에서 196(Ala); (12) 서열 번호 3의 아미노산 잔기 203(Lys)에서 209(Tlu)을 포함한다. 본 발명은 IL-22RA에 대한 항체를 생성하기 위해서, 또는 본 발명의 중화된 모노클로날 항체를 스크리닝하거나 확인하기 위한 도구로서 항원성 펩티드 1 내지 12 중 어느 하나의 사용을 고려한다. 본 발명은 IL-22RA에 대한 항체를 생성하기 위해서 뿐만 아니라, IL-22 및 IL-20(개별적으로 또는 함께)의 활성과 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있는, 중화된 항-IL-22RA 모노클로날 항체를 확인하고 스크리닝하기 위해서 본원에 설명된 어떤 항원성 펩티드나 에피토프의 사용을 고려한다.
또, 적합한 항원은 IL-22RA 시토카인 결합, 또는 다른 클래스 I 또는 II 시토카인 세포외 도메인과 조합된 상기 개시된 세포외 도메인을 포함하는 IL-22RA 폴리펩티드, 예를 들어 가용성 IL-22RA 이종이량체 또는 다량체 폴리펩티드, 예를 들어, 가용성 IL-22RA/CRF2-4, IL-22RA/zcytor11, IL-22RA/zcytor7 등을 포함한다.
당업자에게 공지된 방법을 사용하여 재조합 IL-22RA 또는 천연 공급원으로부터 분리된 IL-22RA에 대한 폴리클로날 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, Green 등, "Production of Polyclonal Antisera" Immunochemical Protocols (Manson, ed), pages 1-5(Humana Press 1992), 및 Williams 등, "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal ant-ibodies," DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover 등, page 15 (Oxford University Press 1995). IL-22RA 폴리펩티드의 면역원성이 명반(수산화 알루미늄) 또는 Freund 완전 또는 비완전 보조제와 같은 보조제의 사용을 통해 증가될 수 있다. 또한, 면역화에 유용한 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드, 예를 들어 IL-22RA나 이들의 일부분과 면역글로불린 폴리펩티드 또는 말토스 결합 단백질의 융합체를 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전-길이 분자거나 이것의 일부일 수 있다. 만일 폴리펩티드 부분이 "합텐-형"이라면, 그러한 부분은 유리하게는 면역화를 위해서 거대분자 캐리어(열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 파상풍 톡소이드)와 연결되거나 결합될 수 있다.
폴리클로날 항체는 전형적으로 말, 소, 개, 닭, 래트, 마우스, 기니아 피그, 염소 또는 양과 같은 동물들에서 발생하지만, 본 발명의 항-IL-22RA 항체는 유인원 영장류 항체로부터 유래될 수도 있다. 비비에서 진단적으로 그리고 치료적으로 유용한 항체를 발생시키는 일반적인 기술이, Goldenberg 등의 국제특허 공보 No. WO 91/11465, 및 Losman 등의 Int. J. Cancer 46:310 (1990)에 나와 있다.
또는 달리, 모노클로날 항-IL-22RA 항체가 생성될 수 있다. 특이적 항원에 대한 설치류 모노클로날 항체가 당업자에게 공지된 방법에 의해 얻어질 수 있다(예를 들어, Kohleret 등, Nature 256: 495 (1975), Coligan 등, Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan"], Picksley 등, "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli," DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover 등, page 93 (Oxford University Press 1995) 참조).
간단히 말해서, 모노클로날 항체는 IL-22RA 유전자 생성물을 포함하는 조성물을 마우스에 주사하는 단계, 혈청 샘플을 제거하여 항체 생성물의 존재를 확인하는 단계, 비장을 제거하여 B-림프구를 얻는 단계, B-림프구와 골수종 세포를 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계, 하이브리도마를 클로닝하는 단계, 항원에 대한 항체를 생성하는 양성 클론을 선택하는 단계, 항원에 대한 항체를 생성하는 이 클론을 배양하는 단계, 및 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리하는 단계에 의해 얻어질 수 있다.
여기에 더하여, 본 발명의 항-IL-22RA는 인간 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다. 인간 모노클로날 항체는 항원 시험감염에 반응하여 특이적 인간 항체를 생성하도록 조작된 트랜스젠 마우스로부터 얻어진다. 이 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 원소들이 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 분열을 함유하는 배아줄기 셀라인으로부터 유래된 마우스의 균주에 도입된다. 트랜스젠 마우스는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있으며, 이 마우스를 사용하여 인간 항체-분비 하이브리도마를 생성할 수 있다. 트랜스젠 마우스로부터 인간 항체를 얻는 방법은, 예를 들어 Green 등, Nature Genet. 7: 13 (1994), Lonberg 등, Nature 368: 856 (1994), 및 Taylor 등, Int. Immun. 6: 579 (1994)에 의해 설명된다.
잘 확립된 여러 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 모노클로날 항체가 분리 및 정제될 수 있다. 그러한 분리 기술은 Protein-A Sepharose를 사용한 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 및 이온교환 크로마토그래피를 포함한다(예를 들어, Coligan, pages 2.7.1-2.7.12 및 pages 2.9.1-2.9.3; Baines 등, "Purification of Immunoglobulin G(IgG)" Methods in Molecular Biology, Vol 10, pages 79-104(The Humana Press, Inc. 1992) 참조).
특정한 용도를 위해서 항-IL-22RA 항체의 단편을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 항체 단편은, 예를 들어 항체의 단백질 가수분해에 의해 얻어질 수 있다. 항체 단편은 종래의 방법에 의한 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 얻어질 수 있다. 예로서, 항체 단편은 펩신을 사용한 항체의 효소 절단에 의해 생성돌 수 있으며, 이로써 F(ab')2라고 하는 5S 단편이 얻어진다. 이 단편은 티올 환원제를 사용하여 더 절단되어 3.5S Fab' 일가 단편을 생성한다. 선택적으로, 절단 반응은 이황화 결합의 절단으로 인한 술프히드릴기에 알맞은 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 또는 달리, 펩신을 사용한 효소 절단은 2개의 일가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접 생성한다. 이들 방법은, 예를 들어 Goldenberg의 미국 특허 제4,331,647호, Nisonoff 등, Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960), Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman 등, Methods in E1nzymology Vol. 1, page 422(Academic Press 1967) 및 Coligan, pages 2.8.1-2.8.10 및 2.10.-2.10.4에 의해 설명된다.
또한, 단편들이 완전한 항체에 의해 인식되는 항원과 결합하지 않는 한, 중쇄의 분리에 의한 일가 경-중쇄 단편의 형성, 단편의 추가 절단, 또는 다른 효소, 화학 또는 유전자 기술과 같은 다른 항체 절단 방법이 사용될 수 있다.
예를 들어, Fv 단편은 VH 및 VL 사슬의 회합을 포함한다. 이 회합은 Inbar 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69: 2659 (1972)에 설명된 대로 비공유일 수 있다. 또는 달리, 다양한 사슬이 중간분자 이황화 결합에 의해 결합되거나, 글루타르알데히드와 같은 화학물질에 의해 가교결합될 수 있다(예를 들어, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992) 참조).
Fv 단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함할 수 있다. 이들 단일-사슬 항원결합단백질(scFv)은 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 VH 및 VL을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 이 구조 유전자는 발현 벡터에 도입되고, 이어서 E. coli와 같은 숙주 세포에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 2개의 V 도메인에 걸쳐 있는 링커 펩티드를 갖는 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. scFv를 생성하는 방법은, 예를 들어 Whitlow 등, Methods : A Companion to Methods in Enzymology 2: 97 (1991)에 설명된다(또한, 예를 들어, Bird 등, Science 242: 423 (1988), Ladner 등, 미국 특허 제4,946,778호, Pack 등, Bio/Technology 11: 1271 (1993), and Sandhu, 상동, 참조).
예로서, scFv는 시험관내에서 림프구를 IL-22RA 폴리펩티드에 노출시키고 파지나 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택(예를 들어, 고정된 또는 표지된 IL-22RA 단백질 또는 펩티드를 사용하여)함으로써 얻어질 수 있다. 잠재적 IL-22RA 폴리펩티드 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 파지(파지 디스플레이) 또는 E. coli와 같은 박테리아 상에 나타난 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 다양한 방식으로, 예를 들어 무작위 돌연변이생성 및 무작위 폴리뉴클레오티드 합성을 통해서 얻어질 수 있다. 이들 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 사용하여 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어 리간드 또는 수용체, 생물학적 또는 합성 거대분자, 또는 유기 또는 무기 물질일 수 있는 기지의 표적과 상호작용하는 펩티드를 스크리닝할 수 있다. 그러한 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 만들과 스크리닝하는 기술은 본 분야에 공지되어 있으며(Ladner 등, 미국 특허 제5,223,409호, Ladner 등, 미국 특허 제4,946,778호, Ladner 등, 미국 특허 제5,403,484호, Ladner 등, 미국 특허 제5,571,698호, 그리고 Kay 등, Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc.1996)), 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 그러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는, 예를 들어 CLONTECH Laboratories, Inc.(캘리포니아 팔로알토), Invitrogen Inc.(캘리포니아 샌디에고), New England Biolabs, Inc.(메릴랜드 비벌리), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(뉴저지 피스카타웨이)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 IL-22RA에 결합하는 단백질을 확인하기 위해 본원에 개시된 IL-22RA 서열을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
항체 단편의 다른 형태는 단일 상보성-결정 영역(CDR)을 암호화하는 펩티드이다. CDR 펩티드("최소인식단위")는 관심의 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 구성함으로써 얻어질 수 있다. 그러한 유전자는, 예를 들어 폴리머라제 연쇄반응을 사용하여 항체-생성 세포의 RNA로부터 가변영역을 합성함으로써 제조된다(예를 들어, Larrick 등, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991), Court-enay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," Monoclonal Anti-bodies: Production, Engneering and Clinical Application, Ritter 등, page 166 (Cambridge University Press 1995), 그리고 Ward 등, "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch 등, (eds.), page 137(Wiley-Liss, Inc. 1995) 참조).
또는 달리, 항-IL-22RA 항체는 "인간화된" 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다. 인간화된 모노클로날 항체는 마우스 면역글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄로부터의 마우스 상보성 결정 영역을 인간 가변 도메인으로 전이시킴으로써 생성된다. 다음에, 인간 항체의 전형적인 잔기가 쥐과 대응물의 프레임워크 영역에서 치환된다. 인간화된 모노클로날 항체로부터 유래된 항체 성분의 사용은 쥐과 불변영역의 면역원성에 관련된 잠재적인 문제들을 미연에 방지한다. 쥐과 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하는 일반적인 기술은, 예를 들어 Orlandi 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)에 설명된다. 인간화된 모노클로날 항체를 생성하는 기술은, 예를 들어 Jones 등, Nature 321: 522 (1986), Carter 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 4285(1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992), Singer 등, J. Immun. 150: 2844(1993), Sudhir, Antibody Engineering Protocols(Humana Press, hic. 1995), Kelley "Engineering Therapeutic Antibodies," Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland 등, pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 그리고 Queen 등, 미국 특허 제5,693,762호 (1997)에 의해 설명된다.
더욱이, 본 발명의 항-IL-22RA 항체 또는 항체 단편은 본 분야 및 본원에 설명된 방법을 사용하여 PEG화될 수 있다.
폴리클로날 항-유전자형 항체가 표준 기술을 사용하여, 항-IL-22RA 항체 또는 항체 단편으로 동물을 면역화함에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Green 등, "Production of Polyclonal Antisera," Methods In Molecular Biology: Immunoche-mical Protocols, Manson, pages 1-12(Humana Press 1992) 참조. 또한, Coligan, pages 2.4.1-2.4.7. 참조. 또는 달리, 모노클로날 항-유전자형 항체는 상기 설명된 기술을 사용하여, 면역원으로서 항-IL-22RA 항체 또는 항체 단편을 사용하여 제조될 수 있다. 또는 달리, 인간화된 항-유전자형 항체 또는 유인원 영장류 항-유전자형 항체가 상기 설명된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 항-유전자형 항체를 생성하는 방법은, 예를 들어 Irie, 미국 특허 제5,208,146호, Greene, 등, 미국 특허 제5,637,677호 및 Varthakavi 및 Minocha, J. Gen. Miro. 77: 1875 (1996)에 의해 설명된다.
항-IL-22RA 항체는 검출가능한 표지와 콘쥬게이트되어 항-IL-22RA 면역콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 적합한 검출가능한 표지들은, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생체발광 표지, 또는 콜로이드상 금을 포함한다. 그러한 검출가능하게 표지된 면역콘쥬게이트를 제조 및 검출하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며 하기 더 상세히 설명된다.
검출가능한 표지는 자동방사선사진술에 의해 검출되는 방사성 동위원소일 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는 3H, 125I, 131I, 35S 및 14C이다.
또한, 항-IL-22RA 면역콘쥬게이트는 형광 화합물로 표지될 수 있다. 형광으로 표지된 항체의 존재는 면역콘쥬게이트를 적합한 파장의 빛에 노출시키고 결과의 형광을 검출함으로써 측정된다. 형광 표지 화합물은 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드 및 플루오레사민을 포함한다.
또는 달리, 항-IL-22RA 면역콘쥬게이트는 항체 성분과 화학발광 화합물을 커플링함에 의해서 검출가능하게 표지될 수 있다. 화학발광 물질로 태그된 면역콘쥬게이트의 존재는 화학반응의 과정 중에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염 및 옥살레이트 에스테르를 포함한다.
유사하게, 생체발광 화합물을 사용하여 본 발명의 항-IL-22RA 면역콘쥬게이트를 표지할 수 있다. 생체발광 물질은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 화학발광 물질의 한 종류이다. 생체발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 측정된다. 표지에 유용한 생체발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿼린을 포함한다.
또는 달리, 항-IL-22RA 면역콘쥬게이트는 항-IL-22RA 항체 성분을 효소에 결합시킴으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 항-IL-22RA-효소 콘쥬게이트가 적합한 기질의 존재하에 인큐베이트될 때, 효소 부분이 기질과 반응하여, 예를 들어 분광광도법, 형광측정법 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 부분을 생성한다. 다중-특이적 면역콘쥬게이트를 검출가능하게 표지하는데 사용될 수 있는 효소의 예는 β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다.
본 발명에 따라서 이용될 수 있는 다른 적합한 표지들이 당업자에게 잘 알려져 있다. 마커 부분과 항-IL-22RA 항체의 결합은 본 분야에 공지된 표준 기술들을 사용하여 달성될 수 있다. 이와 관련된 전형적인 방법은 Kennedy 등, Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976), Schurs 등, Clin. Chim. Acta 81: 1 (1977), Shih 등, Int'l J. Cancer 46: 1101 (1990), Stein 등, Cancer Res. 50: 1330 (1990) 및 Coligan(상동)에 의해 설명된다.
더욱이, 면역화학물질 검출의 편리성 및 다능성이 아비딘, 스트렙토아비딘, 및 비오틴과 콘쥬게이트된 항-IL-22RA 항체를 사용함에 의해 증진될 수 있다(예를 들어, Wilchek 등, "Avidin-Biotin Technology," Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990), 및 Bayer 등, "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology," Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson, pages 149-162(The Humana Press, Inc. 1992) 참조).
면역분석을 수행하는 방법은 잘 확립되어 있다. 예를 들어, Cook 및 Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays," Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter 및 Ladyman, page 180 -208(Cambridge University Press, 1995), Perry, "The Role of Monoclonal Anti-bodies in the Advancement of Immlmoassay Technology," Monoclonal Antibodies: Principles and Applicatioils, Birch 및 Lennox, pages 107-120(Wiley-Liss, Inc. 1995), 및 Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996) 참조.
또한, 본 발명은 IL-22RA 유전자 발현에 대한 면역학적 진단분석을 수행하기 위한 키트를 고려한다. 그러한 키트는 IL-22RA 항체 또는 항체 단편의 존재를 나타낼 수 있는 하나 이상의 시약을 포함하는 최소 하나의 용기를 포함한다. 그러한 인디케이터 시약의 예는 방사성 활성 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생체발광 표지, 콜로이드상 금 등과 같은 검출가능한 표지를 포함한다. 또한, 키트는 IL-22RA 항체 또는 항체 단편을 사용하여 IL-22RA 단백질을 검출한다는 것을 사용자에게 알리는 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 동봉된 항체 또는 항체 단편을 사용하여 IL-22RA를 검출할 수 있다는 것을 서면 설명서에서 알려줄 수 있다. 이 서면설명서는 용기에 직접 부착되거나, 포장 삽입물의 형태로 제공될 수 있다.
9. IL-22 또는 IL-20와 IL-22 모두에 대한 IL-22RA의 결합을 길항하기 위한 항-IL-22RA 항체의 사용
본원에서 유용한 항체를 발생시키거나 선택하는 또 다른 기술은 시험관내에서 림프구를 가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드 또는 이들의 단편, 예를 들어 항원성 에피토프에 노출시키고, 파지나 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택(예를 들어, 고정된 또는 표지된 가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드 또는 이들의 단편, 예를 들어 항원성 에피토프의 사용에 의해)하는 것이다. 가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드나 이들의 단편, 예를 들어 항원성 에피토프와 같은 잠재적 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 파지(파지 디스플레이) 또는 E. coli와 같은 박테리아 상에 나타난 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 다양한 방식으로, 예를 들어 무작위 돌연변이생성 및 무작위 폴리뉴클레오티드 합성을 통해서 얻어질 수 있다. 이들 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 사용하여 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어 리간드 또는 수용체, 생물학적 또는 합성 거대분자, 또는 유기 또는 무기 물질일 수 있는 기지의 표적과 상호작용하는 펩티드를 스크리닝할 수 있다. 그러한 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 만들과 스크리닝하는 기술은 본 분야에 공지되어 있으며(Ladner 등, 미국 특허 제5,223,409호, Ladner 등, 미국 특허 제4,946,778호, Ladner 등, 미국 특허 제5,403,484호, Ladner 등, 미국 특허 제5,571,698호), 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 그러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는, 예를 들어 CLONTECH Laboratories, Inc.(캘리포니아 팔로알토), Invitrogen Inc.(캘리포니아 샌디에고), New England Biolabs, Inc.(메릴랜드 비벌리), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(뉴저지 피스카타웨이)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드 또는 이들의 단편, 예를 들어 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드와 결합하는 단백질을 확인하기 위해서 본원에 개시된 항원성 에피토프 폴리펩티드 서열을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드와 상호작용하는 이들 "결합 폴리펩티드"는 세포의 태그; 친화성 정제에 의한 상동성 폴리펩티드의 분리에 사용될 수 있으며, 이들은 약물, 독소, 방사성 핵종 등에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 또, 이들 결합 폴리펩티드는 발현 라이브러리를 스크리닝하고 활성을 중화하기 위한, 예를 들어 IL-22 리간드와 수용체를 결합시키거나, 이들 사이의 상호작용을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하거나, 또는 수용체와 바이러스를 결합시키거나, 이들의 결합을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하기 위한 분석 방법에 사용될 수 있다. 또한, 결합 폴리펩티드는 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드의 순환 수준의 측정; 잠재적인 병인이나 질환의 마커로서 가용성 또는 비-가용성 IL-22RA-포함 수용체의 검출 또는 정량을 위한 진단분석에서 사용될 수 있다. 또한, 이들 결합 폴리펩티드는 가용성 또는 멤브레인-결합 IL-22RA 단량체 수용체 또는 IL-22RA 동종이량체, 이종이량체 또는 다량체 폴리펩티드 결합(예를 들어, 리간드와의) 및 신호변환을 생체외 및 생체내에서 차단하거나 억제하는 "길항물질"로서 작용할 수 있다. 또한, 이들 결합 폴리펩티드는 항-IL-22RA 단량체 수용체 또는 항-IL-22RA 동종이량체, 이종이량체 또는 다량체 폴리펩티드로서 작용하며, IL-22 또는 IL-20 및 IL-22의 활성을 억제하는데 뿐만 아니라 수용체 활성 또는 단백질-결합을 억제하는데 유용하다. 본 발명의 천연 수용체 복합체에 대해 발생된 항체, 및 IL-22RA-에피토프-결합 항체, 그리고 항-IL-22RA 중화 모노클로날 항체는, 이들은 IL-22RA에 대해 더 특이적으로 작용하고 IL-22 또는 IL-20과 IL-22를 모두 억제할 수 있으므로, 바람직한 구체예일 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체의 길항 및 결합 활성은 각각 IL-20 또는 IL-22의 존재하에서 IL-20 또는 IL-22 증식, 신호 트랩, 루시페라제 또는 결합 분석으로, 그리고 본원에 설명된 IL-22RA-포함 가용성 수용체 및 다른 생물학적 또는 생화학적 분석으로 분석될 수 있다.
가용성 IL-22RA 수용체 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 3에 대한 항체) 또는 이들의 단편, 예를 들어 항원성 에피토프에 대한 항체는 생체내에서 IL-20, IL-22 또는 IL-20와 IL-22 모두의 염증 효과의 억제를 위해; 건선, 아토피 피부염, 염증피부상태, 내독소혈증, 관절염, 천식, IBD, 대장염, 건선 관절염, 류마티스성 관절염 또는 다른 IL-20 및 IL-22-유발 염증 상태의 치료 용도를 위해; IL-22RA 수용체를 발현하는 세포의 태그를 위해; 친화성 정제에 의한 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드의 분리를 위해; 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드의 순환 수준을 측정하기 위한 진단분석을 위해; 잠재적인 병인 또는 질환의 마커로서 가용성 IL-22RA-포함 수용체의 검출이나 정량을 위해; FACS를 이용한 분석 방법; 발현 라이브러리의 스크리닝을 위해; IL-22 또는 IL-20 작동제로서 작용할 수 있는 항-유전자형 항체의 발생을 위해; 그리고 IL-22RA 수용체 기능과 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소 또는 길항하거나, 또는 시험관내에서 및 생체내에서 IL-22 및/또는 IL-20 활성(개별적으로 또는 함께)과 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 중화 항체 또는 길항물질로서 사용될 수 있다. 적합한 직접 태그 또는 표지는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 비오틴, 억제제, 형광 마커, 화학발광 마커, 자기입자 등을 포함하며, 간접 태그 또는 표지는 중간물로서 비오틴-아비딘이나 다른 보체/항-보체 쌍의 사용을 특징으로 한다. 또한, 본원의 항체는 약물, 독소, 방사성 핵종 등에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬케이트될 수 있고, 이들 콘쥬게이트는 생체내 진단이나 치료 용도에 사용된다. 더욱이, 분석에서, 예를 들어 웨스턴 블롯이나 본 분야에 공지된 다른 분석에서, 변성 또는 비-변성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드 또는 이들의 단편을 검출하기 위해서 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드 또는 이들의 단편에 대한 항체가 시험관내에서 사용될 수 있다.
가용성 IL-22RA 수용체나 가용성 IL-22RA 동종이량체, 이종이량체 또는 다량체 수용체 폴리펩티드에 대한 항체는, 형광물질-활성화 세포 분류를 이용하는 분석 방법인, 수용체 폴리펩티드의 순환 수준을 측정하기 위한 진단분석 내의 친화성 정제를 위해서, 상응하는 수용체를 발현하는 세포를 태그하고 이들의 발현 수준을 분석하는데 유용하다. 더욱이, 이가 항체, 및 항-유전자형 항체는 IL-22RA 리간드인 IL-22 또는 IL-20의 효과를 의태하는 작동제로서 사용될 수 있다.
또한, 본원의 항체는 약물, 독소, 방사성 핵종 등에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이트될 수 있으며, 이들 콘쥬게이트는 생체내에서 진단용 또는 치료용으로 사용된다. 예를 들어, 가용성 IL-22RA 수용체나 가용성 IL-22RA 동종이량체, 이종이량체 또는 다량체 수용체 폴리펩티드를 인식하는 항체 또는 결합 폴리펩티드를 사용하여 상응하는 항-보체 분자(즉, IL-22RA-포함 가용성 또는 멤브레인-결합 수용체)를 발현하는 조직이나 기관을 확인하거나 치료할 수 있다. 더 구체적으로, 가용성 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드나, 또는 이들의 생체활성 단편이나 부분에 대한 항체가 검출가능한 또는 세포독성 분자에 커플링되고, IL-22RA-발현 암과 같은 IL-22RA-포함 수용체를 발현하는 세포, 조직 또는 기과늘 갖는 포유동물에 송달된다.
적합한 검출가능한 분자는 IL-22RA-포함 수용체 폴리펩티드와 결합하는 폴리펩티드, 예를 들어 "결합 폴리펩티드"(상기 개시된 결합 펩티드를 포함함), 항체, 또는 이들의 생체활성 단편이나 부분에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 적합한 검출가능한 분자는 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 마커, 화학발광 마커, 자기입자 등을 포함한다. 적합한 세포독성 분자가 폴리펩티드나 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있으며, 이들은 박테리아 또는 식물 독소(예를 들어, 디프테리아 독소, Pseudomonas 외독소, 리신, 아브린 등) 뿐만 아니라, 치료용 방사성 핵종, 예를 들어 요오두-131, 레늄-188 또는 이트륨-90을 포함한다(폴리펩티드나 항체에 직접적으로 부착되거나, 예를 들어 킬레이트 부분의 통해 간접적으로 부착된다). 또한, 결합 폴리펩티드나 항체는 아드리아마이신과 같은 세포독성 약물과 콘쥬케이트될 수 있다. 검출가능한 또는 세포독성 분자의 간접 부착을 위해서, 검출가능한 또는 세포독성 분자는 보체/항-보체 쌍의 한 구성원과 콘쥬게이트될 수 있으며, 이 때 나머지 구성원이 결합 폴리펩티드나 항체 부분에 결합된다. 비오틴/스트렙토아비딘이 이들 목적에 알맞은 전형적인 보체/항-보체 쌍이다.
또 다른 구체예에서, 결합 폴리펩티드-독소 융합 단백질 또는 항체-독소 융합 단백질이 표적화된 세포나 조직 억제 또는 절제(예를 들어, 암세포나 조직을 치료하기 위한)에 사용될 수 있다. 또는, 결합 폴리펩티드가 다기능 도메인(즉, 활성화 도메인 또는 리간드 결합 도메인, 더하기 표적화 도메인)을 가지는 경우, 표적화 도메인만을 포함하는 융합 단백질이 검출가능한 분자, 세포독성 분자 또는 관심의 세포 또는 조직 종류에 대한 상보성 분자를 검출하는데 적합할 수 있다. 단일 도메인만을 융합 단백질이 상보성 분자를 포함하는 경우, 항-보체 분자는 검출가능한 또는 세포독성 분자와 콘쥬게이트될 수 있다. 따라서, 그러한 도메인-상보성 분자 융합 단백질은 일반적인 항-보체-검출가능한/세포독성 분자 콘쥬게이트의 세포/조직-특이적 송달을 위한 일반적인 표적화 비히클을 나타낸다.
다른 구체예에서, 결합 폴리펩티드-시토카인 또는 항-IL-22RA 수용체 항체가 고도증식 세포를 표적으로 하는 경우, IL-22RA 결합 폴리펩티드-시토카인 또는 항체-시토카인 융합 단백질을 사용하여 표적 조직(예를 들어, 비장암, 췌장앙, 혈액암, 림프암, 결장암 및 골수암)의 생체내에서 살해를 증진시킬 수 있다(일반적으로 Homick 등, Blood 89:4437-47, 1997 참조). 설명된 융합 단백질은 시토카인을 원하는 작용 부위에 표적화할 수 있으며, 이로써 시토카인의 국부 농도가 상승된다. 적합한 항-IL-22RA 단량체, 동종이량체, 이종이량체 또는 다량체 항체는 바람직하지 않은 세포나 조직(즉, 종양 또는 백혈병)을 표적화하고, 융합 시토카인은 이펙터 세포에 의한 개선된 표적 세포 융해를 매개한다. 이런 목적에 적합한 시토카인은, 예를 들어 인터류킨 2 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극인자(GM-CSF)를 포함한다.
또는 달리, 본원에 설명된 IL-22RA 수용체 결합 폴리펩티드 또는 항체 융합 단백질을 사용하여 IL-22RA 수용체-조절 세포자살 경로를 직접 자극함으로써 표적 조직의 생체내 살해를 증진시킬 수 있으며, 그 결과 IL-22RA-포함 수용체를 발현하는 과증식 세포가 세포사한다.
10. IL-22RA 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 IL-22RA에 대한 항체의 치료적 사용
가용성 IL-22RA 활성을 갖는 아미노산 서열을 사용하여 IL-22RA 리간드 IL-20 및 IL-22(단독으로 또는 함께)를 결합시켜 IL-22RA 리간드와 내인성 IL-22RA 수용체의 결합을 방지함으로써 면역 시스템을 조절할 수 있다. 또, 항-IL-22RA 항체와 같은 IL-22RA 길항물질을 사용하여 IL-22RA 리간드와 내인성 IL-22RA 수용체의 결합을 억제함으로써 면역 시스템을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명은 IL-22RA 활성을 갖는 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드(예를 들어, 가용성 IL-22RA 폴리펩티드, IL-22RA 폴리펩티드 단편, IL-22RA 유사체(예를 들어, 항-IL-22RA 항-유전자형 항체), 및 IL-22RA 융합 단백질)를 이 폴리펩티드를 적합한 양만큼 가지고 있지 않은 피험자나, 또는 과량의 IL-22RA 리간드를 생성하는 피험자에게 사용하는 것을 포함한다. 또한, IL-22RA 길항물질(예를 들어, 항-IL-22RA 항체)를 사용하여 과량의 IL-22RA 리간드 또는 IL-22R를 생성하는 피험자를 치료할 수 있다. 적합한 피험자는 포유동물, 예를 들어 사람을 포함한다. 예를 들어, 그러한 IL-22RA 폴리펩티드 및 항-IL-22RA 항체는 건선, 아토피 피부염, 염증피부상태, 건선 관절염, 관절염, 내독소혈증, 천식, 염증성 장 질환(IBD), 대장염, 및 본원에 개시된 다른 염증상태의 치료에서 IL-20 및 IL-22(단독으로 또는 함께)와 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 유용하다.
더 나아가, 우리는 IL-22RA 수용체가 T-세포 유발 인자(IL-22)(서열 번호 6; Dumoutier, L. 등, Proc. Nat'1. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000; 마우스 IL-22 서열은 Dumontier 등, J. immunol. 164: 1814-1819, 2000에 나타나 있다)라고 명명된 리간드와 결합한다는 것을 알았다. 더욱이, 일반적으로 소유하는 zcytor11(IL-22RA)(미국 특허 제5,965,704호) 및 CRF2-4 수용체가 또한 이종이량체로서 IL-22와 결합한다(WIPO 공보 WO00/24758호; Dumontier 등 J. Immunol. 164: 1814-1819, 2000; Spencer, SD 등 J. Exp. Med. 187: 571-578, 1998; Gibbs, VC 및 Pennica Gene 186: 97-101, 1997(CRF2-4 cDNA); Xie, MH 등, J. Biol. Chem. 275: 31335-31339, 2000; 및 Kotenko, SV 등, J. Biol. Chem. 276:2725-2732, 2001). 더욱이, IL-10β 수용체가 IL-22에 대한 수용체로서 포함될 수 있는데, 이것은 CRF2-4와 동의어인 것으로 여겨진다(Dumoutier, L 등 Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:10144-10149, 2000; Liu Y 등, J Immunol. 152;1821-1829, 1994 (IL-10R cDNA)). 더욱이, 우리는 IL-22RA 수용체가 IL-20(서열 번호 8; WIPO 공보 No. WO 99/27103)라고 명명된 리간드와 결합한다는 것을 알았다. 바람직한 구체예의 범위 내에서, IL-22RA(서열 번호 3)의 가용성 수용체 형태는 단량체, 동종이량체, 이종이량체, 또는 다량체이며, 이것은 생체내에서 IL-22 및 IL-20과 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화한다. 또, 그러한 IL-22RA 단량체, 동종이량체, 이종이량체, 또는 다량체에 대한 항체 및 결합 폴리펩티드는, 본원에 설명된 대로, IL-22RA 활성의 길항물질로서, 그리고 IL-20 및 IL-22 길항물질로서(단독으로 또는 함께) 작용한다.
이에 더하여, 우리는 본원에서 폴리클로날 및 모노클로날 중화 항-IL-22 항체가 세포 기제 중화분석에서 IL-22 및 IL-20 활성과 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화한다는 것을 설명하고 증명했다.
IL-22는 Il-9의 존재하에 유도되는 것으로 나타났으며, Th1-형 면역반응, 및 염증을 촉진하는데 연루된다고 의심된다. IL-9는 면역기능의 증식, 활성화, 분화 및/또는 유도를 다양한 방식으로 자극하며, 천식, 폐 비만세포증 및 다른 질환들에 관련될 뿐만 아니라 STAT 경로를 활성화한다. IL-22 또는 IL-9 기능에 대한 길항물질은 그러한 사람의 질환에 대해 유리한 용도를 가질 수 있다. 본 발명은 그러한 IL-22의 신규한 길항물질을 제공한다.
IL-22는 급성 단계 반응물질, 예를 들어 혈청 아밀로이드 A(SAA), α1-안티키모트립신, 및 합토글로빈의 생성을 상향조절하는데 연루되고, IL-22 발현은 생체내에 지질다당류(LPS)의 주입시 증가되는 것으로 나타났으며, 이는 IL-22가 염증반응에 연루된다는 것을 시사한다(Dumoutier, L. 등 Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000). SAA와 같은 급성 단계 단백질의 생성은 s 단기 생존 메카니즘으로 생각되며, 이 경우에는 염증이 유리하지만, 더 긴 기간 동안의 급성 단계 단백질의 지속은 만성 염증에 기여하여 인체의 건강에 해로울 수 있다. 예를 들어, Uhlar, CM 및 Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265: 501-523, 1999, 그리고 Baumann H. 및 Gauldie, J. Immunology Today 15: 74-80, 1994 참조. 더욱이, 급성 단계 단백질인 SAA는 몇몇 만성 염증 질환의 발병기전에 관련되고, 죽상경화증과 류마티스성 관절염에 관련되며, 그리고 아밀로이드증에서 퇴적되는 아밀로이드 A 단백질의 전구물질이다(Uhlar, CM 및 Whitehead, 상동). 따라서, IL-22가 전-염증성 분자로 작용하여 SAA의 생성을 유발함에 따라서, 염증 질환 및 IL-22에 의해 유발된 급성 단계 반응 단백질에 관련된 다른 질환들을 치료하는데 길항물질이 유용할 것이다. 그러한 길항물질이 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어, IL-22 유발 또는 IL-9 유발 염증을 감소시키는 방법은 가용성 IL-22RA-포함 수용체의 조성물을 염증을 감소시키는데 충분한 양으로 염증을 가진 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 또한, 염증을 가진 포유동물에서 염증반응을 억제하는 방법은, (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 수준을 측정하는 단계; (2) 허용되는 제약학적 비히클 중에 본원에 설명된 가용성 IL-22RA 시토카인 수용체 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 투여 후의 수준을 측정하는 단계; (4) 단계 (1)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준과 단계 (3)에서의 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준을 비교하는 단계를 포함하며, 여기에는 혈청 아밀로이드 A 단백질 수준의 증가 없음 또는 감소가 염증반응의 억제를 나타내는 것이다. 본원에 설명된 실험적 증거는 가용성 수용체 및 항체 같은 IL-22 길항물질이 염증 질환의 생체내 모델에서 SAA의 수준을 실제로 감소시킨다는 것을 나타내며, 이는 IL-22과 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 것이 항-염증 효과를 가진다는 것을 나타내는 것이다.
증거는 IL-20 및 그것의 수용체의 역할이 건선에 연루된다는 것을 나타낸다. 이 다유전자 피부질환은 각질세포 증식의 증가, 각질세포 분화의 변형, 그리고 피부로의 면역세포의 침윤을 특징으로 한다. 건선에서 IL-20의 역할에 대한 제 1 라인의 증거는 사람의 건선 이상성을 닮은 트랜스젠 마우스에서 각화과다증과 두꺼워진 표피가 관찰된다는 것이다. 결함 있는 각질화에 관련된 것으로 생각되는, 당김미세섬유 수의 감소가 인간 건선의 두드러진 특징이다. 미토콘드리아 내의 세포함유물이 마우스에서 화학적으로 유도된 그리고 천연발생한 과다형성 피부상태 모두에서 발견되었다. 세포함유물의 원인 및 미토콘드리아 기능에 대한 이들의 효과는 아직 알려져 있지 않다. IL-20 트랜스젠 마우스는 인간 건선에서 관찰된 특징들을 대부분 나타낸다.
더욱이, IL-20 수용체 mRNA(IL-20RA과 IL-20RB mRNA 모두)는 정상 피부에 비하여 인간 건선 피부에서 현저히 상향조절되는데, 이는 건선에서의 IL-20의 역할을 시사한다. IL-20 수용체 서브유닛은 모두 표피 전체의 각질세포에서 발현되며, 또한 면역세포와 내피세포의 서브셋에서도 발현된다. 우리는 활성화된 IL-20 수용체의 증가된 발현이 내피세포, 면역세포 및 각질세포 사이의 상호작용을 변형시킬 수 있으며, 이로써 각질세포 증식 및 분화의 조절이 곤란해진다는 것을 제안한다. 게다가, IL-22RA 수용체가 녹아웃된 본원에 설명된 마우스 녹아웃 데이타는 IL-22RA가 트랜스젠 동물의 피부에서 IL-20-유발 염증 효과에 필요했다는 것을 나타낸다. 이들 결과는, 예를 들어 IL-22RA 유전자 녹아웃에 의해, 또는 유사하게 본 발명의 IL-22RA에 대한 중화 모노클로날 항체에 의해 IL-22RA 활성을 효과적으로 차단하는 것이, 예를 들어 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-20에 의해 유발된 다른 염증성 질환, 및/또는 IL-22 유발된 IBD, 관절염, 천식, 건선 관절염, 대장염, 염증피부상태, 및 아토피 피부염에서 IL-20-유발 피부 효과뿐만 아니라 IL-22-유발 피부 효과를 유사하게 감소시킨다는 증거를 제공했다.
더욱이, IL-20은 인간 각질세포 HaCaT 셀라인에서 신호변환을 자극하며, 이는 피부에서의 이 신규한 리간드의 직접적 작용을 시사한다. 게다가, 각질세포에서 활성이며 피부에서의 증식 및 전-염증성 신호에 연루된다고 알려진 IL-1β, EGF 및 TNF-α는 IL-20에 대한 반응을 증진시킨다. IL-20 수용체를 발현하는 HaCaT 및 BHT 세포 모두에서, IL-20은 STAT3을 통해 신호를 내보낸다.
상기 논의 및 하기 실시예에 나타낸 대로, IL-20은 건선의 발병기전에 연루된다. 본 발명은 특히 IL-20과 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 제제를 투여함으로써 건선을 치료하는 방법이다. IL-20에 대한 길항물질은 가용성 IL-22RA와 같은 IL-20와 결합하는 가용성 수용체거나, 또는 IL-20이나 IL-20 수용체와 결합하는 항체, 단일사슬 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항-IL-22RA 항체일 수 있다. 따라서, 길항물질은 IL-20 수용체의 활성화를 방지할 것이다.
더욱이, IL-20과 IL-22는 공통 수용체로서 IL-22RA를 공유하기 때문에, 가용성 IL-22RA와 같은 길항물질, 또는 IL-22RA 수용체와 결합하는 항체, 단일사슬 항체 또는 항체의 단편이 IL-22 또는 IL-20과 IL-22 활성 모두와 동시에 결합하거나, 또는 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 사용될 수 있다.
건선은 전세계 인구의 1 내지 2%까지에서 발생하는 가장 흔한 피부 질환 중 하나이다. 이것은 홍반, 날카롭게 구획된 구진 및 둥근 구진과 은백색의 운모비늘로 덮인 것을 특징으로 하는 만성 염증성 피부장애이다. 건선의 피부 병소는 일정치 않게 가렵다. 상처난 영역이 주로 건선의 병소로 발전한다. 추가로, 감염, 스트레스, 및 약물, 예를 들어 리튬, 베타 차단제 및 항말라리아제를 포함하는 다른 외부 요인들이 건선을 악화시킬 수 있다.
건선의 가장 흔한 변형은 플라크 형이라고 하는 것이다. 플라크 형 건선을 가진 환자는 안정한 서서히 성장하는 플라크를 가질 것이며, 이것은 기본적으로 오랜 기간 동안 변하지 않고 남아 있는다. 플라크 건선이 발생하는 가장 흔한 영역은 팔꿈치 관절, 둔부 사이 및 두피이다. 병발은 대칭이려는 경향이 있다. 역위 건선은 겨드랑이, 사타구니, 유방 영역, 및 배꼽을 포함하는 겹친피부 영역에서 발생하며, 이것은 또한 두피, 손바닥, 및 발바닥에서 발생하려는 경향이 있다. 개별적 병소는 날카롭게 구획된 플라크지만, 그들의 위치로 인해 습할 수도 있다. 플라크 형 건선은 일반적으로 서서히 전개되며 무통성 과정이다. 그것은 거의 자발적으로 완화되지 않는다.
발진 건선(방울 건선)은 아이들과 10대 후반의 청소년에서 가장 흔하다. 이것은 건선이 없는 개체에서나 만성 플라크 건선을 가진 개체에서 급격하게 전개된다. 환자는 주로 베타-용혈성 streptococci로 상기도가 감염된 후에 많은 작은 홍반, 비늘이 벗겨지는 플라크를 나타낸다. 또한, 건선을 가진 환자에서는 농포 병소가 발생할 수 있다. 이들은 손바닥과 발바닥에 국한될 수 있거나, 또는 만연되어 열, 불쾌감, 설사, 및 관절통과 관련될 수 있다.
건선을 가진 모든 환자의 약 반에서 점 함목, 손톱 비후 또는 손발톱밑 각화과다증으로서 나타나는 손톱 병발이 나타난다. 건선을 가진 환자의 약 5 내지 10%는 관련된 관절병을 가지며, 이들은 손톱 병발을 가진 환자에서 가장 흔하게 발견된다. 일부에서는 전형적인 류마티스성 관절염이 동시에 발생하지만, 대부분은 건선에 관련된 5가지 종류 중 하나에 속하는 관절 질환을 가지며, 이들 관절 질환은 다음과 같다: (1) 단일 또는 소수의 소관절에 제한된 질환(70%); (2) 음성혈청반응 류마티스성 관절염-형 질환; (3) 먼 지골간 관절의 병발; (4) "관절염 단절"이 발생되는 몇몇 파괴성 관절염; 및 (5) 척추에 제한된 질환.
건선은 IL-22, IL-20, 또는 IL-20과 IL-22 모두와 결합하거나, 또는 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 제제를 투여함으로써 치료될 수 있다. 바람직한 길항물질은 IL-22RA(서열 번호 3)와 같은 IL-20 및 IL-22에 대한 가용성 수용체, 또는 본 발명의 중화 항체와 같은 IL-22RA 수용체와 결합하는 항체, 항체 단편 또는 단일사슬 항체이다. 그러한 길항물질은 단독으로 또는 윤활제, 각질용해제, 국소 겉질스테로이드제, 국소 비타민 D 유도체, 안트랄린, 전신성 항대사물질, 예를 들어 메토트렉세이트, 소사렌-자외선-요법(PWA), 에트레티네이트, 이소트레티오인, 시클로스포린, 및 국소 비타민 D3 유도체 칼시포트리올과 같은 다른 확립된 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 더욱이, 그러한 길항물질은 피하, 정맥내, 또는 길항물질을 함유하는 크림 또는 경치 패치를 사용한 경피 경로로 개체에게 투여될 수 있다. 피하 투여되는 경우에 길항물질은 하나 이상의 건선 플라크에 주사될 수 있다. 경피 투여되는 경우에 길항물질은 길항물질을 함유하는 크림, 연고, 고약, 또는 용액을 사용하여 플라크 위에 직접 투여될 수 있다.
IL-20 또는 IL-22에 대한 길항물질은 천식, 기관지염 또는 낭성 섬유증 또는 다른 염증성 폐질환을 가진 사람에게 이 질환을 치료하기 위해서 투여될 수 있다. 길항물질은 정맥내, 피하, 기관지 세척, 및 길항물질을 함유하는 흡입제의 사용을 포함하는 어떤 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다.
IL-22RA cDNA에 상응하는 mRNA의 조직 분포 분석은 mRNA 수준이 태반과 비장에서 최고이며, IL-22RA가 결합하는 리간드(IL-22)가 급성 단계 반응의 유발을 포함하는 염증반응을 유발하는데 연루된다는 것을 나타냈다(Dumoutier, L. 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97: 10144-10149, 2000). 따라서, 본 발명의 특정한 구체예는 건선, 건선 관절염, 아토피 피부염, 염증피부상태, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환(IBD), 크론씨병, 게실증, 천식, 췌장염, I형 당뇨병(IDDM), 췌장암, 췌장염, 그레이브스씨병, 결장 및 장 암, 내독소혈증, 외상, 수술 또는 감염으로 인한 염증; 아밀로이드증; 비장비대증; 이식편 대 숙주병; 및 염증 억제, 면역 억제, 조혈, 면역, 염증 또는 림프양 세포, 마크로파지, T-세포(Th1 및 Th2 세포를 포함한다), 병원균이나 항원에 대한 면역반응의 억제가 바람직한 경우나, 또는 IL-22 또는 IL-20 시토카인의 억제가 바람직한 다른 예들과 같은, 염증 및 면역 질환 또는 이상에서 길항물질로서 가용성 IL-22RA 및 항-IL-22RA 항체의 사용에 관한 것이다.
더욱이, 본원에 설명된 IL-22RA 폴리펩티드와 결합하는 항체 또는 결합 폴리펩티드, 및 IL-22RA 폴리펩티드 자체는 다음에 유용하다.
1) 급성 염증, 외상, 조직손상, 수술, 패혈증 또는 감염으로 인한 염증, 및 천식, 염증성 장 질환(IBD), 만성 대장염, 비장비대증, 류마티스성 관절염, 재발성 급성 염증성 에피소드(예를 들어, 결핵)와 같은 만성 염증성 질환의 치료에서, 그리고 아밀로이드증, 및 죽상경화증, 캐슬만씨병, 천식, 및 급성 단계 반응의 유발에 관련된 다른 질환의 치료에서 IL-20 또는 IL-22 수용체에 의한 신호화를 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화.
2) IDDM, 다발성 골수종(MS), 전신홍반성 루프스(SLE), 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 및 IBD와 같은 자가면역질환의 치료에서 IL-20 또는 IL-22 수용체에 의한 신호화를 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화함으로써 IL-22RA에 의한 면역 세포(예를 들어, 림프구, 단구, 백혈구)에서의 신호화를 방지 또는 억제(Hughes C 등, J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). 또는 달리, IL-22RA-포함 수용체에 대한 모노클로날 항체(MAb)와 같은 항체가 또한 자가면역질환을 치료하기 위해 원치 않는 면역 세포를 고갈시키기 위한 길항물질로서 사용될 수 있다. 천식, 알레르기 및 다른 아토피성 질환이 면역반응을 억제하거나 해로운 세포를 고갈시킬 수 있는, 예를 들어 가용성 IL-22RA 가용성 수용체에 대한 MAb로 치료될 수 있다. 또, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체를 사용하여, IL-22RA에 의한 신호화를 차단, 억제, 감소 또는 길항하는 것은 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포의 질환에도 유리할 수 있다. IDDM, NIDDM, 췌장염, 및 췌장암종이 유리할 수 있다. MAb를 길항하는 것이 암의 성장을 억제하고 면역-매개 살해를 표적으로 하는 경우, IL-22RA는 암에 대한 MAb 치료법의 표적으로서 작용할 수 있다(Holliger P 및 Hoogenboom H:Nature Bio-tech. 16: 1015-1016, 1998). 또한, 가용성 IL-22RA에 대한 MAb는 사구체경화증, 막 신경병증, 아밀로이드증(이것은 다른 조직들 중 신장에서도 발생한다), 신장 동맥경화증, 여러 기관의 사구체신염, 신장의 섬유 증식성 질환과, 뿐만 아니라 SLE, IDDM, II형 당뇨병(NIDDM), 신종양 및 다른 질환에 관련된 신기능부전과 같은 신장병증을 치료하는데 유용할 수 있다.
3) IDDM, MS, SLE, 중증 근무력증, 류마티스성 관절염, 및 IBD와 같은 자가면역질환의 치료에서 IL-20 또는 IL-22 수용체에 의한 신호화의 작동, 증진, 증가 또는 개시. 항-IL-22RA 중화 및 모노클로날 항체는 자가면역을 개선하는 시토카인이나 세포표면 단백질을 분화시키거나, 이들의 증식을 변형시키거나, 또는 생성을 변화시킬 수 있는 신호 림프구 또는 다른 면역 세포일 수 있다. 구체적으로, 시토카인 분비의 교대 패턴에 대한 T-헬퍼 세포 반응의 조절은 질환을 개선할 수 있는 자가면역반응을 빗나가게 한다(Smith J A 등, J. Immunol. 160: 4841-4849, 1998). 유사하게, 작동성 항-가용성 IL-22RA, 항-가용성 IL-22RA/CRF2-4 이종이량체 및 다량체 모노클로날 항체를 사용하여, 천식, 알레르기 및 아토피성 질환에 연루된 면역 세포를 신호화하고, 고갈시키고, 빗나가게 할 수 있다. 또한, IL-22RA에 의한 신호화는 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포의 질환에서 유리할 수 있다. IDDM, NIDDM, 췌장염, 및 췌장암종이 유리할 수 있다. MAb를 길항하는 것이 암의 성장을 억제하고 면역-매개 살해를 표적으로 하는 경우, IL-22RA는 췌장암에 대한 MAb 치료법의 표적으로서 작용할 수 있다(Tutt, AL 등 J.Immunol. 161: 3175-3185, 1998). 유사하게, 신장세포암종이 본 발명의 IL-22RA-포함 가용성 수용체에 대한 모노클로날 항체로 치료될 수 있다.
본원에 설명된 가용성 IL-22RA 폴리펩티드는 자가면역질환, 아토피성 질환, NIDDM, 췌장염 및 상기 설명된 신기능부전의 치료에서, 단독으로 또는 함께 IL-22 또는 IL-20 활성과 결합하거나, 또는 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 사용될 수 있다. IL-22RA의 가용성 형태는 Th 세포에 의해 매개된 항체 반응을 촉진하거나 및/또는 림프구나 다른 면역 세포에 의한 IL-4 또는 다른 시토카인의 생성을 촉진하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 가용성 IL-22RA-포함 수용체는 IL-20 또는 IL-22 시토카인의 길항물질로서 유용하다. 그러한 길항 효과는 IL-20 또는 IL-22의 직접적 중화나 결합에 의해 달성된다. 길항 용도에 더하여, 본 발명의 가용성 수용체는 IL-22에 결합하여 IL-20 또는 IL-22 시토카인에 대한 캐리어 단백질로서 작용하며, 이로써 이 리간드를 체내의 상이한 조직, 기관, 세포로 수송한다. 이와 같이, 본 발명의 가용성 수용체는 가용성-수용체-리간드 복합체를 조직, 특이적 면역 세포, 또는 종양과 같은 특이적 부위로 보내는 분자, 폴리펩티드 또는 화학적 부분에 융합되거나 커플링될 수 있다. 예를 들어, 급성 감염이나 어떤 암에서는 IL-22의 작용에 의한 염증 및 국소 급성 단계 반응 단백질의 유발로 인한 이점이 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 가용성 수용체는 IL-20 또는 IL-22의 작용을 특이적으로 지휘하는데 사용될 수 있다. Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; 및 Fernandez-Botran R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-513, 2000 참조.
더욱이, 본 발명의 가용성 수용체는 IL-22 또는 IL-20을 안정화시키는데 사용될 수 있으며, 분해 또는 클리어런스로부터 리간드를 안정화시킴으로써, 또는 리간드를 체내의 작용 부위에 표적화함으로써, 생체이용률, 치료 수명, 및/또는 리간드의 효능이 증가된다. 예를 들어, 자연발생 IL-6/가용성 IL-6R 복합체는 IL-6을 안정화시키고, gp130 수용체를 통해 신호화할 수 있다. 예를 들어, Cosman, D.(상동) 및Fernandez-Botran, R.(상동) 참조. 더욱이, IL-22RA는 리간드/가용성 수용체 복합체가 포함되도록 IL-22와 같은 동족 리간드와 조합될 수 있다. 그러한 복합체는 동료 수용체 서브유닛, 예를 들어 pDIRS1(L-20RB) 또는 CRF2-4(IL-1ORB)을 나타내는 세포로부터의 반응을 자극하는데 사용될 수 있다. IL-22RA/리간드 복합체의 세포 특이성은 리간드만 단독 투여되었을 때 보여진 것과 다를 수 있다. 더욱이, 이 복합체는 반감기, 용량/반응 및 기관 또는 조직 특이성에 영향을 미치는 것과 같이, 구별되는 약물동력학적 특성을 가질 수 있다. 따라서, IL-22RA/IL-22 또는 IL-22RA/IL-20 복합체는 면역반응을 증진시키거나 혈관사이세포를 자극하거나 간세포를 자극하는 작동 활성을 가질 수 있다. 또 다르게는, 복합체와의 이종이량체인 신호화 서브유닛을 발현하는 조직만이 IL6/IL6R 복합체에 대한 반응에 유사한 영향을 미칠 수 있다(Hirota H. 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 92: 4862-4866, 1995; Hirano, T. in Thomason, A. "The Cytokine Handbook", 3판, p. 208-209). IL12와 CNTF에 대한 가용성 수용체/시토카인 복합체가 유사한 활성을 나타낸다.
더욱이, 염증은 침입 원인을 방어하려는 유기체에 의한 보호 반응이다. 염증은 많은 세포 및 체액 매개인자를 수반하는 연속단계적 사건이다. 한편, 염증반응의 억제는 숙주에게 면역손상을 남길 수 있지만, 억제하지 않고 그대로 둘 경우에, 염증은 만성 염증성 질환(예를 들어, 건선, 관절염, 류마티스성 관절염, 다발성 골수종, 염증성 장 질환 등), 패혈 쇼크 및 다기관 기능부전과 같은 심각한 합병증을 가져올 수 있다. 중요하게는, 이들 다양한 질환 상태는 공통의 염증 매개인자를 공유한단. 염증을 특징으로 하는 집합적 질환들은 사람의 질병률 및 사망률에 큰 영향을 미친다. 따라서, IL-22RA, 및 항-IL-22RA 항체와 같은 항-염증 단백질이, 천식 및 알레르기에서 자가면역성 및 패혈증 쇼크까지, 수많은 인간 및 동물의 질환에 대해 결정적인 치료적 잠재력을 가질 수 있다는 것이 분명하다.
1. 관절염
골관절염, 류마티스성 관절염, 상처로 인한 관절염성 관절 등을 포함하는 관절염은 본 발명의 IL-22RA 폴리펩티드와 같은 항-염증 단백질의 치료적 사용이 유리한 흔한 염증성 이상이다. 예를 들어, 류마티스성 관절염(RA)은 전 신체에서 발생하는 전신성 질환이며, 관절염의 가장 흔한 형태 중 하나이다. 이것은 관절 내층의 막의 염증을 특징으로 하며, 통증, 강직, 온기, 붉어짐 및 부종을 일으킨다. 염증 세포는 뼈와 연골을 소화시킬 수 있는 효소를 방출한다. 류마티스성 관절염의 결과로서, 염증을 일으킨 관절 내층, 즉 활액막이 뼈와 연골에 침입하여 이들을 손상시킬 수 있으며, 그 결과 다른 생리학적 효과 중에서도 특히 관절 퇴화와 심한 통증을 가져온다. 관련된 관절은 그것의 모양과 정렬상태를 잃을 수 있으며, 통증이 생기고 움직일 수 없게 된다.
류마티스성 관절염(RA)은 특히 심각한 장애 및 사망률의 증가를 가져오는 염증 및 후속하는 조직 손상을 특징으로 하는 면역-매개 질환이다. 다양한 시토카인이 류마티스성 관절에서 국소적으로 생성된다. 수많은 연구는 2개의 원형적 전-염증성 시토카인인 IL-1과 TNF-알파가 활액 염증에 연루된 메카니즘 및 진행성 관절 파괴에서 중요한 역할을 한다는 것을 증명했다. 게다가, RA를 가진 환자에게 TNF-알파 및 IL-1 억제제를 투여하는 것은 염증의 임상적 징후와 생물학적 징후에 극적인 개선을 가져왔으며, 뼈 미란과 연골 파괴에 대한 방사선적 징후를 감소시켰다. 그러나, 이들 고무적인 결과에도 불구하고 상당한 퍼센트의 환자는 이들 제제에 반응하지 않았으며, 이는 관절염의 병태생리학에 다른 매개인자가 또 연루된다는 것을 시사한다(Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149, 2002). 이들 매개인자들 중 하나가 IL-20 또는 IL-22일 수 있으며, IL-22 또는 IL-20과 결합하거나 이들을 억제하는 그러한 분자, 예를 들어 IL-22RA 폴리펩티드, 또는 항-IL-22RA 항체 또는 결합 파트너가 류마티스성 관절염 및 다른 관절염 질환을 감소시킬 수 있는 유용한 치료제로서 작용할 수 있다.
