CZ292061B6 - Jednořetězcové fragmenty protilátek a protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje - Google Patents
Jednořetězcové fragmenty protilátek a protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje Download PDFInfo
- Publication number
- CZ292061B6 CZ292061B6 CZ19953014A CZ301495A CZ292061B6 CZ 292061 B6 CZ292061 B6 CZ 292061B6 CZ 19953014 A CZ19953014 A CZ 19953014A CZ 301495 A CZ301495 A CZ 301495A CZ 292061 B6 CZ292061 B6 CZ 292061B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- egfr
- cells
- antibodies
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 title claims description 103
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 title claims 5
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 title claims 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title description 24
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 88
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 claims description 23
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 claims description 22
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 17
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 10
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims description 4
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 98
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 98
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 98
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 52
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 39
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 39
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 39
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 32
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 32
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 29
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 26
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 26
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 26
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 25
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 22
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 13
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 12
- 101000693922 Bos taurus Albumin Proteins 0.000 description 10
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 6
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 6
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 6
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 6
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 6
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- -1 fluorescein isocyanate Chemical class 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 2
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 108010048673 Vitronectin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 108010021083 hen egg lysozyme Proteins 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVXVWWANJIWJOO-UHFFFAOYSA-N 1-(1,3-benzodioxol-5-yl)-N-ethylpropan-2-amine Chemical compound CCNC(C)CC1=CC=C2OCOC2=C1 PVXVWWANJIWJOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- QMMZSJPSPRTHGB-UHFFFAOYSA-N MDEA Natural products CC(C)CCCCC=CCC=CC(O)=O QMMZSJPSPRTHGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101000930477 Mus musculus Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002096 anti-tetanic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000002352 blister Diseases 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I calcium;potassium;disodium;(2s)-2-hydroxypropanoate;dichloride;dihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[Na+].[Na+].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].C[C@H](O)C([O-])=O BPKIGYQJPYCAOW-FFJTTWKXSA-I 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- FCIROHDMPFOSFG-LAVSNGQLSA-N disialyllacto-N-tetraose Chemical compound O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@@]1(C(O)=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@]3(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)C(O)O[C@@H]3CO)O)O[C@H](CO)[C@@H]2O)O)O1 FCIROHDMPFOSFG-LAVSNGQLSA-N 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N ensulizole Chemical compound N1C2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 125000002421 ganglioside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000045108 human EGFR Human genes 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000012917 library technology Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000035901 vesication Effects 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
Jedno°et zcov² fragment Fv protil tky proti receptoru epiderm ln ho r stov ho faktoru, z skateln² z f gov²ch protil tkov²ch knihoven konstruovan²ch z bun k imunizovan²ch savc , p°i em variabiln oblast °et zce Fv obsahuje aminokyselinovou sekvenci t k ho °et zce ze souboru zahrnuj c ho sekv. ID. .: 4, sekv. ID. .: 8, sekv. ID. .: 12, sekv. ID. .: 16, sekv. ID. .: 18, sekv. ID. .: 20, sekv. ID. .: 22, sekv. ID. .: 24, sekv. ID. .: 26 a sekv. ID. .: 28, a aminokyselinovou sekvenci lehk ho °et zce ze souboru zahrnuj c ho sekv. ID. .: 2, sekv. ID. .: 6, sekv. ID. .: 10, sekv. ID. .: 14, sekv. ID. .: 18, sekv. ID. .: 20, sekv. ID. .: 22, sekv. ID. .: 24, sekv. ID. .: 26 a sekv. ID. .: 28. Dva z jedno°et zcov²ch scFvs, izolovan z knihoven f gov²ch protil tek, jsou konstruov ny k vytvo°en ste n humanizovan²ch ·pln²ch protil tkov²ch molekul. Tyto chim rick protil tky anti-EGFR obsahuj konstantn oblasti lidsk²ch imunoglobulin a lze jich pou t stejn dob°e jako jedno°et zcov²ch scFv pro v²robu inidel pro terapii lidsk²ch n dor a kit k diagn ze lidsk²ch n dor . Zp sob p° pravy a farmaceutick² prost°edek, kter² je obsahuje.\
Description
Jednořetězcové fragmenty protilátek a protilátky proti receptorů epidermálního růstového faktoru, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje
Oblast techniky
Vynález se týká nových protilátek proti receptorů epidermálního růstového faktoru (anti-EGFR) a fragmentů protilátek, zvláště jednořetězcových fragmentů (scFvs), které lze získat z knihoven fágových protilátek konstruovaných z buněk imunizovaných savců, s výhodou myší. Fragmenty protilátek, izolované z knihoven fágových protilátek, je možno konstruovat k vytvoření částečně humanizovaných úplných protilátkových molekul. Tyto chimémí anti-EGFR protilátky obsahují konstantní oblasti lidských imunoglobulinů a lze jich použít stejně jako jejich fragmentů jako činidel k diagnostice a terapii lidských nádorů.
Vynález dokládá, že knihovny fágových protilátek jsou alternativním a všestrannějším způsobem k izolování protilátek z imunizovaných savců v porovnání se standardní hybridomovou technologií.
Vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících protilátky nebo fragmenty protilátek k léčení nádorů, jako je melanom, gliom nebo karcinom. Protilátek může být také použito k diagnostickým účelům lokalizace a posouzení nádorů in vitro nebo in vivo.
Jednotlivé používané výrazy mají tento význam:
Výraz „FRs“ (rámcové oblasti) znamená čtyři podoblasti variabilních oblastí lehkých nebo těžkých řetězců, které nesou tři CDRs.
Výraz „CDRs“ (complementarity determining regions) znamená tři suboblasti variabilních oblastí lehkých a těžkých řetězců, které mají hypervariabilní sekvence a tvoří smyčkové struktury, které jsou primárně zodpovědné za vytváření přímého styku s antigenem.
Výraz „chimémí“ nebo částečně humanizované protilátky znamená protilátky zahrnující konstantní oblasti odvozené z lidských zdrojů a variabilní oblasti (včetně CDRs) odvozené z nelidských zdrojů, například z myši.
Výraz „humanizované“ nebo plně humanizované protilátky znamená protilátky obsahující konstantní oblasti a FRs odvozené z lidských zdrojů, zatímco CDRs z nelidských zdrojů.
Výraz „EGF“ znamená epidermální růstový faktor a „EGFR“ znamená receptor epidermálního růstového faktoru.
Výraz „PCR“ znamená polymerázovou řetězovou reakci.
Výraz „scFv“ znamená jednořetězcový Fv, který je protilátkovým fragmentem.
Výraz „VL“ znamená variabilní oblast lehkého řetězce.
Výraz „Vk“ znamená variabilní oblast kappa lehkého řetězce.
Výraz „VH“ znamená variabilní oblast těžkého řetězce.
Výraz PBS znamená fosfátem pufrovanou solanku.
Výraz FCS znamená zárodečné telecí sérum.
-1 CZ 292061 B6
Výraz HBSS znamená Hankův vyvážený solný roztok.
Výraz FITC znamená fluoresceinizokyanát.
Výraz MTC znamená směsnou buněčnou kulturu.
Dosavadní stav techniky
Epidermální růstový faktor (EFG) je polypeptidový hormon, který je mitogenický pro epidermální a epiteliální buňky. Dojde-li k interakci EGF se senzitivními buňkami, váže se na membránové receptory (EGFR). EGFR je transmembránový glykoprotein s přibližně 170 kD a je genovým produktem c-erb-B protoonkogenu.
MAb 425 je myší monoklonální protilátka vypěstovaná proti dobře známé lidské karcinomové buněčné linii A431 (ATCC CRL 1555), váže se na polypeptidový epitop externí domény lidského EGFR a inhibuje vazbu EGF. Zjistilo se, že MAb 425 (ATCC HB 9629) zprostředkovává nádorovou cytotoxicitu in vitro a potlačuje růst buněčných linií odvozených z epidermodiních a colorektálních karcinomů in vitro (Rodeck a kol., Cancer Res. 47, str. 3692, 1987). Humanizované a chimémí verze MAb 425 jsou popsány v patentovém spise číslo WO 92/15 683.
V posledních několika málo letech byly popsány způsoby (Skerra a Pltickthun, Science 240, str. 1038, 1988; Better a kol. Science 240, str. 1041, 1988), umožňující produkovat funkční protilátkové fragmenty v eukaryotických hostitelských buňkách, jako je E. coli. Zahrnují Fv fragment a Fab fragment, přičemž obzvlášť zajímavý je Fv fragment. Byly též popsány jednořetězcové Fvs (kde řetězce Vl a VH jsou spolu svázány) (Bird a kol., science 242, str. 423, 1988; Huston a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, str. 5879,1988).
Knihovny fágových protilátek umožňují alternativní technologii hybridomové technologie pro izolaci protilátek z imunizovaných zvířat. Při hybridomové technologii se imortalizují buňky, které produkují protilátky. Při fágové protilátkové technologii se imortalizují geny, které kódují protilátky (Winter G. a Milstein C., Nátuře 349, str. 293, 1991). Při fágové protilátkové technologii se protilátkové variabilní oblasti těžkého řetězce (VH) a variabilní oblasti lehkého řetězce (VL) amplifikují (zesilují) polymerázovou řetězovou reakcí PCR, variabilní oblasti se statisticky zkombinují a produkují jako protilátkové fragmenty na povrchu fágových částic a knihovny fágových protilátek se skrínují pro protilátky, které se vážou na příslušné antigeny.
Hybridomová technologie byla velmi úspěšná při izolování myších monoklonálních protilátek, když bylo možno vyvolat silnou imunitní odezvu ve slezinách zvířat. Například myší MAbs vůči lidskému epidermálnímu růstovému faktoru (EGFR) byly izolovány ze slezin myší imunizovaných intraperitoneálně lidskými nádorovými buňkami A431 (Murthy a kol., Arch. Biochem. Biophys. 252, str. 549, 1987). Potenciální předností fágové protilátkové technologie před hybridomovou technologií je možnost použití skutečně jakéhokoli zdroje buněk vytvářejících protilátku jako výchozího materiálu a možnost lychlého skrínování velkého množství různých protilátek. Jinou výhodou fágové protilátkové technologie je skutečnost, že geny, kódující variabilní oblasti příslušných protilátek, již byly klonovány a jsou okamžitě dostupné pro další genové inženýrství.
Uvádí se, že antitetanový toxoidní Fab fragment, izolovaný z fágové protilátkové knihovny, byl převeden na úplnou protilátkovou molekulu (Bender a kol., Hum. Antibod. Hybridomas 4, str. 74, 1993).
V posledních deseti letech bylo použito imunizace in vitro jako alternativní techniky k aktivaci imunizace k vytvoření monoklonálních protilátek (mAbs) oproti široké rozmanitosti antigenů jak
-2CZ 292061 B6 z lidských, tak z myších systémů (flapříklad Vaux D.J.T., Helenius A. a Mellman I., Nátuře 336, str. 95,1991; Borrebaeck C.A.K., Immunol. Today 9, str. 355, 1988). Výhodou tohoto přistupuje potřeba jen malých množství antigenů a možnost použití ke generování lidských hybridomů.
Avšak vytváření protilátek IgM nízké afinity a obtížnost imortalizace lidských lymfocytů po imunizaci in vitro se staly přetrvávajícími problémy spojenými s touto technologií. ,
Novou cestou k získání protilátek je zesilování polymerázovou řetězovou reakcí repertoárů variabilních oblastí těžkých (Vh) a lehkých (VL) řetězců genů, které se pak statisticky rekombinují a produkují jako fágové exhibiční knihovny (7-9). Protilátkové geny variabilní oblasti se klonují a fuzují na malý povlakový protein (gen 3) jako jednořetězcový Fv fragment (scFv) (10). Fágová částice má na svém povrchu protilátkový fragment a může být selektována za využití vazebních vlastností protilátky. Výhodou této technologie je skutečnost, že statistická rekombinace V genů může vytvořit nové spárování s novými specifikacemi a afinitami, které nebylo možno selektovat přírodními postupy. Kromě toho umožňuje takový přístup použití naivních nebo in vitro imunizovaných lymfocytů z myších nebo z lidských zdrojů.
Dřívější snahy získat mAbs proti EGFR myšími buňkami B imunizací in vitro a hybridomová technologie poskytovaly navzájem reagující protilátky s nízkou afinitou. Aby se čelilo těmto nedostatkům, byla provedena kombinace imunizace in vitro, následovaná klonovací technologií PCR.
Úkolem vynálezu je vyvinout protilátky a fragmenty protilátek, které mají vysokou afinitu k receptoru EGF.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je jednořetězcový fragment Fv protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru, získatelný zfágových protilátkových knihoven konstruovaných z buněk imunizovaných savců, přičemž variabilní oblast řetězce Fv obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce ze souboru zahrnujícího sekv. ID. č.: 4, sekv. ID. č.: 8, sekv. ID. č.: 12, sekv. ID. č.: 16, sekv. ID. č.: 18, sekv. ID. č.: 20, sekv. ID. č.: 22, sekv. ID. č.: 24, sekv. ID. č.: 26 a sekv. ID. č.: 28 a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce ze souboru zahrnujícího sekv. ID. č.: 2, sekv. ID. č.: 6, sekv. ID. č.: 10, sekv. ID. č.: 14, sekv. ID. č.: 18, sekv. ID. č.: 20, sekv. ID. č.: 22, sekv. ID. č.: 24, sekv. ID. č.: 26 a sekv. ID. č.: 28.
Porovnávají se myší anti-EGFR protilátky izolované ze tří různých fágových protilátkových knihoven s myším MAb (425) izolovaným standardní hybridomovou technologií (Murthy a kol., Arch. Biochem. Biophys. 1987, 252, str. 549; Kettleborough a kol., Protein Eng. 1991, 4, str. 773). Knihovny se připravují nejenom ze sleziny imunizovaných myší, ale také z lymfatické uzliny imunizovaných myší a z in vitro imunizovaných myších buněk. Upraví se dva protilátkové fragmenty Fv s jedním řetězcem (scFv), izolované z knihoven, k vytvoření chimémích úplných protilátkových molekul s myšími variabilními oblastmi připojenými k lidským konstantním oblastem.
