CN111378039B - 治疗恶性肿瘤的抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种治疗恶性肿瘤的抗体及其应用。本发明提供了抗ROR2抗体包括下列至少之一：(1)具有CSASSSVTYTYWYQ、IYDTSNLAS和CQQWSSYPFTFGSG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTFTSYLMHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区；与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代的氨基酸序列。该抗ROR2抗体能够高特异性与ROR2抗原结合，从而用于靶向治疗癌症。

Description

治疗恶性肿瘤的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及治疗恶性肿瘤的抗体及其应用，具体地涉及一种抗ROR2抗体及其应用。

背景技术

酪氨酸激酶孤儿样受体ROR2是重要的发育相关调节蛋白，在胚胎发育早期，多种组织中均有较高的表达和对组织的增值，分化等具有重要的作用。妊娠中期后，ROR2的表达水平逐渐下降。除了在部分成骨细胞和子宫细胞之外，ROR2在成人组织中基本不表达。而目前研究表明，ROR2在许多肿瘤组织中高表达，包括骨肉瘤，黑色素瘤，结直肠癌和胃癌，乳腺癌，淋巴瘤，白血病等癌症。因此，许多学者认为ROR2是个疾病相关的基因，且可以作为理想的药物靶点。

ROR2是一个在胚胎发育过程中大量表达并起重要作用的一个酪氨酸激酶孤儿受体，而在成体大多数的组织中很难检测到，最近几年的研究发现，虽然大多数正常组织不表达ROR2，但是许多恶性肿瘤细胞包括乳腺癌，肺癌，胰腺癌等细胞却高表达ROR2；并且，ROR2表达水平越高的癌细胞，其恶性程度越高，越容易发生转移，复发，预后越差。ROR2通常在分化程度很低的肿瘤细胞上可以检测到，这类肿瘤细胞具有很强的复发和转移能力。

然而针对ROR2的药物研发还有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种抗ROR2抗体及其应用。

本发明是基于发明人的如下研究所发现的：在肿瘤的研究过程中，作为肿瘤干细胞的表面标记物，例如CD133,CD44,CD24,ALDH1等，无论在肿瘤细胞还是在正常的成体组织中都有表达，致使针对这些表面分子开发的抗肿瘤干细胞的药物对正常组织也会造成一定的毒害。而ROR2在肿瘤干细胞也有丰富的表达，但是在正常细胞中却表达较少，因此开发出针对ROR2的治疗性抗体对正常组织的伤害会比较小。所以，ROR2是理想的药物靶点。而针对ROR2所开发出的药物可以用于肿瘤和癌症的治疗中，且对正常组织的损害会比较小。

为此，本发明提供了一种抗ROR2抗体或者抗原结合片段，以及分离的核苷酸、表达载体、重组细胞等。利用本发明提供的抗ROR2抗体或抗原结合片段，能够高特异性和ROR2抗原结合，在较低浓度下，例如0.0001μg/ml浓度下就可以表现出较高的亲和力。将其应用于肿瘤的靶向性治疗，或者制成试剂盒特异性检测ROR2抗原等，具有重要的价值。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种抗ROR2抗体或抗原结合片段，包括下列至少之一：具有CSASSSVTYTYWYQ、IYDTSNLAS和CQQWSSYPFTFGSG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有YTFTSYLMHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区；与(1)相比，具有一个以上保守氨基酸取代的氨基酸序列。本发明所提供的抗体或抗原结合片段，能够特异性结合ROR2蛋白。

根据本发明的实施例，以上所述抗ROR2抗体或抗原结合片段可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述抗ROR2抗体或抗原结合片段包括下列至少之一：

(a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区；

与(a)相比，具有一个以上保守氨基酸取代的氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:3所示的轻链和SEQ ID NO:4所示的重链。

在本发明的一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段的抗原表位为ROR2的胞外端的Kringle段。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段。

根据本发明的实施例，所述多核苷酸具有下列至少之一的核苷酸序列：SEQ IDNO:5所示的轻链可变区核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的重链可变区核苷酸序列；SEQ IDNO:9所示的轻链核苷酸序列和SEQ ID NO:10所示的重链核苷酸序列；与SEQ ID NO:5所示的轻链可变区核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列，任选具有95％以上同源性的序列，优选为具有98％以上同源性的序列，更优选为具有99％以上同源性的序列；与SEQ IDNO:6所示的重链可变区核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列，任选具有95％以上同源性的序列，优选为具有98％以上同源性的序列，更优选为具有99％以上同源性的序列；与SEQ ID NO:9所示的轻链核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列，任选具有95％以上同源性的序列，优选为具有98％以上同源性的序列，更优选为具有99％以上同源性的序列；与SEQ ID NO:10所示的重链核苷酸序列相比，具有90％以上同源性的序列，任选具有95％以上同源性的序列，优选为具有98％以上同源性的序列，更优选为具有99％以上同源性的序列。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种表达载体，包含本发明第二方面所述的多核苷酸。

根据本发明的实施例，以上所述的表达载体进一步包括：控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操作地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达。

根据本发明的实施例，所述控制元件包括下列至少之一：启动子、增强子和终止子。

根据本发明的实施例，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种重组细胞，包含本发明第三方面任一实施例所述的表达载体。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，包括培养本发明第四方面所述的重组细胞，其中所述抗体或抗原结合片段为本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段。

根据本发明的第六方面，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症，所述抗体或抗原结合片段为本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段。

