CN105837690A - 具有效应功能的单链多价结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有免疫球蛋白效应功能的多价结合肽(包括双特异性结合肽)，以及编码核酸、载体和宿主细胞，以及制造所述肽的方法，和使用所述肽治疗或预防各种疾病、病症或状态，以及改善至少一种与该疾病、病症或状态相关的症状的方法。

Description

具有效应功能的单链多价结合蛋白
技术领域
本发明通常涉及多价结合分子及其治疗应用的领域。
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背景技术
在健康哺乳动物中，免疫***保护动物身体免受外来物体及病原体的损害。但在某些情况下，免疫***会出差错，导致创伤性损伤和/或疾病。例如，B-细胞可产生识别自身蛋白而非外来蛋白的抗体，导致产生以自身抗体为特征的自体免疫疾病，诸如红斑性狼疮症、类风湿性关节炎及其类似疾病。在其他情况下，免疫***抗击外来物质的典型有利效应起相反作用，诸如伴随器官移植。已确认哺乳动物免疫***(且尤其人类免疫***)的功效，且已努力控制该***以避免或改善因免疫***在异常环境(例如器官移植)中正常行使功能或免疫***在其他外在正常环境(例如自体免疫疾病进展)中异常行使功能对健康所造成的有害结果。此外，已努力利用免疫***来提供多种靶标特异性诊断及治疗方法，这视抗体特异性地识别及结合具特异性的抗原性靶标的能力而定。
免疫***保护动物身体的一种方式是产生特化细胞，称作B淋巴细胞或B-细胞。B-细胞产生结合至外来物体或病原体且在某些情况下介导外来物体或病原体的破坏的抗体。但在某些情况下，人类免疫***(且特定而言，人类免疫***的B淋巴细胞)会出差错且导致疾病。存在多种癌症涉及B-细胞的失控增殖。亦存在多种自体免疫疾病涉及结合至动物身体的部分而非结合外来物体及病原体的抗体的B-细胞产生。此外，存在多种自体免疫疾病及炎性疾病的病理学涉及B-细胞，例如，经由B-细胞抗原向T-细胞的不当呈递或经由涉及B-细胞的其他途径。例如，缺乏B-细胞的易自体免疫小鼠不发展自体免疫肾病、脉管炎或自身抗体。(Shlomchik等人，J Exp.Med.1994,180:1295-306)。有趣的是，所述具有B-细胞但缺乏免疫球蛋白产生的易自体免疫小鼠在经实验方法诱导时不发展自体免疫疾病(Chan等人，J Exp.Med.1999,189:1639-48)，这表明B-细胞在自体免疫疾病的发展中具有不可或缺的作用。
B-细胞可由其细胞表面上的分子来识别。CD20为第一种由单克隆抗体识别的人类B-细胞谱是特异性表面分子。其为未经糖基化的疏水性35kDa B-细胞跨膜磷蛋白，该磷蛋白的氨基端与羧基端均位于细胞内。Einfeld等人，EMBO J.1988,7:711-17。CD20由所有正常成熟B-细胞表达，而非由前体B-细胞或浆细胞表达。CD20的天然配体还未被鉴定，且对CD20在B-细胞生物学中的功能仍不完全了解。
另一种B-细胞谱是特异性细胞表面分子为CD37。CD37为经严重糖基化的40-52kDa蛋白，其属于细胞表面抗原的四次跨膜蛋白家族。其四次横跨细胞膜，形成两个细胞外环且使其氨基端与羧基端暴露于细胞质。CD37于产生正常抗体(sIg+)的B-细胞上得以高度表达，但在前B-细胞或浆细胞上未经表达。CD37在静息T细胞且活化T细胞、单核细胞及粒细胞上的表达较低，且检测不到CD37于NK细胞、血小板或红血球上的表达。参见Belov等人，Cancer Res.,61(11):4483-4489(2001)；Schwartz-Albiez等人，J.Immunol.,140(3):905-914(1988)；及Link等人，J.Immunol.,137(9):3013-3018(1988)。除正常B-细胞外，B-细胞起源的几乎所有恶性肿瘤(包括CLL、NHL及毛细胞白血病)对于CD37表达均呈阳性(Moore等人，1987；Merson及Brochier 1988；Faure等人，1990)。CD37参与B-细胞功能的调节，因为发现缺乏CD37的小鼠具有低含量的血清IgG1且发现其对病毒抗原及模型抗原的体液反应减弱。其看起来充当非经典型协同刺激分子或经由与II类MHC分子形成复合物来直接影响抗原呈递。参见Knobeloch等人，Mol.Cell.Biol.,20(15):5363-5369(2000)。
基于以下概念进行研究及药物研发：B-细胞谱是特异性细胞表面分子(诸如CD37和CD20)本身可靶向抗体，所述抗体可结合至在其表面上具有CD37和CD20、导致癌性疾病及自体免疫疾病的B-细胞且介导所述B-细胞的破坏。向患者提供在非人类动物中制备的结合至CD37或CD20的所谓“免疫治疗”抗体(或基于所制备的抗体)以耗尽导致癌性疾病或自体免疫疾病的B-细胞。
单克隆抗体技术及遗传工程方法有利于研发用于诊断及治疗人类疾病的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白的结构域结构与工程设计的相符之处在于，抗原结合结构域与赋予效应功能的结构域可在免疫球蛋白类与子类之间互换。免疫球蛋白结构及功能是综述于例如Harlow等人编的Antibodies:A Laboratory Manual，第14章，Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor(1988)中。关于重组抗体技术所有方面的广泛介绍以及详细信息可见于教科书“Recombinant Antibodies(重组抗体)”(John Wiley&Sons,NY,1999)中。详细抗体工程设计实验室方案的综合性汇编可见于R.Kontermann及S.Dübel(编)，“The Antibody Engineering Lab Manual(抗体工程设计实验室手册)”(SpringerVerlag,Heidelberg/New York,2000)中。
免疫球蛋白分子(缩写为Ig)为一种多聚蛋白，其通常由两个相同轻链多肽及两个相同重链多肽(H2L2)组成，所述多肽由链间二硫键(亦即，相邻半胱氨酸残基的氢硫基之间的共价键)连接成巨分子复合物。基于重链组成定义五类人类免疫球蛋白，且命名为IgG、IgM、IgA、IgE及IgD。IgG类及IgA类抗体进一步分成子类，亦即分别为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，以及IgA1及IgA2。链内二硫键连接同一多肽链中的不同区域，导致形成环，所述环与相邻氨基酸一起构成免疫球蛋白结构域。各轻链及各重链在氨基-末端部分处具有单一可变区，不同抗体的单一可变区在氨基酸组成上显示相当大的不同。轻链可变区VL具有单一抗原结合结构域且与重链可变区VH(也含有单一抗原结合结构域)结合以形成免疫球蛋白的抗原结合位点Fv。
除可变区外，全长抗体链各自具有含有一个或多个结构域的恒定区。轻链具有含有单一结构域的恒定区。因此，轻链具有一个可变结构域及一个恒定结构域。重链具有含有若干个结构域的恒定区。IgG、IgA及IgD抗体中的重链具有三个指定为CH1、CH2及CH3的结构域；IgM及IgE抗体中的重链具有四个结构域：CH1、CH2、CH3及CH4。因此，重链具有一个可变结构域及三或四个恒定结构域。在所有已知物种中，值得注意的是所述结构域的不变构成，其中含有一或多个结构域的恒定区位于或靠近免疫球蛋白分子的轻链与重链的C-末端，可变结构域朝向轻链与重链的N-末端定位。免疫球蛋白结构及功能是综述于例如Harlow等人编的Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，第14章，Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor(1988)中。
免疫球蛋白的重链亦可分成三个功能区：Fd区(包含VH及CH1(亦即重链的两个N-末端结构域)的片段)、铰链区及Fc区(“可结晶片段”区)。Fc区含有与细胞上的免疫球蛋白受体相互作用且与补体级联的起始元件相互作用的结构域。因此，一般认为Fc区或片段负责免疫球蛋白的效应功能，诸如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、CDC(补体依赖性细胞毒性)及补体结合反应、结合至Fc受体、相对于缺乏FC区的多肽而言更长的体内半衰期、蛋白A结合及或许甚至胎盘转移。Capon等人，Nature,337:525-531,(1989)。此外，含有Fc区的多肽容许多肽的二聚化/多聚化。所述术语亦可用于其他免疫球蛋白的类似区。
尽管所有人类免疫球蛋白同型均含有共同的可识别结构，但各同型显示不同型式的效应功能。IgG(作为非穷举性实例)中和毒素及病毒，调理、结合补体(CDC)且参与ADCC。相反，IgM中和血源性病原体且参与调理作用。IgA在与其分泌片段结合时被分泌且经由粘膜提供针对微生物感染的主要防御；其亦中和毒素且支持调理作用。IgE介导炎性反应，主要涉及于确立完全反应所需的其他细胞的募集中。已知IgD用于提供免疫调节功能，控制B细胞的活化。同型效应功能的所述特征为可存在于人类同型之间的差异提供非全面性说明。
存在于IgG、IgA、IgD及IgE类抗体中的铰链区充当柔性间隔子，使得Fab部分在空间内可自由移动。在免疫球蛋白类及子类中，铰链结构域与恒定区相比在结构上不同，序列与长度均各不相同。例如，铰链区的长度及柔性在IgG子类中各不相同。IgG1的铰链区包含氨基酸216-231，且由于其可自由挠曲，因此Fab片段可绕其对称轴旋转且可在以两个重链间二硫键的第一键为中心的球体内移动。IgG2具有比IgG1更短的铰链，IgG2的铰链具有12个氨基酸残基及四个二硫键。IgG2的铰链区缺少甘氨酸残基，相对较短，且含有通过额外的重链间二硫键稳固的刚性聚脯氨酸双螺旋。所述特性限制IgG2分子的柔性。IgG3与其他子类的不同之处在于其独特的延长铰链区(约IgG1铰链的四倍长)，该延长铰链区含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸及11个半胱氨酸)，形成非柔性聚脯氨酸双螺旋。在IgG3中，Fab片段距Fc片段相对较远，使得该分子具有更大柔性。IgG3中的伸长铰链亦造成其分子量比其他子类更高。IgG4的铰链区比IgG1的铰链区更短且其柔性居于IgG1柔性与IgG2柔性中间。据报导，铰链区的柔性依如下次序递减：IgG3>IgG1>IgG4>IgG2。该四种IgG子类就其效应功能而言亦彼此不同。此差异与结构差异(包括可变区之间相互作用、Fab片段及恒定Fc片段方面的差异)有关。
根据结晶学研究，免疫球蛋白铰链区在功能上可进一步再分为三个区：上铰链区、核心区及下铰链区。Shin等人，1992 Immunological Reviews 130:87。上铰链区包括CH1的羧基端至铰链中限制移动的第一残基(通常为在两条重链之间形成链间二硫键的第一半胱氨酸残基)的氨基酸。上铰链区的长度与抗体的区段柔性相关。核心铰链区含有重链内二硫键，且下铰链区连接CH2域的氨基末端且包括CH2中的残基。同前。人类IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，该序列在通过形成二硫键而二聚合时形成环状八肽，导致该环状八肽可充当枢轴，因此赋予柔性。铰链区亦可含有一个或多个糖基化位点，其包括多个具有不同结构类型的用于连接碳水化合物的位点。例如，IgA1在铰链区的17氨基酸区段内含有五个糖基化位点，从而使铰链区多肽对肠蛋白酶具有耐受性，被认为是分泌免疫球蛋白的有利特性。
免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构及柔性所容许的构形变化亦可影响抗体的Fc部分的效应功能。与Fc区相关的三类一般效应功能包括(1)经典补体级联的活化；(2)与效应细胞相互作用；及(3)免疫球蛋白的区室化。不同人类IgG子类就其结合补体或活化补体级联及扩增补体级联的步骤的相对效力而言彼此不同。参见例如Kirschfink,2001Immunol.Rev.180:177；Chakraborti等人，2000 Cell Signal 12:607；Kohl等人，1999Mol.Immunol.36:893；Marsh等人，1999 Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.8:557；Speth等人，1999 Wien Klin.Wochenschr.111:378。
存在于骆驼科动物(骆驼、单峰骆驼及美洲驼；Hamers-Casterman等人，1993Nature 363:446；Nguyen等人，1998 J.Mol.Biol 275:413)、护士鲨(Roux等人，1998Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95:11804)及斑点兔银鲛(Nguyen等人，2002 Immunogenetics 54(1):39-47)中的免疫球蛋白的某些同型中存在常规抗体的H2L2结构的例外情况。显然，所述抗体仅使用重链可变区即可形成抗原结合区，亦即所述功能性抗体为仅重链的同型二聚体(称为“重链抗体”或“HCAb”)。虽然抗体技术在疾病诊断及治疗中具有优势，但在研发全抗体技术作为诊断和/或治疗试剂中仍存在某些不利方面。全抗体为大蛋白结构，例如含有两条轻链及两条重链的IgG同型的异型四聚体结构。所述大分子在某些应用中受空间位阻。例如，在实体肿瘤的治疗中，全抗体不易于渗入肿瘤内部。此外，相对大尺寸的全抗体可提供激发以确保所述分子的体内给药不诱发免疫反应。此外，活性抗体分子的产生通常涉及培养能够对初生抗体分子提供适当翻译后加工的重组真核细胞，而所述细胞难以培养且难以用提供活性抗体的商业使用产量的方式诱发。
最近，已建构较小免疫球蛋白分子以克服与全免疫球蛋白方法相关的问题。单链可变抗体片段(scFv)包含经由短肽与抗体轻链可变结构域连接的抗体重链可变结构域(Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988,85:5879-83)。由于scFv分子的尺寸小，因此其与全免疫球蛋白相比显示更有效地渗入组织。抗肿瘤scFv与相应嵌合抗体相比显示更快速的肿瘤渗透及在肿瘤块内的更均匀分布(Yokota等人，Cancer Res.1992,52:3402-08)。
虽然scFv分子为血清治疗带来优势，但该治疗方法仍存在若干缺点。scFv可从循环***中快速清除，从而可减少对正常细胞的毒性作用，但此快速清除阻碍最低有效剂量递送至靶组织。由于表达及分离scFv困难而对产量造成不利影响，因此制造足量用于给予患者的scFv已成为挑战。在表达期间，scFv分子缺乏稳定性且经常由于不同分子的可变区配对而聚集。此外，在哺乳动物表达***中，scFv分子的产量低，此限制有效制造治疗用scFv分子的潜能(Davis等人，J Biol.Chem.1990,265:10410-18；Traunecker等人，EMBO J1991,10:3655-59)。已探究改良生产的策略，包括向可变区中添加糖基化位点(Jost,C.R.美国专利第5,888,773号，Jost等人，J.Biol.Chem.1994,69:26267-73)。
使用scFv治疗的另一缺点为缺乏效应功能。不具有细胞溶解功能(诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)及补体依赖性细胞毒性(CDC))、与免疫球蛋白的恒定区结合的scFv对治疗疾病而言无效。虽然已在12年前开始研发scFv技术，但目前尚无scFv产品获准用于治疗。
或者，已提议可利用特异性抗原结合活性及小尺寸的scFv使scFv与诸如毒素的另一分子融合以将毒素递送至靶组织。Chaudary等人，Nature 1989,339:394；Batra等人，Mol.Cell.Biol.1991,11:2200。因此，可将毒素与scFv的结合或融合作为提供有效抗原特异性分子的替代性策略，但以所述结合体或嵌合体给药却受到过度和/或非特异毒性(因所述制剂中的毒素部分所致)的限制。毒性作用可包括肝酶的超生理性升高及血管渗漏综合症，及其他不良作用。此外，免疫毒素在给予宿主后本身具有高免疫原性，且针对免疫毒素所产生的宿主抗体限制重复治疗性治疗个体的潜在有效性。
非外科癌症治疗(诸如外部照射及化疗)由于所述治疗对癌细胞显示特异性缺乏、因对正常组织及细胞的毒性作用而功效受限。为克服此局限性，已研发靶向治疗方法以增强治疗对需要其的细胞及组织的特异性。该靶向方法用于体内用途的实例为给予抗体结合体，其中抗体被设计为可特异性地识别与需要治疗的细胞或组织相关的标志物且使该抗体与治疗剂(诸如毒素(在癌症治疗的情况下))结合。抗体作为全身性药剂可循环至敏感性及不良身体区室，诸如骨髓。在急性辐射损伤中，淋巴及造血区室的破坏为发展败血病且随后死亡的主要因素。此外，抗体为球状大蛋白，其对需要治疗的组织可显示不良的渗透。
罹患多种末期疾病过程的人类患者及非人类个体通常需要器官移植。然而，器官移植必须应对受者的不当免疫反应且通过用影响造血***的淋巴部分及其他部分的细胞毒性剂抑制受者对外来器官的细胞性免疫反应来避免植入器官的免疫排斥反应。移植体接受性受到受者对所述细胞毒性化学品(其中多种与抗癌(抗增殖性)药剂类似)的耐受性的限制。同样，当使用细胞毒性抗微生物剂(尤其抗病毒药物)或当使用细胞毒性药物治疗自体免疫疾病时，例如在治疗全身性红斑性狼疮症中，严重限制为治疗剂对身体的骨髓及造血细胞的毒性作用。
靶向疗法(诸如靶向抗体结合疗法)的用途经设计为尽可能使最大量的治疗剂定位于需要作用的位点，且所述疗法是否成功通过治疗剂的相对高的信号与本底值的比率来体现。靶向抗体的实例包括抗体或抗体片段、细胞特异性肽或组织特异性肽以及激素及其他受体结合分子的诊断剂结合体或治疗剂结合体。例如，已使用针对与病理性细胞及正常细胞相关以及与病原性微生物相关的不同决定子的抗体来检测及治疗多种病理性状态或病灶。在所述方法中，靶向抗体直接偶联至如以下文献中所述的适当检测剂或治疗剂，例如Hansen等人，美国专利第3,927,193号及Goldenberg，美国专利第4,331,647号、第4,348,376号、第4,361,544号、第4,468,457号、第4,444,744号、第4,460,459号、第4,460,561号、第4,624,846号及第4,818,709号。
直接靶向方法(亦即其中诊断剂或治疗剂(“活性剂”)直接偶联至靶向部分的方法)中所遭遇的一个问题为，偶联物的相对较小部分实际上结合至靶标位点，而大部分偶联物保持循环且想方设法减损靶向偶联物的功能。为确保活性剂的最大量定位，通常给予过量靶向偶联物，从而确保某些偶联物保持未结合状态且促进活性剂的本底含量。诊断性偶联物(例如不结合其靶标的放射免疫显像偶联物或磁共振成像偶联物)可保持循环，从而增加本底且降低诊断技术的解析度。在治疗性偶联物的情况下(该治疗性偶联物具有与长时循环靶向部分(诸如抗体)连接的作为活性剂的毒素(例如放射性同位素、药物或毒性化合物))，循环偶联物可产生宿主不可接受的毒性，诸如骨髓中毒或全身性副作用。
美国专利第4,782,840号揭示一种在手术期间降低高本底辐射量的作用的方法。该方法包括用对赘生性组织具特异性的抗体对患者进行注射，其中经放射性同位素(诸如碘-125)标记的抗体具有适当长的半衰期。在注射经放射性标记的抗体后，将手术延迟至少7至10天、优选14至21天，以使得可将任何未结合的放射性标记抗体清除直至低本底量。
美国专利第4,932,412号揭示在手术进行中检测期间用于降低或修正非特异性本底辐射的方法。所述方法包括向已接受经放射性标记的初级抗体的患者给予造影剂、减影剂或结合初级抗体的二级抗体。
除产生上述抗体外，免疫***包括多种具有强生物效应的细胞类型。在造血期间，源于骨髓的干细胞分化成免疫***的成熟细胞(“B”细胞)或分化成自骨髓中迁出在胸腺中成熟的细胞前体(“T”细胞)。
B细胞对于免疫反应的体液组成至关重要。B细胞经抗原的适当呈递活化而变成抗体分泌浆细胞；抗原呈递亦导致活化B细胞的克隆扩增。B细胞主要负责免疫反应的体液组成。浆细胞在其表面上通常显示约105个抗体分子(IgD及IgM)。
T淋巴细胞可分成两类。细胞毒性T细胞、Tc淋巴细胞或CTL(CD8+T细胞)杀死携带有与I类MHC相关的外来表面抗原的细胞且可杀死具有细胞内寄生物(细菌或病毒)的细胞，只要所感染细胞在其表面上显示微生物抗原即可。Tc细胞杀死肿瘤细胞，且说明对植入细胞的排斥反应。Tc细胞识别靶标细胞上的抗原-I类MHC复合物，与其接触，且将颗粒内含物直接释放至靶标细胞膜中，从而溶解细胞。
第二类T细胞为辅助T细胞或Th淋巴细胞(CD4+T细胞)，其产生在B细胞成熟为抗体分泌浆细胞中作为“辅助”因子的淋巴因子。Th细胞亦产生某些刺激效应T淋巴细胞的分化及巨噬细胞的活性的淋巴因子。Th1细胞识别巨噬细胞上与II类MHC相关的抗原且(通过IL-1)经活化以产生淋巴因子，包括活化巨噬细胞及NK细胞的IFN-γ。所述细胞介导细胞介导的免疫反应(包括延迟型过敏性反应)的各种方面。Th2细胞识别抗原呈递细胞或APC(例如迁移性巨噬细胞及树突状细胞)上与II类MHC相关的抗原且接着产生介白素及刺激特异性B-细胞及T-细胞增殖及活性的其他物质。
除充当引发T细胞相互作用、发育及增殖的APC之外，巨噬细胞亦涉及于细胞介导免疫的表达中，因为其通过细胞介导免疫反应中所产生的IFN-γ活化。活化巨噬细胞具有增强的吞噬细胞潜能且释放导致炎症且破坏多种细菌及其他细胞的可溶性物质。天然杀伤细胞为可溶解带有新抗原的细胞(不管其是否为MHC型)，且甚至可溶解一些不带有MHC蛋白的细胞的细胞毒性细胞。天然杀伤T细胞或NK细胞依据其杀死显示外来抗原的细胞(例如肿瘤细胞)的能力来定义，无论是否为MHC型且无论是否预先敏化(暴露)于抗原。NK细胞可由IL-2及IFN-γ活化，且以与细胞毒性T淋巴细胞相同的方式溶解细胞。某些NK细胞具有IgG抗体的Fc结构域的受体(例如CD16或FCγRIII)且因此能够结合至靶标细胞表面上的IgG的Fc部分且释放经由抗体依赖性细胞介导的细胞毒性杀死靶标细胞的溶细胞组份。
另一组细胞为粒细胞或多形核白细胞(PMN)。嗜中性白细胞(PMN的一种类型)杀死细菌侵袭者且吞噬残留物。嗜伊红细胞为PMN的另一种类型且含有在对于另一种细胞(诸如外来细胞)释放时显示细胞毒性的颗粒。嗜碱细胞(PMN的第三种类型)为强生理性反应(例如炎症)的重要介质粒，其通过释放多种生物学活性化合物(诸如组织氨、血清素、***素及白三烯)来发挥其作用。所述所有细胞类型的共同点为在有机体内通常通过杀死且任选地清除有害组合物(诸如外来细胞)来发挥生理作用的能力。
尽管多种哺乳动物细胞(包括免疫***的细胞)能够直接发挥生理作用(例如，以Tc、NK、某些PMN、巨噬细胞及其类似细胞为代表的细胞杀死作用)，但其他细胞间接促成生理作用。例如，抗原初始呈递至免疫***的原始T细胞需要命令细胞-细胞接触的MHC呈现。此外，活化T细胞与抗原特异性B细胞之间通常需要接触以获得特定免疫原性反应。免疫反应中常见的细胞-细胞接触的第三种形式为活化B细胞与滤泡性树突状细胞之间的接触。所述细胞-细胞接触要求各自使生物活性剂靶向指定靶标变得复杂化。
补体依赖性细胞毒性(CDC)被认为是清除诸如肿瘤细胞的特定靶标细胞的重要机制。CDC是由大量酶以级联方式彼此间活化组成的一系列事件。补体在清除抗原中具有重要作用，此由其四种主要功能实现：(1)局部血管扩张；(2)吸引免疫细胞，尤其巨噬细胞(趋化性)；(3)标记外来有机体用于吞噬作用(调理作用)；及(4)通过膜攻击复合物(MAC攻击)破坏侵袭有机体。主要分子为C3蛋白。其为由经典途径或替代途径的组份裂解成两个片段的酶。经典途径通过抗体(尤其IgG及IgM)诱发，而替代途径通过细菌产物(如脂多糖(LPS))非特异性地刺激。简而言之，C3裂解的产物包括小肽C3a，其对于吞噬型免疫细胞具有趋化性且通过促使C5a片段自C5中释放而导致局部血管扩张。C3的另一部分C3b包覆外来有机体表面上的抗原且对有机体发挥调理作用以将其破坏。C3b亦与补体***的其他组份反应以形成由C5b、C6、C7、C8及C9组成的MAC。
在人类治疗中存在与使用抗体相关的问题，此是因为免疫***对任何抗原的反应，即使最简单者，亦为“多克隆”反应，亦即***制造在其结合区以及其效应区中均具有大范围结构的抗体。
已使用两种方法以试图减少免疫原性抗体的问题。第一种方法为制备嵌合抗体，其中使小鼠单克隆抗体的抗原结合部分(可变区)与人类抗体的效应部分(恒定区)融合。在第二种方法中，已经由称为互补决定区(CDR)移植或“人源化”的技术来改变抗体。该方法经进一步改良以包括称为以下各者的变化：“重构”(Verhoeyen等人，1988 Science239:1534-1536；Riechmann等人，1988 Nature 332:323-337；Tempest等人，Bio/Technol 1991 9:266-271)、“超嵌合”(Queen等人，1989 Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033；Co等人，1991 Proc Natl Acad Sci USA88:2869-2873；Co等人，1992 J Immunol 148:1149-1154)，及“面饰”(Mark等人，于：Metcalf BW,Dalton BJ编Cellular adhesion:moleculardefinition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312中)。
自1986年，即公布单克隆抗体后十一年时起，平均每年有不到一种治疗性抗体引入市场。自1986年至1995年的十年期间，有五种鼠单克隆抗体引入人类药物中，包括用于器官移植体的急性排斥反应的“莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)”(OrthoClone)；用于结肠直肠癌的“依决洛单抗(edrecolomab)”用于移植体排斥反应的“奥度莫单抗(odulimomab)”及用于非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)的“替伊莫单抗(ibritumomab)”(yiuxetan)。此外，已市售单克隆Fab“阿昔单抗(abciximab)”用于预防冠状动脉再阻塞。亦已推出三种嵌合单克隆抗体：用于治疗B细胞淋巴瘤的“利妥昔单抗(rituximab)”用于移植体排斥反应的“巴利昔单抗(basiliximab)”及用于治疗类风湿性关节炎及克罗恩氏病(Crohn’sdisease)的“英利昔单抗(infliximab)”此外，“阿昔单抗”(嵌合型人类-鼠单克隆抗体的47.6kD Fab片段)是作为经皮冠状动脉介入术的佐剂市售以用于预防经历经皮冠状动脉介入术的患者的心脏缺血性并发症。最后，已推出七种“人源化”单克隆抗体。“达利珠单抗(Daclizumab)”是用于预防移植肾脏的急性排斥反应；“帕利珠单抗(palivizumab)”是用于RSV；“曲妥珠单抗(trastuzumab)”结合HER-2(一种存在于乳癌细胞上的生长因子)；“吉妥珠单抗(gemtuzumab)”是用于急性骨髓性白血病(AML)；且“阿仑单抗(alemtuzumab)”是用于慢性淋巴细胞性白血病；“阿达木单抗(adalimumab)”((D2E7))是用于治疗类风湿性关节炎；且“奥马佐单抗(omalizumab)”是用于治疗持续性哮喘。
因此，多种抗体技术已在研发及销售更有效治疗剂及缓和剂的工作中受到关注。遗憾的是，仍存在问题而破坏所述各种疗法的前景。例如，大部分经利妥昔单抗治疗的癌症患者通常在约6至12个月内复发，且已报导在利妥昔单抗输注24小时内发生致命性输注反应。亦已报导，在存在致命性结果的情况下需要透析的急性肾衰竭在以利妥昔单抗治疗中具有严重(有时致命)的粘膜皮肤反应。此外，静脉内注射需要高剂量的利妥昔单抗，此是因为该分子大(约150kDa)且扩散进入存在有大量肿瘤细胞的淋巴组织受到限制。
曲妥珠单抗给药可导致发生心室机能不良、充血性心脏衰竭及严重过敏性反应(包括重度过敏)、输注反应及肺部事件。达利珠单抗免疫抑制疗法使得发生淋巴组织增殖症及机会性感染的风险增加。已报导在接受吉妥珠单抗的患者中发生因肝衰竭所致的死亡、因严重肝脏毒性所致的死亡及因静脉闭塞疾病(VOD)所致的死亡。
亦报导接受阿仑单抗的患者体内的肝脏毒性。接受阿仑单抗疗法的患者已发生严重的(在某些罕见情况下为致命性的)全血细胞减少症/骨髓发育不全、自体免疫特发性血小板减少症及自体免疫性溶血性贫血。阿仑单抗亦可导致严重输注反应以及机会性感染。据报导，在经阿达木单抗治疗的患者中，严重感染及败血症(包括致命性严重感染及败血症)出现临床症状的恶化和/或脱髓鞘疾病的放射照相迹象，且在临床试验中经阿达木单抗治疗的患者患淋巴瘤的发病率比一般群体所预期的发病率更高。奥马佐单抗据报导可诱发恶性肿瘤及重度过敏。
癌症包括广泛范围的疾病，波及全世界范围内约四分之一的个体。恶性细胞的快速且不受调节的增殖为多种癌症类型(包括恶性血液病)的标志。尽管患有恶性血液病的患者在过去二十年中因癌症治疗的进步而受益(Multani等人，1998 J.Clin.Oncology 16:3691-3710)，且症状缓解已成倍增加，但大多数患者的疾病仍会复发且死亡。对于细胞毒性药物医治的障碍包括例如肿瘤细胞耐受性及化疗的高毒性，所述障碍妨碍对诸多患者的最佳给药。
据报导，使用嵌合型CD20单克隆抗体治疗患有低度恶性或滤泡性B细胞淋巴瘤的患者可诱发患者的部分反应或全部反应。McLaughlin等人，1996 Blood 88:90a(增刊1，摘要)；Maloney等人，1997 Blood 90:2188-95。然而，如上所述，肿瘤复发一般在六个月至一年内发生。需要进一步改良血清疗法以诱发对例如低度恶性B细胞淋巴瘤的更持久反应且使得可有效治疗高度恶性淋巴瘤及其他B细胞疾病。
另一种方法为使用对CD20具特异性的单克隆抗体来使放射性同位素靶向B细胞淋巴瘤。尽管据报导治疗有效性得以增加，但与放射性抗体的长体内半衰期相关的毒性亦增强，时常需要患者经历干细胞挽救。Press等人，1993 N.Eng.J.Med.329:1219-1224；Kaminski等人，1993 N.Eng.J.Med.329:459-65。在连接放射性同位素之前，亦已用蛋白酶将CD20的单克隆抗体裂解以产生F(ab’)2或Fab片段。据报导，此可改良放射性同位素结合体渗透至肿瘤中且可缩短体内半衰期，从而降低对正常组织的毒性。然而，所述分子缺乏效应功能，包括补体结合反应和/或ADCC。
自体免疫疾病包括自体免疫甲状腺疾病(包括格雷氏病(Graves’disease)及桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis))。仅在美国，约有两千万人患有某种形式的自体免疫性甲状腺病。自体免疫性甲状腺病是因产生刺激甲状腺而导致甲状腺功能亢进(格雷氏病)或破坏甲状腺而导致甲状腺功能减退(桥本氏甲状腺炎)的自体抗体所致。对甲状腺的刺激是因自身抗体结合且活化促甲状腺激素(TSH)受体所致。对甲状腺的破坏是因自身抗体与其他甲状腺抗原反应所致。格雷氏病的当前疗法包括手术、放射性碘或抗甲状腺药物疗法。放射性碘受到广泛使用，此是因为抗甲状腺药物具有显著副作用且疾病复发率高。手术专供患有大甲状腺肿的患者或需要极快速正常化甲状腺功能时所用。尚不存在靶向负责刺激TSH受体的自身抗体的产生的疗法。桥本氏甲状腺炎的当前疗法为左旋甲状腺素钠(levothyroxine sodium)，且由于症状缓解的可能性低而预期为终生疗法。抑制性疗法已证明可缩减桥本氏甲状腺炎的甲状腺肿，但尚未知减少自身抗体产生以靶向疾病机制的疗法。
类风湿性关节炎(RA)为以关节发炎为特征的慢性疾病，其导致肿胀、疼痛及功能丧失。在美国估计有两百五十万人患有RA。RA是因包括初始感染或损伤、异常免疫反应及遗传因素在内的事件组合所致。尽管RA中存在自反应性T细胞及B细胞，但可利用检测聚集于关节中的高含量抗体(称为类风湿性因子)来诊断RA。RA的当前疗法包括用于控制疼痛且减缓疾病进展的多种药物。尚未发现可治愈该疾病的疗法。药物包括非类固醇消炎药(NSAIDS)及改变病情抗类风湿药物(DMARDS)。NSAIDS适用于良性疾病，但无法阻止发展为严重RA的关节破坏及无力。NSAIDS与DMARDS均与显著副作用相关。10年来仅一种新DMARD来氟米特(Leflunomide)获准。来氟米特阻止产生自身抗体，减少炎症且减缓RA进展。然而，该药物亦导致严重副作用，包括恶心、腹泻、落发、皮疹及肝损伤。
全身性红斑性狼疮症(SLE)为自体免疫疾病，其是因包括肾、皮肤及关节的多种器官中的血管发生反复性损伤所致。在美国估计逾500,000人患有SLE。在患有SLE的患者中，T细胞与B细胞之间的不当相互作用导致产生攻击细胞核的自身抗体。所述抗体包括抗双链DNA及抗-Sm抗体。约一半SLE患者体内亦存在结合磷脂的自身抗体，且所述自身抗体造成血管损害及低血球计数。免疫复合物积聚于SLE患者的肾、血管及关节中，导致炎症及组织损害。尚未发现可治愈该疾病的SLE疗法。视疾病的严重程度而定，可使用NSAIDS及DMARDS治疗。利用血浆交换移除自身抗体的血浆清除术可使SLE患者得到暂时性改善。通常一致认为自身抗体导致SLE，因此耗尽B细胞谱是的新颖疗法(当由前体产生新B细胞时可使免疫***恢复)为SLE患者持久受益提供希望。
修格兰氏综合征(Sjogren’s syndrome)为以身体水分产生腺体的破坏为特征的自体免疫疾病。修格兰氏综合征为最普遍的自体免疫病症之一，在美国估计多达4百万人患有此病。修格兰氏综合征患者中约一半亦患有***疾病，诸如RA，而另一半患有原发性修格兰氏综合征、但未患其他并发性自体免疫疾病。包括抗细胞核抗体、类风湿性因子、抗胞衬蛋白及抗蕈毒碱受体在内的自身抗体通常存在于患有修格兰氏综合征的患者体内。常规疗法包括皮质类固醇，且其他更有效疗法亦有益。
免疫性血小板减少性紫癜(ITP)是因自身抗体结合至血小板且导致其破坏所致。ITP的某些情况是因药物所致，而其他情况是与感染、怀孕或诸如SLE的自体免疫性疾病相关。所有情况中约一半可归类为特发性起源。ITP的治疗是依据症状的严重程度来决定。尽管在大多数情况下提供免疫抑制性药物(包括皮质类固醇或静脉内输注免疫球蛋白以耗尽T细胞)，但在某些情况下无需治疗。常导致血小板数量增加的另一种治疗为移除脾脏，该器官破坏抗体包覆的血小板。对于严重情况的患者，使用更有效的免疫抑制性药物，包括环孢素(cyclosporine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)或硫唑嘌呤(azathioprine)。通过使患者血浆通过蛋白A管柱移除自身抗体可用作患有严重疾病的患者的第二线治疗。需要其他更有效的疗法。
多发性硬化症(MS)亦为自体免疫疾病。其特征为中枢神经***的炎症及髓鞘的破坏，使得脑、脊髓及身体中的神经细胞纤维孤立。尽管MS的病因未知，但广泛相信自体免疫T细胞为该疾病发病机制的主要促成因素。然而，MS患者的脑脊髓液中存在高含量的抗体，且某些人预言导致抗体产生的B细胞反应对于介导该疾病而言具有重要作用。尚未对MS患者研究B细胞耗尽疗法，且尚无MS治愈。当前疗法为皮质类固醇，其可减少攻击的持续时间及严重程度，但不影响MS随时间的进程。最近MS的新颖生物技术干扰素(IFN)疗法已获批准，但仍需要其他更有效的疗法。
重症肌无力(MG)为以任意肌肉群虚弱为特征的慢性自体免疫神经肌肉失调症。在美国约40,000人患有MG。MG是因自身抗体结合至在神经肌肉接点处经表达的乙酰胆碱受体所致。自身抗体减少或阻断乙酰胆碱受体，阻止信号由神经传递至肌肉。尚未知MG的治愈方法。普通治疗包括用皮质类固醇、环孢素、环磷酰胺或硫唑嘌呤进行免疫抑制。通常利用手术移除胸腺来减弱自体免疫反应。用于减少血液中的自身抗体含量的血浆清除术可有效用于MG，但因自身抗体持续产生而为短暂性的。血浆清除术一般供严重肌肉虚弱者在手术之前使用。新颖有效的疗法亦为有益的。
约五百万人患有牛皮癣，且其特征为皮肤的自体免疫性炎症。在30％患者中，牛皮癣亦与关节炎相关(牛皮癣性关节炎)。已使用多种疗法，包括类固醇、紫外光类视色素、维生素D衍生物、环孢素及甲氨喋呤(methotrexate)，但显然牛皮癣亦将受益于新颖且有效的疗法。硬皮症为***的慢性自体免疫疾病，亦称为全身性硬化。硬皮症特征为胶原蛋白的超量产生，导致皮肤变厚，且在美国约300,000人患有硬皮症，硬皮症亦将受益于新颖且有效的疗法。
由以上论述显而易见，需要经改良的组合物及方法以治疗、改善或预防多种疾病、病症及状态，包括癌症及自体免疫疾病。
概述
本发明通过提供以下各者来满足本领域中的上述需要中的至少一者：含有至少两个特异性结合结构域的蛋白，其中该两个结构域是通过源自抗体分子的恒定亚区来连接，该抗体分子的C-末端连接至本文中称为蝎形连接子的连接子；及编码所述蛋白的核酸；以及所述蛋白及核酸的制备、诊断性及治疗性用途。该恒定亚区包含源自免疫球蛋白CH2结构域的结构域及优选源自免疫球蛋白CH3结构域的结构域，但不含有源自或对应于免疫球蛋白CH1结构域的结构域或区。先前认为将源自抗体的恒定区置于蛋白内部会干扰抗体功能，诸如效应功能，以此类推，通常将抗体的恒定区置于抗体链的羧基末端亦会干扰抗体功能。此外，于恒定亚区的C-末端布置蝎形连接子(其可为免疫球蛋白铰链样肽)为不同于天然存在的免疫球蛋白构成的构成。然而，根据本发明将恒定亚区(其中蝎形连接子连接恒定区的C-末端)置于多肽链或蛋白链内部使得显示效应功能及多价(单特异性或多特异性)结合能力的蛋白相对不受空间位阻的阻碍。正如本领域技术人员在考虑本揭示内容后所显而易见，所述蛋白设计为模块且可如下被构建：通过在多种结合结构域中选择任何结构域作为结合结构域1或结合结构域2(或作为存在于本发明的特定蛋白中的任何其他结合结构域)；通过选择具有效应功能的恒定亚区；且通过选择铰链样或非铰链样的蝎形连接子(例如II型C-凝集素受体茎区肽)，其中蛋白显示N-结合结构域1-恒定亚区-蝎形连接子-结合结构域2-C的一般构成。本领域技术人员将进一步了解具有该结构的蛋白及编码此蛋白的核酸将存在多种应用，包括医学及兽医学应用。
本发明的一方面是关于具有效应功能或蝎形连接子(所述术语可互换使用)的多价单链结合蛋白，该结合蛋白包含源自免疫球蛋白(例如抗体)或免疫球蛋白样分子的第一结合结构域；提供效应功能的恒定亚区，该恒定亚区位于第一结合结构域的C-末端；位于恒定亚区的C-末端的蝎形连接子；及源自免疫球蛋白(诸如抗体)或免疫球蛋白样分子的第二结合结构域，该第二结合结构域位于恒定亚区的C-末端；从而使恒定亚区定位于第一结合结构域与第二结合结构域之间。单链结合蛋白的多特异性(例如双特异性)在于其可结合两个或两个以上不同靶标，或其可具有单特异性，具有两个针对同一靶标的结合位点。此外，该蛋白的所有结构域均存在于单链中，但该蛋白可形成同型多聚体，例如通过形成链间二硫键形成同型多聚体。在某些实施方案中，第一结合结构域与/或第二结合结构域是源自相同或不同免疫球蛋白(例如抗体)的轻免疫球蛋白链及重免疫球蛋白链的可变区。免疫球蛋白可来源于任何脊椎动物，诸如哺乳动物，包括人类，且可为天然存在的免疫球蛋白的嵌合型、人源化片段、变异体或衍生物。
本发明涵盖其中第一及第二结合结构域源自相同或不同免疫球蛋白(例如抗体)且其中第一及第二结合结构域识别相同或不同分子靶标(例如细胞表面标志物，诸如膜结合蛋白)的蛋白。此外，第一及第二结合结构域可识别相同或不同表位。第一及第二分子靶标可与第一及第二靶标细胞、病毒、载体和/或物体相关。在根据本发明的该方面的优选实施方案中，第一结合结构域、第二结合结构域及恒定亚区各自是源自人类免疫球蛋白，诸如IgG抗体。在其他实施方案中，具有效应功能的多价结合蛋白具有可识别至少一种无细胞分子靶标(例如与细胞不相关的蛋白，诸如沉积蛋白或可溶性蛋白)的第一结合结构域及第二结合结构域中的至少一者。例如，无细胞分子靶标包括与细胞从不相关的蛋白，例如所给予的化合物，诸如蛋白；以及经分泌、裂解、存在于外来体中或自细胞排出或分离的蛋白。
由第一及第二结合结构域所识别的靶标分子可存在于相同或不同的原核细胞、真核细胞、病毒(包括细菌性噬菌体)、有机或无机靶标分子载体及外来物体上或与所述物体相关。此外，该靶标分子可位于类型相同、实体不同的细胞、病毒、载体或物体上(例如两个不同的真核细胞、原核细胞、病毒或载体)，或该靶标分子可位于不同类型的细胞、病毒、载体或物体上(例如真核细胞及病毒)。靶标细胞为与由结合结构域所识别的靶标分子相关的那些细胞且包括内源细胞或自体细胞以及外源细胞或外来细胞(感染性微生物细胞、移植哺乳动物细胞(包括输血细胞))。本发明包括用于存在于与哺乳动物(诸如人类)的疾病、病症或状态相关的靶标细胞表面上的第一和/或第二结合结构域的靶标。示例性靶标细胞包括癌细胞、与自体免疫疾病或病症相关的细胞及感染性细胞(例如感染性细菌)。亦涵盖感染性有机体(诸如哺乳动物寄生虫)的细胞作为靶标细胞。在某些实施方案中，本发明的蛋白为具有效应功能的多价(例如多特异性)结合蛋白，其中第一结合结构域及第二结合结构域中的至少一者识别选自由以下各者组成的组的靶标：肿瘤抗原、B-细胞靶标、TNF受体超家族成员、Hedgehog家族成员、受体酪氨酸激酶、蛋白聚糖相关分子、TGF-β超家族成员、Wnt相关分子、受体配体、T-细胞靶标、树突状细胞靶标、NK细胞靶标、单核细胞/巨噬细胞靶标及血管生成靶标。
在上述蛋白的某些实施方案中，肿瘤抗原是选自由以下各者组成的组：鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、(蛋白T4-A)、鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)、粘蛋白1(肿瘤相关粘蛋白)、(癌相关粘蛋白)、(多形性上皮粘蛋白)、(PEM)、(PEMT)、(上皮粘蛋白)、(肿瘤相关上皮细胞膜抗原)、(EMA)、(H23AG)、(花生反应性尿粘蛋白)、(PUM)、(乳癌相关抗原DF3)、CTCL肿瘤抗原se1-1、CTCL肿瘤抗原se14-3、CTCL肿瘤抗原se20-4、CTCL肿瘤抗原se20-9、CTCL肿瘤抗原se33-1、CTCL肿瘤抗原se37-2、CTCL肿瘤抗原se57-1、CTCL肿瘤抗原se89-1、***特异性细胞膜抗原、5T4癌胚滋养层糖蛋白、Orf73卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(Orf73 Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus)、MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变异体A、癌症相关表面抗原、腺癌抗原ART1、副肿瘤相关脑-睾丸-癌症抗原(神经癌抗原MA2；副肿瘤神经元抗原)、神经肿瘤腹侧抗原2(NOVA2)、肝细胞癌抗原基因520、肿瘤相关抗原CO-029、肿瘤相关抗原MAGE-X2、滑液肉瘤、X断点2、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原、血清学定义的结肠癌抗原1、血清学定义的乳癌抗原NY-BR-15、血清学定义的乳癌抗原NY-BR-16、嗜铬粒蛋白A；副甲状腺分泌蛋白1、DUPAN-2、CA 19-9、CA 72-4、CA 195及L6。
上述方法的实施方案包含选自由以下各者组成的组的B细胞靶标：CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD38、CD39、CD40、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD78、CD79a/b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD89、CD98、CD126、CD127、CDw130、CD138及CDw150。
在上述方法的其他实施方案中，TNF受体超家族成员是选自由以下各者组成的组：4-1BB/TNFRSF9、NGFR/TNFRSF16、BAFF R/TNFRSF13C、护骨素/TNFRSF11B、BCMA/TNFRSF17、OX40/TNFRSF4、CD27/TNFRSF7、RANK/TNFRSF11A、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD40/TNFRSF5、TACI/TNFRSF13B、DcR3/TNFRSF6B、TNF RI/TNFRSF1A、DcTRAIL R1/TNFRSF23、TNFRII/TNFRSF1B、DcTRAIL R2/TNFRSF22、TRAIL R1/TNFRSF10A、DR3/TNFRSF25、TRAIL R2/TNFRSF10B、DR6/TNFRSF21、TRAIL R3/TNFRSF10C、EDAR、TRAIL R4/TNFRSF10D、Fas/TNFRSF6、TROY/TNFRSF19、GITR/TNFRSF18、TWEAK R/TNFRSF12、HVEM/TNFRSF14、XEDAR、淋巴毒素βR/TNFRSF3、4-1BB配体/TNFSF9、淋巴毒素、APRIL/TNFSF13、淋巴毒素β/TNFSF3、BAFF/TNFSF13C、OX40配体/TNFSF4、CD27配体/TNFSF7、TL1A/TNFSF15、CD30配体/TNFSF8、TNF-α/TNFSF1A、CD40配体/TNFSF5、TNF-β/TNFSF1B、EDA-A2、TRAIL/TNFSF10、Fas配体/TNFSF6、TRANCE/TNFSF11、GITR配体/TNFSF18、TWEAK/TNFSF12及LIGHT/TNFSF14。
