TW201302793A - 新穎之抗原結合蛋白 - Google Patents

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Kyung Oh Johanson
Zdenka Ludmila Jonak
Alexander H Taylor
Christopher B Hopson
Stephen H Trulli
Zdenka Haskova
Judithann M Lee
John R White
Yu Xue
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Abstract

本揭示文係關於抗原結合蛋白，例如結合HER3之抗體，編碼此抗原結合蛋白之多核苷酸、包含該抗原結合蛋白之醫藥組成物及製造方法。本揭示文亦關於此抗原結合蛋白於治療或預防乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、胃癌、黑色素瘤和其他表現HER3之癌症相關疾病之用途。

Description

新穎之抗原結合蛋白
本申請書係申請2010年9月3日申請的美國臨時專利申請案第61/379,840號之利益及2011年2月8日申請的美國臨時專利申請案第61/440,460號之利益。上述核可申請書之教導全文係以引用的方式併入本文中。
本揭示文係關於抗原結合蛋白，例如結合HER3受體之抗體，編碼此抗原結合蛋白之多核苷酸、包含該抗原結合蛋白之醫藥組成物及製造方法。本揭示文亦關於此抗原結合蛋白於治療或預防各種癌症相關疾病之用途。
HER3(亦稱為ErbB3)(SEQ ID NO：21)為四種結構上相關的受體酪蛋白激酶(包括受體之ErbB/HER蛋白家族或表皮生長因子受體(EGFR)家族)之一。這些受體係由含有約620個胺基酸之胞外區、單一跨膜區及細胞質酪胺酸激酶區所組成。各家族成員的胞外區係由四個子域L1、S1(CR1)、L2和S2(CR2)所組成，其中「L」係代表富含白胺酸重複區而「CR」為富含半胱胺酸區。活化這些受體典型地需要配體引發的受體二聚化作用。在這些家族中HER3為獨特的，其中，當其具有配體(神經調節蛋白-1(Neuregulin-1)NRG；調蛋白(Heregulin)HRG；參見表1)結合區時，因為在激酶區中有特定的胺基酸改變存在，則其不具有原有的酪胺酸激酶活性。因此，其可結合配體，但為同源二聚體，無法經由蛋白質磷酸化將訊號送入細胞。然而，其確實與其他具有激酶活性的EGF受體家族成員形成異源二聚體(例如HER1/HER3；HER2/HER3；HER3/HER4)，而形成具訊號傳遞能力活性之基團。其中應特別注意的為與HER2之配對，因為HER2/HER3組合，經由各種胞內路徑包括PI3K/pAKT路徑，似乎具有最高的增生潛在性。當HER3與HER2形成二聚體時，所產生的訊號傳遞複合物可被針對HER2組份之抗體例如帕妥珠單抗(pertuzumab)破壞。此外，當與HER2共表現時，HER3對HRG之親和性可能會增加。最近，HER3與其他細胞表面受體(包括HER家族以外的，例如c-MET)之交互作用已顯示為抵抗特定抗癌劑之重要逃避機制。編碼不同異構型HER3之可變的轉錄剪切變異體已經特性化，但並不完全。一異構型缺乏間膜區且係於細胞外所分泌。此形式可藉由螯合配體用於調節膜結合形式之活性。HER3與其他受體之異源二聚化使得細胞生長和存活重要的路徑活化。因此，控制這些路徑之表現和活化對於生物體正常的生長為必要的，且其任何的損傷皆可能導致疾病。
HER蛋白家族的四個成員因被潛在的生長因子配體之子群活化，而能形成同源二聚物、異源二聚物及更高階寡聚物。下表1係列出已知的HER家族受體之配體。
在小鼠中，喪失任何ErbB家族成員之訊號傳遞會導致器官(包括肺、皮膚、心臟及腦)缺陷之胚胎致死性。在另一方面，過量的ErbB/HER訊號傳遞係與各種實體腫瘤類型之發生有關。在許多人類的癌症中發現ErbB-1(EGFR/HER1)及ErbB-2(HER2)且其過量的訊號傳遞可能與這些腫瘤發生和惡性化有關。例如，EGFR係過度表現在許多癌症中，包括肺及大腸。例如西妥昔單抗(cetuximab)、吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)為用於這些癌症中抑制此受體活化之藥物。在乳癌中，HER2基因增幅及蛋白過度表現，目前係以其中的賀癌平(herceptin)、它莫西芬(tamoxifen)及拉帕替尼(lapatinib)來治療。對這些治療無敏感性為癌症中益增的問題，亦是為何需要更新穎和更有效的治療之主要原因。在許的癌症中已有報告提出HER3基因之增幅及/或其蛋白之過度表現。最近，已顯示，對例如吉非替尼之獲得性阻抗係與HER3過度活化相關聯。此係與磷酸化HER3之c-MET的獲得性過度表現有關，其，轉而活化PI3K/Akt路徑-主要細胞生長/存活路徑。
HER3受體(SEQ ID NO：21)具有獨特的性質並在由HER受體家族媒介的細胞訊號傳遞路徑上佔據著關鍵點。其與一般癌症治療劑之阻抗機制之關聯亦與日漸增。因為其缺乏功能活性激酶區，所以不具有習用小分子之「成藥性」。然而，作為一細胞表面受體，在各種關鍵生長、存活和分化路徑中其活性係依賴與其他細胞表面受體之交互作用，其為生物醫藥方面之受矚目的目標。因此，對於以HER3受體為目標之治療抗體及以此等抗體治療癌症之方法係存有需求。
本揭示文一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為專一性結合HER3受體之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有由SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列及SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列組成之群中選出之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其中此抗原結合蛋白係與包括SEQ ID NO：21之184至329的胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合。
本揭示文另一方面為專一性結合HER3受體之抗原結合蛋白，其中此抗原結合蛋白係與包括SEQ ID NO：21之330至495的胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文亦提供所有與本揭示文等方面有關之單離的核酸、表現載體、重組的宿主細胞、製造抗原結合蛋白之方法、醫藥組成物、治療癌症之方法、用途及製造抗原結合蛋白之方法。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列之20至466胺基酸殘基的重鏈序列，及具有SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列之20至238胺基酸殘基的輕鏈序列。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列之20至466胺基酸殘基的重鏈序列，及具有SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列之20至238胺基酸殘基的輕鏈序列。
本揭示文另一方面為編碼SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列之20至466胺基酸殘基的單離核酸。
本揭示文另一方面為編碼SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列之20至238胺基酸殘基的單離核酸。
本揭示文另一方面為編碼SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列之20至466胺基酸殘基的單離核酸。
詳細說明
本發明係提供與主題有關之抗原結合蛋白。
術語「HER3」和「HER3受體」如文中所用可相互交換，且其任一係指：全長未經處理的HER3之前驅物形式；由C端區之後轉錄裂解所產生的成熟的HER3；潛在及非潛在(活化)形式。術語「HER3」和「HER3受體」亦指任何HER3受體的片段和變異體，其係保留一或多種與HER3受體有關的生物活性。
全長未經處理的HER3受體之前驅物形式包括形成成熟蛋白之前-胜肽和C-區，有或無訊號序列。此形式亦稱為多蛋白。HER3受體前驅物可以單體或二聚體存在。
成熟的HER3為從HER3前驅蛋白之C端裂解之蛋白，亦稱為C-端區。成熟的HER3可以單體、二聚體或潛隱複合物存在。依照情況，成熟的HER3可在這些不同形式之組合間建立平衡。
HER3前-胜肽為依照訊號序列從HER3前驅蛋白之N-端區裂解之多肽。前-胜肽亦稱為潛伏相關胜肽(LAP)。HER3前-胜肽能與成熟HER3的前-胜肽結合區非共價結合。
HER3受體抗原結合蛋白可與任一HER3受體之前驅物、成熟、單體、二聚理、潛隱和活化形式或其任何之組合結合。抗原結合蛋白可與單體形式及/或二聚化形式之成熟的HER3受體結合。抗原結合蛋白可與HER3受體之前-胜肽及/或卵泡抑素複合物相結合。另外，抗原結合蛋白可與HER3受體之HER2受體複合物或其他HER3交互作用受體(例如HER3之異源二聚體)複合物相結合。
術語「抗原結合蛋白」如文中所用係指單離的抗體、抗體片段、抗原結合片段和其他蛋白結構，例如能與HER3受體(SEQ ID NO：21)、包括SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的HER3受體II區或包括SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的HER3受體III區結合之區域。
術語「抗體」用於文中最廣義係指帶有類免疫球蛋白區之分子並包括單株、重組、多株、嵌合、人源化、雙專一性及異源接合抗體，例如單株抗體/區域抗體結合物；單一可變區；區域抗體；抗原結合片段；免疫學上有效片段；單鏈Fv；雙抗體；TANDABSTM等(替代的「抗體」形式之概要請參見Holliger,等人,Nature Biotechnology,Vol 23,No. 9：1126-1136(2005))。
「單一可變區」一詞，如文中所用係指抗原結合蛋白可變區(例如，VH、VHH、VL)，其係與抗原或獨立於不同的可變區域或區之抗原決定位專一性結合。
術語「區域抗體」或「dAb」如文中所用可視為與能結合抗原之「免疫球蛋白單一可變區」相同。免疫球蛋白單一可變區可為人類抗體可變區，但亦包括其他物種之單一抗體可變區，例如囓齒類(例如WO 00/29004中揭示)、護士鯊及駱駝科(Camelid)VHH dAbs。駱駝科VHH為衍生自包括駱駝、大羊駝、羊駝、單峰駝、原駝等物種之免疫球蛋白單一可變區多肽，其產生本質上缺乏輕鏈之重鏈。此等VHH區可根據本項技術中可取得的標準技術人源化，且此等區可視為「區域抗體」。如文中所用VH包括駱駝科VHH區。NARV為另一種在軟骨魚(包括護士鯊)中辨識出之免疫球蛋白單一可變區。這些區域亦稱為新穎的抗原受體可變區(一般縮寫為V(NAR)或NARV)。就更進一步的詳情請參見Mol. Immunol. 44,656-665(2006)及US20050043519A，其係以引用的方式併入本文中。
如文中所用，術語「區域」係指具有與其餘的蛋白無關之三級結構的摺疊蛋白結構。一般而言，區域係負責蛋白之離散的功能性，且在許多案例中，可在無喪失剩餘的此蛋白及/或此區域之功能下，經添加、移除或轉移至其他蛋白。術語「免疫球蛋白單一可變區」如文中所用為包括抗體可變區之序列特性的摺疊多肽區。因此，其包括完整的抗體可變區及修飾的可變區，例如其中一或多個環經不具抗體可變區特性之序列取代，或經截斷或包括N-或C-端延伸之抗體可變區，以及保留至少全長區域之結合活性和專一性之可變區的摺疊片段。區域可與抗原或獨立於不同的可變區域或區之抗原決定位結合。
術語「抗原決定位結合區」係指專一性與抗原或獨立於不同的V區域或區之抗原決定位結合之區，其可為區域抗體(dAb)，例如人類、駱駝科或鯊魚免疫球蛋白單一可變區，或其可為選自CTLA-4(Evibody)組成之群之支架的衍生物；lipocalin；蛋白A衍生分子，例如蛋白A之Z-區(Affibody,SpA)、A-區(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白例如GroEL和GroES；運鐵蛋白(trans-body)；錨蛋白重複蛋白(DARPin)；胜肽適體；C-型凝集素區(Tetranectin)；人類γ-晶體蛋白及人類泛素(affilins)；PDZ區；蠍毒素、人類蛋白酶抑制劑之kunitz型區；及纖維連接蛋白(adnectin)；其係經蛋白工程，以便得以與天然配體以外的配體結合。
抗原結合片段可藉由將一或多個排列在非抗體蛋白支架，例如一區域中之CDR，來提供。此區域可為區域抗體，或其可為由下列組成之群中選出之支架衍生物的區域：CTLA-4(Evibody)；lipocalin；蛋白A衍生分子，例如蛋白A之Z-區(Affibody,SpA)、A-區(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白例如GroEL和GroES；運鐵蛋白(trans-body)；錨蛋白重複蛋白(DARPin)；胜肽適體；C-型凝集素區(四聯蛋白)；人類-晶體蛋白及人類泛素(affilins)；PDZ區；蠍毒素、人類蛋白酶抑制劑之kunitz型區；及纖維連接蛋白(adnectin)；其係經蛋白工程，以便得以與天然配體以外的配體結合。
CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞-相關抗原4)為主要表現在CD4+ T-細胞之CD28-家族受體。其胞外區具有一類可變區域Ig摺疊。對應抗體CDR之環可經異源序列取代，而給予不同的結合性質。經工程化而具有不同結合專一性之CTLA-4分子亦稱為Evibody。就更進一步詳情請參見Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。
Lipocalin為轉運小的疏水性分子例如類固醇、後膽色素、類視色素和脂質之胞外蛋白家族。其具有堅硬的薄片二級結構，在錐形結構的開口端有許多環，其可經工程化與不同的目標抗原結合。Anticalin的大小介於160-180個胺基酸間，且係衍生自lipocalin。就更進一步的詳情請參見Biochim Biophys Acta 1482：337-350(2000),US7250297B1 and US20070224633。
Affibody為衍生自金黃色葡萄球菌之A蛋白的支架，其可經工程化與抗原結合。此區係由大約58個胺基酸之三螺旋束所組成。已由表面殘基之隨機化產生資料庫。就更進一步的詳情請參見Protein Eng. Des. Sel. 17,455-462(2004)及EP1641818A1。
Avimer為衍生自A-區域支架蛋白家族之多區蛋白。此大約35個胺基酸之原生區係採用定義的雙硫鍵鍵結結構。藉由A-區家族具有的天然變異之改組產生多樣性。就更進一步的詳情請參見Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。
運鐵蛋白為單體式血漿轉運糖蛋白。運鐵蛋白可經工程化，藉由在允許的表面環***胜肽序列與不同的目標抗原結合。工程化運鐵蛋白支架之實例包括Trans-body。就更進一步的詳情請參見J. Biol. Chem 274,24066-24073(1999)。
經設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin)係衍生自錨蛋白，其為媒介膜整合蛋白黏附細胞骨架之蛋白家族。單一的錨蛋白重複為由二-螺旋和一轉折所組成之33個殘基模體。其可經工程化，藉由在各重複的第一螺旋和轉折隨機化殘基，與不同的目標抗原結合。其結合介面可藉由增加模組數目來增加(親和力成熟之方法)。就更進一步的詳情請參見J. Mol. Biol. 332,489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003) and J. Mol. Biol. 369,1015-1028(2007)和US20040132028A1。
纖維連接蛋白為可經工程化與抗原結合之支架蛋白。Adnectin係由15個重複單元之人類纖維連接蛋白第III型(FN3)的10區之天然胺基酸序列骨架所組成。三個環在三明治的一端，其可經工程化使得Adnectin能專一辨識出相關的治療目標。就更進一步的詳情請參見Protein Eng. Des. Sel. 18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。
胜肽適體為由恆定支架蛋白所組成之組合的辨識分子，典型地，含有一約束的可變胜肽環***活性位置之硫氧化還原蛋白(thioredoxin)(TrxA)。就更進一步的詳情請參見Expert Opin. Biol. Ther. 5,783-797(2005)。
微抗體係由長度25-50個胺基酸中含有3-4個半胱胺酸橋之天然生成的微蛋白所衍生-微蛋白之實例包括KalataB1及芋螺毒素(conotoxin)和knottin。微蛋白具有一個可在無影響整體微蛋白摺疊下經工程化，用以包括高達25個胺基酸的環。就工程化knottin區之更進一步的詳細說明請參見WO2008098796。
其他的抗原決定位結合區包括已用作支架供工程化不同目標抗原結合性質之蛋白，包括人類晶體蛋白和人類泛素(affilins)、人類蛋白酶抑制劑之kunitz型區、Ras-結合蛋白AF-6之PDZ區、蠍毒素(卡律不德蠍毒素)、C-型凝集素區(四聯蛋白)；及纖維連接蛋白(adnectin)，係參見第7章-Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007,Stefan Dubel編輯)及Protein Science 15：14-27(2006)。本揭示文之抗原決定位結合區可衍生自任何這些可替代的蛋白區。
抗原結合片段或免疫學上有效的片段可包括部分重鏈或輕鏈可變序列。片段長度為至少5、6、8或10個胺基酸。另外，片段長度為至少15個、至少20個、至少50個、至少75個或至少100個胺基酸。
術語「專一性結合」如文中所用與抗原結合、蛋白相關時係指與抗原結合蛋白與HER3受體以及離散區，或離散的胺基酸序列結合，在HER3受體中沒有或非顯著與其他(例如，無關的)蛋白結合。然而，此術語並未將抗原結合蛋白可能與密切相關的分子(例如HER2受體)交叉反應之事實排除在外。文中所述之抗原結合蛋白可以至少比其與密切相關分子結合(例如HER2受體)大2、5、10、50、100或1000-倍之親合力結合。
文中所提供的範圍包括所有描述的特定範圍及大約特定範圍端點值之內的所有值。
抗原結合蛋白-HER3交互作用之結合親和力(KD)可為1 mM或更低，100 nM或更低，10 nM或更低，2 nM或更低或1 nM或更低。另外，KD可介於5至10 nM間；或介於1至2 nM間。KD可介於1 pM至500 pM間；或介於500 pM至1 nM間。抗原結合蛋白之結合親和力係以結合常數(Ka)和解離常數(Kd)來測定(KD=Kd/Ka)。結合親和力可以BIACORETM來測量，例如將試驗的抗體捕捉至塗覆蛋白-A的感應器表面並讓HER3受體流過此表面。另外，結合親和力可以FORTEBIOTM來測量，例如將試驗的抗體受體捕捉至塗覆蛋白-A的針上並讓HER3受體流過此表面。
Kd可為1x10-3 Ms-1或更低，1x10-4 Ms-1或更低，或1x10-5 Ms-1或更低。Kd可介於1x10-5 Ms-1至1x10-4 Ms-1間；或可介於1x10-4 Ms-1至1x10-3 Ms-1間。慢的Kd可導致慢的抗原結合蛋白-配體複合物解離及促進配體之中和。文中所述的抗原結合蛋白之示例的結合親和力和相關的數據係提供於表2中。
在表2中，「鼠科15D5抗體」係指包括SEQ ID NO：1-8所示的可變重鏈、可變輕鏈、互補決定區及架構區之單株抗體；「人源化15D5抗體」係指包括SEQ ID NO：22-29所示的可變重鏈、可變輕鏈、互補決定區及架構區之單株抗體；「鼠科1D9抗體」係指包括SEQ ID NO：44-51所示的可變重鏈、可變輕鏈、互補決定區及架構區之單株抗體；「人源化1D9抗體」係指包括SEQ ID NO：30-37所示的可變重鏈、可變輕鏈、互補決定區及架構區之單株抗體。特言之，表2中「人源化1D9單株抗體係包括SEQ ID NO：30所示的重鏈可變區胺基酸序列及SEQ ID NO：57所示的可變輕鏈胺基酸序列，以及SEQ ID NO：30-33和SEQ ID NO：35-37所示的對應互補決定區。
術語「ECD」係指胞外區及，就HER3而言可指包括HER3異構型的I、II、III及IV區之胜肽鏈，例如具有SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列者。
術語「中和」如文中所用係指在活體外或活體內，與無抗原結合蛋白存在下之HER3活性相比較時，在如文中所述的抗原結合蛋白之存在下HER3的生物活性降低了。中和可因(但不限於)一或多項之阻斷HER3與其配體結合、阻止HER3被其配體活化、下調HER3受體或其配體、干擾受體認可「活化」構型之能力(例如足以勝任訊號傳遞)、阻斷受體異源或同源或寡聚化之能力或另外影響受體活性或效應子功能。
HER3受體活性之測量包括(但不限於)測定磷酸化受體(pHER3)、磷酸化AKT(pAKT)、HER3和HER(或其他)受體家族成員間形成複合物之程度，PI3激酶、ERK2、c-Jun或PYK2活性減低，表現腫瘤細胞株之HER3增生、該細胞株在軟性瓊脂上之生長能力(選殖株生長)，此株跨膜回應配體之遷移等。
生物活性之減低或抑制可為部分的或完全的。相較於缺乏抗原結合蛋白下之HER3活性，中和抗原結合蛋白可中和至少20%、30%40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之HER3受體活性。在功能分析中，IC50為降低50%其最大生物反應時之濃度。
中和可使用一或多種熟習技術者已知之分析，或如文中所述來測定或測量。例如，可於三明治ELISA中以BIACORETM、FMAT、FORTEBIOTM或類似的體外分析來評估抗原結合蛋白與HER3結合。
ELISA受體結合分析可藉由在抗原結合蛋白的存在下測量HER3受體與其固定在一微孔盤中之配體-神經調節蛋白1和神經調節蛋白2之結合，用於測定抗原結合蛋白之中和活性。
另外，細胞受體結合分析可藉由測量抑制受體結合、下游訊號傳遞及基因活化，用於測定抗原結合蛋白之中和活性。
活體內的中和作用可於例如於任一HER3媒介的功能及/或訊號轉導或其組合顯示變化之動物中，使用數種不同的分析，例如磷酸化受體(pHER3)、磷酸化AKT(pAKT)、HER3和HER(或其他)受體家族成員間形成複合物減少，PI3激酶、ERK2、c-Jun或PYK2活性減低，以及藉由在腫瘤異體移植模型中測量抗原結合蛋白防止、降低或另外減小腫瘤細胞生長之能力，來測定。
術語「效應子功能」如文中所用係指一或多種抗體依賴細胞媒介的細胞毒殺活性(ADCC)和補體依賴的細胞毒殺活性(CDC)媒介的反應、Fc-媒介的吞噬作用及經由FcRn受體之抗體再利用。咸信，抗體恆定區和各種Fc受體(FcR)間之交互作用媒介了抗體之效應子功能。顯著的生物效應可能為效應子功能性之結果，特別是抗體-依賴的細胞毒殺(ADCC)、補體結合(補體依賴的細胞毒殺或CDC)、吞噬作用(抗體-依賴的細胞媒介之吞噬作用或ADCP)及抗體之半衰期/清除。通常，媒介效應子功能之能力需要抗體與抗原結合且並非所有的抗體會媒介每一種效應子功能。
效應子功能可以許多方式來測量，包括經由FcγRIII與天然殺手細胞之結合或經由FcγRI與單核細胞/巨噬細胞之結合，測量ADCC效應子功能。例如，當在天然的殺手細胞分析中測量抗同等的野生型抗體或其抗原結合片段時，本發明之抗體或抗原結合片段具有增進的ADCC效應子功能。此等分析之實例可參見Shields等人,2001 The Journal of Biological Chemistry,Vol. 276,p6591-6604；Chappel等人,1993 The Journal of Biological Chemistry,Vol 268,p25124-25131；Lazar等人,2006 PNAS,103；4005-4010。測定CDC功能之分析的實例包括1995 J Imm Meth 184：29-38中所述之分析。
依照所欲的效應子性質，可對抗體之重鏈恆定區進行各種修飾。人類恆定區，其本質上缺乏下列功能：a)以經典路徑活化補體；及b)媒介抗體-依賴的細胞毒性，包括IgG4恆定區和IgG2恆定區。含有特定突變之IgG1恆定區就其減低與Fc受體之結合並因此降低ADCC和CDC，已各別描述(Duncan等人,Nature 1988,332；563-564；Lund等人J. Immunol. 1991,147；2657-2662；Chappel等人,PNAS 1991,88；9036-9040；Burton和Woof,Adv. Immunol. 1992,51；1-84；Morgan等人.,Immunology 1995,86；319-324；Hezareh等人,J. Virol. 2001,75(24)；12161-12168)。含有特定突變或殘基Asn297上變異的糖基化之人類IgG1恆定區對其促進與Fc受體結合亦已有描述。在某些案例中，此等已顯示促進ADCC和CDC(Lazar等人,PNAS 2006,103；4005-4010；Shields等人,J Biol Chem 2001,276；6591-6604；Nechansky等人,Mol Immunol,2007,44；1815-1817)。
就IgG抗體，效應子功能性包括ADCC和ADCP，係由重鏈恆定區與存在免疫細胞表面的Fcγ受體家族之交互作用所媒介。在人類中，此等係包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。與抗原結合之抗體和形成Fc/Fcγ複合物間之交互作用引發一定範圍的效應，包括細胞毒殺作用、免疫細胞活化、吞噬作用及發炎性細胞激素之釋放。在恆定區(包括S239D/I332E)專一性的取代作用已知係增加重鏈恆定區對特定Fc受體之親和力，因而促進了抗體之效應子功能性(Lazar等人.PNAS 2006)。對熟習本項技術者顯而易見的，術語「衍生」如文中所用，希望不僅係以物質之生理來源的意義加以定義，亦定義其結構上與此物質相同但並非源自於參照來源之物質。因此，「供體抗體中所發現之殘基」並非必要係由供體抗體所純化。
「單離的」，係希望，此分子例如抗原結合蛋白或核酸，係從可於自然界中發現的環境中所移出。例如，此分子可從一般天然存在的物質中純化出。例如，樣本中分子的質量可為總質量之95%。
術語「表現載體」如文中所用係指單離的核酸，其可用於將相關的核酸導入細胞中，例如真核細胞或原核細胞，或其中相關的核酸序列係以胜肽鏈(例如蛋白)表現之無細胞表現系統。此等表現載體可為，例如黏粒、質體、病毒序列、轉位子及包括相關核酸之線性核酸。一旦表現載體導入細胞或無細胞表現系統(例如網織紅細胞裂解物)後，由相關核酸所編碼的蛋白則藉由轉錄/轉譯機制產生。本揭示文範圍內的表現載體可提供真核細胞或原核細胞表現之必要的元素，並包括病毒啟動子驅動載體，例如CMV啟動子驅動載體，例如pcDNA3.1、pCEP4及其衍生物。桿狀病毒表現載體、果蠅(Drosophila)表現載體及由哺乳動物基因啟動子驅動的表現載體，例如人類Ig基因啟動子。其他實例包括原核細胞表現載體，例如T7啟動子驅動載體，例如pET41、乳糖啟動子驅動載體及***糖基因啟動子驅動載體。熟習本項技術者應可辨認許多其他適合的表現載體和表現系統。
術語「重組的宿主細胞」如文中所用係指包括相關核酸序列之細胞，其中該核酸序列係在導入細胞前分離出的。例如，當此細胞為原核細胞或真核細胞時，此相關的核酸序列可在表現載體中。示例的真核細胞有哺乳動物細胞，例如(但不限於)COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、NS0、293、HeLa、骨髓瘤、淋巴細胞或其任何衍生物。最佳地，真核細胞為HEK293、NS0、SP2/0或CHO細胞。大腸桿菌(E. coli)為示例的原核細胞。本揭示文之重組細胞可藉由轉染、細胞融合、永生化或其他本項技術熟知的製程來製造。相關的核酸序列，例如表現載體，轉染到細胞，可為染色體外或穩定地整合於細胞染色體中。
「嵌合抗體」係指一工程化抗體類型，其係含有衍生自供體抗體之天然生成可變區(輕鏈和重鏈)與衍生自受體抗體之輕鏈和重鏈恆定區結合。
「人源化抗體」係指一工程化抗體類型，其具有衍生自非人類供體免疫球蛋白之CDR，該分子之其餘的免疫球蛋白衍生部分係衍生自一或多種人類免疫球蛋白。此外，架構載體殘基可經改變以便保留結合親和力(參見，例如Queen等人,Proc. Natl Acad Sci USA,86：10029-10032(1989),Hodgson,等人,Bio/Technology,9：421(1991))。適合的人類受體抗體可為選自習知數據庫，例如KABATTM數據庫、Los Alamos數據庫及Swiss Protein數據庫，與供體抗體之核苷酸和胺基酸序列同源。特徵為與供體抗體之架構區同源(以胺基酸為基準)的人類抗體可能適合提供用於***供體CDR之重鏈恆定區及/或重鏈可變架構區。能供給輕鏈恆定區或可變架構區之適合的受體抗體可用類似的方法來選擇。應注意，受體抗體重鏈和輕鏈並不需要源自相同的受體抗體。先前技術描述了數種製造此等人源化抗體之方法-參見，例如EP-A-0239400和EP-A-054951。
術語「供體抗體」係指將其可變區之胺基酸、CDR或其他功能片段或其類似物給予第一免疫球蛋白夥伴之抗體。因此，供體係提供變異的免疫球蛋白編碼區及生成表現具抗原專一性之變異抗體及中和供體抗體之活性特性。
術語「受體抗體」係指與供體抗體互為異源之抗體，其係將所有的(或任何部分)編碼其重鏈及/或輕鏈架構區，及/或其重鏈及/或輕鏈恆定區之胺基酸序列給予第一免疫球蛋白夥伴。人類抗體可為受體抗體。
術語「VH」和「VL」如文中所用分別係指抗原結合蛋白之重鏈可變區和輕鏈可變區。
「CDR」係定義為抗原結合蛋白之互補決定區胺基酸序列。此等為免疫球蛋白重鏈和輕鏈之高變區。在免疫球蛋白之可變部分有三種可變重鏈和三種可變輕鏈CDR(或CDR區)。因此，「CDR」如文中所用係指所有三種重鏈CDR、所有三種輕鏈CDR、所有的重鏈和輕鏈CDR或至少一CDR且其中至少一CDR為CDRH3。
在整個說明書中，可變區序列和全長抗體序列中之胺基酸殘基係根據Kabat編號規則加以編號。同樣地，用於實例中之術語「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」係依照Kabat編號規則。就更進一步的訊息，請參見Kabat,等人,SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第4版,U.S. Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。
對熟習本項技術者顯而易見的，有替代的編碼規則可用於可變區序列和全長抗體序列中之胺基酸殘基。亦有用於CDR序列之替代的編碼規則，例如該等描述於Chothia,等人(1989) Nature 342：877-883中者。抗體之結構和蛋白摺疊可能表示其他殘基係視為CDR序列之部分且熟習技術者應可明瞭。
其他用於CDR序列之編號規則已為熟習技術者所知，包括「AbM」(University of Bath)及「接觸(contact)」(University College London)法。使用至少二種Kabat、Chothia、AbM和接觸法可測定最小重疊區，用以提供「最小結合單位」。最小結合單位可為CDR之子部分。
下表3係代表使用各編號規則對各CDR或結合單位之定義。表3中係使用Kabat編號流程對可變區胺基酸序列進行編號。應注意，依照所用的個別版本，某些CDR定義可能不同。
如文中所用，術語「抗原結合位置」係指能與抗原專一性結合之抗原結合蛋白的位置。其可為單一區(例如，抗原決定位結合區)或單鏈Fv(ScFv)區，或其可如標準抗體中所發現的可為成對的VH/VL區。
術語「抗原決定位」如文中所用係指得以與抗原結合蛋白的特定結合區接觸之抗原的部分。抗原決定位可為線性的，包括來自抗原本質上線性的胺基酸序列。另外，抗原決定位可為構形或非連續的。例如，構形抗原決定位係包括需要結構約束元素之胺基酸殘基。非連續抗原決定位係包括被其他序列分開之胺基酸殘基，亦即抗原的初級序列為非連續的序列。在抗原三級和四級結構之環境中，非連續抗原決定位之殘基彼此間夠接近足以與抗原結合蛋白相結合。
就核苷酸和胺基酸序列而言，術語「相同」或「序列一致性」係指當完全對齊並以適當的***或刪除相比較時，二組核苷酸或二組胺基酸序列間之一致性程度。
二序列間之一致性百分比為序列共享的相同位置數目之函數(亦即，一致性%=位置相同之數目/位置的總數，乘以100)，考慮空位數目及各空位之長度，其需要以二序列之最佳排列導入。比較序列及決定二序列間之一致性百分比可使用如下述之數學比對演算法來進行。
二個核苷酸序列間之一致性百分比可使用GCG套裝軟體之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之空位權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定。二個核苷酸序列或胺基酸序列間之一致性百分比亦可使用Meyers,等人,Comput. Appl. Biosci.,4：11-17(1988)之比對演算法，併入ALIGN程式(version 2.0)，使用PAM120重量殘基表，以空位罰值12及空位罰值4來測量。此外，二個胺基酸序列間之一致性百分比亦可使用Needleman,等人,J. Mol. Biol. 48：444-453(1970)之比對演算法，併入GCG套裝軟體之GAP程式，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及16、14、12、10、8、6之空位權重或4及1、2、3、4、5或6之長度權重來測量。
例如，多核苷酸序列可與參照的多核酸序列相同，即與參照序列100%相同，或其可包括高達特定整數數目的核苷酸變異，例如至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99%一致性。此等變異係選自至少一個核苷酸刪除、取代[包括同類置換(transition)和異類置換(transversion)]，或***，其中該變異可發生在參照核苷酸序列的5'或3'端位置或此等端點位置間的任何處，個別地穿插在參照序列的核苷酸中或以一或多個連續群組穿插在參照序列中。核苷酸變異的數目係藉由文中所述的參照多核苷酸序列中的核苷酸總數乘以個別的一致性百分比(除以100)的百分比數值並以參照多核苷酸序列中的該核苷酸總數減掉此乘積所測定，或：
nn xn-(xn‧y),
其中nn為核苷酸變異之數目，xn為文中所述的參照多核苷酸序列中之核苷酸總數(參見「序列表」中之核酸序列作為示例的參照多核苷酸序列)，y為0.50代表50%，0.60代表60%，0.70代表70%，0.75代表75%，0.80代表80%，0.85代表85%，0.90代表90%，0.95代表95%，0.98代表98%，0.99代表99%或1.00代表100%，‧為乘法運算之符號，且其中xn和y之非整數的乘績在被xn減掉前先四捨五入至最接近的整數。
同樣地，多肽序列可與文中所述的多肽參照序列相同(參見「序列表」中之胺基酸序列作為示例的參照多肽序列)，即100%相同，或相較於參照序列其可包括高達特定整數數目的胺基酸變異，使其一致性%低於100%，例如至少50、60、70、75、80、85、90、95、98或99%一致性。此等變異係選自下列組成之群：至少一個胺基酸刪除、取代(包括保守性和非保守性取代)或***，且其中該變異可發生在參照多肽序列之胺基端或羧基端位置或此等端點位置間的任何處，個別地穿插在參照序列的胺基酸中或以一或多個連續群組穿插在參照序列中。所給予的一致性%之胺基酸變異的數目係將由多肽參照序列所編碼多肽序列中胺基酸的總數乘以乘以個別的一致性百分比(除以100)的百分比數值及然後以如文中所述的多肽參照序列中之該胺基酸總數減掉此乘積所測定(參見，例SEQ ID NOs：1-21)，或：
na xa-(xa‧y),
其中na為胺基酸變異之數目，xa為照序多肽參列中之胺基酸總數，而y為0.50代表50%，0.60代表60%，0.70代表70%，0.75代表75%，0.80代表80%，0.85代表85%，0.90代表90%，0.95代表95%，0.98代表98%，0.99代表99%或1.00代表100%，‧為乘法運算之符號，且其中xa和y之非整數的乘績在被xn減掉前先四捨五入至最接近的整數。
一致性%可跨過序列長度來測定。如文中所定義，術語「超過75%一致性」包括超過75%、80%、85%、95%和99%一致性以及在此範圍內之所有個別的值及個別的子範圍。
術語「胜肽」、「多肽」及「蛋白」各係指包括一或多個胺基酸殘基之分子。胜肽可為單聚或多聚性。
在本項技術已完全了解，特定的胺基酸取代被認為是「保守性」。胺基酸係以共通的側鏈性質來分類，且各類的取代作用若維持所有或大體上所有抗原結合蛋白之結合親和力，則被認為是保守性取代作用。參見表4。文中所揭示的抗原結合蛋白可包括此「保守性」胺基酸取代作用。
本揭示文一方面為與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。較佳的，本揭示文之抗原結合蛋白係包括至少一個CDRH3，例如來自文中所述的鼠科或人源化1D9、15D5、22A5單株抗體之CDRH3。
本揭示文亦提供與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係由嵌合抗體和人源化抗體組成之群中選出。
本揭示文亦提供與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：2所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：3所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：5所示的CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及一具有SEQ ID NO：2所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：7所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：8所示的CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
本揭示文亦提供與包括SEQ ID NO：21之184至329的胺基酸殘基之胜肽鏈區專一性結合的抗原結合蛋白。SEQ ID NO：21之184至329的胺基酸殘基包括HER3之II區。HER3之II區係涉及二聚體形成，例如異源二聚化作用。
本揭示文另一方面為與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
本揭示文亦提供與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：23所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：24所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：25所示的CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及一具有SEQ ID NO：27所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：28所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：29所示的CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