본 분야에 류마티스성 관절염에 대한 몇몇 동물 모델이 공지되어 있다. 예를 들어, 콜라겐-유발 관절염(CIA) 모델에서, 사람의 류마티스성 관절염과 아주 유사한 만성 염증성 관절염이 마우스에서 발생한다. CIA는 RA와 유사한 면역학적 및 병리학적 특징들을 공유하므로, 이것은 CIA를 잠재적인 인간 항-염증 화합물을 스크리닝하기 위한 이상적인 모델로 만든다. CIA 모델은 그것이 발생하기 위해서 면역반응, 및 염증반응에 의존하는 마우스에서 잘 알려진 모델이다. 면역반응은 콜라겐에 대한 반응으로 B-세포와 CD4+ T-세포의 상호작용을 포함하는데, 이것은 항원으로서 제공되고, 항-콜라겐 항체의 생성을 가져온다. 염증 단계는 이들 항체의 일부가 마우스의 자생 콜라겐과 교차반응하고 보체 연속단계를 활성화시킨 결과에 따른, 염증 매개인자로부터의 조직반응의 결과이다. CIA 모델을 사용하는 것의 이점은 발병기전의 기초 메카니즘이 알려져 있다는 것이다. II형 콜라겐에 대한 관련된 T-세포 및 B-세포 에피토프가 확인되었으며, 면역-매개 관절염에 관련된 다양한 면역학적(예를 들어, 지연형 과민증 및 항-콜라겐 항체) 및 염증성(예를 들어, 시토카인, 케모카인 및 매트릭스-분해 효소) 파라미터들이 측정되었고, 따라서 CIA 모델에서 시험 화합물 효능을 평가하는데 사용될 수 있다(Wooley, Curr. Opin. Rhum. 3: 407-20, 1999; Williams 등, Immunol. 89: 9784-788, 1992; Myers 등, Life Sci. 61: 1861-78,1997; 및 Wang 등, Immunol. 92: 8955-959, 1995).
이들 CIA 모델 마우스에 가용성 IL-22RA2 포함 폴리펩티드(zcytor16), 예를 들어 zcytor16-Fc4 또는 다른 IL-22RA2 가용성 및 융합 단백질을 투여하여, 질환의 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경시키는데 사용된 IL-22에 대한 길항물질로서 IL-22RA2의 사용을 평가하였다. 더욱이, IL-22RA2에 의한 IL-22의 억제를 나타낸 결과는, IL-22RA나 이에 대한 항체와 같은, 다른 IL-22 길항물질도 질환의 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경시키는데 사용될 수 있다는 개념에 대한 증거를 제공한다. IL-22RA2의 리간드인 IL-22가 류마티스성 관절염의 발병기전에 연루되는 SAA의 생성을 유도하고, IL-22RA2는 시험관내 및 생체내에서 IL-22와 SAA 활성을 억제할 수 있다고 나타났기 때문에, IL-22RA2 포함 폴리펩티드, 예를 들어 zcytor16-Fc4 또는 다른 IL-22 가용성 수용체(예를 들어, IL-22RA; 서열 번호 3) 및 항-IL-22RA 항체, 그리고 융합 단백질의 전신 또는 국소적 투여는 RA에서 면역반응을 잠재적으로 억제할 수 있다. 10ug zcytorl6-Fc의 주입(4주간 주 당 3회)은 질환 스코어(포 스코어, 염증 또는 질환의 발생)를 현저히 감소시켰다. 다른 가능한 치료제는 IL-22RA 폴리펩티드, 항-IL-22RA 항체, 또는 항 IL-22 항체나 결합 파트너 등을 포함한다.
한 그룹은 항-마우스 IL-22 항체가 대조군 마우스에 비하여 마우스 CIA-모델에서 증상을 감소시킬 수 있다는 것을 나타냈으며, 따라서 가용성 IL-22RA 폴리펩티드 및 IL-22RA에 대한 중화 항체가 인간 질환을 치료하는데 유리할 수 있다는 것을 개념적으로 나타낸다. 단일 마우스-IL-22-특이적 래트 모노클로날 항체(P3/1)의 투여는, 예방적으로 도입되었을 때나 CIA-유발 관절염이 모델에서 유발된 후에 동물에서 관절염의 증상을 감소시켰다(WIPO 공보 02/068476; 2002년 9월 9일 공개). 따라서, 본 발명의 중화 항-인간 IL-22RA 항체를 포함하여, 본 발명의 가용성 IL-22RA 폴리펩티드 및 항-IL-22RA 항체는 건선, 건선 관절염, 관절염, 내독소혈증, 염증성 장 질환(IBD), 대장염, 및 본원에 개시된 다른 염증상태와 같은 특정한 인간 질환의 치료에서 IL-22 및 IL-20을 중화시키는데 사용될 수 있다.
2. 내독소혈증
내독소혈증은 박테리아 및 다른 감염성 질환 발생원, 예를 들어 패혈증, 독성 쇼크 증후군과 같은 감염원으로 인해, 또는 기회감염 등에 노출된 면역손상 환자에서 흔히 발생하는 심각한 이상이다. 본 발명의 IL-22RA 폴리펩티드 및 항체와 같은 치료적으로 유용한 항-염증 단백질이 인간 및 동물에서 내독소혈증을 예방 및 치료하는데 도움을 줄 수 있다. IL-22RA 폴리펩티드, 항-IL-22RA 항체, 또는 항 IL-22 항체나 결합 파트너는 내독소혈증에서 염증 및 병리학적 효과를 감소시킬 수 있는 유용한 치료제로서 작용할 수 있다.
지질다당류(LPS) 유발된 내독소혈증은 감염성 질환에서 병리학적 효과를 야기하는 많은 전-염증성 매개인자에 관여되며, 설치류에서 LPS 유발 내독소혈증은 광범위하게 사용되고, 잠재적인 전-염증성 또는 면역조절 제제의 제약학적 효과를 연구하기 위해 허용되는 모델이다. 그람-음성 박테리아에서 생성된 LPS가 패혈 쇼크의 발병기전에서 주된 원인제이다(Glausner 등, Lancet 338: 732, 1991). 쇼크와 같은 상태는 실제로 동물에 LPS를 단독 주입함으로써 실험적으로 유발될 수 있다. LPS에 대해 반응하는 세포에 의해 생성된 분자가 병원균을 직접적으로 또는 간접적으로 표적화할 수 있다. 이들 생물학적 반응은 병원균의 침입에 대해 숙주를 보호하지만, 이들은 또 해악을 일으킬 수도 있다. 따라서, 심한 그람-음성 박테리아 감염의 결과로서 발생하는, 선천적인 면역성에 대한 큰 자극은, 시토카인 및 다른 분자의 과량 생성과, 발열, 저혈압, 파종 혈관내 응고 및 다기관 기능부전을 특징으로 하는 치사 증후군은 패혈 쇼크 증후군의 발생을 가져온다(Dumitrtl 등 Cell 103: 1071-1083, 2000).
LPS의 이들 독성 효과는 대부분 다수의 염증성 매개인자의 방출을 가져오는 마크로파지 활성화와 관련된다. 이들 매개인자 중에서 TNF가 결정적인 역할을 하는 듯하며, 이는 중화 항-TNF 항체의 투여에 의한 LPS 독성의 예방에 의해 나타난다(Beutler 등, Science 229: 869, 1985). 1ug의 E. coli LPS를 C57B1/6 마우스에 주입하면 대략 2시간 후에 순환 IL-6, TNF-알파, IL-1, 및 급성 단계 단백질(예를 들어, SAA)가 현저히 감소할 것이라는게 잘 확립되어 있다. LPS의 독성은 이들 시토카인에 의해 매개되는 듯하며, 이것은 이들 매개인자에 대한 수동적 면역화가 사망률의 감소를 가져올 수 있기 때문이다. 패혈 쇼크의 예방 및/또는 치료에 대한 가능한 면역개입 전략은 항-TNF mAb, IL-1 수용체 길항물질, LIF, IL-10, 및 G-CSF를 포함한다.
이들 LPS-유발된 모델에 대한 가용성 IL-22RA2 포함 폴리펩티드, 예를 들어 zcytor16-Fc4 또는 다른 IL-22RA 가용성 및 융합 단백질을 사용하여, LPS-유발 질환의 증상을 개선하고 이 질환의 과정을 변경시키기 위한 IL-22RA2의 사용을 평가했다. 더욱이, IL-22RA2에 의한 IL-22의 억제를 나타내는 결과는 다른 IL-22 길항물질, 예를 들어 IL-22RA 또는 이것에 대한 항체를 사용하여 LPS-유발 모델에서 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경시킬 수 있다는 개념에 대한 증거를 제공한다. 이 모델은 LPS 주입에 의한 IL-22의 유도와 IL-22RA2 폴리펩티드에 의한 질환의 치료 가능성을 나타냈다. LPS가 내독소혈증의 발병기전에 기여할 가능성이 있는 전-염증성 IL-22, SAA 또는 다른 전-염증성 인자들의 생성을 유도하기 때문에, 길항물질 IL-22RA2 폴리펩티드에 의한 IL-22 활성, SAA 또는 다른 전-염증성 인자들의 중화가, 내독소 쇼크에서 보여진 것과 같이, 내독소혈증의 증상을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
3. 염증성 장 질환, IBD
미국에서는 대략 500,000명의 사람들이 결장이나 직장(궤양성 대장염), 또는 이들 모두에서, 그리고 소장과 대장(크론씨병)에서 발생하는 염증성 장 질환(IBD)으로 고통받고 있다. 이들 질환의 발병기전은 불명확하지만, 이들은 환부 조직의 만성적 염증을 수반한다. IL-22RA 폴리펩티드, 항-IL-22RA 항체, 또는 항 IL-22 항체나 결합 파트너가 IBD 및 관련된 질환에서 염증 및 병리학적 효과를 감소시키는 유용항 치료제로서 작용할 수 있다.
궤양성 대장염(UC)는 흔히 결장이라고 하는 대장의 염증성 질환이며, 결장의 점막이나 최내층의 염증과 궤양을 특징으로 한다. 이 염증이 결장이 빈번히 비게 되는 원인이며, 그 결과 설사가 일어난다. 증상은 설사 및 관련된 복부 경련, 발열 및 체중감소를 포함한다. UC의 정확한 원인은 알려지지 않았지만, 최근 연구는 신체의 자연적 방어가 신체가 외부물질이라고 여기는 체내의 단백질에 대해 작용한다는 것을 시사한다("자가면역반응"). 아마도 이들이 소화관 내의 박테리아 단백질과 유사하기 때문에, 이들 단백질은 결장의 내층을 파괴하기 시작하는 염증 과정을 조장하거나 자극할 수 있을 것이다. 결장의 내층이 파괴됨에 따라, 궤양은 점액, 고름 및 혈액을 방출한다. 이 질환은 보통 직장에서 시작되며, 결국 전체 대장으로 확장될 수 있다. 반복된 염증 에피소드는 장과 직장의 벽을 두껍게 만들고 흉터 조직을 남긴다. 질환이 심해지면 결장 조직의 죽음이나 패혈증이 일어날 수 있다. 궤양성 대장염의 증상은 심한 정도에 따라 변하며, 이들의 개시는 점진적이거나 돌연히 일어날 수 있다. 공격은 호흡기 감염이나 스트레스를 포함하는 많은 요인들에 의해 자극된다.
현재는 이용가능한 UC의 치료법이 없지만, 치료제는 결장 내층에서 비정상적인 염증 과정을 억제하는데 집중하고 있다. 겉질스테로이드계 면역억제제(예를 들어, 아자티오프린, 메르캅토퓨린, 및 메토트렉세이트) 및 아미노살리실레이트를 포함하는 치료제가 이 질환을 치료하는데 이용할 수 있다. 그러나, 겉질스테로이드 및 아자티오프린과 같은 면역억제제의 장기간 사용은 뼈의 얇아짐, 백내장, 감염, 및 간과 골수에 대한 영향을 포함하는 심각한 부작용을 가져올 수 있다. 현재 치료법이 성공적이지 않은 환자에서는 수술이 선택된다. 수술은 결장과 직장을 전체적으로 절제하는 것을 포함한다.
만성 궤양성 대장염을 부분적으로 의태할 수 있는 몇명 동물 모델들이 있다. 가장 광범위하게 사용되는 모델은 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산/에탄올(TNBS) 유발된 대장염 모델인데, 이것은 결장에서 만성 염증과 궤양을 유발한다. TNBS가 직장내 점적주입에 의해 감수성 있는 마우스의 결장에 도입될 때, 이것은 결장 점막에서 T-세포 매개 면역반응을 유발하며, 이 경우 대장벽 전체적으로 T-세포 및 마크로파지의 조밀한 침윤을 특징으로 하는 큰 점막 염증을 가져온다. 더욱이, 이 조직병리학적 특징은 진행성 체중감소(소모성), 피가 섞인 설사, 직장 탈출, 및 대장벽 비후화의 임상적 특징을 수반한다(Neurath 등, Intem. Rev. Immunol. 19: 51-62, 2000).
다른 대장염 모델은 덱스트란 술페이트 소듐(DSS)를 사용하는데, 이것은 피가 섞인 설사, 체중감소, 결장의 단축화 및 호중구 침윤을 갖는 점막 궤양에 의해 나타나는 급성 대장염을 유발한다. DSS-유발 대장염은 림프구 증식, 국소움 손상, 및 상피 궤양과 함께, 고유판에의 염증 세포의 침윤에 의해 조직학적으로 특성화된다. 이들 변화는 상피에 대한 DSS의 독성 효과로 인해, 그리고 고유판 세포의 포식작용과 TNF-알파 및 IFN-감마의 생성에 의해 발생하는 것으로 생각된다. 그것의 통상적인 사용에도 불구하고, 인간 질환과의 관련성에 대해서 DSS의 메카니즘에 관련된 몇몇 논점은 아직 해결되지 않고 있다. DSS는 이것이 SCID 마우스와 같은 T-세포-결핍 동물에서 관찰되기 때문에 T-세포-의존성 모델로서 간주된다.
이들 TNBS 또는 DSS 모델들에 가ㄹ용성 IL-22RA2 포함 폴리펩티드, 예를 들어 zcytor16-Fc4 또는 다른 IL-22RA 가용성 및 융합 단백질을 투여하여, 위장 질환의 증상을 개선하거나 이들 질환의 과정을 변경시키기 위한 IL-22RA의 사용을 평가할 수 있다. 더욱이, IL-22RA2에 의한 IL-22의 억제를 나타내고 있는 결과는 다른 IL-22 길항물질, 예를 들어 IL-22RA 또는 이것에 대한 항체가 또한 대장염/IBD 모델에서 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경시키기 위해 사용될 수 있다는 개념에 대한 증거를 제공한다. 우리는 RT-PCR에 의해 DSS-마우스의 결장 조직에서 IL_22의 증가된 발현과, 장 셀라인에 대한 IL-1 베타를 사용한 IL-22의 상승작용적 활성을 관찰했다. 이것은 IL-22가 대장염의 염증반응에서 어떤 역할을 할 수 있으며, IL-22RA2 폴리펩티드를 투여함에 의한 IL-22 활성의 중화가 IBD에 대한 가능한 치료적 접근법임을 나타낸다. 다른 가능한 치료법은 IL-22RA 폴리펩티드, 항-IL-22RA 항체, 또는 항 IL-22 항체나 결합 파트너 등을 포함한다.
4. 건선
건선은 700만명 이상의 미국인에서 발생하는 만성적 피부 이상이다. 건선은 새로운 피부 세포가 비정상적으로 성장하는 경우 발생하며, 그 결과 염증, 부종을 일으키며, 오래된 피부가 충분히 빨리 떨어지지 않을 경우에는 피부에 비늘형 반이 형성된다. 플라크 건선이 가장 흔한 형태이며, 은백색의 비늘이 위에 덮인 피부의 염증성 반("병소")을 특징으로 한다. 건선은 작은 플라크에 제한될 수 있거나, 피부의 중간 내지는 광범한 영역을 포함할 수 있으며, 가장 흔하게는 두피, 무릎, 팔꿈치 및 몸통에서 나타난다. 건선은 눈으로 보아 매우 분명하지만, 전염성 질환은 아니다. 이 질환의 발병기전은 환부 조직의 만성적 염증을 수반한다. IL-22RA 폴리펩티드, 항-IL-22RA 항체, 또는 항 IL-22 및 항 IL-20 항체 또는 결합 파트너가 건선, 다른 염증성 피부 질환 및 점막 알레르기, 그리고 관련된 질환에서 염증 및 병리학적 효과를 감소시키기 위한 유용한 치료제로서 작용한다.
건선은 상당한 불편함을 야기할 수 있는 T-세포 매개 염증성 피부 장애이다. 이것은 치료법이 없고 모든 연령의 사람에게서 발생하는 질환이다. 건선은 유럽과 북미의 인구 중 대략 2%에서 발생한다. 가벼운 건선을 가진 개체는 주로 국소제제를 사용하여 그들의 질환을 조절할 수 있지만, 전세계적으로 100만명 이상의 환자는 자외선요법이나 전신성 면역억제 요법을 필요로 한다. 불행히도, 자외선의 불편함과 위험 그리고 많은 치료법의 독성은 이들의 장기 사용을 제한한다. 더욱이, 환자들은 통상 건선이 재발되며, 일부 경우에는 면역억제요법을 중단한 후 바로 예전 상태로 되돌아 간다.
IL-20은 Il-20 트랜스젠 마우스에서 이상 표피 분화를 포함하는 피부 비정상성과 함께 신생아 치사를 일으키는 것으로 나타난 신규 IL-10 상동물이다(Blumberg H 등, Cell 104: 9-19, 2001). IL-20 수용체는 건선 피부에서 극적으로 상향조절된다. IL-22는 IL-20 수용체와 수용체 서브유닛(zcytor11)을 공유하고, IL-22 트랜스젠 마우스가 유사한 표현형을 나타내기 때문에, IL-22도 건선과 같은 염증성 피부 질환에 연루되는 것이 가능하다. IL-22RA 폴리펩티드 또는 항-IL-22RA 항체 길항물질의 피하 또는 국소 투여는 염증 및 증상을 감소시킬 가능성이 있다. 다른 가능한 치료제는 IL-22RA 폴리펩티드, 가용성 zcytor11/CRF2-4 수용체 폴리펩티드 또는 항 IL-22 항체나 결합 파트너 등을 포함한다.
더욱이, IL-22 및 IL-20의 과발현이 사람의 건선 병소에서 나타났는데, 이는 IL-20과 유사한 IL-22가 또한 인간 건선에 연루된다는 것을 시사한다. 더욱이, 본원에 설명된 대로, 트랜스젠 마우스에서 IL-20 또는 IL-22의 과발현은 건선 표현형의 징표인 표피 비후화 및 면역세포 병발을 나타냈으며, 이에 더하여 정상 마우스에 IL-22를 주입한 것도 건선 표현형의 징표인 표피 비후화 및 면역세포 병발을 나타냈고, 이것은 가용성 수용체 길항물질 IL-22RA2에 의해 제거되었다(zcytor16; WIPO 공보 WO01/40467호). 그러한 생체내 데이타는 전-염증성 IL-22가 건선에 연루된다는 것을 더욱 시사한다. 이와 같이, IL-22 및 IL-20 활성에 대한 길항물질, 예를 들어 본 발명의 IL-22RA 가용성 수용체 및 항-사람-IL-22RA 모노클로날 및 중화 항체를 포함하는 이에 대한 항체가, 특히 건선의 치료에서 IL-22 및 IL-20에 대해 단독으로 또는 함께 길항물질로서 염증성 질환의 치료에 유용하다. 더욱이, IL-22 활성에 대한 길항물질, 예를 들어 본 발명의 IL-22RA 가용성 수용체 및 항-사람-IL-22RA 모노클로날 및 중화 항체를 포함하는 이에 대한 항체는, 예를 들어 아토피 피부염, IBD, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스성 관절염, 및 건선 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈 쇼크, 다기관 기능부전, 천식이나 기관지염 같은 염증성 폐손상, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 아토피 및 접촉성 피부염, 및 궤양성 대장염 및 크론씨병과 같은 염증성 장 질환의 치료에서 IL-22 및 IL-20과 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 제제로서, 다른 염증성 질환의 치료에서 유용하다.
더욱이, 본 발명의 항-IL-22RA 항체 및 IL-22RA 가용성 수용체는 본원에 설명된 많은 염증성 질환과 관련된 체중감소에 대한 예방 및 치료뿐만 아니라, 암(예를 들어, 화학요법 및 악액질), 및 다른 감염성 질환을 위한 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 심한 체중감소는 패혈증, MS, RA, 및 종양 모델의 모델과 관련된 중요한 마커이다. 게다가, 체중감소는 암, 감염성 질환 및 염증성 질환을 포함하는 많은 인간 질환에 대한 중요한 파라미터이다. 체중감소는 본원에 설명된 IL-22 아데노바이러스가 주입된 마우스에서 나타났다. 본 발명의 가용성 IL-22RA 수용체 및 이에 대한 항체와 같은 항-IL-22RA 항체 및 IL-22 길항물질, 뿐만 아니라 zcytor16(IL-22RA2) 수용체는 본원에 설명된 IL-22 아데노바이러스가 주입된 마우스에서 체중감소를 예방 및 치료하는 이들의 능력에 대해 시험될 수 있다. 그러한 IL-22 길항물질에 대한 예방적 또는 치료적 섭생을 결정하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 본원에 설명된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
또한, IL-22RA 가용성 수용체 폴리펩티드 및 이것에 대한 항체는 IL-22 또는 IL-20 리간드의 순환 수준을 검출하기 위한 진단 시스템 내에서, 그리고 급성 단계 염증반응에 관련된 IL-22의 검출에서 사용될 수 있다. 관련된 구체예의 범위 내에서, 본 발명의 IL-22RA 가용성 수용체와 특이적으로 결합하는 항체나 다른 제제는 순환하는 수용체 폴리펩티드를 검출하는데 사용될 수 있고, 반대로 IL-22RA 가용성 수용체 자체는 순환하는 또는 국소-작용하는 IL-22 또는 IL-20 폴리펩티드를 검출하는데 사용될 수 있다. 리간드 또는 수용체 폴리펩티드의 상승된 또는 감소된 수준이 염증 또는 암을 포함하는 병리학적 이상을 나타낼 수 있다. IL-22는 관련된 급성 단계 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, IL-20 또는 IL-22와 같은 급성 단계 단백질 또는 분자의 검출은 어떤 질환 상태(예를 들어, 건선, 류마티스성 관절염, 대장염, IBD)에서 만성 염증 상태를 나타낼 수 있다. 그러한 상태의 검출은 질환 진단에 도움이 될 뿐만 아니라 적합한 치료법을 선택하는데 있어서도 의사에게 도움을 준다.
중화 항-IL-22 또는 IL-20 항체를 인 유테로 투여하여, IL-22를 과발현하는 IL-22 트랜스젠 마우스, 또는 IL-20을 과발현하는 IL-20 트랜스젠 마우스에서 발견된 피부 표현형을 감소 또는 제거함으로써 질환 모델에서 생체내 효능을 나타낼 수 있다. 중화 모노클로날 항체(mAb)를 사용한 인 유테로 치료는 본 분야에 이미 제시되었다. 어떤 케이스에서, B 세포의 B-1 서브셋의 발생은 B 세포-특이적 분자인 CD19에 대해 특이적인 mAb를 사용하여 임신한 암컷 마우스를 치료하는 것에 의해서 극적으로 영향을 받았다(예를 들어, Krop I. 등 Eur. J. Immunol. 261: 238-42, 1996). Krop 등은 PBS 중의 래트 항-마우스 CD19 mAb(또는 래트 동형-일치된 대조표준 Ab) 500ug을 임신한 마우스에게 임신 9일째에 시작하여 일정 시간 후에 복강내로 주입되도록 한 후, 새끼가 태어날 때까지 격일로 주입했다. 또한, 10일된 마우스에게 이들 항체 500ug을 한번 주입했다. 다른 케이스에서, Tanaka 등은 IL-2 수용체 베타-사슬에 대한 모노클로날 항체를 사용한 인 유테로 치료가 Thy-1+ 수지상 표피세포의 발생을 완전히 없앴다는 것을 발견했다. IL-2 수용체의 2개의 상이한 서브유닛, 즉 알파-사슬(IL-2R 알파) 및 베타-사슬(IL-2R 베타)은 태아 흉선 개체발생 전체를 통해 거의 상호 배제하는 방식으로 발현된다. IL-2R 베타에 대한 중화 mAb를 투여함에 의해, IL-2R의 신호변환 성분인 IL-2R 베타를 차단하는 것은 Thy-1+ 피부 수지상 표피세포의 완전하고 선택적인 소실을 가져왔다. 어떤 다른 T 세포 서브셋의 발생은 손상되지 않았다. 이것은 IL-2가 태아 V 감마 5+ 세포 및 이들의 자손의 발생에서 결정적인 역할을 한다는 것을 나타낸다(Tanaka, T. 등, Int Immunol. 4(4): 487-9,1992). 게다가, Schattemann GC 등은 PDGF-A가 인 유테로 시스템을 사용한 정상 쥐과 심장혈관 발생에서 필요하다는 것을 나타냈다. 몇몇 라인의 증거는 혈소판-유래 성장인자 A 사슬(PDGF-A)가 정상 배아 심장혈관 발생에서 필요하다는 것을 시사한다. 마우스 탈락막으로의 항-PDGF-A 중화 항체의 인 유테로 유도는 18-24시간 동안 생체내 PDGF-A 리간드-수용체 상호작용의 선택적 파괴를 가져왔으며, PDGF-A가 심장혈관의 발생에 필요한지의 여부와 그것이 필요한 때를 평가할 수 있도록 한다(Schattemann GC 등, Dev. Biol. 176(1): 133-42, 1996 참조). 이들 결과 및 본 분야에 설명된 다른 결과는 중화 mAb가 강한 효과를 인 유테로 도출할 수 있다는 증거를 제공한다. 유사하게, IL-20 및 IL-22를 각각 과발현하는 IL-20 및 IL-22 트랜스젠 마우스에서 발견된 피부 표현형을 감소 또는 제거하는 질환 모델에서 생체내 모노클로날 항체를 사용한 중화 IL-20 또는 IL-22의 효능을 나타내는 데이타가 나타날 수 있다. 이들 트랜스젠 마우스는 적어도 부분적으로는 본원에 설명된 바와 같은 표피의 비후화로 인해 "반들반들한" 피부 외관을 가지고 태어난다. 꽤 낮은 수준의 트랜스젠 시토카인을 발현하는 IL-20 TG 마우스는 회복되고 살아서 양육될 수 있지만, IL-22 TG 마우스는 태어난 후 바로, 일반적으로 5일 전에 사망했다.
예를 들어, IL-20에 대한 중화 항체는IL-20 항원성 에피토프에 결합하여 IL-20 활성을 중화할 수 있는 중화 모노클로날 항체와 같은 항체들을 포함한다. 따라서, IL-20의 항원성 에피토프를 지닌 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 설명된 IL-20 폴리펩티드와 결합하는 항체를 발생시키는데 유용할 뿐만 아니라, IL-20 활성을 중화하고, IL-20 활성과 결합하거나, 이것을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 항-IL-20 모노클로날 항체를 확인하고 스크리닝하는데 유용하다. 그러한, 본 발명의 중화 모노클로날 항체는 IL-20 항원성 에피토프와 결합할 수 있다. 예를 들어, DNASTAR Protean 프로그램(DNASTAR, Inc., 위스콘신 메디슨)을 사용하여, Jameson-Wolf 플롯에 의해 예측된 서열 번호 8 내의 그러한 에피토프가 바람직한 항원성 에피토프로 작용하며 당업자에 의해 측정될 수 있다. 그러한 항원성 에피토프는 서열 번호 8의 아미노산 잔기 42(Ile)에서 102(Asp); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 42 (Ile)에서 69(Glu); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 42(Ile)에서 81(Cys); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 42(Ile)에서 96(Lys); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 42(Ile)에서 102(Asp); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 60(Ile)에서 69(Glu); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 60(Ile)에서 69(Glu); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 60(Ile)에서 81 (Cys); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 60(Ile)에서 96(Lys); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 60(Ile)에서 102(Asp); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 69(Glu)에서 81(Cys); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 69(Glu)에서 96(Lys); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 69(Glu)에서 102(Asp); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 81(Cys)에서 96(Lys); 서열 번호 8의 아미노산 잔기 81(Cys)에서 102(Asp); 및 서열 번호 8의 아미노산 잔기 96(Lys)에서 102(Asp)를 포함한다.
본원에 설명된 다른 질환 모델에 더하여, 인간 건선 병소로부터 유래된 염증 조직에 대한 항-IL-22RA 항체의 활성은 몇몇 조합된 면역결핍(SCID) 마우스 모델을 사용하여 생체내에서 측정될 수 있다. 면역결핍 마우스에 인간 세포가 이식된(총괄하여 이종이식이라고 한다) 몇몇 마우스 모델이 개발되었다; 예를 들어, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18: 513-22, 1994 및 Flavell, DJ, Hematological Oncol-ogy 14:67-82, 1996 참조. 건선에 대한 생체내 이종이식 모델로서, 인간 건선 피부 조직이 SCID 마우스 모델에 이식되고 적합한 길항체로 시험감염된다. 더 나아가, AGR129 마우스 모델에 이식되어 적합한 길항물질로 시험감염된 인간 피부 이식편과 같은, 본 분야의 다른 건선 동물 모델을 사용하여 IL-20 및 IL-22 길항물질을 평가할 수 있다(예를 들어, Boyman, 0. 등, J. Exp. Med. Online publication #20031 482, 2004, 본원에 참고자료로 수록됨). IL-22 또는 IL-20 및 IL-22 모두의 활성과 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 항-IL-22RA 항체가 바람직한 길항물질지만, 항-IL-20 및 항-IL-22 항체(단독으로 및 조합하여), 가용성IL-22RA, 뿐만 아니라 다른 IL-20 및 IL-22 길항물질도 이 모델에서 사용될 수 있다. 유사하게, 본원에 설명된 IL-20 및 IL-22 길항물질의 항-염증 특성을 평가하기 위해,인간 대장염, IBD, 관절염, 또는 다른 염증성 병소로부터 유래된 조직이나 세포가 SCID 모델에서 사용될 수 있다.
인간 염증 조직(예를 들어, 건선 병소 등)을 지닌 SCID 마우스나, 본원에 설명된 다른 모델에 항-IL22RA 항체 또는 가용성 IL-22RA 화합물을 투여함에 의해서, 항-IL-22RA 항체나 그 유도체, 작동제, 콘쥬게이트 또는 변이체를 사용하여 염증을 없애거나, 저지하거나, 감소시키도록 설계된 치료법이 시험될 수 있다. 본 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 시간에 따른 치료된 집단 내에서의 증가된 항-염증 효과에 따라 치료 효능이 측정되고 통계적으로 평가된다. 어떤 전형적인 방법은, 제한은 없지만, 예를 들어, 건선 모델에서, 표피 두께, 상부 진피에 있는 염증 세포의 수, 및 이상각화증의 등급을 측정하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 본 분야에 공지되어 있으며 본원에 설명된다. 예를 들어, Zeigler M. 등, Lab Invest 81: 1253, 2001; Zollner T. M. 등, J. Clin. Invest. 109: 671, 2002; Yamanaka N. 등, Microbio.1 Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri S. P. 등, Br. J. Dermatol. 144 :931, 2001; Boehncke, W. H. 등, Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W.H. 등 J. Invest. Dermatol. 116: 596, 2001; Nickoloff, B.J. 등 Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke, W. H. 등, J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J. M. 등, J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998; 및 Villadsen L.S. 등, J. Clin. Invest. 112 :1571, 2003 참조. 또, 염증은 흐름 세포측정(또는 PCR)과 같은 잘 공지된 방법을 사용하여 시간에 따라 모니터될 수 있으며, 이로써 샘플에 존재하는 염증 또는 병소 세포의 수, IBD에 대한 스코어(체중감소, 설사, 직장출혈, 결장길이), 발 질환 스코어 및 CIA RA 모델에 대한 염증 스코어를 정량할 수 있다. 예를 들어, 그러한 모델에서 시험하는데 적합한 치료적 전략은, 항-IL-22RA 항체와 그 리간드인 IL-20 및 IL-22와의 상호작용을 파과하는데 기초한 항-IL-22RA 항체, 다른 IL-20 및 IL-22 길항물질(단독으로 또는 함께), 또는 관련된 콘쥬게이트나 길항물질을 사용한 직접 치료나, 항-IL-22RA 항체 또는 그 유도체, 작동제, 콘쥬게이트 또는 변이체를 이용한 세포-기제 치료법을 포함한다.
더욱이, 건선은 CD4+ 메모리 T 세포, 호중구 및 마크로파지를 포함하는, 과다증식성 표피 각질세포 및 침윤성 단핵 세포와 관련된 만성 염증성 피부 질환이다(Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996). 현재 질환의 발병기전을 개시하고 그에 기여하는데 환경 항원이 중요한 역할을 하는 것으로 여겨지고 있다. 그러나, 이것은 건선의 발병기전을 매개한다고 생각되는 자기-항원에 대한 내성의 손실이다. 수지상 세포 및 CD4+ T 세포가 발병기전을 이끄는 면역반응을 매개하는 항원 출현과 인식에서 중요한 역할을 한다고 생각된다. 우리는 최근에 CD4+CD45RB 트랜스퍼 모델에 기초한 건선의 모델을 발견했다(Davenport, 등, 9 Internat. Irnmunopharmacol. 2:653-672). 항-IL20, 항-IL22 또는 IL20R 및/또는 IL22R에 대한 항체, 예를 들어 본 발명의 항-IL-22RA 항체, 또는 가용성 IL-22RA이 마우스에 투여된다. 질환 스코어(피부 병소, 염증성 시토카인)의 억제가 건선에서 IL-20 및 IL-22 길항물질, 예를 들어 항-IL-22RA 항체 또는 IL-22RA 가용성 수용체, 또는 IL20 및/또는 IL-22나 이들의 수용체와 같은 다른 길항물질의 유효성을 나타낸다.
아토피 피부염
IL-20와 IL-22는 모두 인간 아토피 피부염(AD) 환자 샘플에서 상향조절된다. AD는 헬퍼 T 세포 서브셋 2(Th2)의 과활성 시토카인을 특징으로 하는 흔한 만성 염증성 질환이다. AD의 정확한 병인은 알려지지 않았지만, 과활성 Th2 면역반응, 자가면역성, 감염, 알레르기 항원, 및 유전적 소인을 포함하는 많은 요인들이 연루된다. 이 질환의 중요한 특징은 건조증(피부의 건조), 가려움(피부의 간지러움), 결막염, 염증성 피부 병소, Staplylococcus aureus 감염, 상승된 혈액 호산구증가증, 혈청 IgE 및 IgG1의 상승, 그리고 T 세포, 비만세포, 마크로파지 및 호산구 침윤을 갖는 만성적 피부염을 포함한다. S. aureus의 콜로니화 또는 감염이 AD를 악화시키고 이 피부 질환의 만성화를 야기한다.
AD는 주로 천식 및 알레르기성 비염을 가진 환자에서 발견되며, 알레르기 질환의 빈번한 초기 징후이다. 서양 국가들의 인구 중 약 20%가 이들 알레르기 질환으로 고통받고 있으며, 선진국에서 AD의 발생수는 알려지지 않은 이유로 인해 증가하고 있다. AD는 전형적으로 유년기에 시작되며, 흔히 청년기에서 성인이 되어서까지 지속될 수 있다. AD의 현재 치료제는 국소 겉질스테로이드제, 경구 시클로스포린 A, 타크롤리뮤스(연고형 FK506)와 같은 비-겉질스테로이드계 면역억제제, 및 인터페론-감마를 포함한다. AD에 대한 다양한 치료제에도 불구하고, 많은 환자들의 증상은 개선되지 않거나, 이들은 약물에 대한 부작용을 가지기 때문에 다른 더 효과적인 치료제에 대한 연구가 필요하다.
본 발명의 중화 항-인간 IL-22RA 항체를 포함하는 본 발명의 가용성 IL-22RA 폴리펩티드 및 항-IL-22RA 항체가 아토피 피부염, 염증성 피부 상태, 및 본원에 개시된 다른 염증성 상태와 같은 특정한 인간 질환의 치료에서 IL-22 및 IL-20을 중화시키기 위해 사용될 수 있다.
제약학적 용도를 위해서, 본 발명의 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체는 비경구, 특히 정맥내 또는 피하용 제제로 제조되며 종래의 방법에 따라 송달된다. 정맥내 투여는 볼루스 주사에 의해, 예를 들어 미니-펌프나 다른 적합한 기술을 사용하여 제어-방출에 의해, 또는 1시간에서 수시간에 걸친 주입에 의할 것이다. 일반적으로, 제약학적 제제는 식염수, 완충 식염수, 5% 덱스트로스 수용액 등과 같은 제약학적으로 허용되는 비히클과 함께 조혈 단백질을 포함할 것이다. 제제는 하나 이상의 부형제, 보존제, 안정제, 완충제, 바이알 표면에서의 단백질 손실을 방지하기 위한 알부민 등을 더 포함할 수 있다. 그러한 조합 치료법을 이용할 때, 시토카인이 단일 제제로 조합될 수 있거나, 또는 분리된 제제로서 투여될 수 있다. 제조 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참고자료로서 수록되는Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co.(펜실베니아 이스톤, 1990)에 개시되어 있다. 치료 용량은 일반적으로 1일 당 0.1 내지 100mg/kg(환자체중), 바람직하게는 1일 당 0.5-20mg/kg이며, 정확한 용량은 치료된 상태의 성질과 심한 정도, 환자 특성 등을 고려하여, 허용된 표준에 따라 임상의에 의해 결정된다. 용량의 결정은 당업자의 통상적인 기술 수준의 범위 내이다. 단백질은 통상 28일까지의 기간에 걸쳐 투여될 것이며, 그 후 화학요법이나 골수이식이 이어지고, 그렇지 않으면 혈수판수가 > 20,000/mm3, 바람직하게는 > 50,000/mm3이 될 때까지 투여될 것이다. 더 통상적으로, 단백질은 1주 이하에 걸쳐, 흔히 1일 내지 3일에 걸쳐 투여될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체의 치료적 유효량은 림프양 또는 골수양 선조세포의 증식 및/또는 분화에 임상적으로 현저한 증가를 야기할 만큼의 충분한 양이며, 이것은 성숙세포(예를 들어, 혈소판 또는 호중구)의 순환 수준의 증가에 따라 분명해질 것이다. 따라서, 혈소판 수가 최소 20,000/mm3, 바람직하게는 50,000/mm3에 도달할 때까지 혈소판 장애의 치료가 계속될 것이다. 또한, 본 발명의 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체는 IL-3, -6 및 -11과 같은 다른 시토카인; 줄기세포인자; 에리트로포에틴; G-CSF 및 GM-CSF와 조합하여 투여될 수 있다. 조합 치료법의 섭생 범위 내에서, 다른 시토카인의 1일 용량은 일반적으로, EPO, 150U/kg; GM-CSF, 5-15 lg/kg; IL-3, 1-5 lg/kg; 그리고 G-CSF, 1-25 lg/kg일 것이다. EPO와의 조합 치료법은, 예를 들어 낮은 EPO 수준을 가진 빈혈 환자에 처방된다.
일반적으로, 투여되는 가용성 IL-22RA(또는 IL-22RA 유사체 또는 융합 단백질) 또는 항-IL-22RA 항체의 용량은 환자의 나이, 체중, 신장, 성별, 일반적인 의학적 상태 및 이전의 의학적 병력과 같은 요인들에 따라서 변할 것이다. 전형적으로, 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체를 약 1pg/kg 내지 10mg/kg(제제량/환자체중)의 범위 내의 용량으로 수용자에게 제공하는 것이 바람직하지만, 상황에 따라서는 더 낮거나 더 높은 용량이 투여될 수도 있다.
피험자에 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체를 투여하는 것은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 흉막내, 경막내 경로에 의해, 국부 카테터를 통한 관류에 의해, 또는 직접 병소내 주입에 의해 달성될 수 있다. 주사에 의해 치료 단백질을 투여할 때, 투여는 연속 주입이나 단일 또는 다수 볼루스에 의해 달성될 수 있다.
추가의 투여 경로는 경구, 점막, 폐, 및 경피 경로를 포함한다. 경구 송달은 폴리에스테르 마이크로스피어, 제인 마이크로스피어, 프로티노이드 마이크로스피어, 폴리시아노아크릴레이트 마이크로스피어, 및 지질-기제 시스템에 적합하다(예를 들어, DiBase 및 Morrel, "Oral Delivery of Micro encapsulated Proteins," Proteins Delivery: Physical Systems, Sanders 및 Hendren, pages 255-288(Plenum Press 1997) 참조). 비강내 송달의 가능성은 인슐린 투여를 그러한 방식으로 하는 것에 의해 예시된다(예를 들어, Hinchcliffe 및 Ilium, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1999) 참조). IL-22RA를 포함하는 건조 또는 액체 입자가 제조될 수 있으며, 건조-분말 분산장치, 액체 에어로졸 발생장치, 또는 분무장치의 도움을 받아 흡입된다(예를 들어, Pettit 및 Gombotz, TIBTECH16:343 (1998); Patton 등, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999) 참조). 이 접근법은 AERX 당뇨병 관리 시스템에 의해 예시되며, 이것은 에어로졸화된 인슐린을 폐에 송달하는 핸드헬드형 전자 흡입장치이다. 48,000kDa 정도 크기의 단백질을 저주파 초음파의 도움을 받아 치료 농도로 피부를 가로질러 송달하는 것을 나타낸 연구가 있는데, 이것은 경피 투여의 가능성을 예시한다(Mitragotri 등, Science 269:850(1995)). 전기천공을 사용한 경피 송달이 IL-22RA 결합활성을 갖는 분자를 투여하는 또 다른 수단을 제공한다(Potts 등, Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).
가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체를 포함하는 제약학적 조성물은 제약학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있으며, 이로써 치료 단백질은 제약학적으로 허용되는 담체와의 혼합물로 조합된다. 만일 조성물의 투여가 수용자 환자에 의해 견뎌질 수 있다면, 조성물은 "제약학적으로 허용되는 담체"라고 말한다. 멸균 포스페이트-완충 식염수가 제약학적으로 허용되는 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체들이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판 (Mack Publishing Company 1995).
치료의 목적을 위해사, 가용성 IL-22RA 또는 항-IL-22RA 항체 분자와 제약학적으로 허용되는 담체가 치료적 유효량으로 환자에게 투여된다. 본 발명의 치료용 분자와 제약학적으로 허용되는 담체의 조합은, 투여되는 양이 생리학적으로 유의한 경우에 "치료적 유효량"으로 투여된다고 말한다. 만일 제제의 존재가 수용자 환자의 생리기능에 검출가능한 변화를 가져온다면, 제제는 생리학적으로 유의하다. 예를 들어, 염증을 치료하는데 사용된 제제는 이 제제의 존재가 염증 반응을 완화하는 경우 생리학적으로 유의하다.
IL-22RA(또는 IL-22RA 유사체 또는 융합 단백질) 또는 중화 항-IL-22RA 항체를 포함하는 제약학적 조성물은 액체 형태, 에어로졸, 또는 고체 형태로 마무리될 수 있다. 액체 형태는 주사가능한 용액 및 경구 현탁액에 의해 예시된다. 전형적인 고체 형태는 캡슐, 정제, 및 제어-방출 형태를 포함한다. 후자의 형태는 소형삼투펌프 및 임플란트에 의해 예시된다(Bremer 등 Pharm.Biotechnol 10:239(1997); Ranade "Implants in Drug Delivery" Drug Deliver Systems, Ranade 및 Hollinger, page 95-123(CRC Press 1995); Bremer 등 "Protein Delivery with Infusion Pumps" Protein Delivery: Physical Systems, Sanders 및 Hendren, pages 239-254(Plenum Press 1997); Yewey 등, "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injec-table Implant," Protein Delivery: Physical Systems, Sanders 및 Hendren, pages 93-117(Plenum Press 1997)).
리포솜은 정맥내, 복강내, 경막내, 근육내, 피하, 또는 경구 투여, 흡입, 또는 비강내 투여에 의해 피험자에게 치료용 폴리펩티드를 송달하는 한 수단을 제공한다. 리포솜은 수성 구획으로 둘러싸인 하나 이상의 지질 이중충으로 구성된 극히 미세한 소포이다(일반적으로, Bakker-Woudenberg 등, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12(Suppl.1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618(1993) 및 Ranade, "Site -Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," Drug Delivery Systems, Ranade 및 Hollinger, pages 3-24(CRC Press 1995) 참조). 리포솜은 세포막의 조성과 유사하며, 따라서 리포솜은 안전하게 투여될 수 있고 생분해될 수 있다. 제조 방법에 따라, 리포솜은 단층판이나 다층판일 수 있으며, 리포솜은 0.02㎛ 내지 10㎛ 이상의 범위 내의 직경을 갖도록 크기가 다양할 수 있다. 다양한 제제가 리포솜 내에 캡슐화될 수 있으며, 소수성 제제는 이중층에 분배되고, 친수성 제제는 내부 수성 공간(들)에 분배된다(예를 들어, Machy 등, Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987), 및 Ostro 등, American J. Hosp. Pharm. 46: 1576(1989) 참조). 또한, 리포솜 크기, 이중층의 수, 지질 조성, 그리고 리포솜의 전하 및 표면 특성을 변화시킴으로써 캡슐화된 제제의 치료 효용을 조절하는 것이 가능하다.
리포솜은 실질적으로 어떤 종류의 세포에도 흡착할 수 있으며, 그 후 캡슐화된 제제를 서서히 방출한다. 또는 달리, 흡착된 리포솜은 포식성 세포에 의해 흡수될 수 있다. 세포내흡수 후에는 리포솜 지질의 리소솜내 분해 및 캡슐화된 제제의 방출이 이어진다(Scherphof 등, Ann. N. Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). 정맥내 투여 후, 작은 리포솜(0.1 내지 1.0㎛)은 전형적으로, 주로 간과 비장에 위치한 세망내피 시스템의 세포에 의해 흡수되고, 3.0㎛ 보다 큰 리포솜은 폐에 침착된다. 세망내피 시스템의 세포에 의한 작은 리포솜의 선택적인 흡수를 사용하여 간의 마크로파지 및 종양에 화학요법제를 송달할 수 있다.
세망내피 시스템은 다량의 리포솜 입자를 사용하여 포화시키거나, 또는 약리적 수단에 의해 마크로파지를 선택적으로 불활성화시키는 것을 포함하는 몇몇 방법에 의해서 방해될 수 있다(Claassen 등, Biochem. Biophys. Acta 802:428 (1984)). 게다가, 당지질- 또는 폴리에틸렌 글리콜-유도 인지질을 리포솜에 결합시키는 것이세망내피 시스템에 의한 흡수의 현저한 감소를 가져오는 것으로 나타났다(Allen 등, Biochem. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen 등, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)). 또한, 리포솜은 인지질 조성을 변화시키거나 리포솜에 수용체나 리간드를 삽입함으로써 특정한 세포나 기관을 표적화하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 비이온성 계면활성제를 높은 함량으로 사용하여 제조된 리포솜이 간을 표적화하는데 사용되었다(Hayakawa 등 일본특허 04-244,018; Kato 등 Biol.Pharm.Bull. 16:960 (1993)). 이들 제제는 메탄올 중에서 대두 포스파티딜콜린, α-토코페롤, 및 에톡실화 수소화 캐스톨 오일(HCO-60)을 혼합하고, 이 혼합물을 진공 하에서 농축한 다음 혼합물을 물에서 복원시킴으로써 제조되었다. 또한, 대두-유래 스테릴글루코시드 혼합물(SG)와 콜레스테롤(Ch)를 갖는 디팔미토일포스파티틸콜린(DPPC)의 리포솜 제제가 간을 표적화하는 것으로 나타났다(Shimizu 등, Biol.Pharm.Bull. 20:881 (1997)).
또는 달리, 항체, 항체 단편, 탄수화물, 비타민, 및 수송 단백질과 같은 다양한 표적화 리간드가 리포솜의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 간세포 표면에서만 발현되는 아사이알로당단백질(갈락토스) 수용체를 표적화하기 위해서 가지형 갈락토실 지질 유도체로 변형될 수 있다(Kato 및 Sugiyama Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi 등, Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)). 유사하게, Wu 등은 Hepatologv 27:772 (1998)에서 아사이알로페투인으로 표지된 리포솜이 리포솜 혈장 반감기를 단축시키고 간세포에 의한 아사이알로페투인 표지된 리포솜의 흡수를 크게 증진시킨다는 것을 나타냈다. 한편, 가지형 갈락토실 지질 유도체를 포함하는 리포솜의 간 축적은 아사이알로페투인을 미리 주입함으로써 억제될 수 있다(Murahashi 등, Biol. Pharm. Bull. 20:259(1997)). 폴리아코니틸화된 인간 혈청 알부민 리포솜이 리포솜을 간세포에 표적화하는 또 다른 접근법을 제공한다(Kamps 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681(1997)). 더욱이, Geho, 등은 미국 특허 제4,603,044호에서 간세포를 향한 리포솜 소포 송달 시스템을 설명하는데, 이것은 간의 분화된 대사세포와 관련된 간담즙 수용체에 대해 특이성을 가진다.
조직 표적화에 대한 더 일반적인 접근법에서는 표적 세포가 표적 세포에 의해 발현되는 리간드에 대해 특이적인 비오틴화된 항체로 미리 표지된다(Harasym 등, Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99(1998)). 자유 항체의 원형질 제거 후, 스트렙토아비딘-콘쥬게이트 리포솜이 투여된다. 다른 접근법에서는, 표적화 항체가 리포솜에 직접 부착된다(Harasym 등, Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99(1998)).
폴리펩티드 및 항체는 단백질 미세캡슐화의 표준 기술을 사용하여 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다(예를 들어, Anderson 등, Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson 등, Cancer Res. 50:1853 (1990), 및 Cohen 등, Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving 등 "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies" Liposome Technology, 2판, Vol. III, Gregoriadis, page 317 (CRC Press 1993), Wassef 등, Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). 상기 주지된 대로, 치료적으로 유용한 리포솜은 여러 가지 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 폴리(에틸렌 글리콜)의 지질 유도체를 포함할 수 있다(Allen 등, Biochim.Biophys.Acta 1150:9 (1993)).
치료 단백질을 높은 전신적 수준으로 유지하기 위한 분해가능한 폴리머 마이크로스피어가 설계되었다. 마이크로스피어는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG), 폴리무수물, 폴리(오르토 에스테르), 비생분해성 에틸비닐 아세테이트 폴리머와 같은 분해가능한 폴리머로부터 제조되며, 여기서는 단백질이 폴리머에 포획된다(Gombotz 및 Pettit, Bioconjugate Chenu. 6:332(1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", Drug Delivery Systems, Ranade 및 Hollinger, pages 51-93(CRC Press 1995); Roskos 및 Maskiewicz "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", Protein Delivery: Physical Systems, Sanders 및 Hendren, p 45-92(Plenum Press 1997); Bartus 등, Science 281:1161(1998); Putney 및 Burke, Nature Biotechnology 16:153(1998); Putney, Curr.Opin.Chem.Biol. 2:548(1998)). 또, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-코팅 나노스피어가 치료 단백질의 정맥내 투여를 위한 캐리어를 제공할 수 있다(예를 들어, Gref 등, Pharm. Biotechnol. 10:167(1997)).
또한, 본 발명은 IL-22RA 단량체, 동종이량체, 이종이량체 또는 다량체 가용성 수용체와 같은 결합 IL-22RA 활성을 갖는 화학적으로 변형된 폴리펩티드, 그리고 IL-22RA 길항물질, 예를 들어 항-IL-22RA 항체 또는 결합 폴리펩티드, 또는 중화 항-IL-22RA 항체를 고려하며, 여기서 폴리펩티드는 상기 논의된 대로 폴리머와 결합된다.
예를 들어, Ansel 및 Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Del-ivery Systems, 5판(Lea & Febiger 1990), Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판(Mack Publishing Company 1995)에 의해, 그리고 Ranade 및 Hollin-ger, Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)에 의해 알려진 대로, 다른 투약 형태가 당업자에 의해 고안될 수 있다.
예로서, 제약학적 조성물은 IL-22RA 세포외 도메인, 예를 들어 IL-22RA 단량체, 동종이량체, 이종이량체 또는 다량체 가용성 수용체를 갖는 폴리펩티드, 또는 IL-22RA 길항물질(예를 들어, IL-22RA 폴리펩티드와 결합하는 항체나 항체 단편, 또는 중화 항-IL-22RA 항체)를 포함하는 용기를 포함하는 키트로서 공급될 수 있다. 치료 폴리펩티드는 단일 또는 다수 용량을 위한 주사용액의 형태로, 또는 주사 전에 복원되는 멸균 분말로서 제공될 수 있다. 또는 달리, 그러한 키트는 치료 폴리펩티드의 투여에 알맞은 건조 분말 분산장치, 액체 에어로졸 발생장치, 또는 분무장치를 포함할 수 있다. 그러한 키트는 제약학적 조성물의 처방과 용법에 대한 서면설명서를 더 포함할 수 있다. 또한, 그러한 설명서는 IL-22RA 조성물이 IL-22RA에 대해 과민한 환자에게는 금지된다는 설명을 포함할 수 있다.
항-IL-22RA 항체 또는 결합 파트너(또는 항-IL-22RA 항체 단편, 항체 융합체, 인간화된 항체 등), 또는 IL-22RA 가용성 수용체를 포함하는 제약학적 조성물은 액체 형태, 에어로졸, 또는 고체 형태로 마무리될 수 있다. 액체 형태는 주사용액, 에어로졸, 점적제, 국소 용액, 및 경구 현탁액에 의해 예시된다. 전형적인 고체 형태는 캡슐, 정제, 및 제어-방출 형태를 포함한다. 후자의 형태는 소형삼투펌프에 의해 예시된다(Bremer 등, Pharm. Biotechnol. 10:239(1997); Ranade, "Im-plants in Drug Delivery" Drug Delivery Systems, Ranade 및 Hollinger, page 95-123(CRC Press 1995); Bremer 등 "Protein Delivery with Infusion Pumps" Protein Delivery: Physical Systems, Sanders 및 Hendren, p 239-254(Plenum Press 1997); Yewey 등, "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant" Protein Delivery: Physical Systems, Sanders 및 Hendren, p 93-117(Plenum Press 1997)). 다른 고체 형태는 크림, 페이스트, 기타 국소 도포제 등을 포함한다.
리포솜이 정맥내, 복강내, 경막내, 근육내, 피하, 또는 경구 투여, 흡입, 또는 비강내 투여에 의해 피험자에게 치료용 폴리펩티드를 송달하는 한 수단을 제공한다. 리포솜은 수성 구획으로 둘러싸인 하나 이상의 지질 이중충으로 구성된 극히 미세한 소포이다(일반적으로, Bakker-Woudenberg 등, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12(Suppl.1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618(1993) 및 Ranade, "Site -Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," Drug Delivery Systems, Ranade 및 Hollinger, pages 3-24(CRC Press 1995) 참조). 리포솜은 세포막의 조성과 유사하며, 따라서 리포솜은 안전하게 투여될 수 있고 생분해될 수 있다. 제조 방법에 따라, 리포솜은 단층판이나 다층판일 수 있으며, 리포솜은 0.02㎛ 내지 10㎛ 이상의 범위 내의 직경을 갖도록 크기가 다양할 수 있다. 다양한 제제가 리포솜 내에 캡슐화될 수 있으며, 소수성 제제는 이중층에 분배되고, 친수성 제제는 내부 수성 공간(들)에 분배된다(예를 들어, Machy 등, Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey 1987), 및 Ostro 등, American J. Hosp. Pharm. 46: 1576(1989) 참조). 또한, 리포솜 크기, 이중층의 수, 지질 조성, 그리고 리포솜의 전하 및 표면 특성을 변화시킴으로써 캡슐화된 제제의 치료 효용을 조절하는 것이 가능하다.
