CN108395482B - 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定 - Google Patents

一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向CD20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化T细胞的活性鉴定，具体地本发明提供了一种CD20靶向性的嵌合抗原受体及其制法和应用，所述嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域包括SEQ ID NO.7或9或33所示的抗体重链可变区，和SEQ ID NO.11或13或35所示的抗体轻链可变区。实验结果表明，本发明提供的嵌合抗原受体显示出了极高的对肿瘤细胞的杀伤能力。

Description

一种靶向CD20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化T细胞的 活性鉴定
技术领域
本发明提供了一种靶向CD20抗原嵌合抗原受体的序列组分，及其修饰T细胞(CART20)的制备方法和活性鉴定；本发明鉴定出了一种治疗CD20阳性B细胞淋巴瘤的嵌合性抗原受体结构。
背景技术
血液***的恶性肿瘤占人类恶性肿瘤约10％，95％血液***的恶性肿瘤是B淋巴细胞来源的。传统的化疗和放疗对治疗血液***的恶性肿瘤起着重要作用，有的病人亦疗效显著，但大部份都难以治愈。新的、有效的治疗方法一直是这一领域探索的热点。
过继性T细胞治疗针对恶性肿瘤的临床治疗中已经显示了其强大疗效和光明前景。这其中，多个中心独立开展的利用嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修饰的T细胞靶向表达CD19的B细胞复发、难治性恶性肿瘤取得了前所未有的成功。尤其是在宾夕法尼亚大学医学院开展的一项利用CART19治疗复发、难治性急性B细胞淋巴瘤(R/R B-ALL)的临床试验中有高达94％的患者达到了完全缓解。尽管此项临床试验的初始反应率很高，但有近40％的患者在治疗1个月达到完全缓解之后又出现了复发，并且复发的患者中高于60％比例的患者出现了CD19阴性肿瘤细胞的逃逸。因此，迫切需要筛选出靶向除CD19之外的B细胞淋巴瘤相关抗原的CART结构，来治疗恶性淋巴瘤患者。
CD20是糖基化蛋白，是第一个被确定的B细胞膜标识，也被称为B1，由MS4A基因编码。CD20分子是有四个跨膜的疏水区，其N段和C端均位于胞质一侧，从而在胞外形成两个闭环，分别称为大环和小环。CD20特异性地表达在95％以上的正常和癌变的B细胞，这些细胞处于前B细胞及之后的发育阶段，直至分化为浆细胞CD20才停止表达。因此，CD20是理想的B细胞恶性肿瘤免疫治疗的靶点。
Rituximab
Figure BDA0001222300240000011
是第一个经美国FDA和欧洲EMA批准的用于治疗惰性淋巴瘤的第一代靶向CD20的嵌合性单克隆抗体。Rituximab识别并结合CD20胞外区的大环结构，只要通过ADCC介导的杀伤作用对肿瘤细胞杀伤。然而，Rituximab的单独使用活性有限且反应持续时间较短，但与化疗联合使用可显著增强化疗的疗效。Rituximab用于淋巴瘤的治疗，半数的病人有完全(CR)或部分(PR)的反应。
Ofatumumab
Figure BDA0001222300240000012
是第一个全人源的CD20治疗性抗体。与Rituximab不同，Ofatumumab识别的表位包含CD20大环和小环的各一部分；同时，Ofatumumab的肿瘤杀伤方式主要是通过补体依赖的途径，其次是ADCC依赖的肿瘤杀伤作用。
Obinutuzumab
Figure BDA0001222300240000013
是一种人源化的，通过降低岩藻糖基化水平和优化FcγRIIIa亲和力的II型CD20抗体。Obinutuzumab识别并结合CD20胞外分子的大环部分，主要通过ADCC作用介导肿瘤的杀伤作用，同时，Obinutuzumab与CD20分子的结合还具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。Obinutuzumab对Rituximab治疗无效的NHL与氮芥类药bendamustine联合用药，三期临床试验发现Obinutuzumab与bendamustine联合用药比bendamustine单独用药的无恶化时间长一倍，(前者是29个月，后者是14个月)。Obinutuzumab在治疗CLL时，总有效率(ORR，包括CR和PR)达到77.3％，Rituximab是65.7％.