本揭示文另一方面為與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：851組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
本揭示文亦提供與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：45所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：46所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：47所示的CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及具有SEQ ID NO：49所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：50所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：51所示的CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
本揭示文亦提供與包括SEQ ID NO：21之330至495的胺基酸殘基之胜肽鏈區專一性結合的抗原結合蛋白。SEQ ID NO：21之330至495的胺基酸殘基包括HER3之III區。HER3之III區係涉與HER3受體之配體結合。
本揭示文另一方面為與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
本揭示文另一方面為與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：31所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：32所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：33所示的CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及一具有SEQ ID NO：35所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：36所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：37所示的CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
本揭示文另一方面為與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19及SEQ ID NO：20組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。。
本揭示文亦提供與HER3受體專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：10所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：11所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：12所示的CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及一具有SEQ ID NO：12所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：7所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：8所示的CDR胺基酸序列之輕鏈可變區，或一具有SEQ ID NO：18所示的CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：19所示的CDR胺基酸序列和SEQ ID NO：20所示的CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
本揭示文亦提供與HER3專一性結合之抗原結合蛋白且其係抑制包括SEQ ID NO：21所示之序列胺基酸之二聚體形成。本項技術之一般技術者應了解，二聚體形成之抑制作用可在有或無本揭示文之抗原結合蛋白的存在下，藉由二聚體定量分析來測定。此等二聚體形成分析已為本項技術所熟知，例如共沉澱分析或雙雜合分析。
本揭示文另一方面為與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為專一性結合HER3之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為專一性結合HER3之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為專一性結合HER3之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為專一性結合HER3之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有由SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列和SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列組成之群中選出之輕鏈可變區序列。
本揭示文另一方面為專一性結合至HER3受體之抗原結合蛋白，其係包括一具有SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列之重鏈可變區序列，及一具有SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本揭示文亦提供編碼本文所述的抗原結合蛋白之單離的核酸。
本揭示文亦提供一單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：38所示的核酸序列和SEQ ID NO：39所示的核酸序列組成之群中選出之核酸。
本揭示文亦提供一單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：59所示的核酸序列和SEQ ID NO：60所示的核酸序列組成之群中選出之核酸。
本揭示文亦提供一單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：40所示的核酸序列和SEQ ID NO：41所示的核酸序列組成之群中選出之核酸。
本揭示文亦提供一單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：52所示的核酸序列和SEQ ID NO：53所示的核酸序列組成之群中選出之核酸。
本揭示文亦提供一單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：42所示的核酸序列和SEQ ID NO：43所示的核酸序列組成之群中選出之核酸。
本揭示文亦提供一單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：42所示的核酸序列和SEQ ID NO：58所示的核酸序列組成之群中選出之核酸。
本揭示文亦提供單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：54所示的核酸序列、SEQ ID NO：55所示的核酸序列和SEQ ID NO：56所示的核酸序列組成之群中選出之核酸。
本揭示文亦提供單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：63所示的核酸序列、SEQ ID NO：64所示的核酸序列和SEQ ID NO：65所示的核酸序列組成之群中選出之核酸。
本揭示文亦提供包含文中所述的單離核酸之表現載體。
本揭示文亦提供製造與HER3專一性結合之抗原結合蛋白的方法，其包括培養重組的宿主細胞，該重組的宿主細胞包括含有文中所述的單離核酸之表現載體之步驟；及回收此抗原結合蛋白。
本揭示文亦提供包括文中所述的抗原結合蛋白；及醫藥上可接受載劑之醫藥組成物。
本揭示文亦提供於一對象中治療癌症之方法，其包括將一治療上有效量之文中所述的抗原結合蛋白投予此對象，據此治療此對象之癌症。
本揭示文亦提供於一哺乳動物中治療癌症之方法，其包括投予一治療上有效量之文中所述的抗原結合蛋白。
在本揭示文方法之另一方面，此哺乳動物為人類。
在本揭示文方法之另一方面，此癌症係選自乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
在一實施例中，亦提供如文中所述之抗原結合蛋白用於治療乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤之用途。
本揭示文亦提供於一對象中治療癌症之方法，其包括下列步驟：a)辨識患有癌症之對象，其中該癌症係由下列組成之群中選出：乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤；及b)將一治療上有效量之文中所述的抗原結合蛋白投予此對象，據此治療此對象之癌症。
本揭示文亦提供進一步包括下列步驟之治療方法：c)測定包括SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的癌症表現蛋白。此測定可以完整的癌細胞分析，或此等細胞的製備物，例如解離物或免疫組織化學(IHC)製備物，藉由各種不同的技術和試劑來進行，例如與包括SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基之胜肽鏈區或核酸引子或對編碼SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的核酸序列具專一性之探針專一性結合之抗原結合蛋白。此等測定可例如使用流式細胞儀，包括螢光激化細胞分類(FACS)、ELISA、南方墨點、北方墨點或核酸微陣列來進行。此測定可對照適合的正對照和負對照或以之前收集的數據組為基準(例如特定細胞或組織類型中SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的平均表現)來進行。
本揭示文亦提供其中此蛋白係包括SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列之治療方法。本揭示文之治療方法可進一步包括測定至少一該對象之腫瘤細胞，其編碼SEQ ID NO：21或其部分，例如HER3的II區或III區之基因是否具有增幅，或編碼SEQ ID NO：21或其部分之RNA轉錄是否具有增幅。
本揭示文亦提供進一步包括下列步驟之治療方法：c)測定包括SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的癌症表現蛋白。此測定可以完整的癌細胞分析，或此等細胞的製備物，例如解離物或免疫組織化學(IHC)製備物，藉由各種不同的技術和試劑來進行，例如抗原結合蛋白，其係與SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基或核酸引子或對編碼SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的核酸序列具專一性之探針專一性結合。此等測定可例如使用流式細胞儀，包括螢光激化細胞分類(FACS)、ELISA、南方墨點、北方墨點或核酸微陣列來進行。此測定可對照適合的正對照和負對照或以之前收集的數據組為基準(例如特定細胞或組織類型中SEQ ID NO：21之1330至495胺基酸殘基的平均表現)來進行。
本揭示文亦提供文中所述物質之用途，例如抗原結合蛋白於製造醫藥品供治療由下列組成之群中選出之症狀之用途：乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
本揭示文亦關於治療或減輕癌症嚴重度之方法，其中該癌症係選自：腦(膠質瘤)、膠質母細胞瘤、BZS症候群(Bannayan-Zonana syndrome)、考登病(Cowden disease)、小腦發育不良性神經節細胞瘤(Lhermitte-Duclos disease)、乳癌、發炎性乳癌、威爾姆氏腫瘤(Wilm's tumor)、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、橫紋肌肉瘤、室管膜瘤、骨髓母細胞瘤、大腸癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、肝癌黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、***癌、肉瘤、骨肉瘤、骨巨細胞瘤、甲狀腺癌、淋巴母細胞T-細胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、髮細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性嗜中性細胞白血病、急性淋巴母細胞T-細胞白血病、漿細胞瘤、免疫母細胞大細胞白血病、被套細胞白血病、巨核母細胞白血病、多發性骨髓瘤、急性巨核母細胞白血病、前髓細胞性白血病、紅細胞白血病、惡性淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、淋巴母細胞T細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、神經母細胞瘤、膀胱癌、尿道上皮細胞癌、肺癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎癌、間皮癌、食道癌、唾腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽癌、頰癌、口腔癌、GIST(胃腸道基質腫瘤)及睪丸癌。
本揭示文另一方面為與包括SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合之抗原結合蛋白。
本揭示文另一方面為與包括SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合之抗原結合蛋白。
本揭示文亦提供製造與HER3專一性結合之抗原結合蛋白的方法，其包括下列步驟：a)培養重組的宿主細胞，其係包括含有文中所述的單離核酸之表現載體，其中編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因在重組的宿主細胞中已經去活化；及b)回收此抗原結合蛋白；據此產生抗原結合蛋白。此等用於製造抗原結合蛋白的方法可，例如使用BioWa公司(Princeton,NJ)之POTELLIGENTTM技術系統來進行，其中缺乏FUT8基因之功能複製的CHOK1SV細胞，相對於具功能性FUT8基因之細胞所製造的相同抗體，係產生具有促進抗體依賴細胞媒介的細胞毒殺(ADCC)活性之單株抗體。POTELLIGENTTM技術方面細描述於US7214775、US6946292、WO0061739和WO0231240中，其係以引用的方式併入本文中。本項技術之一般技術者亦應知道其他適合的系統。此外，回收重組的宿主細胞所表現之抗原結合蛋白已為本項技術所熟知且包括親和層析、離子交換層析及尺寸排阻層析。
本揭示文之抗原結合蛋白亦可以抗體-藥物接合物(ADC)來提供。抗原結合蛋白可經由蛋白酶可裂解胜肽連接子與化療藥物接合。奧瑞他汀(Auristatins)為此等化療劑之一實例。適合的奧瑞他汀之實例包括單甲基奧瑞他汀E(MMAE)及單甲基奧瑞他汀F(MMAF)。其他適合的化療劑係描述於本文中。熟習本項技術者應知道適合的化療劑。結合物亦可經由反應基團所形成的化學鍵將化療劑與抗原結合蛋白連接來製備。
本揭示文亦提供製造與HER3專一性結合之抗原結合蛋白的方法，其中該重組宿主細胞為CHOK1SV細胞。
本揭示文亦提供與HER3專一性結合之抗原結合蛋白，其係由所揭示的製造抗原結合蛋白之方法所製造。
本揭示文亦提供製造與HER3專一性結合之抗原結合蛋白的方法，其包括下列步驟：a)培養重組的宿主細胞，其係包括含有文中所述的單離核酸之表現載體，其中表現載體係包括編碼嵌合Fc區之Fc核酸序列，而嵌合Fc區係具有IgG1和IgG3 Fc區胺基酸殘基；及b)回收此抗原結合蛋白；據此產生抗原結合蛋白。此等用於製造抗原結合蛋白的方法可，例如使用BioWa公司(Princeton,NJ)及Kyowa Hakko Kogyo公司(現為Kyowa Hakko Kirin公司)之COMPLEGENTTM技術系統來進行，其中包括表現載體(其中在該載體中編碼具有IgG1和IgG3Fc區胺基酸殘基之嵌合Fc區的Fc核酸序列係與抗體的重鏈區融合)之重組的宿主細胞，相對於其他缺乏此嵌合Fc區之相同的單株抗體，係經表現以產生具有增加補體依賴細胞毒殺(CDC)活性之抗原結合蛋白。COMPLEGENTTM技術系統之各方面係描述於WO2007011041和US20070148165中，其各自係以引用的方式併入本文中。在揭示文的方法中，CDC活性亦可藉由將序列專一性突變導入IgG鏈的Fc區來增加。本項技術之一般技術者亦應知道其他適合的系統。
本揭示文亦提供製造與HER3專一性結合之抗原結合蛋白的方法，其中該Fc核酸序列係於框架中與由SEQ ID NO：40所示之核酸序列及SEQ ID NO：42所示之核酸序列組成之群中選出之核酸融合。此等用於製造抗原結合蛋白的方法可例如使用BioWa公司(Princeton,NJ)之ACCRETAMABTM技術系統來進行，其中此ACCRETAMABTM技術系統系組合POTELLIGENTTM和COMPLEGENTTM技術系統，相對於其他缺乏此嵌合Fc區之相同的單株抗體，係用以產生具有增加ADCC和CDC活性之抗原結合蛋白。
本揭示文亦提供製造與HER3專一性結合之抗原結合蛋白的方法，其包含下列步驟：a)培養重組的宿主細胞，其係包括含有文中所述的單離核酸之表現載體，該表現載體進一步係包括編碼嵌合Fc區之Fc核酸序列，而嵌合Fc區係具有IgG1和IgG3Fc區胺基酸殘基，且其中編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因在重組的宿主細胞中已經去活化；及b)回收此抗原結合蛋白；據此於含功能性FUT8基因之細胞中產生抗原結合蛋白。
本揭示文亦提供製造與HER3專一性結合之抗原結合蛋白的方法，其中Fc核酸係於框架中與由SEQ ID NO：40所示之核酸序列及SEQ ID NO：42所示之核酸序列組成之群中選出之核酸融合。
本揭示文亦提供於一對象中治療癌前症狀之方法，其係包括將一治療上有效量之文中所述的抗原結合蛋白投予此對象，據此治療此對象之癌前症狀。
本揭示文亦提供於一對象中治療癌前症狀之方法，其係包括下列步驟：a)辨識患有癌前症狀之對象；及b)將一治療上有效量之本揭示文抗原結合蛋白投予此對象，據此治療此對象之癌前症狀。
本揭示文亦提供於一對象中治療癌前症狀之方法，其係進一步包括下列步驟：c)測定包括SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的癌症表現蛋白。
本揭示文亦提供於一對象中治療癌前症狀之方法，其中此蛋白係包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列。
本揭示文亦提供於一對象中治療癌前症狀之方法，其係進一步包括下列步驟：c)測定包括SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的癌症表現蛋白。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文另一方面為一抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列之CDRH1、具有SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列之CDRH2、具有SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列之CDRH3、具有SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列之CDRL1、具有SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列之CDRL2及具有SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列之CDRL3。
本揭示文亦提供如文中所述的醫藥組成物，係用於醫藥。
本揭示文亦提供如文中所述的醫藥組成物，其係用於治療乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
所揭示之與HER3專一性結合的抗原結合蛋白可為一抗體，例如單株抗體。數種此等示例性抗體係描述於本文中，包括鼠科的15D5、1D9和22A5單株抗體以及人源化的15D5和ID9單株抗體。抗原決定位定位法顯示15D5單株抗體與HER3的II區結合且能抑制或干擾HER3和其他受體間(例如表1中所示)配體引發的受體二聚化。此等包括(但不限於)：HER2和其他HER家族受體、c-MET及其他酪胺酸激酶或細胞表面受體。抑制或干擾HER3與這些受體交互作用能力之結果為抑制或減少受體引發的HER3依賴之細胞傳遞過程或路徑。
抗原決定位定位亦顯示1D9單株抗體係與HER3的III區結合，抑制了HER3配體結合和異源二聚體形成。
所揭示之與HER3專一性結合的抗原結合蛋白可結合及中和HER3受體(亦稱為ErbB3)(SEQ ID NO：21)並與包括SEQ ID NO：1或9之重鏈可變區序列及SEQ ID NO：5、13或17之輕鏈可變區序列的參照抗體競爭結合HER3受體。專一性結合HER3的抗原結合蛋白，例如鼠科和人源化15D5單株抗體，可與HER3受體的II區(SEQ ID NO：21之184-329殘基)結合，但是不與HER3受體的I區(SEQ ID NO：21之20-183殘基)、III區(SEQ ID NO：21之330-495胺基酸殘基)或IV區(SEQ ID NO：21之496-643胺基酸殘基)結合。HER3受體之II區為形成受體二聚體之重要介面，使文中所述的二抗原結合蛋白得以成為候選的二聚化抑制劑。與HER3專一性結合的抗原結合蛋白，例如鼠科和人源化1D9抗體，亦可與III區結合以防止配體與HER3受體結合。所揭示之與HER3專一性結合的抗原結合蛋白亦可與文中所述的鼠科或人源化15D5、1D9或22A5單株抗體競爭。
本揭示文之抗原結合蛋白或包含此等抗原結合蛋白之醫藥組成物亦可用於治療患有過度增生性或HER3相關病症(例如以因子數目為主，如HER3表現之癌症)之對象之方法中。此等腫瘤或癌症可選自(但不限於)下列之群：乳癌、卵巢癌、胃腸癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、胃癌、子宮內膜癌、肺癌、腎癌、頭頸癌、膠質瘤、黑色素瘤和非黑色素瘤皮膚癌，以及其他皮膚癌和其他HER3表現或過度表現之癌症。抗原結合蛋白亦可用於偵測回應EGFR標靶治療之HER3陽性癌症，例如抑制HER2/HER3異源二聚化作用之AG1478-曲妥珠單抗(trastuzumab)組合物或帕妥珠單抗(pertuzumab)。參見例如,Lee-Hoeflich等人,68 Cancer. Res. 5875(2008) and Emlet等人,94 Br. J. Cancer 1144(2006)。此外，可由人從下列群族衍生之本揭示文利益包括：1)抗-HER2 mAb-阻抗之病患、2)抗-HER2 mAb-不適合之病患、3)抗HER1(EGFR) mAb-阻抗或不適合之病患，及4)具有酪胺酸激酶(小分子)-阻抗腫瘤之病患。本揭示文之抗原結合蛋白應可單獨用於單一療法，或於組合治療法中使用，其中該藥劑係與此文件中他處所述之其他藥劑結合給藥。本揭示文係提供可抑制或壓抑一對象之癌症腫瘤、延長病患存活、腫瘤進展的時間或病患生活品質之方法，其中此等方法係包括單獨給予一治療上有效量之抗原結合蛋白，或與文中所述之其他特定藥劑組合給藥。
Trastuzumab emtansine亦稱為曲妥珠單抗-DM1或曲妥珠單抗-MCC-DM1(縮寫為T-DM1)，為一種由抗體曲妥珠單抗(HERCEPTINTM)連接細胞毒素mertansine(DM1)所組成之抗體-藥物接合物。其具有下列結構：
本揭示文之另一實施例為治療哺乳動物癌症之方法，其包括投予一治療上有效量之本揭示文抗原結合蛋白與至少一種如文中所述之其他藥劑。此等藥劑係描述於，例如本揭示文之59-78頁。
在另一實施例中，該至少一種其他藥劑係由曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)和T-DM1組成之群中選出。
本揭示文之抗原結合蛋白亦可用於治療患有腫瘤之對象，其中該腫瘤係選自(但不限於)下列群組：乳癌、卵巢癌、胃腸癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、胃癌、子宮內膜癌、肺癌、腎癌、頭頸癌、膠質瘤、黑色素瘤和非黑色素瘤皮膚癌及其他HER3表現或過度表現之癌症。
本揭示文之抗原結合蛋白亦可用於治療乳癌、卵巢癌、胃腸癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、胃癌、子宮內膜癌、肺癌、腎癌、頭頸癌、膠質瘤、黑色素瘤和非黑色素瘤皮膚癌及其他HER3表現或過度表現之癌症。
抗原結合蛋白可結合或中和HER3受體並和包含SEQ ID NO：1或9之重鏈可變區序列和SEQ ID NO：5、13或17序列之輕鏈可變區序列的參照抗體競爭與HER3受體之結合。
另外，抗原結合蛋白可結合或中和HER3受體並和包含SEQ ID NO：1或9之重鏈可變區序列和SEQ ID NO：5、13或17序列之輕鏈可變區序列的參照抗體競爭與HER3受體之結合。在某些實施例中，此抗原結合蛋白不與HER2受體結合。
參照抗體可包括下列重鏈和輕鏈組合：(1)鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10；鼠科單株抗體；包括SEQ ID NO：1和5)；(2)鼠科22A5抗體(M5.22A5.1G6.1 C10；鼠科單株抗體；包括SEQ ID NO：9、13和17)；(3)人源化15D5抗體(人源化單株抗體；包括SEQ ID NO：22和26)；(4)人源化1D9抗體(人源化單株抗體；包括SEQ ID NO：s 30和34)；(5)鼠科1D9抗體(鼠科單株抗體；包括SEQ ID NO：s44和48)；(6)人源化1D9 RR(亦稱為人源化1D9_E抗體一種人源化單株抗體；包括SEQ ID NO：s 30和57)。二級抗體，鼠科22A5抗體，具有2個輕鏈可變區(SEQ ID NOs；13和17)使其可形成不同的重鏈和輕鏈組合。參照抗體亦可包括下表17所述之抗體。
抗原結合蛋白和參照抗體間的競爭可藉由競爭性ELISA來測定。就中和HER3之競爭可藉由任一或下列組合來測定：HER3結合之競爭，例如以ELISA、FMAT或BIACORETM來測定；HER3對神經調節蛋白1和神經調節蛋白2配體抑制作用之競爭；及抑制細胞訊號傳遞使得A204細胞分析中螢光素酶表現之競爭。競爭的抗原結合蛋白可與相同的抗原決定位、重疊的抗原決定位或與參照抗體結合之抗原決定位非常靠近的抗原決定位結合。
抗原結合蛋白可能不會與HER3胜肽片段或人工胜肽序列顯著結合。抗原結合蛋白可能不會與HER3胜肽片段或抗原結合蛋白與胜肽比例範圍為1：1至1：10之人工胜肽序列結合。
抗原結合蛋白和HER3受體胜肽片段或人工胜肽序列間之結合或不足以結合可藉由ELISA或藉由SDS PAGE使用還原條件來測定。例如，抗原結合蛋白與於線性全長HER3受體序列之結合或不足以結合可藉由還原的SDS PAGE來測定。
本揭示文亦提供一抗原結合蛋白，其係結合或中和HER3受體並包括SEQ ID NO：4、15或20之CDRH3或其CDR變異體。
抗原結合蛋白可進一步包括一或多個選自下列之CDR，或所有CDR的任何組合：CDRH1(SEQ ID NO：2、10或31)、CDRH2(SEQ ID NO：3、11或32)、CDRH3(SEQ ID NO：4、12或33),CDRL1(SEQ ID NO：6、14、18或35)、CDRL2(SEQ ID NO：7、15、19或36)及CDRL3(SEQ ID NO：8、16、20或37)；或其變異體。
例如，抗原結合蛋白可包括CDRH3(SEQ ID NO：4、12或33)及CDRH1(SEQ ID NO：2、10或31)或其變異體。抗原結合蛋白可包括CDRH3(SEQ ID NO：4、12或33)及CDRH2(SEQ ID NOs：3、11或32)或其變異體。抗原結合蛋白可包括CDRH1(SEQ ID NOs：2、10或31)、CDRH2(SEQ ID NOs：3、11或32)及CDRH3(SEQ ID NO：4、12或33)或其變異體。
抗原結合蛋白可包括CDRL1(SEQ ID NO：6、14、18或35)及CDRL2(SEQ ID NO：7、15、19或36)或其變異體。抗原結合蛋白可包括CDRL2(SEQ ID NO：7、15、19或36)及CDRL3(SEQ ID NO：8、16、20或37)或其變異體。抗原結合蛋白可包括CDRL1(SEQ ID NO：6、14、18或35)、CDRL2(SEQ ID NO：7、15、19或36)及CDRL3(SEQ ID NO：8、16、20或37)或其變異體。
抗原結合蛋白可包括CDRH3(SEQ ID NO：4、12或33)及CDRL3(SEQ ID NO：8、16、20或37)或其變異體。抗原結合蛋白可包括CDRH3(SEQ ID NO：4、12或33)、CDRH2(SEQ ID NO：3、11或32)及CDRL3(SEQ ID NO：8、16、20或37)或其變異體。抗原結合蛋白可包括CDRH3(SEQ ID NO：4、12或33)、CDRH2(SEQ ID NO：3、11或32)、CDRL2(SEQID NO：7、15、19或36)及CDRL3(SEQ ID NO：8、16、20或37)或其變異體。
抗原結合蛋白可包括CDRH1(SEQ ID NO：2、10或31)、CDRH2(SEQ ID NO：3、11或32)、CDRH3(SEQ ID NO：4、12或33)、CDRL1(SEQ ID NO：6、14、18或35)、CDRL2(SEQ ID NO：7、15、19或36)及CDRL3(SEQ ID NO：8、16、20或37)或其變異體。
本揭示文亦提供結合或中和HER3受體之抗原結合蛋白，其中此抗原結合蛋白為一嵌合或人源化抗體，其係包括SEQ ID NO：1、9或30可變區序列之對應的CDRH3或CDRH3變異體。
嵌合或人源化抗原結合蛋白可進一步包括一或多個，或所有選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：30之對應的CDR或其CDR變異體。
例如，抗原結合蛋白可包括對應的CDRH3和對應的CDRH1或其變異體。抗原結合蛋白可包括對應的CDRH3和對應的CDRH2或其變異體。另外，抗原結合蛋白可包括對應的CDRH1、對應的CDRH2和對應的CDRH3；或其變異體。
The抗原結合蛋白可包括對應的CDRL1和對應的CDRL2或其變異體。此外，抗原結合蛋白可包括對應的CDRL2和對應的CDRL3或其變異體。抗原結合蛋白亦可包括對應的CDRL1、對應的CDRL2和對應的CDRL3或其變異體。
抗原結合蛋白可包括對應的CDRH3和對應的CDRL3或其變異體。抗原結合蛋白可包括對應的CDRH3、對應的CDRH2和對應的CDRL3或其變異體。另外，抗原結合蛋白可包括對應的CDRH3、對應的CDRH2、對應的CDRL2和對應的CDRL3或其變異體。
抗原結合蛋白可包括對應的CDRH1、對應的CDRH2、對應的CDRH3、對應的CDRL1、對應的CDRL2和對應的CDRL3或其變異體。
對應的CDR可參照Kabat(1987)、Chothia(1989)、AbM或接觸法來定義。各個方法之定義可參見表3並可應用於SEQ ID NO：1、9或30之參照的重鏈可變區及SEQ ID NO：5、13、17或35之參照的輕鏈可變區以測定對應的CDR。
例如，抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR H3和一結合單位CDR H1或其變異體。抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR H3和一結合單位CDR H2或其變異體。抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR H1、一結合單位CDR H2和一結合單位CDR H3；或其變異體。
抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR L1和一結合單位CDR L2或其變異體。抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR L2和一結合單位CDR L3或其變異體。抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR L1、一結合單位CDR L2和一結合單位CDR L3；或其變異體。
抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR H3和一結合單位CDR L3或其變異體。另外，抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR H3、一結合單位CDR H2和一結合單位CDR L3；或其變異體。抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR H3、一結合單位CDR H2、一結合單位CDR L2和一結合單位CDR L3；或其變異體。
抗原結合蛋白可包括一結合單位CDR H1、一結合單位CDR H2、一結合單位CDR H3、一結合單位CDR L1、一結合單位CDR L2和一結合單位CDR L3；或其變異體。
CDR變異體或變異體結合單位包括至少一個胺基酸經修飾之胺基酸序列，其中該修飾作用可為嵌合或胺基酸序列之部分改變(例如不超過10個胺基酸)，此修飾作用使該變異體得以保留未修飾序列之生物特性。例如，該變異體為一結合或中和HER3之功能性變異體。CDR胺基酸序列之部分改變可藉由刪除或取代一至數個胺基酸，或藉由增加或***一至數個胺基酸，或藉由其組合(例如不超過10個胺基酸)。CDR變異體或結合單位變異體，在胺基酸序列中，可含有1、2、3、4、5或6個胺基酸取代、增加或刪除之任何組合。CDR變異體或結合單位變異體，在胺基酸序列中，可含有1、2或3個胺基酸取代、增加或刪除之任何組合。胺基酸殘基之取代可為保守性，例如以一個疏水性胺基酸取代另一個疏水性胺基酸。例如，可以纈氨酸或異白胺酸取代白胺酸。
包括所述的CDR、對應的CDR、變異體CDR、結合單位或變異體結合單位之抗原結合蛋白可展現與HER3結合之效力，如ED50所示，為文中所述的參照抗體所展現的效力之10-倍或5-倍內。與HER3結合之效力，如ED50所示，可以ELISA分析來進行。
抗原結合蛋白在從天門冬醯胺酸(N)至天門冬胺酸(D)或麩醯胺酸(Q)之胺基酸54的位置，可或不可具有取代。抗原結合蛋白變異體在從半胱胺酸(C)至絲胺酸(S)之胺基酸91的位置，可或不可具有取代。
一或多個文中所述的CDR、對應的CDR、變異體CDR或結合單位可存在人類架構之環境中，例如人源化或嵌合可變區中。
人源化重鏈可變區可包括序列表中所述的CDR、對應的CDR、CDR變異體、結合單位或其變異體於受體抗體架構中，其在架構區與SEQ ID NO：1和9之人類可變區序列具有75%或更高，80%或更高，85%或更高，90%或更高，95%或更高，98%或更高，99%或更高，或100%一致性。人源化輕鏈可變區可包括列於SEQ ID NO：6、7、8、14、15、16、18、19或20中之CDR、對應的CDR、CDR變異體、結合單位或其變異體於受體抗體架構中，其係具有75%或更高，80%或更高，85%或更高，90%或更高，95%或更高，98%或更高，99%或更高，或100%一致性。
抗原結合蛋白可變重鏈在位置28可具有一絲胺酸(S)胺基酸殘基及/或在位置105具有一蘇胺酸(T)胺基酸殘基。抗原結合蛋白可變輕鏈在位置16可具有一精胺酸(R)胺基酸殘基及/或在位置71具有酪胺酸(Y)胺基酸殘基及/或在位置100具有丙胺酸(A)胺基酸殘基。例如，抗原結合蛋白在可變重鏈之位置28包括一絲胺酸(S)及在可變輕鏈之位置71包括一酪胺酸(Y)。
本揭示文亦提供一抗原結合蛋白，其係結合或中和HER3受體並包括任一下列重鏈和輕鏈可變區之組合：(1)鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10；鼠科單株抗體；包括SEQ ID NO：1和5)；(2)鼠科22A5抗體(M5.22A5.1G6.1 C10；鼠科單株抗體；包括SEQ ID NO：9、13和17)；(3)人源化15D5抗體(人源化單株抗體；包括SEQ ID NO：22和26)；(4)人源化1D9抗體(人源化單株抗體；包括SEQ ID NO：30和34)；(5)鼠科1D9抗體(鼠科單株抗體；包括SEQ ID NO：44和48)；(6)人源化ID9 RR(亦稱為人源化1D9_E抗體一種人源化單株抗體；包括SEQ ID NO：30和57)。
任何重鏈可變區可與適合的人類恆定區組合。任何輕鏈可變區可與適合的恆定區組合。。
如上述之抗原結合蛋白，例如具有經化學修飾及/或***、刪除或刪除一或多個胺基酸殘基之部分改變序列的變異體，或該等與上述任何序列具75%或更高，80%或更高，85%或更高，90%或更高，95%或更高，98%或更高，99%或更高一致性者，如ED50所示，可展現與HER3結合之效力，其為下列各抗體所展現之效力的10-倍或5-倍內：(1)M5 15D5 2A1 1H10(鼠科單株抗體；包括SEQ ID NOs：1和5)；(2)M5_ 22A5 1G6 1 C10(鼠科單株抗體；包括SEQ ID NOs：9、13和17)；(3)人源化15D5(人源化單株抗體；包括SEQ ID NO：22和26)；(4)人源化1D9(人源化單株抗體；包括SEQ ID NO：30和34)；(5)鼠科1D9(鼠科單株抗體；包括SEQ ID NO：s 44和48)；(6)人源化1D9_E(人源化單株抗體；包括SEQ ID NO：30和57)。與HER3結合之效力，如ED50所示，可以ELISA分析來進行。
抗原結合蛋白可能不會與HER3受體之胜肽片段結合。HER3受體之胜肽片段可為任何由高達14個胺基酸的HER3序列所組成。HER3受體之胜肽片段可為線性的。HER3受體之胜肽片段可為任何HER3受體序列之片段，包括其中序列為線性之全長序列。
抗原結合蛋白和HER3胜肽片段或人工胜肽序列間之結合或不足以結合可藉由ELISA或藉由SDS PAGE使用還原條件來測定。例如，抗原結合蛋白與線性全長HER3受體序列之結合或不足以結合可藉由還原的(亦即變性的)SDS PAGE來測定。
與文中所述的抗原結合蛋白結合之HER3受體的抗原決定位可為構形或非連續抗原決定位。文中所述的抗原結合蛋白可能不會與HER3受體上線性抗原決定位結合。例如抗原結合蛋白可能不會與還原或變性的HER3受體樣本結合。構形或非連續抗原決定位可與HER3結合位置相同、類似或重疊。當HER3受體為其成熟的形式且為與另外的受體分子聚合的二聚體之部分時，則此抗原決定位為可結合的。當HER3受體為其成熟的形式且為與所述的其他HER3受體結合分子聚合的四聚體之部分時，則此抗原決定位亦為可結合的。抗原決定位可分散於二個HER3受體多肽。此等非連續的抗原決定位類型可包括來自各HER3受體分子之序列。在二聚體的三級和四級結構之環境中，此等序列可能彼此間夠接近足以形成抗原決定位及與抗原結合蛋白相結合。構形及/或非連續抗原決定位可由已知的方法來辨識，例如CLIPSTM(Pepscan Systems)。
