KR20210079408A - 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명자들은, 혈장 중에서의 pH에 있어서의 항원 결합활성과 비교하여 조기 엔도솜 내에서의 pH에 있어서의 항원 결합활성이 약한 항체는 1분자의 항체로 복수 분자의 항원에 결합하는 것이 가능해지고, 혈장 중 반감기가 길어, 항원에 결합 가능한 기간이 개선되는 것을 발견하였다.

Description

복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자{Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly}
본 발명은 항원 결합 분자의 약물동태를 향상시키는 방법, 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘리는 방법, 약물동태가 향상된 항원 결합 분자, 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수가 향상된 항원 결합 분자, 및 그들의 제조법 등에 관한 것이다.
항체는 혈장 중에서의 안정성이 높고, 부작용도 적은 것으로부터 의약품으로서 주목받고 있다. 그 중에서도 IgG형의 항체 의약은 다수 시판되고 있고, 현재도 수많은 항체 의약이 개발되고 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 한편, 제2 세대의 항체 의약에 적용 가능한 기술로서 다양한 기술이 개발되어 있어, 이펙터기능, 항원 결합능, 약물동태, 안정성을 향상시키거나, 또는, 면역원성 리스크를 저감시키는 기술 등이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 항체 의약은 일반적으로 투여량이 매우 높기 때문에, 피하 투여제제의 제작이 곤란한 것, 제조비용이 높은 것 등이 과제로서 생각된다. 항체 의약의 투여량을 저감시키는 방법으로서, 항체의 약물동태를 향상시키는 방법과 항체와 항원의 친화성(어피니티)를 향상시키는 방법이 생각된다.
항체의 약물동태를 향상시키는 방법으로서, 정상영역(constant region)의 인공적인 아미노산 치환이 보고되어 있다(비특허문헌 4, 5). 항원 결합능, 항원 중화능을 증강시키는 기술로서, 친화성 성숙기술(affinity maturation technology)(비특허문헌 6)이 보고되어 있어, 가변영역의 CDR영역 등의 아미노산에 변이를 도입함으로써 항원으로의 결합활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항원 결합능의 증강에 의해 인 비트로(in vitro)의 생물활성을 향상시키거나, 또는 투여량을 저감하는 것이 가능하고, 또한 인 비보(in vivo)에서의 약효를 향상시키는 것도 가능하다(비특허문헌 7).
한편, 항체 1분자당 중화할 수 있는 항원량은 어피니티에 의존하여, 어피니티를 강하게 함으로써 적은 투여량으로 항원을 중화하는 것이 가능해, 다양한 방법으로 항체의 어피니티를 강하게 하는 것이 가능하다. 또한 항원에 공유결합적으로 결합하여, 어피니티를 무한대로 할 수 있으면 1분자의 항체로 1분자의 항원(2가의 경우는 2항원)을 중화하는 것이 가능하다. 그러나, 지금까지의 방법으로는 1분자의 항체로 1분자의 항원(2가의 경우는 2항원)의 화학양론적인 중화반응이 한계로, 항원량 이하의 항체량으로 항원을 완전히 중화하는 것은 불가능하였다. 즉, 어피니티를 강하게 하는 효과에는 한계가 존재하고 있었다(비특허문헌 9). 중화 항체의 경우, 그 중화효과를 일정 기간 지속시키기 위해서는, 그 기간에 생체내에서 생산되는 항원량 이상의 항체량이 투여될 필요가 있어, 전술한 항체의 약물동태 향상, 또는, 친화성 성숙기술만으로는, 필요 항체 투여량의 저감에는 한계가 존재하고 있었다.
그 때문에, 항원량 이하의 항체량으로 항원의 중화효과를 목적 기간 지속하기 위해서는, 하나의 항체로 복수의 항원을 중화할 필요가 있다. 하나의 항체로 복수의 항원을 중화하는 방법으로서, 항체에 촉매기능을 부여한 촉매 항체에 의한 항원의 불활성화를 들 수 있다. 단백질 항원의 경우, 항원의 펩티드결합을 가수분해함으로써 불활성화하는 것이 가능하고, 이 가수분해반응을 항체가 촉매함으로써, 반복 항원을 중화(불활성화)하는 것이 가능하다고 생각되고 있다(비특허문헌 8). 지금까지 많은 촉매 항체 및 촉매 항체 제작기술에 관한 보고가 되어 있으나, 의약품으로서 충분한 촉매 활성을 갖는 촉매 항체의 보고는 없다. 즉, 어느 한 항원에 대한 항체의 인 비보 시험에 있어서, 통상의 촉매기능을 갖지 않는 중화 항체와 비교하여, 저용량으로 동등 이상의 효과를 발휘하거나, 또는, 동일한 투여량으로 보다 지속적으로 효과를 발휘할 수 있는 촉매 항체의 보고는 지금까지 없다.
이와 같이, 1분자의 항체로 복수의 항원을 중화하여, 통상의 중화 항체보다 우수한 인 비보 효과를 발휘할 수 있는 항체에 관한 보고는 없어, 투여량의 저감 및 지속성의 연장을 위해서는 1항체로 복수의 항원을 중화하여, 인 비보에서 통상의 중화 항체보다도 효과를 발휘하는 신규한 항체 제작기술이 요망되고 있었다.
또한, 본 발명의 선행기술문헌을 이하에 나타낸다.
Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005) Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96. Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review. Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56 Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40 Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries.Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R. Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665 Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications.Curr Opin Biotechnol. 2005 Dec;16(6):631-6. Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9;334(4):1004-13.
본 발명은 이와 같은 상황에 비추어 이루어진 것으로, 그 목적은 항원 결합 분자가 항원에 복수회 결합하는 방법, 항원 결합 분자의 약물동태를 향상시키는 방법, 복수회 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 약물동태가 개선된 항원 결합 분자, 당해 항원 결합 분자를 포함하는 의약조성물, 및 그들의 제조방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 항원 결합 분자 등의 항원 결합능을 갖는 폴리펩티드의 항원에 복수회 결합하는 방법, 혈장 중 반감기(혈중 반감기)를 개선(약물동태를 향상)하는 방법에 대해, 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 본 발명자들은, 혈장 중(혈중)에서의 pH에 있어서의 항원 결합활성과 비교하여 조기 엔도솜 내에서의 pH에 있어서의 항원 결합활성이 약한 항원 결합 분자는 항원에 복수회 결합하여, 혈장 중 반감기가 긴 것을 발견하였다.
본 발명은, 항원 결합 분자가 항원에 복수회 결합하는 방법, 항원 결합 분자의 약물동태를 향상시키는 방법, 복수회 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 분자, 약물동태가 향상된 항원 결합 분자, 약물동태가 향상된 항원 결합 분자의 제조방법 등에 관한 것으로, 보다 구체적으로는,
[1] 항원에 대한 pH 5.8에서의 KD와 pH 7.4에서의 KD의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 2 이상인 항원 결합 분자,
[2] KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 10 이상인 [1]에 기재된 항원 결합 분자,
[3] KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 40 이상인 [1]에 기재된 항원 결합 분자,
[4] 하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되거나 또는 하나 이상의 히스티딘이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자,
[5] 안타고니스트 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자,
[6] 막 항원 또는 가용형 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자,
[7] 항원 결합 분자가 항체인 것을 특징으로 하는 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자,
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를 포함하는 의약조성물,
[9] 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 함으로써 항원 결합 분자의 약물동태를 향상시키는 방법,
[10] 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 함으로써, 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘리는 방법,
[11] 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 함으로써, 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘리는 방법,
[12] 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 함으로써, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 방법,
[13] 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 함으로써, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법,
[14] 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 함으로써, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법,
[15] 항원에 대한 pH 5.8에서의 KD와 pH 7.4에서의 KD의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값을 2 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 [9] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 방법,
[16] KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값을 10 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 [9] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 방법,
[17] KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값을 40 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 [9] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 방법,
[18] 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입함으로써 약물동태를 향상시키는 방법,
[19] 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입함으로써, 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘리는 방법,
[20] 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입함으로써, 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘리는 방법,
[21] 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입함으로써, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 방법,
[22] 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입함으로써, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법,
[23] 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입함으로써, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법,
[24] 히스티딘으로의 치환 또는 히스티딘의 삽입에 의해, pH 5.8에서의 항원 결합활성과 pH 7.4에서의 항원 결합활성의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 히스티딘 치환 또는 삽입 전과 비교하여 커지는 것을 특징으로 하는 [18] 내지 [23] 중 어느 하나에 기재된 방법,
[25] 항원 결합 분자가 안타고니스트 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 [9] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 방법,
[26] 항원 결합 분자가 막 항원 또는 가용형 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는 [9] 내지 [25] 중 어느 하나에 기재된 방법,
[27] 항원 결합 분자가 항체인 것을 특징으로 하는 [9] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 방법,
[28] 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법,
(a) pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 얻는 공정,
(b) pH 4.0~pH 6.5에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 얻는 공정,
(c) pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
[29] pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성의 2배 이상인 항체를 선택하는 것을 특징으로 하는 [28]에 기재된 스크리닝방법,
[30] 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법,
(a) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는 공정,
(b) (a)의 항원에 결합한 항원 결합 분자를 pH 4.0~pH 6.5의 조건하에 두는 공정,
(c) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
[31] 이하의 공정을 포함하는 제1 pH에서의 결합활성이 제2 pH에서의 결합활성보다도 높은 항원 결합 분자의 스크리닝방법,
(a) 항원을 고정한 칼럼에 제1 pH 조건하에서 항원 결합 분자를 결합시키는 공정,
(b) 제1 pH 조건하에서 칼럼에 결합한 항원 결합 분자를, 제2 pH 조건하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
[32] 이하의 공정을 포함하는 제1 pH에서의 결합활성이 제2 pH에서의 결합활성보다도 높은 항원 결합 분자의 스크리닝방법,
(a) 항원 결합 분자 라이브러리를, 항원을 고정한 칼럼에 제1 pH 조건하에서 결합시키는 공정,
(b) 칼럼으로부터 제2 pH 조건하에서 항원 결합 분자를 용출하는 공정,
(c) 용출된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정,
(d) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
[33] 제1 pH가 pH 6.7~pH 10.0, 제2 pH가 4.0~pH 6.5인 것을 특징으로 하는 [31] 또는 [32]에 기재된 스크리닝방법,
[34] 항원 결합 분자가, 항원 결합 분자 중 하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되었거나 또는 하나 이상의 히스티딘이 삽입된 항원 결합 분자인 [28] 내지 [33] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법,
[35] 혈장 중 체류성이 우수한 항원 결합 분자를 얻는 것을 목적으로 하는 [28] 내지 [33] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법,
[36] 항원에 2회 이상 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 얻는 것을 목적으로 하는 [28] 내지 [33] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법,
[37] 결합 가능한 항원의 수가 항원 결합 부위보다 많은 항원 결합 분자를 얻는 것을 목적으로 하는 [28] 내지 [33] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법,
[38] 세포외에서 결합한 항원을 세포내에서 해리하는 항원 결합 분자를 얻는 것을 목적으로 하는 [28] 내지 [33] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법,
[39] 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입되고, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출되는 항원 결합 분자를 얻는 것을 목적으로 하는 [28] 내지 [33] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법,
[40] 혈장 중 항원 소실능이 증가한 항원 결합 분자를 얻는 것을 목적으로 하는 [28] 내지 [33] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법,
[41] 항원 결합 분자가 의약조성물로서 사용되는 항원 결합 분자인 [28] 내지 [40] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법,
[42] 항원 결합 분자가 항체인 것을 특징으로 하는 [28] 내지 [41] 중 어느 하나에 기재된 스크리닝방법,
[43] 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법,
(a) pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 얻는 공정,
(b) pH 4.0~pH 6.5에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 얻는 공정,
(c) pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정,
[44] 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법,
(a) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는 공정,
(b) (a)의 항원에 결합한 항원 결합 분자를 pH 4.0~pH 6.5의 조건하에 두는 공정,
(c) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) (c)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정,
[45] 이하의 공정을 포함하는 제1 pH에서의 결합활성이 제2 pH에서의 결합활성보다도 높은 항원 결합 분자의 제조방법,
(a) 항원을 고정한 칼럼에 제1 pH 조건하에서 항원 결합 분자를 결합시키는 공정,
(b) 제1 pH 조건하에서 칼럼에 결합한 항원 결합 분자를, 제2 pH 조건하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) (c)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정,
[46] 이하의 공정을 포함하는 제1 pH에서의 결합활성이 제2 pH에서의 결합활성보다도 높은 항원 결합 분자의 제조방법,
(a) 항원 결합 분자 라이브러리를, 항원을 고정한 칼럼에 제1 pH 조건하에서 결합시키는 공정,
(b) 칼럼으로부터 제2 pH 조건하에서 항원 결합 분자를 용출하는 공정,
(c) 용출된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정,
(d) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(e) (d)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(f) (e)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정,
[47] 제1 pH가 pH 6.7~pH 10.0, 제2 pH가 4.0~pH 6.5인 것을 특징으로 하는 [45] 또는 [46]에 기재된 제조방법,
[48] 항원 결합 분자 중 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 공정을 추가적으로 포함하는 [43] 내지 [47] 중 어느 하나에 기재된 제조방법,
[49] 항원 결합 분자가 항체인 것을 특징으로 하는 [43] 내지 [48] 중 어느 하나에 기재된 제조방법,
[50] [43] 내지 [49] 중 어느 하나에 기재된 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 포함하는 의약조성물,
을 제공하는 것이다.
본 발명에 의해, 1분자의 항원 결합 분자를 복수의 항원으로 반복해서 결합시키는 방법이 제공되었다. 1분자의 항원 결합 분자가 복수의 항원에 결합함으로써 항원 결합 분자의 약물동태를 향상시켜, 인 비보(in vivo)에 있어서 통상의 항원 결합 분자보다도 우수한 효과를 발휘시킬 수 있다.
도 1은 막형 항원에 결합한 항체의 분해경로를 나타내는 도면이다.
도 2는 FcRn에 의한 IgG 분자의 샐비지 메커니즘(salvage mechanism)을 나타내는 도면이다.
도 3은 IgG 분자가 엔도솜 내에서 막형 항원으로부터 해리됨으로써 재차 새로운 항원에 결합하는 것을 나타내는 모식도이다.
도 4는 IgG 분자가 엔도솜 내에서 가용형 항원으로부터 해리됨으로써 재차 새로운 항원에 결합하는 것을 나타내는 모식도이다.
도 5는 항원을 고정화한 칼럼 패닝(column panning)을 나타내는 도면이다.
도 6은 칼럼 패닝으로부터 취득한 클론의 파지 ELISA의 결과를 나타내는 그래프이다. 상단이 WT, 하단이 CL5이다.
도 7은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 생물학적 중화활성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 pH 7.4에서의 가용형 IL-6 수용체로의 결합의 Biacore 센서그램의 결과를 나타내는 그래프이다. 제일 위가 WT, 위에서 2번째가 H3pI/L73, 위에서 3번째가 H170/L82, 제일 아래가 CLH5/L73이다.
도 9는 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 pH 5.8에서의 가용형 IL-6 수용체로의 결합의 Biacore 센서그램의 결과를 나타내는 그래프이다. 제일 위가 WT, 위에서 2번째가 H3pI/L73, 위에서 3번째가 H170/L82, 제일 아래가 CLH5/L73이다.
도 10은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 막형 IL-6 수용체로의 결합(pH 7.4) 및 해리(pH 5.8)의 Biacore 센서그램의 결과를 나타내는 그래프이다. 제일 위가 WT, 위에서 2번째가 H3pI/L73, 위에서 3번째가 H170/L82, 제일 아래가 CLH5/L73이다.
도 11은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 SR344로의 반복 결합을 나타내는 Biacore의 센서그램이다.
도 12는 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 SR344로의 반복 결합실험에 있어서의 총항원 결합량을 나타내는 그래프이다.
도 13은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스(transgenic mice)에 있어서의 항체 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
도 14는 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 게잡이원숭이에 있어서의 항체 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
도 15는 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 게잡이원숭이에 있어서의 CRP 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
도 16은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 게잡이원숭이에 있어서의 비결합형 게잡이원숭이 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
도 17은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 막형 IL-6 수용체로의 결합(pH 7.4) 및 해리(pH 5.8)의 Biacore 센서그램의 결과를 나타내는 그래프이다. 위에서부터 WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1이다.
도 18은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스에 있어서의 WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1의 항체 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
도 19는 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 막형 IL-6 수용체로의 결합(pH 7.4) 및 해리(pH 5.8)의 Biacore 센서그램의 결과를 나타내는 그래프이다. 제일 위에서부터 WT, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58이다.
도 20은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스에 있어서의 WT, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58의 항체 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
도 21은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 막형 IL-6 수용체로의 결합(pH 7.4) 및 해리(pH 5.8)의 Biacore 센서그램의 결과를 나타내는 그래프이다. 제일 위에서부터 Fv1-M71, Fv1-M73, Fv3-M71, Fv3-M73이다.
도 22는 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 게잡이원숭이에 있어서의 H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73, Fv4-M73을 0.5 ㎎/㎏, high affinity Ab를 1.0 ㎎/㎏ 투여했을 때의 항체 혈장 중 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
도 23은 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 게잡이원숭이에 있어서의 H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73, Fv4-M73, high affinity Ab 투여군의 CRP 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
도 24는 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체의 게잡이원숭이에 있어서의 H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73, Fv4-M73, high affinity Ab 투여군의 비결합형 게잡이원숭이 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 그래프이다.
도 25는 중쇄(VH1, VH2, VH3, VH4) 및 경쇄(VL1, VL2, VL3)의 FR1, FR2, FR3, FR4 및 CDR1, CDR2, CDR3를 나타내는 도면이다. 아스테리스크(*)는 얼라이먼트한 서열에 있어서의 아미노산의 변이가 있는 부위를 나타낸다.
도 26은 pH 의존적 결합 항IL-6 항체인 Anti-IL6 clone2의 pH 7.4와 pH 5.5에서의 IL-6으로의 결합의 Biacore 센서그램의 결과를 나타내는 그래프이다. pH 7.4의 그래프는, 위에서부터 100, 50, 25, 12.5, 6.25 ng/mL IL-6를 나타낸다.
도 27은 pH 의존적 결합 항IL-31 수용체 항체인 Anti-IL31R clone1의 pH 7.4와 pH 5.5에서의 IL-31 수용체로의 결합의 Biacore 센서그램의 결과를 나타내는 그래프이다. pH 5.5의 그래프는, 위에서부터 100, 50, 25, 12.5 ng/mL IL-31 수용체를 나타낸다.
도 28은 마우스에 SR344 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액을 정맥내 투여 후의 혈장 중의 항체 농도 추이를 나타낸 도면이다.
도 29는 마우스에 SR344 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액을 정맥내 투여 후의 혈장 중의 SR344 농도 추이를 나타낸 도면이다.
[발명을 실시하기 위한 형태]
본 발명은 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘리는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다 약하게 함으로써, 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘리는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘리는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역 중의 아미노산을 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘리는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘리는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘리는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 것을 특징으로 하는, 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘리는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역 중의 아미노산을 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘리는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 것을 특징으로 하는, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역 중의 아미노산을 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하는 것을 특징으로 하는 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 것을 특징으로 하는, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역 중의 아미노산을 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하는 것을 특징으로 하는 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 것을 특징으로 하는, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역 중의 아미노산을 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 약물동태를 향상시키는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 항원 결합 분자의 약물동태를 향상시키는(혈장 중 체류성 길게 하는) 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 것을 특징으로 하는 약물동태를 향상시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역 중의 아미노산을 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하는 것을 특징으로 하는 약물동태를 향상시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로는, 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역 중의 아미노산을 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입하는 것을 특징으로 하는 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 「약물동태의 향상」, 「약물동태의 개선」 또는 「우수한 약물동태」는, 「혈장 중(혈중) 체류성의 향상」, 「혈장 중(혈중) 체류성의 개선」, 「우수한 혈장 중(혈중) 체류성」으로 바꿔 말하는 것이 가능하고, 이들 어구는 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서, 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 한다는 것은, 항원 결합 분자의 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성을 pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성보다 약하게 하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 항원 결합 분자의 pH 5.5~pH 6.5에서의 항원 결합활성을 pH 7.0~pH 8.0에서의 항원 결합활성보다 약하게 하는 것을 의미하고, 특히 바람직하게는, 항원 결합 분자의 pH 5.8에서의 항원 결합활성을 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다 약하게 하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에 있어서 산성 pH란 통상, pH 4.0~pH 6.5이고, 바람직하게는 pH 5.5~pH 6.5이며, 특히 바람직하게는 pH 5.8이다. 또한, 본 발명에 있어서 중성 pH란 통상, pH 6.7~pH 10.0이고, 바람직하게는 pH 7.0~pH 8.0이며, 특히 바람직하게는 pH 7.4이다.
본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다 약하게 한다」는 표현은, 항원 결합 분자의 중성에서의 항원 결합능을 산성에서의 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 높게 한다고 표현하는 것도 가능하다. 즉, 본 발명에 있어서는, 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능과 중성 pH에 있어서의 항원 결합능의 차를 크게 하면 된다(예를 들면, 후술하는 바와 같이 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값을 크게 하면 된다). 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능과 중성 pH에 있어서의 항원 결합능의 차를 크게 하기 위해서는, 예를 들면, 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 낮게 해도 되고, 중성 pH에 있어서의 항원 결합능을 높게 해도 되며, 또는, 그 양쪽이어도 된다.
항원의 결합활성을 측정할 때의 pH 이외의 조건은 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 MES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 또한, 항원 결합 분자의 항원 결합활성의 측정은 당업자에게 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하고, 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다. 항원이 가용형 항원인 경우는, 항원 결합 분자를 고정화한 칩으로의 항원을 애널라이트(analyte)로서 흘림으로써 가용형 항원으로의 결합능을 평가하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는, 항원을 고정화한 칩으로 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흘림으로써 막형 항원으로의 결합능을 평가하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, 산성 pH에 있어서의 항원 결합활성이 중성 pH에 있어서의 항원 결합활성보다도 약한 한, 산성 pH에 있어서의 항원 결합활성과 중성 pH에 있어서의 항원 결합활성의 차는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 항원에 대한 pH 5.8에서의 KD와 pH 7.4에서의 KD(Dissociation constant: 해리상수)의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 40 이상이다. KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한, 400, 1000, 10000 등, 어떠한 값이어도 된다. 항원 결합활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 KD(해리상수)를 사용하는 것이 가능하나, 항원이 막형 항원인 경우는 외관의 KD(Apparent dissociation constant: 외관의 해리상수)를 사용하는 것이 가능하다. KD(해리상수), 및 외관의 KD(외관의 해리상수)는, 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스켓차드 플롯(Scatchard plot), FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 있어서는, 산성 pH에 있어서의 항원 결합활성과 중성 pH에 있어서의 항원 결합활성을 차를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면, 해리속도상수인 Kd(Dissociation rate constant: 해리속도상수)를 사용하는 것도 가능하다. 결합활성의 차를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 Kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 항원에 대한 pH 5.8에서의 Kd(해리속도상수)와 pH 7.4에서의 Kd(해리속도상수)의 비인 Kd(pH 5.8)/Kd(pH 7.4)의 값은, 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. Kd(pH 5.8)/Kd(pH 7.4)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술상식에 있어서 제작 가능한 한, 50, 100, 200 등, 어떠한 값이어도 된다.
