ES2207278T3 - Heterominicuerpos. - Google Patents

Abstract

Un compuesto multifuncional, producido en una célula huésped de mamíferos como un heterodímero totalmente funcional y secretable de dos cadenas de polipéptidos, en donde una de dichas cadenas de polipéptidos comprende, como único dominio de región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina el dominio CH1 y la otra cadena de polipéptido comprende el dominio CL constante de una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde dicho compuesto multifuncional además comprende, unido a dichos dominios de región constante al menos dos y hasta cuatro (poli)péptidos con diferentes funciones de ligando o receptor, en donde además al menos dos de dichos diferentes (poli)péptidos carecen de una afinidad intrínseca uno por el otro y en donde dichas cadenas de polipéptidos están unidas mediante dominios constantes.

Description

Heterominicuerpos.

La presente invención se refiere a compuestos multifuncionales, producidos en una célula huésped de mamíferos como un heterodímero totalmente funcional y secretable de dos cadenas de polipéptidos, en donde una de dichas cadenas de polipéptidos comprende, como único dominio de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina, el dominio C_{H}1 y la otra cadena de polipéptidos comprende el dominio C_{L} constante de una cadena ligera de inmunoglobulina, donde dicho compuesto multifuncional además contiene fusionado a dicho(s) dominio(s) de región constante al menos dos y hasta cuatro (poli)péptidos que tienen diferentes funciones ligando o receptor, en donde además al menos dos de dichos (poli)péptidos diferentes carecen de afinidad intrínseca uno por el otro y en donde dichas cadenas de polipéptido se unen vía dichos dominios de región constante. Preferiblemente, dichos dominios, con función ligando o receptor, están en el formato de un fragmento scFV y/o son moléculas efectoras de inmonumodulación. Más preferiblemente, dicho fragmento-scFV comprende las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo M79 anti 17-1A de ratón, las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo Y anti-Lewis, tal como se muestra en la Fig. 6, o las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo TR66 anti-CD3 y/o dicha molécula efectora inmuno-moduladora comprende citocinas o quimiocinas. Además, la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican dichas cadenas de polipéptidos así como vectores que comprenden dichos polinucleótidos y células huésped transformadas con éstos así como el uso de las anteriores realizaciones para la producción de dichos compuestos multifuncionales. Además, se proporcionan las composiciones de diagnóstico y farmacéuticas, comprendiendo cualquiera de los compuestos multi-funcionales polinucleótidos o vectores, descritos anteriormente. También se describe el uso de los compuestos multifuncionales mencionados anteriormente para prevenir o tratar el crecimiento de células malignas, refiriéndose a malignidades de células hematopoyéticas o tumores sólidos.

A lo largo de los 1980s, se desarrolló el concepto de anticuerpos biespecíficos. La virtud de los anticuerpos biespecíficos, es que se pueden unir de forma cruzada diferentes antígenos, receptores o ligandos, que no interactúan fisiológicamente uno con otro, proporcionando así nuevos métodos interfiriendo en las enfermedades, reclutando células efectoras citotóxicas que maten a las células diana, por ejemplo células tumorales, o células infectadas por virus o facilitando la eliminación de patógenos del cuerpo.

Las construcciones de anticuerpos biespecíficos pequeñas se cree comúnmente que tienen un gran potencial terapéutico y de diagnóstico. En contraposición a las versiones biespecíficas de las moléculas de inmunoglobulina totales (Merchant, Nature, Biotechnology 16 (1998), 677-681) que se espera que mantenga sus propiedades in vivo y especialmente el tiempo de semi-vida largo de sus homólogos monoespecíficos naturales, las construcciones de anticuerpos biespecíficos pequeñas debido a su bajo peso molecular son preferibles para aplicaciones que requieran unas mejores propiedades de biodistribución. Además, los anticuerpos biespecíficos pequeños se ha supuesto que pueden producirse en rendimientos significativos mejores que los de las versiones biespecíficas basándose en inmunoglobulinas totales. Por lo tanto, se han desarrollado varias rutas recombinantes para la producción de tales fragmentos de anticuerpos biespecíficos con el fin de superar los bajos rendimientos de los métodos convencionales (Carter, J. Hematother. 4 (1995) 463-470).

Fragmentos de anticuerpos biespecíficos del campo anterior normalmente no pueden ser glicosilados debido a su carencia de sitios de glicosilación. Por lo tanto, los métodos de producción se han focalizado en E. coli como huésped de expresión, aunque la expresión funcional de los derivados de anticuerpos en E. coli puede ser crítica, dependiendo del éxito de la translocación de las cadenas de polipéptido correspondientes en el espacio periplasmático y en la complejidad estructural de la proteína recombinante. Así, los anticuerpos de cadena simple biespecíficos consisten de cuatro regiones Ig-variables en una cadena de polipéptido simple demostrando que no es expresable como proteínas funcionales en el periplasma de E. coli. En contraposición, los anticuerpos de cadena simple biespecíficos se pueden expresar como proteínas recombinantes totalmente funcionales en la vía secretora de células de mamíferos permitiendo así la purificación a partir del sobrenadante del cultivo (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021-7025.

En general, las estrategias de la expresión de anticuerpos biespecíficos se puede dividir en sistemas de huésped simple o dos huéspedes (Carter, J.Hematother. 4 (1995), 7021-7025).

En general, las estrategias para la expresión de anticuerpos biespecíficos se pueden dividir en sistemas de huésped simple o de dos huéspedes (Carter, J.Hematother. 4 (1995), 463-470). En los sistemas de dos huéspedes, las dos especificidades diferentes se expresan por separado y se purifican y a continuación se combinan in vitro para formar heterodímeros biespecíficos. En sistemas de huésped único, el anticuerpo biespecífico también se expresa en formato de cadena simple o en dos cadenas de polipéptido diferentes formando heterodímeros durante la expresión en la misma célula huésped. En principio, los sistemas de huésped único son más preferibles que los sistemas de dos huéspedes, desde que se requieren pasos adicionales in vitro en los sistemas de dos huéspedes tienden a aumentar los costes de producción, reducen el rendimiento y el límite de la pureza obtenible de los anticuerpos biespecíficos resultantes. Por supuesto, la expresión funcional de los derivados de anticuerpos biespecíficos en un sistema de huésped único apropiado es también preferible a los métodos convencionales que subyacen en la expresión no funcional seguida de la desnaturalización completa de la proteína recombinante, y el posterior repliegue. Por lo tanto, los métodos eficientes para la expresión funcional de anticuerpos biespecíficos en sistemas de huésped único son los mayormente preferidos en comparación con métodos alternativos.

Además de la expresión funcional de anticuerpos de cadena simple biespecíficos en células de mamíferos, el único sistema de huésped único que produce predominantemente fragmentos de anticuerpos biespecíficos y, en el que se ha visto factible su producción a gran escala es la expresión de diacuerpos en el periplasma de E. coli, que se basa en la dimerización preferencial de las dos cadenas de polipéptido diferentes (Hollinger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 6444-6448). Minianticuerpos biespecíficos recientemente publicados también se expresan en el periplasma de E. coli (Müller, FEBS Letters 422 (1998), 259-264) aún deben demostrar su factibilidad de producción a gran escala. En cuanto a la expresión funcional de construcciones de anticuerpos bifuncionales pequeñas que comprenden al menos una parte que no es inmunoglobulina, tan sólo las células huésped de mamíferos cumplen todos los requerimientos de expresión. Esto es debido a que las porciones no inmunoglobulina tal como los dominios extracelulares de los receptores celulares están a menudo glicosilados y frecuentemente rebasan los sitios de unión antígeno-Ig en la complejidad estructural. A diferencia de los sistemas mamíferos, los sistemas de E. coli, levaduras o baculovirus no cumplen o sólo cumplen parcialmente estos requerimientos.

Por ejemplo, muchos de los carbohidratos N-enlazados de las glicoproteínas de vertebrados no se encuentran en E. coli (por ejemplo ácido siálico). Estos carbohidratos tienen importantes funciones en el reconocimiento célula-célula, adhesión o función de la proteína. Además, la O-glicosilación que también ocurre en E. coli es fundamentalmente diferente al proceso de O-glicosilación de mamíferos desde que, inter alia, se añaden diferentes carbohidratos.

Tal como se ha demostrado por otros (Gerstmayer, J. Immunol. 158 (1997), 4584-4590), un formato apropiado para la expresión de tales construcciones de anticuerpos bifuncionales comprendiendo partes no inmunoglobulina en células huésped mayores es el formato de cadena única. Mientras que el formato de cadena única conlleva un número de ventajas significativas, generalmente se cree que muchas partes no inmunoglobulinas comprendidas aquí requieren el extremo N-terminal nativo en moléculas de cadena simple bifuncionales con el fin de mantener su función. Como consecuencia, el lugar de unión antígeno-Ig en una cadena única tal se debe poner en el extremo C-terminal. No obstante, en tales construcciones la actividad de unión del antígeno en la posición C-terminal se pierde a menudo (ver Ejemplo 8). Esto permite verificar aún cuando se usa el sistema de expresión mamífero ventajoso. Por lo tanto se debe concluir, que el sistema de cadena única no proporciona un formato aplicable generalmente para la expresión funcional de construcciones de anticuerpos bifuncionales.

Por lo tanto, el problema técnico subyacente en la presente invención fue desarrollar un formato molecular para la expresión de construcciones de anticuerpos bi- y multifuncionales que sea generalmente aplicable para las combinaciones de cualquier fragmento dado de scFv-anticuerpo opcionalmente en combinación con diferentes porciones no inmunoglobulina. La solución a este problema técnico se resuelve proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un compuesto multifuncional, producido en una célula huésped de mamíferos como un heterodímero totalmente funcional y secretable de dos cadenas de polipéptidos, en donde una de dichas cadenas de polipéptidos comprende, como único dominio de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina el dominio C_{H}1 y la otra cadena de polipéptido comprende el dominio C_{L} constante de una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde dichas cadenas de polipéptido además contienen fusionado a dicho(s) dominio(s) de región constante al menos dos y hasta cuatro (poli)péptidos que tienen diferentes funciones ligando o receptor, en donde además al menos dos de dichos (poli)péptidos diferentes carecen de afinidad intrínseca uno por el otro y en donde dichas cadenas de polipéptido están unidas mediante dichos dominios constantes.

El término "compuesto multifuncional" tal como se usa aquí denota un compuesto que comprende dos cadenas de polipéptidos, en donde dicho compuesto comprende al menos dos dominios funcionales que confieren diferentes funciones. Tales compuestos multifuncionales incluyen, por ejemplo, heterominicuerpos bi-, tri-, o tetraespecíficos. El término "heterominicuerpo" indica un heterodímero de dos cadenas de polipéptido diferentes en donde los dominios que median la heterodimerización consisten tan sólo de los dominios de la región constante de inmunoglobulina. C_{H}1 y C_{L}.

El término "dominios, con una función ligando o receptor" de acuerdo con la presente invención denotan dominios funcionales que comprenden una estructura tridimensional capaz de unirse o interactuar específicamente con una molécula. Tales moléculas pueden ser, pero no se limitan a, péptidos o polipéptidos y sus posibles modificaciones post-traduccionales. Estas modificaciones post-traduccionales comprenden, pero no se limitan a glicosilaciones (N- y/o O-glicosilaciones), sulfatación de tirosina, fosforilación y/o hidroxilación de prolina.

El término "totalmente funcional" indica, de acuerdo con la presente invención, que los compuestos de la invención secretados por las células huésped de mamíferos en el sobrenadante del cultivo en contraposición a por ejemplo las proteínas expresadas como cuerpos de inclusión en E. coli no requieren ningún repliegue de la proteína tras la purificación; todas las subunidades de los compuestos de la invención están correctamente plegadas y expresan así sus funciones específicas simplemente estando expresados en y secretados por células huésped de mamíferos.

Así, la presente invención proporciona un compuesto multifuncional que comprende dos cadenas de polipéptido diferentes en donde una heterodimerización eficiente de dichas cadenas de polipéptido durante los procesos de expresión y secreción en células huésped de mamíferos está mediado por la interacción de los dominios de la región constante específicados anteriormente de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina.

La heterodimerización de los dominios de inmunoglobulina constantes permite la interacción de al menos dos cadenas de (poli)péptidos diferentes adicionales unidas a éstos sin ninguna afinidad intrínseca uno por el otro en un sistema de expresión en mamíferos simple permitiendo además modificaciones post-traduccionales relevantes y conduciendo a un compuesto secretable de elevada complejidad estructural.

Los dominios del compuesto multifuncional de la presente invención, con una función receptor o ligando también pueden estar unidas al extremo C- y N-terminal de uno o ambos dominios de inmunoglobulina constantes. Por lo tanto, la presente invención proporciona compuestos multifuncionales, que pueden comprender moléculas bi-, tri- o tetrafuncionales, en donde cada una de dichas funciones ligando o receptor pueden estar unida también al extremo C- o N-terminal de dichos dominios de inmunoglobulina constantes.

La unión de dichos dominios funcionales a los dominios de inmunoglobulina constantes se puede obtener, por ejemplo mediante ingeniería genética, tal como se describe en los ejemplos. Los métodos para preparar cadenas de polipéptidos fusionadas y operativamente enlazadas y expresar éstas en células de mamíferos son bien conocidas en el campo (por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Tal como se ha detallado anteriormente, la solución a varios problemas relacionados con el campo anterior encontró ser un formato molecular que consiste de dos cadenas de polipéptidos diferentes, en donde una cadena de polipéptido contiene el dominio C_{H}1 de una cadena pesada de inmunoglobulina y la otra cadena de polipéptido contiene el dominio constante de una cadena ligera de inmunoglobulina, mediando así una heterodimerización eficiente de dichas cadenas de polipéptido durante el proceso de secreción y expresión en células huésped de mamíferos. Este formato molecular proporciona ventajosamente dos posiciones N-terminal en contraste con el formato de cadena única anterior y demuestra ser eficientemente secretada por células huésped de mamíferos en el sobrenadante del cultivo, donde se encontró como una proteína heterodimérica adecuadamente glicosilada y totalmente funcional que se pudo purificar fácilmente.

Además, el formato molecular de la invención proporciona adicionalmente dos posiciones C-terminales que se pueden ocupar por otros dominios de proteínas resultando así en un compuesto multifuncional que lleva más de dos entidades funcionales diferentes. En el caso que los dos (poli)péptidos diferentes no se tiendan a asociar bajo las condiciones nombradas anteriormente se unen al extremo N-terminal de los dominios de la región constante, entonces cada extremo C-terminal de dichos dominios de región constante son la región V_{H} y V_{L}, respectivamente, se pueden encontrar. Identificar los dominios de heterodimerización apropiados que cumplen los criterios mencionados no fue una tarea trivial desde que las estrategias para obtener una heterodimerización preferencial en sistemas de expresión en huésped único preferiblemente de dos ligandos o receptores diferentes sin ninguna afinidad intrínseca uno por el otro usando dominios de heterodimerización falló previamente o aún se ha de desarrollar. Los dominios de heterodimerización basados en cremalleras de leucina, por ejemplo, demuestran facilitar la heterodimerización en sistemas de expresión en huésped único de las cadenas de polipéptido que, aunque muy débilmente (Chang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 11408-11412; Kalandadze, J.Biol.Chem. 271 (1996), 20156-20162) intrínsecamente tienden a heterodimerizarse una con la otra como las cadenas \alpha y \beta de los receptores de los linfocitos T o las moléculas II de la clase MHC. No obstante, en los casos de dos proteínas diferentes sin ninguna afinidad intrínseca de una por la otra o con algo de afinidad intrínseca una por la otra pero sin ninguna preferencia de heterodimerización, tal como por ejemplo los dos sitios de unión del antígeno diferentes en los anticuerpos biespecíficos heterodiméricos, homodímeros producidos cuantitativamente con dominios basados en jun y fos en lugar de heterodímeros en sistemas de expresión de huésped único (de Kruif, J. Biol. Chem. 271 (1996), 7630-7634). Tales homodímeros jun y fos se pueden disociar in vitro, mezclar y someter a condiciones para facilitar la reasociación, que volvieron a un resultado principalmente de heterodímeros jun-fos (Kostelny, J. Immunol. 148 (1992), 1547-1553). Un ejemplo que ocurre en la naturaleza de heterodimerización de proteínas se encuentra en las inmunoglobulinas, donde las cadenas pesada y ligera se asocian para formar los sitios de unión del antígeno. En la molécula de anticuerpo, la heterodimerización de los dominios de la región variable V_{L} y V_{H} que tienen una afinidad intrínseca una por la otra, se facilita por los dominios de la región constante C_{L} y C_{H}1. Así, no fue sorprendente que C_{L} y C_{H}1 pudieran también soportar la dimerización de los fragmentos scFv (Müller, FEBS Letters 422 (1998), 259-264), debido a que los fragmentos scFv también se conoce que forman dímeros uno con el otro aún sin el apoyo de ningún dominio de dimerización especial (Korff, Eur. J. Biochem. 221 (1994), 151-157; Griffiths, EMBO J. 12 (1993), 725-734). La dimerización autóctona de los fragmentos scFv es mayormente debida a la rotura de las regiones hidrofóbicas en la interfície del dominio constante/variable del anticuerpo, conduciendo a una exposición al solvente de los residuos que normalmente subyacen en las inmunoglobulinas intactas o fragmentos Fab (Nieba, Protein Eng. 10 (1997), 435-444). Así, C_{L} y CH_{1} de acuerdo con los antecedentes, de forma similar a los dominios jun y fos, se conoce que apoyan al proceso de dimerización autóctono de los polipéptidos con una afinidad intrínseca de uno por el otro, favoreciendo así la formación de heterodímeros sobre homodímeros. El logro de la presente invención, no obstante, permite la heterodimerización de dos cadenas de (poli)péptido diferentes sin ninguna afinidad intrínseca una por la otra en un sistema de expresión de huésped único en donde dichos (poli)péptidos se fusionan con dichos dominios de región constante.

Así, se encontró sorprendentemente que C_{L} y C_{H}1 (solos por ellos mismos) pueden proporcionar suficientes fuerzas de dimerización capaces de unir diferentes receptores o ligandos (por ejemplo CD80 y el fragmento M79scFv, ver Ejemplo 1) que normalmente no se asocia autóctonamente o puede, en algún grado, resistir aún la heterodimerización por razones estéricas o termodinámicas. Por lo tanto, el logro de la presente invención permite la heterodimerización de dos cadenas diferentes de (poli)péptidos sin ninguna afinidad intrínseca una por la otra en un sistema de expresión de huésped único en donde dichos (poli)péptidos se unen a dichos dominios de región constante. Este logro cumple en los más importante la expresión funcional y los requerimientos de secreción de las células huésped de mamíferos, permitiendo así compuestos multifuncionales (del tipo bi-, tri- o tetrafuncionales) basados en heterodimerización que pueden ser glicosilados y de una elevada complejidad estructural. Identificar los dominios de oligomerización que generalmente cumplen los requerimientos de expresión y secreción de las células huésped de mamíferos no fue mediante métodos obvios, desde que la viabilidad de tales dominios en los sistemas de expresión bacteriana se volvieron no predecibles por su viabilidad en células huésped mamíferas. Los resultados mostrados en el Ejemplo 9 ilustran esta inconsistencia general.

Sorprendentemente se encontró en la presente invención, tal como se demuestra en los ejemplos, que el formato molecular de la invención designado "heterominicuerpo" demuestra ser capaz de llevar a cabo varios y muy diferentes (hasta 4) polipéptidos con una función receptor o ligando unida al extremo N- y/o C-terminal de C_{L} o C_{H}1, sin perder la capacidad de producirse como una molécula totalmente funcional y secretable en células huésped de mamíferos.

Los derivados de anticuerpos bifuncionales descritos en los ejemplos 1-4 (las correspondientes realizaciones de los cuales se describen además a continuación) y producidos de acuerdo con el formato molecular de la invención consisten de un fragmento de anticuerpo scFv dirigido contra el antígeno asociado al tumor, por ejemplo 17-1A o LewisY, y la parte extracelular de los receptores celulares (por ejemplo CD80, CD86, CD58, CD54) expresados principalmente en las células presentadoras de antígenos por ejemplo células dendríticas conocidas por su función de adhesión y/o coestimuladora de los linfocitos T. Uno de estos derivados de anticuerpos bifuncionales, el heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 se ensayó extensivamente por su actividad funcional. La molécula recombinante demostró unirse a su antígeno diana nativo 17-1A en células intactas y se halló sorprendentemente que a continuación proporcionaba no tan sólo la señal coestimuladora necesaria para los linfocitos T sencillos por virtud de su brazo CD80(B7-1) sino que también mediaba la coestimulación suficiente con el fin de cebar los linfocitos T CD4+ y CD8+ sencillos, que simultáneamente reciben la primera señal de activación mediante un anticuerpo de cadena simple biespecífico anti-17-1A x anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7021-7025) además designado M79scFv-antiCD3scFv. Los actos de cebo podrían demostrarse claramente por activación del fenotipo de superficie del linfocito T a partir de aquellos sencillos (CD45RA+R0-) a aquellos linfocitos T cebados (CD45RA-RO+) y podrían confirmarse por determinación de las citocinas características en el sobrenadante de los linfocitos T. La secreción exclusiva de INF-\gamma pero no de IL-5 e IL-4 por linfocitos T CD4+ cebados in vitro además demuestran con interés, que el heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 media selectivamente la cebación y diferenciación de los linfocitos T CD4+ que expresan el fenotipo TH1, que se concibe por aumentar ventajosamente la respuesta inmune celular contra las células tumorales in vivo. Otras construcciones B7 (CD80 o CD86) específicas de tumor bifuncionales descritas en la literatura, no han demostrado nunca proporcionar suficiente coestimulación para cebar los linfocitos T sencillos (Gerstmayer, J. Immunol. 158 (1997), 4584-4590; Chalita-Eid, J. Immunol. 160 (1998), 3419-3426). Se concibe que dichas construcciones de heterominicuerpos coestimuladoras se pueden aplicar in vivo solas o en combinación con un anticuerpo biespecífico que proporcione la señal de activación de linfocitos T primarios independiente del receptor de linfocitos T clonotípico. Además se concibe que dicha combinación puede alcanzarse combinando características estructurales de ambas moléculas en un compuesto multifuncional de acuerdo con el formato molecular de la invención tal como se describe en el ejemplo 7 y se muestra en figura 23.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un compuesto multifuncional que consiste de dos cadenas de polipéptido, en donde una de dichas cadenas de polipéptido comprende, como único dominio de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina el dominio C_{H}1 y la otra cadena de polipéptidos comprende el dominio constante C_{L} de una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde dichas cadenas de polipéptido además comprenden, fusionados a dichos dominios de la región constante al menos dos (poli)péptidos con diferentes funciones ligando o receptor, en donde además al menos dos de dichos diferentes (poli)péptidos carecen de afinidad intrínseca uno por el otro y en donde dichas cadenas de polipéptido están unidas mediante dichos dominios constantes. Favorablemente, dicho compuesto multifuncional es producible en una célula huésped de mamíferos como un heterodímero secretable y totalmente funcional.

En una realización preferida, el compuesto multifuncional de la presente invención comprende al menos tres dominios funcionales, con función receptor o ligando, proporcionando un heterominicuerpo tri-específico.

En una realización más preferida, el compuesto multifuncional de la presente invención comprende cuatro dominios, con función receptor o ligando, proporcionando un heterominicuerpo/compuesto multifuncional con dominios efectores presentes en todas las cuatro posiciones. Tal compuesto multifuncional puede ser bi-, tri- o tetra-específico.

La presente invención además se refiere, en otra realización preferida, al compuesto multifuncional de la presente invención, en donde al menos dos dominios, con función ligando o receptor, están unidas por el extremo N-terminal a dichos dominios C_{H}1 o C_{L} constantes. Además, la presente invención se refiere en aún otra realización preferida al compuesto multifuncional de la invención, en donde al menos dos dominios con función receptor o ligando, están unidos por el extremo C-terminal a dichos dominios C_{H}1 o C_{L}. En el caso que C_{H}1 y/o C_{L} no tengan dominios de ligando o receptor en su extremo N-terminal deben llevar un péptido líder N-terminal preferiblemente derivado de las cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulina con el fin de facilitar la secreción por células huésped de mamíferos.

