ES2847155T3 - Moléculas multiespecíficas que fijan como objetivo CLL-1 - Google Patents

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Abstract

Una molecula multiespecifica que comprende un primer dominio de union a antigeno y un segundo dominio de union a antigeno, en donde el segundo dominio de union a antigeno se une a un antigeno de celulas efectoras inmunes. que es un antigeno expresado en una celula T, en donde el antigeno expresado en una celula T es CD3, y en donde el primer dominio de union a antigeno es un dominio de union anti-CLL-1, que comprende: una region determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 322, una region determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 336, una region determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de SEQ ID NO: 350 y una region determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 364, una region determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 378 y una region determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 392; 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o una region determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 327, una region determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 341, una region determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de SEQ ID NO: 355 y una region determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 369, una region determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 383 y una region determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 397.

Description

DESCRIPCIÓN
Moléculas multiespecíficas que fijan como objetivo CLL-1
Campo de la Invención
La presente invención se refiere al campo de la inmunología. Específicamente, la invención se refiere a moléculas multiespecíficas y/o multivalentes que fijan como objetivo la molécula 1 similar a lectina de tipo C (CLL-1) y métodos de fabricación y uso de las mismas.
Solicitudes Relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud PCT N° PCT/CN2016/071599, presentada el 21 de enero de 2016.
Antecedentes de la Invención
Moléculas multiespecíficas que son capaces de unir dos o más antígenos se conocen en la técnica y ofrecen beneficios clínicos significativos, por ejemplo, para ensayos de enzimas de diagnóstico, tales como adyuvantes de vacuna, para suministrar agentes trombolíticos, para el tratamiento de enfermedades, para fijar como objetivo complejos inmunes a receptores de la superficie celular, o para suministrar inmunotoxinas a células tumorales, etc. (Burrows, F. J. y Thorpe, P. E. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:89969000; Zhu, Z. et al. (1996) Bio/Technology 14:192 196; Holliger, P. et al. (1996) Protein Engin. 9:299305; Morrison et al., (1997) Nature Biotech. 15:159-163; Huang, X. et al. (1997) Science 275:547 550Alt et al. (1999) FEBS Letters 454: 90-94; Zuo et al., (2000) Protein Engineering 13:361-367; Lu et al., (2004) JBC 279:2856-2865; Lu et al., (2005) JBC 280:19665-19672; Marvin et al., (2005) Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658; Marvin et al., (2006) Curr Opin Drug Disc Develop 9:184-193; Shen et al., (2007) J Immun Methods 218:65-74; Wu et al., (2007) Nat Biotechnol. 11:1290-1297; Dimasi et al., (2009) J Mol Biol. 393:672-692; y Michaelson et al., (2009) mAbs 1:128-141).
La mayoría de los pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) son incurables utilizando la terapia estándar (Mrozek et al, 2012, J Clin Oncol, 30: 4515-23) y aquellos con AML recidivante o refractaria (RR-AML) tienen un pronóstico particularmente precario (Kern et al, 2003, Blood 2003, 101:64-70; Wheatley et al, 1999, Br J Haematol, 107:69-79). Molécula 1 similar a lectina de tipo C (CLL-1) también se conoce como MICL, CLEC12A, CLEC-1, Lectina 1 Asociada a Células Dendríticas y DCAL-2. CLL-1 es un receptor de glicoproteína y miembro de la gran familia de receptores similares a lectina de tipo C implicados en la regulación inmunitaria. CLL-1 se expresa en células hematopoyéticas, principalmente en células inmunitarias innatas que incluyen monocitos, DCs, pDCs y granulocitos (Cancer Res. 2004; J Immunol 2009) y células progenitoras mieloides (Blood, 2007). CLL-1 también se encuentra en blastos de leucemia mieloide aguda (AML) y células madre leucémicas (p. ej., CD34+/CD38-) (Zhao et al., Haematologica. 2010, 95(1 ):71-78.). La expresión de CLL-1 también puede ser relevante para otras leucemias mieloides, tales como leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloide crónica (CML) y síndrome mielodisplásico (MDS).
El documento WO2014153002 describe anticuerpos biespecíficos con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CD3 y un segundo anticuerpo o fragmento de anticuerpo, dirigido a una variedad de dianas, incluida CLL.
Existe, sin embargo, una necesidad médica insatisfecha de moléculas multiespecíficas que fijen como objetivo CLL-1.
Sumario de la Invención
En un aspecto, la invención se refiere a una molécula multiespecífica que incluye un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno es un dominio de unión anti-CLL-1 y el segundo dominio de unión a antígeno se une a un antígeno de células efectoras inmunes. que es un antígeno expresado en una célula T, en donde el antígeno expresado en una célula T es CD3, y en donde la molécula multiespecífica es como se define adicionalmente en las reivindicaciones.
También se describe en esta memoria una molécula multiespecífica que incluye un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el primer dominio de unión a antígeno es un dominio de unión anti-CLL-1 que incluye una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (HC CDR1), región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (HC CDR2) y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (HC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión anti-CLL-1 enumerada en la Tabla 2.
En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende, además, una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (LC CDR1), una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (LC CDR2) y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (LC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión anti-CLL-1 enumerada en la Tabla 2.
En realizaciones de la divulgación, que incluyen la molécula multiespecífica de los aspectos o realizaciones precedentes, el dominio de unión anti-CLL-1 incluye LC CDR1, LC CDR2 y LC CDR3 que son las secuencias de LC CDR enumeradas en la Tabla 4, 6 u 8.
En realizaciones de la divulgación, que incluyen cada uno de los aspectos o realizaciones precedentes, el dominio de unión anti-CLL-1 incluye HC CDR1, HC CDR2 y HC CDR3 que son las secuencias de HC CDR enumeradas en la Tabla 3, 5 o 7.
En realizaciones de la divulgación, que incluyen en cada una los aspectos o realizaciones precedentes, el dominio de unión anti-CLL-1 de la molécula multiespecífica incluye:
(i) la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera enumerada en la Tabla 2;
(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones variables de cadena ligera proporcionadas en la Tabla 2; o
(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad del 95-99% con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones variables de cadena ligera proporcionadas en la Tabla 2.
En realizaciones de la divulgación, que incluyen en cada una los aspectos o realizaciones precedentes, el dominio de unión anti-CLL-1 de la molécula multiespecífica incluye:
(i) la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada enumerada en la Tabla 2;
(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones variables de cadena pesada proporcionadas en la Tabla 2; o
(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad del 95-99% con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones variables de cadena pesada proporcionadas en la Tabla 2.
En realizaciones de la divulgación, que incluyen cada uno de los aspectos o realizaciones precedentes, la molécula multiespecífica incluye un dominio de unión anti-CLL-1 que incluye la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera enumerada en la Tabla 2, y la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada enumerada en la Tabla 2. En realizaciones, el dominio de unión anti-CLL-1 que incluye la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de cualquier dominio de unión anti-CLL-1 enumerado en la Tabla 2, p. ej., de cualquiera de CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, o CLL-1-13. En realizaciones de la divulgación, que incluyen cada uno de los aspectos o realizaciones precedentes, el dominio de unión anti-CLL-1 de la molécula multiespecífica incluye:
(i) cualquier secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, o SEQ ID NO: 77;
(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de cualquiera de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, o SEQ ID NO: 77; o
(iii) una secuencia de aminoácidos con un 95-99% de identidad con cualquiera de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87 SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 76, o SEQ ID NO: 77.
En aspectos de la invención, en los casos en los que dicho dominio de unión anti-CD3 incluye una secuencia VL de SEQ ID NO: 1209 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 1236, la molécula multiespecífica incluye un dominio de unión anti-CLL-1 que incluye:
a) una secuencia VL de SEQ ID NO: 88 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 75;
b) una secuencia VL de SEQ ID NO: 89 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 76;
c) una secuencia VL de SEQ ID NO: 87 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 74;
d) una secuencia VL de SEQ ID NO: 85 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 72;
e) una secuencia VL de SEQ ID NO: 86 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 73;
f) una secuencia VL de SEQ ID NO: 83 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 70;
g) una secuencia VL de SEQ ID NO: 90 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 77;
h) una secuencia VL de SEQ ID NO: 79 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 66; o
i) una secuencia VL de SEQ ID NO: 84 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 71.
En aspectos de la invención, en los casos en los que dicho dominio de unión anti-CD3 incluye SEQ ID NO: 506; la molécula multiespecífica incluye un dominio de unión anti-CLL-1 que incluye:
a) SEQ ID NO: 49;
b) SEQ ID NO: 50;
c) SEQ ID NO: 48;
d) SEQ ID NO: 46;
e) SEQ ID NO: 47;
f) SEQ ID NO: 44;
g) SEQ ID NO: 51;
h) SEQ ID NO: 40; o
i) SEQ ID NO: 45.
En aspectos de la invención, en los casos en los que dicho dominio de unión anti-CD3 incluye, p. ej., consiste en SEQ ID NO: 507; la molécula multiespecífica incluye un polipéptido que comprende un dominio de unión anti-CLL-1 que incluye, p. ej., consiste en:
a) SEQ ID NO: 512;
b) SEQ ID NO: 517;
c) SEQ ID NO: 522;
d) SEQ ID NO: 527;
e) SEQ ID NO: 532;
f) SEQ ID NO: 537;
g) SEQ ID NO: 542;
h) SEQ ID NO: 547; o
i) SEQ ID NO: 552.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a moléculas multiespecíficas, p. ej., moléculas multiespecíficas anti -CLL-1, incluidas las descritas en cada uno de los aspectos o realizaciones anteriores, que incluyen un segundo dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno canceroso distinto de CLL-1. En realizaciones de la divulgación, el antígeno canceroso distinto de CLL-1 se expresa en una célula que también expresa CLL-1. En realizaciones de la divulgación, el antígeno canceroso distinto de CLL-1 se expresa en una leucemia mieloide aguda (AML), p. ej., es un antígeno de células AML. En realizaciones de la divulgación, el antígeno canceroso se selecciona del grupo que consiste en CD123, CD33, CD34, FLT3 y receptor beta de folato.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a moléculas multiespecíficas, p. ej., moléculas multiespecíficas anti-CLL-1, incluidas las descritas en cada uno de los aspectos o realizaciones precedentes, que incluyen un segundo dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno de célula efectora inmune. En realizaciones de la divulgación, el antígeno de la célula efectora inmunitaria es un antígeno expresado en una célula NK, p. ej., es CD16 (Receptor Fc gamma III) o CD64 (Receptor Fc gamma I). En otras realizaciones de la divulgación, el antígeno de la célula efectora inmunitaria es un antígeno expresado en una célula T, p. ej., es una molécula coestimuladora inmunitaria, por ejemplo, se selecciona del grupo que consiste en una molécula de MHC clase I, una proteína receptora de TNF, una proteína similar a la inmunoglobulina, un receptor de citoquina, una integrina, una molécula de activación linfocítica de señalización (proteína SLAM), un receptor de células NK activante, BTLA, receptor del ligando Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD47, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), TLR7, LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a y un ligando que se une específicamente con CD83. En otras realizaciones de la divulgación, el antígeno de la célula efectora inmunitaria es un antígeno expresado en una célula T, p. ej., es una molécula inhibidora inmunitaria, p. ej., se selecciona del grupo que consiste en PD1, PD-L1, PD-L2, Ct l A4, TIM3, CEACAM (p. ej., CEACAM-1, CEACAM-3 y/o CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC clase I, MHC clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta.
En realizaciones de acuerdo con la invención, el antígeno de la célula efectora inmunitaria es un antígeno expresado en una célula T es CD3. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 incluye una región determinante de la complementariedad 1 de cadena pesada (HC CDR1), una región determinante de la complementariedad 2 de cadena pesada (HC CDR2) y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena pesada (HC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos VH del dominio de unión anti-CD3 enumerada en la Tabla 26. En realizaciones de la divulgación, dicho dominio de unión anti-CD3 comprende, además, una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (LC CDR1), una región determinante de la complementariedad 2 de cadena ligera (LC CDR2) y una región determinante de la complementariedad 3 de cadena ligera (LC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos UL del dominio de unión anti-CD3 enumerada en la Tabla 26.
En realizaciones de la divulgación, dichas LC CDR1, LC CDR2 y LC CDR3 son las secuencias de LC CDR de cualquier dominio de unión anti-CD3 enumerado en la Tabla 27, 28 o 29. En realizaciones de la divulgación, dichas HC c DR1, HC CDR2 y HC CDR3 son las secuencias de HC CDR de cualquier dominio de unión anti-CD3 enumerado en la Tabla 27, 28 o 29.
En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 incluye:
(i) la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera enumerada en la Tabla 26;
(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones variables de cadena ligera proporcionadas en la Tabla 26; o
(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad del 95-99% con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones variables de cadena ligera proporcionadas en la Tabla 26.
En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 incluye:
(i) la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada enumerada en la Tabla 26;
(ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones variables de cadena pesada proporcionadas en la Tabla 26; o
(iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad del 95-99% con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones variables de cadena pesada proporcionadas en la Tabla 26.
En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 incluye la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera enumerada en la Tabla 26, y la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada enumerada en la Tabla 26. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 incluye la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena ligera y la secuencia de aminoácidos de cualquier región variable de cadena pesada de cualquier dominio de unión anti-CD3 enumerado en la Tabla 26. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 incluye una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1200, 1202, 1204, 1206, 1208, 1210, 1212, 1214, 1216, 1218, 1220, 1222, 1224, 1226, 1228, 1230, 1232, 1234, y 1236; y una secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1201, 1203, 1205, 1207, 1209, 1211, 1213, 1215, 1217, 1219, 1221, 1223, 1225, 1227, 1229, 1231, 1233, 1235, y 1237.
En un aspecto, que incluye cualquiera de los aspectos o realizaciones precedentes, la molécula multiespecífica es multivalente, p. ej., bivalente, con respecto al primer dominio de unión a antígeno o al segundo dominio de unión a antígeno. En realizaciones, la molécula multiespecífica es bivalente con respecto al dominio de unión anti-CLL-1. En realizaciones, los dos o más dominios de unión anti-CLL-1 se unen al mismo epítopo de CLL-1, p. ej., Incluyen el mismo dominio de unión anti-CLL-1 (p. ej., las mismas CDRs, las mismas VH y VL o las mismas secuencias scFv). En realizaciones, los dos o más dominios de unión anti-CLL-1 se unen a diferentes epítopos de CLL-1.
La divulgación proporciona moléculas multiespecíficas en una diversidad de formatos. En un aspecto, la divulgación proporciona la molécula multiespecífica de cualquiera de las realizaciones precedentes como un anticuerpo biespecífico. En un aspecto, la divulgación proporciona la molécula multiespecífica de cualquiera de las realizaciones precedentes como un cuerpo dual. En un aspecto, la divulgación proporciona la molécula multiespecífica de cualquiera de las realizaciones precedentes como un scFv-Fc. En un aspecto, la divulgación proporciona la molécula multiespecífica de cualquiera de las realizaciones precedentes como una molécula multiespecífica de cadena mixta. En un aspecto, la divulgación proporciona la molécula multiespecífica de cualquiera de las realizaciones precedentes como un scFv en tándem. Cada uno de estos formatos se describe con más detalle más adelante.
La divulgación proporciona, además, moléculas biespecíficas de cualquiera de las realizaciones precedentes.
En realizaciones, que incluyen cualquiera de los aspectos y realizaciones precedentes que incluyen uno o más dominios constantes de cadena pesada, el dominio constante de cadena pesada puede seleccionarse de SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 504 y SEQ ID NO: 505. En una realización preferida, los dominios de unión a antígeno de la molécula multiespecífica son scFvs, y el primer dominio constante de cadena pesada incluye, p. ej., SEQ ID NO: 500, y el segundo dominio constante de cadena pesada incluye, p. ej., es SEQ ID NO: 501. En otra realización preferida, los dominios de unión a antígeno son Fabs, y el primer dominio constante de cadena pesada comprende, p. ej., SEQ ID NO: 504, y el primer dominio constante de cadena ligera comprende, p. ej., es SEQ ID NO: 502, y el segundo dominio constante de cadena pesada comprende, p. ej., es SEQ ID NO: 505, y el primer dominio constante de cadena ligera comprende, p. ej., es SEQ ID NO: 503.
En una realización, la invención se refiere a moléculas multiespecíficas, incluidas de cualquiera de las realizaciones precedentes de la invención, que incluyen, además, dominios CH3 y, opcionalmente, CH2. En un aspecto, que incluye en cualquiera de las realizaciones y aspectos precedentes, el polipéptido o los polipéptidos de las moléculas multiespecíficas que incluyen las secuencias de HC CDR del primer y/o segundo dominio de unión al antígeno incluyen, además, un dominio CH3 y, opcionalmente, un dominio CH2. La divulgación proporciona, además, moléculas multiespecíficas, incluidas de cualquiera de las realizaciones precedentes, en donde al menos uno, p. ej., ambos, de dichos dominios CH3 incluyen una o más modificaciones para potenciar la heterodimerización, p. ej., como se describe en esta memoria.
En un aspecto de la invención, la molécula multiespecífica que incluye una o más modificaciones para potenciar la heterodimerización incluye la introducción de un botón en un primer dominio CH3 y un agujero en un segundo dominio CH3, o viceversa, de modo que la heterodimerización del polipéptido que incluye el primer dominio CH3 y el polipéptido que incluye el segundo dominio CH3 se ven favorecidos con respecto a los polipéptidos que incluyen solo dominios CH3 no modificados.
En realizaciones, el botón o el agujero se introduce en el primer dominio CH3 en el residuo 366, 405 o 407 de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)) para crear un botón o un agujero, y se introduce un agujero o botón complementario en el segundo dominio CH3 en el residuo 407 si el residuo 366 está mutado en el primer dominio CH3, residuo 394 si el residuo 405 está mutado en el primer dominio CH3, o residuo 366 si el residuo 407 está mutado en el primer dominio CH3, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)).
En realizaciones, el primer dominio CH3 incluye la introducción de un botón en la posición 366, y el segundo dominio CH3 incluye la introducción de un agujero en la posición 366, la posición 368 y la posición 407, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)), o viceversa.
En realizaciones, el primer dominio CH3 incluye una tirosina o triptófano en la posición 366, y el segundo dominio CH3 incluye una serina en la posición 366, alanina en la posición 368 y valina en la posición 407, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)), o viceversa.
En otro aspecto, la una o más modificaciones para potenciar la heterodimerización incluyen modificaciones de heterodimerización de IgG. En realizaciones, el primer dominio CH3 incluye la mutación K409R y el segundo dominio CH3 incluye la mutación F405L, o viceversa.
En otro aspecto, la una o más modificaciones para potenciar la heterodimerización incluyen modificaciones de puentes polares. En realizaciones, dicha una o más modificaciones incluyen modificaciones al primer dominio CH3 que se seleccionan de un grupo que consiste en: S364L, T366V, L368Q, D399K, F405S, K409F, T411K y combinaciones de las mismas. En realizaciones, incluidas aquellas que incluyen mutaciones del primer dominio CH3, el segundo dominio CH3 puede incluir una o más modificaciones que se seleccionan del grupo que consiste en Y407F, K409Q y T411D, y combinaciones de las mismas.
En otro aspecto, la molécula multiespecífica de cualquiera de los aspectos o realizaciones precedentes puede incluir, además, un primer dominio CH3 que incluye una cisteína capaz de formar un enlace disulfuro con una cisteína del segundo dominio CH3. En realizaciones, el primer dominio c H3 incluye una cisteína en la posición 354 y el segundo dominio CH3 incluye una cisteína en la posición 349, o viceversa.
En otro aspecto, la molécula multiespecífica de cualquiera de los aspectos o realizaciones precedentes puede incluir además (o alternativamente) un dominio constante que comprende una o más mutaciones para reducir, p. ej., el silencio, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En una realización, la una o más mutaciones para reducir, p. ej., silenciar ADCC y/o CDC incluyen, p. ej., las mutaciones DAPA (p. ej., D265A y P329A, de acuerdo con la numeración de la UE). En una realización, la una o más mutaciones para reducir, p. ej., silenciar ADCC y/o CDC incluyen, p. ej., las mutaciones LALA (p. ej., L234A y L235A, de acuerdo con la numeración de la UE). En una realización, la una o más mutaciones para reducir, p. ej., silenciar ADCC y/o CDC incluyen, p. ej., es N279A, de acuerdo con la numeración de la UE. También se pueden incluir dominios constantes que comprenden combinaciones de cualquiera de los anteriores.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un ácido nucleico aislado, p. ej., uno o más polinucleótidos, que codifican la molécula multiespecífica de cualquiera de los aspectos o realizaciones precedentes. En realizaciones, el ácido nucleico aislado se dispone en un único polinucleótido continuo. En otras realizaciones, el polinucleótido aislado se dispone en dos o más polinucleótidos continuos.
En realizaciones, el ácido nucleico incluye una secuencia que codifica un dominio de unión anti-CD3. En realizaciones de la invención, que incluyen cualquiera de los aspectos de ácidos nucleicos y realizaciones de la invención mencionados anteriormente, el ácido nucleico incluye SEQ ID NO: 508 y SEQ ID NO: 509.
En realizaciones de la invención, que incluyen cualquiera de los aspectos de ácidos nucleicos y realizaciones de la invención mencionados anteriormente, el ácido nucleico aislado incluye SEQ ID NO: 510.
En realizaciones de la invención, que incluyen cualquiera de los aspectos de ácidos nucleicos y realizaciones de la invención mencionados anteriormente, el ácido nucleico aislado incluye SEQ ID NO: 511.
En realizaciones de la invención, el ácido nucleico incluye una secuencia que codifica un dominio de unión anti-CLL-1 tal como se define en las reivindicaciones. En realizaciones, que incluyen cualquiera de los aspectos de ácidos nucleicos y realizaciones de la invención mencionados anteriormente, el ácido nucleico aislado incluye:
a) SEQ ID NO: 513 y SEQ ID NO: 514;
b) SEQ ID NO: 518 y SEQ ID NO: 519;
c) SEQ ID NO: 523 y SEQ ID NO: 524;
d) SEQ ID NO: 528 y SEQ ID NO: 529;
e) SEQ ID NO: 533 y SEQ ID NO: 534;
f) SEQ ID NO: 538 y SEQ ID NO: 539;
g) SEQ ID NO: 543 y SEQ ID NO: 544;
h) SEQ ID NO: 548 y SEQ ID NO: 549; o
i) SEQ ID NO: 553 y SEQ ID NO: 554.
En realizaciones de la invención, que incluyen cualquiera de los aspectos de ácidos nucleicos y realizaciones de la invención mencionados anteriormente, el ácido nucleico aislado incluye:
a) SEQ ID NO: 515;
b) SEQ ID NO: 520;
c) SEQ ID NO: 525;
d) SEQ ID NO: 530;
e) SEQ ID NO: 535;
f) SEQ ID NO: 540;
g) SEQ ID NO: 545;
h) SEQ ID NO: 550; o
i) SEQ ID NO: 555.
En realizaciones de la invención, que incluyen cualquiera de los aspectos de ácidos nucleicos y realizaciones de la invención mencionados anteriormente, el ácido nucleico aislado incluye:
a) SEQ ID NO: 516;
b) SEQ ID NO: 521;
c) SEQ ID NO: 526;
d) SEQ ID NO: 531;
e) SEQ ID NO: 536;
f) SEQ ID NO: 541;
g) SEQ ID NO: 546;
h) SEQ ID NO: 551; o
i) SEQ ID NO: 556.
En realizaciones, el ácido nucleico aislado incluye una secuencia que codifica un dominio de unión anti-CD3, por ejemplo, como se describe en esta memoria, y una secuencia que codifica un dominio de unión anti-CLL-1, por ejemplo, como se describe en esta memoria. En realizaciones, la secuencia que codifica el dominio de unión anti-CD3 y la secuencia que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 se disponen en polinucleótidos separados. En realizaciones, la secuencia que codifica el dominio de unión anti-CD3 y la secuencia que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 están dispuestas en un único polinucleótido.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un vector, p. ej., uno o más vectores, que incluye el ácido nucleico aislado arriba descrito.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una célula que incluye el ácido nucleico o vector aislado arriba descrito.
En otro aspecto, la divulgación proporciona métodos de tratamiento. En un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad asociada con la expresión de CLL-1 que incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz de una molécula multiespecífica de cualquiera de los aspectos o realizaciones precedentes, el ácido nucleico aislado descrito en esta memoria, el vector descrito en esta memoria o la célula descrita en esta memoria.
En realizaciones, la enfermedad asociada con la expresión de CLL-1 es:
(i) un cáncer o una neoplasia, o una afección precancerosa elegida de una o más de una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia, o
(ii) una indicación no relacionada con el cáncer asociada con la expresión de CLL-1.
En realizaciones, la enfermedad es un cáncer hematológico. En realizaciones, la enfermedad es leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda de células B (leucemia linfoide aguda de células B, BALL), leucemia linfoblástica aguda de células T (leucemia linfoide aguda de células T (TALL), leucemia prolinfocítica de células B, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica (CML), síndrome mielodisplásico, mieloma de células plasmáticas, o una combinación de los mismos. En realizaciones, la enfermedad es leucemia mieloide aguda (AML).
En otro aspecto, la divulgación proporciona el uso de la molécula multiespecífica de cualquiera de los aspectos o realizaciones precedentes, el ácido nucleico aislado arriba descrito, el vector arriba descrito o la célula arriba descrita, en la fabricación de un medicamento.
En otro aspecto, la invención se refiere a la molécula multiespecífica tal como se define en las reivindicaciones, para uso como un medicamento.
En otro aspecto, la invención se refiere a la molécula multiespecífica tal como se define en las reivindicaciones, para uso en una terapia.
En otro aspecto, la invención se refiere a la molécula multiespecífica tal como se define en las reivindicaciones, para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer hematológico.
En otro aspecto, la invención se refiere a la molécula multiespecífica tal como se define en las reivindicaciones, para uso en el tratamiento de un sujeto que padece leucemia mieloide aguda (AML).
En otro aspecto, la invención se refiere a composiciones que incluyen la molécula multiespecífica como se define en las reivindicaciones. En realizaciones, la composición es una composición farmacéutica. En realizaciones, las composiciones pueden incluir además, un diluyente o soporte farmacéuticamente aceptable. En realizaciones, las composiciones incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula multiespecífica como se define en las reivindicaciones.
A menos que se defina lo contrario, todas las expresiones y los términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Los títulos, sub-títulos o elementos numerados o con letras, p. ej., (a), (b), (i), etc., se presentan simplemente para facilitar la lectura. El uso de títulos o elementos numerados o con letras en este documento no requiere que las etapas o elementos se realicen en orden alfabético o que las etapas o elementos sean necesariamente discretos uno de otro.
Breve Descripción de los Dibujos
La FIG. 1 muestra diversos formatos ilustrativos para moléculas multiespecíficas, p. ej., biespecíficas, que incorporan un dominio de unión anti- CLL-1, p. ej., un dominio de unión anti-CLL-1 humano o humanizado.
La FIG. 2 muestra la muerte de células T in vitro de la línea de células cancerosas HL60 que expresa CLL1 con anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL1.
La FIG. 3 Muestra la activación de células T mediada por anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL1 in vitro mediante acoplamiento con la línea celular U937 de cáncer que expresa CLL1, como se demuestra mediante un gen informador de luciferasa NFAT en la línea de células T humanas Jurkat.
Descripción Detallada de la Invención
Definiciones
Con el fin de que la presente invención se entienda más fácilmente, primero se definen determinados términos y expresiones. A lo largo de la descripción detallada se recogen definiciones adicionales. A menos que se defina lo contrario, todas las expresiones y los términos técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el que entienden comúnmente los expertos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención.
El término "anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un polipéptido (o conjunto de polipéptidos) de la familia de las inmunoglobulinas que es capaz de unirse a un antígeno de forma no covalente, reversible y específica. Por ejemplo, un "anticuerpo" que se produce de forma natural del tipo IgG es un tetrámero que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada una de las cadenas pesadas está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en esta memoria como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada una de las cadenas ligeras está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en esta memoria como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse, además, en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada una de las VH y VL está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno, al que a veces se alude en esta memoria como dominio de unión al antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluidas diversas células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. El término "anticuerpo" incluye, pero no se limita a anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, p. ej., anticuerpos anti- Id contra anticuerpos de la invención). Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo/clase (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) o subclase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2).
Tanto la cadena ligera como la pesada se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se utilizan funcionalmente. A este respecto, se apreciará que los dominios variables de las porciones tanto de la cadena ligera (VL) como la pesada (VH) determinan el reconocimiento y la especificidad del antígeno. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren importantes propiedades biológicas, tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión al receptor Fc, unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se vuelven más distales del sitio de unión al antígeno o del extremo amino del anticuerpo. El extremo N es una región variable y en el C-terminal está una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden realmente el extremo carboxi de la cadena pesada y ligera, respectivamente.
La expresión "fragmento de anticuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una o más porciones de un anticuerpo. En algunas realizaciones, estas porciones son parte del dominio o los dominios de contacto de un anticuerpo. En algunas otras realizaciones, estas porciones son fragmentos de unión a antígeno que conservan la capacidad de unión a un antígeno de forma no covalente, reversible y específica, algunas veces denominada en esta memoria como dominio de unión a antígeno. Ejemplos de fragmentos de unión incluyen, pero no se limitan a Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.
Los fragmentos de anticuerpos también se pueden incorporar en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, p. ej., Hollinger y Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23: 1126-1136). Fragmentos de anticuerpos pueden injertarse en armazones basados en polipéptidos tales como Fibronectina tipo III (Fn3) (véase la Pat. De EE.u U. N° 6.703.199, que describe monocuerpos polipeptídicos de fibronectina).
Los fragmentos de anticuerpos se pueden incorporar en moléculas de cadena sencilla que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (por ejemplo, VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios (por ejemplo, VL-VC-VL-VC), forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062; y Pat. de EE.UU. N° 5.641.870).
La expresión "medio anticuerpo" se refiere a una porción de una molécula de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, molécula similar a anticuerpo o molécula multiespecífica que comprende un único dominio de unión a antígeno. En una realización, un medio anticuerpo se refiere a un par de cadenas ligeras y pesadas de, por ejemplo, un anticuerpo IgG. En una realización, un medio anticuerpo se refiere a un polipéptido que comprende un dominio VL y un dominio CL, y un segundo polipéptido que comprende un dominio VH, un dominio CH1, un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, en donde dichos dominios VL y VH comprenden un dominio de unión a antígeno. En otra realización, un medio anticuerpo se refiere a un polipéptido que comprende un dominio scFv, un dominio CH2 y un dominio CH3. En algunas realizaciones de moléculas multiespecíficas, un primer medio anticuerpo se asociará, p. ej., heterodimerizará, con una segunda medio anticuerpo. En algunas moléculas multiespecíficas, un primer medio anticuerpo se enlazará a un segunda medio anticuerpo. En algunas moléculas multiespecíficas, un primer medio anticuerpo, un segundo medio anticuerpo o tanto un primer como un segundo medio anticuerpo pueden comprender un dominio de unión al antígeno adicional.
La expresión "molécula similar a un anticuerpo" se refiere a una molécula que comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo.
Las expresiones "región determinante de la complementariedad " o "CDR ", tal como se usa en esta memoria, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables de anticuerpos que confieren especificidad y afinidad de unión a antígeno. Por ejemplo, en general, hay tres CDRs en cada una de las regiones variables de cadena pesada (p. ej., HCDR1, HCDR2 y HCDR3) y tres CDRs en cada una de las regiones variables de cadena ligera (LCDR1, lCd R2 y LCDR3). Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada se pueden determinar utilizando cualquiera de un cierto número de esquemas bien conocidos, incluidos los descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración de "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeración de "Chothia"), o una combinación de los mismos. Bajo el esquema de numeración de Kabat, en algunas realizaciones, los residuos de aminoácidos de CDR en el dominio variable de cadena pesada (VH) se numeran 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos de CDR en el dominio variable de cadena ligera (v L) se numeran 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3). Bajo el esquema de numeración de Chothia, en algunas realizaciones, los aminoácidos de la CDR en el VH se numeran 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3); y los residuos de aminoácidos de la CDR en el VL se numeran 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDr2) y 91-96 (LCDR3). En un esquema de numeración combinado de Kabat y Chothia, en algunas realizaciones, las CDRs corresponden a los residuos de aminoácidos que forman parte de una CDR de Kabat, una CDR de Chothia o ambas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las CDRs corresponden a los residuos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3) en un VH humano, p. ej., un VH de mamífero, p. ej., un VH humano; y residuos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (Lc DR3) en VL humano, p. ej., un VL de mamífero, p. ej., un VL humano.