항원 결합활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 Kd(해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하나, 항원이 막형 항원인 경우는 외관의 kd(Apparent dissociation rate constant: 외관의 해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하다. kd(해리속도상수) 및 외관의 kd(외관의 해리속도상수)는, 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.
또한 본 발명에 있어서 상이한 pH로 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 측정할 때는, pH 이외의 조건은 동일하게 하는 것이 바람직하다.
항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 하는 방법(pH 의존적인 결합능을 부여하는 방법)은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 방법에 의해 행해져도 된다. 예를 들면 항원 결합 분자 중의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나, 또는 항원 결합 분자 중에 히스티딘을 삽입함으로써 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 하는 방법을 들 수 있다. 항체 중의 아미노산을 히스티딘으로 치환함으로써 pH 의존성의 항원 결합활성을 항체에 부여할 수 있는 것은 이미 알려져 있다(FEBS Letter, 309(1), 85-88, (1992)). 히스티딘 변이(치환) 또는 삽입이 도입되는(행해지는) 위치는 특별히 한정되지 않고, 변이 또는 삽입 전과 비교하여 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성이 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약해지는(KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 커지는) 한, 어떠한 부위여도 된다. 예를 들면, 항원 결합 분자가 항체인 경우에는, 항체의 가변영역 등을 들 수 있다. 히스티딘 변이 또는 삽입이 도입되는(행해지는) 수는 당업자가 적절히 결정할 수 있어, 1개소만을 히스티딘으로 치환해도 되고, 또는 1개소에만 히스티딘을 삽입해도 되며, 2개 이상의 복수 개소를 히스티딘으로 치환해도 되고, 또는 2개소 이상의 복수 개소에 히스티딘을 삽입해도 된다. 또한, 히스티딘 변이 이외의 변이(히스티딘 이외의 아미노산으로의 변이)를 동시에 도입해도 된다. 또한, 히스티딘 변이와 히스티딘 삽입을 동시에 행해도 된다. 히스티딘으로의 치환 또는 히스티딘의 삽입은 당업자에게 공지의 알라닌 scanning의 알라닌을 히스티딘으로 치환한 히스티딘 scanning 등의 방법에 의해 랜덤으로 행해도 되고, 히스티딘 변이 또는 삽입이 랜덤으로 도입된 항원 결합 분자 라이브러리 중에서, 변이 전과 비교하여 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 커진 항원 결합 분자를 선택해도 된다.
항원 결합 분자의 아미노산을 히스티딘으로 치환 또는 항원 결합 분자의 아미노산에 히스티딘을 삽입하는 경우, 특별히 한정되지 않지만, 히스티딘 치환 또는 삽입 후의 항원 결합 분자의 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성이, 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 분자의 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성과 동등한 것이 바람직하다. 여기서, 히스티딘 치환 또는 삽입 후의 항원 결합 분자의 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성이, 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 분자의 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성과 동등하다는 것은, 히스티딘 치환 또는 삽입 후의 항원 결합 분자가, 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 분자가 갖는 항원 결합활성의 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상을 유지하고 있는 것을 말한다. 히스티딘 치환 또는 삽입에 의해 항원 결합 분자의 항원 결합활성이 낮아진 경우에는, 항원 결합 분자 중의 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해 항원 결합활성을 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 항원 결합활성과 동등하게 해도 된다. 본 발명에 있어서, 그러한 히스티딘 치환 또는 삽입 후에 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 행함으로써 결합활성이 동등해진 항원 결합 분자도 포함된다.
또한, 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 하는 다른 방법으로서, 항원 결합 분자 중의 아미노산을 비천연형 아미노산으로 치환 또는 항원 결합 분자 중의 아미노산에 비천연형 아미노산을 삽입하는 방법을 들 수 있다. 비천연 아미노산은 인위적으로 pKa를 조절할 수 있는 것이 알려져 있다(Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 34, Chem Soc Rev. 2004 Sep 10;33(7):422-30., Amino Acids. 1999;16(3-4):345-79.). 따라서, 본 발명에 있어서는 전술한 히스티딘 대신에 비천연형 아미노산을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 전술한 히스티딘 치환 및/또는 삽입과, 비천연형 아미노산의 치환 및/또는 삽입은, 동시에 행해도 된다. 본 발명에서 사용되는 비천연형 아미노산은 어떠한 비천연형 아미노산이어도 되고, 당업자에게 공지의 비천연형 아미노산 등을 사용하는 것이 가능하다.
또한, 항원 결합 분자가 항체 정상영역을 포함하는 물질인 경우, 항원 결합 분자의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 하는 다른 방법으로서, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역을 개변하는 방법을 들 수 있다. 이러한 항체 정상영역의 개변의 구체예로서는, 예를 들면 실시예에 기재된 정상영역으로 치환하는 방법을 들 수 있다.
또한, 항체 정상영역의 개변방법으로서는, 예를 들면, 정상영역의 아이소타입(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)을 복수 검토하여, pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성이 저하되는(pH 5.8에 있어서의 해리속도가 빨라지는) 아이소타입을 선택하는 방법을 들 수 있다. 또한 야생형 아이소타입의 아미노산 서열(야생형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 아미노산 서열)에 아미노산 치환을 도입함으로써, pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 저하시키는(pH 5.8에 있어서의 해리속도를 빠르게 하는) 방법을 들 수 있다. 아이소타입(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)에 의해 항체 정상영역의 힌지영역의 서열이 크게 달라, 힌지영역의 아미노산 서열의 차이는 항원 결합활성에 크게 영향을 미치기 때문에, 항원이나 에피토프의 종류에 따라 적절한 아이소타입을 선택함으로써 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성이 저하되는(pH 5.8에 있어서의 해리속도가 빨라지는) 아이소타입을 선택하는 것이 가능하다. 또한, 힌지영역의 아미노산 서열의 차이는 항원 결합활성에 크게 영향을 미치는 것으로부터, 야생형 아이소타입의 아미노산 서열의 아미노산 치환 개소로서는, 힌지영역이 바람직하다고 생각된다.
전술한 방법 등에 의해 항원 결합 물질의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 하는(KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값을 크게 하는) 경우, 특별히 한정되지 않으나, KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 원래의 항체와 비교하여 통상, 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상이 되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 「약물동태가 향상된다」는 것은, 항원 결합 분자가 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼, 개 등의 동물에 투여되고나서, 혈장 중으로부터 소실될 때까지(예를 들면, 세포내에서 분해되거나 하여 항원 결합 분자가 혈장 중으로 돌아가는 것이 불가능한 상태가 될 때까지)의 시간이 길어질 뿐 아니라, 항원 결합 분자가 투여되고나서 혈장 중으로부터 소실될 때까지의 사이에 항원에 결합 가능한 상태(예를 들면, 항원 결합 분자가 항원에 결합하고 있지 않은 상태)에서 혈장 중에 체류하는 시간이 길어지는 것도 포함한다. 항원 결합 분자가 혈장 중에 존재하고 있어도, 그 항원 결합 분자에 이미 항원이 결합하고 있는 경우는, 그 항원 결합 분자는 새로운 항원에 결합할 수 없다. 그 때문에 항원 결합 분자가 항원에 결합하고 있지 않은 시간이 길어지면, 새로운 항원에 결합할 수 있는 시간이 길어져(새로운 항원에 결합할 수 있는 기회가 많아져), 생체내에서 항원이 항원 결합 분자에 결합하고 있지 않은 시간을 감소시킬 수 있다(바꿔 말하면, 항원에 항원 결합 분자가 결합하고 있는 시간을 길게 할 수 있다). 예를 들면 혈장 중 등의 생체내에 존재하는 항원(항원 결합 분자에 결합하고 있는 분자와 항원 결합 분자에 결합하고 있지 않은 항원의 총량)에 대한, 항원 결합 분자에 결합하고 있는 항원의 비율은, 통상, 항원 결합 분자 투여 후, 일정시간이 경과하면 감소해 간다. 그러나, 항원 결합 분자가 항원에 결합 가능한 상태로 체류하는 시간이 길어지면, 그 감소를 억제(예를 들면, 감소의 정도를 적게 하는 등)하는 것이 가능해져, 결과적으로 항체 투여로부터 일정시간 경과한 후의 생체내에 존재하는 항원에 대한, 항원 결합 분자에 결합하고 있는 항원의 비율이 높아진다.
즉, 본 발명의 「약물동태의 향상」은, 반드시 항원 결합 분자가 투여되고나서 항원 결합 분자가 소실될 때까지의 시간이 연장될(길어질) 필요는 없다. 설령 항원 결합 분자가 투여되고나서 소실될 때까지의 시간에 변화가 없어도, 항원 결합 분자가 항원에 결합할 수 있는 상태(예를 들면, 항원 결합 분자가 항원에 결합하고 있지 않은 상태)에서 혈장 중에 체류하고 있는 시간이 길어져 있는 경우, 생체내의 항원이 항원 결합 분자에 결합하고 있지 않은 시간이 감소해 있는(바꿔 말하면, 항원에 항원 결합 분자가 결합하고 있는 시간이 길어져 있는) 경우, 또는 생체내에 존재하는 항원에 대한 항원 결합 분자에 결합하고 있는 항원의 비율이 높아져 있는 경우 중 어느 경우도, 본 발명의 「약물동태의 향상」에 포함된다. 따라서, 본 발명의 「약물동태의 향상」에는 적어도 이하의 (1)~(4)가 포함된다.
(1) 항원 결합 분자가 투여되고나서, 항원 결합 분자가 혈장 중으로부터 소실될 때까지의 시간의 연장.
(2) 항원 결합 분자가 투여되고나서, 항원 결합 분자가 항원에 결합 가능한 상태로 혈장 중에 존재하는 시간의 연장.
(3) 항원 결합 분자가 투여되고나서, 생체내의 항원이 항원 결합 분자와 결합하고 있지 않은 시간의 감소(생체내의 항원에 항원 결합 분자가 결합하고 있는 시간의 연장).
(4) 생체내에 존재하는 항원에 대한 항원 결합 분자에 결합한 항원의 비율의 상승.
또한, 항원이 혈장 중에 존재하는 가용형 항원인 경우, 항원 결합 분자의 약물동태(혈장 중으로부터의 소실속도)가 동등하더라도, 항원 결합 분자가 결합하고 있는 항원의 소실이 빨라지는 경우가 있다. 이는 항원의 약물동태를 저하시킴(혈장 중으로부터의 소실을 빠르게 함)으로써, 항원에 대한 상대적인 항원 결합 분자의 약물동태가 향상되고 있는 것으로 이어져, 즉, 항원 결합 분자가 항원에 결합 가능한 상태로 혈장 중에 존재하는 시간의 연장으로 이어진다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 분자의 「약물동태의 향상」의 일태양으로서, 항원 결합 분자가 투여되고나서, 가용형 항원이 혈장 중으로부터 소실되는 속도(항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능)의 상승도 포함된다.
본 발명에 있어서, 1분자의 항원 결합 분자가 복수의 항원에 결합했는지 여부는, 항원이 막형 항원인 경우, 항원 결합 분자의 약물동태의 향상 여부로 판단하는 것이 가능하다. 「약물동태의 향상」 여부는, 이하와 같이 하여 판단하는 것이 가능하다. 예를 들면 항원 결합 분자가 투여되고나서 항원 결합 분자가 소실될 때까지의 시간이 연장되었는지 여부는, 항원 결합 분자의 혈장 중 반감기, 평균 혈장 중 체류시간, 혈장 중 클리어런스 등 중 어느 하나의 파라미터(파마코키네틱스 연습에 의한 이해(난잔도))를 측정함으로써 판단하는 것이 가능하다. 예를 들면, 항원 결합 분자를 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼, 개, 인간 등에 투여한 경우, 혈장 중 반감기가 길어졌거나 또는 평균 혈장 중 체류시간이 길어진 경우 등에는 항원 결합 분자의 약물동태가 향상되었다고 할 수 있다. 이들 파라미터는 당업자에게 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면, 약물동태해석 소프트웨어 WinNonlin(Pharsight)을 사용하여, 부속의 수순서에 따라 Noncompartmental 해석함으로써 적절히 평가할 수 있다.
또한, 항원 결합 분자가 투여되고나서 소실될 때까지의 사이에 항원에 결합 가능한 상태로 혈장 중에 존재하는 시간이 연장되었는지 여부는, 항원에 결합하고 있지 않은 항원 결합 분자의 혈장 중 농도를 측정하여, 항원에 결합하고 있지 않은 항원 결합 분자의 혈장 중 반감기, 평균 혈장 중 체류시간, 혈장 중 클리어런스 등 중 어느 하나의 파라미터를 측정함으로써 판단하는 것이 가능하다. 항원에 결합하고 있지 않은 항원 결합 분자의 혈장 중 농도의 측정은 당업자 공지의 방법으로 실시하는 것이 가능하고, 예를 들면, Clin Pharmacol. 2008 Apr;48(4):406-17에 있어서 측정되고 있다.
또한, 항원 결합 분자가 투여되고나서, 생체내의 항원이 항원 결합 분자에 결합하고 있지 않은 시간이 감소되었는지(항원에 항원 결합 분자가 결합하고 있는 시간이 길어졌는지) 여부는, 항원 결합 분자가 결합하고 있지 않은 비결합형 항원의 혈장 중 농도를 측정하여, 비결합형 항원의 혈장 중 농도, 또는, 총항원량에 대한 비결합형 항원량의 비율이 낮게 유지되어 있는 기간을 토대로 판단하는 것이 가능하다. 비결합형 항원의 혈장 중 농도, 또는, 총항원량에 대한 비결합형 항원량의 비율의 측정은 당업자 공지의 방법으로 실시하는 것이 가능하고, 예를 들면, Pharm Res. 2006 Jan;23(1):95-103에 있어서 측정되고 있다. 또한, 항원이 어떠한 기능을 생체내에서 나타내는 경우, 항원이 항원의 기능을 중화하는 항원 결합 분자(안타고니스트 분자)에 의해 결합되어 있는지 여부는, 그 항원의 기능이 중화되어 있는지 여부로 평가하는 것도 가능하다. 항원의 기능이 중화되어 있는지 여부는, 항원의 기능을 반영하는 어떠한 생체내의 마커를 측정함으로써 평가하는 것이 가능하다. 항원이 항원의 기능을 활성화하는 항원 결합 분자(아고니스트 분자)에 의해 결합되어 있는지 여부는, 항원의 기능을 반영하는 어떠한 생체내의 마커를 측정함으로써 평가하는 것이 가능하다.
비결합형 항원의 혈장 중 농도의 측정, 총항원량에 대한 비결합형 항원의 항원량의 비율의 측정, 생체내 마커의 측정 등의 측정은 특별히 한정되지 않으나, 항원 결합 물질이 투여되고나서 일정시간이 경과한 후에 행해지는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 항원 결합 물질이 투여되고나서 일정시간이 경과한 후라는 것은, 특별히 한정되지 않고, 투여된 항원 결합 물질의 성질 등에 따라 당업자가 적시 결정하는 것이 가능하나, 예를 들면 항원 결합 물질을 투여하고나서 1일 경과 후, 항원 결합 물질을 투여하고나서 3일 경과 후, 항원 결합 물질을 투여하고나서 7일 경과 후, 항원 결합 물질을 투여하고나서 14일 경과 후, 항원 결합 물질을 투여하고나서 28일 경과 후 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 인간에 있어서의 약물동태가 향상되는 것이 바람직하다. 인간에서의 혈장 중 체류성을 측정하는 것이 곤란한 경우에는, 마우스(예를 들면, 정상 마우스, 인간 항원 발현 형질전환 마우스, 인간 FcRn 발현 형질전환 마우스 등)나 원숭이(예를 들면, 게잡이원숭이 등)에서의 혈장 중 체류성을 토대로, 인간에서의 혈장 중 체류성을 예측할 수 있다.
혈장 중 체류성의 측정방법은, 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 실시예에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.
항원 결합 분자가 항원에 복수회 결합 가능한지 여부는, 혈장 중과 동일한 중성 조건하에서 항원 결합 분자에 결합한 항원이 엔도솜 내와 동일한 산성 조건하에서 해리되고, 재차 중성 조건하에서 어느 정도의 항원에 결합할 수 있는지 여부를 측정함으로써 평가하는 것이 가능하다. 구체적으로는, Biacore와 같은 항원 결합 분자-항원반응을 평가하는 기기를 사용하여, 중성 조건하에서 항원 결합 분자-항원 복합체를 만들게 하여, 그 후 일정시간 산성 조건하에 폭로한 후에, 재차 중성 조건하에 있어서 항원 결합 분자가 항원에 결합할 수 있는지 여부를 측정함으로써 평가 가능하다. 개변 전의 항원 결합 분자와 비교하여 pH 의존적 결합능을 부여한 항원 결합 분자의 항원 결합량이 2배 향상된 경우, 개변 전의 항원 결합 분자와 비교하여 pH 의존적 결합능을 부여한 항원 결합 분자는 결합 횟수가 2배 향상되었다고 할 수 있다. 또한, 항원이 막형 항원으로서 항원에 결합한 항원 결합 분자가 항원을 매개로 삽입되어 리소좀으로 분해됨으로써 혈장 중으로부터 소실되는 경우, 개변 전의 항원 결합 분자와 비교하여 pH 의존적 결합능을 부여한 항원 결합 분자의 약물동태 또는 항원으로의 결합기간이 어느 정도 향상되었는지 여부를 평가함으로써, 개변 전의 항원 결합 분자와 비교하여 pH 의존적 결합능을 부여한 항원 결합 분자의 결합 횟수가 증대되었는지 여부를 평가하는 것이 가능하다. 예를 들면, 개변 전의 항원 결합 분자와 비교하여 pH 의존적 결합능을 부여한 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 기간이 2배 향상된 경우, 개변 전의 항원 결합 분자와 비교하여 pH 의존적 결합능을 부여한 항원 결합 분자는 결합 횟수가 2배 향상되었다고 할 수 있다. 또한, 항원 결합 분자가 결합하고 있지 않은 비결합형 항원의 혈장 중 농도를 측정하여, 비결합형 항원의 혈장 중 농도, 또는, 총항원량에 대한 비결합형 항원의 항원량의 비율이 낮게 유지되어 있는 시간이 2배 연장된 경우, 개변 전의 항원 결합 분자와 비교하여 pH 의존적 결합능을 부여한 항원 결합 분자는 결합 횟수가 2배 향상되었다고 할 수 있다.
또한, 항원이 가용형 항원인 경우, 혈장 중의 중성 조건하에서 항원 결합 분자에 결합한 항원이 엔도솜 내에서 해리되어 항원 결합 분자가 혈장 중에 돌아가면, 항원 결합 분자는 재차 혈장 중의 중성 조건하에서 항원에 결합할 수 있기 때문에, 엔도솜 내의 산성 조건하에서 항원을 해리하는 성질을 갖는 항원 결합 분자는 항원에 복수회 결합 가능하다. 항원 결합 분자에 결합한 항원이 엔도솜 내에서 해리되지 않는 경우(항원은 항원 결합 분자에 결합한 채로 혈장 중으로 돌아간다)와 비교하여, 항원 결합 분자에 결합한 항원이 엔도솜 내에서 해리되는 경우는, 항원은 리소좀으로 옮겨져 분해되기 때문에 항원의 혈장 중으로부터의 소실속도는 증가한다. 즉, 혈장 중으로부터 항원이 소실되는 속도를 지표로 하여 항원 결합 분자가 항원에 복수회 결합 가능한지 여부를 판단하는 것도 가능하다. 항원의 혈장 중으로부터의 소실속도의 측정은, 예를 들면, 항원(예를 들면, 막 항원)과 항원 결합 분자를 생체내에 투여하고, 투여 후의 혈장 중의 항원농도를 측정함으로써 행하는 것도 가능하다. 또한, 항원(예를 들면, 막 항원)이 생체내에서 생산(분비)되는 경우, 항원의 혈장 중으로부터의 소실속도가 증가하고 있으면 혈장 중 항원농도는 저하되는 것으로부터, 혈장 중 항원농도를 지표로 하여 항원 결합 분자가 항원에 복수회 결합 가능한지 여부를 판단하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘린다」는 것은, 항원 결합 분자가 인간, 마우스, 원숭이 등에 투여되었을 때에, 항원 결합 분자가 항원에 결합하여, 세포내에 삽입되는 공정을 1회로 하고, 이 공정이 늘어나는 것을 의미한다. 즉 본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자가 항원에 2회 결합한다」는 것은, 항원 결합 분자가 항원에 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 후에, 항원을 해리한 상태에서 세포외로 방출되고, 방출된 항원 결합 분자가 재차 항원에 결합하여, 세포내에 삽입되는 것을 의미한다.
항원 결합 분자가 세포에 삽입될 때에는, 항원 결합 분자는 하나의 항원을 결합한 상태에서 삽입되어도 되고, 둘 또는 그 이상의 항원을 결합한 상태에서 삽입되어도 된다.
본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수가 늘어난다」는 것은, 모든 항원 결합 분자의 항원 결합 횟수가 늘어날 필요는 없고, 예를 들면, 항원 결합 분자 조성물에 포함되는 항원 결합 분자 중, 2회 이상 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 비율이 상승하는 것이나, 항원 결합 분자 조성물에 포함되는 항원 결합 분자의 결합 횟수의 평균이 상승하는 것 등이어도 된다.
본 발명에 있어서는, 항원 결합 분자를 인간에 투여했을 때의 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수가 늘어나는 것이 바람직하나, 인간에서의 항원 결합 횟수를 측정하는 것이 곤란한 경우에는, 인 비트로(in vitro)에서의 측정결과, 마우스(예를 들면, 항원 발현 형질전환 마우스, 인간 FcRn 발현 형질전환 마우스 등)나 원숭이(예를 들면, 게잡이원숭이 등) 등에서의 측정결과를 토대로 인간에서의 항원 결합 횟수를 예상해도 된다.
본 발명에 있어서는, 항원 결합 분자가 2회 이상 항원에 결합하는 것이 바람직하고, 예를 들면, 항원 결합 분자 조성물에 포함되는 항원 결합 분자의 적어도 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상(예를 들면, 90% 이상, 95% 이상 등)의 항원 결합 분자가 2회 이상 항원에 결합하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘린다」는 것은, 항원 결합 분자가 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여되고나서, 세포내의 리소좀으로 분해될 때까지의 사이에 항원 결합 분자가 결합할 수 있는 항원의 수를 늘리는 것을 의미한다.
통상, IgG 등의 항체는 2개의 결합 부위를 갖기 때문에, 하나의 항체는 최대 2개의 항원에 결합하고, 항원에 결합한 항체는 세포내에 삽입되어, 리소좀으로 항원과 함께 분해된다. 따라서, 통상, IgG 등의 항체는 최대 2개의 항원에 결합하는 것이 가능하다. 본 발명의 방법에 의해 항체 등의 항원 결합 분자의 엔도솜 내에서의 pH에 있어서의 항원 결합활성을 혈장 중에서의 pH에 있어서의 항원 결합활성보다도 약하게 함으로써, 세포내에 삽입된 항체 등의 항원 결합 분자는, 세포내에서 항원을 해리하여, 재차 세포외로 방출되어 항원에 결합하는 것이 가능해진다. 즉, 본 발명의 방법에 의해, 항원 결합 분자의 항원 결합 부위의 수보다도 많은 수의 항원에 결합하는 것이 가능해진다. 구체적으로는, 예를 들면 2개의 결합 부위를 갖는 IgG의 경우, 본 발명의 방법을 사용함으로써, 항체가 투여되고나서 항체가 분해될 때까지의 사이에 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상의 항원에 결합하는 것이 가능해진다. 예를 들면, 항체가 중화 항체인 경우, 「항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘린다」는 것은, 항원 결합 분자가 중화 가능한 항원의 수를 늘린다라고도 할 수 있다. 따라서, 항체가 중화 항체인 경우에는, 「결합」을 「중화」로 치환하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘린다」는 것은, 모든 항원 결합 분자에 있어서 결합 가능한 항원의 수가 늘어날 필요는 없고, 예를 들면, 항원 결합 분자 조성물에 포함되는 항원 결합 분자의 결합 가능한 항원의 수의 평균이 늘어나는 것이어도 되고, 항원 결합 분자의 항원 결합 부위의 수보다도 많은 항원에 결합할 수 있는 항원 결합 분자의 비율이 상승하는 것 등이어도 된다.