리포솜은 실질적으로 어떤 종류의 세포에도 흡착할 수 있으며, 그 후 캡슐화된 제제를 서서히 방출한다. 또는 달리, 흡착된 리포솜은 포식성 세포에 의해 흡수될 수 있다. 세포내흡수 후에는 리포솜 지질의 리소솜내 분해 및 캡슐화된 제제의 방출이 이어진다(Scherphof 등, Ann. N. Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). 정맥내 투여 후, 작은 리포솜(0.1 내지 1.0㎛)은 전형적으로, 주로 간과 비장에 위치한 세망내피 시스템의 세포에 의해 흡수되고, 3.0㎛ 보다 큰 리포솜은 폐에 침착된다. 세망내피 시스템의 세포에 의한 작은 리포솜의 선택적인 흡수를 사용하여 간의 마크로파지 및 종양에 화학요법제를 송달할 수 있다.
세망내피 시스템은 다량의 리포솜 입자를 사용하여 포화시키거나, 또는 약리적 수단에 의해 마크로파지를 선택적으로 불활성화시키는 것을 포함하는 몇몇 방법에 의해서 방해될 수 있다(Claassen 등, Biochem. Biophys. Acta 802: 428 (1984)). 게다가, 당지질- 또는 폴리에틸렌 글리콜-유도 인지질을 리포솜에 결합시키는 것이세망내피 시스템에 의한 흡수의 현저한 감소를 가져오는 것으로 나타났다(Allen 등, Biochem. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen 등, Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
또한, 리포솜은 인지질 조성을 변화시키거나 리포솜에 수용체나 리간드를 삽입함으로써 특정한 세포나 기관을 표적화하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 비이온성 계면활성제를 높은 함량으로 사용하여 제조된 리포솜이 간을 표적화하는데 사용되었다(Hayakawa 등, 일본특허 04-244,018; Kato 등, Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). 이들 제제는 메탄올 중에서 대두 포스파티딜콜린, α-토코페롤, 및 에톡실화 수소화 캐스톨 오일(HCO-60)을 혼합하고, 이 혼합물을 진공 하에서 농축한 다음 혼합물을 물에서 복원시킴으로써 제조되었다. 또한, 대두-유래 스테릴글루코시드 혼합물(SG)와 콜레스테롤(Ch)를 갖는 디팔미토일포스파티틸콜린(DPPC)의 리포솜 제제가 간을 표적화하는 것으로 나타났다(Shimizu 등, Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).
또는 달리, 항체, 항체 단편, 탄수화물, 비타민, 및 수송 단백질과 같은 다양한 표적화 리간드가 리포솜의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 간세포 표면에서만 발현되는 아사이알로당단백질(갈락토스) 수용체를 표적화하기 위해서 가지형 갈락토실 지질 유도체로 변형될 수 있다(Kato 및 Sugiyama Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi 등, Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)). 유사하게, Wu 등은 Hepatologv 27:772 (1998)에서 아사이알로페투인으로 표지된 리포솜이 리포솜 혈장 반감기를 단축시키고 간세포에 의한 아사이알로페투인 표지된 리포솜의 흡수를 크게 증진시킨다는 것을 나타냈다. 한편, 가지형 갈락토실 지질 유도체를 포함하는 리포솜의 간 축적은 아사이알로페투인을 미리 주입함으로써 억제될 수 있다(Murahashi 등, Biol. Pharm. Bull. 20:259(1997)). 폴리아코니틸화된 인간 혈청 알부민 리포솜이 리포솜을 간세포에 표적화하는 또 다른 접근법을 제공한다(Kamps 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681(1997)). 더욱이, Geho, 등은 미국 특허 제4,603,044에서 간세포를 향한 리포솜 소포 송달 시스템을 설명하는데, 이것은 간의 분화된 대사세포와 관련된 간담즙 수용체에 대해 특이성을 가진다.
조직 표적화에 대한 더 일반적인 접근법에서는 표적 세포가 표적 세포에 의해 발현되는 리간드에 대해 특이적인 비오틴화된 항체로 미리 표지된다(Harasym 등, Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99(1998)). 자유 항체의 원형질 제거 후, 스트렙토아비딘-콘쥬게이트 리포솜이 투여된다. 다른 접근법에서는, 표적화 항체가 리포솜에 직접 부착된다(Harasym 등, Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)).
항-IL-22RA 중화 항체, 및 IL-22OR IL-20 결합 활성과의 결합 파트너, 또는 IL-22RA 가용성 수용체가 단백질 미세캡슐화의 표준 기술을 사용하여 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다(예를 들어, Anderson 등 Infect.Immun. 31:1099(1981), Anderson 등, Cancer Res. 50:1853(1990) 및 Cohen 등 Biochim.Biophys.Acta 1063:95(1991), Alving "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", Liposome Technology, 2판, Vol. III, Gregoriadis, page 317 (CRC Press 1993), Wassef 등, Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). 상기 주지된 대로, 치료적으로 유용한 리포솜은 여러 가지 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 폴리(에틸렌 글리콜)의 지질 유도체를 포함할 수 있다(Allen 등, Biochim.Biophys.Acta 1150:9 (1993)).
치료 단백질을 높은 전신적 수준으로 유지하기 위한 분해가능한 폴리머 마이크로스피어가 설계되었다. 마이크로스피어는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG), 폴리무수물, 폴리(오르토 에스테르), 비생분해성 에틸비닐 아세테이트 폴리머와 같은 분해가능한 폴리머로부터 제조되며, 여기서는 단백질이 폴리머에 포획된다(Gombotz 및 Pettit, Bioconjugate Chenu. 6:332(1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", Drug Delivery Systems, Ranade 및 Hollinger, pages 51-93(CRC Press 1995); Roskos 및 Maskiewicz "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", Protein Delivery: Physical Systems, Sanders 및 Hendren, p 45-92(Plenum Press 1997); Bartus 등, Science 281:1161(1998); Putney 및 Burke, Nature Biotechnology 16:153(1998); Putney, Curr.Opin.Chem.Biol. 2:548(1998)). 또, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-코팅 나노스피어가 치료 단백질의 정맥내 투여를 위한 캐리어를 제공할 수 있다(예를 들어, Gref 등, Pharm. Biotechnol. 10:167(1997)).
또한, 본 발명은 화학적으로 변형된 항-IL-22RA 항체 또는 결합 파트너, 예를 들어 상기 논의된 대로 폴리머에 결합된 항-항-IL-22Ra 항체 또는 IL-22RA 가용성 수용체를 고려한다.
예를 들어, Ansel 및 Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Del-ivery Systems, 5판(Lea & Febiger 1990), Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판(Mack Publishing Company 1995)에 의해, 그리고 Ranade 및 Hollin-ger, Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)에 의해 알려진 대로, 다른 투약 형태가 당업자에 의해 고안될 수 있다.
본 발명은 본원에 설명된 항체, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 항-IL-22 항체의 조성물, 방법 및 치료 용도를 고려한다. 그러한 조성물은 담체를 더 포함할 수 있다. 담체는 종래의 유기 또는 무기 담체일 수 있다. 담체의 예는 물, 완충액, 알콜, 프로필렌 글리콜, 마크로골, 참기름, 옥수수기름 등을 포함한다.
11. 트랜스젠 마우스의 생성
IL-20과 IL-22 모두의 과발현이 인간 건선 병소에서 나타났으며, 이는 IL-20과 IL-22가 모두 인간 건선에 연루된다는 것을 시사한다. 더욱이, 본원에 설명된 대로, 트랜스젠 마우스에서 IL-20과 IL-22의 과발현은 건선 표현형의 징표인 표피 비후화와 면역세포 병발을 나타냈으며, 이에 더하여 정상 마우스에 IL-22를 주입한 것도 건선 표현형의 징표인 표피 비후화 및 면역세포 병발을 나타냈고, 이것은 가용성 수용체 길항물질 IL-22RA2에 의해 제거되었다(zcytor16; WIPO 공보 No. WO 01/ 40467). 그러한 생체내 데이타는 전-염증성 IL-22가 건선에 연루된다는 것을 더욱 시사한다. 이와 같이, IL-22 활성에 대한 길항물질, 예를 들어 본 발명의 항-사람-IL-22RA 중화 항체, 뿐만 아니라 가용성 IL-22RA 수용체가 염증 질환의 치료에서, 특히 건선의 치료에서 IL-22 및 IL-20에 대한 길항물질로서 유용하다. 더욱이, IL-22 또는 IL-20 및 IL-22 활성 모두와 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 제제, 예를 들어 본 발명의 항-사람-IL-22RA 중화 및 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 가용성 IL-22RA 수용체가, 다른 염증성 질환들의 치료에서, 예를 들어 아토피 피부염, IBD, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스성 관절염 및 건선 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈 쇼크, 다기관 기능부전, 천식이나 기관지염 같은 염증성 페손상, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 아토피 및 접촉성 피부염, 및 궤양성 대장염 및 크론씨병과 같은 염증성 장 질환 등의 치료에서 IL-22 또는 IL-20 및 IL-22 모두에 대한 길항물질로서 유용하다.
한 가지 양태 내에서, 본 발명은 (a) 아미노산 번호 1(Pro) 내지 아미노산 번호 6(Asp)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (b) 아미노산 번호 26(Ser) 내지 아미노산 번호 32(Pro)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (c) 아미노산 번호 41(Lys) 내지 아미노산 번호 47(Asp)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (d) 아미노산 번호 49(Val) 내지 아미노산 번호 62(Cys)의 서열 번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (e) 아미노산 번호 41(Lys) 내지 아미노산 번호 62(Cys)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (f) 아미노산 번호 84(Ala) 내지 아미노산 번호 97(Ser)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (g) 아미노산 번호 103(Thr) 내지 아미노산 번호 108(Asp)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (h) 아미노산 번호 130(Arg) 내지 아미노산 번호 135(His)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (i) 아미노산 번호 164(Gly) 내지 아미노산 번호 166(Lys)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (j) 아미노산 번호 175(Tyr) 내지 아미노산 번호 179(Glu)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (k) 아미노산 번호 193(Lys) 내지 아미노산 번호 196(Ala)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (l) 아미노산 번호 203(Lys) 내지 아미노산 번호 209(Thr)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; 및 (m) 서열 번호 4의 아미노산 서열의 군으로부터의 폴리펩티드로 동물에게 접종하는 단계로서, 상기 폴리펩티드는 동물에게서 면역 반응을 유도하여 항체를 생성하는 것인 단계; 및 동물로부터 항체를 분리시키는 단계로서, 항체는 IL-22RA 폴리펩티드(서열 번호 2 또는 서열 번호 3)에 특이적으로 결합하고; IL-20(서열 번호 8) 또는 IL-22(서열 번호 6)의 활성을 감소시키는 것인 단계를 포함하는, 폴리펩티드에 항체를 생성하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 방법에 의해 생성된 항체는 IL-20(서열 번호 8) 또는 IL-22(서열 번호 6)의 전구염증 활성을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 방법에 의해 생성된 항체는 IL-20(서열 번호 8) 또는 IL-22(서열 번호 6)와 IL-22RA(서열 번호 2)의 상호작용을 중화시킨다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같으며, 항체에 의한 중화는 시험관내 세포계 중화 어세이에서 IL-20(서열 번호 8) 또는 IL-22(서열 번호 6)의 중화를 나타냄으로써 측정된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 방법에 의해 생성된 항체는 IL-20(서열 번호 8) 및 IL-22(서열 번호 6)의 전구염증을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 방법에 의해 생성된 항체는 IL-20(서열 번호 8) 및 IL-22(서열 번호 6)와 IL-22RA(서열 번호 2)의 상호작용을 중화시킨다.다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같으며, 시험관내 세포계 중화 어세이에서 IL-20(서열 번호 8) 및 IL-22(서열 번호 6)의 중화를 나타냄으로써 측정된다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법에 의해 생성되는 항체를 제공하며, 이는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3의 폴리펩티드에 결합한다. 한 가지 구체예에서, 항체는 전술한 바와 같으며, 항체는 (a) 폴리클론 항체, (b) 쥐과 모노클론 항체, (c) (b)로부터 유도된 인간화 항체, (d) 항체 단편 또는 (e) 인간 모노클론 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태그, 자성 입자 또는 독소를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 전술한 바와 같으며, 항체는 PEGylation을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 전술한 바와 같으며, 항체는 (a) 폴리클론 항체, (b) 쥐과 모노클론 항체, (c) (b)로부터 유도된 인간화 항체, (d) 항체 단편 또는 (e) 인간 모노클론 항체이다. 다른 구체예에서, 항체는 전술한 바와 같으며, 항체는 방사핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태그, 자성 입자, 약물 또는 독소를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 PEGylation을 더 포함한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 서열 번호 3으로 나타낸 바와 같은 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합되고; IL-20(서열 번호 8) 또는 IL-22(서열 번호 6)의 전구염증 활성을 감소시키는 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 전술한 바와 같고, 항체 또는 항체 단편은 IL-20(서열 번호 8) 및 IL-22(서열 번호 6)의 전구염증 활성을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 전술한 바와 같고, 항체 또는 항체 단편은 (a) 폴리클론 항체, (b) 쥐과 모노클론 항체, (c) (b)로부터 유도된 인간화 항체, (d) 항체 단편 또는 (e) 인간 모노클론 항체이다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 전술한 바와 같고, 항체는 방사핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태그, 자성 입자, 약물 또는 독소를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 전술한 바와 같고, 항체는 PEGylation을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 전술한 바와 같고, 항체 또는 항체 단편은 (a) 폴리클론 항체, (b) 쥐과 모노클론 항체, (c) (b)로부터 유도된 인간화 항체, (d) 항체 단편 또는 (e) 인간 모노클론 항체이다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 전술한 바와 같고, 항체는 방사핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태그, 자성 입자, 약물 또는 독소를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 전술한 바와 같고, 항체는 PEGylation을 더 포함한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 골수 또는 말초혈 세포를, 항체의 부재 하에 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하였을 때 골수 또는 말초혈 세포 내 조혈 세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체를 포함하는 조성물로 배양하는 단계를 포함하는, 조혈 세포 및 조혈 세포 원세포의 IL-22 유도 또는 IL-20 유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 조혈 세포 및 조혈 원세포는 림프양 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 림프양 세포는 대식 세포 또는 T 세포이다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 염증을 감소시키기에 충분한 양의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체의 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-22 유도 또는 IL-20 유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 골수 또는 말초혈 세포를, 항체의 부재 하에 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하였을 때 골수 또는 말초혈 세포 내 조혈 세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체를 포함하는 조성물로 배양하는 단계를 포함하는, 조혈 세포 및 조혈 세포 원세포의 IL-22 유도 또는 IL-20 유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 조혈 세포 또는 조혈 원세포는 림프양 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 림프양 세포는 대식 세포 또는 T 세포이다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 염증을 감소시키기에 충분한 양의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체의 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-22 유도 또는 IL-20 유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 골수 또는 말초혈 세포를, 항체의 부재 하에 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하였을 때 골수 또는 말초혈 세포 내 조혈 세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체를 포함하는 조성물로 배양하는 단계를 포함하는, 조혈 세포 및 조혈 세포 원세포의 IL-22 유도 또는 IL-20 유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 조혈 세포 및 조혈 원세포는 림프양 세포이다. 다른 구체예에서, 림프양 세포는 대식 세포 또는 T 세포이다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 염증을 감소시키기에 충분한 양의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체의 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-22 유도 또는 IL-20 유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 골수 또는 말초혈 세포를, 항체의 부재 하에 배양된 골수 또는 말초혈 세포와 비교하였을 때 골수 또는 말초혈 세포 내 조혈 세포의 증식 또는 분화를 감소시키기에 충분한 양의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체를 포함하는 조성물로 배양하는 단계를 포함하는, 조혈 세포 및 조혈 세포 원세포의 IL-22 유도 또는 IL-20 유도 증식 또는 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 조혈 세포 및 조혈 원세포는 림프양 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 림프양 세포는 대식 세포 또는 T 세포이다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 염증을 감소시키기에 충분한 양의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체의 조성물을 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는, IL-22 유도 또는 IL-20 유도 염증을 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 (1) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 레벨을 결정하는 단계; (2) 본 명세서에 기재된 항체 또는 항체 단편에 따른 항체를 허용 가능한 약학적 비히클 내에 포함하는 조성물을 투여하는 단계; (3) 혈청 아밀로이드 A 단백질의 투여 후 레벨을 결정하는 단계; (4) 단계 (1)의 혈청 아밀로이드 A 단백질의 레벨을 단계 (3)의 혈청 아밀로이드 A 단백질의 레벨과 비교하는 단계를 포함하며, 혈청 아밀로이드 A 단백질 레벨의 증가 결핍 또는 감소가 염증 반응 억제를 나타내는 것인, 염증을 가진 포유류에게서 염증 반응을 억제하는 방법을 제공한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 염증이 감소되도록 IL-22 또는 IL-20의 길항물질을 투여하는 단계로서, 상기 길항물질은 (i) IL-22RA(서열 번호 3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드 또는 (ii) IL-22RA(서열 번호 3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 포함하는 것인 단계를 포함하고; IL-22(서열 번호 6) 또는 IL-20(서열 번호 8)의 염증 활성이 감소되는 것을 특징으로 하는, IL-22 또는 IL-20이 기인하는 염증 질환을 가진 포유류의 치료 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 만성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 아토피성 피부염 또는 건선을 포함하는 만성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 급성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 내독소혈증, 패혈증, 독소 쇼크 증후군 또는 감염 질환을 포함하는 급성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드는 방사핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태그, 자성 입자, 약물 또는 독소를 더 포함한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 염증이 감소되도록 IL-22 및 IL-20의 길항물질을 투여하는 단계로서, 상기 길항물질은 (i) IL-22RA(서열 번호 3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드 또는 (ii) IL-22RA(서열 번호 3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 포함하는 것인 단계를 포함하고; IL-22(서열 번호 6) 및 IL-20(서열 번호 8)의 염증 활성이 감소되는 것을 특징으로 하는, IL-22 및 IL-20이 기인하는 염증 질환을 가진 포유류의 치료 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 만성 감염 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피성 피부염 또는 건선을 포함하는 만성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 급성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 내독소혈증, 패혈증, 독소 쇼크 증후군 또는 감염 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드는 방사핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태그, 자성 입자, 약물 또는 독소이다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 (a) 아미노산 번호 1(Pro) 내지 아미노산 번호 6(Asp)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (b) 아미노산 번호 26(Ser) 내지 아미노산 번호 32(Pro)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (c) 아미노산 번호 41(Lys) 내지 아미노산 번호 47(Asp)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (d) 아미노산 번호 49(Val) 내지 아미노산 번호 62(Cys)의 서열 번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (e) 아미노산 번호 41(Lys) 내지 아미노산 번호 62(Cys)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (f) 아미노산 번호 84(Ala) 내지 아미노산 번호 97(Ser)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (g) 아미노산 번호 103(Thr) 내지 아미노산 번호 108(Asp)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (h) 아미노산 번호 130(Arg) 내지 아미노산 번호 135(His)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (i) 아미노산 번호 164(Gly) 내지 아미노산 번호 166(Lys)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (j) 아미노산 번호 175(Tyr) 내지 아미노산 번호 179(Glu)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (k) 아미노산 번호 193(Lys) 내지 아미노산 번호 196(Ala)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (l) 아미노산 번호 203(Lys) 내지 아미노산 번호 209(Thr)의 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드; (m) 서열 번호 3의 아미노산 서열로 구성된 에피토프; 및 (n) 서열 번호 4의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드의 군으로부터의 인간 IL-22RA(서열 번호 3)의 항원성 에피토프에 특이적으로 결합된 모노클론 항체를 포함하고, 인간 IL-22(서열 번호 6) 또는 IL-20(서열 번호 8)의 활성을 감소 또는 중화시키는 항체를 제공한다. 한 가지 구체예에서, 항체는 전술한 바와 같고, 항체는 인간 IL-22(서열 번호 6) 및 IL-20(서열 번호 8)의 활성을 감소 또는 중화시킨다. 다른 구체예에서, 상기 항체는 전술한 바와 같고, 항체는 (a) 쥐과 모노클론 항체, (b) (a)로부터 유도된 인간화 항체, (c) 항체 단편 및 (d) 인간 모노클론 항체의 군으로부터 유래한다. 다른 구체예에서, 항체는 전술한 바와 같고, 항체는 PEGylation을 더 포함한다. 다른 구체예에서, 항체는 전술한 바와 같고, 항체는 (a) 쥐과 모노클론 항체, (b) (a)로부터 유도된 인간화 항체, (c) 항체 단편 및 (d) 인간 모노클론 항체의 군 중에서 선택된다. 다른 구체예에서, 항체는 전술한 바와 같고, 항체는 PEGylation을 더 포함한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체의 유효량을 투여함으로써 상기 병리학적 상태를 치료하는 단계를 포함하는, IL-22RA 활성과 관련된 환자의 병리학적 상태의 치료 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 상기 병리학적 상태는 만성 염증 상태이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 상기 만성 염증 상태는 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피성 피부염 또는 건선을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 상기 병리학적 상태는 급성 염증 상태이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 상기 급성 염증 상태는 내독소혈증, 패혈증, 독소 쇼크 증후군 또는 감염 질환을 포함한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 염증이 감소되도록 IL-22의 길항물질을 투여하는 단계로서, 상기 길항물질은 IL-22RA(서열 번호 3)의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드를 포함하는 것인 단계를 포함하고; 염증 활성이 감소되는 것을 특징으로 하는, IL-22에 기인하는 염증 질환을 가진 포유류의 치료 방법을 제공한다. 한 가지 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 만성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 크론병, 관절염, 아토피성 피부염 또는 건선을 포함하는 만성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 급성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 질환은 내독소혈증, 패혈증, 독소 쇼크 증후군 또는 감염 질환을 포함하는 급성 염증 질환이다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 항체, 항체 단편 또는 결합 펩티드는 방사핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩티드 태그, 자성 입자, 약물 또는 독소를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 전술한 바와 같고, 항체, 항체 단편 또는 결합 폴리펩티드는 PEGylation을 더 포함한다.
다른 양태 내에서, 본 발명은 염증을 가진 포유류에게 염증을 감소시키기에 충분한 양의 본 명세서에 개시된 바와 같은 항체의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 염증 감소 방법을 제공한다.
( 실시예 )
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 더 예시된다.
실시예 1
형질전환된 BHK 570 세포로부터 IL-22RA2-Fc4 폴리펩티드의 정제
다른 언급이 없는 한 모든 조작은 4 ℃에서 수행하였다. IL-22RA2-Fc4로 표시된, 인간 Fc4 (서열 번호 14)에 대한 C-말단 융합을 포함하고 있는 IL-22RA2 폴리펩티드(서열 번호 13의 잔기 23에서 231로부터 얻어지는 성숙한 가용성 수용체 폴리펩티드; 서열 번호 12로 표시되는 폴리누클레오티드)를 정제하기 위하여 다음의 과정을 사용하였다. IL-22RA2-Fc4로 형질전환된 BHK 570 세포로부터의 약 16,500 ml의 조건 배지를 0.2 ㎛의 멸균 필터를 통하여 여과한 후, 프로테아제 억제제 용액으로 보충하여 최종 농도가 0.001 mM의 로이펩틴(Boerhinger-Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001 mM의 펩스타틴 (Boerhinger-Mannheim) 및 0.4 mM의 Pefabloc (Boerhinger-Mannheim)이 되도록 하였다. 다공성 단백질 A50 칼럼 (20 ml의 베드 부피, Applied Biosystems)을 충전시키고 400 ml의 PBS(Gibco/BRL)로 세척하였다. 보충시킨 조건 배지를 15 ml/분의 유속으로 상기 칼럼을 통과시킨 후, 800 ml의 PBS (BRL/Gibco)로 세척하였다. IL-22RA2-Fc4를 0.1 M 글리신 pH 3.0을 사용하여 용출시켜서 5 ml씩의 분획을 직접 0.5 ml 2 M 트리스 pH 7.8에 수집하였고, 이 분획의 최종 pH를 7.4로 조정하였다.
칼럼의 성능을 출발 배지의 환원 SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯팅과 칼럼 통과에 의해 특성 확인하였다. 웨스턴 블롯팅은 항-인간 IgG HRP (Amersham) 항체를 사용하였는데, 그것은 출발 배지에서 60,000 Da에서 면역반응성 단백질을 나타냈고, 그 외의 곳에서는 아무것도 나타내지 않았는데, 이것은 단백질이 완전히 결합되었음을 시사한다. 단백질 A50을 용출하는 분획을 환원 SDS PAGE 겔에 의해 특성 확인하였다. 이 겔은 분획 3부터 11 까지에서 60,000 Da에서 진하게 쿠마찌로 염색된 밴드를 나타냈다. 분획 3부터 11을 모았다.
단백질 A50 용출 풀을 30,000 Da Ultrafree Biomax 원심분리 농축기 (15 ml 부피, Millipore)를 사용하여 44 ml로부터 4 ml로 농축하였다. 세파크릴 S-300 겔 여과 칼럼 (175 ml 베드 부피; Pharmacia)을 350 ml의 PBS (BRL/Gibco)로 세척하였다. 농축된 풀을 1.5 ml/분의 유속으로 칼럼을 통과하도록 주입한 후, 225 ml의 PBS (BRL/Gibco)로 세척하였다. 용출된 피크를 2 ml 씩의 분획으로 모았다.
용출된 분획을 환원 및 비-환원 은 염색된 (Geno Technology) SDS PAGE 겔에 의해 특성 확인하였다. 환원 은 염색된 SDS PAGE 겔은 분획 14 내지 31에서 60,000 Da에서 진하게 염색된 밴드를 나타낸 한편, 비-환원 은 염색된 SDS PAGE 겔은 분획 14 내지 31에서 160,000 Da에서 진하게 염색된 밴드를 나타냈다. 분획 1 내지 13은 다양한 크기의 많은 밴드를 나타냈다. 분획 14 내지 31을 모아서 30,000 Da Ultrafree Biomax 원심분리 농축기 (15 ml 부피, Millipore)를 사용하여 22 ml로 농축하였다. 이 농축물을 0.2 ㎛의 Acrodisc 멸균 필터 (Pall Corporation)를 통과시켜 여과하였다.
농축되고 모아진 분획의 단백질 농축을 BCA 분석 (Pierce, Rockford, IL)에 의해 수행하고, 물질을 일정량으로 나눈 다음, -80 ℃에서 본 발명자들의 표준 과정에 따라 보관하였다. 모아진 분획의 농도는 1.50 mg/ml이었다.
실시예 2
CRF2-4 수용체를 발현하는 BaF3 세포 (BaF3/CRF2-4 세포)와 IL-22RA 수용체와 함께 CRF2-4 수용체를 발현하는 BaF3 세포 (BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포)의 제조
전체 길이의 CRF2-4 수용체를 발현하는 BaF3 세포를 아래와 같이 30 ㎍의 CRF2-4 발현 벡터를 사용하여 제조하였다. CRF2-4 수용체를 발현하는 BaF3 세포는 BaF3/CRF2-4 로 표시하였다. 이들 세포를 대조표준으로서 사용하여 전체 길이의 IL-22RA 수용체 (미국 특허 제 5,965, 704호)로 추가로 형질전환시키고, 그것을 사용하여 아래와 같이 IL-22 활성에 대한 스크린을 구성하였다.
A. CRF2-4 수용체를 발현하는 BaF3 세포의 제조
CRF2-4의 전체 길이의 cDNA 서열 (Genbank 승인 번호 Z17227)을 다우디 셀라인 cDNA 라이브러리로부터 분리한 후, 발현 벡터 pZP7P 안에 클론하였다.
쥐의 골수로부터 유도된 인터류킨-3 (IL-3) 의존성 전-림프성 셀라인인 BaF3 (Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986)를 완전 배지 (10 %의 열-비활성화 우 태아 혈청, 2 ng/ml의 쥐의 IL-3 (mIL-3)(R & D, Minneapolis, MN), 2 mM의 L-글루타Max-1TM (Gibco BRL), 1 mM의 피루브산 나트륨 (Gibco BRL), 및 PSN 항체 (GIBCO BRL)가 첨가되어 있는 RPMI 배지 (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS))에서 유지시켰다. 일렉트로포레이션 전에 CRF2-4/pZP7P를 제조하여 Qiagen Maxi 예비 키트 (Qiagen)를 제조업체의 지시대로 사용하여 정제하였다. 일렉트로포레이션을 위해서는 BaF3 세포를 혈청이 없는 RPMI 배지로 한번 세척한 다음 혈청이 없는 RPMI 배지에서 107 세포/ml의 세포 밀도로 재현탁시켰다. 재현탁된 BaF3 세포 1 ml을 30 ㎍의 CRF2-4/pZP7P 플라스미드 DNA와 혼합하여, 그것을 별도의 일회용 일렉트로포레이션 챔버 (GIBCO BRL)로 옮겼다. 그것을 실온에서 15분 동안 인큐베이션한 후에 세포에 일렉트로포레이션 장치 (CELL-PORATORTM; GIBCO BRL)에 의해 전달된 충격을 2회 연속으로 주었다 (800 lFad/300 V.; 1180 lFad/300 V.). 5분의 회복 시간을 두었다가 일렉트로포레이트된 세포를 50 ml의 완전 배지에 옮기고 15 내지 24 시간 동안 인큐베이터에 놓아두었다(37 ℃, 5 % CO2). 그런 다음 세포를 회전시키고, 퓨로마이신-내성 풀을 분리하기 위하여 T-162 플라스크에 2 ㎍/ml의 퓨로마이신을 함유하고 있는 50 ml의 완전 배지에 옮겼다. 이하 BaF3/CRF2-4 세포로 명명할, 형질전환된 BaF3 세포의 풀에 대하여 아래에서 설명되는 바와 같이 신호화 능력에 대하여 분석하였다. 추가로 이들 세포를 아래에서 설명되는 바와 같이 IL-22RA 수용체로 형질전환하였다.
B. CRF2-4 및 IL-22RA 수용체를 발현하는 BaF3 세포의 제조
전 길이의 IL-22RA 수용체를 발현하는 BaF3/CRF2-4 세포를 30 ㎍의 IL-22RA 발현 벡터를 사용하여 위에서와 같이 제조하였다. 회수 후에 형질전환체들을 200 ㎍/ml의 제오신 및 2㎍/ml의 퓨로마이신을 사용하여 선택하였다. IL-22RA 수용체를 발현하는 BaF3/CRF2-4 세포를 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포로서 표시하였다. 이들 세포를 사용하여 본원에서 설명되는 IL-22RA 길항체 활성뿐만 아니라 IL-22 활성에 대해서도 스크린하였다.
실시예 3
알라마르 블루 증식 분석법을 사용하는 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포를 사용한 IL-22 길항물질 활성에 대한 스크리닝
A. 알라마르 블루 증식 분석법을 사용하는 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포를 사용한 IL-22 활성에 대한 스크리닝
정제된 IL-22-CEE (실시예 4)를 사용하여 아래와 같이 증식 활성의 존재에 대해 시험하였다. 아래에서 설명되는 이 분석법에서 정제된 IL-22RA2-Fc4 (실시예 1)를 IL-22의 증식성 반응을 길항하는 데 사용하였다.
BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포를 회전시키고 완전 배지 (10 %의 열-비활성화 우 태아 혈청, 2 ng/ml의 쥐의 IL-3 (mIL-3)(R & D, Minneapolis, MN), 2 mM의 L-글루타Max-1TM (Gibco BRL), 1 mM의 피루브산 나트륨 (Gibco BRL), 및 PSN 항체 (GIBCO BRL)가 첨가되어 있는 RPMI 배지 (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS), 그러나 mIL-3은 없는 배지(이하 "mIL-3 유리 배지"로 언급함))로 세척하였다. 세포를 회전시키고 3회 세척하여 mIL-3을 확실하게 제거하였다. 그런 다음 세포를 혈구 계산기로 계수하였다. 세포를 96-웰 포맷으로 웰 당 5000 세포로, mIL-3 유리 배지를 사용하여 웰당 100 ㎕의 부피로 플레이트하였다.
BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포의 증식은 mIL-3 유리 배지로 50, 10, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.13, 0.06 mg/ml 농도로 희석된 IL-22-CEE 단백질을 사용하여 평가하였다. 100 ㎕의 희석된 단백질을 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포에 첨가하였다. 총 분석 부피는 200 ㎕이다. 분석 플레이트를 37 ℃ 및 5 % CO2에서 3일 동안 인큐베이션하였는데, 그 동안에 알라마르 블루(Alamar Blue) (Accumed, Chicago, IL)를 20 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 플레이트를 다시 37 ℃ 및 5 % CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 알라마르 블루는 살아있는 세포의 수를 토대로 한 형광분광학적 정보를 제공하므로, 네가티브 대조표준에 대한 비교시 세포 증식의 직접적인 척도가 된다. 플레이트를 다시 37 ℃ 및 5 % CO2에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 FmaxTM 플레이트 판독기 (Molecular Devices Sunnyvale, CA)상에서 SoftMaxTM Pro 프로그램을 사용하여 544 (여기) 및 590 (방출) 파장에서 판독하였다. 그 결과는 IL-22-CEE에 대한 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포의 용량-의존성 증식성 반응을 확증해주었다. 측정된 바, 반응은 50 ng/ml의 상단부에서 바탕값보다 대략 15배였고, 0.06 ng/ml의 하단부에서는 2배까지 감소하였다. BaF3 야생형 세포와 BaF3/CRF2-4 세포는 IL-22-CEE에 대해 증식적인 반응을 나타내지 않았는데, 그것은 IL-22가 CRF2-4/IL-22RA 이종성이량체 수용체에 특이적이라는 것을 나타낸다.
IL-22RA2가 IL-22 활성을 길항할 수 있는 지를 측정하기 위하여 위에서 설명한 분석법을 정제된 가용성 IL-22RA2/Fc4를 사용하여 반복하였다. IL-22를 10 ㎍/ml의 IL-22RA2와 조합하였을 때 모든 농도에서 IL-22의 반응은 바탕값으로 떨어졌다. 가용성 IL-22RA2의 존재가 IL-22의 증식적 효과를 제거했다는 것은 그것이 IL-22 리간드의 강력한 길항물질라는 것을 증명한다. 이 분석법을 항-IL-22RA 항체와 같은, 본원에서 설명되는 IL-22 활성의 다른 길항물질을 시험하는 데에도 사용할 수 있다.
실시예 4
BHK 570 세포로부터 IL-22-CEE의 정제
다른 언급이 없는 한 모든 조작은 4 ℃에서 수행하였다. 다음의 과정을 사용하여 C-말단 GluGlu (EE) 꼬리 (서열 번호 15; 또는 서열 번호 16)를 함유하고 있는 IL-22 폴리펩티드를 정제하였다. IL-22-CEE를 발현하는 BHK 세포로부터의 조건 배지를 아미콘 S10Y3 스피랄 카트리지로 ProFlux A30 상에서 농축하였다. 프로테아제 억제제 용액을 이 농축된 조건 배지에, 2.5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0.003 mM 로이펩틴 (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), 0.001 mM 펩스타틴 (Boehringer-Mannheim) 및 0.4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim)의 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 분석을 위해 샘플을 취하여 벌크 부피를 -80 ℃에서 정제를 시작할 때까지 냉동시켰다. 농축된 조건 배지의 총 표적 단백질 농도를 SDS-PAGE 및 항-EE HRP 포합 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다.
약 100 ml 칼럼의 항-EE G-세파로스 (아래에서 설명되는 것처럼 준비함)를 Waters AP-5, 5 cm×10 cm 유리 칼럼에 부었다. 칼럼을 흐르게 하여 채운 뒤 BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 상에서 인산염 완충 식염수 (PBS) pH 7.4로 평형화하였다. 농축된 조건 배지를 해동하여 0.2 미크론 멸균 필터를 통하여 여과한 다음 pH를 7.4로 조정한 후, 칼럼에 약 1 ml/분의 유속으로 밤새 로딩하였다. 칼럼을 10 칼럼 부피 (CV)의 인산염 완충 식염수 (PBS, pH 7.4)로 세척한 후, 플러그를 0.5 mg/ml의 EE 펩티드 (Anaspec, San Jose, CA)를 함유하고 있는 200 ml의 PBS (pH 6.0)로 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 사용된 EE 펩티드의 서열은 EYMPME (서열 번호 15)이다. 칼럼을 10 CV의 PBS로 세척한 다음 5 CV의 0.2 M 글리신, pH 3.0으로 용출하였다. 글리신으로 용출된 칼럼의 pH는 2 CV의 5X PBS로 7.0으로 조정하였고, 그런 다음 PBS (pH 7.4)로 평형화하였다. 5 ml의 분획을 전 용출 크로마토그래피 동안에 수집하여 280 과 215 nM에서의 흡광도를 모니터하였고, 한편으로 칼럼을 통과한 것과 세척하여 모아놓은 풀을 또한 보관하였다가 분석하였다. EE-폴리펩티드 용출 피크 분획을 SDS-PAGE 은 염색 및 항-EE HRP 포합 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 표적 단백질에 대해 분석하였다. 관심의 폴리펩티드 용출 분획을 모아서 10,000 달톤 분자량 컷오프 막 회전 농축기 (Millipore, Bedford, MA)를 제조업체의 지시대로 사용하여 60 ml로부터 5.0 ml로 농축하였다.
함께 정제되는 다른 단백질로부터 IL-22-CEE를 분리하기 위하여 농축된 폴리펩티드 용출 풀 분획에 대해 POROS HQ-50 (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA로부터의 강력한 음이온 교환 수지)을 pH 8.0에서 수행하였다. 1.0×6.0 cm 칼럼을 붓고 BioCad Sprint상에서 흐르게 하여 충전하였다. 칼럼을 카운터 이온으로 하전G한 후 20 mM TRIS pH 8.0 (Tris(히드록시메틸 아미노메탄))으로 평형화하였다. 샘플을 1:13으로 희석한 후 (PBS의 이온 강도를 감소시키기 위하여) 다공성 HQ 칼럼에 5 ml/분의 유속으로 로딩하였다. 칼럼을 10 CV의 20 mM 트리스 pH 8.0으로 세척한 다음 40 CV 구배의 20 mM 트리스/1 M 염화 나트륨 (NaCl)으로 10 ml/분의 유속으로 용출하였다. 전 크로마토그래피 과정에 걸쳐 1.5 ml 분획을 수집하여 280 및 215 nM에서의 흡광도를 모니터하였다. 용출 피크 분획을 SDS-PAGE 은 염색을 통해 분석하였다. 관심의 분획을 모아서 10,000 달톤 분자량 컷오프 막 회적 농축기 (Millipore, Bedford, MA)를 제조업체의 지시대로 사용하여 1.5 내지 2 ml로 농축하였다.
유리 EE 펩티드 및 함께 정제된 모든 오염 단백질로부터 IL-22-CEE 단백질을 분리하기 위하여 모아둔 농축 분획에 대해 크기 축출 크로마토그래피를, BioCad Sprint를 사용하여 1.0 ml/분의 유속으로 PBS로 평형화되고 로딩되어 있는 1.5×90 cm Sephadex S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 칼럼상에서 수행하였다. 전 크로마토그래피 과정을 통해 1.5 ml 분획을 모아서 280 및 215 nM에서의 흡광도를 모니터하였다. 피크 분획의 특성은 SDS-PAGE 은 염색에 의해 확인하였고, 가장 순수한 분획만을 모았다. 이 물질을 정제된 IL-22-CEE 폴리펩티드로 표시하였다.
이 정제된 물질에 대해 마지막으로 4 ml의 ActiClean Etox (Sterogene) 칼럼을 수행하여 남아있는 모든 내독소를 제거하였다. 샘플을 PBS로 평형화시켜 놓은 중력 칼럼을 4회 통과하도록 한 후 칼럼을 3 ml 부피의 PBS로 1회 세척하고, 그것을 "세정된" 샘플로 모았다. 그런 다음 물질을 0.2 미크론 멸균 필터를 통해 여과하고 일정량으로 나누기 전까지 -80 ℃에서 보관하였다.
웨스턴 블롯팅에서 쿠마찌 블루와 은은 SDS-PAGE 겔을 염색하였고, IL-22-CEE 폴리펩티드가 주요 밴드로 나타났다. 정제된 물질의 단백질 농도는 BCA 분석 (Pierce, Rockford, IL)에 의해 측정하였고, 단백질을 일정량으로 나눈 다음 표준 과정에 따라 -80 ℃에서 보관하였다.
항-EE 세파로스를 제조하기 위하여 100 ml의 베드 부피를 가지는 단백질 G 세파로스 (Pharmacia, Piscataway, NJ)를 0.02 %의 소디움 아지드를 함유하고 있는 100 ml의 PBS로 500 ml의 Nalgene 0.45 미크론 필터 유닛을 사용하여 3회 세척하였다. 겔을 6.0 부피의 200 mM 트리에탄올아민, pH 8.2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO)를 사용하여 세척하고, 900 mg의 항체를 함유하고 있는 동일한 부피의 EE 항체 용액을 첨가하였다. 그것을 밤새 4 ℃에서 인큐베이션한 후, 미결합 항체를 상술한 것처럼 5 부피의 200 mM TEA로 수지를 세척함으로써 제거하였다. 수지를 2 부피의 TEA에 재현탁한 다음, 적당한 용기에 옮기고, TEA에 녹인 디메틸피밀리미데이트-2HCl (Pierce, Rockford, IL)을 최종 농도가 단백질 G-세파로스 겔 ml당 36 mg이 되도록 첨가하였다. 겔을 실온에서 45분 동안 진동시킨 후 액체를 상술한 것과 같은 필터 유닛을 사용하여 제거하였다. 그런 다음 겔 상에 있는 비특이적 부위를 10분 동안 실온에서 5 부피의 200 mM TEA 중의 20 mM 에탄올아민과 함께 인큐베이션함으로써 차단하였다. 다음 단계로 겔을 0.02 %의 소디움 아지드를 함유하고 있는 5부피의 PBS로 세척하고 그 용액을 4 ℃에서 보관하였다.
실시예 5
IL-22 폴리펩티드의 생체내 효과
마우스들 (암컷, C57BL/6N, 생후 8주; Charles River Labs, Kingston, NY)를 세 그룹으로 나누었다. IL-22 폴리펩티드 (서열 번호 6)를 발현하는 아데노바이러스를 표준 방법을 사용하여 이 실험 전에 만들었다. 제 0 일에 부모의 또는 IL-22 아데노바이러스를 첫 번째 (n=8) 및 두 번째 (n=8) 그룹에 꼬리 정맥을 통하여 각각 투여하였는데, 각 마우스는 약 0.1 ml 부피에 들어있는 약 1×1011 입자의 용량을 투여받았다. 세 번째 그룹 (n=8)에는 아무런 처리를 하지 않았다. 12 일째에 마우스들의 체중을 재고 혈액을 뽑아냈다. 샘플을 완전 혈액 카운트 (CBC) 및 혈청 화학에 대해 분석하였다. 부모의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비해 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹으로부터 취한 혈액 샘플에서, 호중구와 혈소판 수에서 통계학적으로 유의할만한 상승이 검출되었다. 또한 부모의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비해 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹으로부터 림프구와 적혈구 수는 상당히 감소하였다. 또 IL-22 아데노바이러스로 처리한 마우스들은 체중 감소를 보인 한편, 부모의 아데노바이러스로 처리한 마우스들은 체중이 늘었다. 또한 혈청 IL-22 수준은 증가하였고 글루코스 수준은 3 일째에 감소하였다. 요약하면, IL-22 아데노-마우스들은 TNF-알파, IL-1베타 및 gp130 사이토킨과 같은 다른 전-염증성 사이토킨에 의해 개시될 수도 있는 급성 단계 반응을 나타냈다. 급성 단계 반응은 패턴 인식 분자에 의해 개시되는 즉각적인 염증성 반응의 세트이다. 급성 단계 단백질은 미생물에 대항하는 보호력을 증강시키고, 염증성 반응을 세포 교류 및 조절제 방출에 미치는 효과들에 의해 변형시킨다. 예를 들어 SAA는 주화성의 유도, 내피 세포에 대한 백혈구 점착의 증대, 및 증가된 식세포 활동을 포함하는 강력한 백혈구 활성화 기능을 가진다. 급성 단계 반응의 규모와 기간을 개시하고 변경시키는 요인들을 이해하는 것은 감염성 및 염증성 질병에 대한 새로운 치료법의 개발에 있어 중요한 단계를 나타낸다.
그 결과는 IL-22가 조혈작용, 즉 생체내 혈구 형성에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 그 자체로서 IL-22는 상이한 혈액 간세포에 영향을 미치는 생물학적 활성을 가질 수 있고, 따라서 그 결과로 특이한 계통에서 분화된 특정 혈구의 증가 또는 감소를 유발할 것이다. 예를 들어 IL-22는 림프구를 감소시키는 것으로 나타나는데, 그것은 림프구를 발생시키는 것으로 정해진 전구 세포의 억제에 기인하는 것 같다. IL-22는 또한 적혈구를 감소시키는 데, 그것은 IL-22가 빈혈, 감염, 염증, 및/또는 면역 질병에서 이들 질병에 포함된 혈구에 영향을 끼침으로써 어떤 역할을 할 수 있을 것이라는 언급을 지지한다. IL-22에 대한 길항물질, 예컨대 항체 또는 그것의 가용성 수용체 IL-22RA2는 이들 질병에서 치료 시약으로서 사용될 수 있을 것이다.
더욱이 마우스에서 IL-22 아데노바이러스를 사용하는 이들 실험은 IL-22 과잉-발현이 생체내에서 호중구와 혈소판의 수준을 증가시킨다는 것을 시사한다. 전체 동물계에서 IL-22에 대한 반응에 포함된 다른 요인들 (예컨대 사이토킨 및 변형 유전자)이 있음에 틀림없다. 그럼에도 불구하고 이들 데이터는 조혈작용에 IL-22가 관련되어 있음을 강력하게 지지한다. 그러므로 IL-22 및 그것의 수용체는 다양한 질환, 예를 들어 염증, 면역 장애, 감염, 빈혈, 조혈적 및 다른 암, 등의 진단 및 치료에 적당한 시약/표적이다.
실시예 6
IL-22-발현 유전자 도입 마우스
A. 마우스 IL-22를 발현하는 유전자 도입 마우스의 생성
림프계의 특이한 EμLCK 프로모터의 5' 및 3' 플랭킹 서열, 마우스 IL-22 (서열 번호 10; 서열 번호 11에 도시된 폴리펩티드), 쥐의 인슐린 II 인트론, IL-22 cDNA 및 인간 성장 호르몬 폴리 A 서열을 함유하고 있는 유전자 도입 벡터로부터 DNA 단편들을 표준 방법을 사용하여 제조하여, 멸균된 B6C3f1 (Taconic, Germantown, NY) 래트 난모세포에, 표준 미소주입 프로토콜을 사용하여 미소주입하는 데 사용하였다. (Hogan, B. et al., Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 참조).
154 마리의 새끼 중에서 림프계-특이적 EμLCK 프로모터를 가지고 있는 마우스 IL-22에 대해 유전자 도입된 25 마리의 마우스를 확인하였다. 이 유전자 도입 새끼들 중 11 마리는 출생 후 수 시간 내에 죽었고, 외관이 반질반질한 9 마리의 유전자 도입 새끼는 출생일에 부검하였으며, 2 마리는 성체로 성장시켰다. 발현 수준은 한 마리의 성숙한 동물에서 낮았다. 부검한 새끼의 조직을 취하여 아래에서 설명하는 것과 같이 조직학적으로 검사하였다.
신생 새끼의 반질거리는 외관은 마치 새끼들이 너무 건조된 것처럼 피부의 경직과 관련이 있는 것 같았고, 적절한 사육의 축소를 유발하였다. 새끼들의 움직임도 대체로 경직되었다.
B. 유전자 도입 마우스로부터의 유전자형 및 발현 분석
상술한 바와 같이 EμLck 프로모터에 의해 유도된 마우스 IL-22 유전자 도입 계통으로부터 새로 태어난 새끼는 태어난 지 1 일째 (출생일)에 이상이 관찰되었고, 그래서 조직 수집을 위해 희생시켰다. 모든 새끼들에게 고유한 꼬리 번호를 귀에 달아주었고, 그것들은 희생시킨 시점에 반질거리는 피부 표현형을 가지는 것으로 표시되었다. 12 마리의 새끼 중에서 6마리가 반질거리는 피부 표현형을 가지는 것으로 관찰되었고, 2마리는 "중증" 표현형으로서 표시되었다. 중증 표현형은 움직임이 적고, 피부가 특별히 반질거리며 매우 건조한 작은 새끼들로서 규정하였다. 각 새끼들로부터 좌측 옆쪽의 피부를 수집하여 조직-Tek 삽입 배지에 넣어 냉동하였다.
유전자형 분류는 발현 데이터가 수집되지 않았음에도 불구하고 반질반질한 피부가 유전자 도입 현상에 대한 좋은 지표였음을 확증하였다. 냉동된 피부 블록을 저온 유지 장치에서 7 미크론으로 절단하고, CD3, CD4, CD8, 마우스 마크로파지, B-세포, CD80, 및 MHC 부류 II의 존재를 찾기 위해 염색하였다. 염색 프로토콜은 상업적으로 활용할 수 있는 항체의 조직에의 결합, 페록시다제 표지된 이차 항체를 사용한 검출, 및 염색을 가시화하기 위한 DAB 발색 반응을 포함하였다.
유전자 도입 동물은 MHC 부류 II 및 CD80이 높게 나타났는데, 그것들은 각각 항원-제공 세포 및 수지상 돌기 세포를 염색한다. 마크로파지 마커는 또한 야생형 동물에서보다 중증 및 비-중증 유전자 도입 동물에서 더 많은 세포를 검출하였지만, 이들 세포의 분포는 고등 동물의 피부에서는 매우 국소화되어 있다. 중증 표현형으로서 분류된 동물들은 이들 세 개의 모든 마커 중에서 가장 강한 염색을 보였고, 그것은 야생형과 비교했을 때 세포 밀도와 수에서 극적인 증가를 나타냈다. 이 변이성은 이들 유전자 도입 초기 단계 새끼에서 IL-22의 발현 수준의 차이에 기인하는 것일 수 있다. MHC 부류 II 포지티브 세포는 느슨하게 개방되어 있는 클러스터에 배열된 하등 동물 피부에 위치한 한편, CD80 포지티브 세포는 우선적으로 근육/지방 층에 또는 바로 위에 있는 피부 아래에 위치하였다. 이들 두 세포 집단은 겹치는 것으로 보이지 않는다. 다른 모든 마커는 모든 동물에서 동등하게 염색되었다. 비만 세포를 위한 톨루이딘 블루 염색은 야생형과 유전자 도입 동물 사이에 거의 차이를 나타내지 않았다.
C. 유전자 도입 마우스로부터의 조직의 현미경에 의한 평가: EμLck 프로모터를 포함하는 IL-22 TG는 신생아의 치명적-조직학을 보인다.
출생일에 IL-22 도입 유전자를 함유하고 있는 한배 새끼로부터 새끼를 인정적으로 안락사시키고 전 신체를 10 % 완충된 포르말린에 담가서 고정시켰다. 6마리의 유전자 도입 및 두 마리의 비-유전자 도입 새끼를 추가의 작업을 위해 남겨두었다. 6 마리의 유전자 도입 새끼 중에서 4마리는 안락사시킬 때 반질거리는 피부를 가지고 있는 것으로 주지되었다. 고정된 조직을 5 개의 단편으로 잘라놓았다 (머리 부분의 세로 절개부 및 흉부의 상부 및 하부 단편 및 상부 및 하부 복부). 조직을 파라핀에 넣어두었다가 관례대로 처리하고, 5 ㎛로 잘라 (Jung 2065 Supercut micrptome, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) H&E로 염색하였다. 염색된 조직을 광현미경 (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY) 하에서 관청(ACVP)이 인증하는 수의학적 병리학자에 의해 평가하였다.
현미경 조사시 유전자 도입 새끼들 중 두 마리의 표피가 대조표준을 포함한 다른 6마리의 마우스의 표피보다 더 두꺼운 것이 관찰되었다. 어떤 마우스에서도 피부나 다른 조직에서 다른 이상은 관찰되지 않았다. 흉부와 복부의 상응하는 지역으로부터의 대표적인 피부 영역을 40X 대물 렌즈 및 현미경에 부착되어 있는 CoolSnap 디지털 카메라 (Roper Scientific, Inc., San Diego, CA)로 영상화하였다. 그런 다음 표피의 두께를 조직형태 측정기 소프트웨어 (Scion Image for Windows (NIH Image), Scion Corp., Frederick, MD, v.B4.0.2)를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 아래의 표 5에 나타냈다:
[표 5]
Figure pat00005
통계학적 중요성을 측정하기에는 마우스의 수가 불충분하였지만 특히 반질거리는 피부를 가지는 유전자 도입 마우스는 반질거리지 않는 유전자 도입 마우스 및 비-유전자 도입 대조표준보다 표피의 두께가 더 두꺼운 경향을 보였다. 반질거리는 유전자 도입은 반질거리지 않는 유전자 도입보다 더 높은 IL-22 수준을 가질 수 있지만 발현 수준은 이들 마우스에 대해서는 측정하지 않았다. 이들 결과는 건선, 건선성 관절염, 또는 다른 염증성 피부 질환 또는 다른 염증성 질병에서 IL-22에 대한 역할을 시사하였다.
실시예 7
IL-22 폴리펩티드의 생체내 효과
A. IL-22 아데노바이러스로 감염된 마우스는 SAA의 유도를 나타낸다.
마우스들 (암컷, C57BL/6N, 생후 8주; Charles River Labs, Kingston, NY)를 세 그룹으로 나누었다. IL-22 폴리펩티드 (서열 번호 6)를 발현하는 아데노바이러스를 표준 방법을 사용하여 사전에 만들어 두었다. 제 0 일에 부모의 또는 IL-22 아데노바이러스를 첫 번째 (n=8) 및 두 번째 (n=8) 그룹에 꼬리 정맥을 통하여 각각 투여하였는데, 각 마우스는 약 0.1 ml 부피에 들어있는 약 1×1011 입자의 용량을 투여받았다. 세 번째 그룹 (n=8)에는 아무런 처리를 하지 않았다. 12 일째에 마우스들의 체중을 재고 혈액을 뽑아냈다. 연구를 시작한 지 20일째에 마우스들을 희생시키고 체중을 기록한 다음 혈액과 조직을 분석을 위해 수집하였다.
모든 혈액 샘플을 완전 혈액 카운트 (CBC) 및 혈청 화학에 대해 분석하였다. 제 12일과 20일에 부모의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비해 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹으로부터 취한 혈액 샘플에서, 호중구와 혈소판 수에서 통계학적으로 유의할만한 상승이 검출되었다. 또한 제 12일에 부모의 아데노바이러스로 처리된 그룹에 비해 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹으로부터 림프구 수는 상당히 감소하였지만 제 20일에는 반대 효과가 관찰되었다. 또 IL-22 아데노바이러스로 처리한 마우스들은 체중 감소를 보인 한편, 부모의 아데노바이러스로 처리한 마우스들은 체중이 늘었다. 글루코스는 부모의 아데노바이러스를 투여한 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹으로부터 얻은 혈청 샘플에서 12일째에나 20일째에 모두 상당히 감소하였다. 혈청 알부민도 또한 두 시점에서 상당히 감소하였다. 혈액의 우레아 질소 수준은 20일째에 상당히 감소하였다. 혈청 글로불린 수준은 두 시점에서 부모의 아데노바이러스를 투여한 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹에서 상당히 증가하였다. 현미경으로 볼 때 관찰된 IL-22에 기인한 한 가지 조직형태학적 변화는 신장에서 세뇨관의 재생이었다. 마우스들에게서 이것은 통상적인 것이긴 하지만 이 동물 그룹에서는 발생률과 심각성이 증가되었다. 신장병은 피질의 세뇨관 상피 세포의 호염기성 세포의 다중 병소적 영역으로서 구분된다.
상술된 것과 동일한 디자인의 추가의 실험을, 결과를 증명하고 추가의 샘플을 수집하기 위하여 수행하였다. 이 연구에서는 매 3일마다 체중을 기록하고, 혈액을 아데노바이러스를 주입하고 3일 후에 수집하고, 혈액 및 조직 수집을 위해 10일 째 (n=4/그룹) 및 20일째 (n=4/그룹)에 마우스를 희생시켰다. 상승된 호중구 및 혈소판 수를, 부모의 아데노바이러스를 투여한 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹으로부터 취한 혈액 샘플에서 다시 검출하였다. 이 효과는 3일째에 호중구에 대해서도 명백하였지만, 혈소판 수는 10일이 되어도 유의할만하게 변하지 않았다. 또한 림프구 수는 제 3일과 10일에 부모의 아데노바이러스를 투여한 그룹에 비하여 IL-22 아데노바이러스를 투여한 그룹으로부터 상당히 감소하였지만 그것들은 앞의 실험에서는 20일째에도 상승되지 않았었다. 또한 IL-22 아데노바이러스를 받은 마우스들은 연구 과정 동안 체중이 줄어든 반면, 대조 바이러스로 처리하거나 미처리된 마우스들은 체중이 늘었다. 혈청 화학 변수는 앞의 실험과 일치하였다. IL-22 아데노바이러스 처리와 관련된 신장의 세뇨관 재생의 조직학적 특징은 또한 이 실험에서도 확증되었다. 이것은 IL-22 아데노바이러스를 받은 마우스에서 적당한 단백뇨가 추가로 발견된 것 (제 20일)과 일치하였다.