上述方法亦包括其中Hedgehog家族成员是选自由Patched及Smoothened组成的组的实施方案。在其他实施方案中，蛋白聚糖相关分子是选自由蛋白聚糖及其调节剂组成的组。
该方法的其他实施方案是关于其中受体酪氨酸激酶是选自由以下各者组成的组的方法：Axl、FGF R4、C1q R1/CD93、FGF R5、DDR1、Flt-3、DDR2、HGF R、Dtk、IGF-I R、EGF R、IGF-II R、Eph、INSRR、EphA1、胰岛素R/CD220、EphA2、M-CSF R、EphA3、Mer、EphA4、MSP R/Ron、EphA5、MuSK、EphA6、PDGF Rα、EphA7、PDGF Rβ、EphA8、Ret、EphB1、ROR1、EphB2、ROR2、EphB3、SCF R/c-kit、EphB4、Tie-1、EphB6、Tie-2、ErbB2、TrkA、ErbB3、TrkB、ErbB4、TrkC、FGF R1、VEGF R1/Flt-1、FGF R2、VEGF R2/Flk-1、FGF R3及VEGF R3/Flt-4。
在该方法的其他实施方案中，转化生长因子(TGF)-β超家族成员是选自由以下各者组成的组：活化素RIA/ALK-2、GFRα-1、活化素RIB/ALK-4、GFRα-2、活化素RIIA、GFRα-3、活化素RIIB、GFRα-4、ALK-1、MIS RII、ALK-7、Ret、BMPR-IA/ALK-3、TGF-βRI/ALK-5、BMPR-IB/ALK-6、TGF-βRII、BMPR-II、TGF-βRIIb、内皮因子/CD105及TGF-βRIII。
该方法的其他实施方案包含选自由以下各者组成的组的Wnt相关分子：Frizzled-1、Frizzled-8、Frizzled-2、Frizzled-9、Frizzled-3、sFRP-1、Frizzled-4、sFRP-2、Frizzled-5、sFRP-3、Frizzled-6、sFRP-4、Frizzled-7、MFRP、LRP 5、LRP 6、Wnt-1、Wnt-8a、Wnt-3a、Wnt-10b、Wnt-4、Wnt-11、Wnt-5a、Wnt-9a及Wnt-7a。
在该方法的其他实施方案中，该受体配体是选自由以下各者组成的组：4-1BB配体/TNFSF9、淋巴毒素、APRIL/TNFSF13、淋巴毒素β/TNFSF3、BAFF/TNFSF13C、OX40配体/TNFSF4、CD27配体/TNFSF7、TL1A/TNFSF15、CD30配体/TNFSF8、TNF-α/TNFSF1A、CD40配体/TNFSF5、TNF-β/TNFSF1B、EDA-A2、TRAIL/TNFSF10、Fas配体/TNFSF6、TRANCE/TNFSF11、GITR配体/TNFSF18、TWEAK/TNFSF12、LIGHT/TNFSF14、双调蛋白(Amphiregulin)、NRG1同种型GGF2、β细胞生长因子(Betacellulin)、NRG1同种型SMDF、EGF、NRG1-α/HRG1-α、Epigen、NRG1-β1/HRG1-β1、表皮调节素(Epiregulin)、TGF-α、HB-EGF、TMEFF1/土莫调节素(Tomoregulin)-1、神经调节蛋白-3(Neuregulin-3)、TMEFF2、IGF-I、IGF-II、胰岛素、活化素A、活化素B、活化素AB、活化素C、BMP-2、BMP-7、BMP-3、BMP-8、BMP-3b/GDF-10、BMP-9、BMP-4、BMP-15、BMP-5、Dpp蛋白(Decapentaplegic)、BMP-6、GDF-1、GDF-8、GDF-3、GDF-9、GDF-5、GDF-11、GDF-6、GDF-15、GDF-7、阿特明(Artemin)、纽特元(Neurturin)、GDNF、普塞芬(Persephin)、TGF-β、TGF-β2、TGF-β1、TGF-β3、LAP(TGF-β1)、TGF-β5、潜在性TGF-β1、潜在性TGF-βbp1、TGF-β1.2、Lefty、Nodal、MIS/AMH、酸性FGF、FGF-12、碱性FGF、FGF-13、FGF-3、FGF-16、FGF-4、FGF-17、FGF-5、FGF-19、FGF-6、FGF-20、FGF-8、FGF-21、FGF-9、FGF-23、FGF-10、KGF/FGF-7、FGF-11、神经菌毛素-1(Neuropilin-1)、PlGF、神经菌毛素-2、PlGF-2、PDGF、PDGF-A、VEGF、PDGF-B、VEGF-B、PDGF-C、VEGF-C、PDGF-D、VEGF-D及PDGF-AB。
在其他实施方案中，T-细胞靶标是选自由以下各者组成的组：2B4/SLAMF4、IL-2Rα、4-1BB/TNFRSF9、IL-2Rβ、ALCAM、B7-1/CD80、IL-4R、B7-H3、BLAME/SLAMF8、BTLA、IL-6R、CCR3、IL-7Rα、CCR4、CXCR1/IL-8RA、CCR5、CCR6、IL-10Rα、CCR7、IL-10Rβ、CCR8、IL-12Rβ1、CCR9、IL-12Rβ2、CD2、IL-13Rα1、IL-13、CD3、CD4、ILT2/CD85j、ILT3/CD85k、ILT4/CD85d、ILT5/CD85a、整合素α4/CD49d、CD5、整合素αE/CD103、CD6、整合素αM/CD11b、CD8、整合素αX/CD11c、整合素β2/CD18、KIR/CD158、CD27/TNFRSF7、KIR2DL1、CD28、KIR2DL3、CD30/TNFRSF8、KIR2DL4/CD158d、CD31/PECAM-1、KIR2DS4、CD40配体/TNFSF5、LAG-3、CD43、LAIR1、CD45、LAIR2、CD83、白三烯B4R1、CD84/SLAMF5、NCAM-L1、CD94、NKG2A、CD97、NKG2C、CD229/SLAMF3、NKG2D、CD2F-10/SLAMF9、NT-4、CD69、NTB-A/SLAMF6、共同γ链/IL-2Rγ、骨桥蛋白(Osteopontin)、CRACC/SLAMF7、PD-1、CRTAM、PSGL-1、CTLA-4、RANK/TNFRSF11A、CX3CR1、CX3CL1、L-选择素(L-选择素)、CXCR3、SIRPβ1、CXCR4、SLAM、CXCR6、TCCR/WSX-1、DNAM-1、胸腺生成素(Thymopoietin)、EMMPRIN/CD147、TIM-1、EphB6、TIM-2、Fas/TNFRSF6、TIM-3、Fas配体/TNFSF6、TIM-4、FcγRIII/CD16、TIM-6、GITR/TNFRSF18、TNF RI/TNFRSF1A、颗粒溶素(Granulysin)、TNF RII/TNFRSF1B、HVEM/TNFRSF14、TRAIL R1/TNFRSF10A、ICAM-1/CD54、TRAIL R2/TNFRSF10B、ICAM-2/CD102、TRAIL R3/TNFRSF10C、IFN-γR1、TRAIL R4/TNFRSF10D、IFN-γR2、TSLP、IL-1RI及TSLP R。
在其他实施方案中，NK细胞受体是选自由以下各者组成的组：2B4/SLAMF4、KIR2DS4、CD155/PVR、KIR3DL1、CD94、LMIR1/CD300A、CD69、LMIR2/CD300c、CRACC/SLAMF7、LMIR3/CD300LF、DNAM-1、LMIR5/CD300LB、FcεRII、LMIR6/CD300LE、FcγRI/CD64、MICA、FcγRIIB/CD32b、MICB、FcγRIIC/CD32c、MULT-1、FcγRIIA/CD32a、柄蛋白-2/CD112、FcγRIII/CD16、NKG2A、FcRH1/IRTA5、NKG2C、FcRH2/IRTA4、NKG2D、FcRH4/IRTA1、NKp30、FcRH5/IRTA2、NKp44、类Fc受体3/CD16-2、NKp46/NCR1、NKp80/KLRF1、NTB-A/SLAMF6、Rae-1、Rae-1α、Rae-1β、Rae-1δ、H60、Rae-1ε、ILT2/CD85j、Rae-1γ、ILT3/CD85k、TREM-1、ILT4/CD85d、TREM-2、ILT5/CD85a、TREM-3、KIR/CD158、TREML1/TLT-1、KIR2DL1、ULBP-1、KIR2DL3、ULBP-2、KIR2DL4/CD158d及ULBP-3。
在其他实施方案中，单核细胞/巨噬细胞靶标是选自由以下各者组成的组：B7-1/CD80、ILT4/CD85d、B7-H1、ILT5/CD85a、共同β链、整合素α4/CD49d、BLAME/SLAMF8、整合素αX/CD11c、CCL6/C10、整合素β2/CD18、CD155/PVR、整合素β3/CD61、CD31/PECAM-1、胶乳素(Latexin)、CD36/SR-B3、白三烯B4R1、CD40/TNFRSF5、LIMPII/SR-B2、CD43、LMIR1/CD300A、CD45、LMIR2/CD300c、CD68、LMIR3/CD300LF、CD84/SLAMF5、LMIR5/CD300LB、CD97、LMIR6/CD300LE、CD163、LRP-1、CD2F-10/SLAMF9、MARCO、CRACC/SLAMF7、MD-1、ECF-L、MD-2、EMMPRIN/CD147、MGL2、内皮因子/CD105、骨活素(Osteoactivin)/GPNMB、FcγRI/CD64、骨桥蛋白、FcγRIIB/CD32b、PD-L2、FcγRIIC/CD32c、Siglec-3/CD33、FcγRIIA/CD32a、SIGNR1/CD209、FcγRIII/CD16、SLAM、GM-CSF Rα、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TLR3、IFN-γR1、TLR4、IFN-γR2、TREM-1、IL-1RII、TREM-2、ILT2/CD85j、TREM-3、ILT3/CD85k、TREML1/TLT-1、2B4/SLAMF4、IL-10Rα、ALCAM、IL-10Rβ、氨基肽酶N/ANPEP、ILT2/CD85j、共同β链、ILT3/CD85k、C1q R1/CD93、ILT4/CD85d、CCR1、ILT5/CD85a、CCR2、整合素α4/CD49d、CCR5、整合素αM/CD11b、CCR8、整合素αX/CD11c、CD155/PVR、整合素β2/CD18、CD14、整合素β3/CD61、CD36/SR-B3、LAIR1、CD43、LAIR2、CD45、白三烯B4R1、CD68、LIMPII/SR-B2、CD84/SLAMF5、LMIR1/CD300A、CD97、LMIR2/CD300c、CD163、LMIR3/CD300LF、凝血因子III/组织因子、LMIR5/CD300LB、CX3CR1、CX3CL1、LMIR6/CD300LE、CXCR4、LRP-1、CXCR6、M-CSF R、DEP-1/CD148、MD-1、DNAM-1、MD-2、EMMPRIN/CD147、MMR、内皮因子/CD105、NCAM-L1、FcγRI/CD64、PSGL-1、FcγRIII/CD16、RP105、G-CSF R、L-选择素、GM-CSF Rα、Siglec-3/CD33、HVEM/TNFRSF14、SLAM、ICAM-1/CD54、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TREM-1、IL-6R、TREM-2、CXCR1/IL-8RA、TREM-3及TREML1/TLT-1。
在该方法的其他实施方案中，树突状细胞靶标是选自由以下各者组成的组：CD36/SR-B3、LOX-1/SR-E1、CD68、MARCO、CD163、SR-AI/MSR、CD5L、SREC-I、CL-P1/COLEC12、SREC-II、LIMPII/SR-B2、RP105、TLR4、TLR1、TLR5、TLR2、TLR6、TLR3、TLR9、4-1BB配体/TNFSF9、IL-12/IL-23p40、4-氨基-1,8-萘酰亚胺、ILT2/CD85j、CCL21/6Ckine、ILT3/CD85k、8-氧基-dG、ILT4/CD85d、8D6A、ILT5/CD85a、A2B5、整合素α4/CD49d、Aag、整合素β2/CD18、AMICA、郎罕细胞特异蛋白(Langerin)、B7-2/CD86、白三烯B4R1、B7-H3、LMIR1/CD300A、BLAME/SLAMF8、LMIR2/CD300c、C1qR1/CD93、LMIR3/CD300LF、CCR6、LMIR5/CD300LB、CCR7、LMIR6/CD300LE、CD40/TNFRSF5、MAG/Siglec-4a、CD43、MCAM、CD45、MD-1、CD68、MD-2、CD83、MDL-1/CLEC5A、CD84/SLAMF5、MMR、CD97、NCAM-L1、CD2F-10/SLAMF9、骨活素/GPNMB、Chem23、PD-L2、CLEC-1、RP105、CLEC-2、Siglec-2/CD22、CRACC/SLAMF7、Siglec-3/CD33、DC-SIGN、Siglec-5、DC-SIGNR/CD299、Siglec-6、DCAR、Siglec-7、DCIR/CLEC4A、Siglec-9、DEC-205、Siglec-10、凝集素-1/CLEC7A、Siglec-F、凝集素-2/CLEC6A、SIGNR1/CD209、DEP-1/CD148、SIGNR4、DLEC、SLAM、EMMPRIN/CD147、TCCR/WSX-1、FcγRI/CD64、TLR3、FcγRIIB/CD32b、TREM-1、FcγRIIC/CD32c、TREM-2、FcγRIIA/CD32a、TREM-3、FcγRIII/CD16、TREML1/TLT-1、ICAM-2/CD102及辣椒素R1(Vanilloid R1)。
在该方法的其他实施方案中，血管生成靶标是选自由以下各者组成的组：血管生成素(Angiopoietin)-1、类血管生成素2、血管生成素-2、类血管生成素3、血管生成素-3、类血管生成素7/CDT6、血管生成素-4、Tie-1、类血管生成素1、Tie-2、血管生长素(Angiogenin)、iNOS、凝血因子III/组织因子、nNOS、CTGF/CCN2、NOV/CCN3、DANCE、OSM、EDG-1、Plfr、EG-VEGF/PK1、增殖素(Proliferin)、内皮抑制素(Endostatin)、ROBO4、红血球生成素(Erythropoietin)、凝血栓蛋白-1、激肽抑制素(Kininostatin)、凝血栓蛋白-2、MFG-E8、凝血栓蛋白-4、一氧化氮(Nitric Oxide)、VG5Q、eNOS、EphA1、EphA5、EphA2、EphA6、EphA3、EphA7、EphA4、EphA8、EphB1、EphB4、EphB2、EphB6、EphB3、Ephrin-A1、Ephrin-A4、Ephrin-A2、Ephrin-A5、Ephrin-A3、Ephrin-B1、Ephrin-B3、Ephrin-B2、酸性FGF、FGF-12、碱性FGF、FGF-13、FGF-3、FGF-16、FGF-4、FGF-17、FGF-5、FGF-19、FGF-6、FGF-20、FGF-8、FGF-21、FGF-9、FGF-23、FGF-10、KGF/FGF-7、FGF-11、FGF R1、FGF R4、FGF R2、FGF R5、FGF R3、神经菌毛素-1、神经菌毛素-2、臂板蛋白3A、臂板蛋白6B、臂板蛋白3C、臂板蛋白6C、臂板蛋白3E、臂板蛋白6D、臂板蛋白6A、臂板蛋白7A、MMP、MMP-11、MMP-1、MMP-12、MMP-2、MMP-13、MMP-3、MMP-14、MMP-7、MMP-15、MMP-8、MMP-16/MT3-MMP、MMP-9、MMP-24/MT5-MMP、MMP-10、MMP-25/MT6-MMP、TIMP-1、TIMP-3、TIMP-2、TIMP-4、ACE、IL-13Rα1、IL-13、C1q R1/CD93、整合素α4/CD49d、VE-钙粘素、整合素β2/CD18、CD31/PECAM-1、KLF4、CD36/SR-B3、LYVE-1、CD151、MCAM、CL-P1/COLEC12、粘连蛋白-2/CD112、凝血因子III/组织因子、E-选择素、D6、P-选择素、DC-SIGNR/CD299、SLAM、EMMPRIN/CD147、Tie-2、内皮因子/CD105、TNF RI/TNFRSF1A、EPCR、TNFRII/TNFRSF1B、红血球生成素R、TRAIL R1/TNFRSF10A、ESAM、TRAIL R2/TNFRSF10B、FABP5、VCAM-1、ICAM-1/CD54、VEGF R2/Flk-1、ICAM-2/CD102、VEGF R3/Flt-4、IL-1RI及VG5Q。
该方法的其他实施方案提供多价结合蛋白，其中结合结构域1及结合结构域2中的至少一者特异性地结合选自由以下各者组成的组的靶标：***特异性细胞膜抗原(叶酸水解酶1)、表皮生长因子受体(EGFR)、用于高级糖基化终产物的受体(RAGE；亦称为高级糖基化终产物受体或AGER)、IL-17A、IL-17F、P19(IL23A及IL12B)、Dickkopf-1(Dkk1)、NOTCH1、NG2(硫酸软骨素蛋白聚糖4或CSPG4)、IgE(IgHE或IgH2)、IL-22R(IL22RA1)、IL-21、类淀粉β寡聚物(Ab寡聚物)、类淀粉β前驱蛋白(APP)、NOGO受体(RTN4R)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、IL-4、肌肉抑制素(GDF8)、极晚期抗原4、α4、β1整合素(VLA4或ITGA4)、存在于白细胞上的α4、β7整合素，及IGF-1R。例如，VLA4靶标可由其中结合结构域1及结合结构域2中的至少一者为源自那他珠单抗(Natalizumab)(Antegren)的结合结构域的多价结合蛋白来识别。
在某些实施方案中，癌细胞为转型造血细胞或癌性造血细胞。在某些所述实施方案中，第一结合结构域及第二结合结构域中的至少一者识别选自由以下各者组成的组的靶标：B-细胞靶标、单核细胞/巨噬细胞靶标、树突状细胞靶标、NK-细胞靶标及T-细胞靶标(其各自如本文中所定义)。此外，第一结合结构域及第二结合结构域中的至少一者可识别骨髓靶标，包括但不限于：CD5、CD10、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD29、CD30、CD31、CD33、CD34、CD35、CD38、CD43、CD45、CD64、CD66、CD68、CD70、CD80、CD86、CD87、CD88、CD89、CD98、CD100、CD103、CD111、CD112、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a、CD120b、CDw123、CDw131、CD141、CD162、CD163、CD177、CD312、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5、B-B2、B-B8及B-细胞抗原受体。
本发明的其他实施方案是关于如本文所述的多价结合蛋白，其包含选自由以下各者组成的组的序列：SEQ ID NO:2、4、6、103、105、107、109、332、333、334及345。其他实施方案是关于包含选自由以下各者组成的组的序列的多价结合蛋白：SEQ ID NO:355、356、357、358、359、360、361、362、363、364及365。
在其他实施方案中，具有效应功能的多价及多特异性结合蛋白具有识别选自由EPHB4-KDR与TIE-TEK组成的组的靶标对的第一结合结构域与第二结合结构域。在所述实施方案中，该蛋白具有识别EPHB4的第一结合结构域与识别KDR的第二结合结构域，或识别KDR的第一结合结构域与识别EPHB4的第二结合结构域。类似地，该蛋白可具有识别TIE的第一结合结构域与识别TEK的第二结合结构域，或识别TEK的第一结合结构域与识别TIE的第二结合结构域。
在一相关方面中，本发明提供具有效应功能的多价结合蛋白，其中恒定亚区识别效应细胞FC受体(例如FCγRI、FCγRII、FCγRIII、FCαR及FCεRI)。在特定实施方案中，恒定亚区识别选自由以下各者组成的组的效应细胞表面蛋白：CD2、CD3、CD16、CD28、CD32、CD40、CD56、CD64、CD89、FCεRI、KIR、凝血栓蛋白R、NKG2D、2B4/NAIL及41BB。恒定亚区可包含源自相同或不同免疫球蛋白、抗体同型或等位基因变异体的CH2结构域及CH3结构域。在某些实施方案中，CH3结构域为截短型结构域且包含选自由以下各者组成的组的C-末端序列：SEQ IDNO:366、367、368、369、370及371。当连接子为源自免疫球蛋白的铰链样肽时，CH2结构域及蝎形连接子优选是源自相同类别或源自相同子类的免疫球蛋白。
本发明亦涵盖如下某些蛋白，所述蛋白进一步包含具有至少约5个氨基酸、与恒定亚区连接且与第二结合结构域连接的蝎形连接子，从而使蝎形连接子定位于恒定亚区与第二结合结构域之间。通常，蝎形连接子肽长度介于5至45个氨基酸之间。蝎形连接子包括源自免疫球蛋白铰链区(诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及IgE铰链区)的铰链样肽。优选地，铰链样蝎形连接子将保留至少一个在生理条件下能够形成链间二硫键的半胱氨酸。源自IgG1的蝎形连接子可具有1个半胱氨酸或2个半胱氨酸，且优选将保留对应于IgG1的N-末端铰链半胱氨酸的半胱氨酸。在某些实方案中，蝎形连接子相对于同源免疫球蛋白铰链区而言延长，且在示例性实施方案中，包含选自由SEQ ID NO:351、352、353及354组成的组的序列。亦涵盖非铰链样肽作为蝎形连接子，其限制条件为所述肽提供足够空间及柔性以得到能够形成两个结合结构域的单链蛋白，该单链蛋白是相对于更靠近中心定位的恒定亚区结构域而朝向各蛋白末端(N及C)定位。示例性非铰链样蝎形连接子包括源自II型C-凝集素的茎区(诸如CD69、CD72、CD94、NKG2A及NKG2D的茎区)的肽。在某些实施方案中，蝎形连接子包含选自由SEQ ID NO:373、374、375、376及377组成的组的序列。
所述蛋白亦可包含具有至少约5个氨基酸、与恒定亚区连接且与第一结合结构域连接的连接子，从而使该连接子定位于恒定亚区与第一结合结构域之间。在某些实施方案中，连接子是存在于恒定亚区与两个结合结构域中之一者之间，且该连接子可具有相同或不同的序列且可具有相同或不同的长度。
本发明的蛋白的恒定亚区提供至少一种效应功能。涵盖本领域中已知的与免疫球蛋白(例如抗体)相关的任何效应功能，诸如选自由以下各者组成的组的效应功能：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、体内相对延长的半衰期(相对于缺乏恒定亚区的相同分子)、FcR结合性、蛋白A结合性及其类似效应功能。在某些实施方案中，本发明的蛋白在人类中的延长半衰期为至少28小时。当然，欲给予至非人类个体的蛋白在此非人类个体中将显示相对延长的半衰期，而在人类中则未必如此。
一般而言，本发明的蛋白(包括多肽和肽)对于第一结合结构域及第二结合结构域中的至少一者显示小于10-9M或至少10-6M的结合亲和性。
本发明的另一方面是关于包含如本文中所述的蛋白和药学上可接受的佐剂、载体或赋形剂的药学上的组合物。本领域中已知的任何佐剂、载体或赋形剂均适用于本发明的药学上的组合物中。
本发明的又一方面提供一种制备如上所述的蛋白的方法，该方法包含：将编码蛋白的核酸引入宿主细胞且将该宿主细胞优选以至少1毫克/升的量在适于表达蛋白的条件下孵育，从而表达该蛋白。在某些实施方案中，该方法进一步包含如下分离该蛋白：将其与其在细胞内表达后所结合的至少一种蛋白分离。适于表达核酸以制备本发明的蛋白的宿主细胞包括(但不限于)选自由以下各者组成的组的宿主细胞：VERO细胞、海拉细胞(HeLacell)、CHO细胞、COS细胞、W138细胞、BHK细胞、HepG2细胞、3T3细胞、RIN细胞、MDCK细胞、A549细胞、PC12细胞、K562细胞、HEK293细胞、N细胞、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)细胞、多种真菌细胞中的任何者及多种细菌细胞中的任何者(包括(但不限于)大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)及链霉菌(Streptomycete))。
本发明亦提供一种制备如上所述的编码该蛋白的核酸的方法，该方法包含：使编码源自免疫球蛋白可变区的第一结合结构域的聚核苷酸的3’端与编码恒定亚区的聚核苷酸的5’端共价连接，使编码蝎形连接子的聚核苷酸的5’端与编码恒定亚区的聚核苷酸的3’端共价连接，且使编码源自免疫球蛋白可变区的第二结合结构域的聚核苷酸的5’端与编码蝎形连接子的聚核苷酸的3’端共价连接，从而形成编码具有效应功能的多价结合蛋白的核酸。所述编码区各自可作为本发明的单链结构的部分而由连接子或铰链样肽的编码区分离。在某些实施方案中，该方法制备编码第一结合结构域的单链形式的聚核苷酸，该第一结合结构域包含选自由以下各者组成的组的序列：SEQ ID NO:2(抗-CD20可变区、VL-VH取向)、SEQ ID NO:4(抗-CD28可变区、VL-VH取向)及SEQ ID NO:6(抗-CD28可变区、VH-VL取向)，然而要求异型多聚蛋白(包括天然抗体)必需由经分别编码的多肽组装而成。编码第一结合结构域的示例性聚核苷酸序列为包含SEQ ID NO:1、3或5的任意者的聚核苷酸。
本发明的该方面亦提供制备编码核酸的方法，所述编码核酸进一步包含插于编码第一结合结构域的聚核苷酸与编码恒定亚区的聚核苷酸之间的连接子聚核苷酸，该连接子聚核苷酸编码具有至少5个氨基酸的肽连接子。此外，所述方法制备进一步包含插于编码恒定亚区的聚核苷酸与编码第二结合结构域的聚核苷酸之间的连接子聚核苷酸的核酸，该连接子聚核苷酸编码具有至少5个氨基酸的肽连接子。优选地，所编码的肽连接子具有5个与45个之间的氨基酸。
存在于BD1与EFD之间或存在于EFD与BD2之间的连接子区的一致性源自以同源-Ig超家族成员所识别的其他序列。在研发源自同源-Ig超家族成员中所存在的现有序列的新颖连接子中，由于所述序列通常为用于使细胞表面受体经蛋白酶裂解以形成可溶性形式的底物，因此优选避免出现类似于位于C-样结构域末端与跨膜结构域末端之间的那些序列段的序列段。在-Ig超家族与亚家族的不同成员之间进行序列比对，可比较分子之间在连接多个V-样结构域或连接V样结构域与C样结构域的连接子序列方面的类似性。由此分析可知，可出现保守型天然存在的序列模式；所述序列在用作多价融合蛋白的子结构域之间的连接子时应具有更强的蛋白酶耐受性，可促成Ig环区之间的适当折叠，且因其发生于内源性细胞表面分子的细胞外结构域中而不具有免疫原性。
所述核酸本身构成本发明的另一方面。涵盖编码本文所述的本发明任何蛋白的核酸。因此，本发明的核酸依5’至3’的次序包含第一结合结构域的编码区、恒定亚区序列及第二结合结构域的编码区。亦涵盖编码蛋白变异体的核酸，其中该两个结合结构域及恒定亚区序列在氨基酸序列方面与已知免疫球蛋白可变区序列及已知恒定亚区序列的组合序列总共具有至少80％且优选至少85％、90％、95％或99％的一致性。或者，本发明的蛋白变异体通过在65-68℃、0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠的严格杂交条件下或在42℃、0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠及50％甲酰胺的严格杂交条件下与编码本发明的非变异体蛋白的核酸杂交的核酸来编码。本发明的变异体核酸在上文刚刚定义的条件下显示杂交能力，或与编码本发明的非变异体蛋白的核酸显示90％、95％、99％或99.9％的序列一致性。
在相关方面中，本发明提供包含如上所述的核酸的载体以及包含如本文中所述的载体或核酸的宿主细胞。可使用本领域中已知的任何载体(例如质粒、噬菌粒(phagemid)、噬菌粒(phasmid)、粘粒、病毒、人工染色体、穿梭载体及其类似物)，且本领域技术人员将了解何种载体特别适于指定目的。例如，在制备本发明的蛋白的方法中，选择可于所选宿主细胞中操作的表达载体。同样，涵盖能够经本发明的核酸或载体进行遗传转化的任何宿主细胞。优选的宿主细胞为高等真核生物宿主细胞，但亦涵盖低等真核生物(例如酵母)及原核生物(细菌)宿主细胞。
本发明的另一方面是关于一种诱导靶标细胞损伤的方法，该方法包含使靶标细胞与治疗有效量的如本文中所述的蛋白接触。在某些实施方案中，通过将蛋白或编码核酸给予有此需要的有机体来体内接触靶标细胞。本发明的该方面中涵盖其中多价单链结合蛋白可对靶标细胞诱导加成量的损伤的方法，此量为由因包含所述结合结构域中的一者或另一者的分离抗体所致的损伤总量所预计的损伤量。亦涵盖其中多价单链结合蛋白可对靶标细胞诱导协同量(与由包含第一结合结构域、但不包含第二结合结构域的第一抗体及包含第二结合结构域、但不包含第一结合结构域的第二抗体所诱导的损伤总量相比)的损伤的方法。在某些实施方案中，多价单链结合蛋白具有多特异性且包含特异性地识别选自由以下各者组成的组的抗原对的结合结构域对：CD19/CD20、CD20/CD21、CD20/CD22、CD20/CD40、CD20/CD79a、CD20/CD79b、CD20/CD81、CD21/CD79b、CD37/CD79b、CD79b/CD81、CD19/CL II(亦即II类MHC)、CD20/CL II、CD30/CL II、CD37/CL II、CD72/CL II及CD79b/CL II。
本发明的该方面亦包括其中多特异性多价单链结合蛋白可对靶标细胞诱导抑制量的损伤(与包含第一结合结构域、但不包含第二结合结构域的第一抗体及包含第二结合结构域、但不包含第一结合结构域的第二抗体所诱导的损伤总量相比)的方法。示例性实施方案包括其中多特异性多价单链结合蛋白包含特异性地识别选自由以下各者组成的组的抗原对的结合结构域对的方法：CD20/CL II、CD21/CD79b、CD22/CD79b、CD40/CD79b、CD70/CD79b、CD72/CD79b、CD79a/CD79b、CD79b/CD80、CD79b/CD86、CD21/CL II、CD22/CL II、CD23/CL II、CD40/CL II、CD70/CL II、CD80/CL II、CD86/CL II、CD19/CD22、CD20/CD22、CD21/CD22、CD22/CD23、CD22/CD30、CD22/CD37、CD22/CD40、CD22/CD70、CD22/CD72、CD22/79a、CD22/79b、CD22/CD80、CD22/CD86及CD22/CL II。
在一相关方面中，本发明提供一种治疗细胞增殖病症(例如癌症)的方法，该方法包含将治疗有效量的蛋白(如本文中所述)或编码核酸给予有此需要的有机体。本领域技术人员(包括医学专业人员及兽医学专业人员)熟知对于需要治疗的有机体的鉴别。本发明所涵盖的易经受治疗的病症包括选自由癌症、自体免疫病症、劳氏(Rous)肉瘤病毒感染及炎症组成的组的病症。在某些实施方案中，该蛋白是通过体内表达如本文中所述的编码蛋白的核酸来给药。本发明亦包括通过选自由以下各者组成的组的途径来给予蛋白：静脉内注射、动脉内注射、肌肉内注射、皮下注射、腹膜内注射及直接组织注射。
本发明的另一方面是关于一种改善与细胞增殖病症相关的症状的方法，该方法包含将治疗有效量的如本文中所述的蛋白给予有此需要的有机体。本领域技术人员亦熟知对于显示易经受改善的症状的那些病症或疾病或状态的鉴别。在某些实施方案中，该症状是选自由疼痛、发热、肿胀及关节僵硬组成的组。
本发明的又一方面是关于一种治疗与感染物相关的感染的方法，该方法包含将治疗有效量的本发明的蛋白给予有此需要的患者，其中该蛋白包含特异性地结合感染物的靶标分子的结合结构域。根据本发明的该方面，易经受治疗的感染物包括原核细胞及真核细胞、病毒(包括噬菌体)、外来物及感染性有机体，诸如寄生虫(例如哺乳动物寄生虫)。
本发明的一相关方面是关于一种改善与感染物相关的感染症状的方法，该方法包含将有效量的本发明的蛋白给予有此需要的患者，其中该蛋白包含特异性地结合感染物的靶标分子的结合结构域。熟习医学及兽医学技术者将能够利用常规实验基于个例来判定蛋白的有效量。
本发明的又一相关方面为一种降低因感染物所致的感染风险的方法，该方法包含将预防有效量的本发明的蛋白给予具有患该感染的风险的患者，其中该蛋白包含特异性地结合感染物的靶标分子的结合结构域。熟习相关技术者将能够利用常规实验基于个例来判定蛋白的预防有效量。
本发明的另一方面是关于上述多价单链结合蛋白，其中第一结合结构域及第二结合结构域中的至少一者特异性地结合选自由以下各者组成的组的抗原：CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD30、CD37、CD40、CD70、CD72、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86及主要组织相容性复合物II类肽。
在某些实施方案中，第一结合结构域及第二结合结构域中的一者特异性地结合CD20，而在某些所述实施方案中，另一结合结构域特异性地结合选自由以下各者组成的组的抗原：CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD30、CD37、CD40、CD70、CD72、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86及主要组织相容性复合物II类肽。例如，在一个实施方案中，第一结合结构域能够特异性地结合CD20，而第二结合结构域能够特异性地结合例如CD19。在另一实施方案中，第一结合结构域结合CD19，而第二结合结构域结合CD20。亦涵盖其中两个结合结构域均结合CD20的实施方案。
在根据本发明的该方面的某些其他实施方案中，第一结合结构域及第二结合结构域中的一者特异性地结合CD79b，而在某些所述实施方案中，另一结合结构域特异性地结合选自由以下各者组成的组的抗原：CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD30、CD37、CD40、CD70、CD72、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86及主要组织相容性复合物II类肽。示例性实施方案包括不同的多特异性多价单链结合蛋白，其中第一结合结构域:第二结合结构域特异性地结合CD79b:CD19或CD19:CD79b。亦包括具有可识别CD79b的第一及第二结合结构域的多价结合蛋白。
在其他某些实施方案中，第一结合结构域及第二结合结构域中的一者特异性地结合主要组织相容性复合物II类肽，而在某些所述实施方案中，另一结合结构域特异性地结合选自由以下各者组成的组的抗原：CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD30、CD37、CD40、CD70、CD72、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86及主要组织相容性复合物II类肽。例如，在一个实施方案中，第一结合结构域能够特异性地结合主要组织相容性复合物II类肽，而第二结合结构域能够特异性地结合例如CD19。在另一实施方案中，第一结合结构域结合CD19，而第二结合结构域结合主要组织相容性复合物II类肽。亦涵盖其中两个结合结构域均结合主要组织相容性复合物II类肽的实施方案。
在根据本发明的该方面的其他实施方案中，第一结合结构域及第二结合结构域中的一者特异性地结合CD22，而在某些所述实施方案中，另一结合结构域特异性地结合选自由以下各者组成的组的抗原：CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD30、CD37、CD40、CD70、CD72、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86及主要组织相容性复合物II类肽。例示性实施方案包括不同的多特异性多价单链结合蛋白，其中第一结合结构域:第二结合结构域特异性地结合CD22:CD19或CD19:CD22。亦包括具有可识别CD22的第一及第二结合结构域的多价结合蛋白。
本发明的一相关方面是关于上述多价单链结合蛋白，其中该蛋白对靶标细胞行为具有协同效应(相对于各结合结构域的效应的总和)。在某些实施方案中，该蛋白包含特异性地识别选自由以下各者组成的组的抗原对的结合结构域对：CD20-CD19、CD20-CD21、CD20-CD22、CD20-CD40、CD20-CD79a、CD20-CD79b及CD20-CD81。
本发明进一步包括如上所述的多价单链结合蛋白，其中该蛋白对靶标细胞行为具有加成效应(相对于各结合结构域的效应的总和)。根据本发明的该方面的实施方案包括包含特异性地识别选自由以下各者组成的组的抗原对的结合结构域对的多特异性蛋白：CD20-CD23、CD20-CD30、CD20-CD37、CD20-CD70、CD20-CD80、CD20-CD86、CD79b-CD37、CD79b-CD81、主要组织相容性复合物II类肽-CD30及主要组织相容性复合物II类肽-CD72。
本发明的又一相关方面为如上所述的多价单链结合蛋白，其中该蛋白对靶标细胞行为具有抑制效应(相对于各结合结构域的效应的总和)。在某些实施方案中，该蛋白具有多特异性且包含特异性地识别选自由以下各者组成的组的抗原对的结合结构域：CD20-主要组织相容性复合物II类肽、CD79b-CD19、CD79b-CD20、CD79b-CD21、CD79b-CD22、CD79b-CD23、CD79b-CD30、CD79b-CD40、CD79b-CD70、CD79b-CD72、CD79b-CD79a、CD79b-CD80、CD79b-CD86、CD79b-主要组织相容性复合物II类肽、主要组织相容性复合物II类肽-CD19、主要组织相容性复合物II类肽-CD20、主要组织相容性复合物II类肽-CD21、主要组织相容性复合物II类肽-CD22、主要组织相容性复合物II类肽-CD23、主要组织相容性复合物II类肽-CD37、主要组织相容性复合物II类肽-CD40、主要组织相容性复合物II类肽-CD70、主要组织相容性复合物II类肽-CD79a、主要组织相容性复合物II类肽-CD79b、主要组织相容性复合物II类肽-CD80、主要组织相容性复合物II类肽-CD81、主要组织相容性复合物II类肽-CD86、CD22-CD19、CD22-CD40、CD22-CD79b、CD22-CD86及CD22-主要组织相容性复合物II类肽。
本发明的另一方面为一种鉴别上述多价结合分子(诸如多特异性结合分子)的结合结构域中的至少一者的方法，该方法包含：(a)使抗同型抗体与特异性地识别第一抗原的抗体及特异性地识别第二抗原的抗体接触；(b)进一步使包含所述抗原中的至少一者的靶标与步骤(a)的组合物接触；及(c)测量靶标的活性，其中此活性是用于鉴别多价结合分子的结合结构域中的至少一者。在某些实施方案中，该靶标为病态细胞，诸如癌细胞(例如癌性B-细胞)或产生自身抗体的B-细胞。
在本发明的上述各方法中，预期该方法可进一步包含多种多价单链结合蛋白。在某些实施方案中，第一多价单链结合蛋白的结合结构域及第二多价单链结合蛋白的结合结构域可对靶标细胞诱导协同效应、加成效应或抑制效应，诸如对靶标细胞诱导协同量、加成量或抑制量的损伤。多种多价单链结合蛋白的协同效应、加成效应或抑制效应是通过将所述多种蛋白的效应与包含结合结构域中的一者的抗体及包含另一结合结构域的抗体的组合效应相比较来判定。
本发明的一相关方面是关于一种包含多种如上所述的多价单链结合蛋白的组合物。在某些实施方案中，该组合物包含多种多价单链结合蛋白，其中第一种多价单链结合蛋白的结合结构域及第二种多价单链结合蛋白的结合结构域能够对靶标细胞诱导协同效应、加成效应或抑制效应，诸如对靶标细胞诱导协同量、加成量或抑制量的损伤。
本发明进一步是关于一种包含上述组合物及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药学上的组合物。此外，本发明包括一种试剂盒，该试剂盒包含如本文中所述的组合物及一组关于给予该组合物以对靶标细胞产生效应(诸如损伤靶标细胞)的说明书。
最后，本发明亦包括一种试剂盒，该试剂盒包含如本文中所述的蛋白及一组关于给予该蛋白以治疗细胞增殖病症或改善细胞增殖病症的症状的说明书。
通过参考以下详细说明(包括实施例)可更清楚地了解本发明的其他特征和优势。
附图简述
图1显示本发明所设想的多价单链分子的示意图。融合蛋白表达盒的个别子结构域通过图上的独立形状/方块指示。BD1是指结合结构域1，连接子1是指介于BD1与“效应功能结构域”(以EFD指示)之间的任何潜在连接子或铰链样肽。该子结构域通常为人类IgG1的Fc结构域的工程化形式，但可包括如本文中所定义的具有一或多种效应功能的其他子结构域。连接子2是指(若存在，则)存在于EFD的羧基末端与结合结构域2(BD2)之间的连接子序列。
图2显示COS细胞中所表达的非还原蛋白的蛋白质印迹。使蛋白分泌于培养基内，且在48-72小时后通过离心从经瞬间转染的细胞分离培养基上清液。将三十微升(30μl)粗上清液载入各凝胶孔内。泳道标识：1-分子量标记，数字指示千道尔顿(kilodalton)；2-2H7-IgG-STD1-2E12 LH；3-2H7-IgG-STD1-2E12 HL，4-2H7-IgG-STD2-2E12 LH；5-2H7-IgG-STD2-2E12 HL；6-2E12 LH SMIP；7-2E12 HL SMIP；8-2H7SMIP。“2H7”是指单链构建体，其中BD1编码VLVH取向的CD20特异性结合结构域(2H7)；“2E12”是指对CD28具特异性的结合结构域；-IgG-是指具有编码其中所有C均突变为S的序列(sss)的铰链的单链构建体，且IgG1的CH2结构域和CH3结构域含有排除ADCC效应功能与CDC效应功能的突变(P238S与P331S)；“STD 1”是指插在VL-VH取向的BD2相邻处或2E12(VL-VH)相邻处的20氨基酸连接子(在图7中标识为“STD1＝20aa”)。“STD1-HL”是指与刚才所述类似、但BD2V区为VH-VL取向的如下构建体：2H7-sssIgG(P238/331S)-20氨基酸连接子-2E12(VH-VL)。“STD2-LH”是指2H7-sssIgG(P238/331S)-38氨基酸连接子-2E12(VL-VH)；“STD2-LH”是指2H7-sssIgG(P238/331SS)-38氨基酸连接子-2E12(VH-VL)；“SMIP”是指小模组免疫药物；且“H”通常是指VH，而“L”通常是指VL。除非另有说明，否则所有蛋白取向均为N-末端至C-末端取向。
图3显示两幅柱状图，其说明由COS细胞所表达的2H7-sssIgG(P238S/P331S)-STD1-2e12 LH衍生物及2H7-sssIgG(P238S/P331S)-STD1-2e12 HL衍生物的结合特性。所述实验是用粗培养物上清液、而非经纯化的蛋白来进行。将未经16倍稀释的培养物上清液的连续稀释液与表达CD20的细胞(WIL-2S)或表达CD28的细胞(CD28 CHO)一起孵育。将上清液的结合活性与测试相关单一特异性SMIP的结合性的对照样本(诸如TRU-015或2e12 VLVH或2e12VHVL SMIP)相比较。各样本的结合是使用异硫氰酸萤光素(FITC)与山羊抗人类IgG的结合体、以1:100的稀释度来检测。
图4为显示图3中所测试的蛋白的蛋白A纯化型与WIL2-S细胞的结合模式的频度分布图。“TRU015”为对CD20具特异性的SMIP。亦对两种具有效应功能的多特异性结合蛋白进行分析：“2H7-2E12LH”具有VL-VH取向的对CD28具特异性的结合结构域2；“2H7-2E12HL”具有VH-VL取向的对CD28具特异性的结合结构域2。测试所述蛋白各自在5μg/mL下的结合性，且用FITC山羊抗人类IgG、以1:100检测结合性。关于所测试分子的更完整说明，参见以上图2的说明。