Todas las anteriores realizaciones conciben heterominicuerpos/compuestos multifuncionales en donde dos o más dominios efectores/dominios funcionales se unen por los extremos N- o C-terminales al mismo dominio (C) constante. Por ejemplo, si cada posición N- o C-terminal de dichos dominios C está ocupada por un dominio efector/funcional entonces uno o más dominio(s) efectores/funcionales se pueden fusionar a cada uno de dichos dominios efectores en dicha posición. Un ejemplo de este tipo de construcción se proporciona en la Figura 52.

En el caso que los polipéptidos con funciones ligando o receptor consistan de las partes extracelulares de proteínas de transmembrana integrales de tipo I o tipo II se prefiere que las partes extracelulares de ls proteínas de membrana de tipo I se unan al extremo N-terminal de C_{L} o C_{H}1 mientras que las partes extracelulares de las proteínas de tipo II se unen preferiblemente al extremo C-terminal de C_{L} o C_{H}1.

Los polipéptidos con función receptor o ligando se unen preferiblemente a los extremos N- o C-terminales de C_{L} o C_{H}1 mediante regiones Ig-Bisagra o péptidos enlazantes flexibles por ejemplo vía una unión Glicina-Serina con el fin de asegurar la funcionalidad de dichos polipéptidos. Uniones de diferentes tipos o longitudes se pueden identificar sin carga inmerecida para obtener una actividad funcional completa de polipéptidos específicos.

En aún otra realización preferida, la invención se refiere al compuesto multifuncional de la invención, en donde al menos uno de dichos dominios, con función ligando o receptor, está en el formato de un fragmento scFv o una parte funcional del mismo.

El compuesto multifuncional de la invención, en donde al menos uno de dichos dominios, con función ligando o receptor, es un ligando co-estimulador de linfocitos T, una región de unión a antígeno específica para un antígeno asociado a un tumor, o un compuesto proteínico que proporciona la señal de activación primaria para los linfocitos T, es aún otra realización preferida de la invención.

La activación adecuada resultante en el cebo de los linfocitos T sencillos es crítica para las inmunorespuestas primarias y depende de las dos señales derivadas a partir de APC (células presentadoras de antígenos) profesionales del tipo células dendríticas. La primera señal es específica de antígeno y normalmente está mediada por la estimulación del receptor de antígeno de linfocito T clonotípico que está inducido por el antígeno procesado presentado en el contexto de moléculas MHC de clase I o MHC de clase II. No obstante, el estímulo primario es insuficiente para inducir respuestas de cebo de los linfocitos T sencillos, y se requiere la segunda señal que se proporciona por una interacción de las moléculas de superficie de los linfocitos T específicos unidos a moléculas ligando co-estimuladoras en las células presentadoras de antígeno, apoyando además la proliferación de los linfocitos T cebados. El término "ligando coestimulador de linfocitos T" por lo tanto aportan luz a las moléculas de la presente invención, que son capaces de apoyar el cebo de los linfocitos T sencillos en combinación con el estímulo primario e incluyen, pero no se limitan a, miembros de la familia B7 de proteínas, incluyendo B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86).

Una región de unión de antígeno específica para un antígeno asociado a un tumor denota fragmentos de anticuerpos dirigidos contra antígenos asociados a tumor conocidos en el campo, por ejemplo 17-1A o Lewis Y, Muc-1, erbB2 o s-Tn.

En el esclarecimiento de la presente invención, los "compuestos proteínicos" que proporcionan la señal de activación primaria para los linfocitos T puede comprender, pero no limitarse a, fragmentos svFv anti-CD3, fragmentos svFv del receptor anti-linfocito T o superantígenos. Los superantígenos se unen directamente a ciertas subfamilias de las regiones variables de los receptores de linfocitos T de un modo MHC independiente mediando así la señal de activación de linfocitos T primaria.

Además, en aún otra realización preferida, la invención se refiere al compuesto multifuncional de la invención, en donde dicho fragmento scFv o dicha parte funcional del mismo comprende las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo M79 anti 17-1A de ratón (Göttlinger, Int. J. Cancer 38 (1986), 47), las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo anti-Lewis Y tal como se muestra en la Figura 6, las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo TR66 anti-CD3 (Traunecker, EMBO J.10 (1991) 3655) y/o las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo EpCAM anti-humano humano tal como se muestra en la Figura 55 (basándonos en el correspondiente anticuerpo EpCAM anti-humano humano "HD 70" tal como se describe en WO 98/46645).

En una realización más preferida, la invención se refiere al compuesto multifuncional de la invención, en donde el ligando co-estimulador de linfocitos T es una molécula de superficie celular o un fragmento de la misma expresado en las células presentadoras de antígenos (APC).

En aún otra realización más preferida, el compuesto multifuncional de la invención comprende una célula presentadora de antígeno, que es una célula dendrítica.

Además, en una realización más preferida, la presente invención se refiere al compuesto multifuncional de la invención, en donde la molécula de superficie celular en una APC es un factor co-estimulador de linfocitos T del tipo B7-1 (CD80) o B7-2 (CD86), o proteínas de adhesión del tipo LFA-3 (CD58), ICAM-1 (CD54), ICAM-2 o ICAM-3 o del tipo ligando CD137.

El compuesto multifuncional de la invención, en donde al menos uno de dichos dominios, con la función receptor o ligando, es una molécula efectora inmunomoduladora o un fragmento de la misma, es también otra realización preferida de la invención. Una molécula efectora inmunomoduladora influencia positivamente y/o negativamente el sistema inmune celular y/o humoral, particularmente sus componentes celulares y/o no celulares, sus funciones, y/o sus interacciones con otros sistemas fisiológicos.

En aún otra realización más preferida, dicha molécula efectora inmunomoduladora se selecciona de un grupo consistente en citocinas, quimiocinas, factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF; tal como se describe, inter alia, en Bernhagen (1998), Mol Med 76(3-4); 151-61 o Metz (1997), Adv Immunol 66, 197-223), los receptores de linfocitos T y moléculas MHC solubles. Tales moléculas efectoras inmunomoduladoras son bien conocidas en el campo y se describen, inter alia, en Paul, "Fundamental immunology", Raven Press, New York (1989). En particular, citocinas y quimiocinas conocidas se describen en Meager, "The Molecular Biology of Cytokines" (1998), John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, West Sussex, England; Bacon (1998). Cytokine Growth Factor Rev 9(2):167-73; Oppenheim (1997). Clin Cancer Res 12, 2682-6; Taub, (1994) Ther Immunol 1(4), 229-46 o Michiel, (1992). Semin Cancer Biol 3(1), 3-15).

Particularmente preferidas son las citocinas que se seleccionan del grupo consistente de interleucina(s), interferon(es), TNF(s), y VEGF (Veikkola Semin Cancer Biol 9(3), 211-20), en donde dichas interleucina(s) comprenden, pero no se limitan a IL-1\alpha, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 y IL-18, en donde interferon(es) comprende IFN-\gamma así como IFN-\beta e IFN-\alpha y en donde TNF(s) comprende miembros de la superfamilia de las linfotoxinas tipo TNF-\alpha y TNF-\beta (Gruss (1996) Int J Clin Lab Res 26(3), 143-59). Otras citocinas adecuadas son bien conocidas en el campo y comprenden, inter alia, GM-CSF, G-CSF, M-CSF. En una realización particularmente preferida, dicha molécula efectora inmunomoduladora es una quimiocina y se selecciona del grupo consistente de IL-8, Eotaxina, GRO\alpha, GRO\beta, GRO\gamma, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIG, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, NAP-2, RANTES, I309, Linfotactina, SDF-1 y C5a.

En el alcance de la presente invención se encuentran además compuestos multifuncionales, en donde dichos dominios comprenden, inter alia, diferentes moléculas efectoras inmunomoduladoras, opcionalmente, en combinación con dominios que están en el formato de fragmento(s) scFv. Particularmente preferidos son los compuestos multifuncionales que pueden comprender un heterominicuerpo con citocinas unidas en el extremo C-terminal, del tipo IL-2 y GM-CSF, scFv unido al extremo N-terminal reconociendo, por ejemplo, EpCAM tal como se ilustra en los ejemplos indexados. Estas moléculas no se limitan a la activación de células efectoras que se activan específicamente por una citocina simple. Mediante adición de dos dominios funcionales, con función de ligando y que comprenden dos citocinas diferentes, este componente multifuncional puede ser útil en la activación de un amplio espectro de células efectoras en el entorno de un tumor. Estas células efectoras pueden por lo tanto ser estimuladas para evocar una respuesta inmune contra las células tumorales (alrededores) y/o células afectadas por un crecimiento celular maligno. Estas construcciones retienen sus actividades biológicas propias tal como se ilustra aquí en el ejemplo 11 y puede tener aplicación en la terapia y/o prevención del crecimiento celular maligno.

En aún otra realización preferida, la presente invención se refiere al compuesto multifuncional de la invención, en donde al menos uno de dichos dominios, con función receptor o ligando, es un ligando FAS (CD95L) o un fragmento del mismo. El ligando FAS (CD95L) es bien conocido en el campo y se describe, inter alia, en Janeway and Travers, "Immunologie", Spektrum Verlag Heidelberg, Berlin, Oxford (1997).

Además, en aún otra realización preferida la presente invención se refiere al compuesto multifuncional de la invención, en donde dicho dominio(s) con función receptor o ligando, es un factor de crecimiento o un fragmento del mismo. Dicho factor de crecimiento puede además ser un factor de crecimiento modificado con una actividad de unión a su receptor relevante pero puede actuar como antagonista. Desde que muchos tumores u otras células (que pueden ser diana(s) para los compuestos multifuncionales aquí descritos), expresan receptores para factores de crecimiento en su superficie aquellos tipos de molécula pueden ser útiles en la señalización. Los factores de crecimiento comprenden, pero no se limitan a, EGF (factor de crecimiento epidérmico) ligandos de la familia de receptores ErbB, MSH, interleucina 1 (IL-1). Además, los factores de crecimiento y modificaciones de los mismos se conocen en el campo y se describen, inter alia, en Gullick (1996) Cancer Surv.27, 339-49; Siegall (1996) Recent Results Cancer Res 140, 51-60; Carrithers 1996 Chem Biol 3(7), 537-42 o Bresnihan (1998) Rheum Dis Clin North Am 24(3);615-28.

Además, en una realización más preferida, la presente invención se refiere al compuesto multifuncional de la invención, en donde dicho dominio(s), con función receptor o ligando, es un inhibidor de la angiogénesis (tal como se define en, inter alia, Malonne (1999) Clin Exp Metastasis 17(1), 1-14; Veikkola (1999) Semen Cancer Biol 9(3), 211-20; Desa (1999), J Immunother 22(3), 186-211; Strohmeyer (1999) Anticancer Res 19 (2C), 1557-61; Folkman (1995) Nat Med 1 (1), 27-31) o un fragmento del mismo.

Preferiblemente, el compuesto multifuncional de la invención comprende dominios funcionales, con función ligando o receptor, que son de origen mamífero. Más preferiblemente, dichos dominios funcionales son de origen humano.

El compuesto multifuncional de la invención, donde dicho dominio constante de una cadena ligera de inmunoglobulina es de tipo \kappa, es otro aspecto de la presente invención. Opcionalmente, el dominio constante de una cadena ligera de inmunoglobulina puede ser de tipo \lambda.

En todavía otra realización, la presente invención se refiere a compuestos multifuncionales de la invención, donde dicho dominio de inmunoglobulina constante y los dominios del ligando-receptor funcional descritos anteriormente se conectan por un enlazante polipeptídico. Este enlazante polipeptídico, dispuesto entre los dominios de inmunoglobulina y los dominios ligando-receptor funcional preferiblemente comprenden aminoácidos unidos a péptidos, hidrofílicos, plurales que están unidos covalentemente a estos dominios.

En una realización más preferida, dicho enlazante polipeptídico comprende una región bisagra Ig o una pluraliad de glicina, alanina y/o serina.

En una realización preferida particularmente, dicha región bisagra Ig es una región bisagra IgG.

En una realización aún más preferida, la región bisagra IgG es la región bisagra superior de la IgG_{3} humana.

Preferiblemente, el compuesto multifuncional de la invención comprende un compuesto multifuncional, donde dichos dominios funcionales, con función ligando o receptor, contiene GM-CSF, IL-2 y/o fragmento(s) que comprenden las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo EpCAM antihumano humano, como se muestra en la Figura 55. Preferiblemente, dicho GM-CSF y dicha IL-2 están unidos por el extremo C-terminal a dichos dominios C_{H} y C_{L}y dichos fragmentos scFv que comprenden las regiones V_{H} y V_{L}del anticuerpo EpCAM antihumano humano están unidos por el extremo N-terminal a dichos dominios C_{H} y C_{L}.

Más preferiblemente dicho GM-SCF e IL-2 son de origen humano. Tal compuesto multifuncional es particularmente adecuado para propósitos diagnósticos y terapéuticos. Este compuesto multifuncional, comprende GM-SCF, IL-2 y dichos fragmentos scFv comprendiendo la región V_{H} y V_{L}del anticuerpo EpCAM antihumano humano se muestran en la Figura 53. Considerando que en este compuesto multifuncional todos los dominios, con función receptor o ligando, así como los dominios de heterodimerización son de origen humano, puede ser un valor especial y específico para el tratamiento o la prevención del crecimiento de células malignas. Tal compuesto multifuncional es potencialmente menos inmunogénico que una molécula similar que contiene dominios de otras especies. IL-2 humana y GS-CSF humana están en este contexto particularmente útil desde que estas citocinas son capaces de estimular una amplia y sobretodo una amplia gama de células efectoras. Una construcción como se describe en la Fig.53 es particularmente útil en el tratamiento del crecimiento celular maligno, especialmente para el tratamiento de tumores sólidos como carcinomas.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a los compuestos multifuncionales de la invención, donde dicho dominio C_{H}1 además comprende una marca histidina, GST, una marca de proteína A de Staphylococcus, Lex A, una marca FLAG o una marca MYC. Estas secuencias adicionales, capaces de unirse selectivamente a un soporte sólido o usadas para propósitos de purificación, podría ser también cualquiera de las secuencias polipeptídicas de longitud completa o fragmentos de las mismas. Debido al hecho que estas marcas se fusionaron al dominio C_{H}1, el compuesto multifuncional completo puede ser aislado convencionalmente.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un compuesto multifuncional, en donde dichos dominios funcionales, que tienen función receptor o ligando es o es una forma derivada de un dominio de no inmunoglobulina. El término "forma derivada" significa en este contexto que la molécula de aminoácido de dicho dominio no inmunoglobulina puede comprender sustitución(es), delección(es), adición(es), inversión(es), duplicación(es), recombinaciones, etc.

Aparte de esto, la presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica una y/o dos cadenas polipeptídicas del compuesto multifuncional tal como se define aquí anteriormente.

Dicho polinucleótido puede fusionarse a secuencias de control de expresión adecuadas conocidas en el campo para asegurar la trascripción correcta y traducción de la cadena polipeptídica. Dicho polinucleótido puede ser por ejemplo, DNA, cDNA, RNA o DNA o RNA producido sintéticamente o una molécula de ácido nucleico quimérica producido por recombinación que comprende cualquiera de aquellos polinucleótidos solos o en combinación. Preferiblemente dicho polinucleótido es parte de un vector. Tales vectores pueden comprender más genes como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula del huésped adecuada y bajo condiciones adecuadas. Preferiblemente, el polinucleótido de la invención se une operativamente a las secuencias de control de expresión permitiendo la expresión en las células eucariotas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un mRNA traducible. Los elementos reguladores aseguran la expresión en las células eucariotas, preferiblemente células de mamífero, son bien conocidas por aquellos experimentados en el campo. Usualmente comprenden secuencias reguladoras que aseguran la iniciación de la trascripción y opcionalmente las señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales, y/o regiones del promotor heterólogas o asociadas naturalmente. Elementos de regulación posibles que permiten la expresión en células huésped de mamíferos comprenden los promotores CMV, SV40, RSV (virus de sarcoma Rous), 1\alpha-promotor del factor de elongación humano, potenciador CMV o potenciador SV40. Al lado de los elementos que son responsables de la iniciación de la trascripción tales elementos reguladores podrían contener también señales de terminación de la transcripción, como el sitio SV-40-poli-A o el sitio tk-poli-A, corriente abajo del polinucleótido. En este contexto, vectores de expresión adecuados son conocidos en el campo como el pcDV1 vector de expresión del cDNA Okayama-Berg (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (in-vitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL), pEF-DHFR (Mack, PNAS 92 (1995), 7021-7025). Preferiblemente, las secuencias de control de expresión serán sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped de mamíferos. Una vez el vector ha sido incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones adecuadas para el mayor nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos, y, como es deseado, podría seguir con la recolección y purificación del polipéptido de la invención.

Un vector que comprende al menos uno de los polinucleótidos mencionados anteriormente es otra cuestión de la presente invención.

El vector de la presente invención puede ser por ejemplo, un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector usado convencionalmente en ingeniería genética, y puede comprender más genes como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula huésped adecuada y bajo condiciones adecuadas.

En otra realización, la presente invención se refiere a una célula huésped de mamíferos que comprende al menos un vector de la presente invención.

En una realización preferida, la célula huésped de mamíferos de la invención es una célula CHO o una célula de mieloma.

Además, la presente invención se refiere a un método de producción del compuesto multifuncional de la invención, este método comprende cultivar la célula huésped de la presente invención bajo condiciones que permiten la síntesis de dicho compuesto multifuncional, y la recuperación de dicho compuesto multi-funcional del cultivo.

Así, la presente invención permite la producción recombinante de compuestos multifuncionales que comprenden sitios y dominios de los ligandos co-estimuladores de linfocitos-T, regiones de unión al antígeno específicas para un antígeno asociado a tumor o compuestos proteínicos que suministran la primera señal de activación para los linfocitos-T. Como es evidente a partir de lo anterior, la invención suministra una gran familia de multifuncionales que comprenden funciones receptor-ligando para cualquier uso en objetivos diagnósticos y terapéuticos.

Será aparente para aquellos experimentados en el campo que los compuestos multifuncionales de la invención se pueden acoplar además a otras porciones, por ejemplo, fármacos señalizadores o aplicaciones de imagen de diagnóstico. Tal acoplamiento podría conducirse químicamente después de la expresión del compuesto multifuncional o de la expresión de las cadenas de polipéptidos de la invención o el producto de acoplamiento podría diseñarse en los polinucleótidos de la invención como se discute aquí anteriormente. Los polinucleótidos luego se expresaron en un sistema huésped adecuado y el compuesto multifuncional expresado se recogió y purificó, si es necesario.

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición que comprende un compuesto multifuncional de la presente invención, el polinucleótido de la invención y/o el vector de la invención y, opcionalmente, un compuesto proteínico capaz de suministrar la señal de activación primaria para los linfocitos-T. Más preferiblemente, dicha composición es una composición farmacéutica que comprende además, opcionalmente un vehículo aceptable farmacéuticamente y/o diluyente y/o excipiente. De acuerdo con la presente invención, los compuestos proteínicos capaces de suministrar la señal de activación primaria para los linfocitos-T en composiciones de diagnóstico y/o farmacéuticas son anticuerpos biespecíficos o monoespecíficos que interactúan con el complejo CD-3, el receptor de linfocitos-T así como compuestos que incluyen un superantígeno.

Una composición de diagnóstico que comprende un compuesto multifuncional de la invención, el polinucleótido de la invención y/o el vector de la invención y, opcionalmente, un compuesto proteínico capaz de suministrar la señal de activación primaria para los linfocitos-T y, opcionalmente, medios adecuados para la detección, es otro asunto de la presente invención.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al uso de los compuestos multifuncionales de la invención, el polinucleótido de la invención y/o el vector de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir y/o tratar un crecimiento celular maligno.

En una realización preferida particularmente, la presente invención se refiere al uso descrito anteriormente, donde el crecimiento celular maligno se refiere a la malignidad de las células hematopoyéticas o a tumores sólidos.

En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere al uso de la invención, donde dichas malignidades de las células hematopoyéticas son linfomas o leucemias.

En una realización más preferida, sin embargo, la presente invención se refiere al uso de la presente invención, donde dichos tumores sólidos son carcinomas, melanomas o sarcomas.

Un equipo que comprende el compuesto multifuncional de la invención y, opcionalmente, un compuesto proteínico capaz de suministrar la señal de activación primaria para los linfocitos-T, es también objeto de la presente invención.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a la composición farmacéutica de la invención, a la composición de diagnóstico de la invención o al equipo de la invención, donde el compuesto proteínico capaz de suministrar la señal de activación primaria para los linfocitos-T es un anticuerpo biespecífico que interactua con el antígeno CD3 del linfocito-T.

La composición farmacéutica de la presente invención podría comprender además un vehículo aceptable farmacéuticamente, diluyentes y excipientes. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados, diluyentes y excipientes son bien conocidos en la materia e incluyen soluciones salinas de tampón de fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones oleosa/acuosa, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles etc. Las composiciones que comprenden tales vehículos pueden formularse por métodos convencionales conocidos. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser administradas al sujeto a una dosis adecuada. Sustancias activas farmacéuticamente proteínicas pueden estar presentes en cantidades entre 1 ng y 10 mg por dosis. La administración de composiciones adecuadas se pueden efectuar por diferentes vías, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o administración intradérmica. El régimen de dosis se determinará por el médico que atiende y otros factores clínicos. Como es bien conocido en el campo clínico, la dosis para cualquier paciente depende de varios factores, incluyendo la talla de los pacientes, la superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, el estado de salud general, y los fármacos que se administran al mismo tiempo.

A través de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo indique de otro modo, la palabra "comprende", y variaciones como "comprenden" y "comprendiendo" se entenderán para implicar la inclusión de un estado íntegro o un paso o un grupo de íntegros o pasos pero no la exclusión de cualquiera íntegro o paso o grupo de íntegros o paso.

Las Figuras muestran:

Figura 1: Diseño molecular del heterominicuerpo M79scFvCH1/CD80CK mostrado en el nivel de proteína. C_{H}1 y CK indican el primer dominio constante de la cadena pesada IgG1 humana y la región constante de la cadena ligera kapa de Ig humana respectivamente, que juntas forman la unidad de heterodimerización covalentemente unida juntas mediante un puente disulfuro (S-S). VH indica la región variable de la cadena pesada de Ig y VL la región variable de la cadena ligera-Ig.

	Diseño molecular (B-J)	de heterominicuerpos (B)
	M79scFvCK/CD80CH1 (C)	M79scFvCH1/CD54CK (D)
	M79scFvCK/CD54CH1 (E)	M79scFvCH1/CD58CK (F)
	M79scFvCK/CD58CH1 (G)	M79scFvCH1/CD86CK (H)
	M79scFvCK/CD86CH1 (I)	antiLeyscFv/CD80CK (J)

AntiLeyscFv/CD80CH1 mostrado en el nivel de proteína. Para detalles ver la leyenda de la Fig 1 (A).

Figura 2: Secuencia-DNA designada CTI que se clonó en el sitio de clonación múltiple del vector KS Bluescript (X52327 número de acceso GenBank) usando los sitios de restricción SaII y XbaI para incrementar el número de sitios de clonación posibles. Se muestran sitios de escisión de enzimas de restricción derivados de CTI.

Figura 3: El diseño molecular de la Fig.3 de fragmentos de DNA que codifican la cadena polipeptídica única de

	heterominicuerpos (A)	M79scFvCH1/CD80CK (B)
	M79scFvCK/CD80CH1 (C)	M79scFvCH1/CD54CK (D)
	M79scFvCK/CD54CH1 (E)	M79scFvCH1/CD58CK (F)
	M79scFvCK/CD58CH1 (G)	M79scFvCH1/CD86CK (H)
	M79scFvCK/CD86CH1 (I)	antiLeyscFvCH1/CD80CK (J)
	AntiLeyscFvCK/CD80CH1.

Notar que algunos heterominicuerpos comparten la misma cadena polipeptídica; en estos casos las cadenas de polipéptidos correspondientes se muestran sólo una vez. Los símbolos se usan como en las figuras 1(A) y 1(B), se indica el pEF-DHFR o pEF-ADA vectores de expresión usados para clonación y expresión de cadenas individuales. Lewis Y se abrevió como Ley.