La expresión "Fv de cadena sencilla" o "scFv", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios Vh y Vl del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. Preferiblemente, el polipéptido Fv comprende, además, un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de scFv, véase Plückthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (1994) Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315.
El término "diacuerpo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Al utilizar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Diacuerpos se describen con más detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
La expresión "molécula monoespecífica", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una molécula que se une a un epítopo sobre un antígeno diana. En algunas realizaciones, una molécula monoespecífica de la presente invención es una molécula monoespecífica similar a un anticuerpo. En algunas realizaciones, una molécula monoespecífica de la presente invención es un anticuerpo monoespecífico.
Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "CLL1" y "CLL1" se utilizan indistintamente, y se refieren a molécula 1 similar a lectina de tipo C, que es un determinante antigénico detectable en células precursoras de leucemia y en las células inmunitarias normales. Molécula 1 similar a lectina de tipo C (CLL-1) también se conoce como MICL, CLEC12A, CLEC-1, Lectina 1 Asociada a Células Dendríticas y DCAL-2. Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos humanas y murinas se pueden encontrar en una base de datos pública, tal como GenBank, UniProt y Swiss-Prot. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de CLL-1 humana se puede encontrar como UniProt/Swiss-Prot N° de Acceso Q5QGZ9 y la secuencia de nucleótidos que codifica la CLL-1 humana se puede encontrar en los N°s de Acceso NM 001207010.1, NM 138337.5, NM 201623.3 y NM 201625.1. En una realización, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo o molécula similar a anticuerpo biespecífico, comprende al menos uno, p. ej., Un dominio de unión anti-CLL-1 y se une a un epítopo dentro del dominio extracelular de la proteína CLL- 1 o un fragmento de la misma. En una realización, la proteína CLL-1 se expresa en una célula cancerosa.
Los términos "CD3" o "CD-3", como se utilizan indistintamente en esta memoria, se refieren al racimo de diferenciación 3 co-receptor (o complejo de co-receptor, o de la cadena polipeptídica del complejo de co-receptor) del receptor de células T. La secuencia de aminoácidos de las cadenas polipeptídicas de CD3 humano se proporciona en NCBI Acceso P04234, P07766 y P09693. Las proteínas CD3 también pueden incluir variantes. Las proteínas CD3 también pueden incluir fragmentos. Las proteínas CD3 también incluyen modificaciones postraduccionales de las secuencias de aminoácidos de CD3. Las modificaciones postraduccionales incluyen, pero no se limitan a glicosilación ligada a N y O.
La expresión "molécula biespecífica", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una molécula que se une a dos epítopos diferentes en un antígeno (a los que también se alude en esta memoria como "biparatópicos") o dos antígenos diferentes. En algunas realizaciones, una molécula biespecífica de la presente invención es una molécula biespecífica similar a un anticuerpo. En algunas realizaciones, una molécula biespecífica de la presente invención es un anticuerpo biespecífico. En algunas realizaciones, la molécula biespecífica de la presente invención no es biparatrópica.
La expresión "molécula multiespecífica", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una molécula que se une a dos o más epítopos diferentes en un antígeno (a los que también se alude en esta memoria como "multiparatópicos") o en dos o más antígenos diferentes. El reconocimiento de cada uno de los antígenos se logra generalmente con un "dominio de unión a antígeno". En algunas realizaciones, una molécula multiespecífica de la presente invención es una molécula multiespecífica similar a un anticuerpo. En algunas realizaciones, una molécula multiespecífica de la presente invención es un anticuerpo multiespecífico. En algunas realizaciones, la molécula biespecífica de la presente invención no es multiparatrópica. El término "multiespecífico" incluye "biespecífico". En algunos aspectos, las moléculas multiespecíficas consisten en una cadena polipeptídica que comprende una pluralidad, p. ej., dos o más, p. ej. o, dos dominios de unión a antígeno. En algunos aspectos, las moléculas multiespecíficas comprenden dos, tres, cuatro o más cadenas polipeptídicas que juntas comprenden una pluralidad, p. ej., dos o más, p. ej.o, dos dominios de unión a antígeno.
La expresión "un tándem de dominios VH (o VHs)", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una cadena de dominios VH, que consiste en múltiples números de dominios VH idénticos de un anticuerpo. Cada uno de los dominios VH, excepto el último al final del tándem, tiene su extremo C conectado al extremo N de otro dominio VH con o sin un enlazador. Un tándem tiene al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 50, o 100 dominios VH. El tándem de VH puede producirse uniendo los genes codificantes de cada uno de los dominios VH en un orden deseado utilizando métodos recombinantes con o sin un enlazador (p. ej., un enlazador sintético) que les permita fabricarse como una única proteína. En un aspecto, los dominios VH en el tándem, solos o en combinación con dominios VL del mismo anticuerpo, conservan la especificidad de unión del anticuerpo original. El extremo N del primer dominio VH en el tándem se define como el extremo N del tándem, mientras que el extremo C del último dominio VH en el tándem se define como el extremo C del tándem.
La expresión "un tándem de dominios VL (o VLs)", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una cadena de dominios VL, que consiste en múltiples números de dominios VL idénticos de un anticuerpo. Cada uno de los dominios VL, excepto el último al final del tándem, tiene su extremo C conectado al extremo N de otro dominio VH con o sin un enlazador. Un tándem tiene al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 50, o 100 dominios VL. El tándem de VL puede producirse uniendo los genes codificantes de cada uno de los dominios VL en un orden deseado utilizando métodos recombinantes con o sin un enlazador (p. ej., un enlazador sintético) que les permita fabricarse como una única proteína. Preferiblemente, los dominios VL en el tándem, solos o en combinación con dominios VH del mismo anticuerpo, conservan la especificidad de unión de los anticuerpos originales. El extremo N del primer dominio VL en el tándem se define como el extremo N del tándem, mientras que el extremo C del último dominio VL en el tándem se define como el extremo C del tándem.
La expresión "molécula monovalente", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una molécula que tiene un solo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, una molécula monovalente de la presente invención es una molécula monovalente similar a un anticuerpo. En algunas realizaciones, una molécula monovalente de la presente invención es un anticuerpo monovalente.
La expresión "molécula bivalente", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una molécula que tiene un solo dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, una molécula bivalente de la presente invención es una molécula bivalente similar a un anticuerpo. En algunas realizaciones, una molécula bivalente de la presente invención es un anticuerpo bivalente.
La expresión "molécula trivalente", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una molécula que tiene tres dominios de unión a antígeno. En algunas realizaciones, una molécula trivalente de la presente invención es una molécula trivalente similar a un anticuerpo. En algunas realizaciones, una molécula trivalente de la presente invención es un anticuerpo trivalente. En algunas realizaciones, una molécula trivalente puede consistir en dos dominios de unión a antígeno capaces de unirse al mismo epítopo del mismo antígeno y un tercer dominio de unión a antígeno que se une a un epítopo o antígeno distinto, p. ej., un antígeno distinto. Realizaciones de este tipo se consideran moléculas biespecíficas trivalentes.
La expresión "molécula tetravalente", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una molécula que tiene cuatro dominios de unión a antígeno. En algunas realizaciones, una molécula tetravalente de la presente invención es una molécula tetravalente similar a un anticuerpo. En algunas realizaciones, una molécula tetravalente de la presente invención es un anticuerpo tetravalente. En algunas realizaciones, una molécula tetravalente puede consistir en dos dominios de unión a antígeno capaces de unirse al mismo epítopo del mismo antígeno y dos dominios de unión a antígeno adicionales que se unen a un epítopo o antígeno distinto, p. ej., un antígeno distinto. Cuando dos dominios de unión a antígeno adicionales de este tipo se unen al mismo epítopo o antígeno, p. ej., al mismo antígeno distinto, dichas realizaciones se consideran moléculas biespecíficas tetravalentes. Cuando dos dominios de unión a antígeno adicionales de este tipo se unen a diferentes epítopos o antígenos, p. ej., a diferentes antígenos distintos, dichas realizaciones se consideran moléculas triespecíficas tetravalentes.
La expresión "molécula multivalente", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una molécula que tiene al menos dos sitios de unión a antígeno. En algunas realizaciones, una molécula multivalente de la presente invención es una molécula multivalente similar a un anticuerpo. En algunas realizaciones, una molécula multivalente de la presente invención es un anticuerpo multivalente. En algunas realizaciones, una molécula multivalente es una molécula bivalente, una molécula trivalente o una molécula tetravalente.
La expresión "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con una molécula similar a un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparador o molécula similar a un anticuerpo), de modo que un experto en la técnica consideraría que la diferencia entre los dos valores tiene poca o ninguna importancia biológica y/o estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (p. ej., valores de Tm o la cantidad de anticuerpos ensamblados). La diferencia entre dichos dos valores es preferiblemente menos de aproximadamente 50%, preferiblemente menos de aproximadamente 40%, preferiblemente menos de aproximadamente 30%, preferiblemente menos de aproximadamente 20%, preferiblemente menos de aproximadamente 10% en función del valor para el anticuerpo de referencia/comparador.
La expresión "sustancialmente el mismo rendimiento", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la cantidad de una molécula ensamblada (p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo) de la presente invención es sustancialmente la misma que la de los anticuerpos de los que se deriva cuando se prepara en condiciones similares en tipos de células similares. Los rendimientos relativos de anticuerpos o productos similares a anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos estándares que incluyen densitometría de barrido de geles SDS-PAGE y/o inmunotransferencias y el ensayo AME5-RP.
El término " termoestabilidad ", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la capacidad de una proteína (p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo) para conservar la propiedad característica cuando se calienta moderadamente. Cuando se exponen al calor, las proteínas experimentarán un proceso de desnaturalización/desplegado y expondrán residuos hidrofóbicos. Una proteína se desdobla completamente en respuesta al calor a una temperatura característica. La temperatura en el punto medio del proceso de despliegue de la proteína se define como Tm, que es una característica física importante de una proteína, y se puede medir con las técnicas conocidas en la técnica, tal como monitorizando el proceso de desnaturalización utilizando colorante naranja Sypro, marcando residuos hidrofóbicos de proteínas desnaturalizadas o utilizando técnicas de calorimetría diferencial de barrido (DSC).
El término "epítopo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a cualquier determinante capaz de unirse con alta afinidad a un anticuerpo o a una molécula similar a un anticuerpo. Un epítopo es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo (o una molécula similar a un anticuerpo) que fija específicamente como objetivo a ese antígeno, y cuando el antígeno es una proteína, incluye aminoácidos específicos que contactan directamente con el anticuerpo o la molécula similar a un anticuerpo. Muy a menudo, los epítopos residen en proteínas, pero en algunos casos, pueden residir en otros tipos de moléculas, tales como ácidos nucleicos. Los determinantes de epítopo pueden incluir agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.
Generalmente, los anticuerpos o moléculas similares a un anticuerpo, específicos para un antígeno diana particular, reconocerán preferentemente un epítopo en el antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.
Regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo pueden identificarse utilizando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, p. ej., sintetizando simultáneamente un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a porciones de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos todavía están fijados a los soportes. Técnicas de este tipo son conocidas en la técnica y se describen, p. ej., en la Patente de EE.Uu . N° 4.708.87l; Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos, tal como, p. ej., mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional Véase, p. ej., Epitope Mapping Protocols, supra. Regiones antigénicas de proteínas también pueden identificarse utilizando gráficos estándares de antigenicidad e hidropatía, tales como los calculados utilizando, p. ej., el programa de software Omiga versión 1.0 disponible de Oxford Molecular Group. Este programa informático emplea el método Hopp/Woods, Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828; para determinar perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., (1982) J.Mol. Biol. 157:105-132; para gráficas de hidropatía.
La unión específica entre dos entidades significa una unión con una constante de equilibrio (Ka ) (kon/koff) de al menos 102M_1, al menos 5x102M_1, al menos 103M_1, al menos 5x103M_1, al menos 104M_1 al menos 5x104M_1, al menos 105M' 1, al menos 5x105M' 1, al menos 106M_1, al menos 5x106M' 1, al menos 107M_1, al menos 5x107M' 1, al menos 108M_1, al menos 5x108M' 1, al menos 109M_1, al menos 5x109M' 1, al menos 1010M' 1, al menos 5x1010M' 1, al menos 1011M-1, al menos 5x1011M' 1, al menos 1012M' 1, al menos 5x1012M' 1, al menos 1013M' 1, al menos 5x1013 M-1, al menos 1014M' 1, al menos 5x1014M' 1, al menos 1015M' 1 o al menos 5x1015M' 1.
La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un antígeno o un epítopo se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de un antígeno afín o un epítopo en una población heterogénea de proteínas y otros agentes biológicos. Además de la constante de equilibrio (Ka ) indicada anteriormente, un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo de la invención tiene típicamente también una constante de velocidad de disociación (Kd ) (koff/kon) de menos de 5x10' 2M, menos de 10' 2M, menos de 5x10' 3M, menos de 10' 3M, menos de 5x10' 4M, menos de 10-4M, menos de 5x10' 5M, menos de 10' 5M, menos de 5x10' 6M, menos de 10' 6M, menos de 5x10' 7M, menos de 10-7M, menos de 5x10' 8M, menos de 10' 8M, menos de 5x10' 9M, menos de 10' 9M, menos de 5x10' 10M, menos de 10' 10M, menos de 5x10' 11M, menos de 10' 11M, menos de 5x10' 12M, menos de 10' 12M, menos de 5x10' 13M, menos de 10' 13M, menos de 5x10' 14M, menos de 10' 14M, menos de 5x10' 15M o menos de 10' 15M o inferior, y se une al antígeno diana con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por unirse a un antígeno no específico (p. ej., HSA).
La expresión "una molécula (p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo) que reconoce un antígeno (o un epítopo)" y "una molécula específica para un antígeno (o un epítopo)" se utiliza de manera indistinta en esta memoria con la expresión "una molécula que se une específicamente a un antígeno (o un epítopo)". En una realización, la molécula (p. ej., anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo) o fragmento del mismo tiene constante de disociación (Kd) de menos de 3000 pM, menos de 2500 pM, menos de 2000 pM, menos de 1500 pM, menos de 1000 pM, menos de 750 pM, menos de 500 pM, menos de 250 pM, menos de 200 pM, menos de 150 pM, menos de 100 pM, menos de 75 pM, menos de 10 pM, menos de 1 pM según se evalúa utilizando un método descrito en esta memoria o conocido por un experto en la técnica (p. ej., un ensayo BIAcore, ELISA, FACS, SET) (Biacore International AB, Uppsala, Suecia). El término "Kasoc" o "Ka", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kdis" o "Kd ," tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "Kd", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la relación de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de Kd para anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Un método para determinar la Kd de un anticuerpo es utilizando la resonancia de plasmón superficial, o utilizando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore® .
La expresión "especificidades de unión múltiple", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a que una molécula de la presente invención (p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo) es capaz de unirse específicamente al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez epítopos diferentes sobre el mismo antígeno o sobre al menos dos, tres, cuatro, cinco, siete, ocho, nueve o diez antígenos diferentes.
La expresión "especificidades de unión dual", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a que una molécula de la presente invención (p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo) es capaz de unirse a dos epítopos diferentes sobre el mismo antígeno o sobre dos antígenos diferentes.
La expresión "anticuerpo aislado" o "molécula similar a un anticuerpo aislada", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos o moléculas similares a un anticuerpo que tienen diferentes especificidades antigénicas. Además, un anticuerpo aislado o una molécula similar a un anticuerpo aislada puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.
La expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a polipéptidos, incluidos anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, moléculas, etc. que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica o se derivan de la misma fuente genética. Esta expresión también incluye preparaciones de moléculas de anticuerpos de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular.
La expresión formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor están reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia lo de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para obtener más detalles, véase Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988) ; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véanse también los siguientes artículos de revisión y las referencias citadas en los mismos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
La expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en esta memoria, incluye anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto la región marco como la región CDR se derivan de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias humanas de este tipo, p. ej., secuencias de la línea germinal humana o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana o anticuerpos que contienen secuencias marco consenso derivadas del análisis de secuencias marco humanas, por ejemplo, tal como se describe en Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57 - 86). Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina, p. ej., CDR, pueden definirse utilizando esquemas de numeración bien conocidos, p. ej., el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chothia o una combinación de Kabat y Chothia (véase, p. ej., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos (1991), eds. Kabat et al.; Al Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edic., Publicación NIH n° 91-3242 Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; y Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948.
Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo, o una sustitución conservadora para fomentar la estabilidad o la fabricación). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en esta memoria, no pretende incluir anticuerpos en los que se hayan injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias marco humanas.
Una "modificación" o "mutación" de un residuo/posición de aminoácido, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un cambio de una secuencia de aminoácidos primaria en comparación con una secuencia de aminoácidos de partida, en donde el cambio resulta de una alteración de la secuencia que implica dicho residuo/posiciones de aminoácido. Por ejemplo, modificaciones típicas incluyen la sustitución del residuo (o en dicha posición) con otro aminoácido (p. ej., una sustitución conservadora o no conservadora), la inserción de uno o más aminoácidos adyacentes a dicho residuo/posición y la deleción de dicho residuo/posición. Una "sustitución de aminoácidos", o una variación de la misma, se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada (de partida) con un residuo de aminoácido diferente. General y preferiblemente, la modificación da como resultado la alteración de al menos una actividad fisico-bioquímica del polipéptido variante en comparación con un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de partida (o de "tipo salvaje"). Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, una actividad fisico-bioquímica que se altera puede ser la afinidad de unión, la capacidad de unión y/o el efecto de unión sobre una molécula diana.
La expresión "variante modificada de forma conservadora" se aplica tanto a las secuencias de aminoácidos como a las de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, variantes modificadas de forma conservadora se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en que el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifica cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por lo tanto, en cada una de las posiciones en las que una alanina se especifica mediante un codón, el codón se puede alterar en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Variaciones de ácido nucleico de este tipo son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de manera conservadora. Cada una de las secuencias de ácidos nucleicos de esta memoria que codifica un polipéptido también describe cada una de las posibles variaciones silenciosas del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada uno de los codones en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que normalmente es el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada una de las variaciones silenciosas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada una de las secuencias descritas.
Para secuencias de polipéptidos, las "variantes modificadas de forma conservadora" incluyen sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia polipeptídica que dan como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Variantes modificadas de manera conservadora de este tipo se suman y no excluyen variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, p. ej, Creighton, Proteins (1984)). En algunas realizaciones, la expresión "modificaciones de secuencia conservativas" se utiliza para referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo o la molécula similar a un anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.
Las expresiones "porcentaje idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de identidad en una región específica o, cuando no se especifica, en toda la secuencia), cuando se compara y alinea para obtener la máxima correspondencia en una ventana de comparación, o región designada tal como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineamiento manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad existe a lo largo de una región que tiene al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente a lo largo de una región que tiene 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más amino ácidos) de longitud.
Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en una computadora, se designan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar parámetros de programa por defecto o se pueden designar parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidades de secuencia para las secuencias de ensayo en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
La expresión "ventana de comparación", tal como se utiliza en esta memoria, incluye referencia a un segmento de una cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en 20 a 600, habitualmente de aproximadamente 50 a 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a 150, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias estén alineadas de manera óptima. Métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación se puede realizar, p. ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nat ' l. Acad. Sci. USA 85: 2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, p. ej., Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology).
Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res.
25:3389-3402; y Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una puntuación umbral T con valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. A T se la alude como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largos que las contengan. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las secuencias hasta donde se pueda aumentar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabra en cada una de las direcciones se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulativa cae en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores por defecto una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915) alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, p. ej., Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0,2, más preferiblemente menos de aproximadamente 0,01 y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 0,001.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Aparte del porcentaje de identidad de secuencia indicado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo de forma cruzada con los anticuerpos producidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, tal como se describe más adelante. Por lo tanto, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos se diferencian solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan entre sí en condiciones rigurosas tal como se describe más adelante. Aún otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que se pueden usar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.
La expresión "ácido nucleico" se utiliza en esta memoria de manera indistinta con el término "polmudeótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena sencilla o de doble cadena. La expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de la cadena principal modificados, que son sintéticos, se producen de forma natural y se producen de forma no natural, que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de una manera similar a la nucleótidos de referencia. Ejemplos de análogos de este tipo incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos péptido-nucleicos (PNAs).
A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas de manera conservadora de la misma (p. ej., sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, como se detalla más adelante, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081; Ohtsuka et al., (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; y Rossolini et al., (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98).
La expresión "enlazado operativamente" o enlazado funcionalmente, tal como se utiliza en esta memorias, se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de polinucleótidos (p. ej., ADN). Típicamente, se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de la transcripción a una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia de promotor o potenciador está operativamente enlazada a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula huésped apropiada u otro sistema de expresión. Generalmente, las secuencias reguladoras de la transcripción promotoras que están enlazadas operativamente a una secuencia transcrita son físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, actúan en cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, tales como los potenciadores, no necesitan ser físicamente contiguas o estar ubicadas muy próximas a las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en esta memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Las expresiones también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido que se produce de forma natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que se producen de forma natural y polímeros de aminoácidos que no se producen de forma natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia polipeptídica particular también abarca implícitamente variantes modificadas de forma conservadora de la misma.
La expresión "semivida in vivo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a la semivida de la molécula de interés 0 variantes de la misma que circulan en la sangre de un mamífero dado.
El término "sujeto" incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios y reptiles. Excepto cuando se indique, los términos "paciente" o "sujeto" se utilizan en esta memoria indistintamente.
El término "cáncer" se refiere a una enfermedad caracterizada por el crecimiento rápido y descontrolado de células aberrantes. Las células cancerosas pueden diseminarse localmente o a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático a otras partes del cuerpo. Ejemplos de diversos cánceres se describen en este memoria e incluyen, pero no se limitan a cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de piel, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de hígado, cáncer de cerebro, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón y similares. Cánceres preferidos tratados por los métodos descritos en esta memoria incluyen mieloma múltiple, linfoma Hodgkin o linfoma no Hodgkin.
Los términos "tumor" y "cáncer" se utilizan indistintamente en esta memoria, p. ej., ambos términos abarcan tumores sólidos y líquidos, p. ej., difusos o circulantes. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "cáncer" o "tumor" incluye cánceres y tumores premalignos, así como malignos.
Las expresiones " antígeno de cáncer, " "antígeno asociado a de cáncer " o "antígeno tumoral" se refieren indistintamente a una molécula (típicamente una proteína, un hidrato de carbono o lípido) que se expresa en la superficie de una célula cancerosa, ya sea totalmente o como un fragmento (p. ej., MHC/péptido), y que es útil para fijar preferentemente como objetivo un agente farmacológico a la célula cancerosa. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral es un marcador expresado tanto por células normales como por células cancerosas, p. ej., un marcador de linaje, p. ej., CD19 en células B. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular que se sobre-expresa en una célula cancerosa en comparación con una célula normal, por ejemplo, 1 vez la sobreexpresión, 2 veces la sobreexpresión, 3 veces la sobreexpresión o más en comparación con una célula normal. En algunos realizaciones, un antígeno tumoral es una molécula de la superficie celular que se sintetiza de forma inapropiada en la célula cancerosa, por ejemplo, una molécula que contiene deleciones, adiciones o mutaciones en comparación con la molécula expresada en una célula normal. En algunas realizaciones, un antígeno tumoral se expresará exclusivamente en la superficie celular de una célula cancerosa, en su totalidad o como un fragmento (p.
ej., MHC/péptido), y no se sintetizará o expresará en la superficie de una célula normal. En algunas realizaciones, las moléculas multiespecíficas de la presente invención incluyen moléculas multiespecíficas que comprenden un dominio de unión a antígeno (p. ej., anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a un péptido presentado por MHC. Normalmente, los péptidos derivados de proteínas endógenas llenan los bolsillos de las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y son reconocidos por receptores de células T (TCRs) en los linfocitos T CD8+. Los complejos MHC de clase I son expresados constitutivamente por todas las células nucleadas. En el cáncer, los complejos de péptido/MHC específicos para virus y/o específicos para tumores representan una clase única de dianas de la superficie celular para inmunoterapia. Se han descrito anticuerpos de tipo TCR que fijan como objetivo péptidos derivados de antígenos virales o tumorales en el contexto del antígeno leucocitario humano (HLA) -A1 o HLA-A2 (véase, p. ej., Sastry et al., J Virol. 2011 85(5):1935-1942; Sergeeva et al., Blood, 2011 117(16):4262-4272; Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165; Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21): 1601-1608; Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176): 176ra33; Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100). Por ejemplo, un anticuerpo similar a TCR se puede identificar a partir del rastreo de una colección, tal como una colección presentada en fagos scFv humanos.
Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren a la reducción o mejora de la progresión, gravedad y/o duración de un trastorno proliferativo, o la mejora de uno o más síntomas (preferiblemente, uno o más síntomas más discernibles) de un trastorno proliferativo resultante de la administración de una o más terapias (p. ej., uno o más agentes terapéuticos, tales como una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, de la invención). En realizaciones específicas, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren a la mejora de al menos un parámetro físico mensurable de un trastorno proliferativo, tal como el crecimiento de un tumor, no necesariamente discernible por el paciente. En otras realizaciones, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren a la inhibición de la progresión de un trastorno proliferativo, ya sea físicamente mediante, p. ej., la estabilización de un síntoma discernible, fisiológicamente mediante, p. ej., la estabilización de un parámetro físico, o ambos. En otras realizaciones, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren a la reducción o estabilización del tamaño del tumor o el recuento de células cancerosas.
Diversos aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes secciones y subsecciones.
I. Dominios de Unión anti- CLL-1
En un aspecto, la invención proporciona un cierto número de moléculas multiespecíficas, p. ej., moléculas biespecíficas, p. ej., anticuerpos biespecíficos, que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo modificado para una unión potenciada a una proteína CLL-1 tal como se define en las reivindicaciones.
En un aspecto, el dominio de unión anti-CLL-1 de la molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico, comprende más de un polipéptido. A modo de ejemplo, el dominio de unión anti-CLL-1 de una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico, puede comprender una región variable de cadena ligera, p. ej., tal como se describe en esta memoria, dispuesta en un primer polipéptido y una región variable de cadena pesada, p. ej., tal como se describe en esta memoria, dispuesta sobre un segundo polipéptido. En un aspecto, el polipéptido que comprende la región variable de cadena ligera y el polipéptido que comprende el polipéptido de cadena pesada forman un medio anticuerpo. En otro aspecto, el dominio de unión anti-CLL-1 consiste en un polipéptido, p. ej., un polipéptido que comprende tanto una región variable de cadena ligera como una región variable de cadena pesada de un dominio de unión anti-CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria. En un aspecto, la porción de unión al antígeno anti-CLL-1 de la molécula multiespecífica, p. ej., de la molécula biespecífica, p. ej., del anticuerpo biespecífico o de la molécula similar a un anticuerpo biespecífico, es un fragmento de anticuerpo scFv. En un aspecto, fragmentos de anticuerpo de este tipo son funcionales en el sentido de que conservan la afinidad de unión equivalente, p. ej., se unen al mismo antígeno con eficacia equiparable, tal como el anticuerpo IgG del que se deriva. En otras realizaciones, el fragmento de anticuerpo tiene una afinidad de unión más baja, p. ej., se une al mismo antígeno con una afinidad de unión más baja que el anticuerpo del que se deriva, pero es funcional, porque proporciona una respuesta biológica descrita en esta memoria. En una realización, la molécula multiespecífica, p. ej., de la molécula biespecífica, p. ej., del anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, la molécula comprende un fragmento de anticuerpo que tiene una afinidad de unión KD de 10-4 M a 10-8 M, p. ej., 10-5 M a 10-7 M, p. ej., 10-6 M o 10-7 M, para el antígeno diana. En una realización, el fragmento de anticuerpo tiene una afinidad de unión que es al menos cinco veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces, 100 veces o 1000 veces menor que un anticuerpo de referencia, p. ej., un anticuerpo descrito en esta memoria.
En un aspecto, fragmentos de anticuerpos de este tipo son funcionales, porque proporcionan una respuesta biológica que puede incluir, pero no se limita a la activación de una respuesta inmune, la inhibición del origen de la transducción de señales a partir de su antígeno diana, la inhibición de la actividad quinasa y similares, como entenderá un experto en la materia. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno anti-CLL-1 de la molécula multiespecífica, p. ej., de la molécula biespecífica, p. ej., del anticuerpo biespecífico o de la molécula similar a un anticuerpo biespecífico, es un fragmento de anticuerpo scFv que está humanizado en comparación con la secuencia murina del scFv del que se deriva. En una realización, el dominio de unión al antígeno anti-CLL-1 es un dominio de unión a antígeno anti-CLL-1 humano. En una realización, el dominio de unión al antígeno anti-CLL-1 es un dominio de unión al antígeno anti-CLL-1 humanizado.
En algunos aspectos, los dominios de unión anti-CLL-1 de la invención se incorporan en una molécula multiespecífica, p. ej., de la molécula biespecífica, p. ej., del anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico tal como se define en las reivindicaciones. En un aspecto, la molécula multiespecífica, p. ej., la molécula biespecífica, p. ej., del anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, comprende un dominio de unión a CLL-1 que comprende una secuencia de. SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, o SEQ ID NO: 51. En un aspecto, los dominios scFv son humanos.
En un aspecto, el dominio de unión anti-CLL-1, p. ej., scFv humano o humanizado, parte de una molécula multiespecífica, p. ej., de una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico, de la invención es codificado por un transgén cuya secuencia se ha optimizado de codones para la expresión en una célula de mamífero. En un aspecto, las cadenas, p. ej., la construcción completa, de la molécula multiespecífica de la invención es codificada por un transgén cuya secuencia completa ha sido optimizada de codones para la expresión en una célula de mamífero. La optimización de codones se refiere al descubrimiento de que la frecuencia de aparición de codones sinónimos (es decir, codones que codifican el mismo aminoácido) en el ADN codificante está sesgada en diferentes especies. Una degeneración de codones de este tipo permite que un polipéptido idéntico sea codificado por una diversidad de secuencias de nucleótidos. Se conoce en la técnica una diversidad de métodos de optimización de codones, e incluyen, p. ej., métodos descritos en al menos las patentes de EE.UU. Números 5.786.464 y 6.114.148.
En un aspecto de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 39. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 40. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 41. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 42. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 43. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 44. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 45. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 46. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 47. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 48. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 49. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 50. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende la porción scFv proporcionada en SEQ ID NO: 51.
Además, la presente invención proporciona una molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico tal como se define en las reivindicaciones, composiciones y su uso en medicamentos o métodos para tratar, entre otras enfermedades, cáncer o cualquier neoplasia o enfermedad autoinmune que implique células o tejidos que expresan CLL-1.
En un aspecto, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, de la invención se puede utilizar para erradicar células normales que expresan CLL-1 y, por lo tanto, es aplicable para uso como terapia de acondicionamiento antes del trasplante de células. En un aspecto, la célula normal que expresa CLL-1 es una célula madre normal que expresa CLL-1 y el trasplante de células es un trasplante de células madre.
La presente divulgación incluye una molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que comprende un dominio de unión anti- CLL-1 (p. ej., dominio de unión CLL-1 humano o humanizado tal como se describe en esta memoria), y al menos un segundo dominio de unión a antígeno, y en donde dicho dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión de la cadena pesada anti-CLL-1 enumerada en la Tabla 2. El dominio de unión anti -CLL-1 de la molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, puede comprender, además, una región determinante de la complementariedad 1 de cadena ligera (LC CDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (Lc CDR2), y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión de cadena ligera anti-CLL-1 enumerada en la Tabla 2.
La presente divulgación también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican la molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, p. ej., tal como se describe en esta memoria, p. ej., que codifica una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio de unión anti-CLL-1 (p. ej., dominio de unión CLL-1 humano o humanizado tal como se describe en esta memoria), en donde dicho dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) y una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión de cadena pesada anti-CLL-1 enumerada en la Tabla 2. En la realizaciones, el dominio de unión anti-CLL-1 codificado de la molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, puede comprender, además, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1), una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) y una región determinante de complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de unión de cadena ligera anti-CLL-1 enumerada en la Tabla 2.