相比于治疗性抗体而言，细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到***的目的。本领域技术人员一直致力于开发新的细胞免疫疗法，以提高细胞免疫疗法的效果，并降低其副作用。尽管这些年开发了如上所言的很多治疗性抗体，但其临床治疗效果均没有达到类似CART19同样水平的治疗效果。因此，开发出靶向CD20的CART疗法具有极大的市场价值和社会意义。
发明内容
鉴于靶向CD20治疗性抗体在亲和力、杀伤机制的不同，我们利用不同抗体的抗原结合区域的DNA序列构建靶向CD20的系列嵌合性抗原受体，并完成了这些嵌合性抗原受体工程化T细胞体外抗肿瘤活性的鉴定及差异比较，为临床应用CAR-T治疗CD20阳性的白血病和淋巴瘤提供了新的，有效方法和制剂。
本发明的目的是提供一种CD20靶向性的嵌合抗原受体及其制法和应用。
本发明涉及靶向CD20嵌合抗原受体结构的构建、靶向CD20嵌合抗原受体工程化T细胞的制备方法及其活性鉴定。
本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)(序列)，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域(即，scFv)包括SEQ ID NO.7或9或33所示的抗体重链可变区，和SEQ IDNO.11或13或35所示的抗体轻链可变区。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域如下式所示：
VH－VL
其中，VH为抗体重链可变区；VL为抗体轻链可变区；“－”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
在另一优选例中，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，且VL的氨基酸序列如SEQID NO.11所示。
在另一优选例中，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，且VL的氨基酸序列如SEQID NO.13所示。
在另一优选例中，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，且VL的氨基酸序列如SEQID NO.35所示。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的结构如下式所示：
L－VH－VL－H－TM－CS－CD3ζ
其中，
L为任选的引导序列(Leader sequence，即信号肽序列)；
H为绞链区；
TM为跨膜结构域；
CS为为源于4-1BB和/或CD28的共刺激分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
VH、VL和“－”分别如上所述。
在另一优选例中，L的序列如SEQ ID NO.27所示。
在另一优选例中，H的序列如SEQ ID NO.17或19所示。
在另一优选例中，TM的序列包括源于CD8a的跨膜区或CD28的跨膜区，优选地TM的序列如SEQ ID NO.21或37所示。
在另一优选例中，所述CS结构为：CD28-4-1BB，其中CD28为源于CD28的共刺激分子；4-1BB为源于4-1BB的共刺激分子。
在另一优选例中，源于4-1BB的共刺激分子的序列如SEQ ID NO.23所示。
在另一优选例中，源于CD28的共刺激分子的序列如SEQ ID NO.39所示。
在另一优选例中，CD3ζ的序列如SEQ ID NO.25所示。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的序列如SEQ ID NO.1、3、5、29、31所示。
本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述铰链区核酸序列：
(a)编码如SEQ ID NO.17或19所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.18或20所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.18或20所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.17或19所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD8a的跨膜区的核酸序列：
(a)编码如SEQ ID NO.21所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.22所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.22所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.21所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述4-1BB(CD137)的胞内信号结构域的核酸序列：
(a)编码如SEQ ID NO.23所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.24所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.24所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.23所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述酸分子包含选自下组的编码所述CD28的胞内信号结构域的核酸序列：
(a)编码如SEQ ID NO.39所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.40所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.40所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.39所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的编码所述CD3ζ的胞内信号结构域的核酸序列：
(a)编码如SEQ ID NO.25所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.26所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.26所示序列的同源性≥90％(较佳地≥95％)，并且编码SEQ ID NO.25所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子包含选自下组的核酸序列：
(a)编码如SEQ ID NO.1、35、29或31所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.2、4、6、30或32所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.2、4、6、30或32所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，并且编码SEQ ID NO.1、35、29或31所示氨基酸序列的多核苷酸；
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
在另一优选例中，所述核酸分子还包括编码前导序列(引导序列，信号肽)的多核苷酸，所述前导序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；优选地所述编码前导序列(信号肽)的多核苷酸如SEQ ID NO.28所示。
在另一优选例中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2、46、30或32所示。
本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。
在另一优选例中，所述细胞为T细胞。
本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞。
本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用于制备***的药物或制剂。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括CD20阳性肿瘤。
本发明的第七方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞、或本发明第五方面所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述疾病为肿瘤。
本发明的第八方面，提供了一种制备CAR-T细胞(CAR-修饰的T细胞)的方法，所述CAR-T细胞表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体，
所述方法包括步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入T细胞内，从而获得所述CAR-T细胞。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.靶向CD20嵌合型抗原受体结构图。所设计CAR结构各元件如图所示，所列元件包括：前导序列、抗原识别序列(Ofatumumaband,Obinutuzumab,Rituximab)、铰链区、跨膜区、共刺激因子信号区和CD3zeta信号传导区。其中，CAR-T20.14,CAR-T20.13和CAR-T20.16分别是基于Ofatumumab,Obinutuzumab和Rituxmab抗体可变区序列为基础构建的CAR结构；而CAR-T20.19和CAR-20.20是CAR-T20.14在IgG4Hinge-CH2-CH3连接区的L235E-N297Q突变形式；CAR-T20.20又是同时带有CD28和4-1BB共刺激信号分子编码序列的三代嵌合抗原受体结构。
图2.靶向CD20嵌合型抗原受体工程化T细胞转染效率的检测。Protein L方法鉴定培养到第7天(A)和第11天(B)的CAR-T20s细胞中CAR基因编码蛋白在T细胞膜表面的表达水平。
图3.依次取1*105培养到第6天的NT，CART-20.13，CART-20.14及CAR-T20.16细胞，分别与CD20阳性的RAJI和RAMOS肿瘤细胞系，以及CD20阴性的MOLT-4肿瘤细胞系，在200μlGT-551培养基中按照1:1比例共培养18h后检测T细胞膜表面CD137的表达水平(A)和共培养上清中IFNγ的分泌水平(B)。
图4.CART-20诱导肿瘤细胞凋亡水平的检测。分别取1*104经过CFSE标记的CD20阴性(MOLT-4)或CD20阳性的(RAJI，RAMOS)肿瘤细胞系，在200μl GT-551培养基中按照图示比例分别与培养到第11天的NT，CART-20.13，CART-20.14及CAR-T20.16细胞共培养4h后离心收集细胞沉淀，细胞经PBS洗两遍后用AnnexinV-APC染料按1:50的比例100μl染液中染色30min，PBS洗1遍后在流失细胞仪上分析CFSE阳性细胞中Annexin V阳性细胞的比例。图示结果显示了Annexin V阳性细胞在相应共培养样品中的统计分析结果。
图5.以Ofatumumaband抗体序列为基础构建的铰链区突变嵌合抗原受体和三代嵌合抗原受体体外活化能力的鉴定。Protein L方法检测培养到第7天的CAR-T20.14，CAR-T20.19和CAR-T20.20中CAR基因编码蛋白在T细胞膜表面的表达水平(A)；依次取1*105培养到第7天的NT，CART-20.14，CART-20.19及CAR-T20.20细胞，分别与K562，CD19单阳、CD20单阳、CD19和CD20双阳的K562稳转株细胞，以及RAJI靶细胞按照1:1比例，在200μl GT-551培养基中培养18h后分别检测T细胞膜表面CD137的表达水平(B)和培养上清中IFNγ的分泌水平(C)。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种CD20靶向性的嵌合抗原受体及其制法和应用，所述嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域包括SEQ ID NO.1所示的抗体重链可变区和SEQ ID NO.2所示的抗体轻链可变区。实验结果表明，本发明提供的嵌合抗原受体显示出了极高的对肿瘤细胞的杀伤能力。
