JPH0636741B2 - ヒト・プロテインｃの分離方法 - Google Patents
ヒト・プロテインｃの分離方法Info
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- JPH0636741B2 JPH0636741B2 JP1288684A JP28868489A JPH0636741B2 JP H0636741 B2 JPH0636741 B2 JP H0636741B2 JP 1288684 A JP1288684 A JP 1288684A JP 28868489 A JP28868489 A JP 28868489A JP H0636741 B2 JPH0636741 B2 JP H0636741B2
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Description
【発明の詳細な説明】 ａ．産業上の利用分野 本発明はヒト・プロテインＣに対してカルシウムイオン
（Ｃａ＋ ＋）の非存在下では認識せず、カルシウムイオ
ン（Ｃａ＋ ＋）存在下で認識するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ及びヒト・プロテインＣの分離
方法に関する。
（Ｃａ＋ ＋）の非存在下では認識せず、カルシウムイオ
ン（Ｃａ＋ ＋）存在下で認識するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ及びヒト・プロテインＣの分離
方法に関する。
ｂ．従来技術 プロテインＣはビタミンＫ依存性血漿蛋白質すなわちγ
−カルボキシグルタミン酸含有蛋白の一つであり、血管
内皮細胞表層のトロンボモジュリン存在下トロンビンに
より活性されて［Ｅsmon,Ｃ，Ｔ＆Ｏwen，Ｗ．Ｇ：Ｐro
c.Natl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ．78：2249-2251(1981)参
照］活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）となる。活性化プロ
テインＣはセリンプロテアーゼの一種であり、血液凝固
系の補酵素である第Ｖ因子（ＦＶ．ＦＶａ）と第VIII因
子（ＦVIII，ＦVIIIａ）を分解し、強い抗凝固作用［Ｓ
uzuki.Ｋ．et．al．：Ｊ．Ｂiol.Ｃhem．258：1914-192
0(1983)．Ｖehar，Ｇ．Ａ．＆Ｄavie，Ｅ．Ｗ．：Ｂioc
hemistry．19：401-409(1980)参照］を示すと共に血管
壁からプラスミノーゲン・アクチベータを放出させ、線
溶系を促進させる［Ｃomp,Ｐ．Ｃ．＆Ｅsmon,Ｃ．Ｔ：
Ｊ．Ｃlin.I nvest.68：1221-1228(1981)参照］ことが
知られている。
−カルボキシグルタミン酸含有蛋白の一つであり、血管
内皮細胞表層のトロンボモジュリン存在下トロンビンに
より活性されて［Ｅsmon,Ｃ，Ｔ＆Ｏwen，Ｗ．Ｇ：Ｐro
c.Natl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ．78：2249-2251(1981)参
照］活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）となる。活性化プロ
テインＣはセリンプロテアーゼの一種であり、血液凝固
系の補酵素である第Ｖ因子（ＦＶ．ＦＶａ）と第VIII因
子（ＦVIII，ＦVIIIａ）を分解し、強い抗凝固作用［Ｓ
uzuki.Ｋ．et．al．：Ｊ．Ｂiol.Ｃhem．258：1914-192
0(1983)．Ｖehar，Ｇ．Ａ．＆Ｄavie，Ｅ．Ｗ．：Ｂioc
hemistry．19：401-409(1980)参照］を示すと共に血管
壁からプラスミノーゲン・アクチベータを放出させ、線
溶系を促進させる［Ｃomp,Ｐ．Ｃ．＆Ｅsmon,Ｃ．Ｔ：
Ｊ．Ｃlin.I nvest.68：1221-1228(1981)参照］ことが
知られている。
さらにプロテインＣ欠損症は重度の血栓症を呈すること
も報告されており、［Ｇriffin,Ｊ．Ｈ．et al：Ｊ．Ｃ
lin．Ｉnvest.,68，1370-1373(1980)，Ｂertina，Ｒ．
Ｍ．et al：Ｔhromb.Ｈaemostas.,48１〜５（1982）］
プロテインＣは血液凝固線溶系の重要な制御因子である
ことが明らかにされている。
も報告されており、［Ｇriffin,Ｊ．Ｈ．et al：Ｊ．Ｃ
lin．Ｉnvest.,68，1370-1373(1980)，Ｂertina，Ｒ．
Ｍ．et al：Ｔhromb.Ｈaemostas.,48１〜５（1982）］
プロテインＣは血液凝固線溶系の重要な制御因子である
ことが明らかにされている。
したがってプロテインＣの作用機構を明らかにするこ
と、また、プロテインＣの血中における抗原量、活性量
を測定し、その動向を把握することができれば、それは
基礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な意味を
持つと考えられる。
と、また、プロテインＣの血中における抗原量、活性量
を測定し、その動向を把握することができれば、それは
基礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な意味を
持つと考えられる。
一方モノクローナル抗体は単一の抗原決定基にたいして
特異的であり、かつ同一のの特異性を有する抗体を安定
的に産生できるという利点から抗原蛋白質の機能および
構造の解析、あるいは免疫測定（ＥＡＩ，ＲＩＡ）に近
時一般的に広く利用されるようになって来た。特に抗原
蛋白質の機能解析、分子解析には抗原蛋白の機能に関与
する部位、または特殊な構造部位を認識する抗体を見出
すことが有力な手段となり得る。
特異的であり、かつ同一のの特異性を有する抗体を安定
的に産生できるという利点から抗原蛋白質の機能および
構造の解析、あるいは免疫測定（ＥＡＩ，ＲＩＡ）に近
時一般的に広く利用されるようになって来た。特に抗原
蛋白質の機能解析、分子解析には抗原蛋白の機能に関与
する部位、または特殊な構造部位を認識する抗体を見出
すことが有力な手段となり得る。
ヒト・プロテインＣの構造は、分子量約41000のＨ鎖と
分子量約21000のＬ鎖がＳ−Ｓ架橋で結合されており、
Ｈ鎖にセリンプロテアーゼ活性部位を有し、また、Ｌ−
鎖アミノ末端には、９個のカルシウムイオン結合性アミ
ノ酸、すなわち、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇla）
残基を含むＧlaドメインが存在することが知られてい
る。Ｇlaドメインを有する血液凝固因子は、プロテイン
Ｃを含め、第II因子（プロトロンビン）、第VII因子、
第IX因子、第Ｘ因子いずれもカルシウムイオン（Ｃａ＋
＋）存在下でＧlaに依存した立体的構造変化を生じるこ
とが知られており、この機構は、血液凝固系発現の上で
重要な役割を果していることが知られている。