抗原結合蛋白在人類活體中或在鼠科動物模型中可具有至少6小時、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少7天或至少9天之半衰期。
抗體之Fc效應子部分的突變性改變可用於改變調節抗體週轉性之FcRn和抗體間交互作用的親和力。抗體的半衰期在活體中可延長。因在活體中IC50可長期維持，而能達到最大劑量和最高給劑頻率，所以此項對於病患為有利的。
與抗原結合蛋白結合之HER3受體多肽可為重組的多肽。HER3受體可為溶液或可與固體表面相連附。例如，HER3受體可連附於微珠，例如磁性微珠。此外，HER3受體可生物素化。可使用與HER3受體接合之生物素分子，藉由在一固體表面上偶聯生物素鏈黴親和素，將HER3固定在固體表面。
抗原結合蛋白可衍生自大鼠、小鼠、靈長類(例如獼猴、舊世界猴或類人猿)或人類。抗原結合蛋白可為人源化或嵌合抗體。
抗原結合蛋白包括恆定區，其可為任何同型或子類。恆定區可為IgG同型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變異體。抗原結合蛋白恆定區可為IgG1。
抗原結合蛋白可包括一或多種選自突變恆定區之修飾，使得抗體具有增加的效應子功能/ADCC及/或完全活化。適合的修飾作用之實例係描述於Shields等人,J. Biol. Chem.(2001) 276：6591-6604,Lazar等人,PNAS(2006) 103：4005-4010及US6737056、WO2004063351和WO2004029207中。
抗原結合蛋白包括具有改變的糖基化性質之恆定區，使得抗體具有增加的效應子功能/ADCC及/或完全活化。適合製造含有改變的糖基化性質之抗原結合蛋白之實例係描述於WO2003/011878、WO2006/014679和EP1229125中。
本揭示文亦提供編碼如文中所述的抗原結合蛋白之核酸分子。核酸分子可包括編碼重鏈可變序列或全長序列；及輕鏈可變序列或全長序列二者之序列。另外，編碼文中所述的抗原結合蛋白之核酸分子可包括編碼重鏈可變序列或全長序列；及輕鏈可變序列或全長序列之序列。
本揭示文亦提供包含如文中所述之核酸分子的表現載體。亦提供包含文中所述之表現載體的重組宿主細胞。
文中所述之抗原結合蛋白可於適合的宿主細胞中產生。製造如文中所述之抗原結合蛋白的方法可包括培養如文中所述之宿主細胞及回收此抗原結合蛋白之步驟。重組的轉化、轉染或轉導宿主細胞可包括至少一種表現卡匣，因此該表現卡匣係包括編碼文中所述之抗原結合蛋白重鏈之多核苷酸及進一步包括編碼文中所述之抗原結合蛋白輕鏈之多核苷酸。另外，重組的轉化、轉染或轉導宿主細胞可包括至少一種表現卡匣，因此第一表現卡匣係包括編碼文中所述之抗原結合蛋白重鏈之多核苷酸及進一步包括編碼文中所述之抗原結合蛋白輕鏈之多核苷酸。適當轉化的宿主細胞可包括含有一或多個表現卡匣之載體，其中該表現卡匣係編碼文中所述之抗原結合蛋白重鏈及/或輕鏈。例如，此宿主細胞可包括編碼輕鏈之第一載體和編碼重鏈之第二載體。
宿主細胞可為真核細胞，例如哺乳動物。此等細胞株之實例包括CHO或NS0。宿主細胞可於培養基中，例如無血清培養基中培養。抗原結合蛋白可從宿主細胞分泌至培養基中。就有關該含抗原結合蛋白之培養基，抗原結合蛋白可經純化達至少95%或更高(例如98%或更高)。於不同培養基組成物和環境調下培養細胞之方法已為熟習本項技術者所熟知。
可提供包含抗原結合蛋白及醫藥上可接受載劑之醫藥組成物。可提供包括醫藥組成物與使用說明之套組。就方便性而言，套組可包括預先定量好的試劑及使用說明。
抗體結構
完整抗體
來自大部分脊椎動物之抗體輕鏈依照恆定區的胺基酸序列可分為κ和λ二類。依照其重鏈恆定區之胺基酸序列，人類抗體可分為五種不同的種類：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG和IgA可進一步再分成子類：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；及IgA1和IgA2。小鼠和大鼠之物種變異具有至少IgG2a、IgG2b。
可變區之更保守的部分稱為架構區(FR)。完整的重鏈和輕鏈之可變區各包括四個以三個CDR相連的FR。在各鏈中之CDR可藉由FR區緊密連在一起並與其他鏈的CDR形成抗體之抗原結合物位置。
可變區並不直接涉及抗體與抗原之結合，但是具有各種效應子功能例如參與抗體依賴的細胞媒介細胞毒殺作用(ADCC)、經由與Fcγ受體結合之吞噬作用、經由新生兒Fc受體(FcRn)之半衰期/清除率及經由補體聯集之Clq成份的補體依賴細胞毒殺作用。
人類IgG2恆定區基本上缺乏以經典的路徑活化補體之能力，或媒介抗體依賴的細胞毒殺作用之能力。已有報告提出，IgG4恆定區缺乏以經典的路徑活化補體之能力，且僅微弱地媒介抗體依賴的細胞毒殺作用。基本上缺乏這些效應子功能之抗體可稱為「非裂解性」抗體。
人類抗體
人類抗體可由許多熟習本項技術者已知之方法來製造。人類抗體可由融合瘤法，使用人類骨髓瘤或小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株來製造。參見Kozbor(1984) J. Immunol 133,3001,和Brodeur,MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS,51-63(Marcel Dekker Inc,1987)。另外的方法包括使用噬菌體庫或基因轉殖小鼠，其二者係利用人類可變區組成份(參見Winter(1994) Annu. Rev. Immunol 12：433-455；Green(1999) J. Immunol. Methods 231：11-23)。
目前有數種基因轉殖小鼠之品系可取得，其中其小鼠的免疫球蛋白位置已以人類免疫球蛋白基因片段置換(參見Tomizuka(2000) PNAS 97：722-727；Fishwild(1996) Nature Biotechnol. 14：845-851；Mendez(1997) Nature Genetics,15：146-156)。一旦施予抗體，此小鼠能產生人類抗體之組成份，從其中可選擇相關的抗體。
噬菌體展示技術可用於製造人類抗原結合蛋白(及其片段)，參見McCafferty(1990) Nature 348：552-553及Griffiths,等人,EMBO 13：3245-3260(1994)。
親和力成熟技術(Marks Bio/technol(1992) 10：779-783)可用於改善結合親和力，其中初級人類抗體之親和力係藉由連續以天然生成的變異體置換H和L鏈可變區並以改善結合親和力為基準做選擇來改善。此項技術之變化例如「抗原決定位模印」目前亦可取得。參見，例如WO 93/06213；Waterhouse(1993) Nucl. Acids Res. 21：2265-2266。
嵌合及人源化抗體
嵌合抗體典型地係使用重組的DNA法產生。將編碼抗體的DNA(例如cDNA)單離出並使用習用的製程(例如使用能與編碼抗體的H和L鏈基因專一性結合之寡核苷酸探針)定序。以融合瘤細胞作為此DNA之典型來源。一旦單離後，將DNA置入表現載體中，然後將其轉染至不會另外產生免疫球蛋白之宿主細胞中，例如大腸桿菌、COS細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞，而得到合成的抗體。DNA可以人類L和H之編碼鏈序列取代對應的非人類(例如鼠科)H和L恆定區，加以修飾。參見，例如Morrison(1984) PNAS 81：6851。
僅藉由將非人類(例如鼠科)抗體(「供體」)之CDR稼接到人類架構(「受體架構」)和恆定區產生人源化抗體可達到大量降低致免疫性(參見Jones,等人(1986) Nature 321：522-525；及Verhoeyen,等人(1988) Science 239：1534-1536)。然而，CDR稼接本身並不會完全保留抗原結合性質且常會發現，若抗原結合親和力明顯恢復，則某些供體抗體之架構殘基(有時候稱為「回復突變」)需要保留在人源化分子中(參見Queen,等人(1989) PNAS 86：10,029-10,033：Co,等人(1991) Nature 351：501-502)。在此案例中，係由資料庫中選擇與非人類供體抗體顯現最大序列同源性之人類可變區，以提供人類架構(FR)。人類FR可從人類共通的或個別的抗體來選擇。若需要，來自供體抗體之主要殘基可置換成人類受體架構以保留CDR構形。可使用抗體之電腦模擬幫助辨識此等結構上重要的殘基。參見WO 99/48523。
另外，人源化可以「鑲飾(veneering)」之方法來進行。獨特的人類和鼠科免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區之統計分析顯示，暴露的殘基之精確模式在人類和鼠科抗體中並不相同，且大部分個別的表面位置偏愛少數不同的殘基(參見Padlan,等人(1991) Mol. Immunol. 28：489-498；及Pedersen,等人(1994) J. Mol. Biol. 235：959-973)。因此，藉由置換其架構區中與在人類抗體中常見者不同之暴露的殘基，來減少非人類Fv之致免疫性係為可能的。因為蛋白抗原性可能與表面可接觸性相關，因此表面殘基之置換可能足以給予人類免疫系統小鼠可變區「無形性」(亦參見Mark,等人(1994) in Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113：The pharmacology of Monoclonal Antibodies,Springer-Verlag,105-134)。此人源化的過程係稱為「鑲飾」，因為僅抗體表面改變，支撐的殘基仍未被移動。其他替代的方法包括WO04/006955中所述及使用細菌表現系統並產生與人類生殖細胞序列接近之抗體的HUMANEERINGTM(Kalobios)製程(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007,San Diego,California)。
雙專一性抗原結合蛋白
雙專一性抗原結合蛋白為一種對至少二種不同的抗原決定位具結合專一性之抗原結合蛋白。製造此等抗原結合蛋白之方法已為本項技術所知。習用上，重組製造雙專一性抗原結合蛋白係以二對免疫球蛋白H鏈-L鏈之共表現為主，其中二條H鏈係具有不同的結合專一性。參見Millstein,等人(1983) Nature 305：537-539；WO 93/08829；及Traunecker,等人(1991) EMBO 10：3655-3659。因為H和L鏈之隨機分配，在十種不同抗體結構之可能的混合物中，僅有一種具有所欲的結合專一性。另一種替代方法係涉及將具有所欲結合專一性之可變區與包括至少部分絞鏈區、CH2和CH3區之重鏈恆定區融合。含有輕鏈結合必要位置之CH1區可存有至少一種融合。編碼這些融合之DNA和(若需要)L鏈係***個別的表現載體中，及然後共轉染至適合的宿主生物體中。然而將二或所有三條鏈之編碼序列***一個載體中係為可能的。在一方法中，雙專一性抗體係由在一臂中帶有第一結合專一性之H鏈及於另一臂提供第二結合專一性之H-L鏈對所組成。參見WO 94/04690；亦參見Suresh,等人(1986) Methods in Enzymology 121：210。
抗原結合片段
無恆定區之片段缺乏以經典路徑活化補體或媒介抗體-依賴的細胞毒殺作用之能力。習用上，此等片段係由完整抗體之蛋白分解消化作用，例如藉由木瓜酵素消化所產生(參見、例如WO 94/29348)，但亦可直接由重組轉化的宿主細胞來製造。就ScFv之製造，係參見Bird,等人(1988) Science 242：423-426。此外，抗原結合片段可使用如下所述之各種工程技術來製造。
Fv片段其二鏈似乎比Fab片段具有較低的交互作用能量。為了安定VH和VL區之結合，其係以胜肽(Bird,等人(1988) Science 242：423-426；Huston,等人(1988) PNAS 85(16)：5879-5883)、雙硫橋(Glockshuber,等人(1990) Biochemistry 29：1362-1367)及「凹處節點(knob in hole)」突變(Zhu,等人(1997) Protein Sci.,6：781-788)相連接。ScFv片段由熟習技術者熟知之方法來產生，參見Whitlow,等人(1991) Methods Companion Methods Enzymol,2：97-105及Huston,等人(1993) Int. Rev. Immunol 10：195-217。ScFv可在細菌細胞例如大腸桿菌或真核細胞中產生。ScFv之一缺點為單價之產物，其排除了多價結合之親和性增加，及半衰期短。想要克服這些問題包括由含有額外C-端半胱胺酸之ScFv藉由化學偶合(Adams,等人(1993) Can. Res 53：4026-4034；及McCartney,等人(1995) Protein Eng. 8：301-314)，或藉由含非成對的C-端半胱胺酸殘基之ScFv的自發性位點專一性二聚化作用(參見Kipriyanov,等人(1995) Cell. Biophys 26：187-204)，產生雙價的(ScFv')2。另外，ScFv可藉由縮短胜肽連接子至3至12個殘基迫使形成多聚物，形成「雙抗體」，參見Holliger,等人(1993) PNAS 90：6444-6448。減少連結子進一步仍可能產生ScFv三聚體(「三抗體」，參見Kortt,等人(1997) Protein Eng 10：423-433)及四聚物(「四抗體」,參見Le Gall,等人(1999) FEBS Lett,453：164-168)。二價的ScFv分子之建構亦可藉由與蛋白二聚化模體之基因融合形成「微型抗體(miniantibody)」(參見Pack,等人(1992) Biochemistry 31：1579-1584)及「微型體(minibody)」(參見Hu,等人(1996) Cancer Res. 56：3055-3061)來達成。ScFv-Sc-Fv串聯((ScFV)2)亦可藉由將二個ScFv單元以第三胜肽連結子相連接來產生，參見Kurucz,等人(1995) J. Immol. 154：4576-4582。雙專一性雙抗體可經由非共價連結二個由抗體的VH區藉由短連接子與另一個抗體的VL區相連所組成之單鏈融合產物來產生，參見Kipriyanov,等人(1998) Int. J. Can 77：763-772。可藉由導入雙硫橋或如supra所述之「knob in hole」突變，或藉由形成單鏈雙抗體(ScDb)(其中二片雜交的ScFv片段係經由胜肽連接子相連接)增加此等雙專一性雙抗體之安定性，參見Kontermann,等人(1999) J. Immunol. Methods 226：179-188。四價雙專一性分子例如可藉由將片段與IgG分子之CH3區融合或與Fab片段經由絞鏈區融合，來取得。參見Coloma,等人(1997) Nature Biotechnol. 15：159-163。另外，四價雙專一性分子已藉由融合雙專一性單鏈二抗體製造出(參見Alt,等人(1999) FEBS Lett 454：90-94。較小的四價雙專一性分子亦可由ScFv-ScFv串聯與含螺旋-環-螺旋模體之連接子的二聚化作用(DiBi微型抗體，參見Muller,等 人(1998) FEBS Lett 432：45-49)或包括四個防止定向分子內配對的抗體可變區(VH和VL)之單鏈分子來形成(串聯雙抗體，參見Kipriyanov,等人(1999) J. Mol. Biol. 293：41-56)。雙專一性F(ab')2片段可藉由將Fab'片段化學偶合或經由白胺酸拉鍊之異源二聚化作用來製造(參見Shalaby,等人(1992) J. Exp. Med. 175：217-225；及Kostelny,等人(1992),J. Immunol. 148：1547-1553)。分離的VH和VL區(Domantis plc)亦可取得。參見US 6,248,516；US 6,291,158；和US 6,172,197。
異源接合抗體
異源接合抗體係由二個使用任何方便的交鏈法所形成之共價連結抗體所組成。參見，例如US 4,676,980。
其他修飾作用
本揭示文之抗原結合蛋白可包括其他的修飾以增進或改變其效應子功能。抗體的Fc區和各種Fc受體(FcγR)間之交互作用咸信係媒介了包括抗體-依賴細胞毒殺作用(ADCC)、補體固定、吞噬作用及抗體半衰期/清除之抗體的效應子功能。抗體Fc區之各種修飾可依照所欲的性質來進行。例如，得到的不同於裂解性抗體(非裂解性)之Fc區的專一性突變，係詳述於EP 0629 240和EP 0307 434中，或可將補救性受體結合抗原決定位併入抗體中以增加血漿半衰期。參見US 5,739,277。人類Fcγ受體包括FcγR(I)、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和新生的FcRn。Shields,等人(2001) J. Biol. Chem 276：6591-6604證明IgG1殘基的共通組係涉及所有FcγR結合，而FcγRII和FcγRIII係利用此共通組以外的不同位置。當改變成丙胺酸時，一群IgG1殘基減少與FcγR結合：Pro-238、sp-265、Asp-270、Asn-297及Pro-239。所有皆在IgG CH2區中且群集在絞鏈結合CH1和CH2附近。當FcγRI僅利用IgG1殘基的共通組結合時，除了共通組外，FcγRII和FcγRIII係與不同的殘基相互作用。某些殘基之改變僅減少與FcγRII(例如Arg-292)或FcγRIII(例如Glu-293)之結合。某些變異體顯示增進與FcγRII或FcγRIII結合，但對其他受體之結合並無影響(例如Ser-267Ala增加與FcγRII結合並對FcγRIII之結合無影響)。其他的變異體顯現增加與FcγRII或FcγRIII結合，而與其他受體之結合降低(例如Ser-298Ala增加與FcγRIII結合，而降低與FcγRII結合)。就FcγRIIIa而言，最佳的結合IgG1變異體係於Ser-298、Glu-333和Lys-334組合丙胺酸取代作用。新生的FcRn受體咸信係涉及抗體清除和橫越組織的胞吞轉運二者(參見Junghans(1997) Immunol. Res 16：29-57；及Ghetie,等人(2000) Annu. Rev. Immunol. 18：739-766)。決定與人類FcRn直接相互作用之人類IgG1殘基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。在此部分於任何所述位置之取代作用可能使血清半衰期增加及/改變抗體之效應子性質。
其他的修飾作用包括抗體之糖基化變異體。抗體在其恆定區之糖基化已知對抗體功能具有很深的效應，特別是例如上述之效應子運作。參見，例如Boyd,等人(1996) Mol. Immunol. 32：1311-1318。抗體的糖基化變異體或其抗原結合片段係涵蓋其中加入、取代、刪除或修飾一或多個碳水化合物基團。導入天門冬醯胺酸-X-絲胺酸或天門冬醯胺酸-X-蘇胺酸模體製造一個供酵素性黏附碳水化合物基團之位置且因此，可用於操作抗體之糖基化。於Raju,等人(2001) Biochemistry 40：8868-8876中，經由使用β-1,4-半乳糖轉移酶及/或α,2,3涎酸轉移酶之再半乳糖化及/或再涎酸化過程，增加TNFR-IgG免疫黏附素之末端涎酸化。咸信增加末端涎酸化可增加免疫球蛋白之半衰期。抗體，共同含有的大部分的糖蛋白，典型地係以糖結構形式之混合物產生。當抗體係於真核細胞，特別是哺乳動物細胞中產生時，此混合物特別顯見。已發展出各種製造所定義的糖結構形式之方法。參見Zhang,等人(2004) Science 303：371：Sears,等人(2001) Science 291：2344；Wacker,等人(2002) Science 298：1790；Davis,等人(2002) Chem. Rev. 102：579；Hang,等人(2001) Acc. Chem. Res 34：727。文中所述之抗體(例如IgG同型，如IgG1之抗體)可包括一定義數目(例如7或更少，例如5或更少，例如二或單一)之糖結構形式。
抗體可與非蛋白聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亞烷偶合。蛋白與PEG之接合為一增加蛋白半衰期以及降低蛋白之抗原性和致免疫性之成熟技術。已運用完整抗體及Fab'片段研究不同分子量和種類(直鏈或支鏈)之PEG化用途。參見Koumenis等人.,(2000) Int. J. Pharmaceut. 198：83-95。
製造方法
抗原結合蛋白可於基因轉殖生物中製造，例如羊(參見Pollock,等人(1999) J. Immunol. Methods 231：147-157)、雞(參見Morrow(2000) Genet. Eng. News 20：1-55,mice(Pollock,等人)或植物(參見Doran(2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11：199-204；Ma(1998) Nat. Med. 4：601-606；Baez,等人(2000) BioPharm 13：50-54；Stoger,等人(2000) Plant Mol. Biol. 42：583-590)。
抗原結合蛋白亦可以化學合成來製造。然而，抗原結合蛋白典型地係使用熟習本項技術者熟知之重組細胞培養技術來製造。將編碼抗原結合蛋白之多核苷酸單離出並***至可複製之載體例如供進一步選殖(增幅)或表現之質體。麩胺酸合成酶系統(例如Lonza Biologics公司所販售)，特別是其中宿主細胞為CHO或NS0為表現系統。將編碼抗原結合蛋白之核苷酸迅速單離出並使用習知的製程(例如，寡核苷酸探針)定序。可使用之載體包括質體、病毒、噬菌體、轉位子、典型使用質體之微型染色體。一般而言，此等載體進一步包括訊號序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元件、啟動子和操作上與抗原結合蛋白多核苷酸連接以幫助表現之轉錄終止序列。編碼輕鏈和重鏈之多核苷酸可***至個別的載體中並以例如轉化、轉染、電穿孔或轉導，同時或先後導入至相同的宿主細胞中，或若需要，重鏈和輕鏈二者可在導入前***至相同的載體中。
可使用密碼子優化，其目的為當以密碼子優化基因轉染時宿主細胞產生的蛋白總量比以野生型序列轉染時的量更大。已有公開數種方法(Nakamura,等人(1996) Nucleic Acids Research 24：214-215；W098/34640；W097/11086)。因冗餘的基因碼，此等文中所揭示的替代聚核苷酸(特別是在宿主細胞中經表現密碼子優化之聚核苷酸)亦可編碼文中所述的抗原結合蛋白。本揭示文抗原結合蛋白之密碼子用途可經修飾以容納宿主細胞之密碼子偏好性，增加轉錄及/或產物產率(例如Hoekema,等人,(1987),Mol Cell Biol 7(8)：2914-24)。密碼子之選擇可以與用於表現的宿主細胞之適合的相容性為基準。
訊號序列
抗原結合蛋白可製造為融合蛋白，其係帶有在成熟蛋白之N-端具有專一性裂解位置之異源性訊號序列。訊號序列應可被宿主細胞辨識和作用。就原核的宿主細胞而言，訊號序列可為，例如鹼性磷酸酶、青黴素酶或熱安定腸毒素II引導序列。就酵母菌分泌而言，此訊號序列可為，例如酵母菌轉化酶引導序列、α因子引導序列或酸磷酸酶引導序列。參見例如WO90/13646。在哺乳動物系統中，可能適合的為病毒二級引導序列，例如單純疱疹Gd訊號及本身的免疫球蛋白訊號序列。典型地，訊號序列係綁紮在編碼抗原結合蛋白之DNA讀框中。
複製起點
複製起點已為本項技術所熟知，其中pBR322適合大部分的革蘭氏陰性菌，2μ質體適合大部分的酵母菌，而各種病毒起點，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV係適合大部分的哺乳動物細胞。一般而言，複製起點組份對於哺乳動物表現載體並不必要，但可使用SV40，因為其含有早期啟動子。
選擇標記
典型的選擇基因係編碼(a)給予抗生素或其他毒素，例如安比西林(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲胺蝶呤(methotrexate)或四環黴素抗性，或(b)補體營養缺陷或在複合物培養基中無營養素供應，或(c)二者組合之蛋白。選擇的流程可能涉及阻滯宿主細胞生長。以編碼抗原結合蛋白之基因成功轉化的細胞，因為(例如)共同遞送選擇標記所給予的藥物抗性而存活。DHFR選擇標記即為一實例，其中轉化株係於甲胺蝶呤的存在下培養。細胞可在增量的甲胺蝶呤存在下培養，擴增有利的外源基因之複製數量。CHO細胞為對DHFR選擇特別有用的細胞。另一實例為麩胺酸合成酶表現系統(Lonza Biologics)。用於酵母菌之選擇基因之一實例為trp1基因。參見Stinchcomb,等人(1979) Nature 282：38。
啟動子
適合表現抗原結合蛋白之啟動子係可操作連接編碼抗原結合蛋白之DNA/多核苷酸。用於原核宿主之啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶和乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸和雜交啟動子例如Tac。適合表現在酵母菌細胞之啟動子包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其他糖酵解酵素，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶、己糖激酶、丙酮酸去羧基酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶和葡萄糖激酶。可誘發的酵母菌啟動子包括乙醇去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白及負責氮代謝或甘露糖/半乳糖利用之酵素。
表現在哺乳動物細胞系統之啟動子包括病毒啟動子，例如多瘤病毒、禽痘和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒(特別是媒介即早基因啟動子)、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒、肌動蛋白、勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子及早期或晚期類人猿病毒40。當然，啟動子的選擇係依照與用於表現之宿主細胞適合的相容性而定。第一質體可包括RSV及/或SV40及/或CMV啟動子、編碼輕鏈可變區(VL)、κC區之DNA與新黴素和安比西林阻抗選擇標記一起，及第二質體係包括RSV或SV40啟動子、編碼重鏈可變區(VH)之DNA、編碼γ1恆定區之DNA、DHFR和安比西林阻抗標記。
增強子元件
若適當，例如表現在較高等的真核細胞，可使用其在載體中可操作連接啟動子元件之增強子元件。哺乳動物增強子序列包括來自球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、胎兒蛋白和胰島素之增強子元件。另外，可使用來自真核細胞病毒之增強子元件，例如SV40增強子(bp100-270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒增強子、桿狀病毒增強子或鼠科IgG2a基因座(參見WO04/009823)。增強子可位於載體上在啟動子的上游位置。另外，增強子可位於任何地方，例如未轉譯區或多腺苷酸化作用訊號之下游。增強子之選擇和定位係依照與用於表現之宿主細胞適合的相容性而定。
多腺苷酸化作用/終止
在真核系統中，多腺苷酸化作用訊號係操作上連接編碼抗原結合蛋白之DNA/多核苷酸。此等訊號典型地係在開放讀框之3’位置。在哺乳動物系統中，非限定實例包括衍生自生長激素、延長因子-1α及病毒(例如SV40)基因或反轉錄病毒長端點重複序列之訊號。在酵母菌系統中，多腺苷酸化作用/終止訊號之非限定實例包括該等衍生自磷酸甘油酸激酶(PGK)及乙醇去氫酶1(ADH)基因者。在原核系統中，典型地多腺苷酸化作用訊號並不需要，取而代之的，通常係應用較短或更多定義的終止子序列。多腺苷酸化作用/終止序列可依照與用於表現之宿主細胞適合的相容性而定。
用於增加產率之其他方法/元件
除了上述外，可用於增加產率之其他方面包括染色體重塑元件、內插子和宿主細胞專一性密碼子修飾作用。
宿主細胞
適合用於選殖和表現編碼抗原結合蛋白之載體的宿主細胞有原核細胞、酵母菌或高等的真核細胞。適合的原核細胞包括真細菌，例如腸桿菌科如埃希氏菌屬，例如大桿菌(例如ATCC 31,446；31,537；27,325)、腸桿菌，歐文菌(Erwinia)、克雷白桿菌(Klebsiella)、变形桿菌(Proteus)、沙門氏菌(Salmonella)例如沙門氏鼠傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌(Serrati)例如黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)及志賀氏菌(Shigella)以及芽孢桿菌(Bacilli)例如地衣芽孢桿菌(B. subtilis)和枯草芽孢桿菌(B. licheniformis)(參見DD 266 710)、假單胞菌(Pseudomonas)例如綠膿桿菌(P. aeruginosa)和鏈黴菌(Streptomyces)。亦可包括酵母菌宿主細胞中之釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母(Kluyveromyces)(例如ATCC 16,045；12,424；24178；56,500)、耶氏酵母(yarrowia)(EP402,226)、畢氏酵母(Pichia pastoris)(EP 183 070,亦參見Peng,等人(2004) J. Biotechnol. 108：185-192)、念珠菌(Candida)、瑞氏木黴菌(Trichoderma reesia)(EP 244 234)、青黴素，彎頸黴(Tolypocladium)和麴菌(Aspergillus)宿主，例如小巢狀麴菌(A. nidulans)和黑麴菌(A. niger)。
高等的真核宿主細胞包括哺乳動物細胞，例如COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC CRL 1651)、人類胚胎腎細胞株293、幼倉鼠腎細胞(BHK)(ATCC CRL.1632)、BHK570(ATCC NO：CRL 10314)、293(ATCC NO.CRL 1573)、中國倉鼠卵巢細胞CHO(例如CHO-K1、ATCC NO：CCL 61、DHFR-CHO細胞株，例如DG44(參見Urlaub等人(1986) Somatic Cell Mol. Genet. 12：555-556)，特別是適應懸浮培養之CHO細胞株、小鼠睪丸支持細胞(sertoli cell)、猴子腎細胞、非洲綠猴腎細胞(ATCC CRL-1587)、HELA細胞、犬腎細胞(ATCC CCL 34)、人類肺細胞(ATCC CCL 75)、Hep G2及骨髓瘤或淋巴瘤細胞，例如NS0(參見US 5,807,715)、Sp2/0、Y0。
此等宿主細胞亦可進一步工程化或調整修飾抗原結合蛋白之質性、功能及/或產率。非限定實例包括專一性修飾(例如糖基化)酵素之表現或蛋白摺疊伴隨蛋白。
細胞培養方法
以編碼抗原結合蛋白之載體轉化的宿主細胞可以熟習本項技術者已知之方法來培養。宿主細胞可在懸浮培養瓶、滾動培養瓶或中空纖維系統中培養，但對於大量生產係特別是使用攪拌槽反應器進行懸浮培養。攪拌槽可使用例如噴淋器、擋板、低應力葉輪調整給氣。對於泡罩塔和氣升式反應器，可使用空氣或氧泡直接給氣。當宿主細胞係在無血清培養基中培養時，培養基係添加細胞保護試劑，例如pluronic F-68以幫助防止給氣過程所造成的細胞損傷。依照宿主細胞的特性，可使用微載體作為貼附依賴細胞株之生長基質，或使細胞可適應於懸浮培(典型的)。宿主細胞之培養，特別是無脊椎動物宿主細胞可利用各種操作模式，例如分批、重複分批培養(參見Drapeau,等人(1994) Cytotechnology 15：103-109)、擴展分批培養或灌注培養。雖然重組轉化的哺乳動物細胞可在含血清培養基例如胎牛血清(FCS)中培養，例如，但是此等宿主細胞係在合成的無血清培養基，例如Keen,等人(1995) Cytotechnology 17：153-163中所揭示，或市售的培養基例如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ,USA)當需要時，添加能量來源例如葡萄糖和合成的生長因子例如重組的胰島素來培養。宿主細胞之無血清培養可能需要使該等細胞適應生長於無血清條件。將此等宿主細胞培養置於含血清的培養基中並重複以80%無血清的培養基交換，讓宿主細胞學習適應無血清條件，即為一種適應方法(參見，例如Scharfenberg,等人(1995) ANIMAL CELL TECHNOLOGY：DEVELOPMENTS TOWARDS THE 21ST CENTURY(Beuvery,等人,eds,619-623,Kluwer Academic publishers)。
分泌到培養基中的抗原結合蛋白可使用各種技術回收及純化以提供適合希望用途之純度。例如用於治療人類病患之抗原結合蛋白典型地係要求至少95%純度，更典型地98%或99%或更高的純度(相較於粗培養基)。培養基中的細胞碎片典型地係使用離心，接著使用微過濾、超過濾及/或深層過濾之上清液澄清步驟來移除。各種其他的方法例如透析和凝膠電泳及層析技術例如羥基磷灰石(HA)、親和層析(視需要包括親和標記系統，例如聚組胺酸)及/或疏水作用層析(HIC,參見US 5,429,746)亦可取得。抗體，在各種澄清步驟後，可使用蛋白A或G親和層析來捕捉。隨後可進行進一步的層析步驟，例如離子交換及/或HA層析、陰離子或陽離子交換、尺寸排阻層析及硫酸銨沉澱。亦可應用各種病毒移除步驟(例如，如使用DV-20過濾器之奈濾)。在這些各種步驟後，得到包括至少75毫克/毫升或更高，或100毫克/毫升或更高的抗原結合蛋白之純化(例如單株)製備物。此等製備物實質上無聚集形式之抗原結合蛋白。
細菌系統可用表現抗原結合片段。此等片段可侷限在胞內周質中，或排出胞外。不可溶的蛋白可根據熟習本項技術者已知的方法萃取並復性，形成活性蛋白，參見Sanchez,等人(1999) J. Biotechnol. 72：13-20；and Cupit,等人(1999) Lett Appl Microbiol 29：273-277。
脫醯胺基為一其中移除醯胺功能基之化學反應。在生物化學中，此反應對蛋白降解很重要，因為其損傷了含醯胺側鏈之胺基酸，天門冬醯胺酸和麩醯胺酸。脫醯胺反應咸信為可限制蛋白質有效壽命之因子之一，其亦為發生在治療性蛋白製造期間最常見的後轉譯修飾作用之一。例如，已有報告指出重組的人類DNA和重組的可溶性CD4在活體外和活體內生物活性之降低或喪失，而其他重組的蛋白似乎不受影響。在引發脫醯胺作用之壓力條件下，文中所述的抗原結合蛋白與HER3結合之能力似乎不受影響。因此，文中所述的抗原結合蛋白之生物活性及其有效壽命不太可能受脫醯胺作用影響。
醫藥組成物
文中所述之抗原結合蛋白的純化製備物可併入醫藥組成物中，用於治療文中所述之人類疾病、病症和症狀。術語「疾病」、「病症」和「症狀」在文中可交換使用。此醫藥組成物可用於治療其中HER3受體造成疾病，或其中中和HER3受體活性為有利的之疾病。包含治療上有效量之抗原結合蛋白的醫藥組成物可用於治療反應HER3受體中和作用之疾病。
醫藥製備物可包括抗原結合蛋白與醫藥上可接受載劑之組合。抗原結合蛋白可單獨投予或為醫藥組成物之部分。
典型地，此等組成物係包括已為可接受的醫藥施行所知或聲稱之醫藥上可接受載劑。參見，例如馬克出版公司之REMINGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCES,第16版(1980)。此等載劑之實例包括無菌載劑，例如食鹽水、林格氏溶液或葡萄糖溶液，視需要以適合的緩衝劑緩衝到pH 5至8的範圍內。
醫藥組成物可以注射或連續輸注(例如靜脈內、腹腔內、皮內、皮下、肌肉內或門靜脈內)給藥。此等組成物適當的為無可見顆粒。醫藥組成物可包括介於1毫克至10克的抗原結合蛋白，例如介於5毫克至1克的抗原結合蛋白。另外，組成物可包括介於5毫克至500毫克的抗原結合蛋白，例如介於5毫克至50毫克。
製備此等醫藥組成物之方法已為熟習本項技術者所熟知。醫藥組成物可於單位劑型中包括介於1毫克至10克的抗原結合蛋白，視需要與使用說明一起。醫藥組成物可以熟習本項技術者熟知的方法凍乾(冷凍乾燥)在投予前供重建。當抗體具有IgG1同型物時，可於醫藥組成物中加入銅螯合劑例如檸檬酸鹽(例如檸檬酸鈉)或EDTA或組胺酸，以降低銅媒介的此同型抗體之降解程度。參見EP0612251。醫藥組成物亦可包括增溶劑，例如精胺酸、清潔/抗聚集劑例如聚山梨醇酯80及惰性氣體例如氮以置換瓶子上層的氧。
投予抗原結合蛋白之有效劑量及治療療法一般係以經驗決定並可依照例如病患的年齡、體重和健康狀況及所欲治療的病症和疾病等因子而定。此等因子係在主治醫師的範圍內。選擇適當劑量之指南可參見例如Smith,等人(1977) ANTIBODIES IN HUMAN DIAGNOSIS AND THERAPY,Raven Press,New York。
投予至一對象中之抗原結合蛋白的劑量係介於1微克/公斤至150毫克/公斤，介於0.1毫克/公斤至100毫克/公斤，介於0.5毫克/公斤至50毫克/公斤，介於1至25毫克/公斤，或介於1至10毫克/公斤之該對象體重。例如，此劑量可為10毫克/公斤、30毫克/公斤獲60毫克/公斤。此劑量亦可為從10毫克/公斤至110毫克/公斤，15毫克/公斤至25毫克/公斤或15毫克/公斤至100毫克/公斤。抗原結合蛋白可以例如非經腸、皮下、靜脈內或肌肉內給藥。劑量可為這些範圍內之任何各別的子範圍。
若需要，治療組成物之有效每日劑量可以二、三、四、五、六或更多次的子劑量於一整天以適當的時間間隔分開投予，視需要以單位劑型來給藥。
給劑可藉由緩慢連續的輸注液於從2至24小時，例如2至12小時或從2至6小時的期間內給藥。此種給藥可降低毒性副作用。
給劑若需要可重複一或多次，例如每天三次，每天一次，每二天一次，每星期一次，二星期一次，一個月一次，每3個月一次，每6個月一次或每12月一次。抗原結合蛋白可以維持性治療來給藥，例如於6個月或更久的期間每星期一次。抗原結合蛋白可以間歇性治療來給藥，例如給藥3至6個月期間，然後3至6個月不給劑，接著再次給予抗原結合蛋白3至6個月，如此等等，為一循環。
例如，可以每14或28天，在各給劑的當天以多個子劑量的形式皮下給劑。
劑量可藉由投予生物樣本後，使用以抗-HER3抗原結合蛋白為目標的抗獨特型抗體測量循環的抗-HER3抗原結合蛋白之量來測定或調整。
抗原結合蛋白可以特定位置之標靶治療的方式投予一對象。例如，抗原結合蛋白可局部注射至肌肉中，例如骨骼肌。
抗原結合蛋白可與一或多種其他的治療活性劑，例如抗體或其他受體酪胺酸激酶，例如但不限於其他HER家族成員、c-Met、IGF-1R、受體配體例如血管內皮生長因子(VEGF)之小分子抑制劑、細胞毒性劑例如阿黴素(doxorubicin)、順鉑(cis-platin)或卡鉑(carboplatin)、細胞激素或抗腫瘤劑組合使用。後者之實例包括(但不限於)抗體或免疫調節蛋白、小分子抑制劑或化療劑，其係來自有絲***抑制劑、激酶抑制劑、烷化劑、抗代謝物、嵌入抗生素、生長因子抑制劑、細胞週期抑制劑、酵素、拓樸異構酶抑制劑、組蛋白去乙醯酶抑制劑、抗存活劑、生物反應修飾劑、抗激素例如抗***和抗血管新生劑之群。當抗腫瘤劑為放射性時，治療可由體內(近接治療BT)或體外(體外放射線治療：EBRT)來源來進行。本揭示文之抗體可藉由任何種類的機制包括化學鍵結、疏水性作用、靜電作用等與如文中所述或WO2007/077028中之化療劑或放射性同位素相結合，其中WO2007/077028其全文係以引用的方式併入本文中。