En aspectos específicos de la invención, una construcción de molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, de la invención comprende un dominio scFv seleccionado del grupo que consiste en, SEQ ID NO: 39, SEQ iD NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, y SEQ ID NO: 51, en donde el scFv puede estar precedido por una secuencia conductora opcional tal como se proporciona en SEQ ID NO: 1. También se incluye en la invención una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de los fragmentos scFv seleccionados del grupo que consiste en. SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, y SEQ ID NO: 51.
También se incluye en la invención una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de los fragmentos scFv seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, y SEQ ID NO: 51, y cada uno de los dominios de SEQ ID NO: 1, más cualquiera de los dominios adicionales de la molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, de la invención.
En un aspecto, una construcción de molécula multiespecífica CLL-1 ilustrativa, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico comprende una secuencia conductora opcional. Construcciones de molécula multiespecífica de CLL-1 específica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a anticuerpo biespecífico, que contienen dominios scFv humanos de la invención se proporcionan como. SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, y SEQ ID NO: 51.
Una secuencia conductora ilustrativa se proporciona como SEQ ID NO: 1.
En un aspecto, la presente invención abarca una construcción de ácido nucleico recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, en donde la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión anti-CLL-1, o fragmento del mismo (p. ej., un dominio VL o VH) según se define en las reivindicaciones. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 se selecciona de uno o más de. SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 52. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 53. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 54. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 55. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 56. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 57. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 58. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 59. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 60. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende s Eq ID NO: 61. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 62. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 63. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 comprende SEQ ID NO: 64.
En un aspecto, la presente divulgación abarca una construcción de ácido nucleico recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio, p. ej., un dominio VH o un dominio VL, de una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, en donde la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio (p. ej., un VH o VL) de un dominio de unión anti-CLL-1 seleccionado de uno o más de un VH o VL de cualquiera de SEQ ID NO: 39-51.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican las moléculas deseadas se pueden obtener utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, rastreando colecciones de células que expresan el gen, derivando el gen de un vector que se sabe que incluye el mismo, o aislando directamente de células y tejidos que lo contienen, utilizando técnicas estándares. Alternativamente, el ácido nucleico de interés puede producirse sintéticamente, en lugar de clonarse.
La presente divulgación incluye construcciones de vectores, p. ej., construcciones de vectores plasmídico, retrovírico y lentivírico que expresan una molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que se puede transducir directamente en una célula.
La presente divulgación también incluye una construcción de ARN que se puede transfectar directamente en una célula. Un método para generar ARNm para uso en la transfección implica la transcripción in vitro (IVT) de un molde con cebadores especialmente diseñados, seguida de la adición de poliA, para producir una construcción que contenga secuencias 3' y 5' no traducidas ("UTR"), un casquete 5' y/o sitio de entrada al ribosoma interno (IREs ), el ácido nucleico que se ha de expresar, y una cola de poliA, típicamente de 50-2000 bases de longitud (SEQ ID NO: 35). El ARN así producido puede transfectar eficazmente diferentes tipos de células. En una realización, el molde incluye secuencias para los polipéptidos de la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico. En una realización, un vector de ARN se transduce en una célula mediante electroporación.
Las moléculas multiespecíficas, p. ej., moléculas biespecíficas, p. ej., anticuerpos biespecíficos, de la presente divulgación comprenden un dominio de unión específico de la diana. La elección del resto depende del tipo y número de ligandos que definen la superficie de una célula diana. Por ejemplo, el dominio de unión al antígeno puede elegirse para que reconozca un antígeno que actúa como marcador de la superficie celular en células diana asociadas con un estado de enfermedad particular.
En un aspecto, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, de la presente invención comprende un dominio de unión que se une específicamente a CLL-1. En un aspecto, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a CLL-1 humana.
Cada uno de los dominios de unión a antígeno, p. ej., el dominio de unión anti-CLL-1, puede ser cualquier proteína que se una al antígeno, incluyendo pero no limitado a un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento funcional de los mismos, incluyendo, pero no limitados a un anticuerpo de dominio único, tal como un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de nanocuerpo derivado de camélidos, un Fab, un scFv y un armazón alternativo conocido en la técnica por funcionar como dominio de unión a antígeno, tal como un dominio de fibronectina recombinante y similares. En algunos casos, es beneficioso que el dominio de unión a antígeno se derive de la misma especie en la que la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, se utilizarán en última instancia. Por ejemplo, para uso en seres humanos, puede ser beneficioso que el dominio de unión al antígeno de la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, comprenda residuos humanos o humanizados para el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Por tanto, en un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende un anticuerpo humano o humanizado o un fragmento de anticuerpo. En una realización de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende uno o más (p. ej., los tres) región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDRl), región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) y región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de un dominio de unión anti-CLL-1 humano descrito en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2) tal como se define en las reivindicaciones, y/o una o más (por ejemplo, las tres) región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) y región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CLL-1 humano tal como se define en las reivindicaciones (p. ej., en la Tabla 2), p. ej., un dominio de unión anti-CLL-1 humano que comprende una o más, p. ej., las tres LC-CDRs y una o más, p. ej., las tres, HC CDRs, como se define en las reivindicaciones. En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende una o más (p. ej., las tres) región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) y región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CLL-1 humano tal como se define en las reivindicaciones (p. ej., en la Tabla 2), p. ej., el dominio de unión anti-CLL-1 humano tiene dos regiones de cadena pesada variables, cada una de las cuales comprende una HC CDR1, HC CDR2 y HC CDR3 como se definen en las reivindicaciones. En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende una región variable de cadena ligera humana descrita en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2) y/o una región variable de cadena pesada humana descrita en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2) y como se define en las reivindicaciones. En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende una región variable de cadena pesada humana descrita en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2), p. ej., al menos dos regiones variables de cadena pesada humana descritas en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2) tal como se define en las reivindicaciones. En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 según se define en las reivindicaciones. En una realización de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 (p. ej., un scFv) comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con 95-99% de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia con 95-99% de identidad con una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2.
En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en. SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, y SEQ ID NO: 51.. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende una secuencia seleccionada de un grupo que consiste en. SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, y SEQ ID NO: 64 En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 humano es un scFv, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria, p. ej., en la Tabla 2, está fijada a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en esta memoria, p. ej., en la Tabla 2, a través de un enlazador, p. ej., un enlazador descrito en esta memoria. En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 humano incluye un enlazador (Gly4-Ser)n, en donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente 3 o 4 (SEQ ID NO: 26). La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv pueden estar, p. ej., en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligera-enlazadorregión variable de cadena pesada o región variable de cadena pesada-enlazador-región variable de cadena ligera. En un aspecto, la porción del dominio de unión a antígeno anti-CLL-1 comprende una o más secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, y SEQ ID NO: 51.
En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 humano comprende una región variable de cadena ligera humana descrita en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2) y/o una región variable de cadena pesada descrita en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2), según se define en las reivindicaciones. En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende un polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera descrita en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2) y un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada descrita en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2) según se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el polipéptido que comprende la región variable de cadena ligera descrita en esta memoria (p. ej., en la Tabla 2) y el polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada descrita en este memoria (p. ej., en la Tabla 2) según se define en las reivindicaciones forman un semianticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo (p. ej., se asocia de forma no covalente o se asocia de forma covalente para formar un semianticuerpo, o fragmento de anticuerpo del mismo), que comprende un dominio de unión anti-CLL-1.
En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera proporcionada en, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, o SEQ ID NO: 196,y/o una región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, o SEQ ID NO: 195 como se define en las reivindicaciones. En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 codificado es un scFv que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos de la Tabla 2 según se define en las reivindicaciones. En una realización de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 humano o humanizado (p. ej., un scFv) comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, o SEQ ID NO: 196, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, o SEQ ID NO: 195,o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma. En una realización, el dominio de unión anti-CLL-1 codificado incluye un enlazador (Gly4-Ser)n, en donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente 3 o 4 (SEQ ID NO: 26). La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv pueden estar, p. ej., en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligera-enlazador-región variable de cadena pesada o región variable de cadena pesada-enlazador-región variable de cadena ligera.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 78, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 65. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 78, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 65, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 79, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 66. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 79, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 66, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 80, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 67. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 80, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 67, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 81, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 68. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 81, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 68, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 82, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 69. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 82, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 69, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 83, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 70. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 83, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 70, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 84, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 71. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 84, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 71, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 85, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 72. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 85, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 72, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 86, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 73. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 86, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 73, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 87, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 74. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 87, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 74, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 88, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 75. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 88, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 75, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 89, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 76. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 89, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 76, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 90, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 77. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 90, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 77, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones de la invención, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 196, y la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 195. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera proporcionada en SEQ ID NO: 196, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma; y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservadoras) de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada proporcionada en SEQ ID NO: 195, o una secuencia con 95-99% de identidad de la misma.
En realizaciones, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada de cualquier dominio de unión anti-CLL-1 de la Tabla 2, según se define en las reivindicaciones. En realizaciones, el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consta de SEQ ID NO: 78-90, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ. ID NO: 65-77, según se define en las reivindicaciones.
En algunos aspectos, un dominio de unión anti-CLL-1 no humano está humanizado, en donde secuencias o regiones específicas del anticuerpo se modifican para aumentar la similitud con un anticuerpo producido de forma natural en un ser humano o fragmento del mismo. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno está humanizado.
Se puede producir un anticuerpo humanizado utilizando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a injerto de CDR (véanse, p. ej., la Patente Europea N° EP 239.400; la Publicación Internacional N° WO 91/09967; y las Pat. de EE.UU. N°s 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), revestimiento o acondicionamiento (véanse, p. ej., las Patentes Europeas N°s EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et al.,1994, PNAS, 91:969-973), barajado de cadenas (véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N° 5.565.332) y técnicas descritas en, p. ej., la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° US2005/0042664, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N° US2005/0048617, la Pat. de EE. UU. N° 6.407.213, la Pat. de EE.UU. N° 5.766.886, la Publicación Internacional N° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Sup.):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994) y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994). A menudo, los residuos de marco en las regiones marco se sustituirán por el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones de marco, p. ej., sustituciones conservativas, se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los residuos de marco para identificar residuos de marco importantes para la unión de antígenos y la comparación de secuencias para identificar residuos de marco inusuales en posiciones particulares. (Véase, p. ej., Queen et al., Pat. de EE.UU. N° 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323.)
Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos que permanecen en él procedentes de una fuente que no es humana. A estos residuos de aminoácidos no humanos se les alude a menudo como residuos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". Como se proporciona en esta memoria, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos humanizados comprenden una o más CDRs de moléculas de inmunoglobulina no humanas y regiones marco, en donde los residuos de aminoácidos que comprenden el marco se derivan completa o principalmente de la línea germinal humana. Múltiples técnicas para la humanización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son bien conocidas en la técnica y se pueden realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las CDRs o secuencias de CDR de roedores con las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano, es decir, injerto de CDR (documento EP 239.400; Publicación PCT N° WO 91/09967; y Pat. de EE.UU. N°s 4.816.567; 6.331.415; 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 6.548.640). En anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanizados de este tipo, sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la secuencia correspondiente de una especie no humana. Los anticuerpos humanizados son a menudo anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de marco (FR) se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La humanización de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos también se puede lograr mediante recubrimiento o acondicionamiento (documentos EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); y Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) o barajado de cadenas (Pat. de EE.UU. N° 5.565.332).
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar en la producción de anticuerpos humanizados es para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método denominado de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se rastrea frente a la colección completa de secuencias conocidas de dominio variable humanas. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta entonces como marco (FR) humano para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901(1987)). Otro método usa un marco particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Se puede utilizar el mismo marco para varios anticuerpos humanizados diferentes (véase, p. ej., Nicholson et al. Mol. Immun. 34( 16-17): 1157-1165 (1997); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). En algunas realizaciones, la región marco, p. ej., las cuatro regiones marco, de la región variable de cadena pesada se derivan de una secuencia de línea germinal VH4_4-59. En una realización, la región marco puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas, p. ej., del aminoácido en la secuencia murina correspondiente. En una realización, la región marco, p. ej., las cuatro regiones marco, de la región variable de cadena ligera se derivan de una secuencia de línea germinal VK3_1.25. En una realización, la región marco puede comprender una, dos, tres, cuatro o cinco modificaciones, p. ej., sustituciones, p. ej., sustituciones conservativas, p. ej., del aminoácido en la secuencia murina correspondiente.
En algunos aspectos, la parte de una molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, la composición de la invención que comprende un fragmento de anticuerpo se humaniza con retención de alta afinidad por el antígeno diana y otras propiedades biológicas favorables. De acuerdo con un aspecto de la invención, los anticuerpos humanizados y los fragmentos de anticuerpos se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay disponibles programas informáticos que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas exposiciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, p. ej., el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse al antígeno diana. De esta manera, residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir del receptor y las secuencias importadas, de modo que se logre el anticuerpo o la característica del fragmento de anticuerpo deseados, tal como una mayor afinidad por el antígeno diana. En general, los residuos de CDR están directa y más sustancialmente implicados en influir en la unión del antígeno.
Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humanizado puede retener una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original, p. ej., en la presente invención, la capacidad de unirse a CLL-1 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo humanizado puede tener una afinidad y/o especificidad mejoradas de unión a CLL-1 humana.
En un aspecto, el dominio de unión anti-CLL-1 se caracteriza por características o propiedades funcionales particulares de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Por ejemplo, en un aspecto, la parte de una molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, la composición de la invención que comprende un dominio de unión a antígeno de CLL-1 se une específicamente a CLL-1 humana.
En un aspecto, el dominio de unión a antígeno anti-CLL-1 tiene la misma o una especificidad de unión similar a CLL-1 humana que CLL-1 de ratón. En un aspecto, la invención se refiere a un dominio de unión a antígeno que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en donde el dominio de unión a anticuerpo se une específicamente a una proteína c LL-1 o fragmento de la misma, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena ligera variable y/o una cadena pesada variable que incluye una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, o SEQ ID NO: 196 según se define en las reivindicaciones. En un aspecto, el dominio de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de un scFv seleccionado de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, y SEQ ID NO: 51. En determinados aspectos, el scFv es contiguo y está en el mismo marco de lectura que una secuencia conductora. En un aspecto, la secuencia conductora es la secuencia polipeptídica proporcionada como SEQ ID NO: 1.
En un aspecto, el dominio de unión anti-CLL-1 es un fragmento, p. ej., un fragmento variable de cadena sencilla (scFv). En un aspecto, el dominio de unión anti-CLL-1 es un Fv, un Fab, un (Fab')2 o un anticuerpo híbrido bifuncional (p. ej., biespecífico) (p. ej., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17:105 (1987)). En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la invención se unen a una proteína CLL-1 con afinidad de tipo salvaje o potenciada.
En algunos casos, los scFv se pueden preparar de acuerdo con un método conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Moléculas de scFv se pueden producir enlazando regiones VH y VL juntas utilizando enlazadores polipeptídicos flexibles. Las moléculas scFv comprenden un enlazador (p. ej., un enlazador Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizadas. La longitud del enlazador puede afectar en gran medida a cómo se pliegan e interactúan las regiones variables de un scFv. De hecho, si se emplea un enlazador polipeptídico corto (p. ej., entre 5-10 aminoácidos) se evita el plegamiento intracadena. También se requiere el plegamiento entre cadenas para unir las dos regiones variables para formar un sitio de unión de epítopo funcional. Para ejemplos de la orientación y el tamaño del enlazador, véase, p. ej., Hollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448, Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N°s 2005/0100543, 2005/0175606, 2007/0014794, y publicaciones PCT N°s WO2006/020258 y WO2007/024715.
Un scFv puede comprender un enlazador de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos de aminoácidos entre sus regiones VL y VH. La secuencia de enlazador puede comprender cualquier aminoácido que se produce de forma natural. En algunas realizaciones, la secuencia de enlazador comprende los aminoácidos glicina y serina. En otra realización, la secuencia de enlazador comprende conjuntos de repeticiones de glicina y serina tales como (Gly4Ser)n, en donde n es un número entero positivo igual o mayor que 1 (SEQ ID NO: 25). En una realización, el enlazador puede ser (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO: 27) o (Gly4Ser)3(SEQ ID NO: 28). La variación en la longitud del enlazador puede retener o potenciar la actividad, dando lugar a una eficacia superior en los estudios de actividad.
Dominios de Unión Anti-CLL-1 Ilustrativos
Construcciones de molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico ilustrativas descritas en esta memoria comprenden un scFv (p. ej., un scFv tal como se describe en la Tabla 2, opcionalmente precedido de una secuencia conductora opcional (p. ej., SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 12 para secuencias de aminoácidos y nucleótidos conductoras ilustrativas, respectivamente)). Las secuencias de los fragmentos scFv (SEQ ID Nos: 39-51, sin incluir la secuencia conductora opcional) se proporcionan en esta memoria en la Tabla 2 y la descripción que figura más adelante. La construcción de molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, puede comprender, además, uno o más dominios de anticuerpo adicionales, p. ej., uno o más LCs, uno o más CH1s, uno o más CH2s, uno o más CH3s, uno o más dominios bisagra y/o uno o más dominios VL y/o VH adicionales, p. ej., tal como se describe en esta memoria. En determinadas realizaciones, los dominios son contiguos al y están en el mismo marco de lectura para formar un único polipéptido. En otras realizaciones, el dominio está en polipéptidos separados, p. ej., como en un anticuerpo multiespecífico o molécula similar a un anticuerpo descrita en esta memoria.
En determinadas realizaciones de la divulgación, la molécula multiespecífica de CLL-1 incluye una secuencia de aminoácidos (p. ej., una secuencia VL, una secuencia VH y/o una secuencia scFv) de, o incluye una secuencia de aminoácidos ((p. ej., una secuencia VL, una secuencia VH y/o una secuencia scFv) codificada por la secuencia de nucleótidos de, CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, CLL-1-13, 139115, 139116, 139117, 139118, 139119, 139120, 139121, 139122, 146259, 146261, 146262, 146263, o 146264, proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente (p. ej., 95-99%) idéntica a la misma.
En determinadas realizaciones de la divulgación, la molécula multiespecífica de CLL-1, o el dominio de unión a antígeno anti-CLL-1, incluye la secuencia de aminoácidos de CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, CLL-1-13, 139115, 139116, 139117, 139118, 139119, 139120, 139121, 139122, 146259, 146261, 146262, 146263, o 146264proporcionada en la Tabla 2 (con o sin la secuencia conductora), o una secuencia sustancialmente idéntica (p. ej., 95-99% idéntica, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, p. ej., sustituciones (p. ej., sustituciones conservativas)) a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
En determinadas realizaciones de la divulgación, la molécula multiespecífica de CLL-1, o el dominio de unión a antígeno anti-CLL-1, incluye la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera de CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, CLL-1-13, 139115, 139116, 139117, 139118, 139119, 139120, 139121, 139122, 146259, 146261, 146262, 146263, o 146264 proporcionada en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente idéntica (p. ej., 95-99% idéntica, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, p. ej., sustituciones (p. ej., sustituciones conservativas)) a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
En determinadas realizaciones de la divulgación, la molécula multiespecífica de CLL-1, o el dominio de unión a antígeno anti-CLL-1, incluye una, dos o tres CDRs de la región variable de cadena pesada (p. ej., HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3) de CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, CLL-1-13, 139115, 139116, 139117, 139118, 139119, 139120, 139121, 139122, 146259, 146261, 146262, 146263, o 146264 proporcionada en la Tabla 3 ; y/o una, dos o tres CDRs de la región variable de cadena ligera (p. ej., LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3) de CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, CLL-1-13, 139115, 139116, 139117, 139118, 139119, 139120, 139121, 139122, 146259, 146261, 146262, 146263, o 146264, proporcionada en la Tabla 4; o una secuencia sustancialmente idéntica (p. ej., 95-99% idéntica, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, p. ej., sustituciones (p. ej., sustituciones conservativas)) a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
En determinadas realizaciones de la divulgación, la molécula multiespecífica de CLL-1, o el dominio de unión a antígeno anti-CLL-1, incluye una, dos o tres CDRs de la región variable de cadena pesada (p. ej., HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3) de CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, CLL-1-13, 139115, 139116, 139117, 139118, 139119, 139120, 139121, 139122, 146259, 146261, 146262, 146263, o 146264, proporcionada en la Tabla 5; y/o una, dos o tres CDRs de la región variable de la cadena ligera (p. ej., LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3) de CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, CLL-1-13, 139115, 139116, 139117, 139118, 139119, 139120, 139121, 139122, 146259, 146261, 146262, 146263, o 146264, idem proporcionada en la Tabla 6; o una secuencia sustancialmente idéntica (p. ej., 95-99% idéntica, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, p. ej., sustituciones (p. ej., sustituciones conservativas)) a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
En determinadas realizaciones de la divulgación, la molécula multiespecífica de CLL-1, o el dominio de unión a antígeno anti-CLL-1, incluye una, dos o tres CDRs de la región variable de cadena pesada (p. ej., HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3) de CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, CLL-1-13, 139115, 139116, 139117, 139118, 139119, 139120, 139121, 139122, 146259, 146261, 146262, 146263, o 146264, proporcionada en la Tabla 7; y/o una, dos o tres CDRs de la región variable de cadena ligera (p. ej., LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3) de CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, CLL-1-13, 139115, 139116, 139117, 139118, 139119, 139120, 139121, 139122, 146259, 146261, 146262, 146263, o 146264, idem proporcionada en la Tabla 8; o una secuencia sustancialmente idéntica (p. ej., 95-99% idéntica, o hasta 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cambios de aminoácidos, p. ej., sustituciones (p. ej., sustituciones conservativas)) a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
La secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de dominios scFv de CLL-1 ilustrativos y dominios VL y VH de CLL-1 ilustrativos se proporcionan en la Tabla 2.
La Tabla 1 que figura a continuación designa los apodos para las construcciones de CLL-1 con respecto al número de ID del ADN, también enumerados en la Tabla 1.
Tabla 1: Nombres de construcciones anti-CLL-1 ilustrativas.
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Tabla 2: Secuencias del dominio de unión de CLL-1 humana
Tabla 2: Secuencias de Aminoácidos Ácidos Nucleicos de los dominios de unión anti-CLL-1
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En realizaciones de la divulgación, construcciones de molécula multiespecífica de CLL-1 ilustrativas adicionales, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, comprenden un dominio de unión a antígeno que comprende uno o más, p. ej., uno, dos o tres CDRs del dominio variable de cadena pesada y/o una o más, p. ej., una, dos o tres CDRs del dominio variable de cadena ligera, o la secuencia de VH y/o VL, o la secuencia de scFv, de la secuencia scFv el anticuerpo anti-CLL-1 (CLEC12A) descrito en la Publicación PCT WO2014/051433.
En realizaciones, la VL del dominio de unión de CLL-1 precede a la VH ("L2H"). En otras realizaciones, la VH del dominio de unión de CLL-1 precede a la VL ("H2L").
El dominio de unión al antígeno de la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a anticuerpo biespecífico, la construcción puede incluir un enlazador Gly/Ser que tiene una o más de las siguientes secuencias: GGGGS (SEQ ID NO:25); abarcando 1-6 unidades repetitivas "Gly Gly Gly Gly Ser", p. ej., GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:26); GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:27); GGGGSGGGGS GGGGS (SEQ ID NO:28); GGGS (SEQ ID NO:29); o abarcando 1-10 unidades repetitivas "Gly Gly Gly Ser", p. ej., GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS (SEQ ID NO:38). Alternativamente, el dominio de unión al antígeno de la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a anticuerpo biespecífico, la construcción puede incluir, por ejemplo, un enlazador que incluye la secuencia GSTSGSGKPGSGEGSTk G (SEQ ID NO: 1108)
En realizaciones, la construcción de ácido nucleico que codifica una molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, incluye una secuencia de poli A, p. ej., una secuencia que abarca 50-5000 o 100-5000 adeninas (p. ej.,, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 o SEQ ID NO:35), o una secuencia que abarca 50-5000 timinas (p. ej., SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32).
Las secuencias de CDR humanas de los dominios scFv se muestran en las Tablas 3, 5 y 7 para los dominios variables de cadena pesada y en las Tablas 4, 6 y 8 para los dominios variables de cadena ligera. "ID" representa la SEQ ID NO respectiva para cada una de las CDRs.
Tabla 3 CDRs de Dominio Variable de Cadena Pesada de acuerdo con una combinación del esquema de numeración de Kabat Chothia.
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Tabla 4 CDRs de Dominio Variable de Cadena Ligera de acuerdo con una combinación del esquema de numeración de Kabat Chothia.
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Tabla 5 CDRs de Dominio Variable de Cadena Pesada de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of H lh B h MD
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Tabla 6 CDRs de Dominio Variable de Cadena Ligera de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health Bethesda MD
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Tabla 7 CDRs de Dominio Variable de Cadena Pesada de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia (Al-Lazikani et al. 1997 JMB 273927-948
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Tabla 8 CDRs de Dominio Variable de Cadena Ligera de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia (Al-Lazikani et al. 1997 JMB 273927-948
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En determinadas realizaciones, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a anticuerpo biespecífico, descrita en esta memoria (p. ej., la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, ácido nucleico o una molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, polipéptido) o un dominio de unión a CLL-1 incluye un dominio de unión a CLL-1 que incluye: (1) una, dos o tres CDRs de cadena ligera (LC) elegidas de una de las siguientes:
(i) una secuencia LC CDR1 de SEQ ID NO: 156, LC CDR2 de SEQ ID NO: 169 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 182 de CLL-1-1;
(ii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 157, LC CDR2 de SEQ ID NO: 170 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 183 de CLL-1-2; (iii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 158, LC CDR2 de SEQ ID NO: 171 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 184 de CLL-1-3; (iv) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 159, LC CDR2 de SEQ ID NO: 172 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 185 de CLL-1-4; (v) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 160, LC CDR2 de SEQ ID NO: 173 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 186 de CLL-1-5; (vi) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 161, LC CDR2 de SEQ ID NO: 174 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 187 de CLL-1-6; (vii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 162, LC CDR2 de SEQ ID NO: 175 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 188 de CLL-1-7; (viii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 163, LC CDR2 de SEQ ID NO: 176 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 189 de CLL-1-8; o (ix) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 164, LC CDR2 de SEQ ID NO: 177 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 190 de CLL-1-9; (x) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 165, LC CDR2 de SEQ ID NO: 178 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 191 de CLL-1-10; (xi) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 166, LC CDR2 de SEQ ID NO: 179 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 192 de CLL-1-11; (xii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 167, LC CDR2 de SEQ ID NO: 180 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 193 de CLL-1-12; (xiii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 168, LC CDR2 de SEQ ID NO: 181 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 194 de CLL-1-13; (xiv) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 202, LC CDR2 de SEQ ID NO: 203 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 204 de 181286; y/o
(2) una, dos o tres CDRs de cadena pesada (HC) elegidas de una de las siguientes:
(i) una secuencia HC CDR1 de SEQ ID NO: 117, HC CDR2 de SEQ ID NO: 130 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 143 de CLL-1-1;
(ii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 118, HC CDR2 de SEQ ID NO: 131 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 144 de CLL-1-2; (iii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 119, HC CDR2 de SEQ ID NO: 132 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 145 de CLL-1-3; (iv) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 120, HC CDR2 de SEQ ID NO: 133 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 146 de CLL-1-4; (v) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 121, HC CDR2 de SEQ ID NO: 134 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 147 de CLL-1-5; (vi) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 122, HC CDR2 de SEQ ID NO: 135 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 148 de CLL-1-6; (vii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 123, HC CDR2 de SEQ ID NO: 136 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 149 de CLL-1-7; (viii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 124, HC CDR2 de SEQ ID NO: 137 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 150 de CLL-1-8; o
(ix) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 125, HC CDR2 de SEQ ID NO: 138 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 151 de CLL-1-9; (x) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 126, HC CDR2 de SEQ ID NO: 139 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 152 de CLL-1-10; (xi) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 127, HC CDR2 de SEQ ID NO: 140 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 153 de CLL-1-11; (xii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 128, HC CDR2 de SEQ ID NO: 141 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 154 de CLL-1-12; (xiii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 129, HC CDR2 de SEQ ID NO: 142 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 155 de CLL-1-13; (xiv) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 199, HC CDR2 de SEQ ID NO: 200 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 201 de 181286 y se define en las reivindicaciones.
En determinadas realizaciones, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a anticuerpo biespecífico, descrita en esta memoria (p. ej., la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, ácido nucleico o una molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, polipéptido) o un dominio de unión a CLL-1 incluye un dominio de unión a CLL-1 que incluye: (1) una, dos o tres CDRs de cadena ligera (LC) elegidas de una de las siguientes:
(i) una secuencia LC CDR1 de SEQ ID NO: 356, LC CDR2 de SEQ ID NO: 370 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 384 de CLL-1-1;
(ii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 357, LC CDR2 de SEQ ID NO: 371 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 385 de CLL-1-2; (iii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 358, LC CDR2 de SEQ ID NO: 372 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 386 de CLL-1-3; (iv) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 359, LC CDR2 de SEQ ID NO: 373 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 387 de CLL-1-4; (v) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 360, LC CDR2 de SEQ ID NO: 374 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 388 de CLL-1-5; (vi) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 361, LC CDR2 de SEQ ID NO: 375 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 389 de CLL-1-6; (vii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 362, LC CDR2 de SEQ ID NO: 376 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 390 de CLL-1-7; (viii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 363, LC CDR2 de SEQ ID NO: 377 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 391 de CLL-1-8; o (ix) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 364, LC CDR2 de SEQ ID NO: 378 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 392 de CLL-1-9; (x) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 365, LC CDR2 de SEQ ID NO: 379 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 393 de CLL-1-10; (xi) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 366, LC CDR2 de SEQ ID NO: 380 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 394 de CLL-1-11; (xii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 367, LC CDR2 de SEQ ID NO: 381 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 395 de CLL-1-12; (xiii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 368, LC CDR2 de SEQ ID NO: 382 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 396 de CLL-1-13; (xiv) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 369, LC CDR2 de SEQ ID NO: 383 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 397 de 181286; y/o
(2) una, dos o tres CDRs de cadena pesada (HC) elegidas de una de las siguientes:
(i) una secuencia HC CDR1 de SEQ ID NO: 314, HC CDR2 de SEQ ID NO: 328 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 342 de CLL-1-1;
(ii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 315, HC CDR2 de SEQ ID NO: 329 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 343 de CLL-1-2; (iii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 316, HC CDR2 de SEQ ID NO: 330 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 344 de CLL-1-3; (iv) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 317, HC CDR2 de SEQ ID NO: 331 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 345 de CLL-1-4; (v) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 318, HC CDR2 de SEQ ID NO: 332 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 346 de CLL-1-5; (vi) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 319, HC CDR2 de SEQ ID NO: 333 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 347 de CLL-1-6; (vii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 320, HC CDR2 de SEQ ID NO: 334 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 348 de CLL-1-7; (viii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 321, HC CDR2 de SEQ ID NO: 335 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 349 de CLL-1-8; o
(ix) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 322, HC CDR2 de SEQ ID NO: 336 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 350 de CLL-1-9; (x) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 323, HC CDR2 de SEQ ID NO: 337 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 351 de CLL-1-10; (xi) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 324, HC CDR2 de SEQ ID NO: 338 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 352 de CLL-1-11; (xii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 325, HC CDR2 de SEQ ID NO: 339 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 353 de CLL-1-12; (xiii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 326, HC CDR2 de SEQ ID NO: 340 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 354 de CLL-1-13; (xiv) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 327, HC CDR2 de SEQ ID NO: 341 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 355 de 181286 y se define en las reivindicaciones.