根据本发明的第七方面，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于ROR2抗原的诊断检测。

在本发明的一些实施例中，所述试剂盒用于免疫印迹、免疫沉淀、ELISA检测。

根据本发明的第八方面，本发明提供了一种药物组合物，包括本发明第一方面任一实施例所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。

根据本发明的第九方面，本发明提供了一种嵌合蛋白，包括：胞外区、跨膜区和胞内区，所述胞外区包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为单链，所述抗体或抗原结合片段为本发明第一方面任一实施例所述抗体或抗原结合片段。

根据本发明的第十方面，本发明提供了一种Car-T细胞，所述Car-T细胞表达本发明第九方面所述的抗ROR2的嵌合抗原受体。将本发明提供的抗体或抗原结合片段作为单链抗体与胞内信号域蛋白，例如免疫受体酪氨酸活化基序蛋白(通常为CD3ζ)在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，即为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。而表达CAR的T细胞以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的B16Fab抗体ELASA亲和力曲线。

图2是根据本发明的实施例提供的B16嵌合抗体纯化后SDS-PAGE的鉴定结果图。

图3是根据本发明的实施例提供的不同浓度B16嵌合抗体的OD450值。

图4是根据本发明的实施例提供的ROR2抗体检测T-47D细胞(T47D)和MDA-MB-231细胞(231)ROR2的表达水平。

图5是根据本发明的实施例提供的流式分析B16嵌合抗体的结合能力。

图6是根据本发明的实施例提供的B16嵌合抗体用于内源性ROR2蛋白的免疫沉淀结果图。

图7是根据本发明的实施例提供的B16嵌合抗体用于免疫沉淀的结果图。

图8是根据本发明的实施例提供的B16嵌合抗体识别ROR2的不同区域的结果图。

图9是根据本发明的实施例提供的ROR2突变体的各结构区域的示意图。

图10是根据本发明的实施例提供的293T-R2-KO细胞转染不同片段的突变质粒后的B16的流式结果图。

图11是根据本发明的实施例提供的B16介导的ADCC作用对T47D细胞的杀伤作用结果。

图12是根据本发明的实施例提供的B16嵌合抗体的体内药效动力学结果图。

图13是根据本发明的实施例提供的免疫印迹的结果图。

图14是根据本发明的实施例提供的乳腺癌细胞系T47D经过不同浓度B16嵌合抗体处理的侵袭实验显微镜结果图。

图15是根据本发明的实施例提供的乳腺癌细胞系T47D经过不同浓度B16嵌合抗体处理的侵袭实验细胞计数图。

图16是根据本发明的实施例提供的B16嵌合抗体对于病人来源的肿瘤移植组织的原代细胞的侵袭能力的影响结果图。

图17是根据本发明的实施例提供的B16嵌合抗体对于淋巴瘤细胞系Jeko-1侵袭能力的影响结果图。

图18是根据本发明的实施例提供的B16嵌合抗体对于乳腺癌细胞T47D的成球能力的影响结果图。

图19是根据本发明的实施例提供的B16嵌合抗体对于类器官的影响结果图。

图20是根据本发明的实施例提供的将B16嵌合抗体免疫后小鼠中肿瘤大小的变化图

图21是根据本发明的实施例提供的将B16嵌合抗体免疫后小鼠中肿瘤重量的变化图。

图22是根据本发明的实施例提供的经过B16嵌合抗体处理后PDX肿瘤细胞检测结果图。

图23是根据本发明的实施例提供的经过B16嵌合抗体处理后PDX肿瘤细胞检测结果图。

图24是根据本发明的实施例提供的B16-CAR结果图。

图25是根据本发明的实施例提供的流式细胞检测能够表达CAR-T的淋巴细胞的结果图。

图26是根据本发明的实施例提供的CAR-T的淋巴细胞的细胞毒性实验结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在对本发明描述的过程中，对于本文中有关的术语进行了解释和说明，这些解释和说明仅仅是为了方便对于方案的理解，并不能看做是对本发明保护方案的限制。

抗体

本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。

在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。

本发明利用ROR2胞外段，通过免疫获得了高特异性的高亲和力的抗ROR2的Fab(antigen-binding fragment)抗体片段。利用该抗体片段能够与ROR2抗原特异性结合，从而可以靶向性***等疾病。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或者抗原结合片段，所述抗体或者抗原结合片段具有CSASSSVTYTYWYQ、IYDTSNLAS和CQQWSSYPFTFGSG所示的轻链可变区，YTFTSYLMHWV、LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CARSDVYYGVRFAYWGQG所示的重链可变区。在另一些实施方案中，本发明所提供的抗体或者抗原结合片段与上述重链和轻链相比，具有一个以上保守氨基酸取代。“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原(ROR2)能力的抗体片段。“保守氨基酸取代”指的是氨基酸被另一氨基酸发生生物学上、化学上或者结构上相似的残基所取代。生物学上相似的指的是该取代不破坏ROR2抗体或者与ROR2抗原的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:1所示的轻链可变区序列和SEQ ID NO:2所示的重链可变区序列。在另一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区序列与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，具有一个以上保守氨基酸取代。当然，这些保守氨基酸取代不会对抗体或者抗原结合片段的生物学功能带来改变。在一些具体方式中，这些保守氨基酸取代可以发生在重链可变区和轻链可变区中除了CDR区之外的氨基酸上。

其中，轻链可变区序列(VL，SEQ ID NO:1)为：

DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVTYTYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPFTFGSGTKLEIK。

其中重链可变区序列(VH，SEQ ID NO:2)为：

QLQLQQSGPELVKPGASVRMSCKAAGYTFTSYLMHWVKQRPGQDLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKATLTSDKSSSTVYMELSSLTSEDSAVYYCARSDVYYGVRFAYWGQGTLVTVSA。