Figura 4: El análisis ELISA de los sobrenadantes del cultivo celular obtenidos a partir de las células CHO transfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR-M79 scFv-CK pEFADA/CD80-CH1 tras diferentes pasos de amplificación y tras la subclonación. Placas de ELISA de 96 pocillos se incubaron con 50 \mul del antígeno 17-1 A solubles (50 \mug/mL) por pocillo. Posteriormente se añadió sobrenadante del cultivo celular puro como se indicó. La detección se realizó por anticuerpo marcado con biotina CK humana (Pierce, Cat. No. 31780) diluida 1: 1.000 y Avidina conjugada con peroxidasa (Dako, Hamburg Cat No. P0347) diluido 1:1.000. Como control negativo, los pocillos se incuban con tampón de fosfato. El ELISA se desarrolló mediante la solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA.

Figura 5: El análisis FACS del heterominicuerpo M79 scFv-CK/CD80- CH1 unido a células CHO transfectadas 17-1A. Se incubaron 200.000 (ver ejemplo 5.2) células CHO transfectadas 17-1A durante 30 minutos con varias diluciones de M79scFv-CK/CD80-CH1 en un rango desde 4 \mug/mL a 3,9 ng/mL. Después, las células se lavaron dos veces en PBS y se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo CD80 anti-humano de ratón conjugado con R-picoeritrina (Becton Dickinson Immunnocytometry Systems, San Jose CA, USA, Cat No. 340294). Después de dos pasos de lavado final en PBS, las células se analizaron por citometría de flujo (FACS-SCAN Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose CA, USA).

Figura 6: El DNA de la Fig.6 como secuencia de aminoácido del fragmento scFv antiLewisY que lleva una secuencia líder en su extremo N-terminal. Los nucleótidos a partir del 68 hasta el 394 codifican para la región variable de la cadena ligera de Ig, los nucleótidos del 440 hasta el 793 codifican para el dominio variable de la cadena pesada de Ig. Se indican los sitios de escisión del enzima de restricción importantes para la clonación.

Figura 7: El análisis ELISA de los sobrenadantes del cultivo celular obtenido a partir de dos transfectantes de células CHO diferentes, transfectado doblemente con cualquier plásmido de expresión pEF-DHFR-anti-Lewis Y-scFv-CK y pEFADA-CD80-CH1 o con pEFDHFR-CD80-CK y pEFADA anti-Lewis Y-scFv-CH1 después del primer paso de amplificación génica, respectivamente. Placas de ELISA de 96 pocillos se incubaron con 50 \mul de conjugado Y-BSA de Lewis soluble (30 \mug/mL) por pocillo. Posteriormente se añadió sobrenadante de cultivo celular puro del mismo tal como se indica. Se realizó la detección mediante un anticuerpo monoclonal específico CD80 (Immunotech, Cat No. 1449) diluido 1:1000 y un anticuerpo-IgG(Fc) anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa (Dianova Hamburg) diluido 1:5000. Como control negativo, los pocillos se incubaron con tampón de fosfato. El ELISA se desarrrolló mediante solución de substrato ABTS como se describió en el ejemplo 2.1. Se midieron los valores DO a 405 nm mediante un lector de ELISA. Se usó LeY como abreviación deL anti-Lewis Y scFv.

Figura 8: Análisis de ELISA de sobrenadantes del cultivo celular obtenidos a partir de dos transfectantes de células CHO diferentes, doble transfectados con cualquier plásmido de expresión pEF-DHFR-anti-Lewis Y-scFv-CK y pEFADA-CD80-CH1 O con pEFDHFR-CD80-C\kappa y p EFADA anti-Lewis Y-scFv-CH1 tras el primer paso de amplificación del gen, respectivamente. Se incubaron las placas de ELISA de 96 pocillos con 50 \mul de anticuerpo marcado anti-his BSA-libre (25 \mug/mL) por pocillo. Posteriormente se añadió el sobrenadante del cultivo celular puro como se indicó. La detección se realizó mediante anticuerpos CK anti-humanos marcados con biotina (Pierce, Cat. No. 31780) diluido 1:1000 y Avidina conjugada con peroxidasa (Dakko, Hamburg, Cat No. P0347) diluido 1:1.000. Como control negativo, los pocillos se incubaron con tampón de fosfato. El ELISA se desarrolló mediante una solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA. LeY se usó como abreviación de anti-Lewis Y scFv.

Figura 9: El ELISA en el sobrenadante del cultivo celular de ambas versiones de heterominicuerpo CD54, CD58, CD86, CD80 (detección específica).

La unión al antígeno 17-1 A se analizó usando el antígeno 17-1A recombinante obtenido por expresión estable en las células CHO tal como se describe (Mack et.al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995)4021-7025 y ejemplo 4.4). Se inmovilizó el antígeno en placas de ELISA de fondo en U de 96 pocillos (nunc maxisorb) a una concentración de tampón de fosfato PBS de 50 \mug /mL. El recubrimiento se llevó a cabo a 4ºC durante 12 horas con 50 \mul seguido de un lavado con (PBS) 0,05% de Tween. Se bloqueó el ELISA entonces durante 1 hora con PBS/Albúmina de suero bovino 3% (BSA) y lavado una vez más. Posteriormente, el sobrenadante del cultivo celular se añadió sin diluir y a varias diluciones (puro, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) y se incubó durante 2 horas. La detección específica dependió del tipo de proteínas coestimuladoras asociadas con la versión de heterocuerpo diferente. Se usaron anticuerpos específicos anti CD54, anti CD58, anti CD80 y anti CD86 todos se diluyeron a 1:1000 (para detalles mirar la tabla 4,4). Después de lavar tres veces con PBS 0,05% Tween20, un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa policlonal (Fc-específico) (Dianova Hamburg) diluido 1:5000 se añadió e incubó a temperatura ambiente durante una hora. Después de lavar cuatro veces con PBS 0,05% Tween 20, el ELISA se desarrolló finalmente añadiendo el substrato ABTS como se describe en el Ejemplo 4.4. Como control negativo, se incubaron las placas con PBS en vez de con construcciones de heterominicuerpo. El precipitado coloreado se midió a 405 nm usando un lector de ELISA.

Figura 10: ELISA en sobrenadantes del cultivo celular en ambas versiones de heterocuerpo CD80, CD86, CD58, CD54 (detección Ckappa anti humano). Un anticuerpo con marca anti-His (DIANOVA: Hamburg Cat No. DIA 910) diluido 1:40 se cubrió en placas de 96 pocillos como se describió anteriormente. Los sobrenadantes de todos las versiones de heterominicuerpos se añadieron puras y en diluciones 1:2, 1:4, 1:8. Un anticuerpo Ckappa anti-humano biotinilado (Pierce, Cat. No. 31780) seguido por estreptavidina conjugada con peroxidasa (1:1000) (Dako, Hamburg, Cat No. P0347) se usó para la detección de heterominicuerpos unidos (ver Tabla 4.4). Después de lavar cuatro veces con PBS 0,05% Tween 20, el ELISA se desarrolló finalmente añadiendo el substrato ABTS como se describe en el Ejemplo 4.4. Como control negativo las placas se incubaron con PBS en vez de construcciones de heterominicuerpos. Se midió el precipitado coloreado a 405 nm usando un lector de ELISA.

Figura 11: Control de FACS de las células CHO tras la transfección con 17-A.

La expresión de la transmembrana 17-1 A se incrementó por la amplificación génica paso a paso inducida por la adición siguiente de concentraciones en aumento del MTX inhibidor de DHFR a una concentración final de 500 nM, con los pasos de concentración entre 20 nM y 100 nM. Estas células se probaron para la expresión en membrana de 17-1A mediante citometría de flujo a una concentración de 10 \mug/mL del M79 anticuerpo específico 17-1A (Göttinger, In6. J. Cancer 38 (1986) 47-53) seguido por anticuerpo IgM (H+L) + IgG antiratón de cabra policlonal marcado con FITC diluido 1:100 en PBS. Como control negativo se usaron las células CHO no transfectadas mientras que la línea celular Kato de cáncer gástrico humano 17-1A positivo obtenida de ATCC sirvió como control positivo.

Figura 12: Incorporación de BrdU de CD4+CD45RA+linfocitos-T tras la estimulación con heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3scFv. Después de tres días de estimulación las células se incubaron con BrdU durante 14 horas. El ensayo se realizó como se recomienda en la descripción del producto por Boehringer Mannheim Cat.No. 1647229. Los valores de DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA.

Abreviaciones

Sin CHO max = sin células CHO transfectadas 17-1A más 250 ng/mL de anticuerpo M79scFv-anti-CD2scFv de cada única biespecífico más 500 ng/mL de heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1.

Sin Bimax CHO = sin células CHO transfectadas 17-1A más 250 ng/mL de M79scFvb-anti-CD2scFv anticuerpo de cadena única biespecífico.

PBLsMBmaxBimax = células CHO transfectadas 17-1A más células mononucleares sin separar de sangre periférica más 250 ng/mL de anticuerpo M79scFv-anti-CD3scFv de cadena única más 500 ng/mL de heteroanticuerpo de M79scFv CK/CD80 CH1.PBLBimax= Células CHO transfectadas 17-1A más células mononucleares sin separar de sangre periférica más 250 ng/mL de anticuerpo M79scFv-anti-CD2scFv de cadena única biespecífico.

PBL neg = control negativo que consite de células CHO transfectadas de 17-1A más células mononucleares sin separar de sangre periférica.

Figura 13: Porcentaje de CD4+CD45RA+CD45R0-linfocitos T tras 3 días de estimulación de CD4+CD45RA+ linfocitos-T con heterominicuerpos M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 analizados mediante FACS, los niveles de expresión de CD45RA y CD45RO se analizaron por citometría de flujo tras 3 días de estimulación de CD4+CD45RA+ Linfocitos-T con 500 ng/mL de M79CK/CD80CH1 de heterominicuerpo y/ó 250, 50, 10, 2 ng/mL de M79scFv-antiCD3 scFv. La Figura 5.4.1. muestra el porcentaje de CD4+CD45RA-CD45R0+Linfocitos T de todas las células bloqueadas. Se lavaron 100.000 células una vez con PBS y se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo CD45RA antihumano conjugado con R-fico-eritrina (2H4 Coulter) diluido 1:50 y con anticuerpo CD45RO antihumano conjugado con FITC (UHCL-1 DAKO Hamburg) diluido 1:50 y se lavó otra vez con PBS. Como control positivo, PBMCs se estimularon con 500 ng/mL de heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/ó 250 ng/mL de M79scFv-antiCD3 scFv. Para controles negativos PBMC sin estimular, y CD4+CD45R0+Linfocitos-T purificados estimulados con 500 ng/mL de M79CK/CD80CH1 de heterominicuerpo y/ó 250 ng/mL de M79scFv-antiCD3 scFv sin células CHO transfectadas 17-1A. Para abreviaciones ver leyenda Fig.12.

Figura 14: Porcentaje de CD4+CD45RA-CD45RO+linfocitos-T tras 6 días de estimulación de CD4+CD45RA+ linfocitos-T con heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 scFv analizado mediante FACS los niveles de expresión CD45A y CD45RO se analizaron por citometría de flujo tras 6 días de estimulación de los CD4+CD45RA+ linfocitos-T con 500 ng/mL de heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o 250, 50, 10, 2 ng/mL de M79scFv-antiCD3 scFv. La Figura 5.4.1 muestra el porcentaje de CD4+CD45RA-CD45RO+ linfocitos-T de todas las células bloqueadas. 100.000 células se lavaron una vez con PBS y se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo CD45RA antihumano conjugado con R-ficoeritrina diluido 1:50 y con anticuerpo CD45RO antihumano conjugado con FITC (UHCL-1 DAKO Hamburg) diluido 1:50 y se lavó una vez más con PBS. Como control positivo PBMCs se estimularon con 500 ng/mL de heterominicuerpo M79CK/CD80CH1. Para controles negativos PBMC sin estimular, y linfocitos T CD4+CD45RO+ purificados se estimularon con 500 ng/ml de heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o 250 ng/ml de M79scFv-antiCD3 scFv sin células CHO transfectadas con 17-1A. Para las abreviaciones ver leyenda de la Fig.12.

Figura 15: Análisis de ELISA \gamma-IFN de CD4+CD45RA-Linfocitos-T tras 3 días de estimulación con heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 scFv. El sobrenadante del cultivo celular diluido 1:5 antes del análisis de ELISA, se usó como control positivo el estándar \gamma (proporcionado con el kit de prueba). Como control negativo, los pocillos se incubaron con medio de cultivo celular. El ELISA se realizó de acuerdo con la recomendación del manual del fabricante (Genzyme DuoSet, Genzyme Diagnostics Cambridge, MA USA Cat. No. 80-3932-00) y se desarrolló por la solución de substrato ABTS como se describió en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA. Para abreviaciones ver la leyenda Fig.12.

Figura 16: Análisis ELISA de \gamma-IFN de CD4+CD45RA+ linfocitos-T después de 6 días de estimulación con heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 scFv. El sobrenadante del cultivo celular se diluyó 1:5 antes del análisis de ELISA, el estándar \gamma-IFN (proporcionado con el kit de prueba) se usó como control positivo. Como control negativo, se incubaron los pocillos con medio de cultivo celular. El ELISA se realizó de acuerdo al manual del fabricante (Genzyme DuoSet, Genzyme Diagnostics Cambridge, MA USA Cat. NO. 80-3932-00) y se desarrolló mediante solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA. Para las abreviaciones ver la leyenda Fig.12.

Figura 17: Análisis ELISA de IL-5 de CD4+CD45RA+ linfocitos-T tras 3 días de estimulación con heterominicuerpos M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 scFv. Se analizó el sobrenadante del cultivo celular no diluido, la IL-5 estándar (proporcionada con el kit de prueba) se usó como control positivo. Como control negativo, los pocillos se incubaron con medio de cultivo celular. El ELISA se realizó de acuerdo con el manual del fabricante (Genzyme DuoSet, Genzyme Diagnostics Cambridge, MA USA Cat. No. 80-5025-00) y se desarrolló mediante una solución de substrato ABTS tal como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA. Para abreviaciones ver la leyenda Fig.12.

Figura 18: Análisis ELISA de IL-5 de CD4+CD45RA-linfocitos-T tras 6 días de estimulación con el heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 scFv. Se analizó el sobrenadante del cultivo celular sin diluir, la IL-5 estándar (proporcionado con el kit de prueba) se usó como control positivo. Como control negativo, los pocillos se incubaron con medio de cultivo celular. El ELISA se realizó de acuerdo al manual del fabricante (Genzyme DuoSet, Genzyme Diagnostics Cambridge, MA USA Cat. NO. 80-5025-00) y se desarrolló mediante una solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA. Para las abreviaciones ver leyenda Fig.12.

Figura 19: Incorporación de BrdU de CD8+CD45RA+ células tras 3 días de estimulación con heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 scFv. Después de 3 días de estimulación las células se incubaron con BrdU durante 14 horas. El ensayo se realizó como se recomendó en la descripción del producto por Boehringer Mannheim Cat.No. 1647229. Los valores de DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA. Para las abreviaciones ver leyenda Fig.12.

Figura 20: Porcentaje de CD8+CD45RA-CD45RO+ linfocitos-T tras 4 días de estimulación de los CD8+CD45RA-linfocitos-T con heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 scFv analizado mediante FACS los niveles de expresión de CD45RA y CD45RO se analizaron por citometría de flujo después de 4 días de estimulación de CD8+CD45RA con 500 ng/mL de heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o 250, 50, 10, 2 ng/Ml de M79scFv-antiCD3 scFv. La Figura 5.4.1. muestra el porcentaje de CD8+CD45RA-CD45RO+ linfocitos-T de todas las células bloqueadas. Se lavaron una vez 100,000 células con PBS y se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo CD45RA antihumano conjugado con R-ficoeritrina (2H4 Coulter) diluido 1:50 y con un anticuerpo CD45RO antihumano conjugado con FITC (UHCL-1 DAKO Hamburg) diluido 1:50 y se lavó una vez más con PBS. Como control positivo, se estimularon PBMCs con 500 ng/mL de heterominicuerpo M79/CKCHO1 y/o 250 ng/mL de M79scFv-antiCD3 scFv. Para controles negativos PBMC sin estimular, y CD8+CD45RO-linfocitos-T purificados se estimularon con 500 ng/ml de heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o 250 ng/mL de M79scFv-antiCD3 scFv sin células CHO transfectadas 17-1A. Para ver las abreviaciones ver leyenda Fig.12.

Figura 21: Porcentaje de CD8+CD45RA-CD45RO+linfocitos-T tras 6 días de estimulación de CD8+CD45RA+ linfocitos-T con heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 scFv analizado mediante FACS y los niveles de expresión de CD45RA y CD45RO se analizaron por citometría de flujo tras 6 días de estimulación de CD8+CD45RA+linfocitos-T con 500 ng/ml de M79CK/CD80CH1 y/o 250, 50, 10, 2 ng/ml de M79scFv-antiCD3 scFv. La Figura 5.4.1. muestra el porcentaje de CD8+CD45RA-CD45RO+ linfocitos-T de todas las células bloqueadas. Se lavaron una vez 100.000 células con PBS y se incubaron durante 30 minutos con anticuerpo CD45RA antihumano conjugado con R-ficoeritrina (2H4 Coulter) diluido 1:50 y con un anticuerpo CD45RO antihumano conjugado FITC (UHCL-1 DAKO Hamburg) diluido 1:50 y se lavó una vez más con PBS. Como control positivo PBMCs se estimularon con 500 ng/mL de M79CK/CD80CH1 y/o 250 ng/Ml de M79scFv-antiCD3 scFv. Para controles negativos PBMC sin estimular, y CD8+CD45RO-linfocitos-T purificados se estimularon con 500 ng/ml de heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o 250 ng/ml de M79scFv-antiCD3 scFv sin células CHO transfectadas 17-1A. Para ver las abreviaciones ver leyenda Fig.12.

Figura 22: Análisis ELISA de TNF-\alpha de CD8+CD45RA+linfocitos-T después de 4 días de estimulación con heterominicuerpo M79CK/CD80CH1 y/o M79scFv-antiCD3 scFv. Se analizó el sobrenadante del cultivo celular sin diluir, la estándar TNF-\alpha (proporcionado con el kit de prueba) se usó como control positivo. Como control negativo, los pocillos se incubaron con medio de cultivo celular. El ELISA se realizó de acuerdo al manual de fabricación (Genzyme DuoSet, Genzyme Diagnostics Cambridge, MA USA Cat. No. 80-3933-00) y se desarrolló mediante solución de substrato de ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores DO se midieron a 405 nm usando un lector de ELISA. Para las abreviaciones ver la leyenda Fig.12.

Figura 23: Diseño molecular del heterominicuerpo M79scFv-CK-antiCD3scFv/CD80CH1 se mostró en el nivel de proteína. CH1 y CK indican el primer dominio constante de la cadena pesada de IgG1 humana y la región constante de la cadena ligera Ig-kappa humana/respectivamente, que juntas forman la unidad de heterodimerización covalentemente unida por puente disulfuro (S-S). VH indica la región variable de la cadena pesada de Ig y VL la región variable de la cadena ligera de Ig.

Figura 24: Diseño de varias construcciones CD80-scFv bifuncionales mostrando los elementos de construcción a nivel de la proteína. VH indica la región variable de la cadena pesada de Ig. VL de la cadena ligera de Ig.

Figura 25: El diseño de varias construcciones de CD80-scFv bifuncionales mostrando los elementos de construcción a nivel de DNA como los sitios de escisión del enzima de restricción usado.

Figura 26: El análisis de ELISA del sobrenadante del cultivo celular obtenido a partir de células CHO transfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M79scFv(VL/VH) incluyendo la secuencia de codificación del enlazante corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1}. Se incuabaron placas de ELISA de 96 pocillos con 50 \mul del antígeno 17-1A soluble (50 \mug/mL) por pocillo. Posteriormente las diluciones de sobrenadante del cultivo celular puras de las mismas se añadieron como se indica. La detección se realizó mediante un anticuerpo con marca anti-His IgG1 de ratón (dianova, Hamburg) diluido 1:1000 y anticuerpo IgG(Fc) de antiratón de cabra policlonal conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido 1:5000. El anticuerpo de cadena única biespecífico anti-17-1A/anti-CD3 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) se usó como control positivo. Como control negativo, los pocillos se incubaron con tampón de fosfato. El ELISA se desarrolló mediante solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 27: Análisis ELISA del sobrenadante del cultivo celular se obtuvo a partir de células CHO transfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M79scFv(VH/VL) incluyendo la secuencia de codificación del enlazante corto (Gly_{4}Ser_{1})Las placas de ELISA de 96 pocillos se incubaron con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble por pocillo (50 \mug/ml). Posteriormente el sobrenadante del cultivo celular puro y diluciones del mismo se añadieron como se indica. La detección se realizó mediante un anticuerpo antiCD80-IgG1 de ratón diluido 1:1000 seguido de anticuerpo (Fc) IgG antiratón de cabra policlonal conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido 1:5000. El anticuerpo de cadena única biespecífico anti-CD3/anti 17-1 A (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), se usó como control positivo y se detectó como se describe en la Fig. 26. Como control negativo, los pocillos se incubaron con tampón de fosfato. El ELISA se desarrolló por una solución de substrato de ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron mediante un lector de ELISA.

Figura 28: Análisis ELISA de la construcción CD80-M79scFv(VL/VH) recombinante purificada con un enlazante corto (Gly_{4}Ser_{1}) obtenido por purificación a partir del sobrenadante del cultivo celular usando una columna Ni-NTA como se describe (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). Las placas de ELISA de 96 pocillos se cubrieron durante toda la noche a 4ºC con la elución puro a partir de la columna Ni-NTA y diluciones de la misma como se indica. Posteriormente la proteína recombinante unida se detectó por anticuerpo anti CD80 IgG1 de ratón diluido 1:1000 o por un anticuerpo con marca anti-His IgG1 de ratón (dianova. Hamburg) diluido 1:1000 seguido por anticuerpo (Fc) IgG antiratón de cabra policlonal conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) respectivamente diluido 1:5000. Como control negativo los pocillos se cubrieron toda la noche a 4ºC con 3% de BSA en un tampón de fosfato. El ELISA se desarrolló mediante una solución de substrato de ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 29: Análisis ELISA del sobrenadante del cultivo celular se obtuvo a partir de células CHO transfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M79scFv (VH/VL) incluyendo la secuencia de codificación del enlazante corto (Gly_{4}Ser_{1}). Las placas de ELISA de 96 pocillos se incubaron con antígeno 17-1A soluble (50 \mug/mL) por pocillo. Posteriormente el sobrenadante del cultivo celular y diluciones: las mismas se añadieron como se indica. La detección se realizó mediante anticuerpos anti CD80 IgG1 de ratón diluido 1:1000 seguido de anticuerpo (Fc) IgG antiratón de cabra policlonal conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido 1:5000. El anticuerpo de cadena única biespecífico anti-CD3/anti-17-1A (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) se usó como control positivo y se detectó como se describe en la Fig. 26. Como control negativo los pocillos se incubaron con tampón de fosfato. El ELISA se procesó mediante una solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 30: La secuencia de DNA del oligonucleótido de doble cadena designado ACCGS15BAM con salientes de cadena simple compatibles con aquellos enzimas de restricción BspEI y BamHI. Se muestran los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos.

Figura 31: El análisis ELISA del sobrenadante del cultivo celular y de sus diluciones obtenidas a partir de las células CHO tansfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR+CTI+CD80-M79scFv (VH/VL) que incluye la secuencia de codificación del enlazante largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3}. Las placas de ELISA de 96 pocillos se incubaron con 50 \mul del antígeno 17-1A soluble (50 \mug/mL) por pocillo. Posteriormente el sobrenadante del cultivo celular puro y diluciones de las mismas se añadieron como se indicó. Se detectaron proteínas unidas mediante un anticuerpo con marca anti-His de ratón (dianova, Hamburg) diluido 1:1000 seguido por un anticuerpo (Fc) IgG de antiratón de cabra policlonal conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) diluido 1:5000. Los anticuerpos de cadena única biespecíficos anti-CD3/anti-17 (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) se usó como control positivo. Como control negativo se incubaron los pocillos con tampón de fosfato. El ELISA se desarrolló con una solución de substrato de ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 32: Diseño molecular de fragmentos de DNA que codifican las cadenas polipeptídicas únicas del heterominicuerpo M79scFv-CK-anti-CD3scFv/CD80CH1. Los símbolos se usaron como en las figuras 1(A) y 1(B), el vector de expresión pEF-DHFR o pEF-ADA usado para clonación y expresión de cadenas individuales se indicó, Gly_{4}Ser_{1}, indica un enlazante S-aminoácido glicina-Serina.