본 발명에 있어서는, 항원 결합 분자를 인간에 투여했을 때에 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수가 늘어나는 것이 바람직하나, 인간에서의 수를 측정하는 것이 곤란한 경우에는, 인 비트로에서의 측정결과, 마우스(예를 들면, 항원 발현 형질전환 마우스, 인간 FcRn 발현 형질전환 마우스 등)나 원숭이(예를 들면, 게잡이원숭이 등) 등에서의 측정결과를 토대로 인간에서의 결합 가능한 항원의 수를 예상해도 된다. 일반적으로, 항체가 중화 항체인 경우, 전술한 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수는, 항원 결합 분자가 중화 가능한 항원의 수와 상관이 있는 것으로 생각되기 때문에, 항원 결합 분자가 중화 가능한 항원의 수의 측정은, 전술한 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수의 측정과 동일하게 하여 행하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명은 산성 pH에 있어서의 항원 결합활성이 중성 pH에 있어서의 항원 결합활성보다 낮은 항원 결합 분자를 투여함으로써, 체내에서 항원 결합 분자를 2회 이상 항원에 결합시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 중화활성을 갖는 항원 결합 분자에 있어서, 산성 pH에 있어서의 항원 결합활성이 중성 pH에 있어서의 항원 결합활성보다 낮은 항원 결합 분자를 투여함으로써, 항원 결합 분자의 항원 결합 부위의 수보다도 많은 수의 항원을 중화하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 산성 pH에 있어서의 항원 결합활성이 중성 pH에 있어서의 항원 결합활성보다 낮은 IgG를 투여함으로써, 3개 이상, 바람직하게는 4개 이상의 항원을 중화하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서 항원이 항원 결합 분자로부터 해리되는 개소는 세포내라면 어떠한 개소여도 되나, 바람직하게는 조기 엔도솜 내이다. 본 발명에 있어서, 「세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원이 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리된다」는 것은, 항원 결합 분자에 결합하여 세포내에 삽입된 항원 전체가 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리될 필요는 없고, 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리되는 항원의 비율이, 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능을 낮게 하기 전과 비교하여 높아져 있으면 된다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 세포내에서의 항원에 결합하고 있지 않은 항원 결합 분자와 FcRn의 결합을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 통상, FcRn은 엔도솜 내에서 항원 결합 분자와 결합하나, 항원 결합 분자가 막형 항원에 결합하고 있는 경우는 FcRn에 결합하는 것이 불가능하다고 생각되기 때문에, 본 발명의 바람직한 태양으로서, 항원이 막형 항원인 경우, 항원 결합 분자의 엔도솜 내에서의 pH(산성 pH)에 있어서의 항원 결합능을 혈장 중에서의 pH(중성 pH)에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 엔도솜 내에서의 항원 결합 분자의 항원으로부터의 해리를 촉진하여, 항원 결합 분자와 FcRn의 결합을 촉진하는 방법을 들 수 있다. 항원이 가용형 항원인 경우, 항원의 결합 유무에 상관없이 항원 결합 분자는 FcRn에 결합할 수 있으나, 항원 결합 분자의 엔도솜 내에서의 pH(산성 pH)에 있어서의 항원 결합능을 혈장 중에서의 pH(중성 pH)에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 엔도솜 내에서 항원의 항원 결합 분자로부터의 해리를 촉진하는 것이 가능하다면, "항원에 결합하고 있지 않은" 항원 결합 분자와 FcRn의 결합을 촉진하는 방법을 들 수 있다.
항원이 막형, 가용형 어느 쪽 경우이더라도, 항원에 결합하고 있지 않은 항원 결합 분자가 FcRn에 의해 혈장 중에 돌아가는 것이 가능하다면, 재차 항원에 결합하는 것이 가능하기 때문에, 이를 반복함으로써 항원 결합 분자는 항원에 복수회 결합하는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서, 「세포내에서의 항원 결합 분자와 FcRn의 결합을 촉진한다」는 것은, 모든 항원 결합 분자가 FcRn과 결합할 필요는 없고, 세포내에서 FcRn과 결합하는 항원에 결합하고 있지 않은 항원 결합 분자의 비율이, 항원 결합 분자의 엔도솜 내에서의 pH에 있어서의 항원 결합능을 혈장 중에서의 pH에 있어서의 항원 결합능을 낮게 하기 전과 비교하여 높아져 있으면 된다. 본 발명의 세포내에서의 항원 결합 분자와 FcRn의 결합을 촉진하는 방법에 있어서 바람직한 항원 결합 분자의 예로서는, 막단백질 등의 막형 항원(막 항원)에 결합하는 항원 결합 분자를 들 수 있다. 또한, 다른 바람직한 항원 결합 분자로서는, 가용형 단백질 등의 가용형 항원에 결합하는 항원 결합 분자를 들 수 있다.
또한, 세포내에서의 항원 결합 분자와 FcRn의 결합을 촉진하는 방법은, 항원 결합 분자의 세포내(예를 들면 엔도솜 내)에서의 FcRn의 결합활성을 증강시키는 방법이라고도 할 수 있다.
또한 본 발명은, 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 「항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시킨다」는 것은, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자 모두가 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출될 필요는 없고, 세포외로 방출되는 항원 결합 분자의 비율이 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다 낮게 하기 전과 비교하여 높아져 있으면 된다. 바람직하게는, 세포외로 방출된 항원 결합 분자는 항원 결합능을 유지하고 있다. 또한, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법은, 항원과 결합하여 세포내에 삽입된 경우에 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출되기 쉬워지는 성질을 항원 결합 분자에 부여하는 방법이라고도 할 수 있다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 함으로써, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 「혈장 중 항원 소실능」이란, 항원 결합 분자가 생체내에 투여되었거나 또는 생체가 분비했을 때에, 혈장 중에 존재하는 항원을 혈장 중으로부터 소실시키는 능력을 말한다. 따라서, 본 발명에 있어서, 「항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능이 증가한다」는 것은, 항원 결합 분자를 생체내에 투여했을 때에 혈장 중으로부터 항원이 소실되는 속도가, 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다 낮게 하기 전과 비교하여 빨라져 있으면 된다. 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능이 증가되었는지 여부는, 예를 들면, 가용형 항원과 항원 결합 분자를 생체내에 투여하고, 투여 후의 가용형 항원의 혈장 중 농도를 측정함으로써 판단하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다 낮게 함으로써, 가용형 항원 및 항원 결합 분자 투여 후의 혈장 중의 가용형 항원의 농도가 저하되어 있는 경우에는, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능이 증가되었다고 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환하거나, 또는 히스티딘 또는 비천연 아미노산을 삽입함으로써, 항원 결합 분자의 약물동태를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환하거나, 또는 히스티딘 또는 비천연 아미노산을 삽입함으로써, 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘리는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환하거나, 또는 히스티딘 또는 비천연 아미노산을 삽입함으로써, 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘리는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환하거나, 또는 히스티딘 또는 비천연 아미노산을 삽입함으로써, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환하거나, 또는 히스티딘 또는 비천연 아미노산을 삽입함으로써, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환하거나, 또는 히스티딘 또는 비천연 아미노산을 삽입함으로써, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법을 제공한다.
히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이(치환, 삽입 등)가 도입되는 위치는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 부위가 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환되어도 되며, 또는 어떠한 부위에 히스티딘 또는 비천연 아미노산이 삽입되어도 된다. 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환 또는 히스티딘 또는 비천연 아미노산이 삽입되는 부위의 바람직한 예로서, 항원 결합 분자의 항원 결합능에 영향을 미치는 영역을 들 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 분자가 항체인 경우에는, 항체의 가변영역이나 CDR 등을 들 수 있다. 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이가 도입되는 수는 특별히 한정되지 않고, 1개소만을 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환해도 되고, 또는 1개소에만 히스티딘 또는 비천연 아미노산을 삽입해도 된다. 또는 2개소 이상의 복수 개소를 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환해도 되고, 또는 복수 개소에 히스티딘 또는 비천연 아미노산을 삽입해도 된다. 또한, 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로의 치환 또는 삽입 이외에 다른 아미노산의 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환 등을 동시에 행해도 된다.
본 발명에 있어서 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환되는 개소의 예로서, 항원 결합 분자가 항체인 경우에는, 항체의 CDR 서열이나 CDR의 구조를 결정하는 서열이 개변 개소로서 생각되고, 예를 들면 이하의 개소를 들 수 있다. 또한, 아미노산 위치는 Kabat 넘버링(Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)으로 나타내고 있다.
중쇄: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b, H102
경쇄: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, L90, L92, L94
이들 개변 개소 중, H32, H61, L53, L90, L94는 보편성이 높은 개변 개소로 생각된다.
또한, 특별히 한정되지 않으나, 항원이 IL-6 수용체(예를 들면, 인간 IL-6 수용체)인 경우의 바람직한 개변 개소로서 이하의 개소를 들 수 있다.
중쇄: H27, H31, H32, H35, H50, H58, H61, H62, H63, H64, H65, H100b, H102
경쇄: L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92, L94
복수의 개소를 조합하여 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환하는 경우의 바람직한 조합의 구체예로서는, 예를 들면, H27, H31, H35의 조합, H27, H31, H32, H35, H58, H62, H102의 조합, L32, L53의 조합, L28, L32, L53의 조합 등을 들 수 있다. 또한, 중쇄와 경쇄의 치환 개소의 바람직한 조합의 예로서는, H27, H31, L32, L53의 조합을 들 수 있다.
또한, 특별히 한정되지 않으나, 항원이 IL-6(예를 들면, 인간 IL-6)인 경우의 바람직한 개변 개소로서 이하의 개소를 들 수 있다.
중쇄: H32, H59, H61, H99
경쇄: L53, L54, L90, L94
또한, 특별히 한정되지 않으나, 항원이 IL-31 수용체(예를 들면, 인간 IL-31 수용체)인 경우의 바람직한 개변 개소로서 H33을 들 수 있다.
이들 개소는, 하나의 개소만 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환해도 되고, 복수의 개소를 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환해도 된다.
본 발명은 방법은, 표적 항원의 종류에 상관없는 임의의 항원 결합 분자에 적응 가능하다.
본 발명에 있어서 항원 결합 분자는, 대상으로 하는 항원으로의 특이적인 결합활성을 갖는 물질이라면 특별히 한정되지 않으나, 항원 결합 분자의 바람직한 예로서, 항체의 항원 결합영역을 가지고 있는 물질을 들 수 있다. 항체의 항원 결합영역의 예로서는, CDR이나 가변영역을 들 수 있다. 항체의 항원 결합영역이 CDR인 경우, 전장 항체에 포함되는 6개의 CDR 모두를 포함하고 있어도 되고, 하나 또는 둘 이상의 CDR을 포함하고 있어도 된다. 항체의 결합영역으로서 CDR을 포함하는 경우, 포함되는 CDR은 아미노산의 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입 등이 행해져 있어도 되고, 또한, CDR의 일부여도 된다.
또한, 항원 결합 분자에 항체 정상영역이 포함되는 경우, 본 발명은 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역을 개변(아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등)함으로써, 항원 결합 분자의 약물동태를 향상시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 항원 결합 분자에 항체 정상영역이 포함되는 경우, 본 발명은 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역을 개변(아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등)함으로써, 항원 결합 분자의 항원으로의 결합 횟수를 늘리는 방법을 제공한다.
또한, 항원 결합 분자에 항체 정상영역이 포함되는 경우, 본 발명은 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역을 개변(아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등)함으로써, 항원 결합 분자가 결합 가능한 항원의 수를 늘리는 방법에 관한 것이다.
또한, 항원 결합 분자에 항체 정상영역이 포함되는 경우, 본 발명은 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역을 개변(아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등)함으로써, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 항원 결합 분자에 항체 정상영역이 포함되는 경우, 본 발명은 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역을 개변(아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등)함으로써, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 항원 결합 분자에 항체 정상영역이 포함되는 경우, 본 발명은 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역을 개변(아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등)함으로써, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항원 결합 물질의 바람직한 태양으로서, FcRn 결합영역을 포함하는 항원 결합 물질을 들 수 있다. FcRn 결합영역을 포함하는 항원 결합 물질은, FcRn의 샐비지 경로에 의해 세포내에 삽입된 후에 재차 혈장 중으로 돌아가는 것이 가능하다. FcRn 결합영역은, 직접 FcRn과 결합하는 영역인 것이 바람직하다. FcRn 결합영역의 바람직한 예로서, 항체의 Fc영역을 들 수 있다. 그러나, 알부민이나 IgG 등의 FcRn과의 결합능을 갖는 폴리펩티드에 결합 가능한 영역은, 알부민이나 IgG 등을 매개로 간접적으로 FcRn과 결합하는 것이 가능하기 때문에, 본 발명에 있어서의 FcRn 결합영역은 그러한 FcRn과의 결합능을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 영역이어도 된다.
본 발명의 방법이 대상으로 하는 항체 등의 항원 결합 분자가 인식하는 항원은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 항원을 인식하는 항체가 대상이 되어도 된다. 본 발명의 방법에 의해 약물동태를 향상시키는 항체의 예로서는, 예를 들면, 수용체 단백질(막 결합형 수용체, 가용형 수용체)이나 세포 표면 마커 등의 막 항원을 인식하는 항체, 사이토카인 등의 가용형 항원을 인식하는 항체 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 막 항원의 바람직한 예로서 막 단백질을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 가용형 항원의 예로서 가용형 단백질을 들 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 약물동태를 향상시키는 항체가 인식하는 항원의 구체적인 예로서는, 예를 들면 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-31, IL-23, IL-2 수용체, IL-6 수용체, OSM 수용체, gp130, IL-5 수용체, CD40, CD4, Fas, 오스테오폰틴, CRTH2, CD26, PDGF-D, CD20, 단구 주화활성 인자, CD23, TNF-α, HMGB-1, α4 인테그린, ICAM-1, CCR2, CD11a, CD3, IFNγ, BLyS, HLA-DR, TGF-β, CD52, IL-31 수용체 등을 들 수 있다. 특히 바람직한 항원으로서, IL-6 수용체를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 방법이 대상으로 하는 항원 결합 분자로서는 안타고니스트 활성을 갖는 항원 결합 분자(안타고니스트 항원 결합 분자), 아고니스트 활성을 갖는 항원 결합 분자(아고니스트 항원 결합 분자) 등을 들 수 있으나, 바람직한 태양으로서, 안타고니스트 항원 결합 분자, 특히 수용체 등의 막 항원이나 사이토카인 등의 가용형 항원을 인식하는 안타고니스트 항원 결합 분자를 들 수 있다. 예를 들면, 수용체를 인식하는 안타고니스트 항원 결합 분자는, 수용체에 결합하여, 수용체와 그의 리간드의 결합을 저해하여, 수용체를 매개로 한 시그날 전달을 저해하는 항원 결합 분자이다.
본 발명에 있어서 대상이 되는 항원 결합 분자는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 항원 결합 분자여도 된다. 본 발명에서 사용되는 항원 결합 분자는 바람직하게는, 항원 결합활성(항원 결합영역)과 FcRn 결합영역을 갖는다. 본 발명에 있어서는, 특히 인간 FcRn과의 결합영역을 포함하는 항원 결합 분자인 것이 바람직하다. 항원 결합활성과 FcRn 결합영역을 갖는 항원 결합 분자의 예로서, 항체를 들 수 있다. 본 발명의 항체의 바람직한 예로서, IgG 항체를 들 수 있다. 항체로서 IgG 항체를 사용하는 경우, 그 종류는 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 아이소타입(서브클래스)의 IgG를 사용하는 것이 가능하다. 또한, 이들 아이소타입의 IgG의 정상영역에 대해, M73과 같이 정상영역부분에 아미노산 변이를 도입해도 된다. 도입하는 아미노산 변이는, 예를 들면, Fcγ 수용체로의 결합을 증대 또는 저감시킨 것(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10.), FcRn으로의 결합을 증대 또는 저감시킨 것(J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604) 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, IgG2 등의 적절한 정상영역을 선택함으로써, pH 의존적인 결합을 변화시키는 것도 가능하다.
본 발명이 대상으로 하는 항원 결합 분자가 항체인 경우, 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등, 어떠한 동물 유래의 항체여도 된다. 또한, 예를 들면, 키메라 항체, 그 중에서도 인간화 항체 등의 아미노산 서열을 치환한 개변 항체여도 된다. 또한, 이중 특이성 항체, 각종 분자를 결합시킨 항체 수식물, 항체 단편을 포함하는 폴리펩티드 등이어도 된다.
「키메라 항체」란, 상이한 동물 유래의 서열을 조합하여 제작되는 항체이다. 키메라 항체의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변(V)영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 정상(C)영역으로 되는 항체를 들 수 있다.
「인간화 항체」란, 재구성(reshaped) 인간 항체로도 칭해지는, 인간 이외의 포유동물 유래의 항체, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR로 이식한 것이다. CDR을 동정하기 위한 방법은 공지이다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). 또한, 그의 일반적인 유전자 재조합수법도 공지이다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조).
이중 특이성 항체는, 상이한 에피토프를 인식하는 가변영역을 동일 항체 분자 내에 갖는 항체를 말한다. 이중 특이성 항체는 둘 이상의 상이한 항원을 인식하는 항체여도 되고, 동일 항원 상의 상이한 둘 이상의 에피토프를 인식하는 항체여도 된다.
또한, 항체 단편을 포함하는 폴리펩티드로서는, 예를 들면, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv(Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36.) domain antibody(dAb)(WO2004/058821, WO2003/002609), scFv-Fc(WO2005037989), dAb-Fc, Fc 융합 단백질 등을 들 수 있다. 이들 분자 중, 특히 Fc영역을 포함하고 있는 분자는 FcRn으로의 결합활성을 갖는 것으로부터, 본 발명에서 발견된 방법을 사용하기에 적합하다.
또한, 본 발명을 적용할 수 있는 항원 결합 분자는, 항체 유사 분자여도 된다. 항체 유사 분자란, 타겟 분자에 결합함으로써 기능을 발휘하는 분자로(Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10, Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469, Protein Science 2006, 15:14-27), 예를 들면, DARPins(WO2002/020565), Affibody(WO1995/001937), Avimer(WO2004/044011, WO2005/040229), Adnectin(WO2002/032925) 등을 들 수 있다. 이들 항체 유사 분자여도, 표적 분자에 대해 pH 의존적으로 결합하는 것이 가능하다면, 1분자로 복수의 표적 분자에 결합하는 것이 가능하다.
또한 항원 결합 분자는, 표적에 결합하는 수용체 단백질 및 수용체 Fc 융합 단백질이어도 되고, 예를 들면, TNFR-Fc 융합 단백, IL1R-Fc 융합 단백, VEGFR-Fc 융합 단백, CTLA4-Fc 융합 단백 등(Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52, BioDrugs. 2006;20(3):151-60.)을 들 수 있다. 이들 수용체 단백질 및 수용체 Fc 융합 단백질어어도 표적 분자에 대해 pH 의존적으로 결합하는 것이 가능하다면, 1분자로 복수의 표적 분자에 결합하는 것이 가능하다.
또한 항원 결합 분자는, 표적에 결합하나 중화 효과를 갖는 인공 리간드 단백질 및 인공 리간드 융합 단백질이어도 되고, 예를 들면, 변이 IL-6(EMBO J. 1994 Dec 15;13(24):5863-70.) 등을 들 수 있다. 이들 인공 리간드 단백질 및 인공 리간드 융합 단백질이어도 표적 분자에 대해 pH 의존적으로 결합하는 것이 가능하다면, 1분자로 복수의 표적 분자에 결합하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 항체는 당쇄가 개변되어 있어도 된다. 당쇄가 개변된 항체의 예로서는, 예를 들면, 글리코실화가 수식된 항체(WO99/54342 등), 당쇄에 부가하는 푸코오스가 결손된 항체(WO00/61739, WO02/31140, WO2006/067847, WO2006/067913 등), 바이섹팅(bisecting) GlcNAc를 갖는 당쇄를 갖는 항체(WO02/79255 등) 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법은 특정 이론에 의해 한정되는 것은 아니나, 예를 들면, 산성 pH에 있어서의 항원 결합능을 중성 pH에 있어서의 항원 결합능보다도 약하게 하는 것과 약물동태의 향상, 및 복수회의 항원으로의 결합과의 관련은 이하와 같이 설명하는 것이 가능하다.
예를 들면, 항체가 막 항원에 결합하는 항체인 경우, 생체내에 투여한 항체는 항원에 결합하고, 그 후, 항체는 항원에 결합한 채로 항원과 함께 인터날리제이션(internalization)에 의해 세포내의 엔도솜에 삽입된다. 그 후, 항체는 항원에 결합한 채로 리소좀으로 이행하고 항체는 항원과 함께 리소좀에 의해 분해된다. 인터날리제이션을 매개로 한 혈장 중으로부터의 소실은 항원 의존적인 소실이라 불리고 있고, 많은 항체 분자에서 보고되어 있다(Drug Discov Today. 2006 Jan;11(1-2):81-8). 1분자의 IgG 항체가 2가로 항원에 결합한 경우, 1분자의 항체가 2분자의 항원에 결합한 상태에서 인터날라이즈되어, 그대로 리소좀으로 분해된다. 따라서, 통상의 항체의 경우, 1분자의 IgG 항체가 3분자 이상의 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 예를 들면, 중화활성을 갖는 1분자의 IgG 항체의 경우, 3분자 이상의 항원을 중화하는 것은 불가능하다.
IgG 분자의 혈장 중 체류성이 비교적 긴(소실이 느린) 것은, IgG 분자의 샐비지 수용체로서 알려져 있는 FcRn이 기능하고 있기 때문이다. 피노사이토시스(pinocytosis)에 의해 엔도솜에 삽입된 IgG 분자는, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 FcRn에 결합한다. FcRn에 결합할 수 없었던 IgG 분자는 리소좀으로 진행되어 거기서 분해되나, FcRn으로 결합한 IgG 분자는 세포 표면으로 이행되고 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 FcRn으로부터 해리됨으로써 재차 혈장 중으로 돌아간다.
또한, 항체가 가용형 항원에 결합하는 항체인 경우, 생체내에 투여한 항체는 항원에 결합하고, 그 후, 항체는 항원에 결합한 채로 세포내에 포함된다. 세포내에 삽입된 항체의 대부분은 FcRn에 의해 세포외로 방출되나, 항원에 결합한 채로 세포외로 방출되기 때문에, 재차, 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 따라서, 막 항원에 결합하는 항체와 마찬가지로, 통상의 항체의 경우, 1분자의 IgG 항체가 3분자 이상의 항원에 결합하는 것은 불가능하다.