상기 결과들은 IL-22가 조혈작용, 즉 생체내 혈구 형성에 영향을 미친다는 것을 시사하였다. 그 자체로서 IL-22는 상이한 혈액 간 세포에 영향을 미치는 생물학적 활성을 가지고 있어서 특이한 계통에서 특정 분화 혈구의 증가 또는 감소를 유발한다. 예를 들면 IL-22는 림프구를 감소시키는 것으로 나타나는데, 그것은 림프구를 발생시키는 것으로 정해진 전구 세포의 억제에 기인하는 것 같고, 그것은 IL-22가 빈혈, 감염, 염증, 및/또는 면역 질병에서 이들 질병에 포함된 혈구에 영향을 끼침으로써 어떤 역할을 할 수 있을 것이라는 언급을 지지한다. IL-22에 대한 길항체, 예컨대 항체 또는 그것의 가용성 수용체 IL-22RA2는 이들 질병에서 치료 시약으로서 사용될 수 있을 것이다.
더욱이 마우스에서 IL-22 아데노바이러스를 사용하는 이들 실험은 IL-22 과잉-발현이 생체내에서 호중구와 혈소판의 수준을 증가시킨다는 것을 시사한다. 전체 동물계에서 IL-22에 대한 반응에 포함된 다른 요인들 (예컨대 사이토킨 및 변형 유전자)이 있음에 틀림없다. 그럼에도 불구하고 이들 데이터는 조혈작용에 IL-22가 포함되어 있음을 강력하게 지지한다. 그러므로 IL-22, 항-IL-22 항체, IL-22RA 가용성 수용체 (예컨대 서열 번호 3), 및 항-IL-22RA 항체는 다양한 질환, 예를 들어 염증, 면역 장애, 감염, 빈혈, 조혈적 및 다른 암, 등의 진단 및 치료에 적당한 시약/표적이다.
감소된 혈청 글루코스, 알부민 및 우레아 질소에 의해 증명된, IL-22과 체중 손실, 급성 단계 단백질 SAA의 출현, 및 대사 혼란과의 연관은 IL-22가 특정한 염증성 반응에서 초기에 작용하는 사이토킨이라는 것을 시사한다. IL-22 아데노바이러스를 받은 마우스들은 만성 염증 상태, 예를 들면 IBD, 궤양성 대장염, 관절염, 건선, 건선성 관절염, 천식 등에서 관찰되는 것과 같은 상태를 나타낼 수 있다. 특정한 유해 염증성 과정은 IL-22에 대한 길항물질, 예컨대 항-IL-22 항체, 및 그것의 수용체, 예컨대 IL-22RA 가용성 수용체 (예컨대 서열 번호 3), 및 항-IL-22RA 항체 등을 사용함으로써 억제될 수 있을 것이다.
B. IL-22는 전-염증성 사이토킨이다: 아데노-IL-22 마우스에서 SAA의 혈청 수준
IL-22-아데노 마우스에서 SAA의 수준을 측정하기 위하여 마우스 SAA 면역분석 키트 및 프로토콜 (Biosource International, California, USA)을 사용하여 ELISA를 수행하였다. 희석된 표준 및 미지의 것을 HRP-항-마우스 SAA와 함께 항-마우스 SAA 항체로 미리 코팅되어 있는 분석 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 1시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한 다음 키트 지시에 따라 세척하였다. 플레이트를 15분 동안 실온에서 TMB를 사용하여 전개하고, 2 M H2SO4를 사용하여 중지하였다. 450 nm에서의 흡광도를 Spectromax 190 (Molecular Devices, California, USA)을 사용하여 판독하였다. 그 결과의 데이터를 소프트맥스 Pro (Molecular Devices, California, USA) 및 엑셀 (Microsoft Corp., Washington, USA)을 사용하여 분석하였다.
IL-22-아데노바이러스로 감염된 마우스들은 부모의 아데노바이러스 대조표준과 비교하여 10 배 이상의 크게 상승된 수준의 mSAA를 나타냈다.
C. IL-22-아데노바이러스 감염된 마우스의 유동성 혈구 분석
생체내에서 아데노바이러스에 의한 IL-22 발현의 효과를 분석하기 위하여 본 발명자들은 IL-22-아데노바이러스로 감염된 C57BL/6N 마우스로부터 감염후 제 10일과 20일에 말초혈, 비장, 및 골수를 분리하였다. 대략 100 ㎕의 혈액을 헤파린 처리된 튜브에 수집한 후 저장성 용해 (세포를 4.5 ml의 dH2O에 약 5초 동안 용해시킨 후 1.5 ml의 3.6 % NaCl을 첨가한다)에 의해 적혈구를 제거하였다. 비장을 두 개의 급속 냉동한 유리 슬라이드 사이에서 분쇄하고, 방출된 세포를 Nytex 막 (세포 여과기)을 통과시키고 펠릿화하였다. 한쪽 대퇴부를 모르타르와 막자로 분쇄하고, 세포를 세포 여과기 (Falcon)를 통과시킴으로써 골수를 얻었다. 세포를 FACS 세척 완충액 (WB=HBSS/1 % BSA/10 mM Hepes)에 재현탁하고, 트립판 블루로 계수한 다음, 각 유형의 1×106의 생존 세포를 5 ml의 폴리스티렌 튜브에 나눠 담았다. 세포를 세척하고 펠릿화한 다음 특정한 면역 세포 하위세트를 확인하기 위해 사용된 다양한 세포 표면 마커를 인지하는 형광 표지된 (FITC, PE, 및 CyChrome) 단클론성 항체 (PharMingen, San Diego, CA)의 혼합물이 담긴 얼음 위에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이들 마커로는 다음과 같은 것들이 있다 (본 발명자들이 시험한 3 그룹의 마커를 열거한다): 혈액 염색에 대해: CD3, Gr1, 및 B220; 비장 염색에 대해: CD62L, CD44, 및 CD3; CD21, CD23, 및 B220; IgD, IgM, 및 B220; CD11b, Gr1, 및 CD8; 골수 염색에 대해: CD11b, Gr1, CD3; IgD, IgM, 및 B220. 세포를 1.5 ml의 WB로 세척하고 펠릿화한 후, 0.4 ml의 WB에 재현탁한 다음, CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하여 FACScan 상에서 분석하였다.
본 발명자들은 IL-22-아데노-처리된 마우스의 혈액에서 호중구의 분획이 제 10일에는 4 내지 13배, 제 20일에는 2 내지 3배 상승되었음을 발견하였다. 제 10일에 이 차이는 혈액의 림프구 및 단세포의 분획의 부수적인 감소를 유발하였다. 골수에서는 본 발명자들은 B 세포의 총 수가 제 10일에 약 1.5배 감소한 반면, 재순환하는 성숙한 B 세포의 백분율은 증가되었고, 미성숙한 B 세포의 총 수는 약간 감소하였음을 발견하였다. 제 20일에는 이들 차이 중 많은 것이 나타나지 않았지만 본 발명자들은 성숙한 재순환 B 세포의 분획의 경미한 증가라도 발견하지 못하였다. 비장에서 B 세포의 총 수는 시험한 두 날에 약간 (1.5 내지 2배) 감소한 반면, 제 20일에 말단 영역의 B 세포 (CD21+CD23-B220+)는 2배 증가하였고 여포성 B 세포(CD21+CD23+B220+)의 수는 2배 감소하였다. 말단 영역의 B 세포는 병원균에 대한 방어의 제일선인 것으로 간주되는데 그것은 그것들이 보다 통상적인 여포성 B 세포보다 B 세포 발열원 (예컨대 LPS)에 보다 민감하고, 그것들이 그것들의 동족의 항원을 만났을 때는 매우 빠르게 항체-분비 세포로 분화하기 때문이다. IL-22는 여포성 세포의 말단 영역 B 세포로의 전환을 증가시키거나 덜 성숙한 여포성 세포를 선택적으로 고갈시키는 것이 가능하다. 골수에서 발견되는 B 세포 수의 변화는 프레(pre)/프로(pro) 및/또는 미성숙한 B 세포의 증진된 분화, 또는 혈액/비장으로부터 재순환하는 B 세포의 증가된 유입, 및 아마도 말단으로의 미성숙 B 세포의 유출의 동시 증가를 반영할 것이다. 성숙한 BM B 세포의 실제 수는 증가하지 않고, 그래서 IL-22는 그것의 증식을 증대시키지 않을 것이다. 또는 달리 IL-22는 미성숙 B 세포의 분화를 차단, 감소 또는 억제할 수 있으며, 따라서 성숙한 B 세포의 상대적인 출현을 증가시킬 수 있다.
D. IL-22RA2-Fc4는 생체내에서 IL-22 활성을 중화한다: IL-22에 의해 유도된 SAA 발현을 나타내는 SAA ELISA는 IL-22RA2-Fc4 주입에 의해 억제된다.
IL-22RA2가 IL-22 마우스에 의해 SAA 유도를 억제할 수 있는 지를 평가하기 위하여 마우스들 (암컷, C3H/HEJ, 생후 8주; Jackson Labs, Bar Harbor, ME)을 각 세 마리씩의 5 그룹으로 나누어 아래의 표 6에서 나타낸 바와 같이 단백질의 IP 주사에 의해 처리하였다.
[표 6]
Figure pat00006
IL-22RA2 주입은 IL-22 주입보다 15분 전에 수행하였다. 두 가지 단백질의 주입은 복강내 경로로 이루어졌다. 혈액 샘플을 각 마우스로부터 처리 전, 처리 후 제 2일과 제 6일에 취하였다. SAA 및 IL-22의 측정을 위해 혈청을 각 샘플로부터 제조하였다.
ELISA를 앞에서 설명한 것처럼 수행하여 본원에서 설명한 IL-22 및 IL-22에 대한 가용성 수용체, IL-22RA2-Fc4로 처리한 마우스에서 SAA 수준을 측정하였다. 3 ㎍의 IL-22를 20 내지 100 ㎍ 농도의 IL-22RA2-Fc4와 함께 주입받은 마우스들은 IL-22 단독에 의해 유도된 SAA의 수준에서 바탕값 수준으로의 감소를 나타냈고, 이것은 IL-22RA2가 생체내에서 IL-22의 SAA 유도 활성을 억제하였음을 증명한다.
실시예 8
염증성 장 질병 마우스 모델에서 IL-22의 발현
염증성 장 질병 (IBD)은 다인성 질병으로 두 가지 유형, 즉 궤양성 대장염 (UC)과 크론씨병 (CD)으로 나누어진다. 이들 질병의 병인학은 현재 알려져 있지 않으며 임상적 징후도 다르다. UC는 결장에 국한되며, 증상으로는 혈액이 섞인 설사, 체중 감소 및 복부의 통증이 포함된다. UC의 육안적 특징은 천공된 궤양 및 짧아진 결장을 포함한다. 대조적으로 크론씨병은 또한 장의 다른 부분에도 영향을 줄 수 있다. 증상으로는 설사 (UC에서 볼 수 있는 혈변보다는 덜 자주 나타난다), 미열 및 통증을 포함한다. 육안적 특징으로는 협착, 심한 궤양, 열창 및 기공을 수반한 섬유성 및 협착성 장이 있다.
이들 인간 질병을 모방하는 여러 동물 모델이 활용가능하다. 새로운 약물 스크리닝을 위해 통상적으로 사용된 3개의 대장염 모델은 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산 (TNBS) 유도된 래트 모델, 마우스 T-세포 전달 모델, 및 덱스트란 소디움 술페이트 또는 DSS-유도된 마우스 모델이다. DSS 모델은 머티 박사 (Dr. S. Murthy)에 의한 모델로부터 질병 활성 지수 분류 시스템을 사용하여 유도되었다 (S. N. S. Murthy, Treatment of Dextran Sulfate Sodium-Induced Murine Colitis by Intracolonic Cyclosporin, Digestive Disease and Sciences, Vol. 38, No. 9 (1993. 9.), pp.1722-1734).
현재의 연구에서는 급성 대장염은 마우스가 DSS를 마우스들이 6일 동안 마시는 물에 섞어 마셨을 때 유발되었다. 동물들은 체중 감소와 피가 섞인 설사를 보였고, UC 환자와 같은 상태였다. DSS 손상의 메카니즘은 특성확인이 잘 안되었지만 비특이적인 염증성 면역 반응을 유도하고 장에 대한 환경적 영향을 모방하는 것으로 여겨진다. 세포에 독성일 수 있는 H2S가 생성되는 것이 가능하다. 또한 루멘의 박테리아 플로라의 변화도 발생한다. 활성화된 단핵세포, 마크로파지 및 비만 세포는 결장에서 증명되었다. 세 개의 모든 동물 모델에 대한 조절제로는 염증성 프로스타글란딘, 류코트리엔 대사물질 및 사이토킨이 있다.
A. 방법
챨스 리버 실험실로부터 얻은 스위스 웹스터 암컷 마우스에 DSS를 섭취시킴으로써 대장염을 유발시켰다. 마우스들은 연구를 시작할 때 10 및 11주 자란 것들이었다. 마우스에게 4 %의 DSS를 마시는 물에 섞어서 6일 동안 주거나 (처리한 마우스), 단지 정상적인 마실 물만 주었다 (대조표준 마우스). 질병 활성 지수 (Disease Activity Index, DAI) 임상 점수를 사용하였는데, 그것은 대변의 상태, 의문의(occult) 혈액 및 체중 손실의 측정을 조합하는 것을 포함한다. DAI는 SS 처리 후 제 1일부터 시작하여 매일 각 마우스에 대해 기록하였다. 6일 후에 DSS를 처리한 마우스의 마시는 물에서 제거하였다. 모든 마우스를 희생시킬 때까지 연구를 시작한 날로부터 제 2일, 7일 또는 10일에 DAI 임상 기록에 의해 모니터하였다. 2일과 7일에 각각 4마리의 DSS-처리한 마우스와 한 마리의 대조표준 마우스를 희생시켰다. 제 10일에 4마리의 DSS-처리한 마우스와 두 마리의 대조표준 마우스를 희생시켰다. 희생시킨 모든 동물에 대하여 결장의 길이를 측정하였다. 결장 절편을 조직학적 분석을 위해 10 %의 중성 완충 포르말린에 고정시키거나 mRNA 추출을 위해 냉동시켰다.
B. 조직학적 점수 및 질병 활성 지수 (DAI) 점수 기록
조직학적 지수 점수는 참조문헌 1의 방법을 따라 얻었다. 일반적으로 결장 절편을 소와(crypt) 스코어, 과형성 상피, 소와 변형 및 염증에 대하여 병리학자에 의해 맹검 기록하였다.
매일 각 마우스를 체중 손실, 대변의 일관성 및 장 출혈을 토대로 임상 점수로 등급을 매겼다. 체중 손실, 설사 및 출혈의 양이 증가하면 더 높은 점수를 할당하였다. 각 마우스에 대한 매일의 점수는 3회의 결과/관찰로부터 얻어진 평균 점수였다.
C. 결과
DSS-처리 마우스의 결장 길이는 제 7일과 10일에 비처리 대조표준보다 다소 짧았지만 그 결과는 유의할만한 것은 아닐 것이다 (통계학적으로 적용하여 조사하지 않음). 임상 DAI 점수는 이 모델을 사용한 과거의 연구에서 나타난 것과 유사한 DSS-처리 마우스에서의 질병 증상의 발생을 반영하였다. 의문의 혈액은 대략 제 4일과 5일에 가장 컸던 반면, 묽은 대변은 제 6일과 7일에 더 우세하였다. 조직병리학 결과는 질병 점수가 모든 희생일에, 특히 제 7일 (피크)과 10일에 대조표준과 상이하였음을 나타낸다. 조직병리학적 스크리닝 점수는 다음과 같았다: 대조표준=0.5, 제 2일 DSS-처리 마우스=8.8, 제 7일 DSS-처리 마우스=21, 제 10일 DSS-처리 마우스=18. 임상 및 조직병리학적 점수는 DSS-처리 마우스가 비-처리 대조표준에 비해 상당한 결장 질병이 있었음을 나타낸다. 냉동 조직 샘플은 아래에서 설명하는 바와 같이 나중에 mRNA 측정에 사용하였다.
D. 쥐의 IBD 결장 샘플에서 RT-PCR을 사용한 IL-22 RNA의 조직 발현
염증성 장 질병 모델에서 마우스 IL-22 RNA (서열 번호 10; 서열 번호 11)의 상대적 발현을 측정하기 위하여 DSS-처리 마우스의 결장 말단부를 수집하여 액체 질소 중에서 급속 냉동하였다. 이 실험에서 마우스들을 DSS로 처리하고 샘플을 처리 후 제 2일, 7일 및 10일에 취하였다. 정상적인 미처리 마우스로부터의 샘플도 마찬가지로 수집하였다. 그런 다음 샘플로부터 RNA를 표준 RNeasy MidiprepTM 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 제조업체의 지시대로 사용하여 분리하였다.
RT-PCR 반응은 '백금 태그가 있는 수퍼스크립트 1-단계 RT-PCR 시스템' (Life Technologies, Gaithersburg, MD)을 사용하였다. 각각의 25 ㎕ 반응액은 다음과 같은 것들로 구성되었다: 12.5 ㎕의 2X 반응㎕ 완충액, 0.5 ㎕ (20 pmol/㎕)의 ZC39,289 (서열 번호 17), 0.5 ㎕ (20 pmol/㎕)의 ZC39,290 (서열 번호 18), 0.4 ㎕의 RT/Taq 폴리머라제 혼합물, 10 ㎕의 RNase-유리 물, 1.0 ㎕의 총 RNA (100 ng/㎕). 증폭은 다음과 같이 수행하였다: 50 ℃에서 30분 동안 1 주기, 94 ℃에서 30초 동안; 58 ℃에서 30초 동안; 72 ℃에서 60초 동안을 35 주기; 그런 다음 최종적으로 72 ℃에서 7분 동안으로 종결한다. 8 내지 10 ㎕의 PCR 반응 생성물에 대해 2 % 아가로스 겔을 사용하는 표준 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 정확하게 예견한 cDNA 단편 크기를 다음과 같이 관찰하였다: 두 날에 2개의 샘플에서 희미한 밴드가 보였다. 제 2일에는 7개의 샘플 중 두 개가 진한 밴드를 나타냈고 제 3일에 7개의 샘플 모두 매우 진한 밴드를 나타냈다. 3일 후 10개의 샘플 모두 진한 밴드를 나타냈다. 마지막으로 두 개의 '정상' 대조표준 샘플은 어떠한 밴드도 나타내지 못하였다. 이들 결과는 결장의 특정 유형의 염증성 반응, 예컨대 IBD, UC, 및 CD와관련된 반응에서 IL-22가 상향조절되었을 것이라는 것을 시사한다. 이들 데이터를 아래의 표 7에 요약하는데, 표에서 상대 발현을 다음과 같이 점수로 표시하였다: 0=밴드 없음, 1=희미한 밴드, 2=진한 밴드, 3=매우 진한 밴드.
[표 7]
Figure pat00007

실시예 9
IL-22RA2는 마우스 콜라겐 유도된 관절염 (CIA) 모델에서 IL-6 및 SAA 수준을 감소시킨다.
A. 마우스 콜라겐 유도된 관절염 (CIA) 모델
생후 10주의 수컷 DBA/1J 마우스 (Jackson Labs)를 그룹당 13마리씩 3 그룹으로 나누었다. 제 21일에 동물들에게 완존 프로인트 보조제 (Chondrex에 의해 제조됨, Redmond, WA)중에 제형된 50 내지 100 ㎕의 1 mg/ml 병아리 유형 II 콜라겐을 피하로 주입하고, 3주 후 제 0일에 마우스들에게 동결건조된 분취액(Sigma, St. Louis, MO)으로부터 제조된, 대장균 0111:B4로부터의 LPS 100 ㎕ (25 ㎍)를 주입하였다. IL-22RA2를 일주일에 3회 복강내 주사로서 제 0일로부터 제 25일에 이르기까지 4주 동안 투여하였다. 처음 두 그룹에게는 1회당 동물에게 100 또는 10 ㎍의 IL-22RA2를 주입하였고, 세 번째 그룹에게는 부형약 대조표준, PBS (Life Technologies, Rockville, MD) 만을 주입하였다. 동물들은 LPS 주사 후에 관절염 증상을 보이기 시작하였고, 대부분의 동물은 2, 3주 내에 염증을 나타냈다. 질병의 정도를 동물의 각각의 발에서 캘리퍼를 사용하여 발의 두께를 측정함으로써 평가하였는데, 각 발에 대한 임상 점수 (0-3)는 다음과 같이 배정하였다: 0=정상, 0.5=발가락의 염증, 1=경미한 발의 염증, 2=중간 정도의 발의 염증, 3=심각한 발의 염증.
질병의 모니터링:
동물들은 두 번째 콜라겐 주사 직후에 발에 염증을 나타내기 시작하였고, 심지어 몇몇 동물은 두 번째 콜라겐 주사 전에도 발가락에 염증을 보이기 시작하였다. 대부분의 마우스는 추가 면역후 2,3주 내에 관절염을 보였지만 일부는 더 긴 시간을 필요로 하기도 하였다. 이 모델에서 질병의 발생은 전형적으로 95 내지 100 %였으며, 40 마리의 동물을 사용한 연구에서는 전형적으로 0 내지 2마리가 반응을 보이지 않았다 (관찰을 시작한 지 6주 후에 측정함). 염증이 시작됨에 따라 통상적으로 일시적인 가변적 저등급의 발 또는 발가락 염증이 발생할 수 있다. 이런 이유 때문에 동물은 현저하고 영구적인 발의 팽창이 나타나기 전까지는 질병에 걸렸다고 간주하지 않았다.
모든 동물을 매일 관찰하여 발의 질병 상태를 평가하였는데, 그것은 각 발에 대해 질적인 임상 점수를 배정함으로써 수행하였다. 매일 각 동물의 4개의 발을 그것의 임상적 질병 상태에 따라 점수를 매겼다. 임상 점수를 결정하기 위해서는 발을 3 부분, 즉 발가락, 발 자체 (앞발 또는 발) 및 발목 또는 발목 관절로 나누어 생각하였다. 이들 영역과 관련한 염증의 크기 및 심각성을 모든 관절 팽창, 갈라진 발톱, 또는 홍반에 대한 모든 발에 대한 관찰, 어떤 발이든지 부종 또는 홍반의 모든 증거에 대한 표시, 및 힘줄 또는 뼈에 어떠한 미세한 해부학적 경계선이 없어졌다는 표시, 및 어떠한 부종 또는 홍반에 대한 발목 또는 발목 관절의 평가, 및 염증이 다리 기부까지 확대되었는지의 표시를 포함하여 살펴보았다. 1, 2 또는 3으로 표시된 발은 처음에는 전체적인 심각성의 인상을 토대로 하였고, 두 번째로 얼마나 많은 영역이 포함되었는 지를 토대로 하였다. 임상 점수 기록에 사용된 규모는 다음과 같다.
임상 점수:
0=정상
0.5=하나 또는 둘 이상의 발가락이 포함되지만 발가락만이 염증을 보이는 경우.
1=발을 포함한 영역의 경미한 염증 (1 영역), 발가락 하나 또는 여러 개가 포함될 수 있다.
2=발에 중간 정도의 염증, 발가락 및/또는 발목/발목 관절의 일부가 포함될 수 있다 (2 영역).
3=발, 발목/발목 관절, 및 발가락의 일부 또는 전체의 심각한 염증 (3 영역).
질병의 수립은 밤새 계속되는 (연속하여 이틀) 2 이상의 등급을 보이는 발 염증의 정성 점수로서 규정한다. 일단 질병이 수립된 것으로 보이면 그 날짜를 기록하고 동물의 "질병이 수립된" 첫째 날로 표시한다.
실험의 전 과정을 통하여 혈액을 수집하여 항-콜라겐 항체의 혈청 수준을 모니터하였다. 동물을 제 21일에 안락사시키고, 혈청 및 CBC를 위해 혈액을 수집하였다. 각 동물로부터 영향을 받은 발 하나를 조직학을 위해 10 % NBF에 수집하고 하나는 액체 질소 중에서 냉동하여 mRNA 분석을 위해 -80 ℃에서 보관하였다. 또한 1/2의 비장, 1/2의 흉선, 1/2의 장간막 림프절, 한 개의 간 엽 및 왼쪽 신장을 RNA 분석을 위해 RNAlater에 수집하였고, 1/2의 비장, 1/2의 흉선, 1/2의 장간막 림프절, 나머지 간, 및 오른쪽 신장을 조직학을 위해 10 % NBF에 수집하였다. 혈청을 수집하고 면역글로불린과 사이토킨 분석을 위해 -80 ℃에서 보관하였다.
발의 점수와 측정치 데이터를 분석했을 때, IL-22RA2를 받은 하나의 처리 그룹에서 발 염증의 개시 및 진전에 약간의 지연이 있었다는 것을 시사하는 점이 있긴 했지만 그룹들 사이에 통계학적으로 유의할만한 차이는 발견되지 않았다. 체중의 변화, CBC 변수, 또는 항-콜라겐 항체 수준에 대해 그룹들 간에 유의할만한 차이는 없었다. 이들의 초기 결과는 IL-22RA2가 체중, 적혈구 또는 백혈구, 또는 항체 생성에는 해로운 영향을 미치지 않지만 염증을 감소시킬 수는 있을 것이라는 것을 나타낸다. 용량, 작용 메카니즘, 및 효능에 대한 추가의 연구도 진행하였다 (예컨대 실시예 10).
B. 마우스 CIA 모델의 항-콜라겐 ELISA 데이터
혈청 샘플을 콜라겐 유도된 관절염의 래트 모델 (상기 실시예 9A)로부터 LPS 도전(제 0일)에 비하여 제 0일, 7일, 14일, 21일 및 28일에 수집하였다. 혈청 샘플을 항-콜라겐 항체 역가에 대하여 ELISA에 의해 스크린하였다. PBS 대조표준과 비교하여 항-콜라겐 항체의 수준에 미치는 100 ㎍ 또는 10 ㎍ 처리 그룹에서의 IL-22RA2 처리의 통계학적으로 유의할만한 효과는 없었다. 아래에 항-콜라겐 ELISA 방법 및 물질에 대해 설명한다.
항-콜라겐 ELISA에 사용된 시약은 Maxisorp 96-웰 미소적정 플레이트 (NUNC, Rochester, NY), 병아리 유형-II 콜라겐 (Chondrex, Redmond, WA), 슈퍼 블록 (Pierce, Rockford, IL), 양고추냉이 과산화효소(HRP)-포합된 염소 항-마우스 IgG+A+M(H+L)(Zymed, South San Francisco, CA) 및 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 기질 (Pierce, Rockford, IL)이었다. 모든 분석에 사용한 완충액은 ELISA B 희석 완충액 (PBS+0.1 % BSA+0.05 % 트윈(Sigma, St. Louis, MO)), ELISA C 세척 완충액 (PBS+0.05 % 트윈) 및 NovoD 전개 완충액 (0.063 M 시트르산 나트륨, 0.037 M 시트르산), H2O2 (Sigma) 및 1 N H2SO4 (VWR, Tukwilia, WA)이었다.
대략 100 ㎕의 말초혈을 오른쪽 안와를 출혈시켜 혈청 분리기 튜브 (Becton Dickinson)에 수집하였다. 혈청을 원심분리 (2 내지 3분, 16,000×g, 4 내지 6 ℃)에 의해 수집하고, 분석할 때까지 -20 ℃에서 보관하였다. 항-콜라겐 Ig 항체 수준을 측정하기 위하여 NUNC 플레이트를 10 ㎍/ml의 병아리 유형-II 콜라겐 (Chondrex, Redmond, WA)으로 코팅한 다음 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 ELISA C로 세척하고, 슈퍼 블록(Pierce, Rockford, IL)으로 차단한 다음 (5분, 실온에서) ELISA C로 세척하였다. 희석한 혈청 샘플 (ELISA B로 1:5000 부터 1:625,000까지 5배 희석함)을 ELISA 플레이트에 세 개 한 벌로 플레이트한 다음 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 플레이트를 ELISA C로 세척하고, 과산화효소-표지된 염소 항-마우스 Ig Fc (Zymed, ELISA B에 1:2000으로 희석됨)를 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이트하고 (실온, 90분), ELISA C로 다시 세정한 다음 HRP 활성을 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 기질 (10 mL NovoD+1 정제의 OPD+10 ㎕의 H2O2, Pierce)을 사용하여 전개하였다. 반응을 1 N H2SO4를 사용하여 정지시켰다. 혈청 샘플의 상대적 광학 밀도를 1:25,000 희석률에서 측정하여 스펙트라 MAX 190을 사용하여 490 nm에서 판독하고, 데이터를 소프트맥스 프로 소프트웨어 (Molecular Devices Corporation, Palo Alto, CA)를 사용하여 분석하였다.
C. 마우스 CIA 모델에서 IL-6 및 SAA 분석
제 0일에 25 ㎍의 LPS를 복강내 투여한 후 4시간이 지나서 CIA 마우스 (상기 실시예 9A)로부터 혈청 샘플을 수집하였다. 샘플을 바이오소스 인터내셔널 (Camarillo, CA)에 대해 구입한 상업용 ELISA 키트에 의해 제조업체의 지시대로 IL-6 및 혈청 아밀로이드 A (SAA) 농도에 대해 스크린하였다.
IL-6 수준은 100 ㎍의 IL-22RA2, 10 ㎍의 IL-22RA2 및 PBS 대조표준을 받은 마우스 그룹에서 각각 9651+/-1563 pg/ml, 10,865+/-1478 pg/ml 및 15,006+/-2,099 pg/ml이었다. 100 ㎍의 IL-22RA2에 노출된 CIA 마우스 그룹에서 IL-6 농도는 PBS 대조표준 마우스에 비해 p=.0351만큼이나 상당히 더 낮았다. 통계학적 유의성은 피셔의 PLSD를 사용하여 유의성 수준을 5 %로 하여 계산하였다 (ABACUS Consepts, INC, Berkeley, CA).
또한 SAA 농도는 100 ㎍의 IL-22RA2, 10 ㎍의 IL-22RA2 및 PBS 대조표준을 받은 마우스 그룹에서 각각 381+/-40 ㎍/ml, 348+/-37 ㎍/ml, 및 490+/-50 ㎍/ml이었다. 10 ㎍의 IL-22RA2에 노출된 CIA 마우스 그룹에서 SAA 농도는 PBS 대조표준 마우스에 비해 p=.0257만큼이나 상당히 더 낮았다. 통계학적 유의성은 피셔의 PLSD를 사용하여 유의성 수준을 5 %로 하여 계산하였따 (ABACUS Consepts, INC, Berkeley, CA).
실시예 10
항-IL-22RA mAb 또는 항-IL-22 mAb는 마우스 CIA 모델에서 질병 심각성을 억제한다.
콜라겐-유도된 관절염 (CIA) 모델은 사람에서 찾아볼 수 있는 질병을 광범위하게 반영하는 류마티스성 관절염에 대한 마우스 모델이다 (Moore, Methods Mol. Biol. 225:175-179, 2003: Waksman, Scand. J. Immunol. 56:12-34, 2002). 마우스들을 CFA에 유화시킨 콜라겐의 2 용량으로 꼬리의 기부에서 면역시킨다. 이것은 발의 팽창을 유발하고, 그것은 장기간에 걸쳐 점점 더 커지며 육안으로도 점수를 줄 수 있고 캘리퍼를 사용해서도 측정할 수 있다. 나아가 혈청 항-콜라겐 항체는 질병의 심각성과 꽤 상관관계가 있다. IL-20 및 IL-22가 염증을 유발한다는 것을 보여주는 데이터를 토대로 항-IL-22RA mAb 및 항-IL-22 mAb를 콜라겐-면역된 마우스 그룹에 투여하고, 질병 점수에 미치는 영향을 평가한다. 항-IL-22RA mAb 또는 항-IL-22 mAb를 투여한 후에 발의 점수 및 발의 두께의 감소는 IL-20 및 IL-22가 자가면역에 대한 모델에서 면역 반응의 개시를 촉진하며, 그것들의 기능을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화시키는 것은 자가면역 질환을 억제할 수 있음을 시사한다. 혈청 TNF와 항-콜라겐 항체의 억제는 또한 IL-22RA가 자가면역 질병에 유익할 것임을 시사한다.
그러므로 항-IL-22RA mAb 또는 항-IL-22 mAb가 자가면역에 영향을 미치는 지를 측정하기 위하여 류마티스성 관절염-콜라겐-유도된 관절염 (CIA)에 대한 마우스 모델로 그것들을 시험하였다. 구체적으로, DBA1J 마우스들에게 콜라겐을 주입하여 류마티스와 유사한 관절염을 유발시켰다. 제 0일에 접종은 완전 프로인트 보조제 (CFA)와 유형 II 콜라겐 (50 내지 100 ㎕, 2 mg/ml 콜라겐으로서 제조됨)으로 구성된 균질액을 피하 주사함으로써 이루어졌다. 주사는 꼬리 기부 가까이에 놓는다. 제 21일에 두 번째 접종을 하는데, 단 균질액을 CFA 대신에 불완전 프로인트 보조제 (IFA)를 사용하여 제조하였다. 발의 점수와 두께를 매일 측정한다. PBS를 받은 마우스 그룹은 20 내지 200 ㎍의 대조 이소타입을 받았고, 이것은 단클론성 항체 또는 20 내지 200 ㎍의 항-IL-22RA mAb 또는 항-IL-22 mAb, 즉 두 번째 콜라겐 주사시로부터 시작하여 1 내지 4주 동안 일주일에 2회 또는 3회 받은 것과 매치한다. 마우스들을 매일 30일 동안 모니터하였다. 마우스들을 제 30일에 희생시키고, 항-콜라겐 항체 분석 및 혈청 사이토킨 분석 (TNFα)을 위해 혈청을 취하였다.
항-IL-22RA mAb 또는 항-IL-22 mAb의 투여에 의한 발의 점수, 발의 두께, 혈청 TNFa 및 혈청 항-콜라겐 항체의 억제는, IL-22RA를 차단하는 것이 IL-22를 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화시킬 수 있고, 자가면역에 대한 모델에서 면역 반응이 개시되는 것을 억제할 수 있으며, 자가면역 질환을 억제할 수 있음을 시사한다.
실시예 11
DSS 마우스 모델에서 IL-22 수용체, IL-22RA의 발현
DSS-유도된 IBD에 걸려 있는 마우스 (실시예 8)의 결장에서 마우스 IL-22RA의 발현 수준을 측정하기 위하여 정량 RT-PCR을 수행하였다. RNA를 정상 마우스 결장 및 DSS-처리된 마우스의 기부 결장으로부터 제 2일, 7일 및 10일에 분리하였다. 어플라이드 바이오시스템스 7700 TaqMan 기기 및 프로토콜을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 간단하게 설명하자면, "프라이머 익스프레스(Primer Express)" 소프트웨어를 사용하여 마우스 IL-22RA 서열 (ZC39776 (서열 번호 19) 및 ZC39777 (서열 번호 20)) 및 FAM/TAMRA 표지된 TaqMan 프로브 (ZC38752 (서열 번호 21))에 대한 프라이머를 어플라이드 바이오시스템스사 지침을 따라 디자인하였다. 25 ng의 RNA를 PE/어플라이드 바이오시스템스 TqaMan EZ RT-PCR 코어 시약 및 상기 언급한 프라이머와 프로브와 함께 각 반응액에 첨가하였다. RT-PCR 반응을 다음 조건 하에서 이중으로 수행하였다: 50 ℃에서 2분, 60 ℃에서 30분, 95 ℃에서 5분, 94 ℃에서 20초를 40 주기, 그리고 60 ℃에서 1분. 발현 값을 합성 마우스 IL-22RA RNA 전사물의 분자의 알려진 값의 표준 곡선과 비교하였고, 발현을 반응당 마우스 IL-22RA의 분자의 절대값으로서 기록하였다. 예비 데이터는 마우스 IL-22RA 발현이 제 7일과 제 10일에 정상 마우스 결장의 발현 수준과 비교했을 때 DSS-유도된 IBD가 있는 마우스의 기부 결장에서 약간 하향조절될 수 있음을 시사하였다.
실시예 12
경미한 내독소혈증 모델: LPS-유도된 내독소혈증 마우스 모델에서 IL-22 및 전염증성 표지
A. LPS-유도된 내독소혈증 마우스 모델: LPS-유도된 내독소혈증 마우스 모델에서 전염증성 사이토킨 및 체온의 평가
경미한 내독소혈증의 마우스 LPS 모델에서 IL-22RA2 (IL-22RA2)의 효과를 조사하기 위하여 생체내 실험을 디자인하였다. 처음에 모델을 평가하기 위해 본 발명자들은 전염증성 사이토킨과 체온을 측정하여 모델에 대한 참조 데이터를 수집하였다.
간단히 설명하자면 생후 6개월의 Balb/c (CRL) 암컷 마우스에게 멸균 PBS 중의 25 ㎍의 LPS (Sigma)를 복강내 (IP) 주사하였다. 혈청 샘플을 8마리의 마우스로 이루어진 각 그룹으로부터 주사후 0, 4, 8, 16, 24, 48 및 72 시간 후에 각 시간점마다 수집하였다. 혈청 샘플을 염증성 사이토킨 수준에 대해 분석하였다. IL-1b, IL-6, TNFa, IL-10 및 혈청 아밀로이드 A 단백질 (SAA) 수준을 바이오소스 인터내셔널 (Camarillo, CA)에서 구입한 시판중인 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.
TNFa 수준은 LPS 주사 후 1시간이 지나 4000 pg/ml로 피크에 달하였고, IL-10 수준은 341 pg/ml로 피크에 달하였다. LPS 주사 후 4시간이 지나서 IL-6, IL-1b 및 IL-10은 각각 6,100 pg/ml, 299 pg/ml, 및 229 pg/ml이었다. 혈청의 SAA 수준은 LPS 주사 후 4시간째에 0.405 mg/ml이었다. 혈청의 SAA 농도는 계속 증가하여 LPS 주사 후 24시간에는 3.9 mg/ml이었지만, 혈청 내의 1 내지 2 mg/ml보다 큰 SAA 수준은 SAA와 다른 혈청 성분 사이의 상호작용 때문에 기존의 ELISA 키트로는 정확하게나 반복적으로 측정하기 어렵다. 이들 결과는 IL-22 (실시예 11B) 외에 전염증성 사이토킨이 이 모델에서 실제로 생성되었음을 나타냈다. 그러므로 다음의 기준을 경미한 내독소혈증의 LPS 모델에 대한 생물학적 마커로서 수립하였다: LPS 주입 후 1시간째의 TNFa 혈청 수준, LPS 주입 후 4시간째의 IL-6 혈청 수준 및 LPS 주입 후 4 및 8시간째의 SAA 혈청 수준.
체온을 별도의 동물 그룹에서 72시간의 전 실험 과정에 걸쳐 수술을 통해 이식해 놓은 원격 측정기에 의해 모니터하였다. 마우스의 체온은 LPS 주사 후 30분 후에 37.07 ℃에서 34.98 ℃로 최대 2 ℃ 떨어졌다.
LPS를 주사하기 30분 전에 100 ㎍의 IL-22RA2-Fc 융합 단백질을 주사하면 4시간과 8시간 점에서 SAA 유도가 약 50 % 정도 크게 감소한 반면, 10 ㎍의 IL-22RA2-Fc로는 유의할만한 효과를 나타내지 못하였다. TNF-알파와 IL-6 수준에는 유의할만한 변화가 없었다. IL-22RA2-Fc 주사는 1시간 점에서 순환계의 호중구 수를 감소시켰다. 그것은 IL-22RA2-Fc의 투여가 SAA 유도의 관점에서 IL-22 활성을 중화시킬 수 있음을 나타낸다.
B. 알라마르 블루 증식 분석에서 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포를 사용한 LPS-유도된 내독소혈증 마우스 모델로부터의 마우스 혈청에서 IL-22 활성의 검출
본원에서 설명한 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포를 회전시키고 PBS로 2회 세척하여 mIL-3을 확실하게 제거한 후, 세 번째로 회전시키고 mIL-3이 없는 완전 배지 (RPMI 1640, 10 % FBS, 1 % GlutaMAX, 1 % 피루브산 나트륨; mIL-3은 없음, 이하 "mIL-3 유리 배지"로 언급함)에 재현탁하였다. 그런 다음 세포를 혈구계에서 계수하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 mIL-3 유리 배지를 사용하여 웰 당 100 ㎕의 부피로 웰 당 5000 세포로 플레이트하였다.
상기 실시예 11A에서 설명한 실험으로부터 LPS-유도된 내독소혈증 마우스로부터 얻은 혈청을 플레이트의 상부 열에서 mIL-3 유리 배지로 2 %로 희석하고, 연속적으로 96-웰 플레이트상의 나머지 7개의 열에 내려가면서 1:2로 희석하였는데, 각 웰에 100 ㎕씩이 남아있도록 하였다. 그런 다음 100 ㎕의 세포를, 총 분석 부피 200 ㎕ 중에 최종 혈청 농도가 1 %, 0.5 %, 0.25 %, 0.125 %, 0.063 %, 0.031 %, 0.016 %, 및 0.008 %가 되도록 첨가하였다. 분석 플레이트를 37 ℃, 5 % CO2에서 4일 동안 인큐베이션하는데, 그 때 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 웰당 20 ㎕씩 첨가하였다. 플레이트를 다시 37 ℃, 5 % CO2에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 알라마르 블루는 살아있는 세포의 수를 토대로 발색성 판독 자료를 제공하며, 따라서 네가티브 대조표준에 비교하여 세포 증식의 직접적인 척도가 된다. 플레이트를 월락 빅터 2 1420 멀티라벨 카운터 (Wallac, Turku, Finland) 상에서 530 (여기) 및 590 (발광) 파장에서 판독하였다.
결과는 0, 1, 8, 및 16 시간 점에서 상기 바탕값 수준 이상의 유의할만한 증식을 나타내지 않았다. 4시간 점에서 혈청 샘플은 상기 바탕값 이상의 증식에서 4배 내지 10배 이상의 증가를 나타냈고, 그것은 그 샘플에 IL-22가 존재함을 나타낸다.
C. LPS-유도된 내독소혈증 마우스 모델: IL-22RA2의 효과를 평가하기 위한 실험
마우스에서 25 ㎍의 LPS를 한번 IP로 투여하여 유도된 전염증성 표지에 IL-22RA2 처리가 영향을 미칠 수 있는 능력을 시험하였다. 모든 샘플을 SAA, IL-22 및 순환하는 호중구 수에 대해 분석하였다. 각 그룹으로부터의 하위세트를 특정한 사이토킨 수준에 대해 분석하였다 (1시간 샘플을 TNF 알파에 대해 스크린하고, 4시간 샘플을 IL-6에 대해 분석하였다). 동물들을 아래의 표 8에 표시된 시간 점에서 희생시키고, 전체 혈액 및 혈청을 수집하여 분석을 위해 일정량으로 나누었다.
72마리의 C57BL/6N 암컷 마우스 (CRL)에게 아래의 표 8에 나타낸 것과 같이 IL-22RA2를 1회 IP 투여하였다. 대조 마우스는 C57BL/6N (CRL)이었다.
30분 후에 그 마우스들에게 다시 100 ㎕ 중의 25 ㎍의 LPS (Sigma)를 주사하여 내독소혈증 반응이 개시되도록 하였다. 각 그룹에 속한 마우스들을 표 8에 표시한 상응하는 시간점에 희생시키고, 50 ㎕의 전혈을 수집하여 순환하는 호중구의 총 수를 측정하였고, 나머지는 혈청을 위해 회전하여 본원에서 설명되는 다양한 분석을 위해 일정량으로 나누었다.
[표 8]
Figure pat00008
D. IL-22RA2-Fc4는 생체내에서 SAA 유도를 중화한다: LPS-유도된 내독소혈증 마우스 모델에서 LPS에 의해 유도된 SAA 발현을 보이는 SAA ELISA는 IL-22RA2-Fc4 주입에 의해 억제된다.
IL-22RA2가 LPS-유도된 독소증 마우스 모델에서 SAA 유도를 억제할 수 있는지를 평가하기 위하여 마우스들에게 IL-22RA2를 상기 실시예 11C의 표 8에 나타낸 바와 같이 LPS를 주사하기 30분 전에 주사하였다.
4시간 및 8시간 샘플에서 SAA 수준을 측정하기 위한 ELISA를 마우스 SAA 면역분석 키트 (BioSource International, California)를 사용하여 제조업체의 지시를 따라 수행하였다. 4시간 점에서 100 ㎍ 또는 10 ㎍의 IL-22RA2로 처리한 마우스는 PBS 주입 마우스에 비해 SAA 수준에서 용량-의존적이고, 통계학적으로 유의할만한 감소를 보였다. 8시간 점에서 100 ㎍으로 처리한 마우스는 계속해서 PBS 주입 마우스에 비해 SAA 수준에서 통계학적으로 유의할만한 감소를 나타냈다. 이 결과는 IL-22RA2의 존재가 생체내에서 LPS에 의한 SAA의 유도를 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예 13
피부에 대한 IL-22 폴리펩티드의 생체내 효과
A. IL-22-유도된 아칸토시스(acanthosis)
마우스들 (암컷, C3H/HEJ, 생후 8주; Jackson Labs, Bar Harbor, ME)을 6마리씩 4 그룹과 4마리로 이루어진 한 그룹으로 나누었다. 인간 BHK-생성된 IL-22를 미니-삼투 펌프를 경유한 일정한 주입에 의해 투여하였고, 그 결과 펌프에 함유된 IL-22의 농도에 비례하여 국소적이고 한결같은 혈청 상태가 유지되었다. 알젯(Alzet) 미니-삼투 펌프 (모델 2002; Alza corporation, Palo Alto, CA)를 멸균 조건하에서 인산염 완충 식염수 (pH 7.0)에 희석된 IL-22 단백질 (A601F, 0.22 ml)과 함께, 펌프 내의 농도가 그룹 1의 마우스에게는 2 mg/ml, 그룹 2의 마우스에게는 0.2 mg/ml, 그룹 3의 마우스에게는 0.02 mg/ml, 또는 그룹 4의 마우스에게는 0 mg/ml (희석액만 존재함)이 되도록 로딩하였다. 척추 피부를 1 cm 절개하여 펌프를 피하 이식하고, 피부를 멸균 붕대로 덮었다. 이들 펌프는 14일의 기간 동안 시간당 0.5 ㎕의 속도로 내용물을 전달하도록 디자인하였다. 이런 공칭 주입 속도를 사용하여 용량 수준은 그룹 1 내지 4에 대해 각각 24 ㎍/일, 2.4 ㎍/일, 0.24 ㎍/일, 및 0 ㎍/일이 되도록 계산하였다.
14일이 지났을 때 마우스들을 안락사시키고 펌프 부위를 둘러싸고 있는 대략 1 평방 cm의 피부 샘플을 각 마우스로부터 수집하였다. 피부를 10 %의 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 포르말린으로 고정된 피부 샘플을 파라핀에 담가서 관례대로 처리한 다음 5 ㎛로 잘라 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 조직을 ACVP 관청 인증 수의학적 병리학자에 의해 맹검 방식으로 현미경 조사하였다. 조직학적 변화가 나타났고, 아칸토시스 (즉 상피의 두꺼워짐)의 심각성을 다음의 점수 시스템을 사용하여 주관적 방식으로 점수를 매겼다: 0-정상, 1-최소한의 아칸토시스, 2-경미한 아칸토시스, 3-중간 정도의 아칸토시스 및 4-심각한 아칸토시스. 또한 선택된 그룹의 피부를 CoolSnap 디지털 카메라 (Roper Scientific, Inc., San Diego, CA)로 영상화하고, 표피의 두께를 조직형태 측정 소프트웨어 (Scion Image for Windows, v.4.02, Scion Corp., Frederick, MD)를 사용하여 측정하였다.
2.4, 및 24 ㎍/일의 IL-22를 투여한 결과 평균 아칸토시스 점수에 의해 알 수 있는 것과 같이 표피가 두꺼워졌고 (s 참조), 그것은 대조 그룹 피부에서 관찰된 것보다 일관되게 더 두꺼웠다. 더욱이 IL-22 처리 마우스는 또한 단핵세포가 표피에 침윤하는 것으로 나타났다. 이들 침윤물은 부형약으로 처리된 대조표준에서는 관찰되지 않았다.
그룹별 표피 두께의 아칸토시스 점수와 피부 두께의 측정치 (일반적인 픽셀 유니트)를 아래의 표 9에 다음과 같이 나타낸다:
[표 9]
Figure pat00009
B. IL-22-유도된 아칸토시스에 미치는 IL-22RA2의 효과
마우스들 (암컷, C3H/HEJ, 생후 8주; Jackson Labs, Bar Harbor, ME)을 각 8마리씩 8 그룹으로 나누었다. IL-22를 실시예 12A에서 설명한 대로 미니-삼투 펌프를 통하여 일정하게 주입함으로써 투여하였다. 알젯 미니-삼투 펌프 (모델 2001; Alza corporation, Palo Alto, CA)를 멸균 조건하에서 인산염 완충 식염수 (pH 7.0)에 희석된 IL-22 단백질 (A601F, 0.22 ml)과 함께, 펌프 내의 농도가 그룹 1-2의 마우스에게는 0.22 mg/ml, 그룹 3-4의 마우스에게는 0.45 mg/ml, 그룹 5-6의 마우스에게는 0.9 mg/ml, 또는 그룹 7-8의 마우스에게는 0 mg/ml (희석액만 존재함)이 되도록 로딩하였다. 이들 펌프는 14일의 기간 동안 시간당 0.5 ㎕의 속도로 내용물을 전달하도록 디자인하였다. 이런 공칭 주입 속도를 사용하여 용량 수준은 그룹 1-2에서는 10 ㎍/일, 그룹 3-4에서는 5 ㎍/일, 그룹 5-6에서는 2.5 ㎍/일, 그리고 그룹 7-8에서는 0 ㎍/일이 되도록 계산하였다. 각 쌍의 그룹에 대하여 IL-22의 주어진 용량 수준에서 그룹들 중 하나를 0.1 mg의 인간 IL-22RA2 Fc 단백질 (본원에서 설명됨)로 복강내 경로에 의해 3회 (제 1일, 3일, 및 5일) 주사하였다. 그룹의 나머지에는 부형약 (PBS)을 동일한 방식으로 주사하였다.
연구의 제 8일에 마우스를 안락사시키고 펌프 부위를 둘러싸고 있는 대략 1 평방 cm의 샘플을 각 마우스로부터 수집하였다. 피부를 10 %의 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 포르말린으로 고정된 피부 샘플을 파라핀에 담가서 관례대로 처리한 다음 5 ㎛로 잘라 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 조직을 ACVP 관청 인증 수의학적 병리학자에 의해 맹검 방식으로 현미경 조사하였다. 이 연구는 앞의 실시예와는 다른 방식으로 기록하였다. 기저층으로부터 과립층까지 표피 층의 수를 측정하였다. 이들 결과를 토대로 절편의 점수를 다음과 같이 기록하였다: 0-정상 (2-3 층), 1-경미한 두께 증가 (3-4 층), 2-중간 정도의 두께 증가 (4-6 층), 및 3-심각한 두께 증가 (>6 층).
2.5, 5, 10 ㎍/일의 IL-22를 투여하는 것은 표피의 두께를 증가시키는 결과를 초래하였다 (표 10 참조). 더욱이 IL-22 처리 동물은 표피에 단핵 세포 침윤물을 가지고 있었다. 이들 침윤물은 부형약으로 처리된 대조표준에서는 관찰되지 않았다. 동시에 100 ㎍의 IL-22RA2 (3회 주사)를 투여하는 것은 5 ㎍의 IL-22/일로 처리된 마우스에서 표피의 두께를 감소시켰다.
그룹별 표피 두께의 아칸토시스 점수를 다음과 같이 아래의 표 10에 나타낸다:
[표 10]
Figure pat00010
표피의 두께 증가 및 면역 침윤물은 또한 인간 건선 피부에서도 관찰되었다. IL-22 피하 주사에서 관찰된 피부 표현형은 추가로 건선의 병원론에서 IL-22의 잠재적 역할을 나타냈다. IL-22RA2-Fc가 IL-22 유도된 피부 표현형을 중화할 수 있다는 사실은 다른 IL-22 길항제 그 자체와 항-IL-22 중화 항체 또는 가용성 수용체를 건선 및 다른 IL-22 유도된 염증성 질병의 치료를 위해 잠재적으로 사용할 수 있음을 시사한다.
C. IL-22RA 가용성 수용체, 및 항-IL-22RA 항체가 IL-22-유도된 또는 IL-20-유도된 아칸토시스에 미치는 영향
IL-22RA 가용성 수용체, 또는 IL-22RA에 대한 항체가 생체내에서 IL-22 또는 IL-20의 활성을 억제하는 활성을, 유사한 방식으로, IL-22 또는 IL-20 단백질의 피하 주입에 의해 유발된 아칸토시스의 조직학적 종점을 사용하여 평가한다. 이 모델의 실시예에서는 C3H/HEJ 마우스에게 상기 실시예 12(A) 및 12(B)에서 설명한 것과 같은 피하 미니-삼투 펌프를 이식한다. 마우스를 IL-22 또는 IL-20에 노출시키는 동안 IL-22에 대한 정제 단클론성 항체를 주사하거나 또는 대조표준으로서 부형약을 주사함으로써 처리한다. IL-22 주입 기간이 끝날 때 피부를 조직학적 분석을 위해 펌프 부위로부터 샘플화한다. IL-22RA2 가용성 수용체 IL-22 길항제와 유사하게 본 발명의 IL-22 또는 IL-20 길항제 IL-22RA 가용성 수용체, 또는 항-IL-22RA 항체는 표피 두께 증가 및 IL-22 또는 IL-20에 의해 유발된 면역 세포 침윤물의 감소를 나타낼 것으로 예상되고, 따라서 건선 및 다른 IL-22 또는 IL-20 유도된 염증성 질병에 대한 치료제로서 IL-22 또는 IL-20 길항제로서 유용할 것이다.
실시예 14
IL-22는 인간 건선 피부 샘플에서 상향조절된다
A. RNA 샘플:
건선 환자의 피부뿐만 아니라 정상 피부 샘플을 얻었다. 건선 환자 피부에는 안정한 플라크형 건선으로부터의 피부와 건선과 관련은 없지만 인접한 피부도 포함된다. RNA를 종래 방법을 사용하여 인간 피부 샘플로부터 분리하였다. RNA 샘플의 보전성과 질을 Agilent 2100 바이오분석기 (Agilent Technologies, Waldbronn Germany) 상에서 시험하였다.
B. 정량 RT-PCR을 위한 프라이머 및 프로브:
ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하는 실시간 정량 RT-PCR에 대해서는 이미 설명되어 있다 (Heid, C.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터와 소멸제 형광 염료 두 가지를 모두 함유하고 있는 유전자 특이적 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 프로브가 무상일 때 리포터 염료 방출은 소멸제 염료의 근접성 때문에 무효화된다. 추가의 유전자-특이적 전방 및 역 프라이머를 사용하는 연장된 PCR 동안에, 프로브는 프로브로부터 리포터 염료를 방출시키는 rTth DNA 폴리머라제의 5' 에서 3' 방향의 누클레오티드 절단 활성에 의해 절단되고, 그 결과 형광 방출이 증가된다.
IL-22 발현의 실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머와 프로브는 프라이머 디자인 소프트웨어 Primer ExpressTM (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하여 디자인하였다. 인간 IL-22에 대한 프라이머는 게놈 DNA의 증폭을 제거하기 위하여 인트론-엑손 결합부를 중심으로 디자인하였다. 72 bp 생성물을 합성하기 위하여 전방 프라이머, ZC42459 (서열 번호 22)와 역 프라이머, ZC42458 (서열 번호 23)을 800 nM 농도로 PCR 반응 (아래에서 설명됨)에 사용하였다. 상응하는 IL-22 프로브, ZC42460 (서열 번호 24)은 자이모제네틱스사(ZymoGenetics)에서 합성하고 표지하였다. IL-22 프로브를 5' 단부에서 리포터 형광 염료 (6-카르복시-플루오레신)(FAM)(PE Applied Biosystems)으로 표지하고, 3' 단부에서 소멸제 형광 염료 (6-카르복시-테트라메틸-로다민)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)으로 표지하였다.