图5显示两幅频度分布图，其说明具有效应功能的经蛋白A纯化的多特异性结合蛋白与表达CD28的CHO细胞的结合性。“2H7-2E12LH”具有VL-VH取向的对CD28具特异性的结合结构域2；“2H7-2E12HL”具有VH-VL取向的对CD28具特异性的结合结构域2。测试所述蛋白各自在5μg/mL下的结合性，且用FITC山羊抗人类IgG、以1:100检测结合性。关于所测试分子的更完整说明，参见图2的说明。
图6A)显示标识连接恒定亚区与结合结构域2的连接子的表格。连接子是以名称、序列、序列识别号、序列长度及与结合结构域2融合的序列来标识。B)显示标识多种构建体的表格，所述构建体标识本发明的例示分子中的元件。除以名称标识多价结合分子外，亦就结合结构域1(BD1)、恒定亚区(铰链及效应结构域或EFD)、连接子(关于连接子的其他信息，参见图6A)及结合结构域2(BD2)而言来揭示那些分子中的元件。提供多种例示性多价结合蛋白的序列，且在图中以序列识别号来标识。其他多价结合蛋白具有经改变的元件或元件次序，可由所揭示的序列来预测序列的改变。
图7显示组合式柱状图，其说明经纯化蛋白以单一结合浓度结合至表达CD20的WIL-2S细胞及表达CD28的CHO细胞。“H1-H6”是指具有H1-H6连接子及VH-VL取向的2e12V区的2H7-sss-hIgG-Hx-2e12分子。“L1-L6”是指具有L1-L6连接子及VL-VH取向的2e12V区的2H7-sss-hIgG-Lx-2e12分子。所有分子均在0.72μg/mL的浓度下进行测试，且使用FITC与山羊抗人类IgG的结合体、以1:100检测结合性。接着对各样本的平均萤光强度作图，其为所测试的两种靶标细胞类型相对于所测试的各多价构建体(L1-L6或H1-H6)的成对柱状图。
图8显示库马斯(Coomassie)染色非还原性及还原性SDS-PAGE凝胶的像片。所述凝胶显示2H7-sss-hIgG-Hx-2e12 HL蛋白上的变异体连接子序列/长度对显现于凝胶上的两种主要蛋白带的量的影响。
图9显示用与2H7特异性具有反应性的(a)CD28mIgG或(b)Fab所探测的[2H7-sss-hIgG-H6-2e12]融合蛋白及相关单一特异性SMIP的蛋白质印迹。结果显示H6连接子的存在导致产生裂解形式的多价构建体，其缺乏CD28结合特异性。
图10显示[TRU015-sss-IgG-Hx-2e12 HL]H1-H6连接子形式的不同连接子变异体的结合曲线。第一分图显示结合至表达CD20的WIL-2S细胞的结合曲线。第二分图显示不同形式结合至CD28 CHO细胞的结合曲线。所述结合曲线如下产生：连续稀释经蛋白A纯化的融合蛋白且使用FITC与山羊抗人类IgG的结合体以1:100来检测结合性。
图11显示概述具有变异体连接子H1-H7的2H7-sss-IgG-2e12 HL多特异性融合蛋白的SEC分离结果的表格。表中各列列举[2H7-sss-IgG-Hx-2e12-HL]融合蛋白的不同连接子变异体。所关注峰(POI)的滞留时间及以POI存在的融合蛋白的百分率及以其他形式存在的蛋白的百分率亦列入表中。亦列举分子是否裂解，裂解程度以定性方式指示，其中(是)、是、是、或否为四种可能的选择。
图12显示具有变异体连接子H3、H6及H7连接子的[2H7-sss-hIgG-Hx-2e12]多特异性融合蛋白与表达CD20或CD28的细胞的两条结合曲线图。将经蛋白A纯化的融合蛋白自10μg/ml至0.005μg/ml的连续稀释液与表达CD20的WIL-2S细胞或CD28 CHO细胞一起孵育。使用FITC与山羊抗人类IgG的结合体以1:100来检测结合性。分图A显示与WIL-2S细胞的结合，且分图B显示与CD28 CHO细胞的结合。
图13显示由用于图12的分子所产生的替代性结合测定的结果。在此情况下，首先使融合蛋白结合至表达CD20的WIL-2S细胞，且接着用CD28mIgG(5μg/ml)及FITC抗小鼠试剂以1:100来检测结合性。所述结果表明在同一分子中同时结合至CD20与CD28。
图14显示使用另一种多特异性融合构建体变异体所获得的结果。在此情况下，可改变BD2的特异性，以便使用G28-1抗体的V区形成CD37特异性结合结构域。所显示的两幅图说明CD20和/或CD37抗体阻断[2H7-sss-IgG-Hx-G28-1]多特异性融合蛋白与表达CD20及CD37靶标的Ramos或BJAB细胞结合的相对能力。在与多特异性融合蛋白一起孵育之前，将各细胞类型与CD20特异性抗体(25μg/ml)或CD37特异性抗体(10μg/ml)或两种试剂(所述试剂为小鼠抗人类试剂)一起预孵育。接着用FITC山羊抗人类IgG试剂(预吸附于小鼠以排除交叉反应性)以1:100检测多特异性融合蛋白的结合性。
图15显示用BJAB靶标细胞、PBMC效应细胞且以CD20-hIgG-CD37特异性融合蛋白作为测试试剂所进行的ADCC测定的结果。该程序的完整说明参见适当实施例。该图为融合蛋白浓度相对于在各种剂量下对单一特异性SMIP试剂和[2H7-sss-hIgG-STD1-G28-1]LH与HL变异体所测试的％特异性杀死率的曲线图。对于所述单一特异性或多特异性单链融合蛋白中之一者的剂量-反应效应，对各数据系列作图。
图16显示列举共培养实验结果的表格，其中在TRU 015、G28-1SMIP、两种分子一起或[2H7-sss-IgG-H7-G28-1HL]变异体存在下培养PBMC。使用20μg/ml的融合蛋白，且孵育24小时或72小时。接着将样本用结合FITC的CD3抗体及结合PE的CD19或CD40特异性抗体染色，接着经受流式细胞术。接着将各闸中细胞的百分率列入表中。
图17显示在与[2H7-sss-hIgG-H7-G28-1 HL]分子或对照物单一CD20和/或CD37特异性SMIP单独或组合一起孵育24小时后对B细胞系细胞凋亡的影响的两幅柱状图。将膜联蛋白V(annexin V)-碘化丙啶阳性细胞的百分率作为用于共孵育实验的测试试剂类型的函数来作图。分图A显示使用Ramos细胞所获得的结果，且分图B显示使用Daudi细胞所获得的结果。针对各单一CD20或CD37的SMIP是以指定浓度显示；此外，若使用两种试剂的组合，则以括号显示各种试剂的相对量。对于多特异性CD20-CD37融合蛋白以5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml的浓度进行测试。
图18显示[2H7-hIgG-G19-4]分子变异体和其与CD3表达细胞(Jurkats)或CD20表达细胞(WIL-2S)结合的两幅图。所述分子包括[2H7-sss-hIgG-STD1-G19-4 HL]、LH和[2H7-csc-hIgG-STD1-G19-4HL]。经蛋白A纯化的融合蛋白通过20μg/ml滴定至0.05μg/ml，且使用FITC山羊抗人类IgG以1:100来检测结合性。将MFI(平均萤光强度)作为蛋白浓度的函数来作图。
图19显示用具有SSS铰链或CSC铰链的[2H7-hIgG-STD1-G19-4HL]分子变异体、BJAB靶标细胞及作为效应细胞的全部人类PBMC或作为效应细胞的NK细胞耗尽型PBMC所进行的ADCC测定的结果。将杀死率作为多特异性融合蛋白浓度的函数来计分。将以所述分子所观测的杀死率与使用G19-4、TRU 015或该两种试剂的组合所见的杀死率相比较。相对于不同测试试剂对各数据系列作图，其中将％特异性杀死率作为蛋白浓度的函数来作图。
图20显示在抗-CD20抗体存在或不存在下(若添加，则以2μg/ml存在)与B-细胞抗体(2μg/ml)的基质组合中的各成员一起孵育隔夜后，经膜联蛋白V(Ann)和/或碘化丙啶(PI)阳性染色的Ramos B-细胞的百分率。山羊-抗小鼠二级抗体总是以相对于其他抗体(单独基质抗体，或基质抗体与抗-CD20抗体)而言两倍的浓度比存在。竖直条纹柱—X轴上表示的基质抗体(2μg/ml)与山羊抗小鼠抗体(4μg/ml)。水平条纹柱—X轴上表示的基质抗体(2μg/ml)、抗-CD20抗体(2μg/ml)及山羊抗小鼠抗体(4μg/ml)。“第2步”条件充当对照且包括添加4μg/ml的山羊抗小鼠抗体(竖直条纹柱)或8μg/ml(水平条纹柱)，而不添加基质抗体或抗-CD20抗体。图中的“CL II”(II类MHC)是指与HLA DR、DQ及DP(亦即，与II类MHC抗原)具有交叉反应性的单克隆抗体。
图21显示在抗-CD79b抗体存在或不存在下(若添加，则以0.5或1.0μg/ml存在)与B-细胞抗体(2μg/ml)的基质组合中的各成员一起孵育隔夜后，经膜联蛋白V(Ann)和/或碘化丙啶(PI)阳性染色的Ramos B-细胞的百分率。“CL II”及“第2步”样本的鉴别参见图20的说明。竖直条纹柱—基质抗体(2μg/ml)及山羊抗小鼠抗体(4μg/ml)；水平条纹柱—基质抗体(2μg/ml)、抗-CD79b抗体(1.0μg/ml)及山羊抗小鼠抗体(6μg/ml)；点画柱—基质抗体(2μg/ml)、抗-CD79b抗体(0.5μg/ml)及山羊抗小鼠抗体(5μg/ml)。
图22显示在抗-CL II抗体存在或不存在下(若添加，则以0.25或0.5μg/ml存在)与B-细胞抗体(2μg/ml)的基质组合中的各成员一起孵育隔夜后，经膜联蛋白V(Ann)和/或碘化丙啶(PI)阳性染色的Ramos B-细胞的百分率。“CL II”及“第2步”样本的鉴别参见图20的说明。竖直条纹柱—基质抗体(2μg/ml)及山羊抗小鼠抗体(4μg/ml)；水平条纹柱—基质抗体(2μg/ml)、抗-CL II抗体(0.5μg/ml)及山羊抗小鼠抗体(5μg/ml)；点画柱—基质抗体(2μg/ml)、抗-CL II抗体(0.25μg/ml)及山羊抗小鼠抗体(4.5μg/ml)。
图23显示在抗-CD22抗体存在或不存在下(若添加，则以2μg/ml存在)与B-细胞抗体(2μg/ml)的基质组合中的各成员一起孵育隔夜后，经膜联蛋白V(Ann)和/或碘化丙啶(PI)阳性染色的DHL-4B-细胞的百分率。“CL II”及“第2步”样本的鉴别参见图20的说明。实心柱—基质抗体(2μg/ml)及山羊抗小鼠抗体(4μg/ml)；斜条纹柱—基质抗体(2μg/ml)、抗-CD22抗体(2μg/ml)及山羊抗小鼠抗体(8μg/ml)。
图24提供的图表说明游离CD20 SMIP(实心)或单特异性CD20×CD20蝎形分子(空心)对淋巴瘤细胞系Su-DHL6(三角形)及DoHH2(方形)的直接生长抑制作用。
图25的图表显示游离抗-CD37 SMIP(实心)或单特异性抗-CD37蝎形分子(空心)对淋巴瘤细胞系Su-DHL-6(三角形)及DoHH2(方形)的直接生长抑制作用。
图26提供的图表显示两种不同的单特异性SMIP(实心)的组合或双特异性CD20-CD37蝎形分子(空心)对淋巴瘤细胞系Su-DHL-6(三角形)及DoHH2(方形)的直接生长抑制作用。
图27的图表揭示游离CD20 SMIP与CD37 SMIP的组合(实心)或双特异性CD20xCD37蝎形分子(空心)对淋巴瘤细胞系Su-DHL-6(三角形)及WSU-NHL(方形)的直接生长抑制作用。
图28提供的直方图显示蝎形分子的细胞周期效应。DoHH2淋巴瘤细胞的样本分为：未经处理、经SMIP 016处理或经单特异性CD37×CD37蝎形分子处理。空白柱：细胞周期的亚-G1期；黑色柱：G0/G1期；阴影柱：S期；及条纹柱：G2/M期。
图29提供的数据图表证明以蝎形分子处理淋巴瘤细胞使得信号传导能力与游离SMIP相比增强(如通过钙离子流所测量)。
图30提供的图表说明蝎形分子依赖性细胞细胞毒性。
图31显示的数据图表说明蝎形分子介导补体依赖性细胞毒性。
图32以图表形式提供的数据显示SMIP和蝎形分子与FcγRIII(CD16)的低亲和性同种型(B)及高亲和性同种型(A)的比较性ELISA结合。
图33提供的图表证明在靶标细胞存在下，SMIP和蝎形分子与FcγRIII(CD16)的低亲和性等位基因型(A)及高亲和性等位基因型(B)的结合。
图34的直方图显示在两个实验(烧瓶1及烧瓶2)中，在六种不同培养条件下，CD20×CD20蝎形分子的表达程度。实心黑色柱：烧瓶1；条纹柱：烧瓶2。
图35提供的直方图显示CD20×CD37蝎形分子的产量。
图36提供SMIP和蝎形分子的SDS-PAGE凝胶影像(在还原及非还原条件下)。
图37提供的图表显示蝎形分子保持结合至靶标细胞的能力。填充方形：CD20SMIP；填充三角形：CD37 SMIP；填充圆：人源化CD20(2Lm20-4)SMIP；空白菱形：CD37×CD37单特异性蝎形分子；空心方形：CD20×CD37双特异性蝎形分子；及空心三角形：人源化CD20(2Lm20-4)×人源化CD20(2Lm20-4)蝎形分子。
图38所含的图表显示竞争性结合测定的结果证明N-末端与C-末端蝎形分子结合结构域参与靶标细胞结合。
图39以图表形式提供的数据显示蝎形分子具有比SMIP更低的解离速率。
图40显示的图表证明蝎形分子在体内、在血清中具有稳定性，特征为蝎形分子可再生、循环半衰期持久。
图41提供CD20xCD37双特异性蝎形分子的剂量-反应图表，其说明蝎形分子给药的体内功效。
图42显示单特异性CD20xCD20蝎形分子(S0129)和糖变异体与靶标B-细胞的结合。
图43提供的图表说明CD20xCD20蝎形分子(亲本抗体及糖变异体)诱导ADCC介导的杀死BJAB B-细胞。
图44显示的凝胶影像揭示因改变蝎形连接子(包括改变此连接子的序列及通过将H7序列添加至连接子来延长连接子)所导致的对蝎形分子稳定性的影响，此由凝胶下方H7线中的“+”来指示。
图45显示CD20xCD20蝎形分子(S0129)和其蝎形连接子变异体与WIL2S细胞的结合。
图46显示CD20xCD20蝎形分子和CD20 SMIP对多种B-细胞的直接细胞杀死作用。
图47揭示单特异性CD20xCD20蝎形分子对其他B-细胞系的直接细胞杀死作用。
图48显示两种单特异性蝎形分子(亦即CD20×CD20及CD37×CD37)和双特异性CD20xCD37蝎形分子中每一者的直接细胞杀死能力，后者显示不同形式的杀死率曲线。
图49以图表形式描绘Su-DHL-6B-细胞对CD20xCD20(S0129)、CD37xCD37及CD20xCD37蝎形分子中每一者的反应。
图50显示双特异性CD19xCD37蝎形分子和直接杀死Su-DHL-6 B-细胞的能力。
图51提供的直方图显示多种结合CD20的蝎形分子和SMIP以及直接杀死DHL-4 B-细胞(如图中所示)。蓝色柱：活细胞；每一对右侧的粟色柱：膜联蛋白+/PI+。
图52提供的图表描述各种结合CD20的蝎形分子和SMIP以及的直接细胞杀死作用(如图中所示)。
图53提供由各种结合CD20的蝎形分子和SMIP(如图中所示)以及所诱导的ADCC活性的图表。
图54提供由各种结合CD20的蝎形分子和SMIP(如图中所示)以及所诱导的CDC活性的图表。
图55提供的直方图显示C1q与结合至Ramos B-细胞的CD20结合性蝎形分子结合的程度。
图56提供的FACS分析的散布图显示，CD20结合性蝎形分子(2Lm20-4x2Lm20-4和011x2Lm20-4)和导致线粒体膜电位相对于对照物下降(上图)；具有断裂性线粒体膜电位的细胞的百分率的直方图(断裂性MMP：黑色柱)显示于下图中。
图57提供的直方图显示CD20结合性蝎形分子(2Lm20-4x2Lm20-4及011x2Lm20-4)、利妥昔单抗(Rituximab)、CD95及对照物对半胱天冬酶3(caspase 3)活化的相对不足。
图58提供以蛋白质印迹法对获自B-细胞的聚(ADP-核糖)聚合酶及半胱天冬酶3、7及9进行四次分析的组合，显示任何所述蛋白因CD20结合性蝎形分子结合至细胞而小量降解。
图59为B-细胞染色体DNA的凝胶电泳图，其显示因CD20结合性蝎形分子结合至细胞所致的破碎程度。
图60为用抗磷酸化酪氨酸抗体和抗-SYK抗体中每一者所获得的免疫沉淀物的凝胶电泳图。免疫沉淀物是获自B-细胞与CD20结合性蝎形分子接触的溶胞物，如图中所示。
图61提供CD20结合性蝎形分子与羟道诺红霉素(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)及雷帕霉素(rapamycin)中每一者的组合疗法的组合指数曲线图。
发明详述
本发明提供相对小肽的组合物，所述相对小肽具有至少两个结合区或结合结构域，所述结合区或结合结构域可提供一或多种结合特异性、源自免疫球蛋白(诸如抗体)的可变结合结构域、相对于包含至少部分免疫球蛋白恒定区(亦即如本文中所定义的恒定亚区的来源)的效应结构域在末端安置；以及重组制备所述肽中所涉及的核酸、载体及宿主细胞；及在多种诊断性及治疗性应用中使用所述肽组合物的方法，所述应用包括治疗病症以及改善该病症的至少一种症状。所述肽组合物有利地将第二结合结构域C-末端排列至效应结构域，此排列出乎意料地提供该肽中至少两个结合结构域在无空间位阻或较弱位阻下的结合，同时保持安置于中心的效应结构域的效应功能。
本发明的多价肽的第一结合结构域与第二结合结构域可相同(亦即，具有一致性或大体上一致性的氨基酸序列且具有单特异性)或不同(且具有多特异性)。尽管第一结合结构域及第二结合结构域在初级结构方面不同，但其可识别且结合靶标分子的相同表位且因此将具有单特异性。然而，在多种情况下，所述结合结构域将具有不同结构且将结合至不同结合位点，产生多价多特异性蛋白。此不同结合位点可存在于单一靶标分子上或不同靶标分子上。在两个结合分子识别不同靶标分子的情况下，该靶标分子可存在于(例如)相同结构上或相同结构中(例如相同细胞的表面)，或该靶标分子可存在于独立结构或位置上或存在于独立结构或位置中。例如，本发明的多特异性结合蛋白可具有特异性地结合至不同细胞类型表面上的靶标分子的结合结构域。或者，一个结合结构域可特异性地结合至细胞表面上的靶标，且另一结合结构域可特异性地结合至发现与细胞无关的靶标，诸如细胞外结构性(基质)蛋白或游离(例如可溶性或基质)蛋白。
第一结合结构域及第二结合结构域是源自相同或不同免疫球蛋白的蛋白结构(诸如抗体分子)的一或多个区。第一结合结构域和/或第二结合结构域可显示与免疫球蛋白区域的序列一致的序列，或可为该序列的修饰形式以提供(例如)经改变的结合特性或经改变的稳定性。所述修饰于本领域中已知且包括直接导致特性改变(诸如结合性改变)的氨基酸序列改变，例如导致肽的二级结构改变或更高级结构改变的氨基酸序列改变。亦涵盖由并入非天然氨基酸(诸如非天然的常规氨基酸、非常规氨基酸及亚氨基酸)所获得的经修饰氨基酸序列。在某些实施方案中，改变序列导致翻译后加工改变，例如导致糖基化模式改变。
涵盖用于蝎形分子的源自免疫球蛋白或免疫球蛋白样多肽(例如受体)的多种结合结构域中的任意者。源自抗体的结合结构域包含VL结构域及VH结构域的CDR区(参见例如使用源自人源化抗体的结合结构域的上下文)。包含源自抗体的完整VL及VH结构域的结合结构域可以任一取向来组织。本发明的蝎形分子可具有本文中所述的任何结合结构域。对于具有至少一个识别B-细胞的结合结构域的蝎形分子而言，例示性蝎形分子具有至少一个源自以下各者的结合结构域：CD3、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD38、CD39、CD40、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD78、CD79a/b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD89、CD98、CD126、CD127、CDw130、CD138或CDw150。在某些实施方案中，蝎形分子为包含至少一个结合结构域的多价结合蛋白，该结合结构域具有选自由以下各者组成的组的序列：SEQ ID NO:2、4、6、103、105、107及109。在某些实施方案中，蝎形分子包含含有选自由任何以下各者组成的组的序列的结合结构域：SEQ ID NO:332-345。在某些实施方案中，蝎形分子包含含有源自免疫球蛋白VL及VH结构域的序列的结合结构域，其中该序列是选自由SEQ ID NO:355-365中任何者组成的组。本发明进一步涵盖包含结合结构域的蝎形分子，该结合结构域具有可由SEQ ID NO:355-365中的任何者推断的序列、具有VL与VH的反向取向。
对于其中结合结构域中的任一者或两者源自免疫球蛋白的一个以上区(例如IgVL区及Ig VH区)的实施方案而言，多个区可通过连接子肽连接。此外，可使用连接子将第一结合结构域与恒定亚区相连接。恒定亚区与第二结合结构域的连接(亦即结合结构域2朝向蝎形分子的C-末端安置)可通过蝎形连接子来达成。所述蝎形连接子优选具有约2至45个氨基酸或2至38个氨基酸或5至45个氨基酸。例如，H1连接子长度为2个氨基酸且STD2连接子长度为38个氨基酸。除一般考虑长度外，适用于本发明的蝎形分子中的蝎形连接子区包括选自由IgG、IgA、IgD及IgE铰链及其变异体组成的组的抗体铰链区。例如，蝎形连接子可为选自由人类IgG1、人类IgG2、人类IgG3及人类IgG4及其变异体组成的组的抗体铰链区。在某些实施方案中，蝎形连接子区具有用于形成链间二硫键的单一半胱氨酸残基。在其他实施方案中，蝎形连接子具有两个用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，蝎形连接子区是源自免疫球蛋白铰链区或C-凝集素茎区且包含选自由以下各者组成的组的序列：SEQ ID NO:111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、287、289、297、305、307、309、310、311、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、346、351、352、353、354、373、374、375、376及377。更一般而言，提供源自铰链区的序列时，涵盖序列表中所标识的任何氨基酸序列用作本发明的蝎形分子中的蝎形连接子。此外，源自Ig铰链的蝎形连接子为铰链样肽结构域，该肽结构域具有至少一个能够参与链间二硫键的游离半胱氨酸。优选地，源自Ig铰链肽的蝎形连接子保留有半胱氨酸，所述半胱氨酸对应于朝向该铰链的N-末端安置的铰链半胱氨酸。优选地，源自IgG1铰链的蝎形连接子具有一个或具有两个对应于铰链半胱氨酸的半胱氨酸。此外，蝎形连接子为II型C-凝集素分子的茎区。在某些实施方案中，蝎形分子包含具有选自由SEQ ID NO:373-377组成的组的序列的蝎形连接子。
安置于中心的恒定亚区是源自免疫球蛋白的恒定区。恒定亚区通常是源自发明摘要中的免疫球蛋白的CH区的CH2部分，尽管其亦可源自CH2-CH3部分。恒定亚区任选地可源自免疫球蛋白的铰链-CH2或铰链-CH2-CH3部分，将对应于Ig铰链区的肽置于恒定亚区的N-末端且安置于恒定亚区与结合结构域1之间。此外，恒定亚区的部分可源自不同免疫球蛋白的CH区。此外，可将对应于Ig CH3的肽截短，剩下选自由SEQ ID NOS:366-371组成的组的C-末端氨基酸序列。然而优选地，在其中蝎铰链为源自免疫球蛋白铰链的铰链样肽的实施方案中，蝎形连接子及恒定亚区是源自相同类型的免疫球蛋白。恒定亚区提供至少一种与免疫球蛋白的CH区相关的活性，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、蛋白A结合性、与至少一种FC受体的结合性、可再生性检测的稳定性(相对于除不存在恒定亚区以外的本发明的蛋白而言)，及或许胎盘转移性，正如本领域技术人员所知，其中本发明的分子的继代转移为有利的。如同上述结合结构域，恒定亚区是源自至少一种免疫球蛋白分子且与至少一种免疫球蛋白的一或多个区域显示一致或大体上一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，经由至少一种免疫球蛋白的该或所述序列对恒定亚区进行修饰(通过取代一或多个常规或非常规的非天然(例如合成)氨基酸或亚氨基酸)，从而产生可使二级结构或更高级结构改变、特性亦随其改变的初级结构，或可导致翻译后加工改变，诸如糖基化。
若所述结合结构域和恒定亚区与一或多种免疫球蛋白多肽显示一致或大体上一致的氨基酸序列，则对本发明的分子的翻译后修饰可产生经修饰(相对于作为修饰基础的免疫球蛋白)的分子。例如，可利用本领域中已知的技术，以使得多肽糖基化模式相对于未经修饰(例如CHO)宿主细胞中的此多肽发生改变的方式修饰宿主细胞，例如CHO细胞。
在具备所述分子和体内重组制备其的方法的情况下，已开发出新颖靶向诊断及治疗的途径，例如以容许免疫***的效应细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞、天然杀伤细胞及其类似者)靶向募集至欲破坏或隔断的细胞、组织、药剂及外来物，诸如癌细胞及感染物。除使治疗性细胞定位于治疗部位外，所述肽适用于定位治疗性化合物，诸如经放射性标记的蛋白。此外，所述肽亦适用于清除有害组合物，例如通过使有害组合物(诸如毒素)与能够破坏或排除该毒素的细胞(例如巨噬细胞)结合。本发明的分子适用于调节结合伙伴分子(诸如细胞表面受体)的活性。此显示于图17中，其中本发明的分子使经由CD20和/或CD37的细胞凋亡信号传导明显增强。此信号传导的结果为靶标细胞死亡。其中排除限定细胞群为有益的疾病及状态包括感染性及寄生性疾病、炎性及自体免疫状态、恶性肿瘤及其类似疾病。本领域技术人员应了解细胞凋亡信号传导的增强方法不受限制。有丝***信号传导及导致限定细胞群的分化、活化或灭活的信号传导可通过本发明的分子经由适当选择结合伙伴分子来诱导。通过考虑本文中所用术语的以下表述定义将有利于对本发明揭示内容的进一步理解。
“单链结合蛋白”为共价连接的氨基酸的单一邻接排列，该链能够特异性地结合至一或多个结合伙伴，所述伙伴共用足以与单链结合蛋白可检测性地结合的结合位点的决定子。例示性结合伙伴包括蛋白、碳水化合物、脂质及小分子。
为便于说明，本发明的蛋白、多肽及肽的“衍生物”及“变异体”是就与本发明的蛋白和/或多肽和/或肽的差异来描述，此意谓所述衍生物及变异体(其是本发明的蛋白/多肽/肽)以特定方式不同于本发明的未衍生或非变异蛋白、多肽或肽。本领域技术人员应了解所述衍生物及变异体本身为本发明的蛋白、多肽及肽。
“抗体”被赋予与其在本领域中的含义一致的最广泛定义，且包括能够结合至少一个结合伙伴(诸如蛋白性或非蛋白性抗原)的蛋白、多肽及肽。如本文中所使用的“抗体”包括任何物种的蛋白的免疫球蛋白超家族的成员、单链或多链组成的蛋白的免疫球蛋白超家族的成员，及所述分子的变异体、类似物、衍生物及片段。特定而言，“抗体”包括本领域中已知的抗体的任何形式，包括(但不限于)单克隆及多克隆抗体、嵌合型抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、单链可变片段、双特异性抗体、双功能抗体、抗体融合体及其类似抗体。
“结合结构域”为特异性地结合一或多个特异性结合伙伴的肽区域，诸如源自免疫球蛋白(例如抗体)的多肽片段。若存在多个结合伙伴，则此伙伴共用足以可检测性地结合该结合结构域的结合决定子。该结合结构域优选为邻接氨基酸序列。
“表位”在本文中所给定的一般含义为在与抗体特异性相互作用(例如通过结合)的物质(例如蛋白)上具有单一抗原位点，亦即抗原决定子。在免疫球蛋白(例如抗体)技术中已获得确定含义的其他术语，诸如“轻链可变区”、“重链可变区”、“轻链恒定区”、“重链恒定区”、“抗体铰链区”、“互补决定区”、“框架区”、“抗体同型”、“FC区”、“单链可变片段”或“scFv”、“双功能抗体”、“嵌合体”、“CDR移植抗体”、“人源化抗体”、“成形抗体”、“抗体融合体”及其类似术语，各自具有本领域中已知的确定含义，除非本文中另外特别说明。
除非本文中明确定义，否则本领域技术人员参考抗体技术所了解的术语具有本领域中所获得的含义。所述术语的实例为“VL”及“VH”，是指分别源自抗体轻链及重链的可变结合区；以及CL和CH，是指“免疫球蛋白恒定区”，亦即分别源自抗体轻链或重链的恒定区，其中应了解后者恒定区可进一步分为CH1、CH2、CH3及CH4恒定区结构域，此视该区所来源的抗体同型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)而定。CDR意谓“互补决定区”。“铰链区”是源自插于抗体单链的CH1区与CH2区之间且连接该两个区的氨基酸序列，在本领域中已知“铰链区”以“铰链”形式向全抗体提供柔性。
“恒定亚区”为本文中定义的术语，其是指对应于或源自抗体的一或多个恒定区结构域的肽、多肽或蛋白序列。因此，恒定亚区可包括以下任何结构域或所有结构域：CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域(IgA、IgD、IgG、IgE及IgM)及CH4结构域(IgE、IgM)。因此，如本文中所定义的恒定亚区可是指对应于抗体的完整恒定区或其部分的多肽区。通常，本发明的多肽的恒定亚区或编码核酸具有铰链、CH2结构域及CH3结构域。
“效应功能”为与抗体恒定区相关的功能或由抗体恒定区所提供的功能。例示性效应功能包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体活化及补体依赖性细胞毒性(CDC)、FC受体结合性及血浆半衰期增加以及胎盘转移。本发明组合物的效应功能具有可检测性；具有此功能的本发明组合物的特异性活性就此效应功能而言优选与野生型抗体的特异性活性大致相同，亦即相对于野生型抗体而言，多价结合分子的恒定亚区优选不损失任何效应功能。
“连接子”为肽或聚核苷酸，其联接或连接其他肽或聚核苷酸。通常，肽连接子为具有约2至50个氨基酸的寡肽，其中典型聚核苷酸连接子编码该肽连接子且因此长度为约6至150个核苷酸。连接子使第一结合结构域与恒定亚区结构域相连接。例示性肽连接子为(Gly4Ser)3。蝎形连接子是用于将恒定亚区的C-末端与第二结合结构域相连接。蝎形连接子可源自免疫球蛋白铰链区或源自II型C-凝集素的茎区，如下文中更详细描述。
“靶标”被赋予一种以上含义，使用环境定义各种情况下的明确含义。就其最狭窄意义而言，“靶标”为结合位点，亦即本发明的肽组合物的结合伙伴的结合结构域。就更广泛含义而言，“靶标”或“分子靶标”是指必定呈现结合位点的完整结合伙伴(例如蛋白)。特异性靶标(诸如“CD20”、“CD37”及其类似靶标)各自被赋予该术语在本领域中已获得的一般含义。“靶标细胞”为与本发明的靶标分子相关的任何原核细胞或真核细胞(无论健康或患病与否)。当然，亦发现与任何细胞均不相关的靶标分子(亦即无细胞靶标)，或与其他组成相关的靶标分子，诸如病毒(包括噬菌体)、有机或无机靶标分子载体及外来物。
与靶标分子相关的物质的实例包括自体性细胞(例如癌细胞或其他病态细胞)、感染物(例如感染性细胞及感染性病毒)及其类似物。靶标分子可与去核细胞、细胞膜、脂质体、海绵体、凝胶、胶囊、锭剂及其类似物结合，无论何种预定用途(例如作为善意或无意识措施的结果而用于药物治疗，或进一步为生物恐怖威胁)，其均可用于递送、输送或定位靶标分子。“无细胞”、“无病毒”、“无载体”、“无物体”及其类似者是指未与特定组合物或物质结合的靶标分子。
“结合亲和性”是指本发明的肽组合物与其结合伙伴的非共价结合的强度。结合亲和性优选是指对于结合对成员之间吸引力的定量量测。
“佐剂”为增强或促进与其结合(诸如以包含活性剂及佐剂的药学上的组合物形式结合)的化合物的功能效应的物质。“赋形剂”为在药学上的组合物配制中用作稀释剂的惰性物质。“载体”通常为惰性物质，其是用于提供用以递送药学上的组合物的媒介物。
“宿主细胞”是指其中存在本发明的聚核苷酸、蛋白或肽的任何原核细胞或真核细胞。
将核酸或聚核苷酸“引入”宿主细胞意谓通过本领域中已知的任何方式使核酸或聚核苷酸进入该细胞，所述方式包括(但不限于)裸核酸/聚核苷酸或载体携带的核酸/聚核苷酸的体外盐介导的沉淀及其他转化形式、病毒介导的感染及任选地具有或不具有“辅助”分子的转导、弹道抛射体递送、偶联及其类似方式。
“孵育”宿主细胞意谓将该细胞维持在本领域中已知的适于指定用途(诸如基因表达)的环境条件下。所述条件(包括温度、离子强度、氧张力、二氧化碳浓度、营养物组成及其类似条件)已于本领域中所熟知。
“分离”化合物(诸如本发明的蛋白或肽)意谓将该化合物从与其天然结合的存在于诸如表达欲经分离的化合物的宿主细胞中的至少一种不同化合物分离，例如将含有该化合物的消耗培养基从生长于该培养基中的宿主细胞分离。
“有此需要的有机体”为具有罹患易经受治疗或易用本发明的组合物改善的任何疾病、病症或状态的风险或罹患任何该疾病、病症或状态的任何有机体，所述疾病、病症或状态包括(但不限于)各种癌症形式的任意者、多种自体免疫疾病的任意者、因放射性标记蛋白、肽及类似化合物所致的辐射中毒、摄入性或内部产生性毒素及其类似形式，此在回顾整个揭示内容后将变得显而易见。有此需要的有机体优选为人类患者。
如本领域中所知，疾病症状的“改善”意谓疾病的该症状的严重程度可检测性地降低。例示性症状包括疼痛、发热、肿胀及关节僵硬。
除非上下文中明确说明，否则术语“蛋白”、“肽”及“多肽”在本文中可互换使用，其各自是指氨基酸的至少一个邻接链。类似地，除非上下文中明确说明特定且不可互换的含义，否则术语“聚核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”可互换使用。
“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，其是衍生自所述化合物与有机酸或无机酸的组合(酸加成盐)或所述化合物与有机碱或无机碱的组合(碱加成盐)。
下文利用如上文所定义的术语对本发明的各种方面提供一般性说明。在一般性说明之后，描述工作实施例以为本文中所揭示的本发明的可操作性及适用性提供补充证明。
蛋白和多肽
在本发明的某些实施方案中，提供本文中所述的具有效应功能的多价结合蛋白(包括结合结构域-免疫球蛋白融合蛋白)中的任意者，其中具有效应功能的多价结合蛋白或肽包含两个或两个以上结合结构域多肽序列。结合结构域多肽序列中的每一者均能够结合或特异性地结合一个或多个靶标，诸如一个或多个抗原，其中一个或多个靶标或抗原可相同或可不相同。结合结构域多肽序列可源自抗原可变区，或其可源自免疫球蛋白样分子，例如以模仿免疫球蛋白分子的方式折叠的受体。结合结构域所来源的抗体可为多克隆抗体(包括单特异性多克隆抗体)、单克隆抗体(mAb)、重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体(诸如CDR-移植抗体)、人类抗体、单链抗体、催化抗体及本领域中已知的抗体的任何其他形式，以及其片段、变异体或衍生物。在某些实施方案中，本发明的蛋白的结合结构域中的每一者均是源自免疫球蛋白的完整可变区。在优选实施方案中，结合结构域各自是基于人类Ig可变区。在其他实施方案中，蛋白是源自Ig可变区的片段。在所述实施方案中，优选地，各结合结构域多肽序列对应于指定Ig可变区的互补决定区中每一者的序列。本发明亦涵盖对应于比指定Ig可变区的全部CDR更少的CDR的结合结构域，其限制条件为所述结合结构域保持特异性地结合至少一种靶标的能力。
具有效应功能的多价结合蛋白亦具有源自免疫球蛋白恒定区(优选抗体重链恒定区)、共价并置于具有效应功能的多价结合蛋白中的两个结合结构域之间的恒定亚区序列。
具有效应功能的多价结合蛋白亦具有使恒定亚区的C-末端与结合结构域2的N-末端连接的蝎形连接子。蝎形连接子不为螺旋肽且可源自抗体铰链区、源自连接免疫球蛋白结合结构域的区域或源自II型C-凝集素的茎区。蝎形连接子可源自免疫球蛋白的野生型铰链区，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD或IgE铰链区。在其他实施方案中，本发明提供具有经改变的铰链的多价结合蛋白。适于包含于多价结合蛋白中的经改变铰链区的一种类别为涉及于具有野生型铰链的免疫球蛋白对应物分子中的链间二硫键形成的半胱氨酸残基(尤其本领域中已知的那些Cys残基)的数量改变的铰链类别。因此，蛋白可具有IgG1铰链，其中缺失三个能够参与链间二硫键形成的Cys残基中的一者。为指示经改变铰链的半胱氨酸亚结构，自N-末端至C-末端显示Cys亚序列。利用此识别***，具有经改变IgG铰链的多价结合蛋白包括表征为cxc、xxc、ccx、xxc、xcx、cxx及xxx的铰链结构。Cys残基可缺失，或可经氨基酸取代，从而形成保守性取代或非保守性取代。在某些实施方案中，半胱氨酸经丝氨酸置换。对于具有包含IgG1铰链的蝎形连接子的蛋白而言，对应于铰链半胱氨酸的半胱氨酸的数目减少为1或2，优选地，对应于铰链半胱氨酸的那些半胱氨酸中的一者最靠近该铰链的N-末端安置。
对于具有包含IgG2铰链的蝎形连接子的蛋白而言，可存在0、1、2、3或4个Cys残基。对于包含含有1、2或3个Cys残基的经改变IgG2铰链的蝎形连接子而言，涵盖Cys残基的所有可能子集。因此，对于具有一个Cys的所述连接子而言，多价结合蛋白可在铰链区中具有以下Cys基序：cxxx、xcxx、xxcx或xxxc。对于包含具有2或3个Cys残基的IgG2铰链变异体的蝎形连接子而言，涵盖经保留的Cys残基与经取代(或缺失)的Cys残基的所有可能组合。对于具有包含经改变IgG3或经改变IgG4铰链区的蝎形连接子的多价结合蛋白而言，涵盖铰链区中的Cys残基由1减少至小于Cys残基的完整数目，无论该减少是经由缺失或经由保守性氨基酸或非保守性氨基酸(例如丝氨酸)取代。同样涵盖具有包含野生型IgA、IgD或IgE铰链的蝎形连接子的多价结合蛋白，亦涵盖具有数目减少的Cys残基(其数目自0延续至小于对应野生型铰链中所存在的Cys残基的总数的数目)的对应经改变铰链区。在具有IgG1铰链的某些实施方案中，保留该铰链的第一或N-末端Cys残基。对于具有野生型铰链区或经改变铰链区的蛋白而言，预期所述多价结合蛋白为能够例如通过二硫键形成而形成同型多聚体(诸如二聚体)的单链分子。此外，如本文中所揭示，具有改变铰链的蛋白的铰链区末端可经修改，例如在指定区或结构域(诸如铰链结构域)的N-末端、C-末端或两末端缺失或取代一或多个氨基酸残基。
在另一例示性实施方案中，恒定亚区是源自包含天然IgD铰链区或工程化IgD铰链区的恒定区。野生型人类IgD铰链具有一个可与天然IgD结构中的轻链形成二硫键的半胱氨酸。在某些实施方案中，此IgD铰链半胱氨酸经突变(例如缺失)以产生用作例如双特异性分子的结合结构域之间的连接区的经改变铰链。IgD铰链中不产生不良铰链刚性的其他氨基酸变化或缺失或修改是属于本发明的范畴。其他物种的天然或工程化IgD铰链区亦属于本发明的范畴，来自非人类物种的人源化天然或工程化IgD铰链以及来自其他人类或非人类抗体同型的(其他非IgD)铰链区(诸如美洲驼IgG2铰链)亦属于本发明的范畴。
本发明进一步包括与可源自对应于如上所述的已知铰链区(诸如IgG1铰链或IgD铰链)的铰链的蝎形连接子相连接的恒定亚区。该恒定亚区可含有(相对于野生型)经修饰或经修改的铰链区，其中已知参与链间二硫键连接的至少一个半胱氨酸残基以保守性取代(例如Ser取代Cys)或非保守性取代方式置换为另一种氨基酸。该恒定亚区不包括对应于免疫球蛋白CH1结构域的肽区或肽结构域。
可用作连接区的替代铰链及连接子序列是源自连接免疫球蛋白V-样结构域或免疫球蛋白C-样结构域的细胞表面受体的部分。亦涵盖Ig V-样结构域之间的区(其中细胞表面受体含有多个串联式Ig V-样结构域)及Ig C-样结构域之间的区(其中细胞表面受体含有多个串联式Ig C-样区)作为连接区。铰链及连接子序列通常长为5至60个氨基酸，且不仅主要为具柔性，而且亦可提供更多刚性特征。此外，连接子通常提供便于结合结构域之间的空间位阻最小化的空间。优选地，所述铰链及连接子肽的结构主要为α螺旋，β片状结构最少。优选序列在血浆及血清中具有稳定性且耐受蛋白水解切割。优选序列可含有天然存在的基序或经添加的基序，诸如赋予二硫键以稳定二聚体形成的CPPC基序。优选序列可含有一或多个糖基化位点。优选铰链及连接子序列的实例包括(但不限于)CD2、CD4、CD22、CD33、CD48、CD58、CD66、CD80、CD86、CD150、CD166及CD244的Ig V-样区与Ig C-样区之间的结构域间区。
恒定亚区可源自骆驼科动物恒定区，诸如美洲驼或骆驼IgG2或IgG3。
特定而言，涵盖具有源自任何Ig类别或源自任何IgG亚类，诸如IgG1(例如人类IgG1)的CH2-CH3区的恒定亚区。在优选实施方案中，恒定亚区与源自免疫球蛋白铰链的蝎形连接子均源自相同Ig类别。在其他优选实施方案中，恒定亚区与源自免疫球蛋白铰链的蝎形连接子均源自相同Ig亚类。恒定亚区亦可为源自任何Ig类别或亚类(诸如IgG1，例如人类IgG1)的CH3结构域，其限制条件为其与至少一种免疫球蛋白效应功能相关。
恒定亚区不对应于IgG类的完整免疫球蛋白恒定区(亦即CH1-铰链-CH2-CH3)。恒定亚区可对应于其他类别的完整免疫球蛋白恒定区，亦涵盖具有突变尾段或缺失尾段的IgA恒定结构域(诸如IgA1铰链、IgA2铰链、IgA CH2及IgA CH3结构域)作为恒定亚区。此外，任何轻链恒定结构域均可用作恒定亚区，例如CK或任何CL。恒定亚区亦可包括有或无铰链的JH或JK。恒定亚区亦可对应于工程化抗体，其中如本领域中所了解，例如一种环移植体已通过使用IgG框架进行选定的氨基酸取代来构建以产生一个对于天然FCR以外的受体(CD16、CD32、CD64、FCεR1)的结合位点。此类型的一个例示性恒定亚区为一个经修饰而具有CD89结合位点的IgG CH2-CH3区。
本发明的该方面提供一种具有效应功能的多价结合蛋白或肽，包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)一个安置于N-端的源自免疫球蛋白的结合结构域多肽序列，融合或连接于(b)一个源自免疫球蛋白恒定区的恒定亚区多肽序列，其优选包括一个铰链区序列，其中该铰链区多肽可如本文中所述，且可包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：例如一个替代铰链区多肽序列，该恒定亚区多肽序列又融合或连接于(c)一个安置于C-端的源自免疫球蛋白的第二天然或工程化结合结构域多肽序列。
该安置于中心的源自免疫球蛋白恒定区的恒定亚区多肽序列能够具有至少一种选自由以下组成的组的免疫活性：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、CDC、补体固定、及FC受体结合，且所述结合结构域多肽各自能够结合或特异性地结合靶标，诸如抗原，其中靶标可相同或不同，且可有效地存在于相同生理环境(例如相同细胞的表面)中或不同环境(例如不同细胞表面，细胞表面及无细胞的位置，诸如于溶液中)中。
本发明的该方面亦包括与如本文中所揭示的特定序列的具有效应功能的多价蛋白具有至少80％且优选85％、90％、95％或99％一致性的显示效应功能的变异体蛋白或多肽。
聚核苷酸
本发明亦提供编码本发明的蛋白或肽的聚核苷酸(经分离或经纯化的聚核苷酸或纯聚核苷酸)、包含所述聚核苷酸的载体(包括克隆载体和表达载体)，及经本发明的聚核苷酸或载体转化或转染的细胞(例如宿主细胞)。在编码本发明的蛋白或多肽方面，聚核苷酸编码第一结合结构域、第二结合结构域及FC结构域，所述结构域均源自免疫球蛋白，优选源自人类免疫球蛋白。各结合结构域可含有对应于全长可变区序列(重链和/或轻链)或对应于其部分序列的序列，其限制条件为各该结合结构域保留特异性结合的能力。FC结构域可具有对应于全长免疫球蛋白FC结构域序列或对应于其部分序列的序列，其限制条件为FC结构域显示至少一种如本文中所定义的效应功能。此外，所述结合结构域中的每一者均可经由通常长度为至少8个氨基酸且优选至少13个氨基酸的连接子肽而连接至FC结构域。优选连接子序列为基于Gly4Ser基序的序列，诸如(Gly4Ser)3。
本发明亦包括具有效应功能的多价结合蛋白的变异体。变异体聚核苷酸与具有如本文中所述的定义序列的聚核苷酸中的一者具有至少90％且优选95％、99％或99.9％的一致性，或其可与具有定义序列的那些聚核苷酸中的一者在65-68℃、0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或在42℃、0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠及50％甲酰胺的严格杂交条件下杂交。聚核苷酸变异体保留编码具有效应功能的多价结合蛋白的能力。
术语“严格”用于是指本领域中通常所理解为严格的条件。杂交严格性主要依据温度、离子强度及变性剂(诸如甲酰胺)的浓度来判定。用于杂交及洗涤的严格条件的实例为在65-68℃下、0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，或在42℃下、0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠及50％甲酰胺。参见Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,(Cold Spring Harbor,N.Y.1989)。
亦可使用更严格的条件(诸如更高温度、更低离子强度、更高甲酰胺或其他变性剂)；然而，杂交速率将受到影响。在其中涉及去氧寡核苷酸的杂交的情况下，其他例示性严格杂交条件包括在37℃(对于14碱基寡核苷酸而言)、48℃(对于17碱基寡核苷酸而言)、55℃(对于20碱基寡核苷酸而言)及60℃(对于23碱基寡核苷酸而言)下于6倍SSC、0.05％焦磷酸钠中洗涤。