Zvláště se vynález týká anti-EGFR jednořetězcového FV fragmentu, získatelného z fágových protilátkových knihoven konstruovaných z buněk, s výhodou ze sleziny nebo zmizni uzliny imunizovaných savců, s výhodou myší, nebo z in vitro imunizovaných buněk. V zásadě není vynález omezen na scFv, ale zahrnuje také jiné anti-EGFR protilátkové fragmenty, jako je Fab nebo F(ab')2.
Některé scFv podle vynálezu mají dobře definované DNA a aminokyselinové sekvence. Proto se vynález dále týká jednořetězcového protilátkového fragmentu Fv, přičemž variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce zahrnují DNA a/nebo aminokyselinové sekvence vybrané ze sekvencí těžkého a lehkého řetězce daných v sekvenci Id číslo 1 až 32, s výhodou podle obr. 5 až 8.
-3CZ 292061 B6
Jelikož pro diagnostické a terapeutické účely může být v mnoha případech využito pouze plně fungujících, úplných protilátek, je úkolem vynálezu spojovat variabilní oblasti jednořetězcového
Fvs s konstantními oblastmi lidských imunoglobulinů za vytvářejících se úplných, částečných nebo humanizovaných protilátek anti-EGFR.
Vynález se proto týká úplné protilátky anti-EGFR konstruované ze sekvencí DNA, odvozených od shora definovaných protilátkových fragmentů, a ze sekvencí DNA odvozených od konstantních oblastí lidských imunoglobulinů, přičemž - jakožto výhodné provedení - sestává těžký řetězec z aminokyselinové sekvence řetězce gama-1 a lehký řetězec z aminokyselinové sekvence řetězce kappa.
Podle vynálezu se anti-EGFR scFvs izolují technologií využívající fágové protilátkové knihovny. Způsob přípravy anti-EGFR jednořetězcového Fv spočívá podle vynálezu v tom, že se (i) izoluje RNA z imunizovaných savčích buněk, s výhodou z myších buněk, (ii) syntetizuje se první řetězec cDNA, (iii) amplifikují se geny VH a VK v cDNA z imunizovaných buněk, (iv) klonují se tyto geny spolu se vhodnými restrikčními místy do fagemidového vektoru, (v) transformují se prokaryotické buňky s ligačními směsmi, (vi) skrínují se fágové knihovny pro fágové protilátky, zaměřené na EGFR pomocí vyčištěného EGFR a (vii) produkuje se žádaný jednořetězcový Fv v prokaryotických hostitelských buňkách, s výhodou v E.coli.
Vynález se také týká způsobu přípravy úplné protilátky anti-EGFR klonováním DNA kódující variabilní oblasti fragmentů protilátky anti-EGFR, produkovaných jak shora uvedeno, do alespoň jednoho eukaryotického expresního vektoru obsahujícího genomickou DNA, která kóduje konstantní oblasti lidských imunoglobulinů, transformováním eukaryotických buněk uvedeným vektorem nebo vektory a expresí a izolováním protilátky.
Anti-EGFR scFv, a především úplných protilátek anti-EFGR je možno použít k diagnóze a ošetřování lidských nádorů. Vynález se tudíž také týká farmaceutického prostředku obsahujícího anti-EGFR jednořetězcový Fv nebo úplnou anti-EDFR protilátku. Výsledky a přednosti vynálezu jsou následující:
Z knihoven fágových protilátek byly izolovány nové myší protilátky anti-EGFR. Nové protilátky reprezentují nejméně čtyři různé podskupiny vH a čtyři různé podskupiny VK (Kabat a kol., Sequences of proteine of immunological interest. 5. vydání, U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda 1991). Vykazují odlišné páry a sekvence lišící se od sekvencí používaných myších MAb izolovaných hybridomovou technologií. Myší 425 MAb má Vn2b a VK4 páry, které nebyly pozorovány ve fágových protilátkách. VH scFv L3 1 ID má nej vyšší procentuální identitu s 425vh (84,9%). Většina odlišností je v CDR. VK scFv S4 2D má nejvyšší procentuální identitu s 425VK (83,2%). Většina odlišností je opět u CDR, zejména u CDR3. Podle vynálezu je řada nových protilátek anti-EGFR izolována z fágových protilátkových knihoven a všechny tyto protilátky se liší od 425 MAb alespoň dvěma z scFv vykazujícími odlišný epitop EGFR od epitopu vykazovaného pomocí 425 MAb. To je v rozporu s dřívější zprávou, kde se uvádí, že protilátky izolované z kombinatomích knihoven jsou velmi podobné protilátkám izolovaným hybridomovou technologií. (Caton a Koprowski, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1990, 87 str. 6450).
-4CZ 292061 B6
Ze tří knihoven fágových protilátek je nej lepší knihovnou z hlediska počtu selekčních kroků potřebných k dosažení protilátek s vysokou afinitou a z hlediska rozmanitosti izolovaných protilátek s vysokou afinitou, knihovna generovaná z lymfatických uzlin. Lymfatické uzliny se volí jako zdroj RNA pro konstrukci knihoven fágových protilátek ze dvou důvodů. Předně, dřívější práce ukázaly, že vyšší podíl B-buněk produkujících protilátky IgG s vysokou afinitou, se získá z podkolenních lymfatických uzlin po imunizaci cestou tlapek než ze slezin po imunizaci cestou peritonea (Venn a Dresser, J. Immunol. Methods 102, str. 95, 1987). Za druhé jsou drenážované lymfatické uzliny považovány za dobrý zdroj pro izolaci lidských protinádorových protilátek. Tudíž izolace myších anti-EGFR protilátek zpodkolenní mízní uzliny myši imunizované prostřednictvím tlapky je modelem pro izolaci lidských anti-EGFR protilátek z podpažních lymfatických uzlin pacientky s rakovinou prsu. Je dokázána snadnost přípravy knihoven dobré velikosti z malých množství materiálu z lymfatických uzlin a pak z nich izolování protilátky s vysokou afinitou.
Ačkoli myší protilátky anti-EGFR byly izolovány ze všech tří knihoven fágových protilátek, není jasné, zda některá z nově izolovaných protilátek má vyšší afinitu než myší 425 MAb izolovaná pomocí hybridomové technologie. V prvních analýzách se jeví, že fágové protilátkové odvozené scFv váží EGFR lépe než scFv konstruované z 425 MAb (obr. 2). V jiných pokusech s chimémími úplnými protilátkovými molekulami vykazuje jedna z chimémích protilátek (S4 2D) afinitu k EGFR, jež se rovná afinitě chimémí protilátky 425. Druhá chimémí protilátka (L3 11D) má afinitu čtyřikrát nižší než chimémí protilátka 425 (obr. 4). Vazební hodnoty, získané pomocí scFv byly zavádějící pravděpodobně proto, že připravený scFv může obsahovat směsi monomerů a dimerů (Griffiths a kol., EMBO J. 12, str. 725, 1993). Na rozdíl od toho se neočekává, že chimémí protilátky IgG vytvářejí dimery a ukázalo se, že chimémí protilátky L3 1 ID a S4.2D mají velikost očekávanou pro bivalentní, monomemí chimémí protilátky IgG. Analýzy afinity vyčištěných přípravků scFv 425, L3 1 ID a S4 2D však ukazují, že tyto přípravky scFv obsahovaly monomemí, dimemí a jiné multimemí formy. Kromě toho se liší relativní podíly monomemích a multimemích forem pro každý scFv, scFv 425 má nejnižší procento dimemích forem. Jak bylo předpověděno, dimemí a zejména větší multimemí formy vykazují silnější vazbu na čištěný EGFR než monomemí forma. Jeví se tedy, že 425 scFv má slabší sklon k dimerizování než některé nově izolované scFv.
Ačkoli exprese protilátkových fragmentů na povrchu fágových částic tvoří základ účinné metody rychlé selekce protilátek s žádoucími vlastnostmi, je pravděpodobné, že ani fágové protilátky, ani protilátkové fragmenty samy (scFv nebo Fab) nejsou pravděpodobně žádaným konečným produktem. Dále je ukázáno, jak mohou být myší scFv, izolované z fágových knihoven, snadno přeměněny na úplné protilátkové molekuly. V tomto případě jsou myší variabilní oblasti spojeny s lidskými konstantními oblastmi k vytvoření částečně humanizovaných chimémích protilátek.
Tyto výsledky ukazují, že je možno použít technologie fágových protilátek k izolování řady anti-EGFR protilátkových fragmentů z imunizovaných myší. Z protilátkových fragmentů lze pak zkonstruovat úplné protilátkové molekuly s požadovanými konstantními oblastmi. V některých případech může být ještě hybridomová technologie volenou metodou pro izolování monoklonálních protilátek z myší. Je-li k dispozici vysoce imunogenní antigen a postačuj e-li několik hybridomových buněčných linií vytvářejících jednu nebo několik různých protilátek, pak je pravděpodobně málo důvodů pro uvažování o fágové protilátkové technologii. Jestliže však by byly výhodné pro vytváření protilátek s vysokou afinitou speciální imunizační protokoly, jako injekce do tlapek, nebo jestliže se potřebuje velký počet protilátek proti řadě epitopů na antigen, nebo jestliže se potřebují protilátky proti velmi diskrétnímu a možná méně imunogennímu epitopu, pak může být volen způsob fágové protilátkové technologie. Také, jestliže se očekává další genové inženýrství protilátek, pak je fágová protilátková technologie výhodná v tom, že protilátkové geny již byly klonovány.
-5CZ 292061 B6
Kombinování imunizace in vitro s příslušným antigenem podle vynálezu a technologie PCR-klonování vytvářejí fragmenty scFv, které reagují sEGFR a nereagují s jinými antigeny. Zde uváděný imunizační protokol závisí na poloze antigenu, který není rozpustný, je však membránovým vesikulem, a na kultivačním médiu samotném, které je prosté FCS. Obě metodiky 5 jsou zde uvedeny jako prostředek ke zvyšování účinnosti imunizace in vitro tím, že se antigen učiní dostupným pro buňky s polohou pro antigen (například Brams P. a kol., J. Immunol. Methods, 98, str. 11,1987).
Výsledky získané s MTC souhlasí s dřívějšími publikacemi (například Borrebaeck C.A.K. 10 aMoller S.A. a Borrebaeck C.A.K., Borrebaeck C.A.K (vyd.): In Vitro Immunization inHybridoma Technology, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam 1988, str. 3), kde se popisuje použití supematantú MTC jako zdroje lymfokinú ke zlepšení imunizačního procesu in vítro. Membránový vesikul by se měl považovat za polyantigen, neboť v takových vesikulech jsou obsaženy četné různé antigenové determinanty. Z toho důvodu by se zdálo, že navozují 15 určitou úroveň polyklonální aktivace. To se však vyloučilo, jelikož specifická odezva anti-EGFR je zřetelně odlišná od odezvy získané standardním polyklonálním aktivátorem.
Místo imortalitace B-buněk po imunizaci in vitro se podle vynálezu používá molekulární strategie imortalizace protilátkových genů VH a VL. Tyto monoklonální protilátkové fragmenty se 20 expresují a produkují v bakteriích. Fágový displejový systém je mocným způsobem izolování protilátkových fragmentů proti specifickým antigenúm. Přítomnost stop kodonu mezi protilátkovým fragmentem a povlakovým proteinem g3p umožňuje přepnutí mezi povrchovým displejem a sekrecí v podobě rozpustného fragmentu scFv použitím supresivních nebo nesupresivních kmenů (Hoogenboom a kol., Nucl., Acids Res. 19, str. 4133,1991).
Vzhledem k nárůstu specifické odezvy a hladin mRNA v antigenem in vitro stimulovaných B-buňkách přispívá imunizace in vitro k izolaci protilátkových fragmentů s vysokou specifičností k antigenu. Po dvou bězích selekce je 100 % klonů pozitivních pro vazbu EGFR. Na rozdíl od toho klony, odvozené od procesů imunizace in vivo, jsou 100% pozitivní pouze po čtyřech bězích 30 selekce (Kettleborough a kol., EP 94104160 a Eur. J. Immunol., 24 str. 952,1994).
Použití fágových displejových knihoven od naivních protilátkových genů může umožnit vytváření specifických lidských protilátkových fragmentů bez imunizace nebo po imunizaci in vitro. Protilátkové fragmenty mohou být tudíž produkovány přímo v bakteriích jednoduchým, 35 rychlým a ekonomickým způsobem.
Biologický materiál a obecné způsoby
Mikroorganizmy, buněčné linie, plazmidy, fagemidy, promotory, rezistentní markéry (signální 40 znaky), replikační zdroje nebo jiné fragmenty vektorů, zde uváděné, jsou obchodně nebo jinak obecně dostupné. Pokud není uvedeno jinak, jsou zde použity pouze jako příklady a nejsou pro vynález podstatné a mohou být nahrazeny jinými vhodnými činidly a biologickými materiály.
Ke klonování scFv a k produkci scFv proteinů je přednostně použito bakteriálních hostitelů. 45 Příkladem takových hostitelů jsou: E. coli nebo bacillus.
K vytváření úplných protilátek anti-EGFR podle vynálezu je použito s výhodou eukaryotických hostitelů, například COS, CHO nebo kvasnic.
Potřebné techniky podle vynálezu jsou následně podrobně popsány. Jiné nepopsané techniky odpovídají známým standardním způsobům, jež jsou pracovníkům v boru dobře známy, nebo jsou podrobněji popsány v citovaných pramenech a přihláškách vynálezů.
-6CZ 292061 B6
Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis doplněný obrázky. Stručný popis obrázků:
Na obr. 1 jsou vyznačeny sekvence aminokyselin scFv, izolované zfágových protilátkových knihoven. (A) scFv z knihovny lymfatických uzlin. (B) scFv z knihovny sleziny. Vyznačeny jsou 5 komplementaritu určující oblasti (CDR) a rámcové oblasti (FR).