C. 실시간 정량 RT-PCR
IL-22 mRNA의 상대적 수준을 TaqMan EZ RT-PCR 코어 시약 키트 (PE Applied Biosystems)를 사용하여 총 RNA 샘플을 분석함으로써 측정하였다. 최종 IL-22 전사물을 만들어서 정량에 사용된 표준 곡선을 작성하였다. 표준 곡선은 IL-22에 대한 전체 메신저의 총 복사물의 약 le8에서 le3에 걸쳐 연속적으로 10배 희석된 것으로 구성되며, 각 표준 곡선 포인트는 삼중으로 분석하였다. 피부로부터 얻은 총 RNA 샘플을 인간 IL-22 전사물 수준에 대하여 및 내인성 대조표준으로서 hGUS의 수준에 대하여 또한 삼중으로 분석하였다. 총 25 ㎕의 부피에서 각 RNA 샘플에 대해 다음을 포함하는 TaqMan EZ RT-PCR 반응 (PE Applied Biosystems)을 수행하였다: DEPC 처리된 물 (Dnase/Rnase 유리)중의 대략 25 ng의 총 RNA; 적절한 프라이머 (대략 800 nM의 ZC42459(서열 번호 22) 및 ZC42458 (서열 번호 23); 적절한 프로브 (대략 100 nM의 ZC42460 (서열 번호 24); 1X TaqMan EZ 완충액; 3 mM의 아세트산 망간; 300 μM의 d-CTP, d-ATP, 및 d-GTP 및 600 μM의 d-UTP; rTth DNA 폴리머라제 (0.1 U/㎕); 및 AmpErase UNG (0.01 U/㎕). PCR 열 주기 조건은 다음과 같았다: 50 ℃에서 2분 동안 1 주기의 초기 UNG 처리 단계; 60 ℃에서 30분 동안 1 주기의 역전사 (RT) 단계; 95 ℃에서 5분 동안 1 주기의 UNG의 탈활성화 단계; 94 ℃에서 20초 동안 60 ℃에서 1분 동안 40 주기의 증폭 단계.
상대적 IL-22 RNA 수준을, 표준 곡선 방법을 제조업체(PE Biosystems)가 설명한 대로 사용하여 측정하였다 (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, December 11, 1997). hGUS 측정치를 사용하여 IL-22 수준을 표준화하였다. 데이터를 아래 표 11에 나타낸다.
[표 11]
Figure pat00011
IL-22 mRNA는 정상 환자 또는 비포함 영역으로부터 얻은 피부 샘플에서는 검출되지 않았다. 대조적으로 건선 환자로부터의 피부에 포함된 IL-22 메시지는 극적으로 상향 조절되어 있었다. 이들 데이터는 IL-22와 인간 건선 사이에 밀접한 관련이 있음을 시사한다.
IL-22의 과잉 발현을 인간 건선 병변에서 볼 수 있었는데, 그것은 IL-22가 인간 건선에 관련되어 있음을 시사한다. 더욱이 본원에서 설명한 것처럼 유전자 도입 마우스에서 IL-22의 과잉발현은 건선 표현형의 표지인 표피 두께 증가와 면역 세포 포함을 나타냈고, 또한 IL-22를 정상 마우스에 주입하면 건선 표현형의 표지인 표피 두께 증가와 면역 세포 포함을 나타냈는데, 그것은 가용성 수용체 길항제 IL-22RA2에 의해 제거되었다. 그런 생체 데이터는 나아가 전-염증성 IL-22가 건선에 관련된다는 것을 시사한다. IL-22 활성에 대한 길항제, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22 단클론성 항체, 및 가용성 수용체와 그것에 대한 항체는 그 자체로서 염증성 질병의 치료에, 특히 건선의 치료시 IL-22의 길항제로서 유용하다. 더욱이 IL-22 활성에 대한 길항제, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22 단클론성 항체, 및 가용성 수용체와 그것에 대한 항체는 다른 염증성 질병의 치료에 유용한데, 예를 들면 아토피성 피부염, IBD, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스성 관절염, 및 건선성 관절염, 성인 호흡계 질병 (ARD), 패혈성 쇼크, 다발성 기관 장애, 염증성 폐 손상, 예컨대 천식 또는 기관지염, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 아토피성 및 접촉성 피부염, 및 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 대장염 및 크론씨병의 치료에 IL-22에 대한 길항제로서 유용하다.
실시예 15
IL-22는 인간 아토피성 피부염 피부 샘플에서 상향조절된다.
아토피성 피부염 환자 (n=4)로부터의 피부 샘플과 정상인 (n=4) 피부 샘플을 얻었다. RNA를 종래 방법을 사용하여 인간 피부 샘플로부터 분리하였다. RNA 샘플의 보전성과 질을 Agilent 2100 바이오분석기 (Agilent Technologies, Waldbronn Germany) 상에서 시험하였다.
B. 정량 RT-PCR을 위한 프라이머 및 프로브:
ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하는 실시간 정량 RT-PCR에 대해서는 이미 설명되어 있다 (Heid, C.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터와 소멸제 형광 염료 두 가지를 모두 함유하고 있는 유전자 특이적 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 프로브가 무상일 때 리포터 염료 방출은 소멸제 염료의 근접성 때문에 무효화된다. 추가의 유전자-특이적 전방 및 역 프라이머를 사용하는 연장된 PCR 동안에, 프로브는 프로브로부터 리포터 염료를 방출시키는 rTth DNA 폴리머라제의 5' 에서 3' 방향의 누클레오티드 절단 활성에 의해 절단되고, 그 결과 형광 방출이 증가된다.
IL-22 발현의 실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머와 프로브는 프라이머 디자인 소프트웨어 Primer ExpressTM (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하여 디자인하였다. 인간 IL-22에 대한 프라이머는 게놈 DNA의 증폭을 제거하기 위하여 인트론-엑손 결합부를 중심으로 디자인하였다. 72 bp 생성물을 합성하기 위하여 전방 프라이머, ZC42459 (서열 번호 22)와 역 프라이머, ZC42458 (서열 번호 23)을 800 nM 농도로 PCR 반응 (아래에서 설명됨)에 사용하였다. 상응하는 IL-22 프로브, ZC42460 (서열 번호 24)은 자이모제네틱스사(ZymoGenetics)에서 합성하고 표지하였다. IL-22 프로브를 5' 단부에서 리포터 형광 염료 (6-카르복시-플루오레신)(FAM)(PE Applied Biosystems)으로 표지하고, 3' 단부에서 소멸제 형광 염료 (6-카르복시-테트라메틸로다민)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)으로 표지하였다.
C. 실시간 정량 RT-PCR
IL-22 mRNA의 상대적 수준을 TaqMan EZ RT-PCR 코어 시약 키트 (PE Applied Biosystems)를 사용하여 총 RNA 샘플을 분석함으로써 측정하였다. 최종 IL-22 전사물을 만들어서 정량에 사용된 표준 곡선을 작성하였다. 표준 곡선은 IL-22에 대한 전체 메신저의 총 복사물의 약 le8에서 le3에 걸쳐 연속적으로 10배 희석된 것으로 구성되며, 각 표준 곡선 포인트는 삼중으로 분석하였다. 피부로부터 얻은 총 RNA 샘플을 인간 IL-22 전사물 수준에 대하여 및 내인성 대조표준으로서 hGUS의 수준에 대하여 또한 삼중으로 분석하였다. 총 25 ㎕의 부피에서 각 RNA 샘플에 대해 다음을 포함하는 TaqMan EZ RT-PCR 반응 (PE Applied Biosystems)을 수행하였다: DEPC 처리된 물 (Dnase/Rnase 유리)중의 대략 25 ng의 총 RNA; 적절한 프라이머 (대략 800 nM의 ZC42459(서열 번호 22) 및 ZC42458 (서열 번호 23); 적절한 프로브 (대략 100 nM의 ZC42460 (서열 번호 24); 1X TaqMan EZ 완충액; 3 mM의 아세트산 망간; 300 μM의 d-CTP, d-ATP, 및 d-GTP 및 600 μM의 d-UTP; rTth DNA 폴리머라제 (0.1 U/㎕); 및 AmpErase UNG (0.01 U/㎕). PCR 열 주기 조건은 다음과 같았다: 50 ℃에서 2분 동안 1 주기의 초기 UNG 처리 단계; 60 ℃에서 30분 동안 1 주기의 역전사 (RT) 단계; 95 ℃에서 5분 동안 1 주기의 UNG의 탈활성화 단계; 94 ℃에서 20초 동안 60 ℃에서 1분 동안 40 주기의 증폭 단계.
상대적 IL-22 RNA 수준을, 표준 곡선 방법을 제조업체(PE Biosystems)가 설명한 대로 사용하여 측정하였다 (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, December 11, 1997). hGUS 측정치를 사용하여 IL-22 수준을 표준화하였다.
IL-22 mRNA는 정상 환자로부터 얻은 피부 샘플에서는 검출되지 않았다. 대조적으로 아토피성 피부염 환자로부터의 피부 샘플 4개 중에 3개에서는 IL-22 메시지가 극적으로 상향 조절되어 있었다 (약 400 내지 2300 복사물). 이들 데이터는 IL-22와 인간 아토피성 피부염 사이에 밀접한 관련이 있음을 시사한다.
IL-22의 과잉 발현을 인간 아토피성 피부염 피부에서 볼 수 있었는데, 그것은 IL-22가 인간 아토피성 피부염에 관련되어 있음을 시사한다. 더욱이 본원에서 설명한 것처럼 유전자 도입 마우스에서 IL-22의 과잉발현은 아토피성 피부염 표현형의 표지인 표피 두께 증가와 면역 세포 포함을 나타냈고, 또한 IL-22를 정상 마우스에 주입하면 아토피성 피부염 표현형의 표지인 표피 두께 증가와 면역 세포 포함을 나타냈는데, 그것은 가용성 수용체 길항제 IL-22RA2에 의해 제거되었다. 그런 생체 데이터는 나아가 전-염증성 IL-22가 아토피성 피부염에 관련된다는 것을 시사한다. IL-22 활성에 대한 길항제, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22 단클론성 항체, 및 가용성 수용체와 그것에 대한 항체는 그 자체로서 염증성 질병의 치료에, 특히 아토피성 피부염의 치료시 IL-22의 길항제로서 유용하다. 더욱이 IL-22 활성에 대한 길항제, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22 단클론성 항체, 및 가용성 수용체와 그것에 대한 항체는 다른 염증성 질병의 치료에 유용한데, 예를 들면 아토피성 피부염, IBD, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스성 관절염, 및 건선성 관절염, 성인 호흡계 질병 (ARD), 패혈성 쇼크, 다발성 기관 장애, 염증성 폐 손상, 예컨대 천식 또는 기관지염, 박테리아성 폐렴, 아토피성 피부염, 습진, 아토피성 및 접촉성 피부염, 및 염증성 장 질환, 예컨대 궤양성 대장염 및 크론씨병의 치료에 IL-22에 대한 길항제로서 유용하다.
실시예 16
인간 IL-22 다클론성 항체
2마리의 암컷 뉴질랜드산 백색 토끼를 BHK 세포로부터 제조한 정제된 성숙한 재조합 인간 IL-22 폴리펩티드 (IL-22-BHK)(서열 번호 6의 아미노산 잔기 22(Ala)에서 167(Ile)까지)로 면역시킴으로써 항 IL-22 다클론성 항체를 제조하였다. 토끼에게 각각 처음에 완전 프로인트 보조액 중의 200 ㎍의 정제 단백질을 복강내 (ip) 주사한 후 추가로 매 3주마다 불완전 프로인트 보조액 중의 100 ㎍의 펩티드를 IP 주사함으로써 추가면역하였다. 두 번째 추가면역 주사 후 (총 3회 주사) 7일 내지 10일이 지나서 동물들을 출혈시켜 혈청을 수집하였다. 그런 다음 다시 동물을 추가면역하고 매 3주마다 출혈시켰다.
인간 IL-22-특이적 다클론성 항체를 면역 토끼 혈청으로부터, CNBr-세파로스의 g당 10 mg의 특이한 항원 정제된 재조합 단백질 인간 IL-22-BHK를 사용하여 제조한 CNBr-세파로스 4B 단백질 칼럼 (Pharmacia LKB)을 사용하여 친화성 정제하고, PBS로 밤새 20X 투석하였다. 인간 IL-22-특이적 항체는 항체 표적으로서 500 ng/ml의 정제된 재조합 단백질 인간 IL-22-BHK를 사용하여 ELISA에 의하여 특성을 확인하였다. 토끼 항-인간 IL-22 친화성 정제된 항체의 검출 하한 (LLD)은 그것의 특이하게 정제된 재조합 항원 인간 IL-22-BHK에 대해 280 pg/ml이다.
인간 IL-22-특이적 다클론성 항체를, BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3) 상에서 정제된 재조합 인간 IL-22-BHK의 세포-증식 활성을 차단하는 능력에 대하여 추가로 특성확인하였다 ("중화 분석"). 50배 몰 과잉의 인간 IL-22-특이적 다클론성 항체는 세포 증식을 억제하기에 충분하였다.
실시예 17
항-인간 IL-22 단클론성 항체
4마리의 암컷 Sparque-Dawley 래트 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA)를 BHK 세포로부터 제조한 정제된 성숙한 재조합 인간 IL-22 폴리펩티드 (IL-22-BHK)(서열 번호 6의 아미노산 잔기 22(Ala)에서 167(Ile)까지)로 면역시킴으로써 단클론성 항체를 제조하였다. 토끼에게 각각 처음에 완전 프로인트 보조액(Pierce, Rockford, IL)중의 100 ㎍의 정제된 인간 재조합 IL-22 단백질을 복강내 (IP) 주사한 후 추가로 매 2주마다 불완전 프로인트 보조액 중의 50 ㎍의 정제된 재조합 단백질을 IP 주사함으로써 추가면역하였다. 세 번째 추가면역 주사 후 7일 내지 10일이 지나서 동물들을 출혈시켜 혈청을 수집하였다.
인간 IL-22-특이적 래트 혈청 샘플을 500 ng/ml의 비오티닐화된 인간 IL-22-BHK 및 500 ng/ml의 비오티닐화된 마우스 IL-22, 비오티닐화된 muIL-22-대장균 (R+D Systems, Minneapolis, MN) 항체 표적을 사용하여 ELISA에 의해 특성확인하였다. 세 개의 래트 혈청 샘플은 특이한 항체 표적, 비오티닐화된 인간 IL-22-BHK에 대해 1:1E5의 희석에서 역가를 나타냈고, 특이한 항체 표적, 비오티닐화된 muIL-22-대장균에 대해서는 1:1E4에서 역가를 나타냈다.
비장세포와 림프절 세포를 2마리의 고-역가 쥐에서 취하여서 SP2/0 (마우스) 골수종 세포에, PEG 1500을 사용하여 두 개의 별도의 융합 과정 (4:1 융합 비율, 비장세포 대 골수종 세포, "Antibodies A Laboratory Manual, E. Harlow and DLane, Cold Spring Harbor Press)으로 융합시켰다. 융합 후 10일 동안 성장시킨 후 특이한 항체-생성 하이브리도마 풀을 비오티닐화된 재조합 단백질 인간 IL-22-BHK 및 별도의 항체 표적으로서 비오티닐화된 재조합 단백질 muIL-22-대장균을 사용하여 ELISA에 의해 확인하였다. 두 개의 ELISA 프로토콜에서 포지티브인 하이브리도마 풀을 추가로 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3) 상에서 정제된 재조합 muIL-22-대장균의 세포-증식 활성을 차단 또는 감소시키는 능력에 대하여 분석하였다 ("중화 분석").
ELISA 만에 의해 또는 ELISA와 "중화 분석"에 의해 포지티브 결과를 나타내는 하이브리도마 풀을 최소한 2회 제한 희석함으로써 클론하였다.
조직 배양 배지로부터 정제된 단클론성 항체를, 재조합체 및 천연 인간 IL-22의 마우스 및 인간 혈청 샘플에서의 정량 검출을 위해 사용될 수 있는 활용성에 대해 ELISA로 특성확인하였다. 선택된 2개의 항체는 100 % 인간 혈청에서 대략 1 ng/ml의 재조합 huIL-22-대장균의 검출 하한을 나타내면서 정량 분석되었다.
조직 배양 배지로부터 정제된 단클론성 항체를, BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3) 상에서 정제된 재조합 huIL-22-대장균 또는 muIL-22-대장균의 세포-증식 활성을 차단 또는 감소시키는 능력에 대하여 분석하였다 ("중화 분석"). 6개의 "중화" 단클론성 항체를 이 방식으로 확인하였다. 상술된 인간 IL-22에 대하여 중화 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마를 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC; Manassas VA) 특허 기탁기관에 부다페스트 조약하의 원래의 기탁물로서 기탁하였고, 다음의 ATCC 승인 번호를 받았다: 클론 266.16.1.4.4.1 (ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5035); 클론 266.5.1.2.2.3 (ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5033); 클론 267.17.1.1.4.1 (ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5038); 클론 267.4.1.1.4.1 (ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5037); 클론 266.12.6.1.3.2.1 (ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5034); 클론 266.19.1.10.5.2 (ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5036); 및 클론 267.9.1.1.4.1 (ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5353).
실시예 18
항-IL-22-RA 단클론성 항체
4마리의 루이스 래트 (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA)를 절단되고 정제된 재조합 융합 단백질, muIL-22RA-Fc (서열 번호 4)로 면역시킴으로써 단클론성 항체를 제조하였다. 각각의 쥐에 처음에 완전 프로인트 보조액(Pierce, Rockford, IL)중의 100 ㎍의 정제된 재조합 융합 단백질을 복강내 (IP) 주사한 후 추가로 매 2주마다 4주 동안 불완전 프로인트 보조액 중의 50 ㎍의 정제된 재조합 단백질을 IP 주사함으로써 추가면역하였다. 처음 4주의 면역 기간이 지난 후 다시 4주 동안 매 2주마다 불완전 프로인트 중의 담체 단백질 키홀 림페트 헤모시아닌 (KLH, Pierce, Rockford, IL)에 결합된 50 ㎍의 절단된 정제 재조합 단백질을 IP 주사함으로써 추가면역하였다. 네 번째 추가면역 주사 후 7일 내지 10일이 지나서 동물들을 출혈시켜 혈청을 수집하였다.
muIL-22RA-특이적 래트 혈청 샘플을 특이적 항체 표적으로서 500 ng/ml의 정제된 재조합 융합 단백질, muIL-22RA-Fc를 사용하고, 비-특이적 항체 표적으로서 미관련 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 특성확인하였다.
비장세포를 한 마리의 고역가 쥐로부터 취하여서 최적의 PEG-매개된 융합 프로토콜 (Rockland Immunochemicals)로 SP2/0 (마우스) 골수종 세포에 융합시켰다. 융합 후 12일 동안 성장시킨 후 특이한 항체-생성 하이브리도마 풀을, 특이한 항체 표적으로서 500 ng/ml의 각각의 정제된 재조합 융합 단백질 muIL-22RA-Fc-Bv를 사용하고 비-특이적 항체 표적으로서 미관련 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의해 확인하였다. 특이한 항체 표적에 대해서만 포지티브인 하이브리도마 풀을 추가로 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3) 상에서 정제된 재조합 muIL-22-대장균의 세포-증식 활성을 차단 또는 감소시키는 능력에 대하여 분석하였다 ("중화 분석").
ELISA 분석에서 특이한 포지티브 결과와 FACS 또는 "중화 분석"에서 포지티브 결과를 나타내는 하이브리도마 풀을 최소한 2회 제한 희석함으로써 클론하였다.
조직 배양 배지의 단클론성 항체를, 정제된 재조합 단백질 muIL-22-대장균 또는 huIL-22-BHK의 존재 하에 성장한 BaF3/CRF2-4/IL-22RA 세포 (실시예 2 및 실시예 3)의 증식을 차단 또는 감소시키는 능력에 대하여 특성확인하였다. 14개의 "중화" 단클론성 항체를 확인하였고 9개의 단클론성 항체를 클론하였다.
상술된 마우스 IL-22에 대하여 중화 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마를 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC; Manassas VA) 특허 기탁기관에 부다페스트 조약하의 원래의 기탁물로서 기탁하였고, 다음의 ATCC 승인 번호를 받았다: 클론 R2.1.1G11.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6035); 클론 R2.1.5F4.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6024); 클론 R2.1.5H8.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6025); 클론 R2.1.12G7.1(특허 기탁 번호 PTA-6036); 클론 R2.1.13C8.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-5037); 클론 R2.1.15E2.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6038); 클론 R2.1.16C11.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6039); 클론 R2.1.18C8.1(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6040); 및 클론 R2.1.21G8.2(ATCC 특허 기탁 번호 PTA-6111).
실시예 19
두 개의 래트-항-Ms-IL-22RA MAb에 대한 결합 친화성
염소-항-래트 IgG-Fc 감마 특이적 항체 (Jackson)를 CM5 Biacore 칩 위에 고정시켰다. 각 mAb를 항-래트 포획 표면에 결합시킨 후 mAb를 교차하도록 연속적 농도의 IL-22RA를 주입하여 결합 (Ka) 및 분리 (Kd)를 알 수 있도록 분석을 최적화하였다. 예비 시험이 끝난 후 융합 단백질과 칩 상의 포획 표면 사이에 비-특이적 결합이 관찰되었다. 트롬빈에 의해 절단된 Fc4 꼬리를 가지는 IL-22RA의 바이알을 만들고, 계속해서 그것을 시험하여 바탕 효과가 있는 지를 보았다. 각각의 작업 후에 20 mM HCl을 2회 주입함으로써 항-래트 항체에 대해 표면을 다시 재생시켰다. 각 MAb에 대해 데이터를 작성하고 평가 소프트웨어 (BIAevaluation software version 3.2, Pharmacia BIAcore, Uppsala, Sweden)를 사용하여 IL-22RA 단백질에 대한 항-IL-22RA 항체 결합의 역학을 평가하였고, 그 결과를 아래의 표 12에 나타낸다:
[표 12]
Figure pat00012
** 각각의 항IL-22RA MAb에 대한 평형 결합(Ka) 및 분리(Kd) 속도 상수를 나타내며 값은 기계 한계치에서 떨어진다. Chi2는 결합 곡선과 평가 맞춤 곡선 사이의 남아있는 공간의 합을 말한다. 0에 가까울수록 데이터의 신뢰도는 커진다.
표 12에서 알 수 있는 것과 같이 항-IL-22RA MAb는 둘 다 IL-22RA 단백질에 강력하게 결합되며, 이것은 IL-22RA (트롬빈-절단된 Fc4 꼬리)에 대한 피코몰 농도의 결합에 의해서도 증명된다. 이 데이터는 낮은 Chi2 값을 토대로 양호한 신뢰도를 가지는 것으로 나타나며 mAb 클론 R2.1.5F4.1이 IL-22RA 수용체에 대해 약간 더 강한 친화성을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 20
조직 샘플의 생체내 IL-22 단백질 발현의 면역조직화학적 분석
A. 요약
IL-22 단백질 발현 및 병소 부위의 면역조직화학적 (IHC) 분석을 항-인간 IL-22 (항-hIL-22) 단클론성 항체 (Mab 266.19.1.10.5.2)를 사용하여 다음의 조직 샘플에서 수행하였다: 인간 다중-정상 그리드(Grid) 및 종양 그리드; 인간 췌장염, 폐 및 신장병 샘플; 인간 건선 피부 샘플; INS IL-22 TG (래트 인슐린 프로모터로부터 발현됨) 및 WT 마우스 췌장; muIL-22-EuLCK TG 및 WT 마우스 피부 샘플; 및 DSS (WT 및 IL-22 KO) 마우스 결장 샘플. 또한 항-hIL-22 단클론성 항체 MAB 266.19.1.10.5.2 (실시예 17) 대 다클론성 항체 (토끼 항-hIL-22)(실시예 16)의 염색 패턴을 비교하였다.
래트 항-인간 IL-22 단클론성 항체 MAb 266.16.1.4.4.1 및 MAb 266.19.1.10.5.2 (실시예 17)를 시험하였고, 대부분의 BHK/인간 IL-22 (> 50 %) 뿐만 아니라 일부의 BHK/마우스 IL-22 세포 (1 내지 5 %)를 염색하는 것으로 나타났으며, 그것들을 사용하여 인간 환자 및 동물 모델 샘플에서 조직 파괴 및 IL-22의 발현을 조사하고 다클론성 토끼 항체를 사용한 염색 패턴을 비교하는 데 사용하여 결과를 확인하였다.
B. 재료 및 방법
사람으로부터 및 마우스 동물 모델로부터 얻은 포르말린-고정된 및 파라핀-침지된 세포 및 조직을 5 ㎛ 크기로 잘랐다. 세포에는 포지티브 대조표준 및 네가티브 대조표준으로서 각각 인간 또는 마우스 IL-22 및 야생형을 발현하는 BHK 세포가 포함되었다. 인간 조직은 다양한 정상인 조직 (예컨대 뇌, 뇌하수체, 부신, 유방, 신장, 심장, 위, 소장, 대장, 태아 간, 간, 피부, 췌장, 폐, 편도선, 난소, 고환, 전립선, 자궁, 태반, 갑상선 및 비장)의 50개의 절편을 포함한 다중-조직 대조표준 슬라이드 (NormalGridTM; Biomedia, Foster City, CA); 다양한 인간 종양 (예컨대 폐암, 간암, 신장암, 결장암, 유방암, 갑상선암, 위암, 전립선암, 췌장암, 난소암, 림프종, 흑색종, 에빙스 육종(sarcoma ewings), 상피 육종, MFH 육종, 봉상 육종, 암양종, 미분화 암, 중피종, 테레토마(teretoma) 및 세미노마(seminoma))의 50개의 절편을 포함한 다중-조직 대조 슬라이드 (TumorGridTM; Biomedia, Foster City, CA); CHTN (Cooperation Human Tissue Network, Cleveland, Ohio)으로부터의 폐 암종; 정상 췌장, 만성 췌장염에 걸려 있는 췌장, 만성 말초혈 염증이 있는 폐, 다중 병소 사구체 경화증, 메스-혈관 증식성 사구체 경화증, 또는 NDRI(National Disease Research Interchange, Philadelphia, PA)로부터의 경색성 사구체 세포간 괴사에 걸려 있는 신장; 및 사람으로부터의 건선 피부 샘플을 포함하였다. 마우스 조직은 염증성 장 질병 동물 모델 (본원에 개시된 DSS 모델, 스위스 웹스터 암컷 마우스)로부터의 결장 및 부형약 또는 마시는 물에 담긴 4 % DSS로 7일 동안 처리된 IL-20 WT 및 KO 대장염 동물 모델 (DSS 마우스, 야생형 및 IL-20 (IL-20) 녹아웃 암컷 마우스)로부터의 결장; 및 mIL-22-EuLCK TG 및 mIL-22-INS 대조표준 및 TG 동물을 포함한 유전자 도입 (TG) 동물 모델로부터의 피부 샘플을 포함하였다. 블록/슬라이드당 한 개의 절편을 조직학적 조사를 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고 계속해서 절편을 IL-22 단백질 발현 및 병소 부위에 대해 면역조직화학적으로 염색하였다.
면역조직화학을 위해 세포와 조직 절편을 ChemMateTM Capillary Gap Plus 현미경 슬라이드 (BioTek, Winooski, Vermont) 위에 놓고, 60 ℃ 오븐에서 60분 동안 건조시킨 다음 크실렌에서 5분, 100 % EtOH에서 4분, 100 % EtOH에서 3분, 그리고 95 % EtoH에서 2분을 3회 반복하는 표준 조건을 사용하여 파라핀을 제거하였다. 그런 다음 조직 절편에 대하여 펩신 (NeoMarkers Fremont CA)을 사용한 37 ℃에서의 20분-효소-유도 에피토프 회복 처리를 수행한 후, 제조업체 (Zymed, South San Francisco, CA)의 지시대로 아비딘/비오틴-차단 단계를 수행하였다. 아비딘-비오틴-복합체 검출 시스템 (Ventana Biotek Systems, Tucson, AZ)을 사용하는 TechMate 500TM 자동화 면역염색기 및 면역과산화효소 (IP) 면역조직화학 프로토콜을 염색에 사용하였다. TechMate 500TM 자동화 면역염색기는 모세관 작용의 원리를 사용하고, IP 프로토콜은 "샌드위치" 기법으로서 언급된 면역염색 유형을 활용한다. 절편을 PBS 중의 5 %의 정상 염소 혈청 (Vector, Burlingame CA)으로 10분 동안 예비차단한 후 완충액 1(Signet, Dedham MA)로 1회 세척한 다음, 1:800으로 희석된, IL-22에 대한 일차 항체 (MAB 266.19.1.10.5.2)(실시예 17), 2.04 mg/ml로 정제된 PAS)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 완충액 1로 5회 세척하였다. 일차 항체를 TechMate 500TM 항체 희석 완충액 (Ventana)으로 희석하였다. 1:200으로 희석된 비오티닐화된 염소 항-래트 IgG (Vector)와 5 % 정상 염소 혈청 및 PBS 중의 2.5 % 비지방 건조유를 이차-결합 항체로서 사용하여 25분 동안 실온에서 인큐베이션한 후 완충액 1로 1회 세척하고 완충액 2&3 (Signet)으로 1회 세척하였다. 그런 다음 조직 절편을 3 % 과산화수소 (HP)(Ventana)로 7분 동안 3회 차단하고, 완충액 2&3으로 3회 세척하였다. 면역과산화효소 표지화는 과산화물 DAB 키트 (Ventana)로 수행하였는데, 아비딘-비오틴-복합체 (ABC)와 함께 30분 동안 인큐베이션한 후 완충액 2&3으로 5회 세척하고, 디아미노벤지딘(DAB)과 함께 4분 동안 4회 인큐베이션한 후 완충액 2&3으로 2회 세척하고 물로 1회 세척하였다 (Signet, Cat. No. 2340). 그런 다음 조직을 메틸 그린 (Dako, Cat. No. S1962)으로 10분 동안 역 염색한 후 완충액 2&3으로 2회 세척하고 물로 3회 세척하였다. 대조표준은 일차 항체를 대신하기 위해 래트 일차 항체 이소타입 대조표준 (Zymed)을 사용하는 비-면역 일차 혈청을 포함하였다.
면역염색은 올림푸스 BH-2 현미경을 사용하여 관찰하였고, 영상은 CoolSNAP HQ 디지털 카메라 (Roper Scientific, Tucson, AZ)를 사용하여 포착하였다.
C. 결과
포지티브 및 네가티브 대조 셀라인: 인간 IL-22를 발현하는 BHK 세포 (+++) 및 래트 IL-22를 발현하는 BHK 세포 (+)에서 모두 포지티브로 염색되고 야생형 BHK 세포 (-)에서는 염색되지 않는 것으로 증명된 항-hIL-22 단클론성 항체, MAB 266.19.1.10.5.2. 모든 포지티브 및 네가티브 BHK 셀라인을 래트 이소타입 네가티브 대조표준으로 염색하여 일차 항체를 대체하였고, 그 결과 염색되지 않았으며, 그것은 항체가 IL-22 리간드에 특이함을 나타냈다. 항체는 인간 및 마우스 IL-22에 대하여 교차 면역반응성을 가졌다.
인간 조직: 인간 다중-정상 그리드 및 종양 그리드; 췌장, 폐 및 신장병 샘플; 및 인간 건선 피부 샘플을 조사하였다. 이들 인간 조직은 1) 다중-조직 대조표준 슬라이드 (NormalGridTM)/정상인 조직에 대해 뇌, 뇌하수체, 부신, 유방, 신장, 심장, 위, 소장, 대장, 태아 간, 간, 피부, 췌장, 폐, 편도선, 난소, 고환, 전립선, 태반, 갑상선 및 비장; 2) 다중-조직 대조 슬라이드 (TumorGridTM)/인간 이상 조직/종양에 대해 폐암, 간암, 신장암, 결장암, 유방암, 갑상선암, 위암, 전립선암, 췌장암, 난소암, 림프종, 흑색종, 에빙스 육종, 상피 육종, MFH 육종, 봉상 육종, 암양종, 미분화 암, 중피종, 테레토마 및 세미노마; 3) 정상 췌장, 만성 췌장염에 걸려 있는 췌장, 만성 말초혈 염증, 폐암이 있는 폐, 다중 병소 사구체 경화증이 있는 신장, 메스-혈관 증식성 사구체 경화증이 있는 신장, CHTN 및/또는 NDRI로부터의 경색성 사구체 세포간 괴사에 걸려 있는 신장; 4).
마우스 조직: INS IL-22 TG 및 WT 마우스 췌장을 조사하였다. Mab MAB 266.19.1.10.5.2 및 WT 췌장으로 포지티브로 강하게 (+++) 염색되는 것으로 증명된 INS IL-22 TG 췌장에서 샘 전체에 산란된 세포는 염색되지 않는 것으로 (-) 나타났다.
다클론성 및 단클론성 항체의 비교: 항-IL-22 다클론성 항체 (실시예16)는 민감한 한편, 단클론성 항체 MAB 266.19.1.10.5.2는 특이적인 것으로 나타났다. 다클론성 항체는 인간 IL-22 발현 BHK 세포 (+++), 래트 IL-22 발현 BHK 세포 (+), 다양한 인간 및 마우스 조직 샘플 (+), 및 INS mIL-22 TG 마우스 (+++)에서 포지티브로 염색되는 것으로 나타났다. 유전자 도입 동물의 샘이 더 큰 백분율로 (야생형에 비해) 포지티브 염색을 나타냈다. 유전자 도입 샘의 염색은 일반적으로 샘 전체에 (+++) 분포되어 있었던 반면 야생형 샘에서의 염색은 대체로 샘의 말단부에 (+) 한정되어 있었다. 그러나 이 항체는 또한 WT BHK 네가티브 대조 세포에 대해서도 비-특이적 염색을 나타냈다 (+).
MAB 266.19.1.10.5.2는 인간 IL-22 발현 BHK 세포 (+++), 래트 IL-22 발현 BHK 세포 (+), 및 INC mIL-22 TG 마우스의 샘에서 (+++) 포지티브로 염색되는 것으로 나타났다. 유전자 도입 동물의 샘에서의 염색은 일반적으로 샘 전체에 (+++) 분포되어 있었던 반면 야생형 샘은 네가티브 염색 (-)인 것으로 나타났다.
실시예 21
IL-20은 인간 건선 피부 샘플에서 상향조절된다.
A. RNA 샘플:
건선 환자의 피부뿐만 아니라 정상 피부 샘플을 얻었다. 건선 환자 피부에는 건선으로부터의 피부와 건선과 관련은 없지만 인접한 피부도 포함된다. RNA를 종래 방법을 사용하여 인간 피부 샘플로부터 분리하였다. RNA 샘플의 보전성과 질을 Agilent 2100 바이오분석기 (Agilent Technologies, Waldbronn Germany) 상에서 시험하였다.
B. 정량 RT-PCR을 위한 프라이머 및 프로브:
ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하는 실시간 정량 RT-PCR에 대해서는 이미 설명되어 있다 (Heid, C.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터와 소멸제 형광 염료 두 가지를 모두 함유하고 있는 유전자 특이적 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 프로브가 무상일 때 리포터 염료 방출은 소멸제 염료의 근접성 때문에 무효화된다. 추가의 유전자-특이적 전방 및 역 프라이머를 사용하는 연장된 PCR 동안에, 프로브는 프로브로부터 리포터 염료를 방출시키는 rTth DNA 폴리머라제의 5' 에서 3' 방향의 누클레오티드 절단 활성에 의해 절단되고, 그 결과 형광 방출이 증가된다.
IL-20 발현의 실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머와 프로브는 프라이머 디자인 소프트웨어 Primer ExpressTM (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하여 디자인하였다. 71 bp 생성물을 합성하기 위하여 전방 프라이머, ZC40541 (서열 번호 25)과 역 프라이머, ZC40542 (서열 번호 26)를 800 nM 농도로 PCR 반응 (아래에서 설명됨)에 사용하였다. 상응하는 IL-20 TaqManR 프로브, ZC40544 (서열 번호 27)는 어플라이드 바이오시스템즈사(PE Applied Biosystems)에서 합성하고 표지하였다. IL-20 프로브를 5' 단부에서 리포터 형광 염료 (6-카르복시-플루오레신)(FAM)(PE Applied Biosystems)으로 표지하고, 3' 단부에서 소멸제 형광 염료 (6-카르복시-테트라메틸-로다민)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)으로 표지하였다.
C. 실시간 정량 RT-PCR
IL-20 mRNA의 상대적 수준을 TaqMan EZ RT-PCR 코어 시약 키트 (PE Applied Biosystems)를 사용하여 총 RNA 샘플을 분석함으로써 측정하였다. 최종 IL-20 전사물을 만들어서 정량에 사용된 표준 곡선을 작성하였다. 표준 곡선은 IL-20에 대한 전체 메신저의 총 복사물의 약 le8에서 le3에 걸쳐 연속적으로 10배 희석된 것으로 구성되며, 각 표준 곡선 포인트는 삼중으로 분석하였다. 피부로부터 얻은 총 RNA 샘플을 인간 IL-20 전사물 수준에 대하여 및 내인성 대조표준으로서 hGUS의 수준에 대하여 또한 삼중으로 분석하였다. 총 25 ㎕의 부피에서 각 RNA 샘플에 대해 다음을 포함하는 TaqMan EZ RT-PCR 반응 (PE Applied Biosystems)을 수행하였다: DEPC 처리된 물 (Dnase/Rnase 유리)중의 대략 25 ng의 총 RNA; 적절한 프라이머 (대략 800 nM의 ZC40541 (서열 번호 25) 및 ZC40542 (서열 번호 26); 적절한 프로브 (대략 100 nM의 ZC40544 (서열 번호 27); 1X TaqMan EZ 완충액; 3 mM의 아세트산 망간; 300 μM의 d-CTP, d-ATP, 및 d-GTP 및 600 μM의 d-UTP; rTth DNA 폴리머라제 (0.1 U/㎕); 및 AmpErase UNG (0.01 U/㎕). PCR 열 주기 조건은 다음과 같았다: 50 ℃에서 2분 동안 1 주기의 초기 UNG 처리 단계; 60 ℃에서 30분 동안 1 주기의 역전사 (RT) 단계; 95 ℃에서 5분 동안 1 주기의 UNG의 탈활성화 단계; 94 ℃에서 20초 동안 60 ℃에서 1분 동안 40 주기의 증폭 단계.
상대적 IL-20 RNA 수준을, 표준 곡선 방법을 제조업체(PE Biosystems)가 설명한 대로 사용하여 측정하였다 (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, December 11, 1997). hGUS 측정치를 사용하여 IL-20 수준을 표준화하였다. 데이터를 아래 표 13에 나타낸다.
[표 13]
Figure pat00013
IL-20 mRNA는 정상 환자로부터 또는 미포함 영역으로부터 얻은 피부 샘플에서는 검출되지 않았지만 건선 환자로부터의 관련 피부에서는 IL-20 메시지가 상향 조절되어 있었다. IL-20RA, IL-22RA (IL-22RA) 및 IL-20RB에 대한 수용체 하위단위체가 인간 정상 및 질병 피부에서 발현되었다. 이들 데이터는 IL-20과 인간 건선 사이에 밀접한 관련이 있음을 시사한다.
IL-20의 과잉 발현을 인간 건선 병변에서 볼 수 있었는데, 그것은 IL-20이 인간 건선에 관련되어 있음을 시사한다. 더욱이 본원에서 설명한 것처럼 유전자 도입 마우스에서 IL-20의 과잉발현은 건선 표현형의 표지인 표피 두께 증가와 면역 세포 포함을 나타냈다. 그런 생체 데이터는 나아가 IL-20이 건선에 관련된다는 것을 시사한다. IL-20 활성에 대한 길항제, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22RA 단클론성 항체, 및 가용성 수용체와 그것에 대한 항체는 그 자체로서 염증성 질병, 예컨대 건선뿐만 아니라 본원에 개시된 다른 질환의 치료시 IL-20의 길항제로서 치료적으로 유용하다.
실시예 22
IL-20은 인간 아토피성 피부염 피부 샘플에서 상향조절된다.
아토피성 피부염 환자의 피부뿐만 아니라 정상 피부 샘플을 얻었다. NA를 종래 방법을 사용하여 인간 피부 샘플로부터 분리하였다. RNA 샘플의 보전성과 질을 Agilent 2100 바이오분석기 (Agilent Technologies, Waldbronn Germany) 상에서 시험하였다.
B. 정량 RT-PCR을 위한 프라이머 및 프로브:
ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하는 실시간 정량 RT-PCR에 대해서는 이미 설명되어 있다 (Heid, C.A. et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, U.E.M. et al., Genome Research 6:995-1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). 이 방법은 리포터와 소멸제 형광 염료 두 가지를 모두 함유하고 있는 유전자 특이적 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 프로브가 무상일 때 리포터 염료 방출은 소멸제 염료의 근접성 때문에 무효화된다. 추가의 유전자-특이적 전방 및 역 프라이머를 사용하는 연장된 PCR 동안에, 프로브는 프로브로부터 리포터 염료를 방출시키는 rTth DNA 폴리머라제의 5' 에서 3' 방향의 누클레오티드 절단 활성에 의해 절단되고, 그 결과 형광 방출이 증가된다.
IL-20 발현의 실시간 정량 RT-PCR 분석에 사용된 프라이머와 프로브는 프라이머 디자인 소프트웨어 Primer ExpressTM (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)을 사용하여 디자인하였다. 71 bp 생성물을 합성하기 위하여 전방 프라이머, ZC40541 (서열 번호 25)과 역 프라이머, ZC40542 (서열 번호 26)를 800 nM 농도로 PCR 반응 (아래에서 설명됨)에 사용하였다. 상응하는 IL-20 TaqManR 프로브, ZC40544 (서열 번호 27)은 어플라이드 바이오시스템즈사(PE Applied Biosystems)에서 합성하고 표지하였다. IL-20 프로브를 5' 단부에서 리포터 형광 염료 (6-카르복시-플루오레신)(FAM)(PE Applied Biosystems)으로 표지하고, 3' 단부에서 소멸제 형광 염료 (6-카르복시-테트라메틸-로다민)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)으로 표지하였다.
C. 실시간 정량 RT-PCR
IL-20 mRNA의 상대적 수준을 TaqMan EZ RT-PCR 코어 시약 키트 (PE Applied Biosystems)를 사용하여 총 RNA 샘플을 분석함으로써 측정하였다. 최종 IL-20 전사물을 만들어서 정량에 사용된 표준 곡선을 작성하였다. 표준 곡선은 IL-20에 대한 전체 메신저의 총 복사물의 약 le8에서 le3에 걸쳐 연속적으로 10배 희석된 것으로 구성되며, 각 표준 곡선 포인트는 삼중으로 분석하였다. 피부로부터 얻은 총 RNA 샘플을 인간 IL-20 전사물 수준에 대하여 및 내인성 대조표준으로서 hGUS의 수준에 대하여 또한 삼중으로 분석하였다. 총 25 ㎕의 부피에서 각 RNA 샘플에 대해 다음을 포함하는 TaqMan EZ RT-PCR 반응 (PE Applied Biosystems)을 수행하였다: DEPC 처리된 물 (Dnase/Rnase 유리)중의 대략 25 ng의 총 RNA; 적절한 프라이머 (대략 800 nM의 ZC40541 (서열 번호 25) 및 ZC40542 (서열 번호 26); 적절한 프로브 (대략 100 nM의 ZC40544 (서열 번호 27); 1X TaqMan EZ 완충액; 3 mM의 아세트산 망간; 300 μM의 d-CTP, d-ATP, 및 d-GTP 및 600 μM의 d-UTP; rTth DNA 폴리머라제 (0.1 U/㎕); 및 AmpErase UNG (0.01 U/㎕). PCR 열 주기 조건은 다음과 같았다: 50 ℃에서 2분 동안 1 주기의 초기 UNG 처리 단계; 60 ℃에서 30분 동안 1 주기의 역전사 (RT) 단계; 95 ℃에서 5분 동안 1 주기의 UNG의 탈활성화 단계; 94 ℃에서 20초 동안 60 ℃에서 1분 동안 40 주기의 증폭 단계.
상대적 IL-20 RNA 수준을, 표준 곡선 방법을 제조업체(PE Biosystems)가 설명한 대로 사용하여 측정하였다 (User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, December 11, 1997). hGUS 측정치를 사용하여 IL-20 수준을 표준화하였다.
IL-20 mRNA를 피부 샘플에서 낮은 수준으로 (약 800 복사물) 검출할 수 있었다. 대조적으로 아토피성 피부염 환자로부터의 피부에서는 IL-20 메시지에 대해 상향조절이 있었다 (약 8600 복사물). IL-20RA IL-22RA, 및 IL-20RB를 포함하여 IL-20에 대한 수용체 하위단위체는 인간 정상 및 질병 피부에서 발현된다. 이들 데이터는 IL-20과 인간 아토피성 피부염 사이에 밀접한 관련이 있음을 시사한다. IL-20의 과잉 발현을 인간 아토피성 피부염 피부에서 볼 수 있었는데, 그것은 IL-20이 인간 아토피성 피부염에 관련되어 있음을 시사한다. 더욱이 본원에서 설명한 것처럼 유전자 도입 마우스에서 IL-20의 과잉발현은 아토피성 피부염 표현형의 표지인 표피 두께 증가와 면역 세포 포함을 나타냈다. 그런 생체 데이터는 나아가 IL-20이 아토피성 피부염에 관련된다는 것을 시사한다. IL-20 활성에 대한 길항제, 예컨대 본 발명의 항-사람-IL-22RA 단클론성 항체, 및 가용성 수용체와 그것에 대한 항체는 그 자체로서 염증성 질병, 예컨대 아토피성 피부염뿐만 아니라 본원에 개시된 다른 질환의 치료시 IL-20의 길항제로서 치료적으로 유용하다.
실시예 23
IL-20 에 의한 IL-8의 상향-조절
통로 2에서 정상 사람 상피 신생아 케라티노사이트 (NHEK)(Clonetics로부터) 플레이팅되었고 12 웰 조직 배양 플레이트에서 컨플루언시로 성장되었다. KGM(케라티노사이트 성장 배지)를 Clonetics로부터 구매하였다. 셀이 컨플루언시에 도달했을때, 그들을 KGM 배지 마이너스 성장 인자 = KBM (케라티노사이트 바닥 배지)로 세척하였다. 셀을 시험 화합물의 첨가하기 전에 KBM에서 72 시간동안 혈청 결핍시켰다. 1I. U. /mL의 트롬빈과 25nM에서의 트립신을 양성 대조건으로서 사용하였다. 1 mL의 배지/웰을 첨가하였다. KBM만이 오직 음성 대조건으로서 사용되었다.
IL-20를 KBM 배지에 구성시키고 제 1 실험에서 2.5μg/ml 아래에서 618ng/mL까지, 그리고 제 2 실험에서는 2. 5μg/mL 아래에서 3ng/mL 까지 변하는 농도에서 첨가하였다.
세포를 37℃, 5%C02 에서, 48 시간동안 배양하였다. 상청액을 제거하고 IL-8 및 GM-CSF 수준에 대해 분석하기 전에 몇일동안 -80℃에서 냉동시켰다. 사람 IL-8 면역분석 키트 # D8050 (RandD Systems, Inc.) 및 사람 GM- CSF 면역분석 키트 # HSGMO (RandD Systems, Inc.)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 사이토킨 제조를 결정하였다.
결과는 IL-8 및 GM-CSF의 발현이 IL-20에 의해 유도되었다는 것을 나타내었다.
실시예 24
IL-20에 의한 염증 사이토킨의 상향-조절
사람 케라티노사이트 세포주, HaCaT 를 37℃에서 컨플루언스 후 몇일까지 T-75 조직 배양 플라스크에서 성장시켰다. 이 시점에서, 정상 성장 배지(DMEM + 10%FBS)를 제거하고 무혈청 배지로 대체하였다. 세포를 그후 2일동안 37℃에서 배양하였다. DMEM 를 그후 제거하였고 처리당 4 플라스크의 세포를 다음 조건의 각각의 하나로 4 시간동안 37℃에서 처리하였다: 5 ng/mL에서 재조합 사람(rh)IL-1 알파, 20 ng/mL에서 rh IL-1 알파, 5 ng/mL에서 rh IL-1 알파 + l/lg/mL에서 IL-20 , lyg/mL에서 IL-20, 또는 10 ng/mL에서 rhIL-10.
사이토킨 처리 후에, 배지를 제거하고 구아니듐티오시아네이트 용액을 사용하여 세포를 용해시켰다. 총 RNA를 염화세슘 구배에서 밤새 스핀에 의해서 세포 용해물로부터 분리시켰다. 다음날, RNA 펠릿을 TE/SDS 용액 중에 재현탁하였고 에탄올 침전시켰다. RNA을 그후 분광광도계를 사용하여 정량하였고, 이어서 절단면 V. B.of Clontech's AtlasTM cDNA 발현 정렬 User Manual (버전PT3140- 1/PR9X390, 11/5/99 공개됨)에서와 같이 DNase 처리하였다. RNA 샘플의 양을 스펙 판독에 기반하여 순도 계산에 의해, 그리고 아가로스 겔에서 시각화에 의해 확인하였다. RNA 샘플의 게놈 오염은 베타-액틴 유전자의 PCR 분석에 의해 제거되었다.
폴리A+ 풍부함에 대한 Clontech의 프로토콜, Atlas 정렬로의 프로브 합성 및 이종교배가 이어졌다(상기 참조, 플러스 Atlas Pure Total RNA Labeling System User Manual, PT3231-1/PR96157, 6/22/99 공개됨). 간략하게는, 폴리A+ RNA는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비즈(Clontech, Paolo Alto, CA제) 및 자성 입자 세퍼레이터를 사용하여, 50 mg의 총 RNA로부터 분리되었다. 폴리A+ RNA를 그후 RT-PCR를 통해 알파32P-dATP로 표지화하였다. AtlasTM 사람사이토킨/수용체 정렬 (Cat.#7744-1)에서 268 유전자에 특이성인 Clontech CDS 프라이머를 반응에서 사용하였다. 표지화 프로브를 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 분리시켰고 섬광 유체에서 카운팅하였다.
AtlasTM 정렬은 적어도 30분동안 68℃에서 계속적인 교반과 함께 Clontech ExpressHyb 플러스 100 mg/mL 열 변성 연어 정액 DNA으로 미리-잡종화하였다. 막을 그후 밤새 68℃에서 계속적인 교반과 함께 1.9 x106CPM/mL (총 1.14 x107 CPM)으로 잡종화하였다. 다음날, 막을 30분동안 2X SSC, 1% SDS중에서 x 4 in 68℃에서, 플러스 30분동안 68℃에서 0. 1X SSC, 0.5% SDS 중의 x1 세척하고, 이어서 5분동안 2X SSC중에서 하나의 최종 실온 세척하였다. 정렬 막은 그후 봉인된 Kodak 플라스틱 파우치에 넣고 인광체 이미저 스크린에 밤새 실온에서 노출되었다. 다음날, 인광체 스크린을 인광체 이미저에서 스캐닝하고 Clontech's Atlas이미지TM 1.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
IL-20:1에 의해 상향-조절된 유전자.
1. 종양 회저 인저 (TNF)는 IL-20에 의해 1.9-2. 4 배 상향-조절되었다.
2. 태반 성장 인자 1 & 2 (PLGF)는 IL-20에 의해 1. 9-2.0 배 상향-조절되었다.
3. 응고하는 인저 II 수용체는 IL-20에 의해 2.0-2. 5 배 상향-조절되었다.
4. 칼시토닌 수용체는 2.2-2. 3 배 상향-조절되었다.
5.TNF-유도가능한 하이알루로네이트-결합 단백질 TSG-6은 IL-20에 의해 2.1-2. 2 배 상향-조절되었다.
6. 도관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체-1 전구체, 티로신-단백질 키나아제 수용체 (FLT-1) (SFLT)는 IL-20에 의해 2.1-2. 7 배 상향-조절되었다.
7.MRP-8 (대식세포 MIF-관련된 칼슘 결합 단백질)는 IL-20에 의해 2.9-4. 1 배 상향-조절되었다.
8. MRP-14 (대식세포 MIF-관련된 칼슘 결합 단백질)은 IL-20에 의해 3.0-3. 8 배 상향-조절되었다.
9. Relaxin H2는 IL-20에 의해 3.14 배 상향-조절되었다.
10. 변형하는 성장 인자 베타(TGFss) 수용체 III 300kDa는 IL-20에 의해2.4-3. 6 배 상향-조절되었다 .
IL-20 +IL-1 처리로 시너지를 나타내는 유전자 :
1. 골 모르포겐 단백질 2a을 IL-20 처리 단독으로 1.8 배, IL-1 처리 단독으로, 2.5 배 그리고 IL-20와 IL-1 처리 둘다와 함께 8.2 배 상향-조절하였다.
2. MRP-8를 IL-20 처리 단독으로 2.9 배, IL-1 처리 단독으로 10.7 배 그리고 IL-20와 IL-1 처리 둘다 함께로 18. 0 배 상향-조절하였다.
3. Erythroid 미분 단백질 (EDF)이 IL-20 처리 단독으로 1.9 배, IL-1 처리 단독으로 9.7 배 그리고 IL-20와 IL-1 처리 함께로 19.0 배 상향-조절되었다.
4.Mop-14 (대식세포중의 칼슘 결합 단백질, MIF 관련된)은 IL-20 처리 단독으로 3.0 배, IL-1 처리 단독으로 12.2 배 그리고 IL-20와 IL-1 처리 함께로 20.3 배 상향-조절되었다.
5. 헤파린-결합 EGF-형 성장 인자는 IL-20 처리 단독으로 2.0 배, IL-1 처리 단독으로 14 배 및 IL-20와 IL-1 처리 둘다와 함께 25.0 배 상향-조절되었다.
6.베타-트롬보글로불린-형 단백질은 IL-20 처리 단독으로 1.5 배, IL-1 처리 단독으로 15 배 그리고 IL-20 와 IL-1 처리 둘다 함께로 27 배 상향-조절되었다.
7. 뇌-유도된 향신경성 인저(BDNF)는 IL-20 처리 단독으로 1.7 배, IL-1 처리 단독으로 25 배 그리고 IL-20와 IL-1 처리 둘다 함께로 48 배 상향-조절되었다.
8. 단핵 세포 주화성 및 활성화 인저MCAF 은 IL-20 처리 단독으로 1.3 배, IL-1 처리 단독으로 32 배 그리고 IL-20 및 IL-1 처리 둘다 함께로 56 배 상향-조절되었다.
실시예 25
IL-20 트랜스제닉 표현형
사람과 마우스IL-20 둘다 다양한 촉진자를 사용하여 트랜스제닉 마우스에서 과도발현되었다. 사람 IL-20의 발현을 지시하는, 간-특이성 마우스 알부민 촉진자를 초기에 단백질의 순환하는 수준을 달성하려는 시도로 사용하였다. 이어지는 연구를 표피 및 다른 층상화 비늘모양의 상피로의 발현을 주로 타겟으로 하는 케라틴 14(K-14) 촉진자; 넓은 발현 패턴을 주는 마우스 메탈로티오네인-1 촉진자; 및 임파구 혈통의 세포에서 발현 을 추진시키는 EyLCIL 촉진자를 사용하여 수행하였다. 가능하게는 이들 촉진자는 모두 순환하는 수준의 IL-20를 일으키기 때문에, 유사한 결과가 모든 4 경우에서 얻어졌다.
모든 경우에, IL-20 트랜스유전자를 발현하는 트랜스제닉 마우스는 비-트랜스제닉 한배새끼보다 더 작았고, 타이트하고, 주름진 피부와 함께 반들반들한 외양을 가졌고 태어난지 처음 몇일내에 죽었다. 마우스는 그들의 위장에 우유를 가졌고 그들이 젖을 먹을 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 마우스는 팽창된 팔다리, 꼬리, 콧구멍 및 입 영역을 가졌고 움직이는데 어려움을 가졌다. 게다가, 마우스는 허약하였고, 눈에보이는 지방 조직이 부족하였고 귀와 발가락의 발육이 지연되었다. 간에서 낮은 발현 수준 (100 mRNA 미만의 분자/세포)은 신생아 치명적임과 피부 비정상 모두에 대해서 충분하였다. 눈에보이는 표현형이 없는 트랜스제닉 마우스는 트랜스유전자를 발현하지 않고, 검출가능한 수준에서 그것을 발현하지 않거나, 또는 모자이크였다.