在一些优选方案中，本发明提供了一种抗ROR2抗体，该抗体具有SEQ ID NO:3所示的轻链以及SEQ ID NO:4所示的重链，

其中SEQ ID NO:3氨基酸序列为：

DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVTYTYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；

其中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为：

QLQLQQSGPELVKPGASVRMSCKAAGYTFTSYLMHWVKQRPGQDLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKATLTSDKSSSTVYMELSSLTSEDSAVYYCARSDVYYGVRFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

多核苷酸、表达载体、重组细胞

在制备或者获取这些抗体的过程中，可以利用表达这些抗体的多核苷酸，与不同的载体连接，然后在不同细胞中表达，来获得相应抗体。

为此，本发明还提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码上述所述的抗体或抗原结合片段。

在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸为：

编码轻链可变区SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)为：gacatcgtgctgacccagtctccagccatcatgtctgctagccctggcgagaaagtgacaatgacctgctccgcctcctcctccgtgacctacacctactggtatcagcagaagcccggctccagtcctcggctgctgatctacgatacctccaacctggcttctggcgtgcccgtgcggttttctggttctggctctggcacctcctacagcctgaccatctccagaatggaagccgaggatgccgccacctactactgtcagcagtggtctagctaccccttcacctttggctccggcaccaagctggaaatcaag。

编码重链可变区SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列为(SEQ ID NO:6)：cagttgcagctccagcagtctggacctgagctggttaagcctggtgcctccgtccggatgtcttgcaaggctgccggctacaccttcaccagctacctgatgcactgggtcaagcagaggccaggccaggacttggagtggatcggctacatcaacccctacaacgacggcaccaagtacaacgagaagttcaaggacaaggctaccctgacctccgacaagtcctcctccaccgtgtacatggaactgtccagcctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccagatccgatgtgtactatggcgtcagattcgcctactggggccagggcacactggtcacagtttctgct。

在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与上述SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。在至少一些实施方案中，所述分离的多核苷酸与所述SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列至少具有90％以上的同源性，优选具有95％以上的同源性，更优选具有98％、99％以上的同源性。这些与SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:6所示核苷酸序列具有同源性的序列，能够表达与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相似的氨基酸，从而能够与ROR2抗原特异性结合，实现抗体的靶向性功能。

在一些优选实施方式中，所述分离的多核苷酸具有SEQ ID NO:7所示的轻链核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的重链核苷酸序列。这些核苷酸序列经过种属优化，更易在哺乳动物细胞中表达。

其中，轻链的核苷酸序列为(SEQ ID NO:7)：

gacatcgtgctgacccagtctccagccatcatgtctgctagccctggcgagaaagtgacaatgacctgctccgcctcctcctccgtgacctacacctactggtatcagcagaagcccggctccagtcctcggctgctgatctacgatacctccaacctggcttctggcgtgcccgtgcggttttctggttctggctctggcacctcctacagcctgaccatctccagaatggaagccgaggatgccgccacctactactgtcagcagtggtctagctaccccttcacctttggctccggcaccaagctggaaatcaagagaacagtggccgctcctagcgtgttcatcttcccaccttccgacgagcagctgaagtctggcacagcctctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaatagccaagagagcgtgaccgagcaggacagcaaggactctacctacagcctgagcagcaccctgacactgagcaaggccgactacgagaagcacaaagtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctttctagccctgtgaccaagagcttcaaccggggcgaatgt。

其中，重链的核苷酸序列为(SEQ ID NO:8)：

cagttgcagctccagcagtctggacctgagctggttaagcctggtgcctccgtccggatgtcttgcaaggctgccggctacaccttcaccagctacctgatgcactgggtcaagcagaggccaggccaggacttggagtggatcggctacatcaacccctacaacgacggcaccaagtacaacgagaagttcaaggacaaggctaccctgacctccgacaagtcctcctccaccgtgtacatggaactgtccagcctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccagatccgatgtgtactatggcgtcagattcgcctactggggccagggcacactggtcacagtttctgctgcctctacaaagggccctagtgtgttccctctggctcccagcagcaagtctacatctggcggaacagccgctctgggctgcctggtcaaggattactttcccgagcctgtgaccgtgtcctggaatagcggagcactgacaagcggcgtgcacacctttccagctgtgctgcaaagcagcggcctgtactctctgagcagcgtggtcacagtgcctagctctagcctgggcacccagacctacatctgcaatgtgaaccacaagcctagcaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagagctgcgacaagacccacacctgtcctccatgtcctgctccagaactgctcggcggaccttccgtgttcctgtttcctccaaagcctaaggacaccctgatgatcagcagaacccctgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggatcccgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaacagcacctacagagtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgctcctatcgagaaaaccatcagcaaggccaagggccagcctagggaaccccaggtttacacactgcctccaagcagggacgagctgaccaagaatcaggtgtccctgacctgcctcgtgaagggcttctacccttccgatatcgccgtggaatgggagagcaatggccagcctgagaacaactacaagacaacccctcctgtgctggacagcgacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtccagatggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgtctcctggcaaa。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述分离的多核苷酸。在将上述分离的多核苷酸连接到载体上时，可以将多核苷酸与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制多核苷酸的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，多核苷酸与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的***到不同的载体上，常见的是***到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。例如pcDNA质粒。