Na ob. 2 je znázorněna vazba scFv na EGFR. Jsou stanoveny koncentrace scFv v bakteriálních supematantech a scFv testované pomocí ELISA na vazbu k vyčištěným EGFR. (A) scFv z knihovny lymfatických uzlin. (B) scFv z knihovny sleziny. Pl (pozitivní kontrola) je scFv 10 odvozený zMAb 425. LI a SI (negativní kontroly) jsou nevážící scFv z předem vybraných knihoven lymfatických uzlin a sleziny.
Na obr. 3 jsou intermediální vektory použité k rekonstrukci variabilních oblastí k expresi v savčích buňkách. (A) VH vektor. (B) Vr vektor.
Na obr. 4 je znázorněna vazba chimémích úplných protilátek na EGFR. Koncentrace protilátek v buněčných supematantech COS jsou zjištěny technikou ELISA a protilátky jsou testovány technikou ELISA na vazbu k vyčištěným EGFR.
Na obr. 5 je DNA a aminokyselinová sekvence scFv č. L211C.
(A): lehký řetězec; (B): těžký řetězec.
| Polohy aminokyseliny: | ||
| (A) FR-1: | 1-23, | CDR-1: 24-34 |
| FR-2: | 35-49, | CDR-2: 50-56 |
| FR-3: | 57-88, | CDR-3: 89-97 |
| FR-4: | 98-109. | |
| (B) FR-1: | 1-30, | CDR-1: 31-35 |
| FR-2: | 36-49, | CDR-2: 50-66 |
| FR-3: | 67-98, | CDR-3: 99-108 |
| FR-4: | 109-119. |
Na obr. 6 je DNA a aminokyselinová sekvence scFv č. L212B.
Polohy aminokyselin:
| (A) FR-1: FR-2: FR-3: FR-4: | 1-23, 39-49, 57-88, 98-109. | CDR-1: 24-38 CDR-2: 50-56 CDR-3: 89-97 |
| (B) FR-1: | 1-30, | CDR-1: 31-35 |
| FR-2: | 36-49, | CDR-2: 50-66 |
| FR-3: | 67-98, | CDR-3: 99-108 |
| FR-4: | 109-119. |
Na obr. 7 je DNA a aminokyselinová sekvence scFv č. L31 ID.
(A): lehký řetězec; (B): těžký řetězec.
Polohy aminokyseliny FR a CDR odpovídají polohám udaným na obr. 6.
Na obr. 8 je DNA a aminokyselinová sekvence scFv č. S4 2D.
(A): lehký řetězec; (B): těžký řetězec.
Polohy aminokyseliny:
(A) FR-1: FR-2:
FR-3:
FR-4:
1-23, CDR-1: 24-35
36-49, CDR-2:51-57
58-89, CDR-3:90-98 99-110.
(B) FR-1: 1-30,
FR-2: 36-49,
FR-3: 67-98,
FR-4: 108-118.
CDR-1: 31-35
CDR-2: 50-66
CDR-3: 99-107
Sekvence z obr. 5 až 8 jsou také v připojeném seznamu sekvencí, která je součástí popisu.
Podrobný popis vynálezu (1) Konstrukce a skrínování knihoven fágových protilátek
Zkonstruovány byly tři knihovny protilátek, jedna ze sleziny myší imunizovaných lidskou karcinomovou buněčnou linií A431 (8,8* 105 členů), jednak z podkolenních lymfatických uzlin myší imunizovaných do tlapky vyčištěným EGFR (6,5x105 členů) a třetí z myších lymfocytů imunizovaných in vitro vesikly A431 (1,1 xlO5 členů); (podrobnosti o konstrukci vesiklů A431 a imunizace in vitro jsou popsány v příkladech 1 a 2). Před selekcí se analyzuje nejméně 46 klonů každé knihovny mapováním peptidů BstNl (Clackson a kol., Nátuře 1991, 352, str. 624) ke zjištění rozdílnosti repertoárů. Pozoruje se velký rozsah digesčních obrazců. Také před selekcí se testují ELISOU scFv z 96 klonů z každé knihovny na vazbu k EGFR. Žádný z scFv ze slezinové knihovny a z knihovny lymfatických uzlin se neváže na EGFR. Jeden zscFv z knihovny imunizované in vitro vykazuje vazbu kEGFR. Po jednom běhu selekce za použití imunozkumavek povlečených EGFR se pozoruje zřetelné obohacení u scFv vázaných na EGFR u knihovny z lymfatických uzlin a u knihovny imunizované in vitro. Druhý běh selekce je nutný před detekcí nějaké scFv vázané k EGFR u knihovny ze sleziny. Při třetím běhu selekce je z hlediska vazby k EGFR pozitivní většina scFv z knihovny z lymfatické uzliny a z knihovny imunizované in vitro. Po čtvrtém průběhu selekce s knihovnou ze sleziny je většina scFv pozitivní z hlediska vazby k EGFR (tabulka I).
Tabulka I. Procento klonů vázajících EGFR po každém průběhu selekce
| Knihovna | |||
| z lymfatických uzlin | ze sleziny | z buněk imunizovaných in vitro | |
| předselekce | 0 | 0 | 1 |
| první běh | 77 | 0 | 84 |
| druhý běh | 86 | 26 | 100 |
| třetí běh | 90 | 77 | 100 |
| čtvrtý běh | nezkoušeno | 97 | nezkoušeno |
-8CZ 292061 B6 (2) Sekvenční analýza klonů vázajících EGFR
Po každém běhu selekce se analyzují inzerty z klonů vázajících EGFR pomocí mapování peptidů BstNl (Clackson a kol. Nátuře 352, str. 624, 1991). Ukazuje se, že dochází k obohacení určitých 5 digesčních obrazců. Klony s různým mapováním peptidů BstNl se vyberou ze druhého a třetího běhu selekce knihovny z lymfatických uzlin a z třetího a čtvrtého běhu selekce knihovny ze sleziny pro sekvencování DNA Vh a Vr. Klony z pozdějších běhů selekce se analyzují, jelikož se očekává vyšší afinita protilátek v pozdějších bězích (Clackson a kol. Nátuře 352, str. 624,1991).
ío Šestnáct klonů z knihovny lymfatických uzlin se sekvencuje a získá se šest různých scFv (obr. 1). Pět z nich jsou páry jedinečných VH a VK. Těch šest scFv jsou varianty prve se vyskytujících VH se šesti změnami aminokyselin, z nichž pět je v rámcové oblasti (FR) 1. Dvě z těchto změn lze přičíst použití degenerovaného primerů VH1BACKSFL (Hoogenboom a kol., Nucl. Acids Res. 19, str. 4133, 1991). Ostatní mohou být výsledkem omylů PCR. Vh jsou zařazeny do dvou 15 podskupin Vh2b a Vn3d, zatímco VK spadají do čtyř podskupin VK3, Vr4, Vk5 a VK6 (Kabat a kol., Sequences of proteins of immunological interest, 5. vydání U.S. Dept. of Health and Human Services Bethesda 1991). Deset jednotlivých klonů ze slezinové knihovny se sekvencuje a jsou nalezeny čtyři různé scFv. Tři z nich jsou páry jedinečných Vh a VK, zatímco čtvrtý je podobný jednomu z dřívějších párů s pouze dvěma rozdíly aminokyselin ve VH, z nichž jeden se 20 vyskytl v komplementaritě určující oblast (CDR) 2 a dva rozdíly aminokyselin ve VK. Rozdělení do podskupin ukazuje VH z podskupin Vn2a, VH2c a Vn3d a Vr z podskupin Vr3 a VK4. Porovnání scFv získaných z knihovny lymfatických uzlin a ze slezinové knihovny vykazují pouze jeden scFv, který je společný pro obě knihovny, scFv L3 10A(scFv S4 10H (obr. 1). Tento klon se jeví jako silně vázající na EGFR při testování metodou ELISA. Zatímco bylo vynaloženo 25 velké úsilí na eliminování vzájemné kontaminace mezi knihovnami, je obtížné vyloučit malé znečištění u klonů se silnou vazbou k EGFR. Vezme-li se však v úvahu příbuzná povaha myší Balb/c, je možné, že tentýž scFv pochází nezávisle ze dvou různých knihoven.
(3) Analýza afinity a specifičnosti vazby na EGFR
Na základě dobré vazby k antigenu a diverzity sekvencí DNA se k dalším analýzám vybere několik scFv z knihovny lymfatických žláz a ze slezinové knihovny. Tyto scFv se analyzují metodou ELISA na vazbu k vyčištěnému EGFR, vazbu k irelevantním antigenům a vazbu k řadám nádorových buněk, které expresují a neexpresují EGFR. Jako pozitivní kontrola se 35 připraví scFv z myší 425 MAb (Pl). Jako negativní kontrola se připraví scFv zfágových protilátek izolovaných z knihovny lymfatických uzlin a ze slezinové knihovny před selekcí (LlaSl). Koncentrace scFv se stanovuje porovnáním zředěných roztoků scFv, určených k testování, s roztoky vyčištěné scFv známé koncentrace při zkoušce Western Blot.
Testují se scFv způsobem ELISA na vazbu k vyčištěnému EGFR a výsledky se vynesou do grafu (obr. 2). Je možno seřadit scFv s ohledem na jejich vazbu kEGFR. Toto seřazení je reprodukovatelné mezi pokusy. Zkoušené scFv, které mají nejsilnější vazbu k EGFR, jsou L2 1C a L3 10A z knihovny lymfatických uzlin a S4 10H ze slezinové knihovny. Jak bylo shora popsáno, scFv L3 10A a S4 10H mají stejné sekvence DNA. Zkoušený scFv (S4 5A), který je 45 velmi podobný scFv 10H, se dvěma změnami aminokyselin ve VH a se dvěma změnami ve Vr dává konzistentně nižší zařazení než S4 10H. Na rozdíl od toho sekvence, pozorované mezi L2 12B a L3 1 ID, nemají, jak se zdá, výrazný vliv na vazbu. Z izolovaných scFv pouze dva, L2 8C a L2 11C se jeví jako méně vázající než scFv 425.
Testují se scFv způsobem ELISA na vazbu k plastu a k panelu nepříbuzných proteinů (ovalbumin, lysozym slepičích vajec, cytochrom c, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, CBA albumin a BSA). Žádný z scFv nedává signál nad pozadím.
Testují se scFv způsobem ELISA na vazbu ke třem liniím nádorových buněk. Buněčně linie 55 A431 a MDEA MB 468 jsou EGFR nesoucí nádorové buňky izolované z vulvy a z prsu. Buněčná
-9CZ 292061 B6 linie SK-MEL-23 je gangliosid nesoucí melanomová buněčná linie a je zařazena jako negativní kontrola. Z deseti testovaných scFv se vážou pouze čtyři jak k vyčištěným EGFR, tak k EGFR nesoucím nádorovým buňkám (L2 12B, L3 11D, L2 11C a S4 2D, obr. 5 až 8). Nebyla zjištěna vazba na buňky SK-MEL-23. Je několik různých vysvětlení tohoto překvapujícího výsledku. Jedním z nich může být, že EGFR, jehož bylo použito k imunizaci, výběru a ELISA, byl sekretovaný EGFR příbuzný protein (Weber a kol., Science 224, str. 294,1984. Tento protein má na C zakončení 17 přídavných aminokyselin (Gunther a kol., J. Biol. Chem. 265, str. 22082,
1990) . Testují se scFv způsobem ELISA na vazbu k tomuto 17 aminokyselinovému peptidu a nepozoruje se žádná vazba. Je možné, že sekretovaný protein příbuzný EGFR a EGFR na povrchu nádorových buněk mají rozdíly v konformaci nebo glykosylaci.
K dalšímu zkoumání vazby k nádorovým buňkám se vyčistí tři scFv (L2 11A, L3 1 ID a S4 2D) a analyzují se na vazbu k nádorovým buňkám A431 průtokovou cytometrií. Použije se scFv 425 jako pozitivní kontroly. Ze tří testovaných scFv mají vazbu k buňkám A431 pouze L3 1 ID a S4 2D. Tyto dva scFv mají podobný profil vazby k scFv 425.
Vyčištěné scFv, připravené ze dvou izolátů, které se vážou jak k EGFR, tak k EGFR nesoucím nádorovým buňkám (L3 11D a S4 2D) se testují v konkurenčních zkouškách vazby smyší 425 MAb. Zatímco vyčištěný scFv 4125 je schopen inhibovat vazbu myší 425 MAb vazbě na EGFR v daném rozsahu koncentrace, scFv L3 1 ID a S4 2D neinhibuje vazbu myší 425 MAb na EGFR při těchto koncentracích. Zdá se, že tyto oba scFv rozeznávají epitop EGFR, který je odlišný od epitopu rozeznávaného myším 425 MAb.
(4) Úplné chimémí protilátky odvozené od scFv
K přeměně na úplné protilátkové molekuly se vyberou dva scFv (L3 11D a S4 2D). DNA kódující myší VH a VK se klonují do přechodných vektorů obsahujících sekvence DNA kódující imunoglobulinové vůdčí sekvence a sestřihové donorové signály („splice donor signál“) (obr. 3). Poloha klonovacích míst v přechodném vektoru VH znamená, že první zbytek Vh se mění z asparagové na glutamovou kyselinu. Z přechodných vektorů se nyní připojené fragmenty DNA obsahující VH a VK k vůdčím a ksestřihovým donorovým sekvencím klonují do savčích buněčných expresních vektorů obsahujících DNA kódující buď lidskou gama-1 konstantní oblast nebo lidskou kappa konstantní oblast (Maeda a kol., Hum. Antibod. Hybridomy 2, str. 124,
1991) . Pro každou chimémí protilátku se kotransfektují do buněk COS expresní vektory těžkého a lehkého řetězce. Jako pozitivní kontrola se buňky též kotransfektují s expresními vektory s těžkým a s lehkým řetězcem kódujícími chimémí protilátku 425 (Kettleborough a kol., Protein Eng. 4, str. 773, 1991). Médium se shromáždí z buněk a analyzuje se testem ELISA k určení koncentrace obsažené protilátky a schopnosti protilátky vázat se na EGFR (obr. 4). Když se porovná koncentrace protilátky, potřebná k dosažení poloviny maxima vazby na antigen, váže se chimémí protilátka S4 2D na EGFR stejně dobře jako chimémí protilátka 425. Chimémí protilátka L3 11D se však váže na EGFR přibližně čtyřnásobně méně dobře než chimémí protilátka 425. Afinita chimémí protilátky 425 (Kettleborough a kol., Protein Eng. 4, str. 773, 1991), stanovená analýzou konkurenční vazby je 1,9x108 M“T. Tyto výsledky jsou překvapující, jelikož dřívější údaje analyzující scFv naznačovaly, že scFv S4 2D a L3 11D se oba vážou k EGFR lépe než scFv 254 (obr. 2). Vyčištěné vzorky proteinu A chimémích protilátek L3 1 ID a S4 2D se analyzují SDS-PAGE za redukčních a neredukčních podmínek. Chimémí protilátky L3 1 ID a S4 2D se také testují průtokovou cytometrií na vazbu kbuňkám A431 a SK-MEL-23. Obě chimémí protilátky se vážou dobře na EGFR expresující buňky A431 a nevážou se k EGFR negativním buňkám SK-MEL-23.