鉴于靶向CD20治疗性抗体亲和力、杀伤机制等方面的不同，以及不同的跨膜结构域、胞内结构域对嵌合抗原受体活性的显著影响，在本发明中，利用多种抗CD20抗体可变区氨基酸序列构结合不同的跨膜和胞内部分，建了靶向CD20的系列嵌合性抗原受体，并完成了这类嵌合性抗原受体在原代T细胞中的表达，建立了受体表达强度的检测方法，鉴定了这些CAR-T细胞体外、体内识别CD20抗原的能力，及其体外杀伤和体内清除携带CD20抗原的恶性肿瘤的活性差异，为临床应用CAR-T治疗CD20阳性的白血病和淋巴瘤提供了新的有效方法和制剂。
嵌合抗原受体
本发明提供了包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向CD20的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域和/或CD28信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
在一个实施方式中，本发明的CD20靶向性CAR包括本发明特定信号传导结构域(CD8的跨膜区、CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成)。与其他方式的CD20靶向性CAR相比，本发明的信号传导结构域显著增加了抗肿瘤活性和CAR-T细胞的体内持久性。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列如下：
CAR-T20.13(SEQ ID NO.29)
Figure BDA0001222300240000071
CAR-T20.13的编码DNA序列(SEQ ID NO.30)如下：
Figure BDA0001222300240000072
Figure BDA0001222300240000081
CAR-T20.14(SEQ ID NO.1):
Figure BDA0001222300240000082
CAR-T20.14的编码DNA序列(SEQ ID NO.2)如下：
Figure BDA0001222300240000083
Figure BDA0001222300240000091
CAR-T20.16(SEQ ID NO.3)
Figure BDA0001222300240000092
CAR-T20.16的编码DNA序列(SEQ ID NO.4)如下：
Figure BDA0001222300240000093
Figure BDA0001222300240000101
在本发明的另一个更佳的实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列如下：
CAR-T20.19(SEQ ID NO.5)
Figure BDA0001222300240000102
CAR-T20.19的编码DNA序列(SEQ ID NO.6)如下：
Figure BDA0001222300240000111
在本发明的另一个最优的实施方式中，本发明提供的嵌合抗原受体(CAR)的氨基酸序列如下：
CAR-T20.20(SEQ ID NO.31)
Figure BDA0001222300240000112
Figure BDA0001222300240000121
CAR-T20.20的编码DNA序列(SEQ ID NO.32)如下：
Figure BDA0001222300240000122
抗原结合结构域
在一个实施方式中，本发明的CAR包括被称为抗原结合结构域的靶-特异性结合元件。本发明CAR的抗原结合结构域为靶向CD20的特异性结合元件。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述抗原结合结构域包括抗CD20抗体的重链可变区和轻链可变区。
在另一优选例中，所述Ofatumumaband抗体重链可变区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0001222300240000131
Ofatumumaband抗体重链可变区编码DNA序列如下：
Figure BDA0001222300240000132
或者，
所述Rituximab抗体重链可变区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0001222300240000133
Rituximab抗体重链可变区编码DNA序列如下：
Figure BDA0001222300240000134
此外，本发明中用到的Obinutuzumab抗体重链可变区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0001222300240000135
Obinutuzumab抗体重链可变区编码DNA序列如下：
Figure BDA0001222300240000136
Figure BDA0001222300240000141
在另一优选例中，所述Ofatumumaband抗体轻链可变区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0001222300240000142
Ofatumumaband抗体编码DNA序列如下：
Figure BDA0001222300240000143
或者，
所述Rituximab抗体抗体轻链可变区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0001222300240000144
Rituximab抗体来源的单链可变区轻链(VL)编码DNA序列：
Figure BDA0001222300240000145
此外，本发明中用到的Obinutuzumab抗体轻链可变区的氨基酸序列如下：
Figure BDA0001222300240000146
Obinutuzumab抗体重链可变区编码DNA序列如下：
Figure BDA0001222300240000147
在本发明的一个优选地实施方式中，重链可变区与轻链可变区之间的氨基酸连接序列如下：
GGGGSGGGGS GGGGS 15(SEQ ID NO.15)
其编码DNA序列如下：
GGTGGCGGTG GCTCGGGCGG TGGTGGGTCG GGTGGCGGCG GATCT 45(SEQ ID NO.16)
绞链区和跨膜区
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
在本发明的一个优选的实施方式中，绞链区包括以下氨基酸序列(IgG4Hinge-CH2-CH3铰链区)：
Figure BDA0001222300240000151
其编码DNA序列如下：
Figure BDA0001222300240000152
或者，所述绞链区包括以下氨基酸序列(IgG4Hinge-CH2-CH3(L235E，N297Q))：
Figure BDA0001222300240000153
其编码DNA序列如下：
Figure BDA0001222300240000154
Figure BDA0001222300240000161
在本发明的一个优选的实施方式中，CD8来源的跨膜区(CD8TM)氨基酸序列如下：
IYIWAPLAGT CGVLLLSLVI TLYC 24(SEQ ID NO.21)
其编码DNA序列如下：
Figure BDA0001222300240000162
在本发明的一个优选的实施方式中，CD28来源的跨膜区(CD28TM)氨基酸序列如下：
FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV 27(SEQ ID NO.37)；
CD28来源的跨膜区(CD28TM)编码DNA序列：
Figure BDA0001222300240000163
胞内结构域
本发明的CAR中的胞内结构域包括4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。
优选地，4-1BB的胞内信号传导结构域包含如下氨基酸序列：
KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL 42(SEQ ID NO.23)
其编码DNA序列如下:
Figure BDA0001222300240000164
优选地，CD28来源的胞内信号传导结构域包含如下氨基酸序列：
RSKRSRLLHS DYMNMTPRRP GPTRKHYQPY APPRDFAAYR S 41(SEQ ID NO.39)
其编码DNA序列如下:
Figure BDA0001222300240000165
优选地，CD3ζ的胞内信号传导结构域包含如下氨基酸序列：
Figure BDA0001222300240000171
其编码DNA序列如下：
Figure BDA0001222300240000172
载体
本发明还提供了编码本发明CAR序列的DNA构建体。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中***本发明的DNA构建体的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的***，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递***的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因***载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒***在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达***是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因***哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散***，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的***，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体***为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递***的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述DNA构建体中还包括信号肽编码序列。优选地，所述信号肽序列连接在所述抗原结核结构域核酸序列的上游。优选地所述信号肽为人源CD8a信号肽。
优选地，所述信号肽氨基酸序列如下：
CD8前导序列(CD8Leader sequence)的氨基酸序列：
MALPVTALLL PLALLLHAAR P 21(SEQ ID NO.27)
CD8前导序列(CD8Leader sequence)的编码DNA序列序列：
Figure BDA0001222300240000191
治疗性应用