本发明还提供了一种重组细胞，该重组细胞中包含有该表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，构建获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本发明提供的抗体或者抗原结合片段。通过该重组细胞进行培养，即可以获得相应抗体。这些可用的哺乳动物细胞例如可以为293F细胞，CHO细胞等。

药物组合物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的抗体或者抗原结合片段和药学可接受的载体。

本文提供的抗ROR2抗体可以掺入适合受试者施用的药物组合物中。通常，这些药物组合物包括本文提供的抗ROR2抗体以及药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇)或氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。

例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。

当然，本文中的抗ROR2抗体还可以根据需要被制成试剂盒或者其他诊断性试剂的一部分。根据本发明的实施例，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述ROR2抗体。应用本发明提供的试剂盒，例如可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用ROR2抗原和抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗ROR2抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗ROR2抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。这种相关疾病可包括ROR2相关疾病，例如各种癌症等等。当然本文提供的抗体也可以用于癌症的放射免疫检测和放射免疫治疗等等。

这些癌症或者肿瘤可以是任何不受调控的细胞生长。具体地，可以是肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等等。

在利用本发明所提供的抗ROR2抗体治疗癌症时，可以将本发明提供的抗ROR2抗体提供给受试者即可。为此，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用本发明所提供的的抗体或其抗原结合片段。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本申请通过研究，开发了基于ROR2的抗多种肿瘤细胞甚至肿瘤干细胞的基于抗体的免疫治疗方法，包括ROR2的单克隆抗体，及新型的ROR2-Car T细胞治疗技术。

实施例1

我们利用ROR2蛋白，通过免疫小鼠，并借助于噬菌体文库技术，筛选得到B16抗体，该抗体的ELISA检测如图1所示。其中图1中横坐标代表B16的Fab抗体的浓度，分别为0.033，0.134，0.535，2.138，8.552，34.210，136.838，547.352ug/ml，纵坐标代表所测定的OD450值。从图1可以看出，在B16的Fab抗体浓度为8.552ug/ml时，ELISA检测显示抗体亲和力基本达到饱和，说明该抗体具有较高的亲和力。

对该抗体样本进行氨基酸测序，氨基酸序列如下：

其中，该抗体的轻链可变区序列为SEQ ID NO:1所示；该抗体的重链可变区序列为SEQ ID NO:2所示。其对应轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示，重链氨基酸序列为SEQ IDNO:4所示。

实施例2

(一)抗ROR2的单克隆抗体B16嵌合抗体的表达与纯化

利用B16抗体的氨基酸序列推导出其DNA序列，并根据表达载体进行种属优化后建立嵌合抗体的表达序列，并克隆进pcDNA3.4载体内。再将构建好的质粒用PEI转染到293F细胞中，进行表达48小时。48小时后，回收上清，用ProteinA柱子进行纯化和层析/浓缩。纯化后的蛋白用SDS-PAGE胶进行鉴定，结果如图2所示，结果显示我们纯化的抗体具有较高的纯度。表达种属优化对氨基酸序列没有改变，只对核苷酸序列做了改变，根据表达的宿主，进行密码子优化，使得更易在哺乳动物细胞中表达。

需要说明的是，所获得的B16嵌合抗体与实施例1所述的B16抗体的氨基酸序列相同，其轻链氨基酸序列均为SEQ ID NO:3所示，重链氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示：只不过将表达B16抗体的核苷酸序列进行了优化，即B16嵌合抗体对应核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示，对应核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示。

其中图2中，从左向右，第一列代表为上样量为2.0μg的非还原性B16抗体样本的SDS-PAGE胶鉴定结果，第二列代表蛋白marker，第三列代表上样量为2.0μg的还原性B16抗体样本的SDS-PAGE胶鉴定结果，第四、五、六列分别代表上样量为0.5，1.0，2μg的还原性胎牛血清蛋白(BSA)样本的SDS-PAGE胶结果。

从图2可以看出，SDS-PAGE胶中显示还原性和非还原性的B16抗体与正常普通抗体条带大小一致，条带灰度值接近2μg的还原性胎牛血清蛋白(BSA)样本，说明我们纯化的B16嵌合抗体具有较高的纯度。

(二)ELISA验证纯化的ROR2抗体(B16嵌合抗体)的亲和力

96孔板中加入ROR2胞外段蛋白包被过夜，5％牛奶封闭后，将纯化好的抗体进行稀释成不同浓度加入不同孔中，进行ELISA检测。OD450测定值如图3所示，图3代表不同浓度B16嵌合抗体的OD450值，其中横坐标代表B16嵌合抗体的浓度，分别为0.01μg/ml、0.001μg/ml、0.0001μg/ml、0.00001μg/ml和0.000001μg/ml。可见即便在B16嵌合抗体的浓度较低时(0.001μg/ml)，B16嵌合抗体就已经具有较高的亲和力。其中IgG抗体作为阴性对照。

(三)B16嵌合抗体可以用于流式分析

将纯化得到的B16嵌合抗体进行流式分析，检测293T细胞(ROR2表达阳性)，MDA-MB-231乳腺癌细胞(ROR2表达阴性，见图5)和T47D乳腺癌细胞(ROR2表达阳性，见图5)的ROR2水平。其中，检测293T细胞的B16嵌合抗体的浓度分别为1μg/ml、5μg/ml和10μg/ml，检测MDA-MB-231乳腺癌细胞和T47D乳腺癌细胞的B16抗体浓度为5ug/ml。其中图4为用Santacruz公司的ROR2抗体(货号：sc-374174)检测两种细胞(T47D乳腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞)的ROR2水平。