IL-20 트랜스제닉 마우스의 피부의 조직학적 분석은 비- 트랜스제닉 한배새끼에 비해 두꺼워진 표피, 각막 비후증 및 조밀한 층 피부각질층을 나타내었다. Serocellular 크러스트 (scabs)가 종종 관찰되었다. 트랜스제닉 마우스로부터 피부의 전자 현미경 (EM) 분석은 사람 건선 피부 및 마우스 피부 질환 모델에서 관찰된 것과 유사한 미토콘드리아내 지질성 포함물, 얼룩덜룩한 케라토하이알린 과립, 및 비교적 적은 토노필라멘트를 나타냈다. 게다가, 많은 트랜스제닉 마우스는 아폽토틱 흉선 림프구를 가졌다. 다른 비정상은 조직병리학 분석에 의해 검출되지 않았다. 이들 조직학적이고 EM 결과는 관찰된 총체의 피부 변경을 지지하고 확장한다.
실시예 26
가용성 사람 IL-22RA-muFc 의 발현을 위한 발현 벡터의 구성
사람 IL-22RA 가용성 수용체-muFc 융합(쥐과 감마 2a 중쇄 Fc 영역 (mG2a)에 융합된 IL-22RA의 세포외 도메인 을 함유하는 IL-22RA- C (mG2a)로서 표시됨)을 제조하였다. IL- 22RA-C (mG2a)을 함유하는 발현 플라스미드는 두개의 분리된 DNA 단편 및 발현 벡터 pZMP40를 사용하여 상동 재조합을 통해 구성되었다. IL-22RA (SEQ ID NO: 1), 및 mG2a SEQID NO : 39의 폴리뉴클레오티드 서열의 단편들은 다음의 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭에 의해 발생되었다 : (a) IL-22RA 프라이머s ZC45,593 (SEQ ID NO : 28), 및 ZC45, 592 (SEQ ID NO : 29); 및 (b) mG2a 프라이머s ZC45, 591 (SEQID NO :30), 및 ZC45,594 (SEQ ID NO :31).
제 1 단편은 IL-22RA 세포외 도메인 코딩 영역을 함유하였고, 이것은 IL-22RA 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, SEQ ID NO : 1)을 주형으로서 사용하여 만들어졌다. 제 1 단편은 부분 pZMP40 벡터 서열, IL-22RA 분절, 및 링커 서열 및 부분 mG2a 서열을 함유하는 3'오버랩과 함께 S'오버랩을 포함한다. PCR 조건:1 주기, 94℃, 5 분 ; 35 주기, 94℃,1 분, 이어서 55℃, 2 분, 이어서 72℃, 3 분; 1 주기, 72℃,10 분.
제 2 단편은 링커 서열 및 부분 IL-22RA 서열을 갖는 5'오버랩, mG2a 분절, 및 부분 pZMP40 벡터 서열을 함유하는 3'오버랩을 포함하였다. 쥐과 감마 2a 중쇄 Fc 영역(mG2a) (SEQID NO : 39)은 쥐과 Ig 감마 2a 중쇄cDNA의 클론으로부터 발생되었다. mG2a는 쥐과 면역글로불린 감마 2a 중쇄 일정 영역의 경첩, CH2, 및 CH3 도메인을 함유한다. PCR 조건:1 주기, 94℃, 5 분; 35 주기, 94℃, 1분, 이어서 55℃, 2분, 이어서 72℃, 3분; 1 주기, 72℃, 10분.
PCR 반응 혼합물은 1% 아가로스 겔 위에서 수행되었고 삽입체의 크기에 대응하는 밴드는 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen)을 사용하여 겔-추출되었다.
BglII으로 커팅된 플라스미드 pZMP40를 PCR 삽입 단편의 둘다와 3방식으로 재조합에 사용하였다. 플라스미드 pZMP40는 MPSV 촉진자및 코딩 서열의 삽입을 위한 다중 제한 부위 를 갖는 발현 카세트 ; 복제의 E. coli 기원 ; SV40 촉진자, 인핸서 및 복제의 기원, DHFR 유전자, 및 SV40 종결자를 포함하는 포유동물 선택가능한 마커 발현 유닛; 및 S.cerevisiae에서 선택과 복제에 필요한 URA3 및 CEN-ARS 서열을 함유하는 포유동물 발현 벡터이다. 플라스미드 pZMP40는 몇몇의 제한 효소부위의 폴리링커로의 첨가에 의해 pZMP21로부터 구성되었다(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209, 및 지정된 No. PTA-5266에 기탁됨).
백 마이크로리터의 항체반응을 일으키는 효모균 (S.cerevisiae) 세포를 10μl의 삽입 DNA와 100ng의 절단 pZMP40 벡터와 독립적으로 조합시키고, 혼합물을 0.2-cm 전기천공법 큐벳으로 이동시켰다. 효모균/DNA 혼합물을 0.75 1cV (5 kV/cm),∞ ohms, 및 25 p. F의 전력 공급 세팅을 사용하여 전기펄싱하였다(BioRad Laboratories, Hercules, CA). 600μl의 1.2 M 소르비톨을 큐벳에 첨가하였고, 효모균을 100-μl 및 300ul 분액에서 두개의 URA-D 플레이트 위로 플레이팅하였고 30℃에서 배양하였다. 72 시간 후에, 단일 플레이트로부터 Ura+ 효모균 변형체는 1 ml H2O에 재현탁되었고 간략하게 스핀되어 효모균 세포를 펠릿화하였다. 세포 펠릿은 0.5 ml의 용해 완충액 (2% Triton X-100,1% SDS, 100 mM NaCI, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 재현탁되었다.
5백 마이크로리터의 용해 혼합물을 250μl 산-세척한 글래스 비즈 및 300μl 페놀-클로로포름을 함유하는 Eppendorf로 첨가되었고, 3 분동안 와동최대 속도에서 Eppendorf 원심분리기에서 5 분동안 스피닝하였다. 3백 마이크로리터의 수성상은 신선한 튜브로 이동시키고, DNA는 600μl 에탄올 (EtOH) 및 30μl 3M 나트륨 아세테이트로 침전시키고, 이어서 30 분동안 최대 속도에서 원심분리하였다. 튜브를 가만히 따르고 펠릿을 1 mL의 70% 에탄올으로 세척하였다. 튜브를 가만히 따르고 DNA 펠릿을 30μl TE에서 재현탁하였다.
전기항체반응을 일으키는 E. coli 숙주 세포 (DH12S)의 변형은 5ul 의 효모균 DNA prep 및 50μl 의 세포를 사용하여 수행하였다. 세포는 2.0 kV, 25ssF, 및 400 ohms에서 전기 펄싱하였다. 전기천공법 후에, 1 ml SOC (2%Bacto Tryptone(Difco, Detroit, MI), 0.5% 효모균 추출물 (Difco), 10 mM NaCl, 2.5 mMKC1, 10 mM MgCl2, 10 mMMgS04, 20 mM 글루코스)를 첨가하고 그후 세포를 두개의 LB AMP 플레이트 (LB broth (Lennox), 1.8% BactoTM Agar(Difco), 100 mg/L 암피실린)위에 50μl 및 200μl 분액에서 플레이팅하였다.
구성체에 대한 3개의 클론의 삽입은 서열 분석을 당하고 정확한 서열을 함유하는 각각의 구성체에 대해 하나의 클론이 선택되었다. 더 큰 스케일 플라스미드 DNA를 제조업체의 지시에 따라 시중에서 입수 가능한 키트 (QIAGEN 플라스미드 Mega 키트, Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여, 분리시켰다.
실시예 27
사람 가용성 IL-22RA-muFc 폴리펩티드의 발현 및 정제
3세트의 200μg의 IL-22RA-C (mG2a) 구성체 (실시예 22)를 각각 200 유닛의 Pvu I로 37℃에서 3시간동안 소화시키고 그후 IPA으로 침전시키고 1.5 mL 마이크로퓨지 튜브에서 스펀 다운하였다. 상청액에서 펠릿을 따라버리고, 펠릿을 1 mL의 70% 에탄올로 세척하고 5 분동안 실온에서 배양하였다. 튜브를 마이크로퓨지에서 10 분동안 14,000 RPM에서 스피닝하고 상청액에서 펠릿을 따라버렸다. 펠릿을 그후 무균 환경에서 750μl 의 PF-CHO 배지에서 재현탁하였고, 30 분동안 60℃에서 배양하였다 . 5E6APFDXB11 세포를 각각의 3 튜브에서 스펀 다운하였고 DNA-매질 용액을 사용하여 재현탁하였다. DNA/세포 혼합물을 0.4 cm 갭 큐벳에 넣고 다음의 매개변수를 사용하여 전기천공하였다: 9501F, 높은 전기용량, 및 300 V. 큐벳의 내용물을 그후 제거하고, 모으고, PF-CHO 배지로 25 mLs으로 희석하였고 125 mL 진탕 플라스크에 놓았다. 플라스크를 37℃, 6%CO2에서 교반기위에 배양기에 넣고 120 RPM에서 교반하였다.
세포주는 영양 선택되었고 이어서 l00nM 메토트렉세이트 (MTX)로 , 그후 500nMMTX로, 마지막으로 1μM MTX으로 단계 증폭되었다. 단계 증폭은 이어서 CD8 세포 분류되었다. CD8 세포 분류는 안정한 1μM MTX 증폭된 풀을 취하고 제조업자가 권고한 농도를 사용하여 대략 5E6 세포를 단일클론 FITC 항-CD8 항체로 (BDPharMingen, cat# 30324X) 염색함으로써, 수행되었다. 염색된 세포는 가공하고 FACS Vantage (BD) 흐름 사이토미터에 저장하였다. 세포의 상부 5%는 수집되었고 너무 커버렸다. 발현은 웨스턴 블롯에 의해 확인되었고, 세포주는 스케일 업되고 표준 방법을 사용하여 단백질 정제하였다.
실시예 28
huL22RA-mG2a 로 면역화된 마우스로부터 혈청에 의한 huIL-22RA 의 중화
A. IL-20 및/또는 IL-22의 억제에 대해 시험하기 위한 세포-기반 중화 분석. IL-22RA 와 IL- 20RB (pDIRSI) (BAF/IL-22RA/IL-20RB 세포 ; 실시예 38)으로 공-세포감염된 인저-의존 미리-B 세포주 BaF3 은 IL- 22RA/IL-20RB 수용체에서 IL-20를 대항시킴으로써 항-IL-22RA 항체의 중화 포텐셜을 평가하는데 사용되었다.
유사하게는, IL-22RA 및 IL-1ORB (CRF2-4) (BAF/IL-22RA/CRF2-4 세포; 실시예 2)으로 세포감염된 BaF3은 IL-22RA/IL10RB 수용체위에서 IL-22을 대항시킴으로써, 항-IL-22RA 항체의 중화 포텐셜을 평가하는데 사용되었다. 그것의 각각의 수용체-발현 세포주에서 IL-20 또는 IL22의 존재하에서의 증식 및, 대항제 항체의 존재하에서 그러한 증식의 억제가 실시예 3에서 기술된 바와 같이, 알라마르 블루 분석법을 사용하여 평가되었다. 이들 세포에서 증식의 억제는 이 분석에서 활성을 중화하는 지표이다.
B. 항-IL-22RA 혈청은 세포-기반 중화 분석에서 IL-20과 IL-22 둘다를 중화한다.
실시예 28A에서 기술된 분석을 사용하여, huIL-22RA-muG2a (실시예 30 (A)(1))으로 면역화된 IL-22RA 녹아웃 마우스로부터의 혈청을 1%, 0.5%, 0. 25%, 0.13%, 0.06%, 0.03%, 0.02%, 및 0%에서 연속 희석으로서 첨가하였다. 분석 플레이트는 4일동안 37℃, 5%C02에서 배양되었고 이때 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 20p1/웰에서 첨가하였다. 플레이트는 37℃에서, 5%C02에서 16 시간 동안 다시 배양하였다. 알라마르 블루는 살아있는 세포의 수에 기반한 형광강도측정 판독 을 제공하고, 따라서 음성 대조군에 비해서 세포 증식의 직접적인 측정을 제공한다 . 플레이트는 파장 530 (여기) 및 590 (방출)에서 Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter (Wallac,Turku, Finland)에서 판독되었다. 결과는 모든 7마리의 면역화 동물들로부터 혈청은 huIL-22RA를 통해서 huIL-22과 huIL20 둘다의 신호를 중화시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 1%농도에서, 5마리 동물들로부터 혈청 (16517,16518, 16519,16520, 및 16527)은 더 낮은 농도에서 투여량 의존 형태로 감소하는 증식의 적제와 함께, huIL-22에 의해 유도된 증식을 완전히 중화하였다. 더욱이, 1% 농도에서, 다른 두마리의 동물로부터 혈청(16471 및 16701) 은 더 낮은 농도에서 투여량 의존 형태로 감소하는 증식의 억제와 함께, huIL-22에 의해 유발된 약 90%의 증식을 억제하였다. 유사하게는, 1% 및 0.5% 농도에서, 5마리의 동물로부터의 혈청은 (16517, 16518,16519, 16520, 및 16527) 더 낮은 농도에서 투여량 의존 형태로 감소하는 증식의 억제와 함께, huIL-20에 의해 유도된 증식을 완전히 중화하였다.
더욱이, 1% 농도에서, 동물 16701로부터의 혈청은 더 낮은 농도에서 투여량 의존 형태로 감소하는 증식의 억제와 함께, huIL-20에 의해 유도된 증식을 완전히 중화하였다. 1 % 농도에서, 동물 16471로부터의 혈청은 더 낮은 농도에서 투여량 의존 형태에서 감소하는 증식의 억제와 함께, huIL-20에 유발된 약 95%의 증식을 중화하였다. 따라서, 모든 7 동물로부터의 혈청는 huIL-22RA 수용체를 통해 IL-20 또는 IL-22중의 하나에 의해 유발된 증식을 중화할 수 있다. 이들 결과는 IL-22RA에 대한 항체가 낮은 농도에서 전-염증 리간드, IL-20 andIL-22 의 활성을 실제로 대항할 수 있다는 것을 더욱 증명하였다.
이들 결과는 예를 들어 본 발명의 IL-22RA 에 대한 단일클론 항체를 중화하는 것을 통해, IL-20 또는 IL-22 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 대항 또는 중화(개별적으로 또는 함께)함으로써 IL-22RA 활성을 효과적으로 차단하는 것은, 생체내에서 IL-20 와 IL-22 (단독 또는 함께)의 효과를 줄이는데 유익할 수 있고 예를 들어 건선, EDD9 대장염, 또는 IL-20, 및 또는 IBD, 관절염, 천식, 건선 관절염, 대장염, 염증 피부 상태, 및 아토피 피부염을 포함하는 IL-22에 의해 유도된 다른 염증 질환에서 IL-22-유도된 피부 효과는 물론이고, IL-20-유도된 피부 효과에서 보여진 바와 같이, IL-20 및/또는 IL-22-유발된 염증을 줄일 수 있다는 추가의 증거를 제공하였다.
실시예 29
P815/hIL-22RA 세포의 발생 및 마우스의 면역화
A. P815/hIL-22RA 세포 발생 및 항-hIL-22RA 항체의 발생을 위해 마우스 안으로의 주사 :
WT P815 세포 (ATCC No. TIB-64)는 제조업체의 프로토콜에 따라 Fugene 시약을 사용하여(Roche, Indianapolis, IN), hIL-22RA cDNA 서열 (예를 들어, SEQ ID NO:1) 및 선택가능한 퓨로마이신-저항 마커을 함유하는, 플라스미드 벡터로 세포감염되었다. 세포는 퓨로마이신 선택 하에 놓이고 48 시간 후에 트랜스펙션. 퓨로마이신-저항성 세포감염체는 희석을 제한함으로써 클로닝되었고, 바이오티닐화 사람 IL-22 (huIL-22-바이오틴)을 사용하여, 흐름 혈구계산에 의해, hIL-22RA 세포 표면 발현의 그들의 수준을 스크리닝하였다. 간략하게는, 세포를 30 분동안 얼음 위에서 5 ㎍/ml huIL-22-바이오틴으로 배양하였고 그후 세척하였다. huIL-22-바이오틴의 세포에 대한 결합은 그후 PE-표지화 스트렙타비딘을 사용하여 1:500에서 검출되었다 . 세포를 Cellquest 소프트웨어를 사용하여 Facscan 흐름 혈구계산에서 분석하였다(Becton Dickinson, San Jose, CA).
선택된 P815/IL-22RA 세포 클론을 성장시키고 그후 주사를 위해 수확하였다. 세포를 수집하고, PBS에서 3회 세척하고, 카운트하고, 밀리리터당 1x108 세포에서 재현탁하였고 10,000 rads로 조사하였다. 세포 현탁액은 그후 1ml 주사기로 이동시키고, 내부-복막 경로에 의해 DBA/2 마우스 안으로 주사되었다. 마우스는 동일한 방식으로 3 주 후에 증가되었고 혈청을 hIL-22RA 세포감염체 세포주로의 결합을 위해 스크리닝하였다. 간략하게는, 혈청을 Facs 완충액 (HBSS, 2% BSA,. 02%NaN3)안에서 1: 100로 희석하고, 그후 Fc-블록화 293 사람 신장 세포 과발현하는hIL-22RA으로 배양하였다. 항-IL-22RA 항체의 세포로의 결합은 그후 1:200로 희석된 플루오레세인-접합된 염소-항-Mouse IgG을 사용하여 검출되었다.(Southern Biotech, Birmingham, AL) 세포를 이전에 기술된 바와 같이 분석하였다. 마우스를 총 3 회 이상 다시 증가시키고 혈청은 기술된 바와 같이 스크리닝하였다. 2마리 마우스를 hIL-22RA 세포감염체에 결합하는 그들의 혈청의 수준에 기반하여, 단일클론 항체 (실시예 25)의 발생을 위한 업계에서의 표준 방법을 사용하여, 하이브리도마 융합을 위해 선택하였다.
상기 방법은 또한 헤테로다이머 IL-22RA 수용체를 발현하는 P815 세포는, 이를테면 IL-22RA/CRF2-4 (P815/ IL-22RA/CRF2-4 세포), IL-22RA/pDIRS1 (P815/IL-22RA/pDIRS1 세포), 또는 IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1 (P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1 세포), 예를 들면 IL-22RA 및 IL-22RA-포함 헤테로다이머 수용체에 대하여 단일클론 항체의 발생을 위한 마우스를 면역화하기 위해, 사용된다.
실시예 30
쥐과 항-사람 IL-22RA (IL-22RA) mAbs의 발생
A. 항-IL-22RA 항체의 생성을 위한 면역화:
(1) 가용성 IL-22RA-muFc를 사용
6 내지 12주령 IL-22RA 녹아웃 마우스 (실시예 26)를 격주 스케줄로 Ribi 보조제 (Sigma)와 혼합된 1:1 (v:v) 25-50 ug의 가용성 사람 IL-22RA-muFc 단백질 (실시예 23)로 복막내 주사에 의해 면역화하였다. 3번째 면역화 후 7 내지 10일, 혈액 샘플은 후방안화 출혈을 통해 취해지고, 혈청을 수확하고 중화 분석 (예를 들어, 본원에서)에서 IL-22 또는 IL-20와 IL-22 둘다를 IL-22RA에 결합을 억제하고 FACS 착색 검정법으로 IL-22RA 세포감염된 대 세포감염되지 않은 293 세포를 착색하는 능력에 대해 평가되었다. 마우스는 계속해서 면역화하고 혈액 샘플을 취하고 중화 적정농도가 고원에 도달할때까지 위에서 기술된 바와 같이 평가하였다. 그때, 가장 높은 중화 적정농도를 갖는 마우스는 25-50 ug의 PBS중의 가용성IL-22RA-Fc 단백질로 혈관내로 주사되었다. 3일 후에, 이들 마우스로부터 예를 들어 마우스 골수종 (P3-X63-Ag8.653. 3.12. 11) 세포 또는 다른 적절한 세포주를 사용하여, 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 (예를 들어, Kearney, J. F. et al.,JInamufaol. 123:1548-50, 1979; 및 Lane, R.D.Jimmunol Methods 81: 223-8,1985 참조) 비장과 림프절은 하이브리도마 생성을 위해 수확되고 사용되었다.
(2) IL-22RA수용체를 발현하는 P815 세포감염체를 사용함.
6 내지 10주령 암컷 DBA/2 마우스는 1 x105 살이있는, 세포감염된 P815 세포, 예를 들어 P815/IL- 22RA 세포, P815/IL-22RA/CRF2-4,P815/IL-22RA/pDIRSl 또는 P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRSl 세포 (실시예 24) (예를 들어, 2 x105 세포/ml의 세포 밀도에서 0.5 ml)의 복막내 주사에 의해 면역화된다. 주사하기 전에, 세포는 기하급수적인 성장 상태에서 유지한다. 주사를 위해서 세포를 수확하고, PBS로 3회 세척하고 그후 PBS에 2 x 105 세포/ml의 밀도로 재현탁하였다. 이 모델에서, 마우스는 2-3 주내에 복수 종양으로 발전되고 세포감염된 표적 항원에 대한 면역 반응이 시작되지 않으면, 4-6 주까지 죽음으로 진행된다. 명백한 복부 팽창 (복수의 지표)이 없는 3마리 주 마우스에서 2-3 주 간격으로 상기와 같이 재-면역화한다. 제 2 면역화후 7 내지 10일에, 혈액 샘플을 후방안와를 통해 취하고, 혈청을 수확하고 중화 검정 (예를 들어, 본원에서 기술됨) IL-22 또는 IL-20와 IL-22둘다를 IL-22RA에의 결합을 억제하고 FACS 착색 검정법에서 IL-22RA 세포감염된 대 세포감염되지 않은 293 세포를 염색하는 능력을 평가하였다.
마우스는 계속해서 면역화하고 혈액 샘플을 취하고 위에서 기술된 바와 같이 중화 적정농도가 고원에 도달할때까지 평가한다. 그때, 가장 높은 중화 적정농도를 갖는 마우스는 1 x105 살아있는 세포감염된 P815 세포로 복막내 주사되었다. 4 일 후에, 예를 들어 마우스 골수종(P3-X63- Ag8.653. 3.12.11) 세포 또는 업계에서 다른 적절한 세포주를 사용하여, 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 (예를 들어, Kearney, J. F. et al., 상기 ; 및 Lane, R. D.상기 참조) 이들 마우스로부터 비장 및 림프절을 수확하고 하이브리도마 발생에 사용된다.
살아있는, 세포감염된P815 세포로의 상기 면역화 계획안에 대한 대안은 매 2-3 주에 1-5 x106 조사된, 세포감염된 세포의 복막내 주사를 수반한다. 이러한 접근에서, 어떤 동물도 복수로 발전되고 죽지않는다. 대신에, 동물은 위에서 약술한 바와 같이, 제 2 면역화 후에 출혈로 시작하여, 그들의 혈청에서 IL-22RA에 대한 면역 반응을 중화하기 위해 모니터링된다. 일단 중화 적정농도는 최대 수준에 도달하였고, 가장높은 적정농도를 갖는 마우스에는 미리-융합, 복막내 주사 of 5 x106 조사된 세포가 주어지고 4일 후에, 예를 들어 당업계에서 마우스 골수종 (P3-X63-Ag8. 653. 3. 12.11) 세포 또는 다른 적절한 세포주를 사용하여, 당업계에서 공지된 표준 방법을 사용하여 (예를 들어, Kearney, J. F. et al., 상기 ; 및 Lane, R. D. 상기), 이들 마우스로부터 비장과 림프절은 수확되고 하이브리도마 발생을 위해 사용된다.
B. IL-22RA를 결합하고 IL-22의 IL-22RA로의 결합을 억제하는 항체를 위해 하이브리도마 융합을 스크리닝 :
융합후 8-10일째에 하이브리도마 상청액위에서 두개의 다른 일차 스크린을 수행하였다. 제 1 검정법을 위해, 상청액중의 항체는 결합된 마우스 항체를 확인하기 위해, HRP-접합된 염소 항-마우스 카파 및 항-람다 광 사슬 두번째 단계 시약을 사용하여 ELISA에 의해, 결합된 가용성 사람IL-22RA-muFc 단백질을 플레이팅하는 그들의 능력을 테스트하엿다. IL-22RA-muFc 단백질의 IL-22RA 부분에 대한 특이성을 증명하기 위해, 초기 분석에서 동일한 쥐과 Fc 영역 (mG2a)에 융합된 부적절한 단백질 위에서 양성 상청액이 평가되었다. 그러한 상청액중의 항체는 IL-22RA-muFc에 결합되고 융합 단백질을 함유하는 부적절한 muFc는 IL-22RA에 특이성으로 간주되지 않았다. 두번째 분석을 위해서, 모든 하이브리도마 상청액 중의 항체는 결합된 IL-22RA-muFc를 플레이팅하기 위해 바이오티닐화 사람IL-22의 결합을 억제하는 그들의 능력에 대해 ELISA에 의해 평가되었다.
IL-22RA에 특이적으로 결합한 항체를 함유하는 모든 상청액은, IL-22의 IL-22RA로의 결합을 억제하거나 또는 ELISA 분석에서 그렇지 않든, (및 동시에 일어나는 전-증식 효과) 각각 IL-20 또는 IL-22의 IL-22RA/IL-20RB 및 IL-22RA/CRF2-4 세포감염된 Baf3 세포로의 결합을 억제하는 그들의 능력에 대해 이어서 시험하였다.
IL-22 억제 분석 또는 IL-20와 IL-22 억제검정 둘다에서 중화 양성인 모든 상청액은 FACS 분석에 의해 IL-22RA 세포감염된 대 세포감염되지 않은 Baf3 세포를 착색하는 능력에 대해 평가되었다.
이 분석은 IL-22 결합의 IL-22RA/CRF2-4의 억제, 또는 IL-22RA/IL- 20RB에의 IL-20 결합는 실제로 IL-22RA 수용체를 특히 결합하는 항체 때문이라는 것을 확인하기 위해 설계되었다. 추가적으로, FACS 분석은 항-IgG 두번째 단계 시약으로 수행되기 때문에, 특이적인 FACS 양성 결과는 중화하는 항체가 IgG 계층이 될 것 같았다는 것을 암시한다. 이들 수단에 의해서, 마스터 웰은 플레이트 결합된 ELISA에서 결합된 IL-22RA는, ELISA 기반 억제분석에서 IL-22의 IL-22RA로의 결합을 억제하고, IL-20와 IL-22의 IL-22RA/IL-20RB 및 IL-22RA/CRF2-4 세포감염된 Baf3 세포 (실시예 28)와의 상호작용을 각각 차단하고, IL-22RA/IL-20RB 및 IL-22RA/CRF2-4 세포감염된 Baf3 세포 둘다의 항-마우스 IgG 두번째 단계 시약으로의 착색에 대해 강하게 양성이었다는 것이 확인되었다.
D. 하이브리도마를 제조하는 항-IL-22RA 특이적인 항체 클로닝:
IL-20 및 IL-22의 적절하게 세포감염된 BaF3 세포로의 결합을 교차중화한 항-IL-22RA mAb를 제조하는 하이브리도마는 표준 저-밀도 희석 (웰당 1 세포 미만) 접근에 의해 클로닝되었다. 대략 플레이팅 5-7 일 후에, 클론은 플레이트 결합된 사람 IL-22RA- muFc 에서 ELISA에 의해 스크리닝되었고 이어서 위에서 기술한 바와 같은 융합 단백질을 함유하는 부적절한 muFc에서 ELISA에 의해 양성 웰의 재시험하였다. 상청액이 IL- 22RA-muFc에 결합되고 융합 단백질을 함유하는 부적절한 muFc에는 결합되지 않은 선택된 클론은, FACS 분석은 물론이고 중화 검정 모두를 반복함으로써 특이적인 항체 활성에 대해 더욱 확인되었다. 모든 선택된 IL-22RA 항체 양성 클론은 최소 2번 클로닝되어 클론성을 확보하고 항체 제조의 안정성을 평가하는 것을 돕는다. 클로닝의 더 나아간 라운드를 수행하였고 바람직하게는, 적어도 95%의 결과의 클론이 항-IL-22RA 항체 제조를 중성화하는데 양성일때까지 스크리닝하였다.
E. 항-IL-22RA mAbs에 의해 인정된 분자의 생화학적 특성화 :
추정되는 항-IL-22RA mAbs에 의해 인정된, 표적 분자, IL-22RA가 실제로 IL-22RA인 생화학적 확증은 표준 면역침강 이어서 SDS-PAGE 분석 또는 웨스턴 블로팅 과정에 의해 수행되었고, 둘다 IL-22RA 세포감염된 대 세포감염되지 않은 Baf3 세포로부터 가용성 막 제조를 채용한다. 더욱이, IL-22RA를 발현하는 비-세포감염된 세포주의 가용성 막 제조는 mAbs가 세포감염된 것은 물론이고 본래 타고난 수용체 사슬을 인정한다는 것을 보여주는데 사용된다. 대안으로서, mAbs는 그들이 특이적으로 가용성 IL-22RA- muFc 단백질을 면역침강하거나 웨스턴 블롯할수 있는 능력에 대해 시험된다.
실시예 31
huL22RA로 세포감염된 P815 세포가 주사된 마우스로부터의 혈청에 의한 huL22RA의 중화
실시예 28에 기술된 세포 기반 중화 분석을 사용하여, 살아있는 huIL-22RA 세포감염된 P815 세포가 주사된 마우스로부터 혈청(실시예 30. A. 2)은 1%, 0.5%, 0.25%, 0.13%, 0.06%, 0.03%, 0.02%, 및 0%에서 연속 희석으로서 첨가되었다. 분석 플레이트를 37℃에서 5%C02에서 4일동안 배양하였고 그때 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 20μl/웰 첨가하였다. 플레이트는 37℃, 5% C02에서 16 시간동안 다시 배양하였다. 결과는 4 마리의 동물로부터의 혈청은 huIL-22RA을 통해 huIL-22과 huIL20 둘다의 신호를 중화할 수 있다는 것을 보여주었다.
1% 농도에서, 6 동물로부터의 혈청은 (7125,7127, 7128, 7118,7124 및 7117)은 huIL-22에 의해 유도된 증식의 50% 과 80% 사이에서 중화되었고, 더 낮은 농도에서 투여량 의존 형태로 감소하는 증식의 억제를 가졌다. 더욱이, 1 % 농도에서, 4 동물로부터의 혈청(7125,7127, 7118, 및 7117)은 huIL20에 의해 유도된 증식의 40% 과 70% 사이에서 중화하였고, 더 낮은 농도에서 투여량 의존 형태로 감소하는 증식의 억제를 가졌다. 이들 결과는 IL-22RA에 대한 항체는 실제로 낮은 농도에서 전-염증 리간드, IL-20 및 IL-22의 활성을 대항할 수 있다는 것을 더욱 증명하였다.
이들 결과는 예를 들어 본 발명의 IL-22RA에 대한 단일클론 항체의 중화를 통해, IL-20 또는 IL-22 활성 (개별적으로 또는 함께)을 결합하고, 차단하고, 억제하고, 감소하고, 대항하고 또는 중화함으로써 IL- 22RA 활성을 효과적으로 차단하는 것은, 생체내에서 IL-20 및 IL-22 (단독 또는 함께)의 효과를 줄이는데 유리할 수 있고, 예를 들어 건선, IBD, 대장염, 또는 IBD, 관절염, 천식, 건선 관절염, 대장염, 염증 피부 조건, 및 아토피 피부염을 포함하는 IL-20, 및 또는 IL-22에 의해 유발된 다른 염증 질환과 같이, IL-20 및/또는IL-22-유도된 염증, 이를테면 IL-22-유도된 피부 효과는 물론이고, IL-20-유도된 피부 효과에서 나타난 것과 같은 질환을 줄일 수 있다는 추가의 증거를 제공하였다.
실시예 32
IL-22R A 녹아웃 마우스의 표현형
A. 유전자 변형을 갖는 마우스의 발생
1. 신생아 광택으로 쥐과 IL-20 을 발현하는 트랜스제닉 마우스의 발생
a). K14 촉진자로부터 쥐과 IL-20을 발현하기 위한 구성체.
생체내에서 IL-20의 생물학적 기능을 연구하기 위해서, 트랜스제닉 구성체 를 만들었고, 이때 쥐과 IL-20은 사람K14 촉진자에 의해 추진되었다 (또한, 실시예 21 참조). 올리고뉴클레오티드는 교감 Kozak 서열 및 쥐과IL-20 코딩 영역을 함유하는 PCR 단편을 발생하기 위해 설계되었다. 이들 올리고뉴클레오티드는 5'말단부에서 FseI 부위와 3' 말단부에서 AscI 부위와 함께 설계되되어, 사람 케라티노사이트 및 상피 세포-특이성 촉진자를 함유하는 RSK14, 표준 트랜스제닉 벡터로 클로닝하는 것을 촉진한다.
PCR 반응은 약 200 ng 쥐과IL-20 주형 (SEQID NO : 33) 및 IL-20 (SEQED NO : 34)의 전장을 증폭하기 위해 설계된 올리고뉴클레오티드와 함께 수행되었다.
PCR 반응 조건은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정되었다. PCR 생성물은 아가로스 겔 전기이동에 의해 분리되었고 aQiaQuielCm (Qiagen) 겔 추출 키트를 사용하여 정제되었다. 분리된, 정확한 크기의 DNA 단편을 seI 및 AscI(Boerhinger-Mannheim)으로 소화시키고, 에탄올 침전시켰고 이전에 FseI 및 AscI으로 소화되었다. pRSK14으로 결찰하였다. 트랜스제닉 마우스에서 케라티노사이트와 상피에서 관심의 유전자를 발현하기 위해 설계된, pRSK14 플라스미드는 약 3 Kb 사람 케라틴 특이적인 K14 촉진자에 의해 플랭크된 발현 카세트를 함유한다.
결찰 반응의 약 1 마이크로리터를 제조업체의 지시에 따라 DH1OB ElectroMaxTM 항체반응을 일으키는 세포(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)안으로 전기천공시켰고 100μg/ml 암피실린을 함유하는 LB 플레이트 위로 플레이팅시켰고 밤새 배양하엿다. 콜로니를 고르고 100μg/ml 암피실린을 함유하는 inLB 배지에서 성장시켰다.
Miniprep DNA을 선택된 클론으로부터 제조하였고 Fsel 및 AscI 조합된 제한 소화에 의해 쥐과IL-20 삽입체에 대해 스크리닝되었고, 이어지는 아가로스 겔 전기이동하였다. 정확한 cDNA 삽입을 갖는 TG 구성체는 염기순서분석에 의해 확인되었다. 정확한 pRSK14-쥐과 IL-20의 Maxipreps를 수행하였다.
b) K14 IL-20 트랜스제닉 마우스의 발생 및 특성화.
길이가 약 4Kb 의 NotI 단편을 케라틴 특이적인 K14 촉진자의 5'및 3'프랭킹 서열, 마우스 IL-20 (SEQID NO : 34에 나타낸 SEQID NO : 33; 폴리펩티드), Gormon 인트론, IL-20 cDNA 및 사람 성장 호르몬 폴리A 신호 서열을 함유하는 트랜스제닉 (TG) 벡터로부터 분리시켰다. 그것을 수태시킨 B6C3fl (Taconic, Gennantown, NY) 쥐과 난모세포 안으로 마이크로주사하기 위해 사용하였다.
트랜스제닉 마우스의 마이크로주사 및 제조는 Hogan, B. et al. Manipulating the 마우스 태아,2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994에 기술된 바와 같이 제조되었다.
TaqManTM RT-PCR 반응을 사용하여 트랜스유전자의 사람 성장 호르몬 폴리A 신호 부분에 특이적인 PCR 프라이머를 사용함으로써 TG RNA의 발현을 정량하였다.
IL-20를 발현하는 모든 TG 구성체는 높은 비율의 paranatal 사망률을 나타내고, 전형적으로 태어난 TG 마우스는 "반들반들한" 표현형을 나타낸다. 마치 그들이 건조된 것처럼, 신생아 마우스의 반들반들한 외양은 피부의 딱딱함과 연관된 것으로 보였고, 적절한 간호의 감소를 초래한다. 그들의 움직임은 일반적으로 딱딱해진다. 조직병리학적으로 반들반들한 마우스는 두꺼워진 표피를 가지고 케라틴 층은 조밀하였다. 이들 반들반들한 설립자 마우스의 대부분은 첫 5 일내에 죽었고, 생존하는 이유된 마우스는 일반적으로 트랜스유전자 (전사 분석 당)을 발현하지 않고, 또는 그들은 키메릭이었다 (자손에 대한 트랜스유전자의 낮은 전달 당).
K14 촉진자에 의해 추진된, 쥐과 IL-20를 발현하는 하나의 선이 성립되었다. 피부와 흉선에서 발현 수준이 낮고, 모든 신생아는 반들반들한 표현형을 갖고 태어낫다. 일반적으로 이 선은 20% TG 새끼를 가졌고, 트랜스제닉 마우스의 50-60%가 인 유테로(in utero) 죽는다는 것을 나타낸다. (새끼의 반접합 교배 50% 은 TG가 되어야 한다.)
2. 제거된 IL-22RA 발현을 갖는 마우스의 발생; IL-22RA 녹아웃 마우스
a). 쥐과 IL-22RA 에 대한 IElockout (KO) 구성체의 발생
생체내에서 IL-22RA 의 생물학적 기능을 더욱 연구하기 위해서, 마우스 녹아웃(KO) 계통이 생성되어 IL-22RA 발현을 제거하였다. 먼저, 마우스 IL- 22RA cDNA 프로브가 사용되어 마우스 129/SvJ 게놈 BAC 라이브러리를 스크리닝하였다.
IL-22RA 게놈 유전자좌를 함유하는 클론은 확인되었고 특성화되었다. 쥐과 IL-22RA 폴리뉴클레오티드는 SEQID NO : 41에 나타나고 폴리펩티드는 SEQID NO : 42에 나타난다.
IL-22RA의 제거를 위해 녹아웃 구성체를 생성하기 위해, ET 클로닝 기술을 사용함으로써 녹아웃 벡터가 만들어졌다(Zhang et al.1998. A new logic for DNA engineering using recombination in E. coli. Nat. Genet. Vol. 20: 123-8).
간략하게는, KO 벡터는 IL-22RA 유전자의 1.8 kb5'ann (짧은 어깨), IRES-LacZ/MClneo 선택가능한 마커, 및 10 Kb3'arm (긴 어깨)를 함유한다. KO 벡터에서, IL-22RA 게놈 서열의 인트론 2 및 3는 물론이고, 엑손 2,3 및 4 는 ES 세포에서 상동 재조합에 의해 약 4.4 Kb의 결손이 발생되도록, IRES-LacZ/MClneo 선택가능한 마커에 의해 대체가능하였다.
제한 효소 PmeI에 의한 KO 벡터의 선형화, 그것은 129/SvJ ES 세포 안으로 전기천공되었다. 재조합 ES 클론의 확인은 물론이고 상동 재조합 사건의 선택은, Robertson, E. J. et al. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach,2nd ed., IRL Press Limited, Oxford, 1987.b)에서 기술된 바와 같이 수행되었다.
b) 제거된IL-22RA 발현을 갖는 마우스의 생성 및 분석.
IL- 22RA 게놈 유전자좌의 엑손 2-4 과 인트론 2-3의 결손이 일어나는 양성 ES 클론이 확장되었다. 그들은 C57B1/6j 마우스의 배반포 안으로 주입되었다. 주사된 배반포의 간략한 재-팽창 후에, 그들은 거짓-임신 육성 어미 안으로 도입되어 키메라를 생성한다. 돌연변이된 IL-22-RA의 배반포 주사, 키메라 출혈 및 이어지는 생식 계열 전달은 Robertson, E. J. et al.Teratocarcinomas and 태아 Stem 세포: A Practical Approach,2"d ed. , IRL Press Limited, Oxford, 1987에서 기술된 바와 같이 수행되었다.
KO 돌연변이체 마우스는 PCR 유전자형 전략에 의해 확인되었다. 3개 PCR 프라이머, ZC22901 (SEQID NO :35)ZC45039 ((SEQ ID NO : 36), ZC38573 (SEQ ID NO : 37)를 다중x PCR 반응에 사용하여 야생형 대립 유전자 및 돌연변이체 대립 유전자를 검출하였다. 야생형 (WT) 대립 유전자는 길이가 229 bp의 DNA 단편을 산출하고, 한편 돌연변이체 대립 유전자는 길이가 371 bp의 DNA 단편을 산출한다.
반접합체 마우스의 접합은 정상 성비는 물론이고, 동형접합체 (HOM), 이형접합체 (Het), 및 야생형 (WT) 새끼의 정상 비를 생산한다. PhysioScreen (체중 수집, 조직 중량, 완전 혈액 카운트 (CBC), 임상 화학, 총체의 관찰, 및 조직병리학)을 통해 마우스를 검사하면 HOM, Het, 및 WT 동물 사이에 명백한 차이가 없다.
B. IL-22RA는 IL-22 유발된 SAA를 위해 필요하였다 : IL-22에 의해 유발된 SAA 발현을 나타내는 SAA ELISA 은 IL-22RA 녹아웃 마우스에 존재하였다:
IL-22로 주사된 마우스에서 IL-22RA가 SAA 유도에 필요한지 여부를 평가하기 위해서, IL-22RA KO 마우스는 5ug IL-22로 주사하고 6시간 후에 출혈하였다.
제조업체의 지시에 따라서, 마우스 SAA 면역분석 키트 (BioSource International, California)를 사용하여 1: 1000으로 희석된 혈청으로, 혈청 샘플에서 SAA 수준을 결정하기 위한 Elisa를 수행하였다.
5중의 4 WT 마우스는 IL-22 주사에 반응하여, 상승된 SAA 수준을 나타낸 반면, 5중의 4 HOM IL-22RA KO 마우스는 SAA의 기초 수준을 나타냈다. 시험된 Het IL-22RA KO 마우스 둘다는 상승된 SAA 수준을 가졌지만, 상승된 WT 마우스에서의 SAA 수준보다 더 낮았다. 이는 IL-22에 의해 SAA의 유도에 IL-22RA 가 필요했다는 것을 나타낸다.
이들 결과는 예를 들어 IL-22RA 유전자 녹아웃을 통해서 또는 유사하게 본 발명의 IL-22RA 에 대한 단일클론 항체를 중화하는 것을 통해서, 효과적으로 IL-22RA 활성을 차단하는 것은, 유사하게 예를 들어 건선, IBD, 대장염, 내독혈증, 또는 IL-22에 의해 유발된 다른 염증 질환에서 IL- 22-유도된 염증을 감소시킨다는 증거를 제공하였다.
C.IL-22는 IL-22 유도된 상피 비후에 필요하였다 : 삼투 미니-펌프 이식된 피하를 통해 IL-22 순수 단백질을 투여하는 것은 IL-22R KO 마우스에서 표피의 비후를 초래하지 않는다.
IL-22RA가 IL-22 유도된 상피 비후에 대해 필요한지 여부를 평가하기 위해, IL-22를 삼투 미니-펌프를 통해서 피하로 IL-22RA HOM 및 WT KO 마우스에 투여하였다. 펌프는 IL-22를 7일동안 하루에 18.4 μL 의 속도로 전달하였다. 4 HOM 및 6 WT IL-22RA KO 마우스는 IL-22 단백질을 받앗고, 3 HOM 및 1 WT는 PBS를 받았다.
IL-22 처리된 마우스로부터의 혈청 샘플은 IL-22의 존재를 확인하기 위해서 BaF3 증식 분석에서 테스트되었다. IL- 22RA 및 CRF2-4로 세포감염된 BaF3 세포 는 IL-22 또는 쥐과 IL3 중의 하나의 존재하에서 증식하는 것이 필요하다.
이들 세포는 스펀 다운하였고 mIL-3 (10% 열-활성화 태아 송아지 혈청, 2mML-glutaMax-l (Gibco BRL), 1 mM 나트륨 Pyruvate (Gibco BRL), 및 PSN 항biotics (GIBCO BRL)) (이후에 "mIL-3 없는 배지"라 부름)으로 보충된 RPMI 배지(JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS)없이, 완전 배지에서 세척되었다. 세포는 스피닝되었고 3회 세척되어 mIL-3를 확실히 제거하였다.
세포는 그후 헤마사이토미터에서 카운팅되었고 mIL-3 없는 배지를 사용하여 웰당 200 ul의 최종 부피로 웰당 5000 세포에서 96-웰 포맷에서 플레이팅되었다 . 마우스 혈청이 1%, 0.5%, 0.25% 또는 0.125%에서 웰에 존재하였다. 분석 플레이트는 37℃, 5% C02에서 3일동안 배양하였고 그때 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 20μl/웰에서 첨가하였다. 플레이트는 37℃, 5%C02에서 24 시간동안 다시 배양하였다. 알라마르 블루는 살아있는 세포의 수에 기반하여, 형광강도측정 판독을 제공하고 따라서 음성 대조군에 비해서, 세포 증식의 직접적인 측정이었다.
플레이트는 다시 37℃에서, 5% C02에서 24 시간동안 배양되었다. 플레이트는 파장 530 (여기) 및 590 (방출)에서 Wallac Victor 2 1420 Multilabel Counter (Wallac,Turku, Finland) 에서 판독되었다. 결과는 PBS에 대한 것은 없었고 주사된 동물은 IL-22 활성을 가진 반면, 1 Het 동물의 1, 4 HOM 동물의 2, 및 6 WT 동물 중의 3은 검출가능한 IL-22 활성을 가졌다. 이 혈청에 의해 유도된 증식은 1μg/ml IL-22BP의 존재에 의해 차단되었고, 그것이 IL-22 특이적이었다는 것을 입증한다.
IL-22 처리되고 미처리된 IL-22RA HOM 및 Het 녹아웃 (KO) 및 WT 대조군 마우스로부터 피부 샘플은 10% 완충화 포르말린에 담가 고정하였다. 조직을 손질하고 파라핀에 파묻고, 일상적으로 가공되고, 5μm에서 섹션하고 (Jung 2065 Supercut microtome, Leica Microsystems, Wetzlar, Ger많은) H & E으로 착색된다. 착색된 조직은 ACVP 널리 인정된 수의학 병리학자에 의해 광 마이크로소프트 하에서 평가되었다(Nikon Eclipse E600, Nikon Inc., Melville, NY).
피하조직에서 펌프 이식 부위를 경계하는 조직에서의 염증의 심각도에 대해서 각각의 피부 샘플을 0 (없음) 내지 4 (심함) 스케일로, 상피 비후 (가시세포증)의 범위에 대해서 0 (없음) 내지 3 (확산함) 스케일로 평가하였고, 표피의 가장 두꺼운 부분에서 상피층의 수를 세었다. HOM 마우스와 PBS를 주어진 WT 마우스 사이에서 차이가 발견되지 않았다. 이들 두 그룹으로부터의 결과를 한 PBS 그룹으로 모았다. 평균과 표준 편차를 각각의 처리 그룹에 대해서 결정하였고 하기 표 14 에 나타낸다.
[표 14]
Figure pat00014
결과는 IL-22 처리된 WT 마우스에서 증가된 상피 두께와 가시세포증과, IL-22에 노출될때의 IL-22RA HOM 마우스에서 줄어든 상피 두께와 가시세포증 쪽으로의 경향을 나타냈다.
이들 결과는 예를 들어 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-22에 의해 유발된 다른 염증 질환에서, 예를 들어 IL-22RA 유전자 녹아웃을 통해 또는 유사하게는 본 발명의 IL-22RA으로 단일클론 항체를 중화하는 것을 통해 IL-22RA 활성을 효과적으로 차단하는 것은 유사하게 IL-22-유도된 피부 효과를 줄일 것이라는 증거를 제공한다.
D. 신생아 마우스 피부의 IL -20 유도된 광택을 위해 IL -22 RA 가 필요하였다: IL-22 : RA KO 마우스와 함께 마린 I : L-20 을 발현하는 트랜스제닉 마우스의 교차출혈은 윤이 나지 않는 트랜스제닉 마우스를 생산한다.
IL-22RA 가 신생아 TG 마우스의 IL-20 유도된 광택에 대해 필요한지 여부를 평가하기 위해, K14 muIL-20 트랜스유전자는 IL-22RA KO 라인 안으로 크로스되었고, 신생아는 반들반들한 표현형에 대해 관찰되었다.
69 마우스가 Mendelian 유전자형 비를 가지고 태어났다. Het KO 배경위의 모든 TG는 반들반들한 반면, 비-TG의 어느것도, HOM KO 배경위의 TG 의 어느것도 반들반들하지 않았다.
IL-20RA 및 IL-20RB을 발현하는 BaF3 세포를 사용하는 알라마르 블루 증식 분석을 수행하여 마우스 혈청에서 IL-20의 존재를 평가하였다. 이들 세포는 IL-20 또는 쥐과IL3 중의 하나에 반응하여 증식할 것이다. 과정은 상기 섹션 C에서 기술된 것과 동일하였다. 분석의 결과는 모든 TG 마우스는 유사한 IL-20 활성을 가졌고, C57BL/6N 배경에서 IL-20 TG와 동일한 수준에 있었다는 것을 보여주었다. 어떠한 반들반들한 신생아 표현형의 부재는 마른 신생아 표현형이 IL-22RA의 존재에 의존한다는 것을 암시한다. 증식 분석은 모든 TG 마우스가 유사한IL-20 활성을 가졌고, C57BL/6N 배경에서 IL-20 TG 와 동일한 수준에 있다는 것을 보여주었다. 어떠한 반들반들한 신생아 표현형의 부재는 마른 신생아 표현형이 IL-22RA의 존재에 의존하였다는 것을 암시한다.
산후 3일째에, IL-22RA KO 배경에서 K14 muIL-20 TG을 함유하는 한배 새끼로부터의 마우스는 인도적으로 안락사시키고 10% 완충화 포르말린에 전신 담금 고정하였다. 고정된 조직은 흉부와 복부의 단면으로 다듬고, 파라핀에 깊이 묻고, 일상적으로 가공하고, 5 um에서 절개하고(Jung 2065Supercut microtome, Leica Microsystems, Wetzlar, Ger많은) H & E로 착색하였다. 착색된 조직을 ACVP 관청 공인된 수의학 병리학자에 의해 블라인드 형태로 광 현미경하에서 평가하엿다 (Nikon Eclipse E600, Nikon Inc. , Melville, NY). 조직 비정상이 나타났고 상피 층의 개수는 등(척추) 앞 흉부의 표피에서 세었다.
HOM IL-22RA KO 배경(IL-20TG/IL-22RA KO HOM)에서 3마리 IL-20TG 및 IL-22 RRA HOM KO 배경 (비-TG/BL-22RA KO HOM) 에서 3마리 비-TG 마우스로부터의 조직을 현미경으로 검사하였고 비정상을 함유하지 않는 것을 발견하였다.
Het IL-22RA KO 배경 (IL-20TG/IL-22RA KO Het) 마우스에서 2 L-20 TG 으로부터의 조직을 또한 검사하였다. 표피에서 상피 층의 수는 모든 동물에서 유사하였다. 그러나, 2마리의 IL-20 TG/IL-22RA KO Het 마우스의 표피는 다른 동물과 비교할때 호산구증가였고 과립층에서 입도의 손실을 나타냈다. 다른 비정상은 어떠한 마우스의 피부 또는 다른 조직에서 뚜렷하지 않았다.
이들 결과는 효과적으로 IL-22RA 활성을 차단하는 것은, 예를 들어 IL-22RA 유전자 녹아웃을 통해 또는 유사하게는 본 발명의 IL-22RA으로 단일클론 항체를 중화하는 것을 통해, IBD, 관절염, 천식, 건선 관절염, 대장염, 염증 피부 조건, 및 아토피 피부염을 포함하여, IL-22-유도된 피부 효과, 예를 들어 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-20, 및 또는 IL-22에 의해 유발된 다른 염증 질환은 물론이고, IL- 20-유도된 피부 효과를 유사하게 줄일 것이라는 증거를 제공한다.
실시예 33
IL-22RA 녹아웃 마우스의 조직형태학적 이미지 분석
kl4 IL-20 m 트랜스제닉 (TG) 마우스의 라인이 성립되었고, TG 신생아는 반들반들한 표현형을 나타낸다. 트랜스유전자는 kl4 촉진자에 의해 표현되고, 이것은 피부에서 케라틴 제조 세포에 대해 발현을 지시한다. IL-22RA 녹아웃 (KO) 마우스의 라인은 또한 성립되었고, 유의한 변화는 능력이 있는 마우스에서 관찰되지 않았다. 두개의 라인이 서로 교차하였고 다음 4개의 다른 유전자형을 갖는 신생아가 수집되었다: (1) TG/- HOM : IL-22RA 를 발현하지 않는 배경에서 kl4IL-20m 트랜스유전자를 발현함;
(2) TG/-Het: IL-22RA 유전자의 하나의 카피로부터 일부 IL-22RA를 발현하는 배경에서 kl4IL-20m 트랜스유전자를 발현함 ;
(3)WT/HOM : IL-22RA을 발현하지 않는 배경에서 kl4 IL-20 m 트랜스유전자 를 발현하지 않음; 및
(4) WT/Het: IL-22RA 유전자의 하나의 카피로부터 일부 IL-22RA 를 발현하는 배경에서 kl4 IL-20 m 트랜스유전자를 발현하지 않음.
이들 다양한 유전자형의 34마리의 신생아 마우스는 산후 3일째에, 대략 48 시간 째에 안락사시켰다(표 15):
[표 15]
Figure pat00015
TG=트랜스제닉 ; WT=야생형; HOM=동형; Het=이형접합; 및 n=마우스의 수
각각의 마우스를 몸을 통해 3 단면 (두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부)으로 가로로 절단하였고 머리를 버렸다. 두께 4.0-5.Omm의 조직 표본을 10% 중립 완충화 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록으로 가공하고, 일상적인 조직학적 검사 및 조직형태학적 이미지 분석을 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)으로 착색하였다. 올림푸스 BH-2 현미경, 비디오 카메라 (Dage-MTI, Michigan City, IN) 및 BioQuant True Color 윈도우 98 소프트웨어(R & M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209)을 사용하여 하기의 설정과 함께 조직형태학적 이미지 분석을 하기 위해 각각의 조직 샘플에서 척수의 등(척추) 영역으로부터의 표피가 선택되었다: 매개변수: mag. 10X, Z 오프셋 0; 정렬 : 길이(0m) ; 측정 : 수동 및 부가적인 모드.
각각의 피부 샘플로부터 표피 및 층 피부각질층 또는 각화 층의 두께(dom)을 각각의 1 Ox 현미경 영역과 평균값에서 각각의 측정 사이에 약 0.lmm 간격을 갖고, 개별적으로 10 회 측정하였고, SD와 SEM는 엑셀 계산에 의해 얻어졌다. 섹션의 모두는 무작위화되었고 블라인드 형태로 측정되었다. 측정후에, 섹션이 블라인드화되었고, 결과는 처리 그룹으로 매칭되었다. 처리 그룹에 의한 최종 결과는 다음과 같이 계층화되었다: 1.
두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부에서 평균 상피 두께 (Elm), 및 그후 (a) 두개골 흉부에서 평균 상피두께 ; (b)꼬리쪽 흉부에서 평균 상피 두께 ; 및 (c) 복부에서 평균 상피 두께로 하위-계층화된다.
2. 두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부에서 층피부각질층(Elm)의 평균 두께, 및 (a) 두개골 흉부에서 층피부각질층 의 평균 두께; (b) 꼬리쪽 흉부에서 층피부각질층의 평균두께; 및 (c) 복부에서 층피부각질층의 평균 두께로 하위계층화.
3. 두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부에서 표피 플러스 층con-leim 의 평균 두께. 결과의 데이타를 GraphPad InStat 소프트웨어 (GraphPad 소프트웨어,Inc., San Diego, CA. 92121)를 사용하여 분석하였다. 가변조건수 (ANOVA)의 한 방식의 분석을 적용하여 그룹에서 그룹까지 평균값에서의 차이의 통계적인 유의함을 검사하였다.
4. 두개의 그룹들 사이에서 평균값에서의 통계적인 차이의 결정을 위해 Tulcey-Iramer 다중 비교 시험를 사용하였다(*P < 0.05 ; **P < 0.01 ;***P < 0. 001;****P < 0. 0001). P < 0.05의 관찰은 유의한 것으로 간주되었다.
(1) 조직형태학적 결과
(a) 두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부에서 평균 상피 두께(μm)
상피 두께는 IL-22RA 유전자 (TG/-Het)의 한 카피가 부족한 IL-20 트랜스제닉 마우스 대 IL-22RA (TG/-HOM,P=0.001***)의 발현이 없는 IL-20 트랜스제닉 마우스 및 대 대조군 한배새끼 (WT/HOM, P=0.001*** 및 WT/Het, P=0.001***), 각각에서 상당히 증가하였다(표 16). TG/- Het 마우스는 가능하게는 케라티노사이트 비대로 인한 비-케라틴화 표피의 증가된 두께를 나타냈다. 이러한 증가는 모든 3 비케라틴화 층 (기초, 바늘형, 및 과립형)을 수반할 수 있지만 가장 종종 바늘형 새포층에 영향을 주었다.