En determinadas realizaciones, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a anticuerpo biespecífico, descrita en esta memoria (p. ej., la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, ácido nucleico o una molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, polipéptido) o un dominio de unión a CLL-1 incluye un dominio de unión a CLL-1 que incluye: (1) una, dos o tres CDRs de cadena ligera (LC) elegidas de una de las siguientes:
(i) una secuencia LC CDR1 de SEQ ID NO: 440, LC CDR2 de SEQ ID NO: 454 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 468 de CLL-1-1;
(ii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 441, LC CDR2 de SEQ ID NO: 455 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 469 de CLL-1-2; (iii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 442, LC CDR2 de SEQ ID NO: 456 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 470 de CLL-1-3; (iv) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 443, LC CDR2 de SEQ ID NO: 457 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 471 de CLL-1-4; (v) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 444, LC CDR2 de SEQ ID NO: 458 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 472 de CLL-1-5; (vi) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 445, LC CDR2 de SEQ ID NO: 459 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 473 de CLL-1-6; (vii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 446, LC CDR2 de SEQ ID NO: 460 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 474 de CLL-1-7; (viii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 447, LC CDR2 de SEQ ID NO: 461 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 475 de CLL-1-8; o (ix) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 448, LC CDR2 de SEQ ID NO: 462 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 476 de CLL-1-9; (x) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 449, LC CDR2 de SEQ ID NO: 463 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 477 de CLL-1-10; (xi) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 450, LC CDR2 de SEQ ID NO: 464 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 478 de CLL-1-11; (xii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 451, LC CDR2 de SEQ ID NO: 465 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 479 de CLL-1-12; (xiii) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 452, LC CDR2 de SEQ ID NO: 466 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 480 de CLL-1-13; (xiv) una LC CDR1 de SEQ ID NO: 453, LC CDR2 de SEQ ID NO: 467 y LC CDR3 de SEQ ID NO: 481 de 181286; y/o
(2) una, dos o tres CDRs de cadena pesada (HC) elegidas de una de las siguientes:
(i) una secuencia HC CDR1 de SEQ ID NO: 398, HC CDR2 de SEQ ID NO: 412 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 426 de CLL-1-1;
(ii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 399, HC CDR2 de SEQ ID NO: 413 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 427 de CLL-1-2; (iii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 400, HC CDR2 de SEQ ID NO: 414 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 428 de CLL-1-3; (iv) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 401, HC CDR2 de SEQ ID NO: 415 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 429 de CLL-1-4; (v) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 402, HC CDR2 de SEQ ID NO: 416 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 430 de CLL-1-5; (vi) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 403, HC CDR2 de SEQ ID NO: 417 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 431 de CLL-1-6; (vii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 404, HC CDR2 de SEQ ID NO: 418 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 432 de CLL-1-7; (viii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 405, HC CDR2 de SEQ ID NO: 419 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 433 de CLL-1-8; 0
(ix) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 406, HC CDR2 de SEQ ID NO: 420 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 434 de CLL-1-9; (x) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 407, HC CDR2 de SEQ ID NO: 421 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 435 de CLL-1-10; (xi) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 408, HC CDR2 de SEQ ID NO: 422 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 436 de CLL-1-11; (xii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 409, HC CDR2 de SEQ ID NO: 423 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 437 de CLL-1-12; (xiii) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 410, HC CDR2 de SEQ ID NO: 424 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 438 de CLL-1-13; (xiv) una HC CDR1 de SEQ ID NO: 411, HC CDR2 de SEQ ID NO: 425 y HC CDR3 de SEQ ID NO: 439 de 181286 y se define en las reivindicaciones.
ScFv anti -CLL-1 ilustrativos incluyen pero no se limitan a . CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12 y CLL-1-13. Las secuencias de fragmentos scFv anti-CLL-1 humanos (SEQ ID NOs: 39- 51) se proporcionan en la Tabla 2 (y las designaciones de nombres se proporcionan en la Tabla 1).
En realizaciones de la molécula multiespecífica descrita, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, las construcciones se generan utilizando fragmentos scFv, p. ej., fragmentos scFv humanos (p. ej., SEQ ID NOs: 39- 51), en combinación con secuencias adicionales, tales como las que se muestran más adelante.
Se indica que los fragmentos de scFv, VH y VL descritos en esta memoria, p. ej., en la Tabla 2 o en SEQ ID NOs: 39­ 51, 65-77 o 78-90, sin una secuencia conductora (p. ej., sin la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12), están abarcadas por la presente invención. En otras realizaciones, los fragmentos scFv, VH y VL descritos en esta memoria, p. ej., en la Tabla 2 o en SEQ ID NOs: 39-51, 65-77 o 78-90, con una secuencia conductora opcional (p. ej., sin la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12), están abarcadas también por la presente invención.
Conductor ilustrativo (secuencia de aminoácidos) (SEQ ID NO: 1)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
Conductor ilustrativo (secuencia de ácidos nucleicos) (SEQ ID NO: 12) ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
Gly/Ser (SEQ ID NO: 25)
GGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO: 26): Esta secuencia puede abarcar 1-6 unidades repetitivas "Gly Gly Gly Gly Ser" GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO: 27)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO: 28)
GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO: 29)
GGGS
Gly/Ser (SEQ ID NO: 38): Esta secuencia puede abarcar 1-10 unidades repetitivas "Gly Gly Gly Ser" GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
II. Dominios de Unión a Antígeno Adicionales
En un aspecto, la divulgación proporciona moléculas multiespecíficas que comprenden un dominio de unión anti CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, y un dominio que une uno o más, p. ej., un segundo, antígeno o antígenos o epítopos adicionales. La presente divulgación contempla diversos antígenos o epítopos adicionales, y se describen con más detalle más adelante. En un aspecto, el antígeno o epítopo adicional es un epítopo único (p. ej., no reconocido por el primer dominio de unión anti-CLL-1) en CLL-1. En un aspecto de la divulgación, el antígeno o epítopo adicional es un antígeno de una diana (p. ej., una proteína) distinta de CLL-1. En un aspecto, el antígeno o epítopo adicional es un antígeno canceroso o un antígeno tumoral. En un aspecto, el antígeno o epítopo adicional es un antígeno o epítopo de una célula efectora inmunitaria, p. ej., una célula T o una célula NK.
a. Dominios de Unión a Antígeno de Efector Inmunitario
En un aspecto, la presente divulgación proporciona moléculas multiespecíficas que comprenden un dominio de unión anti CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, y un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno o epítopo de una célula efectora inmunitaria, p. ej., una célula T o célula NK. Tal como se utiliza la expresión en este memoria, una "célula efectora inmunitaria" se refiere a una célula que está implicada en una respuesta inmunitaria, p. ej., en la promoción de una respuesta efectora inmunitaria.
En un aspecto el antígeno o epítopo de una célula efectora inmunitaria es un epítopo de una célula T. En un aspecto, el antígeno es CD3.
Diversos dominios conocidos en la técnica de unión a anti-CD3 son adecuados para uso en una molécula multiespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo, que comprende un dominio de unión anti-CLL-1 descrito en esta memoria. Dominios de unión anti-CD3 que pueden incorporarse en las construcciones multiespecíficas de la presente invención incluyen los descritos en, por ejemplo, los documentos US2015/011825, WO2010/037835, WO2015/026894, WO2015/026892, US2014/0302064, US9029508, US2015/0118252, WO2014/051433 y WO2010/037835.
En la Tabla 26 se proporcionan dominios de unión anti-CD3 ilustrativos.
Tabla 26 Secuencias de dominios VL VH de dominios de unión anti-CD3.
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Tabla 27 Secuencias HCDR y LCDR de los dominios de unión anti-CD3 (CDR1, CDR2 y CDR3 asociadas con una cadena VH se refieren a Hc Dr I, HCDR2 y HCDR3, respectivamente (a las que también se alude en esta memoria como HC CDR1, HC CDR2 y HC CDR3, respectivamente); CDR1, Cd R2 y CDR3 asociadas con una cadena VL se refieren a LCDR1, LCDR2 y LCDR3, respectivamente (a las que también se alude en esta memoria como LC CDR1, LC CDR2 y LC CDR3, respectivamente)), de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda ^ MD
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Tabla 28 Secuencias HCDR y LCDR de los dominios de unión anti-CD3 (CDR1, CDR2 y CDR3 asociadas con una cadena VH se refieren a HCDRI, HCDR2 y HCDR3, respectivamente (a las que también se alude en esta memoria como HC CDR1, HC CDR2 y HC CDR3, respectivamente); CDR1, CDR2 y CDR3 asociadas con una cadena VL se refieren a LCDR1, LCDR2 y LCDR3, respectivamente (a las que también se alude en esta memoria como LC CDR1, LC CDR2 y LC CDR3, respectivamente)), de acuerdo con el esquema de numeración de Chothia (Al-Lazikani et al., 1997 JMB 273927-948.
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Tabla 29 Secuencias HCDR y LCDR de los dominios de unión anti-CD3 (CDR1, CDR2 y CDR3 asociadas con una cadena VH se refieren a HCDRI, HCDR2 y HCDR3, respectivamente (a las que también se alude en esta memoria como HC CDR1, HC CDR2 y HC CDR3, respectivamente); CDR1, Cd R2 y CDR3 asociadas con una cadena VL se refieren a LCDR1, LCDR2 y LCDR3, respectivamente (a las que también se alude en esta memoria como LC CDR1, LC CDR2 y LC CDR3, respectivamente)), de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat (Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD es uema de numeración de Chothia Al-Lazikani et al. 1997 JMB 273927-948.
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1413
En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende la VL de SEQ ID NO: (QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSR
GYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWG QGTTLTVSS) y la VH de SEQ ID NO: (QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASG VPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN). En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97 %, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: y una VH que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: . En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10,pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO:, y una VH que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO: .
En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende la VL de SEQ ID NO: (DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASG
VPYRFSGSGSGTSYSLISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK) y la VH de SEQ ID NO: (DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRG
YTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQ GTTLTVSS). En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97 %, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: y una VH que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: . En un aspecto, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO:, y una VH que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO: .
En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende la VL de SEQ ID NO: (QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKR
APGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL) y la VH de SEQ ID NO: (EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKY
NNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVS WFAYWGQGTLVTVSA). En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97 %, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: y una VH que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: . En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO:, y una VH que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO: .
En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende la VL de SEQ ID NO: (QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKR
APWTPARFSGSLLGGKAALIGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL) y la VH de SEQ ID NO: (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKY
NNYATYYADSVKDRFISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSW FAYWGQGTLVTVSS). En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97 %, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: y una VH que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: . En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO:, y una VH que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO: .
En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende la VL de SEQ ID NO: (QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKR
APWTPARFSGSLLGGKAALIGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL) y la VH de SEQ ID NO: (EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKY
NNYATYYADSVKDRFISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSW FAYWGQGTLVTVSS). En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97 %, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: y una VH que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: . En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO:, y una VH que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO: .
En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende la VL de SEQ ID NO: (DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK) y la VH de SEQ ID NO: (QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWYSGSKKNYADSVKGRFTISRDNS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS). En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97 %, al menos 98% o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: y una VH que tiene al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: . En un aspecto de la divulgación, el dominio de unión anti-CD3 comprende una VL que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO:, y una VH que tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10, pero no más de 50, 60, 70, 80, 90 o 100 sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos de SEQ ID NO: .
Virtualmente cualquier otro antígeno o epítopo de células T es útil en la presente divulgación. A modo de ejemplo, el antígeno o epítopo de células T puede ser una molécula coestimuladora inmunitaria (o epítopo de la misma). Como se utilizan los términos y las expresiones en este memoria, una "molécula coestimuladora inmunitaria" o "molécula coestimuladora" (utilizada indistintamente en esta memoria) se refiere al participante en la unión afín en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando con ello una respuesta coestimuladora por la célula T, tal como, pero no limitado a la proliferación. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o sus ligandos que se requieren para una respuesta inmune eficaz. Moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a una molécula MHC de clase I, proteínas receptoras de TNF, proteínas similares a inmunoglobulinas, receptores de citoquinas, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM), receptores de células NK activadoras, BTLA, receptor de ligando de Toll, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD47, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8alfa, CD8beta, IL2R beta, IL2R gamma, IL7R alfa, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Táctil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), TLR7, LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, y un ligando que se une específicamente con CD83.
A modo de ejemplo, el antígeno o epítopo de células T puede ser una molécula inhibidora inmunitaria, p. ej., una proteína de punto de control. Tal como se utiliza la expresión en esta memoria, una " molécula inhibidora inmunitaria" se refiere a una molécula expresada en la superficie de una célula que, cuando se une a su participante en la unión afín, provoca una reducción en una respuesta inmunitaria. Ejemplos de moléculas inhibidoras inmunitarias (p. ej., punto de control) incluyen PD1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, CEACAM (e.g., CEACAM-1, CEACAM-3 and/or CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3 (CD276), B7-H4 (VTCN1), HVEM (TNFRSF14 o CD270), KIR, A2aR, MHC clase I, MHC clase II, GAL9, adenosina y TGFR beta.
En otro aspecto de la divulgación, el antígeno o epítopo de una célula efectora inmunitaria es un epítopo de una célula NK. En un aspecto, el antígeno es CD16 (receptor Fc gamma III). Cualquier dominio de unión anti-CD16, incluidos los conocidos en la técnica, puede ser útil en las moléculas multiespecíficas de la presente divulgación. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CD16 comprende un dominio de unión anti-CD16 descrito, por ejemplo, en los documentos WO2005/0089519 o US2015/0218275. En un aspecto de la divulgación, el antígeno es CD64 (receptor Fc gamma I). Cualquier dominio de unión anti-CD64, incluidos los conocidos en la técnica, puede ser útil en las moléculas multiespecíficas de la presente divulgación. En realizaciones de la divulgación, el dominio de unión anti-CD64 comprende un dominio de unión anti-CD64 descrito, por ejemplo, en el documento WO2006/002438.
b.Dominio de Unión a Antígeno de Células Cancerosas
En un aspecto de la divulgación, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, se caracteriza por un primer dominio de unión anti-CLL-1, p. ej., comprende un scFv tal como se describe en esta memoria, p. ej., tal como se describe en la Tabla 2, o comprende las CDRs de cadena ligera y/o CDRs de cadena pesada de un scFv de CLL-1 descrito en esta memoria, y un segundo dominio de unión a antígeno que tiene especificidad de unión para un antígeno de cáncer, p. ej., un antígeno de cáncer expresado en una célula que también expresa CLL-1. En algunos aspectos de la divulgación, el segundo dominio de unión a antígeno tiene especificidad por un antígeno expresado en células de AML, p. ej., un antígeno distinto de CLL-1. En algunos aspectos de la divulgación, el segundo dominio de unión a antígeno tiene especificidad de unión para un antígeno expresado en células mieloma múltiple (MM). Los siguientes ejemplos en este párrafo son aspectos de las moléculas multiespecíficas descritas. Por ejemplo, el segundo dominio de unión a antígeno tiene especificidad de unión para CD123. Como otro ejemplo, el segundo dominio de unión a antígeno tiene especificidad de unión para CD33. Como otro ejemplo, el segundo dominio de unión a antígeno tiene especificidad de unión para CD34. Como otro ejemplo, el segundo dominio de unión a antígeno tiene especificidad de unión para FLT3. Por ejemplo, el segundo dominio de unión a antígeno tiene especificidad de unión para el receptor beta de folato. Como otro ejemplo, el segundo dominio de unión a antígeno tiene especificidad de unión para BCMA. En algunos aspectos, el segundo dominio de unión a antígeno tiene especificidad de unión para un antígeno expresado en células B, por ejemplo CD10, CD19, CD20, CD22, CD34, CD123, FLT-3, ROR1, CD79b, CD179b, o CD79a.
111. Formatos para Moléculas Multiespecíficas
En algunos aspectos, una molécula multiespecífica es un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico. En algunos aspectos, el anticuerpo o la molécula similar a un anticuerpo biespecífico pueden ser multivalentes, p. ej., bivalente, con respecto a un antígeno y monovalente con respecto al otro antígeno. Una molécula de anticuerpo biespecífica ilustrativa o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, tal como se describe en esta memoria, se caracteriza por un primer dominio de unión a antígeno (p. ej., que comprende una primera VL dispuesta en un primer polipéptido y una primera VH dispuesta en un segundo polipéptido) que tiene especificidad de unión para un primer antígeno o epítopo (p. ej., CLL-1) y un segundo dominio de unión a antígeno (p. ej., que comprende una segunda VL dispuesta en un tercer polipéptido y una segunda VH dispuesta en un cuarto polipéptido) que tiene especificidad de unión para un segundo epítopo (p. ej., un epítopo de una célula efectora inmunitaria o de una célula tumoral o neoplásica, p. ej., tal como se describe en esta memoria). En realizaciones, el primer y segundo epítopos están en el mismo antígeno, p. ej., la misma proteína (o subunidad de una proteína multimérica). En realizaciones, el primer y segundo epítopos se solapan. En realizaciones, el primer y segundo epítopos no se solapan. En realizaciones, el primer y segundo epítopos están en antígenos diferentes, p. ej., proteínas diferentes (o subunidades diferentes de una proteína multimérica). En realizaciones, una molécula de anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que tienen especificidad de unión para un primer epítopo o antígeno, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que tienen especificidad de unión para un segundo epítopo o antígeno. En realizaciones, una molécula de anticuerpo biespecífica o una molécula similar a un anticuerpo comprende un semianticuerpo que tiene especificidad de unión por un primer epítopo o antígeno y un semianticuerpo que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo o antígeno. En una realización, una molécula de anticuerpo biespecífica o una molécula similar a un anticuerpo comprende un semianticuerpo, o fragmento del mismo, que tiene especificidad de unión por un primer epítopo o antígeno y un semianticuerpo, o fragmento del mismo, que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo o antígeno. En realizaciones, una molécula de anticuerpo biespecífica o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico comprende un scFv, o fragmento del mismo, que tiene especificidad de unión por un primer epítopo o antígeno y un scFv, o fragmento del mismo, que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo o antígeno.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico (p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a anticuerpo biespecífico o biespecífico). Se conocen en la técnica protocolos para generar anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos biespecíficos o heterodiméricos; incluyendo, pero no limitados a, por ejemplo, el enfoque de "botón en un agujero" descrito, p. ej., en el documento US 5731168; el emparejamiento Fc de dirección electrostática como se describe, p. ej., en los documentos WO 09/089004, WO 06/106905 y WO 2010/129304; formación de heterodímeros de dominios de intercambio de cadenas (SEED) tal como se describe, p. ej., en el documento WO 07/110205; Intercambio de brazos Fab tal como se describe en, p. ej., los documentos WO 08/119353, WO 2011/131746 y WO 2013/060867; conjugado de anticuerpo doble, p. ej., mediante entrecruzamiento de anticuerpos para generar una estructura biespecífica utilizando un reactivo heterobifuncional que tiene un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con sulfhidrilo tal como se describe, p. ej., en el documento US 4433059; determinantes de anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos biespecíficos generados mediante la recombinación de semianticuerpos (pares de cadenas ligeras pesadas o Fabs) de diferentes anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos a través del ciclo de reducción y oxidación de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas, tal como se describe en, p. ej., el documento US 4444878; anticuerpos trifuncionales, p. ej., tres fragmentos Fab' reticulados a través de grupos reactivos con sulfhidrilo, tal como se describe, p. ej., en el documento US5273743; proteínas de unión biosintéticas, p. ej., par de scFvs reticulados a través de colas C-terminales, preferiblemente a través de reticulación química reactiva con disulfuro o amina, tal como se describe, p. ej., en el documento US5534254; anticuerpos bifuncionales, p. ej., fragmentos Fab con diferentes especificidades de unión dimerizados a través de cremalleras de leucina (p. ej., c-fos y c-jun) que han reemplazado el dominio constante, tal como se describe, p. ej., en el documento US5582996; receptores mono- y oligo-valentes biespecíficos y oligoespecíficos, p. ej., regiones VH-CH1 de dos anticuerpos (dos fragmentos Fab) enlazados a través de un espaciador polipeptídico entre la región CH1 de un anticuerpo y la región VH del otro anticuerpo típicamente con cadenas ligeras asociadas, tal como se describe en, p. ej., el documento US5591828; conjugados de ADN-anticuerpo biespecíficos, p. ej., reticulaciones de anticuerpos o fragmentos Fab a través de un trozo de ADN de doble cadena, tal como se describe, p. ej., en el documento US5635602; proteínas de fusión biespecíficas, p. ej., una construcción de expresión que contiene dos scFvs con un enlazador de péptido helicoidal hidrofílico entre ellos y una región constante completa, tal como se describe, p. ej., en el documento US5637481; proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas, p. ej., dímero de polipéptidos que tienen el primer dominio con la región de unión de la región variable de la cadena pesada de Ig, y el segundo dominio con la región de unión de la región variable de la cadena ligera de Ig, generalmente denominados diacuerpos (también se abarcan estructuras de orden superior, creando moléculas bispecíficas, triespecíficas o tetraespecíficas, tal como se describe en, p. ej., el documento US5837242; construcciones de minicuerpos con cadenas VL y VH enlazadas, conectadas además con espaciadores de péptidos a una región bisagra del anticuerpo y la región CH3, que pueden ser dimerizados para formar moléculas biespecíficas/multivalentes, tal como se describe, p. ej., en el documento US5837821; dominios VH y VL enlazados con un enlazador peptídico corto (p. ej., 5 o 10 aminoácidos) o ningún enlazador en cualquier orientación, que pueden formar dímeros para formar diacuerpos biespecíficos; trímeros y tetrámeros, tal como se describe en, p. ej., el documento US5844094; serie de dominios VH (o dominios VL en miembros de la familia) conectados por enlaces peptídicos con grupos reticulables en el extremo C, asociados, además, con dominios VL para formar una serie de FVs (o scFvs), tal como se describe, p. ej., en el documento US5864019; dominios VL y VH, scFv o Fabs, en donde uno de los antígenos está unido de forma monovalente y uno de los antígenos está unido de forma bivalente, que comprenden opcionalmente regiones Fc heterodiméricas, tal como se describe, p. ej., en el documento WO2011/028952; y polipéptidos de unión de cadena sencilla con un dominio tanto VH como VL enlazado a través de un enlazador de péptido se combinan en estructuras multivalentes a través de reticulación no-covalente o química para formar, p. ej., estructuras homobivalentes, heterobivalentes, trivalentes y tetravalentes utilizando el formato de tipo tanto scFv como diacuerpo, como se describe en, p. ej., el documento US5869620. Ejemplos de moléculas multiespecíficas y biespecíficas adicionales ilustrativas y métodos para producir las mismas, por ejemplo, en los documentos US5910573, US5932448, US5959083, US5989830, US6005079, US6239259, US6294353, US6333396, US6476198, US6511663, US6670453, US6743896, US6809185, US6833441, US7129330, US7183076, US7521056, US7527787, US7534866, US7612181, US2002004587A1, US2002076406A1, US2002103345A1, US2003207346A1, US2003211078A1, US2004219643A1, US2004220388A1, US2004242847A1, US2005003403A1, US2005004352A1, US2005069552A1, US2005079170A1, US2005100543A1, US2005136049A1, US2005136051A1, US2005163782A1, US2005266425A1, US2006083747A1, US2006120960A1, US2006204493A1, US2006263367A1, US2007004909A1, US2007087381A1, US2007128150A1, US2007141049A1, US2007154901A1, US2007274985A1, US2008050370A1, US2008069820A1, US2008152645A1, US2008171855A1, US2008241884A1, US2008254512A1, US2008260738A1, US2009130106A1, US2009148905A1, US2009155275A1, US2009162359A1, US2009162360A1, US2009175851A1, US2009175867A1, US2009232811A1, US2009234105A1, US2009263392A1, US2009274649A1, EP346087A2, WO0006605A2, WO02072635A2, WO04081051A1, WO06020258A2, WO2007044887A2, WO2007095338A2, WO2007137760A2, WO2008119353A1, WO2009021754A2, WO2009068630A1, WO9103493A1, WO9323537A1, WO9409131A1, WO9412625A2, WO9509917A1, WO9637621A2, WO9964460A1. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las moléculas multiespecíficas anti-CLL-1 de la presente invención comprenden un dominio de unión anti- CLL-1 en una cualquiera de los formatos multiespecíficos o biespecíficos conocidos en la técnica y arriba descritos. Formatos adicionales contemplados en esta memoria se describen con más detalle más adelante.
Dentro de cada uno de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (p. ej., scFv) de un anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo, la VH puede estar aguas arriba o aguas abajo de VL. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aguas arriba (p. ej., scFv) se dispone con su VH (VH1) aguas arriba de su VL (VL1) y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aguas abajo (p. ej., scFv) se dispone con su VL (VL2) aguas arriba de su VH (VH2), de manera que el anticuerpo biespecífico global o la molécula similar a un anticuerpo tiene la disposición VH1-VL1-VL2-VH2. En otras realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aguas arriba (p. ej., scFv) se dispone con su VL (VL1) aguas arriba de su VH (VH1) y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aguas abajo (p. ej., scFv) se dispone con su VH (VH2) aguas arriba de su Vl (VL2), de manera que el anticuerpo biespecífico global o la molécula similar a un anticuerpo tiene la disposición VL1-VH1-VH2-VL2. Opcionalmente, un enlazador está dispuesto entre los dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (p. ej., ScFv), p. ej., entre VL1 y VL2 si la construcción está dispuesta como VH1-VL1-VL2-VH2, o entre VH1 y VH2 si la construcción está dispuesta como VL1-VH1-VH2-VL2. El enlazador puede ser un enlazador tal como se describe en esta memoria, p. ej., un enlazador (Gly4-Ser) n, en donde n es 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente 4 (SEQ ID NO: 26). En general, el enlazador entre los dos scFvs debe ser lo suficientemente largo como para evitar el emparejamiento erróneo entre los dominios de los dos scFvs. Opcionalmente, un enlazador está dispuesto entre la VL y la VH del primer scFv. Opcionalmente, un enlazador está dispuesto entre la VL y la VH del segundo scFv. En construcciones que tienen múltiples enlazadores, dos o más de los enlazadores pueden ser iguales o diferentes. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la divulgación, la molécula biespecífica anti-CLL-1 de la presente invención comprende VLs, VHs (p. ej., VLs y/o VHs de cualquiera de los dominios de unión anti-CLL-1 descritos en esta memoria) y opcionalmente uno o más enlazadores en una disposición tal como se describe en esta memoria, junto con, por ejemplo, VLs, VHs que fijan como objetivo un segundo epítopo o antígeno (p. ej., un segundo epítopo o antígeno descrito en esta memoria, p. ej., CD3 o CD16).
La presente invención incluye moléculas multiespecíficas, que comprenden un dominio de unión anti-CLL-1, de diversos formatos. Formatos preferidos para las moléculas multiespecíficas de la presente invención se describen con más detalle a continuación.
Formato 1: Cuerpo dual
En un aspecto, la presente invención incluye una molécula multiespecífica que comprende una primera cadena pesada y una primera cadena ligera que juntas comprenden un primer dominio de unión a antígeno, y una segunda cadena pesada y una segunda cadena ligera que juntas comprenden un segundo dominio de unión a antígeno. En un aspecto, el cuerpo dual se forma a partir de un semianticuerpo que tiene especificidad por un primer antígeno o epítopo y un semianticuerpo que tiene especificidad por un segundo antígeno o epítopo.
Esta molécula comprende un primer polipéptido que comprende una VL, y opcionalmente una CL, y un segundo polipéptido que comprende un dominio VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3, en donde el primero y segundo polipéptido comprenden un primer dominio de unión a antígeno; y un tercer polipéptido que comprende una VL, y opcionalmente una CL, un cuarto polipéptido que comprende un dominio VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3, en donde el tercer y cuarto polipéptidos comprenden un segundo dominio de unión a antígeno. En una realización, el cuerpo dual comprende (preferiblemente desde el extremo N al extremo C; los números que siguen al nombre de dominio se refieren, p. ej., a una primera ("1" o "-1") o una segunda ("2" o "-2") copia o versión de ese dominio en el cuerpo dual)):
Polipéptido 1: VL1-CL1
Polipéptido 2: VH1-CH1-1-bisagra1-CH2-1-CH3-1
Polipéptido 3: VL2-CL2
Polipéptido 4: VH2-CH1-2-bisagra2-CH2-2-CH3-2
En realizaciones, los dominios CL1 y CL2 se derivan del mismo tipo o clase de anticuerpo, p. ej., comprenden la misma secuencia. En otras realizaciones, los dominios CL1 y CL2 se derivan de diferentes tipos o clases de anticuerpos o cadenas y/o comprenden diferentes secuencias, por ejemplo, CL1 puede derivarse de un anticuerpo lambda y CL2 puede derivarse de una cadena de anticuerpo kappa. Sin pretender estar ligado por teoría alguna, se cree que derivar dominios CL de diferentes tipos de anticuerpos favorece el emparejamiento correcto de los dominios VL y VH (p. ej., VH1 con VL1 y VH2 con VL2) para formar dominios de unión a antígenos funcionales. En realizaciones, los dominios CH1-1 y CH1-2 se derivan del mismo tipo o clase de anticuerpo y/o comprenden la misma secuencia. En realizaciones, los dominios CH1-1 y CH1-2 se derivan de diferentes tipos o clases de anticuerpo y/o comprenden diferentes secuencias. En realizaciones, los bisagra1 y bisagra2 se derivan del mismo tipo o clase de anticuerpo y/o comprenden la misma secuencia. En realizaciones, los dominios bisagra-1 y bisagra-2 se derivan de diferentes tipos o clases de anticuerpo y/o comprenden diferentes secuencias. En realizaciones, los dominios CH2-1 y CH2-2 se derivan del mismo tipo o clase de anticuerpo y/o comprenden la misma secuencia. En realizaciones, los dominios CH2-1 y CH2-2 se derivan de diferentes tipos o clases de anticuerpo y/o comprenden diferentes secuencias. En algunos aspectos, los dominios CH2 que comprenden diferentes secuencias comprenden una o más mutaciones para favorecer la heterodimerización de las dos cadenas polipeptídicas que comprenden los dominios CH2, con respecto a las cadenas polipeptídicas no modificadas. Mutaciones para favorecer la heterodimerización se describen en detalle más adelante. En realizaciones, los dominios CH2-1 y CH2-2 se derivan del mismo tipo o clase de anticuerpo y/o comprenden la misma secuencia. En realizaciones, los dominios CH3-1 y CH3-2 se derivan de diferentes tipos o clases de anticuerpo y/o comprenden diferentes secuencias. En algunos aspectos, los dominios CH3 que comprenden diferentes secuencias comprenden una o más mutaciones para favorecer la heterodimerización de las dos cadenas polipeptídicas que comprenden los dominios CH3, con respecto a las cadenas polipeptídicas no modificadas. Mutaciones para favorecer la heterodimerización se describen en detalle más adelante.
En realizaciones, los polipéptidos del cuerpo dual pueden comprender adicionalmente uno o más fragmentos de anticuerpo adicionales, p. ej., uno o más dominios variables o constantes adicionales, para formar un cuerpo dual "extendido". En un aspecto, cada uno de los polipéptidos del cuerpo dual puede comprender adicionalmente un segundo dominio variable (preferiblemente del mismo tipo que el primer dominio variable de la cadena), preferiblemente dispuesto entre el primer dominio variable y el primer dominio constante de dicho polipéptido (si está presente), o C-terminal con el primer dominio variable. Por ejemplo, el primer polipéptido del cuerpo dual puede comprender, desde el extremo N al extremo C: VL1-VL1-CL1. El uno o más dominios variables adicionales pueden ser iguales o diferentes al primer dominio variable. En otras realizaciones, el cuerpo dual "extendido" comprende uno o más dominios constantes de anticuerpos adicionales, p. ej., una o más copias o versiones del dominio constante ya presente en la cadena polipeptídica que se extiende. Por ejemplo, el primer polipéptido del cuerpo dual puede comprender, desde el extremo N al extremo C: VL1-CL1-CL1.
En realizaciones, el cuerpo dual tiene la estructura representada en la Figura 1A. En realizaciones, el cuerpo dual comprende una primera cadena polipeptídica que tiene dominios VL y CL, una segunda cadena polipeptídica que tiene dominios VH, c H1, bisagra, CH2 y CH3 (dichas primera y segunda cadenas constituyen el primer semianticuerpo que comprende el primer dominio de unión a antígeno, p. ej., un dominio de unión anti-CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria), una tercera cadena que tiene dominios VL y CL, y una cuarta cadena que tiene dominios VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3 (formando dichas tercera y cuarta cadenas el segundo semianticuerpo que comprende el segundo dominio de unión a antígeno, p. ej., un dominio de unión anti-CD3, p. ej., tal como se describe en esta memoria). La heterodimerización de los semianticuerpos primero y segundo (mostrada en esta memoria, favorecida por mutaciones de heterodimerización opcionales de los dominios CH3, p. ej., tal como se describe en esta memoria, así como un enlace de cisteína estabilizante, p. ej., tal como se describe en esta memoria) produce la molécula multiespecífica.