본 발명자들은, 인터날리제이션에 의해 막 항원 등의 항원에 결합한 항체가 세포내의 엔도솜에 삽입되었을 때에, 항원에 결합한 채로의 항체는 리소좀으로 이행하여 분해되는 것에 반하여, 엔도솜 내에 있어서 항원이 해리된 IgG 항체는 엔도솜 내에 발현하고 있는 FcRn에 결합하는 것이 가능하다고 생각하였다. 즉, 혈장 중에서는 항원에 강하게 결합하고, 엔도솜 내에서는 항원에 약하게 결합하는 항체는, 혈장 중에서 항원에 결합하여 항원과의 복합체를 형성한 채로 인터날리제이션에 의해 세포내의 엔도솜 내에 삽입되고, 엔도솜 내에서 항원과 해리된 후에, FcRn에 결합하여 세포 표면으로 이행하고, 항원에 결합하고 있지 않은 상태에서 재차 혈장 중으로 돌아가, 복수 개의 막형 항원을 중화할 수 있는 것을 발견하였다. 또한, 혈장 중에서는 항원에 강하게 결합하고, 엔도솜 내에서는 항원에 약하게 결합하는 성질을 갖는 항체는, 가용형 항원 등의 항원에 결합한 경우에도, 엔도솜 내에서 항원과 해리되는 것으로부터, 항원에 결합하고 있지 않은 상태에서 재차 혈장 중으로 방출되어, 복수 개의 가용형 항원을 중화할 수 있는 것을 발견하였다.
특히, 본 발명자들은 혈장 중의 pH와 엔도솜 내의 pH가 상이한 것에 착안하여, 혈장 중의 pH 조건에서는 항원에 강하게 결합하고, 엔도솜 내의 pH 조건에서는 항원에 약하게 결합하는 항체는 1항체 분자가 복수의 항원에 결합할 수 있어, 혈장 중 체류성이 우수한 것을 발견하였다.
엔도솜은 막소포의 하나로, 진핵세포로부터 세포질 내에 네트워크를 형성하여 세포막으로부터 리소좀에 이르는 과정에서 고분자의 대사를 담당한다. 엔도솜 내의 pH는 일반적으로 pH 5.5~pH 6.0의 산성인 것이 보고되어 있고(Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32.), 또한, 혈장 중의 pH는 거의 중성(통상, pH 7.4)인 것이 알려져 있다.
따라서, 산성 pH에 있어서의 항원 결합활성이 중성 pH에 있어서의 항원 결합활성보다도 약한 항원 결합 분자는, 중성 pH의 혈장 중에 있어서 항원에 결합하고, 세포내에 삽입된 후에, 산성 pH의 엔도솜 내에서 항원과 해리된다. 항원과 해리된 항원 결합 분자는 FcRn에 결합하여 세포 표면으로 이행하고, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 재차 혈장 중으로 돌아가, 결과적으로 항원과 복수회 결합할 수 있어, 약물동태가 향상된다.
<항원 결합 분자물질>
또한, 본 발명은 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성이 pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자, 바람직하게는 pH 5.0~pH 6.0에서의 항원 결합활성이 pH 7.0~8.0에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자를 제공한다. pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성이 pH 6.7~10.0에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 구체적인 예로서는, pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자를 들 수 있다. 또한, pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자는, pH 7.4에서의 항원 결합활성이 pH 5.8에서의 항원 결합활성보다도 높은 항원 결합 분자라 하는 것도 가능하다.
본 발명의 pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자는, pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 결합보다 낮은 한, 그 결합활성의 차는 한정되지 않고, 약간이라도 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성이 낮으면 된다.
본 발명의 pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 태양으로서, pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성이 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성의 2배 이상인 항원 결합 분자를 들 수 있고, 더욱 바람직한 태양으로서는 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성이 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성의 10배 이상인 항원 결합 분자를 들 수 있으며, 보다 바람직한 태양으로서는 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성이 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성의 40배 이상인 항원 결합 분자를 들 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 태양으로서, 항원에 대한 pH 5.8에서의 KD와 pH 7.4에 있어서의 KD의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 40 이상이다. KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1000, 10000 등, 어떠한 값이어도 된다.
또한 본 발명의 pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 다른 태양으로서, 항원에 대한 pH 5.8에서의 kd와 pH 7.4에서의 kd의 비인 kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)의 값이 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)의 값이 10 이상이고, 더욱 바람직하게는 kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)의 값이 30 이상이다. kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한, 50, 100, 200 등, 어떠한 값이어도 된다.
항원의 결합활성을 측정할 때의 pH 이외의 조건은 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 MES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 또한, 항원 결합 분자의 항원 결합활성의 측정은 당업자에게 공지의 방법에 의해 행하는 것이 가능하고, 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 Biacore T100(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다.
이러한 산성 pH에 있어서 항원에 약하게 결합하는 항원 결합 분자는, 엔도솜 내의 산송 조건하에 있어서 항원으로부터 용이하게 해리된다고 생각되어, 세포내에 인터날라이즈된 후에 FcRn과 결합하여 세포외로 방출되기 쉽다고 생각된다. 세포내에서 분해되지 않고, 세포외로 방출된 항원 결합 분자는 재차, 항원에 결합하는 것이 가능하다. 따라서, 예를 들면 항원 결합 분자가 중화 항원 결합 분자인 경우에는, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원으로부터 해리되기 쉬운 항원 결합 분자는, 복수회, 항원에 결합하고, 항원을 중화하는 것이 가능하다. 결과적으로, pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성이 pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자는 혈장 중 체류성에 있어서 우수한 항원 결합 분자가 된다.
pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 태양으로서, 항원 결합 분자 중의 아미노산의 하나 이상이 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환되어 있거나 또는 하나 이상의 히스티딘 또는 비천연 아미노산이 삽입되어 있는 항원 결합 분자를 들 수 있다. 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이가 도입되는 위치는 특별히 한정되지 않고, 치환 전과 비교하여 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성이 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약해지는(KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 커지거나, 또는 kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)의 값이 커지는) 한, 어떠한 부위여도 된다. 예를 들면, 항원 결합 분자가 항체인 경우에는, 항체의 가변영역이나 CDR 등을 들 수 있다. 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환되는 아미노산의 수, 또는 삽입되는 아미노산의 수는 당업자가 적절히 결정할 수 있고, 하나의 아미노산을 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환해도 되고, 하나의 아미노산을 삽입해도 되며, 둘 이상의 복수의 아미노산을 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환해도 되고, 둘 이상의 아미노산을 삽입해도 된다. 또한, 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로의 치환 또는 히스티딘 또는 비천연 아미노산의 삽입 이외에, 다른 아미노산의 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환 등을 동시에 행해도 된다. 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로의 치환 또는 히스티딘 또는 비천연 아미노산의 삽입은, 당업자의 공지의 알라닌 scanning의 알라닌을 히스티딘으로 치환한 히스티딘 scanning 등의 방법에 의해 랜덤으로 행해도 되고, 히스티딘 또는 비천연 아미노산이 랜덤으로 도입된 항원 결합 분자 중에서, 변이 전과 비교하여 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) 또는 kd(pH 5.8)/kd(pH 7.4)의 값이 커진 항원 결합 분자를 선택해도 된다.
이와 같이 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로의 변이가 행해지고, 또한 pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 예로서, 예를 들면, 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로의 변이 후의 pH 7.4에서의 항원 결합활성이 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로의 변이 전의 pH 7.4에서의 항원 결합활성과 동등한 항원 결합 분자를 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이 후의 항원 결합 분자가, 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이 전의 항원 결합 분자와 동등한 항원 결합활성을 갖는다는 것은, 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이 전의 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 100%로 한 경우에, 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이 후의 항원 결합 분자의 항원 결합활성이 적어도 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것을 말한다. 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이 후의 pH 7.4에서의 항원 결합활성이 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이 전의 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다 높아져도 된다. 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로의 치환 또는 삽입에 의해 항원 결합 분자의 항원 결합활성이 낮아진 경우에는, 항원 결합 분자 중의 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해 항원 결합활성을 히스티딘 치환 또는 삽입 전의 항원 결합활성과 동등하게 해도 된다. 본 발명에 있어서는, 그러한 히스티딘 치환 또는 삽입 후에 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 행함으로써 결합활성이 동등해진 항원 결합 분자도 포함된다.
또한, 항원 결합 분자가 항체 정상영역을 포함하는 물질인 경우, pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 다른 태양으로서, 항원 결합 분자에 포함되는 항체 정상영역이 개변된 방법을 들 수 있다. 개변 후의 항체 정상영역의 구체예로서는, 예를 들면 실시예에 기재된 정상영역을 들 수 있다.
전술한 방법 등에 의해 항원 결합 물질의 pH 5.8에 있어서의 항원 결합활성을 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성보다 약하게 하는(KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값을 크게 하는) 경우, 특별히 한정되지 않으나, KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 원래의 항체와 비교하여 통상, 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상, 더욱 바람직하게는 10배 이상이 되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 항원 결합 분자는 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성이 pH 6.7~10.0에서의 항원 결합활성보다도 낮은 한, 그 밖에 어떠한 성질을 가지고 있어도 되고, 예를 들면 아고니스트 항원 결합 분자나 안타고니스트 항원 결합 분자 등이어도 된다. 본 발명의 바람직한 항원 결합 분자의 예로서 안타고니스트 항원 결합 분자를 들 수 있다. 안타고니스트 항원 결합 분자는 통상, 리간드(아고니스트)와 수용체의 결합을 저해하여, 수용체를 매개로 한 세포내로의 시그날 전달을 저해하는 항원 결합 분자이다.
또한, 본 발명은 이하의 하나 이상의 개소의 아미노산이 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환된 항체를 제공한다. 또한, 아미노산 위치는 Kabat 넘버링(Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)으로 나타내고 있다.
중쇄: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b, H102
경쇄: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, L90, L92, L94
이들의 개변 개소 중, H32, H61, L53, L90, L94는 보편성이 높은 개변 개소로 생각된다.
또한, 특별히 한정되지 않으나, 항원이 IL-6 수용체(예를 들면, 인간 IL-6 수용체)인 경우의 바람직한 개변 개소로서 이하의 개소를 들 수 있다.
중쇄: H27, H31, H32, H35, H50, H58, H61, H62, H63, H64, H65, H100b, H102
경쇄: L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92, L94
복수의 개소를 조합하여 히스티딘 또는 비천연 아미노산으로 치환하는 경우의 바람직한 조합의 구체예로서는, 예를 들면, H27, H31, H35의 조합, H27, H31, H32, H35, H58, H62, H102의 조합, L32, L53의 조합, L28, L32, L53의 조합 등을 들 수 있다. 또한, 중쇄와 경쇄의 치환 개소의 바람직한 조합의 예로서는, H27, H31, L32, L53의 조합을 들 수 있다.
또한, 특별히 한정되지 않으나, 항원이 IL-6(예를 들면, 인간 IL-6)인 경우의 바람직한 개변 개소로서 이하의 개소를 들 수 있다.
중쇄: H32, H59, H61, H99
경쇄: L53, L54, L90, L94
또한, 특별히 한정되지 않으나, 항원이 IL-31 수용체(예를 들면, 인간 IL-31 수용체)인 경우의 바람직한 개변 개소로서 H33을 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자가 인식하는 항원은 어떠한 항원이어도 된다. 본 발명의 항체가 인식하는 항원의 구체적인 예로서는 전술한 수용체 단백질(막 결합형 수용체, 가용형 수용체), 세포 표면 마커 등의 막 항원이나 사이토카인 등의 가용형 항원, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-31, IL-23, IL-2 수용체, IL-6 수용체, OSM 수용체, gp130, IL-5 수용체, CD40, CD4, Fas, 오스테오폰틴, CRTH2, CD26, PDGF-D, CD20, 단구 주화활성 인자, CD23, TNF-α, HMGB-1, α4 인테그린, ICAM-1, CCR2, CD11a, CD3, IFNγ, BLyS, HLA-DR, TGF-β, CD52, IL-31 수용체 등을 들 수 있다.
특히 바람직한 항원으로서는, IL-6 수용체를 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에 있어서 항원 결합 분자의 바람직한 태양으로서, 항체를 들 수 있다. 항원 결합활성과 FcRn 결합영역을 갖는 항체의 예로서, IgG 항체를 들 수 있다. 항체로서 IgG 항체를 사용하는 경우, 그 종류는 한정되지 않고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 항체의 유래는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 유래의 항체여도 되고, 예를 들면, 마우스 항체, 인간 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등을 사용할 수 있다. 또한, 예를 들면, 전술한 키메라 항체, 그 중에서도 인간화 항체 등의 아미노산 서열을 치환한 개변 항체여도 된다. 또한, 전술한 이중 특이성 항체, 각종 분자를 결합시킨 항체 수식물, 항체 단편을 포함하는 폴리펩티드, 당쇄 개변 항체 등이어도 된다.
키메라 항체의 제작은 공지이며, 예를 들면, 인간-마우스 키메라 항체의 경우, 항체 V영역을 코드하는 DNA와 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이를 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 키메라 항체를 얻을 수 있다.
「인간화 항체」란, 재구성(reshaped) 인간 항체로도 칭해지는, 인간 이외의 포유동물 유래의 항체, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR로 이식한 것이다. CDR을 동정하기 위한 방법은 공지이다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). 또한, 그의 일반적인 유전자 재조합수법도 공지이다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조). 인간화 항체는 공지의 방법에 의해, 예를 들면, 마우스 항체의 CDR을 결정하고, 그 CDR과 인간 항체의 프레임워크영역(framework region; FR)이 연결된 항체를 코드하는 DNA를 취득하여, 인간화 항체를 통상의 발현 벡터를 사용한 계(system)에 의해 생산할 수 있다. 이러한 DNA는 CDR 및 FR 양쪽의 말단영에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 PCR법에 의해 합성할 수 있다(WO98/13388호 공보에 기재된 방법을 참조). CDR을 매개로 하여 연결되는 인간 항체의 FR은, CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하도록 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록, 항체의 가변영역에 있어서의 FR의 아미노산을 개변해도 된다(Sato et al., Cancer Res. (1993) 53: 10.01-6). 개변할 수 있는 FR 중의 아미노산 잔기에는, 항원에 직접, 비공유결합에 의해 결합하는 부분(Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), CDR 구조에 영향 또는 작용하는 부분(Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17) 및 VH-VL 상호작용에 관련된 부분(EP239400호 특허공보)이 포함된다.
본 발명에 있어서의 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 경우에는, 이들 항체의 C영역은, 바람직하게는 인간 항체 유래의 것이 사용된다. 예를 들면 H쇄에서는, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4 등을, L쇄에서는 Cκ, Cλ 등을 사용할 수 있다. 또한 Fcγ 수용체나 FcRn으로의 결합을 증대 또는 저감시키기 위해, 항체의 안정성 또는 항체의 생산을 개선하기 위해, 인간 항체 C영역을 필요에 따라 아미노산 변이를 도입해도 된다. 본 발명에 있어서의 키메라 항체는, 바람직하게는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간 항체 유래의 정상영역으로 된다. 한편, 인간화 항체는, 바람직하게는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 CDR과, 인간 항체 유래의 FR 및 C영역으로 된다. 인간 항체 유래의 정상영역은, FcRn 결합영역을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 그러한 항체의 예로서, IgG(IgG1, IgG2, IGg3, IgG4)를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 인간화 항체에 사용되는 정상영역은, 어느 아이소타입에 속하는 항체의 정상영역이어도 된다. 바람직하게는, 인간 IgG의 정상영역이 사용되나, 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간화 항체에 이용되는 인간 항체 유래의 FR도 특별히 한정되지 않고, 어느 아이소타입에 속하는 항체의 것이어도 된다.
본 발명에 있어서의 키메라 항체 및 인간화 항체의 가변영역 및 정상영역은, 원래의 항체의 결합 특이성을 나타내는 한, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 등에 의해 개변되어 있어도 된다.
인간 유래의 서열을 이용한 키메라 항체 및 인간화 항체는, 인간 체내에 있어서의 면역원성이 저하되어 있기 때문에, 치료 목적 등으로 인간에 투여하는 경우에 유용하다고 생각된다.
본 발명의 항체는 어떠한 방법에 의해 얻어져도 되고, 예를 들면, 본래는 pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다 높은 항체 또는 항원 결합활성이 동일 정도인 항체를, 전술한 히스티딘으로의 치환 등에 의해, 인위적으로 pH 5.8에서의 항원 결합활성을 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다 낮게 해도 되고, 또한, 이하에 나타내는 항체 라이브러리나 하이브리도마로부터 얻어지는 복수의 항체 중에서 pH 5.8에서의 항원 결합활성이 pH 7.4에서의 항원 결합활성보다 낮은 항체를 스크리닝함으로써 선택해도 된다.
항체 중의 아미노산을 히스티딘으로 치환하는 경우, 히스티딘 변이 도입 전의 항체의 H쇄 또는 L쇄의 아미노산 서열은 기지의 서열을 사용하는 것도 가능하고, 또한, 당업자에게 공지의 방법으로 새롭게 취득한 항체의 아미노산 서열을 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면, 항체는 항체 라이브러리로부터 취득하는 것도 가능하고, 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항체를 코드하는 유전자를 클로닝하여 취득하는 것도 가능하다.
항체 라이브러리에 대해서는 이미 많은 항체 라이브러리가 공지가 되어 있고, 또한, 항체 라이브러리의 제작방법도 공지이기 때문에, 당업자는 적절히 항체 라이브러리를 입수하는 것이 가능하다. 예를 들면, 항체 파지 라이브러리에 대해서는, Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8, Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97, Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6, Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 324.0-60, Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14, 및 일본국 특허공표 평20-504970호 공보 등의 문헌을 참조할 수 있다. 기타, 진핵세포를 라이브러리로 하는 방법(WO95/15393호 팸플릿)이나 리보솜 제시법 등의 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 인간 항체 라이브러리를 사용하여, 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변영역을 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시켜, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 명확해지면, 당해 서열을 토대로 적당한 발현 벡터를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 주지로, WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388을 참고로 할 수 있다.
하이브리도마로부터 항체를 코드하는 유전자를 취득하는 방법은, 기본적으로는 공지 기술을 사용하여, 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포를 감작항원으로서 사용하여, 이를 통상의 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해, 단일클론 항체 생산 세포(하이브리도마)를 스크리닝하여, 얻어진 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 합성하고, 이를 목적하는 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결함으로써 얻을 수 있다.
보다 구체적으로는, 특히 이하의 예시에 한정되지 않으나, 상기의 H쇄 및 L쇄를 코드하는 항체 유전자를 얻기 위한 감작항원은, 면역원성을 갖는 완전 항원과, 면역원성을 나타내지 않는 합텐 등을 포함하는 불완전 항원의 양쪽을 포함한다. 예를 들면, 목적 단백질의 전장 단백질, 또는 부분 펩티드 등을 사용할 수 있다. 기타, 다당류, 핵산, 지질 등으로 구성되는 물질이 항원으로 될 수 있는 것이 알려져 있어, 본 발명의 항체의 항원은 특별히 한정되는 것은 아니다. 항원의 조제는, 당업자에게 공지의 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면, 베큘로바이러스를 사용한 방법(예를 들면, WO98/46777 등) 등에 준하여 행할 수 있다. 하이브리도마의 제작은, 예를 들면, 밀스테인 등의 방법(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대분자와 결합시켜, 면역을 행하면 된다. 또한, 필요에 따라 항원을 다른 분자와 결합시킴으로써 가용성 항원으로 하는 것도 가능하다. 막 항원(예를 들면, 수용체 등)과 같은 막관통 분자를 항원으로서 사용하는 경우, 막 항원의 세포외영역 부분을 단편으로서 사용하거나, 막관통 분자를 세포 표면 상에 발현하는 세포를 면역원으로서 사용하는 것도 가능하다.
항체 생산 세포는, 전술한 적당한 감작항원을 사용하여 동물을 면역화함으로써 얻을 수 있다. 또는, 항체를 생산할 수 있는 림프구를 인 비트로에서 면역화하여 항체 생산 세포로 하는 것도 가능하다. 면역화하는 동물로서는, 각종 포유동물을 사용할 수 있으나, 설치목, 토끼목, 영장목의 동물이 일반적으로 사용된다. 마우스, 랫트, 햄스터 등의 설치목, 토끼 등의 토끼목, 게잡이원숭이, 붉은털원숭이, 망토비비, 침팬지 등의 원숭이 등의 영장목의 동물을 예시할 수 있다. 기타, 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물도 알려져 있어, 이러한 동물을 사용함으로써 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56 참조). 이러한 형질전환 동물의 사용 대신에, 예를 들면, 인간 림프구를 인 비트로에서 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포에서 감작하여, 감작 림프구를 인간 골수종 세포, 예를 들면 U266과 융합시킴으로써, 항원으로의 결합활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878호 공보 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물을 목적하는 항원으로 면역함으로써 목적하는 인간 항체를 취득할 수 있다(WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO96/34096, WO96/33735 참조).
동물의 면역화는, 예를 들면, 감작항원을 Phosphate-Buffered Saline(PBS) 또는 생리식염수 등으로 적절히 희석, 현탁하고, 필요에 따라 애쥬번트를 혼합하여 유화한 후, 동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 그 후, 바람직하게는, 프로인트 불완전 애쥬번트에 혼합한 감작항원을 4~21일 마다 수회 투여한다. 항체 생산의 확인은, 동물의 혈청 중의 목적으로 하는 항체 역가를 관용의 방법에 의해 측정함으로써 행해질 수 있다.
하이브리도마는, 목적하는 항원으로 면역화한 동물 또는 림프구로부터 얻어진 항체 생산 세포를, 관용의 융합제(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜)를 사용하여 골수종 세포와 융합하여 제작할 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103). 필요에 따라 하이브리도마 세포를 배양·증식하고, 면역침강, 방사면역분석(RIA), 효소결합면역흡착분석(ELISA) 등의 공지의 분석법에 의해 그 하이브리도마로부터 생산되는 항체의 결합 특이성을 측정한다. 그 후, 필요에 따라, 목적으로 하는 특이성, 친화성 또는 활성이 측정된 항체를 생산하는 하이브리도마를 한계희석법 등의 수법에 의해 서브클로닝하는 것도 가능하다.
계속해서, 선택된 항체를 코드하는 유전자를 하이브리도마 또는 항체 생산 세포(감작 림프구 등)로부터, 항체에 특이적으로 결합 가능한 프로브(예를 들면, 항체 정상영역을 코드하는 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 등)를 사용하여 클로닝할 수 있다. 또한, mRNA로부터 RT-PCR에 의해 클로닝하는 것도 가능하다. 면역 글로불린은, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 상이한 클래스로 분류된다. 또한, 이들 클래스는 몇개의 서브클래스(아이소타입)(예를 들면 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 및 IgG-4;IgA-1 및 IgA-2 등)로 나뉜다. 본 발명에 있어서 항체의 제조에 사용하는 H쇄 및 L쇄는, 이들 중 어느 클래스 및 서브클래스에 속하는 항체에 유래하는 것이어도 되고, 특별히 한정되지 않으나, IgG는 특히 바람직한 것이다.
