CN113747917A - 针对MHC结合的人Dickkopf-1肽的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本文提供了治疗癌症的方法和试剂。提供了治疗癌症的方法，其包括给予有此需要的患者有效量的本文所提供的加载DKK1肽的MHC抗体。所述方法还可包括给予所述患者有效量的化疗或免疫治疗。

Description

针对MHC结合的人Dickkopf-1肽的单克隆抗体及其应用

相关申请的引用

本申请要求2019年2月1日提交的美国临时申请号62/800,007的优先权，通过引用将该申请的全部内容纳入本文。

对序列列表的引用

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背景技术

1.技术领域

本公开总体涉及医学、免疫学和癌症生物学领域。更具体而言，它涉及与加载DKK1肽的MHC结合的抗体及其使用方法。

2.相关领域的描述

研究已表明，Dickkopf-1(DKK1)在所有多发性骨髓瘤患者的肿瘤细胞中高度表达，但在除胎盘和***以外的正常器官或组织中不存在。此外，DKK1也表达于其他癌症，如淋巴瘤、***癌、肺癌和乳腺癌。诺华公司有一种人源化抗DKK1单克隆抗体(BHQ880)，其结合并中和DKK1。该产品目前正在癌症的临床研究中。然而，由于DKK1是一种分泌蛋白，BHQ880单抗不能与癌细胞结合，因此可能无法治疗性抗击癌细胞。因此，需要结合并通过介导ADCC和/或CDC来杀死癌细胞的单克隆抗体。

发明内容

因此，根据本公开，提供了单克隆抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段的特征为表1的克隆配对重链和轻链CDR序列。抗体或抗体片段具有分别根据SEQ ID NO:2、3和4的重链可变序列CDR1-3和分别根据SEQ ID NO:5、6和7的轻链可变序列CDR1-3。在各个方面中，任何给定的CDR序列可与表1的序列有一个或两个氨基酸取代的不同。在各个方面中，任何给定的CDR序列可以与表1中的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性。

在一些方面，抗体或抗体片段由根据表3的克隆配对序列的轻链和重链可变序列编码。在一些方面，抗体或抗体片段由与表3克隆配对可变序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。在一些方面，抗体或抗体片段由与表3克隆配对序列具有至少95％同一性的轻链和重链可变序列编码。

在一些方面，抗体或抗体片段由与表3克隆配对序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列编码。在一些方面，抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:10具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:11具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面，抗体或抗体片段由与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。在一些方面，抗体或抗体片段由SEQ ID NO:10的重链可变序列和SEQ ID NO:11的轻链可变序列编码。

在一些方面，抗体或抗体片段包含根据表2的克隆配对序列的轻链和重链可变序列。

在一些方面，抗体或抗体片段包含与表2克隆配对可变序列具有至少70％、80％或90％同一性的轻链和重链可变序列。在一些方面，抗体或抗体片段包含与表2克隆配对序列具有95％同一性的轻链和重链可变序列。

在一些方面，抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:8具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:9具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。在一些方面，抗体或抗体片段包含与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的轻链可变序列。在一些方面，抗体或抗体片段包含具有SEQ ID NO:8序列的重链可变序列和具有SEQ ID NO:9序列的轻链可变序列。

本文还提供了单克隆抗体或其抗原结合片段，其与本文基于其CDR序列定义的任何单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合到相同表位。

在一些方面，抗体或抗体片段是人源化抗体。在一些方面，抗体片段是单价scFv(单链片段可变)抗体、二价scFv、Fab片段、F(ab')₂片段、F(ab')₃片段、Fv片段或单链抗体。在一些方面，抗体是嵌合抗体或双特异性抗体。在一些方面，抗体是IgG抗体或重组IgG抗体或抗体片段。在一些方面，抗体偶联或融合于显像剂或细胞毒性剂。

在一个实施方式中，本文提供了杂交瘤或经工程化改造的细胞，其编码本文实施方式中任一所述的抗体或抗体片段。

在一个实施方式中，本文提供了治疗癌症患者的方法，该方法包括给予有效量的加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段。在一些方面中，加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段是本文实施方式中任一所述的抗体或抗体片段。在一些方面，已确定该癌症患者相对于对照患者表达升高水平的DKK1。

在一些方面，这些方法被进一步定义为提高化疗敏感性的方法。在一些方面，这些方法被进一步定义为提高免疫治疗敏感性的方法。在一些方面，癌症是骨髓瘤、乳腺癌、***癌或淋巴瘤。在一些方面，这些方法被进一步定义为抑制癌生长的方法。

在一些方面，所述方法进一步包括给予至少第二抗癌疗法。在一些方面，第二抗癌疗法是化疗、免疫疗法、放疗、基因疗法、外科手术、激素疗法、抗血管生成疗法或细胞因子疗法。在一些方面，化疗包括来那度胺。在一些方面，免疫疗法包括免疫检查点抑制剂。在一些方面，免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂、PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、OX40激动剂、LAG3拮抗剂、4-1BB激动剂或TIM3拮抗剂。在一些方面，免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂。在一些方面，免疫检查点抑制剂是PD1或PDL1拮抗剂。在一些方面，免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂与PD1拮抗剂的组合。在一些方面，免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂与PDL1拮抗剂的组合。

在一个实施方式中，本文提供本文实施方式中任一所述的抗体或抗体片段，其用作在对象中治疗癌症的药物。在一个实施方式中，本文提供本文实施方式中任一所述的抗体或抗体片段在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

在一个实施方式中，本文提供了检测癌细胞上细胞表面DKK1肽/HLA-A2复合物的存在的方法，该方法包括将所述癌细胞与加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段接触。在一些方面中，加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段是本文实施方式中任一所述的抗体或抗体片段。

在一个实施方式中，本文提供了测定癌细胞上细胞表面DKK1肽/HLA-A2复合物的水平的方法，该方法包括将所述癌细胞与加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段接触。在一些方面中，加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段是本文实施方式中任一所述的抗体或抗体片段。

如本文所用，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于表示该特定组分未被有意配制入组合物和/或仅作为污染物存在或微量存在。因此，由组合物的任何非计划污染产生的该指定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是使用标准分析方法无法检测到任何量的指定成分的组合物。

如本说明书中所用，“一”或“一个/种”可指一个/种或多个/种。如本文权利要求中所用，当与词语“包括”结合使用时，“一”或“一个/种”可指一个或多于一个。

在权利要求中使用的术语“或”表示“和/或”，除非特别指出仅指替代方式，或替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或”的定义。如本文所用，“另一”可指至少第二个/种或更多个/种。

在本申请全文中，术语“约”用于表示数值包括装置、用于确定该数值的方法、研究对象之间差异的固有误差变化，或在规定数值10％范围内的值。

通过以下详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将显而易见。然而，应当理解，在指示本发明的优选实施方式的同时，详细描述和具体实施例仅是示例说明，因为本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将由该详细描述变得显而易见。

附图简述

以下所述附图属于说明书的一部分，包括于此用以进一步说明本文某些方面的内容。参照这些附图中的一幅或者多幅并结合具体实施方式的详细描述可更好地理解本发明。

图1A-C：A2-DKK1单克隆抗体体内作用机制的验证。结果显示了接受不同治疗的小鼠的生物发光图像(图1A)、肿瘤负荷(图1B)和存活率(图1C)。SCID小鼠(5只/组)皮下异种移植U266骨髓瘤细胞，然后用小鼠IgG(mIgG)、A2-DKK1 mAb(C2)、A2-DKK1 mAb(C2)联合用特定mAb耗竭NK细胞(NK耗竭)、以及A2-DKK1mAb(C2)联合用眼镜蛇毒因子(CVF)耗竭补体(CP耗竭)进行治疗。每周两次测定肿瘤负荷。待皮下肿瘤达到225mm²或待小鼠濒死时对其实施安乐死。显示了所进行两个独立实验中的一个的代表性结果。误差线＝SEM。*P<0.05，与A2-DKK1 mAb治疗相比。

图2A-C：A2-DKK1 MAb对SCID-hu模型中原发MM的治疗益处。在SCID-hu小鼠(6只小鼠每组)中，将来自HLA-A2患者(n＝3)的原发性骨髓瘤细胞直接注射到植入的人骨中，并以循环人M-蛋白或其轻链的水平监测肿瘤生长。小鼠接受100μgA2-DKK1单抗(C2)或100μg小鼠IgG1或等体积PBS的腹腔注射(每三天注射一次，共六次注射)。当循环人M-蛋白达到50μg/mL或皮下肿瘤达到400mm²时，对小鼠实施安乐死。所示为接受不同治疗的小鼠的肿瘤负荷(图2A)、存活率(图2B)和X射线图像(图2C)。误差线＝SEM。*P<0.05，**P<0.01。

图3A-B.A2-DKK1单抗在SCID小鼠中的药代动力学。A2-NSG小鼠静脉注射U266骨髓瘤细胞，然后腹腔注射50μg(C2-50)、100μg(C2-100)、200μg(C2-200)A2-DKK1单抗(C2)或100μg小鼠IgG1(每三天一次，共六次注射)。根据循环人M-蛋白或其轻链水平监测肿瘤负荷。所示为接受不同治疗的小鼠的肿瘤负荷(图3A)和接受100μg A2-DKK1单抗治疗的小鼠的A2-DKK1单抗药代动力学(图3B)。误差线＝SEM。*P<0.05，**P<0.01。

图4A-E.A2-DKK1单抗在A2-SCID小鼠中的毒性和安全性试验。用U266骨髓瘤细胞皮下攻击A2-SCID小鼠，然后腹腔注射400μg A2-DKK1单抗(C2)或400μg小鼠IgG1(mIgG)进行治疗(每三天一次，共注射六次)。显示了接受不同治疗的小鼠不同组织和肿瘤的HE染色(图4A)、A2-DKK1单克隆抗体染色(图4B)、Tunel分析(图4C和4E)和平均荧光强度(MFI)(图4D)。显示了所进行两个独立实验中的一个的代表性结果。*P<0.05；**P<0.01(与对照相比)。

图5A-C.A2-DKK1单抗与T2细胞的抗体结合能力。(图5A)肽结合试验显示A2-DKK1单抗(C2)的特异性，T2细胞与不同剂量的DKK1肽P20和P66v孵育过夜，并使用A2-DKK1单抗(C2)分析表面HLA-A*0201-DKK1的表达(MFI)。(图5B)T2细胞与不同剂量的DKK1肽P20孵育过夜，用100μg/mL A2-DKK1单抗(C2)处理48小时，并分析凋亡。(图5C)T2细胞与不同剂量的DKK1肽P20孵育过夜，然后分析抗体结合能力。

图6A-C.A2-NSG小鼠模型中A2-DKK1单抗的免疫治疗。A2-NSG小鼠静脉注射U266骨髓瘤细胞，然后腹腔注射100μg A2-DKK1单抗(C2)或100μg小鼠IgG1(mIgG)或PBS进行治疗(每三天一次，共注射六次)。根据循环人M-蛋白或其轻链水平监测肿瘤负荷。当循环人M-蛋白达到50μg/mL或小鼠濒死时，对小鼠实施安乐死。结果显示了接受不同治疗的小鼠的生物发光图像(图6A)、肿瘤负荷(图6B)和存活率(图6C)。误差线＝SEM。*P<0.05，**P<0.01。

图7A-D.A2-DKK1单抗的特异性和抗体结合能力。(图7A)通过包被不同抗原的ELISA检测A2-DKK1单抗的特异性。(图7B)肽结合试验显示A2-DKK1单抗的特异性，将MM细胞系U266和ARP-1与DKK1肽P20一起孵育过夜，并通过A2-DKK1单抗分析表面HLA-A*0201-DKK1表达(MFI)。(图7C)不同剂量的A2-DKK1单抗对U266的表面结合亲和力。(图7D)A2-DKK1单抗与正常PBMC、MGUS和MM患者样品以及U266的抗体结合能力。误差线＝SEM。*P<0.05，**P<0.01。

图8A-B.A2-DKK1单抗与乳腺癌和***癌细胞系的表面结合。结果显示A2-DKK1单抗与乳腺癌细胞系(图8A)和***癌细胞系(图8B)的表面结合。

图9A-F.A2-DKK1单抗体外诱导不同癌细胞凋亡。(图9A和9B)不同剂量A2-DKK1单抗诱导的U266细胞凋亡。在图9B中，每对的左栏为“C2”，右栏为“C3”。(图9C)T2细胞与不同剂量的DKK1肽P20孵育过夜，然后用100μg/mL A2-DKK1单抗处理48小时，并分析凋亡。(图9D)具有或不具有肽加载的T2细胞。(图9E)A2-DKK1单抗诱导的骨髓瘤和淋巴瘤细胞系的凋亡。(图9F)A2-DKK1单抗诱导的乳腺癌和***癌细胞系的凋亡。误差线＝SEM。*P<0.05，**P<0.01。

图10A-H.A2-DKK1单抗体外诱导不同癌细胞的ADCC。(图10A)Cr-51释放试验检测A2-DKK1单抗诱导的骨髓瘤和淋巴瘤细胞系的ADCC。在每组列中，这些列从左到右表示U266、ARP-1、Mino和SP53。(图10B)Cr-51释放试验检测A2-DKK1单抗诱导的乳腺癌和***癌细胞系的ADCC。在每组列中，这些列从左到右表示MCF-7、MDA-MD-231、LNCap-LN3和PC-3(A2+)。(图10C和10D)IncuCyte ZOOM实况成像***显示了A2-DKK1单抗诱导的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的ADCC。(图10E-H)Cr-51释放试验检测骨髓瘤(图10E)、淋巴瘤(图10E)、乳腺癌(图10F)和***癌细胞系(图10G)以及加载有不同肽的A2-DKK1单抗诱导的ADCC，以小鼠同种型IgG1和抗HLA-A2单抗(BB7.2)为对照。误差线＝SEM。*P<0.05，**P<0.01。

图11A-G.A2-DKK1单抗体外诱导不同癌细胞的CDC。(图11A)Cr-51释放试验检测A2-DKK1单抗诱导的骨髓瘤和淋巴瘤细胞系的CDC。在每组列中，这些列从左到右表示U266、ARP-1、Mino和SP53。(图11B)Cr-51释放试验检测A2-DKK1单抗诱导的乳腺癌和***癌细胞系的CDC。在每组列中，这些列从左到右表示MCF-7、MDA-MD-231、LNCap-LN3和PC-3(A2+)。(图11C和D)IncuCyte ZOOM实况成像***显示了A2-DKK1单抗诱导的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的CDC。(图11E-G)IncuCyte ZOOM实时成像***检测A2-DKK1单抗诱导的***细胞系PC-2-A2-(图11E&G)和PC-2-A2+(图11F&G)的CDC，小鼠同种型IgG1作为对照。误差线＝SEM。*P<0.05，**P<0.01。