在本发明的相关方面中，提供一种制备本发明的多肽或蛋白或其他构建体(例如，包括具有效应功能的多价结合蛋白或肽)的方法，该方法包含以下步骤：(a)将如本文中所述或所提供的宿主细胞在容许表达该构建体的条件下培养；及(b)将表达产物(例如具有效应功能的多价结合蛋白或肽)与宿主细胞或宿主细胞培养物分离。
构建体
本发明亦是关于各自包括本发明的聚核苷酸或核酸的载体及由已知载体所制备的构建体，特别是关于适用于基因疗法的重组表达构建体，包括各种已知构建体中的任意者，包括递送构建体，其包括编码如本文中所提供的具有效应功能的多价(例如多特异性，包括双特异性)结合蛋白及多肽的任何核酸；是关于在遗传上经本发明的载体和/或其他构建体工程化的宿主细胞；且是关于通过重组技术给予包含编码具有效应功能的多价(例如多特异性，包括双特异性)结合蛋白或其片段或变异体的核酸序列的表达构建体或其他构建体的方法。
在用于基因疗法的情况下，在适当启动子的控制下，视构建体的性质(例如如上所述的启动子的类型)而定及视所要宿主细胞的性质(例如有丝***后末端分化或活跃***；例如可表达构建体维持为附加体或整合于宿主细胞基因组内)而定，本发明的各种构建体(包括具有效应功能的多价(例如多特异性)结合蛋白)实际上可表达于任何宿主细胞中，包括体内宿主细胞。
用于原核及真核宿主的适当克隆载体和表达载体描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor,NY,(1989)中。例示性克隆/表达载体包括(但不限于)克隆载体、穿梭载体及表达构建体，其可基于质粒、噬菌粒(phagemid)、噬菌粒(phasmid)、粘粒、病毒、人工染色体或适于扩增、转移和/或表达其中所含的本领域中已知的聚核苷酸的任何核酸媒介物。如本文中所述，在本发明的优选实施方案中，在已经本发明的核酸转染、转化或转导的哺乳动物细胞中进行重组表达。亦参见例如Machida,CA.,“Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols(基因治疗的病毒载体：方法和实验方案)”；Wolff,JA,“Gene Therapeutics:Methods andApplications of Direct Gene Transfer(基因疗法：直接基因转移的方法和应用)”(Birkhauser 1994)；Stein,U及Walther,W(编),“Gene Therapy of Cancer:Methods andProtocols(癌症的基因治疗：方法和实验操作)”(Humana Press 2000)；Robbins,PD(编),“Gene Therapy Protocols(基因治疗方案)”Humana Press 1997)；Morgan,JR(编),“GeneTherapy Protocols(基因治疗方案)”(Humana Press 2002)；Meager,A(编),“GeneTherapy Technologies,Applications and Regulations:From Laboratory to Clinic(基因治疗技术、应用和调节：实验室到临床)”(John Wiley&Sons Inc.1999)；MacHida,CA和Constant,JG,“Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols(基因治疗的病毒载体：方法和实验操作)”(Humana Press 2002)；“New Methods Of Gene TherapyFor Genetic Metabolic Diseases NIH Guide(用于遗传代谢病的基因治疗新方法NIH指南)”第22卷，第35期，1993年10月1日。亦参见美国专利第6,384,210号、第6,384,203号、第6,384,202号、第6,384,018号、第6,383,814号、第6,383,811号、第6,383,795号、第6,383,794号、第6,383,785号、第6,383,753号、第6,383,746号、第6,383,743号、第6,383,738号、第6,383,737号、第6,383,733号、第6,383,522号、第6,383,512号、第6,383,481号、第6,383,478号、第6,383,138号、第6,380,382号、第6,380,371号、第6,380,369号、第6,380,362号、第6,380,170号、第6,380,169号、第6,379,967号及第6,379,966号。
表达构建体通常是源自质粒载体。一种优选构建体为经修饰的pNASS载体(Clontech,Palo Alto,CA)，其具有编码氨苄西林(ampicillin)抗性基因的核酸序列、多聚腺苷酸化信号及T7启动子位点。其他合适哺乳动物表达载体已熟知(参见例如Ausubel等人，1995；Sambrook等人，同上；亦参见例如Invitrogen,San Diego,CA的目录；Novagen,Madison,WI；Pharmacia,Piscataway,NJ)。为促进具有效应功能的多价结合蛋白的产量增加(所述产量是在应用适当选择剂(例如甲氨喋呤)后因基因扩增所致)，目前可在合适调节控制下制备包括二氢叶酸还原酶(DHFR)编码序列的优选构建体。
通常，重组表达载体将如上所述包括复制起点及容许宿主细胞转化的可选择标志物，及源自经高表达的基因以直接转录下游结构性序列的启动子。载体与本发明的聚核苷酸的可操作性连接产生克隆构建体或表达构建体。例示性克隆/表达构建体含有至少一个与本发明的聚核苷酸操作性连接的表达控制元件，例如启动子。本发明的载体及克隆/表达构建体中亦涵盖其他表达控制元件，诸如增强子、因子特异性结合位点、终止子及核糖体结合位点。本发明的聚核苷酸的异源结构性序列是在适当时期与翻译起始序列及终止序列一起组装。因此，例如，如本文中所提供的多价结合蛋白编码核酸可作为用于在宿主细胞中表达该蛋白的重组表达构建体而包括于各种表达载体构建体的任一者中。在某些优选实施方案中，所述构建体是包括于体内给药的制剂中。所述载体及构建体包括染色体DNA序列、非染色体DNA序列及合成DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；源自质粒与噬菌体DNA、病毒DNA(诸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒及假狂犬病或如下所述的复制缺乏性逆转录病毒)的组合的载体。然而，可使用任何其他载体来制备重组表达构建体，且在优选实施方案中，该载体可复制且可存活于宿主中。
可将适当DNA序列例如通过各种程序***载体中。一般而言，将DNA序列通过本领域中已知的程序***适当限制性核酸内切酶切割位点中。涵盖用于克隆、DNA分离、扩增及纯化的标准技术，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶及其类似酶的酶促反应的标准技术及各种分离技术。多种标准技术描述于例如Ausubel等人(1993 CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学现行实验方案),GreenePubl.Assoc.Inc.&John Wiley&Sons,Inc.,Boston,MA)；Sambrook等人(1989 MolecularCloning(分子克隆)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY)；Maniatis等人(1982Molecular Cloning(分子克隆),Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY)；Glover(编)(1985 DNA Cloning(DNA克隆)第I及II卷，IRL Press,Oxford,UK)；Hames和Higgins(编),(1985Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交),IRL Press,Oxford,UK)；及其他文献中。
使表达载体中的DNA序列与至少一个适当表达控制序列(例如组成性启动子或调节性启动子)操作性地连接以引导mRNA合成。所述表达控制序列的代表性实例包括如上所述的真核细胞或其病毒的启动子。启动子区可选自使用CAT(氯霉素转移酶)载体或具有可选择标志物的其他载体的任何所要基因。真核启动子包括CMV快速早期启动子、HSV胸苷激酶、早期及晚期SV40、源自逆转录病毒的LTR，及小鼠金属硫蛋白-I。选择适当载体及启动子是属于本领域普通技术人员的水平范围内，且本文中描述某些特别优选的重组表达构建体的制备，所述重组表达构建体包含至少一个与编码本发明的蛋白或多肽的核酸操作性地连接的启动子或调节性启动子。
通过高等真核细胞转录编码本发明的蛋白及多肽的DNA可通过将增强子序列***载体中来增强。实例包括位于复制起点近侧的SV40增强子(bp 100至270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点近侧的多形瘤增强子及腺病毒增强子。
亦涵盖使用本发明的核酸的基因疗法(包含置换缺陷型基因或将新颖基因添加至细胞和/或组织中的策略)，且其正在研发以供用于治疗癌症、调整代谢失调及用于免疫疗法领域。本发明的基因疗法包括使用具有或不具有独立载体或递送媒介物或构建体的本发明的各种构建体以供治疗本文中所述的疾病、病症和/或状态。所述构建体亦可用作用于治疗或预防本文中所述的疾病、病症和/或状态的疫苗。DNA疫苗例如利用编码免疫原性蛋白的聚核苷酸及核酸决定子以刺激免疫***从而防御病原体或肿瘤细胞。所述策略可刺激后天性或先天性免疫，或可经由细胞因子表达而涉及免疫功能的修饰。体内基因疗法通常涉及将遗传物质直接注入患者或动物体内以治疗、预防或改善疾病或与疾病相关的症状。疫苗及免疫调节为全身性疗法。对于组织特异性体内疗法，诸如旨在治疗癌症的那些疗法，优选为定位基因递送和/或表达/靶向***。靶向特异性组织的多种基因疗法载体于本领域中已知，且已研发出完全靶向特异性组织的程序，例如使用基于导管的技术，所有所述内容均涵盖于本文中。
本文中亦涵盖离体基因疗法，且所述方法涉及移除、遗传性修饰、扩增及再给予个体(例如人类患者)的自身细胞。实例包括用于癌症治疗的骨髓移植或淋巴祖细胞的遗传性修饰。离体基因疗法优选适用于处理易得到且在基因转移过程期间可存活于培养物中的细胞(诸如血液或皮肤细胞)。
适用的基因疗法载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、单纯性疱疹病毒(HSV)载体及逆转录病毒载体。基因疗法亦可使用“裸DNA”、基于脂质体的递送法、基于脂质的递送法(包括与带正电荷的脂质连接的DNA)、电穿孔法及弹道投射法来进行。
在某些实施方案(包括但不限于基因疗法实施方案)中，载体可为病毒载体，诸如逆转录病毒载体。Miller等人，1989 BioTechniques7:980；Coffin和Varmus,1996Retroviruses,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY。例如，逆转录病毒质粒载体所来源的逆转录病毒包括但不限于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒(诸如劳氏(Rous)肉瘤病毒)、哈维(Harvey)肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人类免疫缺乏病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒及乳腺肿瘤病毒。
逆转录病毒为可复制且可经由DNA中间体整合于宿主细胞的基因组中的RNA病毒。此DNA中间体或前病毒可稳定地整合于宿主细胞DNA中。根据本发明的某些实施方案，表达构建体可包含其中并入有编码外来蛋白的外来基因而非正常逆转录病毒RNA的逆转录病毒。当逆转录病毒RNA进入宿主细胞内、同时发生感染时，外来基因也被引入细胞中，且接着可整合于宿主细胞DNA中，仿佛其为逆转录病毒基因组的部分。在宿主内表达此外来基因导致表达外来蛋白。
已研发出用于基因疗法的大部分逆转录病毒载体***是基于鼠逆转录病毒。所述逆转录病毒以两种形式存在：称为病毒粒子的游离病毒颗粒或整合于宿主细胞DNA中的原病毒。病毒粒子形式的病毒含有：逆转录病毒的结构性和酶促性蛋白(包括逆转录酶)、病毒基因组的两个RNA拷贝和含有病毒包膜糖蛋白的源细胞质膜的部分。逆转录病毒基因组被组织为四个主要区：长末端重复(LTR)，其含有为转录起始和终止所必需的顺式作用元件且位于编码基因的5'与3'；和三个编码gag、pol及env的基因。该三个基因gag、pol及env分别编码内部病毒结构、酶促性蛋白(诸如整合酶)及包膜糖蛋白(命名为gp70及p15e)，其赋予病毒以感染性及宿主范围特异性以及“R”肽的未定功能。
出于与使用逆转录病毒(包括用于表达构建体中)相关的安全考虑，已研发出单独包装的细胞系及载体制备性细胞系。简而言之，此方法是利用两种组份(逆转录病毒载体和包装细胞系(PCL))的用途。逆转录病毒载体含有长末端重复(LTR)、待转移的外来DNA及包装序列(y)。此逆转录病毒载体因编码结构性和包膜蛋白的基因不包括于载体基因组中而无法由自身再生。PCL含有编码gag、pol及env蛋白的基因，但不含有包装信号“y”。因此，PCL仅可自身形成空病毒粒子。在该一般方法中，逆转录病毒载体是被引入PCL中，从而形成载体制备性细胞系(VCL)。该VCL制造仅含有逆转录病毒载体的外来基因组的病毒粒子，且因此在先前被视为安全逆转录病毒载体以供治疗性使用。
“逆转录病毒载体构建体”是指在本发明的优选实施方案中能够引导所关注的一个或多个序列或基因(诸如编码多价结合蛋白的核酸序列)的表达的组合体。简而言之，逆转录病毒载体构建体必须包括5'LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点及3'LTR。载体构建体中可包括多种异源序列，包括例如编码蛋白(例如细胞毒性蛋白、疾病相关抗原、免疫辅助分子或置换基因)的序列或本身用作分子的序列(例如用作核糖核酸酶或反义序列)。
本发明的逆转录病毒载体构建体可易于由多种逆转录病毒来建构，所述逆转录病毒包括例如B、C及D型逆转录病毒以及泡沫病毒和慢病毒(参见例如RNA Tumor Viruses(RNA肿瘤病毒)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,1985)。所述逆转录病毒易获自保藏处或保藏中心，诸如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；Rockville,Maryland)，或使用通常可利用的技术由已知来源分离而得。已知本文中所提供的揭示内容和标准重组技术，可易于利用任何上述逆转录病毒以组装或构建本发明的逆转录病毒载体构建体、包装细胞或生产者细胞(例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989；Kunkle,1985Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:488)。
适用于病毒载体中的启动子通常可包括但不限于：逆转录病毒LTR；SV40启动子；及人类巨细胞病毒(CMV)启动子(描述于Miller等人，1989 Biotechniques 7:980-990中)或其他任何启动子(例如细胞性启动子，诸如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、polIII及β-肌动蛋白启动子)。可使用的其他病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子及B19小病毒启动子。对于本领域技术人员，合适启动子的选择将经由本文中所含的教导显而易见，且可选自调节启动子或如上所述的启动子。
使用逆转录病毒质粒载体可转导包装细胞系以形成生产者细胞系。可经转染的包装细胞的实例包括但不限于如Miller,Human Gene Therapy(人基因治疗),1:5-14(1990)中所述的PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12及DAN细胞系。载体可经由本领域中已知的任何方式来转导包装细胞。所述方式包括但不限于电穿孔法、使用脂质体及CaPO4沉淀。在一个选择中，可将逆转录病毒质粒载体囊封于脂质体中，或与脂质偶联，且接着给予宿主。
生产者细胞系产生感染性逆转录病毒载体颗粒，所述颗粒包括编码具有效应功能的多价结合蛋白的核酸序列。所述逆转录病毒载体颗粒接着可用于体外或体内转导真核细胞。经转导的真核细胞将表达编码该蛋白或多肽的核酸序列。可经转导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞以及造血干细胞、肝细胞、纤维母细胞、循环外周血单核细胞及多形核细胞(包括骨髓单核细胞)、淋巴细胞、肌母细胞、组织巨噬细胞、树突状细胞、库普弗细胞(Kupffer cell)、***及脾的淋巴细胞及网状内皮细胞、角化细胞、内皮细胞及支气管上皮细胞。
宿主细胞
本发明的另一方面提供一种经本发明的任何聚核苷酸或克隆/表达构建体转化或转染的宿主细胞，或含有本发明的任何聚核苷酸或克隆/表达构建体的宿主细胞。聚核苷酸及克隆/表达构建体可利用本领域中已知的任何方法(包括转化、转染及转导)而被引入合适细胞中。宿主细胞包括经历离体细胞疗法(包括例如离体基因疗法)的个体的细胞。本发明的一方面所涵盖的真核宿主细胞在具有本发明的聚核苷酸、载体或蛋白时，除包括个体自身的细胞(例如人类患者自身的细胞)以外，亦包括VERO细胞、海拉细胞(HeLa cell)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(包括能够修饰所表达的多价结合分子的糖基化模式的经修饰CHO细胞，参见已公开的美国专利申请第2003/0115614 A1号，其以引用方式并入本文中)、COS细胞(诸如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、HEK293细胞、HepG2细胞、N细胞、3T3细胞、草地贪夜蛾细胞(例如Sf9细胞)、酿酒酵母细胞及本领域中已知的适用于表达及任选地分离本发明的蛋白或肽的任何其他真核细胞。亦涵盖原核细胞，包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)、链霉菌(Streptomycete)或本领域中已知的适于表达及任选地分离本发明的蛋白或肽的任何原核细胞。在自原核细胞分离蛋白或肽中，尤其涵盖可使用本领域中已知的用于从包涵体中萃取蛋白的技术。由本文中的教导可知，适当宿主的选择是在本领域技术人员的技术范畴内。
工程化宿主细胞可培养于常规培养基中，该培养基经修饰以适合活化启动子、选择转化体或扩增特定基因。经选择用于表达的特定宿主细胞的培养条件，诸如温度、pH值及其类似条件，对于一般本领域技术人员而言是显而易见的。亦可使用各种哺乳动物细胞培养***来表达重组蛋白。哺乳动物表达***的实例包括猴肾纤维母细胞的COS-7系(由Gluzman,1981 Cell 23:175所描述)及能够表达相容性载体的其他细胞系，例如C127、3T3、CHO、海拉细胞系及BHK细胞系。哺乳动物表达载体将包含复制起点、合适启动子及任选的增强子，以及任何必需的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体及受***点、转录终止序列及5'侧翼非转录序列，例如如本文中关于多价结合蛋白表达构建体的制备所述。源自SV40剪接的DNA序列及多聚腺苷酸化位点可用于提供所需的非转录遗传元件。构建体导入宿主细胞内可通过本领域技术人员熟知的多种方法来实现，所述方法包括但不限于磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖介导转染法或电穿孔法(Davis等人，1986 Basic Methods inMolecular Biology(分子生物学基本方法))。
在一实施方案中，宿主细胞通过引导本发明的蛋白或多肽的表达的重组病毒构建体来转导。经转导的宿主细胞产生含有经表达的蛋白或多肽的病毒颗粒，该经表达的蛋白或多肽是源自在病毒萌芽期间经病毒颗粒合并的宿主细胞膜的部分。
药学上的组合物
在某些实施方案中，本发明的组合物(诸如包含编码如本文中所述的该蛋白的聚核苷酸的多价结合蛋白或组合物)适于在足以容许所编码的蛋白在宿主细胞中经体内或体外表达的条件及时间下给药以用于基因疗法及其类似疗法。所述组合物可被配制为根据熟知方法给药的药学上的组合物。药学上的组合物通常包含一或多种重组表达构建体和/或所述构建体的表达产物以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述载体在所用剂量及浓度下对受者应为无毒的。对于基于核酸的制剂或对于包含本发明的表达产物的制剂而言，可通过例如皮内、皮下、肌肉内或静脉内途径或通过本领域中已知的在给定的一组环境下合适的任何途径，每公斤体重给予约0.01μg至约100mg。优选剂量例如为约1μg/kg至约1mg/kg，特别优选为约5μg/kg至约200μg/kg。
对于本领域技术人员显而易见，给药次数和频率将视宿主的反应而定。适于治疗性用途的药学上可接受的载体已熟知于药物技术中，且描述于例如RemingtonsPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编，1985)中。例如，可使用生理学pH值下的无菌盐水及磷酸盐缓冲盐水。药学上的组合物中可提供防腐剂、稳定剂、染料及其类似物。例如，可添加苯甲酸钠、山梨酸及对羟基苯甲酸的酯作为防腐剂。同上，在第1449页。此外，可使用抗氧化剂和悬浮剂。同上。本发明的化合物可以游离碱或盐形式使用，两种形式均视为属于本发明的范畴。
含有本发明的一或多种核酸构建体或对应于由所述核酸构建体所编码的产物的蛋白的药学上的组合物可为容许组合物给予患者的任何形式。例如，组合物可为固体、液体或气体(气雾剂)的形式。典型的给药途径包括但不限于经口、局部、肠胃外(例如经舌下或经颊)、舌下、直肠、***及鼻内。如本文中所使用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵体内、鞘内、耳道内、尿道内注射或输注技术。药学上的组合物可被配制以使得其中所含的活性成份在将该组合物给予患者后可被生物利用。将给予患者的组合物可采取一或多种剂量单位的形式，其中例如锭剂可为单一剂量单位，且气雾剂形式的本发明的一或多种化合物的容器可具有多数个剂量单位。
对于经口给药而言，可存在赋形剂和/或粘合剂。实例为蔗糖、高岭土、甘油、淀粉糊精、褐藻酸钠、羧甲基纤维素及乙基纤维素。可存在着色剂和/或调味剂。可使用包衣外壳。
组合物可为液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。举两个实例，液体可供经口给药或通过注射递送。当意欲经口给药时，优选组合物除含有一或多个结合结构域-免疫球蛋白融合构建体或表达产物外，亦含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂及增香剂中的一或多者。在意欲通过注射给药的组合物中，可包括界面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂及等渗剂中的一或多者。
如本文中所使用的液体药学上的组合物(无论溶液、悬浮液形式或其他类似形式)可包括以下佐剂中的一或多者：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液(优选为生理盐水)、林格氏溶液(Ringer's solution)、等渗性氯化钠、不挥发性油类(诸如可用作溶剂或悬浮介质的合成单甘油酯或二甘油酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂)；抗菌剂，诸如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，及用于调整张力的药剂，诸如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可封装于由玻璃或塑料制成的安瓶、抛弃式针筒或多剂量小瓶中。生理盐水为优选佐剂。可注射药学上的组合物优选为无菌的。
制剂中亦需要包括其他组份，诸如递送媒介物，包括但不限于铝盐、油包水乳液、生物可降解性油媒介物、水包油乳液、生物可降解性微胶囊及脂质体。用于所述媒介物中的免疫刺激性物质(佐剂)的实例包括N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸-D-异谷酰胺(MDP)、脂多醣(LPS)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ干扰素及IL-15。
尽管本发明的药学上的组合物中可使用本领域普通技术人员已知的任何合适载体，但载体类型将视给药模式及是否需要持续释放而变化。对于肠胃外给药(诸如皮下注射)而言，载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于经口给药而言，可使用上述任何载体或固体载体，诸如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖及碳酸镁。生物可降解性微球体(例如聚乳酸半乳糖苷)亦可用作本发明的药学上的组合物的载体。合适的生物可降解性微球体是揭示于例如美国专利第4,897,268号和第5,075,109号中。就此而言，微球体优选大于约25微米。
药学上的组合物亦可含有稀释剂(诸如缓冲剂)、抗氧化剂(诸如抗坏血酸)、低分子量(少于约10个残基)多肽、蛋白、氨基酸、碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(例如EDTA)、谷胱甘肽及其他稳定剂及赋形剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水为例示性的适当稀释剂。优选地，使用适当赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂将产物配制为冻干物。
根据本领域中已知的技术(包括揭示于已公开的美国专利申请第2006/0008415A1号中的技术，其以引用方式并入本文中)，本发明的药学上的组合物亦包括稳定蛋白及稳定液体药物制剂。所述技术包括蛋白的衍生化，其中该蛋白包含与N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙基-顺丁烯二酰亚胺或半胱氨酸偶合的硫醇基。
如上所述，本发明包括能够递送编码具有效应功能的多价结合蛋白的核酸分子的组合物。所述组合物包括重组病毒载体，例如逆转录病毒(参见WO 90/07936、WO 91/02805、WO 93/25234、WO 93/25698及WO 94/03622)、腺病毒(参见Berkner,1988 Biotechniques6:616-627；Li等人，1993 Hum.Gene Ther.4:403-409；Vincent等人，Nat.Genet.5:130-134及Kolls等人，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:215-219)、痘病毒(参见美国专利第4,769,330号、美国专利第5,017,487号及WO89/01973))、与聚阳离子型分子复合的重组表达构建体核酸分子(参见WO 93/03709)及与脂质体结合的核酸(参见Wang等人，1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851)。在某些实施方案中，可将DNA与灭活或失活的腺病毒相连接(参见Curiel等人，1992 Hum.Gene Ther.3:147-154；Cotton等人，1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6094)。其他合适的组合物包括DNA-配体(参见Wu等人，1989J.Biol.Chem.264:16985-16987)及脂质-DNA组合(参见Felgner等人，1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)。
除引导体内程序外，亦可使用离体程序，其中将细胞从宿主(例如个体，诸如人类患者)中移除、修饰且置于同一或另一宿主动物中。显然，在离体环境中，可使用上述任何组合物将本发明的构建体(蛋白/多肽或编码其的核酸)引入组织细胞中。病毒、物理及化学摄取方法的实验方案已熟知于本领域中。
抗体的形成
借助于多次皮下或腹膜内注射抗原多肽或其片段及佐剂，通常可在动物(例如兔、仓鼠、山羊、绵羊、马、猪、大鼠、沙鼠、豚鼠、小鼠或任何其他合适哺乳动物，以及其他非哺乳动物种类)中产生针对抗原多肽的多克隆抗体。佐剂包括但不限于弗氏完全或不完全佐剂(complete or incomplete Freund's adjuvant)、矿物质凝胶(诸如氢氧化铝)及表面活性物质，诸如溶血卵磷脂、普流尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳液及二硝基苯酚。BCG(卡介苗(bacilli Calmette-Guerin))及短小棒状杆菌亦为潜在适用的佐剂。其可适用于使抗原多肽与在待免疫的物种中具有免疫原性的载体蛋白结合；典型载体包括匙孔螺血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。此外，可使用诸如明矾的聚集剂以增强免疫反应。免疫之后，将动物放血且利用常规技术测定血清的抗-抗原多肽抗体效价。可将多克隆抗体用于血清中，自血清中检测多克隆抗体，或可利用例如抗原亲和层析法将多克隆抗体自血清中纯化。
针对抗原多肽的单克隆抗体可利用通过培养物中的连续细胞系产生抗体分子的任何方法来制备。例如，单克隆抗体可通过如Kohler等人，Nature 256:495[1975]中所述的杂交瘤方法；人类B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等人，Immunol Today 4:72,1983；Cote等人，Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030,1983)及EBV-杂交瘤技术(Cole等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss Inc,New York N.Y.，第77-96页，(1985))来制备。
当使用杂交瘤技术时，可使用骨髓瘤细胞系。优选地，适用于产生杂交瘤的融合程序中的细胞系不产生内源抗体，具有高融合效率，且显示酶缺乏，从而使其不能在仅支持所要融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。例如，若经免疫的动物为小鼠，则可使用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XX0 Bul；若为大鼠，则可使用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210；且U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6均可结合细胞融合来使用。
在一替代实施方案中，人类抗体可经由噬菌体显示文库来制备(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227:381[1991]；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581；亦参见美国专利第5,885,793号)。所述方法经由以下步骤来模拟免疫选择：在丝状噬菌体表面上显示全部抗体，且随后依据其与所选抗原的结合来选择噬菌体。一种该技术是描述于以Adams等人的名义申请的PCT申请第PCT/US98/17364号中，其描述利用该方法分离MPL-受体及msk-受体的高亲和性及功能性促效抗体。在该方法中，人类抗体基因的完整清单可通过自如前所述的外周血淋巴细胞中克隆天然重排的人类V基因而形成(Mullinax等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87:8095-8099[1990])。
或者，完整的全部合成人类重链可通过将各人类VH区段与随机核苷酸的D区段连同人类J区段一起组合而由未经重排的V基因区段来形成(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227:381-388[1992])。同样，全部轻链可通过将各人类V区段与J区段合并来构建(Griffiths等人，EMBO J.13:3245-3260[1994])。将编码完整抗体(亦即重链与轻链)的核苷酸连接为单链Fv片段，且将该聚核苷酸与编码丝状噬菌体次要外壳蛋白的核苷酸接合。当该融合蛋白在噬菌体表面上表达时，编码特异性抗体的聚核苷酸可通过使用固定抗原选择来鉴别。
除形成多克隆及单克隆抗体的典型方法外，亦涵盖用于形成任何已知抗体形式的任何方法。除多克隆及单克隆抗体外，抗体形式亦包括嵌合抗体、人源化抗体、CDR-移植抗体及抗体片段及变异体。
特异性结合剂的变异体及衍生物
在一实施例中，提供***变异体，其中一或多个氨基酸残基增补特异性结合剂氨基酸序列。***可位于蛋白的任一末端或两末端，或可位于特异性结合剂氨基酸序列的内部区中。本发明的变异体产物亦包括成熟特异性结合剂产物，亦即其中前导序列或信号序列已移除而所得蛋白具有其他氨基末端残基的特异性结合剂产物。其他氨基末端残基可源自另一种蛋白或可包括一或多个因源自特异性蛋白而无法鉴别的残基。涵盖在位置-1具有其他甲硫氨酸残基的多肽(例如具有效应功能的Met-1-多价结合肽)，亦包括在位置-2及位置-1具有其他甲硫氨酸及赖氨酸残基的本发明的多肽(具有效应功能的Met-2-Lys-1-多价结合蛋白)。具有其他Met、Met-Lys或Lys残基(或一般而言为一或多个碱性残基)的本发明多肽的变异体尤其适用于增强在细菌宿主细胞中产生重组蛋白。
本发明亦包括因使用特异性表达***所产生的具有其他氨基酸残基的本发明的特异性多肽。例如，使用表达作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合产物的部分的所要多肽的市购载体可在GST组份与所要多肽切割之后提供在位置-1具有其他甘氨酸残基的所要多肽。亦涵盖在其他载体***中经由表达而产生的变异体，包括其中组氨酸标志物通常在序列的羧基末端和/或氨基末端并入氨基酸序列中的那些变异体。
在另一方面中，本发明提供缺失变异体，其中本发明的多肽中的一或多个氨基酸残基被移除。缺失可在多肽的一个末端或两个末端实现，或经由氨基酸序列中的一或多个残基的移除来实现。缺失变异体必然包括本发明的多肽的所有片段。
抗体片段是指具有对应于免疫球蛋白可变区序列中的至少部分的序列的多肽。片段例如可通过酶促裂解或化学裂解对应于全长抗体的多肽而形成。其他结合片段包括通过合成技术或通过重组DNA技术(诸如表达含有编码部分抗体可变区的核酸序列的重组质粒)而形成的那些片段。优选的多肽片段呈现如本文中所述的靶标所特有或所特异性的免疫特性。具有所要免疫特性的本发明的片段可通过本领域中熟知且常规实践的任何方法来制备。
在又一方面中，本发明提供具有效应功能的多价结合多肽的取代变异体。取代变异体包括其中氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基被移除且经替代性残基置换的那些多肽。在某些实施方案中，所述取代在性质上为保守的；然而本发明包括亦为非保守性的取代。氨基酸可根据物理特性和对二级与三级蛋白结构的作用来进行分类。在本领域中，保守性取代可理解为一种氨基酸取代具有类似特性的另一氨基酸。表A中列举例示性保守性取代(参见WO 97/09433，第10页，1997年3月13日公开(PCT/GB96/02197，于96年6月9日提交))，紧接如下。
表A
或者，如在表B中所列举，保守性氨基酸可如Lehninger，[Biochemistry，第二版；Worth Publishers,Inc.NY:NY(1975)，第71-77页]中所述来分组，紧接如下。
表B：
保守性取代II
本发明亦提供特异性结合剂多肽的衍生物。衍生物包括具有除氨基酸残基的***、缺失或取代以外的修饰的特异性结合剂多肽。优选地，所述修饰具有共价性质，且包括例如与聚合物、脂质、其他有机部分及无机部分的化学键合。本发明的衍生物可被制备以增加特异性结合剂多肽的循环半衰期，或可被设计以改良多肽靶向所要细胞、组织或器官的能力。
本发明进一步包括如美国专利第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号及第4,179,337号中所述、经共价修饰或衍生化以包括一或多种水溶性聚合物连接物(诸如聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇)的具有效应功能的多价结合蛋白。本领域中已知的其他适用聚合物包括单甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纤维素及其他基于碳水化合物的聚合物、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)及聚乙烯醇，以及所述聚合物的混合物。尤其优选为聚乙二醇(PEG)衍生化蛋白。水溶性聚合物可键合于特定位置，例如键合于本发明的蛋白及多肽的氨基末端，或与多肽的一或多个侧链随机连接。PEG用于改良治疗能力的用途是描述于颁予Gonzales等人的美国专利第6,133,426号中。
免疫球蛋白诱变的靶点
某些策略可供用于操控抗原特异性免疫球蛋白(例如抗体)的固有特性，所述策略对基于非免疫球蛋白的结合分子无效。所述策略中支持例如基于抗体的分子优于所述替代物的良好实例为，经由亲和性成熟在体内调节抗体对其靶标的亲和性，其是利用免疫球蛋白基因的体细胞超突变以产生随免疫反应进展而亲和性增加的抗体。此外，已研发出改变免疫球蛋白的结构及免疫球蛋白区及结构域的重组技术。因此，可制备对指定抗原显示经改变的亲和性的源自抗体的多肽，且本领域中已知多种用于鉴别及纯化或分离所述多肽的纯化方案及监控屏幕。使用所述已知技术，可获得对抗原显示减少或增加的亲和性、包含源自抗体的结合结构域的多肽。用于产生显示改变的亲和性的多肽变异体的策略包括：对编码抗体的DNA使用定点诱变或随机诱变以改变蛋白中所存在的氨基酸，继而为筛检步骤，该步骤经设计以回收显示所要变化(例如，相对于未经修饰的亲本抗体或参照抗体增加或减少的亲和性)的抗体变异体。
诱变策略中为改变亲和性所最常靶向的氨基酸残基为抗体的轻链及重链可变区的互补性决定区(CDR)或超可变区中的那些残基。所述区含有与抗原进行物化相互作用的残基以及影响所述残基的空间排列的其他氨基酸。然而，亦已证明CDR区以外的可变结构域框架区中的氨基酸对抗体的抗原结合特性具有实质性作用，且可经靶向以操控所述特性。参见Hudson,P.J.Curr.Opin.Biotech.,9:395-402(1999)及其中的参考文献。
抗体变异体的更小且更有效筛检文库可通过对CDR中对应于在体细胞亲和性成熟过程期间倾向于“超突变”的区域的位点限制随机诱变或定点诱变来制备。参见Chowdhury等人，Nature Biotech.,17:568-572(1999)及其中的参考文献。已知以此方式限定超突变位点的DNA元件的类型包括同向重复和反向重复、某些共有序列、二级结构及回文序列。共有DNA序列包括四碱基序列嘌呤-G-嘧啶-A/T(亦即A或G-G-C或T-A或T)及丝氨酸密码子AGY(其中Y可为C或T)。
因此，本发明的另一方面为一组用于修饰抗体对其靶标的亲和性的诱变策略。所述策略包括重链和/或轻链的整个可变区的诱变、仅CDR区的诱变、CDR内的共有超突变位点的诱变、框架区的诱变或所述方法的任何组合(“诱变”在本上下文中可为随机诱变或定点诱变)。经由本领域技术人员已知的技术(诸如X射线晶体分析法)解决所述抗体和抗体:配体复合物的结构从而可完成对CDR区的明确描述及对包含抗体的结合位点的残基的鉴别。基于对所述抗体晶体结构的分析和表征的各种方法已为本领域技术人员所知且可用于接近CDR区。所述常用方法的实例包括Kabat、Chothia、AbM及接触定义。
Kabat定义是基于序列可变性且为预测CDR区的最常用定义。Johnson等人，Nucleic Acids Research,28:214-8(2000)。Chothia定义是基于结构性环区的位置。(Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901-17[1986]；Chothia等人，Nature,342:877-83[1989])。AbM定义是兼顾于Kabat与Chothia定义之间。AbM为牛津大学分子组(OxfordMolecular Group)所生产的用于抗体结构建模的整套程序(Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)86:9268-9272[1989]；Rees等人，ABMTM(用于抗体可变区建模的电脑程序)，Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd.)。AbM程序组是利用知识数据库与从头开始方法的组合由一级序列对抗体的三级结构建模。最近已引入另一种定义，称为接触定义。参见MacCallum等人，J.Mol.Biol.,5:732-45(1996)。此定义是基于对可获得的复合物晶体结构的分析。
根据惯例，重链中的CDR结构域通常称为H1、H2及H3，且依氨基末端向羧基末端移动的次序依次编号。轻链中的CDR区通常称为L1、L2及L3且依氨基末端向羧基末端移动的次序依次编号。
CDR-H1长为约10至12个残基且根据Chothia和AbM定义，通常始于Cys后的第4个残基，或根据Kabat定义通常始于其后的第5个残基。H1之后通常为Trp，通常为Trp-Val，而且可为Trp-Ile或Trp-Ala。根据AbM定义，H1的长度为约10至12个残基，而Chothia定义不包括最后的4个残基。
根据Kabat和AbM定义，CDR-H2通常始于H1末端后的第15个残基。H2之前的残基通常为Leu-Glu-Trp-Ile-Gly，但可存在多种变异。H2之后通常为氨基酸序列Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。根据Kabat定义，H2的长度为约16至19个残基，其中AbM定义预测长度通常为9至12个残基。
CDR-H3通常始于H2末端后的第33个残基，且通常在氨基酸序列Cys-Ala-Arg之后。H3之后通常为氨基酸Gly。H3长度的范围为3至25个残基。
CDR-L1通常始于约残基24且通常在Cys之后。CDR-L1之后的残基通常为Trp且通常以如下序列中之一者开始：Trp-Tyr-Gln、Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln或Trp-Tyr-Leu。CDR-L1的长度为约10至17个残基。
CDR-L2始于L1末端后的约16个残基。其通常在以下残基之后：Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe。CDR-L2的长度为约7个残基。
CDR-L3通常始于L2末端后的第33个残基且通常在Cys之后。L3之后通常为氨基酸序列Phe-Gly-XXX-Gly。L3的长度为约7至11个残基。
用于修饰抗体的各种方法已描述于本领域中，包括例如人源化抗体的制备方法，其中人源化免疫球蛋白重链可变区框架的序列与供体免疫球蛋白重链可变区框架的序列具有65％至95％的一致性。各人源化免疫球蛋白链除包含CDR外，通常亦包含来自供体免疫球蛋白框架的氨基酸，所述氨基酸例如能够与CDR相互作用以实现结合亲和性，诸如一或多个与供体免疫球蛋白中的CDR紧邻的氨基酸或约3埃(angstrom)以内的那些氨基酸(如通过分子建模所预测)。重链和轻链可各自通过使用各种定位标准中的任一种或所有标准来设计。当组合成完整抗体时，人源化免疫球蛋白在人类中大体上具有非免疫原性且对抗原(诸如含有表位的蛋白或其他化合物)保留与供体免疫球蛋白大体上相同的亲和性。