流式结果如图5所示，B16嵌合抗体能识别ROR2表达阳性的T47D细胞和293T细胞，不能识别ROR2表达阴性的231细胞；当用不同浓度检测293T细胞时，流式的荧光强度呈梯度变化，说明我们的抗体能特异性结合ROR2膜蛋白，且当B16抗体在1μg/ml较低的浓度时，流式检测即达到较高的灵敏度。

(四)B16嵌合抗体可以用于免疫沉淀(IP)

为了鉴定B16嵌合抗体能否用于免疫沉淀，我们用ROR2表达阳性的293T细胞进行IP，以ROR2表达阴性的MBA-MD-231细胞作为阴性对照。两种细胞裂解后，分别用B16嵌合抗体进行IP，IP后的蛋白用Santa Cruz的ROR2抗体(货号：sc-374174)进行免疫印迹检测ROR2蛋白。结果如图6，用B16抗体IP后能在免疫印迹中用Santa Cruz的ROR2抗体检测到ROR2蛋白，表明本申请的B16嵌合抗体能用于IP，且能用于检测内源性的ROR2。其中IgG抗体作为B16的阴性对照抗体(不能将ROR2沉淀下来)，Input为未进行IP的细胞裂解液样本(表达ROR2蛋白)。

为了进一步验证B16嵌合抗体是否能进行IP，我们过表达293T细胞的ROR2受体(过表达质粒带有Flag标签)。然后分别用B16嵌合抗体和Flag抗体进行IP，分别用Flag抗体和B16嵌合抗体进行免疫印迹(IB)。结果如图7所示，结果显示不管是B16嵌合抗体还是Flag进行IP，IB结果中都能检测到ROR2(130kD)条带。其中IgG抗体作为B16的阴性对照抗体(不能将ROR2沉淀下来)，Input为未进行IP的细胞裂解液样本(表达ROR2蛋白)。

图6和图7结果表明，不管是内源性的细胞裂解液样本还是过表达ROR2的细胞裂解液样本，都能用B16嵌合抗体沉淀出ROR2蛋白。这说明本申请的B16抗体能用于免疫沉淀，且能用于内源性和外源性ROR2的免疫沉淀。

(五)B16嵌合抗体抗原表位的确定

为了寻找B16嵌合抗体所结合的抗原表位，我们构建了带Flag标签(Flag标签是由八个亲水氨基酸DYKDDDDK组成的多肽片段，能够与蛋白融合，而且不会占据蛋白表位或者结构域，避免影响蛋白的功能、分泌性以及转运等各方面性能，利用flag标签标记目的蛋白，若标签有表达，目的蛋白也会表达)的来自于ROR2蛋白不同区域的突变质粒(B1～B8)，所用到的质粒为pcDNA3.0质粒。其中人源的ROR2蛋白的全长序列包括SP区域、Ig-like区域、CRD区域、Kringle区域、Kinase区域、S/T1区域、Pro区域以及S/T2区域。各部分以及对应功能可以参考文献Debebe Z,Rathmell W K.Ror2as a Therapeutic Target in Cancer[J].Pharmacology&Therapeutics,2015,150:143-148。其中B1～B8分别对应ROR2蛋白的全长序列(full length hROR2)、缺失d-Ig-like区域的ROR2突变体、缺失d-CRD区域的ROR2突变体、缺失d-Kringle区域的ROR2突变体、缺失d-Kinase区域的ROR2突变体、缺失d-750区域的ROR2突变体、缺失d-S/T1区域的ROR2突变体和突变Y641，645，646F三个位点的ROR2突变体。

然后用PEI分别将以上突变质粒转染入293T细胞中。经过48小时的表达后，将转染了ROR2不同区域突变质粒的细胞进行裂解，通过western blot方法，分别用B16嵌合抗体，Flag抗体和Santa Cruz公司的ROR2抗体(货号：sc-374174)检测其ROR2蛋白的表达。

结果显示，能在所有转染了质粒的样品中检测到Flag标签，这说明突变质粒均成功转染到细胞内部；而当用B16嵌合抗体检测时，除了B4区域(即Kringle区域)外其他样品均能检测到相应大小的条带，这说明我们B16嵌合抗体识别的ROR2胞外段中的Kringle区域(图8和图9所示)。

另外，转染了ROR2不同突变区域质粒的293T ROR2敲除细胞(293T-R2-KO)进行流式分析，如图10所示，结果也显示ROR2胞外端区域(B1-B4)中，只有B4(Kringle区域)段突变后，B16无法识别转入表达的ROR2。综其所述，我们的B16嵌合抗体识别ROR2的Kringle区域。

(六)B16嵌合抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)

抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)是指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞等)表面的FcR结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。

ADCC杀伤实验结果如图11所示，虽然效应细胞和T细胞比例(E/T)为3：1和10：1时，其ADCC杀伤作用不显著，但当效应细胞和T细胞比例(E/T)为30：1，B16嵌合抗体具有较强的杀伤作用，在抗体浓度达到3ug/ml时，抗体介导的对乳腺癌细胞的4.5小时的杀伤作用达到40％。说明B16抗体具有ADCC作用。

(七)B16嵌合抗体的体内药效动力学

为了检测B16抗体在动物体内的半衰期，我们给小鼠尾静脉注射不同浓度的B16嵌合抗体(1g/kg，3mg/kg，10mg/kg)，分别取注射后1min，5min，2h，5h，1day，3day，7day的血清，进行ELASA检测血液中B16嵌合抗体的浓度，药效动力学曲线如图12所示。