本发明包括用编码本发明CAR的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)。转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达本发明CAR的T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本发明的CAR，和CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗CD20 CAR-T细胞引起抗表达CD20的细胞的特异性免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-CD20scFv、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩展细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的T细胞用于治疗CCL。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成CCL风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防CCL的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，***或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的优点包括：
(1)本发明的嵌合抗原受体，其细胞外抗原结合结构域为特定的抗CD20scFv，该特定的抗CD20scFv结合特定的绞链区和胞内结构域形成的CAR显示出了极大的对肿瘤细胞的杀伤能力，而且细胞毒性较小，副作用低。
(2)本发明提供的嵌合抗原受体可在携带CAR基因的慢病毒感染T细胞后实现CAR蛋白的稳定表达和膜定位；
(3)本发明的CAR修饰的T细胞在体内存活时间较长，且抗肿瘤效力较强；对IgG4Hinge-CH2-CH3连接区优化后的CAR，能够避免Fc受体的结合及后续的ADCC作用(抗体依赖性细胞毒作用)。
实施例1慢病毒表达载体的构建
编码质粒为委托上海博益生物科技有限公司做全长DNA合成和克隆构建。各编质粒中，分别使用不同的抗CD20scFv编码序列，克隆载体选用的是pWPT慢病毒载体，克隆位点为BamH I和Sal I位点。具体序列结构如图1所示。各元件的氨基酸和核苷酸序列如上所述。
以下实施例中以效果较好的CAR-T20.13、CAR-T20.14、CAR-T20.16、CAR-T20.19、CAR-T20.20作示例性说明。
实施例2 CAR-T细胞的制备
(1)取健康人静脉血，密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(PBMCs)。
(2)第0天，PBMCs采用含2％人血白蛋白的GT-T551细胞培养基培养，调整细胞终浓度为2×106cell/mL。将细胞接种于预先经过终浓度为5μg/mLCD3单克隆抗体(OKT3)及终浓度为10μg/mL的Retronectin(购自TAKARA公司)包被的细胞培养瓶。培养基里添加终浓度为1000U/mL的重组人白介素2(IL-2)，在37℃，饱和湿度为5％CO2培养箱培养。
(3)第2天，加入新鲜培养液，浓缩纯化的CAR20s慢病毒液，protamine sulfate(12ug/ml)，以及终浓度为1000U/mL IL-2。置于37℃，5％CO2培养箱中感染12小时后，弃培养液，加入新鲜的培养基，于37℃，5％CO2培养箱继续进行培养。
(4)第6天开始，可取CART20s细胞做相应的活性检测试验。
本发明中，对靶向CD20抗原CAR结构修饰T细胞的制备工艺作了改进，选用补加2％人血白蛋白的GT-551无血清培养基在体外培养淋巴细胞。
实施例3 CAR基因在T细胞基因组整合率及其编码蛋白在膜表面表达水平的检测。
分别取0.5×106实施例2中培养到第7天(图2A和图5A)和第11天(图2B)的CART-20s细胞样品，经过Protein L染色在流式细胞仪上分析CAR20蛋白在T细胞膜表面的表达水平。结果显示：本研究中所设计的CAR结构除CAR-T20.13外均可用Protein L检测到嵌合抗原受体在相应修饰的T细胞的细胞膜表面定位。
实施例4 CAR-T20s体外激活能力的检测
采用实施例2中培养到第6天deCAR-T20s细胞与靶细胞共培养后检测CD137的上调水平和培养上清中IFNγ的分泌水平。依次取1*105培养到第6天的CART-20细胞，分别与CD20阳性的RAJI和RAMOS肿瘤细胞系，以及CD20阴性的MOLT-4肿瘤细胞系或不添加肿瘤细胞，在200μl GT-551培养基中按照1:1比例培养18h后流逝方法检测T细胞膜表面CD137的表达水平(图3A)，ELISA方法检测培养上清中IFNγ的分泌水平(图3B)。
从图3的结果我们可以得出如下结论：以Obinutuzumab为基础的CAR也实现了在相应修饰细胞的表达和膜表面定位，但以Ofatumumab序列为基础的CAR结构比以Obinutuzumab和Rituximab为基础构建的CAR显示出更好的体外活化能力和靶抗原特异性。
实施例5 CAR-T20s细胞诱导肿瘤细胞早期凋亡活性的检测
采用实施例2中培养到第11天CAR-T20.13、CAR-T20.14和CAR-T20.16细胞按图4所示比例分别与1*104经过CFSE标记的CD20阴性(MOLT-4)或CD20阳性的(RAJI，RAMOS)肿瘤细胞系，在200μl GT-551培养基中共培养4h，离心收集细胞沉淀，细胞经PBS洗两遍后用Annexin V-APC染料按1:50的比例100μl染液中染色30min，PBS洗1遍后在流失细胞仪上分析CFSE阳性细胞中Annexin V阳性细胞的比例。
图4的结果显示以Ofatumumab序列为基础的CAR结构比以Obinutuzumab和Rituximab为基础构建的CAR显示出更好的体外诱导CD20靶细胞早期凋亡的能力。
实施例6铰链区突变嵌合抗原受体及第三代嵌合抗原受体体外活化能力的鉴定
(1)采用实施例2中方法制备的培养到第7天的CAR-T20s细胞,在保证转染率基本相当的条件下(图5A),分别与K562，CD19单阳、CD20单阳、CD19和CD20双阳的K562稳转株细胞，以及RAJI靶细胞按照1:1比例，各取1*105细胞，在200ulGT-551培养基中培养18h后细胞后检测CD137的上调水平(图5B)和培养上清中IFNγ的分泌水平(图5C)。
(2)图5所示结果表明，在感染效率基本一致的情况下，铰链区突变的嵌合抗原受体CAR-T20.19与CAR-T20.14的体外活化能力(CD137和IFNg)基本相当，而三代CAR结构CAR-T20.20比二代的CAR-T20.14和CAR-T20.19显示出更好的体外活化能力(CD137和IFNg)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 西比曼生物科技（上海）有限公司
西比曼生物科技（无锡）有限公司
<120> 一种靶向CD20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化T细胞的活性鉴定
<130> P2016-1975
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
165 170 175
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp
195 200 205
Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr Phe
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
260 265 270
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr
485 490 495
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
500 505 510
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
515 520 525
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
530 535 540
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
545 550 555 560
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
565 570 575
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
580 585 590
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
595 600 605
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
610 615 620
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
625 630 635 640
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
645 650 655
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
660 665 670
<210> 2
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaagtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggcag gtccctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt aatgattatg ccatgcactg ggtccggcaa 180
gctccaggga agggcctgga gtgggtctca actattagtt ggaatagtgg ttccataggc 240
tatgcggact ctgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaagtccctg 300
tatctgcaaa tgaacagtct gagagctgag gacacggcct tgtattactg tgcaaaagat 360
atacagtacg gcaactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 420
gtctcctcag gtggcggtgg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaaatt 480
gtgttgacac agtctccagc caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 540
tgcagggcca gtcagagtgt tagcagctac ttagcctggt accaacagaa acctggccag 600
gctcccaggc tcctcatcta tgatgcatcc aacagggcca ctggcatccc agccaggttc 660
agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat 720
tttgcagttt attactgtca gcagcgtagc aactggccga tcaccttcgg ccaagggaca 780
cgactggaga ttaaagagag caagtacgga ccgccctgcc ccccttgccc tgcccccgag 840
ttcctgggcg gacccagcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc 900
agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga tcccgaggtc 960
cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag 1020
gaacagttca acagcaccta ccgggtggtg tctgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1080
ctgaacggca aagaatacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgcccag cagcatcgaa 1140
aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct cgcgagcccc aggtgtacac cctgcctccc 1200
tcccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gcctggtgaa gggcttctac 1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc 1320
acccctcccg tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac 1380
aagagccggt ggcaggaagg caacgtcttt agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1440
aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tccctgggca agatctacat ctgggcgccc 1500
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 1560
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1620
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1680
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 1740
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1800
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1860
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1920
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1980
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctag 2019
<210> 3
<211> 670
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr
115 120 125
Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val
145 150 155 160
Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val
165 170 175
Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser
195 200 205
Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
225 230 235 240
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
260 265 270
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
325 330 335
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
355 360 365
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
385 390 395 400
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
465 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp
485 490 495
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
500 505 510
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
515 520 525
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
530 535 540
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
545 550 555 560
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn
565 570 575
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
580 585 590
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
595 600 605
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
610 615 620
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
625 630 635 640
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
645 650 655
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
660 665 670
<210> 4
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc agttgcaaca gcctggagct gagttggtga agcctggtgc ttctgtgaag 120
atgtcttgta aggcttctgg atacacattc acttcttaca acatgcactg ggtgaagcag 180
actcctggta ggggtttgga gtggatcgga gctatctacc caggaaacgg agacacatct 240
tacaaccaga agttcaaggg taaggctaca ttgactgctg acaagtcttc atctactgct 300
tacatgcaat tgtcttcttt gacatctgag gactctgcag tttactactg cgctaggtct 360
acatactacg gaggtgactg gtacttcaac gtgtggggag caggtaccac ggtcactgtc 420
tctgcaggtg gaggtggatc tggaggagga ggatctggtg gaggaggttc tcaaattgtt 480
ctctcccagt ctccagcaat cctgtcagct tctcctggag agaaggtgac tatgacttgc 540
agggcttctt catctgtttc ttacatccac tggttccagc agaagcctgg ttcttcacct 600
aagccttgga tctacgctac atctaacttg gcatctggag tgcctgtgag gttctctggt 660
tctggttcag gtacttctta ctctttgaca atctctaggg tggaggctga ggacgctgct 720
acttactact gccagcagtg gacatctaac cctccaacat tcggaggtgg tactaagttg 780
gagatcaagg agagcaagta cggaccgccc tgcccccctt gccctgcccc cgagttcctg 840
ggcggaccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgg 900
acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aagatcccga ggtccagttc 960
aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggaacag 1020
ttcaacagca cctaccgggt ggtgtctgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 1080
ggcaaagaat acaagtgcaa ggtgtccaac aagggcctgc ccagcagcat cgaaaagacc 1140
atcagcaagg ccaagggcca gcctcgcgag ccccaggtgt acaccctgcc tccctcccag 1200
gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 1260
gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccacccct 1320
cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagcc ggctgaccgt ggacaagagc 1380
cggtggcagg aaggcaacgt ctttagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1440
tacacccaga agagcctgag cctgtccctg ggcaagatct acatctgggc gcccttggcc 1500
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1560
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1620
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1680
aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac 1740
gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1800
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cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1920
ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1980
gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc tag 2013
<210> 5
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
165 170 175
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp
195 200 205
Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr Phe
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
260 265 270
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr
485 490 495
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
500 505 510
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
515 520 525
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
530 535 540
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
545 550 555 560