TG/-Het 마우스의 표피는 두께가 약 25% 증가되었고 바늘형은 현저해졌다. 그러나 TG/-HOM 마우스의 표피는 대조군(WT/HOM 및 WT/Het)보다 약간 더 두꺼웠고 통계는 그룹들 (P > 0.05) 사이에서 어떠한 유의한 차이도 나타내지 않았다. 두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부의 상피 두께는 또한 비교되었다. 정상적으로 복부의 얇은 표피는 꼬리쪽 흉부보다 더 두껍고 꼬리쪽 흉부는 두개골 흉부보다 더 두껍다 (표 16).
[표 16]
Figure pat00016
결과는 평균값 ±SEM를 나타낸다. N= 측정된 단면의 수.
TG/- Het 마우스로부터의 두개골 흉부에서 피부의 비늘모양의 상피는 상피 세포 (케라티노사이트)의 비대에 의해 수반된 두께의 증가를 나타냈다 ; 그러나 다른 그룹, TG/-HOM, WT/HOM andWT/Het (P=0.1565, 표 17)과 비교할때 통계적인 차이가 없었다. 이것은 조직학적 인공물, 예를 들어, 단면-대-단면 변이성, 표피의 자연 구조로부터 기인하는 듯하고, 또는 두개골 흉부에서 얇은 피부에서 많은 효과는 없었다. 비고: 두개골 흉부의 조직구조 과정 또는 조직 섹션은 통계적인 유의함을 얻기 위한 조직형태학적 분석을 위해 실격시킬 수 있다.
[표 17]
Figure pat00017
결과는 값± SEM를 나타낸다. N=측정된 섹션의 수.
하나의 카피의 IL-ZZRA 유전자 (Het)를 갖는 IL-20 (TG/-)은 각각 TG/-HOM (P < 0.05*), WT/HOM(P < O.OO1***), 및 WT/Het(P < 0.O1*),(표 18)에 비해 상피 두께의 증가된 평균 값을 나타냈다.
통계는 그룹들 사이에서 매우 유의한 것을 나타냈다(P < 0.0001****). TG/- Het 표피는 증가된 WT/Het의 그것보다 약 29% 증가하였다. IL-22RA (HOM)의 부재를 갖는 IL-20 (TG/-) 마우스의 표현형은 대조군 한배새끼(WT/HOM andWT/Het)의 그것보다 더 두꺼운 표피와 관련된 한 카피의 IL-22RA 유전자 (Het)가 부족한 마우스의 그것과 부분적으로 닮았지만, 그러나, 그것은 대조군과 비교할때 (P > 0.05) 통계적인 차이를 나타내지 않았다. TG/-HOM 표피는 WT/HOM의 그것보다 약 14% 증가하였다. IL-20TG/-마우스와 달리, IL- 22RAm 수용체-결핍 마우스(WT/HOM 및 WT/Het)는 비교적 더얇은 상피 두께를 나타냈다. 현저하게, 꼬리쪽 흉부에서 상피 두께의 조직형태학적 결과는 두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부 에서 평균 상피 두께와 서로관련된 일관된 발견이었고 (표 15), 이것은 꼬리쪽 흉부의 조직학적 과정 및 조직 섹션은 조직형태학적 이미지 분석를 위한 가자 좋은 품질을 수행했다는 것을 나타냈다. .
[표 18]
Figure pat00018
결과는 평균값± SEM를 나타낸다. N=측정된 섹션의 수.
TG/-HOM 가 대조군 한배새끼이 비해 (WT/HOM 및 WT/Het, P > 0.05) 차이를 나타내지 않았다는 것을 제외하고, 복부 (표 19)에서 평균 상피두께의 결과는 꼬리쪽 흉부의 그것과 유사하였다 (표 18)
조직 섹션에서 일부 변화가 있었고 또한 두 섹션이 사라졌고, 즉, TG/-HOM 그룹에서 등(척추) 영역을 커버하는 표피 없었다.
[표 19]
Figure pat00019
결과는 평균값± SEM를 나타낸다. N=측정된 섹션의 수.
(b) 두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부에서 층피부각질층의 평균 두께(㎛)
IL-22RA (HOM)을 발현하지 않거나 한 카피의 유전자 (Het)를 발현하는 배경에서 IL-20 트랜스제닉 마우스(TG/-)에서 증가된 상피 두께에도 불구하고, 대조군 한배새끼 (WT/HOM 및 WT/Het)와 비교할때 TG/-HOM 및 TG/-Het 피부에서 층 피부각질층 또는 comified 층 두께의 우세한 감소가 관찰되었고 통계는 그룹 사이에서 매우 유의한 것을 나타냈다 (P< 0.0001****, 표 20). TG/-Het 마우스는 표피의 표면에서 TG/-HOM(P < 0. 01**), WT/HOM(P < 0.001***) 및 WT/Het(P < 0. 001***)에 대해 각각 약 36%, 50% 및 49% 증가된 양의 케라틴을 보였다. TG/-HOM 마우스는 그것의 대조군(WT/HOM, P < 0.05')과 비교할때 층 피부각질층 두께에서 약 22% 유의한 감소를 나타냈고 통계적인 유의함(P > 0.05)을 드러내지 않은 WT/Het에 대한 오직 17% 감소를 나타냈다. 대조군 마우스, WT/HOM 및 WT/Het 에서 층피부각질층의 두께는 대략 동일하였다. 명백하게는, 꼬리쪽 흉부에서의 층피부각질층은 복부의 층보다 더 두껍고 복부는 두개골 흉부의 층보다 더 두껍다.
[표 20]
Figure pat00020
결과는 값± SEM.N=측정된 단면의 수를 나타낸다.
두개골 흉부에서 층 피부각질층의 평균 두께는 (표 21) 두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부 (표 20)의 그것과 닮았으나, 그러나 피부각질층의 유의한 감소는 오로지 TG/-Het 각각 vs. TG/-HOM (P < 0. 05*) 및 vs. WT/HOM(P < 0.01**), 에서만 발견되었다. 불량한 절단면, 사라진 피부 샘플, 표피의 자연 건축물로 인할 수 있는 평균의 표준 편차 및 표준 오차는 높았고, 또는 두개골 흉부에서 큰 효과는 없었다. 주의: 두개골 흉부의 조직구조 과정 또는 조직 절단면은 품질 결과를 얻기 위해 조직형태학적 분석을 실격시킬 수 있다.
[표 21]
Figure pat00021
결과는 평균값 ±SEM을 나타낸다. N=측정된 절단면의 수
꼬리쪽 흉부 (표 22) 에서 층피부각질층의 평균 두께는 두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부에서의 그것과 유사하였지만 3가지 예외가 있다: (1) TG/-HOM vs. TG/-Het 및 TG/-HOM vs. WT/HOM는 어떤 통계적인 차이도 나타내지 않았다(P > 0. 05); (2)TG/-HOM vs.WT/Het는 유의한 차이(P < 0.0 **)를 나타냈다 ; (3) 현저하게 두꺼워진 WT/Het에서 층 피부각질층은 조직 프로세싱 인공물의 결과가 될 수 있다, 예를 들어, 케라틴은 저장성 용액에 그것을 넣거나 수욕에 너무 오래 둘때 팽창하거나 확장하였다.
[표 22]
Figure pat00022
결과는 값± SEM를 나타낸다. N=측정된 절단면의 수.
오로지 TG/-HOM vs. WT/HOM 및 TG/-Het vs. WT/HOM 는 통계적인 유의한 차이, 각각 P < 0. 05* 및 P < 0. 001***,을 나타내었다(표 23). TG/-마우스는 그것의 대조군 한배새끼에 비교할때 복부에서 층피부각질층의 두께에서 감소를 나타냈다 (WT/HOM 및 WT/Het).
[표 23]
Figure pat00023
결과는 평균값 + SEM. N=측정된 절단면의 수
(c) 두개골 흉부, 꼬리쪽 흉부 및 복부에서 표피 플러스 층피부각질층의 평균두께 (μm)
TG/-Het 마우스는 대조군 한배새끼 (WT/HOM andWT/Het)에 비해 상피 두께에서의 유의한 증가와 층피부각질층의 두께에서 유의한 감소를 나타냈고 TG/-HOM 마우스는 유사하지만 최소의 효과를 갖는 결과를 생산하였다(표 24).
[표 24]
Figure pat00024
결과는 평균값을 나타낸다. N=마우스의 수
(d) IL-20RA 와 IL-22RA 둘다를 통한 IL-20 의 신호화
표피는 층상화되고, 계속적으로 새로운 상피는 항상성에 대한 세포 증식, 미분, 및 사망 중에서 균형에 대해 의존한다. 정상표피에서, 유사분열로 활성 기초 층은 바깥쪽으로 이동하고 적출된 편평상피(squames), 층피부각질층에 위치한 케라틴 또는 각화 층처럼 궁극적으로 피부 표면으로부터 빠져나온, 종말에 분화하는 케라티노사이트를 일으킨다. 많은 단백질이 상피 항상성을 유지하는 기능을 하지만, 이들 사건의 분자 배위는 잘 이해되지 않는다. IL-20는 신규 수용체-상호작용하는 단백질이고 그것은 케라티노사이트의 증식과 관련된 피부층에 발현된 IL20RA 또는 IL-22RA 수용체(IL-22RA) 를 통해서 신호한다.
IL-20 트랜스제닉 신생아는 비정상의 두꺼워지고 반들반들한 피부 표현형을 나타낸다. 마우스에서 IL-22RAm (HOM) 결핍은 Tel-22 처리에 대한 반응을 나타내지 않았고, 반면 IL-22RA 유전자를 갖는 IL-22로 처리된 야생형 마우스는 상피 두께에서 유의한 증기를 나타냈다 (P < 0.001***, 결과 IL-22RAm KO/IL-22 조직형태학적 이미지 분석, PID 59.2를 참조할것). IL-22RA의 부재가 K14 IL-20m TG 신생아에서 관찰된 반들반들한 표현형에 효과가 있는지 여부를 연구하기 위해서, 정규 장소 밖에서 IL-20을 발현하는 트랜스제닉 마우스는 IL-22RA 동형 (HOM) 또는 IL-22RA이형접합 (Het) 결핍과 짝지어졌다. 상피 두께의 정량적 이미지 분석은 이 연구로부터 꼬리쪽 흉부에서 더 적은 마우스에서 이전에 수행되었지만 (즉, 총 19 절단면에 대해서 마우스당 19 마우스, 1 절단면) 연구된 동물의 제한된 수와 그룹내의 변동 때문에 통계적인 유의함은 얻어지지 않았다. 본 연구의 목적은 IL-20의 생물학을 조사하고 신뢰할만한 정량적인 결과를 얻기위해서, 동일한 연구로부터 각각의 마우스로부터 꼬리쪽 흉두개골 흉부,부 및 복부에서 더많은 피부 샘플을 조직형태학적으로 정량하는 것이었다 (즉,34 마우스, 마우스당 3개의 절단면, 총 102 절단면에 대해서). 효과적인 이미지 분석을 위해서, 본 발명자들은 모든 개인에서 및 마우스의 그룹에서 파라핀 블록에서 피부의 배향이 일정하였고 동일한 각각의 위치로부터 피부 샘플을 측정하였다는 것을 확실히 하였다. 두가지 종류의 측정이 수행되었다 : (1) 표피의 두께를 등(척추) 쪽의 척수에서 각각의 피부 샘플에서 lOx 현미경 시야당 10 회 측정하여, 케라티노사이트 증식 및 미분을 매개하는데 있어서 IL-20의 역할을 연구하였다; (2) 동일한 방식으로 각화 층 또는 층 피부각질층의 두께를 측정하여 EL-20 TG 신생아에서 반들반들한 피부 외양의 결과와 서로 관련지었다.
상피 두께의 조직형태학적 이미지 분석은 한 카피의 IL-22RA 유전자로부터 일부 IL-22RA를 발현하는 배경에서 kl4IL-20m 트랜스유전자를 발현하는 TG/-Het 신생아는 두꺼워진 표피를 나타냈고 IL-22RA을 발현하지 않는 배경에서 kl4 IL-20m 트랜스유전자를 발현하는 TG/-HOM 신생아는 유의한 변화를 갖지 않았다는 것을 드러냈다. 상피 두께는 두 카피의 IL- 22RA 유전자 (TG/-HOM,P=O.001 *'r*)가 부족한 IL-20 트랜스제닉 마우스에 대해서 그리고 대조군 한배새끼에 대해서 (WT/HOM, P=0.001*** 및 WT/Het, P=0.001***), 한 카피의 IL- 22RA 유전자 (TG/-Het)가 부족한 IL-20 트랜스제닉 마우스에서 유의하게 증가되었다.
TG/-Het 마우스는 주로 바늘형 층에서 케라티노사이트의 비대로 인하여, 비-케라틴화 표피의 증가된 두께를 나타냈다. TG/-Het 마우스의 표피는 두께가 약 25% 증가된 반면, TG/-HOM 마우스의 표피는 오로지 약간 더 두껍고, 대조군 (WT/HOM 및 WT/Het)보다 약 4-5% 증가되고, 통계는 TG/-HOM와 그것의 대조군 WT/HOM 사이에서 유의한 차이를 나타냈다(P > 0. 05).
층피부각질층의 조직형태학적 결과는 TG/-Het 신생아에서 상피 비후에도 불구하고, 대조군한배새끼 (WT/HOM andWT/Het)에 비해 TG/-HOM 및 TG/-Het 피부에서 케라틴 또는 각화 층 두께의 우세한 감소가 관찰되었고 통계는 그룹들 사이에서 매우 유의하게 나타났다(P < 0.0001 ****)는 것을 나타냈다. TG/-Het 마우스는 표피의 표면에서 각각 TG/-HOM(P < 0.01**), WT/HOM(P < 0.001***) 및 WT/Het(P < 0.001''')에 대해서 약 36%, 50% 및 49% 증가된 양의 케라틴을 나타냈다. TG/-HOM 마우스는 그것의 대조군과 비교하여(WT/HOM, P < 0.05*) 층피부각질층 두께에서 약 22% 유의한 감소를 나타냈고 WT/Het(P > 0. 05)에 대해서 오로지 17% 감소를 나타냈다.
대조군 마우스, WT/HOM 및 WT/Het 에서의 층피부각질층의 두께는 거의 동일하였다. TG/-HOM 및 TG/-Het 신생아에서 층피부각질층의 평균 두께의 감소는 총체의 발견과 상호관련있는 것으로 보이며, 이때 총체의 수준에서 IL-20(TG)/IL-22RA (Het) 신생아는 광택으로 불리는 감소된 광택(예를 들어, 더적은 케라틴을 가짐)을 가지는 것으로 보이는 반면, IL-20(TG)/IL-22RA (HOM) 신생아는 광택이 없다 (예를 들어, 더많은 케라틴을 가짐).
조직학적으로, TG/-마우스에서 층피부각질층에서 케라틴은 WT 마우스에서의 그것보다 더욱 컴팩트한것으로 나타났다. 함께, IL-20 트랜스제닉 신생아에서 비후성 케라티노사이트와 관련된 두꺼워진 표피 및 층피부각질층의 얇은 층은 그들이 왜 반들반들한 피부 표현형을 나타냈는지를 설명할 수 있다.
케라티노사이트의 증가된 비대 및 장애가 있는 종말 미분은 한 카피의 IL-22RA 유전자 (Het)의 표적화된 녹아웃과 함께 IL-20 트랜스제닉 신생아에서 관찰되었다. 피부는 케라티노사이트에서 비대를 나타냈지만 완전히 미분하는데 실패하고, 케라틴 또는 층피부각질층이 부족하다. 2 카피의 IL-22RA 유전자 (HOM)의 분열을 갖는 IL-20 트랜스제닉 신생아는 덜하거나 최소의 효과를 나타낸 TG/-Het 피부를 닮은 표현형을 나타냈다(도12-15). IL-22RA (HOM)의 부재는 K14 IL-20m TG 신생아에서 관찰된 반들반들한 표현형에 대해 부분적인 효과를 가지고 IL-22RA (Het)의 부재는 반들반들한 표현형에 대해 최소 또는 전혀 효과가 없는 것으로 보인다. 즉, IL- 20RA 또는 IL-22RA 수용체(IL-22RA)중의 하나를 통해 신호하는 IL-20, 신규 수용체-상호작용하는 단백질의 신호화는 아마도 한 카피의 IL-22RA 유전자 (Het)의 결핍 발현에 의해 차단되지 않지만 부분적으로는 2 카피의 IL-22RA 유전자 (HOM)의 결핍 발현에 의해 차단된다.
이들 결과는 예를 들어 IL-22RA 유전자 녹아웃을 통해 또는 유사하게는 본 발명의 IL-22RA로의 단일클론 항체를 중화하는 것을 통해 IL-22RA 활성을 효과적으로 차단하는 것은, 유사하게는 IL-22-유도된 피부 효과는 물론이고, 예를 들어 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-20, 및 또는 IL-22에 의한 유도된 다른 염증 질환에서 IL- 20-유도된 피부 효과를 줄일 것이라는 증거를 제공한다.
실시예 34
IL-22RA 녹아웃 마우스에 대한 IL-22 의 효과
23 IL-22RA KO (HOM) 및 13 대조군 (WT)을 포함하는 36 마우스는 튜브와 함께 이식된 미니펌프 또는 미니펌프 단독으로에 의해 피하 투여된 IL-22 또는 PBS으로 처리되었다 (표 25) :
[표 25]
Figure pat00025
각각의 동물의 펌핑 부위로부터 스킨 샘플, 길이 1.5-2. 5cm이고 두께 4. 0-5. Omm가 일상적인 조직학적인 검사 및 조직형태학적 영상 분석법을 위해서 얻어졌다 . 모든 조직 표본은 10% 중성 완충화 포르말린에 고정시키고 파라핀 블록 안으로 가공하였다. 동물 당 각각의 피부 샘플로부터 6 분절 섹션은, 두께 5um 이고 인접한 섹션들 사이의 간격 10um 전체 표면을 덮는 상피와 함께, 헤마톡실린과 에오신 (H&E)으로 착색되었다. 올림푸스 BH-2 현미경, 비디오 카메라 (Dage-MTI, Michigan City, IN) 및 BioQuant True Color 윈도우 98 소프트웨어 (R&amp;M Biometrics, Inc. Nashville, TN 37209)를 사용하여 하기의 셋업을 사용하여 피부 샘플의 조직형태학적 영상 분석법이 수행되었다: 매개변수 : mag. 10X, Z 오프셋 0 ; 배열 : 길이 (um); 측정 : 수동 및 추가 모드. 표피의 두께(um)는 각각의 lOx 현미경 시야에서 각각의 피부 절단면의 중심 0.4cm으로부터 잡힌 총 4 시야로부터 5회 측정되었다 (예를 들어, 하나는 lOx 현미경 시야 = 0.1cm 및 4개는 lOx 현미경시야=0. 4cm). 각각의 동물로부터 총 6 절단면을 측정하였고 평균 값, SD 및 SEM을 Excel 계산에 의해 얻었다. 모든 절단면을 무작위화하고 블라인드 형태로 측정하였다. 측정 후에, 절단면을 섞지 않고, 결과는 처리 그룹에 매칭되었다. 처리 그룹에 의한 최종 결과는 다음과 같이 계층화되었다 :
1. HOM 및 WT 수컷과 암컷 마우스로부터의 상피 두께.
2. HOM 및 WT 수컷 마우스로부터의 상피 두께.
GraphPad InStat 소프트웨어 (GraphPad 소프트웨어,Inc., San Diego, CA 92121)를 사용하여 결과의 데이타를 분석하였다. 가변조건수 (ANOVA)의 하나의 분석을 적용하여 그룹 1 내지 그룹 4로부터의 평균값 의 차이의 통계적인 유의함을 검사하였다. Tukey-Kramer 다중 비교 시험 및 Unpaired-T 테스트를 적용하여 두 그룹 사이에서 평균값에서의 유의함을 분석하였다. P < 0.05의 관찰은 유의한 것으로 간주되었다.
III. HOM 및 WT 수컷 및 암컷 마우스 로부터의 조직형태학적 결과 (1) 상피 두께 ( m)
상피 두께는 WT/PBS 대조군 (P=0. 0001)에 대해서 IL-22 (WT/IL-22)으로 처리된 WT 마우스 피부에서 유의하게 증가되었다. IL-22 (HOM/IL-22) 으로 처리된 IL-22RAm KO 마우스 피부는 HOM/PBS 대조군과 비교할때 상피 두께의 증가된 평균 값을 나타냈지만, 그러나 통계는 두 그룹 사이의 유의한 차이가 없음을 나타냈다 (P > 0. 05). WT 마우스와 비교할때 IL-22RA KO 마우스에서 상피 두께의 우세한 감소가 관찰되었다 (예를 들어 , HOM/IL-22 vs. WT/IL-22: P < 0. 001) (표 26).
[표 26]
Figure pat00026
결과는 평균값±SEM을 나타낸다. N=동물 수.
(2) HOM 및 WT 수컷 마우스로부터의 상피 두께(um)
WT/PBS 수컷 대조군(P=0. 0001)과 비교할때, 상피 두께는 IL-22 (WT/IL-22)로 처리된 WT 수컷 마우스 피부에서 약 2-배 증가되었지만, IL-22(HOM/IL-22)으로 처리된 IL-22RAm KO 수컷 마우스 표피는 HOM/PBS 수컷 대조군와 비교할때 오직 약간의 증가를 나타내었다(P > 0. 05).
현저하게, IL-22RAm KO 마우스는 그것의 대조군, WT 수컷 마우스과 비교할때, 상피 두께의 두드러진 감소를 나타냈다(예를 들어,HOM/PBS VSWT/PBS : P < 0. 05; HOM/IL-22 VS WT/IL-22: P < 0.001) (표 27).
[표 27]
Figure pat00027
결과는 평균 값± SEM을 나타낸다.
(3) HOM 및 WT 마우스, 수컷 vs. 암컷으로부터의 상피 두께 (um)
암컷 마우스의 표피는 수컷 마우스보다 더 두껍게 발견되었다 (예를 들어, HOM/IL-22/수컷 VS HOM/IL-22/암컷:P < 0.01 ; WT/IL-22/수컷 VSWT/IL-22/암컷 : P < 0.05) (표 28).
[표 28]
Figure pat00028
결과는 평균 값± SEM을 나타낸다.
(4) HOM 마우스, EL-22 펌프 vs. 튜브를 갖는 IL-22 펌프 로부터의 상피 두께(m)
IL-22 펌프 & 튜브로 IL-22 RAm KO (HOM) 마우스로부터의 표피는 유의하게 오직 펌프만 있는 IL-22RAm KO(HOM) 마우스의 그것보다 더 두꺼웠다. (P < 0.0001, 쌍을 이루지 않은-T 시험에 의해) (표29).
[표 29]
Figure pat00029
결과는 평균 값± SEM을 나타낸다.
M: 수컷; F: 암컷; N: 마우스의 총수.
IV. 논의:
함께 취하여, 본 연구의 목적은 IL-22RAm KO 와 WT 마우스 둘다로부터 IL-22 처리된 피부에서 상피 효과를 특성화하는 것이고 임상 지시에 대한 이들의 발견과 관련된다. 정량적인 이미지 분석은 수행되어 H & E 착색된 피부 절단면에서의 에피데니스의 두께를 결정하였다. 각각의 동물로부터의 피부 샘플은 조직형태학적으로 120회 측정되었고 (즉, 각각의 마우스=120 측정으로부터 20 회/각각의 절단면 X 6 분절 절단면) 평균 상피 두께가 엑셀 계산에 의해 얻어졌다. 조직형태학적 연구는 IL-22가 특히 IL-22RA 수용체(ANOVA에 의해 P < 0.0001, 매우 유의한 것으로 간주됨)의 존재를 갖는 WT 마우스에서 상피두께에서의 유의한 증가를 초래했다는 것을 증명하였고 IL-22RA 수용체 (P > 0.05)의 부재를 갖는 IL-22RAm KO (HOM) 마우스에 대해서 덜 또는 최소의 효과를 나타냈다.
IL-22 처리된 WT 마우스에서의 상피 두께는 PBS으로 처리된 것보다 약 43% 증가되었고(예를 들어, WT/PBS,P < 0.001), 반면에 IL-22 처리된 IL-22RAm KO (HOM) 마우스는 상피 두께에서 대조군(HOM/PBS,P > 0. 05)과 비교할때 오직 26% 증가를 나타냈다. L-22Rkn KO 마우스는 WT 마우스(P < 0.001)와 비교할때 더얇은 표피를 나타냈다. 총체적인, 마우스 피부에 대한 IL-22의 생물학적 효과는 이러한 인저가 상피 성장 및 증식의 조절에 수반될 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 35
항-사람IL-20 단일클론 항체의 약물 동력학 (클론 #262. 7.1. 3.2. 4)
시험 단일클론 항체, 항-사람 IL-20 mAb, (클론 #262. 7.1. 3. 2. 4)는 1.08 mg/mL의 농도에서 3x 3 mL 분액으로 제공되었고(280 nM에서 UV 흡광도에 의해 결정됨) -80℃에서 사용할때까지 저장하였다. 부형제는 1X PBS (50mMNaP04, 109mMNaCl), pH 7.3였다. mAb을 사용하기 전에 실온에서 해동하였고 분액 1 과 2를 각각의 100ug IV 및 SC 투약 그룹에 대해 제공될 때 사용하였다.
분액 3의 절반을 50 μg SC 투여량 그룹에 대해서 1X PBS 중에 1: 2 희석하였고 분액 3의 두번째 절반은 10 μg SC 투여량 그룹에 대해서 1: 10 in1X PBS에 희석하였다. 암컷 SCID 마우스(n=96)는, Charles River Labs을 받았다. 동물은 도착시 건강에 대해 체크되었고 그룹-하우징되었다(우리당 3 동물). 마우스는 연구 시작할때 22 g의 평균 체중을 갖는 12 주령이었다.
A. 복용 프로토콜
암컷SCID 마우스(n=24/용량 그룹)는 무작위로 4 복용 그룹으로 놓았다(표 30 참조). 그룹 1에는 꼬리 정맥에서 대략 93uL의 IV 주사를 통해 항-huIL-20 mAb 를 투여하고 그룹 2,3, 및 4에는 목덜미에서 대략 93KLL의 SC 주사를 통해서 mAb를 투여한다.
B. 샘플 수집
혈액 수집하기 전에, 마우스를 할로세인 또는 이소플루오란으로 완전히 마취하였다. 168 hr 시점을 제외하고 모든 시점에 대해서 심장 스틱을 통해 혈액 샘플을 수집하였다(눈 출혈을 통해 수집하고 동일한 동물은 심장 스틱을 통해서 504 시점에서 다시 출혈하였다). 혈액을 혈청 세퍼레이터 튜브 안에 수집하고 15 분 동안 응고시켰다. 샘플을 이어서 3 분동안 14,000 rpm에서 원심분리하였다. 원심분리후에, 125-150uL의 분액을 표지화 eppendorf 튜브 안으로 분배하고 즉시 -80℃에서 분석할때까지 저장하였다(표 30).
[표 30]
Figure pat00030
* 168 및 504 hr시점에 대해서 동일한 동물을 사용하였다.
C. ELISA 에 의해 혈청 항-huIL-20 mAb 농도의 정량
효소 연결된 면역흡착제 분석 (ELISA)을 개발하엿고 자격을 받아 약동학 연구동안에 항-IL-20 mAb 267.7. 1.3. 2.4를 복용한 동물로부터의 마우스 혈청 샘플을 분석하였다. 이 분석은 시중에서 입수 가능한 제 2 항체 및 TMB을 사용하여 비색법 검출을 이용하도록 설계되었다. 표준 곡선에 사용된 희석은 변경되어 표준 곡선의 선형부분의 선명도를 개선하였다. 2-배 희석과 함께 100 ng/mL 내지 0.231 ng/mL의 범위에 있는 표준 곡선은 마우스 혈청 샘플의 정량을 허용하였다. QC 샘플은 10%SCID 마우스 혈청에서 1: 100,1 : 1000 및 1: 10000으로 희석되었고 표준 곡선으로부터 역 계산되었다.
D.약동학 분석
혈청 농도 대 시간 데이타는 약물동력학 분석을 위해서 WinNonlin Professional 4.0 소프트웨어(Pharsight, Inc.;Cary, NC)로부터 다운로드하였다. 구분되지 않은 분석을 사용하여 각각의 시점에서 평균 데이타에 근거한 약동학 매개변수를 결정하였다.
E. 결과
100 Rg IV 및 100,50, 및 10μg SC의 투여 후에 평균 혈청 항-사람 IL-20 mAb 농도가 표 31에 나와있다 :
[표 31]
Figure pat00031
IV 투여후에, mAb 농도 대 시간 프로파일은 쌍기하급수적인 기울기를 나타냈다. SC 투여 후에, mAb은 흡수 속도-제한된 제거와 함께, 느린 흡수 상태를 가지는 것으로 나타냈다. 각각의 시점에서 평균 데이타에 근거한 혈청 약동학 매개변수는 표 32에 나와있다:
[표 32]
Figure pat00032
ND: 농도 대 시간 프로파일의 종말 제거 상에서 데이타의 부족으로 인해 검출가능하지 않음
IV 투여 후에, mAb 는 매우 낮은 청소(Cl = 0.002mL/hr) 및 긴 제거 반감기 (tl/2, λz
Figure pat00033
21 일)를 나타냈다. mAb는 마우스(
Figure pat00034
1. 7 mL)중의 혈액 부피 미만인 분포의 정상-상태 부피를 나타냈고(Vss = 1. 3 mL), mAb는 실질적으로 도관 구획 밖으로 분포되지 않았다는 것을 암시한다. 역-계산된 최대 농도(Co)는 주사된 용량과 마우스에서 혈액 부피에 기반하여, 기대보다 더 높았다. 이는, 작은 Vss와 함께, mAb가, 큰 범위로, 혈액의 혈청 분율에서 한정될 수 있다는 것을 암시한다.
SC 투여 후에, Cmax 값은 복용량에 따라 선형으로 증가된다. 100μg SC 복용량에서, mAb는 청소 및 다음 IV 복용의 그것과 유사한 분포의 명백한 부피와 함께 대략 25일의 t1/2,λz 를 가졌다. 생체이용률은 86%였다. 더 낮은 SC 복용량에서, 대부분의 약동학 매개변수는 측정가능한 종말 제거 상의 부족으로 인해, 샘플이 504 시간으로 취해졌지만 추정될 수 없었다. SC 복용 후의 mAb의 흡수는 연구의 지속에 걸쳐서 제거와 함께 정상-상태에 도달한 것으로 보인다.
실시예 36
CD4+CD45RB hi (CD25-) 대장염 및 건선 모델 에서 IL-20 및 IL-22 대항제
A. 요약
마우스에서 대장염에서 CD4+ CD45RBhi 또는 CD4+CD25-T 세포의 공통유전자의 SCID 마우스 결과 안으로의 이동. 규제 T 세포(CD4+CD25+ 또는 CD4+CD45RB10)의 공동-이동은 이 대장염을 억제한다. CD4+CD25- T 세포의 마우스 안으로의 이동후에, 만일 마우스가 추가적으로 스타필로코칼 엔테로톡신 B (SEB)이 주사되면, 마우스는 대장염은 물론이고, 건선까지 발전된다. IL-22RA, IL-20, IL-22, IL20R 및/또는IL-22R에 대한 항체, 또는 가용성IL-22RA 수용체가 투여된다. 세포 이동 후에 일 0-21 및 대장염과 건선의 증상이 모니터링된다.
건선 점수 또는 대장염 (조직구조)의 억제는 IL-21이 이들 자가면역 질환을 억제할 수 있다는 것을 지시한다.
B. 연구 설계
비장 및 사타구니 림프절은 B10. D2 마우스로부터 분리된다. 단일 세포 현탁액은 형성되고 카운트되었다. Miltenyi Bead 시스템을 사용하여, CD25+ 세포가 양성 선택에 의해 분류되었다. 세포는 1: 100 희석에서 CD25-PE (BDPhanningen)으로 착색되고 15 분동안 배양되었다. 과잉의 항체가 씻겨나가고 세포는 20 분동안 l0ul 항-PE비즈/106 세포로 배양된다. 세포는 PBS으로 세척되고 LS 칼럼 (Miltenyi Biotech)위에서 통과된다. 칼럼 (CD25-)을 통과한 세포는 더 나아간 분석을 위해서 보유된다. CD4 풍부함 칵테일 (Stem Celltechnologies)을 이들 CD25-세포에 첨가하고(1: 100) 15 분동안 배양하였다. 세포를 PBS으로 세척한다. 항-바이오틴 테트라머의 1: 10 희석을 15 분동안 세포에 첨가하고 이어서 15 분동안 자성 콜로이드(60㎕/106 세포)를 첨가하였다(Stem Cell Technologies로부터의 모든). 세포는 음성 선택 칼럼을 통해서 통과된다(0.5", Stem cell Technologies). 통과되는 세포는 CD4+CD25-세포이다. 흐름 혈구계산을 사용하여 순도를 분석한다. 0.4 x 106 세포는 200Ljl의 총 부피에서 미투약 CB-17SCID 마우스 안으로 i. v. 주사된다.
마우스가 10Dg SEB 다음날 (dl)로 i. p 주사된다. 건선에 대한 증상 및 대장염에 대한 증상은 2-5 주부터이다. 마우스는 다음 기준하에서 건선 질환에 대해 점수매겨진다. 0- 병소없음,1-목에 가벼운 병소, 2-목과 등(몸통)에 심각한 병소 및 3-마우스의 목, 등 및 배의 매우 심각한 병소. 귀 비후가 또한 질환 심각도의 측정으로서 측정된다. 마우스의 그룹은 IL-22RA, IL-20,IL-22, IL- 20R 또는 IL-22R에 대해서 PBS, 100D g 대조군 항체 또는 10-100Qg 항체로 i. p. 주사된다 , 또는 다른 복용 요법하에서 일 1-30 으로부터 가용성 IL-22RA (3X/주 또는 2X/주).
C. 결과 및 결론
항체 처리된 마우스에서 건선 및 대장염 증상의 억제는 IL-20 및/또는IL-22 기능의 억제는 건선 및 대장염에 대한 이 모델에서 자가면역 증상을 억제할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 37
SCID-hu 이식 건선 모델 에서 IL-20, 및 IL-22 대항제
SCED 마우스에 이식된 사람 건선 피부는 그것의 임상, 광 현미경, 및 면역히스토케미칼 건선 특징을 몇주동안 유지할 수 있다. 이 모델은 손상 조직을 정상 표현형으로 회복시키려는 의도의 치료법을 평가하기 위해서 시스템을 제공한다.
일단 사람 피부가 성공적으로 이식되면, IL- 22RA,IL-20, IL-22, IL-20R 및/또는 IL-22R에 대한 항체, 또는 가용성IL-20 또는 IL-22 수용체는 몇 주동안 투여될 수 있고, 상피 두께는 건선에 대한 이들 대항제의 효과를 평가하기 위해 분석될 수 있다.
B. 연구 설계
전체 표피 및 몇 mm의 진피로 구성되는 전체-두께 6-mm 펀치 생체검사법이 건강한 성인 지원자들 및 건선 손상 피부으로부터 얻어진다. 4 내지 6 생체검사법 이 각각의 기증자로부터 얻어진다. 각각의 기증자로부터 하나의 펀치 생체검사법 은 수용자 SCID 마우스 (CB-17, Taconic)의 등(척추) 표면위로 이식된다. 동물은 병원체-없는 환경에서 유지된다. 다음과 같이 성공적인 이식 후에 처리가 시작된다(2-3 주 이식후): 음성 대조군에 대한 하나의 생체검사법(PBS 또는 동형 mAb), 양성 대조군을 위한 하나의 생체검사법(Cyclosporin A), 및 for 항-사람IL-22RA, 항-사람 IL-20, 항- 사람IL-22 mAb 로의 처리를 위한 2-3 생체검사법 또는 IL-20 또는 IL-22 를 위한 가용성 수용체(M-W-F 스케줄로 복막내 주사, 3회 2-4 주동안 주 ).
C. 정량적인 분석 :
임상 관찰 및 평가는 실험을 통해서 규칙적으로 만들어질 것이고, 기록될 것이다. 건선 병소의 심각도는 블라인드 형태로 인상, 경결, 및 홍진에 대해서 평가된다. 매개변수는 점 스케일을 사용하여 점수화될 수 있다3: 0 = 피부해치는 연좌의 완전한 부족 ;1 = 약간 연좌;2 =적당 연좌; 3 = 심한 연좌. 복용 기간의 끝에 각각의 동물을 안락사시키고 조직을 조직구조 및 IHC을 위해서 수집한다. (1)조직의 일부를 10%포르말린에 고정하고 헤마톡실린 및 에오신으로 착색하였다. 상피 영역은 NIH 이미지 소프트웨어를 사용하여단위 길이 당 상피 두께의 변화의 함수로서 측정된다. 각각의 이식으로부터 다중 영역은높은 n 값 및 평균 상피 영역을 제공하도록 정량화된다. (2) 상부 진피에 있는 고-전력 시야 (0.103 x 0. 135 mm)당 염증단핵 세포의 수는; (3) 부전각화증의 등급은 0 내지 3의 임의의스케일로 매겨진다, 이때 0은 부전각화증이 없고, 1은 절단면의 3분의 1 미만이 부전각화증 이고, 2 는 절단면의 3분의 2 미만 3분의 1 이상이 부전각화증이고, 3은 절단면의 3분의 2 이상이 부전각화증이다. (4) 남아있는 조직은 Ki67 에 대해 착색될 것이다(증식하는 케라티노사이트의 마커), 절단면의 Ksi67 싸이클링 케라티노사이트-per-밀리미터 길이의 수를 평가한다. 상피 두께에 의해 측정될 때 건선의 감소된 심각성은 IL-20 및 IL-22 기능의 중화가 건선 모델에서 효과적일 수 있다는 것을 지시한다. 건선의 감소된 심각성을 정량하기 위해서, 본 발명자들은 측정 상피 두께, 상부 데니스에서의 상부 염증 세포의 수, Ksi67 싸이클링 케라티노사이트의 수, 및 부전각화증의 등급을 측정한다. 대조군 마우스와 비교할때 처리된 그룹에 대해서 유의하게 감소된 모든 4 매개변수는IL-20, IL- 22 대항제의 포텐셜 치료 사용을 암시한다.
실시예 38
알라마르 블루 증식 분석을 사용하는 BaF3/IL-22RA/IL-20RB 세포을 사용하는 IL-20 대항제 활성에 대한 스크리닝
인저-의존 미리-B 세포주 BaF3는 IL- 22RA 및 IL-20RB 으로 공동-세포감염된다(실시예 3의 방법을 참조) 및 다양한 농도에서 IL-20으로 처리된다. 증식은 실시예 3에서 기술된 바와 같은 알라마르 블루 분석을 사용하여 평가되었다. IL-20는 용량-의존 방식으로 증식을 자극하였다 사이토킨에 대해 예측된 농도, 사이토킨에 대해 예측된 농도에서 헤테로다이머IL-22RA/IL-20RB 수용체를 결합되고 활성화한다 는 것을 증명한다. 세포감염되지 않은 BaF3를 함유하는 음성 대조군은 증식되지 않았다.
만일 항-IL-22RA 항체가 IL-20 활성을 대항할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 항-IL-22RA 항체를 IL-20 활성에 대한 대항제로서 사용하여 위에서 기술된 분석을 수행한다. IL-20가 그러한 대항제와 조합될 때, IL-20에 대한 반응이 배경 수준으로 낮아진다. IL-20의 증식 효과를 제거하거나 줄이는 대항제의 존재는 그것이 IL-20 리간드의 대항제라는 것을 증명한다. 이 분석은 가용성 IL-22RA 수용체를 포함하는 대항제 폴리펩티드와 같은 본원에서 기술된 IL-20 활성의 다른 대항제를 시험하는데 사용될 수 있다.
실시예 39
항-huL22RA 단일클론 항체에 의한 IL-20 및 IL-22 활성의 중화
실시예 28에서 기술된 세포-기반 중화 분석을 사용하여, 정제된 마우스항-huIL-22RA 단일클론 항체 (실시예 30 (D))를 예를 들어, 10㎍/ml, 5㎍/ml, 2. 5㎍/ml, 1.25㎍/ml, 625ng/ml, 313ng/ml, 156ng/ml 및 78ng/ml에서 연속 희석으로서 첨가하였다. 분석 플레이트를 37℃에서, 5% C02 4일동안 배양하였고 그때 알라마르 블루 (Accumed, Chicago, IL)를 20μ1/웰로 첨가하였다.
플레이트는 37℃, 5% C02에서 16 시간동안 다시 배양하였다. 결과는 정제된항-huIL-22RA 단일클론 항체가 hulL- 22 와 hulL-20 둘다의 huIL-22RA를 통한 신호화를 중립한다는 것을 보여주었다. 10㎍/ml 농도에서, 항체는 huIL-22 또는 huIL-20에 의해서 유도된 증식을 완전하게 중립화하였고, 더 낮은 농도에서 용량 의존 형태로 감소하는 증식의 억제. 위에서 기술된 농도에서 시험된, 동형-매칭된 음성 대조군 마우스 mAb는 사이토킨 중의 어떤 것도 증식의 억제를 제공하지 않았다. 이들 결과는 더욱 IL-22RA 에 대한 단일클론 항체가 정말로 낮은 농도에서 전-염증 리간드,IL-20 및 IL-22의 활성을 대항할 수 있다는 것을 증명한다.
이들 결과는 효과적으로 IL- 22RA 활성을 차단하는 것은, 예를 들어 본 발명의 IL-22RA에 대해 단일클론 항체 를 중화하는 것을 통해, 생체내에서 IL-20와 IL-22 (단독 또는 함께)의 효과를 차단하고, 억제하고, 감소하고, 대항하고 또는 중립하는데 이로울 수 있고 예를 들어 IBD, 관절염, 천식, 건선 관절염, 대장염, 염증 피부 조건, 및 아토피 피부염을 포함하는, 건선, IBD, 대장염, 또는 IL-20및 또는 IL-22 에 의해 유도된 다른 염증 질환에서, IL-20 및/또는 IL-22-유도된 염증, 이를테면 IL-22-유도된 피부 효과는 물론이고 IL- 20-유도된 피부 효과에서 보여지는 것과 같은것이 줄어들 수 있다는 추가의 증거를 제공하였다.
실시예 40
항-IL-22RA 단일클론 항체를 중화하는 임신L-20 및 IL-22 트랜스제닉 마우스의 처리
생체내에서 활성을 중화하기 위해 래트 항-마우스 IL-22RA 단일클론 항체 (mAb)를 테스트하기 위해, 임신 IL-20 트랜스제닉 (Tg) 및 IL-22 Tg 마우스는 항-마우스IL-22RA mAb가 복막내 주사된다. 새로태어난 마우스는 그후 정상적으로 이들 계통의 마우스를 특성화하는 "반들반들한" 피부 표현형의 존재 또는 부재에 대해 평가된다.
특이적으로, 수컷 IL-20 Tg (케라틴-14을 사용하여 발생되는) 또는 IL-22 Tg (인슐린 촉진자를 사용하여) 마우스는 발정기에 있는 C57BL/6N 암컷으로 자라고 자란 암컷은 다음날 질 플러그의 존재에 의해 확인된다. 각각의 임신 암컷은 따로 우리에 두고 매일매일 관찰한다. 처리 그룹은 적어도 4 임신 암컷를 포함하고 각각, Tg 와 비Tg 마우스 모두의 통계적으로 유의한 분석을 허용한다. 이들 Tg 마우스와 이전의 경험을 기반으로, 한배 새끼는 보통 한배 새끼당 대략 6 내지 8 마우스 사이의 범위이고, 2 내지 3 사이는 Tg+이다.
마우스가 자란지 7 내지 9일 후(태아 나이 7-9; e7-9), 암컷은 250-500ug의 래트 항-마우스 IL-22RA mAb (래트 IgG2a 동형)이 200-250ul의 부피의 PBS로 복막내 주사된다. 얕은 주사 각으로 짧은 주사가 사용되어 직접 자궁을 주사하는 것을 피한다. 임신 암컷은 성공적으로 태아를 발전하는 것을 접근하기 위해 , 이러한 식으로 3일 주 (월요일, 수요일 및 금요일) 2 주동안 (태어날때까지) 주사된다. 제어 그룹은 (4이상의 임신 암컷 마우스 각각의)다음을 포함한다: 동형 대조군 래트 IgG2a mAb,항-humaW마우스IL-22 mAb(래트 IgGl 동형), 및 동형 대조군 래트 IgGl mAb. 쥐과IL-20의 중화를 위한 대조군으로서, 임신 암컷은 사람과 쥐과IL-20 모두를 중화할 수 있는가용성IL-20R-Fc4 융합 단백질이나 또는 Fc4 대조군 단백질을 주사한다.
태어난지 1 내지 2일에, 마우스는 반들반들한 피부 표현형의 외양에 대해 가까이 모니터링된다. 2일째에, 마우스를 안락사시키고 꼬리의 일부를 DNA 분리를 위해 수집하여 각각의 마우스의 유전자형(Tg 또는 비Tg)을 결정한다. 피부 샘플을 마우스가 이들 Tg 마우스를 보통 특성화하는 두꺼워진 상피 세포 층을 나타내는지 여부를 평가하기 위해 조직학적 분석을 위해 수집한다. ELISA를 통해서, 각각의 마우스의 혈청에서 항- IL-22RA mAb 의 수준을 정량하기 위해 몸통 혈액 을 또한 마우스로부터 수집한다 (및 태어난지 1일 후에 어미짐승으로부터 눈출혈). 이들 mAbs가 IL-20 및/또는 IL-22 생체내의 유력한 저해제이기 때문에, Tg 마우스는 정상 피부 (즉, 상피 비후 또는 "반들반들한" 외양이 없음)를 가진다.
실시예 41
기관 배양 건선 모델 에서 IL-20 및 IL-22 대항제
사람 건선 플라크 피부는 기관 배양에 유지될 수 있고, 손상 피부의 비정상 조직학적 특징은 외인성 성장 인자의 부재하에서 유지된다. IL-22RA,IL-20, IL-22,BL20R 및/또는 IL- 22R에 대한 항체, 또는 가용성 IL-20 또는 IL-22 수용체가 투여될 수 있고, 건선 손상 피부의 조직학적 특징은 개선될 수 있다.
B. 연구 설계
전체 표피 및 몇mm의 데니스로 구성되는 전체-두께 2-mm 펀치 생체검사법을 건강한 성인 지원자들로부터 또는 건선 손상 피부로부터 얻는다. 생체검사법 직후, 조직은 케라티노사이트 기초 배지(KBM) (클론틱스, Walkersville, MD)으로 구성되는 배양 배지에 담근다. 배양 배지는 CaC12으로 보충하여 최종 Ca2+ 농도를 1.4 mM (Varani et al, 1993,1994)로 가져간다. 생체검사법은 그후 사람IL-20, L-22,IL-22RA, 또는 IL-20 또는 IL-22의 가용성 수용체에 대해서, 추가의 항체 처리가 있거나 없는 200 ul의 Ca2+ 보충된 KBM를 함유하는 96-웰 접시의 웰에서 배양한다. 배양은 95% 공기 및 5%CO2의 분위기에서 8일동안 37℃에서 배양한다.
C. 정량적인 분석 :
배양 기간의 끝에, 조직을 10% 완충화 포르말린에 고정하고 헤마톡실린과 에오신으로 착색한 후에 조직학적으로 검사한다. 항체 또는 가용성 수용체에 노출된 건선 조직의 외양은 정상 조직의 그것과 보다 밀접하게 닮을 수 있었다, 다음의 관찰을 포함하여: 초기 부주의함, 불규칙 형태의 기초 상피 세포는 회복된 극성을 갖는 보다 원주형 외양을 발전시키고; 상피 망 융기 복귀됨, 더 적은 영역의 상피 세포가 피부 공간 안으로 연장; 및 상부 상피 층의 덜 총체적인 퇴화가 존재했다. 기관 배양 모델은 특정한 화합물이 항- 과다증식제로서 포텐셜을 가지는지 여부를 결정하기 위해서 신속하고 민감한 수단을 제공한다. 비정상 조직학적 특징은 IL-20,IL-22 대항제의 존재에서 개선될 수 있고, 건선의 치료에서 그러한 약제의 효과를 제시한다.
실시예 42
중화 mAbsR2. 1.5F4. 1 및 R2. 1.15E2. 1으로의 mIL22RA (zCytoR11m) 영역 결합의 매핑
A. 중화 단일클론 항체가 결합하는 쥐과 IL-22RA에서의 에피토프
하기에 기술한 실험의 목표는 쥐과 IL-22RA 가용성 수용체 단백질 (SEQID NO : 62)의 아미노산 서열에서 수용체 활성에 대해 중요한, 또는 대항제 또는 중화 항체 결합에 대해서 중요한 영역 또는 영역을 확인하는 것이었다. Fc를 제거하기 위해 트롬빈으로 이전에 분할한 쥐과 IL-22RA-Fc 단백질은 그후 시아노겐 브롬화물 (CNBr)로 배양함으로써 서열에서 메티오닌 잔기로 C-종말에 분할되었다. CNBr-발생된 펩티드는 분별되었고, 소부분은 중화성, 클론 R2. 1.5F4. 1 및 R2. 1.15E2. 1을 갖는 단일클론 항체를 사용하여 웨스턴 분석에 의해 검출될 때 ELISA 및 반응성에 의해 결합 활성에 대해 시험되었다.
CNBr로 분할할 때, 하기의 펩티드는 잠재적으로 비-감소된 전장mIL-22RA로부터 발생되었다 (표33). 비-감소 조건하에서, 시스테인은 디술피드-결합되고, 이것은 펩티드 1에서 내부 연결과 펩티드 3과 5 사이의 연결을 초래할 수 있다. 굵은 글씨체로 쓰여진 잔기는 실시예 42B에서 기술된 바와 같이, 잠재적으로 사람 IL-22RA 잔기와 대응하는 리간드 결합에 수반되고 잠재적으로 SEQID NO : 2 또는 SEQID NO : 3에 있는 리간드 결합을 수반한다. 특이적으로, SEQID NO : 48 는 아미노산 잔기 16 (His) 내지 83(Met)의 SEQID NO : 42에 해당하고; SEQID NO : 49 는 아미노산 잔기 84 (Glu) 내지 109 (Met)의 SEQID NO : 42에 해당하고, SEQID NO :50은 아미노산 잔기 110 (Thr) 내지 137(Met)의 SEQID NO : 42에 해당하고, SEQ ID NO : 51는 아미노산 잔기 138(Leu) 내지 177 (Met)의 SEQ ID NO : 42에 해당하고, SEQID NO : 52 는 아미노산 잔기 163 (His) 내지 208 (Pro) 의 SEQID NO : 42 또는 163 (His) 내지 212(Arg)의 SEQ ID NO : 62에 대당한다.
[표 33]
Figure pat00035
1. CNBr 분리 및 펩티드 소부분의 분리
50Mg의 mIL22E는 감압하 동결건조되었고 180/AL의 포름산 (70%)에 재구성되었다. 아세토니트릴에 용해된 1 L의 5M CNBr를 첨가하였다. 샘플은 혼합되고 18 시간 실온에서 반응하도록 어둠속에 방치되었다. 150 AL의 반응 혼합물을 분석 ZorbaxSB300-C8 칼럼으로 맞춰진 역상 HPLC에 의해 분별하였다. 25% 아세토니트릴(0. 085% TFA)과 75% 물 (0.1% TFA)에서 시작하여 95% 아세토니트릴 (0.085% TFA) 및 5% 물 (0. 1% TFA)에서 끝나는 구배를 사용하여 피크를 분리하였다.
UV 분석은 3개의 주요 피크와 2개의 작은 피크를 보였고, 그것을 수집하였다. 각각의 소부분은 절반으로 나뉘어졌다; 한 부분은 ELISA으로 보내고, 나머지 부분은 동결건조되고 150μL의 포스페이트-완충화 식염수 용액(PBS)에 재구성한다. PBS 소부분의 UV 분석은 분석 칼럼으로부터 수집된 모든 피크의 발견을 확인하였다. PBS 부분들은 웨스턴 분석하였다.
2. ELISA
CNBr으로 분할된 IL-22RA로부터 펩티드 서열을 함유하는 HPLC 소부분은 HPLC 완충액 (90% 아세토니트릴, 10% H20, 0.09% 트리플루오로아세트산)을 사용하여 추정된 동일한 농도로 희석되었다. 샘플을 각각 100uL/웰인 4 웰에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 로딩하였고 밤새 실온에서 연기 후드에서 건조시켰다. 플레이트는 ELISAC 완충액 (PBS, 0.05% Tween-20)으로 세척하고, 그후 2 시간동안 37℃에서 ELISA B 완충액 (PBS, 0.1% BSA, 0.05% Tween-20)으로 블록화하였다. IL22RA (클론 R2. 1.5F4. 1, 및 클론 R2.1. 15E2.1)에 대한 2 단일클론 항체 (mAb) 를 ELISA B중에 2yg/mL 로 희석시켰다. 각각의 mAb를 100 L/웰에서 각각의 펩티드 서열 샘플에 첨가하였고 플레이트를 60 분동안 37℃에서 배양하였다. 플레이트는 세척하여 미결합 항체를 제거하고, 제 2 항체 (염소 항-래트 IgG 호스래디쉬 퍼옥시다아제(Jackson)에 접합됨)는 ELISA B 완충액중에 1 g/mL 로 희석시키고 100μL/웰에서 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트는 1 시간동안 37℃에서 배양하였다. 웰은 ELISA C 완충액으로 세척하고, 그후 5분동안 TMB 1 성분 HRP마이크로웰 기질 (BioFx)으로 배양하였다. TMB 마이크로웰 (BioFx)을 위해서 450 nm 중지 시약을 첨가함으로써 반응이 멈췄고 플레이트는 Dynatech ELISA 플레이트 리더에서 (Molecular Devices) 흡광도 450 nm에서 판독하였다.
결과는 mAb R2.1.5F4.1이 HPLC 부분 #4 의 IL22RA CNBR 반응과 반응했다는 것을 암시하고, 이것은 또한 웨스턴 블로팅 실험에서 밴드를 제조하였다.
3. 웨스턴
CNBr으로 분할된 IL22RA 로부터 펩티드 서열을 함유하는 HPLC 소부분은 밤새 실온에서 동결건조되고, PBS에서 재구성되었다.
샘플은 그후 비-감소 샘플 완충액 (Invitrogen)과 혼합되고 10 min동안 끓는다. 샘플은 로딩되고 lx MES-SDS Running 완충액 (Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 4-12% Bis-Tris 겔 (Invitrogen)에서 전기이동작용되고 20% 메탄올 이동 완충액 중의 니트로셀룰로오스 (0.2 Om ; Bio-Rad)로 이동시켰는데, 모두 실온에서였다. 필터는 밤새 실온에서 건조되었다. 필터는 30 분동안 실온에서 완충액 A (50 mM Tris, pH 7.4, 5 mM EDTA, 0.05% Igepal CA-630,150mM NaCI, 0.25% 겔atin) 중의 10% 비-지방 건조 우유로 블록화하였다. IL22RA (클론 R2.1.5F4. 1)으로의 단일클론 항체 (mAb)는 2.5% 비-지방 건조 우유를 함유하는 완충액 A중의 2Itg/mL으로 희석되었다. 블롯을 이 일차 항체에서 1시간동안 실온에서 배양하였다. 배양 후에, 블롯을 완충액 A에서 3회 세척하였고 실온에서 2.5% 비-지방 건조 우유를 갖는 완충액 중에서 제 2 항체 (염소 항-래트 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다아제;Jackson,me)의 1: 5000 희석과 함께 1 시간 배양하였다. 블롯을 그후 세척하고, 화학발광 기질(Lumi-Light 웨스턴 블로팅 기질; Roche)로 현상시키고, 발광성 이미저(MannheimBoehringer Lumi-Imager)를 사용하여 노출시킨다.
30 분 노출을 사용하여, 비-감소 겔은 소부분 #4 및 #5에 대해서 매우 강한 밴드를 나타냈고 소부분 #3에 대해서는 희미한 밴드를 나타냈다. 소부분 #4 는 또한 ELISA에서 양성 시험되었다.