Figura 33: Cambio de fenotipo de CD45 RA+/RO- CD4 linfocitos T a RA-/RO+ CD4 linfocitos T inducidos por cebaje in vitro. La expresión de CD45 y CD45RO en PBMCs y CD4+CD4RO-linfocitos T sencillos se analizaron por FACS el día 0. Los niveles de expresión CD45RA y CD45RO de CD4+CD45RO-células se analizaron más por citometría de flujo tras 6 días de estimulación con 500 ng/mL del heterominicuerpo M79scFv/CD80CH1 y/ó 250 ng/mL del anticuerpo de cadena única biespecífica M79scFv-anti CD3scFv en contacto con las células CHO transfectadas 17-1A irradiadas. 100.000 linfocitos-T se lavaron una vez con PBS y se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo CD45RA antihumano conjugado con ficoeritrina (2H4 Coulter) diluido 1:50 con un anticuerpo CD45RO antihumano conjugado FITC (UCHL-1 DAKO Hamburg) diluido 1:50 y se lavó una vez más con PBS antes de la citometría de flujo.

Figura 34: Cambio de fenotipo de linfocitos T CD45 RA+/RO-CD8 a linfocitos T RA-/RO+ CD8. La expresión de CD45RA y CD45RO en PBMCs y linfocitos T CD8+CD45RO-sencillos purificados se analizó por FACS en el día 0. Los niveles de expresión de CD45RA y CD45RO de células CD4+CD45RO se analizaron posteriormente por citometría de flujo tras 6 días de estimulación con 500 ng/ml de heterominicuerpo M79scFCK/CD80CH1 y/o 250 ng/ml del anticuerpo de cadena única biespecífico M79scFv-anti CD3scFv en contacto con células CHO transfectadas con 17-1A irradiadas. Cada uno de los 100.000 linfocitos T se lavaron una vez con PBS y se incuban durante 30 minutos con un anticuerpo CD45RA antihumano conjugado con ficoeritrina (2H4 Coulter) diluido 1:50 y un anticuerpo CD45RO antihumano conjugado con FITC (UCHL-1 DAKO Hamburg) diluido 1:50 y se lavó de nuevo una vez con PBS previa a citometría de flujo.

Figura 35: Ensayo de liberación de ^{51}Cr con linfocitos T CD8+ CD45RA+ CD45RO- sencillos (antes de cebar) y linfocitos T derivados de los mismos por cebaje in vitro con el heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 y el anticuerpo de cadena única biespecífica M79scFv-anti CD3scFV (antes de cebar). Los linfocitos T se redirigieron contra células Kato 17-1A positivas por diferentes concentraciones de anticuerpo de cadena única biespecífico M79scFv-anti CD3scFv como se indica; opcionalmente el heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 se presentó durante el ensayo de liberación de ^{51}CR a una concentración de 500 ng/ml. PMBC se usó como control positivo. El tiempo de incubación fue 20h a una proporción de E:T de 20:1.

Figura 36: SDS PAGE (7,5%) del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1. La tinción Coomassie del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 heterominicuerpo purificado se mostró bajo condiciones de reducción (panel izquierdo) y no reductoras (panel derecho). En ambos paneles se muestra peso molecular estándar.

Figura 37: Unión del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 a células CHO 17-1A transfectadas y no tranasfectadas. 200.000 células de cada línea celular se incubaron durante 30 minutos con heterominicuerpo M79scFvCK/CD80 CH1 purificado a una concentración de 0,2 \mug/mL. Después, las células se lavaron dos veces en PBS y se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo específico C_{kappa} antihumano conjugado con FITC (Coulter 6604287) diluido 1:10. Tras dos pasos de lavado finales en PBS, las células se analizaron por citometría de flujo (FACS-SCAN Becton Dickinson Inmunocytometry Systems, San Jose CA, USA).

Figura 38: Unión del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 a CD28 en linfocitos T. 100,000 CD8+CD11b- linfocitos-T sencillos purificados se incubaron durante 30 minutos con 20 \mug/mL de heterominicuerpo M79scFvCK/CD80 CH1. Después, se lavaron las células dos veces en PBS y se incubaron durante 30 minutos con anticuerpo específico C_{kappa} antihumano conjugado con FITC (Coulter 6604287) diluido 1:10. Después de dos pasos de lavado finales en PBS, las células se analizaron por citometría de flujo.

Figura 39: Unión del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 a CTLA-4 como se mide mediante ELISA. Placas ELISA de 96 pocilllos se cubrieron con 50 \mul/pocillo de CTLA-4/FcChimera soluble (R&D Systems. Minneapolis MN USA, Cat. No325-CT) a una concentración de 10 \mug/mL. Posteriormente se añadieron concentraciones diferentes de heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 purificado en tampón fosfato PBS. Se realizó la detección por anticuerpo específico C_{kappa}antihumano marcado con biotina (Pierce, Cat.No 31780) diluido 1:1.000 seguido por Avidina conjugada con peroxidasa (Dako, Hamburg. Cat. No p 0347) diluido 1:1000. Como control negativo, algunos pocillos se incubaron con proteínas de fusión CD4-Ig. El ELISA se desarrolló mediante una solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 40: Unión del heterominicuerpo M79scFvCK-antiCD3scFv/CD80CH1 a un antígeno 17-1A recombinante inmobilizado. Placas de ELISA de 96 pocillos se incubaron con 50 \mul de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/mL). Posteriormente, el sobrenandante del cultivo celular puro de células CHO transfectadas con el heterominicuerpo M79scFvCK-antiCD3scFv/CD80CH1 se añadió correspondiente a la selección primaria (PS) o al primer paso de amplificación genica (1. Amp). La detección del heterominicuerpo unido se realizó mediante un anticuerpo monoclonal específico-CD80 (Immunotech, Cat No. 1449) diluido 1:1000 y anticuerpo (Fc)-IgG antiratón de cabra conjugado con peroxidasa (Dianova, Hamburg) diluido 1:5000. Como control negativo, los pocillos se incubaron con tampón de fosfato. El ELISA se desarrolló mediante solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 41: Análisis de ELISA de los sobrenadantes de cultivo celular a partir de células CHO transfectadas con los plásmidos de expresión pEF-CHFR-M79scFvCK-antiCD3scFv y pEF-ADA CD80CH1 que corresponden a la selección primaria (PS) y a diferentes pasos de amplificación del gen (1-3 Amp) como se indica. Las placas ELISA de 96 pocillos se incubaron con 50 \mul/pocillo de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/mL). Posteriormente se añadieron los sobrenadantes puros que contienen el heterominicuerpo M79scFvCK-antiCD3scFv/CD80CH1. Se realizó la detección por anticuerpo con marca anti-histidina marcado con peroxidasa (Roche, 1965085) diluido 1:500. Como control negativo, los pocillos se incubaron con PBS. Se desarrolló el ELISA mediante una solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 42: Unión del heterominicuerpo M79scFvCK-antiCD3scFv/CD80CH1 a CD3 en los linfocitos-T humanos.

100.000 CD8+CD3+CD11b+ linfocitos T se incubaron durante 30 minutos con 400 \mug/mL (línea negra gruesa) y 50 \mug/mL (línea gris delgada) del heterominicuerpo M79scFvCK-antiCD3scFv/CD80CH1. Después, las células se lavaron dos veces en PBS y se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo específico C_{kappa} antihumano conjugado con FITC (Coulter 6604287) diluido 1:10. Como control negativo las células se incubaron con tampón de fosfato (línea rota) en vez de heterominicuerpo. Después de dos pasos de lavado finales en PBS, las células se analizaron luego por citometría de flujo.

Figura 43: Diseño molecular del bscAbM79scFv-antiCD3scFv-CK/CD80-CH1 mostrado a nivel de proteína. CH1 y CK indican el primer dominio constante de la cadena pesada IgG1 humana y la región constante de la cadena ligera Ig-kappa humana, respectivamente, que juntas forman la unidad de heterodimerización covalentemente enlazada unida por un puente disulfuro (S-S). VH indica la región variable de la cadena pesada de Ig y VL la región variable de la cadena ligera de Ig.

Figura 44: Diseño de ambos brazos del heterominicuerpo bscAbM79scFv-antiCD3scFv-CK/CD80-CH1 mostrado a nivel de DNA; se indicaron los sitios de escisión del enzima de restricción. VH indica la región variable de la cadena pesada de Ig, VL de la cadena ligera.

Figura 45: La unión del heterominicuerpo bscAbM79scFv- antiCD3scFv-CK/CD80-CH1 para inmovilizar el antígeno 17-1A recombinante se midió mediante ELISA. Las placas de ELISA de 96 pocillos se incubaron con 50 \mul/pocillo de antígeno 17-1A soluble (50 \mug/ml). Posteriormente sobrenadantes del cultivo celular puro de las células CHO transfectadas con el heterominicuerpo bscAbM79scFv-antiCD3scFv-CK/CD80-CH1 se añadieron correspondiendo a la selección primaria (PS) o al primer paso de amplificación del gen (1. Amp). La detección del heterominicuerpo unido se realizó mediante un anticuerpo con marca anti-histidina marcado con peroxidasa (Roche, 1965085) diluido 1:500. Como control negativo, los pocillos se incubaron con tampón de fosfato en vez de heterominicuerpo. El ELISA se desarrolló mediante una solución de substrato de ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 46: El análisis de ELISA del heterominicuerpo bscAbM79scFv-antiCD3scFv-CK/CD80-CH1 se realizó con un anticuerpo anti-CD80 inmovilizado. Las placas de ELISA de 96 pocillos se incubaron con 50 \muL/pocillo de un anticuerpo antihumano CD80 monoclonal (Immunotech Cat. No. 1449) diluido 1:200. Posteriormente los sobrenadantes del cultivo celular puro de las células CHO transfectadas con bscAbM79scFv-antiCD3scFv-CK/CD80-CH1 heterominicuerpo se añadieron correspondiendo a la selección primaria (PS) o al primer paso de amplificación (1. Amp). La detección se realizó mediante un anticuerpo con marca anti-histidina marcado con peroxidasa (Roche, 1965085) diluido 1:500. Como control negativo, se incubaron los pocillos con tampón de fosfato en vez de heterominicuerpo. Se desarrolló el ELISA mediante una solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores DO se midieron a 405 nm en un lector de ELISA.

Figura 47: Secuencia de aminoácidos y DNA de la construcción M79scFv-IL-2 que contiene un dominio de dimerización. Los nucleótidos 10 al 66 codifican un péptido lider N-terminal. Los nucleótidos 67 a 387 codifican la región VL variable de la cadena ligera de Ig de M79scFv, los nucleótidos de 388 a 432 codifican un enlazante Glicina-Serina seguido por una dominio VH variable de la cadena pesada de Ig de M79scFv (nucleótido 433 a777). En el extremo 5' de la región bisagra superior de IgG3 de ratón descrita por Pack (1993) Biotechnology 11:1271 (nucleótido 784 a 813) se añadieron 6 nucleótidos a través de la inserción de un sitio de escisión EcoRI. Los nucleótidos 814 a 918 codifican el dominio de dimerización dHLX descrito por Pack (1993) Biotechnology 11:1271 seguido por un enlazante peptídico corto a partir de los nucleótidos 919 a 936. El dominio IL-2 (nucleótidos 937 a 1341) se siguió por una marca his C-terminal (nucleótidos 1342 a 1359) y dos codones stop. Se indicaron los sitios de escisión de los enzimas de restricción usados para la clonación.

Figura 48: Secuencia de aminoácidos y DNA de la construcción M79scFv-IL-2 que contiene un dominio de tetramerización. Los nucleótidos 10 a 66 codifican un péptido líder N-terminal. Los nucleótidos de 67 a 387 codifican la región VL variable de cadena ligera de la Ig de M79scFv, los nucleótidos de 388 a 432 codifican un enlazante Glicina-Serina seguido por VH dominio variable de la cadena pesada Ig de M79scFv (nucleótido 433 a 777). En el extremo 5' de la región bisagra superior de la IgG3 humana descrita por Rheinnecker y al. J. Immunol- 157, (1996) 2989-2997 (nucleótido 784 al 816) se añadieron 6 nucleótidos a través de la inserción del sitio de escisión de EcoRI. Los nucleótidos 817 a 933 codifican el dominio de tetramerización p53 (Rheinnecker y al. J. Immunol. 157, (1996) 2989-2997) seguido por un enlazante peptídico corto a partir de los nucleótidos 934 a 954. El dominio IL-2 (nucleótidos 955 a 1359) se siguió a una his-tag C-terminal (nucleótidos 1360 a 1377) y dos codones stop. Se indicaron los sitios de escisión del enzima de restricción usados para la clonación.

Figura 49: La secuencia de aminoácidos y DNA de la construcción DC8scFv/erb2-_{EC}que contienen un dominio de tetramerización. Los nucleótidos de 10 a 66 codifican un péptido líder N-terminal. Los nucleótidos 67 a 390 codifican VL una región variable de la cadena ligera de Ig de DC8scFv, los nucleótidos del 391 al 435 codifican un enlazante Glicina-Serina seguido por VH dominio variable de cadena pesada de Ig de DC8scFv (los nucleótidos de 436 a 771). En el extremo 5' terminal de la región bisagra superior de IgG3 humana descrita por Rheinnecker et al. J. Immunol. 157, (1996) 2989-2997 (nucleótiod 775 a 807) se añadieron 3 nucleótidos completando así con el siguiente triplete de nucleótidos para formar un sitio de escisión BspEI. Los nucleótidos 808 a 924 codifican el dominio de tetramerización p53 humano (Rheinnecker y al. J. Immunol. 157. (1996) 2989-2997), seguido por un enlazante peptídico corto a partir de los nucleótidos 925 a 945. El dominio erbB2_{Ec} (nucleótidos 946 a 2844) se siguió por una marca his C-terminal (nucleótidos 2845-2862) y un codón stop. Se indicaron los sitios de escisión del enzima de restricción usados para la clonación.

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Figura 50: Análisis ELISA de los sobrenadantes del cultivo celular y el lisado obtenido de las células CHO transfectadas con el dímero M79scFv-IL-2- o construcción de tetrámero. Placas de ELISA de 96 pocillos se cubrieron con 50 \mul/pocillo del antígeno 17-1A soluble. Posteriormente el sobrenadante del cultivo celular puro o el correspondiente lisado de células se añadió como se indica. La detección se realizó con un anticuerpo con marca anti-His conjugado con peroxidasa (Roche, Cat No. 1968085) diluido 1:500. Como control negativo, los pocillos se incubaron con tampón de fosfato en vez de con la construcción M79scFv-IL-2. El ELISA se desarrolló mediante una solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores de DO se midieron a 405 nm mediante una lector de ELISA.

Figura 51: Análisis de ELISA del sobrenadante del cultivo celular y el lisado obtenido a partir de células CHO transfectadas con la construcción tetrámero M79scFv-IL-2. Las placas de ELISA de 96 pocillos se cubrieron con 50 \mul/pocillo del antígeno 17-1A soluble (50 \mug/mL). Posteriormente los sobrenadantes del cultivo celular puro y el correspondiente lisado de células así como las diluciones de las mismas se añadieron como se indica. La detección se realizó con un anticuerpo con marca anti-His conjugado con peroxidasa (Roche, Cat No. 1965085) diluido 1:500. Como control negativo, los pocillos se incubaron con tampón de fosfato en vez de la construcción M79scFv-IL-2 tetramérico. El ELISA se desarrolló mediante la solución de substrato ABTS como se describe en el ejemplo 2.1. Los valores DO se midieron a 405 nm mediante un lector de ELISA.

Figura 52: El potencial del formato de heterominicuerpo por la adición de dominios efectores en sus posiciones
C-terminal y N-terminal.

Figura 53: Un heterominicuerpo que reconoce EpCAM con su scFv (HD70) N-terminal y células que llevan receptores IL-2 y GM-CSF con sus citocinas GM-CSF e IL-2 unidas por el extremo C-terminal.

Figura 54: Los insertos de cDNA de dos vectores usados para expresar el heterominicuerpo mostrado esquemáticamente en la Figura 53 en células de mamíferos. Las flechas muestran varias porciones funcionales de los insertos y apuntan en la orientación 5'-3'.

Figura 55: A. El nucleótido completo y la secuencia de aminoácidos deducidos codifican la cadena HD70scFv-CH1-GM-CSF que se usa para expresar la mitad izquierda del heterominicuerpo esquemáticamente mostrado en la figura 53 (parte superior del heterominicuerpo mostrado en la figura 54).

B. El nucleótido completo y la secuencia de aminoácidos deducida que codifica la cadena HD70scFv-CK-IL-2 que se usó para expresar la parte derecha del heterominicuerpo esquemáticamente mostrado en la Figura 53 (parte inferior del heterominicuerpo esquemáticamente mostrado en la Fig.54).

Figura 56: Unión de un heterominicuerpo a las células CHO que expresan el EpCAM humano. Los vectores de expresión que codifican el heterominicuerpo mostrado en la Figura 53 se transfectaron de forma estable en células CHO. Los sobrenadantes a partir de tales células se ensayaron para la producción y secreción del heterominicuerpo por análisis de FACS (FACSCalibur, Beckton Dickinson) usando células CHO que expresan en su superficie EpCAM humano. El heterominicuerpo unido se detectó mediante un segundo anticuerpo unido a la porción del GM-SCF del heterominicuerpo particular y un tercer anticuerpo marcado-FITC marcado específico de especies (ver texto). Panel superior. Células CHO que expresan EpCAM más medio de cultivo celular. Siguientes paneles: Los sobrenandantes a partir de las células CHO que expresan el heterominicuerpo diluidas en medio de cultivo (con el orden de la parte superior a inferior 1:625, 1:125, 1:25, 1:5, y 1:1) y ensayando para ver su aumento de unión a las células positivas EpCAM.

Figura 57: La actividad de unión EpCAM esta unida físicamente con GM-CSF e inmunoreactivos de IL-2 en los sobrenadantes a partir de las células CHO que producen heterominicuerpos. Los heterominicuerpos mostrados en la Fig.53 se expresaron en las células CHO y resultaron en sobrenadantes de cultivo celular incubados con el dominio extracelular del EpCAM recombinante inmovilizado en la placa de ELISA. Después de lavados extensivos, el heterominicuerpo unido se analizó mediante inmunoreactividad con anticuerpos reconocidos GM-CSF humanos o IL-2 humana en un ELISA.

Figura 58: Inmunoreactivos GM-CSF e IL-2 están físicamente unidos a los sobrenadantes a partir de las células CHO que producen heterominicuerpos. Los heteromincuerpos mostrados en la Figura 53 se expresaron en las células CHO y el sobrenadante del cultivo celular resultante se incubó en una placa de ELISA cubierto con cualquiera de los anticuerpos anti-hu-GM-CSF o anti-hu-IL-2. Se ensayó el heterominicuerpo unido para ver su reactividad con un anticuerpo que reconoce las otras citocinas respectivas (ver ejemplos).

Figura 59: El heteromicuerpo purificado consiste de las cadenas unidas covalentemente e inmunoreactivos con anticuerpos que reconocen proteínas C\Box GM-CSF humanas e IL-2 humanas en Western blots. El heteromincuerpo mostrado en la Fig.53 se expresó en células CHO y se purificó en dos pasos a partir del sobrenadante del cultivo celular. Una alícuota del heterominicuerpo purificado parcialmente se analizó mediante un gradiente SDS-PAGE y el gel se sometió a tinción para ver sus proteínas mediante Coomassie blue (carril 1). Las alicuotas del sobrenadante se separaron mediante SDS-PAGE seguido de electroblot en las membranas e inmunotinción con anticuerpos que reconocen C\oblong\oblong humana (carril 2), IL-2 humana (carril 3) y GM-SCF humana (ver ejemplos) (carril 4), La estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina se usó para visualizar la unión de anticuerpos primarios. La posición de los pesos moleculares estándares se muestran en los carriles designados "S" y sus tamaños se dan en números en los paneles de la derecha e izquierda. Las flechas indican la posición de la banda del heterominicuerpo de 116-kDa. Las líneas discontinuas indican las posiciones de los marcadores 97 kDa y 188.

Figura 60: Bioactividad del GM-CSF humano unido al heterominicuerpo. El heterominicuerpo mostrado en la Figura 53 se produjo en células CHO, se purificó a partir del sobrenadante del cultivo celular y posteriormente se probó en un ensayo de proliferación usando la línea celular TF-1 de eritroleucemia humana sensible a GM-SCF. La alicuota del heterominicuerpo probada contiene > 300 IU/mL de GM-SCF se midió mediante titulación contra un estándar de GM-CSF humano.

Figura 61: Bioactividad de la IL-2 humana unida al heterominicuerpo. El heterominicuerpo mostrado en la Figura 53 se produjo en las células CHO, purificado a partir del sobrenadante del cultivo celular y posteriormente probado en un ensayo de proliferación usando la línea CL96 de linfocitos T de ratón sensible a IL-2. La alicuota de heterominicuerpo ensayado contenía > 10.000 IU/mL de la IL-2 humana medida por titulación contra IL-2 humana estándar.

La invención será descrita ahora en referencia a los siguientes ejemplos biológicos que son meramente ilustrativos y no tienen que ser interpretados como una limitación del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1

Ejemplo 1.1

Heterominicuerpo M79scFvCH1/CD80CK

Se construyó una proteína que unía el fragmento Fv de cadena simple (scFv) del anticuerpo M79 anti 17-1A murino (Göttlinger, Int. J. Cancer 38 (1986) 47-53) con los dominios extracelulares de CD80 humanos en virtud de la asociación heterodimérica de los dominios de inmunoglobulina CH1 a partir de la cadena pesada \gamma1 humana y Ck, la región constante de la cadena ligera humana kappa. Con este propósito el M79scFv se unió al CH1 humano y la parte extracelular del CD80 humano se unió al Ckappa humano, las cadenas que codifican por el polipéptido resultante se insertaron en vectores de expresión separados y ambos se transfectaron en la misma línea celular huésped mamífera resultando en el heterominicuerpo CD80 representado en la figura 1. En el siguiente ejemplo el procedimiento de construcción se describe paso a paso.

Ejemplo 1.1.1

Construcción de la cadena CD80-CK

Primero la cadena CD80-Ckappa se ensambla. El fragmento Ck de DNA se obtuvo por PCR usando cebadores 5' y 3' específicos. El molde de cDNA para esta PCR se preparó por transcripción reversa del RNA total preparado a partir de células mononucleares de sangre periférica humana de acuerdo con procedimientos estándar. (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, cold Spring Habour, New York (1989)). El cebador 5' HuCKBspE1 introduce los sitios de escisión por restricción BspE1 y BsiW1 así como la región bisagra de IgG3 (5' HuCKBspE1: 5' AAT TCC GGA ACC CCG CTG GGT GAC ACC ACC CAC ACC CGT ACG GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC 3'), el cebador 3'HuCKSalNOT introduce los sitios de escisión Sal1 y Not1 (3'HuCKSalNOT: 5'ATA AGA ATG CGG CCG CGT CGA CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT C-3'). El fragmento CD80 se obtuvo por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótidos específicos complementario a los extremos 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos codificante por la parte extracelular de CD80 (Freeman G.J. et. al. J. Immunol. 143, (1989) 2714-2722). Esos cebadores también introdujeron un sitio de escisión EcoRI y BspEI (5'CD80 Cebador: 5'GCA GAA TTC ACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG 3'; 3'CD80 Cebador: 5' TGG TCC GGA GTT ATC AGG AAA ATG CTC TTG CTT G 3'). El molde cDNA usado para esta PCR se preparó por transcripción reversa del RNA total preparado a partir de la transcripción reversa del RNA total preparado a partir de una línea celular de linfoma de Burkitt Raji de acuerdo con procedimientos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Habour, New York (1989)).

La proteína co-estimuladora CD80 pertenece a la superfamilia de Ig. Es una proteína fuertemente glicosilada de 262 aminoácidos. Una descripción más detallada se publicó por Freeman G.J. et. al. J. Immunol. 143, (1989) 2714-2722.

La cadena CD80-Ckappa se clonó en varios pasos usando el vector ya existente pEF-DHFR-CTI-CD80-M79scFv. Este vector se elaboró tal como sigue.