具体实施方式

DKK1肽(如P20和P66v，其能与HLA-A2分子结合)特异性细胞毒性T细胞可特异性杀死骨髓瘤和其他表达DKK1和HLA-A2的癌细胞，但不能杀死HLA-A2⁺正常细胞，这表明DKK1⁺肿瘤细胞在其表面天然表达这些肽(在HLA-A2的情况下)。因此，DKK1是一种广泛表达的肿瘤相关抗原，可作为免疫治疗的靶点。

合成了DKK1肽P20/HLA-A2单体，并用于免疫小鼠。获得了分泌识别可溶性和细胞表面表达DKKl P20/HLA-A2复合物的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤。这些单抗与表达DKK1的HLA-A2⁺癌细胞特异性结合，但不与表达DKK1的HLA-A2^-癌细胞或DKK1^-HLA-A2⁺正常血细胞特异性结合。因此，由于DKK1由癌细胞而非正常细胞表达，这些单抗有可能在HLA-A2⁺癌症患者中特异性靶向癌细胞而非正常细胞。由于大多数(如果不是全部)治疗性单抗通过介导抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)杀死其靶细胞，这些单抗可用于治疗骨髓瘤、淋巴瘤和实体瘤(如乳腺、肺和***)患者，通过介导ADCC和CDC或向癌细胞输送毒素来杀死癌细胞。此外，小鼠抗人DKK1 P20/HLA-A2单抗还可作为检测和测定癌细胞的细胞表面DKK1肽/HLA-A2复合物水平的研究工具。

I.Dickkopf-1(DKK1)

Dickkopf-1(此处也称为“DKK1”，有时被其他人拼写为“Dikkopf-1”)是一种分泌蛋白，其通过与共受体Lrp-6相互作用，特异性抑制Wnt/β-连环蛋白信号(Mao等人，2001年；Zorn，2001年)。骨髓瘤患者的DKK1与溶骨性病变的存在相关(Tian等人，2003年)。骨髓活检标本的免疫组化分析也显示只有骨髓瘤细胞含有可检测的DKK1。重组人DKK1或含有高水平DKK1的骨髓血清在体外抑制成骨细胞前体细胞的分化。此外，在骨髓瘤小鼠模型中，抗DKK1抗体治疗与肿瘤生长减少相关。因此，DKK1在骨髓瘤骨病中起着重要作用，阻断DKK1活性可减少溶骨性骨吸收，增加骨形成，并有助于控制骨髓瘤的发展(Yaccoby等，2006)。DKK1基因仅在胎盘和间充质干细胞(MSCs)中有限制性地表达，而在其他正常组织中没有该表达(Glinka等，1998年；Gregory等，2003年)。此外，对肺癌和食管癌的基因表达谱分析显示，DKK1在绝大多数肺癌和食管鳞状细胞癌(ESCC)中高度反式激活(Yamabuki等，2007年)。

II.定义

“抗体”是能够通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点来特异性结合诸如碳水化合物、多核苷酸、脂类、多肽等靶标的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且还包括其片段(例如Fab，Fab'，F(ab')₂，Fv)，单链(ScFv))，其突变体，自然产生的变体，包含具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白，人源化抗体，嵌合抗体，以及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。

“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点，因此保留结合抗原的能力。本定义包含的抗体片段的实例包括：(i)具有VL、CL、VH和CH1结构域的Fab片段；(ii)Fab'片段，其是在CH1结构域的C端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1结构域以及CH1结构域C端的一个或多个半胱氨酸残基的Fd'片段；(v)具有单个抗体的VL和VH结构域的Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab')₂片段，一种二价片段，包括通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab'片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗体”(“diabodies”)，其包括连接到同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)；(xi)“线性抗体”包括一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。

“嵌合抗体”指如下抗体，其中重链和轻链各自的氨基酸序列的一部分与源自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的剩余区段与其他物种或类别的相应序列同源。典型地，在这些嵌合抗体中，轻链和重链的可变区模仿源自一种哺乳动物的抗体可变区，而恒定部分与源自另一种哺乳动物的抗体中的序列同源。例如，可变区域可以方便地使用来自非人类宿主或生物体的现成杂交瘤或B细胞，结合来自例如人类细胞制剂的恒定区，从目前已知的来源衍生。虽然可变区具有易于制备且特异性不受其来源的影响的优点，但当注射抗体时，恒定区为人类，与非人类来源的恒定区相比，不易引发人类受试者的免疫反应。然而，定义不限于此特定示例。

抗体的“恒定区”指单独或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3，或在IgM和IgE的情况下为CH4)的恒定区域赋予重要的生物学特性，例如分泌、经胎盘的移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照习惯，恒定区结构域的编号随着远离抗原结合位点或抗体的N末端而增加。

抗体的“可变区”指单独或组合的抗体轻链可变区或抗体重链可变区。轻链(VL)和重链(VH)部分的可变区决定了抗原识别和特异性。VL和VH分别由通过三个互补决定区(CDR，也称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。CDR补充抗原的形状并决定抗体对抗原的亲和力和特异性。VL和VH中有六个CDR。每条链中的CDR通过FR紧密连接在一起，并且与另一条链中的CDR一起，有助于形成抗体的抗原结合位点。至少有两种技术用于确定CDR：(1)基于跨物种序列可变性的方法(Kabat编号方案；见Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(《免疫学感兴趣蛋白质序列》，第5版，1991年，马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院))；以及(2)基于抗原抗体复合物的结晶学研究的方法(校正由Kabat提议的CDR-L1和CDR-H1中***和缺失位点(indels)的Chothia编号方案；见Al-Lazkani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948)。也可以使用其他编号方法或方案。如本文所使用的，CDR可指由两种方法之一或由两种方法的组合或由其它期望的方法定义的CDR。此外，还可以使用高度保守的核心、边界和超变区的新定义。

本文使用的术语“重链”是指通过其氨基末端区域与免疫球蛋白轻链结合的较大免疫球蛋白亚单位。重链包括可变区(VH)和恒定区(CH)。恒定区还包括CH1、铰链、CH2和CH3结构域。在IgE、IgM和IgY的情况下，重链包含CH4结构域但不具有铰链结构域。本领域技术人员将理解，重链被分类为伽马、缪、阿尔法、德尔塔或艾普希龙(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(例如γ1-γ4)。该链的特性决定抗体“类别”，分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已被充分表征，且已知提供功能性特化。

本文使用的术语“轻链”是指与重链的氨基末端区域相联合的较小免疫球蛋白亚单位。与重链一样，轻链包括可变区(VL)和恒定区(CL)。轻链分类为卡巴或兰巴达(κ,λ)。一对轻链可以与各种重链中的任何一对结合形成免疫球蛋白分子。轻链的含义中还包括具有与κ恒定区(C-κ)连接的λ可变区(V-λ)的轻链或具有与λ恒定区(C-λ)连接的κ可变区(V-κ)的轻链。

本文所用“核酸”、“核酸序列”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”或其他语法等同形式表示共价接合在一起的至少两个核苷酸，其为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸是任何长度的聚合物，包括，例如，20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10000等。本文所述的多核苷酸通常包含磷酸二酯键，但在某些情况下，包括可能具有至少一个不同键的核酸类似物，例如磷酰胺，硫代磷酸、二硫代磷酸或O-甲基磷酰亚胺键，以及肽核酸骨架和键。可以制备天然多核苷酸和类似物的混合物；或者，可以制备不同的多核苷酸类似物的混合物，以及天然产生的多核苷酸和类似物的混合物。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、cRNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物的组装之前或之后赋予。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸聚合后可被进一步修饰，如通过与标记性组分偶联。该术语也包括双链和单链分子。除非另有说明或要求，本发明包含多核苷酸的任何实施方式都是双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。多核苷酸由4种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)，并且当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)替代胸腺嘧啶(T)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。除非另有说明，否则具体多核苷酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，可通过产生一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来获得简并密码子取代。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中指氨基酸残基的聚合物。这些术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物、包含修饰残基的那些和非天然产生的氨基酸聚合物。在本情况中，术语“多肽”包含抗体或其片段。

如本文所使用的在重组核酸技术、微生物学、免疫学、抗体工程学以及分子和细胞生物学领域中使用的其他术语将被适用领域的普通技术人员普遍理解。

III.抗体和抗体修饰

在一个实施方式中，抗体是嵌合抗体，例如，包含来自移植到异源非人类、人类或人源化序列(例如，框架和/或恒定结构域序列)的非人类供体的抗原结合序列的抗体。已开发出用人类来源的类似结构域替换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域且保留外源抗体的可变区域完好无损的方法。或者，在转基因人类免疫球蛋白基因的小鼠中产生“全人类”单克隆抗体。还开发了通过重组构建同时具有啮齿动物(例如，小鼠)和人类氨基酸序列的抗体可变结构域将单克隆抗体的可变结构域转化为更多人类形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，只有高变CDR源自小鼠单克隆抗体，而框架和恒定区源自人类氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557，通过引用纳入本文)。据认为，将啮齿动物特有的抗体中的氨基酸序列替换为人类抗体相应位置的氨基酸序列将降低治疗使用期间出现不良免疫反应的可能性。杂交瘤或产生抗体的其他细胞也可能会发生基因突变或其他变化，这可能会或可能不会改变杂交瘤产生的抗体的结合特异性。

用于在各种动物物种中产生多克隆抗体的方法以及用于产生各种类型的单克隆抗体(包括人源化、嵌合和完全人化)的方法在本领域中是众所周知的且高度可预测的。例如，以下美国专利和专利申请提供了实施此类方法的说明：美国专利申请号2004/0126828和2002/0172677；以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024，均通过引用纳入本文。

在某些实施方式中为抗体偶联物。例如，偶联物可以是与其他蛋白质、碳水化合物、脂质或混合部分分子偶联的本发明的特定结合剂(例如抗体)。此类抗体偶联物包括但不限于包括将其连接到一种或多种聚合物的修饰。在某些实施方式中，抗体连接到一个或多个水溶性聚合物。在某些此类实施方式中，与水溶性聚合物的连接降低了抗体在水环境(例如生理环境)中沉淀的可能性。在某些实施方式中，治疗性抗体连接到水溶性聚合物。在某些实施方式中，本领域技术人员可基于如下考虑因素选择合适的水溶性聚合物，包括但不限于聚合物/抗体偶联物是否将用于患者治疗，以及如果是，抗体的药理学特征(例如，半衰期、剂量、活性、抗原性和/或其他因素)。

在进一步的实施方案中，偶联物可例如为细胞毒性剂。该类型的细胞毒性剂可改善抗体介导的细胞毒性，并包括诸如直接或间接刺激细胞死亡的细胞因子、放射性同位素、化疗药物(包括前药)、细菌毒素(例如，假单胞菌外毒素、白喉毒素等)、植物毒素(例如，蓖麻毒素、胶凝蛋白等)、化学偶联物(例如，美登木素毒素、卡雷霉素(calechaemicin)等)、放射性偶联物、酶偶联物(例如，RNA酶偶联物、颗粒酶抗体导向的酶/前药疗法)等部分。蛋白质细胞毒素可在编码毒素的多核苷酸与编码结合剂的多核苷酸连接后表达为与特异性结合剂的融合蛋白。在另一种替代方案中，特异性结合剂可共价修饰以包括所需细胞毒素。

在其他实施方式中，抗体或其片段可结合至报告基团，包括但不限于放射性标签、荧光标签、酶(例如，催化比色或荧光反应)、底物、固体基质或运载体(例如，生物素或抗生物素)因此，本发明提供了一种包含抗体分子的分子，其中该分子优选地进一步包含选自下组的报告基团：放射性标签、荧光标签、酶、底物、固体基质和运载体。此类标签为本领域技术人员所熟知，例如生物素标签是特别考虑的。此类标签的使用对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且在例如美国专利第3,817,837号、美国专利第3,850,752号、美国专利第3,996,345号和美国专利第4,277,437号中进行了描述，各自通过引用纳入本文中。其他有用的标签包括但不限于放射性标签、荧光标签和化学发光标签。关于使用此类标签的美国专利包括例如美国专利第3,817,837号、美国专利第3,850,752号、美国专利第3,939,350号和美国专利第3,996,345号。本发明的任何肽可包含一个、两个或更多个任何此类标签。

A.单克隆抗体及其制备

“分离的抗体”是从其自然环境的成分中分离和/或回收的成分。其自然环境的污染成分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在某些实施方式中，将抗体纯化至(1)通过Lowry方法确定为抗体大于95重量％，如99重量％、97重量％、98重量％或99重量％，(2)通过使用转杯式(spinning cup)测序仪足以获得至少15个残基的内部或N-末端氨基酸序列，或者(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或银染色确定具有均质性。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不会存在。然而，分离的抗体通常经过至少一个纯化步骤来制备。

基本的四链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本异四聚体单元以及称为J链的额外多肽组成，从而具有10个抗原结合位点，而分泌型IgA抗体则可聚合形成多价组装体，其中包含2-5个基本4链单元与J链。在IgG的情况下，4链单元通常约为150,000道尔顿。每条L链通过一共价二硫键与H链相连，而两条H链根据H链的同种型通过一个或多个二硫键彼此相连。各H链和L链也具有规则间隔的链内二硫桥。各H链具有N末端的可变结构域(V_H)，其后为各自为α和γ链的三个恒定结构域(C_H)，和μ和同种型的四个CH结构域。每条L链在N端具有可变结构域(V_L)，在其另一端具有恒定结构域(C_L)。V_L与V_H对齐，C_L与重链的第一恒定结构域(C_H1)对齐。某些特定氨基酸残基被认为会形成轻链可变结构域与重链可变区之间的界面。V_H和V_L的配对共同形成单个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和特性，可见例如《基础与临床免疫学》(Basicand Clinical Immunology)，第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr和TristramG.Parslow等(合编)，Appleton&Lange，康涅狄格诺沃克，1994年，第71页和第6章。

根据其恒定结构域(C_L)的氨基酸序列，可将任意脊椎动物的L链分成两种明显不同的类型之一，称为卡巴(κ)和兰巴达(λ)。根据重链(C_H)恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有指定为α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能中相对较小的差异，将γ和α类进一步分为亚类，人类表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