分子量約21000のＬ鎖がＳ−Ｓ架橋で結合されており、
Ｈ鎖にセリンプロテアーゼ活性部位を有し、また、Ｌ−
鎖アミノ末端には、９個のカルシウムイオン結合性アミ
ノ酸、すなわち、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇla）
残基を含むＧlaドメインが存在することが知られてい
る。Ｇlaドメインを有する血液凝固因子は、プロテイン
Ｃを含め、第II因子（プロトロンビン）、第VII因子、
第IX因子、第Ｘ因子いずれもカルシウムイオン（Ｃａ＋
＋）存在下でＧlaに依存した立体的構造変化を生じるこ
とが知られており、この機構は、血液凝固系発現の上で
重要な役割を果していることが知られている。
従来、ヒト・プロテインＣのモノクロナール抗体は鈴木
らにより作成されたことが報告されており、［鈴木宏治
他：“血液と脈管”，15：171-174(1984)参照］、こ
の抗体はヒト・プロテインＣの抗原量の測定、活性の測
定に利用されているが、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）
存在下で構造変化を受けたヒト・プロテインＣを認識す
るモノクロナール抗体についての報告はまだなされてい
ない。
らにより作成されたことが報告されており、［鈴木宏治
他：“血液と脈管”，15：171-174(1984)参照］、こ
の抗体はヒト・プロテインＣの抗原量の測定、活性の測
定に利用されているが、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）
存在下で構造変化を受けたヒト・プロテインＣを認識す
るモノクロナール抗体についての報告はまだなされてい
ない。
そこで本発明らは、プロテインＣがカルシウムイオン
（Ｃａ＋ ＋）存在下で立体的構造変化を受けることに着
目し、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下で構造変
化を受けたプロテインＣを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体について研究を進めた結果本発明に到達した。
（Ｃａ＋ ＋）存在下で立体的構造変化を受けることに着
目し、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下で構造変
化を受けたプロテインＣを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体について研究を進めた結果本発明に到達した。
ｃ．発明の構成 すなわち、本発明は、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の
非存在下ではヒト・プロテインＣに対して認識せず且つ
カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下ではヒト・プロ
テインＣに対して特異的に認識するヒト・プロテインＣ
に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
である。
非存在下ではヒト・プロテインＣに対して認識せず且つ
カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下ではヒト・プロ
テインＣに対して特異的に認識するヒト・プロテインＣ
に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
である。
さらに他の本発明は、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の
非存在下ではヒト・プロテインＣに対して認識せず且つ
カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下ではヒト・プロ
テインＣに対して特異的に認識するヒト・プロテインＣ
に対するモノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた
吸着体に、ヒト・プロテインＣ含有混合物を、カルシウ
ムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下に接触せしめて、該吸着
体にヒト・プロテインＣを結合せしめることを特徴とす
るヒト・プロテインＣ含有混合物からのヒト・プロテイ
ンＣの分離法である。
非存在下ではヒト・プロテインＣに対して認識せず且つ
カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下ではヒト・プロ
テインＣに対して特異的に認識するヒト・プロテインＣ
に対するモノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた
吸着体に、ヒト・プロテインＣ含有混合物を、カルシウ
ムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下に接触せしめて、該吸着
体にヒト・プロテインＣを結合せしめることを特徴とす
るヒト・プロテインＣ含有混合物からのヒト・プロテイ
ンＣの分離法である。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞はケーラーとミルシュタインの方法［Ｋhler ＆
Ｍilstein,Nature：256495-497(1975) ］として知ら
れた方法によって得られる。すなわち、ヒト・プロテイ
ンＣでマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマ
ウス・ミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリド
ーマ細胞はマイクロタイタープレートに固定されたヒト
・プロテインＣと反応する抗体に対し、系統的に検査
し、選択される。この際に、カルシウムイオン（Ｃａ＋
＋）存在下における検査と、カルシウムイオン非存在下
における検査を同時に行い前者においてのみ陽性を示す
ハイビリドーマを選別することにより、目的とする抗体
を合成し分泌するハイブリドーマを単離することができ
る。
細胞はケーラーとミルシュタインの方法［Ｋhler ＆
Ｍilstein,Nature：256495-497(1975) ］として知ら
れた方法によって得られる。すなわち、ヒト・プロテイ
ンＣでマウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマ
ウス・ミエローマ細胞と融合させ、得られたハイブリド
ーマ細胞はマイクロタイタープレートに固定されたヒト
・プロテインＣと反応する抗体に対し、系統的に検査
し、選択される。この際に、カルシウムイオン（Ｃａ＋
＋）存在下における検査と、カルシウムイオン非存在下
における検査を同時に行い前者においてのみ陽性を示す
ハイビリドーマを選別することにより、目的とする抗体
を合成し分泌するハイブリドーマを単離することができ
る。
かかる新規なハイブリトーマ細胞が産生する産生物から