从图12可以看出，随着时间的延长，血液中B16抗体的浓度逐渐降低，半衰期在50小时左右。10mg/kg的注射浓度相对于1g/kg，3mg/kg组能在血液中维持较久的时间。

从以上实验可以看出，通过利用免疫小鼠的脾脏构建免疫噬菌体文库，筛选高亲和力的特异识别ROR2的单克隆抗体(B16抗体)的可变区轻重链的氨基酸。进而推导出其核苷酸序列，并构建到含有人缘抗体的Fc段的质粒载体中，表达纯化获得B16嵌合抗体，并对B16嵌合抗体的亲和力及诊断功能等进行了表征，并分析获得了B16嵌合抗体的抗原表位。

总之，利用免疫库筛选特异的抗体，可以拿到尽可能多的不同的抗体序列，为找到具有功能的单克隆抗体提供了有力的条件。同时通过诊断功能的检测，我们筛选得到特异识别ROR2的抗体，可以为临床精确诊断肿瘤细胞做出帮助，为将来进入临床治疗ROR2阳性的肿瘤病人奠定基础，为将来的临床试验中提供用来预测病人对药物的反应的生物标记(biomarker)。

实施例3B16嵌合抗体的功能检测

通过功能筛选实验进一步验证了B16嵌合抗体可以抑制ROR2阳性细胞活性的单克隆抗体的生物学功能。具体而言，我们利用本实验室已经建立好的成球实验，侵袭实验，及PDX小鼠模型的肿瘤生长，转移及复发模型，筛选可以抑制肿瘤细胞形成spheroid，抑制肿瘤细胞侵袭和成瘤能力的功能性ROR2抗体。

(一)B16嵌合抗体对乳腺癌细胞系T47D侵袭能力的影响

乳腺癌细胞系T47D高表达ROR2，当利用shRNA敲低ROR2的表达时，相比对照组，ROR2敲低组36小时穿过基质胶的细胞更少。当用不同浓度的B16嵌合抗体与T47D细胞孵育半小时后，5ug/ml组和50ug/ml组均能显著降低36小时穿过基质胶的细胞数目，这说明我们的B16嵌合抗体能抑制乳腺癌细胞T47D对基质胶的侵袭能力。实验结果如图13～图14所示。

其中，图13中vector代表转染空载质粒组的细胞，shROR2代表转染shRNA质粒组的细胞。免疫印迹的结果代表shRNA能有效地降低T47D细胞的ROR2的表达。

图14中为穿过Transwell小室的细胞光学显微镜图，vector代表转染空载质粒组的穿过小室细胞，shROR2表示转染shRNA质粒组穿过小室细胞，ctrl代表PBS处理组穿过小室细胞，B16-5ug/ml,B16-50ug/ml分别代表5ug/ml和50ug/ml的B16处理组穿过小室的细胞。

图15代表上述各组穿过小室的细胞的平均每个视野的T47D的细胞数目。

(二)B16嵌合抗体对病人来源的肿瘤移植组织(PDX)的原代细胞侵袭能力的影响

将免疫缺陷小鼠长出的的PDX肿瘤组织取出后，用Human Dissociation kit将组织分离成单细胞。取100000个单细胞与B16嵌合抗体或对照IgG预先孵育半小时，然后将细胞加入到铺好基质胶(10：1)的Transwell小室内细胞混悬液用无生长因子无血清的MBGM稀释，下室加入NIH 3T3细胞特定培养基(无血清培养24小时的NIH3T3细胞收集的培养基)。24小时后观察穿过基质胶贴入孔底的细胞，并计数。结果如图16所示，结果显示B16嵌合抗体处理后，来自两个病人的PDX单细胞穿过基质胶的数目显著低于IgG对照组，说明B16嵌合抗体能显著降低PDX细胞的侵袭能力。

(三)B16嵌合抗体对淋巴瘤细胞系Jeko-1侵袭能力的影响

B16抗体检测淋巴瘤细胞系Jeko-1的流式结果显示，Jeko-1高表达ROR2蛋白。当用50ug/ml的B16嵌合抗体与Jeko-1(8*10⁴个)孵育半小时后，穿过5um孔径小室的细胞数目显著少于IgG组和未处理组，结果如图17所示。说明B16抗体显著抑制了淋巴瘤细胞系Jeko-1的侵袭能力。

其结果如图17所示。图17右侧柱状图中对照组代表未进行任何处理，柱状图的横坐标代表穿过小室细胞的数目。

(四)B16嵌合抗体对乳腺癌细胞T47D成球能力的影响

成球实验是在低黏附培养板中利用富有生长因子的培养基MEGM培养消化成单细胞的肿瘤细胞，观察单个细胞的形成细胞球的能力，细胞成球能力越强，说明该肿瘤细胞干性越强。当用shRNA敲低乳腺癌T47D细胞ROR2水平后，shROR2组形成细胞球的个数显著少于对照质粒组。同样的，当在正常T47D的MEGM培养基中加入50ug/ml的B16嵌合抗体时，培养两周后，抗体处理组形成细胞球的个数显著少于对照IgG组。这便说明了我们的B16嵌合抗体能有效地抑制乳腺癌细胞系T47D的成球能力。其结果如图18所示。

(五)B16嵌合抗体对病人乳腺癌组织类器官(organoid)形成能力的影响

类器官(organoid)是一种微型化和简化的器官，在体外三维显示真实的显微解剖形态。它们来自于一个或几个来自组织、胚胎干细胞或诱导多能干细胞的细胞，由于它们的自我更新和分化能力，可以在体外中培养，培养得到的细胞球与人体内的细胞状态比较接近。