术语“可变”指V结构域的某些区段在序列上在抗体间广泛变化的事实。V结构域介导抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变区的110个氨基酸范围内并不是均匀分布的。相反，V区由以下组成：称之为框架区(FR)的约15-30个氨基酸的较少可变的区段，以及分隔这些FR的称之为“超变区”的极具可变性的、长度各为9-12个氨基酸的较短区域。天然重链和轻链的可变区各包含四个FR，主要采用β-折叠构型，通过三个超变区相连(形成环连接)，并在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。各链中的超变区被FR聚集在一起，紧密相邻，与另一条链的超变区一起形成抗体的抗原结合位点(参见例如，Kabat等,《免疫学感兴趣蛋白质序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，美国国立卫生研究院公共卫生局，马里兰州贝塞斯达(1991))。恒定区并不直接使抗体与抗原的结合，但是展现出各种效应物功能，诸如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、抗体依赖性中性粒细胞吞噬(ADNP)和抗体依赖性补体沉积(ADCD)。

本文使用的术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，根据Kabat编号***进行编号时，VL中大致约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中大致约31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《免疫学感兴趣蛋白质序列》，第五版，公共卫生服务，马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院(1991年))；和/或“高变环”中的那些残基(例如，当按照Chothia编号***进行编号时，VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及VH中的残基26-32(H1)、52-56(H2)和95-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；和/或来自“高变环”/CDR的残基(例如，残基27-38(L1)、56-65(L2)和105-120(L3))根据IMGT编号***进行编号时，VL中的27-38(H1)、56-65(H2)和VH中的105-120(H3)；Lefranc，M.P.等人Nucl.Acids Res.27:209-212(1999)，Ruiz，M.等人Nucl.Acids Res.28:219-221(2000))。可选地，抗体在以下一个或多个点具有对称***：根据AHo编号时，VL中的28、36(L1)、63、74-75(L2)和123(L3)，以及VH中的28、36(H1)、63、74-75(H2)和123(H3)；Honneger，A.和Plunkthun，A.J.Mol.Biol.309:657-670(2001))。

本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，即除了存在少数可能天然发生的突变外，群体包含的单独抗体均是相同的。单克隆抗体具有针对单个抗原性位点的高度特异性。此外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相比，每一单克隆抗体针对抗原上单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们可以在不受其他抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，本公开中有用的单克隆抗体可通过Kohler等人首先描述的杂交瘤方法制备，Nature，256:495(1975)，或可使用细菌、真核动物或植物细胞中的重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第4,816,567号)对抗原特异性B细胞进行单细胞分选后，产生对感染或免疫反应的抗原特异性浆母细胞，或在批量分选的抗原特异性集合中从单个细胞捕获连接的重链和轻链。也可通过例如Clackson等，Nature 352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。

B.人源化抗体及其制备

如果抗体或其片段用于治疗目的，它们可能需要被“人源化”以减弱任何免疫反应。此类人源化抗体可在体外或体内环境下被研究。人源化抗体可例如通过用与抗体免疫原性部分对应但非免疫原性的部分来替换免疫原性部分来产生(即嵌合抗体)。PCT申请PCT/US86/02269；EP申请184,187；EP申请171,496；EP申请173,494；PCT申请WO 86/01533；EP申请125,023；Sun等，J.Steroid Biochem.,26(1):83-92,1987；Wood等,J.Clin.Lab.Immunol.,17(4):167-171,1985；和Shaw等,J.Natl.Cancer Inst.,80(19):1553-1559,1988；所有参考文献均通过引用纳入本文。“人源化”抗体也可通过CDR或CEA取代产生。Jones等，Nature,321:522-525,1986和Beidler等,J.Immunol.,141(11):4053-4060,1988,各自通过引用纳入本文。为此，可以通过在GenBank数据库中搜索来识别与小鼠单克隆抗体的VH和VL框架同源的人类VH和VL序列。然后选择具有最高同源性的人类序列作为人源化的受体。然后将小鼠单克隆抗体的CDR序列转移到选定人体框架的相应位置。

C.通用方法

应当理解，本发明的单克隆抗体具有多种应用。这些应用包括生产诊断试剂盒，用于检测加载DKK1肽的MHC，以及用于治疗与DKK1水平升高相关的疾病。在这些情况下，可以将此类抗体与诊断或治疗剂连接，在竞争性分析中将它们用作捕获剂或竞争剂，或单独使用它们而不附连额外的试剂。抗体可以发生突变或修饰，如下所述。制备和表征抗体的方法在本领域中是众所周知的(例如，参见《抗体：实验室手册》(Antibodies:A LaboratoryManual)，冷泉港实验室，1988年；美国专利第4,196,265号)。

产生单克隆抗体(MAb)的方法通常按照与制备多克隆抗体相同的路线开始。这两种方法的第一步都是对适当的宿主进行免疫。如本领域所知，用于免疫的特定组合物的免疫原性可能不同。因此，通常有必要增强宿主免疫***，这可以通过将肽或多肽免疫原连接到运载体来实现。示例性和优选的运载体为钥孔戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白，例如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作运载体。用于将多肽偶联到运载体蛋白的方法在本领域中是众所周知的，包括戊二醛、间-马来酰亚胺基-N-羟基丁二酰亚胺酯、碳二亚胺和双偶氮联苯胺。在本领域中还众所周知特定免疫原组合物的免疫原性可通过使用免疫反应的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。动物情况中的示例性和优选佐剂包括完全弗氏佐剂(含有杀死的结核分枝杆菌的免疫反应的非特异性刺激物)，不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂，在人类情况中包括明矾(alum)、CpG、MFP59和免疫刺激分子的组合(“佐剂***”，如AS01或AS03)。可以进行其他实验形式的接种以诱导抗原特异性B细胞，包括纳米颗粒疫苗，或在物理传递***(如脂质纳米颗粒或金基因枪珠)中以DNA或RNA基因形式传递的基因编码抗原，用针、基因枪、经皮电穿孔装置递送。抗原基因也可由复制感受态或缺陷型病毒载体编码来携带，如腺病毒、腺相关病毒、痘病毒、疱疹病毒或α病毒复制子，或者病毒样颗粒。

产生产抗体细胞和骨髓瘤细胞杂交体的方法通常包括以2:1的比例将体细胞与骨髓瘤细胞混合，尽管在存在促进细胞膜融合的一种或多种试剂(化学或电)的情况下，比例可能分别从约20:1到约1:1不等。在某些情况下，用EB病毒(EBV)转化人类B细胞作为初始步骤，可增加B细胞的大小，增强与相对较大的骨髓瘤细胞的融合。在转化培养基中使用CpG和Chk2抑制剂药物可提高EBV的转化效率。或者，人类B细胞可以通过与表达CD40配体(CD154)的转染细胞系在含有额外可溶性因子(如IL-21和人类B细胞激活因子(BAFF，TNF超家族II型成员))的培养基中共培养来激活。Kohler和Milstein(1975；1976)描述了使用仙台病毒的融合方法，Gefter等人(1977)描述了使用聚乙二醇(PEG)的融合方法，如37％(v/v)PEG。使用电致融合方法也是合适的(Goding，第71-74页，1986年)，并且有提高效率的方法(Yu等人，2008年)。融合程序通常以低频率(约为1×10^-6至1×10^-8)产生可存活的杂交体，但通过优化程序可以实现接近1/200的融合效率(Yu等，2008)。然而，相对较低的融合效率并不构成问题，因为通过在选择性培养基中培养，可存活的融合杂交体与亲代未融合(infused)细胞(尤其是通常会无限***的未融合骨髓瘤细胞)区分开。选择性培养基通常是含有阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂的培养基。示例性和优选试剂为氨基喋呤、氨甲喋呤和重氮丝氨酸。氨基喋呤、氨甲喋呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。当使用氨基喋呤或氨甲喋呤时，培养基补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。如果使用重氮丝氨酸，则培养基中补充次黄嘌呤。如果B细胞来源是EBV转化的人类B细胞系，则添加乌本苷(ouabain)以消除未与骨髓瘤融合的EBV转化系。

优选的选择培养基是HAT或含乌本苷的HAT。只有能够运行核苷酸挽救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏挽救途径的关键酶，如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，由此无法存活。B细胞可以通过这一途径运作，但它们在培养物中的寿命有限，通常在两周内死亡。因此，唯一能在选择性培养基中存活的细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的杂交细胞。当用于融合的B细胞来源为EBV转化的B细胞系时，如本文所述，乌本苷也可用于杂交体的药物选择，因为EBV转化的B细胞易受药物杀伤，而所用的骨髓瘤伴侣被选择为乌本苷耐受。

培养提供杂交瘤群体，从中选择特定的杂交瘤。通常，杂交瘤的选择是通过在微量滴定板中进行单克隆稀释来培养细胞，然后测试单个克隆上清液(大约两到三周后)的所需反应性来进行的。该分析应灵敏、简单和快速，例如放射免疫分析、酶免疫分析、细胞毒性分析、斑块分析、斑点免疫结合分析等。然后将所选杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并克隆到单个抗体产生细胞系中，然后这些克隆可以无限繁殖以提供单抗。细胞系可通过两种基本方式用于单抗的生产。可将杂交瘤样品注射到动物(如小鼠)体内(通常注入腹腔)。任选地，在注射之前，用烃，特别是油诸如姥鲛烷(Pristane)对动物进行致敏。当以这种方式使用人类杂交瘤时，最好注射免疫功能低下的小鼠，如SCID小鼠，以防止肿瘤排斥反应。经注射的动物产生肿瘤，分泌融合细胞杂交体产生的特异性单克隆抗体。然后，可提取动物的体液，如血清或腹水，以提供高浓度的单克隆抗体。单个细胞系也可以在体外培养，其中单抗自然分泌到培养基中，从中可以很容易地获得高浓度的单克隆抗体。或者，人杂交瘤细胞系可用于在体外产生细胞上清液中的免疫球蛋白。该细胞系可适于在无血清培养基中生长，以优化回收高纯度人类单克隆免疫球蛋白的能力。

如果需要，可采用过滤、离心和各种色谱法(如FPLC或亲和色谱法)进一步纯化通过任一方法产生的单抗。本公开的单克隆抗体片段可通过包括用酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通过化学还原切割二硫键的方法从纯化的单克隆抗体获得。或者，可以使用自动肽合成仪合成本公开所涵盖的单克隆抗体片段。

还设想可将分子克隆方法用于产生单克隆抗体。用感兴趣抗原标记的单一B细胞可以使用顺磁珠选择或流式细胞仪分选进行物理分选，然后从单一细胞中分离RNA，并通过RT-PCR扩增抗体基因。或者，可将抗原特异性批量分选细胞群分离成微囊泡，并使用重链和轻链扩增子的物理连接或囊泡重链和轻链基因的公共条形码从单一细胞中回收匹配的重链和轻链可变基因。也可以通过使用带有RT-PCR引物和用于标记转录物的条形码(每个细胞一个条形码)的细胞穿透型纳米颗粒来处理细胞，从抗原特异性B细胞群中获得形成单一细胞的匹配重链和轻链基因。抗体可变基因也可通过杂交瘤系的RNA提取和通过RT-PCR获得的抗体基因分离并克隆到免疫球蛋白表达载体中。或者，从分离自细胞系的RNA制备组合免疫球蛋白噬菌粒文库，并通过使用病毒抗原淘选表达适当抗体的噬菌粒。与传统杂交瘤技术相比，这种方法的优势在于一轮中可产生和筛选约10⁴倍之多的抗体，且H和L链组合产生新的特异性，这进一步增加了找到合适抗体的机会。

教导本公开中有用抗体的生产的其他美国专利(各自通过引用纳入本文)包括美国专利5,565,332，其描述了使用组合方法生产嵌合抗体；美国专利4,816,567，其描述了重组免疫球蛋白制剂；以及美国专利4,867,973，其描述了抗体-治疗剂偶联物。

根据本公开的抗体首先可通过其结合特异性来定义。本领域技术人员通过采用他们熟知的技术评估给定抗体的结合特异性/亲和力，可以确定此类抗体是否属于本公开权利要求书的范围。例如，给定抗体结合的表位可由位于抗原分子内的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个)氨基酸的单个连续序列组成(例如，结构域中的线性表位)。或者，表位可由位于抗原分子内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如，构象表位)。

可用本领域普通技术人员已知的各种技术来确定抗体是否与多肽或蛋白质内的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包括例如常规的交叉阻断实验，例如在《抗体》(Antibodies)，Harlow和Lane(冷泉港出版社，冷泉港，纽约)中描述的那些。可在各种结合分析中测定交叉阻断，如ELISA、生物层干涉测量或表面等离子体共振。其他方法包括丙氨酸扫描突变分析，肽印迹分析(Reineke(2004)Methods Mol.Biol.248：443-63)，肽裂解分析，使用单粒子重建的高分辨率电子显微镜技术，cryoEM，或断层扫描，晶体学研究和NMR分析。另外，可以采用诸如表位切除，表位提取和抗原化学修饰的方法(Tomer(2000)Prot.Sci.9：487-496)。可以用于鉴定抗体相互作用的多肽内氨基酸的另一种方法是通过质谱检测氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及氘标记目标蛋白质，然后将抗体与氘标记的蛋白质结合。接下来，蛋白质/抗体复合物被转移到水中，被抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子比不属于界面的氨基酸内的可交换质子以较慢的速率经历由氘到氢的反向交换。结果，形成蛋白质/抗体界面一部分的氨基酸可能保留氘，因此与未包含在界面中的氨基酸相比，其质量相对较高。抗体解离后，对目标蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，从而揭示与抗体相互作用的特定氨基酸相对应的氘标记残基。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267:252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。

术语“表位”是指抗原上B细胞和/或T细胞应答的部位。B细胞表位既可以由连续氨基酸形成，也可以由蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含呈现独特空间构象的至少3个、更通常至少5个或约8-10个氨基酸。

修饰辅助概况分析(MAP)，也称为基于抗原结构的抗体概况分析(ASAP)，是一种根据每种抗体与化学或酶修饰抗原表面的结合图谱的相似性将针对同一抗原的大量单克隆抗体(mAb)分类的方法(参见US 2004/0101920，通过引用整体纳入本文)。每一类别可反映一个独特的表位，该表位与另一类别所代表的表位明显不同或部分重叠。该技术允许快速筛选遗传学上相同的抗体，以便将特征描述集中在遗传学上不同的抗体上。当用于杂交瘤筛选时，MAP可能有助于鉴定产生具有所需特性的mAb的罕见杂交瘤克隆。MAP可用于将本公开的抗体分类为结合不同表位的抗体组。