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
565 570 575
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
580 585 590
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
595 600 605
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
610 615 620
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
625 630 635 640
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
645 650 655
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
660 665 670
<210> 6
<211> 2019
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaagtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggcag gtccctgaga 120
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atacagtacg gcaactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 420
gtctcctcag gtggcggtgg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaaatt 480
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gctcccaggc tcctcatcta tgatgcatcc aacagggcca ctggcatccc agccaggttc 660
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tttgcagttt attactgtca gcagcgtagc aactggccga tcaccttcgg ccaagggaca 780
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agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga tcccgaggtc 960
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gaacagttcc aaagcaccta ccgggtggtg tctgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1080
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aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tccctgggca agatctacat ctgggcgccc 1500
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 1560
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1620
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agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 1740
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1800
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1860
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tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctag 2019
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<210> 8
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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tcctca 366
<210> 9
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
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Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 10
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caggtgcagt tgcaacagcc tggagctgag ttggtgaagc ctggtgcttc tgtgaagatg 60
tcttgtaagg cttctggata cacattcact tcttacaaca tgcactgggt gaagcagact 120
cctggtaggg gtttggagtg gatcggagct atctacccag gaaacggaga cacatcttac 180
aaccagaagt tcaagggtaa ggctacattg actgctgaca agtcttcatc tactgcttac 240
atgcaattgt cttctttgac atctgaggac tctgcagttt actactgcgc taggtctaca 300
tactacggag gtgactggta cttcaacgtg tggggagcag gtaccacggt cactgtctct 360
gca 363
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
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gggacacgac tggagattaa a 321
<210> 13
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctgtcagctt ctcctggaga gaaggtgact 60
atgacttgca gggcttcttc atctgtttct tacatccact ggttccagca gaagcctggt 120
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ttctctggtt ctggttcagg tacttcttac tctttgacaa tctctagggt ggaggctgag 240
gacgctgcta cttactactg ccagcagtgg acatctaacc ctccaacatt cggaggtggt 300
actaagttgg agatcaag 318
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45
<210> 17
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 18
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagatcccg aggtccagtt caattggtac 180
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaacagc 240
acctaccggg tggtgtctgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagaa 300
tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgaaaagac catcagcaag 360
gccaagggcc agcctcgcga gccccaggtg tacaccctgc ctccctccca ggaagagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600
gaaggcaacg tctttagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagagcctga gcctgtccct gggcaag 687
<210> 19
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 20
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctgccc ccgagttcga gggcggaccc 60
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgag 120
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagatcccg aggtccagtt caattggtac 180
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttccaaagc 240
acctaccggg tggtgtctgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagaa 300
tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg cccagcagca tcgaaaagac catcagcaag 360
gccaagggcc agcctcgcga gccccaggtg tacaccctgc ctccctccca ggaagagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg 540
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag 600
gaaggcaacg tctttagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660
aagagcctga gcctgtccct gggcaag 687
<210> 21
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 22
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 23
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 24
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 26
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 27
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 28
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 29
<211> 677
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp
65 70 75 80
Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser
85 90 95
Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr
145 150 155 160
Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile
165 170 175
Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr
180 185 190
Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala
225 230 235 240
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Tyr
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Glu Ser
260 265 270
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
275 280 285
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
290 295 300
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
325 330 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
340 345 350
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
355 360 365
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
370 375 380
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
405 410 415
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
420 425 430
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
435 440 445
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
465 470 475 480
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
485 490 495
Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
500 505 510
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
515 520 525
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
530 535 540
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
545 550 555 560
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
565 570 575
Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
580 585 590
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
595 600 605
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
610 615 620
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
625 630 635 640
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
645 650 655
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
660 665 670
Ala Leu Pro Pro Arg
675
<210> 30
<211> 2034
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc aattggtgca gtctggcgct gaagttaaga agcctgggag ttcagtgaag 120
gtctcctgca aggcttccgg atacgccttc agctattctt ggatcaattg ggtgcggcag 180
gcgcctggac aagggctcga gtggatggga cggatctttc ccggcgatgg ggatactgac 240
tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg acaaatccac tagcacagcc 300
tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg tgtattactg tgcaagaaat 360
gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420
ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatctgatat cgtgatgacc 480
cagactccac tctccctgcc cgtcacccct ggagagcccg ccagcattag ctgcaggtct 540
agcaagagcc tcttgcacag caatggcatc acttatttgt attggtacct gcaaaagcca 600
gggcagtctc cacagctcct gatttatcaa atgtccaacc ttgtctctgg cgtccctgac 660
cggttctccg gctccgggtc aggcactgat ttcacactga aaatcagcag ggtggaggct 720
gaggatgttg gagtttatta ctgcgctcag aatctagaac ttccttacac cttcggcgga 780
gggaccaagg tggagatcaa acgtacggtg gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct 840
tgccctgccc ccgagttcct gggcggaccc agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag 900
gacaccctga tgatcagccg gacccccgag gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccag 960
gaagatcccg aggtccagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 1020
accaagccca gagaggaaca gttcaacagc acctaccggg tggtgtctgt gctgaccgtg 1080
ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagaa tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1140
cccagcagca tcgaaaagac catcagcaag gccaagggcc agcctcgcga gccccaggtg 1200
tacaccctgc ctccctccca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1260
gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag 1320
aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc 1380
cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag gaaggcaacg tctttagctg cagcgtgatg 1440
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctga gcctgtccct gggcaagatc 1500
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1560
ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1620
ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1680
ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtacaagcag 1740
ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1800
gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1860
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1920
atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1980
gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctag 2034
<210> 31
<211> 716
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Phe Asn Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Lys Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr
115 120 125
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile
145 150 155 160
Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg
165 170 175
Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp
195 200 205
Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ile Thr Phe
245 250 255
Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
260 265 270
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Phe Trp
485 490 495
Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val
500 505 510
Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
515 520 525
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
530 535 540
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
545 550 555 560
Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
565 570 575
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
580 585 590
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