활성 소부분 #4 의 N-종말염기순서분석
분석 역상 칼럼으로부터 수집된 5개의 CNBR 펩티드 소부분 중에, 소부분 #4 는 ELISA에서 활성을 나타냈고 또한 웨스턴 블로팅에 의해 양성이었다. 활성 소부분#4에 존재하는 펩티드를 확인하기 위해, 샘플은 잘 알려진 방법을 사용하여 에드먼 붕괴시켰다. 3 N-종점은 펩티드 2 (SEQID NO : 49), 3 (SEQID NO : 50), 및 5 (SEQ BD NO : 52)와 일치하는 활성 소부분으로부터 확인되었다. 이들 결과는 항체가 펩티드 2 (SEQID NO : 49), 3 (SEQ ID NO : 50), 및 5 (SEQID NO : 52)에 결합되었다는 것을 나타냈다.
[표 34]
Figure pat00036
논의
5개의 소부분은 CNBr-분할된 mIL22RA 펩티드의 혼합물로부터 분리되었다. 이들 중에서, 오로지 소부분 #4는 ELISA에서 활성이었고 웨스턴에 의해 양성이었다.
에드먼 붕괴는 소부분 #4에서 CNBr 펩티드 2 (SEQID NO : 49), 3 (SEQ ID NO : 50), 및 5 (SEQID NO : 52) 와 일치하는 3 N-종점을 확인하였다. 이들 영역 내에서, 6 잔기는 잠재적으로 리간드 결합에 수반된다. 이들 잔기는 SEQ ID NO : 42의 Y93,R112, K210, 및 E211이고, 이것은 또한 SEQ ID NO : 62의 잔기 Y78,R97, K195, 및 E196에 해당한다. SEQID NO : 42의 잔기 Y60 및 F164 는 또한 리간드 결합에 수반된다.
B. 중화 단일클론 항체가 결합되는 사람 IL-22RA 에서의 에피토프
하기 기술된 실험은 수용체 활성, 또는 대항제 또는 중화 항체 결합에 중요한 사람IL-22RA 단백질 (SEQID NO : 2)의 아미노산 서열에 대해서 세포외 도메인에서의 영역 또는 영역을 확인하는 것이 목표이다. 사람 가용성 수용체 IL-22RA 단백질 (예를 들어, SEQED NO : 3, 이를테면, 트롬빈으로 분할되어 Fc를 제거한 IL-22RA-Fc를 포함함)은 그후 시아노겐 브롬화물(CNBr), 또는 사람 단백질을 한정된 단편으로 분할하는 당업계에 알려진 다른 작용제로 배양함으로써 서열에서 C-종말에서 메티오닌 잔기로 분할된다. CNBr-발생된 펩티드는 소부분화되고, 결과의 소부분은 ELISA에 의해 검출될 때 결합 활성에 대해 시험되고 중화 성질을 갖는 단일클론 항체를 사하여, 웨스턴 분석에 의해 반응성에 대해 시험된다.
4개의 시스테인은 SEQ ID N0 : 2의 Cys71-Cys79 및 Cys204-Cys217의 연결 패턴과 결합된 디술피드로 예측된다. CNBr로 분리할때, 다음의 펩티드는 잠재적으로 비-감소된 전장 사람IL-22RA : 펩티드 6(SEQ ID NO : 56), 펩티드 7 (SEQ ID NO : 57); 펩티드 8 (SEQ ID NO : 58); 펩티드 9 (SEQ ID NO : 59); 펩티드 10 (SEQ ID NO : 60); 및 펩티드 11(SEQ ID NO : 61) (표 35)으로부터 발생된다. 시스테인은 디술피드-결합되고, 이것은 펩티드 7 (SEQ ID NO : 57)과 10 (SEQID NO : 60 사이의 가능한 연결을 초래한다. 특이적으로, SEQID NO : 56 는 SEQID NO :3의 아미노산 잔기1 (Pro) 내지 92 (Met)에 해당하고 ; SEQ ID NO : 57 는 SEQID NO : 3의 아미노산 잔기 93 (Thr) 내지 120 (Met)에 해당하고, SEQ ID NO : 58는 SEQID NO : 3의 아미노산 잔기 121 (Ile) 내지 160 (Met)에 해당하고, SEQ ID NO : 59는 SEQ ID NO : 3의 아미노산 잔기 161 (His) 내지 185 (Met)에 해당하고, SEQID NO : 60는 SEQID NO : 3 의 아미노산 잔기186(Ile) 내지 199 (Met)에 해당하고 SEQ ID NO : 61는 SEQ ID NO : 3의 아미노산 잔기 200 (Cys) 내지 211(Thr) 에 해당한다.
[표 35]
Figure pat00037
4. 펩티드 소부분, 웨스턴 및 ELISA의 CNBr 분할 및 분리, 및 N-종말 염기순서분석
약 50μg의 사람 IL22RA을 동결건조시키고 재구성하여, 소부분화하고, 수집하고 웨스턴 분석, 및 실시예 42A에서 기술한 바와 같은 ELISA 을 사용하여, 분석하여 항-IL-22RA 단일클론 항체을 함유하는 소부분과, ELISA 및 웨스턴 분석에 의해 나타날때 IL-22RA을 결합시키는 것들을 확인한다. 분석 역상 칼럼으로부터 수집된 CNBr 펩티드 소부분은, ELISA에서 활성에 대해 시험되고 웨스턴 블로팅에 의해 양성 으로 확인된다. 양성 소부분에 대해서, 펩티드는 잘 알려진 방법을 사용하여 에드먼 붕괴를 통해 확인된다.
논의
마우스 CNBr 펩티드 #5 (SEQ ID NO : 52)는 사람 CNBr 펩티드 #9, 및 #10 (SEQ ID NO :59 및 SED ID NO : 60)에 해당하고; 마우스 CNBr 펩티드#2 (SEQID NO : 49)는 사람CNBr #6 (SEQ ID N0 : 56)에 해당하고; 마우스 CNBr 펩티드#3 (SEQ ID NO : 50)는 사람 CNBr #7 (SEQID NO :57)에 해당한다. 혼합물로부터 분리되는 소부분 중에서 CNBr-분할된 사람IL-22RA 펩티드, 가능한 영역내에 있는 6 잔기는 잠재적으로 리간드 결합에 수반된다: 리간드-수용체 결합에 중요한 SEQID NO : 2 (및 SEQ ID NO : 3의 대응하는 잔기)의 잔기는 SEQID NO : 2의 Tyr-60, 및 Phe-164, Tyr-93, Arg- 112,Lys-210, 및 Glu-211 및 (및 SEQID NO :3의 해당되는 잔기)을 포함한다. 더욱이, 리간드-수용체 결합을 지시하는데 중요한 SEQID NO : 2 의 일차 잔기 (및 SEQ ID NO : 3의 대응하는 잔기)는 SEQID NO : 2 의 Tyr-60, 및 Phe-164(및 SEQ ID NO : 3의 대응하는 잔기)를 포함하고, 제 2 잔기는 SEQID NO : 2 의 잔기 Tyr-93, Arg-112,Lys-210, 및 Glu-211 및 (및 SEQID NO :3의 대응하는 잔기)를 포함한다.
앞서 말한 것으로부터, 비록 본 발명의 특이적인 구체예가 예증의 목적으로 본원에서 기술되었지만, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 만들어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항에 의해서만 제외하고 한정되지 않는다.
<110> ZymoGenetics, Inc. <120> ANTI-IL-22RA ANTIBODIES AND BINDING PARTNERS AND METHODS OF USING IN INFLAMMATION <130> 04-04PC <150> US 60/457,481 <151> 2003-03-24 <150> US 60/523,295 <151> 2003-11-17 <160> 62 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2831 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (34)..(1755) <400> 1 tagaggccaa gggagggctc tgtgccagcc ccg atg agg acg ctg ctg 48 Met Arg Thr Leu Leu 1 5 acc atc ttg act gtg gga tcc ctg gct gct cac gcc cct gag gac ccc 96 Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His Ala Pro Glu Asp Pro 10 15 20 tcg gat ctg ctc cag cac gtg aaa ttc cag tcc agc aac ttt gaa aac 144 Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn 25 30 35 atc ctg acg tgg gac agc ggg cca gag ggc acc cca gac acg gtc tac 192 Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro Asp Thr Val Tyr 40 45 50 agc atc gag tat aag acg tac gga gag agg gac tgg gtg gca aag aag 240 Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys 55 60 65 ggc tgt cag cgg atc acc cgg aag tcc tgc aac ctg acg gtg gag acg 288 Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr 70 75 80 85 ggc aac ctc acg gag ctc tac tat gcc agg gtc acc gct gtc agt gcg 336 Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala 90 95 100 gga ggc cgg tca gcc acc aag atg act gac agg ttc agc tct ctg cag 384 Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln 105 110 115 cac act acc ctc aag cca cct gat gtg acc tgt atc tcc aaa gtg aga 432 His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg 120 125 130 tcg att cag atg att gtt cat cct acc ccc acg cca atc cgt gca ggc 480 Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly 135 140 145 gat ggc cac cgg cta acc ctg gaa gac atc ttc cat gac ctg ttc tac 528 Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr 150 155 160 165 cac tta gag ctc cag gtc aac cgc acc tac caa atg cac ctt gga ggg 576 His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met His Leu Gly Gly 170 175 180 aag cag aga gaa tat gag ttc ttc ggc ctg acc cct gac aca gag ttc 624 Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe 185 190 195 ctt ggc acc atc atg att tgc gtt ccc acc tgg gcc aag gag agt gcc 672 Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala 200 205 210 ccc tac atg tgc cga gtg aag aca ctg cca gac cgg aca tgg acc tac 720 Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr Trp Thr Tyr 215 220 225 tcc ttc tcc gga gcc ttc ctg ttc tcc atg ggc ttc ctc gtc gca gta 768 Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly Phe Leu Val Ala Val 230 235 240 245 ctc tgc tac ctg agc tac aga tat gtc acc aag ccg cct gca cct ccc 816 Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys Pro Pro Ala Pro Pro 250 255 260 aac tcc ctg aac gtc cag cga gtc ctg act ttc cag ccg ctg cgc ttc 864 Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe Gln Pro Leu Arg Phe 265 270 275 atc cag gag cac gtc ctg atc cct gtc ttt gac ctc agc ggc ccc agc 912 Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Phe Asp Leu Ser Gly Pro Ser 280 285 290 agt ctg gcc cag cct gtc cag tac tcc cag atc agg gtg tct gga ccc 960 Ser Leu Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile Arg Val Ser Gly Pro 295 300 305 agg gag ccc gca gga gct cca cag cgg cat agc ctg tcc gag atc acc 1008 Arg Glu Pro Ala Gly Ala Pro Gln Arg His Ser Leu Ser Glu Ile Thr 310 315 320 325 tac tta ggg cag cca gac atc tcc atc ctc cag ccc tcc aac gtg cca 1056 Tyr Leu Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln Pro Ser Asn Val Pro 330 335 340 cct ccc cag atc ctc tcc cca ctg tcc tat gcc cca aac gct gcc cct 1104 Pro Pro Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala Pro Asn Ala Ala Pro 345 350 355 gag gtc ggg ccc cca tcc tat gca cct cag gtg acc ccc gaa gct caa 1152 Glu Val Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val Thr Pro Glu Ala Gln 360 365 370 ttc cca ttc tac gcc cca cag gcc atc tct aag gtc cag cct tcc tcc 1200 Phe Pro Phe Tyr Ala Pro Gln Ala Ile Ser Lys Val Gln Pro Ser Ser 375 380 385 tat gcc cct caa gcc act ccg gac agc tgg cct ccc tcc tat ggg gta 1248 Tyr Ala Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro Pro Ser Tyr Gly Val 390 395 400 405 tgc atg gaa ggt tct ggc aaa gac tcc ccc act ggg aca ctt tct agt 1296 Cys Met Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr Gly Thr Leu Ser Ser 410 415 420 cct aaa cac ctt agg cct aaa ggt cag ctt cag aaa gag cca cca gct 1344 Pro Lys His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln Lys Glu Pro Pro Ala 425 430 435 gga agc tgc atg tta ggt ggc ctt tct ctg cag gag gtg acc tcc ttg 1392 Gly Ser Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Gln Glu Val Thr Ser Leu 440 445 450 gct atg gag gaa tcc caa gaa gca aaa tca ttg cac cag ccc ctg ggg 1440 Ala Met Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu His Gln Pro Leu Gly 455 460 465 att tgc aca gac aga aca tct gac cca aat gtg cta cac agt ggg gag 1488 Ile Cys Thr Asp Arg Thr Ser Asp Pro Asn Val Leu His Ser Gly Glu 470 475 480 485 gaa ggg aca cca cag tac cta aag ggc cag ctc ccc ctc ctc tcc tca 1536 Glu Gly Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu Pro Leu Leu Ser Ser 490 495 500 gtc cag atc gag ggc cac ccc atg tcc ctc cct ttg caa cct cct tcc 1584 Val Gln Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro Leu Gln Pro Pro Ser 505 510 515 ggt cca tgt tcc ccc tcg gac caa ggt cca agt ccc tgg ggc ctg ctg 1632 Gly Pro Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser Pro Trp Gly Leu Leu 520 525 530 gag tcc ctt gtg tgt ccc aag gat gaa gcc aag agc cca gcc cct gag 1680 Glu Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys Ser Pro Ala Pro Glu 535 540 545 acc tca gac ctg gag cag ccc aca gaa ctg gat tct ctt ttc aga ggc 1728 Thr Ser Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp Ser Leu Phe Arg Gly 550 555 560 565 ctg gcc ctg act gtg cag tgg gag tcc tgagg ggaatgggaa aggcttggtg 1780 Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser 570 cttcctccct gtccctaccc agtgtcacat ccttggctgt caatcccatg cctgcccatg 1840 ccacacactc tgcgatctgg cctcagacgg gtgcccttga gagaagcaga gggagtggca 1900 tgcagggccc ctgccatggg tgcgctcctc accggaacaa agcagcatga taaggactgc 1960 agcgggggag ctctggggag cagcttgtgt agacaagcgc gtgctcgctg agccctgcaa 2020 ggcagaaatg acagtgcaag gaggaaatgc agggaaactc ccgaggtcca gagccccacc 2080 tcctaacacc atggattcaa agtgctcagg gaatttgcct ctccttgccc cattcctggc 2140 cagtttcaca atctagctcg acagagcatg aggcccctgc ctcttctgtc attgttcaaa 2200 ggtgggaaga gagcctggaa aagaaccagg cctggaaaag aaccagaagg aggctgggca 2260 gaaccagaac aacctgcact tctgccaagg ccagggccag caggacggca ggactctagg 2320 gaggggtgtg gcctgcagct cattcccagc cagggcaact gcctgacgtt gcacgatttc 2380 agcttcattc ctctgataga acaaagcgaa atgcaggtcc accagggagg gagacacaca 2440 agccttttct gcaggcagga gtttcagacc ctatcctgag aatggggttt gaaaggaagg 2500 tgagggctgt ggcccctgga cgggtacaat aacacactgt actgatgtca caactttgca 2560 agctctgcct tgggttcagc ccatctgggc tcaaattcca gcctcaccac tcacaagctg 2620 tgtgacttca aacaaatgaa atcagtgccc agaacctcgg tttcctcatc tgtaatgtgg 2680 ggatcataac acctacctca tggagttgtg gtgaagatga aatgaagtca tgtctttaaa 2740 gtgcttaata gtgcctggta catgggcagt gcccaataaa cggtagctat ttaaaaaaaa 2800 aaaaaaaaaa aaaaaatagc ggccgcctcg a 2831 <210> 2 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Thr Leu Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His 1 5 10 15 Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser 20 25 30 Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr 35 40 45 Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp 50 55 60 Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn 65 70 75 80 Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val 85 90 95 Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg 100 105 110 Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys 115 120 125 Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe 145 150 155 160 His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln 165 170 175 Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr 180 185 190 Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp 195 200 205 Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp 210 215 220 Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly 225 230 235 240 Phe Leu Val Ala Val Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys 245 250 255 Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe 260 265 270 Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Phe Asp 275 280 285 Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile 290 295 300 Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Ala Gly Ala Pro Gln Arg His Ser 305 310 315 320 Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Pro Ser Asn Val Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala 340 345 350 Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val 355 360 365 Thr Pro Glu Ala Gln Phe Pro Phe Tyr Ala Pro Gln Ala Ile Ser Lys 370 375 380 Val Gln Pro Ser Ser Tyr Ala Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro 385 390 395 400 Pro Ser Tyr Gly Val Cys Met Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr 405 410 415 Gly Thr Leu Ser Ser Pro Lys His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln 420 425 430 Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Gln 435 440 445 Glu Val Thr Ser Leu Ala Met Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu 450 455 460 His Gln Pro Leu Gly Ile Cys Thr Asp Arg Thr Ser Asp Pro Asn Val 465 470 475 480 Leu His Ser Gly Glu Glu Gly Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu 485 490 495 Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro 500 505 510 Leu Gln Pro Pro Ser Gly Pro Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser 515 520 525 Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys 530 535 540 Ser Pro Ala Pro Glu Thr Ser Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp 545 550 555 560 Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser 565 570 <210> 3 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser 1 5 10 15 Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro 20 25 30 Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp 35 40 45 Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu 50 55 60 Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr 65 70 75 80 Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe 85 90 95 Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile 100 105 110 Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro 115 120 125 Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His 130 135 140 Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met 145 150 155 160 His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro 165 170 175 Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala 180 185 190 Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg 195 200 205 Thr Trp Thr 210 <210> 4 <211> 541 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A Soluble IL-22RA-Fc Fusion Polypeptide <400> 4 Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser 1 5 10 15 Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro 20 25 30 Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp 35 40 45 Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu 50 55 60 Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr 65 70 75 80 Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe 85 90 95 Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile 100 105 110 Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro 115 120 125 Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His 130 135 140 Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met 145 150 155 160 His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro 165 170 175 Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala 180 185 190 Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg 195 200 205 Thr Trp Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 210 215 220 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 225 230 235 240 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 245 250 255 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 260 265 270 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 275 280 285 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 290 295 300 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 305 310 315 320 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 325 330 335 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 340 345 350 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 355 360 365 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 370 375 380 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 385 390 395 400 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 405 410 415 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 420 425 430 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 435 440 445 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 450 455 460 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 465 470 475 480 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 485 490 495 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 500 505 510 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 515 520 525 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 530 535 540 <210> 5 <211> 1116 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (21)..(557) <400> 5 tcgagttaga attgtctgca atg gcc gcc ctg cag aaa tct gtg agc tct ttc 53 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe 1 5 10 ctt atg ggg acc ctg gcc acc agc tgc ctc ctt ctc ttg gcc ctc ttg 101 Leu Met Gly Thr Leu Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu 15 20 25 gta cag gga gga gca gct gcg ccc atc agc tcc cac tgc agg ctt gac 149 Val Gln Gly Gly Ala Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp 30 35 40 aag tcc aac ttc cag cag ccc tat atc acc aac cgc acc ttc atg ctg 197 Lys Ser Asn Phe Gln Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu 45 50 55 gct aag gag gct agc ttg gct gat aac aac aca gac gtt cgt ctc att 245 Ala Lys Glu Ala Ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile 60 65 70 75 ggg gag aaa ctg ttc cac gga gtc agt atg agt gag cgc tgc tat ctg 293 Gly Glu Lys Leu Phe His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu 80 85 90 atg aag cag gtg ctg aac ttc acc ctt gaa gaa gtg ctg ttc cct caa 341 Met Lys Gln Val Leu Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln 95 100 105 tct gat agg ttc cag cct tat atg cag gag gtg gtg ccc ttc ctg gcc 389 Ser Asp Arg Phe Gln Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala 110 115 120 agg ctc agc aac agg cta agc aca tgt cat att gaa ggt gat gac ctg 437 Arg Leu Ser Asn Arg Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu 125 130 135 cat atc cag agg aat gtg caa aag ctg aag gac aca gtg aaa aag ctt 485 His Ile Gln Arg Asn Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu 140 145 150 155 gga gag agt gga gag atc aaa gca att gga gaa ctg gat ttg ctg ttt 533 Gly Glu Ser Gly Glu Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe 160 165 170 atg tct ctg aga aat gcc tgc att tga ccagagcaaa gctgaaaaat 580 Met Ser Leu Arg Asn Ala Cys Ile 175 gaataactaa ccccctttcc ctgctagaaa taacaattag atgccccaaa gcgatttttt 640 ttaaccaaaa ggaagatggg aagccaaact ccatcatgat gggtggattc caaatgaacc 700 cctgcgttag ttacaaagga aaccaatgcc acttttgttt ataagaccag aaggtagact 760 ttctaagcat agatatttat tgataacatt tcattgtaac tggtgttcta tacacagaaa 820 acaatttatt ttttaaataa ttgtcttttt ccataaaaaa gattactttc cattccttta 880 ggggaaaaaa cccctaaata gcttcatgtt tccataatca gtactttata tttataaatg 940 tatttattat tattataaga ctgcatttta tttatatcat tttattaata tggatttatt 1000 tatagaaaca tcattcgata ttgctacttg agtgtaaggc taatattgat atttatgaca 1060 ataattatag agctataaca tgtttatttg acctcaataa acacttggat atccta 1116 <210> 6 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg 115 120 125 Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn 130 135 140 Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn 165 170 175 Ala Cys Ile <210> 7 <211> 926 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (45)..(572) <220> <221> variation <222> (188) <223> Nucleotide may be C or G at position 188 <220> <221> variation <222> (186)..(188) <223> Amino acid at position 186-188(PRT position 48) can be a D (Asp) or E (Glu) <400> 7 ctttgaattc ctagctcctg tggtctccag atttcaggcc taag atg aaa gcc 53 Met Lys Ala 1 tct agt ctt gcc ttc agc ctt ctc tct gct gcg ttt tat ctc cta tgg 101 Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr Leu Leu Trp 5 10 15 act cct tcc act gga ctg aag aca ctc aat ttg gga agc tgt gtg atc 149 Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser Cys Val Ile 20 25 30 35 gcc aca aac ctt cag gaa ata cga aat gga ttt tct gas ata cgg ggc 197 Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Xaa Ile Arg Gly 40 45 50 agt gtg caa gcc aaa gat gga aac att gac atc aga atc tta agg agg 245 Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile Leu Arg Arg 55 60 65 act gag tct ttg caa gac aca aag cct gcg aat cga tgc tgc ctc ctg 293 Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys Cys Leu Leu 70 75 80 cgc cat ttg cta aga ctc tat ctg gac agg gta ttt aaa aac tac cag 341 Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys Asn Tyr Gln 85 90 95 acc cct gac cat tat act ctc cgg aag atc agc agc ctc gcc aat tcc 389 Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser 100 105 110 115 ttt ctt acc atc aag aag gac ctc cgg ctc tgt cat gcc cac atg aca 437 Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala His Met Thr 120 125 130 tgc cat tgt ggg gag gaa gca atg aag aaa tac agc cag att ctg agt 485 Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln Ile Leu Ser 135 140 145 cac ttt gaa aag ctg gaa cct cag gca gca gtt gtg aag gct ttg ggg 533 His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys Ala Leu Gly 150 155 160 gaa cta gac att ctt ctg caa tgg atg gag gag aca gaa taggagga 580 Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu 165 170 175 aagtgatgct gctgctaaga atattcgagg tcaagagctc cagtcttcaa tacctgcaga 640 ggaggcatga ccccaaacca ccatctcttt actgtactag tcttgtgctg gtcacagtgt 700 atcttattta tgcattactt gcttccttgc atgattgtct ttatgcatcc ccaatcttaa 760 ttgagaccat acttgtataa gatttttgta atatctttct gctattggat atatttatta 820 gttaatatat ttatttattt tttgctatta atgtatttaa ttttttactt gggcatgaaa 880 ctttaaaaaa aattcacaag attatattta taacctgact agagca 926 <210> 8 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Lys Ala Ser Ser Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ser Ala Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser 20 25 30 Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Xaa 35 40 45 Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile 50 55 60 Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys 65 70 75 80 Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95 Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala 115 120 125 His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln 130 135 140 Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160 Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu 165 170 175 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide Linker <400> 9 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 1050 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (5)..(586) <400> 10 aaca ggc tct cct ctc act tat caa ctt ttg aca ctt gtg cga tcg 46 Gly Ser Pro Leu Thr Tyr Gln Leu Leu Thr Leu Val Arg Ser 1 5 10 gtg atg gct gtc ctg cag aaa tct atg agt ttt tcc ctt atg ggg act 94 Val Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr 15 20 25 30 ttg gcc gcc agc tgc ctg ctt ctc att gcc ctg tgg gcc cag gag gca 142 Leu Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala 35 40 45 aat gcg ctg ccc atc aac acc cgg tgc aag ctt gag gtg tcc aac ttc 190 Asn Ala Leu Pro Ile Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe 50 55 60 cag cag ccg tac atc gtc aac cgc acc ttt atg ctg gcc aag gag gcc 238 Gln Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala 65 70 75 agc ctt gca gat aac aac aca gac gtc cgg ctc atc ggg gag aaa ctg 286 Ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu 80 85 90 ttc cga gga gtc agt gct aag gat cag tgc tac ctg atg aag cag gtg 334 Phe Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val 95 100 105 110 ctc aac ttc acc ctg gaa gac att ctg ctc ccc cag tca gac agg ttc 382 Leu Asn Phe Thr Leu Glu Asp Ile Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe 115 120 125 cgg ccc tac atg cag gag gtg gtg cct ttc ctg acc aaa ctc agc aat 430 Arg Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn 130 135 140 cag ctc agc tcc tgt cac atc agt ggt gac gac cag aac atc cag aag 478 Gln Leu Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys 145 150 155 aat gtc aga agg ctg aag gag aca gtg aaa aag ctt gga gag agc gga 526 Asn Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly 160 165 170 gag atc aaa gcg atc ggg gaa ctg gac ctg ctg ttt atg tct ctg aga 574 Glu Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg 175 180 185 190 aat gct tgc gtc tgag cgagaagaag ctagaaaacg aagaactgct ccttcctgcc 630 Asn Ala Cys Val ttctaaaaag aacaataaga tccctgaatg gactttttta ctaaaggaaa gtgagaagct 690 aacgtccacc atcattagaa gatttcacat gaaacctggc tcagttgaaa gagaaaatag 750 tgtcaagttg tccatgagac cagaggtaga cttgataacc acaaagattc attgacaata 810 ttttattgtc attgataatg caacagaaaa agtatgtact ttaaaaaatt gtttgaaagg 870 aggttacctc tcattcctct agaagaaaag cctatgtaac ttcatttcca taaccaatac 930 tttatatatg taagtttatt tattataagt atacatttta tttatgtcag tttattaata 990 tggatttatt tatagaaaaa ttatctgatg ttgatatttg agtataaagc aaataatatt 1050 1050 <210> 11 <211> 194 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Gly Ser Pro Leu Thr Tyr Gln Leu Leu Thr Leu Val Arg Ser Val Met 1 5 10 15 Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu Ala 20 25 30 Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn Ala 35 40 45 Leu Pro Ile Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln Gln 50 55 60 Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 65 70 75 80 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe Arg 85 90 95 Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 100 105 110 Phe Thr Leu Glu Asp Ile Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Arg Pro 115 120 125 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln Leu 130 135 140 Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn Val 145 150 155 160 Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 165 170 175 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 180 185 190 Cys Val <210> 12 <211> 2149 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(693) <400> 12 atg atg cct aaa cat tgc ttt cta ggc ttc ctc atc agt ttc ttc ctt 48 Met Met Pro Lys His Cys Phe Leu Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe Leu 1 5 10 15 act ggt gta gca gga act cag tca acg cat gag tct ctg aag cct cag 96 Thr Gly Val Ala Gly Thr Gln Ser Thr His Glu Ser Leu Lys Pro Gln 20 25 30 agg gta caa ttt cag tcc cga aat ttt cac aac att ttg caa tgg cag 144 Arg Val Gln Phe Gln Ser Arg Asn Phe His Asn Ile Leu Gln Trp Gln 35 40 45 cct ggg agg gca ctt act ggc aac agc agt gtc tat ttt gtg cag tac 192 Pro Gly Arg Ala Leu Thr Gly Asn Ser Ser Val Tyr Phe Val Gln Tyr 50 55 60 aaa ata tat gga cag aga caa tgg aaa aat aaa gaa gac tgt tgg ggt 240 Lys Ile Tyr Gly Gln Arg Gln Trp Lys Asn Lys Glu Asp Cys Trp Gly 65 70 75 80 act caa gaa ctc tct tgt gac ctt acc agt gaa acc tca gac ata cag 288 Thr Gln Glu Leu Ser Cys Asp Leu Thr Ser Glu Thr Ser Asp Ile Gln 85 90 95 gaa cct tat tac ggg agg gtg agg gcg gcc tcg gct ggg agc tac tca 336 Glu Pro Tyr Tyr Gly Arg Val Arg Ala Ala Ser Ala Gly Ser Tyr Ser 100 105 110 gaa tgg agc atg acg ccg cgg ttc act ccc tgg tgg gaa aca aaa ata 384 Glu Trp Ser Met Thr Pro Arg Phe Thr Pro Trp Trp Glu Thr Lys Ile 115 120 125 gat cct cca gtc atg aat ata acc caa gtc aat ggc tct ttg ttg gta 432 Asp Pro Pro Val Met Asn Ile Thr Gln Val Asn Gly Ser Leu Leu Val 130 135 140 att ctc cat gct cca aat tta cca tat aga tac caa aag gaa aaa aat 480 Ile Leu His Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Arg Tyr Gln Lys Glu Lys Asn 145 150 155 160 gta tct ata gaa gat tac tat gaa cta cta tac cga gtt ttt ata att 528 Val Ser Ile Glu Asp Tyr Tyr Glu Leu Leu 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cggtcctgaa gcaatggttt ttcactctct tattgagcca attaaattga 1140 cattgctttg acaatttaaa acttctataa aggtgaatat ttttcataca tttctatttt 1200 atatgaatat actttttata tatttattat tattaaatat ttctacttaa tgaatcaaaa 1260 ttttgtttta aagtctactt tatgtaaata agaacaggtt ttggggaaaa aaatcttatg 1320 atttctggat tgatatctga attaaaacta tcaacaacaa ggaagtctac tctgtacaat 1380 tgtccctcat ttaaaagata tattaagctt ttcttttctg tttgtttttg ttttgtttag 1440 tttttaatcc tgtcttagaa gaacttatct ttattctcaa aattaaatgt aattttttta 1500 gtgacaaaga agaaaggaaa cctcattact caatccttct ggccaagagt gtcttgcttg 1560 tggcgccttc ctcatctcta tataggagga tcccatgaat gatggtttat tgggaactgc 1620 tggggtcgac cccatacaga gaactcagct tgaagctgga agcacacagt gggtagcagg 1680 agaaggaccg gtgttggtag gtgcctacag agactataga gctagacaaa gccctccaaa 1740 ctggcccctc ctgctcactg cctctcctga gtagaaatct ggtgacctaa ggctcagtgc 1800 ggtcaacaga aagctgcctt cttcacttga ggctaagtct tcatatatgt ttaaggttgt 1860 ctttctagtg aggagataca tatcagagaa catttgtaca attccccatg aaaattgctc 1920 caaagttgat aacaatatag tcggtgcttc tagttatatg caagtactca gtgataaatg 1980 gattaaaaaa tattcagaaa tgtattgggg ggtggaggag aataagaggc agagcaagag 2040 ctagagaatt ggtttccttg cttccctgta tgctcagaaa acattgattt gagcatagac 2100 gcagagactg aaaaaaaaaa aatgctcgag cggccgccat atccttggt 2149 <210> 13 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Met Pro Lys His Cys Phe Leu Gly Phe Leu Ile Ser Phe Phe Leu 1 5 10 15 Thr Gly Val Ala Gly Thr Gln Ser Thr His Glu Ser Leu Lys Pro Gln 20 25 30 Arg Val Gln Phe Gln Ser Arg Asn Phe His Asn Ile Leu Gln Trp Gln 35 40 45 Pro Gly Arg Ala Leu Thr Gly Asn Ser Ser Val Tyr Phe Val Gln Tyr 50 55 60 Lys Ile Tyr Gly Gln Arg Gln Trp Lys Asn Lys Glu Asp Cys Trp Gly 65 70 75 80 Thr Gln Glu Leu Ser Cys Asp Leu Thr Ser Glu Thr Ser Asp Ile Gln 85 90 95 Glu Pro Tyr Tyr Gly Arg Val Arg Ala Ala Ser Ala Gly Ser Tyr Ser 100 105 110 Glu Trp Ser Met Thr Pro Arg Phe Thr Pro Trp Trp Glu Thr Lys Ile 115 120 125 Asp Pro Pro Val Met Asn Ile Thr Gln Val Asn Gly Ser Leu Leu Val 130 135 140 Ile Leu His Ala Pro Asn Leu Pro Tyr Arg Tyr Gln Lys Glu Lys Asn 145 150 155 160 Val Ser Ile Glu Asp Tyr Tyr Glu Leu Leu Tyr Arg Val Phe Ile Ile 165 170 175 Asn Asn Ser Leu Glu Lys Glu Gln Lys Val Tyr Glu Gly Ala His Arg 180 185 190 Ala Val Glu Ile Glu Ala Leu Thr Pro His Ser Ser Tyr Cys Val Val 195 200 205 Ala Glu Ile Tyr Gln Pro Met Leu Asp Arg Arg Ser Gln Arg Ser Glu 210 215 220 Glu Arg Cys Val Glu Ile Pro 225 230 <210> 14 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-Terminal Fc4 tag <400> 14 gagcccagat cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag 60 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 699 <210> 15 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu-Glu (CEE) Peptide Tag <400> 15 Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu-Glu (CEE) Peptide Tag with spacer <400> 16 Gly Ser Gly Gly Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 10 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC39289 <400> 17 tccgaggagt caatgctaag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer ZC39290 <400> 18 tccaagcttt ttcactgtct 20 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer ZC39776 <400> 19 gggcccgcta gcacct 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IL-20 TaqMan probe ZC40544 <400> 27 agaaggacct ccggctctgt catgc 25 <210> 28 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC45,593 <400> 28 caggaaatcc atgccgagtt gagacgcttc cgtagacacg cccctgagga cccctcg 57 <210> 29 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC45,592 <400> 29 tctgggctca ccgcttccag acccgcttcc agacccgctt cctgtccggt ctggcagtgt 60 ctt 63 <210> 30 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC45,591 <400> 30 gaccggacag gaagcgggtc tggaagcggg tctggaagcg gtgagcccag aggccccaca 60 atc 63 <210> 31 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC45,594 <400> 31 agagctgttt taaggcgcgc ctctagatta tttttattta cccggagtcc gggagaa 57 <210> 32 <211> 531 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(528) <400> 32 atg aaa ggc ttt ggt ctt gcc ttt gga ctg ttc tcc gct gtg ggt ttt 48 Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala Val Gly Phe 1 5 10 15 ctt ctc tgg act cct tta act ggg ctc aag acc ctc cat ttg gga agc 96 Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser 20 25 30 tgt gtg att act gca aac cta cag gca ata caa aag gaa ttt tct gag 144 Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu 35 40 45 att cgg gat agt gtg caa gct gaa gat aca aat att gac atc aga att 192 Ile Arg Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Thr Asn Ile Asp Ile Arg Ile 50 55 60 tta agg acg act gag tct ttg aaa gac ata aag tct ttg gat agg tgc 240 Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ser Leu Asp Arg Cys 65 70 75 80 tgc ttc ctt cgt cat cta gtg aga ttc tat ctg gac agg gta ttc aaa 288 Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95 gtc tac cag acc cct gac cac cat acc ctg aga aag atc agc agc ctc 336 Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu 100 105 110 gcc aac tcc ttt ctt atc atc aag aag gac ctc tca gtc tgt cat tct 384 Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser 115 120 125 cac atg gca tgt cat tgt ggg gaa gaa gca atg gag aaa tac aac caa 432 His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln 130 135 140 att ctg agt cac ttc ata gag ttg gaa ctt cag gca gcg gtg gta aag 480 Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160 gct ttg gga gaa cta ggc att ctt ctg aga tgg atg gag gag atg cta 528 Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu 165 170 175 ta g 531 <210> 33 <211> 176 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Met Lys Gly Phe Gly Leu Ala Phe Gly Leu Phe Ser Ala Val Gly Phe 1 5 10 15 Leu Leu Trp Thr Pro Leu Thr Gly Leu Lys Thr Leu His Leu Gly Ser 20 25 30 Cys Val Ile Thr Ala Asn Leu Gln Ala Ile Gln Lys Glu Phe Ser Glu 35 40 45 Ile Arg Asp Ser Val Gln Ala Glu Asp Thr Asn Ile Asp Ile Arg Ile 50 55 60 Leu Arg Thr Thr Glu Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ser Leu Asp Arg Cys 65 70 75 80 Cys Phe Leu Arg His Leu Val Arg Phe Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95 Val Tyr Gln Thr Pro Asp His His Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ile Lys Lys Asp Leu Ser Val Cys His Ser 115 120 125 His Met Ala Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Glu Lys Tyr Asn Gln 130 135 140 Ile Leu Ser His Phe Ile Glu Leu Glu Leu Gln Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160 Ala Leu Gly Glu Leu Gly Ile Leu Leu Arg Trp Met Glu Glu Met Leu 165 170 175 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC22901 <400> 34 catcaaaccg cctgatgtga c 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC45039 <400> 35 attaggcttg ggagggaatg g 21 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC38573 <400> 36 tggcgatgcc tgcttgccga ata 23 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC25223 <400> 37 gtcttcctca catctgttat cg 22 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer ZC40128 <400> 38 ggcttgaact ttgagaaagg cagt 24 <210> 39 <211> 1473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-22RA Extracellular domain with tPA leader and fused to murine gamma 2a heavy chain Fc region (mG2a) <220> <221> CDS <222> (1)..(1470) <400> 39 atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg ctg ctg tgt ggc 48 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 gcc gtc ttc gtt tcg ctc agc cag gaa atc cat gcc gag ttg aga cgc 96 Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 ttc cgt aga cac gcc cct gag gac ccc tcg gat ctg ctc cag cac gtg 144 Phe Arg Arg His Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val 35 40 45 aaa ttc cag tcc agc aac ttt gaa aac atc ctg acg tgg gac agc ggg 192 Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly 50 55 60 cca gag ggc acc cca gac acg gtc tac agc atc gag tat aag acg tac 240 Pro Glu Gly Thr Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr 65 70 75 80 gga gag agg gac tgg gtg gca aag aag ggc tgt cag cgg atc acc cgg 288 Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg 85 90 95 aag tcc tgc aac ctg acg gtg gag acg ggc aac ctc acg gag ctc tac 336 Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr 100 105 110 tat gcc agg gtc acc gct gtc agt gcg gga ggc cgg tca gcc acc aag 384 Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys 115 120 125 atg act gac agg ttc agc tct ctg cag cac act acc ctc aag cca cct 432 Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro 130 135 140 gat gtg acc tgt atc tcc aaa gtg aga tcg att cag atg att gtt cat 480 Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His 145 150 155 160 cct acc ccc acg cca atc cgt gca ggc gat ggc cac cgg cta acc ctg 528 Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu 165 170 175 gaa gac atc ttc cat gac ctg ttc tac cac tta gag ctc cag gtc aac 576 Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn 180 185 190 cgc acc tac caa atg cac ctt gga ggg aag cag aga gaa tat gag ttc 624 Arg Thr Tyr Gln Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe 195 200 205 ttc ggc ctg acc cct gac aca gag ttc ctt ggc acc atc atg att tgc 672 Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys 210 215 220 gtt ccc acc tgg gcc aag gag agt gcc ccc tac atg tgc cga gtg aag 720 Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys 225 230 235 240 aca ctg cca gac cgg aca gga agc ggg tct gga agc ggg tct gga agc 768 Thr Leu Pro Asp Arg Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 245 250 255 ggt gag ccc aga ggc ccc aca atc aag ccc tgt cct cca tgc aaa tgc 816 Gly Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 260 265 270 cca gca cct aac ctc ttg ggt gga cca tcc gtc ttc atc ttc cct cca 864 Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 275 280 285 aag atc aag gat gta ctc atg atc tcc ctg agc ccc ata gtc aca tgt 912 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 290 295 300 gtg gtg gtg gat gtg agc gag gat gac cca gat gtc cag atc agc tgg 960 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 305 310 315 320 ttt gtg aac aac gtg gaa gta cac aca gct cag aca caa acc cat aga 1008 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 325 330 335 gag gat tac aac agt act ctc cgg gtg gtc agt gcc ctc ccc atc cag 1056 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 340 345 350 cac cag gac tgg atg agt ggc aag gag ttc aaa tgc aag gtc aac aac 1104 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 355 360 365 aaa gac ctc cca gcg ccc atc gag aga acc atc tca aaa ccc aaa ggg 1152 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 370 375 380 tca gta aga gct cca cag gta tat gtc ttg cct cca cca gaa gaa gag 1200 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 385 390 395 400 atg act aag aaa cag gtc act ctg acc tgc atg gtc aca gac ttc atg 1248 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 405 410 415 cct gaa gac att tac gtg gag tgg acc aac aac ggg aaa aca gag cta 1296 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 420 425 430 aac tac aag aac act gaa cca gtc ctg gac tct gat ggt tct tac ttc 1344 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 435 440 445 atg tac agc aag ctg aga gtg gaa aag aag aac tgg gtg gaa aga aat 1392 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 450 455 460 agc tac tcc tgt tca gtg gtc cac gag ggt ctg cac aat cac cac acg 1440 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 465 470 475 480 act aag agc ttc tcc cgg act ccg ggt aaa taa 1473 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 485 490 <210> 40 <211> 490 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 40 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg His Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val 35 40 45 Lys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly 50 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Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Ala Val 85 90 95 agc gca gga ggc cca cca gtc aca aag atg act gat cgt ttc agc tcg 387 Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe Ser Ser 100 105 110 115 ctg cag cac act acc atc aaa ccg cct gat gtg acc tgt atc ccc aaa 435 Leu Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Pro Lys 120 125 130 gtg agg tcc att cag atg ctg gtc cac ccc aca ctc aca ccg gtc ctc 483 Val Arg Ser Ile Gln Met Leu Val His Pro Thr Leu Thr Pro Val Leu 135 140 145 tcg gaa gat ggc cac cag cta acc ctg gag gag att ttc cat gac ctg 531 Ser Glu Asp Gly His Gln Leu Thr Leu Glu Glu Ile Phe His Asp Leu 150 155 160 ttc tac cgc tta gag ctc cac gtc aac cac acc tac cag atg cac ctt 579 Phe Tyr Arg Leu Glu Leu His Val Asn His Thr Tyr Gln Met His Leu 165 170 175 gaa ggc aaa cag aga gaa tac gag ttc ctt ggc ctg act ccc gac aca 627 Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro Asp Thr 180 185 190 195 gag ttc ctc ggc tcc atc aca att ttg act ccg ata ttg tcc aag gaa 675 Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile Leu Ser Lys Glu 200 205 210 agt gcc ccc tac gtg tgc cga gtg aag acg ctg ccc gat cgg acg tgg 723 Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr Trp 215 220 225 gcc tac tcc ttc tcg ggc gcc gtg ctc ttt tcc atg ggt ttc ctc gtc 771 Ala Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Val Leu Phe Ser Met Gly Phe Leu Val 230 235 240 ggc ttg ctc tgt tat ctg ggc tac aaa tac atc acc aag cca cct gta 819 Gly Leu Leu Cys Tyr Leu Gly Tyr Lys Tyr Ile Thr Lys Pro Pro Val 245 250 255 cct cct aac tcc ctg aac gtc caa cgt gtc ctg acc ttt caa ccc cta 867 Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe Gln Pro Leu 260 265 270 275 cgc ttc atc caa gaa cac gta ctg atc cct gtc ttg gac ctc agt ggc 915 Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Leu Asp Leu Ser Gly 280 285 290 ccc agc agt ctg cct cag ccc atc cag tac tcc caa gtg gtg gtg tct 963 Pro Ser Ser Leu Pro Gln Pro Ile Gln Tyr Ser Gln Val Val Val Ser 295 300 305 ggg ccc agg gag cct cct gga gct gtg tgg cgg cag agc ctg tct gac 1011 Gly Pro Arg Glu Pro Pro Gly Ala Val Trp Arg Gln Ser Leu Ser Asp 310 315 320 ctc acc tac gta ggg cag tca gat gtc tcc atc ctg caa cct acc aac 1059 Leu Thr Tyr Val Gly Gln Ser Asp Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Asn 325 330 335 gtg cca gct cag cag aca ctg tcc cca cca tcc tac gct ccg aag gct 1107 Val Pro Ala Gln Gln Thr Leu Ser Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Lys Ala 340 345 350 355 gtc cct gag gtc cag ccc cct tcc tat gcg cct cag gta gcc tcg gat 1155 Val Pro Glu Val Gln Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val Ala Ser Asp 360 365 370 gcc aaa gct ctg ttc tac tca cca caa cag ggg atg aag acc agg cct 1203 Ala Lys Ala Leu Phe Tyr Ser Pro Gln Gln Gly Met Lys Thr Arg Pro 375 380 385 gcc acc tat gac ccg cag gac att ctg gac agc tgc cct gct tct tat 1251 Ala Thr Tyr Asp Pro Gln Asp Ile Leu Asp Ser Cys Pro Ala Ser Tyr 390 395 400 gct gtg tgt gtg gaa gac tct ggc aaa gac tct acc cca ggc atc ctc 1299 Ala Val Cys Val Glu Asp Ser Gly Lys Asp Ser Thr Pro Gly Ile Leu 405 410 415 tcc act ccc aaa tac ctc aag aca aaa ggt cag ctc cag gaa gac aca 1347 Ser Thr Pro Lys Tyr Leu Lys Thr Lys Gly Gln Leu Gln Glu Asp Thr 420 425 430 435 ctt gtt aga agc tgt ctc cca ggg gac ctt tct cta cag aaa gtc acc 1395 Leu Val Arg Ser Cys Leu Pro Gly Asp Leu Ser Leu Gln Lys Val Thr 440 445 450 tcc tta ggt gaa ggg gag aca cag aga cca aaa tca ctc ccc tca cct 1443 Ser Leu Gly Glu Gly Glu Thr Gln Arg Pro Lys Ser Leu Pro Ser Pro 455 460 465 ctg gga ttt tgc aca gac aga gga cct gac ctt cac aca ctg cgc agt 1491 Leu Gly Phe Cys Thr Asp Arg Gly Pro Asp Leu His Thr Leu Arg Ser 470 475 480 gag gaa cca gag aca cca cgg tac ctg aag ggg gcg ctg tct ctc ctg 1539 Glu Glu Pro Glu Thr Pro Arg Tyr Leu Lys Gly Ala Leu Ser Leu Leu 485 490 495 tcc tct gtg cag atc gag ggc cac cct gtc tcc ctc cct ttg cac gtc 1587 Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Val Ser Leu Pro Leu His Val 500 505 510 515 cat tct gtc tca tgt tcc ccc tca gac gag gga cca agt ccc tgg ggc 1635 His Ser Val Ser Cys Ser Pro Ser Asp Glu Gly Pro Ser Pro Trp Gly 520 525 530 ctg ctg gac tcc ctt gtg tgt cca aag gat gag ggt ccc gcg gtt gag 1683 Leu Leu Asp Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Gly Pro Ala Val Glu 535 540 545 act gag gcc atg tgc ccc agt gct gca gcc tct gag ctg gag cag tcc 1731 Thr Glu Ala Met Cys Pro Ser Ala Ala Ala Ser Glu Leu Glu Gln Ser 550 555 560 aca gaa ctg gac tct ctt ttc aaa ggc ttg gcc ctg act gtg cag tgg 1779 Thr Glu Leu Asp Ser Leu Phe Lys Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp 565 570 575 gaa tcc tgaag ggagatcgga gcaagcaggc ctaagtttcc tcccgcccca 1830 Glu Ser 580 ccta 1834 <210> 42 <211> 581 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Met Lys Thr Leu Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His 1 5 10 15 Thr Thr Val Asp Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser 20 25 30 Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg Lys 50 55 60 Trp Leu Ala Lys Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys Asn 65 70 75 80 Leu Thr Met Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys 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atg aat act acc ttg acg gaa tgt gat ttc tca agt ctt tcc 240 Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser 65 70 75 80 aag tat ggt gac cac acc ttg aga gtc agg gct gaa ttt gca gat gag 288 Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu 85 90 95 cat tca gac tgg gta aac atc acc ttc tgt cct gtg gat gac acc att 336 His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile 100 105 110 att gga ccc cct gga atg caa gta gaa gta ctt gat gat tct tta cat 384 Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Asp Asp Ser Leu His 115 120 125 atg cgt ttc tta gcc cct aaa att gag aat gaa tac gaa act tgg act 432 Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr 130 135 140 atg aag aat gtg tat aac tca tgg act tat aat gtg caa tac tgg aaa 480 Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys 145 150 155 160 aac ggt act gat gaa aag ttt caa att act ccc cag tat gac ttt gag 528 Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu 165 170 175 gtc ctc aga aac ctg gag cca tgg aca act tat tgt gtt caa gtt cga 576 Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg 180 185 190 ggg ttt ctt cct gat cgg aac aaa gct ggg gaa tgg agt gag cct gtc 624 Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val 195 200 205 tgt gag caa aca acc cat gac gaa acg gtc ccc tcc 660 Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser 210 215 220 <210> 44 <211> 220 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 44 Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys Leu Leu Val Ser 1 5 10 15 Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val 20 25 30 Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly 35 40 45 Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu 85 90 95 His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile 100 105 110 Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Asp Asp Ser Leu His 115 120 125 Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr 130 135 140 Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys 145 150 155 160 Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu 165 170 175 Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg 180 185 190 Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val 195 200 205 Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser 210 215 220 <210> 45 <211> 199 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 45 Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly Asn Leu Thr 20 25 30 Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp Lys Cys Met 35 40 45 Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Gly 50 55 60 Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu His Ser Asp 65 70 75 80 Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile Ile Gly Pro 85 90 95 Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His Met Arg Phe 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr Met Lys Asn 115 120 125 Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys Asn Gly Thr 130 135 140 Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu Val Leu Arg 145 150 155 160 Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg Gly Phe Leu 165 170 175 Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val Cys Glu Gln 180 185 190 Thr Thr His Asp Glu Thr Val 195 <210> 46 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ser Asp Ala His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val Trp Phe 1 5 10 15 Glu Ala Glu Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile Pro Asn 20 25 30 Gln Ser Glu Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr Gly Ile 35 40 45 Glu Ser Trp Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser Tyr Asp 50 55 60 Leu Thr Ala Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr Arg Ala 65 70 75 80 Arg Val Arg Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr Val Thr 85 90 95 Asn Thr Arg Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly Ser Val 100 105 110 Asn Leu Glu Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln Leu Pro 115 120 125 Arg Pro Lys Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile Phe Ser 130 135 140 His Phe Arg Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly Asn Phe 145 150 155 160 Thr Phe Thr His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu Leu Thr 165 170 175 Ser Gly Glu Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser Val Ala 180 185 190 Ser Arg Ser Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile Ser Leu 195 200 205 Thr Arg Gln 210 <210> 47 <211> 201 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 47 Asp Glu Val Ala Ile Leu Pro Ala Pro Gln Asn Leu Ser Val Leu Ser 1 5 10 15 Thr Asn Met Lys His Leu Leu Met Trp Ser Pro Val Ile Ala Pro Gly 20 25 30 Glu Thr Val Tyr Tyr Ser Val Glu Tyr Gln Gly Glu Tyr Glu Ser Leu 35 40 45 Tyr Thr Ser His Ile Trp Ile Pro Ser Ser Trp Cys Ser Leu Thr Glu 50 55 60 Gly Pro Glu Cys Asp Val Thr Asp Asp Ile Thr Ala Thr Val Pro Tyr 65 70 75 80 Asn Leu Arg Val Arg Ala Thr Leu Gly Ser Gln Thr Ser Ala Trp Ser 85 90 95 Ile Leu Lys His Pro Phe Asn Arg Asn Ser Thr Ile Leu Thr Arg Pro 100 105 110 Gly Met Glu Ile Thr Lys Asp Gly Phe His Leu Val Ile Glu Leu Glu 115 120 125 Asp Leu Gly Pro Gln Phe Glu Phe Leu Val Ala Tyr Trp Arg Arg Glu 130 135 140 Pro Gly Ala Glu Glu His Val Lys Met Val Arg Ser Gly Gly Ile Pro 145 150 155 160 Val His Leu Glu Thr Met Glu Pro Gly Ala Ala Tyr Cys Val Lys Ala 165 170 175 Gln Thr Phe Val Lys Ala Ile Gly Arg Tyr Ser Ala Phe Ser Gln Thr 180 185 190 Glu Cys Val Glu Val Gln Gly Glu Ala 195 200 <210> 48 <211> 68 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 His Thr Thr Val Asp Thr Ser Gly Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln 1 5 10 15 Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Gly Gly Pro Ala Ser 20 25 30 Thr Ser Asp Thr Val Tyr Ser Val Glu Tyr Lys Lys Tyr Gly Glu Arg 35 40 45 Lys Trp Leu Ala Lys Ala Gly Cys Gln Arg Ile Thr Gln Lys Phe Cys 50 55 60 Asn Leu Thr Met 65 <210> 49 <211> 26 <212> PRT <213> mus musculus <400> 49 Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met 20 25 <210> 50 <211> 28 <212> PRT <213> mus musculus <400> 50 Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile Lys Pro Pro Asp 1 5 10 15 Val Thr Cys Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met 20 25 <210> 51 <211> 40 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Leu Val His Pro Thr Leu Thr Pro Val Leu Ser Glu Asp Gly His Gln 1 5 10 15 Leu Thr Leu Glu Glu Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Glu Leu 20 25 30 His Val Asn His Thr Tyr Gln Met 35 40 <210> 52 <211> 50 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 52 His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro 1 5 10 15 Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile Leu Ser 20 25 30 Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Leu Val 35 40 45 Pro Arg 50 <210> 53 <211> 70 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 53 His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu Thr Pro 1 5 10 15 Asp Thr Glu Phe His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu 20 25 30 Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr 35 40 45 Pro Ile Leu Ser Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr 50 55 60 Leu Pro Leu Val Pro Arg 65 70 <210> 54 <211> 46 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 54 Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Ala Val 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Glu Thr Arg Asn His Thr Glu Phe Tyr Tyr Ala Lys 20 25 30 Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Pro Pro Val Thr Lys Met 35 40 45 <210> 55 <211> 48 <212> PRT <213> mus musculus <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> (11) <223> Xaa = Any Amino Acid <220> <221> VARIANT <222> (13) <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 55 Thr Asp Arg Phe Ser Xaa Leu Gln His Thr Xaa Ile Xaa Pro Xaa Asp 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Ile Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Ile 20 25 30 Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Pro Lys Val Arg Ser Ile Gln Met 35 40 45 <210> 56 <211> 92 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 56 Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser Ser 1 5 10 15 Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro 20 25 30 Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp Trp 35 40 45 Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu 50 55 60 Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr 65 70 75 80 Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met 85 90 <210> 57 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp 1 5 10 15 Val Thr Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met 20 25 <210> 58 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg 1 5 10 15 Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu 20 25 30 Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln Met 35 40 <210> 59 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro 1 5 10 15 Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met 20 25 <210> 60 <211> 14 <212> PRT 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His Gln Leu Thr Leu Glu Glu Ile 130 135 140 Phe His Asp Leu Phe Tyr Arg Leu Glu Leu His Val Asn His Thr Tyr 145 150 155 160 Gln Met His Leu Glu Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Leu Gly Leu 165 170 175 Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Ser Ile Thr Ile Leu Thr Pro Ile 180 185 190 Leu Ser Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Val Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro 195 200 205 Leu Val Pro Arg 210

Claims (10)

  1. 서열 번호 2의 아미노산 잔기 18 내지 228의 아미노산 서열을 가지는 인간 IL-22RA 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는, 분리된 단일클론 항체로서,
    상기 항체는 서열 번호 2의 Tyr-60 및 Phe-164를 포함하는 IL-22RA의 에피토프에 특이적으로 결합을 하고;
    상기 항체는 IL-22 (서열 번호 6)의 활성을 감소 또는 중화하는 것을 특징으로 하는, 분리된 단일클론 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는,
    (a) 쥐과(murine) 단일클론 항체,
    (b) (a)로 부터 유도된 인간화 항체,
    (c) 항체 단편, 및
    (d) 인간 단일클론 항체
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 분리된 단일클론 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 단일사슬 항체인 것을 특징으로 하는, 분리된 단일클론 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 PEGylation을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 단일클론 항체.
  5. 인간을 제외한 포유동물에서 IL-22 유도 염증을 감소시키는 방법으로서,
    상기 방법은 IL-22 유도 염증을 감소시키기 위한 충분한, 제 1 항의 항체의 유효량을 상기 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  6. IL-22 유도 염증 질환을 가진, 인간을 제외한 포유류의 치료방법으로서,
    상기 방법은 IL-22의 염증 활성이 감소되도록, 제 1 항의 항체의 유효량을 상기 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 염증 질환은 만성 염증 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 만성 염증 질환은 건선, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 아토피성 피부염 및 천식으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6 항에 있어서, 상기 염증 질환은 염증성 피부 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 염증성 피부 질환은 건선, 아토피성 피부염 및 접촉성 피부염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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