Una o más cadenas de las moléculas multiespecíficas del formato de cuerpo dual arriba descrito pueden comprender, además, otro dominio de reconocimiento de antígeno, p. ej., un scFv. En una realización, el scFv está dispuesto en el extremo C de la cadena. En una realización, el scFv está dispuesto C-terminal al dominio más C-terminal de un polipéptido que comprende un dominio constante de cadena pesada, p. ej., un dominio CH2 o un dominio CH3. En una realización, el scFv está dispuesto en el extremo C del dominio CH3 de uno o más polipéptidos del cuerpo dual o del cuerpo dual extendido. El uno o más scFv pueden reconocer el mismo o diferente antígeno o epítopo que el reconocido por el primer o segundo dominio de unión al antígeno del cuerpo dual o del cuerpo dual extendido. En los casos en los que uno o más dominios de unión a antígeno, p. ej., scFvs, reconocen un epítopo o antígeno idéntico a uno de los dominios de unión a antígeno primero o segundo, la molécula es multivalente, p. ej., bivalente, con respecto a ese antígeno o epítopo. En una realización de la divulgación, los dominios de reconocimiento de antígenos del cuerpo dual reconocen uno o más antígenos del cáncer, p. ej., CLL-1, y el dominio de unión a antígeno adicional, p. ej., scFv, reconoce un antígeno o epítopo de una célula efectora inmunitaria, p. ej.,, una célula T o célula NK, p. ej., CD3, CD64 o CD16.
El experto en la materia apreciará que las moléculas de cuerpo dual o de cuerpo dual extendido de la presente invención pueden estabilizarse enlazando covalentemente una o más de las cadenas polipeptídicas de la molécula. Enlazadores son conocidos en la técnica y pueden ser químicos o peptídicos. El enlace puede ser a lo largo de la cadena principal del polipéptido (p. ej., de extremo a extremo), de la cadena lateral de aminoácidos a la cadena lateral o de la cadena lateral de los aminoácidos al extremo.
En realizaciones, CL1 y CL2 se pueden seleccionar independientemente de:
(a) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 502); y (b) GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQ WKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 503).
En una realización preferida, CL1 y CL2 son diferentes (p. ej., CL1 comprende SEQ ID NO: 502 y CL2 comprende SEQ ID NO: 503 o viceversa).
En realizaciones, la región constante de cadena pesada del péptido 2 y del péptido 4 comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada independientemente de:
(a) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVC TLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 504); y
(b) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 505).
En realizaciones, el péptido 2 (p. ej., la región constante de cadena pesada del péptido 2) comprende SEQ ID NO: 504 y el péptido 4 (p. ej., la región constante de cadena pesada del péptido 4) comprende SEQ ID NO: 505 o viceversa. Los formatos de cuerpo dual son conocidos en la técnica y se describen adicionalmente, por ejemplo, en los documentos WO2008/119353 y WO2011/131746. Ejemplos del formato de cuerpo dual, incluyendo el formato de cuerpo dual "extendido", se muestran en la Figura 1.
Formato 2: scFv-Fc
En un aspecto, la presente invención incluye una molécula multiespecífica que comprende un primer polipéptido que comprende un primer scFv, un dominio bisagra, un dominio CH2 y, preferiblemente, un dominio CH3; y un segundo polipéptido que comprende un segundo scFv (que reconoce preferiblemente un antígeno o epítopo diferente del primer scFv), un dominio bisagra, un dominio CH2 y, preferiblemente, un dominio CH3. En una realización, el scFv está dispuesto N-terminal a los dominios bisagra y constante. En otra realización, los dominios scFv están dispuestos C-terminales a los dominios bisagra y constante. En otra realización, el primer dominio scFv está dispuesto N-terminal a los dominios bisagra y constante del primer polipéptido, y el segundo dominio scFv está dispuesto C-terminal a los dominios bisagra y constante del segundo polipéptido. En realizaciones, independientemente de la orientación entre el dominio scFv y los dominios constantes, el dominio bisagra está dispuesto entre el dominio scFv y los dominios constantes.
En algunos aspectos, los dominios CH2 y/o CH3 de la molécula multiespecífica scFv-Fc comprenden una o más mutaciones para favorecer la heterodimerización de las dos cadenas polipeptídicas que comprenden los dominios CH2 y/o CH3 de la scFv-Fc, con respecto a las cadenas polipeptídicas no modificadas. Mutaciones para favorecer la heterodimerización se describen en detalle más adelante.
En realizaciones, el cuerpo dual tiene la estructura representada en la Figura 1B. En realizaciones, la molécula multiespecífica scFv-Fc comprende una primera cadena polipeptídica que comprende un scFv (p. ej., el primer dominio de unión a antígeno, un dominio de unión anti-CLL-1, tal como se define en las reivindicaciones), un dominio bisagra, CH2 y CH3 (es decir, el primer semianticuerpo) y una segunda cadena polipeptídica que consiste en un scFv (el segundo dominio de unión a antígeno, un dominio de unión anti-CD3, tal como se define en las reivindicaciones), un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3 (p. ej., el segundo semianticuerpo). La heterodimerización de los semianticuerpos primero y segundo (mostrada en esta memoria, favorecida por mutaciones de heterodimerización opcionales de los dominios CH3, p. ej., tal como se describe en esta memoria, así como un enlace de cisteína estabilizante, p. ej., tal como se describe en esta memoria) produce la molécula multiespecífica.
Una o más cadenas de las moléculas multiespecíficas del formato scFv-Fc arriba descrito pueden comprender, además, otro dominio de reconocimiento de antígeno, p. ej., un scFv. En una realización, el scFv está dispuesto en el extremo C de la cadena. En una realización, el scFv está dispuesto C-terminal al dominio más C-terminal de un polipéptido que comprende un dominio constante de cadena pesada, p. ej., un dominio CH2 o un dominio CH3. En una realización, el scFv está dispuesto C-terminal al dominio CH3 de uno o más polipéptidos de la scFv-Fc. El uno o más scFvs pueden reconocer el mismo o diferente antígeno o epítopo que el reconocido por el primer o segundo dominio de unión a antígeno de la scFv-Fc. En los casos en los que uno o más dominios de unión a antígeno, p. ej., scFvs, reconocen un epítopo o antígeno idéntico a uno de los dominios de unión a antígeno primero o segundo, la molécula es multivalente, p. ej., bivalente, con respecto a ese antígeno o epítopo. En una realización de la divulgación, los dominios de reconocimiento de antígenos de la scFv-Fc reconocen uno o más antígenos del cáncer, p. ej., CLL-1, y el dominio de unión a antígeno adicional, p. ej., scFv, reconoce un antígeno o epítopo de una célula efectora inmunitaria, p. ej.,, una célula T o célula NK, p. ej., CD3, CD64 o CD16.
El experto en la materia apreciará que las moléculas de scFv-Fc de la presente invención pueden estabilizarse enlazando covalentemente una o más de las cadenas polipeptídicas de la molécula. Enlazadores son conocidos en la técnica y pueden ser químicos o peptídicos. El enlace puede ser a lo largo de la cadena principal del polipéptido (p. ej., de extremo a extremo), de la cadena lateral de aminoácidos a la cadena lateral o de la cadena lateral de los aminoácidos al extremo.
En realizaciones, la primera cadena polipeptídica puede incluir un primer dominio de unión a antígeno, p. ej., un scFv, y una primera región constante de cadena pesada que tiene la siguiente secuencia:
GGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCA VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 500);
y la segunda cadena polipeptídica puede incluir un segundo dominio de unión a antígeno, p. ej., un scFv, y una segunda región constante de cadena pesada que tiene la siguiente secuencia:
GGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 501).
Cada uno de los polipéptidos primero y/o segundo puede comprender residuos de aminoácidos adicionales dispuestos entre el dominio de unión a antígeno y la región constante, p. ej., una bisagra. Alternativamente, los aminoácidos del dominio de unión a antígeno se pueden conectar directamente a los aminoácidos del dominio constante (p. ej., SEQ ID NO: 500 y/o SEQ ID NO: 501) sin aminoácidos intermedios.
Alternativamente, la fijación de los dominios constantes puede invertirse: el primer polipéptido puede comprender SEQ ID NO: 501 y el segundo polipéptido puede comprender SEQ ID NO:
500.
En la Figura 1 se muestran ejemplos del formato scFv -Fc.
Formato 3: Moléculas Multiespecíficas de Cadena Mixta
En un aspecto, la presente invención incluye una molécula multiespecífica que comprende un primer semianticuerpo que comprende un primer polipéptido que comprende un primer scFv, un dominio bisagra, un dominio CH2 y, preferiblemente, un dominio CH3; y un segundo semianticuerpo que comprende dos polipéptidos, comprendiendo el primero un dominio VL y, opcionalmente, un dominio CL, y comprendiendo el segundo un dominio VH, un dominio CH1, un dominio bisagra y un dominio CH2 y/o un dominio CH3. Por lo tanto, el formato de molécula multiespecífica de cadena mixta incluye un semianticuerpo derivado de una estructura de anticuerpo típica heterodimerizada con un semianticuerpo del formato scFv-Fc arriba descrito.
En realizaciones, la molécula multiespecífica de formato mixto tiene la estructura representada en la Figura 1C. En realizaciones, la molécula multiespecífica de formato mixto comprende un primer semianticuerpo que comprende una primera cadena polipeptídica que tiene dominios VL y CL y una segunda cadena polipeptídica que tiene dominios VH, CH1, bisagra, CH2 y CH3 (constituyendo dichos dominios VL y VH de la primera y segunda cadenas polipeptídicas, respectivamente, el primer dominio de unión a antígeno, p. ej., un dominio de unión anti-CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria), y un segundo semianticuerpo que comprende una tercera cadena polipeptídica que tiene un scFv (que comprende el segundo dominio de unión a antígeno, p. ej., un dominio de unión anti-CD3, p. ej., tal como se describe en esta memoria), dominio bisagra, CH2 y CH3. La heterodimerización de los semianticuerpos primero y segundo (mostrada en esta memoria, favorecida por mutaciones de heterodimerización opcionales de los dominios CH3, p. ej., tal como se describe en esta memoria, así como un enlace de cisteína estabilizante, p. ej., tal como se describe en esta memoria) produce la molécula multiespecífica.
En algunos aspectos, los dominios CH2 y/o los dominios CH3 de la molécula multiespecífica de cadena mixta comprenden una o más mutaciones para favorecer la heterodimerización de las dos cadenas polipeptídicas que comprenden los dominios CH2 y/o CH3 de la molécula multiespecífica de cadena mixta, con respecto a las cadenas polipeptídicas no modificadas. Mutaciones para favorecer la heterodimerización se describen en detalle más adelante.
Una o más cadenas de las moléculas multiespecíficas del formato multiespecífico de cadena mixta arriba descrito pueden comprender, además, otro dominio de reconocimiento de antígeno, p. ej., un scFv. En una realización, el scFv está dispuesto en el extremo C de la cadena. En una realización, el scFv está dispuesto C-terminal al dominio más C-terminal de un polipéptido que comprende un dominio constante de cadena pesada, p. ej., un dominio CH2 o un dominio CH3. En una realización, el scFv está dispuesto C-terminal al dominio CH3 de uno o más polipéptidos de la molécula multiespecífica de cadena mixta. El uno o más scFv pueden reconocer el mismo o diferente antígeno o epítopo que el reconocido por el primer o segundo dominio de unión a antígeno de la molécula multiespecífica de cadena mixta. En los casos en los que uno o más dominios de unión a antígeno, p. ej., scFvs, reconocen un epítopo o antígeno idéntico a uno de los dominios de unión a antígeno primero o segundo, la molécula es multivalente, p. ej., bivalente, con respecto a ese antígeno o epítopo. En una realización de la divulgación, los dominios de reconocimiento de antígenos de la molécula multiespecífica de cadena mixta reconocen uno o más antígenos del cáncer, p. ej., CLL-1, y el dominio de unión a antígeno adicional, p. ej., scFv, reconoce un antígeno o epítopo de una célula efectora inmunitaria, p. ej.,, una célula T o célula NK, p. ej., CD3, CD64 o CD16.
El experto en la materia apreciará que las moléculas multiespecíficas de cadena mixta de la presente invención pueden estabilizarse enlazando covalentemente una o más de las cadenas polipeptídicas de la molécula. Enlazadores son conocidos en la técnica y pueden ser químicos o peptídicos. El enlace puede ser a lo largo de la cadena principal del polipéptido (p. ej., de extremo a extremo), de la cadena lateral de aminoácidos a la cadena lateral o de la cadena lateral de los aminoácidos al extremo.
En realizaciones, cualquier mitad de la molécula de formato mixto puede comprender una o más de las secuencias de la región constante arriba descritas en las secciones sobre scFv-Fc o cuerpos duales. En una realización preferida, la mitad de la molécula de formato mixto que comprende el scFv comprende una secuencia de región constante arriba descrita en la sección sobre scFv-Fc, y la mitad de la molécula de formato mixto que comprende polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada separados comprende secuencias de regiones constantes arriba descritas en la sección sobre cuerpos duales.
En la Figura 1 se muestran ejemplos del formato molécula multiespecífica de cadena mixta.
Formato 4: scFv en tándem
En un aspecto, la presente invención incluye una molécula multiespecífica que comprende un único polipéptido que comprende dos o más dominios scFv, enlazados por un enlazador adecuado. A modo de ejemplo, el polipéptido del scFv en tándem comprende, desde el extremo N al extremo C: VL1-enlazador-VH1-enlazador2-VH2-enlazador3-VL2. A modo de ejemplo, el polipéptido del scFv en tándem comprende, desde el extremo N al extremo C: VL1-enlazador-VH1-enlazador2-VL2-enlazador3-VH2. Los enlazadores pueden ser iguales o diferentes.
Los dominios scFv del scFv en tándem pueden estar separados adicionalmente por una molécula que añade estabilidad mejorada a la construcción, por ejemplo, una proteína de albúmina de suero humano o un fragmento de la misma.
En realizaciones, el scFv en tándem multiespecífico tiene la estructura representada en la Figura 1D. En realizaciones, la molécula multiespecífica de scFv en tándem comprende un primer scFv (que comprende el primer dominio de unión a antígeno, un dominio de unión anti-CLL-1, tal como se define en las reivindicaciones) y un segundo scFv (que comprende el segundo dominio de unión a antígeno, un dominio de unión anti-CD3, como se define en las reivindicaciones), conectado por un enlazador.
Ejemplos de Anticuerpos Multiespecíficos (biespecíficos) CD3 x CLL-1
Los anticuerpos de la siguiente tabla son ejemplos de anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL-1. Estos anticuerpos biespecíficos se generaron en un formato scFv-Fc, con un brazo de unión a CD3 en el formato scFv-Fc emparejado con un brazo de unión a CLL-1 en formato scFv-Fc mediante mutaciones de botones y agujeros para favorecer la heterodimerización de los dominios Fc.
Tabla 11 Anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL-1. Para cada una de las moléculas biespecíficas de CLL-1xCD3, el scFv-Fc de CLL-1 reseñado se emparejó con el anti -CD3-Fc (SEQ ID NO: 507) para formar la molécula biespecífica.
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En aspectos, la invención proporciona una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, que comprende un dominio de unión anti-CD3 que comprende una secuencia VL de SEQ ID NO: 1209 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 1236, y un dominio de unión anti-CLL-1 que comprende:
a) una secuencia VL de SEQ ID NO: 88 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 75;
b) una secuencia VL de SEQ ID NO: 89 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 76;
c) una secuencia VL de SEQ ID NO: 87 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 74;
d) una secuencia VL de SEQ ID NO: 85 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 72;
e) una secuencia VL de SEQ ID NO: 86 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 73;
f) una secuencia VL de SEQ ID NO: 83 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 70;
g) una secuencia VL de SEQ ID NO: 90 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 77;
h) una secuencia VL de SEQ ID NO: 79 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 66; o
i) una secuencia VL de SEQ ID NO: 84 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 71.
En aspectos, la invención proporciona una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, que comprende un dominio de unión anti-CD3 que comprende SEQ ID NO: 506, y un dominio de unión anti-CLL-1 que comprende:
a) SEQ ID NO: 49;
b) SEQ ID NO: 50;
c) SEQ ID NO: 48;
d) SEQ ID NO: 46;
e) SEQ ID NO: 47;
f) SEQ ID NO: 44;
g) SEQ ID NO: 51;
h) SEQ ID NO: 40; o
i) SEQ ID NO: 45.
En aspectos, la invención proporciona una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica (p. ej., una molécula biespecífica que tiene un formato scFv-Fc), que comprende un primer polipéptido que comprende un dominio de unión anti-CD3, en donde dicha primera cadena polipeptídica comprende, p. ej., consiste en SEQ ID NO: 507, y un segundo polipéptido que comprende un dominio de unión anti-CLL-1, en donde dicha segunda cadena polipeptídica comprende, p. ej., consiste en:
a) SEQ ID NO: 512;
b) SEQ ID NO: 517;
c) SEQ ID NO: 522;
d) SEQ ID NO: 527;
e) SEQ ID NO: 532;
f) SEQ ID NO: 537;
g) SEQ ID NO: 542;
h) SEQ ID NO: 547; o
i) SEQ ID NO: 552.
IV. Especificidad de Unión
Las moléculas de la presente invención pueden ser multiespecíficas multivalentes, monoespecíficas multivalentes, multiespecíficas monovalentes o monoespecíficas monovalentes.
En una realización, la molécula es una molécula bivalente (p. ej., un anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo bivalente). En un aspecto particular, la presente molécula tiene dos especificidades de unión si el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno reconocen dos antígenos diferentes o dos epítopos diferentes en el mismo antígeno. En otro aspecto particular, si el primer y segundo dominios de unión a antígeno se unen al mismo antígeno/epítopo, la molécula es una molécula mono-específica. La incorporación de dominios de unión a antígeno adicionales, p. ej., mediante la incorporación de uno o más dominios de unión a antígeno scFv adicionales, puede formar una molécula multiespecífica cuando el uno o más dominios de unión a antígeno scFv adicionales reconocen un antígeno/epítopo diferente que el primer y segundo dominios de unión a antígeno.
Se conocen en la técnica ensayos estándares para evaluar la especificidad de unión de los anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos a diversos epítopos y/o antígenos, incluyendo, por ejemplo, análisis Biacore o afinidad relativa FACS (Scatchard), ELISAs, transferencias Western y RIAs. Ensayos adecuados se describen en detalle en la Definición y los Ejemplos.
V. Propiedad Física/Rendimiento
En determinadas realizaciones, la presente molécula ofrece propiedades físicas deseables, tales como una termoestabilidad sustancialmente igual o aumentada con respecto a la de los anticuerpos naturales.
Termoestabilidad se refiere a la estabilidad de la proteína durante el estrés por calor, que es la capacidad de una proteína de retener la propiedad característica cuando se calienta moderadamente. Cuando se exponen al calor, las proteínas experimentarán un proceso de desnaturalización/desplegado y expondrán residuos hidrofóbicos. Cada una de las proteínas se desdobla completamente en respuesta al calor a una temperatura característica. La temperatura en el punto medio del proceso de despliegue de la proteína se define como Tm, que es una característica física importante para una proteína y se puede medir con las técnicas conocidas en la técnica. A molécula multiespecífica que tiene un valor relativamente alto de Tm es habitualmente deseable debido a que un alto valor de Tm a menudo indica menos agregación cuando se utiliza para preparar una composición farmacéutica. Además, una Tm alta también puede dar como resultado una mayor expresión y rendimiento.
En una realización particular, la molécula multiespecífica de la presente invención tiene sustancialmente la misma Tm en comparación con la de un anticuerpo IgG.
En aún otra realización, la presente divulgación incluye un método para generar una molécula multiespecífica que tiene sustancialmente la misma termoestabilidad que un anticuerpo de referencia, que comprende 1) diseñar una molécula de uno de los formatos descritos en esta memoria; 2) producir la molécula en una célula huésped; y 3) medir y comparar la Tm de la molécula de y la referencia de anticuerpo.
Sistemas de cultivo celular se han utilizado ampliamente para expresar fragmentos de anticuerpos, pero ha habido pocos intentos de expresar y recuperar con un alto rendimiento anticuerpos funcionales de longitud completa y totalmente ensamblados. Debido a la estructura compleja y al gran tamaño de los anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos totalmente ensamblados, a menudo es difícil lograr el plegamiento y ensamblaje adecuados de las cadenas pesada y ligera expresadas, especialmente en células bacterianas. Este problema es especialmente desafiante cuando se producen moléculas multiespecíficas. Debido al emparejamiento aleatorio de dos cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos diferentes dentro de las células huésped, sólo un pequeño porcentaje del anticuerpo o de la especie similar a un anticuerpo ensamblad son las moléculas multiespecíficas funcionales deseadas. Debido a la presencia de subproductos mal emparejados y a rendimientos de producción significativamente reducidos, se requieren procedimientos de purificación sofisticados (véase, p. ej., Morrison, S. L., Nature Biotech 25 (2007) 1233­ 1234).
En algunas realizaciones, las presentes moléculas (p. ej., anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos), cuando se producen de forma recombinante en cultivos celulares equiparables, tienen sustancialmente el mismo rendimiento que cuando se produce un anticuerpo de referencia. En particular, en las mismas condiciones de cultivo, que se expresa por el mismo tipo de células huésped, las moléculas tienen sustancialmente los mismos niveles de expresión que un anticuerpo de referencia. Los niveles de expresión de la molécula producida se pueden medir con las técnicas estándar de la técnica, tales como densitometría de barrido de geles SDS-PAGE y/o inmunotransferencias y el ensayo AME5-RP. El rendimiento de anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos también se puede cuantificar mediante un chip sensor de proteína A utilizando Qctec Red (Fotrte Bio).
La presente divulgación incluye un método de generar una molécula multiespecífica que tiene sustancialmente el mismo rendimiento que la producción de un anticuerpo de referencia, que comprende 1) diseñar una molécula de la presente invención descrita en esta memoria; 2) producir la molécula en una célula huésped; y 3) medir y comparar el nivel de expresión de dicha molécula con dicho anticuerpo de referencia.
VI. Modificación de las Moléculas de la Presente Invención
I. Moléculas con Heterodimerización Potenciada
Una heterodimerización inadecuada de dos dominios de la cadena pesada del anticuerpo ha sido siempre un obstáculo para aumentar el rendimiento de moléculas multiespecíficas deseadas y representan desafíos para la purificación. Una diversidad de enfoques disponibles en la técnica se puede utilizar para potenciar la dimerización de los dos dominios de cadena pesada de anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo biespecífico o multiespecífico, tal como se describe en el documento EP 1870459A1; Pat. de EE.UU. N° 5.582.996; Pat. de EE.UU. N° 5.731.168, Pat. de EE.UU. N° 5.910.573, Pat. de EE.UU. N° 5.932.448; Pat. de EE.UU. N° 6.833.441; Pat. de EE.UU. N° 7.183.076; Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2006204493A1; y Publicación PCT N° WO2009/089004A1.
La presente divulgación proporciona métodos de potenciar la dimerización (hetero-dimerización) de dos interactuar polipéptidos heterólogos y/o de reducir la dimerización (homo-dimerización) de dos polipéptidos idénticos. Típicamente, cada uno de los dos polipéptidos que interactúan comprende un dominio CH3 de un anticuerpo. Los dominios CH3 se derivan de la región constante de un anticuerpo de cualquier isotipo, clase o subclase, y preferiblemente de la clase IgG (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4).
Típicamente, los polipéptidos comprenden otros fragmentos de anticuerpos además de los dominios CH3, tales como dominios CH1, dominios CH2, dominio bisagra, dominio(s) VH, dominio(s) VL, CDR(s) y/o fragmentos de unión a antígeno descritos en esta memoria. Estos fragmentos de anticuerpos se derivan de diversos tipos de anticuerpos descritos en esta memoria, por ejemplo, anticuerpo policlonal, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, anticuerpos camelizados, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) y conjugados de anticuerpos. En algunas realizaciones, los dos hetero-polipéptidos son dos cadenas pesadas que forman moléculas biespecíficas o multiespecíficas. La heterodimerización de las dos cadenas pesadas diferentes en los dominios CH3 da lugar al anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo deseado, mientras que la homodimerización de cadenas pesadas idénticas reducirá el rendimiento del anticuerpo o molécula deseado. En una realización ilustrativa, las dos o más cadenas heteropolipeptídicas comprenden dos cadenas que comprenden dominios CH3 y que forman las moléculas de cualquiera de los Formatos de moléculas multiespecíficas arriba descritos de la presente invención. En una realización, las dos cadenas heteropolipeptídicas que comprenden dominios CH3 comprenden modificaciones que favorecen la asociación heterodimérica de los polipéptidos, en relación con las cadenas no modificadas. A continuación se proporcionan diversos ejemplos de estrategias de modificación.
Botón en un Agujero (KIH)
Moléculas multiespecíficas, p. ej., anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos multiespecíficos de la presente invención pueden comprender una o más, p. ej., una pluralidad de mutaciones en uno o más de los dominios constantes, p. ej., en los dominios CH3. En un ejemplo, la molécula multiespecífica de la presente invención comprende dos polipéptidos, cada uno de los cuales comprende un dominio constante de cadena pesada de un anticuerpo, p. ej., un dominio CH2 o CH3. En un ejemplo, los dos dominios constantes de cadena pesada, p. ej., los dominios c H2 o CH3 de la molécula multiespecífica comprenden una o más mutaciones que permiten una asociación heterodimérica entre las dos cadenas. En un aspecto, la una o más mutaciones están dispuestas en el dominio CH2 de las dos cadenas pesadas del anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo multiespecífico, p. ej., biespecífico. En un aspecto, la una o más mutaciones están dispuestas en los dominios CH3 de al menos dos polipéptidos de la molécula multiespecífica. En un aspecto, la una o más mutaciones en un primer polipéptido de la molécula multiespecífica que comprende un dominio constante de cadena pesada crea un "botón" y la una o más mutaciones en un segundo polipéptido de la molécula multiespecífica que comprende un dominio constante de cadena pesada crea un "agujero", de tal manera que la heterodimerización del polipéptido de la molécula multiespecífica que comprende un dominio constante de cadena pesada hace que el "botón" haga interfaz (p. ej., interactúe, p. ej., un dominio CH2 de un primer polipéptido que interactúa con un dominio CH2 de un segundo polipéptido, o un dominio CH3 de un primer polipéptido que interactúa con un dominio CH3 de un segundo polipéptido) con el "agujero". Tal como se utiliza el término en esta memoria, un "botón" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que se proyecta desde la interfaz de un primer polipéptido de la molécula multiespecífica que comprende un dominio constante de cadena pesada y, por lo tanto, se puede colocar en un "agujero" compensatorio en la interfaz con un segundo polipéptido de la molécula multiespecífica que comprende un dominio constante de cadena pesada para estabilizar el heteromultímero y, con ello, favorecer la formación de heteromultímero sobre la formación de homomultímero, por ejemplo El botón puede existir en la interfaz original o puede introducirse sintéticamente (p. ej., alterando el ácido nucleico que codifica la interfaz). Los residuos de importación preferidos para la formación de un botón son generalmente residuos de aminoácidos que se producen de forma natural y se seleccionan preferiblemente de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). Los más preferidos son triptófano y tirosina. En la realización preferida, el residuo original para la formación de la protuberancia tiene un volumen de cadena lateral pequeño, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina.
Un "agujero" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que está rebajada de la interfaz de un segundo polipéptido de la molécula multiespecífica que comprende un dominio constante de cadena pesada y, por lo tanto, aloja un botón correspondiente en la superficie de interfaz adyacente de un primer polipéptido de la molécula multiespecífica comprende un dominio constante de cadena pesada. El botón puede existir en la interfaz original o puede introducirse sintéticamente (p. ej., alterando el ácido nucleico que codifica la interfaz). Los residuos de importación preferidos para la formación de un agujero son habitualmente residuos de aminoácidos que se producen de forma natural y se seleccionan preferentemente de alanina (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). Los más preferidos son serina, alanina o treonina. En la realización preferida, el residuo original para la formación del agujero tiene un gran volumen de cadena lateral, tal como tirosina, arginina, fenilalanina o triptófano.
En una realización preferida, un primer dominio CH3 se muta en el residuo 366, 405 o 407 de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)) para crear un "botón" o un "agujero" (como se describió arriba), y el segundo dominio CH3, que heterodimeriza con el primer dominio CH3, está mutado en: residuo 407 si el residuo 366 está mutado en el primer dominio CH3, residuo 394 si el residuo 405 está mutado en el primer dominio CH3, o residuo 366 si el residuo 407 está mutado en el primer dominio CH3, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)), para crear un "agujero" o "botón" complementario al "botón" o "agujero" del primer dominio CH3.
En otra realización preferida, un primer dominio CH3 se muta en el residuo 366 de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol.
1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)) para crear un "botón" o un "agujero" (como se describió arriba), y el segundo dominio CH3, que heterodimeriza con el primer dominio CH3, está mutado en los residuos 366, 368 y/o 407 de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)), para crear un "agujero" o "botón" complementario al "botón" o "agujero" del primer dominio CH3. En una realización, la mutación al primer dominio CH3 introduce un residuo tirosina (Y) en la posición 366. En una realización, la mutación al primer CH3 es T366Y. En una realización, la mutación al primer dominio CH3 introduce un residuo triptófano (W) en la posición 366. En una realización, la mutación al primer CH3 es T366W. En realizaciones, la mutación en el segundo dominio CH3 que heterodimeriza con el primer dominio CH3 mutado en la posición 366 (p. ej., tiene una tirosina (Y) o un triptófano (W) introducido en la posición 366, p. ej., comprende la mutación T366Y o T366W), comprende una mutación en la posición 366, una mutación en la posición 368 y una mutación en la posición 407, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs.
688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)). En realizaciones, la mutación en la posición 366 introduce un residuo de serina (S), la mutación en la posición 368 introduce una alanina (A), y la mutación en la posición 407 introduce una valina (V). En realizaciones, las mutaciones comprenden T366S, L368A e Y407V. En una realización, el primer dominio CH3 de la molécula multiespecífica comprende la mutación T366Y, y el segundo dominio CH3 que heterodimeriza con el primer dominio CH3 comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V, o viceversa. En una realización, el primer dominio CH3 de la molécula multiespecífica comprende la mutación T366W, y el segundo dominio CH3 que heterodimeriza con el primer dominio CH3 comprende las mutaciones T366S, L368A e Y407V, o viceversa.
Pares de mutación de botón en el agujero adicionales adecuados para uso en cualquiera de las moléculas multiespecíficas de la presente invención se describen adicionalmente, por ejemplo, en el documento WO 1996/027011 y Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677- 681 (1998).
En cualquiera de las realizaciones descritas en esta memoria, los dominios CH3 se pueden mutar adicionalmente para introducir un par de residuos de cisteína. Sin pretender estar ligado por teoría alguna, se cree que la introducción de un par de residuos de cisteína capaces de formar un enlace disulfuro proporciona estabilidad a la molécula multiespecífica heterodimerizada. En realizaciones, el primer dominio CH3 comprende una cisteína en la posición 354, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)) y el segundo dominio CH3 que heterodimeriza con el primer dominio CH3 comprende una cisteína en la posición 349, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)). En realizaciones, el primer dominio CH3 de la molécula multiespecífica comprende una cisteína en la posición 354 (p. ej., comprende la mutación S354C) y una tirosina (Y) en la posición 366 (p. ej., comprende la mutación T366Y), y el segundo dominio CH3 que heterodimeriza con el primer dominio CH3 comprende una cisteína en la posición 349 (p. ej., comprende la mutación Y349C), una serina en la posición 366 (p. ej., comprende la mutación T366S), una alanina en la posición 368 (p. ej., comprende la mutación L368A) y una valina en la posición 407 (p. ej., comprende la mutación Y407V). En realizaciones, el primer dominio CH3 de la molécula multiespecífica comprende una cisteína en la posición 354 (p. ej., comprende la mutación S354C) y un triptófano (W) en la posición 366 (p. ej., comprende la mutación T366W), y el segundo dominio CH3 que heterodimeriza con el primer dominio CH3 comprende una cisteína en la posición 349 (p. ej., comprende la mutación Y349C), una serina en la posición 366 (p. ej., comprende la mutación T366S), una alanina en la posición 368 (p. ej., comprende la mutación L368A) y una valina en la posición 407 (p. ej., comprende la mutación Y407V).