本揭示文之抗體可與其他治療活性劑組合，用於治療文中所述之疾病。此等組合可用治療其中HER3受體造成此疾病或其中中和HER3受體為有利的之疾病。
當抗原結合蛋白係與其他治療活性劑組合使用時，個別的組份可共同或分開、先後或同時以分開或組合的醫藥調配物藉由任何方便的路徑來給藥。若分開或先後給藥，則抗原結合蛋白和治療活性劑可以任何順序給藥。
上述之組合可以用於包括上述定義之組合物及視需要醫藥上可接受載劑和賦形劑的單一醫藥調配形式呈現。此等醫藥上可接受載劑或賦形劑已為本項技術所熟知且包括該等揭示於WO2007//077028中之載劑或賦形劑，其中WO2007//077028其全文係以引用的方式併入本文中。此外，文中認定的任何其他參考文獻，其全文係以引用的方式併入本揭示文中。
當組合於相同的調配物中時，應了解，組份必須為安定的且彼此和調配物中的其他組份須相容及可經調配給藥。當分開調配時，其可以任何方便的調配物提供，例如以本項技術中已知用於抗原結合蛋白之方式。
當與抗相同疾病之第二治療劑組合時，各組份之劑量可與單獨使用抗原結合蛋白時不同。熟習本項技術者應可容易了解適合的劑量。
抗原結合蛋白及治療活性劑可協同性作用。換言之，投予抗原結合蛋白和治療活性劑之組合對文中所述的疾病、病症或症狀比各自單獨功效之總和具有較大效用
如文中所用，術語「有效量」係指藥物或醫藥劑之量將會引起例如研究者或臨床醫師所尋求之組織、系統、動物或人類之生物或醫療反應。醫藥劑可引起一種以上的生物或醫療反應。再者，「治療上有效量」係指任何量，當與沒有接受此量之對應的對象相比較時，其造成(但不限於)痊癒、防止或改善疾病、病症或副作用，或降低疾病或病症進行速率。此術語之範圍亦包括有效促進正常生理功能之量以及增進或幫助第二醫藥劑之治療效用有效引起病患生理功能之量。
如文中所用，術語「癌症」、「贅瘤」和「腫瘤」可交換使用且，以單數或複數形式，係指遭遇惡性轉化使其對宿主生物體產生病理之細胞。初級癌細胞(亦即，由惡性轉化之鄰近位置所取得之細胞)可藉由成熟的技術，特別是組織學檢查，容易地與非癌性細胞區分。癌細胞之定義，如文中所用，不僅包括初級癌細胞亦包括任何衍生自癌細胞前代之細胞。其係包括轉移的癌細胞，及活體外培養和衍生自癌細胞之細胞株。當指一般顯示為實體腫瘤之癌症種類時，「臨床上可偵測的」腫瘤為可基於腫瘤重量偵測出之腫瘤；例如以CAT掃描、MR造影、X-光、超音波或觸診之過程，及/或因為從病患之可取得的樣本中，一或多種癌症專一性抗原之表現使其可偵測出。腫瘤可為造血的腫瘤，例如血液細胞之腫瘤或其類似腫瘤，係指液體腫瘤。此等腫瘤臨床症狀之特定的實例包括白血病，例如慢性髓細胞白血病或急性髓細胞白血病；骨髓瘤例如多發性骨髓瘤；淋巴瘤及類似腫瘤。
術語「治療」或其語法變化，如文中所用係指治療性治療。就特定的症狀而言，治療係指：(1)改善一或多種此症狀之生物顯現狀況，(2)干擾(a)導致或造成此症狀之生物聯級的一或多個點，或(b)一或多個此症狀之生物顯現，(3)減輕一或多個與此症狀有關的癥狀、作用或副作用，或其治療，(4)減緩症狀或一或多個此症狀生物顯現之進程，或(5)防止一或多個此症狀之生物顯現的發生。因此亦涵蓋預防性治療。熟習技術者應了解，「防止」並非一絕對的術語。在藥物中，「防止」請了解係指預防性給予藥物以實質上減少一症狀或其生物顯現之可能或嚴重性，或延緩此症狀或其生物顯現之發生。例如當該對象被認為係楚於發生癌症的高風險時，預防性治療為適當的，例如當一對象具有很強的癌症家族史或當一對象已暴露於致癌物質中時。
在本揭示文之方法中，抗原結合蛋白可「共投予」，其係，指如同時給予或任何個別先後給予文中所述之抗原結合蛋白，及已知可用於治療癌症(包括化療和放射性治療)之另外的活性成份或成份之方式。術語，如文中所用，另外的活性成份或成份係包括任何已知的或當投予需要癌症或關節炎治療之病患時其顯現有利性質之化合物或治療劑。較佳地，若並非同時給藥時，化合物係以相互極接近的時間給藥。再者，若化合物係以相同的劑型給藥則無所謂，例如一化合物可局部給藥而另一化合物可口服給藥。
典型地，任何具有活性及對所欲治療的腫瘤具敏感性之抗癌藥皆可共投予用於本揭示文之癌症治療。此等藥劑之實例可參見V.T. Devita和S. Hellman(編輯者)之Cancer Principles and Practice of Oncology，第6版(2001年2月15日),Lippincott Williams & Wilkins出版商。本項技術之一般技術者應能以藥物的特定性質和所涉及的癌症為基準，辨別藥劑的組合是否為有效。可用於本揭示文之典型的抗腫瘤藥包括(但不限於)抗微管劑例如二萜類和長春鹼類；鉑配位複合物；烷化劑例如氮芥、氧氮膦類(oxazaphosphorine)、烷基磺酸酯、亞硝基尿素及三氮烯(triazene)；抗生素例如蒽環類(anthracyclin)、放線菌素(actinomycin)及博來黴素(bleomycin)；拓樸異構酶II抑制劑例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)；抗代謝物例如嘌呤和嘧啶類似物及抗葉酸化合物；拓樸異構酶I抑制劑例如喜樹鹼(camptothecin)；激素和激素類似物；訊號轉導路徑抑制劑；非受體酪胺酸激酶血管新生抑制劑；免疫治療劑；促凋亡劑；及細胞週期訊號傳遞抑制劑。
可用於與文中所述之抗原結合蛋白組合使用或共投予之另外的活性成份或成份(抗腫瘤劑)之實例為化療劑。此等化療劑和其他可與文中所述之抗原結合蛋白組合於組成物中或於治療方法中共投予之治療劑種類係描述如下。
抗微管劑或抗有絲***劑為於細胞週期之M期或絲***期期間抗腫瘤細胞微管之時期專一性藥劑。抗微管劑之實例包括(但不限於)二萜類和長春鹼。
衍生自天然來源之二萜類為用於細胞週期G2/M期之時期專一性抗癌劑。咸信，二萜類係藉由與此蛋白結合利用微管之β-微管蛋白亞基。因有絲***受阻似乎可抑制此蛋白單離及隨後細胞死亡。二萜類之實例包括(但不限於)太平洋紫杉醇(paclitaxel)及其類似物多西紫杉醇(docetaxel)。
太平洋紫杉醇5β,20-環氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六-羥基紫杉-11-烯-9-酮4,10-二乙酸2-苯甲酸13-酯帶有(2R,3S)-N-苯甲醯基-3-苯基異絲胺酸；為從太平洋紫杉(Taxus brevifolia)所單離出的天然二萜產品且市售的為注射溶液TAXOLTM。其為松烯之紫杉烷家族之一成員。其首先係由Wani等人J. Am. Chem,Soc.,93：2325.1971)於1971年分離出，Wani等人係以化學和X-光結晶學反定出其結構特性。其活性之一機制係與太平洋紫杉醇和微管結合之能力有關，藉此抑制癌細胞生長。Schiff等人,Proc. Natl,Acad,Sci. USA,77：1561-1565(1980)；Schiff等人,Nature,277：665-667(1979)；Kumar,J. Biol,Chem,256：10435-10441(1981)。就某些太平洋紫杉醇衍生物之合成和抗癌活性之論述請參見：D. G. I. Kingston等人,Studies in Organic Chemistry vol. 26,標題為“New trends in Natural Products Chemistry 1986”,Attaur-Rahman,P.W. Le Quesne,Eds.(Elsevier,Amsterdam,1986) pp 219-235。
太平洋紫杉醇已核准供臨床上用於美國治療難治性卵巢癌(Markman等人,Yale Journal of Biology and Medicine,64：583,1991；McGuire等人,Ann.lntem,Med.,111：273,1989)及用於治療乳癌(Holmes等人,J. Nat. Cancer Inst.,83：1797,1991.)。其為治療皮膚腫瘤(Einzig等人,Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.,20：46)及頭頸癌(Forastire等人,Sem. Oncol.,20：56,1990)之潛在候選藥。此化合物亦顯現治療多囊性腎疾病(Woo等人,Nature,368：750.1994)、肺癌和瘧疾之潛在性。以太平洋紫杉醇治療病患產生骨髓抑制(多細胞譜系,Ignoff,R.J.等人,Cancer Chemotherapy Pocket Guide,1998)係與給劑極限濃度以上之效期有關(50nM)(Kearns,C.M.等人,Seminars in Oncology,3(6) p.16-23,1995)。
多西紫杉醇，(2R,3S)-N-羧基-3-苯基異絲胺酸,N-第三丁酯,13-酯帶有5β-20-環氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羥基紫杉-11-烯-9-酮4-乙酸2-苯甲酸，三水合物；為市售TAXOTERETM可注射溶液。多西紫杉醇適於治療乳癌。多西紫杉醇為太平洋紫杉醇之合成的衍生物q.v.，係使用由歐洲紫杉針葉中所萃取的天然前驅物10-去乙醯基-巴卡丁(baccatin)III所製備。多西紫杉醇之給劑限制毒性為噬中性白血球減少症。
長春鹼為從長春花衍生之時期專一性抗腫瘤劑。長春鹼係藉由專一性與微管蛋白結合，作用於細胞週期之M時期(有絲***)。因此，此結合微管蛋的白分子無法聚合成微管。咸信有絲***在中期受阻，及隨後細胞死亡。長春鹼之實例包括(但不限於)長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)及長春瑞濱(vinorelbine)。
長春鹼，長春鹼硫酸鹽市售為VELBANTM可注射溶液。雖然其可能適用於各種實體腫瘤之第二線治療，但是其主要係適用治療睪丸癌和各種淋巴瘤包括何杰金氏症；及淋巴細胞性和組織細胞性淋巴瘤。骨髓抑制為長春鹼之劑量限制的副作用。
長春新鹼，長春鹼(vincaleukoblastine)，22-側氧基-,硫酸鹽，市售為ONCOVINTM之可注射溶液。長春新鹼係適用於治療白血病及亦發現可用於治療何杰金氏和非何杰金氏惡性淋巴瘤。脫髮和神經性效應為長春新鹼最常見的副作用及較小程度的骨髓抑制和發生胃腸黏膜炎效應。
長春瑞濱，3’,4’-二去氫-4’-去氧-C’-長春鹼[R-(R*,R*)-2,3-二羥基丁二酸鹽(1：2)(鹽類)]，市售為長春瑞濱酒石酸鹽(NAVELBINETM)可注射溶液，為半合成的長春鹼。長春瑞濱適合作為單一藥劑或與其他化療劑，例如順鉑組合，用於治療各種實體腫瘤，特別是非小細胞肺癌、晚期乳癌和激素抗拒性***癌。骨髓抑制為長春瑞濱最常見的劑量限制副作用。
鉑配位複合物為非時期專一性抗癌劑，其係具有與DNA相互作用之活性。鉑複合物進入腫瘤細胞，經歷水合作用並與DNA形成股內和股間交鏈，產生對腫瘤有害的生物效應。鉑配位複合物之實例包括(但不限於)順鉑和卡鉑。
順鉑，順-二胺二氯鉑，市售為PLATINOLTM之注射溶液。順鉑主要係適用治療轉移性睪丸和卵巢癌和晚期膀胱癌。順鉑主要的劑量限制副作用為腎毒性(其可由水合作用和利尿來控制)及耳毒性。
卡鉑，鉑二胺[1,1-環丁烷-二羧酸(2-)-O,O’]，市售為PARAPLATINTM之可注射溶液。卡鉑主要係適用於晚期卵巢癌之第一和第二線治療。骨髓抑制為卡鉑之劑量限制毒性。
烷化劑為非時期專一性抗癌劑及強力的親電子劑。典型地，烷化劑係由烷化作用與DNA經由DNA分子之親電子基團，例如磷酸、胺基、巰基、羥基、羧基和咪唑基形成共價連接。此烷化作用會擾亂核酸功能導致細胞死亡。烷化劑之實例包括(但不限於)氮芥例如環磷醯胺、氮芥***酸(melphalan)及氮芥苯丁酸(chlorambucil)；烷基磺酸酯例如白消安(busulfan)；硝基尿素例如卡莫司汀(carmustine)；和三氮烯例如氮烯唑胺(dacarbazine)。
環磷醯胺，2-[雙(2-氯乙基)胺基]四氫-2H-1,3,2-氧氮膦2-氧化物單水合物，市售為CYTOXANTM可注射溶液或錠劑。環磷醯胺係適合作為單一藥劑或與其他的化療劑組合，用於治療惡性淋巴瘤、多發性淋巴瘤和白血病。脫髮、噁心、嘔吐和白血球減少為環磷醯胺最常見的劑量限制副作用。
氮芥***酸，4-[雙(2-氯乙基)胺基]-L-***酸，市售為ALKERANTM可注射溶液或錠劑。氮芥***酸係適用於多發性骨髓瘤和無切除上皮細胞卵巢癌之舒緩治療。骨髓抑制為氮芥***酸最常見的劑量限制副作用。
氮芥苯丁酸，4-[雙(2-氯乙基)胺基]苯丁酸，市售為LEUKERANTM錠劑。氮芥苯丁酸係適用於慢性淋巴性白血病和惡性淋巴瘤例如巨濾泡性淋巴瘤和何杰金氏症之舒緩治療。骨髓抑制為氮芥苯丁酸最常見的劑量限制副作用。
白消安，1,4-丁二醇二甲基磺酸酯，市售為MYLERANTM錠劑。白消安係適用於慢性骨髓性白血病之舒緩治療。骨髓抑制為白消安最常見的劑量限制副作用。
卡莫司汀，1,3-[雙(2-氯乙基)-1-硝基尿素，市售為BiCNUTM單瓶之凍乾物。卡莫司汀係適用於舒緩治療之單一藥劑或與其他用於腦瘤、多發性骨髓瘤、何杰金氏症和非何杰金氏症之藥劑組合。延遲性骨髓抑制為卡莫司汀最常見的劑量限制副作用。
氮烯唑胺，5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲醯胺，市售為DTIC-DomeTM單瓶物。氮烯唑胺係適用於治療轉移的惡性腫瘤及與其他用於何杰金氏症第二線治療之藥物組合。噁心、嘔吐和厭食為氮烯唑胺最常見的劑量限制副作用。
抗生素抗腫瘤藥為非時期專一性藥物，其係與DNA結合或***DNA。典型地，此作用產生安定的DNA複合物或股斷裂，擾亂核酸正常功能而導致細胞死亡。抗生素抗腫瘤藥之實例包括(但不限於)放線菌素(actinomycin)例如更生黴素(dactinomycin)、蒽環類(anthrocyclin)例如柔紅黴素(daunorubicin)和阿黴素(doxorubicin)；及博來黴素。
更生黴素，又稱為放線菌素D，市售為可注射形式COSMEGENTM。更生黴素係適用於治療威爾姆氏腫瘤和橫紋肌肉瘤。噁心、嘔吐和厭食為更生黴素最常見的劑量限制副作用。
柔紅黴素，(8S-順-)-8-乙醯基-10-[(3-胺基-2,3,6-三去氧-α-L-來蘇糖-吡喃己糖苷)氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-1-甲氧基-5,12四并苯醌鹽酸鹽，市售為微脂體可注射形式之DAUNOXOMETM或為可注射之CERUBIDINETM。柔紅黴素係適用於治療急性非淋巴性白血病和晚期HIV有關的卡波西氏肉瘤。骨髓抑制為柔紅黴素最常見的劑量限制副作用。
阿黴素，(8S,10S)-10-[(3-胺基-2,3,6-三去氧-α-L-來蘇糖-吡喃己糖苷)氧基]-8-乙醇醯基,7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-1-甲氧基-5,12四并苯醌鹽酸鹽，市售為可注射形式之RUBEXTM或ADRIAMYCIN RDFTM。阿黴素主要係適用於治療急性淋巴母細胞白血病和急性骨髓母細胞白血病，但亦可作為治療某些實體腫瘤和淋巴瘤之有效組份。骨髓抑制為阿黴素最常見的劑量限制副作用。
博來黴素，一種由輪絲鏈黴菌株(Streptomyces verticillus)分離出的細胞毒性糖胜肽抗生素，市售為BLENOXANETM。博來黴素係適用於舒緩治療、單一藥劑或與其他鱗狀細胞癌、淋巴瘤和睪丸癌之藥劑組合。肺和皮膚毒性為博來黴素最常見的劑量限制副作用。
拓樸異構酶II抑制劑包括(但不限於)表鬼臼毒素。
表鬼臼毒素為衍生自曼陀羅植株之時期專一性抗腫瘤藥。表鬼臼毒素典型地係藉由與拓樸異構酶II和DNA形成三元複合物，造成DNA股斷裂，影響細胞之細胞週期的S和G2期。股斷裂蓄積及隨後細胞死亡。表鬼臼毒素之實例包括(但不限於)依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)。
依托泊苷，4’-去甲基-表鬼臼毒素9[4,6-0-(R)-亞乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，市售為VePESIDTM可注射溶液或膠囊，一般係稱為VP-16。依托泊苷係適用作單一藥劑或與其他治療睪丸癌和非小細胞肺癌之化療劑組合。骨髓抑制為依托泊苷最常見的副作用。白血球減少發生率比血小板低下會更嚴重。
替尼泊苷，4’-去甲基-表鬼臼毒素9[4,6-0-(R)-噻吩亞甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，市售為VUMONTM可注射溶液且一般稱為VM-26。替尼泊苷係適用係適用作單一藥劑或與其他治療兒童急性白血病之化療劑組合。骨髓抑制為替尼泊苷最常見的劑量限制副作用。替尼泊苷可能引起白血球減少和血小板低下。
抗代謝物腫瘤藥劑為時期專一性之抗腫瘤藥劑，其係藉由抑制DNA合成或抑制嘌呤和嘧啶鹼基合成並因而限制DNA合成，作用在細胞週期之S期(DNA合成)。因此，S期無法進行及隨後死亡。抗代謝物抗腫瘤藥劑之實例包括(但不限於)氟尿嘧啶(fluorouracil)、甲胺蝶呤(methotrexate)、阿糖胞苷(cytarabine)、巰嘌呤(mecaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)和吉西他濱(gemcitabine)。
5-氟尿嘧啶，5-氟-2,4-(1H,3H)嘧啶二酮，市售為氟尿嘧啶。給予5-氟尿嘧啶會抑制胸苷酸合成且亦或併入RNA和DNA。典型的結果為細胞死亡。5-氟尿嘧啶係適用作單一藥劑或與其他治療乳癌、大腸癌、直腸癌、胃癌和胰臟癌之化療劑組合。骨髓抑制和黏膜炎為5-氟尿嘧啶之劑量限制副作用。其他的氟嘧啶類似物包括5-氟去氧尿苷(氟尿苷)及5-氟去氧尿苷單磷酸鹽。
阿糖胞苷，4-胺基-1-β-D-***呋喃糖基-2(1H)-嘧啶酮，市售為CYTOSAR-UTM且一般係稱為Ara-C。咸信，阿糖胞苷具有S-期之細胞時期專一性，其係藉由於成長的DNA鏈中末端併入阿糖胞苷，抑制DNA鏈延長。阿糖胞苷係適用作單一藥劑或與其他治療急性白血病之化療劑組合。其他的胞苷類似物包括5-氮胞苷和2’,2’-二氟去氧胞苷(吉西他濱)。阿糖胞苷會引起白血球減少、血小板低下和黏膜炎。
巰嘌呤，1,7-二氫-6H-嘌呤-6-硫酮單水合物，市售為PURINETHOLTM。巰嘌呤具有S-期之細胞時期專一性，其係藉由尚為指明的機制，抑制DNA合成。巰嘌呤係適用作單一藥劑或與其他治療急性白血病之化療劑組合。骨髓抑制和腸胃黏膜炎為高劑量巰嘌呤可能的副作用。有用的巰嘌呤類似物有硫唑嘌呤(azathioprine)。
硫鳥嘌呤，2-胺基-1,7-二氫-6H-嘌呤-6-硫酮，市售為TABLOIDTM。硫鳥嘌呤具有S-期之細胞時期專一性，其係藉由尚為指明的機制，抑制DNA合成。硫鳥嘌呤係適用作單一藥劑或與其他治療急性白血病之化療劑組合。骨髓抑制，包括白血球減少、血小板低下和貧血為硫鳥嘌呤給藥最常見的劑量限制副作用。然而，會有腸胃副作用發生且可受劑量限制。其他嘌呤類似物包括噴司他丁(pentostatin)、紅羥基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine)、氟達拉濱磷酸鹽(fludarabine phosphate)和克拉曲濱(cladribine)。
吉西他濱2’-去氧-2’,2’-二氟胞苷單鹽酸鹽(β-異構物)，市售為GEMZARTM。吉西他濱具有S-期之細胞時期專一性並經由G1/S交界阻斷細胞進程。吉西他濱係適合與順鉑組合用於局部晚期非小細胞肺癌及單獨用於治療局部晚期胰臟癌。骨髓抑制，包括白血球減少、血小板低下和貧血為吉西他濱給藥最常見的劑量限制副作用。
甲胺蝶呤，N-[4[[(2,4-二胺基-6-蝶啶基)甲基]甲基胺基]苯甲醯基]-L-麩胺酸，市售為甲胺蝶呤鈉。甲胺蝶呤具有S-期之細胞時期專一性，其係經由抑制嘌呤核苷酸和胸苷酸合成所需的二氫葉酸還原酶，抑制DNA合成、修復及/或複製。甲胺蝶呤係適用作單一藥劑或與其他治療绒毛膜癌、腦膜白血病、非何杰金氏淋巴瘤及乳癌、頭癌、頸癌、卵巢癌和膀胱癌之化療劑組合。骨髓抑制(白血球減少、血小板低下和貧血)及黏膜炎為甲胺蝶呤給藥可能的副作用。
喜樹鹼，包括喜樹鹼和喜樹鹼衍生物，為可取得或開發為拓樸異構酶I抑制劑。喜樹鹼細胞毒殺活性咸信係與其拓樸異構酶I抑制劑活性有關。喜樹鹼之實例包括(但不限於)伊立替康(irinotecan)、拓樸替康(topotecan)和如下述之各種光學形式之7-(4-甲基哌基-亞甲基)-10,11-伸乙基二氧-20-喜樹鹼。
伊立替康HCl，(4S)-4,11-二乙基-4-羥基-9-[(4-哌啶并哌啶)羰基氧基]-1H-哌喃并[3’,4’,6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮鹽酸鹽，市售為CAMPTOSARTM可注射溶液。
伊立替康為喜樹鹼之衍生物，其隨同其活性代謝物SN-38，與拓樸異構酶I-DAN複合物結合。咸信，係因拓樸異構酶I：DNA：伊立替康或SN-38三元複合物與複製酵素的交互作用，導致不能恢復的雙股斷裂，產生細胞毒性。伊立替康係適用於治療轉移性大腸或直腸癌。伊立替康HCl之劑量限制副作用為骨髓抑制包括白血球減少，和GI效應包括腹瀉。
拓樸替康HCl，(S)-10-[(二甲基胺基)甲基]-4-乙基-4,9-二羥基-1H-哌喃并[3’,4’,6,7]吲哚并[1,2-b]喹啉-3,14-(4H,12H)-二酮單鹽酸鹽，市售為HYCAMTINTM可注射溶液。拓樸替康為喜樹鹼衍生物，其係與拓樸異構酶I-DNA複合物結合並防止由拓樸異構酶I回應DNA分子之扭變股所造成的斷裂單股再連接。拓樸替康係適用於卵巢癌和小細胞肺癌之轉移性癌症第二線治療。拓樸替康HCl之劑量限制副作用為骨髓抑制，主要為白血球減少。
目前開發中之下式A亦為有利的喜樹鹼衍生物，包括外消旋混合物(R,S)形式及R和S鏡像異構物：
已知的化學名稱為“7-(4-甲基哌基-亞甲基)-10,11-亞乙基二氧-20(R,S)-喜樹鹼(外消旋混合物)或7-(4-甲基哌基-亞甲基)-10,11-亞乙基二氧-20(R)-喜樹鹼(R鏡像異構物)或7-(4-甲基哌基-亞甲基)-10,11-亞乙基二氧-20(S)-喜樹鹼(S鏡像異構物)。此化合物以及相關的化合物，包括製造方法係描述於美國專利第6,063,923號；第5,342,947號；第5,559,235號；第5,491,237號中及1977年12月24日申請的審查中美國專利申請案第08/977,217號。
激素和激素類似物為治療其中激素與癌症之生成及/或無生成間有相關之癌症的有效化合物。可用於治療癌症之激素和激素類似物之實例包括(但不限於)腎上腺皮質類固醇例如潑尼松(prednisone)和潑尼松龍(prednisolone)，且其可用於治療惡性淋巴瘤和兒童急性白血病；胺魯米特(aminoglutethimide)和其他芳香酶抑制劑例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrazole)、伏氯唑(vorazole)和依西美坦(exemestane)可用於治療腎上腺皮質癌和包含***受體之激素依賴乳癌；黃體激素例如甲地孕酮乙酸鹽(megestrol acetate)可用於治療激素依賴乳癌和子宮內膜癌；***、雄激素和抗雄激素例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、環丙孕酮乙酸鹽(cyproterone acetate)，和5α-還原酶例如非那雄胺(finasteride)和度他雄胺(dutasteride)可用於治療***癌和良性攝護腺肥大；抗***例如塔莫西芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifen)e、屈洛昔芬(droloxifene)、艾多昔芬(iodoxyfene)以及選擇性***受體調節劑(SERMS)，例如該等描述於美國專利第5,681,835號、第5,877,219號和第6,207,716號者，可用於治療激素依賴乳癌和其他可感受之癌症；及刺激黃體形成激素(LH)釋放之性腺激素釋放激素(GnRH)及其類似物，及/或用於治療***癌之濾泡促進激素(FSH)，例如LHRH促進劑和拮抗劑例如戈舍瑞林乙酸鹽(goserelin acetate)和亮丙瑞林(luprolide)。
訊號傳導路徑抑制劑為該等阻斷或抑制引起胞內變化之化學過程的抑制劑。如文中所用，此變化為細胞增生或分化。可用於本發明之訊號傳導抑制劑包括受體酪胺酸激酶、非受體酪胺酸激酶、SH2/SH3阻斷劑、絲胺酸/蘇胺酸激酶、磷脂醯肌醇-3激酶、肌醇訊號傳遞和Ras致癌基因之抑制劑。
數種蛋白質酪胺酸激酶在各種涉及細胞生長調節之蛋白中催化特定酪醯胺殘基之磷酸化。此等蛋白質酪胺酸激酶可廣泛地分類為受體和非受體激酶。
受體酪胺酸激酶為具有胞外配體結合，一跨膜區，和酪胺酸激酶區之跨膜蛋白。受體酪胺酸激酶係涉及細胞生長調控且一般稱為生長因子受體。許多此等激酶之不適當或不受控制活化，亦即異常激酶生長因子受體活性，例如過度表現或突變，會導致細胞生長不受控制。因此，此等激酶異常的活性係與惡性組織生長相關聯。因此，此等激酶之抑制劑可提供癌症治療方法。生長因子受體包括，例如表皮生長因子受體(EGFr)、血小板衍生生長因子受體(PDGFr)、erbB2、erbB4、血管內皮生長因子受體(VEGFr)、帶有類免疫球蛋白和表皮生長因子同源區之酪胺酸激酶(TIE-2)、胰島素生長因子-I(IGFI)受體、巨噬細胞集落刺激因子(cfms)、BTK、ckit、cmet、纖維母細胞生長因子(FGF)受體、Trk受體(TrkA、TrkB和TrkC)、蝶素(ephrin)(eph)受體及RET原致癌基因。數種生長受體之抑制劑正在開發中且包括配體拮抗劑、抗體、酪胺酸激酶抑制劑及反義寡核苷酸。生長因子受體和抑制生長因子受體功能之藥劑係描述於，例如Kath,John C.、Exp. Opin. Ther. Patents(2000) 10(6)：803-818；Shawver等人DDT Vol 2,No. 2 February 1997；及Lofts,F. J.等人“Growth factor receptors as targets”,New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy,ed. Workman,Paul and Kerr,David、CRC press 1994,London中。
不為生長因子受體激酶之酪胺酸激酶係稱為非受體酪胺酸激酶。用於本發明之非受體酪胺酸激酶，可為抗癌藥物之目標或潛在目標，係包括cSrc、Lck、Fyn、Yes、Jak、cAbl、FAK(局部黏著斑激酶)、布魯頓氏酪胺酸激酶和Bcr-Abl。此等非受體激酶和抑制非受體酪胺酸激酶功能之藥劑係描述於Sinh,S.和Corey,S.J.,(1999) Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research 8(5)：465-80；及Bolen,J.B.,Brugge,J.S.,(1997) Annual review of Immunology. 15：371-404。
SH2/SH3區阻斷劑為擾亂各種酵素或銜接蛋白，包括PI3-K p85子單元、Src家族激酶、連接體分子(Shc、Crk、Nck、Grb2)和Ras-GAP中SH2或SH3區結合之藥劑。SH2/SH3區作為抗癌藥劑目標係論述於Smithgall,T.E.(1995),Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 34(3) 125-32中。
絲胺酸/蘇胺酸激酶之抑制劑包括MAP激酶聯集阻斷劑，其亦包括Raf激酶(rafk)、促細胞***原或胞外調節激酶(MEK)，和胞外調節激酶(ERK)；蛋白激酶C家族成員阻斷劑，包括PKC之阻斷劑(α、β、γ、ε、μ、λ、、ζ)。IkB激酶家族(IKKa、IKKb)、PKB家族激酶、akt激酶家族成員和TGFβ受體激酶。此等絲胺酸/蘇胺酸激酶和其抑制劑係描述於Yamamoto,T.,Taya,S.,Kaibuchi,K.,(1999),Journal of Biochemistry. 126(5) 799-803；Brodt,P,Samani,A.,and Navab,R.(2000),Biochemical Pharmacology,60.1101-1107；Massague,J.,Weis-Garcia,F.(1996) Cancer Surveys. 27：41-64；Philip,P.A.,and Harris,A.L.(1995),Cancer Treatment and Research. 78：3-27,Lackey,K.等人Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,(10),2000,223-226；美國專利第6,268,391號；及Martinez-Iacaci,L.,等人,Int. J. Cancer(2000),88(1),44-52。
磷脂醯肌醇-3激酶家族成員之抑制劑，包括PI3-激酶、ATM、DNA-PK和Ku之阻斷劑，亦可用於本發明。此等激酶係論述於Abraham,R.T.(1996),Current Opinion in Immunology. 8(3) 412-8；Canman,C.E.,Lim,D.S.(1998),Oncogene 17(25) 3301-3308；Jackson,S.P.(1997),International journal of Biochemistry and Cell Biology. 29(7)：935-8；及Zhong,H.等人,Cancer res,(2000) 60(6),1541-1545中。
本揭示文亦為有利的為肌醇訊號傳遞抑制劑例如磷脂酶C阻斷劑和肌醇類似物。此等訊號抑制劑係描述於Powis,G.,and Kozikowski A.,(1994) New Molecular Targets for Cancer Chemotherapy ed.,Paul Workman and David Kerr,CRC press 1994,London中。
另一群的訊號傳導路徑抑制劑為Ras致癌基因之抑制劑。此等抑制劑，包括法呢醯基轉移酶、異戊二烯基轉移酶和CAAX蛋白酶之抑制劑，以及反義寡核苷酸、核糖酶和免疫治療。此等抑制劑於含野生型Ras突變物之細胞中已顯現阻斷ras活化，藉此用作為抗增生劑。抑制Ras致癌基因係論述於Scharovsky,O.G.,Rozados,V.R.,Gervasoni,S.I. Matar,P.(2000),Journal of Biomedical Science. 7(4) 292-8；Ashby,M.N.(1998),Current Opinion in Lipidology. 9(2) 99-102；和BioChim. Biophys. Acta,(19899) 1423(3)：19-30中。
受體激酶結合之抗體拮抗劑亦可用作訊號傳導抑制劑。此群的訊號傳導路徑抑制劑包括於受體酪胺酸激酶之胞外配體結合區使用人源化抗體。例如Imclone C225 EGFR專一性抗體(參見Green,M.C.等人,Monoclonal Therapy for Solid Tumors,Cancer Treat. Rev.,(2000),26(4),269-286)；HerceptinTM erbB2抗體(參見Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer：erbB Family Receptor Tyrosine Kniases,Breast cancer Res.,2000,2(3),176-183)；及2CB VEGFR2專一性抗體(參見Brekken,R.A.等人,Selective Inhibition of VEGFR2 Activity by a Monoclonal Anti-VEGF antibody blocks tumor growth in mice,Cancer Res.(2000) 60,5117-5124)。
非受體激酶血管新生抑制劑亦可用於本發明。與VEGFR和TIE2有關的血管新生抑制劑係論述於上文有關訊號傳導抑制劑中(二種受體皆為受體酪胺酸激酶)。血管新生係與erbB2/EGFR訊號傳遞有關，因為erbB2和EGFR之抑制劑已顯現可抑制血管新生，主要為VEGF表現。因此，非受體酪胺酸激酶抑制劑可與本揭示文之化合物組合使用。例如，抗-VEGF抗體，其無法辨識VEGFR(受體酪胺酸激酶)，但可與配體結合；整合素(αvβ3)之小分子抑制劑將可抑制血管新生；內皮抑素(endostatin)和血管抑素(angiostatin)(非-RTK)亦可證實可用於與本揭示文之化合物組合。(參見Bruns CJ等人(2000),Cancer Res.,60：2926-2935；Schreiber AB,Winkler ME,and Derynck R.(1986),Science,232：1250-1253；Yen L等人(2000),Oncogene 19：3460-3469)。
用於免疫治療療法中之藥劑亦可用於與本揭示文之抗原結合蛋白組合。有許多產免疫反應之免疫學方法。這些方法一般係在接種腫瘤疫苗領域。可使用小分子抑制劑經由與抑制訊號傳遞路徑組合，大大增進此免疫法之功效。抗erbB2/EGFR免疫/腫瘤疫苗法之論述係參見Reilly RT等人(2000),Cancer Res. 60：3569-3576；及Chen Y,Hu D,Eling DJ,Robbins J,and Kipps TJ.(1998),Cancer Res. 58：1965-1971。
用於促凋亡療法(例如bcl-2反義寡核苷酸)之藥劑亦可用於與本發明組合。蛋白Bcl-2家族之成員阻斷凋亡作用。因此bcl-2之上調係與藥物抗性有關。研究顯示，表皮生長因子(EGF)刺激抗凋亡bcl-2家族成員(亦即mcl-1)。因此設計用於下調腫瘤中bcl-2表現之方法已證明臨床利益且目前已進行II/III階段的試驗，亦即Genta's G3139 bcl-2反義寡核苷酸。此等對bcl-2使用反義寡核苷酸法之促凋亡法係論述於Water JS等人(2000),J. Clin. Oncol. 18：1812-1823；及Kitada S等人(1994),Antisense Res. Dev. 4：71-79中。
細胞訊號傳遞抑制劑抑制了涉及控制細胞週期之分子。稱為週期素依賴激酶(CDK)之蛋白質激酶家族及其與稱為週期素之蛋白質家族的交互作用，控制了真核細胞週期進程。不同週期素/CDK複合物之配位活化和去活化為正常細胞週期進程所需。數種細胞週期訊號傳遞之抑制劑正在開發中。例如，週期素依賴激酶，包括CDK2、CDK4和CDK6及其抑制劑係描述於，例如Rosania等人,Exp. Opin. Ther. Patents(2000) 10(2)：215-230中。另外，p21WAF1/CIP1係描述為一強力及通用的週期素依賴激酶(Cdk)抑制劑(Ball等人,Progress in Cell Cycle Res.,3：125(1997))。已知可引起p21WAF1/CIP1表現之化合物係與抑制細胞增生有關且具有腫瘤抑制活性(Richoh等人,Proc. Nat Acad. Sci. U.S.A. 97(18)：10014-10019(2000))，及可包括作為細胞週期訊號傳遞之抑制劑。組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑係與p21WAF1/CIP之轉錄活化有關(Vigushin等人,Anticancer Drugs,13(1)：1-13(Jan 2002))且適合用作本文之細胞週期訊號傳遞抑制劑。
此等HDAC抑制劑之實例包括：
1.伏立諾他(Vorinostat)，包括其醫藥上可接受鹽類。Marks等人,Nature Biotechnology 25,84 to 90(2007)；Stenger,Community Oncology 4,384-386(2007)。
伏立諾他具有下列化學結構和名稱：
-N-羥基-N'-苯基-辛二醯胺。
2.羅米地辛(Romidepsin)，包括其醫藥上可接受鹽類。
Vinodhkumar等人,Biomedicine & Pharmacotherapy 62(2008) 85-93。
羅米地辛具有下列化學結構和名稱：
-(1S,4S,7Z,10S,16E,21R)-7-亞乙基-4,21-二(丙-2-基)-2-氧雜-12,13-二硫-5,8,20,23-四氮雜雙環[8.7.6]二十三-16-烯-3,6,9,19,22-戊酮。
3.帕比司他(Panobinostat)，包括其醫藥上可接受鹽類。Drugs of the Future 32(4)：315-322(2007)。
帕比司他具有下列化學結構和名稱：
-(2E)-N-羥基-3-[4-({[2-(2-甲基-1H-吲哚-3-基)乙基]胺基}甲基)苯基]丙烯醯胺。
4.丙戊酸，包括其醫藥上可接受鹽類。Gottlicher,等人,EMBO J. 20(24)：6969-6978(2001)。
丙戊酸具有下列化學結構和名稱：
2-丙基戊酸。
5.莫西司他(Mocetinostat)(MGCD0103)，包括其醫藥上可接受鹽類。Balasubramanian等人,Cancer Letters 280：211-221(2009)。
莫西司他具有下列化學結構和名稱：
N-(2-胺基苯基)-4-[[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)胺基]甲基]苯甲醯胺。
此等HDAC抑制劑之另外的實例係包括在Bertrand European Journal of Medicinal Chemistry 45,(2010) 2095-2116中，特別是如下所示文中表3之化合物。
本揭示文之癌症治療方法亦包括本揭示文之抗原結合蛋白及/或其醫藥上可接受鹽、水合物或前藥與至少一種例如由下列組成之群中選出之抗腫瘤藥共投予：抗微管劑、鉑配位複合物、烷化劑、抗生素、拓樸異構酶II抑制劑、抗代謝物、拓樸異構酶I抑制劑、激素或激素類似物、訊號傳導路徑抑制劑、非受體酪胺酸激酶血管新生抑制劑、免疫治療劑、促凋亡劑及細胞週期訊號傳導抑制劑。本揭示文之抗原結合蛋白可與MEK抑制劑組合使用，例如N-{3-[3-環丙基-5-(2-氟-4-碘-苯基胺基)-6,8-二甲基-2,4,7-三側氧基-3,4,6,7-四氫-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基}乙醯胺或其醫藥上可接受鹽或溶劑化物包括二甲基亞碸溶劑化物，其係揭示及聲請於申請日期2005年7月10日的國際申請案第PCT/JP2005/011082號；國際公開日期2005年12月22日的國際公開案號WO 2005/121142，其全文係以引用的方式併入本文中。N-{3-[3-環丙基-5-(2-氟-4-碘-苯基胺基)-6,8-二甲基-2,4,7-三側氧基-3,4,6,7-四氫-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基}乙醯胺可如2006年1月19日公開的美國專利公開案號US 2006/0014768中所述來製備，其全文係以引用的方式併入。本揭示文之抗原結合蛋白可與B-Raf抑制劑組合使用，例如N-{3-[5-(2-胺基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-***-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺醯胺或其醫藥上可接受鹽，其係揭示及聲請於申請日期2009年5月4日的國際申請案第PCT/US2009/042682號中，其全文係以引用的方式併入。N-{3-[5-(2-胺基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-***-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺醯胺可如國際申請案第PCT/US2009/042682號中所述來製備。本揭示文之抗原結合蛋白可與Akt抑制劑組合使用，例如N-{(1S)-2-胺基-1-[(3,4-二氟苯基)甲基]乙基}-5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-呋喃甲醯胺或其醫藥上可接受鹽，其係揭示及聲請於申請日期2008年1月7日的國際申請案第PCT/US2008/053269號中；申請日期2008年8月14日的國際公開案號WO 2008/098104，其全文係以引用的方式併入本文中。N-{(1S)-2-胺基-1-[(3,4-二氟苯基)甲基]乙基}-5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-呋喃甲醯胺可如國際申請案第PCT/US2008/053269號中所述來製備。本揭示文之抗原結合蛋白亦可與Akt抑制劑組合使用，N-{(1S)-2-胺基-1-[(3-氟苯基)甲基]乙基}-5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-硫基-苯甲醯胺或其醫藥上可接受鹽，其係揭示及聲請於申請日期2008年1月7日的國際申請案第PCT/US2008/053269號；申請日期2008年8月14日的國際公開案號WO 2008/098104，其全文係以引用的方式併入。N-{(1S)-2-胺基-1-[(3-氟苯基)甲基]乙基}-5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-硫基-苯甲醯胺為實例96之化合物且可如國際申請案第PCT/US2008/053269中所述來製備。N-{(1S)-2-胺基-1-[(3-氟苯基)甲基]乙基}-5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-2-硫基苯甲醯胺為鹽酸鹽形式。鹽形式可由熟習本項技術者從國際申請日期2010年1月28日的國際申請案第PCT/US2010/022323號之說明來製備帕唑帕尼(Pazopanib)為另一種可與本揭示文之抗原結合蛋白共投予之組成物。帕唑帕尼，市售為VOTRIENTTM，是一種酪胺酸激酶抑制劑(TKI)。帕唑帕尼係以鹽酸鹽的形式存在，化學名稱為5-[[4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)甲基胺基]-2-嘧啶基]胺基]-2-甲基苯磺醯胺單鹽酸鹽。帕唑帕尼經核准可用於治療患有晚期腎細胞癌之病患。