取得乳腺癌病人组织后，用胶原酶(1-2mg/ml)消化组织2小时。消化后的细胞悬浮液用100um的筛子过滤去掉大颗粒和没消化完全的组织。过筛后的细胞加入10ml DMEM/AF12，400g离心10min。弃上清，加入无酚红的基质胶，混匀细胞。将混有细胞的基质胶加入预热半小时的24孔板中，再放入培养箱。半小时后加入含有各种生长因子的培养基BCOM。Organoid建立好后，检测ROR2的表达，然后将Organoid传代，在培养基中分别加入50ug/ml的B16嵌合抗体或对照组IgG，定期观察Organoid的生长情况。结果如图19所示。B16嵌合抗体组乳腺癌组织的organnoid的生长较慢，体积小于IgG组的。

(六)B16嵌合抗体抑制免疫缺陷小鼠PDX肿瘤的生长

为了验证B16嵌合抗体在体内是否对肿瘤的生长是否有抑制作用，我们首先建立起PDX小鼠模型。然后将小鼠分成两组分别尾静脉注射B16嵌合抗体(10mg/kg)或者对照IgG，并定期测量肿瘤组织的大小，肿瘤组织的生长曲线如下所示。结果如图20和图21所示，结果显示B16嵌合抗体能显著抑制免疫缺陷小鼠的PDX的生长。当肿瘤长得足够大时，将其取出，并测量其重量。结果显示，经过B16嵌合抗体处理后的实验组的肿瘤大小显著少于对照组。

肿瘤组织取下来之后，用human Tumor Dissociation kit将组织消化成单细胞，进行肿瘤干细胞特性的标记物ALDH1和CD44⁺/CD24^Low细胞群的流式分析。结果如图22和图23显示，B16嵌合抗体处理后，ALDH1+细胞群和ROR2+细胞群显著降低，同时CD44⁺/CD24^Low细胞群也显著减少，这边说明B16嵌合抗体能杀伤一部分具有干细胞特性的细胞群。

其中图22显示B16抗体处理后，PDX肿瘤细胞中ALDH1+细胞群和ROR2+细胞群显著降低，图23显示B16抗体处理后，PDX肿瘤细胞中CD44+/CD24Low细胞群显著降低。

由于PDX小鼠模型使用的原代细胞都是传代非常少的病人细胞，利用PDX小鼠模型，用于肿瘤干细胞的研究及靶向免疫药物筛选，能够在更接近病人本身体内生理状态的情况，模拟药物在体内的作用情况，相比较于传统的用细胞系研究生物学现象及药物筛选，其结果更具有价值。

实施例4

我们采用二代的Car序列，用筛选出来的具有高亲和力的抗ROR2的抗体B-16构建ROR2-Car。

1、Car的结构

B16CAR由CD8leader，B16scFv-VL，18氨基酸linker，B16scFv-VH，CD8铰链区，CD8跨膜区，4-1BB共刺激因子结构，CD3ζ链结构构成。结果示意图如图24所示。

2、CAR-T能够结合ROR2

用Ficoll从新鲜的人血样中提取人的淋巴细胞，并用CarT-B16病毒感染淋巴细胞，48小时后，用终浓度2μg/ml的生物素化ROR2蛋白与B16-CAR-T细胞冰上共孵育30分钟，然后用带有PE荧光的亲和链霉素标记ROR2蛋白，冰上15分钟，用流式细胞术检测能够与ROR2蛋白结合的CAR-T的比例。

流式结果如图25显示，有50.1％的淋巴细胞表达B16-CarT。

3、CAR-T体外杀伤靶细胞

将未转化的T细胞(NT)，转化空载的CD532A-T，和转化B16-CAR的CAR-B16-T细胞与两种靶细胞在96孔板中共培养。其中一种是表达ROR2的T47D乳腺癌细胞系，一种是不表达ROR2的MDA-MB-231乳腺癌细胞系。每孔12000个靶细胞，120000个T细胞，E:T＝10:1，共培养12小时，然后用乳酸脱氢酶释放试验检测对靶细胞的杀伤情况。杀伤率根据公式％细胞毒性＝(实验组-效应细胞自发-靶细胞自发)/(靶细胞最大-靶细胞自发)x100计算。得出的杀伤率再以未转化的T细胞(NT)组对靶细胞的杀伤率为基准进行标准化。结果如图26所示，B16-Car-T能显著杀伤ROR2表达阳性的T47D细胞，但并不能杀伤ROR2表达阴性MDA-MB-231细胞。

利用我们筛选出来的具有高亲和力的ROR2抗体，开发ROR2-Car T细胞治疗技术，可以用于疾病的靶向治疗。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> 治疗恶性肿瘤的抗体及其应用

<130> PIDC3186450A

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Thr

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区

<400> 2

Gln Leu Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Leu Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asp Val Tyr Tyr Gly Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链

<400> 3

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Thr

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 4

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链

<400> 4

Gln Leu Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Leu Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asp Val Tyr Tyr Gly Val Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 5