(5) Terapeutické a diagnostické použití
Protilátkové fragmenty a úplné protilátky podle vynálezu mohou být podávány pacientům k léčení. Vynález se proto také týká farmaceutického prostředku obsahujícího jako účinnou látku
-10CZ 292061 B6 nejméně jednu protilátku nebo protilátkový fragment shora definovaný spolu s jedním nebo s několika farmaceuticky vhodnými nosiči, excipienty nebo jejich ředidly.
Zpravidla se protilátka podle vynálezu podává intravenózně nebo parenterálně. Obecně je dávka pro podávání protilátkových fragmentů dostatečně velká, aby vyvolala žádoucí potlačení nádoru a narušení nádoru. Dávka závisí na věku, stavu, pohlaví a rozsahu onemocnění pacienta a je 0,1 až 200 mg/kg tělesné hmotnosti, s výhodou 0,1 až 100 mg/kg, přičemž se taková dávka podává najednou nebo v několika denních dávkách po dobu jednoho nebo několika dnů.
Farmaceutické prostředky pro parenterální podání zahrnují sterilní vodné nebo bezvodé roztoky, suspenze a emulze. Jakožto příklady nevodných roztoků se uvádějí roztoky v propylenglykolu, v polyethylenglykolu, v rostlinných olejích, jako je olivový olej, a v injektovatelných organických esterech, jako je ethyloleát a v jiných rozpouštědlech známých v oboru, jež se hodí k těmto účelům. Protilátek podle vynálezu je možno používat v prostředcích obsahujících fyziologicky vhodný nosič. Jako příklady takových vhodných nosičů se uvádějí solanka, PBS, Ringerův roztok nebo laktátovaný Ringerův roztok. Ochranné látky a jiné přísady, jako jsou antibiotika, antioxidanty a chelatizační činidla, mohou farmaceutické prostředky rovněž obsahovat.
Protilátka (fragment) může být též konjugována známými způsoby na cytokiny jako je IL-2 k podpoře jejich cytotoxicity.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu se hodí k ošetřování nádorů všeho druhu, včetně melanomů, gliomů a karcinomů, stejně jako nádorů oběhového systému a pevných nádorů.
K diagnostickým účelům může být protilátka konjugována například k barvivu neproniknutelnému zářením nebo může být radiologicky značená. Výhodnou metodou značení je způsob lodogen. Protilátka se s výhodou podává jako F(ab')2 nebo jako fragmenty scFv pro diagnostické účely. To zaručuje vynikající výsledky, takže odečet pozadí není nutný.
Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují, následující příklady praktického provedení. Procenta jsou míněna hmotnostně, pokud není jinak uvedeno.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
VesiklyA431
Přípravky vesiklů s odbouratelnými membránami se získají poněkud modifikovanými způsoby popsanými v literatuře (Cohen a kol., J. Biol. Chem. 257 str. 1523, 1982; Yeaton a kol., J. Biol. Chem. 258, str. 9254, 1983). Baňky, obsahující buňky A431, se promyjí PBS obsahujícím vápník a hořčík. Přidá se hypotonické PBS a baňky se protřepávají 15 minut. Buňky se promyjí vesikulačním pufrem (100 mM chloridu sodného, 50 mM dinatriumhydrogenfosforečnanu, 5 mM chloridu draselného, 0,5 mM síranu hořečnatého, hodnota pH 8,5). Přidá se vesikulační pufr a baňky se míchají při teplotě místnosti a při teplotě 37 °C. Pufr se dekantuje přes kovové sítko do 50 ml zkumavek v ledu a odstřeďuje se pět minut při 150 x g při teplotě 4 °C. Pelety se vyhodí a supematant se ultraodstřeďuje při počtu otáček 39 000/min po dobu 90 minut Získané pelety se resuspendují v 10 mM pufru Hepes (o hodnotě pH 7,4). K analyzování EGFR z vesiklů se vzorky vysráží 9 objemy ethanolu, resuspendují se s 0,08 M Tris, s hodnotou pH 6,8, a pak se provede SDS-PAGE s MAb 425 jako standardem.
Obsah proteinů produktů se kvantifikuje modifikovaným způsobem Coomassie Plus pomocí BSA jako standardu a odečte se při 595 nm. K analyzování EGFR z vesiklů se vzorky vysráží devíti
-11 CZ 292061 B6 objemy ethanolu přes noc při teplotě 4 °C. Pelety se resuspendují s Tris (0,08 M, hodnota pH 6,8) a provede se SDS-PAGE (5% gel, 1 hodina, 35 mA, 10% tekoucí gel, 2,5 hodin, 40 mA). Vzorky a standard jsou dvojité. Jeden z nich se obarví Coomassiovou modří a ostatní se nakapou na nitrocelulózové listy (12 V, 16 hodin při teplotě 4 °C) a zpracují se myším mAb 425 (anti-EGFR) $ a antimyší protilátkou lgG konjugovanou k alkalickému fosfátu.
K imunizaci in vitro se použije tří médií. Médium 1 (Ml), médium 2 (M2) a smíšené médium thymocitové kultury (MTC). Ml sestává z HL1 (Ventrex Laboratories, Sp. st. a.) suspendované s50mM 2-merkaptoethanolu a 2mM L-glutaminu (Gibco). M2 sestává zHLl doplněného 10 50 mM 2-merkaptcethanolu; 40U/ml IL-2 (Genzyme); 20mg/ml adjuvans peptidů (Sigma);
2mM L-glutaminu; 100 U/ml penicilinu (Gibco); 100 mg/ml streptomycinu (Gibco). Do M2 se přidá 4 % nebo 20 % FCS (Biological Industries). MTC se připraví způsobem, který popsal Vaux (1). Při tomto způsobu se jednobuňkové suspenze brzlíků tři týdny starých myší Balb/c aC57/ML-l připraví protlačením brzlíkových uzlin sterilním sítem o velikosti otvorů síta 15 300 mikrometrů (50 mesh). Suspenze buněk se shromáždí, promyje se dvakrát HBSS a počet živých buněk se zjistí vyloučením trypanové modři. Thymocyty se pak kultivují při hustotě 2,5 χ 106 thymocytů každého kmene na 1 ml v médiu HL1 obsahujícím 4% FCS, 2mM L-glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu. Po 48 hodinách se supematant oddělí, zfiltruje se přes 0,22 mm filtr a uloží se při teplotě -70 °C.
Suspenze splenocytů z neimunizovaných osm týdnů starých myší BALB/c se získá způsobem popsaným pro thymocyty. Životnost se zjistí vyloučením tiypanové modře.
Příklad 2
Imunizace in vitro a skrínování
K imunizaci in vitro se použije tří médií. Médium-1 (Ml), médium-2 (M2) a médium smíšených 30 thymocytových kultur (MTC). Ml tvoří HL1 (Ventrex Laboratories, Sp. st. a.) doplněného mM 2-merkaptoethanolu a 2mM L-glutaminu (Gibco). M2 tvoří HL1 doplněné 50 mM 2-merkaptoethanolu; 40 U/ml IL-2 (Genzyme); 20 mg/ml adjuvans peptidů (Sigma); 2mM L-glutaminu; 100 U/ml penicilinu (Gibco); 100 mg/ml streptomycinu (Gibco). Do M2 se přidá 3 % nebo 20 % FCS (Biological Industries). MTC se připraví způsobem popsaným Vausem (1).
Při způsobu se jednobuněčné suspenze brzlíků tři týdny starých myší Balb/c a C57/ML-1 připraví protlačením brzlíkových uzlin sterilním sítem o velikosti otvorů síta 300 mikrometrů (50 mesh). Suspenze buněk se shromáždí, promyje se dvakrát HBSS a počet živých buněk se zjistí vyloučením trypanové modři. Thymocyty se pak kultivují při hustotě 2,5 χ 106 thymocytů každého kmene na 1 ml v médiu HL1 obsahujícím 4% FCS, 2mM L-glutaminu, 100 U/ml 40 penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu. Po 48 hodinách se supematant oddělí, zfiltruje se přes 0,22 mm filtr a uloží se při teplotě -70 °C.
Suspenze splenocytů z neimunizovaných osm týdnů starých myší BALB/c se získá jak popsáno pro thymocyty. Životnost se zjistí vyloučením trypanové modři.
Jednobuněčné suspenze brzlíků tři týdny starých myší Balb/c a C57/ML-1 se připraví protlačením brzlíkových uzlin sterilním sítem o velikosti otvorů síta 300 mikrometrů (50 mesh). Suspenze buněk se shromáždí, promyje se dvakrát HBSS a počet živých buněk se zjistí vyloučením trypanové modři. Thymocyty se pak kultivují při hustotě 2,5 χ 106 thymocytů 50 každého kmene na 1 ml v médiu HL1 obsahujícím 4% FCS, 2mM L-glutaminu, 100 U/ml penicilinu a 100 mg/ml streptomycinu. Po 48 hodinách se supematant oddělí, zfiltruje se a uloží. Suspenze splenocytů z neimunizovaných osm týdnů starých myší BALB/c se získá jak popsáno pro thymocyty. Životnost se zjistí vyloučením trypanové modři.
-12CZ 292061 B6
Imunizace in vitro se provede v 6-důlkových destičkách (Costar). Důlky, obsahující 107 splenocytů v 3,5 ml média Ml (tvořeného médiem HL1 (Ventrex Laboratories, Sp. st. a.) doplněným 50 mM 2-merkaptoethanolu a 2mM L-glutamiu (Gibco)) se inkubují (37 °C, 5 % oxidu uhličitého) s vesikly nesoucími EGFR v požadované koncentraci. Vesikly z buněk, které neexpresují EGFR nebo PBS se přidají do kontrolních důlků. Po několika hodinách se do každého důlku přidá 3,5 ml média M2 (tvořeného médiem HL1 doplněným 50 mM 2-merkaptoethanolu, 40 U/ml IL-2 (Genzyme), 20 pg/ml adjuvans peptidu (Sigma), 2 mM L-glutaminu, 100 U/ml penicillinu (Gibco), 100 mg/ml streptomycinu (Gibco), obsahujícího 3% nebo 20% FCS (Biological Industries). U několika pokusů je M2 nahrazeno médiem MTC (smíšené thymocytové kultivační médium (Vaux a kol., Nátuře 336, str. 36, 1988) doplněné adjuvans peptidem /20 pg/ml) a IL-2 (40 U/ml)) (připomíná se, že konečná koncentrace FCS, IL2 a adjuvans peptidu v kultuře je snížena o 50 %). Buňky se inkubují za těchže podmínek po dobu 72, 96, 120 a 144 hodin a nakonec se buňky testují na přítomnost specifického imunoglobulinu nebo se zpracují k izolaci RNA.
Skrínování se provede vyčištěnými antigeny nebo fixovanými buňkami A431. Postup je v podstatě stejný jak shora popsáno (Carroll a kol., Hybridoma 9, str. 81, 1990) jen s určitými modifikacemi. Postupuje se tak, že se sterilní 96-důlkové destičky (Nunc, Maxisorb) přes noc povléknou vyčištěným EGFR (2,5 pg/ml), GD3 gangliosidem (2 pg/ml) nebo RNázou (10 pg/ml) v PBS. Použije-li se buněk A431 jako antigenu, kultivují se buňky v 96-důlkových destičkách až do splynutí a fixují se 0,1% glutaraldehydem. Lymfocyty imunizované in vitro se promyjí a resuspendují se v médiu HL1 doplněném 2 % FCS a 2mM L-glutaminu při 5 * 105 buněk/ml a do každého důlku se přidá 1 χ 48 hodin. Provede se 16 duplikátů z každé skupiny. Lymfocyty se odstraní 5-násobným promytím PBS obsahujícím 0,1 % Tween-20. Specifické imunoglobuliny se detekují pomocí značeného králičího antimyšího imunoglobulinu (Dako) (1 hodina, 37 °C). Jako substrátu se použije diamoniové soli kyseliny 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6sulfonové (ABTS) (SIGMA) v citrát-fosfátovém pufru (0,55 mg/ml).
Příklad 3
Konstrukce knihovny
Tři knihovny se konstruují z RNA připravené z myší sleziny imunizované intraperitoneálně buňkami A431 (Murthy a kol., Arch. Biochem. Biophys, 252, str. 549, 1987) zpodkolenní lymfatické uzliny myši imunizované v tlapce vyčištěným EGFR a z myších buněk imunizovaných vesikly A431 in vitro. Syntetizuje se první řetězec cDNA. Geny Vh a VK se zesílí PCR a shromáždí se (Clackson a kol., Nátuře 352, str. 624, 1991). Pomocí PCR se připojí Notl a Sfil restrikční místa a scFv se klonují do fagemidového vektoru pHENl (Hoogenboom a kol., Nucl. Acids Res. 19, str. 4133, 1991). Ligační směsi se elektroporují do buněk E. coli a výsledné kolonie se seškrábnou do média k vytvoření knihovny (Marks a kol., J. Mol. Biol. 222, str. 581, 1991).