利妥昔單抗(Rituximab)為另一種可與本揭示文之抗原結合蛋白共投予之組成物。利妥昔單抗為嵌合的單株抗體係係以RITUXANTM和MABTHERATM販售。利妥昔單抗與B細胞上的CD20結合並導致細胞凋亡。利妥昔單抗係以靜脈內給藥並經核准可用於治療類風濕性關節炎和B細胞非何杰金氏淋巴瘤。
歐伐他姆單抗(Ofatumumab)為另一種可與本揭示文之抗原結合蛋白共投予之組成物。歐伐他姆單抗(Ofatumumab)為全人類單株抗體係以ARZERRATM販售。歐伐他姆單抗與B細胞上的CD20結合並用於治療對氟達拉濱(fludarabine)(Fludara)和阿侖單抗(alemtuzumab)(Campath)治療具抗性之成人的慢性淋巴性白血病(CLL；一種白血球癌症)。
mTOR抑制劑可與本揭示文之抗原結合蛋白共投予。mTOR抑制劑包括(但不限於)雷帕黴素(rapamycin)和雷帕黴素類似物(rapalog)，RAD001或依維莫司(everolimus)(Afinitor)、CCI-779或西羅莫司(temsirolimus)、AP23573、AZD8055、WYE-354、WYE-600、WYE-687和Pp121。
蓓薩羅丁(Bexarotene)為另一種可與本揭示文之抗原結合蛋白共投予之組成物。蓓薩羅丁係以TargretinTM販售並為類視色素子類之成員，其可選擇性活化類視色素X受體(RXR)。這些類視色素受體具有不同於視網酸受體(RAR)之生物活性。化學名稱為4-[1-(5,6,7,8-四氫-3,5,5,8,8-五甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸。蓓薩羅丁係用於治療其疾病無法成功地以至少一種其他醫藥治療者之皮膚T-細胞淋巴瘤(CTCL，一種皮膚癌)。
索拉非尼(Sorafenib)為另一種可與本揭示文之抗原結合蛋白共投予之組成物。索拉非尼市面售為NexavarTM且係為稱作多重激酶抑制劑之醫藥類。其化學名稱為4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]胺甲醯基胺基]苯甲氧基]-N-甲基-吡啶-2-甲醯胺。索拉非尼係用於治療晚期的腎細胞癌(一種始於腎臟之癌症)。索拉非尼亦用於治療無法切除的肝細胞癌(一種無法以手術治療之肝癌)。
本揭示文係提供治療癌症之方法。以所揭示的方法治療之癌症可選自：腦(膠質瘤)、膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、多型性神經膠質母細胞瘤、BZS症候群(Bannayan-Zonana syndrome)、考登病(Cowden disease)、小腦發育不良性神經節細胞瘤(Lhermitte-Duclos disease)、乳癌、發炎性乳癌、威爾姆氏腫瘤(Wilm's tumor)、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、橫紋肌肉瘤、室管膜瘤、骨髓母細胞瘤、大腸癌、頭頸癌、腎癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、***癌、肉瘤、骨肉瘤、骨巨細胞瘤、甲狀腺癌、淋巴母細胞T-細胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、髮細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性嗜中性細胞白血病、急性淋巴母細胞T-細胞白血病、漿細胞瘤、免疫母細胞大細胞白血病、被套細胞白血病、巨核母細胞白血病、多發性骨髓瘤、急性巨核母細胞白血病、前髓細胞性白血病、紅細胞白血病、惡性淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、淋巴母細胞T細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、神經母細胞瘤、膀胱癌、尿道上皮細胞癌、肺癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎癌、間皮癌、食道癌、唾腺癌、肝細胞癌、胃癌、鼻咽癌、頰癌、口腔癌、GIST(胃腸道基質腫瘤)及睪丸癌。
本揭示文方法中癌前症狀可為子宮頸上皮內贅瘤、意義未明之單株γ免疫球蛋白病(MGUS)、骨髓發育不良症候群、再生不良性貧血、子宮頸病變、皮膚痣(前黑色素瘤)、***上皮內(管內)瘤(PIN)、乳管原位癌(DCIS)、大腸息肉和嚴重的肝炎或肝硬化。
醫藥組成物可包括抗原結合蛋白與其他醫藥一起，視需要含使用說明之部件套組。就方便性而言，此套組可包括預先計量之試劑及使用說明。
術語「個體」、「對象」及「病患」於文中可交換使用。對象典型地亦可為哺乳動物，例如小鼠、大鼠或靈長類(例如絨猴或猴子)。此對象可為非人類之動物。抗原結合蛋白亦可具有獸醫用途。治療之對象可為農用動物，例如乳牛或公牛、綿羊、豬、牛、山羊或馬，或可為家養動物例如狗或貓。動物可為任何年齡或成熟的成年動物。當該對象為實驗室動物，例如小鼠、大鼠或靈長類時，此動物可經處理引發與乳癌、卵巢癌、***癌或膀胱癌有關的疾病或症狀。
治療可為治療性、預防性或防治性。此對象應為有此需要之對象。需要治療者可包括已患有特定醫學疾病之個體，以及在未來可能發生此疾病者。
因此，文中所述之抗原結合蛋白可用於預防或防治治療。在本案例中，係將文中所述之抗原結合蛋白投予一個體用以防止或延遲此疾病的一或多種態樣或徵候發生。此對象可能無症狀。此對象可能對此疾病具有遺傳傾向。將預防上有效量之抗原結合蛋白投予此一個體。預防上有效量為防止或延遲文中所述之疾病的態樣或徵候發生之量。
文中所述之抗原結合蛋白亦可用於治療的方法中。術語「治療」如文中所用，係涵蓋緩和、減少或防止至少一種疾病的態樣或徵候。例如，文中所述之抗原結合蛋白可用於改善或減少一或多項文中所述之疾病的態樣或徵候。
預防上有效量抗原結合蛋白係以有效量用於治療性、預防性或防治性治療。治療上有效量之文中所述的抗原結合蛋白為改善或減少一或多項疾病的態樣或徵候之有效量。文中所述之抗原結合蛋白亦可用於治療、防治或治癒文中所述之疾病。
文中所述之抗原結合蛋白一般可對此對象之健康具有有利的效應，例如其可增加此對象的壽命。
文中所述之抗原結合蛋白不需要完全治癒，或根除此疾病的每一種癥狀或表徵才被視為是可行的治療性治療。如相關領域所理解的，用作治療劑之藥物可減低疾病狀態之嚴重性，但並不需要消除每一種疾病的表徵才被視為是有效的治療劑。同樣地，預防性投予之治療不需要對預防疾病發生完全有效才視為是可行的預防性藥劑。僅減低疾病之影響(例如減低癥狀之數目或嚴重度，或增加另一種治療之效用，或產生另外的有利效應)，或減低疾病發生或惡化之可能性(例如延遲疾病發生)即為有效。
此病症、疾病或症狀包括乳癌、卵巢癌、***癌和膀胱癌。此疾病可能與高量的HER3有關。文中所述之抗原結合蛋白可用於調節HER3之量及/或HER3之活性。
診斷方法之用途
就診斷目的，文中所述之抗原結合蛋白可用於活體外或活體內偵測生物樣本中的HER3。例如，抗-HER3抗原結合蛋白，如鼠科或人源化15D5單株抗體，可用於培養細胞中，組織或血漿中偵測HER3。組織可先從人類或動物體中移除(例如活檢體)。可使用習用的免疫分析，包括ELISA、西方墨點、免疫組織化學或免疫沉澱。
藉由HER3之存在或量與疾病聯繫起來，熟習技術者可診斷此相關疾病。再者，在一對象中偵測到HER3量增加可能象徵病患人口對文中所述之抗原結合蛋白治療具反應性。偵測到HER3量、功能或訊號傳導能力減少，可能象徵以文中所述之抗原結合蛋白治療的對象中腫瘤減小之生物效應。
抗原結合蛋白可以診斷套組之形式提供，其係包括一或多個抗原結合蛋白、偵測標籤及套組使用說明。就方便性而言，此套組可包括預先計量的試劑與使用說明。
基因治療
編碼文中所述之抗原結合蛋白的核酸分子可投予有此需要之對象。核酸分子可於適當的支架或區、可變區或全長抗體中表現CDR。核酸分子可包含在得以表現於人類或動物細胞之載體中。核酸分子或載體可與醫藥上可接受賦形劑及/或一或多種如上述之治療活性劑一起調配用於給藥。
本揭示文另一方面為包括一重鏈序列和一輕鏈序列之抗原結合蛋白，其中該重鏈係具有SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列之20至466胺基酸殘基，而該輕鏈係具有SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列之20至238胺基酸殘基。
本揭示文亦提供包括岩藻糖基化多聚糖之如文中所述的抗原結合蛋白。
本揭示文亦提供文中所述之抗原結合蛋白，其中該岩藻糖基化多聚糖係由G0、G2、G0F、G2F、G1、Man5、G1F和G1F’組成之群中選出。
本揭示文亦提供包括非岩藻糖基化多聚糖之如文中所述的抗原結合蛋白。
本揭示文亦提供文中所述之抗原結合蛋白，其中該非岩藻糖基化多聚糖係由G0、G2、G1和Man5組成之群中選出：。
本揭示文另一方面為包括一重鏈序列和一輕鏈序列之抗原結合蛋白，其中該重鏈係具有SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列之20至466胺基酸殘基，而該輕鏈係具有SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列之20至238胺基酸殘基。
本揭示文另一方面為編碼SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列之20至466胺基酸殘基之單離的核酸。
本揭示文亦提供包括SEQ ID NO：101所示的核酸序列之單離的核酸。
本揭示文另一方面為編碼SEQ ID NO：104所示的胺基酸序列之20至238胺基酸殘基之單離的核酸。
本揭示文亦提供包括SEQ ID NO：105所示的核酸序列之單離的核酸。
本揭示文另一方面為編碼SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列之20至466胺基酸殘基之單離的核酸。
本揭示文亦提供包括SEQ ID NO：103所示的核酸序列之單離的核酸。
本揭示文亦提供文中所述之重組的宿主細胞，其中係存有一編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶之FUT8基因。
本揭示文亦提供文中所述之重組的宿主細胞，其中該宿主細胞為CHOK1細胞。術語CHOK1包括親代CHOK1細胞和衍生自此親代細胞株之任何細胞株(例如基因工程或選殖等)。
本揭示文亦提供文中所述之重組的宿主細胞，其中編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶之FUT8基因已去活化。
本揭示文亦提供製造抗原結合蛋白之方法，其包括下列步驟：a)培養包含一表現載體之重組的宿主細胞，而該載體係包括一編碼如文中所述之抗體重鏈之單離的核酸及包括一編碼如文中所述之抗體輕鏈之單離的核酸，其中編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶之FUT8基因在重組的細胞中為活化的；及b)回收此抗原結合蛋白；藉此產生抗原結合蛋白。
本揭示文亦提供製造抗原結合蛋白之方法，其包括下列步驟：a)培養包含一表現載體之重組的宿主細胞，而該載體係包括一編碼如文中所述之抗體重鏈之單離的核酸及包括一編碼如文中所述之抗體輕鏈之單離的核酸，其中編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶之FUT8基因在重組的細胞中已去活化；及b)回收此抗原結合蛋白；藉此產生抗原結合蛋白。
本揭示文亦提供文中所述之抗原結合蛋白，供用於治療由下列組成之群中選出之症狀：乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
 實例1
1.概要
以鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)、鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)、嵌合1D9抗體及嵌合15D5抗體進行結合全長的人類HER3胞外區(ECD)或其子區之BIACORETM分析。
2.前言
此實例之目的係測定鼠科1D9抗體、鼠科15D5抗體、嵌合1D9抗體和嵌合15D5抗體之親和力。
3.方法
3.1.實驗方法
於BIACORETM 2000儀器(SN#33-0901-2420 GE Healthcare)上進行分析，其係以系統檢查試驗並通過之後製備各新的晶片。所有的操作係於25℃使用HBS-EP(GE Healthcare BR-1006-69/5 mM HEPES,150 mM NaCl,3.4 mM EDTA,0.005% surfactant P20,pH 7.4)作為運作緩衝液來進行。小鼠單株抗體係使用藉由一級胺化學(經NHS/EDC活化)(GE Healthcare胺偶合套組BR-1000-50)與BIACORETM CM5晶片(GE HEalthcare BR-1000-14)共價偶合的兔抗-小鼠(RAM)IgG(GE Healthcare BR-1008-38)來分析。嵌合和人源化競爭者單株抗體係使用同樣偶合之抗人類Fc專一性單株(GE Healthcare BR-1008-39)來分析。各晶片亦以無偶合捕捉試劑抗體之參照表面所製備。將得到的不同分析物濃度運作循環之傳感圖用於動力分析。一個循環係由在表面上捕捉單株、一短期的流動緩衝液安定化，接著與定義濃度的分析物(ECD或子區蛋白)結合所組成。注射供表面結合之分析物(3-4分鐘)產生曲線連接部分。接著僅讓緩衝液流過(3-4分鐘)，以便記錄解離數據。然後完成此循環及注射捕捉套組供應的再生溶液(用於RAM之微酸性溶液和用於抗人類捕捉之3M MgCl2)移除捕捉抗體/分析物，但對於捕捉抗體進行另一次後續循環之單株抗體捕捉能力並無顯著影響。
親和力分析之通用方法係如下。首先，製備晶片及進行數種單株抗體濃度劑捕捉的共振單位試驗。然後進行動力循環，其中單株抗體捕捉量約為100RU，能結合分析蛋白然後解離及表面再生以移除所有的蛋白(但共價結合的蛋白除外)。以供應100mM甘胺酸pH1.7之捕捉套組和供應3M MgCl2捕捉套組之抗人類晶片使RAM晶片再生。此等一系列的循環係以6種不同的濃度的分析物蛋白來進行(通常256nM、128nM、64nM、32nM、16nM和8nM)。在分析物蛋白之前先進行數個緩衝液循環以確定循環的一致性且在某些實驗中緩衝液循環係使用「雙重對照[.]」。所用的分析物為人類全長HER3胞外區(ECD)、人類HER3胞外部份之分開的子區(D1、D2、D3、D4)或組合HER3區蛋白(D1-2和D2-3)。所有的人類HER3 ECD分析物係使用標準技術表現及製備。
動力實驗循環期間模擬偶合表面提供一參照值，從運轉的專一性抗體-分析物RU數據中減掉該值以消除緩衝液虛象。藉由從動力曲線組的各濃度之含分析物的循環數據減除僅緩衝液之循環，對某些操作進行雙重參照。將產生的曲線數據使用BIAEVALUATIONrM軟體(v.3.2)與1：1 Langmuir模型進行全擬合。
3.2.藥物和材料
此實例中所使用的部分列表：
鼠科1D9a抗體(4.77 mg/ml)
鼠科15D5抗體(4.23 mg/ml)
嵌合1D9抗體
嵌合體15D5抗體
所有的抗體係以磷酸緩衝食鹽水pH 7.0來調配及製備。
4.結果
產生各交互作用之傳感圖。這些係使用BIAEVALUATIONTM軟體用於評估動力學。其操作和動力學參數，包括所有的KD，係如下表5和表6所示。
表5.鼠科1D9抗體(m1D9)和嵌合1D9抗體(Ch1D9)之親和力
表6.鼠科15D5抗體(m15D5)和嵌合15D5抗體(Ch15D5)之親和力
5.討論
產生抗人類HER3胞外區之單株鼠科1D9抗體和鼠科15D5抗體。鼠科1D9抗體抗體係與全長人類HER3 ECD和人類HER3 ECD子區3結合。鼠科15D5抗體係與全長人類HER3 ECD、人類HER3和人類HER3 ECD子區2結合。
測定所有抗體與全長人類HER3 ECD和選擇的人類HER3 ECD子區交互作用的奈莫耳和次奈莫耳親和力。在鼠科1D9抗體和鼠科15D5抗體中可看到與具有較快的結合(ka)及解離速率(kd)之鼠科1D9抗體類似的總親和力。藉由免疫分析和競爭性免疫細胞化學，鼠科15D5抗體顯示與人類HER3 ECD之子區2、1-2和2-3結合，但不與子區1、3或4結合。就BIACORETM分析，這些HER3 ECD蛋白(亦即人類HER3 ECD之子區2、1-2和2-3)相對於全長的人類HER3 ECD(子區1-4)顯現增強的親和力。此效應在所有三個含子區2的人類HER3 ECD蛋白結構(D2、D1-2和D2-3)中皆可看到，且，不希望受限於理論，咸信此情況係因為在較小的子區蛋白之2區內有較大的抗原決定位可接近性。再者，不希望受限於理論，咸信結構考量可能是因鼠科15D5抗體對HER3受體之開放的構形具有較大的親和力。當受體介入調蛋白配體時，此開放的構形係顯示此狀況。嵌合15D5抗體和嵌合1D9抗體對親代鼠科1D9抗體和鼠科15D5抗體維持類似的親和力。
實例2
結合X-光晶體學分析與電腦模擬建模來預測鼠科1D9抗體及其變異體的結合介面。這些分析亦提供以鼠科1D9抗體所觀察的功能性中和作用深入的機轉及促進合理抗體成熟。包括鼠科1D9抗體衍生Fab結合人類HER3 ECD III區之複合物的高解析(3.0 )結構，己建構出。就其建構，人類HER3 ECD III區和鼠科1D9抗體係表現於CHO細胞並以親和層析和尺寸排阻層析純化。鼠科1D9抗體之Fab片段係使用標準方法以木瓜酵素裂解所產生。包括鼠科1D9抗體衍生Fab結合人類HER3 ECD III區之複合物係藉由混合1：1.2莫耳比的鼠科1D9抗體衍生Fab與人類HER3 ECD III區所產生。然後將此蛋白混合物濃縮並使用懸滴蒸氣擴散法結晶。X-光繞射數據係以先進光子源於阿岡國家實驗室所收集。繞射數據係使用HKL2000軟體(HKL Research,Inc.)索引及調整。於X-PLOR程式以分子重排測定結構。然後將所產生的最初分子重排溶液於CNS中進行多次的分子動力改良及以WINCOOT程式重建。然後產生包括鼠科1D9抗體衍生Fab結合人類HER3 ECD III區之複合物的原子配位檔案並分析此產生的結構。
由此分析測定人類HER3 ECD III區上之抗原決定位，其係包括SEQ ID NO：66之Ile346、Asn350、Gly351、Asp352、Pro353、Trp354、His355、Lys356、Ile357、Pro358和Ala359，該等抗原決定位可於包括SEQ ID NO：21之20至643胺基酸殘基的片段中發現。參見表7。相互作用殘基間的接觸細描述於表7和圖55中。
表7.人類HER3 ECD III區與鼠科1D9輕鏈可變區和鼠科1D9重鏈可變區間之胺基酸接觸
不希望受限於理論，咸信，基於此高解析晶體結構，鼠科1D9抗體Fab片段係專一地與人類HER3 ECD III區域結合並涵蓋部份與存在於HER3 ECD開放構形中之調蛋白結合區重疊之抗原決定位。不希望受限於理論，咸信，鼠科1D9抗體可與HER3 ECD結合，當其係以密閉的構形於空間位阻上使受體無法採取二聚化所需之延伸構形時。咸信，鼠科1D9抗體Fab，部分係藉由防止人類HER3 ECD之I區採取二聚化所需之構形來產生其效應。不希望受限於理論，進一步相信本處所述的結構效應造成鼠科1D9抗體及其變異體產生有效的抑制HER3活性。
實例3
鼠科15D5抗體與HER3 ECD開放構形結合之交互作用的電腦結構模型化係以Rosetta Dock軟體(RosettaCommons.org)來進行。第一階段之軟體所用的演算法係進行剛體蒙地卡羅搜尋以及使用殘基-等級交化作用勢，轉譯和將抗原沿著抗體表面轉。演算法給分係針對導向抗體CDR環之抗原。在低解析搜尋後，使用骨架依賴的旋轉異構體套裝演算法將明確的側鏈加到蛋白骨架。然後在小區域的接合構形空間以同時最適化側鏈構形和剛體位置，蒙地卡羅-正-最小化流程有效地取樣一組局部最小值。由不同的隨機起始向位重複搜尋步驟，創造105結構，然後將其使用凡得瓦爾力支配的能量函數(一種虛擬溶劑模型和向位依賴的氫鍵結勢)排列。保留通過分數門檻的前1000個誘餌。為了增進側鏈預測的解析度，將未結合的旋轉異構體構形包括在旋轉異構體庫中及於側鏈扭轉角使用梯度為基準的最小化。在此高解析搜尋終了時，使用階層式分群演算法，以成對的均方根偏差為基準群集200個最佳得分誘餌。將2.5 群集閥值以內的結構分成一組，而組內最低得分的誘餌則代表此群聚。
所產生的鼠科15D5抗體結合人類HER3 ECD之模型預測此抗體係與開放構形之HER3 ECD結合及在二聚化臂附近產生立體阻礙。不希望受限於理論，此顯示鼠科15D5抗體阻斷了HER3二聚化。
實例4
1.概要
使用分子生物技術產生及表現一系列鼠科1D9抗體和鼠科15D5抗體之人源化RR變異體。然後將這些抗體進行結合全長人類HER3胞外區(ECD)之BIACORETM分析。
2.前言
此實例之目的係測定鼠科1D9和15D5抗體之人源化變異體的親和力。
3.方法
3.1.實驗方法(s)
3.2.BIACORETM分析
使用BIACORETM測定利用標準分子生物技術所產生及表現的鼠科1D9抗體和鼠科15D5抗體之人源化RR變異體的結合親和力。人源化變異體有1D9 H6L2 RR抗體(包括SEQ ID NO：30及SEQ IDN O：57)、1D9 H0L7 RR抗體(包括SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：85)、1D9 H2L2 RR抗體(包括SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：57)、1D9 H6L6 RR抗體(包括SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：83)、1D9 H6L3 RR抗體(包括SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：77)、1D9 H3L6 RR抗體(包括SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：83)、1D9 H0L9 RR抗體(包括SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：87)、1D9 H2L6 RR抗體(包括SEQ ID NO：71及SEQ ID NO：83)、1D9 H6L4 RR抗體(包括SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：79)、1D9 H6L5 RR抗體(包括SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：81)、1D9 H6L0 RR抗體(包括SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：75)、1D9 H3L2 RR抗體(包括SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：57)、1D9 H6L9 RR抗體(包括SEQ ID NO：30及SEQ ID NO：87)、15D5 H1L3抗體(包括SEQ ID NO：90及SEQ ID NO：98)、15D5 H2L2抗體(包括SEQ ID NO：92及SEQ ID NO：96)、15D5 H1L1抗體(包括SEQ ID NO：90及SEQ ID NO：26)、15D5 H3L1抗體(包括SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：26)、15D5 H2L1抗體(包括SEQ ID NO：92及SEQ ID NO：26)及15D5 H3L3抗體(包括SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：98)。亦分析嵌合15D5抗體(ch15D5)。
使用BIACORETM 3000評估這些抗體之結合動力學。將抗體捕捉至CM5生物感測晶片上，將其使用供應偶合緩衝液(9000 RU)與固定化抗-人類IgG(Fc專一性)BIACORETM(GE Healthcare型號BR-1008-39)單株抗體接合。以30ul/min流速注射全長人類HER3 ECD濃度120秒。如實例1中所述再生生物感測晶片。使用BIACORETM評估軟體對1：1 Langmuir模型進行數據全擬合來測定動力學。分析操作係於25℃使用HBS-EP作為操作緩衝液來進行。
BIACORETM分析方法之基本步驟係概述如下：
1)固定化抗人類Fc抗體(9000-1000RU；25 ug/ml,使用乙酸鈉緩衝液,pH 5.0)；
2)捕捉相關抗體(400 ng/ml)；
3)將分析物與捕捉的結合(例如512 nM至16 nM之HER ECD)；
4)解離分析物(例如以緩衝液)；
5)BIAcore動力學運行循環步驟：緩衝液、512nM HER3 ECD、256nM HER3 ECD、128nM HER3 ECD、64 nM HER3 ECD、32 nM HER3 ECD及16nM HER3 ECD。如實例1中所述進行緩衝液循環及雙參照；及
6)以BIACORETM最適化緩衝液再生生物感測晶片。
4.結果及討論
下表8和表9係顯示所獲得的數據並顯示人源化1D9 RR抗體(H6L2)和人源化15D5抗體(H4L1)，相對於親代分子，似乎對所有產生的人源化抗體之全長人類HER3 ECD具有最佳親和力。
實例5
1.概要
使用分子生物技術產生及表現人源化1D9抗體、人源化1D9Fc缺損抗體、人源化1D9ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體。然後將這些抗體如下所示進行結合全長人類HER3胞外區(ECD)、全長大鼠HER3胞外區(ECD)及全長食蟹獼猴HER3胞外區(ECD)之BIACORETM分析。
2.前言
此實例之目的係測定人源化1D9抗體、人源化1D9 Fc缺損抗體、人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體之結合親和力。
3.方法
3.1.實驗方法
3.2.BIACORETM分析
BIACORETM分析係用來測定人源化1D9抗體、人源化1D9Fc缺損抗體、人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體之結合親和力。
將蛋白A以一級胺偶合固定在CM5晶片上，達~1300共振單位(RU)的量。然後將人源化抗體捕捉至此晶片上。所有的抗體皆捕捉達類似量(100-200 RU’s)。然後將全長人類HER3 ECD如下所示以50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM和1.5625nM通過此晶片。另外，全長大鼠HER3 ECD或全長食蟹獼猴ECD係以10nM、5nM、2.5nM、1.25nM、0.625nM和0.3125nM通過此晶片。如實例1所示，將只注射緩衝液者用於雙參照結合曲線。使用10 mM甘胺酸緩衝液pH 1.5進行此表面之再生。將結合數據使用BIACORETM評估軟體與1：1模型擬合。分析操作係於25℃以BIACORETM T3000使用HBS-EP作為操作緩衝液來進行。
4.結果和討論
下表10和表11係顯示所獲得之人源化1D9抗體、人源化1D9 Fc缺陷抗體、人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體與全長人類HER3胞外區(ECD)、全長大鼠HER3胞外區(ECD)和全長食蟹獼猴HER3胞外區(ECD)結合之數據，如下所示。
表10.人源化1D9抗體、人源化1D9 Fc缺損抗體、人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體之親和力。
表11.人源化1D9 H6L2 Fc缺損抗體對全長人類HER3 ECD、全長大鼠HER3 ECD和全長食蟹獼猴HER3 ECD之親和力
人源化1D9抗體、人源化1D9 Fc缺損抗體、人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體之性性描述證明專一性與全長人類HER3 ECD結合。基於交叉的物種同源性預測，大鼠HER3 ECD之III區和食蟹獼猴HER3 ECD之III區與結合人源化1D9抗體及其變異體之人類HER3 ECD抗原決定位III區具有約95%的同源性。此項顯示功能***叉反應之強烈可能性。與此相符的，觀察到人源化1D9 Fc缺損抗體與全長食蟹獼猴HER3 ECD和全長大鼠HER3 ECD，如BIACORETM分析所評估的，係以類似程度交叉反應。參見上表10和表11。
實例6
1.概要
此實例係驗證1D9抗體(例如鼠科1D9抗體及其人源化變異體)和15D5抗體(例如鼠科15D5抗體及其人源化變異體)抑制調蛋白引發的HER3磷酸化，降低下游AKT訊號傳遞，作為異源二聚化抑制劑用以防止活化的EGFR與HER3異源性二聚化，防止調蛋白引發EGFR-HER3，HER2-HER3以及HER4-HER3異源性二聚物形成及防止後續HER3磷酸化之能力。
2.前言
檢驗1D9抗體(例如鼠科1D9抗體及其人源化變異體)和15D5抗體(例如鼠科15D5抗體及其人源化變異體)抑制調蛋白引發的HER3磷酸化，降低下游AKT訊號傳遞，作為異源二聚化抑制劑用以防止活化的EGFR與HER3異源性二聚化，防止調蛋白引發EGFR-HER3，HER2-HER3以及HER4-HER3異源性二聚物形成及防止後續HER3磷酸化之能力。
3.方法
3.1.實驗製備物
用於這些研究之模型係符合英國內政部所規定之動物照護標準。
3.2.實驗方法
3.2.1於癌細胞株中以抗-HER3 mAb抑制調蛋白引發的HER3受體磷酸化
以胰蛋白酶收取約80%滿度之BxPC3、CHL-1、N87、SK-BR-3、BT-474或MCF-7細胞，置於10% FBS/培養基中清洗並以3-5 x105細胞/毫升懸浮於10% FBS/培養基。以100 ul/孔植入96孔組織培養處理的平底盤中，並於37℃、5% CO2大氣下培養至隔夜。隔天將培養基吸出及以無血清培養基取代，並以血清飢餓培養至隔夜。然後於無血清培養基中準備mAb儲液，並進行對數對半的連續稀釋。將10 ul的mAb儲液以雙重複加到96孔細胞盤(8個點的濃度曲線)並於37℃培養1小時。30或100 ng/ml的最後濃度後，其次加入10 ul的HRGβ1並培養15分鐘。將培養基吸出並於含磷酸酶和蛋白酶抑制劑之冷的解離緩衝液中將細胞解離，及於冰上震盪30分鐘。立即使用解離液或於-80℃冷凍並稍後於冰上解凍用於人類磷酸-ErbB3 ELISA(R&D Systems，型號DYC1769)。藉由製造商的方法進行ELISA。使用GRAPHPADTM PRISMTM軟體進行數據分析。
3.2.2於癌細胞株中以抗-HER3 mAb抑制調蛋白引發的Akt磷酸化
以胰蛋白酶收取約80%滿度之BxPC3、CHL-1、N87、SK-BR-3或BT-474細胞，置於10% FBS/培養基中清洗並以3-5 x105細胞/毫升懸浮於10% FBS/培養基。以100 ul/孔植入96孔組織培養處理的平底盤中，並於37℃、5% CO2大氣下培養至隔夜。隔天將培養基吸出及以無血清培養基取代，並以血清飢餓培養至隔夜。然後以無血清培養基準備mAb儲液，並進行對數對半的連續稀釋。將10 ul的mAb儲液以雙重複加到96孔細胞盤(8個點的濃度曲線)並於37℃培養1小時。30或100 ng/ml的最後濃度後，其次加入10 ul的HRGβ1並培養15分鐘。將培養基吸出並於含磷酸酶和蛋白酶抑制劑之冷的解離緩衝液中將細胞解離，及於冰上震盪30分鐘。立即使用解離液或於-80℃冷凍並稍後於冰上解凍用於人類/小鼠/大鼠磷酸-Akt(S473)泛專一性ELISA(R&D Systems型號DYC887B)。藉由製造商的方法進行ELISA。使用GRAPHPADTM PRISMTM軟體進行數據分析。
3.2.3於SK-BR-3乳癌細胞中以抗-HER3 mAb抑制表皮生長因子或β細胞素引發的HER3受體磷酸化
如本實例(上列)3.2.1部分所述，用於人類磷酸-ErbB3 ELISA R&D Systems型號DYC1769，但是係以表皮生長因子(EGF)或β細胞素為活化配體取代調蛋白，分析SK-BR-3細胞。
3.2.4於HER家族受體BACMAMTM轉導的CHO細胞中調蛋白引發異源二聚物形成和HER3受體磷酸化之抑制用
使用PerkinElmer ALPHALISATM分析技術，檢驗抗-HER3 mAb媒介的HER3受體磷酸化抑制作用(HER3受體磷酸化係由EGFR、HER2和HER4引起)來進行異源二聚化分析。根據PerkinElmer方法製備試劑。簡言之，將磷酸-酪胺酸專一性小鼠mAb(P-Tyr-100 CellSignaling Technology，型號9411，僅含PBS配方)與ALPHALISATM受體微珠(PerkinElmer，型號6772002)接合。使用10：1偶合重量比率將1毫克的受體微珠與100 ug的抗體接合48小時。將市售的抗-人類HER3抗體(R&D Systems MAB3481)使用30：1莫耳比之生物素與抗體，每100 ug的抗體利用7.6 ul的2 mg/ml CHROMALINKTM Biotin 354(Sulfo NHS,SoluLinK型號B-1007-105)進行生物素化。然後藉由以EGFR+HER3、HER2+HER3和HER4+HER3之專一性BACMAMTM配對轉導的中國倉鼠卵巢細胞，以3x105細胞/毫升於96孔盤中評估抗-HER3 mAb至隔夜。隔天加入抗-HER3 mAb並於37℃培養1小時。然後加入調蛋白-β1至100 ng/ml的最終濃度並將微孔盤培養30分鐘。然後將培養基吸出並將細胞置於含磷酸酶和蛋白酶抑制劑之冷的解離緩衝液中溶離。將解離液置於冰上震盪30分鐘並立即使用或於-80℃冷凍及稍後於冰上解凍，進行ALPHALISATM分析。然後將2.5ul的解離液加到384孔盤中之10 ul的2.5 nM生物素化抗-人類ErbB3抗體中(R&D Systems MAB3481)，並於室溫培養1小時。然後加入5 ul/孔的50 ug/ml磷酸-酪胺酸專一性小鼠mAb(P-Tyr-100 Cell Signaling Technology型號9411)並於黑暗中震盪培養1小時。然後加入12.5 ul/孔的80 ug/ml塗覆鏈黴親和素的供體微珠之製備物(PerkinElmer型號6760002)並另再培養30分鐘。將微孔盤置於ENVISIONTM 2103多標記盤式判讀儀中判讀並使用GRAPHPADTM PRISMTM進行數據分析。
3.3.藥物和材料
人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體(12.68 mg/ml)
人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體(7.45 mg/ml)
人源化1D9抗體(1.88 mg/ml)
人源化1D9 Fc缺損抗體(3.713 mg/ml)
鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5；4.77 mg/ml)
鼠科15D5抗體(3.19 mg/ml)
鼠科IgG1同型對照抗體(R&D Systems 500 ug/ml型號MAB002)
鼠科IgG2b同型對照(R&D Systems 500 ug/ml型號MAB004)
人類抗-瘧疾mAb(人類同型對照；5.74 mg/ml)
調蛋白-β1(HRGβ1；1.88 mg/ml)
3.4.數據分析
所有此實例所顯示之數據係代表最少二個實驗之平均值。抗體值除以正對照調蛋白處理的細胞值並乘以100，計算出「調蛋白對照磷酸HER3之%」或「調蛋白對照磷酸AKT[.]之%」。使用表皮生長因子或β細胞素正對照處理的細胞值與表皮生長因子或β細胞素處理的SK-BR-3細胞相比較。將個別實驗之數據平均，並使用GRAPHPADTM PRISMTM分析軟體計算IC50值。
4.結果
4.2.1於癌細胞中以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的HER3受體磷酸化
在BxPC3(圖1)、CHL-1(圖2)、N87(圖3)、SK-BR-3(圖4)、BT-474(圖5)和MCF-7(圖6)癌細胞中，抗-HER3 1D9和15D5抗體抑制了調蛋白引發的HER3受體磷酸化。如表12所示，所有的1D9抗體結構，包括人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體和人源化ACCRETAMABTM抗體，以範圍從2.5至40.6 ng/ml之IC50值顯現強力的抑制作用。
表12.以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的HER3受體磷酸化
4.2.2於癌細胞中以抗-HER3 mAb抑制調蛋白引發的Akt磷酸化
在BxPC3(圖7)、CHL-1(圖8)、N87(圖9)和SK-BR-3(圖10)癌細胞中，抗-HER3 1D9抗體和15D5抗體降低了調蛋白引發的AKT磷酸化。在BxPC3細胞中可看見最強力的AKT磷酸化之抑制作用，其中人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體以2.6 ng/ml之IC50值抑制了調蛋白引發的磷酸-Akt形成(表13)。
表13.於BxPC3乳癌細胞中以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的Akt磷酸化
4.2.3於SK-BR-3乳癌細胞中以抗-HER3 mAb抑制表皮生長因子和β細胞素引發的HER3受體磷酸化
於SK-BR-3乳癌細胞中抗-HER3 1D9抗體和15D5抗體抑制了表皮生長因子和β細胞素引發的HER3磷酸化。1D9鼠科構成物以約3 ng/ml之IC50值，抑制配體引發的HER3受體磷酸化，無論是否使用活化的配體(表14).