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变区核苷酸序列

<400> 5

gacatcgtgc tgacccagtc tccagccatc atgtctgcta gccctggcga gaaagtgaca 60

atgacctgct ccgcctcctc ctccgtgacc tacacctact ggtatcagca gaagcccggc 120

tccagtcctc ggctgctgat ctacgatacc tccaacctgg cttctggcgt gcccgtgcgg 180

ttttctggtt ctggctctgg cacctcctac agcctgacca tctccagaat ggaagccgag 240

gatgccgcca cctactactg tcagcagtgg tctagctacc ccttcacctt tggctccggc 300

accaagctgg aaatcaag 318

<210> 6

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变区核苷酸序列

<400> 6

cagttgcagc tccagcagtc tggacctgag ctggttaagc ctggtgcctc cgtccggatg 60

tcttgcaagg ctgccggcta caccttcacc agctacctga tgcactgggt caagcagagg 120

ccaggccagg acttggagtg gatcggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac 180

aacgagaagt tcaaggacaa ggctaccctg acctccgaca agtcctcctc caccgtgtac 240

atggaactgt ccagcctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagatccgat 300

gtgtactatg gcgtcagatt cgcctactgg ggccagggca cactggtcac agtttctgct 360

<210> 7

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链核苷酸序列

<400> 7

gacatcgtgc tgacccagtc tccagccatc atgtctgcta gccctggcga gaaagtgaca 60

atgacctgct ccgcctcctc ctccgtgacc tacacctact ggtatcagca gaagcccggc 120

tccagtcctc ggctgctgat ctacgatacc tccaacctgg cttctggcgt gcccgtgcgg 180

ttttctggtt ctggctctgg cacctcctac agcctgacca tctccagaat ggaagccgag 240

gatgccgcca cctactactg tcagcagtgg tctagctacc ccttcacctt tggctccggc 300

accaagctgg aaatcaagag aacagtggcc gctcctagcg tgttcatctt cccaccttcc 360

gacgagcagc tgaagtctgg cacagcctct gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 420

agagaagcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agagcggcaa tagccaagag 480

agcgtgaccg agcaggacag caaggactct acctacagcc tgagcagcac cctgacactg 540

agcaaggccg actacgagaa gcacaaagtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctt 600

tctagccctg tgaccaagag cttcaaccgg ggcgaatgt 639

<210> 8

<211> 1350

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链核苷酸序列

<400> 8

cagttgcagc tccagcagtc tggacctgag ctggttaagc ctggtgcctc cgtccggatg 60

tcttgcaagg ctgccggcta caccttcacc agctacctga tgcactgggt caagcagagg 120

ccaggccagg acttggagtg gatcggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac 180

aacgagaagt tcaaggacaa ggctaccctg acctccgaca agtcctcctc caccgtgtac 240

atggaactgt ccagcctgac ctctgaggac tccgccgtgt actactgcgc cagatccgat 300

gtgtactatg gcgtcagatt cgcctactgg ggccagggca cactggtcac agtttctgct 360

gcctctacaa agggccctag tgtgttccct ctggctccca gcagcaagtc tacatctggc 420

ggaacagccg ctctgggctg cctggtcaag gattactttc ccgagcctgt gaccgtgtcc 480

tggaatagcg gagcactgac aagcggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcaaagcagc 540

ggcctgtact ctctgagcag cgtggtcaca gtgcctagct ctagcctggg cacccagacc 600

tacatctgca atgtgaacca caagcctagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660

aagagctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtcctg ctccagaact gctcggcgga 720

ccttccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatcag cagaacccct 780

gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggatc ccgaagtgaa gttcaattgg 840

tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac 900

agcacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 960

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgagaa aaccatcagc 1020

aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtttacacac tgcctccaag cagggacgag 1080

ctgaccaaga atcaggtgtc cctgacctgc ctcgtgaagg gcttctaccc ttccgatatc 1140

gccgtggaat gggagagcaa tggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg 1200

ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac agcaagctga cagtggacaa gtccagatgg 1260

cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320

cagaagtccc tgagcctgtc tcctggcaaa 1350

Claims (18)

1.一种抗ROR2抗体或抗原结合片段，其特征在于，

具有CDR1为CSASSSVTYTYWYQ、CDR2为IYDTSNLAS和CDR3为CQQWSSYPFTFGSG所示氨基酸序列的轻链可变区，以及具有CDR1为YTFTSYLMHWV、CDR2为LEWIGYINPYNDGTKYNEKFKDKAT和CDR3为CARSDVYYGVRFAYWGQG所示氨基酸序列的重链可变区。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，

具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的轻链可变区和SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的重链可变区。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段具有SEQ ID NO:3所示的轻链和SEQ ID NO:4所示的重链。

4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段的抗原表位为ROR2的胞外端的Kringle段。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的抗体或抗原结合片段。

6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有：

SEQ ID NO:5所示的轻链可变区核苷酸序列和SEQ ID NO:6所示的重链可变区核苷酸序列；或

SEQ ID NO:7所示的轻链核苷酸序列和SEQ ID NO:8所示的重链核苷酸序列。

7.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求5或6所述的多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，进一步包括：

控制元件，所述控制元件与所述多核苷酸可操作地连接，用于控制所述多核苷酸在宿主细胞中的表达。

9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述控制元件包括下列至少之一：启动子、增强子和终止子。

10.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

11.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求7～10中任一项所述的表达载体。

12.一种制备抗ROR2抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，包括培养权利要求11所述的重组细胞。

13.权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物用于治疗癌症。

14.权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于ROR2抗原的诊断检测。

15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于免疫印迹、免疫沉淀和/或ELISA检测。

16.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。

17.一种抗ROR2的嵌合抗原受体，其特征在于，包括：胞外区、跨膜区和胞内区，

所述胞外区包括抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为单链，所述抗体或抗原结合片段为权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗原结合片段。

18.一种Car-T细胞，其特征在于，所述Car-T细胞表达权利要求17所述的抗ROR2的嵌合抗原受体。

Images