Primero un poli-enlazante designado CTI se insertó en un vector Bluescript KS (GenBank® número de acceso X52327) usando los sitios de escisión por enzimas de restricción KbaI y SaII (Boehringer Mannheim). La introducción del poli-enlazante CTI proporciona sitios de escisión adicionales así como la secuencia codificante por un enlazante (Gly_{4}Ser_{1})_{1}, un marcador de seis aminoácidos de histidina y un codón de stop tal como se muestra en la figura 2. El vector BluescriptKS-CTI se preparó por escisión con los enzimas de restricción EcoRV y XmaI (Boehringer Mannheim and New England Biolabs) con el fin de ligarse a éste (T4 DNA, Ligase Boehringer Mannheim) con el fragmento M79scFv escindido por EcoRV y BspEI (Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025). El vector resultante BluescriptKS-CTI-M79scFv de nuevo se escindió con EcoRI (Boehringer Mannheim) y BspEI con el fin de insertar el fragmento de DNA PCR CD80 obtenido tal como se describe anteriormente y escindir con los mismos enzimas. A continuación, el fragmento de DNA CD80-M79scFv (VL/VH) total se aisló por escisión del vector BluescriptKS-CTI-CD80-M79scFv (VL/VH) con EcoRI y SaII (Boehringer Mannheim) y a continuación se introduce en un vector de expresión eucariota pEF-DHFR descrito en Mack et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995), 7021-7025, conteniendo el gen de la dihidrofolatoreductasa como marcador de la selección.

Para el paso final de la construcción de la cadena CD80-Ckappa, el fragmento Ckappa obtenido tal como se describe anteriormente se escindió con los enzimas de restricción BspEI y SaII y se clonó en el vector pEF-DHFR-CTI-M79scFv-CD80 usando los mismos enzimas. Por lo tanto el fragmento M79scFv se reemplazó por Ckappa. El plásmido final pEF-DHFR-CTI-CD80-Ckappa mostrado en la figura 3 se linealizó con el enzima de restricción NdeI (Boehringer Mannheim) y se transfectó en las células CHO por electroporación. Las condiciones de electroporación fueron 260V/960\muF usando un BioRad Gene Pulser™. La expresión estable se realizó en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. et.al. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Las células crecieron por selección en medio \alpha-MEM libre de nucleósido suplementado con FCS dializado al 10%, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml Penicilina y 100 ng/ml estreptomicina.

Ejemplo 1.1.2

Construcción de la cadena M79scFv-CH1

En el próximo paso la cadena M79scFv-CH1 se ensambló. El fragmento CH1 de la cadena pesada IgG1 humana se amplificó por PCR a partir del mismo molde de cDNA usado para la amplificación por PCR del dominio Ckappa humano. El cebador de PCR 5' introdujo dos sitios de escisión (BspE1 y Nhe1) así como la región bisagra superior de la IgG3 humana (5'CH1huG1BspE1: AAT TCC GGA ACC CCG CTG GGT GAC ACC ACC CAC ACC GCT AGC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC C). El cebador de PCR 3' introdujo los sitios de escisión BspE1 y Spe1 (3'CH1huG1BspE1: AAT TCC GGA ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GG). El fragmento de PCR resultante se preparó por clonación por escisión con el enzima de restricción BspE1 y se insertó en el vector BS-CTI descrito anteriormente que se escindió con BspE1 y Xma1. Con el fin de evitar la unión a si mismo del vector, el vector se trató con fosfatasa alcalina. Después de eso, el fragmento CH1 se escindió de BS-CTI con los enzimas de restricción SaI1 y BspE1 con el fin de conectar a éste con el fragmento Fv de cadena simple M79 tal como se describe posteriormente:

El anticuerpo M79 se describió por Göttlinger et. al., (1986) Int. J. Cancer:38, 47-53. El fragmento scFv M79 se obtuvo a partir de anticuerpos de cadena simple biespecífica (M79scFv-antiCD3scFv) descrito por Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025. El fragmento de DNA que codifica por este anticuerpo de cadena simple biespecífico se extirpó del vector de expresión pEF-DHFR y se insertó en el vector de expresión pEF-ADA usando los enzimas de restricción EcoRI y SaII respectivamente. El vector de expresión pEF-ADA se derivó del vector de expresión pEF-DHFR (Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025) por reemplazo del cDNA codificante de la dihidrofolato reductasa murina (DHFR) por el que codifica la desaminasa murina.

Con el fin de introducir el fragmento CH1 y reemplazar por lo tanto el fragmento anti-CD3scFv, el vector pEF-ADA que contiene el anticuerpo de cadena simple biespecífico M79scFv-antiCD3scFv se escindió usando los mismos enzimas de restricción que para la preparación del fragmento CH1 (BspE1, SaI1). El plásmido resultante pEF-ADA-M79scFv-CH1 mostrado en la figura 3 se linealizó con NdeI y se transfectó en células CHO ya transfectadas con el vector de expresión pEF-DHFR-CTI-CD80-Ck. Las células doblemente transfectadas crecieron por selección en medio \alpha-MEN libre de nucleósidos suplementado con FCS dializado al 10% y 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 ng/ml de estreptomicina, 0,1 \muM de desoxicoformicina (dCF) y 1x1,1-AAU-aditivo tal como se describe por Kaufmann-RJ (Meth. Enzym. 185 (1990) 537-566). Tras que las células crecieran con éxito bajo estas condiciones la concentración de dCF aumentó a 0,3 \muM (selección ADA) y se añadió MTX a la concentración final de 20 nM (selección DHFR) con el fin de obtener mayores niveles de expresión del heterominicuerpo debidos a la amplificación de genes. El análisis por ELISA del sobrenadante del cultivo de las líneas celulares transfectadas se llevó a cabo con el fin de determinar el nivel de expresión del heterominicuerpo y para confirmar su especificidad de unión al antígeno 17-1A (ver ejemplo 4.4 y figuras 9, 10).

Ejemplo 1.2.1

Heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1

Otra versión del heterominicuerpo CD80 se construyó reemplazando el fragmento M79scFv por el CD80. Por lo tanto los dos plásmidos de expresión pEF-DHFR-CTI-CD80-Ck y pEF-ADA M79scFv-CH1 se escindieron con EcoR1 y BspE1. El fragmento M79scFv entonces se ligó con el fragmento pEF-DHFR-CTI-CK y el fragmento CD80 se ligó con el fragmento pEF-ADA-CH1. Primero, el vector pEF-DHFR-M79scFv-CK se transfectó en células CHO y crecieron por selección tal como se describe en el ejemplo 1.1. El pEF-ADA-CD80-CH1 se transfectó en las mismas células CHO en un segundo paso y las células CHO doblemente transfectadas crecieron por selección tal como se describe anteriormente (ver figura 1 y 3).

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Ejemplo 1.2.2.

Amplificación, subclonación y purificación del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1

La selección primaria se llevó a cabo en un medio de cultivo MEM alfa libre de nucleósidos suplementado con FCS dializado al 10% y 0,1 \muM desoxicoformicina (dCF) y 1x1,1-AAU-aditivo tal como se describe (Kaufman, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566). La expresión de esta construcción se incrementó por amplificación génica inducida paso a paso aumentando las concentraciones de metrotexato inhibidor de DHFR y la desoxiformicina dCF inhibidor de ADA.

Los pasos de amplificación simple llevados a cabo son los siguientes:

1. Amplificación 20 nM MTX y 0,3 \muM dCF

2. Amplificación 100 \muM MTX y 1 \muM dCF

3. Amplificación 500 nM MTX y 3 \muM dCF.

Las células obtenidas del tercer paso de amplificación se clonaron por mediante una dilución limitante. Por lo tanto las células se cultivaron a una concentración de 50 células por ml, 10 células por ml y 2 células por ml en placas de 96 pocillos de fondo plano de acuerdo con los Protocolos Actuales en Inumonología (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 1992) bajo condiciones de cultivo del tercer paso de amplificación. Los clones positivos de los pocillos con un aglomerado apretado simple de células como evidencia de crecimiento monoclonal se identificaron mediante ELISA tal como se describe en el Ejemplo 2.1.

Un clon positivo se expandió y se recogió para la producción de proteínas. La producción de anticuerpos a gran escala se llevó a cabo en botellas cilíndricas usando 500 ml de medio. El heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 se purificó vía su cola de histidina C-terminal tal como se describe. (Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (1995), 7021-7025).

Ejemplo 1.2.3.

ELISA en el sobrenadante del cultivo celular de heterominicuerpos CD80

Para analizar las propiedades de unión de 17-1A de ambas versiones de heterominicuerpos CD80 y para confirmar la asociación correcta de CH1 y CK se llevaron a cabo dos ELISAs diferentes. La unión específica al antígeno 17-1A se mostró por incubación del sobrenadante del cultivo en antígeno 17-1A recombinante inmobilizado y la detección de los CD80- heterominicuerpos unidos mediante un anticuerpo anti-CD80. La estructura heterodimérica de los Heterominicuerpos se confirmó por incubación del sobrenadante del cultivo en anticuerpo-marcado-anti-His inmobilizado seguido de un paso de detección con un anticuerpo C_{kappa} anti-humano. Para los detalles acerca de ambos ELISA ver el ejemplo 4.4., figura 9 y 10.

Ejemplo 2 Análisis de Heterominicuerpos M79scFvCK/CD80CH1 y M79scFvCH1/CD80CK 2.1 Análisis de ELISA del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 expresado por líneas celulares CHO transfectadas en diferentes etapas de la amplificación génica

Los sobrenadantes del cultivo correspondientes a la selección primaria, primera, segunda y tercera amplificación más consiguiente clonación celular se ensayaron mediante ELISA. Con este propósito se utilizó 17-1A recombinante (Mack, Proc.Natl.Acad.Sci USA 92 (1995) 7021-7025) para recubrir placas de ELISA de 96 pocillos con el fondo en forma de U (Nunc maxisorb) (50 \mug/ml, 50 \mul/pocillo) en una solución salina tampón de fosfatos (PBS). El recubrimiento se realizó durante toda la noche a 4ºC, el bloqueo se realizó con albúmina de suero bovino al 3% (BSA) en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Las construcciones de anticuerpos como sobrenadantes de cultivos para la selección primaria (PS) y a partir de diferentes pasos de amplificación (1.Amp, 2.Amp, 3.Amp subclonado) (figura 4), respectivamente, se añadieron y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. El heterominicuerpo unido se detectó por un anticuerpo CK anti-humano marcado con biotina (Pierce, Cat Nº31780) diluido 1:1000 en PBS 1% BSA. Tras lavado tres veces con PBS 0,05% Tween 20, se añadió avidina peroxidasa (DAKO, Hamburg, Cat.nºP0347) diluida 1:1000 y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar cuatro veces con PBS 0,05% Tween 20, el ELISA se desarrolló finalmente por adición de la siguiente solución substrato: 22 mg ATS (2,2-Azino-bis(Ácido 3-etilbenztiazolina-6-sulfónico)diamonio sal) se disolvió en 10 ml de tampón citrato 0,1M pH 5,1 conteniendo 2,3 mg de perborato sódico tetrahidrato. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de construcciones de anticuerpos bifuncionales. El precipitado coloreado se midió a 405 nm usando un lector de ELISA. Tal como se muestra en la figura 4, la expresión de heterominicuerpo aumentó contiuamente a partir de la primera selección a un clon celular a partir del tercer paso de amplificación.

2.2 Análisis de ELISA de Heterominicuerpos M79scFvCK/CD80CH1 y M79scFvCH1/CD80CK mediante combinaciones diferentes de anticuerpos inmobilizados o antígenos 17-1A inmobilizados con anticuerpos de detección apropiados 2.2.1. Análisis de ELISA con antígenos 17-1A inmobilizados y un anticuerpo de detección anti-CD80

Los sobrenadantes del cultivo derivados del paso de amplificación 1 se ensayaron. El antígeno 17-1A recombinante se cubrió la placa ELISA. Las construcciones de anticuerpo unido se detectaron mediante un anticuerpo monoclonal específico de CD80 (Immunotech, Cat.Nº 1449) diluidos 1:1000 en PBS 1% BSA seguido de un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa monoclonal (Fc-específico) diluido 1:1000 en PBS 1% BSA. El procedimiento de ELISA se realizó tal como se describe anteriormente. Tal como se muestra en la figura 9 ambas versiones de heterominicuerpos han demostrado unir al antígeno 17-1A aunque la versión M79scFvCK/CD80CH1 mostró un nivel de expresión sustancialmente mayor que la versión M79scFvCH1/CD80CK.

2.2.2. Análisis de ELISA con anticuerpo marcado con anti-His y un anticuerpo de detección C_{kappa} anti-humano

Los sobrenadantes del cultivo derivados del paso de Amplificación 1 se ensayaron. El anticuerpo marcado anti-histidina libre de BSA (Dianova, Hamburg, Cat Nº DIA910) se cubrió en la placa de ELISA. Las construcciones de anticuerpo unidas se detectaron mediante un anticuerpo C_{kappa} anti-humano marcado con biotina (Pierce, Cat Nº 5031780) diluido 1:1000 en PBS seguido de Avidina Peroxidasa (DAKO, Hamburg, Cat. Nº P0347) diluido 1:1000 BSA 1%. El procedimiento de ELISA se realizó tal como se describe anteriormente. Tal como se muestra en la Figura 10 los resultados del ELISA confirmaron el mayor nivel de expresión del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 y junto con los resultados del posterior ELISA claramente demostraron la estructura heterodimérica de los Heterominicuerpos CD80.

2.2.3. Análisis ELISA con proteína de fusión CTLA-4-Ig inmobilizada y un anticuerpo de detección C_{kappa} anti-humano

Con el fin de demostrar la interacción del brazo (B7-1) CD80 del heterominicuerpo M79scFVCK/CD80CH1 con su contra-receptor CTLA-4, una proteína de fusión CTLA-4-Ig comercialmente disponible (concentración de recubrimiento 10 \mug/ml) y tras bloquear con PBS/BSA 3% con cuatro concentraciones diferentes de heterominicuerpo purificado (en PBS/ BSA 1%); el heterominicuerpo unido se detectó con un anticuerpo C_{kappa} anti-humano marcado con biotina (Pierce, Cat.Nº 31780) diluido 1:1000 en PBS/BSA 1% seguida de peroxidasa conjugada con avidina. Como control negativo algunos pocillos de la placa de ELISA se cubrieron con una proteína de fusión CD4-Ig en lugar de con la proteína de fusión CTLA-4-Ig. El procedimiento de ELISA general se realizó tal como se describe anteriormente. Los resultados mostrados en la Fig.39 demuestran claramente la unión específica del heterominicuerpo a CTLA-4 humano.

Ejemplo 2.3

SDS-Proteingel

Para determinar el tamaño del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 SDS-PAGE purificado se llevó a cabo con un gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones reductoras y no reductoras de acuerdo con Laemmli (Laemmli, Nature 227 (1970), nº 259680-5) gel seguido de la tinción de las proteínas con ROTI®-Blue (Carl Roth GMBH + Co, Karlsruhe, Alemania; Cat Nº A152.1). Comparando el estándar molecular usado (el marcador de peso molecular de proteína coloreado Rainbow™, rango 14.300-2.200.000, Amersham LIFESCIENCE, Braunschweig, Alemania, Cat Nº RPN 756) una banda de proteína distinta se podría ver bajo condiciones no reductoras a alrededor de 115 kD que se encuentra de acuerdo con el peso molecular esperado. Bajo condiciones de reacción, aparecieron dos bandas de alrededor de 40 kD correspondientes al brazo M79scFcCK del heterominicuerpo y alrededor de 60 kD correspondientes al brazo CD80CH1 del heterominicuerpo. Así, la unión covalente de los dos brazos de heterominicuerpo mediante un puente disulfuro se podría confirmar con la banda 60 kD "enmugrecida" demostrando la glicosilación del dominio extracelular CD80.

Ejemplo 2.4

Análisis por flujo citométrico del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1

La unión del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 al antígeno 17-1A nativo se analizó por citometría de flujo. Las células CHO transfectadas con 200.000 17-1A (ver ejemplo 5.1) se incubaron durante 30 minutos con varias diluciones del heterominicuerpo purificado en un rango de 4 \mug/ml a 3,9 ng/ml. Después de eso, las células se lavaron dos veces en PBS y se incubaron durante otros 30 minutos con anticuerpo CD80 anti-humano murino conjugado con R-Ficoeritrina (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose CA, USA, Cat. nº 340294). Tras dos pasos de lavado final en PBS, las células se analizaron por citometría de flujo (FACS-SCAN Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose CA, USA) Para resultados ver la figura 5.

Alternativamente, las células CHO transfectadas con 17-1A se incubaron durante 30 minutos en hielo con heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 purificado a una concentración de 0,2 mg/ml. Tras lavado en PBS, las células se incubaron durante 30 minutos en hielo con un anticuerpo C_{kappa} anti-humano conjugado con FITC (Coulter, Cat.Nº 6604287) diluido 1:10, lavado de nuevo con PBS y a continuación se sometió a citometría de flujo, el resultado se muestra en la Fig. 37.

Con el fin de demostrar la interacción del brazo (B7-1) CD80 del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 con su contra-receptor CD28, se realizó un análisis por citometría de flujo en los linfocitos T CD11b^{-}CD8^{+} sencillos, que se aislaron como en el Ejemplo 6.1; las células se confirmaron por citometría de flujo estándar para expresar CD28 pero no CTLA-4, los otros contra-receptores CD80. Los linfocitos T CD11b^{-}CD8^{+} sencillos se incubaron durante 30 minutos en hielo con el heterominicuerpo M79scFVCK/CD80CH1 purificado a una concentración de 0,2 mg/ml. Tras lavado con PBS, las células se incubaron durante 30 minutos en hielo con un anticuerpo C_{kappa} anti-humano conjugado con FITC (Coulter, Cat.Nº 6604287) diluido 1:10, lavado de nuevo en PBS y a continuación sometidos a citometría de flujo. El resultado mostrado en la Fig.38 demuestra la unión del heterominicuerpo M79scFVCK/CD80CH1 a CD28; la especificidad de la unión se confirmó por bloqueo de la señal de fluorescencia con una proteína de fusión CTLA-4-Ig comercialmente disponible (R&D Systems, Mineapolis MN USA Cat.Nº 325-CT).

Ejemplo 3 Construcciones de Heterominicuerpos antiLeyscFv CD80 3.1 Construcciones de Heterominicuerpo antiLeyscFvCH1/CD80CK

Un heterominicuerpo CD80 con otra especificidad de antígeno (anti-LewisY(LeY) se construyó reemplazando la región de unión a antígeno específica 17-1A M79scFv mediante el fragmento scFv de un anticuerpo monoclonal murino dirigido contra el antígeno LewisY (LeY), expresado en muchas células tumorales epiteliales. Para la estrategia de construcción ver la figura 1 y 3. Para la generación de la cadena antiLeyscFv-CH1 el vector pEF-ADA-M79scFv-CH1 descrito en el ejemplo 1.1.2 y mostrado en la figura 3 se escindió con los enzimas de restricción EcoRI y BspEI liberando así el fragmento m79scFv incluyendo la secuencia líder eucariota N-terminal. Este fragmento scFv entonces se reemplazó por aquel anticuerpo específico de LeY también llevando un líder eucariota en su extremo N-terminal. La secuencia del correspondiente fragmento EcoRI/BspEI-DNA se muestra en la figura 6. La subclonación se llevó a cabo en la cepa XL-1 blue de E. coli siguiendo métodos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Habour, NY (1989). El plásmido de expresión resultante pEF-ADA-anti LeYscFv-CH1 se linealizó con NdeI y se transfectó en células CHO que ya estaban transfectadas con el plásmido de expresión pEF-DHFR-CTI-CD80-C_{kappa} descrito en el ejemplo 1 y mostrado en la Figura 7. La selección primaria de las dobles transfecciones resultantes se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 1. La expresión del heterominicuerpo anti-LeYscFvCH1/CD80CK aumentó a continuación mediante amplificación génica inducida por la adición del DHFR-inhibidor metotrexato (MTX) a una concentración final de 20 nM, y el aumento de desoxicoformicina (dCF) a una concentración final de 0,3 \muM descrita (Kaufman, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566).

3.2 Heterominicuerpo antiLeyscFvCK/CD80CH1

Para la construcción del heterominicuerpo antiLeYscFvCK/CD80CH1 el fragmento M79scFv se escindió del vector pEF-DHFR-M79scFv-CK descrito en el Ejemplo 1 usando los enzimas de restricción EcoRI y BspEI y reemplazado por el fragmento EcoRI/BspEI de la región de unión del antígeno del anticuerpo específico LeY como se muestra en la figura 6. La subclonación se llevó a cabo en la cepa XL-1 blue de E. coli siguiendo métodos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Habour, NY (1989)). El plásmido de expresión resultante pEF-DHFR-anti LeYscFv-CK se transfectó en células CHO seguido de la transfección del plásmido de expresión pEF-ADA-CD80-CH1 descrito en el Ejemplo 1. Con el fin de aumentar la expresión del heterominicuerpo anti-LeYscFv-CK/CD80CH1, la amplificación génica se llevó a cabo tal como se describe anteriormente para el heterominicuerpo antiLeYscFvCH1/CD80CK.

3.3.1. Análisis ELISA del heterominicuerpo antiLeyscFvCK/CD80CH1 y el heterominicuerpo antiLeyscFvCH 1/CD80CK con el conjugado LeY-BSA inmobilizado y un anticuerpo de detección anti CD80

Los sobrenadantes del cultivo de los correspondientes transfectos cultivados tras el primer paso de amplificación génica se ensayaron mediante ELISA. Con este propósito se cubrió con un conjugado de BSA comercialmente disponible del antígeno Lewis Y sintético (Alberta Research Council, Canada) placas de ELISA de 96 pocillos con el fondo en forma de U (Nunc maxisorb) (30 \mug/ml 50 \mul/pocillo) en una solución de tampón fosfato (PBS). El recubrimiento se realizó durante toda la noche a 4ºC, el bloqueo se realizó con albúmina de suero bovino 3% (BSA) en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes del cultivo del primer paso de amplificación (1.Amp) (figura 7) se añadieron y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente a diferentes diluciones elaboradas en PBS conteniendo BSA 1%.

Los heterominicuerpos unidos se detectaron mediante un anticuerpo monoclonal específico de CD80 (Immunotech, Cat Nº 1449) diluido 1:1000 en PBS 1% BSA. Tras lavar tres veces con PBS 0,05% Tween 20, un anticuerpo-IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa policlonal (Fc específico) diluido 1:5000 se añadió y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. Tras lavar cuatro veces con PBS 0,05% Tween 20, el ELISA se desarrolló finalmente añadiendo la siguiente solución de substrato: 22 mg ABTS (2,2 Azino-bis(Ácido 3-Etilbenztiazolina-6-sulfónico) sal diamonio) disuelta en 10 ml de tampón citrato 0,1M pH 5,1 conteniendo 2,3 mg de perborato sódico tetrahidrato. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de los sobrenadantes del cultivo. El precipitado coloreado se midió a 405 nm usando un lector de ELISA. Los resultados se muestran en la figura 7 demostrando la especificidad de ambas versiones de heterominicuerpos para el antígeno LeY y su estructura heterodimérica.

3.3.2. Análisis por ELISA del heterominicuerpo antiLeyscFvCK/CD80CH1 y el heterominicuerpo antiLeyscFvCH1/CD80CK con anticuerpo marcado anti-His y un anticuerpo de detección C_{kappa} anti-humano de las correspondientes transfecciones cultivadas tras el primer paso de construcciones de amplificación génica usando el recubrimiento his

Los sobrenadantes del cultivo se ensayaron mediante ELISA. Con este propósito, un anticuerpo marcado anti-His libre de BSA (Dianova, Cat No 910) se utilizó para cubrir placas de ELISA de 96 pocillos con el fondo en forma de U (Nunc maxisorb) (25 \mug/ml 50 \mul/pocillo) en un tampón fosfato (PBS). El recubrimiento se realizó durante toda la noche a 4ºC, el bloqueo se realizó con albúmina de suero bovino al 3% (BSA) en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes del cultivo del primer paso de amplificación (1.Amp) (figura 8), se añadieron y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente a diferentes diluciones elaboradas en PBS conteniendo BSA1%.

Los heterominicuerpos unidos se detectaron mediante un anticuerpo C_{kappa} anti-humano marcado con biotina
(Pierce, Cat No 31780) diluido 1:10000 en PBS BSA1%. Tras lavar tres veces con PBS 0,05% Tween 20, se añadió avidina conjugada con peroxidasa (DAKO, Hamburg Cat No P0347) y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. Tras lavar cuatro veces con PBS 0,05% Tween 20, el ELISA finalmente se desarrolló añadiendo la siguientes solución substrato: 22 mg ABTS (2,2 Azino-bis (Ácido 3-Etilbenztiazolina-6 sulfónico) sal diamonio) se disolvieron en 10 ml de tampón citrato 0,1M pH 5,1 conteniendo 2,3 mg de perborato sódico tetrahidrato. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de sobrenadante del cultivo. El precipitado coloreado se midió a 405 nm usando un lector de ELISA. Los resultados se muestran en la figura 8 conforme los resultados del anteriormente mencionado ELISA.