得られるモノクローナル抗体は、カルシウムイオン（Ｃ
ａ＋ ＋）の存在下におけるヒト・プロテインＣ分子上の
特定の抗原決定基に対して単一特異的に作用する。
得られるモノクローナル抗体は、カルシウムイオン（Ｃ
ａ＋ ＋）の存在下におけるヒト・プロテインＣ分子上の
特定の抗原決定基に対して単一特異的に作用する。
本発明によって得られるノモクローナル抗体はその特性
からヒト・プロテインＣの精製に利用する場合非常に有
利である。すなわち、不溶性担体に本発明によって得ら
れるモノクローナル抗体を固定化し、カルシウムイオン
（Ｃａ＋ ＋）が存在する溶液中で血漿（カルシウムイオ
ン存在下で凝固しないように調製したもの）または、他
のヒト・プロテインＣを含む原料、あるいはそれらの粗
抽出物、粗精製物および溶液からヒト・プロテインＣを
吸着・分離しカルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）存在下で洗
浄後、溶液をカルシウムイオンを含まないもの（例えば
ＥＤＴＡが存在する溶液）に置き換えて、ヒト・プロテ
インＣを溶出することができる。この方法によれば、従
来の不溶化抗体による抗原蛋白質の精製のように、過激
な条件下（例えば、0.2Ｍグリシン塩酸あるいは８Ｍ尿
素のような）に蛋白質をさらすことなく、穏和な条件下
で精製を行うことができる。
からヒト・プロテインＣの精製に利用する場合非常に有
利である。すなわち、不溶性担体に本発明によって得ら
れるモノクローナル抗体を固定化し、カルシウムイオン
（Ｃａ＋ ＋）が存在する溶液中で血漿（カルシウムイオ
ン存在下で凝固しないように調製したもの）または、他
のヒト・プロテインＣを含む原料、あるいはそれらの粗
抽出物、粗精製物および溶液からヒト・プロテインＣを
吸着・分離しカルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）存在下で洗
浄後、溶液をカルシウムイオンを含まないもの（例えば
ＥＤＴＡが存在する溶液）に置き換えて、ヒト・プロテ
インＣを溶出することができる。この方法によれば、従
来の不溶化抗体による抗原蛋白質の精製のように、過激
な条件下（例えば、0.2Ｍグリシン塩酸あるいは８Ｍ尿
素のような）に蛋白質をさらすことなく、穏和な条件下
で精製を行うことができる。
また、ヒト・プロテインＣその他のγ−カルボキシルグ
ルタミン酸含有蛋白質にはＧlaを含まず、Ｇlaに依存す
る構造変化を受けない異常分子が存在することが知られ
ているが、本発明によって得られるモノクローナル抗体
を用いることにより、この異常分子の測定が可能になる
と考えられる。すなわち、カルシウムイオン（Ｃ
ａ＋ ＋）の存在の有無に拘らず、ヒト・プロテインＣを
認識する抗体を用いて免疫学的手段（例えばＥＩＡ，Ｒ
ＩＡ）により血漿その他の試料中のヒト・プロテインＣ
抗原量を測定し、更に本発明によるモノクローナル抗体
を用いて、血漿、その他の試料中のヒト・プロテインＣ
をカルシウムイオン存在下で免疫学的手法（ＥＩＡ，Ｒ
ＩＡ）により測定すれば、その測定値の差から、異常ヒ
ト・プロテインＣの量を把握することができる。
ルタミン酸含有蛋白質にはＧlaを含まず、Ｇlaに依存す
る構造変化を受けない異常分子が存在することが知られ
ているが、本発明によって得られるモノクローナル抗体
を用いることにより、この異常分子の測定が可能になる
と考えられる。すなわち、カルシウムイオン（Ｃ
ａ＋ ＋）の存在の有無に拘らず、ヒト・プロテインＣを
認識する抗体を用いて免疫学的手段（例えばＥＩＡ，Ｒ
ＩＡ）により血漿その他の試料中のヒト・プロテインＣ
抗原量を測定し、更に本発明によるモノクローナル抗体
を用いて、血漿、その他の試料中のヒト・プロテインＣ
をカルシウムイオン存在下で免疫学的手法（ＥＩＡ，Ｒ
ＩＡ）により測定すれば、その測定値の差から、異常ヒ
ト・プロテインＣの量を把握することができる。
次に本発明によって得られるモノクローナル抗体を作成
する具体的方法について詳細に説明する。
する具体的方法について詳細に説明する。
Ａ．抗原の単離・精製； 抗原に用いるヒト・プロテインＣは鈴木らの方法［Ｓuz
uki.Ｋ．et al，Ｊ．Ｂiol.Chem.258:1914-1920(198
3)］によりヒト・血漿から単離・精製される。
uki.Ｋ．et al，Ｊ．Ｂiol.Chem.258:1914-1920(198
3)］によりヒト・血漿から単離・精製される。
Ｂ．ヒト・プロテインＣによるマウスの免疫； 雌Ｂalb／Ｃマウスを用いることができるが他の系（Ｓt
rain）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、
及びヒト・プロテインＣの濃度は十分な量の抗原刺戟を
受けた、リンパ球が形成されるように選ばれるべきであ
る。例えばマウスに50μｇのヒト・プロテインＣを２週
間間隔で腹腔に３回投与の後、さらに30μｇを静脈に投
与する。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞をとり
出す。
rain）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、
及びヒト・プロテインＣの濃度は十分な量の抗原刺戟を
受けた、リンパ球が形成されるように選ばれるべきであ
る。例えばマウスに50μｇのヒト・プロテインＣを２週
間間隔で腹腔に３回投与の後、さらに30μｇを静脈に投
与する。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞をとり
出す。
Ｃ．細胞融合； 上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤
の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨髄腫細
胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１の範囲である。
約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5ｍの融合媒体の
使用が適当である。
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤
の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対、骨髄腫細
胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１の範囲である。
約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5ｍの融合媒体の
使用が適当である。
細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は、良く知られてい
るが、本発明では、Ｐ３−Ｘ63−Ａｇ８−Ｕ１細胞（Ｐ
３−Ｕ１）［Ｙelton，Ｄ．Ｅ et al，Ｃurrent．Ｔop
ics in Ｍicrobiology and Ｉmmunology，81 1(1978)