Heterodimerización de IgG
En un aspecto, la heterodimerización de las cadenas polipeptídicas (p. ej., de los semianticuerpos) de la molécula multiespecífica se incrementa mediante la introducción de una o más mutaciones en un dominio CH3 que se deriva de la clase de anticuerpo IgG1. En una realización, las mutaciones comprenden una mutación K409R en un dominio CH3 emparejada con la mutación F405L en el segundo dominio CH3, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)). Mutaciones adicionales pueden estar también, o alternativamente, en las posiciones 366, 368, 370, 399, 405, 407 y 409 de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)). Preferiblemente, la heterodimerización de polipéptidos que comprenden mutaciones de este tipo se logra en condiciones reductoras, p. ej., 2-MEA 10-100 mM (p. ej., 2-MeA 25, 50 o 100 mM) durante 1-10, p. ej., 1,5-5, p. ej. 5, horas a 25-37°C, p. ej., 25°C o 37°C.
Los reemplazos de aminoácidos descritos en esta memoria se introducen en los dominios CH3 utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Normalmente, el ADN que codifica la o las cadenas pesadas se modifica mediante ingeniería genética utilizando las técnicas descritas en Mutagenesis: a Practical Approach. La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un método preferido para preparar variantes de sustitución del ADN que codifica las dos cadenas pesadas híbridas. Esta técnica es bien conocida en la técnica como la describen Adelman et al., (1983) DNA, 2:183.
La estrategia de heterodimerización de IgG se describe, por ejemplo, en los documentos WO2008/119353, WO2011/131746 y WO2013/060867.
En cualquiera de las realizaciones descritas en esta memoria, los dominios CH3 se pueden mutar adicionalmente para introducir un par de residuos de cisteína. Sin pretender estar ligado por teoría alguna, se cree que la introducción de un par de residuos de cisteína capaces de formar un enlace disulfuro proporciona estabilidad a la molécula multiespecífica heterodimerizada. En realizaciones, el primer dominio CH3 comprende una cisteína en la posición 354, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)) y el segundo dominio CH3 que heterodimeriza con el primer dominio CH3 comprende una cisteína en la posición 349, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)).
Puente Polar
En un aspecto, la heterodimerización de las cadenas polipeptídicas (p. ej., de los semianticuerpos) de la molécula multiespecífica se incrementa mediante la introducción de mutaciones en base a la racionalización "puenteo polar", que es hacer que los residuos en la interfaz de unión de los dos cadenas polipeptídicas interactúen con residuos de propiedad física similar (o complementaria) en la configuración del heterodímero, mientras que con residuos de propiedades físicas diferentes en la configuración del homodímero. En particular, estas mutaciones están diseñadas de manera que, en la formación de heterodímeros, los residuos polares interactúan con residuos polares, mientras que residuos hidrofóbicos interactúan con residuos hidrofóbicos. Por el contrario, en la formación de homodímeros, los residuos se mutan de modo que residuos polares interactúan con residuos hidrofóbicos. Las interacciones favorables en la configuración del heterodímero y las interacciones desfavorables en la configuración del homodímero trabajan juntas para hacer más probable que los dominios CH3 formen heterodímeros que homodímeros.
En una realización ilustrativa, las mutaciones anteriores se generan en una o más posiciones de los residuos 364, 368, 399, 405, 409 y 411 del dominio CH3, numeración de aminoácidos de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)).
En un aspecto, una o más mutaciones seleccionadas de un grupo que consiste en: Ser364Leu, Thr366Val, Leu368Gln, Asp399Lys, Phe405Ser, Lys409Phe y Thr411Lys se introducen en uno de los dos dominios CH3. (Ser364Leu: el residuo original de serina en la posición 364 es reemplazado por leucina; Thr366Val: el residuo original de treonina en la posición 366 es reemplazado por valina; Leu368Gln: el residuo original de leucina en la posición 368 es reemplazado por glutamina; Asp399Lys: residuo original de ácido aspártico en la posición 399 es reemplazado por lisina; Phe405Ser: el residuo original de fenilalanina en la posición 405 es reemplazado por serina; Lys409Phe: el residuo original de lisina en la posición 409 es reemplazado por fenilalanina; Thr411Lys: el residuo original de treonina en la posición 411 es reemplazado por lisina).
En otro aspecto, el otro CH3 puede introducirse con una o más mutaciones seleccionadas de un grupo que consiste en: Tyr407Phe, Lys409Gln y Thr411Asp (Tyr407Phe: el residuo original de tirosina en la posición 407 es reemplazado por fenialanina; Lys409Glu: el residuo original de lisina en la posición 409 es reemplazado por ácido glutámico; Thr411Asp: el residuo original de treonina en la posición 411 es reemplazado por ácido aspártico).
En un aspecto adicional, un dominio CH3 tiene una o más mutaciones seleccionadas de un grupo que consiste en: Ser364Leu, Thr366Val, Leu368Gln, Asp399Lys, Phe405Ser, Lys409Phe y Thr411Lys, mientras que el otro dominio CH3 tiene una o más mutaciones seleccionadas de un grupo que consiste en: Tyr407Phe, Lys409Gln y Thr411Asp.
En una realización ilustrativa, el residuo original de treonina en la posición 366 de un dominio CH3 es reemplazado por valina, mientras que el residuo original de tirosina en la posición 407 del otro dominio CH3 es reemplazado por fenilalanina.
En otra realización ilustrativa, el residuo original de serina en la posición 364 de un dominio CH3 es reemplazado por leucina, mientras que el residuo original de leucina en la posición 368 del mismo dominio CH3 es reemplazado por glutamina.
En aún otra realización ilustrativa, el residuo original de fenilalanina en la posición 405 de un dominio CH3 es reemplazado por serina y el residuo original de lisina en la posición 409 de este dominio CH3 es reemplazado por fenilalanina, mientras que el residuo original de lisina en la posición 409 del otro dominio CH3 es reemplazado por glutamina.
En aún otra realización ilustrativa, el residuo original de ácido aspártico en la posición 399 de un dominio CH3 es reemplazado por lisina, y el residuo original de treonina en la posición 411 del mismo dominio CH3 es reemplazado por lisina, mientras que el residuo original de treonina en la posición 411 del otro dominio CH3 es reemplazada por ácido aspártico.
Los reemplazos de aminoácidos descritos en esta memoria se introducen en los dominios CH3 utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Normalmente, el ADN que codifica la o las cadenas pesadas se modifica mediante ingeniería genética utilizando las técnicas descritas en Mutagenesis: a Practical Approach. La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un método preferido para preparar variantes de sustitución del ADN que codifica las dos cadenas pesadas híbridas. Esta técnica es bien conocida en la técnica como la describen Adelman et al., (1983) DNA, 2:183.
La estrategia del puente bipolar se describe, por ejemplo, en los documentos WO2006/106905, WO2009/089004 y K.Gunasekaran, et al. (2010) The Journal of Biological Chemistry, 285:19637-19646.
En cualquiera de las realizaciones descritas en esta memoria, los dominios CH3 se pueden mutar adicionalmente para introducir un par de residuos de cisteína. Sin pretender estar ligado por teoría alguna, se cree que la introducción de un par de residuos de cisteína capaces de formar un enlace disulfuro proporciona estabilidad a la molécula multiespecífica heterodimerizada. En realizaciones, el primer dominio CH3 comprende una cisteína en la posición 354, de acuerdo con el esquema de numeración de la u E de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)) y el segundo dominio CH3 que heterodimeriza con el primer dominio CH3 comprende una cisteína en la posición 349, de acuerdo con el esquema de numeración de la UE de Kabat et al. (págs. 688-696 en Sequences of proteins of immunological interest, 5a ed., Vol. 1 (1991; NIH, Bethesda, Md.)).
II. Moléculas Con Modificaciones de la Región Variable
Cada uno de los dominios VH y VL N-terminales y los dominios VH y VL C- terminales de la molécula (p. ej., anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo) de la presente invención comprende secuencias de regiones hipervariables CDR1, CDR2 y CDR3. En determinadas realizaciones, una o más de estas secuencias de CDR tienen modificaciones conservativas de las secuencias de aminoácidos, y en donde las moléculas modificadas retienen o tienen propiedades de unión potenciadas en comparación con los anticuerpos parentales.
Además, se ha encontrado que en determinados casos es beneficioso mutar residuos dentro de las regiones marco para mantener o potenciar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. N°s 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 expedidas a Queen et ai). Las moléculas (p. ej., anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos) de la presente invención se pueden modificar introduciendo mutaciones de este tipo en sus marcos de región variable con el fin de mejorar las propiedades de unión.
Otro tipo de modificación de la región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de los dominios VH y/o VL CDR1, CDR2 y/o CDR3 para mejorar con ello una o más propiedades de unión (p. ej., afinidad) de la molécula (p. ej., anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo) de interés, conocida como "maduración por afinidad". Se puede realizar una mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir la o las mutaciones y el efecto sobre la unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés puede evaluarse en ensayos in vitro o in vivo tal como se describe en este memoria y se proporciona en los Ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservativas (como se comentó arriba). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Además, típicamente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR.
Variantes de la secuencia de aminoácidos de las presentes moléculas se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en los ADN codificantes, o mediante la síntesis de las variantes deseadas. Variantes de este tipo incluyen, por ejemplo, deleciones o inserciones o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de las moléculas presentes. Se realiza cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características de unión a antígeno deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales de las moléculas tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación.
La presente solicitud incluye variantes de las moléculas descritas en esta memoria y/o fragmentos de las mismas que tienen modificaciones conservativas de aminoácidos en regiones variables y/o regiones constantes.
III. Moléculas con una Semivida Prolongada in vivo.
La presente molécula se puede modificar adicionalmente para que tenga una semivida prolongada in vivo.
Se puede utilizar una diversidad de estrategias para prolongar la semivida de las moléculas de la presente invención. Por ejemplo, mediante enlace químico con polietilenglicol (PEG), reCODE PEG, armazón de anticuerpos, ácido polisálico (PSA), hidroxietil almidón (HES), ligandos de unión a albúmina y protectores de hidratos de carbono; por fusión genética a proteínas que se unen a proteínas del suero, tales como albúmina, IgG, FcRn y transferencia; mediante acoplamiento (genética o químicamente) a otros restos de unión que se unen a proteínas del suero, tales como nanocuerpos, Fabs, DARPins, avímeros, aficuerpos y anticalinas; por fusión genética con rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de unión a albúmina y Fc; o mediante incorporación en nanoportadores, formulaciones de liberación lenta, o dispositivos médicos.
Las moléculas de la presente invención que tienen una semivida incrementada in vivo también se pueden generar introduciendo una o más modificaciones de aminoácidos (es decir, sustituciones, inserciones o deleciones) en un dominio constante de IgG, o un fragmento de unión de FcRn del mismo (preferiblemente un Fc o fragmento de dominio Fc de bisagra). Véase, p. ej., la Publicación Internacional N° WO 98/23289; la Publicación Internacional N° WO 97/34631; y la Patente de EE.UU. N° 6.277.375.
Además, las moléculas se pueden conjugar con albúmina con el fin de hacer que las moléculas sean más estables in vivo o tengan una semivida más prolongada in vivo. Las técnicas son bien conocidas en la técnica, véanse, p. ej., las Publicaciones Internacionales N°s WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la Patente europea N° EP 413.622.
Las moléculas de la presente invención también pueden fusionarse con uno o más polipéptidos de albúmina de suero humano (HSA), o una porción de los mismos. El uso de albúmina como un componente de una proteína de fusión de albúmina como un soporte para diversas proteínas se ha sugerido en los documentos WO 93/15199, WO 93/15200 y EP 413 622. También se ha propuesto el uso de fragmentos N-terminales de HSA para fusiones con polipéptidos (documento EP 399666). Por consiguiente, al fusionar o conjugar genética o químicamente las moléculas a albúmina, se puede estabilizar o prolongar el tiempo de conservación, y/o retener la actividad de las moléculas durante períodos prolongados de tiempo en solución, in vitro y/o in vivo. Se pueden encontrar métodos adicionales relacionados con las fusiones de HSA, por ejemplo, en los documentos WO 2001077137 y WO 200306007. En una realización específica, la expresión de la proteína de fusión se realiza en líneas celulares de mamíferos, por ejemplo, líneas celulares de CHO
IV. Silenciamiento de Fc
Sin estar ligado a la teoría, en realizaciones que incorporan uno o más dominios constantes, p. ej., regiones constantes de cadena pesada, puede ser beneficioso incluir una o mutaciones para silenciar, p. ej., la función efectora de ADCC y/o CDC dentro de hFc. La activación de la célula inmunitaria se produce preferentemente en presencia de reticulación con la célula diana. Sin embargo, el Fc humano puede unirse a receptores gamma de FcR de alta y baja afinidad. Por lo tanto, la reticulación de receptores (p. ej., CD3) en la célula inmunitaria y el agonismo posterior pueden producirse tras la unión en ausencia de fijación como objetivo del tumor. Además, la reticulación de Fc a través de receptores gamma puede inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Fc humano cuando forma un complejo en la superficie celular también puede unirse a proteínas del complemento e inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Las mutaciones a residuos en Fc que reducen o anulan estas interacciones pueden limitar, por lo tanto, estos efectos y enfocar el impacto de las moléculas descritas en la presente memoria sobre la célula diana del tumor. En realizaciones, uno o más, p. ej., todos los dominios de la región constante de cadena pesada de la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo biespecífico comprenden la mutación DAPA (p. ej., D265A y P329A en la numeración de la UE). Véase, p. ej., Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, Fox JA, Presta LG. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 2001;276(9):6591-604; Publicación de Patente de EE.UU.
US2015/0320880 A1. En realizaciones, uno o más, p. ej., todos los dominios de la región constante de cadena pesada
de la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo biespecífico comprenden la mutación LALA (p. ej., L234A y L235A en la numeración de la UE). P. ej., Hezareh M, Hessell AJ, Jensen RC, van de Winkel JGJ, Parren PWHI. Effector Function Activities of a Panel of Mutants of a Broadly Neutralizing Antibody against Human Immunodeficiency Virus Type 1. Journal of Virology. 2001;75(24):12161-12168; Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, Fox JA, Presta LG.
Mapeo de alta resolución del sitio de unión en IgG1 humana para Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII y FcRn
y diseño de variantes de IgG1 con unión mejorada a Fc gamma R. J Biol Chem. 2001;276(9):6591-604. En realizaciones, uno o más, p. ej., todos los dominios de la región constante de cadena pesada de la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo o molécula similar a un anticuerpo biespecífico comprenden una mutación N279A (de acuerdo con la numeración de la UE). P. ej., Tao MH(1), Morrison SL. Studies
of aglycosylated chimeric mouse-human IgG. Role of carbohydrate in the structure and effector functions mediated by the human IgG constant region. J Immunol. 1989; 143(8):2595-601; Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae
J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, Fox JA, Presta LG. High resolution mapping of the binding site on human
IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to
the Fc gamma R. J Biol Chem. 2001;276(9):6591-604.
V. Conjugados
La presente invención incluye moléculas multiespecíficas (p. ej. anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos) o los fragmentos de las mismas fusionados de manera recombinante o conjugadas químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento de la misma, preferiblemente a un polipéptido) de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. Métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos o péptidos con un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo son conocidos
en la técnica. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. N°s 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851 y 5.112.946; Patentes europeas N°s EP 307.434 y EP 367.166; Publicaciones Internacionales N°s WO 96/04388 y w O 91/06570; Ashkenazi et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zheng et al., (1995) J. Immunol.
154:5590-5600; y Vil et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.
Se pueden generar proteínas de fusión adicionales mediante las técnicas de barajado de genes, barajado de motivos, barajado de exones y/o barajado de codones (a los que se alude colectivamente como "barajado de a Dn "). El barajado
de ADN se puede emplear para alterar las actividades de moléculas de la invención o fragmentos de las mismas (p.
ej., moléculas o fragmentos de las mismas con altas afinidades y bajas tasas de disociación). Véanse, en general, las Patentes de EE.UU. N°s 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 y 5.837.458; Patten et al., (1997) Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33; Harayama, (1998) Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., (1999) J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, (1998) Biotechniques 24(2):308- 313. Las moléculas descritas en esta memoria o fragmentos
de las mismas pueden alterarse sometiéndolas a mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a errores, inserción aleatoria de nucleótidos u otros métodos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un fragmento de
la presente molécula puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Además, las presentes moléculas o fragmentos de las mismas pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tales
como un péptido, para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Tal como se describe
en Gentz et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, por ejemplo, la hexahistidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras etiquetas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero
no se limitan a la etiqueta de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina
de la influenza (Wilson et al., (1984) Cell 37:767), y la etiqueta "flag".
En otras realizaciones, las moléculas de la presente invención o fragmentos de las mismas se conjugan con un agente
de diagnóstico o detectable. Moléculas de este tipo pueden ser útiles para monitorizar o pronosticar el inicio, desarrollo, progresión y/o gravedad de una enfermedad o trastorno como parte de un procedimiento de ensayo clínico, tal como determinar la eficacia de una terapia particular. Un diagnóstico y una detección de este tipo se pueden realizar acoplando las moléculas a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a diversas enzimas, tales como, pero no limitadas a peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos protésicos, tales como, pero no limitados a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales
como, pero no limitados a umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no limitados a luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero no limitados a luciferasa, luciferina y aequorina; materiales radiactivos, tales como, pero no limitados a yodo (131I, 125I, 123I e 121I,), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio(115In, 113In, e 111In,), tecnecio (99Tc), tallio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenon (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 117estaño; y metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías por emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos.
La presente solicitud abarca, además, usos de las presentes moléculas o fragmentos de las mismas conjugadas con un resto terapéutico. Las moléculas de la presente invención o fragmentos de las mismas pueden conjugarse con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, p. ej., un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo, p. ej., emisores alfa. Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.
Además, la presente molécula o fragmento de la misma se puede conjugar con un resto terapéutico o un resto de fármaco que modifica una respuesta biológica dada. Los restos terapéuticos o los restos de fármacos no deben interpretarse como limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína, un péptido o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Proteínas de este tipo pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina del cólera o toxina diftérica; una proteína, tal como factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, un agente apoptótico, un agente antiangiogénico; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfoquina.
En una realización, la presente molécula, o un fragmento de la misma, se conjuga con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (p. ej., un inmunosupresor) o una radiotoxina. A conjugados de este tipo se les alude en esta memoria como "inmunoconjugados". A inmunoconjugados que incluyen uno o más citotoxinas se les alude como "inmunotoxinas". Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial (p. ej., mate) para las células. Ejemplos incluyen taxón, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, t. colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina), agentes de ablación (p. ej., mecloretamina, tioepa cloraxnbucilo, meifalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino, antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina). (Véase, por ejemplo, Seattle Genetics US20090304721).
Otros ejemplos de citotoxinas terapéuticas que pueden conjugarse con las moléculas de la presente invención incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas y derivados de las mismas. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo de caliqueamicina está disponible comercialmente (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).
Las citoxinas se pueden conjugar con las moléculas de la invención utilizando tecnología de enlazador disponible en la técnica. Ejemplos de tipos de enlazadores que se han utilizado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptidos. Puede elegirse un enlazador que sea, por ejemplo, susceptible de escisión por pH bajo dentro del compartimiento lisosómico o susceptible de escisión por proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en tejido tumoral, tales como catepsinas (p. ej., catepsinas B, C, D).
Para más información sobre los tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos con las moléculas, véase también Saito et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al., (2003) Cancer Immunol. Immunother: 52:328-337; Payne, (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan y Kreitman, (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter y Springer, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
Las moléculas de la presente invención también se pueden conjugar con un isótopo radiactivo para generar radiofármacos citotóxicos, a los que también se aluden como radioinmunoconjugados. Ejemplos de isótopos radiactivos que se pueden conjugar con moléculas para uso diagnóstico o terapéutico incluyen, pero no se limitan a, yodo 131, indio111, ytrio90 y lutecio177 Métodos para preparar radioinmunconjugados están establecidos en la técnica. Ejemplos de radioinmunoconjugados están disponibles comercialmente, incluyendo Zevalin™ (DEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden utilizar métodos similares para preparar radioinmunoconjugados utilizando las moléculas de la invención. En determinadas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N, N', N” , N"-tetraacético (DOTA) que puede unirse al anticuerpo mediante una molécula de enlazador. Moléculas de enlazador de este tipo se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo et al., (1998) Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., (1999) Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al., (1999) Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.
Técnicas para conjugar restos terapéuticos con anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos son bien conocidas, véase, p. ej., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents en Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., (1982) Immunol. Rev. 62:119-58.
Las moléculas también pueden fijarse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Soportes sólidos de este tipo incluyen, pero no se limitan a vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.
VII. Métodos de Preparar las Moléculas de la Presente Invención
En los casos en los que se reticulen polipéptidos de las moléculas multiespecíficas de la presente invención, estos enlaces funcionales se pueden lograr utilizando métodos conocidos en la técnica. Puede utilizarse una diversidad de agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), ofenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)ciclohexano- 1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, p. ej., Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. N° 78:118-132; Brennan et al., (1985) Science 229:81-83), y Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Alternativamente, los presentes moléculas se pueden generar de forma recombinante mediante la introducción de construcciones de ADN que codifican las moléculas deseadas en vectores de expresión y la expresión y el ensamblaje de las moléculas deseadas en las mismas células huésped.
A. Preparación de Cadenas Polipeptídicas
La primera etapa de producción de las presentes moléculas es preparar los semianticuerpos o polipéptidos componentes (es decir, la una o más cadenas polipeptídicas de las moléculas que comprenden el primer y segundo dominios de unión a antígeno). Si las moléculas se producen de forma recombinante, las moléculas de ácido nucleico que codifican el primer y el segundo semianticuerpos pueden prepararse primero.
Pueden producirse polipéptidos y anticuerpos y fragmentos de los mismos (p. ej., semianticuerpos) mediante una diversidad de técnicas, incluida la metodología de anticuerpos monoclonales convencional, p. ej., la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, (1975) Nature 256: 495. Pueden emplearse muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, p. ej., transformación viral u oncogénica de linfocitos B.
Un sistema animal para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión se conocen en la técnica También se conocen participantes en la fusión (p. ej., células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.
Los anticuerpos quiméricos o humanizados utilizados en la presente invención pueden prepararse basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describió arriba. El ADN que codifica inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede obtenerse del hibridoma murino de interés y modificarse por ingeniería genética para que contenga secuencias de inmunoglobulinas no murinas (p. ej., humanas) utilizando técnicas de biología molecular estándares. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas se pueden enlazar a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en la técnica (véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N° 4,816,567 expedida a Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas se pueden insertar en un marco humano utilizando métodos conocidos en la técnica. Véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N° 5225539 expedida a Winter, y las Pat. de EE.UU. N°s 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 expedidas a Queen et al.
En una determinada realización, el anticuerpo o las moléculas similares a un anticuerpo de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Anticuerpos monoclonales humanos de este tipo se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones a los que se alude en esta memoria como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se les alude colectivamente en esta memoria como "ratones de Ig humana".
El ratón HuMAb ® (Medarex, Inc.) contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (|j y y) ligera k humana no reordenadas, junto con mutaciones fijadas como objetivo que inactivan los loci de la cadena |j y k endógena (véase, p. ej., Lonberg, et al., (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones exhiben una expresión reducida de IgM o k de ratón y, en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena ligera y pesada humana introducidos experimentan un cambio de clase y una mutación somática para generar IgG k monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg et al., (1994) supra; revisado en Lonberg, (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg y Huszar, (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding y Lonberg, (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y el uso de ratones HuMAb y las modificaciones genómicas que portan dichos ratones se describen adicionalmente en Taylor et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen et al., (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor et al., (1994) International Immunology 579-591; y Fishwild et al., (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse, además, las Pat. de EE.UU. N°s 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas expedidas a Lonberg y Kay; Patente de EE.UU. N° 5.545.807 expedida a Surani et al.; Publicaciones PCT N°s WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas expedidas a Lonberg y Kay; y Publicación PCT N° WO 01/14424 expedida a Korman et al.
En otra realización, los anticuerpos humanos utilizados en la presente invención se pueden generar utilizando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulinas humanas en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Ratones de este tipo, a los que se alude en esta memoria como "ratones KM", se describen en detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 expedida a Ishida et al.
Además, en la técnica están disponibles sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden utilizarse para generar anticuerpos humanos utilizados en la presente invención. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgénico alternativo al que se alude como Xenomouse (Abgenix, Inc.). Ratones de este tipo se describen en, p. ej., las Pat. de EE.UU. N°s 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 expedidas a Kucherlapati et al.
Además, en la técnica están disponibles sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden utilizarse para generar anticuerpos humanos utilizados en la invención. Por ejemplo, pueden utilizarse ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, a los que se alude como "ratones TC"; ratones de este tipo se describen en Tomizuka et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Además, se han descrito en la técnica vacas que portan transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera (Kuroiwa et al., (2002) Nature Biotechnology 20: 889­ 894) y pueden utilizarse para generar anticuerpos humanos utilizados en la presente solicitud.
Anticuerpos monoclonales humanos también se pueden preparar utilizando métodos de presentación en fagos para rastrear genotecas de inmunoglobulina humana. Métodos de presentación en fagos de este tipo para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica o se describen en los ejemplos que figuran más adelante Véanse, por ejemplo, las Pat. de EE.UU. N°s 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 expedidas a Ladner et al.; las Patentes de EE.Uu . N°s 5.427.908 y 5.580.717 expedidas a Dower et al.; las Patentes de EE.UU. N°s 5.969.108 y 6.172.197 expedidas a McCafferty et al.; y las Patentes de EE.UU. N°s 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 expedidas a Griffiths et al.
Anticuerpos monoclonales humanos utilizados en la invención también se pueden preparar utilizando ratones SCID en los que se han reconstituido células inmunes humanas de manera que se pueda generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Ratones de este tipo se describen en, por ejemplo, las Pat. de e E.UU. N°s.
5.476.996 y 5.698.767 expedidas a Wilson et al.
Métodos de hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica y se comentan en la presente solicitud.
B. Métodos de Producir Moléculas de la Presente Invención de forma Recombinante
En una realización, la presente solicitud proporciona un método de producir las una o más cadenas polipeptídicas de la molécula multiespecífica de forma recombinante, que comprende: 1) producir una o más construcciones de ADN que comprende un molécula de ácido nucleico que codifica cada una de las cadenas polipeptídicas de la molécula multiespecífica; 2) introducir dicha construcción o construcciones de ADN en uno o más vector de expresión; 3) cotransfectar dicho vector o vectores de expresión en una o más células huésped; y 4) expresar y ensamblar la molécula en una célula huésped o en solución.
A este respecto, la divulgación proporciona un ácido nucleico aislado, p. ej., uno o más polinucleótidos, que codifican la molécula multiespecífica descrita en esta memoria, por ejemplo, una molécula multiespecífica que incluye un dominio de unión anti-CD3, p. ej., como se describe en esta memoria, y un dominio de unión anti-CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria. En realizaciones, el ácido nucleico aislado se dispone en un único polinudeótido continuo. En otras realizaciones, el polinucleótido aislado se dispone en dos o más polinucleótidos continuos.
En aspectos, el ácido nucleico incluye una secuencia que codifica un dominio de unión anti-CD3. En aspectos, el ácido nucleico incluye SEQ ID NO: 508 y SEQ ID NO: 509.
En aspectos, el ácido nucleico aislado incluye SEQ ID NO: 510.
En aspectos, el ácido nucleico aislado incluye SEQ ID NO: 511.
En aspectos, el ácido nucleico incluye una secuencia que codifica un dominio de unión anti-CLL-1. En aspectos, el ácido nucleico aislado incluye:
a) SEQ ID NO: 513 y SEQ ID NO: 514;
b) SEQ ID NO: 518 y SEQ ID NO: 519;
c) SEQ ID NO: 523 y SEQ ID NO: 524;
d) SEQ ID NO: 528 y SEQ ID NO: 529;
e) SEQ ID NO: 533 y SEQ ID NO: 534;
f) SEQ ID NO: 538 y SEQ ID NO: 539;
g) SEQ ID NO: 543 y SEQ ID NO: 544;
h) SEQ ID NO: 548 y SEQ ID NO: 549; o
i) SEQ ID NO: 553 y SEQ ID NO: 554.
En aspectos, el ácido nucleico aislado incluye:
a) SEQ ID NO: 515;
b) SEQ ID NO: 520;
c) SEQ ID NO: 525;
d) SEQ ID NO: 530;
e) SEQ ID NO: 535;
f) SEQ ID NO: 540;
g) SEQ ID NO: 545;
h) SEQ ID NO: 550; o
i) SEQ ID NO: 555.
En aspectos, el ácido nucleico aislado incluye:
a) SEQ ID NO: 516;
b) SEQ ID NO: 521;
c) SEQ ID NO: 526;
d) SEQ ID NO: 531;
e) SEQ ID NO: 536;
f) SEQ ID NO: 541;
g) SEQ ID NO: 546;
h) SEQ ID NO: 551; o
i) SEQ ID NO: 556.
En aspectos, el ácido nucleico aislado incluye una secuencia que codifica un dominio de unión anti-CD3, por ejemplo tal como se describe en esta memoria, y una secuencia que codifica un dominio de unión anti-CLL-1, por ejemplo tal como se describe en esta memoria. En aspectos, la secuencia que codifica el dominio de unión anti-CD3 y la secuencia que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 están dispuestas en polinucleótidos separados. En aspectos, la secuencia que codifica el dominio de unión anti-CD3 y la secuencia que codifica el dominio de unión anti-CLL-1 están dispuestas en un único polinucleótido.
En una realización ilustrativa, las secuencias de ADN que codifican la cadena ligera del primer semianticuerpo, la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del primer semianticuerpo, las secuencias de ADN que codifican la cadena ligera del segundo semianticuerpo y la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada del segundo semianticuerpo están dispuestas en vectores de expresión separados. Los vectores de expresión son entonces cotransfectado en una célula huésped en una relación que da lugar a un ensamblaje óptimo. Las cadenas pesadas y cadenas ligeras codificadas se expresan en la célula huésped y se ensamblan en moléculas funcionales.
En otra realización ilustrativa, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera del primer semianticuerpo están dispuestas en un vector de expresión y las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera del segundo semianticuerpo están dispuestas en un segundo vector de expresión. Los vectores de expresión pueden entonces ser co-transfectados en una célula huésped en una relación que da lugar a un ensamblaje óptimo. Las cadenas pesadas y cadenas ligeras codificadas se expresan en la célula huésped y se ensamblan en moléculas funcionales. Alternativamente, los vectores de expresión pueden transfectarse en diferentes poblaciones de células huésped y la molécula multiespecífica puede ensamblarse en solución.
Mutaciones deseadas en la región variable o la región constante de la molécula descrita en esta memoria, tales como para potenciar la heterodimerización, se pueden introducir en esta fase tal como se describe en esta memoria.
Las secuencias de ADN se pueden producir mediante síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagénesis por PCR de una secuencia existente (p. ej., secuencias tal como se describen en los Ejemplos que figuran más adelante) que codifican cadenas pesadas o ligeras de las presentes moléculas. La síntesis química directa de ácidos nucleicos se puede realizar mediante métodos conocidos en la técnica, tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90; el método del fosfodiéster de Brown et al., (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; y el método de soporte sólido de la Patente de EE.UU. N° 4.458.066. La introducción de mutaciones en una secuencia de polinucleótidos mediante PCR se puede realizar tal como se describe en, p. ej., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:967; y Eckert et al., (1991) PCR Methods and Applications 1:17.
También se proporcionan en la invención vectores de expresión y células huésped para producir las moléculas de acuerdo con la invención tal como se define en las reivindicaciones. Pueden emplearse diversos vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican cadenas o dominios de unión de la molécula. Pueden utilizarse vectores de expresión tanto basados en virus como no virales para producir los anticuerpos en una célula huésped de mamífero. Los vectores y sistemas no virales incluyen plásmidos, vectores episomales, típicamente con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, p. ej., Harrington et al., (1997) Nat Genet 15: 345). Por ejemplo, vectores no virales útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos en células de mamíferos (p. ej., humanas) incluyen pThioHis A, B y C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B y C, (Invitrogen, San Diego, CA), vectores Mp Sv y numerosos otros vectores conocidos en la técnica para expresar otras proteínas. Vectores virales útiles incluyen vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, vectores basados en SV40, virus del papiloma, virus de Epstein Barr HBP, vectores del virus vaccinia y virus Semliki Forest (SFV). Véase, Brent et al., (1995) supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807; y Rosenfeld et al., (1992) Cell 68:143.