表14).於SK-BR-3乳癌細胞中以抗-HER3抗體抑制表皮生長因子(EGF)、β細胞素(BTC)和調蛋白引發的HER3受體磷酸化
4.2.4 EGFR、HER2或HER4與HER3 BACMAMTM轉導的CHO細胞之組合物中抑制調蛋白引發的異源二聚物形成和HER3受體磷酸化
如所示，在以人類HER3受體和EGFR、HER2或HER4受體共轉導的CHO細胞中，抗-HER3 1D9抗體和15D5抗體抑制了調蛋白引發的HER3磷酸化。這些抗體能抑制調蛋白引發的EGFR-HER3、HER2-HER3或HER4-HER3異源二聚物形成。IC50值係列於表15中。
表15.抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類HER3受體磷酸化
5.討論
HER3受體酪胺酸激酶屬於人類表皮生長因子受體家族，其亦包括EGFR(HER1)、HER2和HER4。HER3與調蛋白配體結合，但本質上無激酶活性。其必須與其他家族成員二聚化，才得以在其胞內C端區進行酪胺酸殘基轉磷酸。因活化、磷酸化HER3受體所導致的後續下游訊號傳遞包括PI3K/AKT存活路徑。
此實驗之數據驗證了抗-HER3 1D9抗體和15D5抗體可抑制調蛋白引發的HER3受體磷酸化。在以調蛋白刺激前，以1D9抗體處理癌細胞株，對調蛋白引發的HER3磷酸化產生了完全的抑制作用。圖16係顯示於不同的癌細胞株，不同的1D9抗體其抑制HER3磷酸化之IC50值。以1D9抗體和15D5抗體處理，亦降低了下游AKT磷酸化。因此，1D9抗體和15D5抗體抑制了調蛋白引發的HER3磷酸化並降低了下游Akt訊號傳遞。
表皮生長因子和β細胞素為之EGFR配體，並可引發EGFR-HER3異源二聚體形成。當以這些配體處理時，SK-BR-3乳癌細胞顯現引發了HER3磷酸化。以1D9抗體或15D5抗體處理SK-BR-3細胞抑制了表皮生長因子或β細胞素引發的HER3磷酸化(圖11和圖12)。其顯示這些抗體係作為異源二聚化抑制劑並可防止活化的EGFR與HER3二聚化。
1D9抗體和15D5抗體專一性抑制了EGFR-HER3，或HER2-HER3，或HER4-HER3調蛋白引發的異源二聚物形成。將CHO細胞以HER3及另一個能因形成異源二聚物轉磷酸化HER3之其他家族成員轉導。無論是否有使用EGFR或HER2，或HER4作為二聚化夥伴，1D9抗體和15D5抗體皆抑制了調蛋白引發的HER3磷酸化(圖13、圖14和圖15)。其顯示1D9抗體和15D5抗體防止調蛋白引發之與其他家族成員的異源二聚體形成並防止HER3磷酸化。
實例7
1.概要
以數個活體外分析定出抗-人類HER3抗體性質。這些包括此等mAb與全長HER3 ECD和專一HER3區結合之分析、此等mAb與腫瘤細胞結合之分析、增生分析、侵入分析、內部化分析及此等mAb之跨物種(鼠科和食蟹獼猴)專一性分析。對鼠科1D9抗體、人源化1D9抗體、人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體和人源化ACCRETAMABTM抗體進行評估。結過顯示抗-人類HER3 1D9抗體之鼠科和人源化結構物辨識出全長人類HER3 ECD並與HER3 ECD 3區專一性結合。此等mAb以劑量依賴的方式抑制調蛋白引發的腫瘤細胞增生。此等mAb亦抑制調蛋白引發的腫瘤細胞入侵。1D9抗體引發HER3受體內部化至腫瘤細胞中。此等mAb亦與鼠科HER3交叉反應。
2.前言
此實例係概述活體外進行的抗-人類HER3抗體之定性。其包括鼠科1D9抗體、人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體和人源化ACCRETAMABTM抗體之數據。詳細描述下列分析之結果：全長人類HER3 ECD和區域結合、腫瘤細胞之結合、增生、入侵、內部化和交叉專一性(鼠科)。
3.方法
3.1 HER3全長ECD和區域結合分析
目的：這些分析之目的係確認人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體和人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體與全長HER3胞外區結合。這些分析之另一目的係確認mAb亦與HER3的III區專一性結合。
使用解離增強鑭系元素螢光免疫分析(DELFIA)偵測抗-HER3抗體與HER3胞外區(ECD)之結合。DELFIA過程係如下：以100ul/孔、塗覆溶於0.1M碳酸緩衝液pH 9.5之1 ug/ml HER-3 ECD全長或HER3 I、II、III及IV區的白色Maxisorp 96-孔盤(Nunc #437796)，於4℃放至隔夜。將這些微孔盤以酪蛋白之TBS溶液(Thermo Scientific #37532 lot#JD121074)阻斷。將純的融合瘤上清液，或以Perkin Elmer #4002-0010分析緩衝液稀釋至0.01 ug/ml(或100 ug/ml)之純化的抗-HER3抗體，或經最少三次稀釋的PK血清樣本(100 ul/孔)加到此盤中。將這些樣本於室溫培養2小時，同時震盪培養盤或於4℃放至隔夜。使用100 ul/孔的抗-小鼠Eu抗體(PE DELFIA #AD-0124 lot 326-949-A,以1：1000=50ng/ml使用)或Eu-標定的抗-人類IgG 2nd抗體(Wallac #1244-330 50ug/ml,對純化的抗體係使用1：4,000稀釋，或對PK試驗為1：2,000)並於室溫培養1小時。將此盤置於BIOTEKTM洗盤機上以tris-緩衝液加上0.05% tween-20(Perkin Elmer #4010-0010)清洗4次，接著進行各抗體培養步驟。於室溫下加入100 ul/孔的DELFIA增強溶液(Perkin Elmer 1244-105)計5分鐘。然後將此盤置於VICTORTM 1420盤式判讀機上使用銪時差性螢光儀(TRF)法判讀。以每孔銪數記錄抗體結合。
結果：圖17係顯示鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)與全長HER3 ECD及與HER3 III區之專一性結合。圖18係顯示鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)與全長HER3 ECD及HER3 II區之專一性結合。圖19係顯示人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體與全長HER3 ECD及HER3 III區之專一性結合。圖20係顯示人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體與全長HER3 ECD及HER3 III區之專一性結合。圖21係顯示人源化1D9抗體與全長HER3 ECD及與HER3 III區之專一性結合。參見圖17、圖18、圖19、圖20及圖21。
結論：鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)與全長HER3 ECD及HER3 III區專一性結合。鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)與全長HER3 ECD及HER3 II區專一性結合。人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體與全長HER3 ECD及HER3 III區專一性結合。人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體與全長HER3 ECD及HER3 III區專一性結合。人源化1D9抗體與全長HER3 ECD及HER3 III區專一性結合。參見圖17、圖18、圖19、圖20和圖21。
3.2在流式細胞儀分析中抗-人類HER3抗體與人類癌細胞株結合
目的：測定抗-人類HER3抗體對人類癌細胞株(已知為HER3陽性細胞株)之結合性質。
試劑：
FACS緩衝液：PBS、0.2% BSA、0.1%疊氮鈉
抗體：鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)
人源化1D9抗體
人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體
人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體
PE山羊抗-小鼠IgG(H+L)-Caltag Laboratories(M30004-4)
山羊抗-人類IgGALEXAFLUOR647TM-Invitrogen(A21445)
細胞株：CHL1、BxPC3
方法：將5x106個先前經HER3受體篩選過的細胞株，加到流式細胞儀試管中。將欲試驗的各抗體之劑量反應濃度加到適當的試管中。將細胞及抗體於冰上培養30分鐘。以1毫升的染色緩衝液清洗一次及然後將適當的二級抗體加倒適當的試管中。將細胞再次於冰上黑暗中培養30分鐘及然後清洗並懸浮於FACS緩衝液中。以FACSCANTOTM流式細胞儀分析細胞。
數據分析：使用BD Biosciences開發的FACSDIVATM軟體進行分析。使用前散射和側散射調控細胞群族並產生螢光強度之長條圖。
結果：抗體與各細胞株之分布圖，因由同型對照抗體分布圖位移到右方，顯示人源化抗-HER3 mAb之專一性結合。鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)與MCF7人類乳癌細胞及BxPC3人類胰臟腫瘤細胞所表現的人類HER3結合。參見圖22。人源化1D9抗體、人源化1D9ACCRETAMABTM抗體及人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體皆與表現在CHL-1人類黑色素瘤細胞和BxPC3人類胰臟腫瘤細胞之人類HER3結合。參見圖23。
結論：鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)抗體辨識出MCF7人類乳癌細胞及BxPC3人類胰臟腫瘤細胞所表現的人類HER3。參見圖22。人源化1D9抗體、人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體皆辨識出表現在CHL-1(黑色素瘤)和BxPC3(胰臟)人類癌細胞株之人類HER3。參見圖23。
3.3以M5.1D9抑制調蛋白引起的細胞增生抑制調蛋白引起的腫瘤細胞增生
目的：於MCF7或BxPC3細胞株中測定任何抗-人類HER3抗體是否可抑制調蛋白-1β引發的細胞增生
試劑：
完全培養基：RPMI,10% FBS,glutamine
細胞株：MCF7
BxPC3-ATCC
抗體：鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)
鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)
鼠科24H5抗體(M5.24H5.C2)
人源化1D9抗體
人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體
人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體
Cell Titer 96非放射性細胞增生分析(MTT)-Promega G4000.
方法：分別將1x103或1x104細胞/孔的MCF7或BxPC3細胞株加到平底96-孔盤各孔槽之含10%血清的完全培養基中並於37℃培養至隔夜。移除培養基並以無血清RPMI置換。將欲篩選的10μl抗體以四重複加到適合的孔槽中。將抗體和細胞於37℃培養一小時。將30 ng/ml的調蛋白-1β加到各孔中。就人源化抗體實驗而言，對用於p-HER3和pAkt分析之條件可比較性係使用100 ng/ml調蛋白。將微孔盤於37℃培養72小時。使用Promega之MTT套組測定增生作用並將微孔盤置於ENVISIONTM 2103多標記判讀儀上分析並以EXCELTM軟體分析數據。將數據以調蛋白引發之生長百分比對抗體濃度作圖。
結果：MCF7細胞回應調蛋白-1β引發良好的增生作用(約40%)。然而，BxPC3細胞之反應則有限(約10%)。鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)和鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)二者皆抑制調蛋白-1β引起的MCF7細胞增生。鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)和鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)實際上抑制BxPC3增生在單獨細胞之程度以下。人源化1D9ACCRETAMABTM抗體在BxPC3細胞中顯現與鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)類似的抑制效用。參見圖24、圖25和圖26。
結論：鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)和鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)其抑制MCF7和BxPC3細胞增生之能力相當。參見圖24和圖25。人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體抑制BxPC3腫瘤細胞增生。參見圖26。
3.4抑制腫瘤入侵
目的：此研究之目的係測定在調細胞刺激後，任何抗-人類HER3抗體是否可抑制腫瘤細胞入侵。
方法：將先前經HER家族表現定性過之人類腫瘤細胞株用於入侵分析。BXPC3細胞顯示表現HER-2及較小程度HER3。HER3抗體對BXPC3細胞入侵之效用係使用Trevigen CULTREXTM細胞入侵分析(型號3455-096-K)來測定。簡言之，讓BXPC3細胞生長至60%滿度，以血清飢餓至隔夜，然後以VERSENETM螯合劑(EDTA)和胰蛋白酶從培養瓶移出。以阻封緩衝液(RPMI+2% BSA)清洗細胞，使用台盼藍(trypan blue)染劑排除來測定生存力，並將細胞以1百萬細胞/毫升懸浮於不含FBS或BSA之RPMI培養基中供分析之用。將抗體和細胞於37℃培養1小時，之後加到侵入盤之上方孔槽。下方孔槽含有RPMI培養基+10%非熱滅活性FBS。然而，讓一列下方孔槽接受無FBS之RPMI以找出隨機遷移之原因。將遷移的細胞以calcein-am標定並將下方格室置於VICTORTM IV盤式判讀機上判讀。螢光(RFU)代表遷移細胞之量。將各抗體的RFU除以同型對照抗體的RFU並乘以100得到「入侵%」值。
結果：所有的鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)、嵌合1D9抗體和嵌合15D5抗體皆展現40%之抑制BXPC3細胞入侵。鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)係以30%抑制細胞入侵。鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)係以20%抑制細胞入侵。參見圖27。
結論：鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)、嵌合1D9抗體和嵌合15D5抗體抑制腫瘤細胞入侵。參見圖27。
3.5鼠科1D9抗體抗體與人類腫瘤細胞結合造成HER3受體內部化
目的：測定抗-人類HER3抗體是否會因結合而造成HER3受體內部化
試劑：
染色緩衝液：PBS、0.2% BSA、0.1%疊氮鈉
抗體：IgG1對照組-R&D Systems MAB002
IgG2b對照組-R&D Systems MAB004
鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)-(3.19 mg/ml)
Hz10-(9.82 mg/ml)
人源化1D9抗體-(1.88 mg/ml)
二級抗體：
PE山羊抗-小鼠IgG(H+L)-Caltag Laboratories M30004-4
山羊抗-人類IgG ALEXAFLUOR647TM-Invitrogen A21445
方法：將100 μl的5x106細胞/毫升加到含抗-HER3抗體之流式細胞儀的試管中。各抗體皆以雙重複添加。將各抗體之一支試管置於冰上培養，而其他的試管則於37℃培養。2小時後，以1毫升的染色緩衝液清洗細胞並以PE-標定的山羊抗-小鼠二級抗體複染30分鐘。另外以1毫升的染色緩衝液清洗後，將細胞置於FACSCANTOTM細胞儀上分析。使用BD Biosciences開發的FACSDIVATM軟體進行數據分析。使用前散射和側散射調控細胞群族並產生螢光強度之長條圖。
結果：鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)和人源化1D9抗體經篩選可內部化CHL-1細胞上的HER3受體。於37℃培養後，無偵測到抗體，其顯示此受體不在細胞表面。參見圖28。
結論：鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)和人源化1D9抗體因與HER3受體結合而造成該受體內部化。參見圖28。
3.6鼠科1D9抗體與鼠科腫瘤細胞上之鼠科HER3交叉反應
目的：測定抗-人類HER3抗體是否會與鼠科HER3陽性細胞株交叉反應
試劑：
FACS緩衝液：PBS,0.2% BSA,0.1% sodium azide
抗體：EGFR-Bioscience 44783M
HER2-Bioscience AHO1011
HER3-Upstate 05-471
鼠科15D5抗體
鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)
鼠科24H5抗體(M5.24H5.C2)
細胞株：B16
B16F10
ZENONTM標定套組：
小鼠IgG1 PE-Invitrogen Z25021
小鼠IgG1 APC-Invitrogen Z25051
小鼠IgG2b APC-Invitrogen Z25151
方法：提供市售抗-人類EGFR和HER2抗體。提供由供應商提出辨識人類HER3之市售HER3抗體。亦提供鼠科15D5抗體、鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)、鼠科24H5抗體(M5.24H5.C2)抗體。將這些抗體以PE或APC使用ZENONTM標定套組(Invitrogen)標定。將5x106個B16或B16F10鼠科黑色素瘤細胞加到含標定的抗-HER3抗體之流式細胞儀試管中。將細胞和抗體於冰上黑暗中培養30分鐘，以FACS緩衝液清洗及再懸浮。然後將細胞置於FACSCANTOTM流式細胞儀上分析。使用BD Biosciences開發的FACSDIVATM軟體進行數據分析。使用前散射和側散射調控細胞群族並產生螢光強度之長條圖。
結果：市售的EGFR、HER2和HER3抗體無法辨識出這些鼠科細胞表面上的受體(數據未顯示)。鼠科15D5抗體、鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)和鼠科24H5抗體(M5.24H5.C2)皆辨識出B16和B16F10細胞表面上的HER3。參見圖29。
結論：鼠科15D5抗體、鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)及鼠科24H5抗體(M5.24H5.C2)與鼠科HER3交叉反應。參見圖29。
實例8
1.概要
人類癌症之小鼠模型被廣泛的運用在臨床前設置用以驗證新抗癌藥於活體內之活性。在本研究中，係以小鼠同基因肺定植模型及數個人類異種移植模型評估小鼠抗-HER3單株抗體(mAb)以建立活性和區分可用於人類臨床試驗做為進一步開發之領導候選藥物優先順序。
以i.v.注射給予C57BL/6小鼠單一B16F10黑色素瘤以評估有或無抗-HER3 mAb處理之肺定植作用。於B16F10注射後第三天以i.p.給予50 mg/kg的鼠科1D9抗體及於第7和11天以i.p.給予25 mg/kg；在研究終了，亦即B16F10注射後第20天造成肺重量顯著下降(p<0.001)。鼠科15D5抗體亦抑制腫瘤細胞定植於肺中(p<0.05)，然而較低的劑量療法25和5 mg/kg,i.p.，相較於50/25 mg/kg的劑量療法，具有較高的活性。隨後將小鼠1D9和15D5以異體移植模型評估抗人類腫瘤之活性。
小鼠抗-HER3 mAb延緩了CB-17 SCID小鼠中植入之晚期HER3+人類異種移物的生長。每星期二次以0.5至100 mg/kg,i.p.之鼠科1D9抗體或鼠科15D5抗體治療，使得CHL-1黑色素腫瘤在生長劑量依賴上及統計上顯著減小(p<0.001，於5 mg/kg)。在皮下植後，於CB-17 SCID小鼠中觀察到類似的抗BxPC3胰臟癌腫瘤生長之活性(p<0.001，於5mg/kg)。
在CHL-1黑色素瘤異種移植模型中，5至50 mg/kg給劑範圍之1D9抗體和15D5抗體維持顯著及劑量依賴的抗腫瘤活性(p<0.001)。再者，5、25和50 mg/kg劑量的人源化1D9 RR抗體和人源化1D9 RR ACCRETAMABTM抗體具有顯著和同等的效力(p<0.001)。
在皮下和原位BxPC3異種移植模型中，50 mg/kg的嵌合1D9抗體或人源化15D5抗體對腫瘤生長造成顯著的抑制直到研究終了(p<0.001)，而50 mg/kg的人源化1D9 RR抗體對皮TBxPC3模型之腫瘤生長則顯示顯著但過渡性效應(p<0.001)。生長抑制之效期的差異可能是因為研究-對-研究之變異(亦即植入的BxPC3片段之特性)，不過，驗證了基因工程的mAb之抗腫瘤生長功效。
最後，人源化1D9 RR抗體、人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體於NCI-N87胃模型中之評估顯示增強mAb抗CHL-1黑色素瘤異種移植之活性。
2.前言
在本研究中，係評估鼠科親代或人源化HER3單株抗體對於晚期HER3+人類異種移植物，亦即CHL-1黑色素瘤、BxPC3胰臟腫瘤和NCI-N87胃腫瘤之抗腫瘤活性。使用小鼠B16F10黑色素瘤細胞之同基因肺定植模型係包括在初步評估中，用以評估鼠科親代抗-HER3 mAb之活性。
3.方法
3.1.實驗製備物
用於這些研究之模型係符合英國內政部所規定之動物照護標準。
以重量約15-20克之6-8週大的雌性CB-17 SCID小鼠(Taconic,Indiana,IN)進行人類異種移植腫瘤模型研究。研究開始時小鼠約10-12週大。同基因肺定植模型係以重量約15-20克之6-8週大的C57B1雌性小鼠來進行。
小鼠(B16F10)和人類(BxPC3、NCI N87及CHL-1)腫瘤細胞株係由細胞庫得來。
3.2.實驗方法
3.2.1.小鼠B16F10黑色素瘤同基因模型
以i.v.注射2x105 B16F10細胞至C57BL/6雌性小鼠。在腫瘤注射後的第3天i.p.給予50或25 mg/kg的小鼠抗-HER3抗體或同型對照組，及隨後於第7和11天i.p.給予25或5 mg/kg。於注射後第3天i.v.給予GEMZARTM(NDC 0002-7502-01；吉西他濱)。在第20天殺死動物並取出肺測量濕重。
3.2.2.人類CHL-1黑色素瘤異種移植模型
將於MATRIGELTM中之CHL-1細胞(5x105至5×106)皮下注射(s.c.)至CB-17 SCID小鼠的側腹。一旦異種移植腫瘤達到80-120 mm3之平均體積，將小鼠隨機分入治療組(每組n=6隻小鼠)並給予抗-HER3 mAb或同型對照組。每星期二次以i.p.給予0.5至100 mg/kg之劑量。以媒劑治療小鼠作為腫瘤生長之對照組。
每星期以手動游標尺測量腫瘤寬度(W)和長度並使用下列公式計算腫瘤體積(V)：V=1/2(LxW2)。當同型對照組的平均腫瘤體積超過1000 mm3時，終止研究。
3.2.3.人類BxPC3胰臟異種移植模型：皮下及原位植入
將BxPC3細胞(5×106/小鼠)以s.c.注射至作為供體之CB-17 SCID小鼠。當腫瘤體積達到800-1000 mm3時，將帶有BxPC3腫瘤之供體小鼠殺死；然後收取腫瘤並分成3 mm3的腫瘤片段。將新鮮收取的BxPC3腫瘤以s.c.植入受體小鼠之側腹。在原位模型中，片段係以手術植入受體小鼠的胰臟。
一旦受體小鼠之異種移植腫瘤達到80-120 mm3之平均體積時，將小鼠隨機分入治療組(每組h=6隻小鼠)並以抗-HER3 mAb或同型對照組治療。每星期二次以i.p.(皮下植入模型)或i.v.(原位植入模型)給予0.5至100 mg/kg之劑量。以媒劑治療小鼠作為腫瘤生長之對照組。
如上述每星期以手動游標尺測量腫瘤體積。在原位模型中，以超音波測量腫瘤並使用VISUAL SONICS VEVOTM 770攝影分析系統測定體積。
3.2.4.人類NCI-N87胃異種移植模型
以每隻動物~1x106個細胞將NCI-N87細胞植入供體小鼠之右側腹。從供體小鼠中收集腫瘤片段並以s.c.植入10-12週受體小鼠的側腹。當異種移植腫瘤之平均體積達到50-80 mm3時或在片段移植後的第29天，開始以小鼠抗HER3 mAb治療。當異種移植腫瘤之平均體積達到80-100 mm3時或在移植後的第15天，開始以基因工程的抗HER3 mAb治療。
如上述以手動游標尺測量腫瘤體積。
3.3.藥物和材料
用於本項研究之抗-HER3抗體和同型對照組系列於下表中。亦包括文中所含的縮寫命名法。所有用於給劑的抗體係以pH 7.0的磷酸緩衝食鹽水調配和製備。
3.4.數據分析
測定對照組及治療組的平均值及平均值之標準差。對數據作圖並以Bonferroni事後檢定法使用2-因子ANOVA分析人類異種移植模型，或以Dunnett’s事後檢定使用1-因子Anova分析小鼠同基因模型(GRAPHPADTM PRISMTM軟體,v.5)。
4.結果
4.1.活體中小鼠抗-HER3 mAb之效力
以小鼠同基因模型及數個人類異種移植模型評估鼠科1D9抗體和鼠科15D5抗體，以驗證抗腫瘤生長之效力。
4.1.1.小鼠B16F10黑色素同基因模型
以抗-HER3鼠科1D9抗體治療降低了B16F10腫瘤於C57BL/6小鼠肺中之定植。相較於同型的對照組，50/25 mg/kg組之肺重顯著下降(p<0.01)(圖30)。相較於同型的對照組，在25/5 mg/kg組中以鼠科15D5抗體治療亦顯示降低肺之腫瘤定植(p<0.05；圖31)。
4.1.2.人類CHL-1黑色素瘤異種移植模型
相較於其個別同型的對照組，每星期二次以i.p.投予劑量範圍從5至100 mg/kg之抗-HER3鼠科1D9抗體或鼠科15D5抗體的CB-17 SCID小鼠，其人類CHL-1腫瘤生長具有劑量依賴和統計上顯著下降(p<0.001)(圖32和圖33)。
4.1.3.人類BxPC3胰臟異種移植
相較於同型的對照組，每星期二次以i.p.投予0.5至50 mg/kg劑量之鼠科1D9抗體或鼠科15D5抗體的CB-17 SCID小鼠，其BxPC3腫瘤生長具有顯著下降(p<0.001，以5 mg/kg)(圖36)。同樣地，相較於同型的對照組，以鼠科15D5抗體治療之5至50 mg/kg組造成BxPC3腫瘤生長下降(p<0.001)(圖35)。
4.1.4.人類NCI-N87胃異種移植模型
相較於媒劑對照組，每星期二次以i.p.投予75至100 mg/kg劑量之鼠科1D9抗體的CB-17 SCID小鼠，對腫瘤體積具有顯著性下降(p<0.001)(圖36)。鼠科15D5抗體對NCI-N87腫瘤生長之效應與媒劑和同型對照組比較，係如圖37所示。
4.2.活體中嵌合和人源化抗-HER3 mAb之效力
產生人源化15D5抗體、嵌合1D9抗體和人源化1D9 RR抗體並評估。以人源化1D9 RR抗體之活性為基礎，於各種活體外和活體內模型中進一步運用基因工程增進IgG1 mAb(人源化1D9 RR ACCRETAMABTM抗體)之抗體依賴的細胞毒殺作用(ADCC)及補體依賴的細胞毒殺作用(CDC)特性或僅CDC(人源化1D9 RR POTELLIGENTTM抗體)特性。下列為人類異種移植模型中各種抗體活性之概述。
4.2.1.人類CHL-1異種移植模型
相較於同型的對照組，每星期二次以i.p.投予從5至50 mg/kg之嵌合1D9抗體的CB-17 SCID小鼠，對人類CHL-1腫瘤生長具有劑量依賴性下降。在植入後第24天，25和50 mg/kg組為統計上顯著性下降(p<0.05)，及植入後第27天，所有的組皆觀察到顯著下降(p<0.001)(圖38)。在人源化15D5抗體治療組中亦觀察到同樣的發現(圖39)。
於CHL-1異種移植模型中，以5至50 mg/kg劑量評估人源化H1D9 RR抗體、人源化H1D9 RR ACCRETAMABTM抗體和人源化H1D9 RR POTELLIGENTTM抗體。人源化H1D9 RR抗體、人源化H1D9 RR ACCRETAMABTM抗體和人源化H1D9 RR POTELLIGENTTM抗體具有類似的活性特質。自植入後第29天開始觀察到所有的劑量腫瘤生長皆係顯著下降直到第34天研究終了(p<0.001)(圖40、圖41和圖42)。
4.2.2.人類BxPC3異種移植模型(皮下和原位移植)
皮下植入BxPC3後，每星期二次以i.p.投予0.5至50 mg/kg ch1D9之CB-17 SCID小鼠，其在第33天開始，50 mg/kg組(p<0.001)及5和0.5 mg/kg組(p<0.01)之腫瘤生長具有統計上顯著性、劑量依賴性下降。在50 mg/kg組的腫瘤體積持續顯著減小直到第36天(p<0.001)(圖43)。以0.5至50 mg/kg的h15D5治療，於移植後第33天和36天在50 mg/kg組中造成腫瘤生長延遲(p<0.01)(圖44)。在每星期二次以0.5至50 mg/kg之人源化1D9 RR抗體治療後，觀察到的BxPC3腫瘤生長下降之特性係如(圖45)所示。
以BxPC3手術原位移植模型評估嵌合1D9抗體和人源化15D5抗體，而相較於皮下移植，BxPC3手術原位移植模型被視為更具臨床結果之預測性。相較於同型的對照組，每星期二次以50 mg/kg嵌合1D9抗體或人源化15D5抗體之i.v.路徑治療從植入後第5星期至第7星期造成腫瘤生長顯著延遲(p<0.01)(圖46)。
4.2.3.人類NCI-N87胃異種移植模型
以人類NCI-N87胃模型評估人源化H1D9 RR抗體、人源化H1D9 RR ACCRETAMABTM抗體和人源化H1D9 RR POTELLIGENTTM抗體之抗腫瘤活性。每星期二次以50 mg/kg i.p.投予CB-17 SCID小鼠。投予50 mg/kg人源化H1D9 RR ACCRETAMABTM抗體於植入後第44天達到統計上顯著性之腫瘤體積下降(p<0.05)(圖47)。
5.討論
人類癌症之小鼠模型被廣泛的運用在臨床前設置用以驗證新抗癌藥於活體內之活性。在本研究中，係以小鼠同基因肺定植模型及數個人類異種移植模型評估小鼠抗-HER3單株抗體(mAb)以建立活性和區分可用於人類臨床試驗做為進一步開發之領導候選藥物的優先順序。
小鼠抗-HER3 mAb造成C57BL/6小鼠肺中B16F10腫瘤細胞定植化顯著降低。鼠科1D9抗體之有效劑量療法為50/25 mg/kg,i.p.，25/5 mg/kg,i.p.，而相較於較高劑量者，以鼠科15D5抗體治療則具有較大功效。隨後以異種移植模型評估小鼠抗-HER3 mAb，用以評估抗人類腫瘤之活性。
小鼠抗-HER3 mAb延遲了晚期HER3+人類異種移植之已建立腫瘤的生長。在CHL-1黑色素瘤細胞移植後，每星期二次以>5 mg/kg劑量之鼠科1D9抗體或鼠科15D5抗體治療，造成腫瘤生長在劑量依賴上和統計上顯著性下降。在皮下BxPC3胰臟異種移植模型中觀察到類似的活性。
在CHL-1黑色素異種移植模型中，1D9抗體和15D5抗體於5 mg/kg時維持劑量依賴的抗腫瘤活性。再者，以5 mg/kg之人源化1D9 RR抗體或人源化1D9 RR ACCRETAMABTM抗體治療，相較於25mg/kg之劑量，造成腫瘤生長延遲。
在皮下及原位BxPC3異種移植模型中，50 mg/kg的嵌合1D9抗體或人源化15D5抗體造成腫瘤生長顯著抑制，直到研究終了，而20 mg/kg的人源化1D9 RR抗體在皮下BxPC3模型中則對腫瘤生長顯示顯著的效用。抗體抗腫瘤生長之效力得到了驗證。
最後，以NCI-N87胃模型評估人源化1D9 RR抗體、人源化1D9 RR ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 RR POTELLIGENTTM抗體，相較於在CHL-1黑色素異種移植模型，其顯示某些mAb之活性增加了。
6.結論
以鼠科親代及/或人源化HER3單株抗體治療，每星期二次給予從0.5至100 mg/kg濃度範圍之劑量，能延緩在CHL-1黑色素和BxPC3胰臟人類異種移植模型中已建立的HER3+人類腫瘤之生長。
實例9
1.概要
使用抗體依賴的細胞媒介細胞毒殺作用(ADCC)分析及補體媒介的細胞毒殺作用(CDC)分析來評估野生型抗-HER3抗體以及這些抗體之進化型的功能性。
這些實例係描述用於評估抗體之野生型和進化型功能之活體外分析。這些分析係使用不同的HER3表現「目標」細胞，評估此抗體與其目標結合之能力，及然後加入補體或「效應子」細胞，評估抗體之功能Fc區。
2.前言
這些實例顯示抗-HER3「進化型抗體」之功能性/效力增加優於非進化「野生型」抗體。
3.方法
3.1.實驗方法
3.2.實驗方法
3.2.1抗體依賴的細胞媒介細胞毒殺作用
以這些ADCC分析找出純化的人類週邊血液單核細胞作為效應細胞之性質。簡言之，將以肝素鈉收集的人類全血使用密度梯度離心試管(UNI-SEPMAXTM來自Accurate Surgical and Scientific公司)純化。然後清洗這些純化的人類週邊血液單核細胞並再懸浮於無酚紅+10% FBS(1x107細胞/毫升，T：E比例為1：50)之RMPI 1640中。然後將HER3受體陽性細胞(HER3 BACMAMTM轉導的HEK293 MSRII或CHL-1細胞)載入銪用作為目標細胞。轉導的細胞係作為高HER3-表現細胞株，而CHL-1細胞係作為低表現細胞株。將這些載入的目標細胞再懸浮於無酚紅+10% FBS之RMPI 1640至8 x105細胞/毫升。
將數種抗-HER3抗體(25 ul/孔)裝載入96-孔圓底盤中。然後將載入銪之目標細胞(25 ul/孔)加到含抗體的微孔盤中並於37℃及5% CO2培養30分鐘。在培養30分鐘後，將100 ul/孔的效應細胞加到微孔盤中並放回培養器中另再培養2小時。從實驗的微孔盤移出25 ul/孔的上清液並將其轉置於含100 ul/孔DELFIATM增強溶液之96-孔maxisorp盤中，進行專一細胞解離之測量。於室溫培養5分鐘後，然後將此盤於Wallac VICTORTM V盤式判讀儀上使用時差性螢光判讀。以螢光單位測量從解離的目標細胞釋放至周圍上清液中的任何銪(細胞毒性)。將此等值轉換為專一性解離百分比並使用GRAPHPADTM PRISMTM軟體以解離百分比對抗體濃度作圖。用於計算專一性細胞毒性之方程式為：
%細胞毒性=(試驗釋放)-(自發性釋放) x 100
(最大釋放)-(自發性釋放)
對照孔槽：將1%去污劑TRITON XTM溶液加到「最大釋放」的孔槽，引發細胞死亡及隨後釋放出銪。某些額外的對照組孔槽含有無效應細胞之目標細胞以便測量「自發性」銪的’釋放。
轉導：將適合的BACMAMTM病毒(人類HER3、食蟹獼猴HER3或大鼠HER3)以100 moi(相當8-15%病毒(v/v))加到HEK293 MSRII細胞計24小時。然後使用TrypLE將轉導細胞從組織培養瓶中移出，清洗數次並載入銪，之後用作為ADCC分析之目標細胞。
猴子全血：將密度梯度分離緩衝液(FICOLLTM)以無Ca2和Mg2之PBS稀釋10%(v/v)之後對猴子週邊血液淋巴細胞(效應細胞)進行密度梯度離心。
人類血液係依照既定政策用於這些研究。猴子血液係於既定的協議下取得。用於這些研究之模型係符合美國的動物照護標準。
3.2.2　補體依賴的細胞毒性
這些實驗係以hHER3 BACMAMTM轉導的HEK 293 MSR II細胞作為目標來進行。簡言之，於T175培養瓶中，在37℃和5% CO2下轉導這些細胞(moi 100)計~21小時。然後使用TrypLE將黏附的細胞從培養瓶中移出並清洗數次，之後以1x105細胞/50ul/孔植入96-孔盤中。立即加入25 ul/孔的抗-人類HER3 mAb並於37℃和5% CO2培養30分鐘。培養後，於實驗盤中加入20 ul/孔的CALBIOCHEMTM兔補體(最終20%)並於37℃和5% CO2另再培養2小時。藉由於各孔槽加入100ul的CELLTITER-GLOTM，以多道移液器緩慢混合，進行細胞存活力之評估。然後將此盤置於Wallac VICTORTM V盤式判讀儀上讀取發光訊號(存活的細胞會使訊號增加)。