在一实施例中，描述与亲本抗体具有类似结合特异性，但具有增强的人类特征的抗体及抗体片段的制备方法。人源化抗体是通过利用例如噬菌体显示技术的链替换法及包含对所关注的抗原具特异性的非人类抗体的重链或轻链可变区的多肽而获得，接着将其与全部人类互补(轻链或重链)链可变区组合。鉴别对所关注的抗原具特异性的杂交对，且将所选对中的人类链与全部人类互补可变结构域(重链或轻链)组合。在另一实施方案中，将CDR中来自非人类抗体的组份与CDR中来自人类抗体的全部组成部分组合。自抗体多肽二聚体的所得文库选择杂交体，且其可用于第二人源化替换步骤中；或者，若该杂交体已具有足够的人类特征而具有治疗价值，则排除此第二步骤。增强人类特征的修饰方法于本领域中已知。
另一实施例为一种如下制备人源化抗体的方法：以CDR氨基酸序列取代对应的人类CDR氨基酸序列和/或以FR氨基酸序列取代对应的人类FR氨基酸序列。
另一实施例提供用于鉴别抗体可变结构域中可经修饰的氨基酸残基的方法，所述方法在减少其相对于异源物种的免疫原性的同时不减弱抗原结合结构域的天然亲和性；及制备所述适于给予异源物种的经修饰抗体可变区的方法。
通过本领域中已知的任何方法对免疫球蛋白(诸如抗体)的修饰可被设计以达成增加或减少的抗原结合亲和性和/或以减少抗体在受者体内的免疫原性和/或以调节效应活性程度。在一种方法中，人源化抗体可被修饰以排除糖基化位点从而增强抗体对其同源抗原的亲和性(Co等人，Mol.Immunol.30:1361-1367[1993])。诸如“重构”、“超嵌合”及“面饰/重修表面”的技术已制备具有更大治疗潜能的人源化抗体。Vaswami等人，Annals ofAllergy,Asthma,&Immunol 81:105(1998)；Roguska等人，Prot.Engineer.9:895-904(1996)]。亦参见美国专利第6,072,035号，其描述抗体重构方法。尽管所述技术通过减少外来残基的数目而减弱抗体免疫原性，但在抗体重复给药之后，其无法阻止抗遗传型反应及抗同种异型反应。用于减少免疫原性的所述方法的替代方法是描述于Gilliland等人，J.Immunol.62(6):3663-71(1999)中。
在很多情况下，人源化抗体导致抗原结合能力下降。因此，优选使人源化抗体“回复突变”以包括一或多个初始(最常为啮齿动物)抗体中所存在的氨基酸残基，以试图恢复抗体的结合亲和性。参见例如Saldanha等人，Mol.Immunol.36:709-19(1999)。
已证明免疫球蛋白的糖基化可影响效应功能、结构稳定性及自抗体生产细胞分泌的速率(参见Leatherbarrow等人，Mol.Immunol.22:407(1985)，该文献以引用方式并入本文中)。导致所述特性的碳水化合物群通常与抗体的恒定区相连接。例如，在CH2结构域中的Asn297处将IgG糖基化可促使IgG活化补体依赖性细胞溶解的全部能力(Tao等人，J.Immunol.143:2595(1989))。在CH3结构域中的Asn 402处将IgM糖基化例如可促成抗体的适当组装及细胞溶解活性(Muraoka等人，J.Immunol.142:695(1989))。在IgA抗体的CH1及CH3结构域中的位置162及419处将糖基化位点移除导致细胞内降解及对分泌的至少90％抑制作用(Taylor等人，Wall,Mol.Cell.Biol.8:4197(1988))。因此，本发明的分子包括经突变方式改变的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白因例如恒定亚区中的特异性残基发生突变而显示改变的糖基化模式，从而改变效应功能。参见Co等人，Mol.Immunol.30:1361-1367(1993),Jacquemon等人，J.Thromb.Haemost.4:1047-1055(2006),Schuster等人，CancerRes.65:7934-7941(2005)，及Warnock等人，Biotechnol Bioeng.92:831-842(2005)，各文献以引用方式并入本文中。
本发明亦包括具有至少一个结合结构域的多价结合分子，该结合结构域在序列上与已知免疫球蛋白可变区序列具有至少80％、优选90％或95％或99％的一致性且具有至少一个不同于该免疫球蛋白可变区的残基，其中所改变的残基增加糖基化位点、改变一或多个糖基化位点的位置或优选相对于免疫球蛋白可变区移除糖基化位点。在某些实施方案中，该变化移除免疫球蛋白可变区框架中的N-连接糖基化位点或移除存在于免疫球蛋白重链可变区框架中，在约氨基酸残基65至约氨基酸残基85(使用Co等人，J.Immunol.148:1149,(1992)的编号规定)范围的区域内的N-连接糖基化位点。
涵盖本领域中已知的用于制备相对于免疫球蛋白参照序列显示改变的糖基化模式的多价结合分子的任何方法。例如，可利用多种遗传技术中的任何技术来改变一或多个特定残基。或者，用于制备的宿主细胞可经工程化以制备改变的糖基化模式。例如，本领域中已知的一种方法以增强ADCC的对分式非岩藻糖化变异体形式提供改变的糖基化作用。所述变异体因在含有寡糖修饰酶的宿主细胞表达而产生。或者，涵盖BioWa/Kyowa Hakko的Potelligent技术以减少本发明的糖基化分子中的岩藻糖含量。在一种已知方法中，提供经由产生GDP-岩藻糖来修饰免疫球蛋白FC区的糖基化模式的用于重组免疫球蛋白制备的CHO宿主细胞。该技术可用于修饰本发明的多价结合分子的恒定亚区的糖基化模式。
除修饰结合结构域(诸如免疫球蛋白的结合结构域)的结合特性外，和除诸如人源化的修饰外，本发明亦包括通过使造成效应功能(诸如恒定亚区的效应功能)的残基变化或突变来调节效应功能。所述修饰可利用本领域中已知的任何技术来实现，诸如Presta等人，Biochem.Soc.Trans.30:487-490(2001)中所揭示的方法，该文献以引用方式并入本文中。例示性方法将包括使用Presta等人所揭示的实验方案以修饰已知可影响对应于FCγRI、FCγRII、FCγRIII、FCαR及FCεR的一或多个恒定亚区中的结合的特异性残基。
在另一种方法中，Xencor XmAb技术可用于使对应于FC结构域的恒定亚区工程化以增强细胞杀死效应功能。参见Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)103(11):4005-4010(2006)，该文献以引用方式并入本文中。例如，利用该方法可形成使FCγR特异性与结合性最优化的恒定亚区，从而增强细胞杀死效应功能。
制备具有效应功能的多价结合蛋白
可使用含有且表达本发明的多价结合蛋白(具有效应功能)的多种表达载体/宿主***。所述***包括但不限于微生物，诸如经重组噬菌体、质粒、粘粒或其他表达载体转化的细菌；经酵母表达或穿梭载体转化的酵母；经病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞***；经病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus；CaMV)；烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus；TMV))转染或经细菌性表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞***；或动物细胞***。适用于重组多价结合蛋白制备的哺乳动物细胞包括但不限于：VERO细胞、海拉细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(诸如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562及HEK293细胞。本文中以下描述重组表达多价结合蛋白的示例性实验方案。
表达载体可包含转录单元，该转录单元包含以下各者的组合：(1)在基因表达中具有调节作用的一或多种遗传元件，例如启动子、增强子或因子特异性结合位点；(2)编码转录成mRNA且翻译成蛋白的结合剂的结构或序列；及(3)适当的转录起始和终止序列。欲用于酵母或真核表达***中的结构单元优选包括使宿主细胞能够胞外分泌所翻译的蛋白的前导序列。或者，若在无前导序列或转运序列的情况下表达重组多价结合蛋白，则其可包括氨基末端甲硫氨酸残基。该残基随后可从所表达的重组蛋白中裂解或不从其裂解以提供最终多价结合蛋白。
例如，可使用商购表达***(例如毕赤氏酵母表达***(Pichia ExpressionSystem)(Invitrogen,San Diego,CA))，依照制造商说明书在酵母中重组表达多价结合蛋白。该***亦依赖于前-原-α序列以引导分泌，但***物的转录是在甲醇诱导下由醇氧化酶(AOX1)启动子来驱动。所分泌的多价结合肽可通过以下方法自酵母生长培养基中纯化，例如通过用于自细菌性及哺乳动物细胞上清液中纯化肽的方法。
或者，编码多价结合肽的cDNA可被克隆入杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen,San Diego,CA)中。该载体可根据制造商说明书(PharMingen)使用以感染无SF9蛋白的培养基中的草地贪夜蛾细胞及制备重组蛋白。多价结合蛋白可使用肝素-琼脂糖柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)自培养基中纯化及浓缩。用于蛋白表达的昆虫***(诸如SF9***)已为本领域技术人员所熟知。在一种该***中，苜蓿丫纹夜蛾核多角体病病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus；AcNPV)可用作在草地贪夜蛾细胞中或在粉纹夜蛾幼虫(Trichoplusia larvae)中表达外来基因的载体。可将多价结合肽编码序列克隆入病毒的非必需区(诸如多角体蛋白基因)且在多角体蛋白启动子的控制下安置。多价结合肽的成功***将使得多角体蛋白基因具有非活性且产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。重组病毒可用于感染表达肽的草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫(Smith等人，JVirol 46:584,1983；Engelhard等人，Proc Nat Acad Sci(USA)91:3224-7,1994)。
在另一实施例中，编码多价结合肽的DNA序列可通过PCR扩增且克隆入适当载体内，例如pGEX-3X(Pharmacia,Piscataway,NJ)。pGEX载体被设计以制备由该载体编码的包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白，及***该载体的克隆位点中的由DNA片段编码的多价结合蛋白。可形成包括例如适当裂解位点的PCR引物。若多价结合蛋白融合部分仅用于促进表达，或无需作为所关注的肽的连接物，则重组多价结合蛋白融合体可自融合蛋白的GST部切割。将pGEX-3X/多价结合肽构建体被转化至大肠杆菌XL-1 Blue细胞(Stratagene,La Jolla CA)中，且将个别转化体分离并培养。将来自个别转化体的质粒DNA纯化且可使用自动测序仪对其进行部分测序以证明存在具有适当取向的所要多价结合蛋白编码核酸***物。
可作为不溶性包涵体于细菌中制备的融合多价结合蛋白可如下加以纯化。通过离心收集宿主细胞；于0.15M NaCl、10mM Tris(pH 8)、1mM EDTA中洗涤；且在室温下用0.1mg/ml溶菌酶(Sigma Chemical Co.)处理15分钟。通过超音波处理使溶菌产物澄清，且将细胞碎片通过以12,000倍重力离心10分钟而沉淀。可将含有多价结合蛋白融合体的沉淀再悬浮于50mM Tris(pH 8)和10mM EDTA中，经50％甘油分层，且以6000倍重力离心30分钟。可将沉淀再悬浮于不含Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中。多价结合蛋白融合体可通过将再悬浮的沉淀于变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离而进一步纯化(Sambrook等人)。将凝胶浸泡于0.4M KCl中以显现蛋白，将其切除且于缺乏SDS的凝胶电泳缓冲剂中电洗脱。若GST/多价结合肽融合蛋白是以可溶性蛋白的形式而于细菌中制备，则其可使用GST纯化模组(Pharmacia Biotech)来纯化。
优选使多价结合蛋白融合体经受消化以使GST自本发明的多价结合肽裂解。可将消化反应物(20-40μg融合蛋白、20-30单位人类凝血酶(4000U/mg(Sigma)于0.5ml PBS中)在室温下孵育16至48小时且加载于变性SDS-PAGE凝胶上以分离反应产物。可将凝胶浸泡于0.4M KCl中以显现蛋白带。对应于具有预期分子量的多价结合肽的蛋白带的特性可使用自动测序仪(Applied Biosystems Model 473A,Foster City,CA)通过氨基酸序列分析来证明。或者，可通过对所述肽进行HPLC和/或质谱分析来证明其特性。
或者，可将编码多价结合肽的DNA序列克隆入含有所要启动子及任选地含有前导序列的质粒内(参见例如Better等人，Science,240:1041-43,1988)。该构建体的序列可通过自动测序来证明。接着可使用对细菌进行CaCl2孵育及热休克处理的标准程序(Sambrook等人)，将质粒转化至合适大肠杆菌菌株(诸如菌株MC1061)中。经转化的细菌可培养于LB培养基中，该LB培养基补充有羧苄西林(carbenicillin)或如本领域中已知的其他合适形式的选择物，且通过培养于合适培养基中来诱导表达蛋白的产生。若存在，则前导序列可实现多价结合肽的分泌且在分泌期间裂解。所分泌的重组蛋白可通过本文中以下所述的方法自细菌培养基中纯化。
用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主***已为本领域技术人员所熟知且为优选***。可选择具有加工所表达的蛋白或产生某些用于提供蛋白活性的翻译后修饰的特定能力的宿主细胞系。多肽的所述修饰包括但不限于：乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂质化及酰化。不同宿主细胞(诸如CHO、海拉、MDCK、293、WI38及其类似宿主细胞)具有特异于所述翻译后活性的细胞机制及特征机制且可被选择以确保对外来蛋白进行正确的修饰及加工。
转化的细胞优选可用于长期高产率的蛋白生产，且因而需要稳定表达。所述细胞优选含有至少一个可选择标志物以及所要表达盒的载体转化后，将所述细胞于富集培养基中培养1-2天，之后转移至选择性培养基。可选择标志物被设计以赋予选择物抗性且其存在使得成功表达外来蛋白的细胞可生长及回收。稳定转化细胞的抗性团可利用适于该细胞的组织培养技术来增殖。
可使用多种选择***来回收转化的细胞以用于产生重组蛋白。所述选择***包括但不限于分别位于tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶及腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。亦可利用抗代谢物抗性作为以下各者的选择基础：赋予甲氨喋呤抗性的dhfr；赋予霉酚酸抗性的gpt；赋予氨基糖苷G418抗性及赋予氯磺隆(chlorsulfuron)抗性的neo；及赋予潮霉素抗性的hygro。可适用的其他可选择基因包括trpB，其使得细胞可使用吲哚替代色氨酸；或hisD，其使得细胞可使用组氨醇替代组氨酸。为鉴别转化体而提供目测指示的标志物包括花青素、β-葡糖醛酸酶及其底物GUS，及萤光素酶和其底物萤光素。
蛋白纯化
蛋白纯化技术已为本领域技术人员所熟知。所述技术包括在某一级别将多肽与非多肽组分的粗分离。将多价结合多肽与至少一种其他蛋白分离，可纯化所关注的多肽，但通常需要利用层析技术及电泳技术进一步纯化以达成部分或完全纯化(或纯化为均质性)。尤其适于制备纯多价结合肽的分析方法为离子交换层析法、排阻层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法及等电聚焦法。尤其有效的肽纯化方法为快速蛋白液相层析法及HPLC。
本发明的某些方面是关于所编码的多价结合蛋白或肽的纯化和在特定实施方案中的大体上纯化。如本文中所使用的术语“纯化的多价结合蛋白或肽”欲指可与其他组份分离的组合物，其中多价结合蛋白或肽被纯化至任何相对于其天然可获得的状态的程度。因此，纯化的多价结合蛋白或肽亦是指其天然存在的环境中所不存在的多价结合蛋白或肽。
通常，“纯化”是指一种已经受分离以移除各种其他组份且该组合物大体上保留其所表达的生物活性的多价结合蛋白组合物。若使用术语“大体上纯化”，则此名称是指多价结合蛋白组合物，其中多价结合蛋白或肽形成组合物的主要组份，诸如在组合物中构成蛋白重量的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％或99％以上。
本领域技术人员根据本公开将获知各种用于定量多价结合蛋白的纯化度的方法。所述方法包括例如测定活性组分的特异性结合活性或通过SDS/PAGE分析来评估组分中多价结合多肽的量。用于评估多价结合蛋白组分纯度的优选方法为计算该组分的结合活性，将其与初始提取物的结合活性比较，及从而计算纯化度(本文中通过“纯化倍数”来评估)。用于表示结合活性的量的实际单位当然视选用于纯化的特定测定技术而定，而无论所表达的多价结合蛋白或肽是否显示可检测的结合活性。
适用于多价结合蛋白纯化的各种技术已为本领域技术人员所熟知。所述技术包括例如：经硫酸铵、PEG、抗体及其类似物的沉淀或通过热变性，继而离心；层析步骤，诸如离子交换、凝胶过滤、反相层析、羟基磷灰石及亲和层析法；等电聚焦；凝胶电泳；及所述技术与其他技术的组合。如本领域中通常所知，认为进行各种纯化步骤的次序可改变，或某些步骤可省略且仍不失为制备大体上纯化的多价结合蛋白的合适方法。
一般不需要总是以最纯化状态提供多价结合蛋白。实际上，预期在某些实施方案中可使用不是大体上纯化的多价结合蛋白。部分纯化可通过组合使用较少的纯化步骤来实现，或通过使用相同的常规纯化方案的不同形式来实现。例如，应了解使用HPLC装置所进行的阳离子交换柱层析通常比使用低压层析***的相同技术产生更大的纯化。显示相对较低纯化度的方法在多价结合蛋白产物的回收总量方面或在维持所表达的多价结合蛋白的结合活性方面具有优势。
已知多肽的迁移在SDS/PAGE的不同条件下可变化，有时显著变化(Capaldi等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.,76:425,1977)。因此应了解，在不同电泳条件下，纯化或部分纯化的多价结合蛋白表达产物的表观分子量可变化。
效应细胞
针对靶标细胞诱导例如ADCC、ADCP(抗体依赖性细胞吞噬作用)及其类似者的效应细胞包括人类白细胞、巨噬细胞、单核细胞、活化嗜中性白细胞、活化天然杀伤(NK)细胞及嗜伊红细胞。效应细胞表达FCαR(CD89)、FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FCεR1且包括例如单核细胞及活化嗜中性白细胞。已发现例如FcγRI的表达可通过干扰素γ(IFN-γ)来上调。此增强的表达可增强单核细胞和嗜中性白细胞防御靶标细胞的细胞毒性活性。因此，效应细胞可经(IFN-γ)或其他细胞因子(例如TNF-α或β、群落刺激因子、IL-2)活化，以在与本发明的多价蛋白接触之前增加细胞表面上FcγRI的存在。
本发明的多价蛋白提供抗体效应功能，诸如抗体依赖性效应细胞介导的细胞毒性(ADCC)，以供用于防御靶标细胞。具有效应功能的多价蛋白可如本文中所教导单独给予，或与效应细胞偶联后给予，从而形成“活化效应细胞”。“活化效应细胞”为如本文中所定义的效应细胞，其与亦如本文中所定义的具有效应功能的多价蛋白连接，以便在给药之前有效提供具有靶向功能的效应细胞。
活化效应细胞可以细胞在生理学上可接受的溶液中的悬浮液形式被体内给药。所给予的细胞数目是在约108-109个的数量级上，但视治疗目的而有所变化。一般而言，该量将足以获得效应细胞在靶标细胞处的定位及在此位置提供所要程度的效应细胞功能，诸如通过ADCC和/或吞噬作用的细胞杀死作用。如本文中所使用的术语生理学上可接受的溶液意欲包括可使体内给予的靶向效应细胞稳定的任何载体溶液，包括例如盐水及缓冲水溶液、溶剂、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂及其类似物。
因此，本发明的其他方面提供一种在个体中针对细胞诱导特异性抗体效应功能(诸如ADCC)的方法，该方法包含向个体给予于生理学上可接受的培养基中的多价蛋白(或编码核酸)或活化效应细胞。如本领域中所知，给药途径可变化且合适的给药途径将由本领域技术人员基于对病例特异性变量及常规程序的考虑来判定。
无细胞效应
无细胞效应亦由本发明的多价分子提供，例如通过提供CDC功能性。补体***为免疫***的生物化学级联，其有助于将外来物(诸如病原体)自有机体中清除。其是源自很多小的血浆蛋白，所述血浆蛋白共同运作，通过破坏靶标细胞的质膜而诱导靶标细胞的细胞溶解。补体***由35个以上的可溶性且结合细胞的蛋白组成，其中12个直接涉及于补体通路中。所述蛋白在引起补体***活化的三种生物化学通路中具有活性：经典补体通路、替代性补体通路及甘露糖结合凝集素通路。抗体(尤其IgG1类抗体)亦可“结合”补体。所述通路在本领域中已获得详细了解且此处不再重复，但值得注意的是，补体依赖性细胞毒性不取决于结合分子与免疫***的细胞(例如B细胞)的相互作用。亦值得注意的是补体***通过补体调节蛋白来调节。所述蛋白以高于补体蛋白的浓度存在于血液血浆中。补体调节蛋白是存在于自身细胞表面上，提供防止自身细胞受补体蛋白靶向的机制。预期补体***在具有免疫组份的若干种疾病中起作用，诸如巴-西二氏(Barraquer-Simon)综合征、阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)、哮喘、红斑性狼疮症、各种形式的关节炎、自体免疫心脏病及多发性硬化症。缺乏末端通路使得个体易感染自体免疫疾病及传染病(尤其脑膜炎)。
疾病、病症和状态
本发明提供结合一或多个结合伙伴的具有效应功能的多价结合蛋白及其变异体和衍生物，且该结合事件适用于治疗、预防或改善与疾病、病症或病理性状态(优选使人类痛苦的疾病、病症或病理性状态)相关的症状。在所述方法的优选实施方案中，具有效应功能的多价(及多特异性)结合蛋白可使具有靶标(诸如肿瘤特异性细胞表面标志物)的细胞与效应细胞(诸如免疫***中显示细胞毒活性的细胞)结合。在其他实施方案中，具有效应功能的多特异性、多价结合蛋白特异性地结合两种不同的疾病特异性细胞表面标志物、病症特异性细胞表面标志物或状态特异性细胞表面标志物，以确保正确靶标与效应细胞(诸如免疫***的细胞毒性细胞)结合。此外，可使用具有效应功能的多价结合蛋白来诱导或增强抗原活性或抑制抗原活性。具有效应功能的多价结合蛋白亦适于组合疗法和姑息疗法。
在一方面中，本发明提供适用于治疗或预防以与细胞相关的抗原活性量异常为特征的疾病和状态的组合物及方法。所述疾病包括癌症及其他过度增殖性状态，诸如增生、牛皮癣、接触性皮炎、免疫性病症及不育症。包括实体肿瘤及白血病在内的多种癌症易受本文中所揭示的组合物及方法作用。可治疗的癌症类型包括但不限于：***、***及结肠的腺癌；所有形式的肺支气管癌；髓样瘤；黑素瘤；肝瘤；神经母细胞瘤；***状瘤；氨前体摄取与脱羧细胞瘤(apudoma)；迷芽瘤；鳃原性瘤；恶性类癌综合征；类癌心脏病；和癌(例如瓦尔克癌(Walker)、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、布-皮二氏(Brown-Pearce)氏癌、乳腺管瘤、艾利希氏(Ehrlich)瘤、Krebs 2癌、默克尔(merkel)细胞癌、粘质肿瘤、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳突状癌、硬癌、细支气管癌、支气管癌、鳞状细胞癌及转移细胞癌)。可治疗的其他癌症类型包括：组织细胞病症；白血病；恶性组织细胞增生症；霍奇金氏(Hodgkin's)病；小免疫增殖症；非霍奇金氏淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮细胞增生病；黑素瘤；软骨母细胞瘤；软骨瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间质瘤；中肾瘤；肌肉瘤；釉母细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养叶瘤。此外，亦涵盖易受治疗作用的以下癌症类型：腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；圆柱瘤；囊腺癌；囊腺瘤；粒导细胞瘤；两性胚细胞瘤；肝瘤；汗腺腺瘤；胰岛细胞瘤；莱氏(Leydig)细胞瘤；***状瘤；塞氏(sertoli)细胞瘤；卵泡膜细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；肌母细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；节细胞神经瘤；神经胶质瘤；髓母细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘瘤；神经母细胞瘤；神经上皮瘤；纤维神经瘤；神经瘤；副神经节瘤；非嗜铬性副神经节瘤。可治疗的癌症类型亦包括但不限于：血管角质瘤；血管淋巴样过度增生伴发嗜伊红血球增多症；硬化性血管瘤；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；***瘤；***肌瘤；***肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；***肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌瘤；横纹肌肉瘤；肉瘤；赘瘤；神经纤维瘤；及子宫颈发育不良。本发明进一步提供适用于治疗其中细胞因抗原的表达异常高而变得永生化或过度增殖的其他状态的组合物及方法。
易受本发明的组合物及方法作用的各种过度增殖性病症例示为B-细胞癌症，包括B-细胞淋巴瘤(诸如各种形式的霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或中枢神经***淋巴瘤)、白血病(诸如急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病及慢性肌母细胞白血病)及骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)。其他B细胞癌症包括小淋巴细胞性淋巴瘤、B-细胞前淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、骨孤立性浆细胞肉瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)的节外边缘区B-细胞淋巴瘤、节边缘区B-细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、扩散性大B-细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B-细胞淋巴瘤、血管内大B-细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤/白血病、未定恶性潜能肿瘤的B-细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病及移植后淋巴组织增殖性病症。
以产生自身抗体为特征的病症通常视为自体免疫疾病。自体免疫疾病包括但不限于：关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、多软骨炎、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、皮炎、多发性肌炎/皮肌炎、包涵体肌炎、炎性肌炎、中毒性表皮坏死溶解、全身性硬皮病及硬化症、肢端硬皮综合征(CREST syndrome)、炎性肠病伴随的反应、克罗恩氏(Crohn's)病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、丝球体肾炎、过敏性状态、湿疹、哮喘、涉及T细胞渗入及慢性炎性反应的状态、动脉粥样硬化症、自体免疫心肌炎、白细胞粘附缺陷症、全身性红斑性狼疮症(SLE)、亚急性皮肤红斑性狼疮症、盘状狼疮症、狼疮骨髓炎、狼疮大脑炎、青少年发作型糖尿病、多发性硬化症、过敏性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、风湿热、西登哈姆舞蹈病(Sydenham'schorea)、与由细胞因子及T-淋巴细胞介导的急性及迟发型过敏相关的免疫反应、结核病、类肉瘤病、肉芽肿病(包括韦格纳氏(Wegener's)肉牙肿病及丘-施二氏(Churg-Strauss)疾病)、粒性白细胞缺乏症、脉管炎(包括过敏反应脉管炎/血管炎、ANCA及类风湿性脉管炎)、再生障碍性贫血、戴-布二氏(Diamond Blackfan)贫血、免疫溶血性贫血(包括自体免疫溶血性贫血(AIHA))、恶性贫血、单纯红血球发育不全(PRCA)、凝血因子VIII缺乏症、A型血友病、自体免疫嗜中性白血球减少症、全血细胞减少症、白血球减少症、涉及白血球渗出的疾病、中枢神经***(CNS)炎性病症、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、贝切特氏(Behcet)病、凯瑟曼氏(Castleman's)综合征、古德帕斯丘(Goodpasture)综合征、伊-兰二氏(Lambert-Eaton)重症肌无力综合征、雷诺氏(Reynaud's)综合征、修格兰氏(Sjorgen's)综合征、史蒂芬-强森氏(Stevens-Johnson)综合征、实体器官移植排斥反应、移植物抗宿主疾病(GVHD)、大疱性类天疱疮、天疱疮、自体免疫多内分泌腺病、血清反应阴性脊柱关节病、莱特尔氏(Reiter's)病、全身肌僵直综合征、巨细胞性动脉炎、免疫复合性肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、亨诺-许兰氏(Henoch-Schonlein)紫癜、自体免疫血小板减少症、睾丸及卵巢的自体免疫疾病(包括自体免疫***及***)、原发性甲状腺功能不足；自体免疫内分泌疾病，包括自体免疫甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本氏(Hashimoto's)甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能不足、阿狄森氏(Addison's)病、格雷氏(Grave's)病、自体免疫多腺综合征(或多腺内分泌病综合征)、I型糖尿病(亦称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM))及席汉氏(Sheehan's)综合征；自体免疫肝炎、淋巴间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)伴发性NSIP、吉兰-巴雷氏(Guillain-Barré)综合征、大血管炎(包括风湿性多肌痛及巨细胞(高安氏(Takayasu's))动脉炎)、中血管炎(包括川崎氏(Kawasaki's)病及结节性多动脉炎)、结节性多动脉炎(PAN)、僵直性脊椎炎、伯杰氏(Berger's)病(IgA肾病)、快速进行性丝球体肾炎、原发性胆汁性肝硬化症、乳糜泻(麦胶性肠病)、冷球蛋白血症、冷球蛋白血症伴发肝炎、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、冠状动脉病、家族性地中海热、显微镜下多血管炎、科根氏(Cogan's)综合征、威斯科特-奥尔德里奇二氏(Whiskott-Aldrich)综合征及阻塞血栓性血管炎。
类风湿性关节炎(RA)为以关节的炎症为特征的慢性疾病，其导致肿胀、疼痛及功能丧失。长期患有RA的患者通常显示进行性关节损坏、畸形、失能及甚至早逝。除RA外，炎性疾病、病症及状态一般而言均易受与炎症进程相关的症状(例如发热、疼痛、肿胀、充血)的治疗、预防或改善的作用，且本发明的组合物及方法有益于治疗、预防或改善异常或反常炎性过程，包括RA。
克罗恩氏病及相关疾病溃疡性结肠炎为属于称为炎性肠病(IBD)的疾病群的两类主要疾病。克罗恩氏病为导致消化道或胃肠(GI)道发炎的慢性病症。尽管其会牵涉口腔至***的胃肠道的任何区域，但其最常影响小肠和/或结肠。在溃疡性结肠炎中，GI的牵涉仅限于结肠。克罗恩氏病的特征为抵抗嗜中性白细胞抗原的抗体，亦即“核周抗嗜中性白细胞抗体”(pANCA)；及抗酿酒酵母的抗体，亦即“抗酿酒酵母抗体”(ASCA)。很多溃疡性结肠炎患者在其血液中具有pANCA抗体，但无ASCA抗体；而很多克罗恩氏病患者显示ASCA抗体且不显示pANCA抗体。评估克罗恩氏病的一种方法为使用克罗恩氏病活动指数(CDAI)，该活动指数是基于医师所收集的18种预测变量记分。150及150以下的CDAI值与静态疾病有关；150以上的值指示活动性疾病，且450以上的值被视为极其严重的疾病[Best等人，“Development ofa Crohn's disease activity index(克罗恩氏病活动指数的发展).”Gastroenterology70:439-444(1976)]。然而，自研究开始起，有些研究者使用200至250的“主观值”作为健康记分。
全身性红斑性狼疮症(SLE)为自体免疫疾病，其因包括肾、皮肤及关节的多种器官中的血管发生反复性损伤所致。在患有SLE的患者中，T细胞与B细胞之间不适当的相互作用导致产生攻击细胞核的自身抗体。通常一致认为自身抗体导致SLE，因此耗尽B细胞谱系的新颖疗法(由于新B细胞由前驱细胞形成而使得免疫***可复原)为SLE患者持久受益提供希望。
多发性硬化症(MS)亦为自体免疫疾病。其特征为中枢神经***的炎症及髓鞘的破坏，使得脑、脊髓及身体内的神经细胞纤维隔绝。尽管MS的病因尚且未知，但广泛认为自体免疫T细胞为该疾病的发病机制的始作俑者。然而，MS患者的脑脊髓液中存在高含量的抗体，且有些理论预言导致抗体产生的B细胞反应对于介导该疾病起重要作用。
自体免疫甲状腺病是因产生刺激甲状腺而导致甲状腺功能亢进(格雷氏病)或破坏甲状腺而导致甲状腺功能减退(桥本氏甲状腺炎)的自身抗体所致。甲状腺的刺激是因自身抗体结合且活化促甲状腺激素(TSH)受体所致。甲状腺的破坏是因自身抗体与其他甲状腺抗原反应所致。
可受本发明的组合物及方法所提供的益处作用的其他疾病、病症及状态包括修格兰氏综合征，该综合征为以身体产生水分的腺体的破坏为特征的自体免疫疾病。此外，免疫性血小板减少性紫癜(ITP)是因自身抗体结合血小板且导致其破坏所致，且此状态适于应用本发明的物质及方法。重症肌无力(MG)(一种导致随意肌群无力的慢性自体免疫神经肌肉病症，其特征为自身抗体结合在神经肌肉接点处所表达的乙酰胆碱受体)为具有可使用本发明的组合物及方法治疗的症状的疾病，且预期本发明将有益于治疗和/或预防MG。此外，使用本发明的组合物及方法，预期劳氏(Rous)肉瘤病毒感染可受至少一种症状的治疗或改善的作用。
本发明的另一方面是使用本发明的物质及方法来预防和/或治疗皮肤的任何过度增殖性状态，包括牛皮癣及接触性皮炎或其他过度增殖性疾病。牛皮癣的特征为皮肤的自体免疫性炎症且亦与关节炎(在30％的情况下)以及硬皮症、炎性肠病(包括克罗恩氏病及溃疡性结肠炎)相关。已证明患有牛皮癣及接触性皮炎的患者在所述病灶内具有增高的抗原活性(Ogoshi等人，J.Inv.Dermatol.,110:818-23[1998])。多特异性多价结合蛋白可将免疫***的细胞毒性细胞直接递送至例如表达高含量抗原的病灶内的细胞。多价(例如多特异性)结合蛋白可经皮下给予或通过使用本文中所述的各种给药途径及本领域技术人员熟知的其他给药途径中的任何途径而给予至病灶附近。
亦涵盖特发性炎性肌病(IIM)(包括皮肌炎(DM)及多肌炎(PM))的治疗。炎性肌病可利用多种分类方案来加以分类。米勒氏分类法(Miller's classification schema)(Miller,Rheum Dis Clin North Am.20:811-826,1994)鉴别2种特发性炎性肌病(IIM)：多肌炎(PM)和皮肌炎(DM)。
多肌炎和皮肌炎为牵涉肌肉和(在DM情况下)皮肤的慢性、使衰弱的炎性疾病。所述病症为罕见病症，据报导，在美国，年发病率为每百万成人中每年约5至10例及每百万儿童中每年0.6至3.2例(Targoff,Curr Probl Dermatol.1991,3:131-180)。特发性炎性肌病与显著发病率及死亡率有关，已注意到患病成人中多达一半曾罹患严重损伤(Gottdiener等人，Am J Cardiol.1978,41:1141-49)。米勒(Rheum Dis Clin North Am.1994,20:811-826和Arthritis and Allied Conditions(关节炎和有关状态)，第75章，Koopman及Moreland编，Lippincott Williams和Wilkins,2005)列举五类用于诊断IIM的标准，亦即，特发性炎性肌病标准(IIMC)评估，包括肌无力、肌肉退化的活组织检查迹象、肌肉相关酶的血清含量升高、肌病的电磁三联症、皮肌炎中皮疹的迹象，且亦包括自身抗体的迹象作为第二标准。
IIM相关因子(包括肌肉相关酶及自身抗体)包括但不限于肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶、醛缩酶、C-反应性蛋白、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及抗核自身抗体(ANA)、肌炎特异性抗体(MSA)及针对可提取核抗原的抗体。
易受本发明的方法作用的优选自体免疫疾病包括克罗恩氏病、吉兰-巴雷氏综合征(GBS；亦称为急性炎性脱髓鞘多发性神经病、急性特发性多神经根神经炎、急性特发性多发性神经炎及兰德里氏(Landry's)上行性麻痹)、红斑性狼疮症、多发性硬化症、重症肌无力、视神经炎、牛皮癣、类风湿性关节炎、甲状腺功能亢进(例如格雷氏病)、甲状腺功能不足(例如桥本氏病)、奥德氏(Ord's)甲状腺炎(类似于桥本氏病的甲状腺炎)、糖尿病(1型)、再生障碍性贫血、莱特尔氏综合征、自体免疫肝炎、原发性胆汁性肝硬化症、抗磷脂抗体综合征(APS)、眼阵挛-肌阵挛综合征(OMS)、颞动脉炎(亦称为“巨细胞性动脉炎”)、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、古德帕斯丘综合征、韦格纳氏肉牙肿病、腹腔病、天疱疮、犬多发性关节炎、温热自体免疫性溶血性贫血。此外，本发明涵盖用于治疗或改善与以下疾病相关的症状的方法：子宫内膜异位、间质性膀胱炎、神经性肌强直、硬皮症、白斑病、外阴炎、导致扩大型心脏病(心肥大)的卡格氏(Chagas')病、类肉瘤病、慢性疲劳综合征及自主神经障碍。
认为补体***在具有免疫组份的很多疾病中起作用，诸如阿兹海默氏病、哮喘、红斑性狼疮症、各种形式的关节炎、自体免疫心脏病及多发性硬化症，所有所述疾病均作为易受治疗作用的疾病、病症或状态或利用本发明的方法可改善的症状而涵盖于本发明中。
由多价单链结合分子显示的一个或多个特定效应功能而定，优选为某些恒定亚区。例如，对于补体活化而言，IgG(IgG1、IgG2或IgG3)及IgM优选；对于调理作用及毒素中和作用而言，任何亚型的IgG均优选；对于病原体结合而言，IgA优选；且对于诸如蠕虫的寄生虫的结合而言，IgE优选。
例如，人类白细胞上存在作为三种不同类型的Fcγ受体的识别IgG抗体的恒定区的FCR，其可依据结构特性及功能特性以及依据CD单克隆抗体所检测的抗原结构来辨别。其称为FcγRI、FcγRII及FcγRIII且在白细胞的(重叠)子集上经差异性表达。
FcgRI(CD64)(在单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、骨髓前体细胞及树突状细胞上经表达的高亲和性受体)包含同种型la及lb。FcgRI对单体性人类IgG1及IgG3具有高亲和性。其对IgG4的亲和性为低约10倍，同时其不结合IgG2。FcgRI不显示遗传多态现象。
FcγRII(CD32)(包含同种型lla、llb1、llb2、llb3及llc)为分布最广泛的人类FcγR型，其被表达于大部分类型的血液白细胞上以及被表达于郎格罕氏(Langerhans)细胞、树突状细胞及血小板上。FcγRII为仅结合所聚集的IgG的低亲和性受体。仅FcγR类能够结合IgG2。FcγRIIa显示遗传多态现象，分别产生两种不同的同种异型：FcγRlla-H131及FcγRlla-R131。该功能性多态现象可归因于位置131处的单一氨基酸差异：组氨酸(H)或精氨酸(R)残基，此对于IgG结合而言至关重要。FcγRlla易于结合人类IgG和IgG3且似乎不结合IgG4。FcγRlla-H131比FcγRlla-R131同种异型对复合IgG2具有高得多的亲和性。
FcγRIII(CD16)具有两种同种型或等位基因型，其两者均能够结合IgG1和IgG3。对IgG具有中等亲和性的FcγRIIa是表达于巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤(NK)细胞及T细胞子集上。FcγRIIIb为对IgG具低亲和性的受体，其在嗜中性白细胞上被选择性地表达。高移动性受体可与其他膜受体进行有效协作。对于骨髓瘤IgG二聚体的研究已证明，仅IgG1和IgG3结合FcγRIIIb(以低亲和性结合)，而未发现IgG2和IgG4的结合。FcγRIIIb具有共显性双等位基因多态现象，所述同种异型命名为NA1(嗜中性白细胞抗原)和NA2。
本发明的又一方面是使用本发明的物质及方法通过治疗、预防或减轻感染的效应来抗击因多种感染物中的任何感染物所致的感染。本发明的多价多特异性结合分子被设计以高效且有效地募集宿主有机体的免疫***以抵抗源自外来有机体、外来细胞、外来病毒或外来无生命物体的感染。例如，多特异性结合分子可具有一个特异性地结合感染物上的靶标的结合结构域及另一个特异性地结合抗原呈递细胞上的靶标(诸如CD40、CD80、CD86、DC-SIGN、DEC-205、CD83及其类似者)的结合结构域。或者，多价结合分子的每一结合结构域均可特异性地结合感染物，从而更有效地中和感染物。此外，本发明涵盖特异性地结合感染物上的靶标且结合非细胞相关结合伙伴的多特异性多价结合分子，所述多特异性多价结合分子可结合多特异性结合分子的效应功能而有效治疗或预防因感染物所致的感染。
本发明所涵盖的感染性细胞包括任何已知的感染性细胞，包括但不限于各种细菌(例如病原性大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏杆菌(S.typhimurium)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、肉毒梭菌(C.botulinum)、难治梭状芽孢杆菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、幽门螺旋杆菌(H.pylori)、霍乱弧菌(V.cholerae)及其类似细菌)、分枝杆菌、支原体、真菌(包括酵母及霉菌)及寄生虫(包括原生虫纲(Protozoa)、吸虫纲(Trematoda)、多节绦虫纲(Cestoda)及线虫纲(Nematoda)的任何已知寄生性成员)中的任何者。感染性病毒包括但不限于真核病毒(例如腺病毒(adenovirus)、布尼亚病毒(bunyavirus)、疱疹病毒(herpesvirus)、乳多泡病毒(papovavirus)、副粘病毒(paramyxovirus)、小核糖核酸病毒(picornavirus)、痘病毒(poxvirus)、呼肠弧病毒(reovirus)、逆转录病毒(retrovirus)及其类似病毒)以及噬菌体。外来物包括(无论进入方式且无论是否存在有意伤害)进入有机体(优选人类)内的物体。鉴于多耐药性感染物(例如细菌)(尤其医院感染的病原体)日益盛行，因此本发明的物质及方法可提供一种治疗方法以避免抗生素抗性增强所导致的困难。
与感染物相关且易受本文中所揭示的物质及方法(预防性或治疗性)治疗的疾病、状态或病症包括但不限于炭疽病、曲霉病、细菌性脑膜炎、细菌性肺炎(例如肺炎衣原体)、芽生菌病、肉毒中毒(botulism)、布鲁氏菌病(brucellosis)、念珠菌病(candidiasis)、霍乱、脑隐球菌病、隐球菌病、致泻性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌或肠毒性大肠杆菌、白喉、鼻疽、组织胞浆菌病、退伍军人病、麻风病、李氏杆菌病(listeriosis)、诺卡氏菌病(nocardiosis)、百日咳、沙门氏菌病(salmonellosis)、猩红热、孢子丝菌病、链球菌性喉炎、中毒性休克综合征、旅行者痢疾及伤寒。