Ejemplo 4 Construcción de heterominicuerpos M79scFv con diferentes proteínas co-estimuladoras (CD54, CD58, CD86)

Se construyeron heterominicuerpos que contienen proteínas co-estimuladoras (CD86) o de adhesión (CD54,
CD58). CD54, CD58 y CD86 se introdujeron en ambas versiones de heterominicuerpos (ver Ejemplo 1.1 y 1.2). Los fragmentos CD54, CD58 y CD86 se obtuvieron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótidos específicos complementarios a los extremos 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos codificante por la parte extracelular de estas proteínas. El molde de cDNA usado para estas PCR se preparó por transcripción reversa del RNA total preparado a partir de diferentes líneas celulares tal como se menciona anteriormente de acuerdo a procedimientos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, cold Spring Habour, New York (1989)).

4.1 Construcción de dos versiones de heterominicuerpos M79scFv-CD54

Los heterominicuerpos CD54 se construyeron reemplazando la parte extracelular de CD80 en los heterominicuerpos descritos en el ejemplo 1 por aquellos CD54 (figura 1). La estrategia de construcción se describe posteriormente.

4.1.1. Construcción del heterominicuerpo M79scFvCH1/CD54CK

El antígeno CD54 conocido como ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular-1) pertenece a la superfamilia de Ig. Es una proteína fuertemente glicosilada que se expresa en muchas células linfoides, por ejemplo, células dendríticas. Una descripción más detallada se publica en Simmons D. et al. Nature 331 (1987) 624-626. El molde cDNA se obtiene por transcripción reversa del RNA total a partir de células HL-60 estimuladas por TPA. Para amplificar el dominio extracelular de CD54, los cebadores específicos para los extremos 3' y 5' se usaron. Estos cebadores también introdujeron sitios de escisión por restricción EcoR1 y BspE1 (5' ICAM: CTC GAA TTC ACT ATG GCT CCC AGC AGC CCC CG y 3'ICAM: GAT TCC GGA CTC ATA CCG GGG GGA GAG CAC). El posterior procedimiento de clonación y expresión fue el mismo que el descrito en el ejemplo 1.1. para el correspondiente heterominicuerpo CD80 resultando en las células CHO doblemente transfectadas (pEF-ADA M79scFvCH1, pEF-DHFR-CTI-CD54-CK; figura 3) que demuestra secretar el heterominicuerpo CD54 en el medio de cultivo celular.

4.1.2. Construcción del heterominicuerpo M79scFvCK/CD54CH1

Otra versión del heterominicuerpo CD54 se construyó reemplazando el fragmento M79scFv por el CD54 uno por el otro. Con este propósito los dos plásmidos de expresión pEF-DHFR-CTI-CD54-CK y pEF-ADA-M79scFv-CH1 descrito anteriormente se escindieron con Nde1 y BspE1, respectivamente. El fragmento que contiene CD54 se clonó en el fragmento del vector pEF-ADA que contiene CH1. El plásmido de expresión resultante pEF-ADA-CD54-CH1 (figura 3) se transfectó en células CHO (ver ejemplo 1.2.2) ya transfectadas con PEF-DHFR-M79scFv-CK (figura 3) tal como se describe en el ejemplo 1.1.1. Las células CHO doblemente transfectadas se hicieron crecer por selección tal como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 4.1.3.

ELISA en sobrenadantes del cultivo celular de los heterominicuerpos M79scFv-CD54

Para analizar la especificidad de unión 17-1A de ambas versiones de heterominicuerpos CD54 y para confirmar la asociación adecuada de CH1 y CK se llevaron a cabo dos ELISA diferentes. La unión específica del antígeno 17-1A y la estructura heterodimérica de los heterominicuerpos se muestra por incubación del sobrenadante del cultivo en antígenos 17-1A recombinantes inmobilizados y la detección de heterominicuerpos CD54 unidos mediante un anticuerpo anti-CD54. La estructura heterodimérica de los heterominicuerpos se confirmó además por incubación del sobrenadante del cultivo en anticuerpo marcado con anti-His seguido del paso de detección con anticuerpo C_{kappa} anti-humano. Para detalles acerca de ambos ELISA ver el ejemplo 4.4, figura 9 y 10.

4.2. Construcción de dos versiones de heterominicuerpos M79scFv-CD58

Los heterominicuerpos CD58 se construyeron reemplazando la parte extracelular de CD80 con los heterominicuerpos descritos en el ejemplo 1 por aquellos CD58 (figura 1). La estrategia de construcción se describe posteriormente.

4.2.1. Construcción del heterominicuerpo M79scFvCH1/CD58CK

CD58 también conocido como LFA-3 (antígeno asociado a la función linfocito) es una proteína perteneciente a la superfamilia de Ig y es el contrareceptor de CD2. Una descripción más detallada se publicó por Wallner B.P. et. al. J.Exp. Med. 166 (1987) 923-932). El molde de cDNA se obtuvo por transcripción reversa del RNA total a partir de células U937. Para amplificar el dominio extracelular de CD58 y para introducir los sitios de escisión por enzimas de restricción Xba1 y BspE1, se usaron cebadores 3' y 5' específicos (5'LFA-3 AA TCT AGA ACC ATG GTT GCT GGG AGC GAC G y 3'LFA-3 AAG TCC GGA TCT GTG TCT TGA ATG ACC GCT GC). El posterior procedimiento de clonación y expresión fue el mismo que el descrito en el ejemplo 1 excepto que se usó XbaI en lugar de EcoRI debido a su sitio EcoRI interno en el fragmento CD58-DNA y se usó una cepa de E. coli dam-metilasa deficiente con el fin de prevenir el bloqueo del sitio BspEI en el extremo 3' del fragmento CD58 debido al sitio dam superpuesto. Las células CHO doblemente transfectadas finalmente resultantes (pEF-ADA-M79scFv-CH1, pEF-DHFR-CTI-CD58-CK, ver figura 3) demostraron secretar heterominicuerpo CD58 en el medio de cultivo celular.

4.2.2. Construcción del heterominicuerpo M79scFvCK/CD58CH1

Otra versión del heterominicuerpo CD58 se construyó reemplazando el fragmento M79scFv por el CD58 uno por el otro (ver figura 1). Con este propósito dos plásmidos de expresión pEF-DHFR-CTI-CD58-Ck y pEF-ADA-M79scFv-CH1 descritos anteriormente se escindieron con Nde1 y BspE1, respectivamente. El fragmento que contiene CD58 se clonó en el fragmento del vector pEF-ADA conteniendo CH1. El plásmido de expresión resultante pEF-ADA-CD58-CH1 (figura 3) se transfectó en células CHO con pEF-DHFR-M79scFv-CK tal como se describe en el ejemplo 1. Las células CHO doblemente transfectadas se hicieron crecer por selección tal como se describe en el Ejemplo 1.

Ejemplo 4.2.3 ELISA en el sobrenadante del cultivo celular de heterominicuerpos M79scFv-CD58

Para analizar la especificidad de unión de 17-1A de ambas versiones de heterominicuerpos CD58 y para confirmar la asociación correcta de CH1 y CK, se llevaron a cabo dos ELISA. La unión específica al antígeno 17-1A y la estructura heterodimérica de los Heterominicuerpos se mostró por incubación del sobrenadante del cultivo en antígeno 17-1A recombinante inmobilizado y detección de los heterominicuerpos CD58 unidos por un anticuerpo anti-CD58. La estructura heterodimérica de los Heterominicuerpos se confirmó además por incubación del sobrenadante del cultivo en anticuerpo marcado con anti-His inmobilizado seguido de un paso de detección con un anticuerpo C_{kappa} anti-humano. Para detalles alrededor de ambos ELISA ver el ejemplo 4.4.

4.3. Construcción de las dos versiones de heterominicuerpos M79scFv-CD86

Los heterominicuerpos CD86 se construyeron reemplazando la parte extracelular de CD80 en los Heterominicuerpos descritos en el ejemplo 1 por aquellos de CD86 (figura 1). La estrategia de construcción se describe posteriormente.

4.3.1. Construcción del heterominicuerpo M79scFvCH1/CD86CK

La proteína co-estimuladora CD86 también conocida como B7-2 pertenece a la superfamilia Ig. Es una proteína fuertemente glicosilada de 306 aminoácidos. Una descripción más detallada se publicó por Freeman G.J. et. al. Science 262 (1993) 909-911. El molde de cDNA se obtuvo por transcripción reversa del RNA total de la línia celular de linfoma de Burkitt Raji. Para amplificar el dominio extracelular de CD86 se usaron cebadores 5' y 3' específicos (5'B7-2: 5'AAG TCT AGA AAA TGG ATC CCC AGT GCA CTA TG3', 3'B7-2: 5'AAT TCC GGA TGG GGG AGG CTG AGG GTC CTC AAG C3'). Estos cebadores también introdujeron sitios de escisión Xba1 y BspE1 que se usaron para clonar el fragmento de PCR CD86 en el vector Bluescript KS-CTI-M79scFv. El consiguiente procedimiento de clonación y expresión fue el mismo que el descrito en el ejemplo 1 excepto que se usó XbaI en lugar de EcoRI debido al sitio interno EcoRI en el fragmento CD86-DNA. Las células CHO doblemente transfectados finalmente resultantes (pEF-ADA-M79scFv-CH1, pEF-DHFR-CTI-CD86-CK) demostró secretar heterominicuerpos CD86 en el medio de cultivo celular.

4.3.2. Construcción del heterominicuerpo M79scFvCK/CD86CH1

Otra versión del heterominicuerpo CD86 se construyó reemplazando el fragmento M79scFv y el CD86 uno por el otro (figura 1). Con este propósito los dos plásmidos de expresión pEF-DHFR-CTI-CD86-CK y pEF-ADA-M79scFv-CH1) se escindieron con NdeI y BspE1, respectivamente. El fragmento que contiene CD86 se clonó en el fragmento vector pEF-ADA que contiene CH1. El plásmido de expresión resultante pEF-ADA-CD86-CH1 (figura 3) se transfectó en las células CHO ya transfectadas con pEF-DHFR-M79scFv-Ck tal como se describe en el ejemplo 1. Las células CHO doblemente transfectadas (pEF-DHFR-M79scFv-CK, pEF-ADA-CD86-CH1, figura 3) crecieron por selección tal como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 4.3.3 ELISA en el sobrenadante de cultivo celular del heterominicuerpo CD86

Para analizar la especificidad de unión de 17-1A de las versiones del heterominicuerpo CD86 y para confirmar la asociación apropiada de CH1 y CK se llevaron a cabo dos ELISA diferentes. La unión específica al antígeno 17-1A y la estructura heterodimérica de los Heterominicuerpos se mostró por incubación del sobrenadante del cultivo en el antígeno 17-1A recombinante y detección de los Heterominicuerpos CD86 unidos por un anticuerpo anti-CD86. La estructura heterodimérica de los Heterominicuerpos se confirmó además por incubación del sobrenadante del cultivo en anticuerpo marcado anti-His inmobilizado seguido de un paso de detección con un anticuerpo C_{kappa} anti-humano. Para detalles acerca de los ELISA ver el ejemplo 4.4 figura 9 y 10.

Ejemplo 4.4

ELISA en los sobrenadantes del cultivo celular de los heterominicuerpos M79scFv

Se realizaron dos ELISA diferentes en los sobrenadantes del cultivo celular para cada heterominicuerpo M79scFv:

La unión del antígeno 17-1A se analizó usando un antígeno 17-1A recombinante obtenido mediante expresión estable en células CHO tal como se describe (Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025). El antígeno recombinante consiste de los primeros 264 aminoácidos del antígeno 17-1A nativo también conocido como GA 733-2 (Scala, Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (1990), 3542-3546) seguido de un codón de stop. El antígeno se inmobilizó en placas de ELISA con fondo en forma de U de 96 pocillos (nunc maxisorb) a una concentración de tampón fosfato 50 \mug/ml. El recubrimiento se llevó a cabo a 4ºC durante 12 horas con 50 \mul seguido de un lavado con Tween 0,05% (PBS). El ELISA entonces se bloqueó durante 1 hora con albúmina de suero bovino (BSA) 3% / PBS y se lavó de nuevo. A continuación, el sobrenadante del cultivo celular se añadió sin diluir y a varias diluciones se incubó durante 2 horas. La detección específica era dependiente del tipo de proteínas co-estimuladoras asociadas con las diferentes versiones de heterominicuerpos. Para anticuerpos específicos y diluciones de trabajo ver la tabla 1. Tras lavar tres veces con Tween 20 0,05% PBS, se añadió un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa policlonal (Fc-específico) y se incubó a temperatra ambiente durante una hora. Tras lavar cuatro veces con PBS 0,05% Tween 20, el ELISA finalmente se desarrolló por adición de la siguiente solución substrato: 22 mg ABTS (2,2 Azino-bis (Ácido 3-Etilbenztiazolina-6-sulfónico) sal diamonio) disueltos en 10 ml de tampón citrato 0,1M pH 5,1 conteniendo 2,3 mg de perborato sódico tetrahidrato. Para los controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de con los sobrenadantes del cultivo. El precipitado coloreado se midió a 405 nm usando un lector de ELISA (figura 9). Los resultados mostrados en la figura 9 claramente demuestran que cada uno de los heterominicuerpos M79scFv construidos se podrían detectar como heterodímeros completamente funcionales en el sobrenadante de los correspondientes transfectos.

Para un segundo ELISA un anticuerpo marcado anti-His (DIANOVA: Hamburg Cat. nº DIA 910) diluido 1:40 se cubrieron placas de 96 pocillos tal como se describe anteriormente. Los sobrenadantes de todas las versiones de heterominicuerpos se añadieron puros y en varias diluciones. Un anticuerpo Ckappa anti-humano biotinilado seguido de estreptavidina conjugada con peroxidasa (1:1000) (DAKO, Hamburg Cat. nº P0347) se usó para la detección de heterominicuerpos unidos (ver tabla 1). El ELISA se desarrolló tal como se describe anteriormente. Para los resultados ver la figura 10.

Ejemplo 5 Estimulación de los linfocitos T CD4+CD45RO-sencillos por el heterominicuerpo M79scFcCK/CD80CH1

Ejemplo 5.1

Purificación de CD4+CD45RO- nativo a partir de sangre periférica de sangre de donante humanos sanos

Para analizar la función biológica del heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1, se llevó a cabo un experimento de estimulación de linfocitos T CD4+. Los linfocitos T CD4+CD45RO-, comúnmente considerados sencillos, se aislaron de la sangre periférica de donante sanos por selección negativa. Primero, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron por gradiente de densidad Ficoll (Current Protocols of Immunology, Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 1992). Tras lavar las células tres veces con un tampón fosfato (PBS) suplementado con suero de ternera fetal 2% (FCS), los linfocitos CD4+ se purificaron usando columnas de linfocitos T CD4+ comercialmente disponibles (R&D Systems, Minneapolis MN USA, Cat nº HCD43). En el próximo paso los linfocitos T CD45RO+ se eliminaron por Dynabeads M450 paramagnéticas (Dynal, Hamburg, Cat. Nº 110.02). Con este propósito, los linfocitos T CD4+ se incubaron durante 30 minutos con el anticuerpo CD45RO anti-humano de ratón (UHCL-1) a una concentración de 10 \mug/ml. A continuación las células se lavaron dos veces y después se incubaron durante otros 30 minutos con cabezas magnéticas conjugadas con anticuerpo M450 IgG1 anti-ratón de cabra. Los linfocitos T CD4+CD45RO+ que se unieron cuantitativamente a las cabezas magnéticas entonces se eliminaron mediante la aplicación de un imán. Las células remanentes fueron CD4+ y CD45RO- con una pureza del 98% tal como se confirma por citometría de flujo.

Ejemplo 5.2

Estimulación de los linfocitos T CD4+CD45RO-por incubación simultánea con el heterominicuerpo M79scFvCK/ CD80CH1 y/o anticuerpo M79scFv-antiCD3scFv de cadena simple biespecífico

Los linfocitos T CD4+CD45RO- se purificaron tal como se describe anteriormente. La estimulación se realizó en placas de fondo plano TPP de 96 pocillos. El ensayo de estimulación se llevó a cabo tal como sigue. Las células CHO 17-1A transfectadas se usaron como células estimuladoras. Esta línia celular transfectada 17-1A se generó por subclonación del fragmento de DNA codificante por la secuencia de aminoácidos completa del antígeno 17-1A también conocida como GA733-2 (Szala, Proc.Natl.Acad. Sci. USA 87(1990) 3542-3546), en el vector de expresión pEFDHFR eucariótico de acuerdo con procedimientos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Habour, NY (1989); linealización del plásmido resultante con el enzima de restricción NdeI y consiguiente transfección estable en células CHO deficientes en DHFR se realizaron tal como se describe en el ejemplo 1.1.1. La expresión de 17-1A transmembrana aumentó por amplificación génica inducida paso a paso por la adición de cantidades en aumento de DHFR inhibidor Metotrexato (MTX) a una concentración final de 500 nM, con los pasos de concentración estando entre 20 nM y 100 nM (Kaufman, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566).

Estas células se ensayaron para la expresión en membrana de 17-1A por citometría de flujo usando un anticuerpo M79 monoclonal específico de 17-1A (Göttlinger, Int.J.Cancer 38 (1986) 47-53) a una concentración de 10 \mug/ml seguido de un anticuerpo IgG + IgM (H+L) anti-ratón de cabra policlonal diluido 1:100 en PBS. Las células CHO sin transfectar como control negativo se usaron mientras que la línea celular Kato de cáncer gástrico humano 17-1A positiva, obtenido de ATCC sirvió como control positivo. Los resultados se muestran en la Figura 11. Antes de usar estas células para la estimulación de linfocitos T se irradiaron con 14000 rad, se lavaron dos veces con PBS, 2%FCS, se contaron y se diluyeron en medio (para detalles ver posteriormente) y se cultivaron en placas de 96 pocillos a un número de 25.000 células por pocillo. 50.000 linfocitos T CD4+CD45RO- se añadieron a cada pocillo resultando así en una proporción linfocito T/ célula estimuladora de 2:1. El heterominicuerpo M79scFvCK7CD80CH1 y/o el anticuerpo M79scFv-antiCD3scFv de cadena única biespecífico se añadieron en varias concentraciones tal como se muestra en (Tabla 2). Las células crecieron en medio RPMI 1640 suplementado con suero AB humano 10%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml, Glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, tampón HEPES 10 mM, mercaptoetanol 50 \muM a 37ºC 6% CO2 y 100% de humedad hasta los 12 días.

5.3. Ensayo de proliferación BrdU

Con el fin de medir la cinética de proliferación de los linfocitos T CD4+CD45R0- estimulados simultáneamente por el heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 y el anticuerpo M79scFv-antiCD3scFv de cadena simple biespecífico o estimulado tan sólo por el anticuerpo de cadena simple biespecífico, se realizó un ensayo de proliferación BrdU. Para detalles ver la descripción del producto por Boehringer Mannheim Cat.No. 1647229. Los resultados mostrados en la figura 12 claramente demuestran una proliferación celular sustancialmente aumentada inducida por heterominicuerpo más el anticuerpo de cadena simple biespecífico a aquellos inducidos por el anticuerpo biespecífico sólo.

5.4. Análisis por citometría de flujo de los linfocitos T CD4+CD45R0- estimulados con el heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 y/o el anticuerpo de cadena simple biespecífico M79scFv-anti-CD3scFv

Los niveles de expresión CD45RO y CD45RA en los linfocitos T estimulados se analizaron por citometría de flujo (FACS Scan, Becton Dickinson) en el dia 3 y 6 del experimento de estimulación. Los linfocitos T estimulados así como el control (ver ejemplo 5.1) se incubaron durante 30 minutos con diferentes combinaciones de anticuerpos listados en la Tabla 4.

Los linfocitos T se incubaron con las siguientes tres combinaciones de anticuerpos: anti CD45RO FITC / anti CD45RA PE, anti CD45RO FITC / Isotipo IgG1 PE, anti CD45RA PE/Isotipo IgG2a FITC. El porcentaje de linfocitos T cebados que intercambian a la superficie fenotipo CD45R0+/CD45RA-dependiendo de las concentraciones de heterominicuerpos y anticuerpos biespecíficos se muestra en las figuras 13 y 14 correspondiente al tiempo de estimulación en los días 3 y 6, respectivamente. El resultado final de la estimulación de linfocitos T tras 6 días también se muestra en la Figura 33.

5.5. Análisis ELISA INF-\gamma del sobrenandante del cultivo celular de los linfocitos T CD4+ estimulados

Con el fin de confirmar in vitro el cebo de los linfocitos T CD4+ mediante la combinación de heterominicuerpo u anticuerpo de cadena simple biespecífico, la concentración de INF-\gamma en el sobrenadante del cultivo de linfocitos T se determinó usando un ELISA IFN-\gamma semi-cuantitativo (Genzyme DuoSet, Genzyme Diagnostics Cambridge, MA USA Cat No. 80-3932-00) realizado de acuerdo con el manual del fabricante. Desde que INF-\gamma se secreta normalmente por TH1 cebado pero no por los linfocitos T CD4+ sencillos, los resultados mostrados en las figuras 15 y 16 demuestran que el cebo de los linfocitos T se ha llevado a cabo en presencia de ambos, heterominicuerpo y anticuerpos de cadena simple biespecíficos pero no con anticuerpo biespecífico sólo. Además, la secreción de INF-\gamma por los linfocitos T CD4+ cebados indica fuertemente la diferenciación de aquellas células en el fenotipo TH1.

Ejemplo 5.6

ELISA IL-5 - análisis del sobrenadante del cultivo celular de los linfocitos T CD4+ estimulados

Un segundo ELISA se realizó analizando la secreción de IL-5 de las células CD4+ estimuladas. No obstante el ELISA IL-5 (Genzyme DuoSet, genzyme Diagnostics Cambridge, MA USA Cat.Nº 80-5025-00) del sobrenadante del cultivo de los linfocitos T no detectó ninguna secreción de IL-5 tal como se muestra en las figuras 17 y 18. Desde que IL-5 se secreta normalmente es por linfocitos T CD4+ cebados del fenotipo TH2, la estimulación de linfocitos T combinada por el heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 y el anticuerpo de cadena simple biespecífico M79scFv-antiCD3scFv demostró inducir más el cebo de los linfocitos T TH2.

Ejemplo 5.7

ELISA IL-4 - análisis del sobrenadante del cultivo de los linfocitos T CD4+ estimulados

De forma similar al análisis IL-5 descrito en el Ejemplo 5.6, los sobrenadantes del cultivo de linfocitos T se analizaron mediante ELISA (Pharmingen, Cat.Nº 2629KI) para la presencia de IL-4, otra citocina normalmente secretada por linfocitos T CD4+ cebados del fenotipo TH2. A partir de que no se detecta más IL-4, la estimulación de los linfocitos T CD4+ sencillos con el heterominicuerpo M79scFVCK/CD80CH1 y el anticuerpo de cadena simple biespecífico M79scFv-antiCD3scFv se confirmó para inducir el no cebaje de las células TH2.

Ejemplo 6 Co-estimulación de los linfocitos T CD8+CD45RO- por el heterominicuerpo M79scFVCKCD80CH1

Ejemplo 6.1

Purificación de los linfocitos T CD8+CD45RO-sencillos de la sangre periférica de donantes humanos sanos

Para analizar la función biológica del heterominicuerpo M79scFv-CK/CD80-CH1, se realizó un experimento de estimulación de linfocitos T CD8+, comúnmente considerados como sencillos, se aislaron de la sangre periférica de donantes sanos por selección negativa. Primero, se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por gradiente de densidad de Ficoll (Current Protocols of Immunology, Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 1992). Tras lavar las células tres veces con tampón fosfato (PBS) suplementado con suero de ternera fetal 2% (FCS), los linfocitos T CD8+ se purificaron, usando columnas de linfocitos T CD8+ comercialmente disponibles (R&D Systems, Minneapolis MN USA, Cat No HCD8C-1000). Además del protocolo del fabricante se añadió 1 \mug/ml de anticuerpo CD11b anti humano murino a un cocktail de anticuerpos aportado con el fin de eliminar los linfocitos T supresores que son CD11b+/CD28-. En el próximo paso los linfocitos T CD45RO+ se eliminaron por el uso de Dynabeads M450 paramagnéticas (Dynal, Hamburg, Cat.Nº 110.02) Con este propósito los linfocitos T CD8+ se incubaron durante 30 minutos con el anticuerpo CD45RO anti-humano murino (UHCL-1) a una concentración de 10 \mug/ml. A continuación, las células se lavaron dos veces y después se incubaron durante otros 30 minutos con cabezas magnéticas conjugadas con el anticuerpo M450 IgG1 anti-ratón de cabra. Los linfocitos T CD8+CD45RO+ que se unieron cuantitativamente a las cabezas magnéticas se eliminaron por aplicación de un imán. Las células remanentes eran CD8+CD45RO-CD28+, con una pureza del 95-98%.