여기서, H쇄 및 L쇄를 코드하는 유전자를 유전자 공학적 수법에 의해 개변하는 것도 가능하다. 예를 들면, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 햄스터 항체, 양 항체, 낙타 항체 등의 항체에 대해서, 인간에 대한 이종 면역원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여, 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면, 키메라 항체, 인간화 항체 등을 적절히 제작할 수 있다. 키메라 항체는, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면, 마우스 항체의 H쇄, L쇄의 가변영역과 인간 항체의 H쇄, L쇄의 정상영역으로 되는 항체로, 마우스 항체의 가변영역을 코드하는 DNA를 인간 항체의 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하여, 이를 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다. 인간화 항체는, 재구성(reshaped) 인간 항체로도 칭해지고, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 수 개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 정상영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 삽입하여, 이를 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(EP239400; WO96/02576호 참조). CDR을 매개로 연결되는 인간 항체의 FR은, 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체의 가변영역의 프레임워크영역의 아미노산을 치환해도 된다(K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 10.01-10.06).
전술한 인간화 이외에, 예를 들면, 항원과의 결합성 등의 항체의 생물학적 특성을 개선하기 위해 개변을 행하는 것도 생각된다. 본 발명에 있어서의 개변은, 부위 특이적 돌연변이(예를 들면, Kunkel (1910.0) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 참조), PCR 변이, 카세트 변이 등의 방법에 의해 행할 수 있다. 일반적으로, 생물학적 특성이 개선된 항체 변이체는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면, 95% 이상, 97%, 98%, 99% 등)의 아미노산 서열 상동성 및/또는 유사성을, 기초가 된 항체의 가변영역의 아미노산 서열에 대해 갖는다. 본 명세서에 있어서, 서열의 상동성 및/또는 유사성은, 서열 상동성이 최대의 값을 취하도록 필요에 따라 서열을 정렬화, 및 갭 도입(gap introduction)한 후, 기초가 된 항체 잔기와 상동(동일한 잔기) 또는 유사(일반적인 아미노산의 측쇄의 특성에 기초하여 동일한 그룹으로 분류되는 아미노산 잔기)한 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 통상, 천연의 아미노산 잔기는, 그 측쇄의 성질을 토대로 하여,
(1) 소수성: 알라닌, 이소류신, 발린, 메티오닌 및 류신;
(2) 중성 친수성: 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 트레오닌 및 세린;
(3) 산성: 아스파라긴산 및 글루타민산;
(4) 염기성: 아르기닌, 히스티딘 및 리신;
(5) 사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기: 글리신 및 프롤린; 및
(6) 방향족성: 티로신, 트립토판 및 페닐알라닌
의 그룹으로 분류된다.
통상, H쇄 및 L쇄의 가변영역 중에 존재하는 전부 6개의 상보성 결정영역(초가변부; CDR)이 상호작용하여, 항체의 항원 결합 부위를 형성하고 있다. 이 중 하나의 가변영역이더라도 전체 결합 부위를 포함하는 것보다는 낮은 친화성으로 되지만, 항원을 인식하고, 결합하는 능력이 있는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 H쇄 및 L쇄를 코드하는 항체 유전자는, 그 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드가 목적하는 항원과의 결합성을 유지하고 있으면 되고, H쇄 및 L쇄의 각각의 항원 결합 부위를 포함하는 단편부분을 코드하고 있으면 된다.
중쇄 가변영역은, 전술한 바와 같이, 통상 3개의 CDR영역과 4개의 FR영역에 의해 구성되어 있다. 본 발명의 바람직한 태양에 있어서 「개변」에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면, CDR영역 또는 FR영역에 위치하는 아미노산 잔기 중에서 적절히 선택할 수 있다. 일반적으로 CDR영역의 아미노산 잔기의 개변은, 항원에 대한 결합능을 저하시키는 경우가 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 「개변」에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 특별히 한정되는 것은 아니나, FR영역에 위치하는 아미노산 잔기 중에서 적절히 선택하는 것이 바람직하다. CDR이더라도 개변에 의해 결합능이 저하되지 않는 것이 확인된 경우는, 그 개소를 선택하는 것이 가능하다. 또한, 인간 또는 마우스 등의 생물에 있어서, 항체의 가변영역의 FR로서 이용 가능한 서열을, 당업자라면 공공의 데이터 베이스 등을 이용하여 적절히 취득할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 코드하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 항체를 코드하는 유전자는 어떠한 유전자여도 되고, DNA, RNA, 기타 핵산 유사체 등이어도 된다.
또한 본 발명은, 상기 유전자를 갖는 숙주세포를 제공한다. 그 숙주세포는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 대장균이나 각종 동물세포 등을 들 수 있다. 숙주세포는, 예를 들면, 본 발명의 항체의 제조나 발현을 위한 생산계로서 사용할 수 있다. 폴리펩티드 제조를 위한 생산계로는, 인 비트로 및 인 비보의 생산계가 있다. 인 비트로의 생산계로서는, 진핵세포를 사용하는 생산계 및 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.
숙주세포로서 사용할 수 있는 진핵세포로서, 예를 들면, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 들 수 있다. 동물세포로서는, 포유류세포, 예를 들면, CHO(J. Exp. Med. (1995) 108: 94.0), COS, HEK293, 3T3, 미엘로마, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero 등, 양서류 세포, 예를 들면 아프리카발톱개구리 난모세포(Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340), 및 곤충세포, 예를 들면, Sf9, Sf21, Tn5가 예시된다. 본 발명의 항체의 발현에 있어서는, CHO-DG44, CHO-DX11B, COS7 세포, HEK293 세포, BHK 세포가 매우 적합하게 사용된다. 동물세포에 있어서, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면, 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 양이온성 리포솜 DOTAP(Boehringer Mannheim제)를 사용한 방법, 전기천공법(electroporation method), 리포펙션 등의 방법으로 행하는 것이 가능하다.
식물세포로서는, 예를 들면, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포 및 부평초(Lemna minor)가 단백질 생산계로서 알려져 있어, 이 세포를 캘러스 배양하는 방법에 의해 본 발명의 항체를 생산시킬 수 있다. 진균세포로서는, 효모, 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces)속의 세포(사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe) 등), 및 사상균, 예를 들면 아스페르길루스(Aspergillus)속의 세포(아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 등)를 사용한 단백질 발현계가 공지로, 본 발명의 항체 생산의 숙주로서 이용할 수 있다.
원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는, 전술한 대장균(E. coli)에 더하여, 고초균을 사용한 생산계가 알려져 있어, 본 발명의 항체 생산에 이용할 수 있다.
<스크리닝방법>
본 발명은 항원 결합 분자의 산성 pH에 있어서의 항원 결합활성이 중성 pH에 있어서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 1분자로 복수의 항원에 결합하는 것이 가능한 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 혈장 중 체류성이 우수한 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 해리하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입되고, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출되는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 혈장 중 항원 소실능이 증가한 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 의약조성물로서 사용할 때 특히 유용한 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
구체적으로는, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 얻는 공정,
(b) pH 4.0~pH 6.5에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 얻는 공정,
(c) pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
본 발명의 스크리닝방법에 있어서, pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성은 pH 6.7~pH 10.0 사이의 항원 결합활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 항원 결합활성으로서, pH 7.0~pH 8.0 사이의 항원 결합활성을 들 수 있고, 보다 바람직한 항원 결합활성으로서 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성을 들 수 있다. 또한, pH 4.0~pH 6.5에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성은 pH 4.0~pH 6.5 사이의 항원 결합활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 항원 결합활성으로서 pH 5.5~pH 6.5 사이의 항원 결합활성을 들 수 있고, 보다 바람직한 항원 결합활성으로서 pH 5.8 또는 pH 5.5에 있어서의 항원 결합활성을 들 수 있다.
항원 결합 분자의 항원 결합활성은 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, pH 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적절히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자의 항원 결합활성은, KD(Dissociation constant: 해리상수), 외관의 KD(Apparent dissociation constant: 외관의 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate: 해리속도), 또는 외관의 kd(Apparent dissociation: 외관의 해리속도) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면, Biacore(GE healthcare), 스켓차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정은, pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성이 pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.
pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성보다 높은 한, pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성과 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성의 차는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는 공정,
(b) (a)의 항원에 결합한 항원 결합 분자를 pH 4.0~pH 6.5의 조건하에 두는 공정,
(c) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(b) (a)에서 선택된 항원 결합 분자를 pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(c) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는 공정,
(b) (a)의 항원에 결합한 항원 결합 분자를 pH 4.0~pH 6.5의 조건하에 두는 공정,
(c) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) 해리된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정,
(e) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한, (a)~(d)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가적으로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(b) (a)에서 선택된 항원 결합 분자를 pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(c) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) 해리된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정,
(e) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한, (a)~(d)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가적으로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.
본 발명의 스크리닝방법에 있어서, 파지 라이브러리 등이 사용되는 경우에는, 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정은, 파지를 증폭하는 공정으로 하는 것도 가능하다.
본 발명의 방법에 있어서 항원과 항원 결합 분자의 결합은 어떠한 상태에서 행해져도 되고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 고정화된 항원 결합 분자에 항원을 접촉시킴으로써 항원 결합 분자와 항원을 결합시켜도 되고, 고정화된 항원에 항원 결합 분자를 접촉시킴으로써 항원 결합 분자와 항원을 결합시켜도 된다. 또한, 용액 중에서 항원 결합 분자와 항원을 접촉시킴으로써 항원 결합 분자와 항원을 결합시켜도 된다.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제1 pH에서의 결합활성이 제2 pH에서의 결합활성보다도 높은 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 제1 pH 조건하에서 항원 결합 분자를 결합시키는 공정,
(b) 제1 pH 조건하에서 칼럼에 결합한 항원 결합 분자를, 제2 pH 조건하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제1 pH 에서의 결합활성이 제2 pH에서의 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 제1 pH 조건하에서 항원 결합 분자를 통과시키는 공정,
(b) (a)의 공정에서 칼럼에 결합하지 않고 용출된 항원 결합 분자를 회수하는 공정,
(c) (b)에서 회수된 항원 결합 분자를 제2 pH 조건하에서 칼럼에 결합시키는 공정,
(d) (c)의 공정에 있어서 칼럼에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 제1 pH에서의 결합활성이 제2 pH에서의 결합활성보다도 높은 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) 항원 결합 분자 라이브러리를, 항원을 고정한 칼럼에 제1 pH 조건하에서 결합시키는 공정,
(b) 칼럼으로부터 제2 pH 조건하에서 항원 결합 분자를 용출하는 공정,
(c) 용출된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정,
(d) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정.
또한, (a)~(c)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(c)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가적으로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(c)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.
본 발명에 있어서, 제1 pH와 제2 pH는 각각이 동일 pH가 아닌 한, 어떠한 pH여도 된다. 바람직한 제1 pH와 제2 pH의 조합의 예로서, 제1 pH가 pH 6.7~10.0 사이의 pH이고, 제2 pH가 pH 4.0~pH 6.5 사이의 pH인 조합을 들 수 있고, 보다 바람직한 조합의 예로서는, 제1 pH가 pH 7.0~pH 8.0 사이의 pH이고, 제2 pH가 pH 5.5~pH 6.5 사이의 pH인 조합을 들 수 있으며, 더욱 바람직한 조합의 예로서는, 제1 pH가 pH 7.4이고, 제2 pH가 pH 5.8 또는 pH 5.5인 조합을 들 수 있다.
다른 바람직한 제1 pH와 제2 pH의 조합의 예로서, 제1 pH가 pH 4.0~6.5 사이의 pH이고, 제2 pH가 pH 6.7~pH 10.0 사이의 pH인 조합을 들 수 있고, 보다 바람직한 조합의 예로서는, 제1 pH가 pH 5.5~pH 6.5 사이의 pH이고, 제2 pH가 pH 7.0~pH 8.0 사이의 pH인 조합을 들 수 있으며, 더욱 바람직한 조합의 예로서는, 제1 pH가 pH 5.8 또는 pH 5.5이고, 제2 pH가 pH 7.4인 조합을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 스크리닝되는 항원 결합 분자는 어떠한 항원 결합 분자여도 되고, 예를 들면 전술한 항원 결합 분자를 본 발명의 스크리닝에 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 천연의 서열을 갖는 항원 결합 분자를 스크리닝해도 되고, 아미노산 서열이 치환된 항원 결합 분자를 스크리닝해도 된다. 본 발명에 있어서 스크리닝되는 항원 결합 분자의 바람직한 예로서, 예를 들면, 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되었거나 또는 하나 이상의 히스티딘이 삽입된 항원 결합 분자를 들 수 있다. 히스티딘 치환 또는 삽입이 도입되는 개소는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개소에 도입되어 있어도 된다. 또한, 히스티딘 치환 또는 삽입은 1 개소에 도입되어도 되고, 2 개소 이상의 복수의 개소에 도입되어도 된다. 또한, 본 발명에 있어서 스크린이되는 항원 결합 분자의 바람직한 예로서, 예를 들면, 개변된 항체 정상영역을 포함하는 항원 결합 분자를 들 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 스크리닝되는 항원 결합 분자는, 예를 들면, 히스티딘 스캔 등의 방법에 의해, 상이한 개소에 히스티딘 치환 또는 삽입이 도입된 복수의 상이한 항원 결합 분자여도 된다.
따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환하거나 또는 하나 이상의 히스티딘을 삽입하는 공정을 추가적으로 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 스크리닝방법은 히스티딘 대신에 비천연 아미노산을 사용해도 된다. 따라서, 전술한 히스티딘을 비천연 아미노산과 치환하여 본 발명을 이해하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 스크리닝방법은, 항체 정상영역의 아미노산을 개변하는 공정을 추가적으로 포함해도 된다.
본 발명의 스크리닝방법으로 스크리닝되는 항원 결합 물질은 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면, 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물로의 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 히스티딘이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(히스티딘 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 스크리닝방법에 의해 복수회 항원에 결합하여 혈장 중 체류성이 우수한 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 혈장 중 체류성이 우수한 항원 결합 분자를 얻기 위한 스크리닝방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝방법에 의해, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 항원에 2회 이상 결합하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 항원에 2회 이상 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 얻기 위한 스크리닝방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝방법에 의해, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 항원 결합 분자의 항원 결합 부위의 수보다 많은 수의 항원에 결합하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 항원 결합 분자의 항원 결합 부위의 수보다도 많은 수의 항원에 결합하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 얻기 위한 스크리닝방법으로서 이용할 수 있다. 예를 들면, 항체가 중화 항체인 경우에는, 항원 결합 분자의 항원 결합 부위의 수보다도 많은 수의 항원을 중화하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 얻기 위한 스크리닝방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝방법에 의해, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 세포외에서 결합한 항원을 세포내에서 해리하는 것이 가능한 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 세포외에서 결합한 항원을 세포내에서 해리하는 항원 결합 분자를 얻기 위한 스크리닝방법으로서 이용할 수 있다.
또한 본 발명의 스크리닝방법에 의해, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입되고, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출되는 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입되고, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출되는 항원 결합 분자를 얻기 위한 스크리닝방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝방법에 의해, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 항원을 혈장 중으로부터 빠르게 소실시킬 수 있는 항원 결합 분자를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 혈장 중 항원 소실능이 증가한(높은) 항원 결합 분자를 얻기 위한 스크리닝방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 이들 항원 결합 분자는, 환자로의 투여량이나 투여빈도를 줄이는 것이 가능하여, 결과적으로 총투여량을 줄이는 것이 가능해지기 때문에, 의약품으로서 특히 우수하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 스크리닝방법은, 의약조성물로서 사용하기 위한 항원 결합 분자의 스크리닝방법으로서 이용하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명은 원래의 라이브러리와 비교하여 히스티딘을 포함하는 비율을 상승시킨 라이브러리를 제공한다. 라이브러리 중에 포함되는 항원 결합 분자가 갖는 히스티딘의 비율이 높아져 있는 라이브러리는 전술한 스크리닝방법이나 후술하는 제조방법에 사용하는 것이 가능하다.
히스티딘을 포함하는 비율을 높인 라이브러리의 제작방법은, 당업자에게 공지의 방법을 사용함으로써 제작하는 것이 가능하고, 예를 들면 이하의 방법을 들 수 있다. 라이브러리 제작을 위한 핵산을 합성할 때, 트리뉴클레오티드법(J Mol Biol. 2008 Feb 29;376(4):1182-200.)에 의해, 20종류의 아미노산을 코드하는 20종류의 3염기 코돈(트리뉴클레오티드)을 동일한 확률로 함유시킴으로써, 라이브러리화한 부위에 20종류의 아미노산을 동일한 확률로 함유시키는 것이 가능하다. 이때 20종류 중 히스티딘을 코드하는 트리뉴클레오티드의 비율을 다른 아미노산보다도 높게 함으로써, 라이브러리화한 부위에 히스티딘이 출혈할 가능성을 높이는 것이 가능하다.
<항원 결합 분자 제조방법>
본 발명은 항원 결합 분자의 엔도솜 내에서의 pH에 있어서의 항원 결합활성이 혈장 중에서의 pH에 있어서의 항원 결합활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 혈장 중 체류성이 우수한 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 의약조성물로서 사용할 때 특히 유용한 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
구체적으로는, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
(a) pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 얻는 공정,
(b) pH 4.0~pH 6.5에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성을 얻는 공정,
(c) pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(d) (c)에서 선택된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
(a) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는 공정,
(b) (a)의 항원에 결합한 항원 결합 분자를 pH 4.0~pH 6.5의 조건하에 두는 공정,
(c) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) (c)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
(a) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(b) (a)에서 선택된 항원 결합 분자를 pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(c) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) (c)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
(a) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원 결합 분자를 항원에 결합시키는 공정,
(b) (a)의 항원에 결합한 항원 결합 분자를 pH 4.0~pH 6.5의 조건하에 두는 공정,
(c) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 해리된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) 해리된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정,
(e) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(f) (e)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(g) (f)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
또한, (a)~(d)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가적으로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.
또한 본 발명은 이하의 공정을 포함하는, 항원 결합 분자의 스크리닝방법을 제공한다.
(a) pH 4.0~pH 6.5의 조건하에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(b) (a)에서 선택된 항원 결합 분자를 pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(c) pH 6.7~pH 10.0의 조건하에서 항원에 결합한 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) 해리된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정,
(e) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(f) (e)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(g) (f)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
또한, (a)~(d)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가적으로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.
또한, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 제1 pH에서의 결합활성이 제2 pH에서의 결합활성보다도 높은 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 제1 pH 조건하에서 항원 결합 분자를 결합시키는 공정,
(b) 제1 pH 조건하에서 칼럼에 결합한 항원 결합 분자를, 제2 pH 조건하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(d) (c)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(e) (d)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
또한, 본 발명은 이하의 공정을 포함하는 제1 pH에서의 결합활성이 제2 pH에서의 결합활성보다도 높은 항원 결합 분자의 제조방법을 제공한다.
(a) 항원 결합 분자 라이브러리를, 항원을 고정한 칼럼에 제1 pH 조건하에서 결합시키는 공정,
(b) 칼럼으로부터 제2 pH 조건하에서 항원 결합 분자를 용출하는 공정,
(c) 용출된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정,
(d) 용출된 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(e) (d)에서 취득된 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 얻는 공정,
(f) (e)에서 얻어진 유전자를 사용하여 항원 결합 분자를 제조하는 공정.
또한, (a)~(c)의 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서, 본 발명은 전술한 방법에 있어서, (a)~(c)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가적으로 포함하는 방법을 제공한다. (a)~(c)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 파지 라이브러리 등이 사용되는 경우에는, 항원 결합 분자를 코드하는 유전자를 증폭하는 공정은, 파지를 증폭하는 공정으로 하는 것도 가능하다.
본 발명의 제조방법에서 사용되는 항원 결합 물질은 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면, 사전에 존재하고 있는 항체, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지 라이브러리 등), 동물로의 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 히스티딘이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(히스티딘 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 히스티딘 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.
전술한 제조방법에 있어서, pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성은 pH 6.7~pH 10.0 사이의 항원 결합활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 항원 결합활성으로서 pH 7.0~pH 8.0 사이의 항원 결합활성을 들 수 있고, 더욱 바람직한 항원 결합활성으로서 pH 7.4에 있어서의 항원 결합활성을 들 수 있다. 또한, pH 4.0~pH 6.5에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합활성은 pH 4.0~pH 6.5 사이의 항원 결합활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 항원 결합활성으로서 pH 5.5~pH 6.5 사이의 항원 결합활성을 들 수 있고, 더욱 바람직한 항원 결합활성으로서 pH 5.8 또는 pH 5.5에 있어서의 항원 결합활성을 들 수 있다.
항원 결합 분자의 항원 결합활성은 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, pH 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적절히 결정하는 것이 가능하다.
pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정은, pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성이 pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.
pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성보다 높은 한, pH 6.7~pH 10.0에서의 항원 결합활성과 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성의 차는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 pH 6.7~pH 10.0에 있어서의 항원 결합활성이 pH 4.0~pH 6.5에서의 항원 결합활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.
전술한 제조방법에 있어서 항원과 항원 결합 분자의 결합은 어떠한 상태에서 행해져도 되고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 고정화된 항원 결합 분자에 항원을 접촉시킴으로써 항원 결합 분자와 항원을 결합시켜도 되고, 고정화된 항원에 항원 결합 분자를 접촉시킴으로써 항원 결합 분자와 항원을 결합시켜도 된다. 또한, 용액 중에서 항원 결합 분자와 항원을 접촉시킴으로써 항원 결합 분자와 항원을 결합시켜도 된다.
전술한 제조방법에 있어서, 제1 pH와 제2 pH는 각각 동일한 pH가 아닌 한, 어떠한 pH여도 된다. 바람직한 제1 pH와 제2 pH의 조합의 예로서, 제1 pH가 pH 6.7~10.0 사이의 pH이고, 제2 pH가 pH 4.0~pH 6.5 사이의 pH인 조합을 들 수 있고, 보다 바람직한 조합의 예로서는, 제1 pH가 pH 7.0~pH 8.0 사이의 pH이고, 제2 pH가 pH 5.5~pH 6.5 사이의 pH인 조합을 들 수 있으며, 더욱 바람직한 조합의 예로서 제1 pH가 pH 7.4이고, 제2 pH가 pH 5.8 또는 pH 5.5인 조합을 들 수 있다.
다른 바람직한 제1 pH와 제2 pH의 조합의 예로서, 제1 pH가 pH 4.0~pH 6.5 사이의 pH이고, 제2 pH가 pH 6.7~pH 10.0 사이의 pH인 조합을 들 수 있고, 보다 바람직한 조합의 예로서는, 제1 pH가 pH 5.5~pH 6.5 사이의 pH이고, 제2 pH가 pH 7.0~pH 8.0 사이의 pH인 조합을 들 수 있으며, 더욱 바람직한 조합의 예로서 제1 pH가 pH 5.8 또는 pH 5.5이고, 제2 pH가 pH 7.4인 조합을 들 수 있다.
전술한 제조방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자는 어떠한 항원 결합 분자여도 되나, 예를 들면, 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산이 히스티딘으로 치환되었거나 또는 하나 이상의 히스티딘이 삽입된 항원 결합 분자를 바람직한 예로서 들 수 있다. 그러한 히스티딘 변이가 도입되는 개소는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개소에 도입되어 있어도 된다. 또한, 히스티딘 변이는 1 개소에 도입되어도 되고, 2 개소 이상의 복수의 개소에 도입되어도 된다.
따라서, 본 발명의 제조방법에 있어서는, 항원 결합 분자의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환 또는 삽입하는 공정을 추가적으로 포함해도 된다.
또한, 본 발명의 제조방법에 있어서 히스티딘 대신에 비천연 아미노산을 사용해도 된다. 따라서, 전술한 히스티딘을 비천연 아미노산과 치환하여 본 발명을 이해하는 것도 가능하다.