Příklad 4
Skrínování knihovny
Fágové protilátky se z knihoven vyjmou pomocným fágem M13KO7 (Promega, Madison, WI) (Marks a kol., J. Mol. Biol. 222, str. 581, 1991). Imunozkumavky (Nunc, Life Sciences, Paisley, UK) se povléknou 4 ml 2,5 pg/ml EGFR v PBS přes noc. Po trojnásobném promytí PBS se zkumavky inkubují při teplotě 37 °C po dobu nejméně jedné hodiny v PBS obsahujícím 2 % práškového mléka (PBSM). Fág (10β až 1013) se resuspenduje ve 4 ml PBSM a inkubuje se ve zkumavce pokrytě EGFR 1 hodinu při teplotě místnosti. Zkumavka se promyje 20 krát PBS 0,1% Tween a 20krát PBS. Vázaný fág se eluuje po 10 minutové inkubaci v 1 ml 0,lM triethyl-13CZ 292061 B6 aminu za stálého míchání. Eluovaný fág se neutralizuje přísadou 0,5 ml 1M Tris-HCl s hodnotou pH 7,5 a použije se ho k infikování log fáze buněk TG1 E. coli. Infikované buňky se rozprostřou a očkují a individuální kolonie se zachytí pro indukci scFv v malém měřítku. Zbývající kolonie se seškrabou do média a podílu se použije k přípravě fágu pro další běh skrínování.
Příklad 5
Výroba a analýza scFv
Rozpustné scFv se produkují vE. coli HB2151 jak shora popsáno (například Kettleborrough a kol.). Koncentrace scFv v bakteriálních supematantech se stanoví za použití čištěného scFv o známé koncentraci jako standardu. Supematanty se zfiltrují a přidá se azid sodný do 0,1 %. Sériová zředění supematantů a standardu se nakapou na filtry Immobillon-PVDF (Millipore, Watford, UK) v 96-důlkové destičce. Filtry se zpracují jako Western blot (Towbin a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76, str. 4350, 1979). Detekují se scFv za použití protilátky (9E10) zaměřené na C-zakončení (Munro a Pelham, Cell 46, str. 291, 1986) a pak peroxidázou konjugované kozí antimyší protilátky lgG (Jackson Immuno Research Lab lne. West Grow, PA). Reakce se vyvolají za použití systému ECL (Amersham, Aylesbury, UK). Denzitometrem se proměří pre-flešové autoradiogramy. Připraví se standardní křivka a použije se jí k určení koncentrací scFv v supematantech.
Provedou se testy ELIS antigenové vazby s destičkami povlečenými EGFR (2,5 pg/ml). Supematantový povlak scFv se zředí v PBSM a přidá se na destičky. Vázané scFv se detekují pomocí 9E10 protilátky, jak shora popsáno. Supematanty se také testují na vazbu k panelu nepříbuzných proteinů a plastu. Destičky ELISA se povléknou přes noc 100 pg/ml ovalbuminem, lysozymem slepičích vajec, cytochromem c, glyceraldehydem 3-fosfátdehydrogenázy, myším albuminem (kmen CBA) a BSA. Nezředěné supematanty, obsahující 2 % práškového mléka, se přidají jako duplikát k povlečeným destičkám a vázané scFv se detekují popsaným způsobem.
Testy ELISA vazby k buňkám se provedou pomocí linií nádorových buněk, A431 (ATCC CRL 1555), MDA MB 468 (ATCC HTB 132) a SK-MEL-23 (negativní kontrola). Buňky se nechají růst až do slinutí v miskách s poly-D-lysinem zpracovanými 96-důlkovými tkáňovými kulturami (Nunc). Buňky se promyjí DMEM a blokují se při teplotě 37 °C dvě hodiny s PBSA obsahujícím 2,5 % BSA. Po odsátí se do každého důlku přidají supematanty spolu se stejným objemem média 2xYT obsahujícího 4 % práškového mléka a inkubují se při teplotě 4 °C jednu hodinu. Vázané scFv se detekují popsaným způsobem.
Testy ELISA na konkurenční bázi se provedou preinkubací EGFR povlečených destiček ELISA s 50 μΐ vyčištěného scFv (100 pg/ml) po dobu 10 minut. Pak se přidá myší MAb 425 (50 μΐ) k dosažení koncentrace 3,13 až 200 pg/ml. Po inkubaci a promytí se detekují myší MAb 425 pomocí peroxidázou konjugované kozí antimyší protilátky lgG a lgM.
Příklad 6
Analýza DNA
Pro BstNI mapování peptidů se zesílí PCR inzerty scFv z jednotlivých klonů a produkty se diferují s BstNI (Clackson a kol., Nátuře 352, str. 624, 1991). DNA se sekvencuje za použití křtu Sequenase (United States Biochemical, Cleveland, OH).
-14CZ 292061 B6
Příklad 7
Čištění scFv
Bakteriální supematanty se vyčeří odstředěním a filtrací 0,2 pm filtry před vnesením na lml sloupec vyčištěného EGFR (5 mg) kopulovaného na bromkyanem aktivované Sepharose 4B (Pharmacia, Upsala, Švédsko). Sloupec se promyje 30 ml PBS, následně 5 ml 0,2M glycinem s hodnotou pH 5,0. Eluují se scFv za použití systému 0,2M glycin/kyselina chlorovodíková s hodnotou pH 2,8. Eluát se neutralizuje 10 x PBS. Frakce, obsahující protein, se shromáždí a pufr se zamění ultrafiltrací (Amicon, Stonehouse, UK) na PBS obsahující 1 % BSA a 0,05 % azidu sodného.
Příklad 8
Analýza FACS vyčištěných scFv
Buňky A431 se trypsinují a inkubují v DMEM obsahujícím 10 % FCS. Buňky se promyjí dvakrát studeným DMEM a zfiltrují se sítem 45 pm. Buňky (105) se inkubují na ledě 30 minut v 50 pl PBS, 1 % BSA, s vyčištěnými scFv. Po dvou promytích studeným PBS se detekují vázané scFv pomocí 50 pl FITC-konjugovanou protilátkou 9E10 (100 pg/ml). Po 30 minutách na ledě se buňky promyjí jednou PBS, fixují se v PBS obsahujícím 1 % formaldehydu a analyzují se pomocí FACSCAN (Becton-Dickinson, Cowley, UK).
Příklad 9
Konstrukce, analýza a exprese úplných chimémích protilátek
Za použití míst Pstl a BstEII se subklonují DNA kódující VH vybraných scFv do přechodného vektoru VH obsahujícího eukaryotickou vůdčí sekvenci odvozenou z lidské protilátky HG3 CL (Rechavi a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80, str. 855, 1983) a sestřihového donorového místa (obr. 3). DNA kódující Vk se adaptují pro inzerci do přechodného vektoru Vk pomocí PCR primerů k začlenění míst Xhol a Sstl na zakončení 5' a 3' (VKFor: 5'CCG TTT CAG CTC GAG CTT GGT CCC-3VKBack: 5'-GAC ATT GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3').
Fragmenty Sstl-Xhol se klonují do přechodného vektoru VK obsahujícího eukaryotickou vůdčí sekvenci odvozenou od přetvařovaného lehkého řetězce lidské CAMPATH-l (Reichmann a kol., Nátuře 332, str. 21, 1988) a od sestřihového donorového místa (obr. 3). DNA kódující variabilní pluseukaiyotické lemovací oblasti se klonují jakožto fragmenty Hindiii-BamHI do expresních vektorů savčích buněk obsahujících genomové DNA kódující konstantní lidskou oblast gama-1 nebo konstantní lidskou kappa-oblast (Maeda a kol., Hum. Antibod. Hybridomas 2, str. 124, 1991). Expresní vektory s těžkým a lehkým řetězcem se elektroporují do buněk COPS. Po 72 hodinách se médium shromáždí a chimémí anti-EGFR protilátky se analyzují metodou ELISA (Kettleborrough a kol., Protein Eng. 4, str. 773,1991.).
Příklad 10
Příprava scFv odvozených z buněk imunizovaných in vitro
-15CZ 292061 B6
Dále popsané způsoby jsou mírnou modifikací shora popsaných způsobů. Imunizace, konstrukce knihovny a skrínování jsou uvedeny v příkladech 1 až 4. Následující stupně jsou dále podrobně popsány.
Po skrínování primární knihovny s klony, odvozené ze tří běhů zpracování, se vybere několik jednotlivých kampicilinu rezistentních kolonií. Alkalickou lýzou se připraví fagemid DNA a použije se k transfektování nesupresorového kmene E. coli HB2151 tepelným šokem. Kolonie se inokulují do 2xTY-Amp-Glu a nechají se růst přes noc při teplotě 30 °C. Použije se 5 ml podílů k inokulaci 50 ml 2xTY půdy obsahujícího 100 mg ampicillinu/ml a 0,1 % glukózy a růst se provádí za protřepávání při 30 °C po dobu jedné hodiny (až do log-fáze). Buňky se sklidí a exprese rozpustných scFv se navodí přísadou izopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) do konečné koncentrace 1 mM (De Bellis D. a Schwartz I., Nucleic Acids Res. 18, str. 1311,1990). Kultury se nechávají růst přes noc při 30 °C za protřepávání. Odeberou se supematanty obsahující scFv vyčištěné odstředěním a filtrací přes 0,22 mm filtry a testují se. Bakteriální supematanty se testují na vazbu k EGFR metodou ELIS A (Kettleborrough a kol., EP 94104160 a Eur. J. Immunol. 24, str. 952, 1994). Specificita selektovaných fragmentů scFv se kontroluje způsobem ELISA pomocí destiček povlečených různými proteiny příbuznými nebo nepříbuznými EGFR i jinými antigeny a plasty. Použitými antigeny jsou: RNasa, BSA, OVA, gangliosid GD3, victrorectinový receptor (VNR), destičkový glykoprotein 1 lbl 1 la (GP1 lbl 1 la) a disialyl-lakto-NPtetraosa (DSLNT). Povlaky se provedou přes noc při optimální koncentraci pro každý antigen. Povlečené destičky ELISA se blokují po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C 1,5% odstředěným mlékem v PBS (hmotnost k objemu). Po promytí se přidá 100 ml supematantů scFv do mikrotitrových důlků a inkubuje se po dobu dvou hodin při teplotě 37 °C. Vázané scFv se detekují pomocí protilátky anti-c-myc 9E10 (odpadní kultivační prostředí od Myc 1-9 El0.2 hybridu) a králičí anti-myší protilátky (Dako) konjugované alkalickou fosfatázou.
K testování schopnosti scFv vazby kEGFR na buňkách se použije tří řad nádorových buněk, nesoucích EGFR, A431, MDA MB 231 lidského adenokarconomu prsu (ATCC HTB 26) a HT29 lidského adenokarcinomu tlustého střeba (ATCC, HTB 38) a jedné EGFRneexpresující buněčné linie WM 164 pomocí analýzy FACS a imunofluorescence s nefixovanými buňkami. K nepřímé imunofluorescenční analýze se buňky vnesou do Terasaki destiček (2x104 buněk/důlek) a kultivují se po dobu 24 hodin. Pak se buňky inkubují 20 ml surového bakteriálního supernatantu obsahujícího fragmenty scFv po dobu 90 minut při teplotě místnosti. Inkubace s primární protilátkou (anti-c-myc) a sekundární protilátkou se provádí po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Sekundární protilátka, FICT-konjugovaná králičí anti-myší protilátka (Dako) se zředí v poměru 1:20.
Pro analýzu FACS se promyje 5x105 buněk PBS s 1 % BSA a s 0,1 % azidu sodného (PBS-BSA) a inkubuje se při teplotě 4 °C po dobu 20 minut s 50 ml surového bakteriálního supematantu. Po dvounásobném promytí studenou PBS-BSA se vázané scFv detekují pomocí protilátky anti-c-myc a konjugované FITC-konjugované kozí anti-myší protilátky (BectonDickinson) zředěné 1:25 v PBS-BSA. Do konečné koncentrace 5 mg/ml se přidá propidiumjodid (PI). Průtoková cytometrická analýza se provádí vEPICS Profilu Π opatřeném vzduchem chlazeným argonovým laserem. K excitaci se použije čáry 488 nm (15 mV). Ke shromáždění emise FITC se použije pásmového filtru 530 nm a ke shromáždění emise PI se použije pásmového filtru 625 nm. Živé buňky se vyberou sestavením bitové mapy na přední a boční rozptyl a vylučováním na buňkách obarvených PI.
Rozmanitost primární a vybrané knihovny se určí zesílením PCR klonovaných fragmentů (Giissow D., Clacksonm T., Nucleic Acids Res. 17, str. 4000,1989) a analýzou BsťNI digesčního obrazce (8). Několik klonů se sekvencuje za použití kitu Sequenase (USB) způsobem dideoxy-řetězcového zakončení (Sanger F. a kol., J. Proč. Nat. Acad. Sci., USA 74, str. 5463, 1977).
- 16CZ 292061 B6
Surové bakteriální supematanty (10 ml) se podrobí SDS-PAGE za použití 12,5% gelu. Provede se Western blotting v podstatě způsobem, který popsal Towbin (Towbin a kol., J. Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 76, str. 4350, 1979). Proteiny se transferují elektroblottingem na Immobilon-P (Millopore) nebo na nitrocelulózu (Bio-Rad). Skvrna (blot) se blokuje PBS obsahujícím 2 % odstředěného mléka (hmotnost/objem). Fragmenty scFv se detekují za použití anti-c-myc protilátky (9E10), peroxidázou konjugované protilátky anti-myší (Jackson) a podpořeného systému chemiluminiscence (ECL, Amersham).
Kvantitativní analýza odloučených membránových vesiklů ukazuje celkovou proteinovou koncentrací 2,5 mg/ml, z níž pouze 10 až 14 % odpovídá EGFR (Sáto a kol., J. Nati. Cancer Inst. 21, str. 1601, 1986; Yeaton R. a kol., J. Biol. Chem. 258, str. 9254, 1983), 250 až 350ng/ml. Elektroforézní analýza za použití PAGE-SDS následovaná vybarvováním Coomassiovou modří ukazuje, že vesikly obsahují spíše komplexní směs proteinů. Nezjišťuje se žádné odbourání proteinů. Western blot analýza ukazuje, že za daných experimentálních podmínek jsou v přípravku membránového vesiklu obsaženy úplné molekuly receptorů EGF.