参照］を用いた。
るが、本発明では、Ｐ３−Ｘ63−Ａｇ８−Ｕ１細胞（Ｐ
３−Ｕ１）［Ｙelton，Ｄ．Ｅ et al，Ｃurrent．Ｔop
ics in Ｍicrobiology and Ｉmmunology，81 1(1978)
参照］を用いた。
好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子量1000
〜4000のポリエチレングルコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明においては、平均分子量1540のポ
リエチレングルコールを用いた。
〜4000のポリエチレングルコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明においては、平均分子量1540のポ
リエチレングルコールを用いた。
Ｄ．融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地は
未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えば
ＨＡＴ培地）が使用される。この選択培地中では、未融
合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非
腫瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅す
る。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と、脾臓細胞の性質を合わせ持つため、選択培地
中で存在できる。
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地は
未融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの、（例えば
ＨＡＴ培地）が使用される。この選択培地中では、未融
合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非
腫瘍性細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅す
る。これらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と、脾臓細胞の性質を合わせ持つため、選択培地
中で存在できる。
Ｅ．各容器中のヒト・プロテインＣ抗体の確認； かくして、ハイブリドーマ細胞が検出された後、その培
養上清を採取し、ヒト・プロテインＣに対する抗体につ
いて酵素免疫定量法（ＥnzymeＬinked Ｉ mmunosoben
t Ａ ssay）によりスクリーニングする。この際、培
養上清、酵素標識抗体溶液および洗浄液に一定濃度のＣ
ａC２を加えた条件下の測定と、ＣａC２を加えない
条件下の測定の両方を行い、前者に対してのみ陽性を示
すハイブリドーマを選択することにより、カルシウムイ
オン非存在下では、ヒト・プロテインＣを認識せず、カ
ルシウムイオン存在下で、ヒト・プロテインＣを認識す
る抗体を産生、分泌するハイプリドーマを選別すること
ができる。
養上清を採取し、ヒト・プロテインＣに対する抗体につ
いて酵素免疫定量法（ＥnzymeＬinked Ｉ mmunosoben
t Ａ ssay）によりスクリーニングする。この際、培
養上清、酵素標識抗体溶液および洗浄液に一定濃度のＣ
ａC２を加えた条件下の測定と、ＣａC２を加えない
条件下の測定の両方を行い、前者に対してのみ陽性を示
すハイブリドーマを選択することにより、カルシウムイ
オン非存在下では、ヒト・プロテインＣを認識せず、カ
ルシウムイオン存在下で、ヒト・プロテインＣを認識す
る抗体を産生、分泌するハイプリドーマを選別すること
ができる。
Ｆ．目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のクロー
ン化と抗体の産生 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養
することにより、その内容上清からそのハイブリドーマ
細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺
伝子、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射する
ことができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹
水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
ン化と抗体の産生 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば、ハイブリドーマ細胞を一定時間、適当な培地で培養
することにより、その内容上清からそのハイブリドーマ
細胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺
伝子、又は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射する
ことができる。一定時間後の宿主動物の血液中および腹
水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロ
ーナル抗体を得ることができる。
Ｇ．ヒト・プロテインＣ含有混合物からのヒト・プロテ
インＣの分離； 本発明によって得られるモノクローナル抗体は、前記し
た如く、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の非存在下では
ヒト・プロテインＣに対して認識せず、且つカルシウム
イオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下ではヒト・プロテインＣに
対して特異的に認識するという性質を有しているので、
この性質を利用して、ヒト・プロテインＣを含有してい
る混合物（例えばヒト血漿など）からヒト・プロテイン
Ｃを簡単に分離することができる。
インＣの分離； 本発明によって得られるモノクローナル抗体は、前記し
た如く、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の非存在下では
ヒト・プロテインＣに対して認識せず、且つカルシウム
イオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下ではヒト・プロテインＣに
対して特異的に認識するという性質を有しているので、
この性質を利用して、ヒト・プロテインＣを含有してい
る混合物（例えばヒト血漿など）からヒト・プロテイン
Ｃを簡単に分離することができる。
そのため、先ず前記ヒト・プロテインＣに対するモノク
ローナル抗体を不溶性担体に固定化又は結合させて吸着
体を得る。その際使用される不溶性担体としてじは、モ
ノクローナル抗体を用いた測定試薬又は測定用キットの
基材として一般的使用されるものであればよい。例えば