本发明的其他方面及细节将由以下实施例显而易见，所述实施例旨在说明而非限制。实施例1描述免疫球蛋白重链和轻链可变区的重组性克隆。实施例2描述小模组免疫药物的构建。实施例3描述用于具有效应功能的多价结合蛋白的原型盒的构建。实施例4描述对该初始原型分子的结合及表达的研究。实施例5描述源自该初始原型分子的替代性构建体的构建，其中EFD与BD2之间连接子区的序列在长度与序列上已改变。此外，描述了替代形式，其中结合结构域2中V区的取向亦改变。实施例6描述随后对所述具有变异连接子形式的替代性构建体的结合及功能研究，从而在若干所述衍生形式中鉴别出连接子区的切割；及为解决该问题所研发的新颖序列变异体。实施例7描述多特异性多价融合蛋白(其中BD1与BD2均结合相同细胞类型上的抗原(CD20和CD37))或另一种多特异性融合蛋白(其中对于BD2具结合特异性的抗原已改变为人类CD3而非CD28)的优选替代实施方案的构建。实施例8描述用CD20-hIgG-CD37多特异性构建体所进行的结合及功能研究。实施例9描述用CD20-hIgG-CD3多价融合蛋白构建体所进行的结合及功能研究。实施例10揭示具有连接子的多价结合分子，所述连接子是基于免疫球蛋白超家族成员的胞外结构域的特定区。实施例11揭示鉴别结合结构域的测定，所述结合结构域在多价结合分子中预期可有效达成至少一种有益效应，该效应经鉴别与所述分子有关(例如疾病治疗)。
实施例1
免疫球蛋白重链和轻链可变区的克隆
可使用本领域中已知的任何方法来诱发针对既定抗原靶标的抗体。此外，可使用本领域中已知的任何方法来克隆免疫球蛋白轻链和/或重链可变区，以及一或多种抗体的恒定亚区。以下方法提供例示性克隆方法。
A.总RNA的分离
为克隆免疫球蛋白重链和轻链可变区或恒定亚区，从分泌适当抗体的杂交瘤细胞中分离总RNA。将获自杂交瘤细胞系的细胞(2×107)用PBS洗涤1次，且于12×75mm圆底聚丙烯管(Falcon第2059号)中经由离心来沉淀。向各管中添加TRIzolTM总RNA分离试剂(GibcoBRL,Life Technologies，目录号第15596-018号)(8ml)且经由重复吸取将细胞溶解。在室温下将溶菌产物孵育5分钟，之后添加1.6ml(0.2个体积)氯仿且剧烈震荡15秒钟。在室温下静置3分钟后，将溶菌产物于4℃预冷却的Beckman JA-17旋转器中以9,000rpm离心15分钟，以便将水相与有机相分离。将上部水相(约4.8ml)移入新管中且与4ml异丙醇轻缓地混合。在室温下孵育10分钟后，通过在4℃JA-17旋转器中以9,000rpm离心11分钟使RNA沉淀，将RNA沉淀用8ml的冰冷75％乙醇洗涤，且于4℃下于JA-17旋转器中以7,000×rpm离心7分钟来再沉淀。将乙醇洗涤液轻轻倒出，且将RNA沉淀风干10分钟。将RNA沉淀再悬浮于150μl经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH2O中，每1ml经DEPC处理的ddH2O中含有1μl核糖核酸酶抑制剂(目录号第799017号；Boehringer Mannheim/Roche)。将所述沉淀通过轻缓吸取而再悬浮且在55℃下孵育20分钟。通过测量经稀释等分试样的OD260nm(1.0OD260nm单位＝40μg/mlRNA)来对RNA样本进行定量。
B.cDNA末端的快速扩增
进行5'RACE以扩增重链和轻链可变区或恒定亚区的末端。根据制造商说明书，使用快速扩增cDNA末端试剂盒2.0版的5'RACE***(Life Technologies，目录号第18374-058号)。使用寡核苷酸设计程序Oligo 5.1版(Molecular Biology Insights,Cascade CO)将简并5'RACE寡核苷酸引物设计成与例如两类常用小鼠免疫球蛋白重链(IgG1和IgG2b)的恒定区匹配。引物亦被设计成与小鼠IgGκ轻链的恒定区匹配。此为唯一类别的免疫球蛋白轻链，因此在引物设计中无需简并。引物的序列如下：
为扩增小鼠免疫球蛋白重链组份，在0.2ml薄壁PCR管中进行逆转录酶反应，该PCR管含有2.5皮摩尔(pmole)的重链GSP1引物(SEQ ID NO:7)、4μg自合适杂交瘤克隆(例如克隆4A5或克隆4B5)所分离的总RNA及12μl经DEPC处理的ddH2O。同样，对于小鼠轻链组份而言，在0.2ml薄壁PCR管中进行逆转录酶反应，该PCR管含有2.5皮摩尔的轻链GSP1引物(SEQID NO:9)、4μg获自合适杂交瘤克隆(例如克隆4A5或克隆4B5)的总RNA及12μl经DEPC处理的ddH2O。
在PTC-100可程序化热循环器(MJ research Inc.,Waltham,MA)中进行反应。将混合物在70℃下孵育10分钟以使RNA变性且接着在湿冰上冷却1分钟。将所述管简短离心以便自管盖收集水份。随后，将以下组份添加至反应中：2.5μl的10x PCR缓冲剂(200mM Tris-HCl(pH 8.4)、500mM KCl)、2.5μl的25mM MgCl2、1μl的10mM dNTP混合物及2.5μl的0.1MDTT。在通过轻缓吸取将各管混合后，将所述管置于42℃的PTC-100热循环器中历时1分钟以将混合物预温热。随后，将1μl(200个单位)的SuperScriptTM II逆转录酶(Gibco-BRL；目录号第18089-011号)添加至各管中，通过吸取轻缓地混合，且在42℃下孵育45分钟。使反应循环至70℃历时15分钟以终止反应，且接着循环至37℃。接着将核糖核酸酶混合物(1μl)添加至各反应管中，轻缓地混合，且在37℃下孵育30分钟。
将逆转录酶反应所产生的第一链cDNA用GlassMAX DNA分离旋转滤筒(Gibco-BRL)根据制造商说明书加以纯化。向各第一链反应中添加120μl的6M NaI结合溶液。接着将cDNA/NaI溶液转移至GlassMAX旋转滤筒中且以13,000倍重力离心20秒钟。将滤筒***件小心移除且丢弃管中的流动部分。接着将旋转滤筒放回空管内且将0.4ml冷(4℃)1×洗涤缓冲液添加至各旋转滤筒中。将所述管以13,000倍重力离心20秒钟且丢弃流动部分。将此洗涤步骤再重复三次。接着将GlassMAX滤筒用0.4ml冷(4℃)70％乙醇洗涤4次。在丢弃最后70％乙醇洗液的流动部分后，将滤筒放回管内且以13,000倍重力再离心1分钟以便使滤筒完全干燥。接着将旋转滤筒***件转移至新鲜样本回收管，其中将50μl经65℃(预热)DEPC处理的ddH2O快速添加至各旋转滤筒中。将滤筒以13,000倍重力离心30秒钟以洗脱cDNA。
C.末端去氧核苷酸转移酶(TdT)加尾
对于各第一链cDNA样本，将以下组份添加至0.2ml薄壁PCR管内：6.5μl经DEPC处理的ddH2O、5.0μl的5×加尾缓冲剂、2.5μl的2mM dCTP及10μl经GlassMAX纯化的适当cDNA样本。将各24μl反应物于热循环器中在94℃下孵育2-3分钟以使DNA变性，且在湿冰上冷却1分钟。通过简单离心收集管的内含物。随后，将1μl末端去氧核苷酸转移酶(TdT)添加至各管中。将所述管经由轻缓吸取来混合且于PTC-100热循环器中在37℃下孵育10分钟。此10分钟孵育之后，将TdT通过循环至65℃历时10分钟而将其热灭活。将反应物于冰上冷却且将经TdT加尾的第一链cDNA储存于-20℃下。
D.经dC加尾的第一链cDNA的PCR
于50μl体积中进行双重复PCR扩增(各经dC加尾的第一链cDNA样本进行两次独立的PCR反应)，该50μl体积含有：200μM dNTP、0.4μM的5'RACE简化式锚定引物(SEQ ID NO:11)及0.4μM嵌套重链GSP2(SEQ ID NO:8)或嵌套轻链GSP2(SEQ ID NO:10)中的任一者、10mM Tris-HCl(pH 8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、5μl的经dC加尾cDNA及5个单位的ExpandTM Hi-Fi DNA聚合酶(Roche/Boehringer Mannheim GmbH,Germany)。采用“递减/递增”退火温度实验方案，在PTC-100可程序化热循环仪(MJ Research Inc.)中以如下条件扩增PCR反应物：初始95℃变性40秒钟，如下5个循环：94℃下20秒，61℃-2℃/循环20秒钟，72℃40秒+1秒/循环；接着如下5个循环：94℃下25秒，53℃+1℃/循环20秒，72℃46秒+1秒/循环；接着如下20个循环：94℃下25秒，55℃20秒，72℃51秒+1秒/循环；及最后于72℃下孵育5分钟。
E.TOPO TA-克隆
使用QIAQuick凝胶纯化***(QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA)将所得PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶进行凝胶纯化，并使用TOPO TA试剂盒(Invitrogen,SanDiego,CA，目录号第K4550-40号)将其TA-克隆进pCR2.1，且根据制造商说明书将其转化至大肠杆菌TOP10F’细胞(Invitrogen)中。根据制造商说明书，通过蓝/白筛检法鉴别具有***物的克隆，其中白色克隆视为阳性克隆。将3.5ml含有50μg/ml氨苄西林的液体Luria肉汤(LB)的培养物用白色菌落接种，且以225rpm震荡下于37℃下培养隔夜(约16小时)。
使用QIAGEN质粒微量制备试剂盒(QIAGEN Plasmid Miniprep Kit，QIAGEN Inc.，目录号第12125号)，根据制造商说明书纯化培养物中的质粒DNA。将质粒DNA悬浮于34μl的1x TE缓冲剂(pH 8.0)中且接着如前所述，通过萤光双去氧核苷酸测序和自动检测法，使用ABI Big Dye Terminator 3.1试剂以1:4-1:8的稀释度对阳性克隆测序，且使用ABI 3100DNA测序仪进行分析。所用测序引物包括T7(5'GTAATACGACTCACTATAGG3’；SEQ ID NO:12)和M13反向(5’CAGGAAACAGCTATGACC3’；SEQ ID NO:13)引物。测序结果将证明所述克隆对应于小鼠IgG序列。
F.利用重叠寡核苷酸延伸PCR的从头基因合成
该方法涉及使用重叠寡核苷酸引物和PCR，采用高保真DNA聚合酶或聚合酶的混合物，合成免疫球蛋白V-区或其他基因。起始于V-区序列的中部，设计40至50个碱基引物，以便以任一方向使生长链扩增20至30个碱基，且邻接引物最少重叠20个碱基。各PCR步骤需要两个引物，一者引发反义链(正向引物或有义引物)且一者引发有义链(反向引物或反义引物)，以形成生长的双链PCR产物。在引物设计期间，可改变最终产物的核苷酸序列以形成限制性酶位点，破坏现有限制性酶位点，添加柔性连接子，改变、缺失或***改变氨基酸序列的碱基，最优化整体DNA序列以增强引物合成且符合供预期用于表达合成基因的有机体的密码子使用规则。
将引物对合并且稀释以使得第一对为5μM，其后每一对具有2倍以上的浓度，最高为80μM。使用Platinum PCR SuperMix-High Fidelity(Invitrogen,San Diego,CA，目录号第12532-016号)于50μL PCR反应中将从所述引物混合物每一者中所取的1μL扩增。初始在94℃下变性2分钟后，用如下的循环方案进行PCR的30个循环：94℃下20秒、60℃下10秒及68℃下15秒。使用Qiaquick PCR纯化柱(Qiagen Inc.，目录号第28704号)纯化PCR产物以移除过量引物及酶。接着利用如上所确切描述的PCR条件(例外之处为将每个循环至68℃的时间延长为30秒钟)，用下一组类似稀释的引物对将该PCR产物再扩增。将所得PCR产物经如上所述的引物和酶再次纯化，经TOPO-TA克隆，且如以上E部分中所确切描述进行测序。
实施例2
小模组免疫药物(SMIP)的构建
以单链重组(鼠/人)scFv的形式构建含有结合结构域1的具有效应功能的多特异性多价结合蛋白，将其命名为2H7(VL-连接子-VH)。scFv2H7为特异性地识别CD20的小模组免疫药物(SMIP)。结合结构域是基于可公开获得的人类CD20抗体序列，对于VH而言GenBank登录号为M17953且对于VL而言GenBank登录号为M17954。CD20-特异性SMIP是描述于共同拥有的美国专利公开2003/133939、2003/0118592和2005/0136049中，所述公开是以引用方式全文并入本文中。分隔VL和VH的肽连接子为编码以下序列的15氨基酸连接子：Asp-Gly3Ser-(Gly4Ser)2。结合结构域1是位于多特异性结合蛋白的N-末端，此结构域的C-末端与恒定亚区的N-末端直接连接，该恒定亚区含有铰链、CH2结构域和CH3结构域(以氨基至羧基取向)。恒定亚区是源自IgG1抗体，其是通过从人类PBMC中PCR扩增人类IgG1而分离。铰链区的修饰通过：用三个Ser残基取代野生型人类IgG1铰链结构域中所存在的三个Cys残基，该铰链区通过15氨基酸序列：EPKSDKTHTPPP(SEQ ID NO:14；该三个经Ser残基置换的Cys残基以粗体指示)编码。在替代实施方案中，铰链区在一或多个半胱氨酸处被修饰，以便形成SSS及CSC型铰链。此外，最后脯氨酸有时被丝氨酸取代，以及半胱氨酸取代。
CH3结构域的C-末端与一系列替代连接子结构域共价连接，所述连接子结构域并置于恒定亚区C末端与结合结构域2的氨基末端之间。视BD2的折叠特性而定，具有效应功能的优选多价结合蛋白将具有所述连接子的一者以使恒定亚区与结合结构域2相间隔，尽管该连接子并非本发明组合物的必要组份。对于某些特异性多价分子而言，该连接子对于结构域的分离可能是重要的，而对于其他者而言，该连接子可能是次要的。该连接子与特异性地识别CD28的scFv 2E12的N-末端连接(VH-连接子-VL)。使多价结合分子的scFv 2E12部分的VH结构域与VL结构域分离的连接子为20氨基酸连接子(Gly4Ser)4，而非通常插于scFv的V结构域之间的标准(Gy4Ser)3连接子。经观测，较长连接子可改良VH-VL取向的2e12 scFv的结合特性。
所构建的多特异性多价结合分子含有结合结构域1，该结合分子包含：来自SEQ IDNO:171的氨基酸1-23的2E12前导肽序列；显示于SEQ ID NO:171的位置24的2H7鼠抗人类CD20轻链可变区；始于SEQ ID NO:171的残基130的Asp-Gly3-Ser-(Gly4Ser)2连接子；2H7鼠抗人类CD20重链可变区，其中在VH的可变结构域的残基11处的氨基酸由亮氨酸取代为丝氨酸(VHL11S)，且该结合分子在重链区末端具有单一丝氨酸残基(亦即VTVS，其中规范序列为VTVSS)(Genbank登录号M17953)，且插于两个结合结构域BD1(2H7)与BD2(2E12)之间者为人类IgG1恒定亚区，其包括包含“CSC”或“SSS”序列的经修饰铰链区，及野生型CH2和CH3结构域。具有效应功能的多价结合蛋白的核苷酸和氨基酸序列对于CSC形式而言分别以SEQ IDNO:228和229显示，且对于SSS形式分别以SEQ ID NO:170和171显示。
稳定表达细胞系的形成通过：经由电穿孔将未切或线性化的重组表达质粒转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO DG44细胞)中，继而在含甲氨喋呤的培养基中选择。将产生最高量的多价结合蛋白的大量培养物和主孔在递增量的甲氨喋呤中扩增，且随后通过限制性稀释来克隆适应的培养物。在生物反应器或波纹袋中，使用获自JRH Biosciences的无血清培养基(Excell 302，目录号第14324-1000M号，补充有4mM谷氨酰胺(Invitrogen，25030-081)、丙酮酸钠(Invitrogen 11360-070，稀释1倍)、非必需氨基酸(Invitrogen，11140-050，最终稀释1倍)、青霉素-链霉素100IU/ml(Invitrogen，15140-122)及1μg/mL的重组胰岛素(Invitrogen，97-503311))培养产生多价结合蛋白的经转染CHO细胞。其他无血清的CHO基础培养基(诸如CD-CHO及其类似物)亦可用于制备。
通过蛋白A亲和层析法，从已消耗CHO培养物上清液纯化融合蛋白。使用一系列层析和过滤步骤(包括病毒减少过滤器)纯化多价结合蛋白。将细胞培养物上清液过滤，接着在GE Healthcare XK 16/40柱上经受蛋白A琼脂糖亲和层析。在蛋白结合柱之后，将柱以dPBS洗涤，接着以1.0M NaCl、20mM磷酸钠(pH 6.0)洗涤，且接着以25mM NaCl、25mN NaOAc(pH 5.0)洗涤，以移除非特异性结合蛋白。以100mM甘氨酸(Sigma)(pH 3.5)将所结合的蛋白自柱洗脱，且用0.5M 2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)(pH 6.0)使pH值达到5.0。将蛋白样本浓缩至25mg/mL，以备GPC纯化。使用GE healthcare XK柱及Superdex 200制备级(GEhealthcare)，在GE Healthcare AKTA Explorer 100Air装置上进行尺寸排阻层析。
接着将物质浓缩且与20mM磷酸钠和240mM蔗糖一起配制，所得pH值为6.0。将组合物过滤，之后以各种浓度装填入无菌小瓶中，此视所回收物质的量而定。
实施例3
构建蝎形分子表达盒
将含有如实施例2中所述的与恒定亚区连接的合成2H7 scFv(抗-CD20；SEQ IDNO:1)的核酸命名为TRU-015。使用TRU-015核酸以及编码小模组免疫药物的合成scFv 2E12(抗-CD28 VL-VH；SEQ ID NO:3)和合成scFv 2E12(抗-CD28 VH-VL；SEQ ID NO:5)核酸作为用于PCR扩增蝎形分子盒的各种组份的模板。结合结构域1和恒定亚区的模板或骨架通过TRU-015(编码与恒定亚区连接的scFv 2H7(抗-CD20)的核酸)提供，且此模板是于表达载体pD18中建构。上述含有具有两种取向(VL-VH及VH-VL)中任一取向的scFv 2E12的核酸为结合结构域2提供编码区。
用于BD2/连接子***物的TRU 015 SSS铰链CH2CH3
使用含有SSS铰链的合成2H7 scFv IgG1型，通过充当添加EcoRI位点的模板以置换现有终止密码子和XbaI位点来形成蝎形分子盒。使用引物9(SEQ ID NO:23；参见表1)和引物87(SEQ ID NO:40；参见表1)以及Platinum PCR高保真混合物(Invitrogen)，通过PCR扩增该分子。将所得1.5Kbp片段纯化且克隆至载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，并被转化至大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen)中，验证DNA序列。
表1
表1：寡核苷酸引物用于构建CD20-CD28蝎形分子盒。引物分成2组：PCR组和测序组。PCR引物是用于构建所述盒，测序引物是用于证明所有中间构建体和最终构建体的DNA序列。
n2H7 VK和人类VK3前导序列融合体
使用表1中的引物3和5，利用寡核苷酸引导的PCR诱变将AgeI(ACCGGT)限制性位点引入TRU 015 VK的编码区的5’端，将Nhe I(GCTAGC)限制性位点引入(G4S)3连接子的编码区的3’端。由于引物3亦编码人类VK3前导(gb:X01668)的最后6个氨基酸，因此使用表1中的引物1、2和5，利用重叠PCR依序增添前导的N-末端序列(包括一致性Kozak盒和HinDIII(AAGCTT)限制性位点)。
n2H7 IgG1 SSS铰链-CH2CH3构建体
使用引物4和6(分别为SEQ ID NO:18和20；表1)再扩增TRU-015VH，其中使NheI位点5’与TRU-015的VK融合且使Xho I(5’-CTCGAG-3’)位点在3’端与IgG1铰链-CH2CH3结构域接合。同样，使用表1中的引物8和9扩增IgG1铰链-CH2-CH3区，从而引入5’Xho I位点，将现有3’端用EcoRI(5’-GAATTC-3’)位点置换以供克隆，且破坏终止密码子以使得可翻译CH3结构域下游所连接的结合结构域2。此蝎形分子盒型不同于上述字首为“n”的盒。
除上述多价结合蛋白外，本发明的蛋白可具有对应于免疫球蛋白的单一可变区的结合结构域(结合结构域1或2，或两者)。本发明的该方面的例示性实施方案将包括对应于骆驼科动物抗体的VH结构域的结合结构域，或能够结合靶标抗原的其他物种抗体的经单一修饰或未经修饰的V区，尽管涵盖任何适用于本发明的蛋白中的单一可变结构域。
2E12 VL-VH和VH-VL构建体
为制备与所述盒相容的2E12 scFv，须使用表1中的重叠寡核苷酸引物17和18来破坏内部Xba I(5’-TCTAGA-3’)位点。使用该两个引物与引物对14/16(VL-VH)或13/15(VH-VL)的组合来扩增两个相反取向的结合结构域，以使得其在其5’和3’端分别携有EcoRI位点与XbaI位点。引物13和16亦编码Xba I位点前方紧邻的终止密码子(TAA)。
2H7 SSS IgG1 2e12 LH/HL构建体
效应结构域-结合结构域2连接子添加(STD连接子-STD1和STD2)
将表1中的互补性引物11和12组合，加热至70℃，且缓慢冷却至室温以使该两链粘接。利用制造商实验方案，使用具有1mM ATP的1X连接缓冲剂(Roche)中的T4聚核苷酸激酶(Roche)添加5’磷酸基。接着使用T4DNA连接酶(Roche)将所得双链连接子接合至位于IgG1CH3末端的编码区与结合结构域2的始端之间的EcoRI位点中。对所得DNA构建体筛检连接子-BD2接合处的EcoRI位点的存在及CH3-连接子接合处的核苷酸序列GAATTA的存在。接着将适当STD 1连接子构建体与EcoRI一起再消化，且重复连接子连接以产生具有由两个(STD2)一致性迭代的Lx1序列组成的连接子的分子。再次如上筛检DNA构建体。
实施例4
表达研究
对上述编码具有效应功能的多价结合蛋白的核酸进行表达研究。将编码多价结合蛋白的核酸经瞬间转染至COS细胞中且将经转染的细胞维持在容许异源基因在所述细胞中受表达的熟知条件下。如上所述，使用PEI或DEAE-葡聚糖将DNA瞬间转染至COS细胞中(PEI＝Boussif O.等人，PNAS 92:7297-7301,(1995)，该文献以引用方式并入本文中；PollardH.等人，JBC 273:7507-7511,(1998)，该文献以引用方式并入本文中)。对各新颖分子进行多次独立转染以便测定各新形式的平均表达程度。若通过PEI转染，则将COS细胞涂覆于DMEM/10％FBS培养基中的60mm组织培养板上且孵育隔夜，以使其在转染当日长满约90％。将培养基换为不含抗生素的无血清DMEM且孵育4小时。转染培养基(4毫升/板)含有具有50μg PEI和10-20μg所关注DNA质粒的无血清DMEM。将转染培养基通过涡流混合，在室温下孵育15分钟，且在抽出现有培养基后添加至板中。将培养物孵育3-7天后再收集上清液。通过SDS-PAGE、蛋白质印迹法测定培养物上清液的蛋白表达，通过流式细胞术验证结合且利用各种测定(包括ADCC、CDC和共培养物实验)来测定功能。
SDS-PAGE分析和蛋白质印迹分析
由每孔含有8μg蛋白的粗培养物上清液(通常30微升/孔)或纯化的蛋白等分试样制备样本，且将2X Tris-甘氨酸SDS缓冲剂(Invitrogen)添加至1倍最终浓度。对10微升SeeBlue标记(Invitrogen,Carlsbad,CA)电泳以提供MW大小标准。使多价结合(融合)蛋白变异体在4-20％Novex Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen,San Diego,CA)上经受SDS-PAGE分析。在95℃下加热3分钟后，在还原或非还原条件下使用Novex Tris-甘氨酸SDS样本缓冲剂(2X)装载样本，继而在175V下电泳60分钟。使用1X Novex Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲剂(Invitrogen)进行电泳。
电泳后，使用半干式电印迹装置(Ellard,Seattle,WA)将蛋白在100mAmp下转移至PVDF膜历时1小时。Western转移缓冲剂包括存在于饱和Whatman滤纸上的如下三种缓冲剂：1号含有36.34g/升Tris(pH10.4)和20％甲醇；2号含有3.02g/升Tris(pH 10.4)和20％甲醇；3号含有3.03g/升Tris(pH 9.4)、5.25g/升ε-氨基己酸和20％甲醇。在搅拌下，将膜于PBS中的BLOTTO(＝5％脱脂乳)中阻断隔夜。将细胞膜与5μg/ml的HRP结合的山羊抗人类IgG(Fc特异性，Caltag)一起于BLOTTO中孵育一小时，接着于PBS-0.5％Tween 20中洗涤3次，每次15分钟。将湿膜用ECL溶液孵育1分钟，继而暴露于X-omat膜历时20秒钟。图2显示在COS细胞培养物上清液(30微升/孔)中所表达的蛋白在非还原条件下电泳的蛋白质印迹。泳道用标记1-9指示且含有以下样本：泳道1(切去边＝See Blue标记，kDa指示印迹侧。泳道2＝2H7-sssIgG P238S/P331S-STD1-2e12 VLVH；泳道3＝2H7-sssIgG P238S/P331S-STD1-2e12VHVL；泳道4＝2H7-sssIgG P238S/P331S-STD2-2e12 VLVH；泳道5＝2H7-sssIgG P238S/P331S-STD2-2e12VHVL；泳道6＝2e12 VLVH SMIP；泳道7＝2e12 VHVL SMIP；泳道8＝2H7SMIP。所述构建体中的2H7始终为VLVH取向，sssIgG指示位于连接子位置1的铰链/连接子的特性(如图5中所示)，P238S/P331S指示自野生型(所示第一aa)突变为突变体(所示第二aa)的人类IgG1型式及其存在于野生型人类IgG1 CH2和CH3结构域中的氨基酸位置，STD1指示位于连接子位置2的20氨基酸(18+限制性位点)连接子(如图5中所示)，且STD2指示位于连接子位置2的38氨基酸(36+限制性位点)连接子(如图6中所示)。
结合研究
进行结合研究以评估CD20/CD28多特异性多价结合肽的双特异性结合特性。初始，将WIL2-S细胞添加至96孔板且离心为沉淀状细胞。在整块板上使用两倍滴定法(20μg/ml滴定至0.16μg/ml)，将CD20/CD28纯化蛋白添加至经接种的板中。亦将TRU-015(结合结构域1的来源)纯化蛋白的两倍连续稀释液(TRU-015浓度范围为20μg/ml至0.16μg/ml)添加至接种的板孔中。一个不含蛋白的孔充当本底对照。
将含有蛋白的接种板在冰上孵育一小时。随后，将所述孔用200μl1％FBS(于PBS中)洗涤一次。接着向各孔中添加以1:100经FITC(Fc Sp)标记的山羊抗人类抗体且将所述板在冰上再孵育一小时。接着将所述板用200μl 1％FBS(于PBS中)洗涤一次，且将所述细胞再悬浮于200μl 1％FBS中且通过FACS分析。
为评估抗-CD28肽2E12VHVL的结合特性，将表达CD28的CHO细胞通过接种于培养板的个别孔中来涂覆。接着使用两倍稀释方案(浓度范围为20μg/ml至0.16μg/ml)将CD20/CD28纯化蛋白添加至个别孔中。再次使用两倍稀释方案(亦即20μg/ml至0.16μg/ml)，将2E12IgG-VHVL SMIP纯化蛋白添加至个别接种孔中。一个孔不接受蛋白以提供本底对照。接着将所述板在冰上孵育一小时，用200μl 1％FBS(于PBS中)洗涤一次，且向各孔中添加以1:100经FITC(Fc Sp,CalTag,Burlingame,CA)标记的山羊抗人类抗体。再将所述板于冰上孵育一小时且随后用200μl 1％FBS(于PBS中)洗涤一次。将所述细胞再悬浮于200μl 1％FBS中之后，进行FACS分析。结果显示具有N-末端CD20结合结构域1的多价结合蛋白结合CD20；具有N-VH-VL-C取向的C-末端CD28结合结构域2的那些蛋白亦结合CD28。
流式细胞术(FACS)表明所表达的蛋白可结合WIL-2S细胞上所呈递的CD20(参见图3)且可结合CHO细胞所呈递的CD28(参考图3)，从而证明BD1或BD2可具有结合特异性靶标抗原的功能。图3的图形上所示的各数据显示，不同多价结合(融合)蛋白的连续稀释液在所指示的滴定范围内具有结合性。使用所述初始构建体所获得的数据指示，在当量浓度下，具有结合结构域2型(使用VHVL取向的2e12)的多价结合(融合)蛋白比VLVH取向形式更佳地表达且更佳地结合CD28。
图4显示用获自所述转染体/构建体中每一者的经纯化蛋白所进行的结合研究结果的图形表示。该图显示蛋白与表达CD20的WIL-2S细胞的结合概况，从而证明该多价分子结合CD20，以及在相同浓度下的单一特异性SMIP。图5的顶图和底图显示BD2特异性(2e12＝CD28)结合CD28 CHO细胞的概况。对于结合结构域2与CD28的结合而言，V区的取向影响2e12的结合。具有VH-VL(HL)取向的2e12的2H7-sss-hIgG-STD1-2e12多价结合蛋白显示以相当于单一特异性SMIP的程度结合，而2e12 LH分子在相同浓度下显示低效结合。
实施例5
多价融合蛋白的各种连接子形式的构建
该实施例描述图6所示表格中所列的不同连接子形式的构建。
CH3-BD2连接子H1至H7的构建
为探究CH3-BD2连接子长度和组成对蝎形分子的表达与结合的影响，设计实验以将现有分子2H7sssIgG1-Lx1-2e12HL与具有不同连接子的更大组类似构建体相比较。使用2H7sssIgG1-Lx1-2e12HL作为模板，使用寡核苷酸表2中所列的引物进行一系列PCR反应，从而形成长度为0至16个氨基酸不等的连接子。所述连接子可构建为核酸片段，所述核酸片段跨越BsrGI位点处的CH3编码区至EcoRI位点处的编码连接子-BD2接点的核酸末端。
表2
表2：用于形成CH3-BD2连接子变异体的引物的序列
图6图示多价结合(融合)蛋白的示意性结构且显示各结合结构域的V区的取向，存在于连接子位置1的序列(仅列出Cys残基)及位于分子的连接子位置2的连接子的序列和识别符。
实施例6
针对2H7-IgG-2e12原型多价融合蛋白的变异体连接子形式的结合及功能研究
该实施例显示对连接子位置2中存在各种连接子(H1-H7)的“原型”2H7-sssIgG-Hx-2e12 VHVL构建体的一系列表达和结合研究的结果。如以上实施例中所述，使用蛋白A亲和层析法，通过分子的大规模COS瞬间转染和纯化来表达所述蛋白中的每一者。接着使经纯化的蛋白经受分析，包括SDS-PAGE、蛋白质印迹法、通过流式细胞术对结合的分析研究及生物活性的功能性测定。
比较不同BD2取向的结合研究
如以上实施例中所述进行结合研究，例外之处在于使用经蛋白A纯化的物质，且对于所研究的各变异体使用恒定量的结合(融合)蛋白，亦即0.72μg/ml。图7显示比较各连接子变异体及2e12取向变异体对于CD20与CD28靶标细胞的结合特性的柱状图。H1-H6是指具有H1-H6连接子及VH-VL取向的2e12的构建体。L1-L6是指具有H1-H6连接子及VL-VH取向的2e12的构建体。数据表明，对2e12具特异性的结合结构域2在以HL取向(样本H1-H6)存在时比以LH取向(样本L1-L6)存在时可更有效地结合。如下一组图所示，发现连接子长度的影响复杂化，复杂之处在于具有较长连接子的分子含有某些单一特异性裂解分子，所述裂解分子在羧基末端缺乏CD28结合特异性。进行其他实验以确定所选连接子的结合，结果显示于图10、12及13中。
纯化的H1-H7连接子变异体的SDS-PAGE分析
由纯化的蛋白等分制备样本，每孔含有8μg蛋白，且添加2X Tris-甘氨酸SDS缓冲剂(Invitrogen)至1X最终浓度。对于还原型样本/凝胶，则将10X还原缓冲剂外加Tris-甘氨酸SDS缓冲剂一起添加至样本中至1X。对10μl SeeBlue标记(Invitrogen,Carlsbad,CA)电泳以提供MW大小标准。使多价结合(融合)蛋白变异体在4-20％Novex Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen,San Diego,CA)上进行SDS-PAGE分析。在95℃加热3分钟后，在还原或非还原条件下使用Novex Tris-甘氨酸SDS样本缓冲剂(2X)装载样本，继而在175V电泳60分钟。使用1X Novex Tris-甘氨酸SDS对缓冲剂(Invitrogen)进行电泳。电泳后，在搅拌下凝胶于库马斯(Coomassie)SDS PAGE R-250染色剂中染色30分钟，且脱色至少一小时。图8显示[2H7-sss-hIgG P238S/P331S-Hx-2e12 VHVL]多价结合(融合)蛋白变异体以及作为对照样本的TRU-015和2e12 HLSMIP的非还原和还原的库马斯染色凝胶。当连接子长度增加时，在约SMIP大小(或52kDa)电泳的蛋白的量增加。此带中蛋白量的增加对应于上面在约90kDa电泳的带中蛋白量的降低。凝胶数据显示全长分子在或邻近连接子处裂解，形成一个缺失BD2区的分子。较小BD2片段不存在，显示(1)连接子序列中的核苷酸序列可能形成一个隐蔽的剪接位点，使该较小片段自剪接的RNA转录物中移除；或(2)蛋白在全长多肽翻译后经蛋白水解方式裂解，该较小的BD2片段不稳定，亦即易受到蛋白水解处理。一些所述分子的蛋白质印迹法分析显示所述蛋白均含有CD20 BD1序列，但该较小的带缺乏CD28 BD2反应性。在任何凝胶或印迹上均未观测到较小带以“裸”scFv大小(25-27kDa)迁移，显示样本中不存在此较小的肽片段。
蛋白质印迹分析BD1和BD2与2H7特异性Fab或CD28mIg的结合
图9显示蛋白质印迹分析2H7-sss-hIgG-H6多价结合(融合)蛋白与各单一特异性SMIP相比的结果。
在非还原条件下进行电泳，且在装载之前不使样本沸腾。电泳后，使用半干式电印迹装置(Ellard,Seattle,WA)将蛋白在100mAmp下转移至PVDF膜历时1小时。在搅拌下，将膜于BLOTTO(PBS中的5％脱脂乳)中阻断隔夜。图9A：在BLOTTO中将膜与5μg/mL的AbyD02429.2(针对2H7抗体的Fab)一起孵育一小时，接着于PBS-0.5％Tween 20中洗涤3次，每次5分钟。接着将膜以0.5μg/ml的浓度于6X His-HRP中孵育一小时。将印迹于PBST中洗涤三次，每次15分钟。将湿膜用ECL溶液孵育1分钟，继而暴露于X-omat膜历时20秒钟。
图9B：将膜于BLOTTO中与10μg/ml的CD28Ig(Ancell,Bayport,MN)一起孵育，接着于PBS-0.5％Tween 20中洗涤三次，每次15分钟。接着将膜以1:3000的山羊抗小鼠HRP结合物(CalTag,Burlingame,CA)孵育于BLOTTO中。将膜洗涤三次，每次15分钟，接着于ECL溶液中孵育1分钟，继而暴露于X-omat膜历时20秒钟。蛋白质印迹分析结果指示，CD28结合结构域是以多价“单体”组份(该组份在约90kDa下迁移)存在且以更高级别的形式存在。在对于单一SMIP或裸scFv大小片段预期的位置未观测到带迁移。当使用CD20抗遗传型Fab时，检测到SMIP大小的片段，说明存在含有(2H7-sss-hIgG)且缺乏融合蛋白的CD28scFv BD2部分的肽片段。
对所选连接子的结合研究
图10显示对经纯化的2H7-sss-hIgG-Hx-2e12融合蛋白所进行的结合研究的结果。进行结合研究以评估CD20/CD28多特异性结合肽的双特异性结合特性。初始时利用常规技术涂覆WIL2-S细胞。在整块板上使用两倍滴定法(20μg/ml至0.16μg/ml)将CD20/CD28纯化蛋白添加至经接种的板中。亦将TRU-015(结合结构域1的来源)纯化蛋白的两倍连续稀释液(TRU-015的浓度范围为20μg/ml至0.16μg/ml)添加至经接种的板孔中。一个不含蛋白的孔充当本底对照。
将含有蛋白的经接种板在冰上孵育一小时。随后，将所述孔用200μl 1％FBS(于PBS中)洗涤一次。接着向各孔中添加以1:100经FITC(Fc Sp)标记的山羊抗人类抗体且将所述板在冰上再孵育一小时。接着将所述板用200μl 1％FBS(于PBS中)洗涤一次，且将所述细胞再悬浮于200μl 1％FBS中且通过FACS分析。
为评估抗-CD28肽2E12VHVL的结合特性，将表达CD28的CHO细胞通过接种于培养板的个别孔中来涂覆。接着使用两倍稀释方案(浓度范围为20μg/ml至0.16μg/ml)将CD20/CD28纯化蛋白添加至个别孔中。再次使用两倍稀释方案(亦即20μg/ml至0.16μg/ml)，将2E12IgGvHvL SMIP纯化蛋白添加至个别接种孔中。一个孔不接收蛋白以提供本底对照。接着将所述板在冰上孵育一小时，用200μl 1％FBS(于PBS中)洗涤一次，且向各孔中添加以1:100经FITC(Fc Sp)标记的山羊抗人类抗体。再将所述板在冰上孵育一小时且随后用200μl1％FBS(于PBS中)洗涤一次。在将所述细胞再悬浮于200μl 1％FBS中之后，进行FACS分析。流式细胞术(FACS)表明经表达的蛋白可结合WIL-2S细胞上所呈递的CD20(参见图10A)且可结合CHO细胞上所呈递的CD28(参考图10B)，从而表明BD1或BD2可具有结合特异性靶标抗原的功能。此外，未发现所用连接子(H1-H6)对结合靶标抗原的亲和力具有显著影响。
SEC分离多价结合(融合)蛋白。在GE Healthcare XK 16/40管柱上，通过蛋白A琼脂糖亲和层析法自细胞培养物上清液中纯化结合(融合)蛋白。在蛋白结合至管柱后，将管柱以dPBS洗涤，接着以1.0M NaCl、20mM磷酸钠(pH 6.0)洗涤，且接着以25mM NaCl、25mNNaOAc(pH5.0)洗涤，以移除非特异性结合蛋白。以100mM甘氨酸(Sigma)(pH 3.5)将所结合的蛋白自管柱中洗脱，且用0.5M 2-(N-吗啉基)乙烷磺酸(MES)(pH 6.0)使其pH值达到5.0。利用常规技术将蛋白样本浓缩至25mg/ml，以备GPC纯化。使用GE healthcare XK管柱及Superdex 200制备级(GE healthcare)，在GE Healthcare AKTA Explorer 100Air装置上进行尺寸排阻层析(SEC)。
图12显示的表格概括不同结合(融合)蛋白的SEC分离的结果。随连接子长度增加，溶液中分子的复合物亦增加，使得难以通过HPLC自更高级别形式分离所关注的峰(或POI)。H7连接子似乎可将此大部分复合物在溶液中拆分为更均质的形式，以使得可溶性形式在约172kDa下大部分以单一POI形式迁移。
其他结合研究
对更小子集的多价结合(融合)蛋白进行第二系列实验(参见图12和图13)，此次比较连接子H3、H6及H7。数据表明，与结合CD20相比，结合CD28的程度下降更明显，但当连接子长度增加时，两者均略微下降。此外，数据显示H7连接子对两种抗原均显示最高程度的结合。使用经蛋白A纯化，但未经SEC进一步纯化的多价结合(融合)蛋白获得所述数据，因此溶液中可存在多种形式的分子。结果亦指示，截短形式比实际多价多肽的稳定性更差，因为结合曲线似乎未完全反映溶液中所存在的连接子H6的大量单一特异性形式。
证明单一分子的多特异性结合
进行替代性结合测定(参见图13)，其中用对CD28 BD2具特异性的试剂检测CD20与WIL-2S细胞表面的结合，从而表明同一多特异性结合(融合)蛋白上的BD1与BD2可同时发生与两靶标抗原的结合(参考图12)。该测定证明蛋白的多特异性结合特性。
实施例7
具有替代特异性的BD2的多特异性结合(融合)蛋白的构建
除原型CD20-CD28多特异性结合分子外，可制备具有替代性结合结构域2个区(包括CD37结合结构域和CD3结合结构域)的其他两种形式。亦可制备具有关于[2H7-sss-IgG-Hx/STDx-2e12 HL]多特异性结合(融合)蛋白所述的若干连接子结构域的分子。所述其他多特异性结合(融合)分子的构建描述如下。
抗-CD37结合结构域构建体
表3
表3：用于形成SMIP分子和蝎分子的G28-1抗-CD37结合结构域的寡核苷酸引物。
使用上文表X中的引物，通过PCR将G28-1 scFv(SEQ ID NO:102)转化为G28-1 LHSMIP。将引物23和25与10ng G28-1 scFv组合，使用Platinum PCR Supermix Hi-FidelityPCR混合器(Invitrogen,Carlsbad,CA)于ABI 9700热循环器中扩增VK(30个如下循环：94℃下历时20秒钟、58℃下历时15秒钟、68℃下历时15秒钟)。此PCR产物在VK的5’端具有限制性位点PinAI(AgeI)且在scFv(G4S)3连接子的末端具有NheI。通过在PCR运作中，在与上文VK相同的条件下将引物24和26与10ng G28-1 scFv组合来类似地改变VH。此PCR产物在VH的5’端具有限制性位点NheI且在3’端具有XhoI。由于重要的序列一致性重叠已工程化为引物23和24，因此将VK和VH稀释5倍，接着以1:1比率使用侧翼引物25和26添加至PCR且通过将68℃持续时间由15秒钟延长至45秒钟来如上扩增全长scFv。此PCR产物代表整个G28-1 scFv作为PinAI-XhoI片段，且可通过MinElute管柱(Qiagen)纯化来纯化以移除过量引物、酶及盐。将洗脱物在37℃下于50μL体积的1X H缓冲剂(Roche)中用PinAI(Invitrogen)和XhoI(Roche)消化4小时直至完成。接着将经消化的PCR产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，将片段自凝胶中移除且使用缓冲剂QG在MinElute管柱上再纯化，且伴随间歇性混合将凝胶-缓冲剂混合物在50℃下孵育10分钟以溶解琼脂糖，之后如同引物移除后PCR在管柱上进行纯化。将3μL经PinAI-XhoI消化的G28-1LH与1μL经PinAI-XhoI消化的pD18-n2H7sssIgG1 SMIP及5μL2X LigaFast连接缓冲剂(Promega,Madison,WI)及1μL T4DNA连接酶(Roche)组合成10μL反应物，充分混合且在室温下孵育10分钟。接着利用制造商方案将3μL该连接物转化到感受态TOP 10(Invitrogen)。将所述转化体涂覆于具有100μg/ml羧苄西林(Teknova)的LB琼脂板上且在37℃下孵育隔夜。培养18小时后，拣选菌落且接种于深孔型96孔板中的含有100μg/ml羧苄西林的1ml T-Broth(Teknova)中，且在37℃震荡恒温箱中培养隔夜。培养18至24小时后，使用QIAprep 96Turbo试剂盒(Qiagen)在BioRobot8000(Qiagen)上自各隔夜培养物中分离DNA。接着自各克隆取10μL，于1X B缓冲剂中以15μL的反应体积用HindIII和XhoI限制性酶消化。将经消化的DNA在1％琼脂糖E-凝胶(Invitrogen,CA)上电泳以供限制性位点分析。对含有适当大小的HindIII-XhoI片段的克隆进行序列验证。通过使用上文表X中的引物29、30、31和32将PinAI位点安置于5’端且使(G4S)4连接子端接于G28-1VH的Nhe I位点，以类似方式来构建G28-1HL SMIP。使用表X中的引物33和34通过PCR来改变VK，以便将NheI位点引入VK的5’端且将XhoI引入3’端。接着将所述PCR如上组合且用侧翼引物29和34扩增以产生VH-VL取向的完整G28-1scFv DNA，恰如同G28-1LH SMIP将其克隆至经PinAI-XhoI消化的pD18-(n2H7)sssIgG1 SMIP中。
2H7sssIgG1-STD1-G28-1 LH/HL构建体
使用G28-1 LH及G28-1 HL SMIP作为模板，通过PCR改变LH和HL抗-CD37结合结构域，以使得其侧翼限制性位点与蝎形分子盒相容。使用引物27(LH)或36(HL)将EcoRI位点引入各scFv的5’端，且使用引物28(LH)或35(HL)将终止密码子/XbaI位点引入3’端。将所得DNA克隆至经EcoRI-XbaI消化的pD18-2H7sssIgG-STD1中。
2H7sssIgG1-Hx-G28-1 HL构建体
将2H7sssIgG1-Hx-2e12 HL DNA与BsrGI和EcoRI及由IgG1的C-末端与连接子组成的325bp片段一起消化。通过使用BsrGI-EcoRI移除STD1连接子将所述物用2H7sssIgG1-STD1-G19-4 HL中的等效区取代，且将其用2H7sssIgG1-Hx-2e12 HL克隆中的对应连接子置换。
抗-CD3结合结构域构建体
表4
表4：用于形成G19-4 scFv序列的抗-CD3结合结构域的寡核苷酸。