本公开包括可结合相同表位或表位一部分的抗体。同样地，本公开还包括与本文所述的任何特定示例性抗体竞争结合靶标或其片段的抗体。通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参照抗体结合相同的表位或竞争与之结合。例如，为了确定测试抗体是否与参照抗体结合到同一表位，允许参照抗体在饱和条件下结合到目标。接下来，评估测试抗体结合目标分子的能力。如果测试抗体在参照抗体饱和结合目标分子后能够结合目标分子，则可以得出测试抗体与参照抗体结合不同表位的结论。另一方面，如果在与参照抗体饱和结合目标分子后，测试抗体不能与目标分子结合，则测试抗体可能与参照抗体结合相同的表位。

在另一方面，提供了具有来自表1所示重链和轻链的克隆配对的CDR的单克隆抗体。可使用本文所述方法制备此类抗体。

在另一方面，抗体可由其可变序列定义，其包括额外的“框架”区。表2和表3中提供了编码或表示全可变区的区域。此外，抗体序列可能与这些序列不同，可任选地使用下面更详细讨论的方法。例如，核酸序列可能与前述序列具有如下不同：(a)可变区可与轻链和重链的恒定结构域隔离，(b)核酸可与前述序列不同，但不影响由此编码的残基，(c)核酸可与前述序列存在一定同源性百分比的差异，例如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，(d)核酸可与前述核酸在高严格性条件下的杂交能力存在不同，所述条件为如低盐和/或高温条件，例如在约50℃至约70℃的温度下由约0.02M至约0.15M NaCl提供的条件，(e)氨基酸可与前述氨基酸存在一定同源性百分比的差异，例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或者(f)氨基酸可通过允许保守取代而与前述氨基酸不同(下文讨论)。上述各项均适用于表3所列的核酸序列和表2所列的氨基酸序列。

在比较多核苷酸和多肽序列时，当如下述比对最大对应性时，如果在两条序列中核苷酸或氨基酸残基的序列分别是相同的，这两条核酸序列或多肽被称为是“相同的”。两条序列之间的比较通常通过对比比较窗口上的序列进行，以识别和比较具有序列相似性的局部区域。本文中，“比较窗口”指至少约20个，通常约30至约75个、或约40至约50个连续位置的节段，在其中，一序列与相同数量连续位置的参比序列经最优排比后与该参比序列进行比较。

为了序列比较的最优排比可用生物信息学软件Lasergene套件(DNASTAR公司，威斯康星州麦迪逊)中的Megalign程序用默认参数进行。该程序包括了如下所参考的多个比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins--Matricesfor detecting distant relationships(“蛋白质的进化变化模型——用于检测远距离关系的矩阵”)，见于Dayhoff,M.O.(编)Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白质序列和结构图集),国家生物医学研究基金会(National Biomedical ResearchFoundation,，华盛顿哥伦比亚特区)，第5卷，增刊3，第355-358页；Hein J.(1990)UnifiedApproach to Alignment and Phylogeny(《对齐和***发育的统一方法》)第626-645页Methods in Enzymology第183卷，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥(Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.)；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.(1989)CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.(1971)Comb.Theor 11:105；Santou,N.Nes,M.(1987)Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.(1973)Numerical Taxonomy--the Principles and Practice of Numerical Taxonomy(数值分类学——数值分类学的原理与实践),弗里曼出版社(Freeman Press，加州旧金山)；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80:726-730。

或者，可如下进行待比较序列的最优比对：局部身份算法(Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2:482)，身份比对算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443)，相似性搜索法(Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444)，计算机执行这些算法(遗传学计算组(Genetics Computer Group，GCG)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，575Science Dr.威斯康星州麦迪逊)，或通过观察。

适合测定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法示例是BLAST和BLAST2.0算法，分别描述于Altschul等(1977)Nucl.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。BLAST和BLAST 2.0可与例如本文所述的参数一起使用，以确定本公开所述多核苷酸和多肽的序列同一性百分比。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。抗体序列的重排性质和每个基因的可变长度要求对单个抗体序列进行多轮BLAST搜索。此外，手动组装不同的基因很困难且容易出错。序列分析工具IgBLAST(万维网，ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)识别与生殖系V、D和J基因的匹配、重排连接处的详细信息、Ig V结构域框架区和互补性决定区的描述。IgBLAST可以分析核苷酸或蛋白质序列，可以批量处理序列，并允许同时搜索种系基因数据库和其他序列数据库以最大限度地减少丢失可能最匹配的种系V基因的机会。

一些方法中，“序列同一性百分比”通过两条最优排比的序列在至少20个位置的比较窗口中进行比较来确定，其中，就两序列的最优排比而言，多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分相比参照序列(不含添加或缺失)可包含20％或更少(通常5％至15％或10％至12％)的添加或缺失(空位)。该百分比可如下计算：测定两种序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数产生匹配位置数，将该匹配位置数除以参照序列中位置的总数(即窗口大小)，将所得结果乘以100产生序列同一性百分比。

定义抗体的另一种方法是作为任何下述抗体及其抗原结合片段的“衍生物”。术语“衍生物”是指免疫特异性结合于抗原但包含相对于“亲本”(或野生型)分子包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代、添加、缺失或修饰的抗体或其抗原结合片段。此类氨基酸取代或添加可引入天然存在(即DNA编码的)或非天然存在的氨基酸残基。术语“衍生物”包括例如具有改变的CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区的变体，从而形成例如具有表现出增强或受损效应物或结合特性的变体Fc区的抗体等。术语“衍生物”还包括非氨基酸修饰，例如，氨基酸可被糖基化(例如，甘露糖、2-N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-糖神经氨酸(5-glycolneuraminic acid)等的含量改变)、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化，通过已知的保护/阻断基团、蛋白水解裂解、连接到细胞配体或其他蛋白质等衍生化。在一些实施方式中，改变的碳水化合物修饰调节了以下一种或多种：抗体的增溶、促进亚细胞运输和抗体的分泌，促进抗体组装、构象完整性和抗体介导的效应物功能。在特定实施方式中，相对于缺乏碳水化合物修饰的抗体，经改变的碳水化合物修饰增强抗体介导的效应物功能。导致抗体介导效应器功能改变的碳水化合物修饰在本领域中是众所周知的(例如，参见Shields,R.L.等.(2002)“Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,”(“人类IgG N-连接低聚糖上缺乏岩藻糖可改善与人类FCII的结合和抗体依赖性细胞毒性”)J.Biol.Chem.277(30):26733-26740；Davies J.等.(2001)“Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production CellLine:Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase InADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII,”(“重组抗CD20 CHO生产细胞系中GnTIII的表达：糖型改变的抗体的表达通过对FCγRIII的更高亲和力导致ADCC的增加)，Biotechnology&Bioengineering74(4):288-294)。本领域技术人员已知改变碳水化合物含量的方法，例如，参见Wallick,S.C.等.(1988)“Glycosylation Of A VH Residue Of AMonoclonal Antibody Against Alpha(1----6)Dextran Increases Its Affinity ForAntigen,”(“抗α(1---6)葡聚糖单克隆抗体VH残基的糖基化增加其对抗原的亲和力”)J.Exp.Med.168(3):1099-1109；Tao,M.H.等.(1989)“Studies Of AglycosylatedChimeric Mouse-Human IgG.Role Of Carbohydrate In The Structure And EffectorFunctions Mediated By The Human IgG Constant Region,”(“糖基化嵌合体小鼠人IgG的研究。碳水化合物在由人IgG恒定区介导的结构和效应物功能中的作用”)J.Immunol.143(8):2595-2601；Routledge,E.G.等.(1995)“The Effect Of Aglycosylation On TheImmunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody,”(“糖基化对人源化治疗性CD3单克隆抗体免疫原性的影响”)Transplantation60(8):847-53；Elliott,S.等.(2003)“Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities ThroughGlycoengineering,”(“通过糖工程增强体内治疗性蛋白质的活性”)NatureBiotechnol.21:414-21；Shields,R.L.等.(2002)“Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,”(“人IgG N-连接低聚糖缺乏岩藻糖可改善与人FCγRIII的结合和抗体依赖性细胞毒性”)J.Biol.Chem.277(30):26733-26740)。

衍生抗体或抗体片段可通过工程化序列或以糖基化状态产生，以在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、抗体依赖性中性粒细胞吞噬(ADNP)或抗体依赖性补体沉积(ADCD)中提供优选的活性水平，这些功能可通过基于珠或基于细胞的分析或动物模型体内研究测量。

衍生抗体或抗体片段可使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰进行修饰，包括但不限于衣霉素的代谢合成、特定化学切割、乙酰化、调配等。在一个实施方式中，抗体衍生物将具有与亲本抗体类似或相同的功能。在另一个实施方式中，抗体衍生物将表现出相对于亲本抗体改变的活性。例如，衍生抗体(或其片段)可以比亲本抗体更紧密地结合到其表位或更耐蛋白水解。

在各种实施方式中，人们可出于各种原因，例如改进的表达、改进的交叉反应性或减少的脱靶结合，选择对所识别抗体序列的工程化改造。可通过本领域技术人员已知的任何技术制备修饰抗体，包括通过标准分子生物学方法表达的技术，或多肽的化学合成。重组表达的方法在本文件的其他地方进行了阐述。以下是抗体工程化相关技术的一般性讨论。

可以培养杂交瘤，然后裂解细胞，提取总RNA。随机六聚体可与RT生成RNA的cDNA拷贝，然后使用多重的PCR引物混合物进行PCR，以扩增所有人类可变基因序列。可将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体中，然后通过自动DNA测序采用标准载体引物进行测序。可使用从杂交瘤上清液收集的抗体进行结合和中和测定，并使用蛋白G柱通过FPLC纯化。

通过将克隆载体中的重链和轻链Fv DNA亚克隆到IgG质粒载体中，并转染到293(例如，Freestyle)细胞或CHO细胞中，可产生重组全长IgG抗体，可从293或CHO细胞上清液中收集和纯化抗体。其他合适的宿主细胞***包括细菌，如大肠杆菌、昆虫细胞(S2、Sf9、Sf29、High Five)、植物细胞(如烟草，含或不含人样聚糖工程化改造)、藻类，或在各种非人类转基因环境中，如小鼠、大鼠、羊或牛。

出于后续抗体纯化和宿主免疫的目的，还考虑了编码抗体的核酸的表达。抗体编码序列可以是RNA，如天然RNA或修饰RNA。经修饰RNA包括赋予mRNA提高的稳定性和降低的免疫原性的某些化学修饰，从而促进治疗重要蛋白质的表达。例如，N1-甲基-假尿苷(N1mψ)在翻译能力方面优于其他几种核苷修饰及其组合。除了关闭免疫/eIF2α磷酸化依赖性翻译抑制外，掺入的N1mψ核苷酸通过增加mR上的核糖体暂停和密度来显著改变翻译过程的动力学。通过相同mRNA上的核糖体循环或从头核糖体招募，经修饰mRNA的核糖体负载量增加，使其更易于启动。此类修饰可用于增强RNA接种后的体内抗体表达。无论是天然的还是经修饰的RNA，都可作为裸RNA递送或在递送载体(如脂质纳米颗粒)中递送。

或者，编码抗体的DNA可用于相同目的。DNA包含在表达盒中，该表达盒包含在为其设计的宿主细胞中激活的启动子。该表达盒有利地包含在可复制载体中，例如传统质粒或微载体。载体包括病毒载体，如痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒和慢病毒。还涵盖了编码抗体基因的复制子，如基于VEE病毒或辛德毕斯病毒的α病毒复制子。可通过肌肉内、皮下或皮内途径通过针头递送此类载体，或者在需要体内表达时通过经皮电穿孔递送。

在与最终cGMP制造工艺相同的宿主细胞和细胞培养工艺中产生抗体的快速可用性有可能缩短工艺开发程序的持续时间。Lonza公司开发了一种通用方法，使用在CDACF培养基中生长的混合转染子，在CHO细胞中快速生产少量(高达50g)的抗体。虽然比真正的瞬态***稍慢，但其优点包括产品浓度更高，使用与生产细胞线相同的宿主和过程。在一次性生物反应器中表达模型抗体的GS-CHO池的生长和生产能力示例：在一次性袋式生物反应器中培养在补料分批模式下运行(5L工作体积)，在转染后9周内获得2g/L的收获抗体浓度。

抗体分子将包含片段(如F(ab')、F(ab')₂)，这些片段例如通过单克隆抗体的蛋白水解切割产生，或可通过例如重组手段产生单链免疫球蛋白。F(ab')抗体衍生物是单价的，而F(ab')₂抗体衍生物为二价。在一个实施方式中，此类片段可相互组合，或与其他抗体片段或受体配体组合形成“嵌合”结合分子。值得注意的是，此类嵌合分子可包含能够结合到同一分子不同表位的替代物。

在相关实施方式中，抗体是所公开抗体的衍生物，例如，包含与所公开抗体中相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合或CDR接枝抗体)。或者，人们可能希望进行修饰，例如在抗体分子中引入保守变化。在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质交互生物功能方面的重要性在本领域中被普遍理解(Kyte和Doolittle，1982)。据认为，氨基酸的相对亲水性有助于形成所得蛋白质的二级结构，而二级结构又限定了该蛋白质与其他分子的相互作用，例如与酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。

本领域还应理解，类似氨基酸的取代可以基于亲水性有效地进行。美国专利4,554,101(通过引用纳入本文)中陈述了由其相邻氨基酸的亲水性控制的蛋白质最大局部平均亲水性与该蛋白质的生物活性相关。如美国专利4,554,101中详细说明，氨基酸残基的亲水性值如下：碱性氨基酸：精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)和组氨酸(-0.5)；酸性氨基酸：天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、天冬酰胺(+0.2)和谷氨酰胺(+0.2)；亲水性非离子氨基酸：丝氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)和苏氨酸(-0.4)，含硫氨基酸：半胱氨酸(-1.0)和甲硫氨酸(-1.3)；疏水性非芳香族氨基酸：缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、脯氨酸(-0.5±1)、丙氨酸(-0.5)和甘氨酸(0)；疏水性芳香族氨基酸：色氨酸(-3.4)、苯丙氨酸(-2.5)和酪氨酸(-2.3)。

据了解，一种氨基酸可被具有类似亲水性的另一种氨基酸取代，并产生生物或免疫修饰的蛋白质。在这种变化中，亲水性值在±2范围内的氨基酸的取代是优选的，那些在±1范围内的氨基酸的取代是特别优选的，那些在±0.5范围内的氨基酸的取代是更为优选的。