또한, 전술한 제조방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자의 다른 태양으로서, 예를 들면, 개변된 항체 정상영역을 포함하는 항원 결합 분자를 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 있어서는, 항체 정상영역 중의 아미노산을 개변하는 공정을 추가적으로 포함해도 된다.
본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자는 혈장 중 체류성이 우수한 항원 결합 분자이다. 따라서, 본 발명의 제조방법은, 혈장 중 체류성이 우수한 항원 결합 분자의 제조방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자는, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 항원에 2회 이상 결합하는 것이 가능하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 항원에 2회 이상 결합할 수 있는 항원 결합 분자의 제조방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자는, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 항원 결합 분자의 항원 결합 부위의 수보다 많은 수의 항원에 결합하는 것이 가능하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 제조방법은, 항원 결합 분자의 항원 결합 부위의 수보다도 많은 수의 항원에 결합하는 것이 가능한 항원 결합 분자의 제조방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자는, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 세포외에서 항원 결합 분자에 결합한 항원을 세포내에서 항원 결합 분자로부터 해리시키는 것이 가능하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 제조방법은, 세포외에서 결합한 항원을 세포내에서 해리하는 것이 가능한 항원 결합 분자의 제조방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자는, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입된 항원 결합 분자를, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출시키는 것이 가능하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 제조방법은, 항원과 결합한 상태에서 세포내에 삽입되고, 항원과 결합하고 있지 않은 상태에서 세포외로 방출되는 항원 결합 분자의 제조방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자는, 인간, 마우스, 원숭이 등의 동물에 투여했을 때, 항원을 혈장 중으로부터 빠르게 소실시킬 수 있다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 제조방법은, 혈장 중 항원 소실능이 증가한(높은) 항원 결합 분자의 제조방법으로서 이용할 수 있다.
또한, 이들 항원 결합 분자는, 환자로의 투여 횟수를 줄이는 것이 가능하여, 의약품으로서 특히 우수하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 제조방법은, 의약조성물로서 사용하기 위한 항원 결합 분자의 제조방법으로서 이용하는 것이 가능하다.
본 발명의 제조방법에 있어서 얻어진 유전자는, 통상, 적당한 벡터로 담지(삽입)되고, 숙주세포로 도입된다. 그 벡터로서는, 삽입한 핵산을 안정하게 보유·유지(保持)하는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 숙주에 대장균을 사용하는 것이라면, 클로닝용 벡터로서 pBluescript 벡터(Stratagene사제) 등이 바람직하나, 시판의 각종 벡터를 이용할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 시험관 내, 대장균 내, 배양세포 내, 생물개체 내에서 항원 결합 분자를 발현하는 벡터라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 시험관 내 발현이라면 pBEST 벡터(프로메가사제), 대장균이라면 pET 벡터(Invitrogen사제), 배양세포라면 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864), 생물개체라면 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)) 등이 바람직하다. 벡터로의 본 발명의 DNA의 삽입은, 통상의 방법에 의해, 예를 들면, 제한효소 사이트를 사용한 리가아제 반응에 의해 행할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11).
상기 숙주세포로서는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 각종 숙주세포가 사용된다. 항원 결합 분자를 발현시키기 위한 세포로서는, 예를 들면, 세균세포(예: 스트렙토코커스, 스타필로코커스, 대장균, 스트렙토마이세스, 고초균), 진균세포(예: 효모, 아스페르길루스), 곤충세포(예: 드로소필라 S2, 스포도프테라 SF9), 동물세포(예: CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes 골수종 세포) 및 식물세포를 예시할 수 있다. 숙주세포로의 벡터 도입은, 예를 들면, 인산칼슘 침전법, 전기펄스 천공법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), 리포펙션법, 마이크로인젝션법 등의 공지의 방법으로 행하는 것이 가능하다.
숙주세포의 배양은, 공지의 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 동물세포를 숙주로 한 경우, 배양액으로서, 예를 들면, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 그때, FBS, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용해도 되고, 무혈청 배양에 의해 세포를 배양해도 된다. 배양시의 pH는 약 6~8로 하는 것이 바람직하다. 배양은, 통상, 약 30~40℃에서 약 15~200시간 행하고, 필요에 따라 배지의 교환, 통기, 교반을 추가한다.
숙주세포에 있어서 발현한 항원 결합 분자를 소포체의 내강에, 세포 주변강에, 또는 세포외의 환경에 분비시키기 위해, 적당한 분비 시그날을 목적의 폴리펩티드에 삽입할 수 있다. 이들 시그날은 목적의 항원 결합 분자에 대해 내인성이어도 되고, 이종 시그날이어도 된다.
한편, 인 비보에서 폴리펩티드를 생산시키는 계(system)로서는, 예를 들면, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 이들 동물 또는 식물에 목적으로 하는 폴리뉴클레오티드를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 폴리펩티드를 생산시켜, 회수한다. 본 발명에 있어서의 「숙주」란, 이들 동물, 식물을 포함한다.
동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). 또한, 포유류동물을 사용하는 경우, 형질전환 동물을 사용할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리펩티드를, 염소 β 카제인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 폴리펩티드를 코드하는 유전자와의 융합 유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편을 염소의 배(胚)로 주입하고, 이 배를 암컷의 염소로 이식한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 형질전환 염소 또는 그 자손이 생산하는 유즙으로부터, 목적의 항원 결합 분자를 얻을 수 있다. 형질전환 염소로부터 생산되는 항원 결합 분자를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 호르몬을 형질전환 염소에 투여해도 된다(Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702).
또한, 본 발명의 항원 결합 분자를 생산시키는 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적의 항원 결합 분자를 코드하는 폴리펩티드를 삽입한 베큘로바이러스를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액으로부터 목적의 항원 결합 분자를 얻을 수 있다.
또한, 식물을 본 발명의 항원 결합 분자 생산에 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다. 담배를 사용하는 경우, 목적으로 하는 항원 결합 분자를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시키고, 본 담배의 잎으로부터 목적하는 항원 결합 분자를 얻을 수 있다(Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-8). 또한, 동일한 박테리아를 부평초(Lemna minor)에 감염시키고, 클론화한 후에 부평초의 세포로부터 목적하는 항원 결합 분자를 얻을 수 있다(Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1591-1597).
이와 같이 하여 얻어진 항원 결합 분자는, 숙주세포내 또는 세포외(배지, 유즙 등)로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 항원 결합 분자로서 정제할 수 있다. 항원 결합 분자의 분리, 정제는, 통상의 폴리펩티드의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 조금도 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하여 항원 결합 분자를 분리, 정제할 수 있다.
크로마토그래피로서는, 예를 들면 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). 이들 크로마토그래피는, 액상 크로마토그래피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 사용해서 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들면, 프로테인 A를 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia제) 등을 들 수 있다.
필요에 따라, 항원 결합 분자의 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백질 수식 효소를 작용시킴으로써, 임의로 수식을 가하거나, 부분적으로 펩티드를 제거하는 것도 가능하다. 단백질 수식 효소로서는, 예를 들면, 트립신, 키모트립신, 리실 엔도펩티다아제, 프로테인 키나아제, 글루코시다아제 등이 사용된다.
<항IL-6 수용체 항체>
또한, 본 발명은 이하의 (a)~(m) 중 어느 하나에 기재된 항IL-6 수용체 항체를 제공한다.
(a) 서열번호: 1(H53 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 27번째의 Tyr, 31번째의 Asp, 32번째의 Asp, 35번째의 Trp, 51번째의 Tyr, 59번째의 Asn, 63번째의 Ser, 106번째의 Met, 108번째의 Tyr의 하나 이상이 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(b) 서열번호: 1(H53 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 27번째의 Tyr, 31번째의 Asp 및 35번째의 Trp가 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체(H3pI),
(c) 서열번호: 1(H53 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 27번째의 Tyr, 31번째의 Asp, 32번째의 Asp, 35번째의 Trp, 59번째의 Asn, 63번째의 Ser, 108번째의 Tyr이 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(d) 서열번호: 1(H53 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 27번째의 Tyr, 31번째의 Asp, 32번째의 Asp, 35번째의 Trp, 59번째의 Asn, 63번째의 Ser, 108번째의 Tyr이 His로 치환되고, 또한 99번째의 Ser이 Val로, 103번째의 Thr이 Ile로 치환된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체(H170),
(e) 서열번호: 1(H53 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 31번째의 Asp, 51번째의 Tyr, 63번째의 Ser, 106번째의 Met 및 108번째의 Tyr이 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(f) 서열번호: 1(H53 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 31번째의 Asp, 51번째의 Tyr, 63번째의 Ser, 106번째의 Met 및 108번째의 Tyr이 His로 치환되고, 또한 99번째의 Ser이 Phe로, 103번째의 Thr이 Ile로 치환된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체(CLH5),
(g) 서열번호: 2(PF1L 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 28번째의 Asp, 32번째의 Tyr, 53번째의 Glu, 56번째의 Ser, 92번째의 Asn의 하나 이상이 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(h) 서열번호: 2(PF1L 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 28번째의 Asp, 32번째의 Tyr 및 53번째의 Glu가 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(L73),
(i) 서열번호: 1(H53 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 32번째의 Tyr 및 53번째의 Glu가 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(L82),
(j) 서열번호: 2(PF1L 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 32번째의 Tyr, 53번째의 Glu, 56번째의 Ser 및 92번째의 Asn이 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(CLL5),
(k) (b)의 중쇄 가변영역 및 (h)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(l) (d)의 중쇄 가변영역 및 (i)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체,
(m) (f)의 중쇄 가변영역 및 (h)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체.
서열번호: 1(H53 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 27번째의 Tyr, 31번째의 Asp, 32번째의 Asp, 35번째의 Trp, 51번째의 Tyr, 59번째의 Asn, 63번째의 Ser, 106번째의 Met, 108번째의 Tyr의 하나 이상이 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 이하의 중쇄 가변영역을 들 수 있다.
서열번호: 3(H3pI)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역
서열번호: 4(H170)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역
서열번호: 5(CLH5)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역
서열번호: 2(PF1L 가변영역)의 아미노산 서열에 있어서, 28번째의 Asp, 32번째의 Tyr, 53번째의 Glu, 56번째의 Ser, 92번째의 Asn의 하나 이상이 His로 치환된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역의 구체적인 예로서는, 예를 들면, 이하의 경쇄 가변영역을 들 수 있다.
서열번호: 6(L73)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역
서열번호: 7(L82)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역
서열번호: 8(CLL5)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역
전술한 H3pI, H170, CLH5, L73, L82, 및 CLL5의 각 항체에 있어서의 아미노산 위치와 아미노산 치환에 대해서, 이하의 표 1에 나타낸다. 아미노산 위치는 Kabat 넘버링을 토대로 하여 나타내고 있다.
Figure pat00001
H쇄의 33번째, 및 L쇄의 55번째는 WT에 있어서 히스티딘의 서열을 갖는다.
본 발명은 적어도 전술한 (a)~(j) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 항체 및 그 항체의 제조방법을 제공한다. 따라서 본 발명의 항체에는, 전술한 (a)~(j) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 치환에 더하여, 전술한 (a)~(j)에 기재된 아미노산 치환 이외의 아미노산 치환을 포함하는 항체도 포함된다. 전술한 (a)~(j)에 기재된 아미노산 치환 이외의 아미노산 치환으로서는, 예를 들면, CDR 부분의 아미노산 서열의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등이나, FR의 아미노산 서열의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등을 들 수 있다.
또한 본 발명은 이하의 (1)~(28) 중 어느 하나에 기재된 항IL-6 수용체 항체를 제공한다.
(1) 서열번호: 21(VH1-IgG1)의 1번째에서 119번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(VH1-IgG1 가변영역)을 포함하는 항체,
(2) 서열번호: 22(VH2-IgG1)의 1번째에서 119번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(VH2-IgG1 가변영역)을 포함하는 항체,
(3) 서열번호: 23(VH3-IgG1)의 1번째에서 119번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(VH3-IgG1 가변영역)을 포함하는 항체,
(4) 서열번호: 24(VH4-IgG1)의 1번째에서 119번째까지의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역(VH4-IgG1 가변영역)을 포함하는 항체,
(5) 서열번호: 25(VL1-CK)의 1번째에서 107번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(VL1-CK 가변영역)을 포함하는 항체,
(6) 서열번호: 26(VL2-CK)의 1번째에서 107번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(VL2-CK 가변영역)을 포함하는 항체,
(7) 서열번호: 27(VL3-CK)의 1번째에서 107번째까지의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역(VL3-CK 가변영역)을 포함하는 항체,
(8) (2)의 중쇄 가변영역과 (6)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(Fv1-IgG1),
(9) (1)의 중쇄 가변영역과 서열번호: 7(L82)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(Fv2-IgG1),
(10) (4)의 중쇄 가변영역과 (5)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(Fv3-IgG1),
(11) (3)의 중쇄 가변영역과 (7)의 경쇄 가변영역을 포함하는 항체(Fv4-IgG1),
(12) 서열번호: 33에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체(VH3-IgG2△GK),
(13) 서열번호: 34에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체(VH3-M58),
(14) 서열번호: 35에 기재된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체(VH3-M73),
(15) (12)의 중쇄와 서열번호: 27(VL3-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체(Fv4-IgG2△GK),
(16) (13)의 중쇄와 서열번호: 27(VL3-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체(Fv4-M58),
(17) (14)의 중쇄와 서열번호: 27(VL3-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체(Fv4-M73),
(18) 서열번호: 36(VH2-M71)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체(VH2-M71),
(19) 서열번호: 37(VH2-M73)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체(VH2-M73),
(20)서열번호: 38(VH4-M71)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체(VH4-M71),
(21) 서열번호: 39(VH4-M73)의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체(VH4-M73),
(22) (18)의 중쇄와 서열번호: 26(VL2-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체(Fv1-M71),
(23) (19)의 중쇄와 서열번호: 26(VL2-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체(Fv1-M73),
(24) (20)의 중쇄와 서열번호: 25(VL1-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체(Fv3-M71),
(25) (21)의 중쇄와 서열번호: 25(VL1-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체(Fv3-M73),
(26) 서열번호: 25(VL1-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
(27) 서열번호: 26(VL2-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체,
(28) 서열번호: 27(VL3-CK)의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항체.
또한 본 발명은 이하의 (a)~(v) 중 어느 하나의 FR 또는 CDR을 제공한다.
(a) 서열번호: 40에 기재된 중쇄 CDR1(VH1, 2, 3, 4),
(b) 서열번호: 41에 기재된 중쇄 CDR2(VH1, 2),
(c) 서열번호: 42에 기재된 중쇄 CDR2(VH3),
(d) 서열번호: 43에 기재된 중쇄 CDR2(VH4),
(e) 서열번호: 44에 기재된 중쇄 CDR3(VH1, 2),
(f) 서열번호: 45에 기재된 중쇄 CDR3(VH3, 4),
(g) 서열번호: 46에 기재된 중쇄 FR1(VH1, 2),
(h) 서열번호: 47에 기재된 중쇄 FR1(VH3, 4),
(i) 서열번호: 48에 기재된 중쇄 FR2(VH1, 2, 3, 4)
(j) 서열번호: 49에 기재된 중쇄 FR3(VH1),
(k) 서열번호: 50에 기재된 중쇄 FR3(VH2),
(l) 서열번호: 51에 기재된 중쇄 FR3(VH3, 4),
(m) 서열번호: 52에 기재된 중쇄 FR4(VH1, 2, 3, 4)
(n) 서열번호: 53에 기재된 경쇄 CDR1(VL1, 2),
(o) 서열번호: 54에 기재된 경쇄 CDR1(VL3),
(p) 서열번호: 55에 기재된 경쇄 CDR2(VL1, VL3),
(q) 서열번호: 56에 기재된 경쇄 CDR2(VL2),
(r) 서열번호: 57에 기재된 경쇄 CDR3(VL1, 2, 3),
(s) 서열번호: 58에 기재된 경쇄 FR1(VL1, 2, 3),
(t) 서열번호: 59에 기재된 경쇄 FR2(VL1, 2, 3),
(u) 서열번호: 60에 기재된 경쇄 FR3(VL1, 2, 3),
(v) 서열번호: 61에 기재된 경쇄 FR4(VL1, 2, 3).
상기 (a)~(v)의 각 서열을, 도 25에 정리하여 나타낸다. 또한 본 발명은, 상기 (a)~(v) 중 어느 하나의 FR 또는 CDR을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 항IL-6 수용체 항체에는, 전술한 것 중 어느 하나에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 항체의 단편이나 그의 수식물도 포함된다. 예를 들면, 항체의 단편으로서는, Fab, F(ab')2, Fv 또는 H쇄와 L쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv(scFv), H쇄 단독 도메인이나 L쇄 단독 도메인(예를 들면, Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36.), Unibody(WO2007059782 A1), SMIP(WO2007014278 A2)를 들 수 있다. 또한 항체의 유래로서는, 특별히 한정되지 않으나, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 완전 인간화 항체 등이어도 된다.
구체적으로는, 항체를 효소, 예를 들면, 파파인, 펩신으로 처리하여 항체 단편을 생성시키거나, 또는, 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이를 발현 벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(예를 들면, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 참조).
따라서, 본 발명은, 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 공정을 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
보다 구체적으로는, 이하의 공정을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
(a) 본 발명의 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 도입된 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 공정,
(b) 당해 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드를 취득하는 공정.
scFv는 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 얻어진다. 이 scFv에 있어서, H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하게는, 펩티드 링커를 매개로 연결된다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 10.0, 5879-5883). scFv에 있어서의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은, 상기 항체로서 기재된 것 중 어느 유래여도 된다. V영역을 연결하는 펩티드 링커로서는, 예를 들면 아미노산 12-19 잔기로 되는 임의의 단일 사슬 폴리펩티드가 사용된다.
본 발명의 항IL-6 수용체 항체가 정상영역을 포함하는 경우, 정상영역은 어떠한 타입의 정상영역이어도 되고, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG4 등의 정상영역을 사용할 수 있다. 정상영역은 인간 항체의 정상영역인 것이 바람직하다. 또한, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG4 등의 정상영역에 대해 아미노산 서열의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등을 행한 개변체여도 된다.
본 발명의 항IL-6 수용체 항체가 결합하는 IL-6 수용체는 인간 IL-6 수용체인 것이 바람직하다.
본 발명의 항IL-6 수용체 항체는, 혈장 중 체류성이 우수한 항체로, 항IL-6 수용체 항체가 항원인 가용형 IL-6 수용체 및 막형 IL-6 수용체에 결합 가능한 상태로 혈장 중에 존재하는 시간이 연장되고, 생체내의 가용형 IL-6 수용체 및 막형 IL-6 수용체가 항IL-6 수용체 항체에 의해 결합하고 있는 시간이 연장된 항체이다. 또한, 당해 항IL-6 수용체 항체는, IL-6 수용체에 2회 이상 결합하는 것이 가능하여, 3개 이상의 IL-6 수용체를 중화하는 것이 가능하다고 생각된다.
<의약조성물>
또한 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자, 본 발명의 스크리닝방법에 의해 단리된 항원 결합 분자, 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자를 포함하는 의약조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항원 결합 분자 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 항원 결합 분자는 혈장 중 체류성이 우수하여, 항원 결합 분자의 투여빈도를 줄이는 것이 기대되기 때문에 의약조성물로서 유용하다. 본 발명의 의약조성물은 의약적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 의약조성물이란, 통상, 질환의 치료 또는 예방, 또는 검사·진단을 위한 약제를 말한다.
본 발명의 의약조성물은, 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 액체와의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 도는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약실시에 요구되는 단위용량형태로 혼화함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효성분량은, 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 설정한다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약(예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨)을 포함하는 등장액을 들 수 있다. 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80(TM), HC0-50 등)를 병용해도 된다.
유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산 벤질, 및/또는 벤질알코올을 병용해도 된다. 또한, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액 및 초산나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면, 염산프로카인), 안정제(예를 들면, 벤질알코올 및 페놀), 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전한다.
본 발명의 의약조성물은, 바람직하게는 비경구 투여에 의해 투여된다. 예를 들면, 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형의 조성물로 할 수 있다. 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
투여방법은, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 선택할 수 있다. 항원 결합 분자 함유하는 의약조성물의 투여량은, 예를 들면 1회에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1000 ㎎의 범위로 설정하는 것이 가능하다. 또는, 예를 들면, 환자당 0.001~100000 ㎎의 투여량으로 하는 것도 가능하나, 본 발명은 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여방법은, 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변동되나, 당업자라면 그들 조건을 고려하여 적당한 투여량 및 투여방법을 설정하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에서 기재되고 있는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역후에 수식(예를 들면, N 말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다)을 받는 경우도 있으나, 그와 같이 아미노산이 번역후 수식된 경우이더라도 당연히 본 발명에서 기재되고 있는 아미노산 서열에 포함된다.
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
이하 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 개변 인간화 PM1 항체의 제작
재조합 가용형 인간 IL-6 수용체(SR344)의 조제
항원인 인간 IL-6 수용체의 재조합 인간 IL-6 수용체는 이하와 같이 조제하였다. J. Biochem. 108, 673-676 (1990)에서 보고되어 있는 N 말단측 1번째에서 344번째의 아미노산 서열로 되는 가용형 인간 IL-6 수용체(이하, SR344))(Yamasaki 등, Science 1988;241:825-828 (GenBank # X12830))의 CHO 세포 정상 발현주를 제작하였다.
SR344 발현 CHO 세포로부터 얻은 배양상청으로부터, Blue Sepharose 6 FF 칼럼 크로마토그래피, SR344에 대한 특이 항체를 고정한 칼럼에 의한 친화성 크로마토그래피, 겔여과 칼럼 크로마토그래피의 3개의 칼럼 크로마토그래피에 의해, SR344를 정제하였다. 메인 피크로서 용출된 분획을 최정 정제품으로 하였다.
재조합 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체(cIL-6R)의 조제
공개되어 있는 붉은털원숭이 IL-6 수용체 유전자서열(Birney et al, Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue):D556-61.)을 토대로 올리고 DNA 프라이머 Rhe6Rf1(서열번호: 16), Rhe6Rr2(서열번호: 17)를 제작하였다. 게잡이원숭이 췌장으로부터 조제된 cDNA를 주형으로 하여, 프라이머 Rhe6Rf1 및 Rhe6Rr2를 사용하여, PCR법에 의해 게잡이원숭이 IL-6 수용체 유전자 전장을 코드하는 DNA 단편을 조제하였다. 얻어진 DNA 단편을 주형으로, 올리고 DNA 프라이머 CynoIL6R N-EcoRI(서열번호: 18) 및 CynoIL6R C-NotI-His(서열번호: 19)를 사용하여, PCR법에 의해 게잡이원숭이 IL-6 수용체 유전자의 시그날영역을 포함하는 가용형 영역(Met1-Pro363)의 C 말단에 6xHis가 부가된 단백질을 코드하는 1131 bp의 DNA 단편(서열번호: 20)을 증폭하였다. 얻어진 DNA 단편을 EcoRI-NotI로 소화하고, 동물세포 발현 벡터에 삽입하여, 이를 사용하여 CHO 정상 발현주(cyno.sIL-6R 생산 CHO 세포)를 제작하였다.
cyno.sIL-6R 생산 CHO 세포의 배양액을 HisTrap 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)으로 정제 후, Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)를 사용하여 농축하고, Superdex200pg16/60 겔여과 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)으로 추가적으로 정제를 행하여, 가용형 게잡이원숭이 IL-6 수용체(이하, cIL-6R)의 최종 정제품으로 하였다.