通过如上所述延长重叠寡核苷酸引物来合成G19-4结合结构域。轻链PCR是以两步骤进行，起始为将浓度分别为5μM、10μM、20μM和40μM的引物43/44、42/45、41/46和40/47于Platinum PCR Supermix Hi-Fidelity中组合进行如下的30个循环：94℃下历时20秒钟、60℃下历时10秒钟、68℃下历时15秒钟。将1μL所得PCR产物利用相同的PCR条件(例外之处为将68℃持续时间增加至25秒钟)，使用39/48(10μM)、38/49(20μM)和37/50(40μM)的引物混合物(对于LH取向)或66/67(40μM)的引物混合物(对于HL取向)再扩增。具有LH取向的VK在5’端由PinAI结合且在3’端由NheI结合，而具有HL取向的VK在5’端由NheI结合且在3’端由XhoI结合。
为合成重链，通过在第一PCR步骤将引物56/57、55/58、54/59和53/60组合来制备具有与上文相同浓度的引物混合物。在第二PCR中，利用与轻链的第二PCR相同的PCR条件以来自第一PCR的1μl来扩增引物52/61(20μM)和51/62(50μM)，以形成在5’端具有NheI且在3’端具有XhoI的LH取向。在第二PCR中，将引物52/61(10μM)、63/64(20μM)、63(20μM)/65(40μM)和63(20μM)/5(80μM)与来自前一PCR的1μL组合，以形成在5’端具有PinAI且在3’端具有NheI的HL取向的重链。如同上述构建体，将充足重叠设计为以NheI位点为中心的引物，以便通过将具有LH取向的重链及轻链PCR组合且用侧翼引物37和62再扩增来合成G19-4LH，且通过将HL PCR组合且用引物63和67再扩增来合成G19-4HL。
将全长G19-4 LH/HL PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳来分离，自凝胶中切除且用如上所述的Qiagen MinElute管柱纯化。接着将所述DNA经TOPO克隆至pCR2.1(Invitrogen)中，转化到TOP10，且将菌落首先通过EcoRI片段大小筛检，接着通过DNA测序筛检。接着经由PinAI-XhoI将G19-4 LH/HL克隆至pD18-IgG1中以便在哺乳动物细胞中表达。
2H7sssIgG1-STD1-G19-4 LH/HL构建体
使用G19-4 LH和G19-4 HL SMIP作为模板，通过PCR改变LH和HL抗-CD3结合结构域，以使得其侧翼限制性位点与蝎形分子盒相容。使用引物27(LH)或36(HL)将EcoRI位点引入各scFv的5’端，且使用引物28(LH)或35(HL)将终止密码子/XbaI位点引入3’端。将所得DNA克隆至经EcoRI-XbaI消化的pD18-2H7sssIgG-STD1中。
2H7sssIgG1-Hx-G19-4 HL构建体
将2H7sssIgG1-Hx-2e12 HL DNA与BsrGI和EcoRI及由IgG1的C-末端与连接子组成的325bp片段一起消化。通过使用BsrGI-EcoRI移除STD1连接子将所述物用2H7sssIgG1-STD1-G19-4 HL中的等效区取代，且将其用2H7sssIgG1-Hx-2e12 HL克隆中的对应连接子置换。
考虑本文中所揭示的各种多价结合蛋白后可显而易见易组合形成本发明的分子的所述分子的特征。该特征包括结合结构域1、恒定亚区(包括铰链或铰链样结构域)、连接子结构域及结合结构域2。所述新颖结合蛋白设计中的固有模组化使得本领域技术人员可直接在任何所要模组的N-末端和/或C-末端操控DNA序列，以使得该序列可***几乎任何位置以形成显示与其所来源的亲本分子相比经修改或增强的功能性的新颖分子。例如，涵盖源自免疫球蛋白超家族的成员的任何结合结构域作为本发明的分子的结合结构域1或结合结构域2。所述所衍生的结合结构域包括：具有与免疫球蛋白超家族成员的序列一一对应的氨基酸序列及甚至编码聚核苷酸序列的结构域，以及与免疫球蛋白超家族成员优选共有80％、90％、95％、99％或99.5％序列一致性的变异体及衍生物。所述结合结构域(1及2)优选经由如本文中其他处所述的具有不同序列及长度的连接子与本发明分子的其他模组相连接，其限制条件为所述连接子足以提供分子达成功能性三级结构所必需的任何空间及柔性。多价结合蛋白的另一模组为铰链区，其不仅可对应于免疫球蛋白超家族成员的铰链区，而且可为其变异体，诸如本文中所述的“CSC”或“SSS”铰链区。此外，恒定亚区包含本发明的蛋白的模组，其可对应于免疫球蛋白超家族成员的恒定区的亚区，如铰链-CH2-CH3恒定亚区的结构所说明。亦涵盖恒定亚区的变异体及衍生物，其优选具有与免疫球蛋白超家族成员共有80％、90％、95％、99％或99.5％序列一致性的氨基酸序列。
具有所述分子特征的例示性一级结构显示于表5中，其揭示说明性结合结构域1和2的聚核苷酸和同源氨基酸序列，以及恒定亚区的一级结构(包括铰链或铰链样结构域)及可***例如多价结合蛋白的恒定亚区的C-末端与结合结构域2区的N-末端之间的连接子。本发明分子的其他范例包括上述特征，其中例如结合结构域1与结合结构域2中的任一者或两者包含源自免疫球蛋白超家族成员的VL或VL样结构域及源自免疫球蛋白超家族的相同或不同成员的VH或VH样结构域的结构域，所述结构域可由如本文中所揭示的任何连接子所代表的连接子隔开。涵盖其中所述结构域中BD1和/或BD2的取向为VL-VH或VH-VL的分子。具有本发明的多价结合分子的各种特征的一级结构的更完整表示是存在于本公开结尾所附的表格中。本发明进一步包括编码所述分子的聚核苷酸。
表5
表5：具有多价结合分子的例示性特征的一级结构(聚核苷酸和同源氨基酸序列)
实施例8
对替代多特异性融合蛋白的结合及功能研究
对上述其他多价结合分子的每一者进行与上述原型CD20-IgG-CD28多特异性结合(融合)分子的实验的平行实验。一般而言，所述其他分子所获得的数据与对于原型分子所观测的结果类似。所述实验的某些显著结果揭示于下文中。图14显示对新颖分子中的一者所进行的阻断研究的结果，其中BD1与BD2均结合相同细胞或细胞类型上的靶标抗原(在此情况下为CD20与CD37)。该多特异性多价结合(融合)蛋白经设计为具有结合CD20的结合结构域1(2H7；VLVH取向)及结合CD37的结合结构域2(G28-1 VL-VH(LH)或VH-VL(HL))。进行所述实验旨在证明蛋白的多特异性特性。
阻断研究：将Ramos或BJAB B淋巴母细胞样细胞(2.5x105)与鼠抗-CD20(25μg/ml)抗体或鼠抗-CD37(10μg/ml)抗体一起于染色培养基(具有2％小鼠血清的PBS)中于96孔V形底板中预孵育，一起或单独将染色培养基在黑暗中置于冰上历时45分钟。将阻断抗体与细胞一起在室温下预孵育10分钟，之后以指定浓度范围(一般为0.02μg/ml至10μg/ml)添加多特异性结合(融合)蛋白，且在黑暗中于冰上再孵育45分钟。将细胞于染色培养基中洗涤2次，且于染色培养基中在冰上与Caltag(Burlingame,CA)FITC山羊抗人类IgG(1:100)一起孵育一小时，以检测多特异性结合(融合)蛋白与细胞的结合。接着将细胞用PBS洗涤2次且用1％三聚甲醛(目录号第19943号，USB,Cleveland,Ohio)固定。使用FACsCalibur仪器及CellQuest软件(BD Biosciences,San Jose,CA)通过流式细胞术分析细胞。各数据组描绘2H7-sss-hIgG-STD1-G28-1 HL融合蛋白在CD20、CD37或CD20与CD37二者阻断抗体存在下的结合。虽然该实验使用裂解连接子中的一者，但两阻断抗体的存在完全排除与多特异性结合(融合)蛋白的结合，此证明大多数分子对CD20与CD37具有结合功能。在图A和图B中对两种细胞系Ramos与BJAB测试的数据类似，其中CD20阻断抗体比CD37阻断抗体更有效地降低所观测的与多特异性结合(融合)蛋白结合的程度。
ADCC测定
图15显示对CD20-CD37多特异性结合(融合)蛋白进行的ADCC测定的结果。使用BJAB淋巴母细胞样B细胞作为靶标及人类PBMC作为效应细胞来进行ADCC测定。在37℃下，在IMDM/10％FBS中，将BJAB细胞用500μCi/ml 51Cr铬酸钠(250μCi/μg)标记2小时。将经标记的细胞于RPMI.10％FBS中洗涤三次且以4×105个细胞/毫升再悬浮于RPMI中。肝素化人类全血是获自匿名实验室供者，且经由淋巴细胞分离介质(LSM,ICN Biomedical)梯度通过分级分离来分离PBMC。收获血沉棕黄层(Buffy coats)且于RPMI/10％FBS中洗涤两次，之后以5×106个细胞/毫升的最终浓度再悬浮于RPMI/10％FBS中。在用于后续测定之前，通过锥虫蓝排除法使用血球计对细胞进行计数。将试剂样本以最终浓度4次添加至具有10％FBS的RPMI培养基中，且对各试剂制备三份10倍连续稀释液。接着将所述试剂以50微升/孔添加至96孔U型底板中直至所指示的最终浓度。将经51Cr标记的BJAB细胞以50微升/孔(2×104个细胞/孔)添加至板中。接着将PBMC以100微升/孔(5×105个细胞/孔)添加至板中，使得效应物(PBMC)：靶标(BJAB)的最终比率为25:1。将效应物及靶标添加至单纯培养基中以测量本底杀死率。将经51Cr标记的细胞添加至单纯培养基中以测量51Cr的自发释放率且添加至具有5％NP40(目录号第28324号，Pierce,Rockford,IL)的培养基中以量测51Cr的最大释放率。在96孔板的孔中重复三次进行反应。将多特异性结合(融合)蛋白以0.01μg/ml至10μg/ml范围内的最终浓度(如图所示)添加至孔中。各数据组描绘所述滴定范围内的不同多特异性结合(融合)蛋白或对应单一特异性SMIP。在收获及计数之前，使反应在37℃下、在5％CO2中进行6小时。接着将来自各孔的25μl上清液转移至Luma Plate 96(目录号第6006633号，PerkinElmer,Boston,Mass)中且在室温下干燥隔夜。在Packard TopCounNXT上测量所释放的CPM。通过减去(样本的cpm{三份样本的平均值}-cpm自发释放率)/(cpm最大释放率-cpm自发释放率)x100来计算特异性杀死百分率。以特异性杀死％相对蛋白浓度对数据作图。所述数据证明多特异性结合(融合)蛋白能够介导抵抗表达一个或多个靶标抗原的细胞的ADCC活性以及SMIP对CD20和/或CD37的单一特异性，但未显示此效应功能程度的增加。
共培养实验
图16显示着眼于此类型多特异性结合(融合)蛋白的其他特性所设计的实验的结果，其中通过经两个所结合的表面受体信号传导/结合，使两个抵抗靶标的结合结构域在相同细胞或细胞类型上得以表达可产生协同效应。使用如上文关于ADCC测定所述分离的PBMC进行共培养实验。将所述PBMC以2x106个细胞/毫升，以500微升/孔的最终体积再悬浮于培养基中，且单独培养，或使用H7连接子[2H7-sss-IgG-H7-G28-1HL]与CD20、CD37、CD20+CD37或多特异性结合(融合)蛋白的单一特异性SMIP一起孵育。以20μg/ml的最终浓度添加各测试试剂。培养24小时后，未观察到培养物中B细胞的％有实际差异；然而，当所述细胞经受流式细胞术时，在含有多特异性结合(融合)蛋白的培养物的FWD X 90染色图案中可见细胞团块，此说明表达该两个靶标抗原的B细胞参与同型粘附。培养72小时后，多特异性结合(融合)蛋白使所存在的几乎所有B细胞死亡。两种单一特异性SMIP的组合亦剧烈降低B细胞的百分率，但对于多特异性结合分子未见该量下降。所述数据表明，将CD20的结合结构域与CD37的结合结构域均加在同一多特异性分子上，可使B细胞之间产生同型粘附，且亦可使CD20与CD37抗原结合相同细胞。尽管不希望受理论束缚，但清除靶标细胞的协同效应可归因于(1)经由结合结构域1及2结合相同细胞类型；和/或(2)在PBMC培养物中，多价结合分子的效应功能结构域(恒定亚区)与单核细胞或其他细胞类型相互作用，使得杀死延迟。此杀死效应的动力学速度不快，完成需要24小时以上，说明其可为次级效应，需要产生细胞因子或其他分子后再观测所述效应。
细胞凋亡测定
图17显示为探究在用[2H7-sss-hIgG-H7-G28-1 HL]多特异性多价结合(融合)蛋白或单一特异性CD20和/或CD37 SMIPS单独及相互组合处理B细胞系后诱导细胞凋亡所设计的实验的结果。在37℃下，在5％CO2中，在具有10％FBS及5μg/ml、10μg/ml或20μg/ml融合蛋白的Iscoves(Gibco)完全培养基中，将Ramos细胞(图A；ATCC第CRL-1596号)及Daudi细胞(图B；ATCC第CCL-213号)以3×105个细胞/毫升孵育隔夜(24小时)。若以单一特异性SMIP进行组合实验，则所述蛋白是以如下浓度使用：TRU-015(针对CD20的SMIP)＝10μg/ml，G28-1LH(针对CD37的SMIP)＝5μg/ml。或者，将20μg/ml的TRU-015与10μg/ml的G28-1 LH组合。接着使用BD Pharmingen细胞凋亡检测试剂盒(目录号第556547号)将细胞用膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)及碘化丙啶染色且根据试剂盒说明进行处理。将细胞轻缓地旋转，在黑暗中于室温下孵育15分钟，且于400μl结合缓冲剂中稀释，之后进行分析。在使用CellQuest软件(Becton Dickinson)的FACsCalibur(Becton Dickinson)仪器上通过流式细胞术分析样本。数据以描绘膜联蛋白V/碘化丙啶阳性细胞的百分率相对于处理类型的关系的柱状图来显示。显然，与单一特异性试剂(即使一起使用时)相比，多特异性结合(融合)蛋白对两种细胞系均能够诱导显著更高程度的细胞凋亡。此增强的功能性活性反映BD1和BD2(对CD20和CD37具特异性)受体在靶标细胞上的协调结合相互作用。
实施例9
2H7-hIgG-G19-4多特异性结合(融合)蛋白的结合及功能特性
此实施例描述2H7-hIgG-G19-4多特异性融合蛋白的结合及功能特性。所述分子的构建描述于实施例7中。表达及纯化是如以上实施例中所述。
如对于以上分子如所述进行结合实验，例外之处在于用于测量CD3结合的靶标细胞为在其表面上表达CD3的Jurkat细胞。参考图18，其中顶图显示使用由20μg/ml连续稀释至0.05μg/ml的纯化蛋白，关于CD20-CD3多特异性分子结合Jurkat细胞所获得的结合曲线。与LH取向相比，具有HL取向的G19-4与CD3抗原的特异性结合似乎更优。下图显示关于BD1(识别CD20的结合结构域)所获得的结合曲线。所有分子均结合良好且以近似相当于与CD20具单一特异性的SMIP的程度结合。
ADCC测定
对于图19中所显示的数据，如上述实施例中所述进行ADCC测定。在此情况下，融合蛋白均为2H7-hIgG-G19-4变异体或单一特异性SMIP(对CD20具特异性的2H7)或抗体(对CD3具特异性的G19-4)的组合。此外，对于图19中的下图所显示的数据，在使用之前通过使用MACS(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)管柱分离装置及NK细胞特异性CD16磁性微珠粒(目录号第130-045-701号)的磁性珠粒耗尽法自PBMC中耗尽NK细胞。两图中所显示的数据证明，所有CD20-hIgG-CD3多特异性分子均介导ADCC，而与NK细胞是否耗尽或总PBMC是否用于测定无关。对于TRU 015或G19-4与TRU015的组合而言，仅含有NK细胞的培养物可介导ADCC。尽管G19-4可结合表达CD3的NK T细胞且在所示第一测定中活化所述细胞，但在针对BJAB靶标的任一测定中，G19-4均运作不佳，其不表达CD3。在下图中所观测的多特异性结合(融合)蛋白的杀死作用可能是经由与表达CD20抗原的BJAB靶标相反，通过结合CD3来活化T细胞群的细胞毒性来介导。在所用浓度范围内，此杀死活性对于分子的剂量似乎相对不敏感，且甚至在0.01μg/ml的浓度下，仍明显不同于所测试的其他分子。
实施例10
多价结合分子
其他实施方案包括源自免疫球蛋白的连接子结构域。更特定而言，所述连接子的源序列为如下所获得的序列：比较存在于免疫球蛋白超家族的其他成员的V-样结构域之间或存在于V-样结构域与C-样结构域之间的区。因为所述序列通常作为细胞表面受体的细胞外结构域的部分来表达，因此预期其对于蛋白水解裂解更稳定且亦不应具有免疫原性。预期不适用作多价结合(融合)蛋白的连接子，但存在于C-样结构域与跨膜结构域之间的***区中的一种序列类型为在-Ig超家族的表面表达成员上所表达的序列类型。经观测许多所述分子具有可溶性形式且在靠近细胞膜的所述***区裂解，说明所述序列比其余分子更易受裂解影响。
如本文中所述，将上述连接子***单一特异性SMIP中，***结合结构域与效应功能结构域之间，或***多价结合(融合)蛋白的两种可能性连接子位置的一者中。
随附本申请中所揭示的完整序列表，且该序列表以引用方式全文并入本文中。彩色编码指示特定聚核苷酸及多肽中的各种区或结构域的序列适用于鉴别本文中所揭示的任何分子的序列中的对应区或结构域。
实施例11
用于靶向B-细胞的蝎形分子候选者的筛检基质
引言
作为鉴别很可能产生抵抗靶标群体的适用且有效多价结合分子或蝎形分子的成对单克隆抗体结合结构域的组合的方法，在代表各种非霍奇金氏淋巴瘤的抗B细胞系组合基质中对一系列抵抗B细胞抗原的单克隆抗体进行测试。为确保已知或预期结合所关注细胞的抗体的所有可能逐对比较均得以测定，可使用既定细胞类型，使用抗体的二维基质来导引研究设计。已知的根据其簇名称(CD)的抵抗多种B细胞抗原的单克隆抗体记录于左列。将某些所述抗体(依其特异性结合的一个或多个抗原来命名)(亦即CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD30、CD37、CD40、CD70、CD72、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86及CL II(II类MHC))单独或与该单克隆抗体组的其他成员组合而与抗原阳性靶标细胞一起孵育。涵盖所述抗体的可变结构域作为多价结合分子的例示性实施方案中的结合结构域。本领域技术人员利用对本领域的了解及常规程序，能够在例如可公开获得的数据库中鉴别合适的抗体序列(核酸编码序列以及氨基酸序列)，以形成合适抗体或其片段(例如通过基于杂交的克隆、PCR、肽合成法及其类似者)及使用所述化合物构建多价结合分子。如本文中所述的获得结合结构域的例示性抗体的来源提供于表6中。通常将使用可获得抗体链的CDR区的克隆或合成策略，但仍涵盖保留特异性结合靶标抗原的能力的任何抗体、其片段或其衍生物。
更详细的，来自杂交瘤克隆抗体的重链和/或轻链可变区为本领域中的标准。不需要获知所关注可变区的序列以便利用常规克隆技术来获取此区。参见例如Gilliland等人，Tissue Antigens 47(1):1-20(1996)。为制备包含可识别鼠或人类白细胞抗原的可变区的单链多肽，设计一种用于快速克隆及表达的方法，该方法可在从杂交瘤细胞分离RNA的两至三周内产生功能蛋白。可变区是通过poly-G加尾第一链cDNA，继而由前置poly-C锚定引物及对恒定区序列具有特异性的反向引物锚定PCT来克隆。两种引物均含有用于***pUC19内的侧翼限制性核酸内切酶位点。形成用于分离鼠、仓鼠和大鼠VL和VH基因的PCR引物组。在测定特异性VL与VH对的共有序列后，通过编码介入肽连接子(通常编码(Gly4Ser)3)的DNA使VL与VH基因连接，且将VL-连接子-VH基因盒转移至pCDM8哺乳动物表达载体中。将构建体转染至COS细胞中且从条件培养基上清液中回收sFv。该方法已成功用于从产生鼠、大鼠或仓鼠抗体的杂交瘤中形成抗人类CD2、CD3、CD4、CD8、CD28、CD40、CD45的功能性sFv和抗鼠CD3和gp39的功能性sFv。起初，sFv被表达为具有人类IgG1的铰链-CH2-CH3结构域的融合蛋白，以利于使用山羊抗人类IgG试剂或蛋白A进行快速表征及纯化。活性sFv亦可用小肽(例如标记)来表达或以无尾形式来表达。表达CD3(G19-4)sFv无尾形式证明细胞信号传导活性增强且揭示sFv具有活化受体的潜能。
或者，可如下直接实现对单克隆抗体的可变结构域的一级氨基酸序列的鉴别：例如限制抗体的蛋白水解作用，继而例如使用Edman降解方法或通过断裂质谱法进行N-末端肽测序。N-末端测序方法已为本领域中所熟知。在测定可变结构域的一级氨基酸序列后，通过合成性核酸合成方法(例如PCR)，继而通过scFv形成法来组装编码该序列的cDNA。所述必需或优选核酸操控方法为本领域中的标准。
亦涵盖如上所述的抗体的片段、衍生物及类似物作为合适的结合结构域。此外，涵盖上述任何恒定亚区，包括包含上述任何铰链区的恒定亚区。此外，该实施例中所述的多价单链结合分子可包括本文中所述的任何或全部连接子。
初始使单克隆抗体暴露于细胞且接着使用山羊抗小鼠第二步抗体交联(第2步)。任选地，可在使细胞与抗体接触之前使抗体交联(例如通过在溶液中使抗体交联)。作为另一替代性方法，可如下使单克隆抗体以固相交联：通过吸附至组织培养孔的塑料底层上或藉助于吸附至塑料的山羊抗小鼠抗体而“截留”于该塑料上，继而通过基于孔板的测定来评估例如生长中断或细胞存活。
磷脂酰基丝氨酸经由细胞膜的胞质侧逆转至此质膜的外部细胞表面为促细胞凋亡事件的可接受指标。进展至细胞凋亡导致细胞膜完整性丧失，此可通过细胞不透性***染料(例如碘化丙啶(PI))的进入来检测。在细胞暴露于单独或组合的单克隆抗体后，进行双重促细胞凋亡测定，且对经处理的细胞群就细胞表面阳性膜联蛋白V(ANN)和/或PI包涵物方面进行评分。
膜联蛋白V结合/碘化丙啶内化分析
细胞和细胞培养条件。实验旨在检测使抵抗所表达的靶标的两种不同单克隆抗体交联对四种人类B-细胞系的影响。通过测定暴露后ANN和/或PI染色的程度来测量对细胞系的影响。在37℃下，在5％CO2中，在具有10％FBS的Iscoves(Gibco)完全培养基中将人类B细胞系BJAB、Ramos(ATCC#CRL-1596)、Daudi(ATCC#CCL-213)及DHL-4(DSMZ#ACC495)孵育24小时。研究之前，使细胞密度维持在2×105至8×105个细胞/毫升且存活率通常>95％。
以2×105个细胞/毫升的细胞密度及2μg/ml的各比较单克隆抗体，经由抵抗B-细胞抗原的基质来进行实验。各比较单克隆抗体是以2μg/ml单独添加，或亦以2μg/ml个别地与各基质单克隆抗体组合添加。表6列出所述实验中所用的单克隆抗体的目录号及来源。对于使所述单克隆抗体在溶液中交联而言，则将山羊抗小鼠IgG(Jackson Labs目录号第115-001-008号)以2:1的浓度比(山羊抗小鼠抗体:各单克隆抗体)添加至各孔中，例如，仅具有一种单克隆抗体(2μg/ml)的孔中可添加有最终浓度为4μg/ml的山羊抗小鼠抗体，而具有比较单克隆抗体(2μg/ml)与来自基质的单克隆抗体(2μg/ml)的孔中可添加有8μg/ml的山羊抗小鼠抗体。
细胞在37℃下于5％CO2中孵育24小时后，使用BD Pharmingen膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒I(#556547)，将其用膜联蛋白V-FITC及碘化丙啶染色。简而言之，将细胞用冷PBS洗涤两次且以1×106个细胞/毫升再悬浮于“结合缓冲剂”中。接着将100微升于结合缓冲剂中的细胞用5μl膜联蛋白V-FITC及5μl碘化丙啶染色。将细胞轻缓地混合且在室温下于黑暗中孵育15分钟。接着将400微升结合缓冲剂添加至各样本中。接着在FACsCalibur(Becton Dickinson)上对样本读数且使用Cell Quest软件(Becton Dickinson)进行分析。
表6
表6：该研究中所使用的抵抗B细胞抗原的抗体及其来源。
将交联抗体(例如山羊抗小鼠抗体)添加至单独的单克隆抗体A中使得细胞敏感性增强，说明用识别相同抗原的两个结合结构域所构建的多价结合分子或蝎形分子可有效增强细胞敏感性。不希望受理论束缚，此敏感性增强可归因于抗原聚集及经修改的信号传导。TNF受体家族成员例如需要同型多聚化以便信号转导，且在分子各端具有等效结合结构域的蝎形分子可促进此相互作用。CD40的聚集及随后的信号传导为该现象在B细胞***的实例。
如图20、21和22中所示，添加抵抗不同抗原的单克隆抗体A和单克隆抗体B可对经处理的细胞产生加成的促细胞凋亡效应，或在某些组合中产生大于加成(亦即协同)的促细胞凋亡效应。在图20中，例如，抗-CD20与抵抗其他B细胞抗原的单克隆抗体的组合均可使细胞敏感性得到不同程度的增强。然而，某些组合(诸如抗-CD20与抗-CD19的组合，或抗-CD20与抗-CD21的组合)产生大于加成的促细胞凋亡效应，说明由所述结合结构域组成的多价结合分子或蝎形分子可特别有效地清除转化的B细胞。参考图20，当暴露于单独的抗-CD 20抗体时，显示促细胞凋亡活性的细胞的百分比为约33％(对应于“20”的垂直条形柱，亦即抗-CD20抗体)；暴露于抗-CD19抗体时，促细胞凋亡细胞的百分比为约12％(图20中对应于“19”的垂直条形柱，亦即抗-CD19抗体)；且暴露于抗-CD20与抗-CD19抗体时，促细胞凋亡细胞的百分比为约73％(图20中对应于“19”的水平条形柱)。在暴露于两种抗体后，促细胞凋亡细胞为73％，显著大于各单独抗体所产生的效应总和45％(33％+12％)，说明抗-CD19与抗-CD20抗体对可产生协同效应。适用的多价结合分子包括其中两个结合结构域可对B-细胞行为产生加成效应的分子以及其中两个结合结构域可对B-细胞行为产生协同效应的多价结合分子。在某些实施方案中，一个结合结构域将对所测量的细胞行为参数不具有可检测的影响，其中成对结合结构域中的每一者促成多价结合分子活性的不同方面，诸如多特异性多价结合分子(例如结合结构域A结合靶标细胞且促进细胞凋亡，而结合结构域B结合可溶性治疗剂，诸如细胞毒素)。视多价结合分子的设计而定，两个结合结构域对靶标细胞产生的组合效应的类型(加成、协同或抑制效应)可不相关，此是因为结合结构域中的一者可对非细胞性(例如可溶性)结合伙伴具特异性或对细胞相关性结合伙伴具特异性，而对不同细胞类型却并非如此。
产生加成、协同或抑制效应的例示性结合结构域配对(如图20-23中所示)由表7和表8显而易见。表7提供自图20-23各图中所提取的关于ANN和/或PI染色呈阳性的细胞的百分比的定量数据。表8提供利用表7的数据所计算的数值，基于所述数值可判定给定抗体对的相互作用是否产生加成、协同或抑制效应，又如依据ANN和/或PI染色呈阳性的细胞的百分比所评估。
表7
*表7的第2-4列中的数值分别反映图20-22中的直方图柱的高度，各细胞的第一数值表示垂直条形柱的高度，第二数值表示水平条形柱的高度，且第三数值(若存在)反映点画柱的高度。在第5列中，第一数值反映实心柱的高度且第二数值反映图23中的斜纹柱的高度。
表8
“A”意谓观测到“加成”效应；
“S”意谓观测到“协同”效应；
“I”意谓观测到“抑制”效应；
*示意性方程式：A+B＝C，其中“A”为因基质抗体单独所致的ANN和/或PI阳性细胞百分比，“B”为因共同抗体(图20为抗-CD20、图21为抗-CD79b、图22为抗-CLII和图23为抗-CD22)所致的ANN和/或PI阳性细胞百分比，且“C”为预计加成效应。(参见以上表7中与图20-23对应的定量数据)。若单元格中存在两个方程式，则上方程式反映使用较高指示浓度的共同抗体所得的结果；下方程式反映使用较低指示浓度的共同抗体所得的结果。
在某些实施方案中，两个结合结构域在敏化(或去敏化)靶标细胞(诸如B细胞)中以抑制、加成或协同方式相互作用。图23显示将抗-CD22抗体与强促细胞凋亡单克隆抗体(诸如抗-CD79b抗体或抗-MHC II类(亦即抗-CL II)抗体)组合所产生的保护或抑制效应。例如，图23和表7显示，单独抗-CD22抗体诱导不超过约10％的细胞显示促细胞凋亡行为(图23中对应于“22”的实心柱)且抗-CD79b诱导约26％的促细胞凋亡细胞(图23中对应于“CD79b”的实心柱)。然而，抗-CD22与抗-CD79b的组合诱导仅约16％的促细胞凋亡细胞(图23中对应于“79b”的斜纹柱)。因此，所组合的抗体诱导16％的促细胞凋亡细胞，其小于抗-CD22(12％)和抗-CD79b(26％)单独所产生的效应的总和38％。利用此方法检验图23和/或表7-8揭示，抗-CD22抗体和经由延长包含抗-CD22结合结构域的多特异性多价结合分子，在与以下各抗体(或对应结合结构域)独立组合使用时将获得抑制性总体效应：抗-CD19、抗-CD20、抗-CD21、抗-CD23、抗-CD30、抗-CD37、抗-CD40、抗-CD70、抗-CD72、抗-CD79a、抗-CD79b、抗-CD80、抗-CD81、抗-CD86和抗-MHC II类抗体/结合结构域。
不希望受理论束缚，所述数据可作如下解释：说明抗-CD22抗体或包含抗-CD22结合结构域的多特异性多价结合分子可防止或缓和上文刚列出的任何抗体效应。更一般而言，包含抗-CD22结合结构域的多特异性多价结合分子将抑制与CD19、CD20、CD21、CD23、CD30、CD37、CD40、CD70、CD72、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86和MHC II类分子中任一者相互作用所产生的效应。在图23和表8中可见，抗-CD22抗体和经由延长结合结构域(包含抗-CD22结合结构域)将起抑制或缓和识别B-细胞表面标志物(诸如CD抗原)的任何抗体/结合结构域的活性的作用。预期多价结合分子(包括多特异性多价结合分子)适用于各种疾病的改进治疗方案中，其中需要减弱或控制结合结构域的活性。
除与靶标细胞相互作用的两个结合结构域通常经由细胞表面配体的结合产生抑制、加成或协同组合效应外，本文中所揭示的实验结果证明，给定的结合结构域对可依据两个结合结构域的相对浓度而提供不同类型的组合效应，从而增强本发明的通用性。例如，表8揭示，抗-CD21与抗-CD79b在抗-CD79b的测试浓度较高时以抑制方式相互作用，但在抗-CD79b的测试浓度较低时，该两种抗体以协同方式相互作用。尽管某些实施方案将使用单一类型的多价结合分子，亦即包含例如单一CD21结合结构域和单一CD79b结合结构域的单特异性多价结合分子，但本发明包括多价结合分子的混合物，所述混合物将使得可调整相对结合结构域浓度以达成所要效应，诸如抑制、加成或协同效应。此外，本发明的方法包含将单一多价结合分子与另一种结合分子(诸如常规抗体分子)组合使用以调整或优化结合结构域的相对浓度。本领域技术人员将能够利用标准技术(例如通过设计两组实验性连续稀释基质，每一结合结构域使用一组)来测定结合结构域的适用相对浓度。
不希望受理论束缚，应了解，一个配体的结合可诱导或调节第二配体在相同细胞类型上的表面表达，或其可改变第二配体的表面环境从而改变其与特异性结合分子(诸如抗体或多价结合分子)结合的敏感性。
尽管本文中以使用B细胞系和抗原为例，最佳测定有效多价结合分子(亦即蝎形分子)的所述方法适用于其他疾病背景和靶标细胞群体，包括其他正常细胞、其异常细胞对应物，包括慢性刺激性造血细胞、癌细胞及感染细胞。
在筛检单克隆抗体组合的直接效应的方法中，亦可使用其他信号传导表型(诸如Ca2+移动；酪氨酸磷酸化调节；半胱天冬酶(caspase)活化；NF-κB活化；细胞因子、生长因子或趋化因子加工；或基因表达(例如在报道基因***中))。
作为使用二级抗体以使一级抗体交联和模拟多价结合分子或蝎形分子结构的替代例，可使用结合抗体的Fc部分的其他分子(包括可溶性Fc受体、蛋白A、补体组份(包括C1q)、甘露糖结合凝集素、含有反应剂或交联剂的珠粒或基质、双官能化学交联剂及塑料吸附剂)使抵抗相同或不同抗原的多种单克隆抗体交联。
实施例12
具有效应功能或蝎形分子的结构的多价结合蛋白
蝎形多肽的一般示意性结构为H2N-结合结构域1-蝎形连接子-恒定亚区-结合结构域2。蝎形分子亦可具有安置于结合结构域1的N-末端的铰链样区，通常为源自抗体铰链的肽区。在某些蝎形分子实施方案中，结合结构域1和结合结构域2是各自源自免疫球蛋白结合结构域，例如源自VL和VH。VL与VH通常经连接子连接。实验旨在证明，蝎形多肽可具有不同于免疫球蛋白结合结构域的结合结构域，包括蝎形分子结合结构域所来源的Ig结合结构域，不同之处在于氨基酸序列差异，导致相对于来源Ig结合结构域通常小于5％且优选小于1％的序列趋异。
通常，序列差异导致单一氨基酸变化，诸如取代。所述氨基酸变化的优选位置位于所对应的蝎形分子结合结构域的一或多个区中，或显示与该蝎形分子结合结构域所来源的Ig结合结构域的Ig互补性决定区(CDR)至少80％且优选85％或90％的序列一致性。通过比较肽结合相同靶标(诸如CD20)的模型来提供进一步指导。相对于CD20，表位图谱已揭示，结合CD20的2H7抗体可识别CD20的Ala-Asn-Pro-Ser(ANPS)基序，且预期结合CD20的蝎形分子亦可识别该基序。将ANPS基序深埋入由蝎形分子结合结构域区(对应于Ig CDR)所形成的袋囊中所致的氨基酸序列变化预期为CD20的功能性结合剂。模型研究亦已揭示，对应于CDR3(VL)、CDR1-3(VH)的蝎形区接触CD20，且预期维持或促成所述接触的变化可产生结合CD20的蝎形分子。
除促进蝎形分子与其靶标的相互作用外，涵盖蝎形分子结合结构域中促进对应于Ig VL和VH结构域的蝎形分子结合结构域区之间相互作用的序列变化(相对于同源Ig结合结构域序列)。例如，在对应于VL的结合CD20的蝎形分子区中，序列SYIV可通过用氨基酸(诸如His)取代Val(V33)而改变，产生序列SYIH。此变化预期可改良对应于VL和VH结构域的蝎形分子区之间的相互作用。此外，预期在对应于VH-CDR3的蝎形分子区的N-末端添加残基将改变此蝎形分子区的取向，这可能影响其结合特征，因为VH-CDR3的N-末端Ser与CD20接触。常规测定揭示那些取向可使结合特征产生所要变化。亦预期，对应于VH-CDR2和/或VH-CDR3的蝎形分子区中的突变将形成与靶标(诸如CD20)的潜在新颖接触。例如，基于模型研究，预期取代对应于VH-CDR3的区中的Y105和W106(存在于序列NSYW中)中任一个将以易经受常规测定的方式改变蝎形分子的结合特征以用于鉴别具有经修饰结合特征的蝎形分子。另外例如，预期对应于Ig VL-CDR3的蝎形分子结合结构域的序列(诸如序列CQQW中的Trp(W))的改变将影响结合。通常，对于对靶标显示增强亲和性的那些蝎形分子，筛检对应于Ig CDR的蝎形分子区中的改变。
基于人源化CD20scFv结合结构域20-4的模型结构，基于与CD20细胞外环结构相关的***息(Du等人，J Biol.Chem.282(20):15073-80(2007))，且基于由小鼠2H7抗体(其为人源化20-4 scFv结合结构域的CDR的来源)所识别的CD20结合表位，在2Lm20-4x2Lm20-4蝎形分子的CDR区中进行工程化突变，以便改良其与CD20结合的亲和性。首先，设计可影响20-4CDR构型和促进与CD20细胞外环更有效结合的突变。其次，设计可在2Lm20-4x2Lm20-4蝎形分子与其靶标之间提供新型分子间相互作用的引入式变化。所述突变包括：VL CDR1V33H(亦即在VL区的CDR1的位置33处用His取代Val)、VL CDR3 W90Y、VH CDR2 D57E、VHCDR3在残基S99后***V、VH CDR3 Y101K、VH CDR3 N103G、VH CDR3 N104G及VH CDR3Y105D。由于预期将某些所述突变组合可产生协同效应，因此设计如表9中所示的将不同突变组合的11种突变体(由突变引入的残基字体加粗且加下划线)。
表9
使用编码改变的序列区的引物，通过PCR诱变将突变引入CD20xCD20蝎形分子(2Lm20-4x2Lm20-4)的结合结构域中。序列验证后，将编码具有对应突变的2Lm20-4 scFv片段的DNA片段克隆至含有蝎形分子的恒定亚区的编码区的常规表达载体中，从而产生含有新型2Lm20-4x2Lm20-4蝎形分子的完整DNA序列的聚核苷酸。具有CDR突变的2Lm20-4x2Lm20-4蝎形分子的变异体是通过在瞬间COS细胞***中表达而产生，且经由蛋白A及尺寸排阻(SEC)层析法纯化。使用初级B-细胞和WIL2-S B-淋巴瘤细胞系，通过FACS分析来评估2Lm20-4x2Lm20-4蝎形分子变异体的结合特性。
亦已使用类似方法形成其他突变体以优化CD20结合结构域。命名为TRU015的CD20SMIP充当形成突变体的底物，且除非相反说明，否则所有结构域均为人类结构域。发现以下突变体含有适用的功能性CD20结合结构域。018008分子在VL中的CDR1的位置27处含有取代S的Q(单字母氨基酸编码)，在VH的CDR1中的位置28处含有取代T的S且在VH的CDR3中的位置102处含有取代V的L。依照蝎形分子的模组化设计，将以下对应于IgG1铰链中的CCCP序列的部分蝎形连接子序列独立地与突变的VL和VH组合：CSCS、SCCS和SCCP。018009分子在VL的CDR1的位置27处含有取代S的Q，在VH的CDR1的位置28处含有取代T的S，且在VH的CDR3中，在位置96处含有取代V的S、在位置102处含有取代V的L且在位置95处缺失V。018009中使用上述与018008中所使用的蝎形连接子中所发现的相同的蝎形连接子亚序列。018010分子在VL的CDR1中，在位置27处含有取代S的Q、在位置33处具有取代M的I且在位置34处含有取代H的V，以及在VH的CDR1的位置28处含有取代T的S，且在VH的CDR3的位置102处含有取代V的L。由CSCS和SCCS亚序列定义的蝎形连接子适用于018010。018011在VL的CDR1和VH的CDR1中含有与如018010所述相同的突变，以及在VH的CDR3中，在位置95处缺失V、在位置96处含有取代V的S且在位置102处含有取代V的L。由CSCS、SCCS和SCCP亚序列定义的蝎形连接子用于018011分子中。018014VL为未突变的小鼠VL，其中人类VH在CDR1的28处含有S取代T的变化且在CDR3的102处含有L取代V的变化。018015亦含有未突变的小鼠VL以及人类VH，该人类VH在CDR1的28处含有S取代T的变化，且在CDR3中，在95处缺失V、在96处含有取代V的S且在102处含有取代V的L。2Lm5分子在VL的CDR1中的27处具有取代S的Q；在VH的CDR1中，在27处具有取代Y的F且在30处具有取代T的S；以及在VH的CDR3中，在95处缺失V、在96处具有取代V的S且在102处具有取代V的L。由CSCS、SCCS和SCCP定义的蝎形连接子独立地用于018014和018015的每一者中。2Lm5-1与2Lm5相同，例外之处为2Lm5-1在VH的CDR1中无突变，且仅使用由CSSS亚序列定义的蝎形连接子。2Lm6-1具有2Lm5的突变且在VL的CDR3中，在92处具有取代S的T且在93处具有取代F的S，且仅使用由CSSS亚序列定义的蝎形连接子。仅2Lm16中的突变为上文对2Lm5-1所列的VH的CDR3中的突变。由亚序列CSCS、SCCS和SCCP定义的蝎形连接子独立地用于2Lm16中。2Lm16-1在VL的CDR1中的27处具有取代S的Q；且在VL的CDR3中，在92处具有取代S的T且在93处具有取代F的S；且VH的CDR3中，在95处缺失V、在96处具有取代V的S且在102处具有取代V的L；仅使用由CSSS亚序列定义的蝎形连接子。2Lm19-3在VL的CDR1中，在27处具有取代S的Q、在33处具有取代M的I且在34处具有取代H的V，以及具有对2Lm16-1所列的VH的CDR3中的突变。由亚序列CSCS、SCCS和SCCP定义的蝎形连接子独立地用于2Lm19-3中。2Lm20-4分子在VL的CDR1中，在33处含有取代M的I且在34处含有取代H的V，以及含有对2Lm16-1所列的VH的CDR3中的突变。对于2Lm5-1、2Lm6-1、2Lm16、2Lm16-1、2Lm19-3和2Lm20-4而言，在VH的框架区的位置11处亦存在取代L的S。由CSCS、SCCS和SCCP亚序列定义的蝎形连接子独立地用于2Lm20-4中。最后，以下突变体中在位置331处存在取代P的S：其中蝎形连接子由CSCS定义的018008；其中各蝎形连接子由CSCS和SCCP定义的018009；其中蝎形连接子由CSCS定义的018010；其中蝎形连接子由SCCP定义的018011；其中蝎形连接子由CSCS定义的018014；其中蝎形连接子由CSCS定义的018015；其中蝎形连接子由CSCS、SCCS和SCCP中任一者定义的2Lm16；其中蝎形连接子由CSCS或SCCP定义的2Lm19-3；及其中蝎形连接子由CSCS或SCCP定义的2Lm20-4。
此外，涵盖使结合结构域的两个区(诸如蝎形分子结合结构域中对应于Ig VL和VH的区)连接的连接子长度的变化。例如，其中发现移除结构域间连接子的C-末端Asp预期可影响蝎形分子的结合特征，如同用Gly取代Asp。
亦涵盖具有相对于Ig的铰链区而言经延长的蝎形连接子(***C-末端与恒定亚区之间和N-末端与结合结构域2之间)的蝎形分子，其中氨基酸残基被添加在蝎形分子中的C-末端与任何半胱氨酸(对应于Ig铰链半胱氨酸)之间，其中该蝎形分子半胱氨酸能够形成链间二硫键。含有所述特征的蝎形分子已构建且于下文中表征。
已努力经由优化使恒定亚区与C末端安置的结合结构域2共价连接的蝎形连接子来改良蝎形分子的表达、稳定性及疗效。用于优化研究的原型蝎形分子含有使N-末端与源自IgG1 CH2和CH3的恒定亚区融合的抗-CD20 scFV(结合结构域1)和使C-末端与此恒定亚区融合的二抗-CD20 scFv。该蝎形分子(如免疫球蛋白分子)预期经由恒定区(或亚区)结合以与由二硫键连接的肽链形成同型二聚体复合物。为获取对其CD20靶标具有高亲和性的四价稳定分子的高表达程度，恒定亚区与第二结合结构域之间的蝎形连接子必须满足以下考虑。首先，由两个scFv片段携有的同源结合结构域之间的空间位阻(两个蝎形分子单体的每一者上具有一个scFv片段)应最小化以利于维持各结合结构域的天然构象。其次，结合结构域的构型和取向应使得各结构域可生产性结合且各结合结构域与其靶标可高亲和性结合。第三，蝎形连接子本身应相对具有蛋白酶耐受性和非免疫原性。
在例示性CD20xCD20蝎形分子构建体S0129中，CH3的C-末端与二抗-CD20 scFV结构域经由2H7蝎形连接子(一种源自且对应于IgG1的天然人类铰链序列的片段的肽)连接。2H7蝎形连接子充当设计研究的基础，设计研究使用旨在改良蝎形分子的表达和改良所表达分子的结合特征的计算机辅助模型。
为分析2H7蝎形连接子，使用Insight II软件对人类IgG1铰链的二聚体形式的3维结构进行建模。具有VH-VL取向的抗-CD20 scFV的晶体结构选作20-4结合结构域的参考结构(RCSB蛋白数据库条目编码：1A14)。在完整IgG1中，铰链使CH1结构域的C-末端与CH2结构域的N-末端连接，各结构域的构型应使得铰链半胱氨酸残基可成对以形成同型二聚体。在例示性蝎形分子中，源自铰链的2H7连接子使源自IgG1 CH3结构域的蝎形分子结构域的C-末端与源自IgG1 VH2结构域的蝎形分子结合结构域2的此部分的N-末端连接。利用VH-VL scFV的三维模型结构，预期2H7连接子的C-末端之间的最佳距离受以下三种考虑因素的影响。第一，必须维持铰链稳定性，且稳定性可通过二聚体化(例如同型二聚体化)来支持，此意谓铰链半胱氨酸必须在两个折叠结合结构域的存在下能够成对。第二，两个结合结构域(例如scFV)必须满足2H7连接子C-末端不产生位阻干扰以使得蛋白可适当折叠。第三，各结合结构域的CDR应能够面对同一方向(如同在天然抗体中)，因为原型蝎形分子的各结合结构域可结合相同细胞表面上的邻近受体(CD20)。出于所述考虑，scFv的两个N-末端之间的距离预期为约在二聚体蝎形分子形式中，理论设计的2H7连接子的C-末端之间的距离预期为约为满足预期为优化蝎形分子的效能所需的距离，在2H7连接子的C-末端扩展至少3个氨基酸。该扩展预期使得在2H7连接子半胱氨酸残基之间可形成二硫键，从而使得C-末端结合结构域2可适当正确折叠和促成CDR的正确取向。此外，在完整IgG1中，由于铰链与结合结构域之间存在CH1和VL1结构域，因此两链所携有的结合结构域之间的距离进一步增加且预期可进一步促进相同细胞表面上的邻近受体的交联。鉴于上述考虑，设计一组具有不同长度的连接子(表10)。为使免疫原性最小化，使用CH2结构域的N-末端所存在的天然残基(Ala-Pro-Glu-Leu或APEL)，通过序列添加至蝎形连接子的C-末端来延长2H7蝎形连接子。较长构建体含有一或多个已知具有蛋白酶耐受性和柔性的(Gly4Ser)连接子单元。
在恒定亚区的CH3结构域与C-末端scFv结合结构域之间含有经扩展的蝎形连接子的CD20×CD20蝎形分子构建体是利用PCR诱变法构建且被亚克隆至常规哺乳动物表达载体中。可通过在使用COS或HEK293细胞的瞬间表达实验中比较所分泌蛋白的产量来分析连接子长度对CD20×CD20蝎形分子表达的影响，或通过蛋白质印迹分析法或使用[35]S-标记的甲硫氨酸/半胱氨酸的脉冲追踪研究分析蛋白合成和积聚来分析连接子长度对CD20×CD20蝎形分子表达的影响。