如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代为本领域技术人员所熟知的，且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

本发明还涵盖了同型修饰。通过将Fc区域修饰为不同的同种型，可以实现不同的功能。例如，改变为IgG₁可以增加抗体依赖性细胞毒性，改变为A类可以改善组织分布，改变为M类可以改善价性。

附加或替代地，将氨基酸修饰与改变C1q结合和/或IL-23p19结合分子的Fc区补体依赖性细胞毒性(CDC)功能的一个或多个进一步氨基酸修饰相结合可能是有用的。特别感兴趣的结合多肽可能是与C1q结合并显示补体依赖性细胞毒性的多肽。可对具有预先存在的C1q结合活性(可选地进一步具有介导CDC的能力)的多肽进行修饰，以使其这两种活性中的一者或两者增强。例如，在WO/0042072(通过引用纳入本文)中描述了改变C1q和/或改变其补体依赖性细胞毒性功能的氨基酸修饰。

可以设计具有改变的效应物功能的抗体Fc区域，例如，通过修改C1q结合和/或FcγR结合，从而改变CDC活性和/或ADCC活性。“效应物功能”负责激活或减少生物活性(例如，在受试者中)效应物功能的示例包括但不限于：C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)等。此类效应物功能可要求Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)结合，并可使用各种分析(例如，Fc结合分析、ADCC分析、CDC分析等)进行评估。

例如，可以生成具有改善的C1q结合和改善的FcγRIII结合(例如，同时具有改善的ADCC活性和改善的CDC活性)的抗体的变体Fc区。或者，如果希望降低或消除效应物功能，则可改造变体Fc区使其具有降低的CDC活性和/或降低的ADCC活性。在其他实施方式中，可仅提高这些活性中的一种，并且可选地，还可减少其他活性(例如，生成一个Fc区变体，其ADCC活性改善，但CDC活性降低，反之亦然)。

本公开的一个具体实施方式是一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，含有基本上同质的聚糖，不含唾液酸、半乳糖或岩藻糖。该单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，两者都可以分别连接到重链或轻链恒定区。上述基本上同质的聚糖可共价连接到重链恒定区。

本公开的其他实施方式包括具有新颖Fc糖基化模式的mAb。分离的单克隆抗体或其抗原结合片段以GNGN或G1/G2糖型表示的基本上同质的组合物存在。Fc糖基化在治疗性单克隆抗体的抗病毒和抗癌性质中起着重要作用。本公开与最近的一项研究一致，该研究表明，无岩藻糖抗HIV单克隆抗体在体外提高了抗慢病毒细胞介导的病毒抑制作用。本公开的这一实施方式具有缺乏核心岩藻糖的同质聚糖显示出提高大于2倍的对特定病毒的保护作用。消除核心岩藻糖显著提高了自然杀伤(NK)细胞介导的单克隆抗体的ADCC活性，但似乎对多形核细胞(PMN)的ADCC活性有相反的作用。

包含表示为GNGN或G1/G2糖型的基本上同质的组合物的分离单克隆抗体或其抗原结合片段与没有基本上同质的GNGN糖型且具有包含G0、G1F、G2F、GNF、GNGNF或GNGNFX的糖型的相同抗体相比，对FcγRI和FcγRIII的结合亲和力增强。在本公开的一个实施方式中，抗体与FcγRI以1×10^-8M或更小的Kd解离，与FcγRIII以1×10^-7M或更小的Kd解离。

Fc区的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指糖部分附着在天冬酰胺残基的侧链上。O-连接糖基化指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种附接于羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，虽然也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。酶促连接糖部分与天冬酰胺侧链肽序列的识别序列是天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X为脯氨酸以外的任意氨基酸。因此，多肽中这两种肽序列中任一的存在产生了潜在的糖基化位点。

例如，可以通过使多肽中存在的一个或多个糖基化位点缺失和/或添加该多肽中不存在的一个或多个糖基化位点来改变糖基化模式。通过改变氨基酸序列，使其包含一个或多个上述三肽序列(用于N-连接糖基化位点)，可以方便地实现将糖基化位点添加到抗体的Fc区。示例性糖基化变体具有重链残基Asn 297的氨基酸取代。也可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加到原始多肽序列(用于O-连接糖基化位点)或用丝氨酸或苏氨酸残基取代来进行改变。此外，Asn 297变为Ala可去除其中一个糖基化位点。

在某些实施方式中，抗体在表达β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnT III)的细胞中表达，从而由GnT III将GlcNAc加到IL-23p19抗体。以这种方式产生抗体的方法见WO/9954342、WO/03011878、专利公开20030003097A1和Umana等人，Nature Biotechnology，17:176-180，1999年2月。采用基因编辑技术，如成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)，可改变细胞系以增强或减少或消除某些翻译后修饰(如糖基化)。例如，可用CRISPR技术消除用于表达重组单克隆抗体的293或CHO细胞中编码糖基化酶的基因。

可以对从人类B细胞获得的抗体可变基因序列进行工程化改造，以增强其可制造性和安全性。通过搜索与如下所包含位点相关的序列基序，可以识别潜在的蛋白质序列不利因素(liabilities)：

1)不成对的Cys残基，

2)N-连接糖基化，

3)Asn脱酰胺化，

4)Asp异构化，

5)SYE截短化，

6)Met氧化，

7)Trp氧化，

8)N-端谷氨酸，

9)整合素结合性，

10)CD11c/CD18结合性，或

11)片段化。

可通过改变编码重组抗体的cDNA的合成基因来消除这些基序。

治疗性抗体开发领域的蛋白质工程化研究清楚地揭示了某些序列或残基与溶解度差异有关(Fernandez-Escamilla等,Nature Biotech.,22(10),1302-1306,2004；Chennamsetty等，PNAS,106(29),11937-11942,2009；Voynov等，Biocon.Chem.,21(2),385-392,2010)。文献中溶解度改变突变的证据表明，一些亲水性残基(如天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸)比其他亲水性残基(如天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸和精氨酸)对蛋白质溶解度的贡献明显更大。

抗体可以被工程化改造以增强生物物理特性。可以利用平均表观解链温度，利用高温使抗体去折叠来确定相对稳定性。差示扫描量热法(DSC)测定分子的热容C_p(每度加热所需的热量)，作为温度的函数。可以使用DSC研究抗体的热稳定性。mAb的DSC数据特别令人关注，因为它有时会解析mAb结构内单个结构域的展开，在热谱图中产生多达三个峰(来自Fab、C_H2和C_H3结构域的去折叠)。通常，Fab结构域的去折叠产生最强的峰。DSC图谱和Fc部分的相对稳定性显示了人IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄亚类的特征性差异(Garber和Demarest，Biochem.Biophys.Res.Common.355751-7572007)。还可以使用圆二色谱法(CD)使用CD光谱仪测定平均表观解链温度。以0.5nm的增量，在200至260nm范围内测定抗体的远紫外CD光谱。最终光谱可确定为20次累积的平均值。残基椭圆度值可在减去背景后计算。可检测抗体(0.1mg/mL)在235nm，25-95℃和1℃/分钟的加热速率下的热去折叠。可使用动态光散射(DLS)评估聚集倾向。DLS用于表征包括蛋白质的各种颗粒的大小。如果***的尺寸不分散，则可以确定颗粒的平均有效直径。该测量取决于颗粒核心的大小、表面结构的大小和颗粒浓度。由于DLS本质上测定了由粒子引起的散射光强度的波动，可以确定粒子的扩散系数。商用DLA仪器中的DLS软件显示不同直径的粒子群。使用DLS可以方便地进行稳定性研究。样品的DLS测定了通过确定颗粒的流体动力学半径是否增加来显示颗粒是否随时间聚集或随温度变化聚集。如果颗粒聚集在一起，则可以看到半径更大的颗粒群。通过原位控制温度，可以分析随温度变化的稳定性。毛细管电泳(CE)技术包括确定抗体稳定性特征的经验证的方法。可以使用iCE方法来解决由于脱酰胺化、C-末端赖氨酸、唾液酸化、氧化、糖基化和任何其他可导致蛋白质pI变化。可通过毛细管柱(cIEF)中的高通量、游离溶液等电聚焦(IEF)使用简单的蛋白质Maurice仪器来评估每种所表达的抗体蛋白。全柱紫外吸收检测可每30秒进行一次，以实时监测等电点(PI)处的分子聚焦情况。该方法将传统凝胶IEF的高分辨率与基于柱的分离中的定量和自动化优势相结合，同时消除了对转移步骤的需要。该技术可对所表达抗体的特性、纯度和异质性进行可重复的定量分析。结果鉴定了抗体上的电荷异质性和分子大小，具有吸光度和天然荧光检测模式，检测灵敏度降至0.7μg/mL。

可以确定抗体序列的固有溶解度分数。固有溶解度分数可使用CamSol Intrinsic计算(Sormanni等人，J Mol Biol 427478-4902015)。每个抗体片段(如单链抗体)HCDR3中残基95-102(Kabat编号)的氨基酸序列可通过在线程序进行评估，以计算溶解度分数。还可以使用实验室技术测定溶解度。存在各种技术，包括向溶液中添加冻干蛋白质，直到溶液饱和并达到溶解度极限，或在具有适当分子量截止值的微浓缩器中通过超滤浓缩。最直接的方法是诱导无定形沉淀，该方法使用涉及使用硫酸铵沉淀蛋白质的方法来测定蛋白质溶解度(Trevino等，J Mol Biol，366:449-460，2007)。硫酸铵沉淀提供有关相对溶解度值的快速准确信息。硫酸铵沉淀产生具有明确水相和固相的沉淀溶液，需要相对少量的蛋白质。利用硫酸铵诱导无定形沉淀进行的溶解度测量也可以在不同pH值下轻松完成。蛋白质的溶解度高度依赖于pH，pH被认为是影响溶解度的最重要的外部因素。

一般认为，在个体发生过程中，应通过负选择消除自身反应性克隆；然而，很明显，许多具有自身反应特性的人类天然抗体存在于成人成熟库中，并且自身反应性可能增强许多抗病原体抗体的抗病毒功能。已经注意到，在早期B细胞发育期间，抗体中的HCDR3环通常富含正电荷，并表现出自身反应模式(Wardemann等人，Science 301，1374-1377，2003)。通过在显微镜下(使用贴壁的HeLa或HEp-2上皮细胞)和流式细胞计数细胞表面染色(使用悬浮的Jurkat T细胞和293S人类胚胎肾细胞)评估与人类来源细胞的结合水平，可以测试给定抗体的自身反应性。自身反应性也可以通过评估组织阵列中与组织的结合来测量。

在最近的许多研究中，对来自献血者的人类B细胞进行了大规模的B细胞库深度测序。关于人类抗体库重要部分的序列信息有助于对健康人常见的抗体序列特征进行统计评估。通过了解人类重组抗体可变基因参考数据库中的抗体序列特征，可以估计抗体序列的“人类相似性”(HL)的位置特异性程度。HL已被证明有助于开发临床使用的抗体，如治疗性抗体或作为疫苗的抗体。目的是增加抗体的人类相似性，以减少潜在的不良反应和抗抗体免疫反应，这些反应将导致抗体药物的疗效显著降低或可能导致严重的健康影响。我们可以评估三名健康献血者总共约4亿个序列的组合抗体库的抗体特征，并创建聚焦于抗体高变区的新“相对人类相似性”(rHL)评分。rHL评分可以实现轻松区分人类序列(阳性评分)和非人类序列(阴性评分)。抗体可以被工程化改造以消除人类库中不常见的残基。

在某些实施方式中，可纯化本公开的抗体。如本文所使用的术语“纯化的”意指能与其他组分分离的组合物，其中蛋白质相对于其天然可获得状态被纯化到任何程度。因此，纯化的蛋白质也指不受其天然存在环境影响的蛋白质。在使用术语“基本纯化的”的情况下，该名称将指其中蛋白质或肽构成组合物主要成分的组合物，例如构成组合物中约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的蛋白质。

蛋白质纯化技术是本领域普通技术人员所熟知的。这些技术在某种程度上涉及将细胞环境粗分为多肽和非多肽组分。将多肽与其他蛋白质分离后，可使用色谱和电泳技术进一步纯化所需多肽，以实现部分或完全纯化(或纯化至同质)。特别适合于制备纯肽的分析方法有离子交换色谱法、排斥色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。蛋白质纯化的其他方法包括，用硫酸铵、聚乙二醇、抗体等沉淀，或通过热变性，然后离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和层析；以及这些技术和其他技术的组合。

在纯化本公开的抗体时，可能需要在原核或真核表达***中表达多肽，并使用变性条件提取蛋白质。可使用亲和柱从其他细胞组分纯化多肽，亲和柱结合多肽的标记部分。如本领域中一般所知，相信进行各种纯化步骤的顺序可以改变，或者某些步骤可以省略，并且仍然产生用于制备基本上纯化的蛋白质或肽的合适方法。

通常，利用结合抗体Fc部分的试剂(即蛋白A)分级完整抗体。或者，抗原可用于同时纯化和选择合适的抗体。此类方法通常利用结合到支持物(例如柱、过滤器或珠)的选择剂。抗体与支持物结合，去除污染物(例如，冲洗掉)，并通过施加条件(盐、热等)释放抗体。

结合本公开的启示，本领域技术人员将知道用于量化蛋白质或肽的纯化程度的各种方法。例如，这些包括测定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的数量。评估级分纯度的另一种方法是计算级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进行比较，从而计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于在纯化后选择的特定分析技术，以及表达的蛋白质或肽是否表现出可检测的活性。

已知在不同的SDS/PAGE条件下，多肽的迁移可能会发生变化，有时会显著变化。因此，应了解，在不同电泳条件下，纯化或部分纯化表达产物的表观分子量可能不同。

IV.疾病治疗

本实施方式的某些方面可用于预防或治疗与DKK1水平升高相关的疾病或紊乱，例如癌症。“治疗”和“进行治疗”是指对受试者施用或应用治疗剂，或对受试者实施程序或方式，以获得疾病或健康相关疾病的治疗效果。例如，治疗可包括给予与加载DKK1肽的MHC结合的药学上有效量的抗体。

本文使用的术语“受试者/对象”是指被实施主题方法的任何个体或患者。一般而言，受试者是人类，尽管如本领域技术人员所理解的，受试者可以是动物。因此，其他动物，包括哺乳动物，如啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子、农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪等)和灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、红毛猩猩和大猩猩)，也包括在受试者的定义中。