Ejemplo 6.2

Estimulación de los linfocitos T CD8+CD45R0-sencillos por incubación simultánea con el heterominicuerpo M79scFvCK/CD80CH1 y/o el anticuerpo de cadena simple biespecífico M79scFv-anti CD3scFv

CD8+CD45RO- se estimularon tal como se describe en el ejemplo 5 usando concentraciones de construcciones tal como se revelan en la tabla 3.

El ensayo de proliferación BrdU así como el análisis FACS se realizaron tal como se describe en el ejemplo 5. Para los resultados ver las figuras 19, 20, 21 y 34.

\newpage

Ejemplo 6.3

ELISA TNF-\gamma análisis del sobrenadante del cultivo celular de linfocitos T CD8- estimulados

Con el fin de confirmar in vitro el cebo de los linfocitos T CD8+ mediante la combinación del heterominicuerpo y el anticuerpo biespecífico, la concentración de TNF-\alpha en el sobrenadante del cultivo de linfocitos T se determinó usando un ELISA TNF-\alpha semicuantitativo (Genzyme DuoSet, Genzyme Diagnostics Cambridge, MA USA Cat No 80-3932-00) que se llevó a cabo de acuerdo con el manual del fabricante. Desde que TNF-\alpha se secreta normalmente por los linfocitos T CD8+ cebados pero no por los sencillos los resultados mostrados en la figura 22 demuestran que el cebo de los linfocitos T se ha llevado a cabo en presencia de tanto heterominicuerpo como anticuerpo biespecífico pero no con el anticuerpo biespecífico sólo.

Ejemplo 6.4

Actividad citotóxica de los linfocitos T CD8+ cebados in vitro

Durante el proceso de cebo, los linfocitos T CD8+ inicialmente sencillos adquirieron la capacidad de mediar la citotoxicidad celular diana de un modo CD80 (B7-1) independiente. La independencia CD80 (B7-1) es así un excelente marcador biológico para los linfocitos T cebados. Por lo tanto, los linfocitos T CD8+CD11b-CD45RO- inicialmente sencillos que se han cebado durante 6 días tal como se describe en el Ejemplo 6.2. se usaron como células efectoras en un ensayo de liberación de ^{51}Cr. La citotoxicidad de los linfocitos T se redireccionó contra las células Kato 17-1A positivas mediante el anticuerpo M79scFv-antiCD3scFv de cadena simple biespecífico. Tal como se muestra en la Fig.35, los linfocitos T CD8+ cebados in vitro demostraron ser elevadamente citotóxicos contra las células Kato en el ensayo de liberación de 20h-^{51}Cr aún excediendo PBMC fresco en la actividad citotóxica. En contraposición los linfocitos T CD8+ sencillos no exhibían efectos citotóxicos significativos. Como es de esperar, debido a la independencia de CD80 (B7-1), los linfocitos T CD8+ cebados in vitro no mostraron citotoxicidad redirigida aumentada en presencia del heterominicuerpo M79scFVCK/CD80CH1. Así, cebando los linfocitos T CD8+ sencillos por virtud del heterominicuerpo M79scFVCK/CD80CH1 en combinación con una señal primaria apropiada podría demostrarse claramente por un tercer parámetro además del cambio del fenotipo CD45RA/RO y la secreción de citocinas. El ensayo de liberación ^{51}Cr se llevó a cabo tal como se describe por Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025.

Ejemplo 7 Heterominicuerpo M79scFvCKantiCD3 scFv/CD80CH1

Otra versión del heterominicuerpo CD80 mostrado en la Figura 23 se construyó por adición de un fragmento abtiCD3scFv vía un enlazante Glicina_{4}-Serina_{1} al extremo C-terminal de la cadena de polipéptido M79scFvCK descrita en el ejemplo 1. Con este propósito, el fragmento de DNA codificante de esta cadena de polipéptido se escindió del plásmido de expresión pEF-DHFR-M79scFv-CK descrito en el ejemplo 1 y se subclonó en el vector pMa (Stanssens, Nucleic Acids Res.17 (1998) 441-4454) usando los enzimas de restricción EcoRI y SaII (Boehringer, Mannheim). El fragmento antiCD3scFv se amplificó por PCR a partir del DNA molde codificante por el anticuerpo de cadena simple biespecífico M79scFv-antiCD3scFv descrito por Mack, Proc. Natl. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025 usando los siguientes cebadores. El cebador 5' VHTR66CKSAC (5'-CCT GAG CTC GCC CGT CAC AAA GAG CTT CAA CAG GGG AGA GTG TGG AGG TGG TGG ATC CGA TAT C-3') introduciendo un sitio SacI y el cebador 3'VLTR66SaINotXba introduciendo los sitios de escisión SaII, NotI y XbaI (5'- ATT CTA GAG CGG CCG CGT CGA CTA TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC AGC-3'). El fragmento de PCR resultante se clonó de acuerdo con procedimientos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, cold Spring Habour, New York (1989)) en el vector pMa usando los sitios de escisión de los enzimas de restricción SacI y XbaI (Boehringer Mannheim). En el paso final el fragmento M79scFvCKantiCD3scFv total mostrado en la figura 32 se escindió del vector pMa por los enzimas de restricción EcoRI y SaII y se subclonó en el vector de expresión eucariota pEF-DHFR descrito por Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025. El plásmido de expresión resultante se transfectó en células CHO deficientes en DHFR, antes de la transfección con el plásmido de expresión pEF-ADA-CD80-CH1 descrito en el ejemplo 1. La doble transfección y la selección de las células CHO así como la producción y purificación del heterominicuerpo se realizó tal como se describe en el ejemplo 1.

Para demostrar la unión del heterominicuerpo M79scFVCKantiCD3scFv/CD80CH1 al antígeno 17-1A y para confirmar la presencia de CD80 correctamente unido así como la estructura heterodimérica del heterominicuerpo se realizó un ELISA con los sobrenadantes del cultivo celular tras la selección primaria y tras el primer paso de amplificación génica; el antígeno 17-1A recombinante se inmobilizó y el heterominicuerpo unido detectado con un anticuerpo anti-CD80 tal como se describe en el Ejemplo 1.2.3. Los resultados se muestran en la figura 40.

El aumento del nivel de expresión debido a la amplificación génica también se monitorizó mediante un ELISA; este antígeno 17-1A recombinante se inmobilizó, se incubó con el sobrenadante del cultivo conteniendo el heterominicuerpo M79scFVCKantiCD3scFv/CD80CH1 y el heterominicuerpo unido detectado con un anticuerpo marcado anti-his conjugado con peroxidasa (Roche, Cat. Nº 1965085) diluido 1:500. Los resultados se muestran en la figura 41. El procedimiento general ELISA se realizó tal como se describe en el Ejemplo 4.4.

La interacción del fragmento scFv localizado en el extremo C-terminal a CD3 en linfocitos T humanos se confirmó por citometría de flujo. Con este propósito, los linfocitos T CD8+ CD11b-positivos se aislaron, debido a que este subtipo de linfocitos T se conoce por ser CD28-negativo. El aislamiento de los linfocitos T CD8+ CD11b-positivos se llevó a cabo con columnas de linfocitos T CD8+ comercialmente disponibles tal como se describe en el Ejemplo 6.1 excepto que no se añadió anticuerpo CD11b a la mezcla de anticuerpos del fabricante. En el próximo paso, los linfocitos T CD11b-positivos se seleccionaron positivamente usando Dynabeads M450 paramagnéticos (Dynal, Hamburg; Cat.No. 110.02); con este propósito los linfocitos T CD8+ se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo CD11b anti-humano de ratón a una concentración de 10 \mug/ml. A continuación, las células se lavaron dos veces y después se incubaron durante otros 30 minutos con cabezas magnéticas conjugadas con un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra. Los linfocitos T CD8+ CD11b-positivos unidos a las cabezas magnéticas entonces se aislaron por la aplicación de un imán y entonces se confirmaron por citometría de flujo estándar para ni expresar CD28 ni CTLA-4. Los linfocitos T CD8+ CD11b-positivos entonces se incubaron durante 30 minutos en hielo con heterominicuerpo M79scFVCKantiCD3scFv/CD80CH1 purificado a diferentes concentraciones. Tras lavado en PBS, las células se incubaron con un anticuerpo C_{kappa} anti-humano conjugado con FITC (Coulter Cat. Nº 660287) diluido 1:10, se lavó de nuevo en PBS y a continuación se sometió a citometría de flujo. Los resultados mostrados en la Fig.42 claramente desmuestran la unión del heterominicuerpo a CD3 humano en linfocitos T, desde que ambos contra-receptores de CD80 estaban ausentes del particular subtipo de linfocitos T usados en este experimento. Además, estos resultados ejemplifican la funcionalidad de un polipéptido con una función receptor o ligando cuando se localiza en una posición C-terminal en el heterominicuerpo.

Un segundo derivado antiCD3scFv del heterominicuerpo M79scFVCK/CD80CH1 se obtuvo insertando un fragmento de DNA de PCR codificando el fragmento anti-CD3scFv del anticuerpo de cadena simple biespecífico (bscAb) M79scFv-antiCD3scFv descrito por Mack, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92 (1995) 7021-7025 en el sitio de restricción BspEI del plásmido de expresión pEF-DHFR-M79scFv-CK (ver Ejemplo 1.2.2). El fragmento antiCD3scFv se amplificó por PCR a partir del DNA molde codificando por bscAbM79scFv-antiCD3scFv usando el cebador 5' VHTR66BspEI (5'-GTC ACC GTC TCC TCC GGA G-3') y el cebador 3' VLTR66BspEI (5'-GTG TCC GGA TTT CAG CTC CAG CTT GGT CC-3') y se digerió con BspEI antes de clonación en pEF-DHFR-M79scFv-CK. La orientación correcta del fragmento clonado se comprobó por PCR usando los cebadores 5'VHTR66BspEI (5'-GTC ACC GTC TCC TCC GGA-G3') hibridandose inmediatamente corriente arriba de la secuencia de DNA M79scFv en el vector de expresión pEF-DHFR y secuencia 3' bisagra (5'-GGT GTG GGT GGT GTC ACC-3'). El plásmido de expresión resultante pEF-DHFR-bscAbM79scFv-antiCD3scFv-CK (ver Fig.44) se transfectó junto con el plásmido de expresión pEF-ADA-CD80-CH1 en células CHO tal como se describe en el Ejemplo 1.2.1. Es digno de atención, que en el caso que el polipéptido con función receptor o ligando fusionado al extremo N-terminal del dominio C_{kappa} del heterominicuerpo resultante (ver Fig.43) es idéntica con el anticuerpo de cadena simple biespecífico M79scFv-antiCD3scFv (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). La amplificación génica así como la producción y purificación del heterominicuerpo se realizó como se describe en Ejemplo 1.2.2.

Con el fin de confirmar el pliegue del brazo CK del heterominicuerpo bscAbM79scFv-antiCD3scFv-CK/CD80-CH1 así como la estructura heterodimérica de la molécula recombinante, uniéndose al antígeno 17-1A inmobilizado se mostró mediante ELISA, que se llevó a cabo con sobrenadantes del cultivo celular tras la selección primaria y tras el primer paso de amplificación génica. La unión del heterominicuerpo se detectó con un anticuerpo marcado anti-His conjugado con peroxidasa (Roche, Cat.No. 1965085) diluido 1:500. Los resultados se muestran en la Fig. 45. El procedimiento de ELISA general se realizó tal como se describe en el Ejemplo 4.4.

Con el fin de confirmar la presencia de CD80 correctamente plegado en el heterominicuerpo bscAbM79scFv-antiCD3scFv-CK/CD80-CH1 se llevó a cabo el siguiente ELISA con los sobrenadantes del cultivo celular tras la selección primaria y tras el primer paso de amplificación génica:

Un anticuerpo monoclonal contra CD80 humano (Immunotech, Cat. No. 1449) diluido 1:200 se inmobilizó en una placa de ELISA seguido de incubación con los sobrenadantes del cultivo celular. Por lo tanto, el heterominicuerpo capturado por un anticuerpo anti-CD80 se detectó con un anticuerpo marcado anti-His conjugado con peroxidasa (Roche, Cat.No. 1965085) diluido 1:500. Los resultados se muestran en la Fig. 46. El procedimiento de ELISA general se realizó tal como se describe en el Ejemplo 4.4.

En resumen, estos resultados ejemplifican, que el formato de heterominicuerpo también puede llevar polipéptidos con estructuras de proteína más complejas y/o funciones ligando o receptor más complejas del tipo por ejemplo anticuerpos de cadena simple biespecíficos.

Ejemplo 8 Construcciones CD80-M79scFv 8.1. Construcción CD80-M79 scFv (VL/VH) con enlazante corto (Gly_{4}Ser_{1})

Se construyó una proteína que consiste del fragmento Fv (scFv) de cadena simple del anticuerpo M79 anti 17-1A de ratón y la parte extracelular de la proteína CD80 (B7-1) co-estimuladora humana unida por un enlazante (Gly_{4}Ser_{1})_{1}
(Figura 24). El anticuerpo M79 se obtuvo tal como se describe por Göttlinger et.al. (1986) Int. J. Cancer: 38, 47-53. El fragmento scFv M79 se clonó tal como se describe por Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025. El plásmido completo se clonó en varios pasos. Primero un poli-enlazante designado CTI se insertó en el vector Bluescript KS (GenBank® número de acceso X52327) usando los sitios de escisión de enzimas de restricción XbaI y SaII (Boehringer Mannheim). La introducción del polienlazante CTI proporcionó sitios de escisión adicionales así como la secuencia codificante del enlazante (Gly_{4}Ser_{1})_{1} un marcador de seis aminoácidos de histidina y un codón de stop tal como se muestra en la Figura 2. El vector Bluescript KS + CTI se preparó por escisión con las enzimas de restricción EcoRV y XmaI (Boehringer Mannheim and New England Biolabs) con el fin de ligarse a éstas (T4 DNA, Ligase Boehringer Mannheim) con el fragmento scFv M79 escindido con EcoRV y BspEI (). El vector resultante Bluescript KS+CTI+M79 scFv se escindió de nuevo con EcoRI (Boehringer Mannheim) y BspEI con el fin de insertar el fragmento de DNA CD80 que se preparó previamente usando los mismos enzimas. Antes de subclonar, el fragmento CD80 se obtuvo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótidos específicos complementarios a los extremos 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos codificante por la parte extracelular de CD80 (Freeman G.J. et. al. J. Immunol. 143, (1989) 2714-2722). Estos cebadores también introducen un sitio de escisión EcoRI y BspEI (5'CD80 Cebador: 5'GCA GAA TTC ACC ATG GGC CAC ACA CGG AGG CAG 3'; 3'CD80 Cebador: 5'TGG TCC GGA GTT ATC AGG AAA ATG CTC TTG CTT G 3'). El molde de cDNA usado para esta PCR se preparó por trascripción reversa del RNA total preparado a partir de una línia celular Raji de linfoma de Burkitt de acuerdo con procedimientos estándar (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbour Laboratory Press, cold Spring Habour, New York (1989)).

La proteína co-estimuladora CD80 pertenece a la superfamilia de Ig. Es una proteína fuertemente glicosilada de 262 aminoácidos. Una descripción más detallada se publicó por Freeman G.J. et. al. J. Immunol. 143, (1989) 2714-2722.

En el último paso, el fragmento de DNA (VL/VH) CD80-M79scFv total (figura 25) se aisló por escisión con el vector Bluescript KS+CTI+CD80+M79scFv (VL/VH) con EcoRI y SaII (Boehringer Mannheim) y a continuación se introdujo en el vector de expresión eucariota pEF-DHFR descrito en Mack et. al. Proc. Natl. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025, conteniendo el gen dihidrofolatoreductasa como marcador de selección. El plásmido final se linealizó con el enzima de restricción NdeI (Boehringer Mannheim) y se transfectó en células CHO por electroporación. Las condiciones de electroporación fueron 260V / 960 \muF usando un BioRad Gene Pulser™. La expresión estable se realizó en células CHO deficientes en DHFR tal como se describe por Kaufmann R.J. et. al. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566. Las células crecieron por selección en medio \alpha-MEM libre de nucleósidos suplementado con FCS dializado 10% y 2 mM L-glutamina. Para la producción de construcciones (VL/VH) scFv CD80-M79 bifuncional, las células crecieron en recipientes cilíndricos (Falcon) durante 7 días en 300 ml de medio de cultivo. La proteína se purificó mediante su marcador His al extremo C-terminal (ver figura 24) usando una columna Ni-NTA (Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025). Para analizar las propiedades de unión se realizaron diferentes ELISA:

8.1.1. ELISA con el sobrenadante del cultivo celular usando la detección del marcaje anti-His

La unión al antígeno 17-1A se analizó usando antígeno 17-1A soluble obtenido tal como se describe (Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025) por expresión estable en células CHO del DNA codificante por los primeros 264 aminoácidos del antígeno 17-1A también conocido como GA 733-2 (Scala, Proc. Natl. Acad. Sci. 87 (1990) 3542-3546) seguido de un codón de stop. El antígeno se inmobilizó en placas de ELISA de 96 pocillos con el fondo en forma de U (nunc maxisorb) a una concentración de 50 \mug/ml de tampón fosfato PBS. El recubrimiento se realizó a 4ºC durante 12 horas con 50 \mul seguido de un lavado con (PBS) Tween 0,05%. El ELISA entonces se bloqueó durante 1 hora con PBS / albúmina de suero bovino al 3% (BSA) y se lavó una vez de nuevo. Entonces se añadió el sobrenadante del cultivo celular sin diluir y a varias diluciones y se incubó durante 2 horas. Como sistema de detección un anticuerpo marcado con anti His IgG1 murino (dianova, Hamburg) diluido 1:200 y un anticuerpo IgG (Fc) anti-ratón de cabra policlonal conjugado con peroxidasa (dianova, Hamburg) se aplicaron secuencialmente. El ELISA se desarrolló por adición de una solución substrato de ABTS (2'2 Azino-bis (Ácido 3-etilbenztiazolina-6-sulfónico), SIGMA A-1888, Steinheim) tal como se describe en el ejemplo 2.1. El resultado se midió mediante un lector ELISA a una DO de 405 nm; los resultados se muestran en la Figura 26. Obviamente no se pudo mesurar ninguna actividad de unión. Como controles negativos, las placas se incubaron con PBS en lugar de con construcciones de anticuerpos. Como control positivo se usó el anticuerpo de cadena simple biespecíficos anti-171ª / anti-CD3 descrito previamente (Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025).

8.1.2. ELISA con un sobrenadante del cultivo celular usando la detección anti-CD80

La inmovilización del antígeno 17-1A, el bloqueo y la incubación de los sobrenadantes del cultivo se realizó tal como se describe anteriormente. La detección se llevó a cabo con un anticuerpo anti-CD80 IgG1 murino diluido 1:1000 (dianova, Hamburg) seguido de un anticuerpo-(Fc) IgG anti-ratón de cabra policlonal conjugado con peroxidasa diluido 1:5000 (dianova, Hamburg). El ELISA se desarrolló con una solución substrato ABTS y los valores DO se midieron tal como se describe anteriormente, no obstante, de nuevo no se detectó ninguna actividad de unión 17-1A. Como control positivo, el anticuerpo de cadena simple biespecífico anti-17-1A / anti-CD3 (Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025) se usó y detectó con el anticuerpo marcado anti-His descrito. Los resultados se muestran en la Figura 27.

8.1.3. ELISA-Análisis de la construcción CD80-M79scFv recombinante purificada

Los ELISA con los sobrenadantes del cultivo para detectar la unión específica del antígeno fueron todos negativos, el CD80-M79scFv soluble se obtuvo por purificación de proteínas a partir del sobrenadante del cultivo en el recipiente cilíndrico (300 ml) con el fin de evitar la posibilidad que ninguna proteína recombinante se secretara al sobrenadante. La purificación se llevó a cabo usando una columna de Nickel-NTA tal como se describe (Mack, M et. al. Proc. Natl. Sci. U.S.A. 92 (1995) 7021-7025). Los pocillos del ELISA se cubrieron con la proteína eluida de la columna Nickel-NTA. La detección de la construcción CD80-M79scFv bifuncional se realizó independientemente de la actividad de unión del antígeno 17-1A usando tanto un anticuerpo marcado anti His(ver ejemplo 8.1.1.) como el anticuerpo anti-CD80 (ver ejemplo 8.1.2.) en experimentos separados seguido de un anticuerpo anti-ratón IgG(Fc), respectivamente. El desarrollo del ELISA así como la medida de los valores de DO se realizó tal como se describe anteriormente. Los resultados se muestran en la Fig 28., confirmando la presencia de la construcción CD80-M79scFv en el sobrenadante del cultivo celular.

8.2. Construcción CD80 - M79 scFv (VH/VL) con el enlazante (Gly_{4}Ser_{1})_{1}

Para cambiar la disposición de las regiones variables Ig con el fragmento M79scFv de VL/VH a VH/VL se realizó una PCR de fusión en dos pasos usando cebadores de oligonucleótidos 5'VHB5RRV:AGG TGT ACA CTC CGA TAT C(A,C)A (A,G)CT GCA G(G,C)A GTC (A;T)GG, 3'VHGS15: 5' GGA GCC GCC GCC GCC AGA ACC ACC ACC ACC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G 3', 5'VLGS15:5' GGC GGC GGC GGC TCC GGT GGT GGT GGT TCT GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA 3' y 3'VLBspEI: 5'AAT CCG GAT TTG ATC TCG AGC TTG GTC CC3' se realizó de acuerdo con el procedimiento descrito por Mack et al. Proc.Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025 (ver también el ejemplo 2.1.) El fragmento de PCR codificante por el fragmento scFv VH/VL se escindió con los enzimas de restricción EcoRV/BspEI y se insertó en el vector Bluescript KS + CTI ya preparados mediante escisión con EcoRV/XmaI (ver ejemplo 8.1.) Después, el fragmento M79scFv (VH/VL) invertido se escindió con los enzimas de restricción BspEI/SaII y se introdujeron en el plásmido pEF-DHFR+CTI + CD80-M79scFv (VL/VH) usando BspEI/SaII reemplazando así el fragmento M79scFv-VL/VH (ver Fig.25). Los procedimientos de transfección y cultivo celular se realizaron tal como se describe anteriormente. El análisis de la unión de antígeno se realizó usando el 17-1A ELISA descrito (ejemplo 8.1.2.) No obstante, ninguna actividad 17-1A de la construcción CD80-M79scFv alternativamente dispuesto se puede detectar. Los resultados se muestran en la Fig 29.

8.3. Construcción CD80-M79 scFv (VH/VL) con un enlazante (Gly_{4}Ser_{1})_{3} largo

Primero, el fragmento M79scFv (VH/VL) se obtuvo mediante una PCR de fusión en dos pasos tal como se describe en el ejemplo 8.2. El fragmento PCR codificante por el fragmento VH/VL-scFv se escindió con los enzimas de restricción EcoRV/BspEI y se subclonó en el vector Bluescript KS + CTI escindido EcoRV/XmaI (ver ejemplo 8.1.), En un paso posterior un enlazante Glicina-Serina más largo (Gly_{4}Ser_{1})_{3} consistente de 15 aminoácidos se introdujo. Por lo tanto, otro enlazante de oligonucleótidos (ACCGS15BAM) que se designó para codificar el enlazante (Gly_{4}Ser_{1})_{3} y para proporcionar BspEI y BamHI compatible saliente tiene que insertarse en el Bluescript KS + CTI + M79 scFv (VH/VL) (ejemplo 8.2). La secuencia de nucleótidos del enlazante se muestra en la Fig 30.