表10
亦涵盖糖基化蝎形分子，且在本上下文中，涵盖可在碳水化合物改良剂的存在下培养表达蝎形分子的宿主细胞，碳水化合物改良剂在本文中定义为优选具有小于1000道尔顿的分子量的小分子有机化合物，其可抑制作为连接至多肽的碳水化合物的部分的糖的添加、移除或修饰中所涉及的酶的活性，诸如在蛋白的N连接碳水化合物成熟期间所发生。糖基化为发生于内质网(“核心糖基化”)和高尔基(Golgi)体(“末端糖基化”)中的复杂过程。各种糖苷酶和/或甘露糖苷酶抑制剂提供以下一或多种所要效应：增强ADCC活性、增强Fc受体结合和改变的糖基化模式。例示性抑制剂包括(但不限于)栗精胺(castanospermine)和抑制α-甘露糖苷酶(kifunensine)。以下实施例中揭示在至少一种该抑制剂的存在下表达蝎形分子的效应。
实施例13
蝎形分子蛋白表达程度及表征
测定蝎形分子蛋白表达程度且表征所表达的蛋白以证明蛋白设计可产生具有实用益处的产物。利用常规技术，在培养液中的CHO DG44细胞中表达单特异性CD20×CD20蝎形分子和双特异性CD20×CD37蝎形分子。
观测CD20×CD20蝎形分子S0129(2lm20-4x2lm20-4)在各种补充饲料存在下所培养的CHO DG44细胞中的基准程度的稳定表达，如图34中所示。所有培养基均含有50nM甲氨喋呤，该浓度可维持编码蝎形分子的聚核苷酸的拷贝数。聚核苷酸含有蝎形分子蛋白的编码区，该编码区未经密码子最优化以供在CHO DG44细胞中表达。使用pD18载体将聚核苷酸引入细胞中。由图34显然可见，获得约7-46μg/ml的表达程度。
亦测定在扩增编码双特异性CD20xCD37蝎形分子的聚核苷酸后的表达程度。使用pD18载体克隆CD20×CD37蝎形分子编码区，且将质粒引入CHO DG44细胞中。使用本领域中已知的dhfr-甲氨喋呤技术实现编码聚核苷酸的扩增，其中使用增加浓度的MTX来选择二氢叶酸还原酶基因(dhfr)的增加拷贝数，从而使所关注的紧密连接的聚核苷酸共同扩增。图35显示，观测到双特异性CD20×CD37蝎形分子的稳定表达程度通常为约22-118μg/ml。在不同条件(包括用于扩增的甲氨喋呤浓度)下观察到产量变化，但本领域技术人员易优化所述变化。亦使本文中所述的其他各种蝎形分子在CHO和/或COS细胞中经受表达分析，分析结果提供于下表11中。所述结果证明利用常规技术和常规扩增优化技术可获得高产量的蝎形分子蛋白。
所表达的蛋白亦通过SDS-PAGE分析来表征，以评估所表达蛋白的同源性程度和完整性且验证单体肽的分子量。在还原和非还原条件下对变性聚丙烯酰胺凝胶(4-20％Tris甘氨酸)电泳。图36中所显示的结果揭示在还原条件下，具有预期单体分子量的2Lm20-4SCCSMIP和S1000(CD20(2lm20-4)xCD20(2lm20-4)单特异性蝎形分子S0126)中的每一者的单一蛋白带。所述数据说明SMIP和蝎形分子易以完整形式经受纯化。在非还原条件下，观察到痕量肽与预期尺寸的单体SMIP一致，其中大部分蛋白以与二聚体结构一致的单一清晰带形式出现。在所述非还原条件下，单特异性蝎形分子蛋白显示具有与二聚体结构一致的分子量的单一清晰带。SMIP与蝎形分子的二聚体结构与其单体结构一致，其各自含有铰链样蝎形连接子，该连接子含有至少一个能够参与二硫键形成的半胱氨酸。
亦评估蝎形连接子对蝎形分子的表达和完整性的影响，且结果显示于表12中。此表列出单特异性CD20xCD20(2Lm20-4x2Lm20-4)S0129蝎形分子和CD20xCD28 S0033蝎形分子(2H7sccpIgG1-H7-2e12)的蝎形连接子变异体，其完整性如同单链分子和其在COS细胞中相对于视需要具有H7连接子(设定为100％)的亲本蝎形分子S0129或S0033的瞬间表达程度。表13提供评估并入CD20×CD20蝎形分子中的蝎形连接子变异体所得的数据，以及针对CD20×CD28蝎形分子的类似数据。表13提供评估含有蝎形连接子的S0129变异体所得的数据，所述蝎形连接子并非含有至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸的铰链样连接子；相反，所述分子中的蝎形连接子是源自II型C-凝集素茎区。由表13中所显示的数据显而易见，在瞬间表达测定中，铰链样蝎形连接子可与以高于或低于未经修饰的亲本蝎形连接子的程度表达的蝎形分子结合。此外，某些连接子变异体显示比未经修饰的亲本连接子更大的蛋白水解裂解抗性，这关系到所有或几乎所有的经表达的蛋白。表13的数据显示在呈现与含有铰链样蝎形连接子的蝎形分子稍微不同的结合特征的蝎形分子中存在非铰链样连接子，诸如源自II型C-凝集素的茎区的连接子。此外，含有非铰链样蝎形连接子的蝎形分子所显示的效应功能(ADCC)等同于或超过与具有铰链样蝎形连接子的蝎形分子相关的ADCC。
表11
1NFS为糖基化一致基序
2相对于SO129-H7(％)，于COS(6W板)或CHO(单一烧瓶)中瞬间表达
3通过SDS-PAGE/银染色法所观测的裂解产物：-＝无，+＝模糊带；++＝主带，+++＝＞50％裂解)
表12
表13
如以上实施例中所述，涵盖通过在含有碳水化合物改良剂的培养液中表达来制备蝎形分子。在例示性实施方案中，将栗精胺(MW189.21)添加至培养基中直至最终浓度为约200μM(对应于约37.8μg/mL)，或浓度范围大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μM，及高达约300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60或50μg/mL。例如，涵盖10-50μM或50-200μM或50-300μM或100-300μM或150-250μM的范围。在其他例示性实施方案中，将DMJ(例如DMJ-HCl(MW 199.6))添加至培养基中直至最终浓度为约200μM(对应于约32.6μg DMJ/mL)或浓度范围大于约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μM，及高达约300、275、250、225、200、175、150、125、100、75、60或50μg/mL。例如，涵盖10-50μM或50-200μM或50-300μM或100-300μM或150-250μM的范围。在其他例示性实施方案中，将抑制α-甘露糖苷酶(MW 232.2)添加至培养基中直至最终浓度为约10μM(对应于约2.3μg/mL)或浓度范围大于约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μM，及高达约50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12或11μM。例如，涵盖1-10μM或1-25μM或1-50μM或5-10μM或5-25μM或5-15μM的范围。
在一个实验中，用培养于200μM栗精胺(S0129 CS200)或10μM(过量)抑制α-甘露糖苷酶(S0129 KF 10)中的细胞来表达单特异性CD20xCD20蝎形分子(S0129)，且测量所表达的蝎形分子对WIL2S细胞的结合或染色，如图42中所示。此外，在比较结合研究中，糖基化S0129蝎形分子与CD16(FCγRIII)的结合比未糖基化S0129蝎形分子超过约三倍。
在另一研究中，探究人源化CD20xCD20蝎形分子(S0129)对BJAB B-细胞的ADCC介导性杀死作用。图43中所示的结果证实，蝎形分子当在栗精胺或抑制α-甘露糖苷酶的存在下所培养的细胞中表达时，导致在给定浓度的蝎形分子暴露下产生显著更强的ADCC介导性BJAB B-细胞死亡。
实施例14
蝎形分子结合
a.结构域间距
双特异性蝎形分子能够利用位于分子的N-末端和C-末端处的结合结构域对而同时结合至少两个靶标。在此情况下，对于细胞表面靶标而言，该组合物可与所述靶标交联或促使所述靶标实体上协同趋近。本领域技术人员将了解，多种受体***经此交联而活化，产生促使细胞表型改变的信号诱导。设计本文中所揭示的组合物部分地旨在使该信号传导最大化且控制所产生的表型。
在蝎形分子架构设计中应了解并考虑蝎形分子组合物中各结构域的近似尺寸以及对以结构域间角范围表示的结构域间柔性的预期值。对于使用scFv结合结构域(对于结合结构域1和2(BD1和BD2)而言)、IgG1N-末端铰链(H1)和本文中所述的H7PIMS连接子的蝎形分子而言，N-末端的结合结构域与C-末端的结合结构域最大可相隔约且最小可相隔约N-末端的结合结构域最大可相隔约且最小可相隔约(Deisenhofer等人，1976,Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.Bd.357,S.435-445；Gregory等人，1987,Mol.Immunol.24(8):821-9.；Poljak等人，1973,Proc.Natl.Acad.Sci.,1973,70:3305-3310；Bongini等人，2004,Proc.Natl.Acad.Sci.101:6466-6471；Kienberger等人，2004,EMBO Reports,5:579-583，各文献以引用方式并入本文中)。部分地选择所述尺寸可使得在蝎形分子所结合的受体复合物中，受体-受体距离小于约此是因为小于此距离的距离对于某些受体寡聚物的最大信号传导而言可为最佳的(Paar等人，2002,J.Immunol.,169:856-864，该文献以引用方式并入本文中)，同时使得可并入效应功能所需的FC结构。
蝎形分子的N-末端和C-末端的结合结构域经设计成柔性结构以促进靶标结合且容许结合靶标的几何尺寸范围。本领域技术人员亦将了解，N-末端或C-末端结合结构域(分别为BD1和BD2)之间的柔性和分子的结合结构域与FC结构域之间的柔性以及BD1和/或BD2所结合的受体之间的最大和最小距离，可例如通过选择N-末端铰链结构域(H1)和通过结构性模拟更靠近C-末端定位的蝎形连接子结构域(H2)来加以修饰。例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA2的铰链结构域、合成铰链及IgM的铰链样CH2结构域显示不同程度的柔性以及不同长度。本领域技术人员将了解，H1和蝎形连接子(H2)的最佳选择将视以下因素而定：蝎形分子被设计可与之相互作用的受体***，以及蝎形分子结合所诱导的所需信号传导表型。
在某些实施方案中，蝎形分子具有蝎形连接子(H2)，该连接子为对应于Ig铰链(诸如IgG1铰链)的铰链样连接子。所述实施方案包括具有蝎形分子铰链的氨基酸序列的蝎形分子，该氨基酸序列为相对于例如H7序列或野生型IgG1铰链序列而被N-末端扩展的序列。此类型的例示性蝎形连接子将具有被H2N-APEL(x)y-CO2H进行N-末端扩展的H7铰链序列，其中x为Gly4Ser连接子单元且y为0至3的数值。使用两种蝎形分子(双特异性CD20xCD28蝎形分子和单特异性CD20xCD20蝎形分子)例示性地研究蝎形连接子对蝎形分子稳定性的影响。对于该两种蝎形分子设计中的每一者而言，***各种蝎形连接子。特别地，蝎形连接子H16与H17的主要区别在于H17具有H16的序列，H7的序列随附于C-末端，且蝎形连接子H18与H19的主要区别类似地为，在形成H19中，H7的序列随附于H18的C-末端。对于两种蝎形分子主链(20×28和20×20)中的每一者而言，将上述四种蝎形连接子中的每一者***适当位置。在COS细胞中获得对所述构建体的瞬间表达，且在蛋白A/G-涂覆孔(Pierce SEIZE IP试剂盒)上将存在于培养物上清液中的蝎形分子蛋白纯化。在SDS-PAGE凝胶上分离经纯化的蛋白且通过银染色法显现。检验图44揭示，蝎形连接子中的另一H7序列可增加各类型蝎形连接子和各类型蝎形分子蛋白的稳定性。换句话说，将H7附接至H16或H18的C-末端可增加蝎形分子的稳定性，且无论该蝎形分子是否为CD20xCD28或CD20xCD20，此观测均成立。在靶标结合方面，具有CD20×CD20架构的蝎形分子蛋白显示与亲本单特异性人源化CD20×CD20蝎形分子S0129类似的结合特性，如图45中所示。
然而，除上述实施方案外，需要防止所结合的受体彼此接近于约以内而有意形成次最大信号(Paar等人，J.Immunol.,169:856-864)。在此情况下，预期选择比上述那些连接子更短且柔性更小的H1和蝎形连接子(H2)为适当的。
相同间距考虑适用于非铰链样的蝎形连接子。所述蝎形连接子例如为具有C-凝集素的茎区的氨基酸序列的肽类。包含C-凝集素茎区的例示性蝎形铰链为源自CD72茎区、CD94茎区和NKG2A茎区的蝎形铰链。含有所述蝎形铰链的蝎形分子是经构建且在表达、对裂解的敏感性和纯化适应性方面进行表征。数据显示于表14中。
表14
1Gly4Ser连接子的密码子优化，具有(17)限制性位点或不具有(15)限制性位点
2基于实验台纯化的蛋白回收率评估在COS中的表达
3通过SDS-PAGE/库马斯蓝染色经纯化的蛋白所观测到的一个或多个裂解产物
b.N-末端和C-末端结合结构域的结合
N-末端与C-末端结构域参与靶标细胞结合
CD20 SMIP(TRU015)、CD37 SMIP(SMIP016)、CD20与CD37SMIPS的组合(TRU015+SMIP016)和CD20xCD37双特异性蝎形分子(015x016)的靶标细胞结合能力是通过测量所述分子各自阻断与相关靶标(CD37或CD20)特异性竞争结合的抗体的结合的能力来评估。竞争性抗体视需要为经FITC标记的单克隆抗-CD37抗体或经PE标记的单克隆抗-CD20抗体。Ramos B-细胞提供靶标。
将具有5％小鼠血清的PBS(#100-113,Gemini Bio-Products,West Sacramento,CA)(染色介质)中的Ramos B-细胞(1.2×107个细胞/毫升)添加至96孔V形底板(25微升/孔)中。将各种SMIP和蝎形分子于染色介质中稀释至75μg/ml，且4倍稀释至图38中所示的浓度。将经稀释的化合物添加至所涂板的细胞中(除单独用于对照孔的介质外)。将细胞用所述化合物孵育10分钟，且接着将5μg/ml的FITC抗-CD37抗体(#186-040,Ancell,Bayport,MN)和3μg/ml的PE抗-CD20抗体(#555623,BD Pharmingen,San Jose,CA)(纯)一起添加至孔中的25μl染色介质中。将所述细胞在黑暗中于冰上孵育45分钟且接着用PBS洗涤2.5次。将细胞用1％三聚甲醛(#19943 1 LT,USB Corp,Cleveland,OH)固定，且接着在FACs Calibur(BD Biosciences,San Jose,CA)上运作。用Cell Quest软件(BD Biosciences,San Jose,CA)分析数据。图38中所示的结果证实，所有SMIP、SMIP组合和含有CD20结合位点的蝎形分子均成功地与经PE标记的抗-CD 20抗体竞争结合至Ramos B-细胞(上图)；所有SMIP、SMIP组合和含有CD37结合位点的蝎形分子均成功地与经FITC标记的抗-CD 37抗体竞争结合至Ramos B-细胞(下图)。因此，双特异性CD20×CD37蝎形分子被证明对于B-细胞上的靶标具有可操作的N-末端和C-末端结合位点。
c.细胞表面持久性
研究所结合的SMIP和蝎形分子(单特异性和双特异性)在B-细胞表面上的细胞表面持久性揭示蝎形分子比SMIP显示更强的细胞表面持久性。将染色介质(PBS中的2.5％山羊血清、2.5％小鼠血清)中的6×106个细胞/毫升的Ramos B-细胞(3×105个细胞/孔)添加至96孔V形底板中。通过5倍连续稀释500nM初始物质于染色介质中制备两倍最终浓度的测试试剂，且接着以1:1添加至Ramos B-细胞中。此外，亦涂覆对照介质。将细胞在黑暗中于冰上孵育45分钟。接着将板用冷PBS洗涤3.5次。接着以1:100稀释度将第二试剂FITC山羊抗-人类IgG(#H10501,Caltag/Invitrogen,Carlsbad,CA)添加于染色介质中。将细胞在黑暗中于冰上孵育30分钟。接着将细胞通过离心用冷PBS洗涤2.5次，用1％三聚甲醛溶液(#199431 LT,USB Corp,Cleveland,OH)固定，且接着在FACs Calibur(BD Biosciences,San Jose,CA)上运作。用CellQuest软件(BD Biosciences,San Jose,CA)分析数据。数据分析结果显示于图37中，该图显示若干种SMIP(单特异性CD20×CD20蝎形分子和双特异性CD20×CD37蝎形分子)与其靶标在Ramos B细胞上的结合。
将具有Ramos B-细胞(7x105个细胞/毫升)的两个管在冰上孵育30分钟，对两种化合物(亦即人源化CD20(2Lm20-4)SMIP和人源化CD20×CD20(2Lm20-4x2Lm20-4)蝎形分子)中的每一者(各为25μg/ml，于具有10％FBS的Iscoves介质中)进行研究。孵育期结束时，通过离心将两管洗涤3次。接着将一管的细胞(于150μl Iscoves介质中)以2×105个细胞/孔涂覆于96孔平底板中，接着将一板置于37℃恒温箱中且将另一板在冰上孵育。将第二管的各组细胞再悬浮于具有2％小鼠血清及1％叠氮化钠的冷PBS(染色介质)中，且以2×105个细胞/孔涂覆于96孔V形底板中以便经第二抗体(亦即FITC山羊抗人类IgG(#H10501,Caltag/Invitrogen,Carlsbad,CA))快速染色。将第二抗体以1:100最终稀释度添加于染色介质中且使细胞在黑暗中于冰上染色30分钟。接着将细胞用冷PBS洗涤2.5次且用1％三聚甲醛(#19943 1 LT,USB Corp,Cleveland,OH)固定。
在图39中指定的时点，自96孔平底板中收获样本，在37℃下或在冰上孵育，且置于96孔V形底板(2×105个细胞/孔)中。将细胞用冷染色介质洗涤一次，再悬浮，且将第二抗体以1:100的最终稀释度添加于染色介质中。将所述细胞在黑暗中于冰上孵育30分钟。接着通过离心将细胞于冷PBS中洗涤2.5次，且随后用1％三聚甲醛固定。将样本在FACS Calibur(BD Biosciences,San Jose,CA)上运作，且用CellQuest软件(BD Biosciences,San Jose,CA)分析数据。图39中所显示的结果证明，SMIP和蝎形分子与B-细胞表面的结合持续至少六小时，其中单特异性hu CD20xCD20(2Lm20-4x2Lm20-4)蝎形分子比hu CD20(2Lm20-4)SMIP持续的程度更大。
实施例15
单特异性和双特异性蝎形分子的直接细胞杀死作用
实验旨在评估单特异性和双特异性蝎形分子直接杀死淋巴瘤细胞的能力，亦即不涉及ADCC或CDC来杀死所述细胞的能力。特别地，使Su-DHL-6和DoHH2淋巴瘤细胞系单独地经受单特异性蝎形分子(亦即CD20×CD20蝎形分子或CD37×CD37蝎形分子)，或经受双特异性CD20×CD37蝎形分子。
利用常规技术建立Su-DHL-6、DoHH2、Rec-1和WSU-NHL淋巴瘤细胞的培养液，且接着使某些所述培养液个别地暴露于单特异性CD20SMIP、单特异性蝎形分子(CD20×CD20或CD37×CD37)或双特异性蝎形分子(CD20×CD37或CD19×CD37)。细胞暴露于SMIP或蝎形分子是在不导致交联的条件下进行。使细胞与所述分子保持接触96小时，之后如本领域中所知，通过检测ATP来测量其生长。自图24和表15中显而易见CD20SMIP和CD20xCD20单特异性蝎形分子所产生的细胞杀死作用。自图25和表15中显而易见CD37×CD37单特异性蝎形分子的细胞杀死能力，自图26和表15中显而易见CD20×CD37双特异性蝎形分子杀死淋巴瘤细胞的能力且自图27和表15中显而易见CD19×CD37双特异性蝎形分子杀死淋巴瘤细胞的能力。将三次独立实验的数据组合，且各点表示平均值±标准误差(SEM)。如表15的符号所注，表15中的IC50值通过图24、图25和图26中的曲线确定，且定义为与未经处理的培养物相比产生50％抑制作用的浓度。所述图和表格中的数据证明，蝎形分子杀死所述细胞系的效力与使用相同结合结构域的游离SMIP相比大出10倍以上。
表15
*数据源自图24。
**数据源自图25。
***数据源自图26。
****数据源自图27。
于以下细胞中进行人源化CD20xCD20蝎形分子S0129的其他实验：Su-DHL-4、Su-DHL-6、DoHH2、Rec-1和WSU-NHL细胞。结果显示于图46和图47中。所述图中所提供的数据扩展上述结论，其证明蝎形分子具有直接杀死各种细胞系的能力。
上述结论可推广至其他单特异性和双特异性蝎形分子，各种蝎形分子证明具有直接杀死B细胞的能力。使DoHH2B-细胞体外暴露于单特异性CD20×CD20蝎形分子、单特异性CD37×CD37蝎形分子或双特异性CD20×CD37蝎形分子。图48中所显示的结果证明双特异性蝎形分子具有形式不同于单特异性蝎形分子的杀死率曲线。
在70nM CD20xCD20蝎形分子(S0129)、CD20xCD37蝎形分子或CD37xCD37蝎形分子的存在下培养Su-DHL-6细胞亦在体外环境中产生直接B-细胞杀死作用(图49)。同样，Su-DHL-6细胞暴露于双特异性CD19xCD37蝎形分子或暴露于产生直接细胞杀死作用，而双特异性蝎形分子在较低剂量下显示致死性，如图50中所揭示。
通过使DHL-4细胞暴露于识别CD20的四种独立的单特异性蝎形分子，可提供直接细胞杀死作用的另一证明。将CD20xCD20蝎形分子的两种型式设计成合并两个20-4结合结构域(20-4x20-4和S0129)且另外两种合并011与20-4结合结构域的杂交体。两种CD20×CD20蝎形分子设计的所有四种经独立构建且经纯化的型式((20-4×20-4和S0129)和杂交体(011×20-4和011×20-4ΔAsp))以直接方式有效杀死DHL-4细胞。对于该研究，用1μg/ml指定蛋白将DHL-4细胞经体外处理24小时。接着将细胞分别用膜联蛋白V和碘化丙啶(细胞死亡的早期和晚期标志物)染色，且通过FACS量化细胞群。如以黑柱所示的染色增强所证明，图51中所显示的结果证明各CD20×CD20构建体的直接杀死能力。此外，所述结果证明，相对于基于20-4x20-4的蝎形分子，杂交体011x20-4蛋白对于直接细胞杀死作用显示略微增强，尽管所述蝎形分子各自单特异性识别CD20。在各别实验组中，通过FACS分析膜联蛋白V染色细胞群和碘化丙啶染色细胞群来测定四种独立蝎形分子构建体的剂量-反应。图52中所示的结果证明，在用各种独立蝎形分子构建体处理DHL-4细胞所导致的细胞死亡中，剂量-反应性增加。
实施例16
蝎形分子所介导的附带功能(ADCC和CDC)
a.蝎形分子依赖性细胞的细胞毒性
实验旨在判定蝎形分子是否介导BJAB B淋巴瘤细胞的杀死作用。经观测，BJAB B淋巴瘤细胞可由CD20和/或CD37蝎形分子杀死。
初始时，在37℃下，在具有10％FBS的Iscoves介质中将BJAB B-细胞(1×107个/毫升)用500μCi/ml 51Cr铬酸钠(#CJS1,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)标记2小时。接着将载有51Cr的BJAB B细胞于具有10％FBS的RPMI介质中洗涤3次且以4×105个/毫升再悬浮于RPMI中。通过淋巴细胞分离介质(#50494,MP Biomedicals,Aurora,Oh)离心，从肝素化全血中分离实验室供者的外周血液单核细胞(PBMC)，用RPMI介质洗涤2次且以5×106个/毫升再悬浮于具有10％FBS的RPMI中。将试剂样本以4倍最终浓度添加至具有10％FBS的RPMI介质中，且对各试剂制备三份10倍连续稀释液。接着将所述试剂以50微升/孔添加至96孔U型底板中直至所指定的最终浓度。接着将经51Cr标记的BJAB细胞以50微升/孔(2×104个细胞/孔)添加至板中。接着将PBMC以100微升/孔(5×105个细胞/孔)添加至板中，使得效应物(PBMC)：靶标(BJAB)的最终比率为25:1。将效应物和靶标添加至单独介质中以测量本底杀死率。将经51Cr标记的BJAB添加至单独介质中以测量51Cr的自发性释放率且添加至具有5％NP40(#28324,Pierce,Rockford,Ill)的介质中以测量51Cr的最大释放率。将所述板在37℃下于5％CO2中孵育6小时。接着自各孔取50μl(25μl亦为合适的)上清液转移至LumaPlate-96(#6006633,Perkin Elmer,Boston,Mass)中且在室温下干燥隔夜。
干燥之后，在Packard TopCount-NXT上以cpm量化放射性发射。样本值为三份样本的平均值。使用以下方程式计算特异性杀死百分比：杀死％＝((样本-自发性释放率)/(最大释放率-自发释放率))×100。图30中的曲线显示BJAB B细胞通过单特异性蝎形分子CD20×CD20和CD37×CD37杀死。CD20 SMIP与CD37 SMIP的组合亦杀死BJAB B细胞。所述结果证明蝎形分子显示蝎形分子依赖性细胞的细胞毒性且预期该功能性通过提供ADCC活性的蝎形分子的恒定亚区提供。
b.蝎形分子在补体依赖性细胞毒性中的作用
实验亦证明蝎形分子具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。如下所述且如图31中所示，实验涉及使Ramos B-细胞暴露于CD19和/或CD37 SMIP及蝎形分子。
实验初始为将50μl的Iscoves介质(无FBS)中的5×105至2.5×105个Ramos B-细胞添加至96孔V形底板的孔中。将Iscoves中的测试化合物(或单独Iscoves)以50μl分两次以指定最终浓度添加至孔中。将细胞和试剂在37℃下孵育45分钟。将细胞用无FBS的Iscoves洗涤2.5次且以指定浓度再悬浮于96孔板中的具有人类血清的Iscoves(#A113,Quidel,SanDiego,CA)中。接着将细胞在37℃下孵育90分钟。将细胞通过离心来洗涤且再悬浮于125μl冷PBS中。接着将细胞转移至FAC簇管(#4410,CoStar,Corning,NY)且添加125μl具有5μg/ml的碘化丙啶(#P-16063,Molecular Probes,Eugene,OR)的PBS。将细胞在室温下于黑暗中用碘化丙啶孵育15分钟，且接着置放于冰上，量化，且在FACsCalibur上经CellQuest软件(Becton Dickinson)分析。图31中所显示的结果证明，CD19 SMIP(而非CD37 SMIP)显示CDC活性，该两种SMIP的组合显示与单独CD19 SMIP大致相同的CDC活性程度。然而，CD19xCD37蝎形分子显示比单独SMIP或SMIP组合显著更强的CDC活性，此说明蝎形分子架构可提供比其他分子设计更大程度的补体依赖性细胞毒性。
c.CD20×CD20单特异性蝎形分子的ADCC/CDC活性
对三种不同的CD20xCD20单特异性蝎形分子以及适当对照分子测试ADCC和CDC功能性。利用常规技术测定ADCC，且结果显示于图53中。由图中显而易见与所测试的各CD20×CD20单特异性蝎形分子相关的显著(但非一致)的ADCC活性。
为评估CDC，在37℃下将Ramos B-细胞样本(4×105)用各CD20×CD20蝎形分子(0、0.5、5、50和500nM)和血清(10％)孵育3.5小时。通过7-AAD染色和FACS分析来评估细胞死亡。结果显示于图54中，该图揭示蝎形分子显示某些CDC活性。在类似实验中，在37℃下将Ramos B-细胞样本(4×105)用CD20×CD20蝎形分子蛋白(5、50、100nM)和血清(10％)孵育2小时。将细胞洗涤2次且与抗人类C1q FITC抗体一起孵育。通过FACS分析来评估所结合的C1q，且结果显示于图55中。所述结果与图54中所显示的结果一致，说明各CD20xCD20单特异性蝎形分子与某些CDC活性相关，但活性弱于与CD20 SMIP相关的活性。
d.蝎形分子与FCγRIII的相互作用
ELISA研究显示，在靶标细胞不存在的情况下，蝎形分子以增强程度结合低FcγRIII(CD16)(低亲和性同种型或等位基因型)。初始利用常规技术，用低亲和性或高亲和性CD16mIgG涂覆ELISA板。评估此固定融合蛋白捕获CD20 SMIP或CD20×CD20单特异性蝎形分子的能力。用山羊抗人类IgG(HRP)二级抗体检测所结合的SMIP和蝎形分子，且测定平均萤光强度(MFI)。单独PBS(阴性对照物)以单点显示。结果显示于图32A中(通过CD16高亲和性同种型融合来捕获)和图32B中(通过CD16低亲和性同种型融合来捕获)。由对图32A和图32B的考虑显而易见，CD20 SMIP与CD20×CD20单特异性蝎形分子显示与高亲和性和低亲和性CD16同种型融合体的结合增强，其中CD20×CD20蝎形分子显示与低亲和性同种型融合体的结合随蛋白浓度增加而显著增强。
亦评估在靶标细胞存在下蝎形分子与FcγRIII同种型的结合。数据显示，在靶标细胞存在下，蝎形分子与FcγRIII(CD16)低亲和性同种型或等位基因型和高亲和性同种型或等位基因型的结合随蛋白浓度增加而增强。
在进行实验中，在容许SMIP或蝎形分子与CD20阳性靶标细胞结合的条件下，使CD20阳性靶标细胞暴露于CD20 SMIP或CD20×CD20单特异性蝎形分子。随后，使携有SMIP或蝎形分子的靶标细胞暴露于经小鼠IgFc标记的CD16高亲和性或低亲和性同种型。接着将经标记的山羊抗小鼠Fc作为二级抗体添加，以标记与小鼠IgFc连接的固定化CD16。接着在FACs Calibur(BD Biosciences,San Jose,CA)上利用流式细胞术检测细胞，且用CellQuest软件(BD Biosciences,San Jose,CA)分析。如图33中所示，在靶标细胞存在下，增加CD20SMIP和CD20×CD20单特异性蝎形分子每一者的浓度可使与CD16同种型的结合增强，其中CD20×CD20蝎形分子的结合性的增强比对于CD20 SMIP所见的结合性增强更为显著。
实施例17
蝎形分子对靶标淋巴瘤细胞的细胞周期效应
通过使淋巴瘤细胞暴露于SMIP、单特异性蝎形分子和双特异性蝎形分子来评估蝎形分子的细胞周期效应。更特别地，将DoHH2淋巴瘤细胞(0.5×106)用0.4nM利妥昔单抗(rituximab)、CD20×CD37蝎形分子、TRU-015(CD20 SMIP)+SMIP-016组合(各为0.2nM)、100nM SMIP-016或100nM CD37×CD37蝎形分子处理24小时。在96小时生长抑制测定中，所述浓度显示的IC50值比蝎形分子的IC50值大出约10倍(参见图24-27)。在37℃下，将培养物用10μM BrdU(溴去氧尿苷)标记20分钟。固定之后，将细胞用抗-BrdU-FITC抗体染色且用碘化丙啶对比染色。图28中的数值为2-3个独立实验的4份复制式培养物的平均值+/-SD。同时分析所有样本数据且利用BrdU与PI合并点曲线来组合显示。曲线图证明，蝎形分子处理的主要效应为对处于S-期的细胞的耗尽，以及G0/G1间隔的增加。
实施例18
蝎形分子的生理效应
a.线粒体电位
如JC-1测定中所揭示，CD20×CD20蝎形分子诱导DHL4 B-细胞的线粒体膜电位下降。JC-1为显示线粒体的电位依赖性积聚的阳离子型碳菁染料(来自Molecular Probes的JC-1流式细胞术测定试剂盒)。与质膜相比，JC-1对线粒体膜更具特异性，且用于测定线粒体膜电位的变化。线粒体的积聚可由绿色(529nm)至红色(590nm)的萤光偏移来指示。
在进行实验中，初始将DHL-4 B-细胞(5×105个细胞/毫升)培养于24孔板中且于标准组织培养恒温箱中，在37℃下于5％CO2中用1μg/ml的CD20×CD20蝎形分子、利妥昔单抗、IgG对照抗体或5μM星孢菌素(staurosporine)处理24小时。添加JC-1染料(10μl/ml，2μM最终浓度)且在37℃下将细胞再孵育30分钟。将细胞通过离心(1200rpm，5分钟)来收获，用1ml PBS洗涤且再悬浮于500μl PBS中。通过流式细胞术(FACSCalibur,BD)经由488nM激发及530nM和585nM发射滤光器来分析细胞。对于图56中所示的代表性散布图而言，在Y轴上测量红色萤光且在X轴上测量绿色萤光。如以阳性对照CCCP(羰基氰化物3-氯苯腙)(一种已知的线粒体膜电位扰乱剂)所见，线粒体膜的去极化是作为红色萤光的减弱来测量。为验证JC-1对膜电位变化具有反应，将DHL-4 B-细胞在37℃、5％CO2下用两种浓度的CCCP(50μM和250μM)处理5分钟。另一种阳性对照物为用广谱激酶抑制剂星孢菌素处理以诱导细胞凋亡的细胞。图56中所示的结果为10,000点数的点曲线图，其中红色萤光描绘于Y轴上且绿色萤光描绘于X轴上。具有扰乱线粒体膜电位的细胞百分比的概括性直方图(扰乱MMP：黑柱)显示于图56中。所述结果证明，用20-4×20-4蝎形分子或011×20-4蝎形分子处理可引起与细胞死亡相关的线粒体膜电位的降低。
b.钙流量
利用Ca++流动性(细胞信号传导的共同特征)作为量度，分析蝎形分子对细胞信号传导途径的影响。将SU-DHL-6淋巴瘤细胞用钙4染料标记且用下文所鉴别的测试分子处理。对细胞读数历时20秒钟以测定本底萤光，且接着添加SMIP/蝎形分子(图28中的第一虚线)，且测量萤光直至600秒钟。在600秒钟时，添加8倍过量的交联山羊抗人类F(ab)’2，且再量测萤光300秒钟。图28中的图(A)显示，与未受刺激的细胞相比(蓝线)，由CD20 SMIP与CD37SMIP的组合所获得的结果(红线)；由CD20×CD37双特异性蝎形分子所获得的结果(黑线)。在图28中的图B中，用单独CD20 SMIP处理细胞(红线)的结果导致Ca++流动现象，但此并不如单特异性CD20×CD20蝎形分子所产生的信号(黑线)那样强。图28的Ca++流动图表示获自经等摩尔量的蝎形分子和SMIP/SMIP组合处理的三个孔的萤光。
c.半胱天冬酶3、7和9
如通过膜联蛋白V和碘化丙啶染色增加和线粒体膜电位下降所证明，结合CD20的蝎形分子直接杀死B-细胞的能力引起对结合CD20的蝎形分子对B-细胞的其他细胞凋亡相关效应的进一步研究。所采用的方法是对暴露于CD20×CD20蝎形分子或适当对照物的DHL-4B-细胞进行Apo1测定。Apo1测定是基于半胱天冬酶3和7的合成肽底物。测定组份可购自Promega(Apo-同源半胱天冬酶-3/7测定)。半胱天冬酶介导经标记的肽Z-DEVD-若丹明110(Rhodamine 110)裂解释放萤光若丹明110标志物，使用485nm激发和530nm检测对其进行测量。
在实验中，将100μl DHL-4B-细胞(1×106个细胞/毫升)涂覆于黑色96孔平底组织培养板中且在标准组织培养恒温箱中，在37℃、5％CO2下用1μg/ml的CD20×CD20蝎形分子、利妥昔单抗、IgG对照抗体或5μM星孢菌素处理24或48小时。(星孢菌素为小分子广谱蛋白激酶抑制剂，在本领域中已知其为多种细胞类型的经典细胞凋亡的有效诱导剂)。24或48小时后，将100μl的100倍稀释底物添加至各孔中，在板式震荡器(300rpm)上轻缓地混合一分钟且在室温下孵育两小时。使用485nM激发和527nM发射滤光器(Fluoroskan Ascent FL,Thermo Labsystems)测量萤光。图57中显示的图形显示24小时和48小时(对于星孢菌素，仅24小时)后，三次处理的平均萤光强度+/-标准偏差。所述结果证明，结合CD20的蝎形分子不经由涉及半胱天冬酶3/7活化的细胞凋亡途径来直接杀死B-细胞。
Apo-1测定中所获得的结果是通过蛋白质印迹分析法来验证，所述蛋白质印迹分析法经设计成检测导致半胱天冬酶活化的促半胱天冬酶裂解或检测PARP(聚(ADP-核糖)聚合酶)(一种已知通过活化半胱天冬酶3而裂解的蛋白)的裂解。使DHL-4B-细胞暴露于结合CD20的蝎形分子或对照物历时4、24或48小时，且将细胞裂解物经SDS-PAGE分离并利用常规技术进行蛋白质印迹法分析。图58显示的结果为蛋白质印迹集合的形式。底部三处蛋白质印迹是使用抗半胱天冬酶抗体来检测反映蛋白水解活化的半胱天冬酶分子量的变化。对于半胱天冬酶3、7和9，不存在半胱天冬酶受任何CD20-结合分子活化的迹象。星孢菌素充当测定的阳性对照物且对半胱天冬酶3、7和9中的每一者诱导活性半胱天冬酶的促半胱天冬酶裂解。图58中所示的第四个蛋白质印迹显示，PARP(一种已知的活化半胱天冬酶3的底物)未裂解，此与结合CD20的蝎形分子未能活化半胱天冬酶3相一致。所有所述实验的结果均一致，说明半胱天冬酶3活化并非由结合CD20的蝎形分子所诱导的DHL-4B-细胞的直接细胞杀死作用的重要特征。
此外，时间连续研究旨在测定CD20结合蛋白(包括CD20×CD20蝎形分子)对半胱天冬酶3的效应。将DoHH2或Su-DHL-6 B-细胞与10nM CD20结合蛋白(S0129蝎形分子、2Lm20-4SMIP或)+/-可溶性CD16 Ig(40nM)、单独可溶性CD16 Ig或介质一起孵育。将细胞以3×105个/孔/300微升培养于具有10％FBS的完全RPMI中且在4小时、24小时或72小时时收获。将72小时时间点的样本涂覆于500μl测试剂中。将细胞用PBS洗涤，且接着使用BDPharmingen半胱天冬酶3(活性形式)、mAB细胞凋亡试剂盒：FITC(目录号第55048号，BDPharmingen,San Jose,CA)以细胞内活性半胱天冬酶-3染色。简而言之，在以冷PBS再进行2次洗涤后，将细胞悬浮于冷cytofix/cytoperm溶液中且在冰上孵育20分钟。接着通过离心来洗涤细胞，抽吸，且在室温下用Perm/Wash缓冲剂洗涤两次。接着在室温下于黑暗中将样本于100μl的Perm-Wash缓冲剂中用20μl FITC-抗半胱天冬酶3染色30分钟。接着将样本用Perm-Wash缓冲剂洗涤两次，且再悬浮于500μl的Perm-Wash缓冲剂中。接着将所洗涤的细胞转移至FACs管中，且在FACs Calibur(BD Biosciences,San Jose,CA)上运作，并用CellQuest软件(BD Biosciences,San Jose,CA)分析。结果显示于表16中。
表16
所有所述实验的结果均一致，说明在CD16不存在下，对半胱天冬酶3的活化有限，此并非意谓半胱天冬酶3活化为由结合CD20的蝎形分子所诱导的直接细胞杀死作用的重要特征。
d.DNA断裂
诱导经典细胞凋亡信号传导途径最终导致染色体DNA的浓缩和断裂降解。为测定结合CD20的蝎形分子是否经由经典细胞凋亡机制直接杀死B-细胞，在使细胞暴露于结合CD20的蝎形分子或对照物之后，检查B-细胞染色体DNA的状态。初始时，用CD20结合分子(亦即单特异性CD20×CD20(2Lm20-4×2Lm20-4)蝎形分子、CD20×CD20(011×2Lm20-4)蝎形分子或利妥昔单抗)或用对照物体外处理DHL-4B-细胞历时4小时、24小时或48小时。随后，将细胞溶解且利用常规技术将染色体DNA纯化。接着将染色体DNA通过凝胶电泳法进行分级分离。图59中所示的凝胶电泳图显示DNA断裂的缺乏，证明由结合CD20的蝎形分子所引起的细胞死亡并非通过经典细胞凋亡途径所介导。经星孢菌素处理的细胞在所述测定用作阳性对照物。
e.SYK磷酸化作用
SYK为具有若干磷酸化位点的磷酸调节蛋白，其用作转录抑制子。SYK位于细胞核中，但活化后能够快速再定位于细胞膜中。对于活化而言，SYK须保留其细胞核定位序列。活化SYK具有抑制乳癌肿瘤的作用且SYK通过促细胞凋亡信号(诸如电离辐射、BCR连接和MHCII类交联)活化。此外，已证明SYK可影响PLC-γ和Ca++通路。经由所述观测，研究结合CD20的蝎形分子影响SYK的能力。
使DHL-6B-细胞暴露于双特异性CD20×CD37蝎形分子历时0、5、7或15小时且使细胞溶解。用抗磷酸化酪氨酸抗体或用抗-SYK抗体使溶胞物免疫沉淀通过凝胶电泳将免疫沉淀物分离，且结果显示于图60中。由检验图60显而易见，双特异性CD20×CD37蝎形分子未能诱发SYK的磷酸化作用，从而未能将其活化。与上述对半胱天冬酶活化及染色体DNA断裂的研究一致，结合CD20的蝎形分子似乎未利用经典细胞凋亡途径(诸如半胱天冬酶依赖性途径)直接杀死B-细胞。尽管不希望受理论束缚，但预期结合CD20的蝎形分子是经由半胱天冬酶独立途径和SYK独立途径直接杀死B-细胞，该途径不具有显著的染色体DNA断裂特征，至少在半胱天冬酶依赖性细胞凋亡期间发生断裂的相同时间段内不具有显著的染色体DNA断裂特征。
实施例19
蝎形分子应用
a.蝎形分子的体内活性
蝎形分子的活性亦利用小鼠模型来评估。对于蝎形分子体内活性的测量涉及给予10-300μg蝎形分子且随后依时间次序测定此蝎形分子的血清浓度。所述研究的结果显示于图40中，其显示为对小鼠三周药物动力学研究的两种双特异性蝎形分子(亦即S0033，CD20×CD27蝎形分子和CD20×CD37蝎形分子)中每一者的血清浓度曲线。图40中的数据显示，给药后，在该两种双特异性蝎形分子中每一者的血清含量回落至基线含量之前，需要耗费至少500小时。因此，蝎形分子显示血清稳定性和可再生性、持久的体内循环半衰期。
亦评估蝎形分子的体内功效。在SMIP对比历史性免疫球蛋白对照物的平行实验中使用侵袭性Ramos异种移植模型。图41中所提供的存活曲线揭示给予10μg双特异性蝎形分子对存活具有可忽略不计的影响，但100-300μg的给药对携有Ramos异种移植体的小鼠的存活具有重要的正面效应。
b.组合疗法
预期蝎形分子将适用于预防、治疗或改善影响人类、其他哺乳动物及其他有机体的多种状态的症状。例如，预期结合CD20的蝎形分子可适用于治疗或预防与B-细胞过量或异常相关的多种疾病。实际上，易经受治疗(涉及耗尽B-细胞)的任何疾病均可经受结合CD20的蝎形分子的治疗。此外，蝎形分子(例如结合CD20的蝎形分子)可与其他治疗剂一起用于组合疗法中。为说明各种组合疗法的可行性，将单特异性CD20×CD20蝎形分子(S0129)与羟道诺红霉素(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)或雷帕霉素(rapamycin)组合给予Su-DHL-6B-细胞。羟道诺红霉素为拓扑异构酶II型毒剂，其干扰DNA生物化学机制且属于针对抗癌治疗的药物类别。雷帕霉素(Sirolimus)为大环内酯抗生素，其抑制蛋白合成的起始且抑制免疫***，适用于器官移植且可作为抗增殖剂配合冠状动脉血管内支架使用以抑制或预防再狭窄。长春新碱为抑制小管形成且已用于治疗癌症的长春花生物碱。
图61中所示的实验结果是显示为各组合在效应程度范围内的组合指数值。单特异性CD20×CD20蝎形分子S0129与各类药物的相互作用各不相同，但与(RTXN)的曲线形式类似。由高浓度的羟道诺红霉素所见的效应可反映趋向单价结合的转变。所述数据说明，结合CD20的蝎形分子可与其他多种治疗剂组合使用且所述组合对于本领域技术人员而言在了解本公开后将显而易见。
具有效应功能的多价结合分子或蝎形分子的结构主题的变化对于本领域技术人员而言在回顾本公开后将显而易见，且所述变化结构属于本发明的范畴。

Claims (10)

1.具有效应功能的多价单链结合蛋白，其包含：
a.第一结合结构域，其源自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子；
b.提供效应功能的恒定亚区，该免疫球蛋白恒定亚区位于所述第一结合结构域的C-端；
c.蝎形连接子，其位于所述恒定亚区的C-端；及
d.第二结合结构域，其源自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，并位于所述恒定亚区的C-端；
因此，所述恒定亚区定位于所述第一结合结构域与所述第二结合结构域之间。
2.药学上的组合物，其包含如权利要求1所述的蛋白和药学上可接受的佐剂、载体或赋形剂。
3.编码如权利要求1所述的蛋白的核酸。
4.包含如权利要求3所述的核酸的载体。
5.包含如权利要求4所述的载体的宿主细胞。
6.制备如权利要求1所述的蛋白的方法，所述方法包括：
a.将编码如权利要求1所述的蛋白的核酸引入宿主细胞中；和
b.将所述宿主细胞在适于表达所述蛋白的条件下孵育，从而以至少1mg/ml的水平表达所述蛋白。
7.制备编码如权利要求1所述的蛋白的核酸的方法，所述方法包括：
a.将编码源自免疫球蛋白可变区的第一结合结构域的聚核苷酸的3’端与编码恒定亚区的聚核苷酸的5’端共价连接；
b.将编码蝎形连接子的聚核苷酸的5’端与编码所述恒定亚区的聚核苷酸的3’端共价连接；及
c.将编码源自免疫球蛋白可变区的第二结合结构域的聚核苷酸的5’端与编码所述蝎形连接子的聚核苷酸的3’端共价连接；
从而形成编码具有效应功能的多价结合蛋白的核酸。
8.诱导靶标细胞损坏的方法，所述方法包括使靶标细胞与治疗有效量的如权利要求1所述的蛋白接触。
9.治疗细胞增殖病症的方法，所述方法包括给予有需要的有机体治疗有效量的如权利要求1所述的蛋白。
10.改善与细胞增殖病症相关的症状的方法，所述方法包括给予有需要的有机体治疗有效量的如权利要求1所述的蛋白。
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