595 600 605
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
610 615 620
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
625 630 635 640
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
645 650 655
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
660 665 670
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
675 680 685
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
690 695 700
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
705 710 715
<210> 32
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaagtgc agctggtgga gtctggggga ggcttggtac agcctggcag gtccctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt aatgattatg ccatgcactg ggtccggcaa 180
gctccaggga agggcctgga gtgggtctca actattagtt ggaatagtgg ttccataggc 240
tatgcggact ctgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaagtccctg 300
tatctgcaaa tgaacagtct gagagctgag gacacggcct tgtattactg tgcaaaagat 360
atacagtacg gcaactacta ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 420
gtctcctcag gtggcggtgg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaaatt 480
gtgttgacac agtctccagc caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc 540
tgcagggcca gtcagagtgt tagcagctac ttagcctggt accaacagaa acctggccag 600
gctcccaggc tcctcatcta tgatgcatcc aacagggcca ctggcatccc agccaggttc 660
agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca gcagcctaga gcctgaagat 720
tttgcagttt attactgtca gcagcgtagc aactggccga tcaccttcgg ccaagggaca 780
cgactggaga ttaaagagag caagtacgga ccgccctgcc ccccttgccc tgcccccgag 840
ttcgagggcg gacccagcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc 900
agccggaccc ccgaggtgac ctgcgtggtg gtggacgtga gccaggaaga tcccgaggtc 960
cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag 1020
gaacagttcc aaagcaccta ccgggtggtg tctgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1080
ctgaacggca aagaatacaa gtgcaaggtg tccaacaagg gcctgcccag cagcatcgaa 1140
aagaccatca gcaaggccaa gggccagcct cgcgagcccc aggtgtacac cctgcctccc 1200
tcccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg tccctgacct gcctggtgaa gggcttctac 1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc 1320
acccctcccg tgctggacag cgacggcagc ttcttcctgt acagccggct gaccgtggac 1380
aagagccggt ggcaggaagg caacgtcttt agctgcagcg tgatgcacga ggccctgcac 1440
aaccactaca cccagaagag cctgagcctg tccctgggca agttttgggt gctggtggtg 1500
gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg ctagtaacag tggcctttat tattttctgg 1560
gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc 1620
cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat 1680
cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1740
gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1800
ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc 1860
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1920
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1980
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 2040
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 2100
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta a 2151
<210> 33
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
20 25 30
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttccggata cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg 120
cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180
aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300
tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357
<210> 35
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val
115
<210> 36
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gatatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 60
attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120
tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc 180
tctggcgtcc ctgaccggtt ctccggctcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240
agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300
tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgta cggtg 345
<210> 37
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 38
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 39
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 40
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123

Claims (11)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域包括SEQ ID NO: 7所示的抗体重链可变区，和SEQ ID NO: 11所示的抗体轻链可变区；
并且所述嵌合抗原受体的结构如下式所示：
L－VH－VL－H－TM－CS－CD3ζ
其中，
L为任选的引导序列，即信号肽序列；
H为绞链区；
TM为跨膜结构域；
CS为源于4-1BB和/或CD28的共刺激分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
VH为抗体重链可变区；VL为抗体轻链可变区；“－”为连接肽或肽键；
其中所述嵌合抗原受体的序列如SEQ ID NO: 1、5或31所示。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的序列如SEQ IDNO:5所示。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)。
4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核酸序列如SEQ ID NO:2、32、或6所示。
5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求3所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求5所述的所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求3所述的核酸分子。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为T细胞。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、或权利要求6所述的细胞。
9.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、或权利要求6所述的细胞的用途，用于制备***的药物或制剂。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括CD20阳性肿瘤。
11.一种制备CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述CAR-T细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体，
所述方法包括步骤：将权利要求3所述的核酸分子或权利要求5所述的载体转导入T细胞内，从而获得所述CAR-T细胞。
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