材質としてアガロース，ポリアクリルアミド，セルロー
ス，デキストラン，またはマレイン酸ポリマー或いはこ
れらの混合物が好ましく用いられる。これら不活性担体
の形態としては、粉末状，粒状，ペレット状，ビーズ
状，フイルム状，繊維状など種々の形態であることがで
きる。また一般に血漿、またはその分画成分の測定や分
離に用いられる多数の凹状のくぼみを有するプレート
（ウエル）を用いることが有利である。
ローナル抗体を不溶性担体に固定化又は結合させて吸着
体を得る。その際使用される不溶性担体としてじは、モ
ノクローナル抗体を用いた測定試薬又は測定用キットの
基材として一般的使用されるものであればよい。例えば
材質としてアガロース，ポリアクリルアミド，セルロー
ス，デキストラン，またはマレイン酸ポリマー或いはこ
れらの混合物が好ましく用いられる。これら不活性担体
の形態としては、粉末状，粒状，ペレット状，ビーズ
状，フイルム状，繊維状など種々の形態であることがで
きる。また一般に血漿、またはその分画成分の測定や分
離に用いられる多数の凹状のくぼみを有するプレート
（ウエル）を用いることが有利である。
前記吸着体を用い、これにヒト・プロテインＣ含有混合
物を、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下に接触せ
しめると、該吸着体に固定化したモノクローナル抗体と
ヒト・プロテインＣとが結合して、結果的にヒト・プロ
テインＣが該吸着体に結合する。かくすることによりヒ
ト・プロテインＣを分離、除去することが可能である。
物を、カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下に接触せ
しめると、該吸着体に固定化したモノクローナル抗体と
ヒト・プロテインＣとが結合して、結果的にヒト・プロ
テインＣが該吸着体に結合する。かくすることによりヒ
ト・プロテインＣを分離、除去することが可能である。
又前記の如くしてヒト・プロテインＣを吸着体に結合さ
せ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、次いで吸
着体に結合したヒト・プロテインＣをカルシウムイオン
（Ｃａ＋ ＋）を実質的に含まない液体と接触又は洗滌す
ると、ヒト・プロテインＣが該吸着体から離脱し、これ
を取得することによって、ヒト・プロテインＣを単離す
ることができる。
せ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、次いで吸
着体に結合したヒト・プロテインＣをカルシウムイオン
（Ｃａ＋ ＋）を実質的に含まない液体と接触又は洗滌す
ると、ヒト・プロテインＣが該吸着体から離脱し、これ
を取得することによって、ヒト・プロテインＣを単離す
ることができる。
かくして前記本発明の分離法によれば、ヒト・プロテイ
ンＣを含有する混合物からのヒト・プロテインＣの除
去、該混合物からのヒト・プロテインＣの分離及び精
製、該混合物中のヒト・プロテインＣの含有量の測定な
どが極めて簡単な操作で達成される。
ンＣを含有する混合物からのヒト・プロテインＣの除
去、該混合物からのヒト・プロテインＣの分離及び精
製、該混合物中のヒト・プロテインＣの含有量の測定な
どが極めて簡単な操作で達成される。
以下実施例を上げ本発明を詳細に説明する。以下実施例
ではプロテインＣをＰＣと略称することがある。
ではプロテインＣをＰＣと略称することがある。
実施例１ 精製したヒト・ＰＣの雌のＢalb／Ｃマウス（４週齢）
２匹に対して14日間隔で４回免疫した。
２匹に対して14日間隔で４回免疫した。
初回の免疫はＰＢＳに溶解した。50μｇのヒト・ＰＣを
等量のフロイントの完全アジュバント（Ｃomplete Ｆr
enud's adjuvant）と混合し、そのエマルジョンを、腹
腔内に投与した（0.5mg／head）、２回目，３回目は、
同じく50μｇのヒト・ＰＣをフロイントの不完全アジュ
バント（Ｆ renud's incomplete adjuvant）と混合
し、同じく腹腔内に投与した。最終免疫は30μｇのヒト
・ＰＣをＰＢＣ溶液のまま、マウス尾静脈から投与し
た。最終免疫の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細
胞融合に用いた。
等量のフロイントの完全アジュバント（Ｃomplete Ｆr
enud's adjuvant）と混合し、そのエマルジョンを、腹
腔内に投与した（0.5mg／head）、２回目，３回目は、
同じく50μｇのヒト・ＰＣをフロイントの不完全アジュ
バント（Ｆ renud's incomplete adjuvant）と混合
し、同じく腹腔内に投与した。最終免疫は30μｇのヒト
・ＰＣをＰＢＣ溶液のまま、マウス尾静脈から投与し
た。最終免疫の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細
胞融合に用いた。
免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（Ｐ３Ｕ１）を約２：１〜15：１の割合で混合し、50％
ポリエチレングリコール1540（和光）を融合促進剤とし
てＫhlerとＭilsteinの方法に従い細胞融合を行っ
た。融合後の細胞は、１×106cell／mの細胞濃度とな
るように10％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−1640培地に懸濁し、96
wellsマイクロプレート（Ｃoster）に１ウエル当り100
μずつ分注した。
（Ｐ３Ｕ１）を約２：１〜15：１の割合で混合し、50％
ポリエチレングリコール1540（和光）を融合促進剤とし
てＫhlerとＭilsteinの方法に従い細胞融合を行っ
た。融合後の細胞は、１×106cell／mの細胞濃度とな
るように10％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ−1640培地に懸濁し、96
wellsマイクロプレート（Ｃoster）に１ウエル当り100
μずつ分注した。
融合細胞は、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２，37
℃）中で培養し、ヒポキサチン，アミノプテリン；チミ
ジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培地交換を行い、ＨＡ
Ｔ培地中で増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成
るハイブルドーマのスクリーニングを行った。
℃）中で培養し、ヒポキサチン，アミノプテリン；チミ
ジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培地交換を行い、ＨＡ
Ｔ培地中で増殖させて、脾臓細胞と、骨髄腫細胞から成
るハイブルドーマのスクリーニングを行った。
ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原ヒト・ＰＣを