El plásmido Bluescript KS + CTI + M79 scFv (VH/VL) incluyendo la secuencia codificante (Gly_{4}Ser_{3})_{3} se escindió con BspEI y SaII y el fragmento de DNA resultante (Gly_{4}Ser_{1})_{3}+M79scFv (VH/VL) se insertó en el vector pEF-DHFR escindido con BspEI/SaII que contiene el fragmento codificante por CD80 (ejemplo 8.1.) reemplazando así el fragmento M79scFv (VL/VH) junto con el enlazante corto (Gly_{4}Ser_{1})_{1} (ver Fig. 25). Para los procedimientos de transfección y cultivo celular del ejemplo 8.1. La unión específica del antígeno se analizó por ELISA 17-1A tal como se describe anteriormente (ejemplo 8.1.1.) y la detección de la proteína recombinante funcional en el sobrenadante del cultivo celular se realizó con un anticuerpo marcado anti His seguido de un anticuerpo IgG (Fc) anti-ratón (compara ejemplo 8.1.1.) El anticuerpo de cadena simple biespecífico anti-17-1A / anti-CD3 (Mack et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. 92 (1995) 7021-7025) sirve como control positivo. El desarrollo del ELISA y la medida de los valores DO se realizó tal como se describe anteriormente (ejemplo 8.1.1.) No obstante, ninguna unión del antígeno fue detectable. Los resultados se muestran en la Fig. 31.

Ejemplo 9 Los resultados de la expresión impredecibles en células huésped mamíferas de proteínas recombinantes que llevan dominios de oligomerización establecidos en E. coli

Con el fin de encontrar, si la viabilidad de las estrategias de oligomerización de los polipéptidos en células huésped mamíferas se puede predecir por su uso exitoso en E. coli, dos dominios de oligomerización diferentes caracterizados en sistemas de expresión bacterianos se ensayaron en proteínas de fusión expresadas en celulas mamíferas (Pack (1993) Biotechnology 11: 1271; Rheinnecker (1996) J. Immunol. 157: 2989). La primera proteína de fusión, que se ensayó, consiste de dos dominios funcionales, el fragmento M79scFv específico 17-1A en el extremo N-terminal y la IL-2 humana en el extremo C-terminal; entre esos dos dominios funcionales, aún se insertó un dominio de dimerización o tetramerización resultando en cadenas de polipéptido mostradas en las Figuras 47 y 48, respectivamente. Los fragmentos de DNA correspondientes se clonaron en el vector de expresión pEF-DHFR con los enzimas de restricción EcoRI y SaII y se transfectaron en celulas CHO deficientes en DHFR tal como se describe (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025) (notar que ambas secuencias de DNA mostradas en las figuras 47 y 48 conllevan un sitio de reconocimiento interno para EcoRI, requiriendo así la digestión parcial con su enzima de restricción). Los sobrenadantes del cultivo de las celulas CHO transfectadas así como los correspondientes lisados celulares preparados de acuerdo con procedimientos estándar se ensayaron mediante ELISA. El antígeno 17-1A recombinantes inmobilizado se incubó con el sobrenadante del cultivo o lisado celular y la construcción unida se detectó con un anticuerpo marcado anti-His conjugado con peroxidasa (Roche, Cat. No. 1965085) diluido 1:500. El procedimiento de ELISA general se realizó tal como se describe en el Ejemplo 4.4. Los resultados mostrados en la Fig.50 demuestran, que sólo la construcción tetramérica y no la dimérica se encuentra en el sobrenadante así producido como una proteína secretable y totalmente funcional en células de mamíferos, aunque ambas son bien detectables en el lisado celular. En conclusión, el dominio de dimerización demuestra no ser generalmente aplicable para las estrategias de oligomerización en células huésped mamíferas.

Con el fin de además ensayar el dominio de tetramerización prometedor, se insertó en otra proteína de fusión que se asemeja estrechamente a la construcción M79scFv-IL-2. Este polipéptido consiste del fragmento DC8scFv (Schäekel, Eur. J. Immunol. 28 (1998), 4084-4093) en el extremo N-terminal y el dominio extracelular del erbB2 humano en el extremo C-terminal (notar que el dominio extracelular del erbB2 humano es bien secretado por celulas mamíferas como IL-2 humana). La cadena de polipéptido completa se muestra en la Fig.49. El fragmento de DNA correspondiente también se clonó en el vector de expresión pEF-DHFR con los enzimas de restricción EcoRI y SaII y se transfectaron en celulas CHO deficientes en DHFR tal como se describe (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025). El sobrenadante del cultivo de las células CHO transfectadas así como el correspondiente lisado preparado de acuerdo con los procedimientos estándar se ensayaron mediante un ELISA de Sándwich específico de erbB2 basándose en los dos anticuerpos anti-erbB2 (7C1 quimérico y Her81 murino) que reconocen diferentes epítopos permitiendo la unión simultánea al antígeno. 7C1 quimérico, inmobilizado en una placa ELISA se incubó con varias diluciones del sobrenadante del cultivo o el lisado celular capturando así construcciones DC8scFv-erbB2_{EC} tetraméricos, que pueden entonces detectarse con Her81 de ratón seguido de un anticuerpo IgG anti-ratón de cabra policlonal conjugado con peroxidasa Fc-específico (Dianova, Hamburg; Cat.No. 115-035-071) diluido 1:5000. Como control positivo se hicieron diluciones equivalentes del sobrenadante del cultivo y el lisado celular de la construcción M79scFv-IL-2 tetramérica se analizó en paralelo con el ELISA descrito anteriormente; los resultados se muestran en la Fig. 51A. El procedimiento general ELISA se realizó tal como se describe en el Ejemplo 4.4.

Los resultados mostrados en la Fig.51B demuestran, que en contraposición a la construcción M79scFv-IL-2 tetramérica, la construcción CD8scFv-erbB2_{EC} tetramerica estrechamente relacionada no es detectable en el sobrenadante y así no es producible como secretable la proteína totalmente funcional en células de huésped mamíferas, aunque están sin duda presentes en el lisado celular. En conclusión, el dominio de tetramerización también falló para demostrar la aplicabilidad general para las estrategias de oligomerización en células huésped mamíferas.

Aunque ambos dominios de oligomerización están bien establecidos para la oligomerización de polipéptidos en E. coli y se conciben en la literatura por ser apropiadas proteínas de fusión del tipo ensayado en este ejemplo (Rheinnecker (1996) J. Immunol. 157: 2989), éstos claramente fallan al lograr este objetivo generalmente en células huésped de mamíferos. Así, aparece como un principio común, el uso exitoso de los dominios de oligomerización en E. coli no predice su aplicabilidad general en células huésped de mamíferos.

Ejemplo 10 Diseño de un heterominicuerpo con dominios efectores presentes en todas las cuatro posiciones

El formato de heterominicuerpo principalmente permite la adición de cuatro dominios efectores distintos en dos posiciones C-terminales y dos posiciones N-terminales presentes en el núcleo de los dominios Ckappa y C_{H1} unidos por un puente disulfuro (ver Figura 52). Mientras que los ejemplos previos muestran que los dominios efectores, tales como Fvs (scFvs) de cadena simple y moléculas co-estimuladoras, retienen su funcionalidad en el extremo N-terminal del heterominicuerpo, no está claro si los dos dominios efectores pueden unirse funcionalmente al mismo tiempo en las posiciones C-terminales de C_{H}1 y Ck (kappa). Un pliegue inapropiado, el impedimiento estérico por las secuencias N-terminales o los impediemientos mútuos pueden perturbar la actividad de los dominios efectores unidos al extremo C-terminal de los heterominicuerpos, o prevenir la expresión de tales heterominicuerpos en células mamíferas.

Con el fin de demostrar que, primeramente, los heterominicuerpos se pueden elaborar con todas las cuatro posiciones estando unidas a dominios efectores y, en segundo lugar, que los dos dominios añadidos C-terminales retienen su actividad biológica, se diseñó el heterominicuerpo mostrado en la Figura 53. En esta molécula, un Fv de cadena simple ("HD70 scFv" correspondiente a los nucleótidos 96 a 842 tal como se describe en cualquiera de las dos secuencias de oligonucleótidos mostradas en la Figura 55a y 55b. El correspondiente anticuerpo HD70 se describe en WO98/46645) está unido por el extremo N-terminal al dominio C_{H}1 humano que lleva en su extremo C terminal el factor estimulador de colonias macrófagos (GM-CSF)/ granulocitos citocinas inflamatorias humanas, más una secuencia de hexahistidina para facilitar la purificación. Para una segunda cadena de polipéptido, el dominio Ck humano también tenia unido HD70 scFv a su extremo N-terminal pero la interleucina-2 citocina inflamatoria humana (IL-2) unida a su extremo C-terminal. Con fin de proporcionar una unión flexible, un enlazante serina-glicina se puso entre los dominios C_{H}1 y C_{k} y las citocinas unidas C-terminalmente. HD70 scFv específicamente reconoce moléculas de adhesión celular epitelial humanas (EpCAM; también llamado antígeno 17-1A).

Los vectores de expresión plásmidos codificando las cadenas HD70-CH1-GM-CSF y HD70-Ck-IL-2 se construyeron. Se usaron los vectores de expresión mamíferos previamente mencionados (pEF-DHFR; pEF-ADA). La disposición de varias secuencias de DNA codificantes por varios dominios en los dos vectores de expresión se muestra en la Figura 54. Para una selección correcta en las celulas de mamíferos, una secuencia codificante por un péptido líder de IgG se añadió a los extremos 5' de las construcciones. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos enteras de las dos secuencias codificantes para las cadenas HD70-CH1-GM-CSF y HD70-Ck-IL-1 se muestran en la Figura 55.

Ejemplo 11 Producción y caracterización de un heterominicuerpo anti-EpCAM con dos citocinas distintas unidas a su extremo C-terminal

Con el fin de ensayar si el heterominicuerpo mostrado en la Figura 53 se expresa y secreta, las celulas de ovario de hámster chino (CHO) se transfectaron secuencialmente usando Superfect (Qiagen) con los vectores codificantes por las dos cadenas del heterominicuerpo y células que los expresan establemente seleccionadas tal como se describe previamente. Los sobrenadantes del cultivo celular de las células CHO transfectadas de forma estable se anañizaron por FACS para ver la presencia de una actividad enlazante a las células CHO que expresan establemente EpCAM humana (ver ejemplos previos). Para detectar la unión de heterominicuerpo a las células CHO EpCAM positivas, se usó un anticuerpo GM-CSF anti-humano de ratón (Biosource, Cat. Nº AHC 2812). El segundo anticuerpo se detectó mediante un anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con FITC (Sigma, Cat. Nº F6257). Ninguna unión se vió en el sobrenadante a partir de celulas CHO no transfectadas (Figura 56, panel superior). Cantidades crecientes de sobrenadante de células CHO transfectadas de forma estable causa una respuesta creciente del valor promedio de fluorescencia al indicativo derecho de una cantidad creciente de heterominicuerpo unido a células CHO EpCAM positivas (Figura 56, paneles inferiores). Esto muestra que al menos una de las cadenas se expresa y secreta mientras que mantiene un scFv específico de EpCAM en su extremo N-terminal.

Después se ensayó si la actividad EpCAM en el sobrenadante de celulas CHO transfectadas está físicamente unido con la inmunoreactividad para las citocinas GM-CSF e IL-2. A este fin, se estableció un ELISA que captura scFvs anti-EpCAM por su unión al dominio extracelular recombinante de EpCAM (Micromet) que se usó para cubrir las placas de ELISA. Las moléculas unidas entonces se ensayaron mediante anticuerpos específicos para ver la presencia de inmunoreactividad para la IL-2 humana (Pharmingen Cat. Nº 18951D + anticuerpo anti-rata de cabra marcado con FITC (Sigma Cat.Nº F6258)) y GM-CSF humano (Sigma Cat.Nº F6257)), respectivamente. Tal como se muestra en la Figura 57 (columnas 2) el EpCAM unido ciertamente captura una actividad que inmunoreacciona fuertemente con anticuerpos a ambos IL-2 y GM-CSF. Estas reactividades no se observaron en el sobrenadante de celulas CHO no transfectadas (columnas 1). Estos datos muestran que las cadenas de heterominicuerpos se expresan y secretan, y que las citocinas que están unidas por su extremo C-terminal a las cadenas de heterominicuerpo están en una confirmación que se pueden reconocer por sus respectivos anticuerpos.

Una característica importante del formato de heterominicuerpo es la fuerte unión física de las dos cadenas de polipéptido (ver Figura 53) y ciertamente unida fisicamente en un heterominicuerpo, un ELISA se estableció en que las moléculas contenidas en el sobrenadante del cultivo celular CHO se capturan en la placa de ELISA mediante un anticuerpo a GM-CSF humana (Biosource, ver anteriormente) y, a continuación, se analizó para la reactividad con un anticuerpo anti-IL-2 (Pharmingen, ver antriormente, y estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, DAKO Cat.Nº D0396). De este modo, la captura se realizó con un anticuerpo anti-IL-2 (ver anteriormente) y la consiguiente detección usando un anticuerpo anti-GM-CSF biotinilado (Biosource Cat.Nº AHC 2919) seguido de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (DAKO Cat. Nº D0396). Los resultados mostrados en la Figura 58 (columnas 2) demuestran que, de hecho, los anticuerpos a GM-CSF o IL-2 son capaces de precipitar las inmunoreactividades de IL-2 o GM-CSF, respectivamente. Esto muestra que GM-CSF e IL-2 estan ambos asociados fuertemente en una moléculas. El sobrenadante de las celulas CHO control no mostraron ninguna de las reactividades (Figura 58, columnas 1).

Otra característica importante del formato de heterominicuerpo es la unión covalente de las dos cadenas mediante un puente disulfuro. Con el fin de demostrar que la expresión de las dos cadenas en las celulas CHO resulta en una molécula unida covalentemente que muestra reactividades para ambos IL-2 y GM-CSF, el heterominicuerpo se purificó a partir de células CHO transfectadas de forma estable mediante una cromatografía de afinidad a quelato de cobalto e intercambio de cationes. Tal como se muestra en la Figura 59 (via 1), esta purificación proporcionó una banda prominente con un peso molecular aparente de 116 kDa una vez realizado el SDS-PAGE no reductor seguido de tinción con Comassie blue. La identidad de esta banda con el heterominicuerpo correctamente ensamblado se desmostró por Western blotting usando un anticuerpo biotinilado específico para el dominio C_{K} humano (Pierce; Cat. Nº 31780). El anticuerpo se detectó por un conjugado de estreptavidina / fosfatasa alcalina (DAKO, Cat. Nº D0396). La inmunotinción para C_{K} co-migrado con la banda de 116 kDa teñida con Comassie blue (Figura 59, via 2). El peso molecular de 116 kDa consiste en la suma de los pesos moleculares calculados de las cadenas HD70-CH1-GM-CSF (54,4 kDa) y HD70-Ck-IL-1 (55,4 kDa). Las fracciones carbohidrato unidas a los sitios de N-glicosilación en los dos dominios VH HD70 pueden contarse por la diferencia de 6,2 kDa. Tal como se muestra mediante el Western blotting, la molécula de heterominicuerpo de 116 kDa también era inmunoreactiva con los anticuerpos específicos para IL-2 humana (Figura 59, via 3) y GM-CSF humana (via 4). Estos datos muestran que es posible producir una molécula de heterominicuerpo ensamblada correctamente en células CHO que son inmunoreactivas para dos citocinas distintas.

La producción de heterominicuerpos farmacéuticamente útiles rquiere que los dominios efectores unidos a los extremos N- y C-terminales retengan sus propiedades biológicas. Con el fin de ensayar si las citocinas unidas al extremo C-terminal GM-CSF e IL-2 son aún biológicamente activas en el heterominicuerpo, su actividad se determina en un ensayo de proliferación. Ambos IL-2 y GM-CSF pueden iniciar la proliferación de las celulas inmunes que llevan sus respectivos receptores de alta afinidad. El heterominicuerpo purificado se añadió a los cultivos celulares de
TF-1 (una línia de eritroleucemia humana, descrita en; Marcucci (1981) Nature 291, 79-81), que proliferan en respuesta a GM-CSf humano e IL-2 humana, respectivamente. En ambos casos, la proliferación celular se mide por el reactivo WST-1 (Boehringer Mann heim, Cat. Nº 1644807), se indujo por GM-CSF en celulas TF-1 (Figura 60) y por IL-2 en celulas CL96 (Figura 61) en una forma donde las citocinas están físicamente unidas al extremo C' de heterominicuerpo (Figuras 53). Esto muestra que ambas funciones efectoras en las posiciones C-terminales del heterominicuerpo pueden retener su actividad biológica.

En resumen, se muestra que el formato de heterominicuerpo permite la producción de moléculas altamente activas, multivalentes que pueden tener hasta cuatro dominios funcionales efectores unidos a tanto sus posiciones C-terminales como N-terminales. Se concibe que aún otros dominios efectores se pueden añadir al extremo C- y N-terminal de los dominios efectores unidos (ver Figura 52).

TABLA 1

1

TABLA 2

3

TABLA 3

4

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

5

Claims (41)

1. Un compuesto multifuncional, producido en una célula huésped de mamíferos como un heterodímero totalmente funcional y secretable de dos cadenas de polipéptidos, en donde una de dichas cadenas de polipéptidos comprende, como único dominio de región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina el dominio C_{H1} y la otra cadena de polipéptido comprende el dominio C_{L} constante de una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde dicho compuesto multifuncional además comprende, unido a dichos dominios de región constante al menos dos y hasta cuatro (poli)péptidos con diferentes funciones de ligando o receptor, en donde además al menos dos de dichos diferentes (poli)péptidos carecen de una afinidad intrínseca uno por el otro y en donde dichas cadenas de polipéptidos están unidas mediante dominios constantes.

2. El compuesto multifuncional de la reivindicación 1, en donde los dominios funcionales, con una función receptor o ligando, están unidos C- y/o N-terminalmente a dichos dominios de inmunoglobulina constantes.

3. El compuesto multifuncional de la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo al menos tres dominios funcionales, con función receptor o ligando.

4. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo cuatro dominios funcionales, con función receptor o ligando.

5. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde al menos dos dominios, con función receptor o ligando, están unidos mediante el extremo N-terminal a dichos dominios de inmunoglobulinas constantes.

6. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos uno de dichos dominios, con función receptor o ligando, está en el formato de un fragmento scFv o una parte funcional del mismo.

7. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde, al menos uno de dichos dominios, con función receptor o ligando, es un ligando co-estimulador de linfocitos T, una región de unión al antígeno específica de un antígeno asociado a un tumor, o un compuesto proteínico que proporciona la señal de activación primaria para los linfocitos T.

8. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde dicho fragmento scFv o dicha parte funcional comprende las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo M79 17-1A anti-humano de ratón, las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo Y anti-Lewis, tal como se muestra en la Fig.6, las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo anti-CD3 TR66, y/o las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo EpCAM anti-humano humano tal como se muestra en la Figura 55.

9. El compuesto multifuncional de la reivindicación 7, en donde el ligando co-estimulador de linfocitos T es una molécula de superficie celular o un fragmento del mismo expresado en celulas presentadoras de antígeno (APC).

10. El compuesto multifuncional de la reivindicación 9, en donde la celula presentadora de antígenos es una celula dendrítica.

11. El compuesto multifuncional de la reivindicación 9, en donde la molécula de la superficie celular se selecciona del grupo consistente de ligandos B7-1, B7-2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, LFA-3 y CD137.

12. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos uno de dichos dominios, con una función receptor o ligando, es una molécula efectora inmunomoduladora o un fragmento de la misma.

13. El compuesto multifuncional de la reivindicación 12, en donde dicha molécula efectora inmunomoduladora o un fragmento de la misma se selecciona del grupo consistente en citocinas, quimiocinas, factor de migración de macrófagos (MIF), receptores de linfocitos T y moléculas MHC solubles.

14. El compuesto multifuncional de la reivindicación 13, en donde dicha citocina se selecciona del grupo consistente de interleucinas, interferones, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, TNFs y VEGF.

15. El compuesto multifuncional de la reivindicación 13, en donde dicha quimiocina se selecciona del grupo consistente de IL-8, eotaxina, GRO\alpha, GRO\beta, GRO\gamma, IP10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIG, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, NAP-2, RANTES, I309, Linfotactina y SDF-1.

16. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos uno de dichos dominios, con función receptor o ligando, es un ligando FAS (CD 95 L) o un fragmento del mismo.

17. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos uno de dichos dominios, con función receptor o ligando, es un factor de crecimiento o un fragmento del mismo.

18. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde al menos uno de dichos dominios, con función receptor o ligando, es un inhibidor de la angiogénesis o un fragmento del mismo.

19. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde dicho dominio constante de una cadena ligera de inmunoglobulina es del tipo _{k}.

20. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde dichos dominios de inmunoglobulina constantes y dichos dominios ligando-receptor funcionales están unidos mediante un enlazante polipéptido.

21. El compuesto multifuncional de la reivindicación 20, en donde dicho enlazante polipéptido comprende una región bisagra Ig o una pluralidad de glicina, alanina y/o serina.

22. El compuesto multifuncional de la reivindicación 21, en donde dicha región bisagra Ig es una región bisagra IgG.

23. El compuesto multifuncional de la reivindicación 22, en donde dicha región bisagra IgG es la región bisagra superior de la IgG_{3} humana.

24. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde dichos dominios funcionales, tienen una función receptor o ligando, comprendiendo GM-CSF, IL-2 y/o (un) fragmento(s) scFv comprendiendo la regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo EpCAM anti-humano humano, tal como se muestra en la Figura 55.

25. El compuesto multifuncional de la reivindicación 24, en donde dicho GM-CSF y dicha IL-2 están unidos en el extremo C-terminal a dichos dominios constantes C_{H1} o C_{L} y en donde dicho(s) fragmento(s) scFv comprenden las regiones V_{H} y V_{L} del anticuerpo EpCAM anti-humano humano está(n) unidos por el extremo N-terminal a dichos dominios C_{H1} o C_{L} constantes.

26. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en donde dicho dominio C_{H}1 está limitado a un marcador histidina, GST, proteína A de Staphylococcus, Lex A, un marcador FLAG o un marcador MYC.

27. El compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en donde dichos dominios funcionales, con función receptor o ligando, son o se derivan de un dominio no inmunoglobulina.

28. Un polinucleótido codificando las dos cadenas de polipéptidos del compuesto multifuncional tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.

29. Un vector comprendiendo al menos un polinucleótido de la reivindicación 28.

30. Una célula huésped de mamíferos que comprende al menos un vector de la reivindicación 29.

31. La célula huésped de mamíferos de la reivindicación 30 que es una célula CHO o una célula de mieloma.

32. Un método para la producción del compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 comprendiendo el cultivo de las células huésped de la reivindicación 30 ó 31 bajo condiciones que permiten la síntesis y la secreción de dicho compuesto multifuncional, y recuperar dicho compuesto multifuncional del cultivo.

33. Una composición que comprende el compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, el polinucleótido de la reivindicación 28 o el vector de la reivindicación 29 y, opcionalmente, un compuesto proteínico capaz de proporcionar la señal de activación primaria para los linfocitos T.

34. La composición de la reivindicación 33 que es una composición farmacéutica que además comprende, opcionalmente, un vehículo y/o diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

35. La composición de la reivindicación 33 que es una composición de diagnóstico que además comprende, opcionalmente, métodos adecuados para la detección.

36. El uso de un compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, el polinucleótido de la reivindicación 28 y/o el vector de la reivindicación 29 para la preparación de una composición farmacéutica para prevenir y/o tratar el crecimiento celular maligno.

37. El uso de la reivindicación 36, en donde el crecimiento celular maligno se refiere a malignidades de las células hematopoyéticas o tumores sólidos.

38. El uso de la reivindicación 37, en donde dichas malignidades de las células hematopoyéticas son linfomas o leucemias.

39. El uso de la reivindicación 37, en donde dichos tumores sólidos son carcinomas, melanomas o sarcomas.

40. Un equipo que comprenda el compuesto multifuncional de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 y, opcionalmente, un compuesto proteínico capaz de proporcionar la señal de activación primaria para los linfocitos T.

41. La composición de la reivindicación 33, la composición farmacéutica de la reivindicación 34, la composición de diagnóstico de la reivindicación 35 o el equipo de la reivindicación 40 en donde el compuesto proteínico capaz de proporcionar la señal de activación primaria para los linfocitos T es un anticuerpo biespecífico que interactua con el antígeno CD3 de linfocitos T.