K určení požadavků pro FCS a limphokiny se porovnávají MTC a M2 obsahující 20 % nebo 4 % FCS. Jako antigenu a kontroly se požívají vesikly nesoucí EGFR a PBS. Splenocyty se inkubují v šestidůlkových destičkách s antigenem a bez něho po dobu tří hodin v Ml (bez séra). Pak se přidá MTC nebo M2 a po 72, 96, 120 a 144 hodinách se provede skrínování za použití buněk fixovaných A431. Při všech pokusech je počet získaných žijících buněk 20 až 40 % v souladu s publikovanými výsledky (Gavilon-do-Cowley J. a kol., In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, str. 131, 1988). Maximální specifická odezva se získá čtvrtého dne s MTC; zatímco M2 při 4 % nebo 20% FCS (2% nebo 10% konečné koncentrace) posouvá maximální odezvu až do šestého dne (tabulka Π). Avšak MTC a 10 % FCS spouští nespecifickou odezvu, snad polyklonální aktivací, jak je možno pozorovat jsou-li výsledky vyjádřeny jako poměr specifické k nespecifické odezvě. Pro další zkoušky se používá M2 doplněný 4 % FCFS a šestidenní kultury.
Přítomnost EGFR v povrchu vesiklů silně podporuje odezvu na tento antigen. V podobných protokolech, jak shora popsáno, se porovnávají vesikly z EGFR expresujících a nexpresujících buněčných linií. Lymfocyty se kultivují s vesikly v Ml po dobu tří hodin. Poté se přidá M2 obsahující 4% FCS. Po šesti dnech se lymfocyty z každé skupiny kultivují 48 hodin v 96-důlkových destičkách povlečených EGFR, fixovanými buňkami A431, RNázou nebo GD3. Podle očekávání ukazují výsledky analýz multispecifický obraz odezvy (tabulka ΠΙ). Reaktivita vůči EGFR je zřetelně zvýšena podle optické hustoty, použije-li se EGFR expresujících vesiklů jako antigenu.
V souhrnu ukazují výsledky, že až nedokonalá, je měřitelná na antigenu závislá odezva po imunizaci in vitro, což vytváří několik očkovacích imunizovaných lymfocytů proti EGFR vhodných ke klonování PCR variabilních oblastí.
Knihovna 1,1 xlO5 klonů se získá po klonování fragmentů scFv odvozených z imunizace in vitro imunizace do fagemidu pHENl. Tato knihovna je generována paralelně se dvěma dalšími knihovnami za předpokladu imunizace in vivo. Konstrukce těchto fágových knihoven byla popsána již dříve (Kettleborrough a kol., EP 94104160 a Eur. J. Immunol. 24, str. 952,1994).
K selekci fragmentů scFv, vázaných k EGFR, se pěstují fágy za použití imunozkumavek povlečených EGFR. Eluované fágy jsou použity k reinfektování SupE subkmenu E.coli. Celkově se provedou tři běhy selekce. V každém běhu se testuje zkumavka bez antigenu paralelně k vypočtení pozadí. Při prvním běhu se aplikuje 1,5x1010 fágových částic do imunozkumavky a 6,6x 104 se eluuje z povlečené imunozkumavky; zatímco pouze 200 kolonií se získá z populace pozadí. Po třetím běhu se aplikuje lxlO11 fágů a eluuje se 5,6xlO10.
-17CZ 292061 B6
K dalšímu charakterizování fragmentů scFv se vybere 22 klonů z fágových populací před selekcí a po každém běhu selekce.
Rozlišnost knihovny se analyzuje BstNl digesčními obrazci klonovaných fragmentů. Před selekcí se knihovna jeví jako velmi rozmanitá. Mapování peptidů vazebných klonů, odvozených po prvním běhu selekce, naznačuje přítomnost několika skupin se stejným restrikčním obrazcem.
Klony se vybírají z různých běhů selekce na základě digesčních obrazců. Sekvencování DNA ukazuje přítomnost různých sekvencí ve většině selektovaných klonů. Délka a složení oblastí určujících komplementaritu (CDR) klonů 10D2, 5D3,10E2, 1B3,4B3 a 5E2 jsou různé. Většina variací se pozoruje v sekvencích CDR3 VH a VL. Klony 5D3 a 1E3 jsou odvozeny od třetího běhu selekce. Silně se vážou k EGFR jak je analyzováno metodou ELISA a průtokovou cytometrií a mají stejnou sekvenci.
Rozpustné fragmenty scFv se získají růstem nesupresorového kmene E. coli HB 2151 v přítomnosti IPTG.
K ověření produkce scFv se analyzuje bakteriální médium z individuálních klonů gelovou elektroforézou. Analýza Western blot ukazuje zřetelný pruh kolem 35 000 kD.
Klony s vazebnými aktivitami k EGFR se identifikují metodou ELISA. K prozkoumání vzájemné reaktivity vybraných klonů se provedou testy ELISA za použití různých antigenů. Antigeny (EGFR, RNasa, BSA, KLH, OVA, GD3 gangliosid, vitronektinový receptor, destičkový glycoprotein llbllla a disialyllakto-N-tetraosa) se nanesou jako povlak do destiček ELISA při optimální koncentraci (tabulka IV). Nezjišťuje se žádá vazba k ne-EGFR antigenům. Testují se také scFv na vazbu ke třem EGFR nesoucím nádorové buněčné linie (lidský epidermoidní karcinom A431, lidský adenokarcinom prsu MDA MB 231 a lidský adenokarcinom tlustého střeva HT29). WM 164 lidský melanom neexpresující EGFR se použije jako negativní kontrola. Fragmenty, které vážou linie nádorových buněk, se testují nepřímo imunofluorescenci za použití nefixovaných buněk a kvantifikují se FACS analýzou. Použití nefixovaných buněk zaručuje přírodní konformaci membránových receptorů. Pozitivní klony vykazují zřetelnou fluorescenci použitím buněk A431. Fluorescence s jinými nádorovými buněčnými řadami nesoucími EGFR je slabá. Nezjišťuje se žádá vazba k negativní linii buněk. Výsledky jsou potvrzeny průtokovou cytometrií. Sedmnáct pozitivních klonů a tri negativní klony se analyzují na vazbu k buňkám A431, MDA MB 231 a HT 29 průtokovou cytometrií. WM 164 se použije jako negativní buněčné řady. Jako pozitivní kontroly se použije 425 scFv (PÍ klonu) a klonového vektoru (HEN) jako negativní kontroly. Výsledky jsou shrnuty v tabulce V. Dva klony, 4B2 a 5E2 jsou pozitivní z hlediska vazby k EGFR podle testu ELISA, avšak negativní z hlediska vazby k EGFR expresujícím řadám nádorových buněk.
Tabulka Π. Vliv různých médií na imunizaci in vitroa)
Den skrínování proti A431
| 3. den | 4. den | 5. den | 6. den | ||||||
| Test | Antigen | O.D.c) | Poměrd) | O.D. | Poměr | O.D. | Poměr | O.D. | Poměr |
| 1 | vesikly | 0,393 | 2,11 | 0,801 | 3,76 | 0,784 | 3,90 | 0,951 | 10,3 |
| PBS | 0,186 | 0,213 | 0,201 | 0,092 | |||||
| 2 | vesikly | 0,527 | 2,50 | 0,852 | 1,76 | 0,863 | 2,75 | 1,168 | 3,94 |
| PBS | 0,210 | 0,482 | 0,313 | 0,296 | |||||
| 3 | vesikly | 0,763 | 1,48 | 1,169 | 2,01 | 1,089 | 2,07 | 1,115 | 1,91 |
| PBS | 0,513 | 0,581 | 0,525 | 0,581 |
-18CZ 292061 B6
Test 1: Ml plus M2,4 % FCS (konečné FCS: 2 %).
Test 2: Ml plus M2,20 % FCS (konečné FCS: 10 %).
Test 3: A-médium plus MTC, 4 % FCS (konečné FCS: 2 %).
a) Slezinné myší buňky BALB/c (107) se inkubují v 3,5 ml Ml s vesikly z buněk A431 nebo PBS po dobu tří hodin v důlcích šestidůlkových destiček. Potom se přidá 3,5 ml MTCD nebo M2 obsahujícího 4 %, nebo 20 % FCS a destičky se inkubují. Z kultivačního prostředí se 3., 4., 5. nebo 6. den vyjmou lymfocyty imunizované in vitro, promyjí se HBSS k odstranění vesiklů a naočkují se do 96 důlkových destiček povlečených fixovanými buňkami A431 a inkubují se po dobu 48 hodin (viz metody).
b) Konečná koncentrace FCS v kultivačním prostředí.
c) O.D. = optická hustota (Optical Density) odečtená při 405 nm. Představuje průměr z šedesáti důlků.
d) Poměr specifické odezvy (vesikly jakožto antigen) k nespecifické odezvě (PBS jakožto antigen).
Tabulka ΙΠ. Multi-specifícita odezvy po imunizaci in vitro
| Skupina antigenů | Buňky 431 | Skrínování oproti | RNáze | ||
| EGFR | CD3 | ||||
| Test 1 | EGFR+ | 0,512a) b) | 0,326 | 0,140 | 0,249 |
| EGFR- | 0,427 | 0,070 | 0,123 | 0,304 | |
| Test 2 | EGFR+ | 1,430 | 0,730 | 0,233 | 0,670 |
| EGFR- | 0,789 | 0,195 | 0,118 | 0,561 |
a) Lymfocyty jsou imunizovány in vitro pomocí buď EGFR expresujících vesiklů (EGFR+) nebo vesiklů neexpresujících EGFR (EGFR-). Po šesti dnech inkubace se buňky z kultivačního prostředí vyjmou a skrínují se proti shora uvedeným antigenům.
b) Odezva je vyjádřena jako optická hustota (405 nm).
Tabulka IV. Vzájemná reaktivita vybraných fragmentů scFv vůči několika antigenůma)
| Antigenb) | Povlak mg/ml | Výsledek |
| EGFR | 2,5 | + |
| RNáze | 10,0 | - |
| BSA | 10,0 | |
| KLH | 10,0 | - |
| OVA | 10,0 | - |
| GD3 gangliosid | 2,0 | - |
| VNR | 1,0 | - |
| GPnblHa | 1,0 | - |
| DSLNT | 5,0 | - |
a) Testy ELISA provedeny jak popsáno.
b) Vitronectinový receptor (VNR); destičkový glykoprotein IlbUIa (GPnbUIa); disialyllakto-N-tetraosa (DSLNT).
-19CZ 292061 B6
Tabulka V. Reaktivita klonů scFv vůči EGFR. Komparativní výsledky mezi metodou ELISA s vyčištěným rozpustným antigenem a cytometrickou analýzou buněčných řad.
Klony Cytometrická analýza řad nádorových buněka) (průměr ELISA libovolných fluorescenčních jednotek) (O.D.)
| Pozitivní | WM164 | A431 | MDAAMB231 | HT29 | EGFR |
| 7H1 | 1,6 | 112,9 | 16,4 | 2,6 | 1,2 |
| 4B2 | 1,2 | 5,3 | 4,2 | 0,6 | 2 |
| 10D2 | 1,5 | 145,3 | 36,3 | 4,8 | 2 |
| 12D2 | 1,8 | 129,5 | 29,3 | 5,7 | 2 |
| 5E2 | 1,4 | 2,5 | 7,1 | 0,5 | 1,8 |
| 8E2 | 1,5 | 134,5 | 47,7 | 5,1 | 1,9 |
| 5F2 | 1,3 | 146,3 | 40,6 | 5,7 | 1,9 |
| 11H2 | 1,9 | 152,2 | 25,3 | 2 | 1,9 |
| 1B3 | 0,6 | 105,1 | 36,4 | 5,2 | >2 |
| 4B3 | 0,5 | 78 | 15,8 | 2,3 | 2 |
| 3D3 | 1,2 | 94,3 | 25,1 | 4,8 | 1,9 |
| 5D3 | 0,5 | 112 | 22,2 | 5,5 | >2 |
| 4F3 | 0,4 | 110,3 | 32,3 | 6,2 | >2 |
| 4G3 | 0,4 | 76,5 | 20,4 | 2 | >2 |
| 1E3 | 0,4 | 118,3 | 33,8 | 5,1 | 2 |
| 3H3 | 0,6 | 76,5 | 33,7 | 4,2 | >2 |
| Negativní 5F1 | 2,4 | 2,3 | 3,6 | 1,8 | 0,2 |
| 7G1 | 1,4 | 10,2 | 4 | 2,8 | 0,2 |
| 1H1 | 0,5 | 5 | 4 | 0,75 | 0,2 |
| Kontrolyb) HEN | 0,4 | 4,2 | 3,7 | 1,0 | 0,2 |
| Pl | 0,6 | 85,5 | 21,3 | 2,5 | 1,9 |
a) Tři buněčné řady nesoucí EGFR (A431, MDAAMB231 a HT29) a jedna neexpresující buněčná řada (WM164) použity ke zkoušce schopnosti scFv vázat řady nádorových buněk popsanou cytometrickou analýzou.
b) Jako negativní kontroly použito vektoru bez fragmentu (HEN) a jako pozitivní kontroly 10 použito scFv fragmentu z 425 mAb (Pl).
Průmyslová využitelnost
Jednořetězcové fragmenty protilátek chráněné proti receptorů epidermálnflio růstového faktoru pro výrobu farmaceutických prostředků k léčení nádorových onemocnění a k diagnostické lokalizaci a vyhodnocování růstu nádorů.