本申请中通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效性”是指促进或增强受试者在该疾病的医疗治疗方面的健康的任何物质。这包括但不限于降低疾病体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可能涉及例如减小肿瘤的大小、降低肿瘤的侵袭性、降低癌症的生长速率或预防转移。癌症的治疗也可涉及延长癌症对象的生存期。

如果进行含有抗体的治疗组合物的临床应用，制备适合预期应用的药物或治疗组合物通常是有益的。在某些实施方式中，药物组合物可包含，例如，至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方式中，活性化合物可包含约2％至约75％的单位重量，或约25％至约60％的单位重量，以及其中可衍生的任何范围。

本实施方式的治疗组合物有利地以可注射组合物的形式作为液体溶液或悬浮液给药；也可制备适于在注入前溶解于或悬浮于液体中的固体形式。这些制剂也可被乳化。

短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地给予动物(如人)时不会产生不良、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开的启示，本领域技术人员将知道包含抗体或附加活性成分的药物组合物的制备。此外，对于动物(如人)给药，应了解制剂应符合FDA生物标准办公室所要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所用，“药学上可接受的运载体”包括任何及所有水性溶剂(例如，水、酒精/水溶液、盐水溶液、胃肠外运载体，例如氯化钠、林格葡萄糖等)、非水溶剂(如丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯，如油酸乙酯)、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(如抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)，等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、液体和营养补充剂，如本领域普通技术人员已知的相似材料及其组合。根据熟知的参数常规调节药物组合物的各种组分的pH和确切浓度。

术语“单位剂量”或“剂量”指适用于受试者使用的物理上离散的单元，每个单元包含预定量的治疗组合物，该治疗组合物经计算可产生上述与其给药相关的期望反应，即，适当的路线和治疗方案。根据治疗次数和单位剂量，待给予的量取决于期望的效果。给予患者或受试者的本实施方式组合物的实际剂量可由物理和生理因素确定，例如受试者的体重、年龄、健康和性别、正在治疗的疾病类型、疾病侵入程度、先前或同时进行的治疗干预、患者的自发病、给药途径以及特定治疗物质的效力、稳定性和毒性。例如，剂量也可能包括每次给药约1g/kg/体重至约1000mg/kg/体重(该范围包括干预剂量)或更多，以及其中可衍生的任何范围。在本文所列数字衍生范围的非限制性示例中，可给予约5g/kg/体重至约100mg/kg/体重，约5g/kg/体重至约500mg/kg/体重等。在任何事件中，负责给予的医师将确定组合物中活性成分的浓度，以及对于个体对象合适的剂量。

组合物可以配制用于胃肠外给药，例如配制用于通过静脉内，肌肉内，皮下或甚至腹膜内途径注射。通常，这种组合物可以制成液体溶液形式或悬浮液形式；也可以制备适合用于在注射前加入液体制备溶液或悬浮液的固体形式；并且，制剂也可以经乳化。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油，花生油或丙二醇水溶液制剂；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须为易于注射的程度的流体。其也应该在制造和储存条件下稳定，并且必须在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。

蛋白质组合物可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如，与蛋白质的游离氨基团形成的那些，或由无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的盐。由游离羧基基团形成的盐还可以衍生自无机碱，例如，钠，钾，铵，钙或铁氢氧化物；或有机碱诸如异丙胺，三甲胺，组氨酸或普鲁卡因等。

药学上可接受的组合物可包含溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物以及植物油。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、分散情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂来实现。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多情况中，优选包括等渗剂，例如糖类或氯化钠。可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶用于组合物中来延长可注射组合物的吸收。

在某些实施方式中，本实施方式的组合物和方法涉及针对加载DKK1肽的MHC的抗体或抗体片段，结合第二或附加治疗，例如化疗或免疫治疗。这种疗法可用于治疗与DKK1升高相关的任何疾病。例如，这种疾病可为癌症。

本文使用的术语“癌症”可用于描述实体瘤、转移癌或非转移癌。在某些实施方式中，癌症可起源于膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、十二指肠、小肠、大肠、结肠、直肠、***、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、胰腺、***、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫。

肿瘤可能是以下组织学类型，但不限于此：肿瘤，恶性；癌；未分化癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；***状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛样基质癌；移行细胞癌；***状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；肝细胞癌和胆管癌联合；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌；鳃腺泡腺癌；***状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜氧腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；***状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；顶泌腺癌；皮脂腺癌；***；粘液表皮样癌；囊腺癌；***状囊腺癌；***状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜瘤，恶性；恶性颗粒细胞瘤；雄性母细胞瘤，恶性；支持细胞癌；***瘤，恶性；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；舌癌；恶性黑色素瘤；无色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝色痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；移行细胞肿瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；***肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；牙源性恶性肿瘤；成釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体，恶性；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质性星形细胞瘤；纤维状星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；骨髓瘤；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓系白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；毛细胞白血病。然而，还认识到，本公开还可用于治疗非癌症疾病(例如，真菌感染、细菌感染、病毒感染、神经退行性疾病和/或遗传疾病)。

所述方法和组合物，包括组合疗法，能增强治疗或保护效果，和/或能增加另一种抗癌或抗过度增殖疗法的治疗效果。可以以有效实现期望效果(例如杀死癌细胞和/或抑制细胞过度增殖)的组合量提供治疗和预防方法和组合物。该过程可能涉及用抗体或抗体片段与细胞接触以及第二治疗。组织、肿瘤或细胞可与包含一种或多种试剂(即抗体或抗体片段或抗癌剂)的一种或多种组合物或药理学制剂接触，或使组织、肿瘤和/或细胞与具有两种或更多种不同组合物或制剂接触，其中一种组合物提供1)抗体或抗体片段，2)抗癌剂，或3)抗体或抗体片段和抗癌剂两者。同时，预期这种组合疗法可与化疗、放疗、手术治疗或免疫治疗结合使用。

当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在本文中用于描述将治疗性构建体和化疗剂或放疗剂递送至靶细胞或与靶细胞直接并置的过程。例如，为了实现细胞杀死，将有效杀死细胞或防止其***的组合量的两种药剂递送到细胞。

抗体可在抗癌治疗之前、期间、之后或以与抗癌治疗相关的各种组合施用。给药的时间间隔可以从同时到几分钟到几天到几周不等。在将抗体或抗体片段与抗癌剂分开提供给患者的实施方式中，通常将确保在每次递送之间的有效时间段不会过期，从而两种化合物仍能够对患者施加有利的组合效应。在此类情况中，预期可在彼此之间约12至24或72小时内，更具体地，在彼此之间约6至12小时内，向患者提供抗体治疗和抗癌治疗。在某些情况下，如果各次给药间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)，则可能需要显著延长治疗时间。

在某些实施方式中，一个疗程将持续1-90天或更长时间(该范围包括间隔天数)。预计一种药剂可在第1天至第90天(该范围包括间隔天数)或其任何组合的任何一天提供，而另一种药剂可在第1天至第90天(该范围包括间隔天数)或其任何组合的任何一天提供。在一天内(24小时内)，可给予患者一次或多次药剂。此外，在一个疗程后，预期有一段时间不进行抗癌治疗。该时间段可持续1-7天和/或1-5周和/或1-12个月或更长时间(该范围包括间隔天数)，具体取决于患者的病情，如其预后、体力、健康状况等。预计治疗周期将在必要时重复。

可以采用各种组合。在如下示例中，抗体疗法为“A”，抗癌疗法为“B”：

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

将该实施方式的任何化合物或疗法给予患者将遵循给予该化合物的一般方案，(必要时)考虑药剂的毒性。因此，在一些实施方式中，存在对联合治疗导致的毒性的监测步骤。

A.化疗

根据本实施方式，可使用多种化学治疗剂。术语“化疗”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”是指在癌症治疗中给予的化合物或组合物。这些药剂或药物根据其在细胞内的活性方式进行分类，例如，它们是否影响细胞周期以及在何阶段影响细胞周期。或者，可基于其直接交联DNA、***DNA或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝***畸变的能力来表征药剂。

化学治疗剂的实例包括烷基化剂，例如硫替帕和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、异丙磺烷和吡磺烷；氮丙啶，如苯并多巴、卡波松、甲脲多巴和脲多巴；亚乙基胺和甲胺，包括六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯基膦酰胺、三乙烯基硫代膦酰胺和三甲基色三聚氰胺；丙酮类(尤其是牛拉他星和牛拉他星酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来星(adozelesin)、卡折来星(carzelesin)和比折来星(bizelesin)合成类似物)；隐藻毒素(尤其是隐藻毒素1和隐藻毒素8)；多拉他汀；杜卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；埃列瑟罗宾；胰抑素；肉蜥蜴；海绵素；氮芥子气，如氯苯脲、氯那帕嗪、胆碱磷酰胺、雌芥子碱、异环磷酰胺、甲氯雷他敏、甲氯雷他敏氧化物盐酸盐、麦法仑、诺文比钦、苯酯酶、泼尼莫司汀、曲福酰胺和尿嘧啶芥子气；亚硝脲类，如卡莫司汀、氯唑霉素、福特莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼莫司汀；抗生素，如烯二炔类抗生素(如卡利霉素，尤其是卡利霉素γ1I和卡利霉素ΩI1)；强尼霉素，包括强尼霉素A；二磷酸盐，如氯膦酸盐；埃斯佩拉米辛；以及新卡那霉素生色团和相关的生色蛋白烯二炔类抗菌生色团、阿克拉霉素、放线菌素、阿托霉素、阿扎丝氨酸、博莱霉素、卡那霉素、卡那霉素、卡那霉素、生色菌素、达卡霉素、柔红霉素、脱托霉素、6-重氮-5-氧基-L-去甲亮氨酸、阿霉素(包括吗啉多柔比星、氰基吗啉多柔比星、2-吡咯啉多柔比星和脱氧氧柔比星)，表柔比星，埃索柔比星，伊达柔比星，马塞霉素，丝裂霉素，如丝裂霉素C，霉酚酸，诺加乐霉素，橄榄霉素，培普霉素，泊他霉素，嘌呤霉素，奎拉霉素，罗托霉素，链霉素，链脲佐菌素，结核菌素，乌本美司他丁，唑柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)叶酸类似物，如去甲蝶呤、翼蝶呤和三甲氧基苯甲酸酯；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嗪和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安替他滨、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、多西氟啶、依诺西他滨和氟尿苷；雄激素，如卡卢斯酮，最安诺酮丙酸酯、表雄醇、甲皮托烷和睾丸内酯；抗肾上腺药，如米托烷和曲洛坦；叶酸补充剂，如叶酸；乙酰丙酮；醛缩磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；依尼鲁昔；氨沙林；贝斯拉布西；双沙坦；依达拉替；去叶胺；去甲克林；二嗪喹酮；艾尔福米特；乙酰胆碱e、一种埃博噻隆；依托胶酸；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；忍冬碱；类美坦菌素，如美坦星和安萨米托星；米托瓜宗；米托蒽醌；莫匹达摩；硝酸酯；戊甾；非那美特；吡柔比星；洛沙坦酮；鬼臼苯甲酸；2-乙基肼；丙卡巴嗪；普克多糖复合物；哌嗪；根霉素；西索非兰；锗螺胺；替尼阿松酸；三嗪醌；2,2',2"-三氯三乙胺；毛霉烯(尤其是T-2毒素、维拉库林A、罗里定A和胍)；乌拉坦；长春地嗪；达卡巴嗪；甘露莫司汀；米托勃龙醇；米托内酯；匹波罗曼；加胞嘧啶；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；类紫杉醇，如紫杉醇和多西紫杉醇吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花碱；铂；足叶乙甙(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺凡酮；替尼泊甙；依达氨酯；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸钠；伊立替康(如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲酰鸟氨酸(DMFO)类维甲酸，如维甲酸；卡培他滨；PARP抑制剂，如奥拉帕利、鲁卡帕利、尼拉帕利、他拉唑帕利、BMN673、伊尼帕利、CEP 9722或ABT888(veliparab)CDK4/6抑制剂，如核糖环利布、帕博昔利布、阿德马昔利布或***昔布；雄激素抑制剂和抗雄激素，如环丙孕酮醋酸酯、甲地孕酮醋酸酯、氯马地平醋酸酯、螺内酯、奥辛酮、醋酸奥司泰隆、氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁胺、托吡鲁胺、恩扎鲁胺、阿帕鲁胺、狄诺司特、屈螺内酯、美卓酮艾司酮、醋酸诺美孕酮、普洛美孕酮、曲美孕酮、酮康唑、醋酸阿比特龙、塞维特罗、氨基谷氨酰胺、非那雄胺、度他雄胺、爱普列特、阿法曲尔、锯棕榈提取物卡铂、丙卡巴嗪、普利康霉素、吉西他滨、长春花碱、法尼基蛋白转氨酶抑制剂、顺铂和上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

B.放疗

导致DNA损伤并被广泛使用的其他因素包括通常所知的γ射线、X射线和/或定向递送到肿瘤细胞的放射性同位素。还涵盖了其他形式的DNA损伤因素，如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)以及UV辐照。所有这些因素都极可能对DNA、DNA前体、DNA复制和修复以及染色体的组装和维持造成各种损害。X射线的剂量范围从每天50到200伦琴，持续较长时间(3到4周)，到单剂2000到6000伦琴。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、辐射强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。

C.免疫疗法

本领域技术人员将理解，免疫疗法可结合或合并本实施方式的方法使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗

就是这样一个例子。例如，免疫效应物可为肿瘤细胞表面某些标志物的特异性抗体。抗体本身可作为治疗效应物，或者可招募其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体也可与药物或毒素(化疗、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)偶联并仅作为靶向剂。或者，效应物可以是携带表面分子的淋巴细胞，该表面分子可直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

在免疫治疗的一个方面中，肿瘤细胞必须具有能够被靶向(即，在大多数其他细胞上不存在)的某些标志物。存在许多肿瘤标志物，并且其中任何一种可适合在本实施方式的背景下被靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫治疗的另一个方面是将抗癌作用与免疫刺激作用结合起来。免疫刺激分子也存在，包括：细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，如MIP-1、MCP-1、IL-8，和生长因子，如FLT3配体。

目前正在研究或使用的免疫疗法的实例包括免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等，1998)；细胞因子疗法，例如干扰素α、β及γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等，1998；Davidson等，1998；Hellstrand等，1998)；基因治疗，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等，1998；AustinWard和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi等，1998；美国专利5,824,311)。预期一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。