コーティングしたマイクロタイタープレートを用いＥＬ
ＩＳＡ法により検出した。第２抗体には、アルカリホス
ファターゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を用い、カル
シウムイオン存在下非存在下におけるヒト・ＰＣとの結
合の違いを見るため、一方の培養上清には５ｍＭＣａC
２を添加したＴＢＳ（0.02Ｍ Ｔris／ＨC，0.14Ｍ
Ｎａ C，pH 7.4）またもう一方にはＴＢＳを加え
た。更に第２抗体の希釈液、及び洗浄液には、５ ｍＭ
Ｃａ C２添加ＴＢＳ，0.05％Ｔween20，0.02％Ｎ
ａ Ｎ３またはＴＢＳ，0.05％Ｔween20，0.02％Ｎａ
Ｎ３を使用した。
コーティングしたマイクロタイタープレートを用いＥＬ
ＩＳＡ法により検出した。第２抗体には、アルカリホス
ファターゼ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を用い、カル
シウムイオン存在下非存在下におけるヒト・ＰＣとの結
合の違いを見るため、一方の培養上清には５ｍＭＣａC
２を添加したＴＢＳ（0.02Ｍ Ｔris／ＨC，0.14Ｍ
Ｎａ C，pH 7.4）またもう一方にはＴＢＳを加え
た。更に第２抗体の希釈液、及び洗浄液には、５ ｍＭ
Ｃａ C２添加ＴＢＳ，0.05％Ｔween20，0.02％Ｎ
ａ Ｎ３またはＴＢＳ，0.05％Ｔween20，0.02％Ｎａ
Ｎ３を使用した。
融合細胞をまいた合計541のウエルのうち523のウエルに
コロニーの形成が認められた。このうち抗体産生陽性ウ
エルは下記表−１に示すようにカルシウムイオン存在下
で44，カルシウムイオン非存在下で32であった。
コロニーの形成が認められた。このうち抗体産生陽性ウ
エルは下記表−１に示すようにカルシウムイオン存在下
で44，カルシウムイオン非存在下で32であった。
これらの抗体産生陽性ウエルのうち12のウエルにつてい
限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行な
い、13個のクローンを得た。得られたクローンは90％Ｆ
ＣＳ−10％ＤＭＳＯ中に懸濁させ液体窒素中に保存し
た。
限界希釈法によるクローニングを２回繰り返して行な
い、13個のクローンを得た。得られたクローンは90％Ｆ
ＣＳ−10％ＤＭＳＯ中に懸濁させ液体窒素中に保存し
た。
各クローンの産生するモノクローナル抗体はクローンを
Ｂalb／Ｃマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロ
テインＡ−Ｓepharose４Ｂカラムを用いて精製した。
Ｂalb／Ｃマウス腹腔内で増殖させ、その腹水からプロ
テインＡ−Ｓepharose４Ｂカラムを用いて精製した。
実施例２．（精製したＩｇＧの性質） マウス腹水から精製した各クローンのＩｇＧについてサ
ブクラス，ヒト・ＰＣ活性への影響Ｌ鎖あるいはＨ鎖へ
の結合性を調べた。
ブクラス，ヒト・ＰＣ活性への影響Ｌ鎖あるいはＨ鎖へ
の結合性を調べた。
サブクラスは、各クラス特異性の抗マウス抗血清を用い
て、オクタロニー法により決定した。ヒト・ＰＣ活性へ
の影響は、ヒト・ＰＣにＩｇＧをモル比１：５で加えて
４℃で一夜インキュベーションし、トロンビン−トロン
ボジュリンコンプレックスによりヒトＰＣを活性化し、
その活性は次の合成基質の分解活性を測定することによ
り測定した。この合成基質としは ［ここではＶel−Ｄ形の光学活性のバリン，ＬeuはＬ形
の光学活性のロイシン，ＡrgはＬ形の光学活性のアルギ
ンを示す。ＫabiＶitrumＡＢ（スウェーデン）社製のＳ
−2266を用いた］を使用した。Ｌ鎖、Ｈ鎖への結合性
は、ヒト・ＰＣを還元条件で電気泳動し、ニトロセルロ
ース膜及びＨＲＰ標識Ｇoat anti-mouseＩｇＧを用いた
イムノブロッティングを行って判定した。
て、オクタロニー法により決定した。ヒト・ＰＣ活性へ
の影響は、ヒト・ＰＣにＩｇＧをモル比１：５で加えて
４℃で一夜インキュベーションし、トロンビン−トロン
ボジュリンコンプレックスによりヒトＰＣを活性化し、
その活性は次の合成基質の分解活性を測定することによ
り測定した。この合成基質としは ［ここではＶel−Ｄ形の光学活性のバリン，ＬeuはＬ形
の光学活性のロイシン，ＡrgはＬ形の光学活性のアルギ
ンを示す。ＫabiＶitrumＡＢ（スウェーデン）社製のＳ
−2266を用いた］を使用した。Ｌ鎖、Ｈ鎖への結合性
は、ヒト・ＰＣを還元条件で電気泳動し、ニトロセルロ
ース膜及びＨＲＰ標識Ｇoat anti-mouseＩｇＧを用いた
イムノブロッティングを行って判定した。
各性質について得られた結果を下記表−２に示した。カ
ルシウムイオン依存性抗体はいずれもＬ鎖結合性であ
り、ヒト・ＰＣの活性には影響を及ぼさなかった。
ルシウムイオン依存性抗体はいずれもＬ鎖結合性であ
り、ヒト・ＰＣの活性には影響を及ぼさなかった。
実施例３．（カルシウムイオンの影響） ヒト・ＰＣと精製したＩｇＧとの反応に及ぼすカルシウ
ムイオンの影響について検討した。
ムイオンの影響について検討した。
ヒト・ＰＣをコーティングしたＥＬＩＳＡ法においてカ
ルシウムイオン依存性の抗体７Ｂ12及び10Ｅ12を５ｍＭ
ＣａC２添加ＴＢＳ−Ｔween（0.02Ｍ Ｔris／ＨC
，0.14Ｍ Ｎａ C，pH7.4 0.05％Ｔween20，0.02
％Ｎａ Ｎ３）またはＴＢＳ−Ｔweenで希釈してヒト・
ＰＣと反応させアルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マ
ウスＩｇＧを用いた発色から結合量を測定すると、５ｍ
Ｍ Ｃａ C２を添加したバッファーで希釈した場合
には抗体濃度に依存したヒト・ＰＣとの結合を示した
が、Ｃａ C２を添加しないバッファーで希釈した場
合には、抗体濃度を高くしても結合は認められなかっ
た。その結果を下記表−３に示した。
ルシウムイオン依存性の抗体７Ｂ12及び10Ｅ12を５ｍＭ
ＣａC２添加ＴＢＳ−Ｔween（0.02Ｍ Ｔris／ＨC
，0.14Ｍ Ｎａ C，pH7.4 0.05％Ｔween20，0.02
％Ｎａ Ｎ３）またはＴＢＳ−Ｔweenで希釈してヒト・
ＰＣと反応させアルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マ
ウスＩｇＧを用いた発色から結合量を測定すると、５ｍ
Ｍ Ｃａ C２を添加したバッファーで希釈した場合
には抗体濃度に依存したヒト・ＰＣとの結合を示した
が、Ｃａ C２を添加しないバッファーで希釈した場
合には、抗体濃度を高くしても結合は認められなかっ
た。その結果を下記表−３に示した。
なおカルシウムイオン非依存性の抗体6B10−１及び10H1
1を用いて同様にカルシウムイオンの影響について調べ
た結果も同表−３に併記して示した。
1を用いて同様にカルシウムイオンの影響について調べ
た結果も同表−３に併記して示した。
実施例４．（カルシウムイオン濃度の影響） 前記実施例３におけるカルシウムイオン依存性の抗体7B
12及び10E12を用い、それらの濃度を一定（１μｇ／m