3.3.藥物和材料
人類HER3 BACMAMTM
猴子(食蟹獼猴)HER3 BACMAMTM
FICOLLTM GE Healthcare #17-1440-02
TRITON X-100TM Sigma #T9284
分離試管Accurate Surgical & Scientific #UN-10
銪Fluka #207128
96-孔圓底盤Costar #3799)
96-孔平底盤Thermo Scientific #436110
人源化1D9 Fc缺損抗體
人源化1D9抗體
人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體
人源化1D9 1D9 POTELLIGENTTM抗體
補體CALBIOCHEMTM #234400
CELLTITER GLOTM Promega #G7571
DELFIATM增強溶液#4001-0010
3.4.數據分析
使用GRAPHPADTM PRISMTM軟體以專一性解離對抗體濃度作圖用於計算EC50值。
4.結果
4.1 ADCC分析
由人類PBL ADCC分析所得到的人源化1D9抗體(在某些情況下辨識為HZ1D9或H6L2)、人源化1D9 Fc缺損抗體、人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體及人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體之評估結果係如圖48和圖49所示。這些結果係使用HER3 BACMAMTM轉導的HEK293細胞作為目標細胞及以人類週邊血液淋巴細胞作為效應細胞所得來(圖48)。此實驗設定為使用CHL-1細胞作為目標細胞群與相同人類PBL效應細胞同時進行(圖49)。這些結果清楚地顯示，相較於野生型(非進化型)抗體，進化型抗體的效力增加及最大解離增加。
由食蟹獼猴PBL(週邊血液淋巴細胞)ADCC分析所得到的人源化1D9抗體(在某些情況下辨識為HZ1D9或H6L2)、人源化1D9Fc缺損抗體、人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體和人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體之評估結果係如圖50至圖53所示。這些結果係使用HER3 BACMAMTM轉導的HEK293細胞作為目標細胞及以食蟹獼猴週邊血液淋巴細胞作為效應細胞所得來(圖50和圖51)。此實驗設定為使用CHL-1細胞作為目標細胞群與相同食蟹獼猴PBL效應細胞同時進行(圖52和圖53)。這些結果清楚地顯示，相較於野生型(非進化型)抗體，進化型抗體效力增加及最大解離增加。
4.2 CDC分析
圖54所示之結果係使用人類HER3轉導的HEK293目標細胞及兔補體由CDC分析所得來。此結果顯示人源化1D9抗體(在某些情況下辨識為HZ1D9或H6L2)及人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體各自得到類似的補體媒介目標細胞解離。然而，人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體顯示在補體媒介的解離上有優於或超過在此等其他抗體中所見到的至少10-倍改善。人源化1D9 Fc缺損抗體並無顯現任何可測量的補體媒介解離。
5.討論
本處所示之結果係驗證「Fc進化型」之人源化1D9抗體(例如人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體)於抗體-依賴細胞介導的細胞毒性分析以及補體依賴的細胞毒性分析中顯示改善的功能。此項於高(ADCC和CDC)和低(ADCC)人類HER3-表現細胞株中以及食蟹獼猴HER3表現細胞(ADCC)中得到驗證。
人類效應細胞數據與人類群族中所見的有關，因為並無選擇標準可用於確認ADCC/CDC反應性。雖然在個別的人類供體存有差異性(高與低專一性解離)，但是「Fc-進化型」抗體一貫地顯示比親代野生型抗體更高的效力。食蟹獼猴效應細胞數據使吾等可從用於總毒性研究之實際的猴類中找出效應細胞之性質。
總言之，人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體和人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體顯現改善的ADCC和ADCC/CDC功能性(分別)。
實例10
1.概要
鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)為一種與人類HER3受體胞外區II區結合之抗鼠科-HER3抗體。此抗體已顯示，經由免疫組織化學能與冷凍和甲醛固定石蠟包埋(FFPE)的人類癌症組織充分結合。
2.前言
驗證鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)其作為評估HER3表現之搭配診斷的可能用途。此搭配診斷可用來幫助辨識臨床上可從抗-HER3單株抗體治療得利之病患。此搭配的mAb可以通過其腫瘤組織的HER3表現量及/或其HER3受體表現的強度為基準，用於分類腫瘤。
此實例將概述某些用於協助驗證鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)專一性之重要實驗。本實例之實驗將檢驗鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)對HER3和其他HER家族成員(例如HER1、HER2和HER4)之免疫反應性和專一性。此實例描述了冷凍和甲醛固定石蠟包埋組織上免疫組織化學；四個HER家族成員(例如HER1、HER2、HER3和HER4)之免疫細胞化學、免疫沉澱；確認專一性之競爭分析及細胞解離液之西方墨點和純化的HER3胞外區之結果。
3.方法
3.1.實驗方法
3.2.實驗方法
3.2.1.Her家族之西方墨點法
於37℃和5% CO2，以100倍感染量(moi)之HER1、HER2、HER3或HER4 BACMAMTM轉染HEK 293 MSRII細胞計22小時。使用維爾烯(versene)收取各細胞株及然後使用台盼藍排除染色進行細胞計數。以10毫升的PBS清洗細胞懸浮液後，收集3x107個細胞並置入1毫升的RIPA裂解溶液(儲存RIPA裂解溶液：10ml 1x RIPA裂解緩衝液+1錠mini halt蛋白酶抑制劑)。然後將此製備物旋轉2分鐘，離心並將上清液(細胞解離液)儲存於4℃。
然後將細胞解離液與LDS樣本緩衝液和還原劑組合，及然後加熱至70℃歷時10分鐘。冷卻至室溫後，將解離液放入QIASHREDDERTM並以14,000 rpm旋轉2分鐘。然後將解離液載入4-12%梯度的Bis-Tris凝膠道上並以電泳使蛋白分離。然後將分離的蛋白轉置於硝基纖維素及然後以含0.1% Tween-20之阻斷溶液培養至隔夜。於室溫下加入針對HER1、HER2、HER3或HER4家族成員之初級抗體歷時5小時。並接著以IR-接合的二級抗體培養1小時。然後使用LI-CORTM ODYSSEYTM影像分析儀讓墨點顯現出。
3.2.2,使用鼠科15D5抗體之免疫沉澱法
將200μl從上述3x107細胞/毫升之懸浮液所製備的解離液與10 ug克的鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)組合並於旋轉裝置上以4℃培養至隔夜。然後將抗原-抗體複合物與50μl的固定化蛋白質A/G樹脂(100μl樹脂漿液)組合並在室溫下於旋轉裝置緩和混合2小時。於4℃以5,000 rpm(~1,000xg)離心5分鐘收取免疫沉澱物。然後將團塊以1毫升的RIPA緩衝液清洗四次。將清洗過的團塊以20 ul的1X LDS荷載緩衝液(100 ul的RIPA緩衝液、33 ul的LDS樣本緩衝液(4X)、13.3 ul的還原劑(10X))再懸浮，並將樣本以100℃沸騰5分鐘。在冰上冷卻樣本後，將其以5,000 rpm(~1,000 xg)離心1分鐘。然後將這些樣本載入凝膠(0.4 ug/道之HER3抗原、10ul/道之HER家族BACMAMTM轉導的HEK293 MSRII解離液及20 ul/道之CHL-1細胞解離液)並以200 V進行約50分鐘。待凝膠分離蛋白轉至硝基纖維素後，將產生的墨點以市售的抗-HER3初級mAb(R&D System MAB3482)培養，接著以IR-接合山羊抗小鼠二級抗體培養。然後使用LI-CORTM ODYSSEYTM影像分析儀讓墨點顯現出。
3.2.3.Her家族之免疫細胞化學
於37℃和5% CO2，以100 moi之Her3 BACMAMTM轉導HEK293 MSRII細胞歷時24小時。然後使用TrypLE收取細胞，並使用PBS計數及清洗。然後製備0.5x106細胞/毫升之PBS懸浮液並將100 ul的懸浮液加到連接顯微鏡載玻片之cytospin漏斗。將其以500 rpm旋轉5分鐘，產生含50,000個細胞之細胞點。將載玻片置於生物實驗箱中乾燥至隔夜並於隔天以室溫丙酮固定2分鐘。乾燥2小時後，以保鮮膜包覆載玻片並儲存於-20℃直到可用於免疫染色。
從-20℃冷凍庫移出六片載玻片，使其回到室溫並風乾。一旦乾燥後，將各細胞點以Pap筆標示，形成可供染色之疏水屏障。然後將載玻片置入TBST(Tris緩衝食鹽水+0.05% TWEEN-20TM)進行水合10分鐘並加至蛋白阻斷溶液中30分鐘。將1 ug/ml的鼠科15D5抗體-作為初級抗體-於室溫直接施予此等載玻片2小時。以TBST清洗載玻片三次並於室溫直接塗覆在HRP-接合抗-小鼠二級抗體上2小時。使用TBST清洗載玻片三次每次5分鐘，及然後加入DAB基質2分鐘。然後以水沖洗載玻片三次每次5分鐘，並置入蘇木素(hematoxylin)中2分鐘。然後以水沖洗載玻片三次每次5分鐘，讓載玻片完全乾燥及然後蓋上蓋玻片進行觀察。
3.2.4.使用HER3胞外II區之競爭分析
於37℃和5% CO2，以100 moi之Her3 BACMAMTM轉導HEK293 MSRII細胞歷時24小時。此培養時間後，使用TrypLE收取細胞，並進行細胞計數及使用PBS清洗細胞。將細胞以0.5x106細胞/毫升懸浮於PBS中並取100ul加到連接顯微鏡載玻片之cytospin漏斗。將其以500 rpm旋轉5分鐘，產生含50,000個細胞之細胞點。將載玻片置於生物實驗箱中乾燥至隔夜並於隔天以室溫丙酮固定2分鐘。乾燥2小時後，以SARANTM保鮮膜包覆載玻片並儲存於-20℃直到可用於免疫染色。
從-20℃冷凍庫移出二片載玻片並使其回溫到室溫及風乾。一旦乾燥後，將細胞點以Pap筆圈出，形成可供染色之疏水屏障。然後將載玻片置入TBST(Tris緩衝食鹽水+0.05% TWEEN-20TM)進行水合10分鐘並加至蛋白阻斷溶液中30分鐘。將1 ug/ml的初級抗體或1:1莫耳比之初級抗體和人類HER3 II區於室溫直接塗覆在此等載玻片上2小時。以TBST清洗載玻片三次並於室溫直接施予HRP-接合抗-小鼠二級抗體1小時。使用TBST清洗載玻片三次每次5分鐘，及然後加入DAB基質5分鐘。然後以水沖洗載玻片三次每次5分鐘，讓載玻片完全乾燥及然後蓋上蓋玻片進行觀察。
3.2.5.HER3胞外區之西方墨點
將HER3之四個胞外區與LDS(十二烷基硫酸鋰)樣本緩衝液和還原劑組合，並加熱至70℃計10分鐘。冷卻至室溫後，將解離液載入4-12%梯度Bis-Tris凝膠道並以電泳讓蛋白質分離。將分離的蛋白轉移到硝基纖維素，產生墨點並將墨點以含0.1% TWEEN-20TM之阻斷溶液培養至隔夜。然後將墨點以稀釋的鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)於室溫培養2小時。接著以IR-接合二級抗體將墨點培養1小時。然後使用LI-CORTM ODYSSEYTM影像分析儀讓墨點顯現出。
3.2.6.冷凍和FFPE組織之免疫組織化學
將人類乳癌組織(16943a1d、16945a1o、22687a1p、23110a1k)以來自相同切片腫瘤之冷凍和甲醛固定石蠟包埋(FFPE)樣本保存。
將保存的人類乳癌組織切開用於HER3受體表顯之免疫組織化學(IHC)評估。簡言之，將FFPE組織切開6 um，藉由通過連續的二甲苯替代劑和酒精步驟，使用VARISTAINTM Gemini ES自動染片機脫蠟及再水化。使用DECLOAKING CHAMBERTM，應用數個抗原回收(抗原決定位修復)法以便可對不同情況作比較。在以Tris-0.05% TWEEN-20TM緩衝液清洗之步驟後，將組織以過氧化酶阻斷培養5分鐘，及然後以蛋白阻斷溶液阻斷。將初級抗體塗覆於切片30-60分鐘。清洗步驟後，塗覆二級抗體30-60分鐘。另外的清洗步驟後，以DAB(二胺基聯苯胺)培養5分鐘，顯現專一性免疫反應。然後以水沖洗組織切片並以蘇木素複染一分鐘。使用Dako自動染色機系統進行單株抗體染色。
將冷凍組織切6微米置入顯微鏡載玻片上並於室溫下乾燥2小時。然後於室溫將載玻片上的組織切片以丙酮固定二分鐘並使其乾燥。以Tris-0.05% TWEEN-20TM緩衝液清洗後，將組織與過氧化酶阻斷(peroxidase block)培養5分鐘，及接受一蛋白阻斷溶液。接續的染色係如上文FFPE組織中所概述。
3.2.7.多腫瘤TMA之免疫組織化學評估
使用標準的手動或自動染色法將載玻片染色。將腫瘤切片並脫蠟。將切片與內生性過氧化酶和非專一性抗體結合阻斷溶液一起培養，進行抗原決定位修復，及然後以初級抗體培養。在培養間進行清洗步驟。進行非專一性結合之標準阻斷步驟。進行標準的抗原修復技術。就手動染色結合係使用二級生物化抗體連結ABCTM HRP套組(Vector Laboratories,Inc.)，或ENVISIONTM HRP接合聚合物套組(Dako North America,Inc.)及二胺基聯苯胺基質反應產品，依照製造商說明使其顯像。就自動染色之顯像係使用OMNIMAPTM HRP聚合物化學(Ventana Medical Systems,Inc.)來進行。若需要，使用標準的蘇木素或甲基綠核複染技術將切片複染色
3.3.藥物和材料
HER1 BACMAMTM病毒體
人類HER2 BACMAMTM病毒體
人類HER3 BACMAMTM病毒體
人類HER4 BACMAMTM病毒體
LDS樣本緩衝液(Invitrogen NP0007)
QIASHREDDERTM(Qiagen 79656)
MINI-HALTTM蛋白酶抑制劑(Roche diagnostics 13535400)
Western阻斷緩衝液(Rockland MB-070)
硝基纖維素膜(Invitrogen LC2000)
兔抗-人類ErbB2(人類HER2)(Dako A0485)
小鼠抗-人類EGFR(人類HER1)Dako M3563 Clone H11
山羊抗-小鼠IR-DYE800TM抗體(Rockland 610-131-121)
山羊抗-兔IR-DYE680TM抗體(Li-Cor Odyssey 827-88367)
抗-人類HER3單株抗體(R&D System MAB3482)
Tris-緩衝食鹽水(Dako #S1968)
ENVISIONTM System-HRP DAB套組(Dako #K4007)
鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)(3.19 mg/ml)
人類HER3 II區(用於競爭)(1.66 mg/ml)
蛋白阻斷溶液(Dako X0909 lot 10037797)
THERMO SHANDON EZ DOUBLE CYTOFUNNELTM(#A78710005)
VWR SUPERFROST PLUSTM #48311-703
TRYPLETM Select(Gibco 12563-011)
RIPA緩衝液(Sigma R0278)
多腫瘤人類組織微陣列(TMA) Hu80357(CAMB12-GSK-TMA-Origene)
4.結果
4.1.1.
表現四個HER家族成員之細胞解離液的西方墨點顯示，鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)以極少至沒有與人類HER1、人類HER2和人類HER4交叉反應，選擇性辨識人類HER3。為了確認HER2和HER1表現及作比較，亦以這些解離液對結合HER2(Dako)和HER1(Dako)之市售抗體進行試驗。結果確定人類HER2和人類HER1係經由HEK293細胞所進行的轉導作用來表現。此結果亦顯示與抗-HER2抗體(Dako)之某些交叉反應。
4.1.2.
使用人類HER3轉導的HEK293細胞和CHL-1細胞之免疫沉澱實驗，提供檢驗高和低HER3-表現細胞株之機會。使用鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)或市售-HER3抗體(R&D Systems)以免疫沉澱偵測人類HER3，這些實驗顯示類似的免疫反應之結合模式
4.1.3.
使用鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)之人類HER1、人類HER2、人類HER3和人類HER4BACMAMTM轉導細胞的免疫細胞化學分析顯示對人類HER3強烈的免疫反應性，而與其他的HER家族成員則具極少或無免疫反應性。鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)優先與人類HER3結合。
4.1.4.
使用鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)或鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)與等莫耳濃度的人類HER3 II區ECD組合之競爭分析顯示，鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)免疫反應性藉由與人類HER3 II區預培養而被完全阻斷。這些結果確定鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)與人類HER3受體之胞外區II區專一性結合。
4.1.5.
HER3胞外區之西方墨點分析驗證了鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)對人類HER3 II區之專一性及此抗體對人類HER3 I區、III區和IV區缺乏免疫反應力。
4.1.6.
冷凍和FFPE乳癌組織之免疫組織化學染色(n=4)顯示一致的染色模式。雖然FFPE組織之結構完整性保存比冷凍樣本好，但是此二種保存法之膜染色模式類似。圖6顯示於這些冷凍和固定的***組織中所見之膜染色代表圖。
4.1.7.
以含有腫瘤和代表性正常組織之多腫瘤陣列(Hu80357)，使用鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)評估HER3表現。所有指出大腸、***、***、子宮內膜、腦和皮膚腫瘤中心之定性分析皆顯現人類HER3表現。一腎腫瘤樣本和一肺癌樣本顯現人類HER3表現。在黑色素瘤和***瘤樣本中可看到大多數人類HER3強力的表現。7個黑色素瘤和7個***腫瘤樣本驗證強力的人類HER3表現。8個乳癌樣本亦顯現人類HER3表現。相對於腫瘤樣本，正常的組織樣本則出現相當少的訊號，然而有3個正常的大腸樣本和1個正常的***樣本顯現中度的訊號。
5.討論和總結
本報告所描述的實驗證明了鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)之敏感性和專一性。如文中所述，鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)最初係由一組融合瘤，就其對HER3胞外區之專一性以初步的ELISA篩選為基準所選出。對HER3另外的專一性係以西方墨點和免疫細胞化學使用BACMAMTM轉導的細胞來進行。在這些實驗中，人類HER3轉導的細胞顯現專一的免疫反應性，而表現其他人類HER家族成員之細胞則顯示極小至無的反應性。鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)亦與對HER3專一性「下拉(pull-down)」之市售抗體組合，用於免疫沉澱分析。此外，免疫細胞化學係於人類HER3轉導細胞之cytospin製備物以及這些細胞的冷凍製備物上進行，透過分析確認鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)辨識HER3並可於免疫細胞化學分析中與HER3結合。鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)與人類HER3受體之結合可藉由將抗體與人類HER3 II區預培養來阻斷，確認其對HER3該區之專一性。
另外的免疫組織化學法係開發用於經甲醛固定並以石蠟處理之類似的桿狀病毒轉染細胞上的鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)，進一步驗證鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)經由IHC偵測HER3之能力，與細胞製備物無關。此實例所描述的實驗，藉由在配對的乳腺癌之冷凍和FFPE樣本中證明人類HER3免疫反應性，嚴格地確認鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)行為之跨平台一致性。以鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)所偵測的人類HER3訊號之豐富度和相對表現在二種標本製備物中為相同的。於不同腫瘤類型組上利用鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)之免疫組織化學目標驗證研究顯示不同的表現，然而HER3之模式和相對豐度在特定的腫瘤類型(例如黑色素瘤、***、***)中展現一致性。此外，鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)已成功地以不同的方法和染色系統偵測HER3。此等發現證明，藉由腫瘤切片中之免疫組織化學，鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)可一貫地及準確地偵測人類HER3，與方法和標本保存無關。
鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)在各種分析中亦專一地偵測出HER3胞外區。在此實例中亦描述鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)在這些分析中，儘管有變異，仍一致地作用。特言之，鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)就經由免疫組織化學偵測組織切片中之人類HER3，展現高度的專一性和敏感性。此外，鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)在相同的樣本中利用不同的分析能偵測同等程度的人類HER3(鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)訊號和出現的人類HER3量間成正比)。整體上，本實例所述的結果驗證了鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)之表現、專一性和一致性並支持其作為人類HER3診斷分析(例如IHC分析)中抗體試劑之適性。
實例11
非正式序列表
下列加底線處係識別抗體中可變重鏈和可變輕鏈部分之CDR序列，或編碼這些CDR序列之核酸序列。例如在SEQ ID NO：1中，架構和CDRS係從所示序列之最接近胺基的部分至羧基端部分依序以純文字架構1，加底線CDR1，加底線CDR2，純文字架構3，加底線CDR3及純文字架構4來表示。下列斜體字係識別訊號序列。代表單一字母胺基酸碼之文字右方的星號係指該胺基酸殘基左方為一可能的N-糖基化位置。此配置係適用於，例如SEQ ID NO：5、9、13、17、22、26、30、34、38-43、44、48、57等。亦提供有關各種文中所揭示的抗體詳情之表格。參見下表17。
M5_15D5_2A1_1H10_VH
SEQ ID NO：1
M5_15D5_2A1_1H10_CDRH1
SEQ ID NO：2
DYNMN
M5_15D5_2A1_1H10_CDRH2
SEQ ID NO：3
GINPNYGTTVYNOKFKG
M5_15D5_2A1_1H10_CDRH3
SEQ ID NO：4
MTTIVPFDY
M5_15D5_2A1_1H10_VL
SEQ ID NO：5
M5_15D5_2A1_1H10_CDRL1
SEQ ID NO：6
RASODISNYLN
M5_15D5_2A1_1H10_CDRL2
SEQ ID NO：7
YTSTLHS
M5_15D5_2A1_1H10_CDRL3
SEQ ID NO：8
QQGYTLPWT
M5_22A5_1G6_1C10_VH
SEQ ID NO：9
M5_22A5_1G6_1C10_CDRH1
SEQ ID NO：10
DYGMH
M5_22A5_1G6_1C10_CDRH2
SEQ ID NO：11
YITSGSSEIYYVDTVKG
M5_22A5_1G6_1C10_CDRH3
SEQ ID NO：12
GYGYREGYFDV
M5_22A5_1G6_1C10_VL_LC1
SEQ ID NO：13
M5_22A5_1G6_1C10_CDRL1_LC1
SEQ ID NO：14
KSSOSLLDSDGKTYLN
M5_22A5_1G6_1C10_CDRL2_LC1
SEQ ID NO：15
LVSKLDS
M5_22A5_1G6_1C10_CDRL3_LC1
SEQ ID NO：16
WQGTHFPQT
>M5_22A5_1G6_1C10_VL_LC2
SEQ ID NO：17
M5_22A5_1G6_1C10_CDRL1_LC2
SEQ ID NO：18
RTSENVYSNLA
M5_22A5_1G6_1C10_CDRL2_LC2
SEQ ID NO：19
GATRLPD
M5_22A5_1G6_1C10_CDRL3_LC2
SEQ ID NO：20
OLFWGIPLT
人類HER3胺基酸序列
SEQ ID NO：21
人源化_15D5_VH胺基酸序列
人源化15D5 H4
SEQ ID NO：22
人源化_15D5_CDRH1胺基酸序列
SEQ ID NO：23
DYNMN
人源化_15D5_CDRH2胺基酸sequence
SEQ ID NO：24
GINPNYGTTVYNOKFKG
人源化_15D5_CDRH3胺基酸序列
SEQ ID NO：25
MTTIVPFDY
人源化_15D5_VL胺基酸序列
人源化15D5L1
SEQ ID NO：26
人源化_15D5_CDRL1胺基酸序列
SEQ ID NO：27
RASODISNYLN
人源化_15D5_CDRL2胺基酸序列
SEQ ID NO：28
YTSTLHS
人源化_15D5_CDRL3胺基酸序列
SEQ ID NO：29
QQGYTLPWT
人源化_1D9_VH胺基酸序列
SEQ ID NO：30
人源化1D9 H6
人源化_1D9_CDRH1胺基酸序列
SEQ ID NO：31
SYWMH
人源化_1D9_CDRH2胺基酸序列
SEQ ID NO：32
VIDPSDGYSHYNOKFKG
人源化_1D9_CDRH3胺基酸sequence
SEQ ID NO：33
GLAGTLDY
人源化_1D9_VL胺基酸序列
SEQ ID NO：34
人源化1D9 L2
人源化_1D9_CDRL1胺基酸序列
SEQ ID NO：35
RSSQSIVHSSGNTYLQ
人源化_1D9_CDRL2胺基酸序列
SEQ ID NO：36
KVSNRFS
人源化_1D9_CDRL3胺基酸序列
SEQ ID NO：37
FQGSHVPWT
鼠科15D5_VH核酸序列
SEQ ID NO：38
鼠科15D5_YL核酸序列
SEQ ID NO：39
人源化_15D5_VH核酸序列(細胞)
人源化15D5 H4
SEQ ID NO：40
人源化_15D5_VL核酸序列(細胞)
人源化15D5L1
SEQ ID NO：41
人源化_1D9_VH核酸序列(細胞)
人源化1D9H6
SEQ ID NO：42
人源化_1D9_VL核酸序列(細胞)
人源化1D9 L2
SEQ ID NO：43
MURINE_1D9_VH胺基酸序列
SEQ ID NO：44
M5.1D9.1F5 VH
鼠科_1D9_CDRH1胺基酸序列
SEQ ID NO：45
SYWMH
鼠科_1D9_CDRH2胺基酸序列
SEQ ID NO：46
VIDPSDGYSHYNOKFKG
鼠科_1D9_CDRH3胺基酸序列
SEQ ID NO：47
GLAGTLDY
鼠科_1D9_VL胺基酸序列
SEQ ID NO：48
M5.1D9.1F5 YL
鼠科_1D9_CDRL1胺基酸序列
SEQ ID NO：49
RSSQSIVHSSGNTYLQ
鼠科_1D9_CDRL2胺基酸序列
SEQ ID NO：50
KVSNRFS
鼠科_1D9_CDRL3胺基酸序列
SEQ ID NO：51
FOGSHVPWT
MURINE_1D9_VH核酸序列
SEQ ID NO：52
MURINE_1D9_VL核酸序列
SEQ ID NO：53
MURINE_22A5_YH核酸序列
SEQ ID NO：54
MURINE_22A5_VL核酸序列
SEQ ID NO：55
MURINE_22A5_VL核酸序列
SEQ ID NO：56
人源化_1D9_E_VL胺基酸序列
SEQ ID NO：57
人源化1D9 E L2
人源化_1D9_E_YL核酸序列(細胞)
SEQ ID NO：58
鼠科15D5_VH核酸序列(細胞)
SEQ ID NO：59
鼠科15D5_VL核酸序列(細胞)
SEQ ID NO：60
MURINE_ID9_VH核酸序列(細胞)
SEQ ID NO：61
MURINE_1D9_VL核酸序列(細胞)
SEQ ID NO：62
MURINE_22A5_VH核酸序列(細胞)
SEQ ID NO：63
MURINE_22A5_VL核酸序列(細胞)
SEQ ID NO：64
MURINE_22A5_YL核酸序列(細胞)
SEQ ID NO：65
人類HER3胞外區無訊號序列(相當於晶體結構)
SEQ ID NO：66
人源化1D9 H0 VH胺基酸序列
SEQ ID NO：67
人源化1D9 H0 VH核酸序列
SEQ ID NO：68
人源化1D9 H1 VH胺基酸序列
SEQ ID NO：69
人源化1D9 H1 VH核酸序列
SEQ ID NO：70
人源化1D9 H2 VH胺基酸序列
SEQ ID NO：71
人源化1D9 H2 VH核酸序列
SEQ ID NO：72
人源化1D9 H3 VH胺基酸序列
SEQ ID NO：73
人源化1D9 H3 VH核酸序列
SEQ ID NO：74
人源化1D9 L0 VL胺基酸序列
SEQ ID NO：75
人源化1D9 L0 VL核酸序列
SEQ ID NO：76
人源化1D9 L3 VL胺基酸序列
SEQ ID NO：77
人源化1D9 L3 VL核酸序列
SEQ ID NO：78
人源化1D9 L4 VL胺基酸序列
SEQ ID NO：79
人源化1D9 L4 VL核酸序列
SEQ ID NO：80
人源化1D9 L5 VL胺基酸序列
SEQ ID NO：81
人源化1D9 L5 VL核酸序列
SEQ ID NO：82
人源化1D9 L6 VL胺基酸序列
SEQ ID NO：83
人源化1D9 L6 YL核酸序列
SEQ ID NO：84
人源化1D9 L7 VL胺基酸序列
SEQ ID NO：85
人源化1D9 L7 VL核酸序列
SEQ ID NO：86
人源化1D9 L9 VL胺基酸序列
SEQ ID NO：87
人源化1D9 L9 VL核酸序列
SEQ ID NO：89
人源化15D5 H1 YH胺基酸序列
SEQ ID NO：90
人源化15D5 H1 VH核酸序列
SEQ ID NO：91
人源化15D5 H2 VH胺基酸序列
SEQ ID NO：92
人源化15D5 H2 VH核酸序列
SEQ ID NO：93
人源化15D5 H3 VH胺基酸序列
SEQ ID NO：94
人源化15D5 H3 VH核酸序列
SEQ ID NO：95
人源化15D5 L2 VL胺基酸序列
SEQ ID NO：96
人源化15D5 L2 VL核酸序列
SEQ ID NO：97
人源化15D5 L3 VL胺基酸序列
SEQ ID NO：98
人源化15D5 L3 VL核酸序列
SEQ ID NO：99
人源化1D9 H6全長重鏈胺基酸序列(用於具有FUT8基因功能性複製之非-POTELLIGENT TM 系統細胞中表現人源化1D9 H6L2抗體，及用於缺乏FUT8基因功能性複製之POTELLIGENT TM 系統CHOK1SV細胞中表現人源化1D9 H6L2 POTELLIGENT TM 抗體)
SEQ ID NO：100
人源化1D9 H6全長重鏈核酸序列(用於具有FUT8基因功能性複製之非-POTELLIGENT TM 系統細胞中表現人源化1D9 H6L2抗體，及用於缺乏FUT8基因功能性複製之POTELLIGENT TM 系統CHOK1SV細胞中表現人源化1D9 H6L2 POTELLIGENT TM 抗體)編碼
MGWSCIILFLVATATGVHS 訊號序列之部分可省略。
SEQ ID NO：101
人源化1D9 H6 COMPLEGENT TM (用於具有FUT8基因功能性複製之非-POTELLIGENT TM 系統細胞中表現人源化1D9 H6L2 COMPLEGENT TM 抗斑)或ACCRETAMAB TM (當表現在缺乏FUT8基因功能性複製之POTELLIGENT TM 系統CHOR1SV細胞時，用於表現人源化1D9 H6L2 ACCRETAMAB TM 抗菇)IgG1lIgG3同型嵌合斑全長重鏈肢基豉序列
SEQ ID NO:102
人源化1D9 H6 COMPLEGENT TM (用於具有FUT8基臥 功能性複製之非-POTELLIGENT TM 系統細胞中表現人源化1D9 H6L2 COMPLEGENT TM 抗體)或ACCRETAMAB TM (當表現在缺乏FUT8基因功能性複製之POTELLIGENT TM 系統CHOK1SV細胞時，用於表現人源化1D9 H6L2 ACCRETAMAB TM 抗體)IgG1/IgG3同型嵌合體全長重鏈核酸序列。編碼
MGWSCIILFLVATATGVHS 訊號序列之部分可省略。
SEQ ID NO：103
人源化1D9 L2全長輕鏈胺基酸序列(用於具有FUT8基 因功能性複製之非-POTELLIGENT TM 系統細胞中與SEQ ID NO：100共表現，產生人源化1D9 H6L2抗體；用於缺乏FUT8基因功能性複製之POTELLIGENT TM 系統CHOK1SV細胞中與SEQ ID NO：100共表現，產生人源化1D9 H6L2 POTELLIGENT TM 抗體；用於具有FUT8基因功能性複製之非-POTELLIGENT TM 系統細胞中與SEQ ID NO：102共表現，產生人源化1D9 H6L2 COMPLEGENT TM 抗體；及用於缺乏FUT8基因功能性複製之POTELLIGENT TM 系統細胞中與SEQ ID NO：102共表現，產生人源化1D9 H6L2 ACCRETAMAB TM 抗體)
SEQ ID NO：104
人源化1D9 L2全長輕鏈核酸序列(用於具有FUT8基因功能性複製之非-POTELLIGENT TM 系統細胞中與SEQ ID NO：100共表現，產生人源化1D9 H6L2抗體；用於缺乏FUT8基因功能性複製之POTELLIGENT TM 系統的CHOK1SV細胞中與SEQ ID NO：100共表現，產生人 源化1D9 H6L2 POTELLIGENT TM 抗體；用於具有FUT8基因功能性複製之非-POTELLIGENT TM 系統細胞中與SEQ ID NO：102共表現，產生人源化1D9 H6L2 COMPLEGENT TM 抗體；及用於缺乏FUT8基因功能性複製之POTELLIGENT TM 系統細胞中與SEQ ID NO：102共表現，產生人源化1D9 H6L2 ACCRETAMAB TM 抗體)。編碼 MGWSCIILFLVATATGVHS 訊號序列之部分可省略。
SEQ ID NO：105
本發明目前已充分描述，本項技術之一般技術者應能明瞭在無悖離所附的申請專利範圍之精神和範圍下，可就其做許多的變化和修改。
<110>　CLARK,Neil James
JOHANSON,Kyung Oh
JONAK,Zdenka Ludmila
TAYLOR,Alexander H.