재조합 게잡이원숭이 IL-6(cIL-6)의 조제
게잡이원숭이 IL-6는 이하와 같이 조제하였다. SWISSPROT Accession No.P79341에 등록되어 있는 212 아미노산을 코드하는 염기서열을 제작하고, 동물세포 발현 벡터에 클로닝하여, CHO 세포에 도입함으로써 정상 발현 세포주를 제작하였다(cyano. IL-6 생산 CHO 세포). cyno. IL-6 생산 CHO 세포의 배양액을 SP-Sepharose/FF 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)으로 정제 후, Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)를 사용하여 농축하고, Superdex 75 pg 26/60 겔여과 칼럼(GE 헬스케어 바이오사이언스)으로 추가적으로 정제를 행하여, Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)를 사용하여 농축해, 게잡이원숭이 IL-6(이하, cIL-6)의 최종 정제품으로 하였다.
인간 gp130 발현 BaF3 세포주의 수립
IL-6 의존 증식성을 나타내는 세포주를 얻기 위해, 이하에 나타내는 바와 같이, 인간 gp130을 발현한 BaF3 세포주의 수립을 행하였다.
전장 인간 gp130 cDNA(Hibi 등, Cell 1990;63:1149-1157(GenBank # NM_002184))를 PCR법에 의해 증폭하고 pCHOI(Hirata 등, FEBS Letter 1994;356:244-248)의 DHFR 유전자 발현부위를 제거해, Zeocin 내성 유전자 발현부위를 삽입한 발현 벡터 pCOS2Zeo로 클로닝하여, pCOS2Zeo/gp130을 구축하였다. 전장 인간 IL-6R cDNA를 PCR법에 의해 증폭하고, pcDNA3.1(+)(Invitrogen)로 클로닝하여, hIL-6R/pcDNA3.1(+)를 구축하였다. 10 ㎍의 pCOS2Zeo/gp130을 PBS에 현탁한 BaF3세포(0.8×107 cells)에 혼합하고, Gene Pulser(Bio-Rad)를 사용하여 0.33 kV, 950 μFD의 용량으로 펄스를 가하였다. 전기천공 처리에 의해 유전자 도입한 BaF3세포를 0.2 ng/mL의 mouse interleukin-3(Peprotech), 10% Fetal Bovine Serum(이하 FBS, HyClone)을 포함하는 RPMI1640배지(Invitrogen)에서 하루 배양하고, 100 ng/mL의 human interleukin-6(R&D systems), 100 ng/mL의 human interleukin-6 soluble receptor(R&D systems) 및 10% FBS를 포함하는 RPMI1640배지를 첨가하고 선발하여, 인간 gp130 발현 BaF3세포주(이하, BaF3/gp130)를 수립하였다. 이 BaF3/gp130은, human interleukin-6(R&D systems) 및 SR344 존재하에서 증식되는 것으로부터, 항IL-6 수용체 항체의 증식저해활성(즉 IL-6 수용체 중화활성)의 평가에 사용하는 것이 가능하다.
인간화 항IL-6 수용체 항체의 제작
Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6에 있어서 인간화된 마우스 PM1 항체(이후 Wild type, WT로 약칭, H쇄 WT를 H(WT)(아미노산 서열 서열번호: 9)로 하고, L쇄 WT를 L(WT)(아미노산 서열 서열번호: 10)로 한다)의 프레임워크 서열과 CDR 서열에 변이를 도입하고, 개변 H쇄로서 H53(아미노산 서열 서열번호: 1), PF1H(아미노산 서열 서열번호: 11), 개변 L쇄로서 L28(아미노산 서열 서열번호: 12), PF1L(아미노산 서열 서열번호: 2)을 제작하였다. 구체적으로는, QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여, 첨부 설명서 기재의 방법으로 변이체를 제작하여, 얻어진 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하고, 목적의 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다.
인간화 항IL-6 수용체 항체의 발현과 정제
항체의 발현은 이하의 방법을 사용해서 행하였다. 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen)를 10% Fetal Bovine Serum(Invitrogen)을 포함하는 DMEM배지(Invitrogen)로 현탁하고, 5~6×105개/mL의 세포밀도로 접착세포용 디쉬(직경 10 ㎝, CORNING)의 각 디쉬로 10 mL씩 뿌려넣고 CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내에서 하루 배양한 후에, 배지를 흡인 제거하고, CHO-S-SFM-II(Invitrogen)배지 6.9 mL를 첨가하였다. 조제한 플라스미드를 lipofection법에 의해 세포로 도입하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 원심분리(약 2000 g, 5분간, 실온)하여 세포를 제거하고, 추가적으로 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore)를 통과시켜 멸균하여 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청에 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 정제하였다. 정제 항체 농도는, 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 항체 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
[실시예 2] pH 의존적 결합 항체 H3pI/L73의 제작
복수회 항원을 중화할 수 있는 항체의 창제방법
IgG 분자는 2가이기 때문에 2개소에서 항원에 결합한 경우, 1분자의 IgG 분자로 최대 2분자의 항원을 중화하는 것이 가능하나, 3분자 이상의 항원을 중화하는 것은 불가능하다. 그 때문에 중화 항체의 경우, 그 중화효과를 일정기간 지속시키기 위해서는, 그 일정기간에 생산되는 항원량 이상의 항체량이 투여될 필요가 있어, 항체의 약물동태 향상이나 어피니티 향상 기술만으로는, 필요 항체 투여량의 저감에는 한계가 존재한다. 이에 1분자의 IgG 분자로 2분자 이상의 항원을 중화할 수 있다면, 같은 투여량이라면 중화효과의 지속성이 향상되고, 또한, 동일한 지속성을 달성하기 위해 필요한 투여량을 저감하는 것이 가능하다.
중화 항체의 경우, 타겟이 되는 항원의 종류로서, 항원이 혈장 중에 존재하는 가용형 항원의 경우와 항원이 세포 표면에 발현하고 있는 막형 항원의 경우 2종류가 존재한다.
항원이 막형 항원인 경우, 투여한 항체는 세포 표면 상의 막 항원에 결합하고, 그 후, 항체는 막 항원에 결합한 채로 항원과 함께 인터날리제이션에 의해 세포내의 엔도솜에 삽입되고, 그 후, 항원에 결합한 채로 리소좀으로 이행하여 항체는 항원과 함께 리소좀에 의해 분해된다. 막 항원에 의한 인터날리제이션을 매개로 한 혈장 중으로부터 소실은 항원 의존적인 소실이라 불리고 있고, 많은 항체 분자에서 보고되어 있다(Drug Discov Today. 2006 Jan;11(1-2):81-8). 1분자의 IgG 항체는 2가로 항원에 결합한 경우 2분자의 항원에 결합하고, 인터날라이즈되어 그대로 리소좀으로 분해되는 것으로부터, 통상의 항체의 경우, 1분자의 IgG 항체가 2분자 이상의 항원을 중화하는 것은 불가능하다(도 1).
IgG 분자의 혈장 중 체류성이 긴(소실이 느린) 것은, IgG 분자의 샐비지 수용체로서 알려져 있는 FcRn이 기능하고 있기 때문이다(Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25). 피노사이토시스에 의해 엔도솜에 삽입된 IgG 분자는, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 FcRn에 결합한다. FcRn에 결합하지 못한 IgG 분자는 리소좀으로 진행하여 거기서 분해되나, FcRn에 결합한 IgG 분자는 세포 표면으로 이행하여 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 FcRn으로부터 해리됨으로써 재차 혈장 중으로 돌아간다(도 2).
막 항원에 결합한 IgG 분자는 인터날리제이션에 의해 세포내의 엔도솜에 삽입되고, 항원에 결합한 채로 리소좀으로 이행하여 분해되며, IgG 항체가 2가로 항원에 결합한 경우는 2분자의 항원을 중화하여 항원과 함께 분해된다. 인터날리제이션에 의해 세포내의 엔도솜에 삽입되었을 때, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 IgG 항체가 항원으로부터 해리될 수 있다면, 해리된 항체는 엔도솜 내에 발현하고 있는 FcRn에 결합하는 것이 가능하다고 생각된다. 항원으로부터 해리되어 FcRn으로 결합한 IgG 분자는 세포 표면으로 이행하여 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 FcRn으로부터 해리됨으로써 재차 혈장 중으로 돌아가고, 혈장 중으로 돌아간 IgG 분자는 재차 새로운 막 항원으로 결합하는 것이 가능하다. 이를 반복함으로써, 1분자의 IgG 분자가 반복하여 막형 항원에 결합하는 것이 가능해지기 때문에, 1분자의 IgG 분자가 복수개의 항원을 중화하는 것이 가능해진다(도 3).
항원이 가용형 항원인 경우, 투여한 항체는 혈장 중에서 항원에 결합하고, 항원과 항체의 복합체의 형태로 혈장 중을 체류한다. 통상, 항체의 혈장 중 체류성은 전술한 바와 같이 FcRn의 기능에 의해 매우 긴(소실속도가 매우 느린) 것에 반하여, 항원의 혈장 중 체류성은 짧기(소실속도가 빠르기) 때문에, 항체에 결합한 항원은 항체와 동일 정도의 혈장 중 체류성을 갖는(소실이 매우 느린) 것이 된다. 항원은 생체내에서 항상 일정 속도로 생산되고 있어, 항체 비존재하에서는 항원의 생산속도와 항원의 소실속도가 균형잡힌 상태의 농도로 항원이 혈장 중에 존재한다. 항체 존재하에서는, 대부분의 항원이 항체에 결합하여, 항원의 소실은 매우 느려지기 때문에 혈장 중의 항원농도는 항체 비존재하에 비해 상승한다(Kidney Int. 2003, 64, 697-703, J. National Cancer Institute 2002, 94(19), 1484-1493, J. Allergy and Clinical Immunology 1997, 100(1), 110-121, Eur. J. Immunol. 1993, 23; 2026-2029). 만일 항체의 항원으로의 어피니티가 무한대였다고 하더라도, 항원의 농도가 상승하여, 항체가 혈장 중으로부터 서서히 소실되고, 항체와 항원의 농도가 일치한 시간 이후, 항체의 항원 중화효과가 끊어져 버린다. 가용형 항원에 대한 중화효과는, 해리상수(KD)가 강할수록 적은 항체 농도로 중화하는 것이 가능하나, 어피니티를 아무리 강하게 해도 존재하는 항원농도의 1/2 이하의 항체 농도로는 항원을 중화할 수 없다(Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9;334(4):1004-13). 항원이 결합하고 있지 않은 IgG 분자와 마찬가지로, 항원이 결합한 IgG 분자도 혈장 중에 있어서 피노사이토시스에 의해 엔도솜에 삽입되어, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 FcRn에 결합한다. FcRn으로 결합한 IgG 분자는 항원에 결합한 채로, 세포 표면으로 이행하여 혈장 중의 중성 조건하에 있어서 FcRn으로부터 해리됨으로써 IgG 분자는 항원에 결합한 채로 재차 혈장 중으로 돌아가기 때문에, 혈장 중에서 새로운 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 이때, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 IgG 분자가 항원으로부터 해리되는 것이 가능하면, 해리된 항원은 FcRn에 결합하는 것이 불가능하기 때문에, 그 항원은 리소좀에 의해 분해되는 것으로 생각된다. 한편, IgG 분자는 FcRn에 결합함으로써 재차 혈장 중으로 돌아가는 것이 가능하다. 혈장 중으로 돌아간 IgG 분자는, 이미 엔도솜 내에서 항원을 해리하고 있는 것으로부터, 혈장 중에 있어서 재차 새로운 항원에 결합하는 것이 가능해진다. 이를 반복함으로써, 1분자의 IgG 분자가 반복해서 가용형 항원에 결합하는 것이 가능해지기 때문에, 1분자의 IgG 분자가 복수개의 항원을 중화하는 것이 가능해진다(도 4).
이와 같이 항원이 막형 항원, 가용형 항원인 것에 상관없이, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 IgG 항체가 항원으로부터 해리되는 것이 가능하면, 1분자의 IgG 분자가 반복해서 항원을 중화하는 것을 달성할 수 있다고 생각되었다. 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 IgG 항체가 항원으로부터 해리되기 위해서는, 산성 조건하에 있어서 항원과 항체의 결합이 중성 조건하와 비교하여 대폭 약해질 필요가 있다. 세포 표면에서는 막 항원을 중화할 필요가 있기 때문에, 세포 표면의 pH인 pH 7.4에 있어서는 항원에 강하게 결합할 필요가 있다. 엔도솜 내의 pH는 일반적으로 pH 5.5~pH 6.0인 것이 보고되어 있는(Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32.) 것으로부터, pH 5.5~pH 6.0에 있어서 항원에 약하게 결합하는 항체라면, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원으로부터 항체는 해리된다고 생각된다. 즉, 세포 표면의 pH인 pH 7.4에 있어서는 항원에 강하게 결합하고, 엔도솜 내의 pH인 pH 5.5~pH 6.0에 있어서 항원에 약하게 결합하는 항체라면, 1분자의 IgG 분자가 복수개의 항원을 중화하여, 약물동태를 향상시키는 것이 가능하다고 생각되었다.
일반적으로 단백질-단백질 상호작용은 소수 상호작용, 정전 상호작용, 수소결합으로 되고, 그 결합의 강도는 일반적으로 결합상수(affinity), 또는 외관의 결합상수(avidity)로 표현된다. 중성 조건하(pH 7.4)와 산성 조건하(pH 5.5~pH 6.0)에서 결합의 강도가 변화되는 pH 의존적인 결합은, 천연에 존재하는 단백질-단백질 상호작용에 존재한다. 예를 들면 전술한 IgG 분자와 IgG 분자의 샐비지 수용체로서 알려져 있는 FcRn의 결합은, 산성 조건하(pH 5.5~pH 6.0)에서 강하게 결합하고 중성 조건하(pH 7.4)에서 매우 결합이 약하다. 이들 대부분의 pH 의존적으로 결합이 변화하는 단백질-단백질 상호작용에 있어서는, 그 상호작용에 히스티딘 잔기가 관여하고 있다. 히스티딘 잔기의 pKa는 6.0~6.5 부근에 존재하기 때문에, 중성 조건하(pH 7.4)와 산성 조건하(pH 5.5~pH 6.0) 사이에서 히스티딘 잔기의 프로톤의 해리상태가 변화한다. 즉, 히스티딘 잔기는 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서는 전하를 띠지 않아 중성으로 수소원자 액셉터로서 기능하고, 산성 조건하(pH 5.5~pH 6.0)에 있어서는 양전하를 띠고 수소원자 도너로서 기능한다. 전술한 IgG-FcRn 상호작용에 있어서도, IgG측에 존재하는 히스티딘 잔기가 pH 의존적 결합에 관여하고 있는 것이 보고되어 있다(Mol Cell. 2001 Apr;7(4):867-77.).
그 때문에 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 히스티딘 잔기로 치환하거나, 또는, 상호작용하는 개소에 히스티딘을 도입함으로써 단백질-단백질 상호작용에 pH 의존성을 부여하는 것은 가능하다. 항체-항원간의 단백질-단백질 상호작용에 있어서도 그러한 시도가 이루어지고 있어, 항난백 리소자임 항체의 CDR 서열에 히스티딘을 도입함으로써, 산성 조건하에서 항원에 대한 결합성이 저하된 항체 변이체를 취득하는 것에 성공하였다(FEBS Letter (vol.309, No.1, 85-88, 1992)). 또한, CDR 서열에 히스티딘을 도입함으로써, 암 조직의 낮은 pH에서 특이적으로 항원에 결합하고 중성 조건하에서는 약하게 결합하는 항체가 보고되어 있다(WO2003105757).
이와 같이 항원 항체 반응에 pH 의존성을 도입하는 방법은 보고되어 있으나, 지금까지 체액 중의 pH인 pH 7.4에 있어서는 항원에 강하게 결합하고, 엔도솜 내의 pH인 pH 5.5~pH 6.0에 있어서 항원에 약하게 결합함으로써, 1분자의 IgG 분자가 복수개의 항원을 중화하는 항체는 보고되어 있지 않다. 즉, 중성 조건하에서의 결합을 유지하면서 산성 조건하에서의 결합만을 크게 저하시키는 개변을 도입함으로써, 개변 전의 항체와 비교하여 개변 후의 항체가, 인 비보에 있어서 항원에 복수회 결합함으로써 약물동태가 향상되어, 동일한 투여량으로 중화효과의 지속성이 향상된 항체의 개변에 관한 보고는 없다.
IL-6 수용체는 생체내에 가용형 IL-6 수용체 및 막형 IL-6 수용체 양쪽 형태로 존재한다(Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26.). 항IL-6 수용체 항체는 가용형 IL-6 수용체 및 막형 IL-6 수용체 양쪽에 결합하여 그들의 생물학적인 작용을 중화한다. 항IL-6 수용체 항체는 막형 IL-6 수용체에 결합 후, 막형 IL-6 수용체에 결합한 채로 인터날리제이션에 의해 세포내의 엔도솜에 삽입되고, 그 후, 항IL-6 수용체 항체는 막형 IL-6 수용체에 결합한 채로 리소좀으로 이행하여 함께 리소좀에 의해 분해된다고 생각되고 있다. 실제로, 인간화 항IL-6 수용체 항체는, 비선형의 클리어런스를 나타내, 항원 의존적인 소실이 인간화 항IL-6 수용체 항체의 소실에 크게 기여하고 있는 것이 보고되어 있다(The Journal of Rheumatology, 2003, 30;71426-1435). 즉, 1분자의 인간화 항IL-6 수용체 항체는 1분자 내지는 2분자의 막형 IL-6 수용체에(1가 내지는 2가로) 결합하고, 인터날라이즈 후, 리소좀으로 분해된다고 생각된다. 이에, 천연형 인간화 항IL-6 수용체 항체의 중성 조건하에서의 결합을 유지하면서 산성 조건하에서의 결합만을 크게 저하시키는 개변 항체(pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체)를 제작할 수 있다면, 1분자의 인간화 항IL-6 수용체 항체로 복수 분자의 IL-6 수용체를 중화할 수 있다고 생각되어, 이것에 의해 천연형 인간화 항IL-6 수용체 항체와 비교하여, pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체는 인 비보에 있어서 동일한 투여량으로 중화효과의 지속성을 향상시킬 수 있다고 생각하였다.
pH 의존적 결합 인간화 IL-6 수용체 항체 H3pI/L73의 제작
pH 의존적인 결합을 항원 항체 반응에 도입하는 방법으로서, CDR에 히스티딘을 도입하는 방법이 보고되어 있다(FEBS Letter (vol.309, No.1, 85-88, 1992)). 실시예 1에서 제작한 H53/PF1L의 가변영역 표면에 노출되는 아미노산 잔기 및 항원과 상호작용하고 있다고 생각되는 잔기를 확인하기 위해, MOE 소프트웨어(Chemical Computing Group Inc.)를 사용하여, 호몰로지 모델링에 의해 H53/PFIL의 Fv영역 모델을 제작하였다. H53/PFIL의 서열정보를 토대로 제작한 입체구조 모델로부터, 히스티딘 도입에 의해 항원과의 pH 의존적 결합을 도입할 수 있다고 생각되는 변이 개소를 H27, H31, H35, L28, L32, L53(Kabat 넘버링, Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)으로 선정하였다. H27, H31, H35의 잔기를 히스티딘으로 치환하는 변이를 실시예 1에서 제작한 H53에 대해 도입한 것을 H3pI(아미노산 서열 서열번호: 3)로 하고, L28, L32, L53의 잔기를 히스티딘으로 치환하는 변이를 실시예 1에서 제작한 PF1L에 대해 도입한 것을 L73(아미노산 서열 서열번호: 6)으로 하였다.
H3pI/L73의 발현 벡터의 제작·발현·정제
선정된 개소에 대해서 개변 항체를 제작하기 위한 아미노산 개변을 행하였다. 실시예 1에 있어서 제작한 H53(염기서열 서열번호: 13) 및 PF1L(염기서열 서열번호: 14)에 변이를 도입하여, H3pI(아미노산 서열 서열번호: 3)와 L73(아미노산 서열 서열번호: 6)을 제작하였다. 구체적으로는, QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여, 첨부 설명서 기재의 방법으로 제작하고, 얻어진 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여, 목적의 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. H쇄로서 H3pI, L쇄로서 L73을 사용한 H3pI/L73의 발현·정제는 실시예 1에 기재한 방법으로 행하였다.
[실시예 3] 파지 디스플레이 기술을 사용한 CDR His 개변에 의한 pH 의존적 항원 결합능의 부여
인간화 PM1 항체의 scFv 분자의 제작
인간화 항IL-6R 항체인 인간화 PM1 항체(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)의 scFv화를 행하였다. VH, VL영역을 PCR에 의해 증폭하고, 링커서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호: 15)를 VH, VL 사이에 갖는 인간화 PM1 HL scFv를 제작하였다.
히스티딘 scanning에 의한 히스티딘 도입 가능 개소의 선정
제작한 인간화 PM1 HL scFv DNA를 주형으로 한 PCR에 의해, 각 CDR 아미노산 중 하나의 아미노산이 히스티딘이 되는 히스티딘 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리화하고자 하는 아미노산의 코돈을 히스티딘에 상당하는 코돈인 CAT로 한 프라이머를 사용한 PCR 반응에 의해 라이브러리 부분을 구축, 그 이외의 부분을 통상의 PCR에 의해 제작하여, assemble PCR법에 의해 연결하여 구축하였다. 구축한 라이브러리를 Sfi I로 소화하고, 마찬가지로 Sfi I로 소화한 phagemide 벡터 pELBG IacI 벡터에 삽입하여, XL1-Blue(stratagene)로 트랜스포밍(transforming)하였다. 얻어진 콜로니를 사용하여, phage ELISA에 의한 항원 결합성 평가와 HL scFv 서열 해석을 행하였다. J.Mol.Biol 1992 ; 227 : 381-388에 따라, SR344를 1 ㎍/mL로 코팅(coating)한 플레이트를 사용한 phage-ELISA를 행하였다. SR344로의 결합성이 확인된 클론에 대해서, 특이적 프라이머를 사용하여, 서열 해석을 행하였다.
anti-Etag 항체(GE Healthcare)와 anti-M13 항체(GE Healthcare)에 의한 ELISA에 의해, phage titer를 구하였다. 이 값을 사용하여, SR344에 대한 phage ELISA의 결과로부터, 인간화 PM1 HL scFv와 비교하여, CDR의 잔기를 히스티딘으로 치환해도 결합능에 커다란 변화가 없는 개소를 선정하였다. 이들 개소를 표 2에 나타내었다. 각 잔기의 넘버링은 Kabat 넘버링(Kabat EA et al. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH)에 따랐다.
Figure pat00002
CDR 히스티딘 개변 라이브러리의 구축
표 2에 나타낸, 히스티딘으로 치환해도 결합능에 커다란 변화가 없는 CDR 잔기(히스티딘 도입 가능 개소)의 아미노산을, 원래의 서열(천연형 서열) 또는 히스티딘이 되는 라이브러리의 설계를 행하였다. 실시예 1에서 제작한 H쇄 PF1H, L쇄 PF1L의 서열을 토대로 하여, 라이브러리 개소에 있어서, 원래의 서열 또는 히스티딘(원래의 서열이나 히스티딘 중 어느 한쪽)이 되도록 라이브러리를 구축하였다.