）とし、抗体溶液中のカルシウムイオン濃度を変化さ
せたところ、ヒト・ＰＣとの結合はＣａ C２濃度が
高まるにつれて増加し、約１ｍＭの濃度で飽和となっ
た。その結果を下記表−４に示した。またカルシウムイ
オン非依存性の抗体６Ｅ２を用い同様にＣａ C２濃
度の変化の影響を調べた結果を、下記表−５に示した。
表−５の結果からカルシウムイオン非存在性の抗体で
は、カルシウムイオン濃度に影響なく、ヒト・ＰＣとの
結合はほぼ一定の値を示していることがわかる。
12及び10E12を用い、それらの濃度を一定（１μｇ／m
）とし、抗体溶液中のカルシウムイオン濃度を変化さ
せたところ、ヒト・ＰＣとの結合はＣａ C２濃度が
高まるにつれて増加し、約１ｍＭの濃度で飽和となっ
た。その結果を下記表−４に示した。またカルシウムイ
オン非依存性の抗体６Ｅ２を用い同様にＣａ C２濃
度の変化の影響を調べた結果を、下記表−５に示した。
表−５の結果からカルシウムイオン非存在性の抗体で
は、カルシウムイオン濃度に影響なく、ヒト・ＰＣとの
結合はほぼ一定の値を示していることがわかる。
なお、測定は、所定濃度のＣａ C２を含むＴＢＳ−
Ｔweenで１μｇ／mＩｇＧ溶液を調製し、100μを、
ヒト・ＰＣをコーティングしたwellに加えて行った。イ
ンキュベーション後のwellの洗浄にも各濃度のＣａ C
２を含むＴＢＳ−Ｔweenを用いた。
Ｔweenで１μｇ／mＩｇＧ溶液を調製し、100μを、
ヒト・ＰＣをコーティングしたwellに加えて行った。イ
ンキュベーション後のwellの洗浄にも各濃度のＣａ C
２を含むＴＢＳ−Ｔweenを用いた。
実施例．５ (1)抗体の不溶性担体への固定化； ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ社製）の乾燥ゲル0.5ｇを、Ｇ３
グラスフィルター上で100mの１ｍＭ ＨCを用いて
膨潤、洗浄し、更にカップリングバッファー（0.5Ｍ
Ｎａ Cを含む0.1Ｍ Ｎａ ＨＣＯ３pH8.3）で洗浄
した。カップリングバッファーを吸引除去した後、直ち
にゲルを抗体（６Ｈ２）のカップリングバッファー溶液
（３mg／m）２m中に加えて懸濁させ、４℃で一夜ゆ
るやかに振とうした。次にゲルを１Ｍエタノールアミン
−ＨC（pH8.0、２m）中に移し、室温で２時間振と
うして残存する活性基をブロックした。ブロッキング
後、抗体結合セファロースゲルをグラスフィルター上
で、0.5Ｍ Ｎａ Cを含む0.1Ｍ酢酸バッファーpH4.0
と0.5Ｍ Ｎａ Cを含む0.1Ｍホウ酸バッファーpH8.0
を交互に用いて洗浄した。濾液の280nmにおける吸光度
が0.01以下になったところで、５ｍＭ Ｃａ C２、
および１ｍＭベンザミジンを含む0.05Ｍ Ｔris／ＨC
pH7.4で平衡化し、カラムに充てんした。このように
して調製した抗ヒトＰＣモノクローナル抗体（６Ｈ２）
結合セファロース４Ｂカラムを用いてアフィニティクロ
マトを行った。
ファイン・ケミカルズ社製）の乾燥ゲル0.5ｇを、Ｇ３
グラスフィルター上で100mの１ｍＭ ＨCを用いて
膨潤、洗浄し、更にカップリングバッファー（0.5Ｍ
Ｎａ Cを含む0.1Ｍ Ｎａ ＨＣＯ３pH8.3）で洗浄
した。カップリングバッファーを吸引除去した後、直ち
にゲルを抗体（６Ｈ２）のカップリングバッファー溶液
（３mg／m）２m中に加えて懸濁させ、４℃で一夜ゆ
るやかに振とうした。次にゲルを１Ｍエタノールアミン
−ＨC（pH8.0、２m）中に移し、室温で２時間振と
うして残存する活性基をブロックした。ブロッキング
後、抗体結合セファロースゲルをグラスフィルター上
で、0.5Ｍ Ｎａ Cを含む0.1Ｍ酢酸バッファーpH4.0
と0.5Ｍ Ｎａ Cを含む0.1Ｍホウ酸バッファーpH8.0
を交互に用いて洗浄した。濾液の280nmにおける吸光度
が0.01以下になったところで、５ｍＭ Ｃａ C２、
および１ｍＭベンザミジンを含む0.05Ｍ Ｔris／ＨC
pH7.4で平衡化し、カラムに充てんした。このように
して調製した抗ヒトＰＣモノクローナル抗体（６Ｈ２）
結合セファロース４Ｂカラムを用いてアフィニティクロ
マトを行った。
(2)プロテインＣの抗体結合セファロース４Ｂへの吸
着、溶出； 血漿100mに１Ｍ Ｂａ C２溶液８mを加え４℃で
１時間攪拌した。沈澱を遠心分離して集め５ｍＭ Ｂａ
C２，５ｍＭベンザミジンを含む0.1Ｍ Ｎａ C
で洗浄した後、15mの５ｍＭベンザミジンを含む0.2Ｍ
ＥＤＴＡ pH7.4で沈澱物を溶解し、バリウム吸着分
画を得た。このバリウム吸着分画を１ｍＭベンザミジン
を含む0.05ＭＴris／ＨC pH7.4に透析し、終濃度５
ｍＭとなるようにＣａ C２溶液を加え、５ｍＭ Ｃ
ａC２および１ｍＭベンザミジンを含む0.05ＭＴris／
ＨCで平衡化した抗体（６Ｈ２）結合カラムにかけ
た。５ｍＭ Ｃａ C２，１ｍＭベンザミジンおよび
１Ｍ Ｎａ Cを含む0.05 ＭＴris／ＨCで洗浄
し、50ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭベンザミジンを含む
0.05Ｍ Ｔris／Ｈ Cで溶出したところ、ＰＣを含む
シングルピークが得られた。抗体セファロース４Ｂ溶出
分画中のＰＣはバリウム吸着分画に比べ約52倍に精製さ
れており、回収率は約48.2％であった。
着、溶出； 血漿100mに１Ｍ Ｂａ C２溶液８mを加え４℃で
１時間攪拌した。沈澱を遠心分離して集め５ｍＭ Ｂａ
C２，５ｍＭベンザミジンを含む0.1Ｍ Ｎａ C
で洗浄した後、15mの５ｍＭベンザミジンを含む0.2Ｍ
ＥＤＴＡ pH7.4で沈澱物を溶解し、バリウム吸着分
画を得た。このバリウム吸着分画を１ｍＭベンザミジン
を含む0.05ＭＴris／ＨC pH7.4に透析し、終濃度５
ｍＭとなるようにＣａ C２溶液を加え、５ｍＭ Ｃ
ａC２および１ｍＭベンザミジンを含む0.05ＭＴris／
ＨCで平衡化した抗体（６Ｈ２）結合カラムにかけ
た。５ｍＭ Ｃａ C２，１ｍＭベンザミジンおよび
１Ｍ Ｎａ Cを含む0.05 ＭＴris／ＨCで洗浄
し、50ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭベンザミジンを含む
0.05Ｍ Ｔris／Ｈ Cで溶出したところ、ＰＣを含む
シングルピークが得られた。抗体セファロース４Ｂ溶出
分画中のＰＣはバリウム吸着分画に比べ約52倍に精製さ
れており、回収率は約48.2％であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 青木 延雄 東京都文京区本郷４―20―２―304 (56)参考文献 特開 昭60−120825（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】カルシウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の非存在下
では、ヒト・プロテインＣに対して認識せず且つカルシ
ウムイオン（Ｃａ＋ ＋）の存在下ではヒト・プロテイン