XUE,Yu
<120>　新穎的抗原結合蛋白
<130>　PU64334
<150>　61/379,840
<151>　2010-09-03
<150>　61/440,460
<151>　2011-02-08
<160>　105
<170>　FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>　1
<211>　118
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　1
<210>　2
<211>　5
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　2
<210>　3
<211>　17
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　3
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<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　4
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<212>　PRT
<213>　小鼠
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<211>　11
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　6
<210>　7
<211>　7
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　7
<210>　8
<211>　9
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　8
<210>　9
<211>　120
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　9
<210>　10
<211>　5
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　10
<210>　11
<211>　17
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　11
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<211>　11
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　12
<210>　13
<211>　112
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　13
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<211>　16
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　14
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<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　15
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<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　16
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<212>　PRT
<213>　小鼠
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<212>　PRT
<213>　小鼠
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<212>　PRT
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<213>　小鼠
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<212>　PRT
<213>　智人
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<211>　118
<212>　PRT
<213>　人工序列
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<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　23
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<211>　17
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
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<211>　108
<212>　PRT
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<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　26
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<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　28
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<211>　9
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　29
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<211>　117
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　31
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<211>　17
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　33
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<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　34
<210>　35
<211>　16
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　35
<210>　36
<211>　7
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　36
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<211>　9
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　37
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<212>　DNA
<213>　小鼠
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<211>　321
<212>　DNA
<213>　小鼠
<400>　39
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<211>　357
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　40
<210>　41
<211>　321
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
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<211>　351
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　42
<210>　43
<211>　339
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　43
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<211>　117
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　44
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<211>　5
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　45
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<211>　17
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　46
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<211>　8
<212>　PRT
<213>　小鼠
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<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　48
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<211>　16
<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　49
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<212>　PRT
<213>　小鼠
<400>　50
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<212>　PRT
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<211>　351
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<212>　DNA
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<212>　DNA
<213>　小鼠
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<212>　DNA
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<212>　DNA
<213>　小鼠
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　58
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<212>　DNA
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<400>　59
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<212>　DNA
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<212>　DNA
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<212>　DNA
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<211>　360
<212>　DNA
<213>　小鼠
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<212>　DNA
<213>　小鼠
<400>　64
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<211>　321
<212>　DNA
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<400>　65
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<212>　PRT
<213>　智人
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　67
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　68
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<211>　117
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　69
<210>　70
<211>　351
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　70
<210>　71
<211>　117
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　71
<210>　72
<211>　351
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　72
<210>　73
<211>　117
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　73
<210>　74
<211>　351
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　74
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<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　75
<210>　76
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<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　76
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<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　77
<210>　78
<211>　339
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　78
<210>　79
<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　79
<210>　80
<211>　339
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　80
<210>　81
<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　81
<210>　82
<211>　339
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　82
<210>　83
<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　83
<210>　84
<211>　339
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　84
<210>　85
<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　85
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<211>　339
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　86
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<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　87
<210>　88
<211>　113
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　88
<210>　89
<211>　339
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
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<211>　118
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　90
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<211>　354
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　91
<210>　92
<211>　118
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　92
<210>　93
<211>　354
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　93
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<211>　118
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　94
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<211>　354
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　95
<210>　96
<211>　108
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　96
<210>　97
<211>　324
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　97
<210>　98
<211>　108
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　98
<210>　99
<211>　324
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　99
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<211>　466
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　100
<210>　101
<211>　1398
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　101
<210>　102
<211>　466
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　102
<210>　103
<211>　1398
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　103
<210>　104
<211>　238
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體胺基酸序列
<400>　104
<210>　105
<211>　714
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　以電腦模擬設計及使用分子生物合成技術製造之人源化抗體核酸序列
<400>　105
圖1.在BxPC3胰臟癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白(heregulin)引發的人類HER3受體磷酸化。
圖2.在CHL-1黑色素細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類HER3受體磷酸化。
圖3.在N87胃癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類HER3受體磷酸化。
圖4.在SK-BR-3乳癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類HER3受體磷酸化。
圖5.在BT-474乳癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類HER3受體磷酸化。
圖6.在MCF-7乳癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類HER3受體磷酸化。
圖7.在BxPC3胰臟癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類Akt受體磷酸化。
圖8.在CHL-1黑色素細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類Akt受體磷酸化。
圖9.在N87胃癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類Akt受體磷酸化。
圖10.在SK-BR-3乳癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類Akt受體磷酸化。
圖11.在SK-BR-3乳癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制表皮生長因子(EGF)引發的人類HER3受體磷酸化。
圖12.在SK-BR-3乳癌細胞中，以抗-HER3抗體抑制β細胞素(betacellulin)引發的人類HER3受體磷酸化。
圖13.在表皮生長因子(EGFR)和HER3轉導的CHO細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的異源二聚物形成和人類HER3受體磷酸化。
圖14.在HER2和HER3轉導的CHO細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的異源二聚物形成和人類HER3受體磷酸化。
圖15.在以HER4和HER3轉導的CHO細胞中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的異源二聚物形成和人類HER3受體磷酸化。
圖16.在癌細胞株中，以抗-HER3抗體抑制調蛋白引發的人類HER3受體磷酸化(磷酸化-HER3 ELISA IC50值)。
圖17.鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)與全長的人類HER3 ECD和人類HER3的III區結合。
圖18.鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)與全長的人類HER3 ECD和人類HER3的II區結合。
圖19.人源化1D9 POTELLIGENTTM抗體與全長的人類HER3 ECD和人類HER3的III區結合。
圖20.人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體與全長的人類HER3 ECD和人類HER3的III區結合。
圖21.人源化1D9抗體與全長的人類HER3 ECD和人類HER3的III區結合。
圖22.(a)以流式細胞儀分析，鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)辨識人類MCF-7乳癌細胞上的HER3。(b)以流式細胞儀分析，鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)抗體辨識人類BxPC3胰臟癌細胞上的HER3。
圖23.(a)以流式細胞儀分析，人源化1D9抗體、人源化ACCRETAMABTM 1D9抗體及人源化POTELLIGENTTM抗體辨識人類CHL-1黑色素瘤細胞上之HER3。(b)以流式細胞儀分析，人源化1D9抗體、人源化ACCRETAMABTM 1D9抗體及人源化POTELLIGENTTM抗體辨識BxPC3胰臟癌細胞上之HER3。
圖24.鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)及鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)抑制調蛋白引發的BxPC3胰臟癌細胞增生。
圖25.鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)及鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.1H10)抗體抑制調蛋白引發的MCF-7乳癌細胞增生。
圖26.人源化1D9 ACCRETAMABTM抗體及鼠科1D9抗體抑制調蛋白引發的BxPC3胰臟癌細胞增生。
圖27.鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)、鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1)、鼠科24H5抗體(M5.24H5.C2)、嵌合的1D9抗體及嵌合的15D5抗體抑制調蛋白引發的BxPC3胰臟癌細胞入侵。
圖28.在人類CHL-1黑色素瘤細胞中，鼠科15D5抗體(M5.15D5.2A1.H10)及人源化1D9抗體引發的受體內化。
圖29.(a)鼠科1D9抗體(M5.1D9.1F5)與表現在B16F10細胞之鼠科HER3交叉反應(b)鼠科24H5抗體(M5.24H5.C2)與表現在B16F10細胞之鼠科HER3交叉反應。(c)鼠科15D5抗體(M5.15D5.1C1)與表現在B16F10細胞之鼠科HER3交叉反應。
圖30.小鼠抗-HER3 mAb(鼠科1D9抗體)在B16F10同基因腫瘤模型中之效用。將經靜脈團注給予小鼠B16F10黑色素瘤細胞之C57BL/6小鼠，以同型對照物、小鼠Her3 mAb(m1D9)或GEMZARTM(吉西他濱(emcitabine))治療，用以評估在肺中腫瘤細胞定植化之效應。同型對照物和m1D9係在B16F10注射後第3天(25或50 mg/kg,i.p.)及第7和11天(5或25 mg/kg,i.p.)給劑。GEMZARTM僅在第3天給劑(20 mg/kg,i.v.)。在第20天收集肺進行重量測量。相較於同型的對照組，以m1D9治療者其肺重產生劑量依賴的降低(p<0.01；以杜納氏事後檢定(Dunnett's post test)之單因子ANOVA)。NTB=無腫瘤小鼠。
圖31.抗-HER3 mAb(鼠科15D5抗體)在B16F10同基因腫瘤模型中之效用。將經靜脈團注給予小鼠B16F10黑色素瘤細胞之C57BL/6小鼠，以同型對照物、小鼠Her3 mAb(m15D5)或GEMZARTM治療，用以評估在肺中腫瘤細胞定植化之效應。同型對照物和m15D5係在B16F10注射後第3天(25或50 mg/kg,i.p.)及第7和11天(5或25 mg/kg,i.p.)給劑。GEMZARTM僅在第3天給劑(20 mg/kg,i.v.)。在第20天收集肺進行濕重測量。以GEMZARTM和m15D5產生較低的肺重，然而，相較於同型對照組，僅25/5 mg/kg的m15D5具統計上顯著性(p<0.05；以杜納氏事後檢定進行單因子ANOVA)。NTB=無腫瘤小鼠。
圖32.小鼠抗-HER3 mAb(鼠科1D9抗體)在CHL-1異種移植模型中之效用。每星期二次以5至100 mg/kg i.p之小鼠抗-HER3 mAb(m1D9)治療，在CB-17 SCID小鼠中造成CHL-1腫瘤生長下降。相較於同型對照組，在植入後第24和27天觀察到劑量依賴及統計上顯著下降(*p<0.05；***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖33.小鼠抗-HER3 mAb(鼠科15D5抗體)在CHL-1異種移植模型中之效用。以每星期二次5至100 mg/kg i.p之小鼠抗-HER3 mAb(m15D5)治療，在CB-17 SCID小鼠中造成CHL-1腫瘤生長下降。相較於同型對照組，在植入後第20、24和27天觀察到劑量依賴及統計上顯著下降(*p<0.05；***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖34.小鼠抗-HER3 mAb(鼠科1D9抗體)在BxPC3異種移植模型中之效用。以每星期二次5至50 mg/kg i.p.之小鼠抗-HER3 mAb(m1D9治療)，在CB-17 SCID小鼠中造成BxPC3腫瘤生長之劑量依賴及統計上顯著下降(*p<0.01；***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖35.小鼠抗-HER3 mAb(鼠科15D5抗體)在BxPC3異種移植模型中之效用。以每星期二次0.5至50 mg/kg i.p.之小鼠抗-HER3 mAb(m15D5治療)，在CB-17 SCID小鼠中造成BxPC3腫瘤生長之劑量依賴及統計上顯著下降(*p<0.01；***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖36.小鼠抗-HER3 mAb(鼠科1D9抗體)在NCI-N87異種移植模型中之效用。以每星期二次75或100 mg/kg i.p.之m1D9治療CB-17 SCID小鼠，相較於媒劑對照組，造成N87腫瘤生長下降。在同型對照組小鼠IgG2b中，觀察到類似的下降(*p<0.01；***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖37.小鼠抗-HER3 mAb(鼠科15D5抗體)在NCI-N87異種移植模型中之效用。以每星期二次75或100 mg/kg i.p.之m15D5治療CB-17 SCID小鼠，相較於媒劑對照組或同型對照組，造成N87腫瘤體積減小。但是其差異不具有統計上顯著性。
圖38.嵌合抗-HER3 mAb(嵌合1D9抗體)在CHL-1異種移植模型中之效用。以每星期二次5至50 mg/kg i.p.之嵌合抗-HER3 mAb(ch1D9)治療，在CB-17 SCID小鼠中造成CHL-1腫瘤生長下降。相較於同型對照組，在移植後第24和27天觀察到劑量依賴及統計上顯著下降(*p<0.05；***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖39.人源化抗-HER3 mAb(人源化15D5抗體)在CHL-1異種移植模型中之效用。以每星期二次5至50 mg/kg i.p.之人源化抗-HER3 mAb(h15D5)治療，在CB-17 SCID小鼠中造成CHL-1腫瘤生長下降。相較於同型對照組，在移植後第24和27天觀察到劑量依賴及統計上顯著下降(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖40.人源化抗-HER3 mAb(人源化1D9抗體)在CHL-1異種移植模型中之效用。以每星期二次5至50 mg/kg i.p.之人源化1D9治療，在CB-17 SCID小鼠中造成CHL-1腫瘤生長下降。相較於移植後第29和34天之同型對照組，此腫瘤生長下降在所有的劑量上皆相類似並具統計上顯著性(***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖41.人源化1D9 RR ACCRETAMABTM在CHL-1異種移植模型中之效用。以每星期二次5至50 mg/kg i.p.之人源化1D9 RR ACCRETAMABTM治療，在CB-17 SCID小鼠中造成CHL-1腫瘤生長下降。相較於移植後第29和34天之同型對照組，此腫瘤生長下降在所有的劑量上皆相類似並具統計上顯著性(***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖42.人源化1D9 RR POTELLIGENTTM在CHL-1異種移植模型中之效用。以每星期二次5至50 mg/kg i.p.之人源化1D9 RR POTELLIGENTTM治療，在CB-17 SCID小鼠中造成CHL-1腫瘤生長下降。相較於移植後第29和34天之同型對照組，此腫瘤生長下降係具劑量依賴和統計上顯著性(***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖43.嵌合抗-HER3mAb(嵌合1D9抗體)在BxPC3異種移植模型中(皮下注射)之效用。以每星期二次0.5至50 mg/kg i.p.之嵌合抗-HER3 mAb(ch1D9)治療CB-17 SCID小鼠，評估其對BxPC3腫瘤生長之效應。相較於移植後第33天及第36天50 mg/kg之同型對照組，在0.5、5和50 mg/kg的治療組中天觀察到腫瘤生長之劑量依賴及統計上顯著下降(*p<0.01；***p<0.001；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖44.人源化抗-HER3 mAb(人源化15D5抗體)在BxPC3異種移植模型中(皮下注射)之效用。以每星期二次0.5至50 mg/kg i.p.之人源化抗-HER3 mAb(h15D5)治療CB-17 SCID小鼠，評估其對BxPC3腫瘤生長之效應。相較於移植後第33及36天之同型對照組，在50 mg/kg的治療組中天觀察到腫瘤生長下降(**p<0.01；以Bonferroni事後檢定進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖45.人源化1D9 RR抗體在BxPC3異種移植模型中(皮下注射)之效用。以每星期二次0.5至50 mg/kg i.p.將1D9RR投予帶有BxPC3腫瘤之CB-17 SCID小鼠，測定其對腫瘤生長之效應。在20 mg/kg的治療組中天觀察到，36天後腫瘤體積下降回到同型對照組之程度(*p<0.05；***p<0.01；以Bonferroni事後比較進行2因子ANOVA重複量數分析)。
圖46.嵌合1D9抗體及人源化15D5抗體在BxPC3異種移植模型中(原位移植)之效用。將BxPC3胰臟癌片段原位移植到雌性CB-17 SCID小鼠之胰臟中。一旦腫瘤達到80-100 mm3，給予每星期二次50 mg/kg之HER3 mAbs、h15D5及Ch1D9。每隔一周以超音波(Vevo Image Analysis)測量腫瘤體積。相較於移植後5、6和7星期之同型對照組，以抗-HER3 mAbs治療造成腫瘤生長顯著下降(**p<0.01；***p<0.001；以Bonferroni事後比較進行2因子ANOVA)。
圖47.人源化1D9 RR抗體及變異體在NCI-N87異種移植模型中之效用。以50 mg/kg每星期二次i.p.給予CB-17 SCID小鼠指標性人源化HER3 mAbs(人源化1D9 RR抗體、人源化1D9 RR POTELLIGENTTM抗體及人源化1D9 RR ACCRETAMABTM抗體)，測定其對N87腫瘤細胞生長之效應。相較於同型對照組，在第37天之h1D9 RR POTELLIGENTTM組及第44天之h1D9RR ACCRETAMABTM組中觀察到腫瘤生長在統計上顯著下降(*p<0.05；以Bonferroni事後檢定比較進行2因子ANOVA)。
圖48.使用HER3轉導的HEK293作為目標細胞及人類PBL作為效應細胞(供體2126)之ADCC分析。
圖49.使用CHL-1細胞作為目標細胞及人類PBL作為效應細胞(供體2126)之ADCC分析。
圖50.使用HER3轉導的HEK293作為目標細胞及食蟹獼猴PBL作為效應細胞(70-105)之ADCC分析。
圖51.使用HER3轉導的HEK293作為目標細胞及食蟹獼猴BL作為效應細胞(70-113)之ADCC分析。
圖52.使用CHL-1細胞作為目標細胞及食蟹獼猴PBL作為效應細胞(70-105)之ADCC分析。
圖53.使用CHL-1細胞作為目標細胞及食蟹獼猴PBL作為效應細胞(70-113)之ADCC分析。
圖54.使用HER3 BACMAMTM轉導的HEK293作為目標細胞及CALBIOCHEMTM兔補體之CDC分析。
圖55.X-光晶體結構，係顯示人類HER3 ECD之III區(SEQ ID NO：66；共結晶片段)及鼠科1D9輕鏈可變區和鼠科1D9重鏈可變區(共結晶的鼠科1D9抗體衍生之Fab)間之胺基酸接觸。

Claims (137)

  1. 一種抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係由嵌合抗體和人源化抗體組成之群中選出。
  3. 如申請專利範圍第2項之抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：2所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：3所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：4所示之CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及具有SEQ ID NO：6所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：7所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：8所示之CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
  4. 如申請專利範圍第3項之抗原結合蛋白，其係與包含SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合。
  5. 一種抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：25組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係由嵌合抗體和人源化抗體組成之群中選出。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：23所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：24所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：25所示之CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及具有SEQ ID NO：27所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：28所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：29所示之CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
  8. 如申請專利範圍第7項之抗原結合蛋白，其係與包含SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合。
  9. 一種抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46及SEQ ID NO：47組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
  10. 如申請專利範圍第9項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係由嵌合抗體和人源化抗體組成之群中選出。
  11. 如申請專利範圍第10項之抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：45所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：46所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：47所示之CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及具有SEQ ID NO：49所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：50所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：51所示之CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
  12. 如申請專利範圍第11項之抗原結合蛋白，其係與包含SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合。
  13. 一種抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
  14. 如申請專利範圍第13項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係由嵌合抗體和人源化抗體組成之群中選出。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：31所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：32所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：33所示之CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及具有SEQ ID NO：35所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：36所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：37所示之CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
  16. 如申請專利範圍第15項之抗原結合蛋白，其係與包含SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合。
  17. 一種抗原結合蛋白，其係包括一重鏈可變區及/或一輕鏈可變區，其中該重鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQID NO：10、SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12組成之群中選出之胺基酸序列有超過75%序列一致性；而該輕鏈可變區具有至少一個CDR係與由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20組成之群中選出之胺基酸序列有75%或更高的序列一致性。
  18. 如申請專利範圍第17項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係由嵌合抗體和人源化抗體組成之群中選出。
  19. 如申請專利範圍第18項之抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：10所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：11所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：12所示之CDR胺基酸序列之重鏈可變區；及具有SEQ ID NO：12所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：7所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：8所示之CDR胺基酸序列之輕鏈可變區，或具有SEQ ID NO：18所示之CDR胺基酸序列、SEQ ID NO：19所示之CDR胺基酸序列及SEQ ID NO：20所示之CDR胺基酸序列之輕鏈可變區。
  20. 如申請專利範圍第19項之抗原結合蛋白，其係抑制包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列之二聚體形成。
  21. 一種抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列之重鏈可變區序列；及具有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
  22. 一種抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：22所示之胺基酸序列之重鏈可變區序列；及具有SEQ ID NO：26所示之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
  23. 一種抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：44所示之胺基酸序列之重鏈可變區序列；及具有SEQ ID NO：48所示之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
  24. 一種抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列之重鏈可變區序列；及具有SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
  25. 一種抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列之重鏈可變區序列；及具有由SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列和SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列組成之群中選出的輕鏈可變區序列。
  26. 一種抗原結合蛋白，其係包括具有SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列之重鏈可變區序列；及具有SEQ ID NO：57所示之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
  27. 一種單離的核酸，其係編碼如申請專利範圍第1項之抗原結合蛋白。
  28. 如申請專利範圍第27項之單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：38所示之核酸序列和SEQ ID NO：39所示之核酸序列組成之群中選出之核酸。
  29. 如申請專利範圍第27項之單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：59所示之核酸序列和SEQ ID NO：60所示之核酸序列組成之群中選出之核酸。
  30. 一種單離的核酸，其係編碼如申請專利範圍第5項之抗原結合蛋白。
  31. 如申請專利範圍第30項之單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：40所示之核酸序列和SEQ ID NO：41所示之核酸序列組成之群中選出之核酸。
  32. 一種單離的核酸，其係編碼如申請專利範圍第9項之抗原結合蛋白。
  33. 如申請專利範圍第32項之單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：52所示之核酸序列和SEQ ID NO：53所示之核酸序列組成之群中選出之核酸。
  34. 如申請專利範圍第32項之單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：61所示之核酸序列和SEQ ID NO：62所示之核酸序列組成之群中選出之核酸。
  35. 一種單離的核酸，其係編碼如申請專利範圍第13項之抗原結合蛋白。
  36. 如申請專利範圍第35項之單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：42所示之核酸序列和SEQ ID NO：43所示之核酸序列組成之群中選出之核酸。
  37. 一種單離的核酸，其係編碼如申請專利範圍第26項之抗原結合蛋白。
  38. 如申請專利範圍第37項之單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：42所示之核酸序列和SEQ ID NO：58所示之核酸序列組成之群中選出之核酸。
  39. 一種單離的核酸，其係編碼如申請專利範圍第17項之抗原結合蛋白。
  40. 如申請專利範圍第39項之單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：54所示之核酸序列、SEQ ID NO：55所示之核酸序列和SEQ ID NO：56所示之核酸序列組成之群中選出之核酸。
  41. 如申請專利範圍第39項之單離的核酸，其係包括至少一種由SEQ ID NO：63所示之核酸序列、SEQ ID NO：64所示之核酸序列和SEQ ID NO：65所示之核酸序列組成之群中選出之核酸。
  42. 一種表現載體，其係包括如申請專利範圍第27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40和41項中任一項之單離核酸。
  43. 一種包括表現載體之重組的宿主細胞，其中該表現載體係包括如申請專利範圍第27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40和41項中任一項之單離核酸。
  44. 一種製造抗原結合蛋白之方法，其係包括培養一包含表現載體之重組宿主細胞之步驟，其中該表現載體係包括如申請專利範圍第27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40和41項中任一項之單離核酸；及回收此抗原結合蛋白。
  45. 一種醫藥組成物，其係包括如申請專利範圍第1、5、9、13、17、21、22、23、24、25及26項之抗原結合蛋白；及醫藥上可接受載劑。
  46. 一種於一對象中治療癌症之方法，其包括將一治療上有效量之如申請專利範圍第1、5、9、13、17、21、22、23、24、25和26項之抗原結合蛋白投予該對象之步驟，據此治療該對象之癌症。
  47. 一種於一對象中治療癌症之方法，其包括下列步驟：a)辨識該對象患有癌症，其中該癌症係由下列組成之群中選出：乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤；及b)將一治療上有效量之如申請專利範圍第22項之抗原結合蛋白投予該對象，據此治療該對象之癌症。
  48. 如申請專利範圍第47項之方法係進一步包括下列步驟：c)測定包含SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的癌症表現蛋白。
  49. 如申請專利範圍第48項之方法，其中該蛋白係包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列。
  50. 一種於一對象中治療癌症之方法，其包括下列步驟：a)辨識患有癌症之對象，其中該癌症係由下列組成之群中選出：乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤；及b)將一治療上有效量之如申請專利範圍第24項之抗原結合蛋白投予該對象，據此治療該對象之癌症。
  51. 如申請專利範圍第50項之方法係進一步包括下列步驟：c)測定包含SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的癌症表現蛋白。
  52. 如申請專利範圍第51項之方法，其中該蛋白係包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列。
  53. 一種如申請專利範圍第1、5、9、13、17、21、22、23、24、25和26項中任一項之物質之用途，係用於製造醫藥品供治療由下列組成之群中選出之症狀：乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
  54. 一種抗原結合蛋白，其係與包含SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合。
  55. 如申請專利範圍第54項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係由嵌合抗體和人源化抗體組成之群中選出。
  56. 一種抗原結合蛋白，其係與包含SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的胜肽鏈區專一性結合。
  57. 如申請專利範圍第56項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係由嵌合抗體和人源化抗體組成之群中選出。
  58. 一種製造抗原結合蛋白之方法，其包括下列步驟：a)培養包括表現載體之重組的宿主細胞，而該載體係包括如申請專利範圍第29、35和38項中任一項之單離核酸，其中編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因在重組的宿主細胞中已經去活化；及b)回收此抗原結合蛋白；據此產生抗原結合蛋白。
  59. 如申請專利範圍第58項之方法，其中該重組的宿主細胞為CHOK1SV細胞。
  60. 一種抗原結合蛋白，係如申請專利範圍第58項之方法所製造。
  61. 一種製造抗原結合蛋白之方法，其包括下列步驟：a)培養重組的宿主細胞，其係包括含有如申請專利範圍第29、35和38項中任一項之單離核酸之表現載體，其中該表現載體包括編碼嵌合Fc區之Fc核酸序列，而嵌合Fc區係具有IgG1和IgG3 Fc區胺基酸殘基；及b)回收此抗原結合蛋白；據此產生抗原結合蛋白。
  62. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該Fc核酸序列係在框架中與由SEQ ID NO：40所示之核酸序列及SEQ ID NO：42所示之核酸序列組成之群中選出的核酸融合。
  63. 一種抗原結合蛋白，係如申請專利範圍第62項之方法所製造。
  64. 一種製造抗原結合蛋白之方法，其包括下列步驟：a)培養重組的宿主細胞，其包括含有如申請專利範圍第29、35和38項中任一項之單離核酸之表現載體，該表現載體進一步包括編碼嵌合Fc區之Fc核酸序列，而嵌合Fc區係具有IgG1和IgG3 Fc區胺基酸殘基，且其中編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因在重組的宿主細胞中已經去活化；及b)回收此抗原結合蛋白；據此產生抗原結合蛋白。
  65. 如申請專利範圍第64項之方法，其中該Fc核酸序列係在框架中與由SEQ ID NO：40所示之核酸序列及SEQ ID NO：42所示之核酸序列組成之群中選出的核酸融合。
  66. 如申請專利範圍第65項之方法，其中該重組的宿主細胞為CHOK1SV細胞。
  67. 一種抗原結合蛋白，係如申請專利範圍第64項之方法所製造。
  68. 一種於一對象中治療癌前症狀之方法，係包括將一治療上有效量之如申請專利範圍第1、5、9、13、17、21、22、23、24、25和26項之抗原結合蛋白投予該對象之步驟，據此治療該對象之癌前症狀。
  69. 一種於一對象中治療癌前症狀之方法，係包括下列步驟：a)辨識患有癌前症狀之對象；及b)將一治療上有效量之如申請專利範圍第22項之抗原結合蛋白投予該對象，據此治療該對象之癌前症狀。
  70. 如申請專利範圍第69項之方法，係進一步包括下列步驟：c)測定包括SEQ ID NO：21之184至329胺基酸殘基的癌症表現蛋白。
  71. 如申請專利範圍第69項之方法，其中該蛋白係包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列。
  72. 一種於一對象中治療癌前症狀之方法，係包括下列步驟：a)辨識患有癌前症狀之對象；及b)將一治療上有效量之如申請專利範圍第24項之抗原結合蛋白投予該對象，據此治療該對象之癌症。
  73. 如申請專利範圍第72項之方法，係進一步包括下列步驟：c)測定包括SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的癌症表現蛋白。
  74. 如申請專利範圍第73項之方法，其中該蛋白係包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列。
  75. 一種抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合並包括具有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的CDRH3。
  76. 一種抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合，並包括具有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列的CDRH1，具有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列的CDRH2，具有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列的CDRH3，具有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列的CDRL2，及具有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列的CDRL3。
  77. 一種抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合，並包括具有SEQ ID NO：23所示之胺基酸序列的CDRH1，具有SEQ ID NO：24所示之胺基酸序列的CDRH2，具有SEQ ID NO：25所示之胺基酸序列的CDRH3，具有SEQ ID NO：27所示之胺基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID NO：28所示之胺基酸序列的CDRL2，及具有SEQ ID NO：29所示之胺基酸序列的CDRL3。
  78. 一種抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合，並包括具有SEQ ID NO：31所示之胺基酸序列的CDRH1，具有SEQ ID NO：32所示之胺基酸序列的CDRH2，具有SEQ ID NO：33所示之胺基酸序列的CDRH3，具有SEQ ID NO：35所示之胺基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID NO：36所示之胺基酸序列的CDRL2，及具有SEQ ID NO：37所示之胺基酸序列的CDRL3。
  79. 一種抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合，並包括具有SEQ ID NO：45所示之胺基酸序列的CDRH1，具有SEQ ID NO：46所示之胺基酸序列的CDRH2，及具有SEQ ID NO：47所示之胺基酸序列的CDRH3，具有SEQ ID NO：49所示之胺基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID NO：50所示之胺基酸序列的CDRL2，及具有SEQ ID NO：51所示之胺基酸序列的CDRL3。
  80. 一種抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合，並包括具有SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列的CDRH1，具有SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列的CDRH2，及具有SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列的CDRH3，具有SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列的CDRL2，及具有SEQ ID NO：16所示之胺基酸序列的CDRL3。
  81. 一種抗原結合蛋白，其係與HER3受體專一性結合，並包括具有SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列的CDRH1，具有SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列的CDRH2，及具有SEQ ID NO：12所示之胺基酸序列的CDRH3，具有SEQ ID NO：18所示之胺基酸序列的CDRL1，具有SEQ ID NO：19所示之胺基酸序列的CDRL2，及具有SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列的CDRL3。
  82. 如申請專利範圍第45項之醫藥組成物，係用於醫藥。
  83. 如申請專利範圍第45項之醫藥組成物，係用於治療乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
  84. 一種於哺乳動物中治療癌症之方法，其包括投予一治療上有效量之如申請專利範圍第1、5、9、13、17、21、22、23、24、25和26項中任一項之抗原結合蛋白。
  85. 如申請專利範圍第84項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  86. 如申請專利範圍第84或85項之方法，其中該癌症係選自乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
  87. 一種抗原結合蛋白，其包括一重鏈序列和一輕鏈序列，其中該重鏈具有SEQ ID NO：100所示之胺基酸序列的20至466胺基酸殘基，而該輕鏈具有SEQ ID NO：104所示之胺基酸序列的20至238胺基酸殘基。
  88. 如申請專利範圍第87項之抗原結合蛋白，係包括岩藻糖基化聚醣。
  89. 如申請專利範圍第88項之抗原結合蛋白，其中該岩藻糖基化聚醣係由G0、G2、G0F、G2F、G1、Man5、G1F和G1F’組成之群中選出。
  90. 如申請專利範圍第87項之抗原結合蛋白，係包括非-岩藻糖基化聚醣。
  91. 如申請專利範圍第90項之抗原結合蛋白，其中該非-岩藻糖基化聚醣係由G0、G2、G1和Man5組成之群中選出。
  92. 一種抗原結合蛋白，其包括一重鏈序列和一輕鏈序列，其中該重鏈具有SEQ ID NO：102所示之胺基酸序列的20至466胺基酸殘基，而該輕鏈具有SEQ ID NO：104所示之胺基酸序列的20至238胺基酸殘基。
  93. 如申請專利範圍第92項之抗原結合蛋白，其包括岩藻糖基化聚醣。
  94. 如申請專利範圍第93項之抗原結合蛋白，其中該岩藻糖基化聚醣係由G0、G2、G0F、G2F、G1、Man5、GIF和G1F’組成之群中選出。
  95. 如申請專利範圍第92項之抗原結合蛋白，其包括非-岩藻糖基化聚醣。
  96. 如申請專利範圍第95項之抗原結合蛋白，其中該非-岩藻糖基化聚醣係由G0、G2、G1和Man5組成之群中選出。
  97. 一種單離的核酸，其係編碼SEQ ID NO：100所示之胺基酸序列的20至466胺基酸殘基。
  98. 如申請專利範圍第97項之單離的核酸，其係包括SEQ ID NO：101所示之核酸序列。
  99. 一種單離的核酸，其係編碼SEQ ID NO：104所示之胺基酸序列的20至238胺基酸殘基。
  100. 如申請專利範圍第99項之單離的核酸，其係包括SEQ ID NO：105所示之核酸序列。
  101. 一種單離的核酸，其係編碼SEQ ID NO：102所示之胺基酸序列的20至466胺基酸殘基。
  102. 如申請專利範圍第101項之單離的核酸，其係包括SEQ ID NO：103所示之核酸序列。
  103. 一種表現載體，其係包括如申請專利範圍第97、98、99、100、101和102項中任一項之單離核酸。
  104. 一種包括表現載體之重組的宿主細胞，其中該表現載體係包括如申請專利範圍第97、98、99、100、10I和102項中任一項之單離核酸。
  105. 如申請專利範圍第104項之重組的宿主細胞，其中係存有一編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因。
  106. 如申請專利範圍第105項之重組的宿主細胞，其為CHOK1細胞。
  107. 如申請專利範圍第104項之重組的宿主細胞，其中該編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因已經去活化。
  108. 如申請專利範圍第107項之重組的宿主細胞，其為CHOK1SV細胞。
  109. 一種醫藥組成物，其係包括如申請專利範圍第87、88、89、90、91、92、93、94、95和96項中任一項之抗原結合蛋白；及醫藥上可接受載劑。
  110. 一種於一對象中治療癌症之方法，其包括將一治療上有效量之如申請專利範圍第87、88、89、90、91、92、93、94、95和96項中任一項之抗原結合蛋白投予該對象之步驟，據此治療該對象之癌症。
  111. 一種於一對象中治療癌症之方法，其包括下列步驟：a)辨識患有癌症之對象，其中該癌症係由下列組成之群中選出：乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤；及b)將一治療上有效量之如申請專利範圍第87、88、89、90、91、92、93、94、95和96項中任一項之抗原結合蛋白投予該對象，據此治療該對象之癌症。
  112. 如申請專利範圍第111項之方法，其進一步包括下列步驟：c)測定包括SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的癌症表現蛋白。
  113. 如申請專利範圍第112項之方法，其中該蛋白係包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列。
  114. 一種如申請專利範圍第87、88、89、90、91、92、93、94、95和96項中任一項之物質於製造醫藥品之用途，該醫藥品供治療由下列組成之群中選出之症狀：乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
  115. 一種製造抗原結合蛋白之方法，其包括下列步驟：a)培養包括表現載體之重組的宿主細胞，而該載體係包括如申請專利範圍第97或98項之單離核酸及包括如申請專利範圍第97或100項之單離核酸，其中該編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因在重組的宿主細胞中係具有活性；及b)回收此抗原結合蛋白；據此產生抗原結合蛋白。
  116. 如申請專利範圍第115項之方法，其中該重組的宿主細胞為CHOK1細胞。
  117. 一種抗原結合蛋白，係由如申請專利範圍第115項之方法所製造。
  118. 一種製造抗原結合蛋白之方法，其包括下列步驟：a)培養包括表現載體之重組的宿主細胞，而該載體係包括如申請專利範圍第97或98項之單離核酸及包括如申請專利範圍第97或100項之單離核酸，其中該編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因在重組的宿主細胞中已經去活化；及b)回收此抗原結合蛋白；據此產生抗原結合蛋白。
  119. 如申請專利範圍第118項之方法，其中該重組的宿主細胞為CHOK1SV細胞。
  120. 一種抗原結合蛋白，係由如申請專利範圍第118項之方法所製造。
  121. 一種製造抗原結合蛋白之方法，其包括下列步驟：a)培養包括表現載體之重組的宿主細胞，而該載體係包括如申請專利範圍第99或100項之單離核酸及包括如申請專利範圍第101或102項之單離核酸，其中該編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因在重組的宿主細胞中係具有活性；及b)回收此抗原結合蛋白；據此產生抗原結合蛋白。
  122. 如申請專利範圍第121項之方法，其中該重組的宿主細胞為CHOK1細胞。
  123. 一種抗原結合蛋白，係由如申請專利範圍第121項之方法所製造。
  124. 一種製造抗原結合蛋白之方法，其包括下列步驟：a)培養包括表現載體之重組的宿主細胞，而該載體係包括如申請專利範圍第99或100項之單離核酸及包括如申請專利範圍第101或102項之單離核酸，其中該編碼α-1,6-岩藻糖基移轉酶的FUT8基因在重組的宿主細胞中已經去活化；及b)回收此抗原結合蛋白；據此產生抗原結合蛋白。
  125. 如申請專利範圍第124項之方法，其中該重組的宿主細胞為CHOK1SV細胞。
  126. 一種抗原結合蛋白，係由如申請專利範圍第124項之方法所製造。
  127. 一種於一對象中治療癌前症狀之方法，其包括將一治療上有效量之如申請專利範圍第87、88、89、90、91、92、93、94、95和96項中任一項之抗原結合蛋白投予該對象之步驟，據此治療該對象之癌前症狀。
  128. 一種於一對象中治療癌前症狀之方法，其包括下列步驟：a)辨識患有癌前症狀之對象；及b)將一治療上有效量之如申請專利範圍第87、88、89、90、91、92、93、94、95和96項中任一項之抗原結合蛋白投予該對象，據此治療該對象之癌前症狀。
  129. 如申請專利範圍第128項之方法，其進一步包括下列步驟：c)給予該對象一流體。
  130. 如申請專利範圍第128項之方法，其進一步包括下列步驟：c)測定包括SEQ ID NO：21之330至495胺基酸殘基的癌症表現蛋白。
  131. 如申請專利範圍第130項之方法，其中該蛋白係包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列。
  132. 如申請專利範圍第109項之醫藥組成物，係用於醫藥。
  133. 如申請專利範圍第109項之醫藥組成物，係用於治療乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
  134. 一種於哺乳動物中治療癌症之方法，其包括投予一治療上有效量之如申請專利範圍第87、88、89、90、91、92、93、94、95和96項中任一項之抗原結合蛋白。
  135. 如申請專利範圍第134項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  136. 如申請專利範圍第134或135項之方法，其中該癌症係選自乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
  137. 如任何前述申請專利範圍之抗原結合蛋白，係用於治療由下列組成之群中選出之症狀：乳癌、卵巢癌、***癌、膀胱癌、胰臟癌、皮膚癌、胃癌和黑色素瘤。
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