La elección del vector de expresión depende de las células huésped previstas en las que se ha de expresar el vector. Típicamente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (p. ej., potenciadores) que están enlazados operativamente a los polinucleótidos que codifican una cadena o fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, se emplea un promotor inducible para prevenir la expresión de secuencias insertadas excepto en condiciones de inducción. Promotores inducibles incluyen, p. ej., arabinosa, lacZ, promotor de metalotioneína o un promotor de choque térmico. Cultivos de organismos transformados pueden expandirse en condiciones no inductoras sin sesgar la población para codificar secuencias cuyos productos de expresión son mejor tolerados por las células huésped. Además de los promotores, también pueden ser necesarios o deseados otros elementos reguladores para la expresión eficaz de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de las moléculas multiespecíficas. Estos elementos incluyen típicamente un codón de iniciación ATG y un sitio de unión al ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véase, p. ej., Scharf et al., (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125; y Bittner et al., (1987) Meth. Enzymol., 153: 516). Por ejemplo, el potenciador de SV40 o potenciador de CMV puede utilizarse para aumentar la expresión en células huésped de mamífero.
Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de la secuencia señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos, codificados al insertar las secuencias de cadena pesada y/o cadena ligera arriba descritas y/o fragmentos de las mismas. Más a menudo, las secuencias del anticuerpo o de moléculas similares a un anticuerpo insertadas se unen a secuencias señal antes de su inclusión en el vector. Los vectores a utilizar para recibir secuencias que codifican dominios variables de cadena ligera y pesada a veces también codifican regiones constantes o partes de las mismas. Vectores de este tipo permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, conduciendo con ello a la producción de anticuerpos intactos o moléculas similares a un anticuerpo o fragmentos de los mismos. Típicamente, regiones constantes de este tipo son humanas.
Las células huésped para albergar y expresar las presentes moléculas pueden ser procarióticas o eucarióticas. E. coli es un huésped procariótico útil para clonar y expresar los polinucleótidos de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriáceas, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procarióticos, también se pueden hacer vectores de expresión, que típicamente contienen secuencias de control de la expresión compatibles con la célula huésped (p. ej., un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de una diversidad de promotores bien conocidos, tales como el sistema de promotor de lactosa, un sistema de promotor de triptófano (trp), un sistema de promotor de beta-lactamasa o un sistema de promotor del fago lambda. Los promotores controlan típicamente la expresión, opcionalmente con una secuencia de operador, y tienen secuencias de sitios de unión a ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción. También se pueden emplear otros microbios, tales como la levaduras, para expresar el anticuerpo de la invención. También se pueden utilizar células de insectos en combinación con vectores de baculovirus.
En algunas realizaciones preferidas, se utilizan células huésped de mamífero para expresar y producir las moléculas de la presente invención. Por ejemplo, pueden ser una línea celular de hibridoma que exprese genes de inmunoglobulina endógenos (p. ej., el clon de hibridoma de mieloma 1D6.C9 como se describe en los Ejemplos) o una línea celular de mamífero que alberga un vector de expresión exógeno (p. ej., las células de mieloma SP2/0 ejemplificadas más adelante). Éstas incluyen cualquier célula animal o humana mortal normal o inmortal normal o anormal. Por ejemplo, se ha desarrollado un cierto número de líneas de células huésped adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, incluyendo las líneas de células CHO, diversas líneas de células Cos, células HeLa, líneas de células de mieloma, células B transformadas e hibridomas. El uso de cultivo de células de tejido de mamíferos para expresar polipéptidos se comenta generalmente en, p. ej., Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Vectores de expresión para células huésped de mamíferos pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véase, p. ej., Queen et al., (1986) Immunol. Rev. 89: 49-68), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Estos vectores de expresión contienen habitualmente promotores derivados de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos para el tipo de célula, específicos para la etapa y/o modulables o regulables. Promotores útiles incluyen, pero no se limitan a, el promotor de metalotioneína, el promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, el promotor Mm TV inducible por dexametasona, el promotor SV40, el promotor m Rp polIII, el promotor MPSV constitutivo, el promotor CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor humano inmediato-temprano de CMV), el promotor constitutivo de CMV y combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la técnica.
Métodos para introducir vectores de expresión que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procarióticas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden utilizar para otros huéspedes celulares. (Véase, en general, Sambrook, et al., supra). Otros métodos incluyen, p. ej., electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposomas, inyección y microinyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión: ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión con la proteína estructural del virus del herpes VP22 (Elliot y O'Hare, (1997) Cell 88: 223), captación de ADN potenciada por agentes y transducción ex vivo. Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, a menudo se deseará una expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable cadenas de anticuerpos o fragmentos de unión pueden prepararse utilizando vectores de expresión de la invención que contienen orígenes virales de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a un medio selectivo. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia permite el crecimiento de células que expresan con éxito las secuencias introducidas en medios selectivos. Células resistentes, transfectadas de forma estable, pueden proliferar utilizando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo de célula.
La presente molécula preferiblemente se recupera generalmente del medio de cultivo en forma de un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse del lisado de la célula huésped cuando se produce directamente sin una señal secretora. Si la molécula está unida a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución de detergente adecuada (p. ej., Triton-X 100).
Cuando la molécula se produce en una célula recombinante distinta de una de origen humano, está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar la molécula de proteínas o polipéptidos de células recombinantes para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas en cuanto al heteromultímero. Como una primera etapa, el medio de cultivo o el lisado normalmente se centrifuga para eliminar los restos celulares en partículas. Las moléculas producidas se pueden purificar convenientemente mediante cromatografía de hidroxiapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. También se encuentran disponibles otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina Sepharose, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio.
XI. Uso de las Moléculas de la Presente Invención
A. Uso Diagnóstico y Terapéutico
Dependiendo de los antígenos que son reconocidos por las moléculas de la presente invención, los presentes moléculas tienen muchas aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Por ejemplo, se pueden utilizar para inmunoensayos enzimáticos, uniéndose los brazos N-terminales a un epítopo específico en la enzima y uniéndose los brazos C-terminales a la matriz inmovilizante. El inmunoensayo enzimático utilizando moléculas similares a anticuerpos se comenta por Nolan et al. (Nolan et al., (1990) Biochem. Biophys. Acta. 1040:1-11) Las moléculas multiespecíficas también se pueden utilizar para el diagnóstico de diversas enfermedades tales como el cáncer (Songsivilai et al., (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315). En particular, un dominio de unión a antígeno de la molécula puede unirse a un antígeno canceroso y el otro sitio de unión puede unirse a un marcador detectable descrito en esta memoria, por ejemplo, un quelante que se une fuertemente a un radionucleido. (Le Doussal et al., (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:58-62 y Le Doussal et al., (1993) J. Nucl. Med. 34:1662-1671; Stickney et al., (1995) Cancer Res. 51:6650-6655).
Las presentes moléculas encuentran usos terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades humanas, por ejemplo, cáncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas, etc.
Por ejemplo, con al menos un dominio de unión a antígeno que se une a una diana tumoral o una diana patógena y al menos un segundo dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno de una célula efectora inmunitaria, p. ej., una célula T o una célula NK, las presentes moléculas de la divulgación son capaces de matar células tumorales o patógenos utilizando el sistema de defensa inmunológico del paciente utilizando el enfoque comentado en Segal et al., Chem. Immunol. 47:179 (1989) y Segal et al., Biologic Therapy of Cancer 2(4) DeVita et al. eds. J. B. Lippincott, Philadelphia (1992) p. 1.
De manera similar, las presentes moléculas también pueden mediar en el exterminio por parte de células T, por ejemplo, enlazando el complejo CD3 en las células T a un antígeno asociado a un tumor.
Las presentes moléculas también pueden utilizarse como agentes fibrinolíticos o adyuvantes de vacunas. Además, los anticuerpos o las moléculas similares a un anticuerpo pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades infecciosas (p. ej., para fijar como objetivo células efectoras a las células infectadas por virus, tales como el VIH o virus de la gripe o protozoos tales como Toxoplasma gondii), utilizados para suministrar inmunotoxinas a células tumorales o complejos inmunes diana a receptores de la superficie celular (Romet-Lemonne, Fanger y Segal Eds., Lienhart (1991) p. 249.). Las presentes moléculas también pueden usarse para suministrar inmunotoxina a células tumorales.
B. Composiciones Farmacéuticas
Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles que incluyen la molécula de la presente invención, la molécula se mezcla con un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mezclándolas con soportes, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma de, p. ej., polvos liofilizados, pastas, soluciones acuosas, lociones o suspensiones (véase, p. ej., Hardman, et al. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, Nueva York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: eral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y.).
La selección de un régimen de administración para un agente terapéutico depende de varios factores, incluyendo la tasa de recambio sérico o tisular de la entidad, el nivel de los síntomas, la inmunogenicidad de la entidad y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. En determinadas realizaciones, un régimen de administración maximiza la cantidad de agente terapéutico suministrada al paciente de acuerdo con un nivel aceptable de efectos secundarios. Por consiguiente, la cantidad de agente biológico administrado depende, en parte, de la entidad particular y la gravedad de la afección que se está tratando. Se dispone de orientación para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos, citoquinas y moléculas pequeñas (véase, p. ej., Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, R.U.; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, N.Y.; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, N.Y.; Baert, et al. (2003) Nueva Inglaterra J. Med. 348:601-608; Milgrom, et al. (1999) Nueva Inglaterra J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) Nueva Inglaterra J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz, et al. (2000) Nueva Inglaterra J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) Nueva Inglaterra J. Med. 348:24-32; Lipsky, et al. (2000) Nueva Inglaterra J. Med. 343:1594-1602).
La determinación de la dosis apropiada la realiza el médico, p. ej., utilizando parámetros o factores conocidos o de los que se sospecha en la técnica que afectan al tratamiento o se prevé que afecten al tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y luego se incrementa en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualesquiera efectos secundarios negativos. Medidas de diagnóstico importantes incluyen las de los síntomas de, p. ej., la inflamación o el nivel de citoquinas inflamatorias producidas.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxica para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, la sal o amida de los mismos, la vía de administración, el momento de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y factores similares conocidos en las técnicas médicas.
Las composiciones que comprenden las moléculas o los fragmentos de las mismas de la presente solicitud se pueden proporcionar mediante infusión continua o mediante dosis a intervalos de, p. ej., un día, una semana o 1-7 veces por semana. Las dosis pueden administrarse por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral o por inhalación. Un protocolo de dosis específico es aquel que implica la dosis máxima o la frecuencia de la dosis que evita efectos secundarios indeseables significativos. Una dosis semanal total puede ser de al menos
0,05 |jg/kg de peso corporal, al menos 0,2 |jg/kg, al menos 0,5 |jg/kg, al menos 1 |jg/kg, al menos 10 |jg/kg, al menos
100 jig/kg, al menos 0,2 mg/kg, al menos 1,0 mg/kg, al menos 2,0 mg/kg, al menos 10 mg/kg, al menos 25 mg/kg, o al menos 50 mg/kg (véase, p. ej., (2003) Nueva Inglaterra J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) Nueva Inglaterra
J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother: 52:133-144). La dosis deseada de las moléculas o fragmentos de las mismas es aproximadamente la misma que para un anticuerpo o polipéptido, en moles/kg de peso corporal. La concentración plasmática deseada de las moléculas o fragmentos de las mismas es aproximadamente, sobre una base de moles/kg de peso corporal. La dosis puede ser de al menos 15 jig, al menos 20 jig, al menos 25 jig, al menos 30 jig, al menos
35 jig, al menos 40 jig, al menos 45 jig, al menos 50 jig, al menos 55 jig, al menos 60 jig, al menos 65 jig, al menos
70 jig, al menos 75 jig, al menos 80 jig, al menos 85 jig, al menos 90 jig, al menos 95 dosis administradas a un sujeto pueden ascender al menos a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 o más.
Para las moléculas o fragmentos de las mismas de la invención, la dosificación administrada a un paciente puede ser de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosificación puede estar entre 0,0001 mg/kg y 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 5 mg/kg, 0,0001 y 2 mg/kg, 0,0001 y 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,75 mg/kg, 0,0001 mg/kg y 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg a 0,25 mg/kg, 0,0001 a 0,15 mg/kg, 0,0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg o 0,01 a 0,10 mg/kg del peso corporal del paciente.
La dosificación de las moléculas o fragmentos de las mismas de la presente solicitud puede calcularse utilizando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis a administrar en mg/kg. La dosis de las moléculas o fragmentos de las mismas de la presente solicitud puede ser 150 jig/kg o menos, 125 jig/kg o menos, 100 jig/kg o menos, 95 jig/kg o menos, 90 jig/kg o menos, 85 jig/kg o menos, 80 jig/kg o menos, 75 jig/kg o menos, 70 jig/kg o menos, 65 jig/kg o menos, 60 jig/kg o menos, 55 jig/kg o menos, 50 jig/kg o menos, 45 jig/kg o menos, 40 jig/kg o menos, 35 jig/kg o menos, 30 jig/kg o menos, 25 jig/kg o menos, 20 jig/kg o menos, 15 jig/kg o menos, 10 jig/kg o menos, 5 jig/kg o menos, 2,5 jig/kg o menos, 2 jig/kg o menos, 1,5 jig/kg o menos, 1 jig/kg o menos, 0,5 jig/kg o menos o 0,5 jig/kg o menos del peso corporal de un paciente.
La dosis unitaria de las moléculas o fragmentos de las mismas de la presente solicitud puede ser de 0,1 mg a 20 mg,
0,1 mg a 15 mg, 0,1 mg a 12 mg, 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 8 mg, 0,1 mg a 7 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 a 2,5 mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 a 15 mg, 0,25 a 12 mg, 0,25 a 10 mg, 0,25 a 8 mg, 0,25 mg a 7 mg, 0,25 mg a 5 mg, 0,5 mg a 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15 mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10 mg, 1 mg a 8 mg, 1 mg a 7 mg, 1 mg a 5 mg o 1 mg a 2,5 mg.
La dosificación de las moléculas o fragmentos de las mismas de la presente solicitud puede lograr un título en suero de al menos 0,1 jig/ml, al menos 0,5 jig/ml, al menos 1 jig/ml, al menos 2 jig/ml, al menos 5 jig/ml, al menos 6 jig/ml, al menos 10 jig/ml, al menos 15 jig/ml, al menos 20 jig/ml, al menos 25 jig/ml, al menos 50 jig/ml, al menos 100 jig/ml, al menos 125 jig/ml, al menos 150 jig/ml, al menos 175 jig/ml, al menos 200 jig/ml, al menos 225 jig/ml, al menos 250 jig/ml, al menos 275 jig/ml, al menos 300 jig/ml, al menos 325 jig/ml, al menos 350 jig/ml, al menos 375 jig/ml o al menos 400 jig/ml en un sujeto. Alternativamente, la dosificación de la molécula o fragmentos de la misma, de la presente solicitud puede lograr un título en suero de al menos 0,1 jig/ml, al menos 0,5 jig/ml, al menos 1 jig/ml, al menos 2 jig/ml, al menos 5 jig/ml, al menos 6 jig/ml, al menos 10 jig/ml, al menos 15 jig/ml, al menos 20 jig/ml, al menos 25 jig/ml, al menos 50 jig/ml, al menos al menos 100 jig/ml, al menos 125 jig/ml, al menos 150 jig/ml, al menos
175 |jg/ml, al menos 200 |jg/ml, al menos 225 |jg/ml, al menos 250 |jg/ml, al menos 275 |jg/ml, al menos 300 |jg/ml, al menos 325 jig/ml, al menos 350 jig/ml, al menos 375 jig/ml o al menos 400 jig/ml en el sujeto.
Las dosis de las moléculas o fragmentos de las mismas de la solicitud pueden repetirse y las administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
Una cantidad eficaz para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la afección que se esté tratando, la salud general del paciente, la vía del método y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios (véase, p. ej., Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, R.U.).
La vía de administración puede ser, p. ej., por aplicación tópica o cutánea, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intracerebroespinal, intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida o un implante (véase, p. ej., Sidman et al. (1983) Biopolymers 22:547-556; Langer, et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epstein, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; Pat. de EE.UU. N°s 6.350.466 y 6.316.024). En los casos en los que sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Además, también se puede emplear la administración pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante. Véase, p. ej., las Pat. de Ee .UU. N°s 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y Publicaciones PCT N°s WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903.
Una composición de la presente invención también puede administrarse mediante una o más vías de administración utilizando uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Vías de administración seleccionadas para moléculas o fragmentos de las mismas de la invención incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La administración real puede representar modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente por inyección, e incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, inyección e infusión subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal. Alternativamente, una composición de la presente solicitud se puede administrar por una vía no oral, tal como vía de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. En una realización, las moléculas o fragmentos de las mismas de la invención se administran por infusión. En otra realización, la proteína de unión a epítopo multiespecífica de la invención se administra por vía subcutánea.
Si las moléculas o fragmentos de las mismas de la invención se administran en un sistema de liberación controlada o liberación sostenida, puede utilizarse una bomba para lograr una liberación controlada o sostenida (véase Langer, supra; Sefton, 1987, Cr C Crit. Ref Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Se pueden utilizar materiales poliméricos para lograr una liberación controlada o sostenida de las terapias de la invención (véase, p. ej., Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg.
7 1:105); Pat. de EE.UU. N° 5.679.377, Pat. de EE.UU. N° 5.916.597, Pat. de EE.UU. N° 5.912.015, Pat. de EE.UU. N° 5.989.463, Pat. de EE.UU. N° 5,128,326; Publicación PCT N° WO 99/15154; y Publicación PCT N° WO 99/20253. Ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a poli(metacrilato de 2-hidroxi etilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicólidos) (PLGA) y poliortoésteres. En una realización, el polímero utilizado en una formulación de liberación sostenida es inerte, está libre de impurezas lixiviables, es estable al almacenamiento, estéril y biodegradable. Un sistema de liberación controlada o sostenida se puede disponer cerca de la diana profiláctica o terapéutica, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, págs. 115-138 (1984))
Sistemas de liberación controlada se comentan en la revisión de Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Se puede utilizar cualquier técnica conocida por un experto en la técnica para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden una o más moléculas o fragmentos de las mismas de la presente solicitud. Véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N° 4.526.938, publicación PCT WO 91/05548, publicación PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, y Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.
Si las moléculas o fragmentos de las mismas de la invención se administran por vía tópica, se pueden formular en forma de un ungüento, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, spray, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por un experto en la materia. Véase, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para formas de dosificación tópicas no pulverizables, se emplean típicamente formas viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un soporte o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica, en algunos casos, mayor que el agua. Formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, pomadas y similares, que, si se desea, se esterilizan o se mezclan con agentes auxiliares (p. ej., conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, tampones, o sales) para influir en diversas propiedades, tales como, por ejemplo, la presión osmótica. Otras formas de dosificación tópica adecuadas incluyen preparaciones en aerosol pulverizables, en las que el ingrediente activo, en algunos casos, en combinación con un soporte inerte sólido o líquido, se empaqueta en una mezcla con un componente volátil presurizado (p. ej., un propelente gaseoso, tal como freón) o en una botella exprimible. Si se desea, también se pueden añadir hidratantes o humectantes a las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación. Ejemplos de ingredientes adicionales de este tipo son bien conocidos en la técnica.
51 las composiciones que comprenden las moléculas o fragmentos de las mismas se administran por vía intranasal, se pueden formular en forma de aerosol, pulverización, neblina o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para uso de acuerdo con la presente invención se pueden administrar convenientemente en forma de una presentación de pulverización en forma de aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado (p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos (compuestos de, p. ej., gelatina) para uso en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
Métodos para la co-administración o el tratamiento con un segundo agente terapéutico, p. ej., una citoquina, un esteroide, agente quimioterapéutico, antibiótico o radiación, son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Hardman, et al. (eds.) (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Gilman, 10a ed., McGraw-Hill, Nueva York, N.Y.; Poole y Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; Chabner y Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila., Pa.). Una cantidad eficaz de agente terapéutico puede disminuir los síntomas en al menos un 10%; en al menos un 20%; en al menos aproximadamente un 30%; en al menos un 40% o en al menos un 50%.
Terapias adicionales (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos), que pueden administrarse en combinación con las moléculas o fragmentos de las mismas de la presente solicitud, pueden administrarse con menos de 5 minutos de diferencia, menos de 30 minutos de diferencia, 1 hora de diferencia, aproximadamente 1 hora. separados, con una diferencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas, una diferencia de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas, una diferencia de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas, una diferencia de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas, una diferencia de aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas, una diferencia de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas, una diferencia de aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas, una diferencia de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas, una diferencia de aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas, una diferencia de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas, una diferencia de aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas, una diferencia de aproximadamente 12 horas a 18 horas, una diferencia de 18 horas a 24 horas, una diferencia de 24 horas a 36 horas, una diferencia de 36 horas a 48 horas, una diferencia de 48 horas a 52 horas, una diferencia de 52 horas a 60 horas, una diferencia de 60 horas a 72 horas, una diferencia de 72 horas a 84 horas, una diferencia de 84 horas a 96 horas, una diferencia de 96 horas a 120 horas de las moléculas o fragmentos de las mismas de la invención. Las dos o más terapias pueden administrarse en una misma visita al paciente.
Las moléculas o fragmentos de las mismas de la invención y las otras terapias pueden administrarse cíclicamente. La terapia cíclica implica la administración de una primera terapia (p. ej., un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguida de la administración de una segunda terapia (p. ej., un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, opcionalmente seguida de la administración de una tercera terapia (p. ej., agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo y así sucesivamente, y repitiendo esta administración secuencial, es decir, el ciclo con el fin de reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias, para evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias y/o para mejorar la eficacia de las terapias.
En determinadas realizaciones, las moléculas o fragmentos de las mismas de la invención se pueden formular para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véanse, p. ej., las Pat. de EE.UU. N°s 4.522.811; 5,374,548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, mejorando así el suministro de fármacos fijados como objetivo (véase, p. ej., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Restos de fijación de objetivo ilustrativos incluyen folato o biotina (véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N° 5.416.016 expedida a Low et al); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p 120 (Schreier et al (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
La presente solicitud proporciona protocolos para la administración de una composición farmacéutica que comprende moléculas o fragmentos de las mismas de la presente solicitud sola o en combinación con otras terapias a un sujeto que lo necesite. Las terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente invención pueden administrarse de forma concomitante o secuencial a un sujeto. La terapia (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la presente invención también puede administrarse cíclicamente. La terapia cíclica implica la administración de una primera terapia (p. ej., un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguida de la administración de una segunda terapia (p. ej., un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo y repitiendo esta administración secuencial, es decir, el ciclo, con el fin de reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias (p. ej., agentes) para evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias (p. ej., agentes) y/o mejorar la eficacia de las terapias.
Las terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias de combinación de la invención se pueden administrar a un sujeto al mismo tiempo. La expresión "al mismo tiempo" no se limita a la administración de terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) exactamente al mismo tiempo, sino que significa que una composición farmacéutica que comprende moléculas o fragmentos de las mismas de la presente solicitud se administra a un sujeto. en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que las moléculas de la invención puedan actuar junto con la otra u otras terapias para proporcionar un beneficio incrementado que si se administraran de otro modo. Por ejemplo, cada una de las terapias puede administrarse a un sujeto al mismo tiempo o secuencialmente en cualquier orden en diferentes momentos; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, deben administrarse lo suficientemente próximas en el tiempo como para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada una de las terapias puede administrarse a un sujeto por separado, en cualquier forma apropiada y por cualquier vía adecuada. En diversas realizaciones, las terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos), se administran a un sujeto en menos de 15 minutos, menos de 30 minutos, menos de 1 hora de diferencia, aproximadamente 1 hora de diferencia, aproximadamente 1 hora a aproximadamente 2 horas de diferencia, aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, 24 horas de diferencia, 48 horas de diferencia, 72 horas de diferencia o 1 semana de diferencia. En otras realizaciones, se administran dos o más terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) dentro de una visita del mismo paciente.
Los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación se pueden administrar a un sujeto en la misma composición farmacéutica. Alternativamente, los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias de combinación se pueden administrar simultáneamente a un sujeto en composiciones farmacéuticas separadas. Los agentes profilácticos o terapéuticos se pueden administrar a un sujeto por la misma o diferentes vías de administración.
En los casos en los que se administra una serie de dosis, éstas pueden, por ejemplo, administrarse aproximadamente cada semana, aproximadamente cada 2 semanas, aproximadamente cada 3 semanas o aproximadamente cada 4 semanas, pero preferiblemente aproximadamente cada 3 semanas. Las dosis pueden, por ejemplo, continuar administrándose hasta la progresión de la enfermedad, evento adverso u otro momento según lo determine el médico. Por ejemplo, se pueden administrar desde aproximadamente dos, tres o cuatro, hasta aproximadamente 17 o más dosis fijas.
Aparte de la molécula multiespecífica y el agente quimioterapéutico antimetabolito, pueden combinarse con ellos otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, puede administrarse un segundo (tercero, cuarto, etc.) agentes quimioterapéuticos, en donde el segundo agente quimioterapéutico es otro agente quimioterapéutico antimetabolito diferente, o un agente quimioterapéutico que no es un antimetabolito. Por ejemplo, el segundo agente quimioterapéutico puede ser un taxano (tal como paclitaxel o docetaxel), capecitabina o un agente quimioterapéutico a base de platino (tal como carboplatino, cisplatino u oxaliplatino), antraciclina (tal como doxorrubicina, incluyendo doxorrubicina liposomal), topotecán, pemetrexed, alcaloide de la vinca (tal como vinorelbina) y TLK 286. Se pueden administrar "cócteles" de diferentes agentes quimioterapéuticos.
Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede someterse a extirpación quirúrgica de células cancerosas y/o radioterapia.
C. Aplicación Terapéutica a Enfermedades y/o Trastornos Asociados a CLL-1
La presente invención proporciona, entre otras cosas, composiciones y métodos para tratar el cáncer. En un aspecto, el cáncer es un cáncer hematológico que incluye, pero no se limita a leucemia (Tal como leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica, leucemia linfoblástica aguda de células B (leucemia linfoide aguda de células B, BALL), leucemia linfoblástica aguda de células T (leucemia linfoide aguda de células T (TALL), leucemia prolinfocítica de células B, mieloma de células plasmáticas y síndrome mielodisplásico) y afecciones linfoproliferativas malignas, incluyendo el linfoma (tal como mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y linfoma folicular de células pequeñas y células grandes).
En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar una enfermedad asociada con la expresión de CLL-1. En un aspecto, la invención proporciona métodos para tratar una enfermedad, en donde parte del tumor es negativa para CLL-1 y parte del tumor es positiva para CLL-1. Por ejemplo, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico de la invención es útil para tratar sujetos que han sido sometidos a tratamiento para una enfermedad asociada con una expresión elevada de CLL-1, en donde el sujeto que ha recibido tratamiento por niveles elevados de CLL-1 exhibe una enfermedad asociada con niveles elevados de CLL-1. En realizaciones, la molécula multiespecífica, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico de la invención es útil para tratar sujetos que han sido sometidos a tratamiento para una enfermedad asociada con la expresión de CLL-1, en donde el sujeto que ha sido sometido a un tratamiento relacionado con la expresión de CLL-1 presenta una enfermedad asociada con la expresión de CLL-1.
En una realización, la invención proporciona métodos para tratar una enfermedad, en donde CLL-1 se expresa tanto en células normales como en células cancerosas, pero se expresa a niveles más bajos en células normales. En una realización, el método comprende, además, seleccionar una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico de la invención que se une con una afinidad que permite a la molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico unirse y mediar en la destrucción de las células cancerosas que expresan CLL-1, pero menos del 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o menos de las células normales que expresan CLL-1 se destruyen, p. ej., según se determina mediante un ensayo descrito en esta memoria. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo de exterminio tal como la citometría de flujo basada en Cr51 CTL. En una realización, la molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., la molécula biespecífica, p. ej., el anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, tiene un dominio de unión a antígeno que tiene una afinidad de unión KD de 10'4 M a 10'8 M, e.g., 10'5 M a 10'7 M, e.g., 10'6 M o 10'7 M para el antígeno diana. En una realización, el dominio de unión a antígeno de CLL-1 tiene una afinidad de unión que es al menos cinco veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces, 100 veces o 1.000 veces menor que un anticuerpo de referencia, p. ej., un anticuerpo descrito en esta memoria.
En un aspecto, la invención pertenece a un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una o más cadenas polipeptídicas de una molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, operativamente enlazada al promotor para la expresión. en células de mamífero, p. ej., células T o células NK. En un aspecto, la invención proporciona una célula efectora inmunitaria recombinante, p. ej., célula T o célula NK, que expresa la molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, para uso en el tratamiento de tumores que expresan CLL -1, en donde la célula efectora inmunitaria recombinante (p. ej., célula T o célula NK) que expresa la molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, se denomina una célula que expresa moléculas multiespecíficas de CLL- 1 (p. ej., células T que expresan moléculas multiespecíficas de CLL-1 o células NK que expresan moléculas multiespecíficas de CLL-1). En un aspecto, la célula de la invención que expresa una molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico, es capaz de poner en contacto una célula tumoral con al menos una molécula multiespecífica de CLL-1, p. ej., molécula biespecífica, p. ej., anticuerpo biespecífico o molécula similar a un anticuerpo biespecífico de la invención expresada en su superficie o secretada (y, en una realización, unida por un dominio de unión a antígeno que fija como objetivo un antígeno expresado en dicha célula) de manera que la la célula que expresa la molécula multiespecífico de CLL-1 (p. ej., célula T que expresa la molécula multiespecífica de CLL-1 o célula NK que expresa la molécula multiespecífica de CLL-1) fija como objetivo la célula tumoral e inhibe el crecimiento del tumor.
Generalmente, las moléculas que comprenden un dominio de unión a CLL-1 descritas en esta memoria (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria) y composiciones que comprenden dichas moléculas pueden utilizarse en el tratamiento y la prevención de enfermedades que surgen en individuos inmunodeprimidos. En particular, las moléculas que comprenden un dominio de unión a CLL-1 descritas en esta memoria (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria) y composiciones que comprenden dichas moléculas de la invención pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CLL-1. En determinados aspectos, las moléculas y composiciones de la invención se utilizan en el tratamiento de pacientes con riesgo de desarrollar enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CLL-1. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades, trastornos y afecciones asociados con la expresión de CLL-1, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de las moléculas que comprenden un dominio de unión a CLL-1 descrito en esta memoria. (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria), o composiciones que comprenden dichas moléculas de la invención.
En un aspecto, las moléculas que comprenden un dominio de unión a CLL-1 descritas en esta memoria (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria), y composiciones que comprenden dichas moléculas de la invención pueden utilizarse para tratar una enfermedad proliferativa tal como un cáncer o una neoplasia o es una afección precancerosa, tal como una mielodisplasia, un síndrome mielodisplásico o una preleucemia. En un aspecto, un cáncer asociado con la expresión de CLL-1 es un cáncer hematológico, preleucemia, trastorno hiperproliferativo, hiperplasia o displasia, que se caracteriza por un crecimiento anormal de células.
En un aspecto, las moléculas que comprenden un dominio de unión a CLL-1 descritas en esta memoria (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria) y composiciones que comprenden dichas moléculas de la invención se utilizan en el tratamiento de un cáncer, en donde el cáncer es un cáncer hematológico. Afecciones de cáncer hematológico son los tipos de cáncer, tales como la leucemia y las afecciones linfoproliferativas malignas que afectan la sangre, la médula ósea y el sistema linfático. En un aspecto, el cáncer hematológico puede ser, por ejemplo, leucemia (tal como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica y síndrome mielodisplásico) y afecciones linfoproliferativas malignas, incluido el linfoma (tal como mieloma múltiple, linfoma de no-Hodgkin, linfoma de Burkitt y linfoma folicular de células pequeñas y células grandes). En otras realizaciones, un cáncer hematológico puede incluir una enfermedad residual mínima, MRD, p. ej., de una leucemia, p. ej., de AML o MDS.
En un aspecto, las moléculas que comprenden un dominio de unión a CLL-1 descritas en esta memoria (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria) y composiciones que comprenden dichas moléculas de la invención son particularmente útiles para tratar leucemias mieloides, AML y sus subtipos, leucemia mieloide crónica. (CML) y síndrome mielodisplásico (MDS).
La leucemia se puede clasificar como leucemia aguda y leucemia crónica. La leucemia aguda se puede clasificar, además, como leucemia mielógena aguda (AML) y leucemia linfoide aguda (ALL). La leucemia crónica incluye leucemia mielógena crónica (CML) y leucemia linfoide crónica (CLL). Otras afecciones relacionadas incluyen los síndromes mielodisplásicos (MDS, anteriormente conocido como "preleucemia") que son una colección diversa de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células de la sangre mieloides y el riesgo de transformación en AML.