一些实施方式中，免疫疗法可为免疫调节剂。免疫调节剂包括免疫检查点抑制剂、共刺激分子激动剂和免疫抑制分子拮抗剂。免疫调节剂可以是药物，例如小分子、配体或受体的重组形式，或者抗体，例如人类抗体(例如，国际专利公开WO2015/016718；Pardoll，NatRev Cancer，12(4)：252-264，2012；两者通过引用纳入本文)。可以使用已知的免疫检查点蛋白抑制剂或其类似物，特别是可以使用嵌合、人源化或人类形式的抗体。本领域技术人员将知道，对于本公开中提到的某些抗体，可使用别名和/或等同名称。在本公开的上下文中，此类别名和/或等同名称可以互换。例如，众所周知，兰姆单抗(lambrolizumab)也以别名和等同名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)为人所知。

共刺激分子是与免疫细胞表面受体相互作用的配体，例如CD28、4-1BB、OX40(也称为CD134)、ICOS和GITR。例如，人类OX40完整蛋白质序列的GenBank登录号为NP_003318。在一些实施方式中，免疫调节剂是抗OX40抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人OX40抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗OX40抗体。示例性抗OX40抗体为PF-04518600(例如，参见WO 2017/130076)。ATOR-1015是一种针对CTLA4和OX40的双特异性抗体(参见，例如，WO 2017/182672、WO 2018/091740、WO2018/202649、WO 2018/002339)。

在本文提供的方法中可以靶向的另一个共刺激分子是ICOS，也称为CD278。人类ICOS完整蛋白质序列的GenBank登录号为NP_036224。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗ICOS抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人ICOS抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗ICOS抗体。示例性抗ICOS抗体包括JTX-2011(参见，例如，WO 2016/154177、WO 2018/187191)和GSK3359609(参见，例如，WO 2016/059602)。

在本文提供的方法中可以靶向的另一种共刺激分子是糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(GITR)，也称为TNFRSF18和AITR。人类GITR完整蛋白质序列的GenBank登录号为NP_004186。在一些实施方式中，免疫调节剂是抗GITR抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人GITR抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗GITR抗体。示例性抗GITR抗体为TRX518(例如，参见WO 2006/105021)。

在本文提供的方法中可以靶向的另一个共刺激分子是4-1BB，也称为CD137、TNFRSF9和ILA。人类4-1BB完整蛋白质序列的GenBank登录号为NP_001552。在一些实施方式中，免疫调节剂是抗4-1BB抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人4-1BB抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗4-1BB抗体。示例性抗4-1BB抗体为PF-05082566(例如，奥托单抗(utomilumab)，参见WO 2012/032433)。

免疫检查点阻断可针对的免疫检查点蛋白包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CCL5、CD27、CD38、CD8A、CMKLR1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、CXCL9、CXCR5、HLA-DRB1、HLA-DQA1、HLA-E、杀手细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3，也称为CD223)、Mer酪氨酸激酶(MerTK)、NKG7、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1，也称为CD274)、PDCD1LG2、PSMB10、STAT1、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)，和T细胞激活的V域Ig抑制物(VISTA，也称为C10orf54)。特别是，靶向PD-1轴和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂已在多种癌症类型中广泛获得FDA批准。

在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合伴侣结合的分子。在特定方面中，PD-1配体结合伴侣为PD-L1和/或PD-L2。在一些实施方式中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合伴侣结合的分子。在特定方面中，PD-L1结合伴侣为PD-1和/或B7-1。在另一实施方式中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合伴侣结合的分子。在特定方面中，PD-L2结合伴侣是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体在美国专利号8,735,553、8,354,509和8,008,449中描述，所有这些专利均通过引用纳入本文。本领域已知用于本文所提供方法的其他PD-1轴拮抗剂，例如美国专利申请公开号2014/0294898、2014/022021和2011/0008369中所述，所有这些均通过引用纳入本文。

在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方式中，抗PD-1抗体选自纳武单抗、派姆单抗和CT-011。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方式中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗，也称MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和

是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。派姆单抗，也称MK-3475、Merck3475、兰姆单抗、

和SCH-900475，是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。CT-011，也称hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PD-L2-Fc融合可溶受体。.

可在本文提供的方法中被靶向的另一免疫检查点蛋白是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人类CTLA-4的完整cDNA序列的Genbank登录号为L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，当与抗原呈递细胞表面的CD80或CD86结合时，CTLA-4起到“关闭”开关的作用。CTLA-4类似于T细胞共刺激蛋白CD28，这两种分子都与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28向T细胞传递刺激信号。细胞内CTLA-4也存在于调节性T细胞中，可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28激活T细胞导致CTLA-4表达增加，CTLA-4是B7分子的抑制性受体。

在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人CTLA-4抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗CTLA-4抗体。可用于本文所述方法中的抗-CTLA-4抗体公开于例如：美国专利第8,119,129号；PCT公开第WO 01/14424号、第WO 98/42752号、第WO 00/37504号(CP675,206，也称作特姆单抗(tremelimumab)；原称替西单抗(ticilimumab))；美国专利第6,207,156号；Hurwitz等，(1998)Proc Natl Acad Sci USA,95(17):10067-10071；Camacho等，(2004)J Clin Oncology,22(145):摘要号2505(抗体CP-675206)；以及Mokyr等，(1998)Cancer Res,58:5301-5304。各前述公开物中的教导通过引用纳入本文。也可使用与这些本领域认可的抗体中的任何一种竞争以结合CTLA-4的抗体。例如，在国际专利申请号WO2001/014424、WO2000/037504和美国专利号8,017,114中描述了人源化CTLA-4抗体；所有内容通过引用纳入本文。

示例性抗CTLA-4抗体为伊普利单抗(ipilimumab，也称为10D1、MDX-010、MDX-101和

)或其抗原结合片段及变体(例如，参见WO 01/14424)。在其他实施方式中，抗体包含伊普利单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方式中，抗体包含伊普利单抗VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊普利单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一实施方式中，抗体竞争结合和/或结合到与上述抗体相同的CTLA-4表位。在另一个实施方式中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊普利单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。用于调节CTLA-4的其他分子包括CTLA-4配体和受体，如美国专利号5,844,905、5,885,796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752中所述；全部通过引用纳入本文，以及美国专利号8329867中所述的免疫粘附素,通过引用纳入本文。

可在本文提供的方法中被靶向的另一免疫检查点蛋白是淋巴细胞激活基因3(LAG-3)，也称为CD223。人类LAG-3完整蛋白质序列的Genbank登录号为NP-002277。LAG-3存在于活化的T细胞、天然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞的表面。当LAG-3与抗原呈递细胞表面上的II类MHC结合时，LAG-3充当“关闭”开关。抑制LAG-3同时激活效应T细胞和抑制调节T细胞。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗LAG-3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人LAG-3抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗LAG-3抗体。示例性抗LAG-3抗体为瑞拉特利单抗(relatlimab，也称BMS-986016)或其抗原结合片段和变体(参见例如WO 2015/116539)。其他示例性抗LAG-3抗体包括TSR-033(参见，例如，WO 2018/201096)、MK-4280和REGN3767。MGD013是WO 2017/019846中描述的抗LAG-3/PD-1双特异性抗体。FS118是WO 2017/220569中描述的抗LAG-3/PD-L1双特异性抗体。

可在本文提供的方法中被靶向的另一免疫检查点蛋白是含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3(TIM3)，也称为HAVCR2。人类TIM3完整蛋白质序列的GenBank登录号为NP_116171。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗TIM3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人TIM3抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗TIM3抗体。示例性抗TIM3抗体包括LY3321367(参见，例如，WO 2018/039020)、MBG453(参见，例如，WO 2015/117002)和TSR-022(参见，例如，WO 2018/085469)。

可在本文提供的方法中被靶向的另一免疫检查点蛋白是T细胞激活的V域Ig抑制物(VISTA)，也称为C10orf54。人类VISTA完整蛋白质序列的GenBank登录号为NP_071436。VISTA存在于白细胞上，抑制T细胞效应物功能。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗VISTA3抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人VISTA抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗VISTA抗体。示例性抗VISTA抗体为JNJ-610588(也称为奥瓦利单抗(onvatilimab，参见，例如，WO 2015/097536、WO 2016/207717、WO 2017/137830、WO 2017/175058)。小分子CA-170也可抑制VISTA，该小分子选择性靶向PD-L1和VISTA(参见，例如，WO 2015/033299、WO 2015/033301)。

可在本文提供的方法中被靶向的另一免疫检查点蛋白是CD38。人类CD38完整蛋白质序列的GenBank登录号为NP_001766。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗CD38抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人CD38抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗CD38抗体。示例性抗CD38抗体为达雷姆单抗(daratumumab，参见例如美国专利第7,829,673号)。

可在本文提供的方法中被靶向的另一免疫检查点蛋白是具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。人类TIGIT完整蛋白质序列的GenBank登录号为NP_776160。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是抗TIGIT抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。可使用本领域公知的方法生成适于在本公开方法中使用的抗人TIGIT抗体(或从其衍生的VH和/或VL结构域)。或者，可以使用本领域认可的抗TIGIT抗体。示例性抗TIGIT抗体为MK-7684(参见例如WO 2017/030823、WO 2016/028656)。

其他可作为免疫调节靶点的免疫抑制分子包括STAT3和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)。例如，人类IDO完整蛋白质序列的GenBank登录号为NP_002155。在一些实施方案中，免疫调节剂是小分子IDO抑制剂。示例性小分子包括BMS-986205、依帕司他(epacadostat，INCB24360)和纳沃西莫德(navoximod，GDC-0919)。

在一些实施方式中，免疫治疗可以是过继免疫治疗，其涉及转移体外产生的自体抗原特异性T细胞。用于过继免疫治疗的T细胞可以通过抗原特异性T细胞的扩增或通过基因工程重新定向T细胞来产生(Park，Rosenberg等，2011)。分离和转移肿瘤特异性T细胞已被证明是治疗黑色素瘤的成功方法。通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移，已经成功地在T细胞中产生了新的特异性(Jena，Dotti等，2010年)。CAR是合成受体，由与单个融合分子中的一个或多个信号传导结构域相关的靶向部分组成。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，该scFv包含通过柔性接头连接的单克隆抗体轻链可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也得到了成功的应用。第一代CAR的信号传导结构域来自CD3ζ或Fc受体γ链的细胞质区域。CAR已成功地使T细胞重定向针对各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原(Jena，Dotti等，2010)。

在一个实施方式中，本申请提供用于治疗癌症的组合疗法，其中该组合疗法包括过继性T细胞疗法和检查点抑制剂。在一个方面，过继性T细胞疗法包括自体和/或同种异体T细胞。在另一方面，自体和/或同种异体T细胞靶向性针对肿瘤抗原。

D.手术

大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期性、治疗性和姑息性手术。治疗性手术包括切除，其中全部或部分癌组织被物理移除、切除和/或破坏，并且可以与其他治疗结合使用，例如与本实施方式的治疗、化疗、放疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗结合。肿瘤切除术是指物理切除至少部分肿瘤。除了肿瘤切除，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科和显微镜控制手术(莫氏手术)。

切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空洞。治疗可以通过在该区域灌注、直接注射或局部应用其他抗癌治疗来完成。例如，可每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复进行此类治疗。这些治疗也可能有不同的剂量。

E.其他药剂

预期其他药剂可与本实施方式的某些方面结合使用以提高治疗的治疗效果。这些其他药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接上调的药剂、细胞抑制剂和分化试剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导物敏感性的试剂或其他生物试剂。通过增加GAP连接的数量来增加细胞间信号传导，将增加对邻近过度增殖细胞群的抗过度增殖作用。在其他实施方式中，细胞抑制剂或分化剂可与本实施方式的某些方面结合使用，以提高治疗的抗过度增殖功效。预期细胞粘附的抑制剂可提高本实施方式的功效。细胞粘附抑制剂的例子有粘着斑激酶(FAKs)抑制剂和洛伐他汀。进一步设想，可结合本实施方式的某些方面使用增加过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他药剂，例如抗体c225，以提高治疗效果。

V.试剂盒与诊断

在实施方式的各个方面中，涵盖了包含治疗剂和/或其他治疗剂和递送剂的试剂盒。在一些实施方式中，本实施方式涵盖用于制备和/或施用实施方式的治疗的试剂盒。试剂盒可包括一个或多个密封小瓶，其中包含本实施方式的任何药物组合物。试剂盒可包括，例如，至少一种加载DKK1肽的MHC抗体以及用于制备、配制和/或给予实施方式的组分或执行本公开方法的一个或多个步骤的试剂。在一些实施方式中，试剂盒还可以包括合适的容器，该容器是不会与试剂盒的成分反应的容器，例如Eppendorf管、分析板、注射器、瓶子或管。容器可由可消毒材料制成，如塑料或玻璃。

该试剂盒还可包括概述本文所述方法的程序步骤的说明书，并将遵循与本文所述或本领域普通技术人员已知的基本相同的程序。指令信息可以在包含机器可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行该指令时，导致显示递送药物有效量的治疗剂的真实或虚拟过程。

VI.实施例

包括以下实施例以演示本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解，在下面的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被视为构成其实践的优选模式。在本文基础上，本领域技术人员应懂得，在本文要旨和范围内可对本文所述具体实施方式进行多种改变而仍然得出相同或相近结果。

实施例1－针对DKKl P20/HLA-A2复合物的单克隆抗体的产生

为了产生针对DKKl P20/HLA-A2复合物的特异性单克隆抗体，将DKKl P20(ALGGHPLLGV；SEQ ID NO:1)肽与重组人HLA-A2和β2-微球蛋白复性。6周龄雌性Balb/c小鼠腹腔注射200μL悬浮液，该悬浮液由20μg纯化的P20/HLA-A2单体(抗原)与完全弗氏佐剂(Fisher Scientific)混合而成。每隔3周对小鼠进行免疫，共三次腹腔注射抗原加佐剂，然后在收获脾细胞前三天单独腹腔注射抗原。最后一次加强前三天，使用ELISA检测血清中是否存在与P20/HLA-A2单体结合的多克隆抗体。一旦小鼠血清显示与复合物结合的高滴度抗体，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，并通过ELISA筛选阳性杂交瘤。通过限制稀释法分离阳性克隆。经平行ELISA筛选后，将所选克隆转移到24孔板上，并在含有4mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI-1640中生长。小鼠购自杰克逊实验室(The JacksonLaboratory)。