Ｃに対して特異的に認識するヒト・プロテインＣに対す
るモノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた吸着体
に、ヒト・プロテインＣ含有混合物をカルシウムイオン
（Ｃａ＋ ＋）存在下に接触せしめて、該吸着体にヒト・
プロテインＣを結合せしめることを特徴とするヒト・プ
ロテインＣ含有混合物からのヒト・プロテインＣの分離
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1288684A JPH0636741B2 (ja) | 1989-11-08 | 1989-11-08 | ヒト・プロテインｃの分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1288684A JPH0636741B2 (ja) | 1989-11-08 | 1989-11-08 | ヒト・プロテインｃの分離方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59254186A Division JPS61134399A (ja) | 1984-12-03 | 1984-12-03 | モノクローナル抗体及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02163085A JPH02163085A (ja) | 1990-06-22 |
| JPH0636741B2 true JPH0636741B2 (ja) | 1994-05-18 |
Family
ID=17733349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1288684A Expired - Fee Related JPH0636741B2 (ja) | 1989-11-08 | 1989-11-08 | ヒト・プロテインｃの分離方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JPH0636741B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| EP3689912A1 (en) | 2007-09-26 | 2020-08-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr |
| EP4238993A3 (en) | 2008-04-11 | 2023-11-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly |
| TWI440469B (zh) | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
| SG190727A1 (en) * | 2010-11-30 | 2013-07-31 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly |
| KR102147548B1 (ko) | 2011-02-25 | 2020-08-24 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체 |
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| JP6322411B2 (ja) | 2011-09-30 | 2018-05-09 | 中外製薬株式会社 | 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子 |
| EP3517550A1 (en) | 2011-11-30 | 2019-07-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Drug containing carrier into cell for forming immune complex |
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| WO2014163101A1 (ja) | 2013-04-02 | 2014-10-09 | 中外製薬株式会社 | Ｆｃ領域改変体 |
| SG11201607165YA (en) | 2014-12-19 | 2016-09-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-c5 antibodies and methods of use |
| TWI808330B (zh) | 2014-12-19 | 2023-07-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法 |
| TW202248212A (zh) | 2015-02-05 | 2022-12-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 包含離子濃度依賴之抗原結合域的抗體、Fc區變體、IL-8結合抗體與其用途 |
| TW202339800A (zh) | 2015-02-27 | 2023-10-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途 |
| EP3394098A4 (en) | 2015-12-25 | 2019-11-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE |
| EP3494991A4 (en) | 2016-08-05 | 2020-07-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8 |
| US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS61500226A (ja) * | 1983-10-28 | 1986-02-06 | ニュ−・イングランド・メディカル・センタ−・ホスピタルズ・インコ−ポレ−テッド | コンホメ−ション特異性抗体を用いる血液凝固タンパク質の精製および単離法 |
-
1989
- 1989-11-08 JP JP1288684A patent/JPH0636741B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11608374B2 (en) | 2017-01-30 | 2023-03-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-sclerostin antibodies and methods of use |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02163085A (ja) | 1990-06-22 |
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