Linfoma es un grupo de tumores de células de la sangre que se desarrollan a partir de linfocitos. Linfomas ilustrativos incluyen linfoma no Hodgkin y linfoma Hodgkin.
En la AML, la transformación maligna y la proliferación descontrolada de una célula progenitora mieloide de larga vida diferenciada de forma anormal da como resultado un alto número circulante de formas sanguíneas inmaduras y el reemplazo de la médula normal por células malignas. Los síntomas incluyen fatiga, palidez, moratones y sangrado fáciles, fiebre e infección; los síntomas de infiltración leucémica están presentes solo en aproximadamente el 5% de los pacientes (a menudo como manifestaciones cutáneas). El examen del frotis de sangre periférica y la médula ósea es diagnóstico. El tratamiento existente incluye quimioterapia de inducción para lograr la remisión y quimioterapia posterior a la remisión (con o sin trasplante de células madre) para evitar la recaída.
La AML tiene un cierto número de subtipos que se distinguen entre sí por su morfología, inmunofenotipo y citoquímica. Se describen cinco clases, basadas en el tipo de célula predominante, que incluyen mieloide, mieloide-monocítica, monocítica, eritroide y megacariocítica.
Las tasas de inducción de la remisión oscilan entre el 50 y el 85%. Se informa que la supervivencia sin enfermedad a largo plazo se produce en el 20 al 40% de los pacientes y aumenta al 40 al 50% en los pacientes más jóvenes tratados con trasplante de células madre.
Los factores de pronóstico ayudan a determinar el protocolo y la intensidad del tratamiento; a pacientes con características de pronóstico fuertemente negativas se les da habitualmente formas de tratamiento más intensas, porque se cree que los beneficios potenciales justifican el aumento de la toxicidad del tratamiento. El factor de pronóstico más importante es el cariotipo de células leucémicas; cariotipos favorables incluyen t(15; 17), t (8; 21) e inv16 (p13; q22). Factores negativos incluyen edad avanzada, fase mielodisplásica anterior, leucemia secundaria, recuento alto de leucocitos y ausencia de bacilos de Auer.
La terapia inicial intenta inducir la remisión y se diferencia más de la ALL en que la AML responde a menos fármacos. El régimen de inducción básico incluye citarabina por infusión intravenosa continua o dosis altas durante 5 a 7 días; daunorrubicina o idarrubicina se administra IV durante 3 días durante este tiempo. Algunos regímenes incluyen 6-tioguanina, etopósido, vincristina y prednisona, pero su contribución no está clara. El tratamiento suele producir mielosupresión significativa, con infección o hemorragia; existe una latencia significativa antes de la recuperación de la médula. Durante este tiempo, es vital una atención meticulosa de apoyo y prevención.
La leucemia mielógena crónica (o mieloide) (CML) también se conoce como leucemia granulocítica crónica y se caracteriza como un cáncer de los glóbulos blancos. Regímenes de tratamiento comunes para la CML incluyen inhibidores de tirosina quinasa Bcr-Abl, imatinib (Gleevec®), dasatinib y nilotinib. Inhibidores de tirosina quinasa Bcr-Abl son específicamente útiles para pacientes con CML con translocación del cromosoma Filadelfia.
Los síndromes mielodisplásicos (MDS) son afecciones médicas hematológicas caracterizadas por una hematopoyesis o producción de sangre desordenada e ineficaz. Por lo tanto, el número y la calidad de las células productoras de sangre disminuyen de manera irreversible. Algunos pacientes con MDS pueden desarrollar anemia grave, mientras que otros son asintomáticos. El esquema de clasificación para MDS es conocido en la técnica, con criterios que designan la relación o frecuencia de tipos de células de la sangre particulares, p. ej., mieloblastos, monocitos y precursores de glóbulos rojos. MDS incluye anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos en anillo, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformación, leucemia mielomonocítica crónica (CML).
Los tratamientos para MDS varían según la gravedad de los síntomas. Formas agresivas de tratamiento para pacientes que experimentan síntomas graves incluyen trasplantes de médula ósea y atención de apoyo con apoyo de productos de la sangre (p. ej., transfusiones de sangre) y factores de crecimiento hematopoyético (p. ej., eritropoyetina). Con frecuencia se utilizan otros agentes para tratar MDS: 5-azacitidina, decitabina y lenalidomida. En algunos casos, también se pueden administrar quelantes de hierro deferoxamina (Desferal®) y deferasirox (Exjade®).
En otra realización, las moléculas que comprenden un dominio de unión a CLL-1 descritas en esta memoria (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria) y composiciones que comprenden dichas moléculas de la presente invención se utilizan para tratar cánceres o leucemias con células madre de leucemia. Por ejemplo, las células madre de leucemia son células de leucemia CD34+/CD38-
La presente invención proporciona, entre otras cosas, composiciones y métodos para tratar el cáncer. En un aspecto, el cáncer es un cáncer hematológico que incluye, pero no se limita a leucemia (tal como leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica y síndrome mielodisplásico) y afecciones linfoproliferativas malignas, incluido linfoma (tal como mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y linfoma folicular de células pequeñas y células grandes).
En un aspecto, las moléculas que comprenden un dominio de unión a CLL-1 descritas en esta memoria (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria) y composiciones que comprenden dichas moléculas de la invención pueden utilizarse para tratar otros cánceres y neoplasias malignas, tales como, pero no limitados a, p. ej., leucemias agudas que incluyen, pero no se limitan a, p. ej., leucemia linfoide aguda de células B ("BALL"), leucemia linfoide aguda de células T ("TALL"), leucemia linfoide aguda (ALL); una o más leucemias crónicas, que incluyen, pero no se limitan a, p. ej., leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL); cánceres hematológicos o afecciones hematológicas adicionales que incluyen, pero no se limitan a leucemia prolinfocítica de células B, neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular, leucemia de células pilosas, linfoma folicular células pequeñas o células grandes, afecciones linfoproliferativas malignas, linfoma MALT, linfoma de células del manto, linfoma de la zona marginal, mieloma múltiple, mielodisplasia y el síndrome mielodisplásico, linfoma no Hodgkin, linfoma plasmablástico, neoplasia de células dendríticas plasmocitoide, macroglobulinemia de Waldenstrom y "preleucemia" que son una colección diversa de afecciones hematológicas unidas por la producción ineficaz (o displasia) de células de la sangre mieloides, y similares. Las moléculas que comprenden un dominio de unión a CLL-1 descritas en esta memoria (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria) y composiciones que comprenden dichas moléculas de la presente invención pueden administrarse solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras citoquinas, otras moléculas o poblaciones celulares.
La presente invención también proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir una población de células que expresan CLL-1, comprendiendo los métodos poner en contacto una población de células que comprenden una célula que expresa CLL-1 con una molécula que comprende un dominio de unión a CLL-1 descrito en esta memoria (p. ej., las moléculas multiespecíficas descritas en esta memoria), o la composición que comprende dicha molécula, de la invención que se une a la célula que expresa CLL-1. En un aspecto específico, la presente invención proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CLL-1, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CLL-1 con una molécula que comprende un dominio de unión a CLL-1 según se define en las reivindicaciones, o composición que comprende dicha molécula de la invención que se une a la célula que expresa CLL-1. En un aspecto específico, la presente invención proporciona métodos para inhibir la proliferación o reducir la población de células cancerosas que expresan CLL-1, comprendiendo los métodos poner en contacto la población de células cancerosas que expresan CLL-1 con una molécula que comprende un dominio de unión a CLL-1 según se define en las reivindicaciones, o composición que comprende dicha molécula de la invención que se une a la célula que expresa CLL-1. En determinados aspectos, la molécula que comprende un dominio de unión a CLL-1 según se define en las reivindicaciones, o la composición que comprende dicha molécula, de la invención reduce la cuantía, el número, la cantidad o el porcentaje de células y/o células cancerosas en al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 65%, al menos 75%, al menos 85%, al menos 95% o al menos 99% en un sujeto con o modelo animal para leucemia mieloide u otro cáncer asociado con células que expresan CLL-1 en relación con un control negativo. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.
La presente invención también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o gestionar una enfermedad asociada con células que expresan CLL-1 (p. ej., un cáncer hematológico o cáncer atípico que expresa CLL-1 ), comprendiendo los procedimientos administrar a un sujeto que lo necesite una molécula que comprende un dominio de unión a CLL-1 tal como se define en las reivindicaciones, o una composición que comprende dicha molécula, de la invención que se une a la célula que expresa CLL-1. En un aspecto, el sujeto es un ser humano. Ejemplos no limitantes de trastornos asociados con células que expresan CLL-1 incluyen trastornos autoinmunes (tales como lupus), trastornos inflamatorios (tales como alergias y asma) y cánceres (tales como cánceres hematológicos o cánceres atípicos que expresan CLL-1).
La presente invención también proporciona métodos para prevenir, tratar y/o gestionar una enfermedad asociada con células que expresan CLL-1, comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesite una molécula que comprende un dominio de unión a CLL-1 tal como se define en las reivindicaciones, o composición que comprende dicha molécula de la invención que se une a la célula que expresa CLL-1. En un aspecto, el sujeto es un ser humano.
La presente invención proporciona métodos para prevenir la recidiva del cáncer asociado con células que expresan CLL-1, comprendiendo los métodos administrar a un sujeto que lo necesite una molécula que comprende un dominio de unión a CLL-1 tal como se define en las reivindicaciones, o una composición que comprende dicha molécula., de la invención que se une a la célula que expresa CLL-1. En un aspecto, los métodos comprenden administrar al sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una molécula que comprende un dominio de unión a CLL-1 tal como se define en las reivindicaciones, o una composición que comprende dicha molécula descrita en esta memoria, que se une a la célula que expresa CLL-1, en combinación con una cantidad eficaz de otra terapia.
Una molécula multiespecífica, p. ej. una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que comprende un dominio de unión a c LL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, puede utilizarse en combinación con otros agentes y terapias conocidos. Administrado "en combinación", tal como se utiliza en esta memoria, significa que dos (o más) tratamientos diferentes se administran al sujeto durante el curso de la aflicción del sujeto con el trastorno, p. ej., los dos o más tratamientos se administran después de que el sujeto ha sido diagnosticado. con el trastorno y antes de que el trastorno haya sido curado o eliminado o el tratamiento haya cesado por otras razones. En algunas realizaciones, la administración de un tratamiento todavía se está produciendo cuando comienza el suministro del segundo, de modo que hay superposición en términos de administración. A esto a veces se alude en esta memoria como "suministro simultáneo" o "suministro concurrente". En otras realizaciones, la administración de un tratamiento finaliza antes de que comience el suministro del otro tratamiento. En algunas realizaciones de cualquier caso, el tratamiento es más eficaz debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más eficaz, p. ej., se observa un efecto equivalente con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en mayor medida que lo que se vería si el segundo tratamiento se administrara en ausencia del primer tratamiento, o la situación análoga se observa con el primer tratamiento. En algunas realizaciones, el suministro es tal que la reducción de un síntoma u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor de lo que se observaría con un tratamiento suministrado en ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo o mayor que aditivo. El suministro puede ser tal que un efecto del primer tratamiento suministrado todavía sea detectable cuando se suministra el segundo.
Una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo biespecífico o una molécula similar a un anticuerpo, que comprende un dominio de unión a CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, y el al menos un agente terapéutico adicional se puede administrar simultáneamente, en la misma o en composiciones separadas, o secuencialmente. Para la administración secuencial, la molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que comprende un dominio de unión a CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, puede administrarse primero, y el agente adicional puede administrarse en segundo lugar, o el orden de administración puede invertirse.
La molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que comprende un dominio de unión a CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, y/u otros agentes, procedimientos o modalidades terapéuticos pueden administrarse durante períodos de trastorno activo, o durante un período de remisión o enfermedad menos activa. La molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que comprende un dominio de unión a CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, se puede administrar antes del otro tratamiento, al mismo tiempo que el tratamiento, después del tratamiento o durante la remisión del trastorno.
Cuando se administra en combinación, la molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que comprende un dominio de unión a CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, y el agente adicional (p. ej., segundo o tercer agente), o todos, pueden administrarse en una cantidad o dosis que sea mayor, menor o igual que la cantidad o dosis de cada uno de los agentes utilizados individualmente, p. ej., como una monoterapia. En determinadas realizaciones, la cantidad o dosis administrada de la molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que comprende un dominio de unión a CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, el agente adicional (p. ej., segundo o tercer agente), o todos, es menor (p. ej., al menos 20%, al menos 30%, al menos 40% o al menos 50%) que la cantidad o dosis de cada uno de los agentes utilizados individualmente, p. ej., como una monoterapia. En otras realizaciones, la cantidad o dosis de la molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que comprende un dominio de unión a CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, el agente adicional (p. ej., segundo o tercer agente), o todos, que resulta en un efecto deseado (p. ej., tratamiento de cáncer) es menor (p. ej., al menos 20%, al menos 30%, al menos 40% o al menos 50% menor) que la cantidad o dosis de cada uno de los agentes utilizados individualmente, p. ej., como una monoterapia, requerida para lograr el mismo efecto terapéutico.
En aspectos adicionales, una molécula multiespecífica, p. ej., una molécula biespecífica, p. ej., un anticuerpo o una molécula similar a un anticuerpo biespecífico, que comprende un dominio de unión a CLL-1, p. ej., tal como se describe en esta memoria, puede utilizarse en un régimen de tratamiento en combinación con cirugía, quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, terapias celulares (p. ej., inmunoterapias celulares, p. ej., terapia de células T del receptor de antígeno quimérico), anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citoquinas e irradiación. vacuna peptídica, tal como la descrita en Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108: 963-971.
En determinados casos, los compuestos de la presente invención se combinan con otros agentes terapéuticos, tales como otros agentes anticancerígenos, agentes antialérgicos, agentes contra las náuseas (o antieméticos), analgésicos, agentes citoprotectores y combinaciones de los mismos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la invención, pero no para limitar su alcance.
Ejemplo 1 - Generación y unión de dominios de unión humanos anti-CLL-1
Colecciones de presentación de fagos se cribaron frente a CLL-1 inmovilizada. Los fagos unidos se aislaron y secuenciaron, y la unión a la diana se confirmó mediante ELISA y/o FACs. Se confirmó que 13 scFvs se unían a CLL-1 humana y se designaron CLL-1-1, CLL-1-2, CLL-1-3, CLL-1-4, CLL-1-5, CLL-1-6, CLL-1-7, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10, CLL-1-11, CLL-1-12, y CLL-1-13
Después de la selección y confirmación, para evaluar las características biofísicas y de unión de scFvs de CLL-1 anti­ humanos identificados mediante el cribado de fagos, se produjeron y purificaron transitoriamente construcciones scFv a partir de células HEK293F. La expresión y purificación transitorias en células HEK293F se realizaron con metodología estándar. Brevemente, se transfectaron 100 ml de células HEK293F a 3 x 106 células/ml con 100 |jg de plásmido y 300 jg de polietilenimina. Las células se incubaron a 37°C con 8% de CO2 y se rotaron a 80 rpm. Después de seis días, las células se recolectaron por centrifugación a 3500 g durante 20 minutos. El sobrenadante se purificó uniendo el scFv a 200 j l de perlas de agarosa Ni-NTA (Qiagen) durante la noche a 4°C. La proteína se eluyó con 200 j l de imidazol 300 mM y se dializó frente a solución salina tamponada con fosfato.
A continuación, mediante Biacore se testó la afinidad por CLL-1 humana de un número representativo de scFvs anti-CLL-1. Brevemente, el anticuerpo anti-Fc (Jackson ImmunoReasearch, catálogo n° 109-005-098) se inmovilizó en un chip sensor CM5 mediante acoplamiento de amina, y luego se capturó CLL-1 Fc humano a una densidad de 120 RU. Las muestras de ScFv se diluyeron en serie 3 veces y se inyectaron sobre el chip a un caudal constante. Las tasas de asociación y disociación del complejo proteico se controlaron durante 270 s y 400 s, respectivamente. Se realizó una doble referencia contra una celda de flujo recubierta con anti-huFc y un tampón en blanco y los datos se ajustaron utilizando un modelo de afinidad de estado estable o de Langmuir 1:1 con el software de evaluación Biacore T200.
Los resultados se muestran en la Tabla 9. Se confirmó la unión de los clones CLL-1-6, CLL-1-8, CLL-1-9, CLL-1-10 y CLL1-13 a CLL-1 humana. Además, se encontró que CLL-1-1 se unía débilmente en estas condiciones experimentales y CLL-1-11 y CLL-1-12 no mostraron unión en estas condiciones de ensayo.
Tabla 9 Cinética de unión afinidad de scFvs anti-CLL-1 a CLL-1 humana.
Figure imgf000099_0001
Estos datos confirman la unión de scFvs anti-CLL-1 a scFv humano y demuestran que los clones generados tienen afinidad por CLL-1 humana en el intervalo de 4,3 nM a 46,1 nM.
Ejemplo 2 - Evaluación In vitro de anticuerpos biespecíficos CD3xCLL1 contra células cancerosas que expresan CLL-1
Materiales y Métodos
Se utilizó un panel de anticuerpos CD3 x CLL1 para demostrar la utilidad de estos biespecíficos CLL1 como terapia contra el cáncer. Estos anticuerpos biespecíficos se construyeron en el formato scFv-Fc, y están compuestos por un scFv anti-CD3 fusionado a los dominios hIgG1 CH2 y CH3 (Fc) (SEQ ID NO: 507), emparejados con un scFv-Fc anti-CLL1 (las secuencias se muestran en la Tabla 11). Un anticuerpo biespecífico de control negativo que no se une a CLL1 utilizado en estos ensayos es de un formato scFv-Fc, conteniendo un scFv anti-CD3 y un scFv anti-GH, que es específico para la glicoproteína H de la envoltura del citomegalovirus humano. Las titulaciones de dosis de anticuerpos para los ensayos basados en células in vitro representadas aquí oscilan entre 1 pM y 100 nM.
PBMCs Se aislaron células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) de la sangre de un donante humano sano utilzando un gradiente de densidad Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare n° 17-1440-02). Se aislaron células T (pan) de la fracción de PBMC mediante selección negativa (Miltenyi n° 130-096-535, 130-041-407, 130-042-401). Estas células T aisladas se activaron para la expansión con una relación de 3X de activador T humano CD3/CD28 Dynabeads (Gibco n° 11132D) durante nueve días, se cortaron magnéticamente y se almacenaron como partes alícuotas congeladas en nitrógeno líquido. Las partes alícuotas congeladas se descongelaron, contaron y utilizaron inmediatamente en ensayos de exterminio de células T en una relación E:T de 3:1 con la línea celular de cáncer diana.
La línea celular de cáncer humano diana HL60, que expresa niveles moderados de CLL1 humana, se transdujo para expresar constitutivamente luciferasa. La luciferasa se utiliza para medir la viabilidad/supervivencia celular con el reactivo BrightGlo (Promega E2650). Las células diana se sembraron a razón de 30.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos (Costar 3904) junto con 90.000 células T descongeladas y una dilución en serie de anticuerpo biespecífico, todo en medio que contenía RPMI/1640, FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 10 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM (Gibco 22400089, 16140, 25030-081, 11140-050, 11360-070, 15630-080, 21985-023, respectivamente).
El ensayo se incubó a 37°C/5% de CO2 durante 20-24 horas, seguido de mediciones de la viabilidad de las células diana (BrightGlo, Promega n° E2650) y los niveles de interferón gamma citoquina en los sobrenadantes del cultivo (MSD n° N05049A-1) como una medida de la activación de las células T, siguiendo los protocolos proporcionados por el proveedor.
También se utilizó un ensayo informador del gen (RGA) de la luciferasa Jurkat NFAT (JNL) para evaluar la capacidad de los anticuerpos biespecíficos CD3 de activar las células T mediante el acoplamiento con la línea celular diana U937 que expresa CLL1. Se sembraron células U937 en placas de 96 pocillos a una densidad de 20.000 células por pocillo. Se añadieron 100.000 células JNL por pocillo (E:T = 5:1), así como diluciones en serie de anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL1. El ensayo se incubó durante 4 horas a 37°C, seguido de mediciones de la actividad de luciferasa utilizando el ensayo Promega OneGlo (Promega n° E-6120) de acuerdo con el protocolo del proveedor. Los valores de luminiscencia resultantes se representaron en GraphPad PRISM, y los valores de CE50 se determinaron mediante análisis de regresión logística.
Resultados
La Figura 2 muestra la capacidad in vitro de los anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL-1 para mediar en el exterminio de células T de la línea de células cancerosas HL60 que expresan CLL1. La Figura 3 muestra la capacidad de los anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL1 de mediar en la activación de células T in vitro mediante acoplamiento con la línea de células cancerosas U937 que expresa CLL1. La Tabla 10 resume los resultados de estos dos experimentos (NFAT = resultados del ensayo de activación de células T; Exterminio = resultados del ensayo de exterminio de la línea celular cancerosa CLL1 positiva mediada por células T).
Tabla 10 Sumario de resultados in vitro. Los anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL-1 en la Tabla se enumeran en orden de clasificación de acuerdo con la potencia.
CE50 (nM)
NFAT Ex rmini
Figure imgf000100_0001
Los autores de la invención han desarrollado un panel de anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL1 y han demostrado que muchos de ellos redirigen de forma potente el exterminio de células T de células que expresan CLL1 in vitro. La Figura 2 demuestra que los anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL1 pueden participar de forma específica y eficaz en el exterminio de células T de la línea de células tumorales HL60 que expresan CLL1 en una relación E:T de 3:1 en 22 horas. El clon n° 11 del anticuerpo biespecífico anti-CD3 x anti-CLL1 muestra la mayor potencia in vitro, con un valor de CE50 de 31 pM. Los otros clones tienen una potencia que varía de 44 nM a 20o pM, tal como se resume en la Tabla 10. Sin pretender estar ligados por teoría alguna, se cree que estos anticuerpos biespecíficos CD3 x CLL-1 son capaces de mediar en el exterminio de células T de células que expresan CLL-1 con buena potencia, en parte debido a la combinación de los dominios de unión de CLL-1 altamente específicos. junto con un dominio de unión a CD3 que se une a CD3 con alta afinidad

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula multiespecífica que comprende un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno, en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a un antígeno de células efectoras inmunes. que es un antígeno expresado en una célula T, en donde el antígeno expresado en una célula T es CD3, y en donde el primer dominio de unión a antígeno es un dominio de unión anti-CLL-1, que comprende:
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 322, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 336, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 350 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 364, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 378 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de Se Q ID NO: 392;
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una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 315, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 329, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de SEQ ID NO: 343 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 357, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 371 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 385;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 316, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 330, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de SEQ ID NO: 344 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 358, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 372 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 386;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 317, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 331, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de SEQ ID NO: 345 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 359, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 373 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de Se Q ID NO: 387;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 318, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 332, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 346 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 360, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 374 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SeQ ID NO: 388;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 320, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 334, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 348 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 362, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 376 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SeQ ID NO: 390;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 321, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 335, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 349 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 363, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 377 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de Se Q ID NO: 391;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 326, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 340, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 354 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 368, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 382 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de Se Q ID NO: 396;
o
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 327, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 341, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 355 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 369, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 383 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de Se Q ID NO: 397.
2. La molécula multiespecífica de la reivindicación 1, en donde el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada (VH) y una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera (VL) seleccionada del grupo que consiste en:
VH SEQ ID NO : 73 y VL : SEQ ID NO: 86,
VH : SEQ ID NO : 70 y VL : SEQ ID NO: 83,
VH : SEQ ID NO : 74 y VL : SEQ ID NO: 87,
VH : SEQ ID NO : 75 y VL : SEQ ID NO: 88,
VH : SEQ ID NO : 76 y VL : SEQ ID NO: 89,
VH : SEQ ID NO : 65 y VL : SEQ ID NO: 78,
VH : SEQ ID NO : 66 y VL : SEQ ID NO: 79,
VH : SEQ ID NO : 67 y VL : SEQ ID NO: 80,
VH : SEQ ID NO : 68 y VL : SEQ ID NO 81,
VH : SEQ ID NO : 69 y VL : SEQ ID NO: 82,
VH : SEQ ID NO : 71 y VL : SEQ ID NO: 84,
VH : SEQ ID NO : 72 y VL : SEQ ID NO: 85,
VH : SEQ ID NO : 77 y VL : SEQ ID NO
VH : SEQ ID NO 195 y VL: SEQ ID NO: 196
3. La molécula multiespecífica de la reivindicación 1 o 2, en donde el dominio de unión anti-CLL-1 comprende una secuencia de aminoácidos de un scFv seleccionado del grupo que consiste en:
SEQ ID NO: 47,
SEQ ID NO: 44,
SEQ ID NO: 48,
SEQ ID NO: 49,
SEQ ID NO: 50,
SEQ ID NO: 39,
SEQ ID NO: 40,
SEQ ID NO 41,
SEQ ID NO: 42,
SEQ ID NO: 43,
SEQ ID NO: 45,
SEQ ID NO: 46, y
SEQ ID NO 51.
4. La molécula multiespecífica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a un antígeno de células efectoras inmunes que es un antígeno expresado en una célula T, en donde el antígeno expresado en una célula T es CD3, y en donde el dominio de unión a antígeno anti-CD3 comprende:
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1700, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1738, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1776 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1701, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1739 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1777;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1702, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1740, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1778; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1703, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1741 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1779;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1704, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1742, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1780; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1705, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1743 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1781;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1706, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1744, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1782; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1707, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1745 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1783;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1708, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1746, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de SEQ ID NO: 1784; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1709, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1747 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1785;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1710, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1748, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1786; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1711, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1749 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1787;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1712, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1750, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de SEQ ID NO: 1788; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1713, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1751 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1789;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1714, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1752, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1790; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1715, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1753 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1791;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1716, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1754, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1792; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1717, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1755 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1793;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1718, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1756, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1794; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1719, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1757 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1795;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1720, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1758, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1796; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1721, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1759 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1797;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1722, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1760, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1798; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1723, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1761 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1799;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1724, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1762, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1800; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1725, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1763 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1801;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1726, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1764, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1802; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1727, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1765 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1803;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1728, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1766, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1804; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1729, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1767 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1805;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1730, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1768, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de SEQ ID NO: 1806; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1731, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1769 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1807;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1732, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1770, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1808; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1733, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1771 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1809;
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1734, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1772, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1810; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1735, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1773 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1811;
o
una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1) de SEQ ID NO: 1736, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) de SEQ ID NO: 1774, una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (Hc CDR3) de SEQ ID NO: 1812 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1) de SEQ ID NO: 1737, una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) de SEQ ID NO: 1775 y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de SEQ ID NO: 1813.
5. La molécula multiespecífica de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el dominio de unión anti-CD3 comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada (VH) y una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera (VL) seleccionada del grupo que consiste en:
VH SEQ ID NO 1200 y VL SEQ ID NO 1201,
VH SEQ ID NO 1202 y VL SEQ ID NO 1203,
VH SEQ ID NO 1204 y VL SEQ ID NO 1205,
VH SEQ ID NO 1206 y VL SEQ ID NO 1207,
VH SEQ ID NO 1208 y VL SEQ ID NO 1209,
VH SEQ ID NO 1210 y VL SEQ ID NO 1211,
VH SEQ ID NO 1212 y VL SEQ ID NO 1213,
VH SEQ ID NO 1214 y VL SEQ ID NO 1215
VH SEQ ID NO 1216 y VL SEQ ID NO 1217,
VH SEQ ID NO 1218 y VL SEQ ID NO 1219,
VH SEQ ID NO 1220 y VL SEQ ID NO 1221,
VH SEQ ID NO 1222 y VL SEQ ID NO 1223,
VH SEQ ID NO 1224 y VL SEQ ID NO 1225,
VH SEQ ID NO 1226 y VL SEQ ID NO 1227,
VH SEQ ID NO 1230 y VL SEQ ID NO 1231,
VH SEQ ID NO 1232 y VL SEQ ID NO 1233,
VH SEQ ID NO 1234 y VL SEQ ID NO 1235 y
VH SEQ ID NO 1236 y VL SEQ ID NO 1237.
6. La molécula multiespecífica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a CD3 y comprende una secuencia VL de SEQ ID NO: 1209 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 1236; y en donde el dominio de unión anti-CLL-1 comprende:
una secuencia VL de SEQ ID NO: 88 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 75
una secuencia VL de SEQ ID NO: 89 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 76
una secuencia VL de SEQ ID NO: 87 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 74
una secuencia VL de SEQ ID NO: 85 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 72
una secuencia VL de SEQ ID NO: 86 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 73
una secuencia VL de SEQ ID NO: 83 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 70
una secuencia VL de SEQ ID NO: 90 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 77
una secuencia VL de SEQ ID NO: 79 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 66, o
una secuencia VL de SEQ ID NO: 84 y una secuencia VH de SEQ ID NO: 71.
7. La molécula multiespecífica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el segundo dominio de unión a antígeno se une a CD3 y comprende SEQ ID NO: 506; y en donde el dominio de unión anti-CLL-1 comprende:
SEQ ID NO: 49,
SEQ ID NO: 50,
SEQ ID NO: 48,
SEQ ID NO: 46,
SEQ ID NO: 47,
SEQ ID NO: 44,
SEQ ID NO 51,
SEQ ID NO: 40, o
SEQ ID NO 45.
8. La molécula multiespecífica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido que comprende el segundo dominio de unión a antígeno se une a CD3 y comprende SEQ ID NO: 507; y en donde el polipéptido que comprende el dominio de unión anti-CLL-1 comprende:
SEQ ID NO: 512,
SEQ ID NO: 517,
SEQ ID NO: 522,
SEQ ID NO: 527,
SEQ ID NO: 532,
SEQ ID NO: 537,
SEQ ID NO: 542,
SEQ ID NO: 547, o
SEQ ID NO: 552.
9. La molécula multiespecífica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde los polipéptidos que comprenden las secuencias de CDR de cadena pesada del primer y/o segundo dominio de unión a antígeno comprenden, además, un dominio CH3 y opcionalmente un dominio CH2.
10. La molécula multiespecífica de la reivindicación 9, en donde los polipéptidos que comprenden las secuencias de CDR de cadena pesada del primer y segundo dominio de unión a antígeno comprenden, además, un dominio CH3, en donde ambos dominios c H3 comprenden una o más modificaciones para potenciar la heterodimerización, en donde dichas modificaciones comprenden la introducción de un botón en un primer dominio CH3 y un agujero en un segundo dominio CH3, o viceversa, de modo que la heterodimerización del polipéptido que comprende el primer dominio CH3 y el polipéptido que comprende el segundo dominio CH3 se favorece con respecto a polipéptidos que comprenden dominios CH3 no modificados.
11. Un ácido nucleico aislado que codifica la molécula multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende:
SEQ ID NO: 508 y SEQ ID NO: 509,
SEQ ID NO: 513 y SEQ ID NO: 514,
SEQ ID NO: 518 y SEQ ID NO: 519,
SEQ ID NO: 523 y SEQ ID NO: 524,
SEQ ID NO: 528 y SEQ ID NO: 529,
SEQ ID NO: 533 y SEQ ID NO: 534,
SEQ ID NO: 538 y SEQ ID NO: 539,
SEQ ID NO: 543 y SEQ ID NO: 544,
SEQ ID NO 548 y SEQ ID NO: 549
SEQ ID NO 553 y SEQ ID NO: 554
SEQ ID NO 515,
SEQ ID NO: 520,
SEQ ID NO: 525,
SEQ ID NO: 530,
SEQ ID NO: 535,
SEQ ID NO: 540,
SEQ ID NO: 545,
SEQ ID NO: 550,
SEQ ID NO: 555,
SEQ ID NO 516,
SEQ ID NO 521,
SEQ ID NO 526,
SEQ ID NO 531,
SEQ ID NO 536,
SEQ ID NO 541,
SEQ ID NO: 546,
SEQ ID NO 551, o
SEQ ID NO: 556.
13. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 11 o 12.
14. La molécula multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso como un medicamento, o para uso en una terapia, o para uso en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer hematológico o para uso en el tratamiento de un sujeto que padece leucemia mieloide aguda (AML).
15. Una composición farmacéutica que comprende la molécula multiespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un diluyente o soporte farmacéuticamente aceptable.
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