共选择了1920个克隆，并通过平行筛选测试这些克隆中与DKK1 P20/HLA-A2复合物结合但不与HIV/HLA-A2(一种不相关的HIV对照肽)结合的克隆。将显示与P20/HLA-A2的ELISA信号至少比与HIV/HLA-A2高2倍的两个克隆(C2和C3)亚克隆以产生单细胞源性克隆。流式细胞术验证这两个克隆与U266骨髓瘤细胞系结合，但不与ARP-1骨髓瘤细胞系结合，后者表达DKK1但不表达HLA-A2(图7B)。为了确认C2和C3特异性，使用ELISA显示来自这两个克隆的单克隆抗体与P20/HLA-A2单体结合，但不与其他与HLA-A2紧密结合的无关肽构成的单体结合，如HIV/HLA-A2、流感/HLA-A2和细胞周期蛋白D1肽/HLA-A2(图7A)。此外，来自C2和C3克隆的单克隆抗体不单独结合P20肽，也不结合β2-微球蛋白。这些数据表明C2和C3单抗对P20/HLA-A2复合物具有特异性。表1-3提供了C2的序列。

为了进一步证实C2和C3单抗与细胞表面上的P20/HLA-A2结合，使用流式细胞术。C2和C3单抗显示与HLA-A2⁺DKK1⁺U266细胞的特异性结合，但与HLA-A2^-DKK1⁺ARP细胞或DKK1^-HLA-A2⁺正常血细胞无特异性结合。此外，在向U266细胞加载P20肽后，与U266的结合显著增强(图7B)，进一步证实C2和C3单抗与细胞表面P20/HLA-A2复合物特异性结合。

表1：抗体C2重链和轻链可变序列的CDR

表2：抗体C2可变区的蛋白质序列

表3：抗体C2可变区的核苷酸序列

实施例2－抗DKKl P20/HLA-A2复合物的单克隆抗体与表达DKK1和HLA-A2的癌细胞结合

为了确认DKK1 P20/HLA-A2是抗体C2的靶分子，使用U266细胞和不同剂量的C2单克隆抗体进行肽结合试验(图7C)。此外，使用正常PBMC以及意义未定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)和(多发性骨髓瘤)MM患者样品进行肽结合分析(图7D)。在乳腺癌(图8A)和***癌(图8B)细胞系上进一步测试C2单克隆抗体的结合。C2单克隆抗体仅与HLA-A2阳性的细胞系结合。

最后，使用肽结合试验研究C2单克隆抗体与T2细胞的结合。T2细胞与不同剂量的DKK1肽P20和P66v孵育过夜，并使用C2单克隆抗体分析表面HLA-A*0201-DKK1表达(MFI)(图5A)。图5C显示了与不同剂量的P20肽培养过夜的T2细胞的抗体结合能力。

实施例3－针对DKKl P20/HLA-A2复合物的单克隆抗体的体外功能

为了观察C2结合的效果，将T2细胞与不同剂量的DKK1肽P20孵育过夜，用100μg/mLA2-DKK1单克隆抗体处理48小时，并分析凋亡(图5B)。此外，将U266细胞与不同剂量的C2和C3单克隆抗体孵育，并检测细胞凋亡。两种单克隆抗体均以剂量依赖性方式诱导细胞凋亡(图9A和图9B)。此外，将T2细胞与不同剂量的DKK1肽P20孵育过夜，用100μg/mL C2单克隆抗体处理48小时，并分析凋亡(图9C)。T2细胞也与P20或各种非DKK1肽一起孵育，并检测C2和C3单抗诱导的凋亡。只有加载P20的T2细胞在结合C2和C3单克隆抗体时发生凋亡增加(图9D)。最后，还测试了C2和C3单克隆抗体诱导骨髓瘤细胞系、淋巴瘤细胞系(图9E)、乳腺癌和***癌细胞系(图9F)凋亡的能力。

还研究了C2和C3单克隆抗体诱导抗体依赖性细胞毒性的能力。以Cr-51释放试验检测C2和C3单克隆抗体诱导的骨髓瘤细胞系(图10A和E)、淋巴瘤细胞系(图10A和E)、乳腺癌细胞系(图10B和F)和***癌细胞系(图10B和G)的ADCC。还将T2细胞与P20或各种非DKK1肽一起孵育，并检测C2单抗诱导的凋亡。只有加载P20的T2细胞在结合C2单克隆抗体时增加了细胞毒性(图10H)。IncuCyte ZOOM实时成像***显示了C2单克隆抗体诱导的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的ADCC(图10C和D)。

使用不同的癌细胞系测试C2和C3单克隆抗体诱导补体依赖性细胞毒性的能力。Cr-51释放试验检测了由C2和C3单克隆抗体诱导的骨髓瘤和淋巴瘤细胞系(图11A)以及乳腺癌和***癌细胞系(图11B)的CDC。IncuCyte ZOOM实时成像***显示了C2单克隆抗体诱导的乳腺癌细胞系MDA-MB-231的CDC(图11C和D)。Inucyte ZOOM实时成像***还检测到A2-DKK1单抗诱导的***细胞系PC-2-A2^-(图11E和G)和PC-2-A2⁺(图11F和G)的CDC。

实施例4－针对DKKl P20/HLA-A2复合物的单克隆抗体的体内功能

为了研究A2-DKK1单抗在体内的作用机制，SCID小鼠(每组5只)皮下移植U266骨髓瘤细胞，然后用小鼠IgG(mIgG)、A2-DKK1单抗、A2-DKK1单抗联合用特异性单抗耗竭NK细胞(NK耗竭)和A2-DKK1单抗联合用眼镜蛇毒因子(CVF)耗竭补体(CP耗竭)进行治疗。在第1、2、4和6周获得生物发光图像(图1A)。每周两次测定肿瘤负荷(图1B)。待皮下肿瘤达到225mm²或待小鼠濒死时对其实施安乐死。存活曲线如图1C所示。

为了在SCID-hu模型中研究A2-DKK1单抗对原发性MM的治疗作用，将HLA-A2患者(n＝3)的原发性骨髓瘤细胞直接注射到植入的人骨骼中，并监测肿瘤生长以及循环人类M-蛋白或其轻链的水平(图2A)。小鼠接受100μg A2-DKK1单抗(C2)或100μg小鼠IgG1或等体积PBS的腹腔注射(每三天注射一次，共六次注射)。当循环人M-蛋白达到50μg/mL或皮下肿瘤达到400mm²时，对小鼠实施安乐死。图2B提供了生存曲线。图2C探测了接受不同治疗的小鼠的X射线图像。

为了研究A2-DKK1单抗在SCID小鼠中的药代动力学，对A2-NSG小鼠静脉注射U266骨髓瘤细胞，然后腹腔注射50μg(C2-50)、100μg(C2-100)、200μg(C2-200)A2-DKK1单抗或100μg小鼠IgG1(每三天一次，共六次注射)。根据循环人M-蛋白或其轻链水平监测肿瘤负荷(图3A)。接受100μg A2-DKK1单抗治疗的小鼠的A2-DKK1单抗药代动力学如图3B所示。

为了研究A2-DKK1单抗对A2-SCID小鼠的毒性和安全性，皮下注射U266骨髓瘤细胞攻击A2-SCID小鼠，然后腹腔注射400μg A2-DKK1单抗或400μg小鼠IgG1(mIgG)进行治疗(每三天一次，共6次注射)。通过H&E染色(图4A)、A2-DKK1单克隆抗体染色(图4B)和Tunel测试(图4C和E)分析各种组织。图4D提供了接受不同治疗的小鼠不同组织和肿瘤的平均荧光强度(MFI)。

研究了A2-DKK1单抗在A2-NSG小鼠模型中发挥免疫治疗功能的能力。A2-NSG小鼠静脉注射U266骨髓瘤细胞，然后腹腔注射100μg A2-DKK1单抗(C2)或100μg小鼠IgG1(mIgG)或PBS进行治疗(每三天一次，共注射六次)。根据循环人M-蛋白或其轻链水平监测肿瘤负荷(图6B)。当循环人M-蛋白达到50μg/mL或小鼠濒死时，对小鼠实施安乐死。图6A提供了第2、4和6周小鼠的生物发光图像。图6C提供了接受不同治疗的小鼠的存活曲线。

***

根据本公开，本文公开和要求保护的所有方法都可以在不进行不当实验的情况下制造和执行。虽然已经根据优选实施方式描述了本公开的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说，显而易见的是，在不脱离本公开的概念、精神和范围的情况下，可以对本文所述方法的步骤或步骤序列进行改变。更具体而言，可以用化学和生理相关的某些试剂代替本文所述的试剂，同时可以得到相同或类似的结果。所有此类类似替代和修改对于本领域技术人员而言是显而易见地被视为在所附权利要求所定义的本公开的精神、范围和概念范围内的。

参考文献

以下参考文献在一定程度上提供了补充本文所述内容的示例性程序或其他细节，通过引用具体纳入本文。

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序列表

<110> 得克萨斯州大学***董事会（Board of Regents, The University of TexasSystem）

<120> 针对MHC结合的人Dickkopf-1肽的单克隆抗体及其应用

<130> UTFC.P1418WO

<140> 提交于此

<141> 2020-02-03

<150> US 62/800,007

<151> 2019-02-01

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val

1 5 10

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile

1 5

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Ala Arg Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Gln Asp Val Gly Ser Thr

1 5

<210> 6

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Trp Thr Ser

1

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Gln Lys Phe Gly Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 8

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 8

Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 9

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Leu Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ser Thr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Val Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Lys Phe Gly Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 10

gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct 120

ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg gcagtagcac catctactat 180

gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc 240

ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagaccctat 300

tactacggta gtacctacga tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 11

<211> 322

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多核苷酸

<400> 11

Gly Ala Cys Ala Thr Thr Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys

1 5 10 15

Ala Gly Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala Thr

20 25 30

Gly Thr Cys Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly Thr Ala Gly Gly Ala

35 40 45

Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala

50 55 60

Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Ala

65 70 75 80

Gly Gly Ala Thr Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr Cys Thr Ala Cys Thr

85 90 95

Gly Thr Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys

100 105 110

Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Thr Cys

115 120 125

Thr Cys Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Ala Thr Thr

130 135 140

Thr Ala Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys

145 150 155 160

Gly Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys

165 170 175

Thr Gly Ala Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Ala Gly Gly Cys

180 185 190

Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly

195 200 205

Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr

210 215 220

Thr Ala Gly Cys Ala Ala Thr Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr

225 230 235 240

Gly Thr Ala Gly Ala Cys Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Thr Thr Thr

245 250 255

Ala Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr

260 265 270

Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly

275 280 285

Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala

290 295 300

Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala

305 310 315 320

Ala Cys

Claims (40)

1.一种单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包括：

重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:2的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:3的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:4的VHCDR3氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:5的VLCDRl氨基酸序列、SEQ ID NO:6的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:7的VLCDR3氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:10具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:11具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列编码。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段由与SEQ IDNO:10具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的轻链可变序列编码。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段由SEQ IDNO:10的重链可变序列和SEQ ID NO:11的轻链可变序列编码。

5.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含与SEQID NO:8具有至少70％、80％或90％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:9具有至少70％、80％或90％同一性的轻链可变序列。

6.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含与SEQID NO:8具有至少95％同一性的重链可变序列和与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的轻链可变序列。

7.如权利要求1所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含具有SEQ ID NO:8序列的重链可变序列和具有SEQ ID NO:9序列的轻链可变序列。

8.如权利要求1-7中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段是人源化抗体。

9.如权利要求1-8中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体片段是单价scFv(单链片段可变)抗体、二价scFv、Fab片段、F(ab')₂片段、F(ab')₃片段、Fv片段或单链抗体。

10.如权利要求1-8中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体是嵌合抗体或双特异性抗体。

11.如权利要求1-10中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体是IgG抗体或重组IgG抗体或抗体片段。

12.如权利要求1-11中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体偶联或融合至显像剂或细胞毒性剂。

13.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其与如权利要求1-11中任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合相同的表位。

14.如权利要求13所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段是人源化抗体。

15.如权利要求13或14所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体片段是单价scFv(单链片段可变)抗体、二价scFv、Fab片段、F(ab')₂片段、F(ab')₃片段、Fv片段或单链抗体。

16.如权利要求13-15中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体是嵌合抗体或双特异性抗体。

17.如权利要求13-16中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体是IgG抗体或重组IgG抗体或抗体片段。

18.如权利要求13-17中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，所述抗体偶联或融合至显像剂或细胞毒性剂。

19.一种杂交瘤或经工程化改造的细胞，其编码如权利要求1-11或13-18中任一项所述的抗体或抗体片段。

20.一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括给予有效量的加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段。

21.如权利要求20所述的方法，其中，所述加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段是如权利要求1-18中任一项所述的抗体或抗体片段。

22.如权利要求20或21所述的方法，其中，所述癌症患者已被确定相对于对照患者表达升高水平的DKK1。

23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其进一步定义为用于提高化疗敏感性的方法。

24.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其进一步定义为用于提高免疫疗法敏感性的方法。

25.如权利要求20-24中任一项所述的方法，其中，所述癌症是骨髓瘤、乳腺癌、***癌或淋巴瘤。

26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其进一步定义为抑制癌生长的方法。

27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其进一步包含给予至少一种第二抗癌疗法。

28.如权利要求27所述的方法，其中，所述第二抗癌疗法是化疗、免疫疗法、放疗、基因疗法、外科手术、激素疗法、抗血管生成疗法或细胞因子疗法。

29.如权利要求28所述的方法，其中，所述化疗包含来那度胺。

30.如权利要求28所述的方法，其中，所述免疫疗法包括免疫检查点抑制剂。

31.如权利要求30所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂、PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、OX40激动剂、LAG3拮抗剂、4-1BB激动剂或TIM3拮抗剂。

32.如权利要求30所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂。

33.如权利要求30所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是PD1或PDL1拮抗剂。

34.如权利要求30所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂与PD1拮抗剂的组合。

35.如权利要求30所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4拮抗剂与PDL1拮抗剂的组合。

36.一种检测癌细胞上细胞表面DKK1肽/HLA-A2复合物的存在的方法，该方法包括将所述癌细胞与加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段接触。

37.一种测定癌细胞上细胞表面DKK1肽/HLA-A2复合物的水平的方法，所述方法包括将所述癌细胞与加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段接触。

38.如权利要求36或37所述的方法，其中，所述加载DKK1肽的MHC靶向抗体或抗体片段是如权利要求1-18中任一项所述的抗体或抗体片段。

39.如权利要求1-18中任一项所述的抗体或抗体片段，其用作在对象中治疗癌症的药物。

40.如权利要求1-18中任一项所述的抗体或抗体片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

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