Claims (10)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Jednořetězcový fragment Fv protilátky proti receptorů epidermálního růstového faktoru, získatelný zfágových protilátkových knihoven konstruovaných buněk imunizovaných savců, přičemž variabilní oblast řetězce Fv obsahuje aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce ze souboru zahrnujícího sekv. ID. č.: 4, sekv. ID. č.: 8, sekv. ID. č.: 12, sekv. ID. č.: 16, sekv. ID. č.: 18, sekv. ID. č.: 20, sekv. ID. č.: 22, sekv. ID. č.: 24, sekv. ID. č.: 26 a sekv. ID. č.: 28, a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce ze souboru zahrnujícího sekv. ID. č.: 2, sekv. ID. č.: 6, sekv. ID. č.: 10, sekv. ID. č.: 14, sekv. ID. č.: 18, sekv. ID. č.: 20, sekv. ID. č.: 22 sekv. ID. č.: 24, sekv. ID. č.: 26 a sekv. ID. č.: 28.
- 2. Jednořetězcový fragment Fv protilátky podle nároku 1, získatelný z buněk imunizované myši.
- 3. Jednořetězcový fragment Fv protilátky podle nároku 1 nebo 2, získatelný z buněk (i) lymfatické uzliny, (ii) sleziny, nebo (iii) imunizovaných in vitro.
- 4. Molekula DNA kódující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce a aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce jednořetězcového fragmentu Fv protilátky proti receptorů epidermálního růstového faktoru podle nároků 1 až 3, volená z jedné ze sekvenci v SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15,17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 a 31.
- 5. Úplná protilátka proti receptorů epidermálního růstového faktoru konstruovaná ze sekvencí DNA odvozených od jednořetězcového fragmentu Fv protilátky podle nároků 1 až 3, nebo DNA molekuly podle nároku 4 a od DNA sekvencí odvozených od konstantních oblastí lidských imunoglobulinů.
- 6. Protilátka podle nároku 5, přičemž konstantní oblast těžkého řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci lidského řetězce gama-1 a konstantní oblast lehkého řetězce obsahuje aminokyselinovou sekvenci lidského řetězce kappa.
- 7. Způsob přípravy jednořetězcového fragmentu Fv protilátky proti receptorů epidermálního růstového faktoru podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se (i) izoluje RNA z imunizovaných savčích buněk, s výhodou z myších buněk, (ii) syntetizuje se první řetězec cDNA, (iii) amplifikují se geny VH a VK v cDNA z imunizovaných buněk, (iv) klonují se tyto geny spolu s vhodnými restrikčními místy do fagemidového vektoru, (v) transformují se prokaryotické buňky ligačními směsmi, (vi) skrínují se fágové knihovny pro fágové protilátky, zaměřené na EGFR pomocí vyčištěné EGFRa (vii) produkuje se žádaný jednořetězcový fragment Fv protilátky v prokaryotických hostitelských buňkách, s výhodou v E. coli.-21 CZ 292061 B6
- 8. Způsob přípravy protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru podle nároku 5, vyznačující se tím, že se klonuje DNA kódující variabilní oblasti fragmentu Fv protilátky proti EGFR do alespoň jednoho eukaryotického expresního vektoru obsahujícího genomovou DNA, která kóduje konstantní oblasti lidských imunoglobulinů, transformují se eukaryotické buňky uvedeným vektorem nebo uvedenými vektory a expresuje se a izoluje se protilátka.
- 9. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jednořetězcový Fv fragment protilátky anti-EGFR podle nároků 1 až 4 nebo úplnou protilátku anti-EGFR podle nároků 5 nebo 6.
- 10. Použití jednořetězcového fragmentu Fv protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru podle nároků 1 až 3 nebo úplné protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru podle nároku 5 nebo 6 k výrobě léčiv zaměřených na nádory nebo pro diagnostický kit.35 str. sekvenčního protokolu
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94104160 | 1994-03-17 | ||
| EP94118970 | 1994-12-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ301495A3 CZ301495A3 (en) | 1996-02-14 |
| CZ292061B6 true CZ292061B6 (cs) | 2003-07-16 |
Family
ID=26135522
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19953014A CZ292061B6 (cs) | 1994-03-17 | 1995-03-16 | Jednořetězcové fragmenty protilátek a protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5844093A (cs) |
| EP (1) | EP0699237B1 (cs) |
| JP (2) | JPH08510922A (cs) |
| KR (1) | KR100376038B1 (cs) |
| AT (1) | ATE232902T1 (cs) |
| AU (1) | AU2071695A (cs) |
| CA (1) | CA2163012C (cs) |
| CZ (1) | CZ292061B6 (cs) |
| DE (1) | DE69529649T2 (cs) |
| DK (1) | DK0699237T3 (cs) |
| ES (1) | ES2191702T3 (cs) |
| HU (1) | HU221001B1 (cs) |
| MX (1) | MX9504802A (cs) |
| NO (1) | NO322252B1 (cs) |
| PL (1) | PL181342B1 (cs) |
| PT (1) | PT699237E (cs) |
| RU (1) | RU2170257C2 (cs) |
| SK (1) | SK283889B6 (cs) |
| UA (1) | UA41929C2 (cs) |
| WO (1) | WO1995025167A1 (cs) |
Families Citing this family (126)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2166368T3 (es) * | 1993-12-24 | 2002-04-16 | Merck Patent Gmbh | Inmunoconjugados. |
| US7060808B1 (en) * | 1995-06-07 | 2006-06-13 | Imclone Systems Incorporated | Humanized anti-EGF receptor monoclonal antibody |
| WO1998012227A1 (en) * | 1996-09-19 | 1998-03-26 | Diagnocure Inc. | Recombinant single chain antibodies directed against the gp54 cancer marker, composition comprising same and use thereof |
| EP1500329B1 (en) * | 1996-12-03 | 2012-03-21 | Amgen Fremont Inc. | Human antibodies that specifically bind human TNF alpha |
| US6562599B1 (en) | 1997-09-02 | 2003-05-13 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Single-stranded antibody against hepatitis B virus core protein, gene thereof, and therapeutic agent for hepatitis B containing these |
| DE19744531A1 (de) * | 1997-10-09 | 1999-05-27 | Klaus Dr Rer Nat Bosslet | Bindemoleküle gegen Rezeptor-Ligand-Komplexe |
| ATE447613T1 (de) | 1997-11-17 | 2009-11-15 | Micromet Ag | Verfahren zur identifikation von bindestellendomänen, die ihre epitopbindefähigkeit beibehalten |
| US20030224001A1 (en) * | 1998-03-19 | 2003-12-04 | Goldstein Neil I. | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors |
| ZA200007412B (en) * | 1998-05-15 | 2002-03-12 | Imclone Systems Inc | Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases. |
| CN1183160C (zh) | 1998-08-28 | 2005-01-05 | 基因技术股份有限公司 | 人抗因子IX/IXa抗体 |
| IL146480A0 (en) * | 1999-05-14 | 2002-07-25 | Imclone Systems Inc | Treatment of refractory human tumors with epidermal growth factor receptor antagonists |
| US7144991B2 (en) | 1999-06-07 | 2006-12-05 | Aletheon Pharmaceuticals, Inc. | Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof |
| US6790631B1 (en) * | 1999-10-05 | 2004-09-14 | Agensys, Inc. | G protein-coupled receptor up-regulated in prostate cancer and uses thereof |
| US7361338B2 (en) * | 1999-10-05 | 2008-04-22 | Agensys, Inc. | Methods to inhibit growth of prostate cancer cells |
| US20040091485A1 (en) * | 2000-05-19 | 2004-05-13 | Ellis John Robert Maxwell | Humanised antibodies to the epidermal growth factor receptor |
| AU2001262750A1 (en) * | 2000-06-14 | 2001-12-24 | Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. | Method of constructing scfv antibody fused with fluorescent protein |
| US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
| US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
| US8697394B2 (en) | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
| DE60139720D1 (de) * | 2000-06-28 | 2009-10-08 | Glycofi Inc | Verfahren für die Herstellung modifizierter Glykoproteine |
| JP2004527456A (ja) * | 2000-08-09 | 2004-09-09 | イムクローン システムズ インコーポレイティド | Ｅｇｆ受容体拮抗剤による過増殖性の疾患の治療 |
| JP2004520011A (ja) * | 2000-08-21 | 2004-07-08 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | Ｒａｎｋリガンド介在障害の治療において有用な抗−ｒａｎｋリガンドモノクローナル抗体 |
| US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| WO2002056910A1 (en) * | 2001-01-17 | 2002-07-25 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| GB0103389D0 (en) * | 2001-02-12 | 2001-03-28 | Novartis Ag | Organic compounds |
| ES2328796T3 (es) | 2001-03-14 | 2009-11-18 | Myriad Genetics, Inc. | Interaccion tsg101-gag y uso de la misma. |
| US20080008704A1 (en) * | 2001-03-16 | 2008-01-10 | Mark Rubin | Methods of treating colorectal cancer with anti-epidermal growth factor antibodies |
| US20100056762A1 (en) | 2001-05-11 | 2010-03-04 | Old Lloyd J | Specific binding proteins and uses thereof |
| WO2002092771A2 (en) | 2001-05-11 | 2002-11-21 | Ludwig Institute For Cancer Research | Specific binding proteins and uses thereof |
| US20020193569A1 (en) * | 2001-06-04 | 2002-12-19 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells |
| US7595378B2 (en) | 2001-06-13 | 2009-09-29 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR) |
| CN100497389C (zh) * | 2001-06-13 | 2009-06-10 | 根马布股份公司 | 表皮生长因子受体(egfr)的人单克隆抗体 |
| CA2472937C (en) | 2002-01-11 | 2014-06-17 | Biomarin Pharmaceutical, Inc. | Use of p97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes |
| US20050276812A1 (en) | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Genentech, Inc. | Antibody-drug conjugates and methods |
| US8034904B2 (en) * | 2002-06-14 | 2011-10-11 | Immunogen Inc. | Anti-IGF-I receptor antibody |
| MXPA05000403A (es) | 2002-07-15 | 2005-07-22 | Genentech Inc | Metodos para identificar tumores que responden al tratamiento con anticuerpos contra erbb2. |
| US10919956B2 (en) | 2002-11-12 | 2021-02-16 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
| US20040147428A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-07-29 | Pluenneke John D. | Methods of treatment using an inhibitor of epidermal growth factor receptor |
| US7332299B2 (en) | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
| EP1622941A2 (en) * | 2003-03-20 | 2006-02-08 | ImClone Systems Incorporated | Method of producing an antibody to epidermal growth factor receptor |
| US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
| DK1687338T3 (da) | 2003-11-07 | 2011-02-07 | Ablynx Nv | Camelidae enkeltdomæne-antistoffer VHH, der er rettet mod epidermal vækstfaktor-receptor og anvendelser deraf |
| JP4734319B2 (ja) * | 2004-03-19 | 2011-07-27 | イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | ヒト抗上皮成長因子受容体抗体 |
| PL1745075T3 (pl) | 2004-04-21 | 2013-09-30 | Brigham & Womens Hospital Inc | Peptydy wiążące poli-N-acetyloglukozaminę (PNAG/DPNAG) i sposoby ich zastosowania |
| GB0410627D0 (en) * | 2004-05-12 | 2004-06-16 | Scancell Ltd | Specific binding members |
| US20100111856A1 (en) | 2004-09-23 | 2010-05-06 | Herman Gill | Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates |
| NZ580115A (en) | 2004-09-23 | 2010-10-29 | Genentech Inc | Cysteine engineered antibody light chains and conjugates |
| SI1912675T1 (sl) | 2005-07-25 | 2014-07-31 | Emergent Product Development Seattle, Llc | zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20 |
| US20100056439A1 (en) * | 2005-12-06 | 2010-03-04 | Domantis Limited | Ligands that have binding specificity for egfr and/or vegf and methods of use therefor |
| US7503217B2 (en) * | 2006-01-27 | 2009-03-17 | Weatherford/Lamb, Inc. | Sonar sand detection |
| WO2007102787A1 (en) | 2006-03-06 | 2007-09-13 | Agency For Science, Technology & Research | Human embryonic stem cell methods and podxl expression |
| MX363905B (es) | 2006-06-12 | 2019-04-08 | Aptevo Res & Development Llc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
| EP2975057A1 (en) | 2006-07-10 | 2016-01-20 | Fujita Health University | Novel anti-cd73 antibody |
| WO2008070780A1 (en) | 2006-12-07 | 2008-06-12 | Novartis Ag | Antagonist antibodies against ephb3 |
| WO2008077171A1 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Novelix Therapeutics Gmbh | Treatment of diabetes by at least one epidermal growth factor receptor specific antibody or a derivative thereof |
| MX2009007987A (es) | 2007-01-25 | 2010-03-01 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Uso de anticuerpos anti-egfr en el tratamiento de enfermedad mediada por egfr mutante. |
| US9023356B2 (en) | 2007-03-15 | 2015-05-05 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd | Treatment method using EGFR antibodies and SRC inhibitors and related formulations |
| WO2008154927A1 (en) * | 2007-06-21 | 2008-12-24 | Genmab A/S | Novel methods for treating egfr-associated tumors |
| JP5532486B2 (ja) | 2007-08-14 | 2014-06-25 | ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ | Ｅｇｆ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５ならびにその誘導体および用途 |
| MX2010003099A (es) | 2007-09-21 | 2010-05-17 | Univ California | Interferon de objetivo demuestra actividades potentes apoptoticas y antitumorales. |
| EP2132228B1 (en) | 2008-04-11 | 2011-06-22 | Emergent Product Development Seattle, LLC | Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof |
| CA2722466A1 (en) | 2008-04-29 | 2009-11-05 | Tariq Ghayur | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| CA2725666A1 (en) | 2008-06-03 | 2009-12-10 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| AU2009256250B2 (en) | 2008-06-03 | 2013-05-30 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| NZ590074A (en) | 2008-07-08 | 2012-12-21 | Abbott Lab | Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| KR20110031393A (ko) | 2008-07-21 | 2011-03-25 | 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. | 합성 베타-1,6 글루코사민 올리고당에 관한 방법 및 조성물 |
| KR101108642B1 (ko) * | 2009-09-29 | 2012-02-09 | 주식회사 녹십자 | 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 |
| KR20140015139A (ko) | 2009-10-15 | 2014-02-06 | 애브비 인코포레이티드 | 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 |
| UY32979A (es) | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
| US20120282274A1 (en) * | 2009-11-20 | 2012-11-08 | Northshore University Health System Research Institute | Targeting of the c-terminal segment of c.difficile toxin b for improved clinical diagnosis, prevention, and treatment |
| CA2781682A1 (en) | 2009-12-04 | 2011-06-09 | Genentech, Inc. | Multispecific antibodies, antibody analogs, compositions, and methods |
| CN102167743B (zh) * | 2010-02-25 | 2014-05-14 | 上海百迈博制药有限公司 | 一种全人源抗egfr单克隆抗体、其制备方法及用途 |
| RU2624027C2 (ru) | 2010-04-23 | 2017-06-30 | Дженентек, Инк. | Получение гетеромультимерных белков |
| WO2011152525A1 (ja) * | 2010-06-04 | 2011-12-08 | 東亞合成株式会社 | 抗体およびその利用 |
| CA2807014A1 (en) | 2010-08-03 | 2012-02-09 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| TW201211252A (en) | 2010-08-26 | 2012-03-16 | Abbott Lab | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| KR101273918B1 (ko) * | 2010-09-17 | 2013-06-13 | 강원대학교산학협력단 | 인간 항-상피세포성 성장인자수용체 Ｆａｂ 항체 및 이를 포함하는 종양 치료용 약학 조성물 |
| EA201390472A1 (ru) | 2010-10-29 | 2014-02-28 | Иммьюноджен, Инк. | Новые молекулы, связывающиеся с egfr, и их иммуноконъюгаты |
| AU2011320318B9 (en) | 2010-10-29 | 2015-11-19 | Immunogen, Inc. | Non-antagonistic EGFR-binding molecules and immunoconjugates thereof |
| US10689447B2 (en) | 2011-02-04 | 2020-06-23 | Genentech, Inc. | Fc variants and methods for their production |
| CA2825064C (en) | 2011-02-04 | 2022-08-30 | Genentech, Inc. | Fc variants and methods for their production |
| CN103561771B (zh) | 2011-03-17 | 2019-01-04 | 伯明翰大学 | 重新定向的免疫治疗 |
| JP6208658B2 (ja) | 2011-07-05 | 2017-10-04 | バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド | ｐ９７−抗体結合体および使用方法 |
| EP2739649B1 (en) | 2011-08-05 | 2017-09-27 | Bioasis Technologies Inc. | P97 fragments with transfer activity |
| MX357391B (es) | 2011-09-30 | 2018-07-06 | Regeneron Pharma | Anticuerpos anti-erbb3 y usos de los mismos. |
| US9273143B2 (en) | 2011-09-30 | 2016-03-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions comprising a combination of an anti-ErbB3 antibody and an anti-EGFR antibody |
| KR102037541B1 (ko) | 2011-10-28 | 2019-10-29 | 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 | 폴리펩티드 구축물 및 이의 용도 |
| CA2856411A1 (en) | 2011-11-21 | 2013-05-30 | Immunogen, Inc. | Method of treatment of tumors that are resistant to egfr therapies by egfr antibody cytotoxic agent conjugate |
| UY34558A (es) | 2011-12-30 | 2013-07-31 | Abbvie Inc | Proteínas de unión específicas duales dirigidas contra il-13 y/o il-17 |
| EP2827906A1 (en) * | 2012-03-21 | 2015-01-28 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der Angewandten Forschung e.V. | Novel photoimmunoconjugates for use in photodynamic therapy |
| CN104918956A (zh) * | 2012-05-17 | 2015-09-16 | 索伦托治疗有限公司 | 与egfr结合的抗原结合蛋白 |
| TWI641619B (zh) | 2012-06-25 | 2018-11-21 | 美商再生元醫藥公司 | 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途 |
| EP2880156B1 (en) | 2012-07-31 | 2017-08-23 | biOasis Technologies Inc | Dephosphorylated lysosomal storage disease proteins and methods of use thereof |
| AU2013337775B2 (en) | 2012-11-01 | 2017-03-30 | Abbvie Inc. | Anti-VEGF/DLL4 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| CN105263958B (zh) | 2013-03-13 | 2019-09-27 | 比奥阿赛斯技术有限公司 | p97片段及其应用 |
| CN105324396A (zh) | 2013-03-15 | 2016-02-10 | 艾伯维公司 | 针对IL-1β和/或IL-17的双重特异性结合蛋白 |
| EA033115B1 (ru) | 2013-04-29 | 2019-08-30 | Тева Фармасьютикалз Острэйлиа Пти Лтд. | АНТИТЕЛА ПРОТИВ CD38 И СЛИТЫЕ БЕЛКИ С ОСЛАБЛЕННЫМ ИНТЕРФЕРОНОМ АЛЬФА-2b |
| US11117975B2 (en) | 2013-04-29 | 2021-09-14 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B |
| EP3038657A2 (en) | 2013-08-28 | 2016-07-06 | Bioasis Technologies Inc. | Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof |
| JP6603227B2 (ja) | 2014-02-03 | 2019-11-06 | バイオアシス テクノロジーズ インコーポレイテッド | Ｐ９７融合タンパク質 |
| DK3107562T3 (da) | 2014-02-19 | 2019-12-16 | Bioasis Technologies Inc | P97-ids-fusionsproteiner |
| UA119352C2 (uk) | 2014-05-01 | 2019-06-10 | Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд | Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину |
| US10058619B2 (en) | 2014-05-01 | 2018-08-28 | Bioasis Technologies, Inc. | P97-polynucleotide conjugates |
| CN106456768B (zh) | 2014-06-13 | 2019-12-03 | 腾博龙公司 | 含有抗egfr1抗体的缀合物 |
| IL251822B2 (en) | 2014-10-29 | 2023-03-01 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Variants of interferon alpha-2-b |
| US10093733B2 (en) | 2014-12-11 | 2018-10-09 | Abbvie Inc. | LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins |
| TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白 |
| WO2017053469A2 (en) | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Aptevo Research And Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
| WO2017201488A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-11-23 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single domain serum albumin binding protein |
| US11623958B2 (en) | 2016-05-20 | 2023-04-11 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single chain variable fragment CD3 binding proteins |
| US11618784B2 (en) | 2016-07-19 | 2023-04-04 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd. | Anti-CD47 combination therapy |
| WO2018152033A1 (en) * | 2017-02-14 | 2018-08-23 | Promab Biotechnologies, Inc. | Cd47-car-t cells |
| EP3589662A4 (en) | 2017-02-28 | 2020-12-30 | Harpoon Therapeutics, Inc. | INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN |
| JP7090347B2 (ja) | 2017-05-12 | 2022-06-24 | ハープーン セラピューティクス，インク． | メソテリン結合タンパク質 |
| CR20200195A (es) | 2017-10-13 | 2020-08-14 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteínas de unión a antigenos de maduraciòn de celulas b |
| CN109879964B (zh) * | 2017-12-06 | 2022-08-05 | 北京科立思维生物科技有限公司 | 抗egfr单链抗体、抗pd1单链抗体及融合蛋白 |
| WO2019195959A1 (en) | 2018-04-08 | 2019-10-17 | Cothera Biosciences, Inc. | Combination therapy for cancers with braf mutation |
| US10815311B2 (en) | 2018-09-25 | 2020-10-27 | Harpoon Therapeutics, Inc. | DLL3 binding proteins and methods of use |
| JP2022514262A (ja) | 2018-12-17 | 2022-02-10 | レビトープ リミテッド | 双子型免疫細胞エンゲージャー |
| EP4142778A1 (en) * | 2020-04-30 | 2023-03-08 | Board of Regents, The University of Texas System | Anti-cd79b antibodies and chimeric antigen receptors and methods of use thereof |
| EP3954393A1 (en) | 2020-08-13 | 2022-02-16 | Bioasis Technologies Inc. | Combination therapies for delivery across the blood brain barrier |
| CA3187272A1 (en) | 2020-10-08 | 2022-04-14 | Thorsten Ross | Trispecific binders |
| CA3216098A1 (en) | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Uwe Reusch | Duplexbodies |
| AU2022382368A1 (en) | 2021-11-03 | 2024-05-02 | Affimed Gmbh | Bispecific cd16a binders |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2016842A1 (en) * | 1989-05-16 | 1990-11-16 | Richard A. Lerner | Method for tapping the immunological repertoire |
| US5395750A (en) * | 1992-02-28 | 1995-03-07 | Hoffmann-La Roche Inc. | Methods for producing proteins which bind to predetermined antigens |
| GB9401182D0 (en) * | 1994-01-21 | 1994-03-16 | Inst Of Cancer The Research | Antibodies to EGF receptor and their antitumour effect |
-
1995
- 1995-03-16 US US08/553,497 patent/US5844093A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-16 DK DK95913134T patent/DK0699237T3/da active
- 1995-03-16 JP JP7523847A patent/JPH08510922A/ja active Pending
- 1995-03-16 PT PT95913134T patent/PT699237E/pt unknown
- 1995-03-16 CZ CZ19953014A patent/CZ292061B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-03-16 PL PL95311661A patent/PL181342B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-03-16 DE DE69529649T patent/DE69529649T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-16 MX MX9504802A patent/MX9504802A/es not_active IP Right Cessation
- 1995-03-16 WO PCT/EP1995/000978 patent/WO1995025167A1/en active IP Right Grant
- 1995-03-16 HU HU9503285A patent/HU221001B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-03-16 ES ES95913134T patent/ES2191702T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-16 KR KR1019950705118A patent/KR100376038B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-03-16 AT AT95913134T patent/ATE232902T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-03-16 UA UA95114873A patent/UA41929C2/uk unknown
- 1995-03-16 AU AU20716/95A patent/AU2071695A/en not_active Abandoned
- 1995-03-16 EP EP95913134A patent/EP0699237B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-03-16 RU RU95122645/13A patent/RU2170257C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-03-16 SK SK1430-95A patent/SK283889B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-03-16 CA CA002163012A patent/CA2163012C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-16 NO NO19954626A patent/NO322252B1/no not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-08-11 JP JP2005233093A patent/JP2006025794A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0699237B1 (en) | 2003-02-19 |
| MX9504802A (es) | 1997-05-31 |
| KR100376038B1 (ko) | 2003-06-09 |
| NO322252B1 (no) | 2006-09-04 |
| UA41929C2 (uk) | 2001-10-15 |
| NO954626D0 (no) | 1995-11-16 |
| NO954626L (no) | 1995-11-16 |
| US5844093A (en) | 1998-12-01 |
| AU2071695A (en) | 1995-10-03 |
| DE69529649D1 (de) | 2003-03-27 |
| PL181342B1 (pl) | 2001-07-31 |
| CZ301495A3 (en) | 1996-02-14 |
| SK283889B6 (sk) | 2004-04-06 |
| HUT73461A (en) | 1996-08-28 |
| EP0699237A1 (en) | 1996-03-06 |
| ATE232902T1 (de) | 2003-03-15 |
| DE69529649T2 (de) | 2003-12-18 |
| PT699237E (pt) | 2003-07-31 |
| WO1995025167A1 (en) | 1995-09-21 |
| PL311661A1 (en) | 1996-03-04 |
| JP2006025794A (ja) | 2006-02-02 |
| SK143095A3 (en) | 1996-11-06 |
| CA2163012A1 (en) | 1995-09-21 |
| CA2163012C (en) | 2009-12-08 |
| HU221001B1 (hu) | 2002-07-29 |
| HU9503285D0 (en) | 1996-02-28 |
| ES2191702T3 (es) | 2003-09-16 |
| JPH08510922A (ja) | 1996-11-19 |
| RU2170257C2 (ru) | 2001-07-10 |
| DK0699237T3 (da) | 2003-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ292061B6 (cs) | Jednořetězcové fragmenty protilátek a protilátky proti receptoru epidermálního růstového faktoru, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje | |
| KR20210020999A (ko) | CD47-SIRPα 상호 작용을 차단할 수 있는 항체 및 이의 응용 | |
| JP4231862B2 (ja) | リンパ球抗原ｃｄ２および腫瘍抗原を認識する二特異性トリガー分子 | |
| US7718174B2 (en) | Anti-HGF/SF humanized antibody | |
| US20100240100A1 (en) | Human antibodies that have mn binding and cell adhesion-neutralizing activity | |
| CN101389791A (zh) | 融合蛋白文库的产生和筛选方法及其应用 | |
| JP4475949B2 (ja) | 組換え抗マラリア原虫抗体 | |
| CN114805582B (zh) | 抗Trop2纳米抗体及其用途 | |
| JP2021526013A (ja) | 抗ヒトｌａｇ−３モノクローナル抗体とその応用 | |
| CA3125855C (en) | Anti-her2 affibody and switchable chimeric antigen receptor using same as switch molecule | |
| WO2023137958A1 (zh) | 抗cd70纳米抗体及其用途 | |
| JPH10155489A (ja) | 組換え抗体及びそれをコードする核酸 | |
| JP2002520021A (ja) | ヒトゼータ鎖の細胞外ドメインと特異的に相互作用する免疫学的試薬 | |
| US20230257469A1 (en) | TGFßR2 EXTRACELLULAR DOMAIN TRUNCATED MOLECULE, FUSION PROTEIN OF TGFßR2 EXTRACELLULAR DOMAIN TRUNCATED MOLECULE AND ANTI-EGFR ANTIBODY, AND ANTI-TUMOR USE OF FUSION PROTEIN | |
| AU724562B2 (en) | Anti-EGFR single-chain Fvs and anti-EGFR antibodies | |
| Nadal | Isolation and validation of novel monoclonal antibodies targeting the tumor microenvironment for the selective delivery of cytokines payloads | |
| CN116903757A (zh) | Cd70纳米抗体和双靶向嵌合抗原受体 | |
| CN117264055A (zh) | 一种特异性结合人cd318的vhh抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用 | |
| MXPA00010434A (en) | Methods of selecting internalizing antibodies | |
| AU2003237187A1 (en) | Identification of novel broadly cross-reactive neutralizing human monoclonal antibodies using sequential antigen panning of phage display libraries | |
| MXPA01000325A (en) | Immunological reagent specifically interacting with the extracellular domain of the human zeta chain |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110316 |