라이브러리화하고자 하는 개소를, 원래의 아미노산의 코돈, 또는 히스티딘의 코돈이 되도록 설계한 프라이머를 사용한 PCR 반응에 의해 라이브러리부분을 구축, 그 이외의 장소를 통상의 PCR, 또는 라이브러리부분과 동일하게 합성 프라이머를 사용한 PCR 반응에 의해 제작하고, assemble PCR법에 의해 연결하여 구축하였다(J.Mol.Biol 1996 ; 256 : 77-88).
이 라이브러리를 사용하여, J. Immunological Methods 1999 ;231:119-135에 따라, 리보솜 디스플레이(ribosome display)용 라이브러리를 구축하였다. 대장균 무세포계 인 비트로 트랜슬레이션(in vitro translation)을 행하기 위해, SDA 서열(ribosome binding site), T7 promoter를 5'측에 부가하고, 리보솜 디스플레이용 링커로서 3'측에 gene3 부분서열을 Sfi I를 사용하여 결찰(ligation)하였다.
비드 패닝(bead panning)에 의한 라이브러리로부터의 pH 의존적 결합 scFv의 취득
SR344로의 결합능을 갖는 scFv만을 농축시키기 위해, Nature Biotechnology 2000 Dec ; 18 : 1287-1292에 따라, 리보솜 디스플레이법에 의한 패닝을 2회 행하였다. 조제된 SR344를, NHS-PEO4-Biotin(Pierce)을 사용하여 비오틴화하여 항원으로 하였다. 비오틴화 항원량을 40 nM 사용해, 패닝을 행하였다.
얻어진 DNA pool을 주형으로 하고, 특이적 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 HL scFv를 복원하였다. Sfi I로 소화하고, 마찬가지로 Sfi I로 소화한 phagemide 벡터 pELBG IacI 벡터에 삽입하여, XL1-Blue(stratagene)로 트랜스포밍하였다.
목적의 플라스미드를 갖는 대장균을, 2YT/100 ㎍/mL 암피실린/2% 글루코오스 배지 중에서 0.4-0.6 O.D./mL까지 증식시켰다. 거기에 Helper phage(M13KO7, 4.5×1011 pfu)를 첨가하고, 37℃에서 30분간 정치 배양, 37℃에서 30분간 진탕 배양을 행한 후, 50 mL Falcon 튜브로 옮겨 3000 rpm으로 10분간 원심분리하고, 2YT/100 ㎍/mL 암피실린/25 ㎍/mL 카나마이신/0.5 mM IPTG 중에 재현탁하여, 30℃에서 하룻밤 증식시켰다.
파지액은, 하룻밤 배양한 배양액을 2.5 M NaCl/10% PEG에 의해 침전시킨 후 PBS로 희석하여 파지 라이브러리액으로 하였다. 파지 라이브러리액에 10% M-PBS(10% 스킴밀크를 포함하는 PBS), 1 M Tris-HCl을 첨가하고, 종농도 2.5% M-PBS, pH 7.4로 하였다. 패닝은, 일반적인 방법인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝방법을 사용하였다(J Immunol Methods. 2008 Mar 20;332(1-2):2-9., J Immunol Methods. 2001 Jan 1;247(1-2):191-203., Biotechnol Prog. 2002 Mar-Apr;18(2):212-20.). 구체적으로는, 조제한 파지 라이브러리에 40 pmol의 비오틴 표지 SR344를 첨가하고, 37℃에서 60분간 항원과 접촉시켰다. 5% M-PBS(5% 스킴밀크를 포함하는 PBS)로 세정한 Streptavidin coated beads(Dynal M-280)를 첨가하고, 37℃에서 15분간 결합시켰다. 비드를 0.5 mL의 PBST(0.1% Tween-20을 포함하는 PBS, pH 7.4)와 PBS(pH 7.4)로 5회씩 세정하였다. 1 mL의 PBS(pH 5.5) 중에 비드를 37℃에서 현탁하고, 즉시 파지를 회수하였다. 회수한 파지용액에, 대수증식기(OD600 0.4-0.5) XL1-Blue 10 mL에 첨가하고, 37℃에서 30분간 정치함으로써 감염시켰다. 감염시킨 대장균을, 2YT/100 ㎍/mL 암피실린/2% 글루코오스의 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 플레이팅하였다. 재차 이 대장균으로부터 배양을 개시하고, 상기와 동일하게 파지의 배양을 행하여 패닝을 8회 반복하였다.
파지 ELISA에 의한 평가
상기의 싱글 콜로니를 100 μL 2YT/100 ㎍/mL 암피실린/2% 글루코오스/12.5 ㎍/mL 테트라사이클린에 식균하고, 30℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 2 μL를 300 μL 2YT/100 ㎍/mL 암피실린/2% 글루코오스에 식균하고, 37℃에서 4시간 배양 후, 헬퍼 파지(M13K07) 9×108 pfu를 첨가하고, 37℃에서 30분간 정치 배양, 37℃ 30분간 교반 배양을 행하여 감염시켰다. 이 후 2YT/100 ㎍/mL 암피실린/25 ㎍/mL 카나마이신/0.5 mM IPTG 300 μL에 배지교환을 행하였다. 계속해서 30℃에서 하룻밤 배양하고, 원심 상청을 회수하였다. 원심 상청 40 μL에 50 mM PBS(pH 7.4) 360 μL를 첨가하고, ELISA에 제공하였다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)를 62.5 ng/mL 비오틴 표지 SR344를 포함하는 PBS 100 μL로 하룻밤 코트하였다. PBST로 세정하여 항원을 제거한 후, 2% BSA-PBS 250 μL로 1시간 이상 블로킹하였다. 2% BSA-PBS를 제거하고, 여기에 조제한 배양상청을 첨가하여 37℃에서 1시간 정치하여 항체를 결합시켰다. 세정 후, 50 mM PBS(pH 7.4) 또는 50 mM PBS(pH 5.5)를 첨가하여 37℃에서 30분간 정치하고 인큐베이트하였다. 세정 후, 2% BSA-PBS로 희석한 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Parmacia Biotech)와 TMB single solution(ZYMED)으로 검출하고, 황산의 첨가에 의해 반응을 정지한 후, 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
그러나 이 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝에서는, 강한 pH 의존적 결합능을 갖는 클론은 얻어지지 않았다. 약하면서 pH 의존적 결합능이 확인된 클론에 대해서, 특이적 프라이머를 사용하여, 서열 해석을 행하였다. 이들 클론에 있어서, 높은 확률로 히스티딘으로 되어 있던 개소를 표 3에 나타내었다.
Figure pat00003
칼럼 패닝에 의한 라이브러리로부터의 pH 의존적 결합 scFv의 취득
일반적인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝에서는 강한 pH 의존적 결합능을 갖는 클론은 얻어지지 않았다. 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝이나 플레이트에 고정화한 항원을 사용한 패닝의 경우는, 자기 비드 또는 플레이트로부터 산성 조건하에서 해리된 파지를 모두 회수하기 때문에, pH 의존성이 약한 클론의 파지이더라도 회수되어 버려, 최종적으로 농축되는 클론에 강한 pH 의존성을 갖는 클론이 포함될 가능성이 낮은 것이 원인으로 생각된다.
이에, 보다 엄격한 조건에서의 패닝방법으로서 항원을 고정화한 칼럼을 사용한 패닝을 검토하였다(도 5). 항원을 고정화한 칼럼을 사용한 패닝을 사용하여 pH 의존적 결합능을 갖는 클론을 취득한 보고는 지금까지 없다. 항원을 고정화한 칼럼을 사용한 패닝의 경우, 중성 조건하에서 결합시킨 파지를 산성 조건에서 용출시킬 때, pH 의존성이 약한 클론은 칼럼 내에서 항원에 재결합함으로써 용출되기 어려워, pH 의존성이 강하여 칼럼 내의 재결합이 일어나기 어려운 클론이 선택적으로 칼럼으로부터 용출되는 것이 생각된다. 또한, 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝이나 플레이트에 고정화한 항원을 사용한 패닝에서는 산성 조건하에서 해리된 파지를 "모두" 회수하게 되나, 항원을 고정화한 칼럼을 사용한 패닝에서는 칼럼에 산성 조건의 완충액을 흘림으로써 용출을 개시하여 "적절한 분획만"을 회수함으로써, 강한 pH 의존적 결합능을 갖는 파지를 선택적으로 회수하는 것이 가능하다고 생각된다.
먼저, 항원인 SR344를 고정화한 칼럼을 제작하였다. 200 μL Streptavidin Sepharose(GE Healthcare)를 1 mL PBS로 세정한 후, 500 μL PBS에 현탁하고, 비오틴 표지 SR344 400 pmol과 실온에서 1시간 접촉시켰다. 그 후, 빈 칼럼(Amersham Pharmcia Biotech)으로 상기의 sepharose를 충전하고, 약 3 mL의 PBS에 의해 칼럼의 세정을 행하였다. 0.5% BSA-PBS(pH 7.4)에 의해 상기 PEG 침전한 라이브러리 파지(library phage)를 1/25로 희석하여 0.45 nm 필터를 통과시킨 후, 칼럼에 첨가하였다. 약 6 mL의 PBS(pH 7.4)로 세정한 후, 50 mM MES-NaCl(pH 5.5)을 흘려, 낮은 pH로 하자 해리되는 항체가 용출되었다. 적절한 용출 분획을 회수하고, 회수한 파지용액에, 대수증식기(OD600 0.4-0.5) XL1-Blue 10 mL에 첨가하고, 37℃에서 30분간 정치함으로써 감염시켰다.
감염시킨 대장균을, 2YT/100 ㎍/mL 암피실린/2% 글루코오스의 225 ㎜×225 ㎜의 플레이트로 플레이팅하였다. 재차 이 대장균으로부터 배양을 개시하고, 싱가와 동일하게 파지의 배양을 행하여, 패닝을 6회 반복해서 행하였다.
파지 ELISA에 의한 평가
파지 ELISA에 의해, 얻어진 파지(phage)의 평가를 행하였다. pH 의존성이 강하게 확인된 클론에 대해서, 특이적 프라이머를 사용하여, 서열 해석을 행하였다. 그 결과, WT와 비교하여 pH 의존적인 결합이 강하게 보인 클론이 복수 얻어졌다. 도 6에 나타내는 바와 같이, WT와 비교하여 클론 CL5(H쇄 CLH5, L쇄 CLL5)(CLH5: 아미노산 서열 서열번호: 5, CLL5: 아미노산 서열 서열번호: 8)는 특히 강한 pH 의존적인 결합이 확인되었다. 일반적인 자기 비드에 고정화한 항원을 사용한 패닝으로는 취할 수 없었던 강한 pH 의존적 결합을 나타내는 항체를, 항원을 고정화한 칼럼을 사용한 패닝에 의해 취득할 수 있음을 알 수 있어, pH 의존적 결합 항체를 라이브러리로부터 취득하는 방법으로서는 항원을 고정화한 칼럼을 사용한 패닝이 매우 유효한 것을 알 수 있었다. pH 의존적인 결합이 보인 복수의 클론의 아미노산 서열 해석의 결과, 농축된 클론에 있어서 높은 확률로 히스티딘으로 되어 있던 개소를 표 4에 나타내었다.
Figure pat00004
[실시예 4] 인간화 IL-6 수용체 항체의 히스티딘 개변체의 발현과 정제
인간화 IL-6 수용체 항체의 히스티딘 개변 항체의 발현 벡터의 제작·발현·정제
파지 ELISA에서 pH 의존성이 강하게 확인된 클론에 대해서, IgG화하기 위해, VH 및 VL을 각각 PCR에 의해 증폭하고, XhoI/NheI 소화 및 EcoRI 소화에 의해 동물세포 발현용 벡터에 삽입하였다. 각 DNA 단편의 염기서열은, 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. H쇄로서 CLH5, L쇄로서 실시예 2에서 얻어진 L73을 사용한 CLH5/L73을 IgG로 하여 발현·정제하였다. 발현·정제는 실시예 1에 기재한 방법으로 행하였다.
변이 개소의 조합에 의해, 더욱 높은 pH 의존성을 갖는 항체 제작을 행하였다. 파지 라이브러리에서 His가 농축된 개소, 구조 정보 등으로부터, H쇄로서 실시예 2에서 얻어진 H3pI의 H32, H58, H62, H102를 히스티딘으로 치환하고, 추가적으로 H95를 발린으로, H99를 이소류신으로 치환하여, H170(서열번호: 4)을 제작하였다. 개변체의 제작은 실시예 1에 기재한 방법으로 행하였다. 또한, L쇄로서 실시예 2에서 제작한 L73의 28번째의 히스티딘을 아스파라긴산으로 치환한 L82(서열번호: 7)를 제작하였다. 개변체의 제작은 실시예 1에 기재한 방법으로 행하였다. 실시예 1에 기재한 방법으로, H쇄로서 H170, L쇄로서 L82를 사용한 H170/L82를 IgG로 하여 발현·정제를 행하였다.
[실시예 5] pH 의존적 결합 항체의 IL-6R 중화활성 평가
IgG화한 클론의 인간 IL-6 수용체 중화활성 평가
인간화 PM1 항체(야생형: WT), 및 실시예 2, 4에서 제작한 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82의 4종류에 대해서 IL-6 수용체 중화활성을 평가하였다.
구체적으로는 IL-6/IL-6 수용체 의존성 증식을 나타내는 BaF/gp130을 사용하여, IL-6 수용체 중화활성을 평가하였다. BaF/gp130을 10% FBS를 포함하는 RPMI1640배지로 3회 세정한 후에, 5×104 cells/mL가 되도록 60 ng/mL의 human interleukin-6(TORAY), 60 ng/mL의 재조합 가용형 인간 IL-6 수용체(SR344) 및 10% FBS를 포함하는 RPMI1640배지에 현탁하고, 96 well-plate(CORNING)의 각 well에 50 μL씩 분주(分注)하였다. 다음으로, 정제한 항체를 10% FBS를 포함하는 RPMI1640에 희석하고, 각 well에 50 μL씩 혼합하였다. 37℃, 5% CO2 조건하에서, 3일간 배양하고, PBS로 2배로 희석한 WST-8 시약(Cell Counting Kit-8, 주식회사 도진화학연구소)을 20 μL/well로 첨가하고, 직후에 SUNRISE CLASSIC(TECAN)을 사용하여 450 nm의 흡광도(참조파장 620 nm)를 측정하였다. 2시간 배양한 후에, 재차 450 nm의 흡광도(참조파장 620 nm)를 측정하여, 2시간의 흡광도 변화를 지표로 IL-6 수용체 중화활성을 평가하였다. 그 결과, 도 7에 나타내는 바와 같이, 인간화 PM1 항체(야생형: WT)와 비교하여, H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82는 동등한 생물학적 중화활성을 갖는 것이 나타내어졌다.
[실시예 6] pH 의존적 결합 항체의 Biacore 해석
pH 의존적 결합 클론의 가용형 IL-6 수용체로의 결합 해석
인간화 PM1 항체(야생형: WT) 및 실시예 2, 4에서 제작한 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82의 4종류에 대해서, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 5.8과 pH 7.4에 있어서의 항원 항체반응의 속도론적 해석을 실시하였다(버퍼는 10 mM MES pH 7.4 또는 pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20). 아민 커플링법에 의해 recomb-protein A/G(Pierce)를 고정화한 센서 칩 상에 각종 항체를 결합시키고, 거기에 애널라이트로서 9.8-400 nM의 농도로 조제한 SR344를 주입하였다. pH 의존적 결합 클론의 SR344로의 결합 및 해리를 실시간으로 관측하였다(도 8 및 도 9). 측정은 모두 37℃에서 실시하였다. Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여, 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 해리상수 KD(M)를 산출하였다(표 5). 또한 각각에 대해 pH 5.8과 pH 7.4의 affinity비를 산출하고, pH 의존성 결합을 평가하였다. 측정은 모두 37℃에서 실시하였다.
각각에 대해서 pH 5.8과 pH 7.4의 affinity비를 산출한 결과, SR344에 대한 H3pI/L73, H170/L82, CLH5/L73의 pH 의존성 결합(affinity)은 각각 41배, 394배, 66배이고, 어느 클론도 WT와 비교하여 15배 이상의 높은 pH 의존적 결합을 나타내었다.
지금까지 혈장 중의 pH인 pH 7.4에 있어서는 항원에 강하게 결합하고, 엔도솜 내의 pH인 pH 5.5~pH 6.0에 있어서 항원에 약하게 결합하는 항IL-6 수용체 항체는 보고되어 있지 않다. 본 검토에 있어서, WT의 인간화 IL-6 수용체 항체와 동등한 생물학적 중화활성 및 pH 7.4에서의 affinity를 유지한 채로, pH 5.8에서의 affinity만을 특이적으로 10배 이상 저하시킨 항체가 얻어졌다.
Figure pat00005
pH 의존적 결합 클론의 막형 IL-6 수용체로의 결합 해석
제작한 상기 pH 의존적 결합 클론에 대해서, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 5.8, pH 7.4에 있어서의 막형 IL-6 수용체로의 항원 항체반응을 관측하였다. 센서 칩 상에 고정화한 IL-6 수용체로의 결합을 평가함으로써, 막형 IL-6 수용체로의 결합을 평가하였다. SR344를 당업자 공지의 방법에 따라 비오틴화하고, 스트렙트아비딘과 비오틴의 친화성을 이용하여, 스트렙트아비딘을 매개로 비오틴화 SR344를 센서 칩 상에 고정화하였다. 측정은 모두 37℃에서 실시하고, 이동상의 버퍼는 10 mM MES pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20으로 하여, 거기에 pH 의존적 결합 클론을 pH 7.4의 조건하에서 주입하여 SR344와 결합시킨 후(주입 샘플의 버퍼는 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20), 이동상의 pH인 5.8에서 각 클론의 pH 의존적인 해리를 관측하였다(도 10).
샘플농도를 0.5 ㎍/mL로 하여, 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 결합시키고, 10 mM MES pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20로 해리시켰을 때의 pH 5.8에 있어서의 해리상만 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여 피팅(fitting)함으로써, pH 5.8에 있어서의 해리속도(kd(1/s))를 산출하였다. 마찬가지로 또한, 샘플농도를 0.5 ㎍/mL로 하여, 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 결합시키고, 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20로 해리시켰을 때의 pH 7.4에 있어서의 해리상만 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여 피팅함으로써, pH 7.4에 있어서의 해리속도(kd(1/s))를 산출하였다. 각 클론의 pH 의존적인 해리속도상수를 표 6에 나타내었다.
Figure pat00006
해리도의 pH 의존성이 큰 순으로 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L8이고, 어느 클론도 WT보다도 높은 pH 의존성적인 막형 IL-6 수용체로부터의 해리를 나타내었다. 그러나, pH 의존적 결합·해리의 순위는 가용형 IL-6 수용체와 막형 IL-6 수용체가 상이하였다. 가용형 IL-6 수용체로의 결합 해석에 있어서 가장 높은 pH 의존성 결합을 나타낸 H170/L82는, 막형 IL-6 수용체로의 결합 해석에 있어서는 가장 낮은 pH 의존성 결합을 나타내는 것이 명확해졌다. 일반적으로, 가용형의 항원에 대해서 IgG 분자는 1가(affinity)로 결합하는 것에 반하여, 막형의 항원에 대해서는 2가(avidity)로 결합하는 것이 알려져 있다. 이러한 가용형 항원과 막형 항원에서는 결합양식의 차이가 H170/L82의 pH 의존적 결합에 영향을 미친 것으로 생각되었다.
[실시예 7] pH 의존적 결합 항체에 의한 항원으로의 복수회 결합의 확인
실시예 2에서 기재한 바와 같이, pH 의존적 결합 항체는 항원에 복수회 결합하는 것이 가능해진다고 생각된다. 즉, 항원이 결합한 pH 의존적 결합 항체는 비특이적으로 엔도솜 내에 삽입되나, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 가용형 항원으로부터 해리된다. 항체는 FcRn에 결합함으로써 재차 혈장 중으로 돌아가고, 혈장 중으로 돌아간 항체에는 항원이 결합하고 있지 않은 것으로부터, 재차 새로운 항원에 결합하는 것이 가능하다. 이를 반복함으로써, pH 의존적 결합 항체는 항원에 복수회 결합하는 것이 가능하다. 그러나 pH 의존적 결합을 갖지 않는 IgG 항체는, 엔도솜의 산성 조건하에서 모든 항원이 항체로부터 해리되는 경우는 없기 때문에, FcRn에 의해 혈장 중으로 돌아간 항체는 항원을 결합한 채이기 때문에, 재차 새로운 항원에 결합하는 것은 불가능하다. 그 때문에, 대부분의 경우 1분자의 IgG 항체는 2개의 항원밖에 중화할 수 없다(2가로 결합한 경우).
이에, 실시예 2, 4에서 제작한 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82의 3종류의 pH 의존적 결합 항체가, 인간화 PM1 항체(야생형: WT)와 비교하여, 항원인 SR344에 복수회 결합하는 것이 가능해져 있는지 여부의 평가를 행하였다.
pH 7.4에서 결합하고, pH 5.8에서 해리됨으로써 항원에 복수회 결합 가능한 것을 Biacore(GE Healthcare)에 의해 평가하였다. 아민 커플링법에 의해 recomb-protein A/G(Pierce)를 고정화한 센서 칩에 대해 평가할 항체를 결합시키고, pH 7.4의 이동상을 흘렸다(공정 1). pH 7.4로 조정한 SR344용액을 애널라이트로서 흘리고, pH 7.4에서 항체에 SR344를 결합시켰다(공정 2). 이 pH 7.4에서의 결합은 혈장 중에서의 항원으로의 결합을 모방하고 있다. 그 후, pH 5.8로 조정한 버퍼만(SR344를 함유하지 않는 용액)을 애널라이트로서 흘려 항체에 결합한 항원을 산성 조건하에 폭로시켰다(공정 3). 이 pH 5.8에서의 해리는 엔도솜 내에서의 항체 항원 복합체의 결합상태를 모방하고 있다. 그 후, 재차 공정 2를 행하였다. 이는 FcRn에 의해 혈장 중으로 돌아간 항체가 재차 새로운 항원에 결합하는 것을 모방하고 있다. 그 후, 재차 공정 2를 행하여, 항체 항원 복합체를 산성 조건하에 폭로시켰다. 이와 같이 "공정 2→공정 3"을 37℃에서 복수회 반복함으로써, 항체가 혈장 중으로부터 피노사이토시스에 의해 엔도솜 내에 삽입되어 FcRn에 의해 혈장 중으로 돌아가는 것을 반복하고 있는(Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):715-25) 생체내의 상태를 모방하는 것이 가능하다.
제작한 상기 pH 의존적 결합 클론에 대해서, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 5.8, pH 7.4에 있어서의 항원인 SR344에 대한 복수회 결합능을 해석하였다. 구체적으로는 이하와 같이 행하였다. 측정은 모두 37℃에서 실시하고, 먼저 아민 커플링법에 의해 recomb-protein A/G(Pierce)를 고정화한 센서 칩 상에, 이동상의 버퍼는 10 mM MES pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 하여, 전술한 샘플이 되는 항체를 결합시켰다(공정 1). 거기에 애널라이트로서 약 40 nM의 농도로 조제한 SR344를 pH 7.4의 조건하에서 3분간 주입하여(주입 SR344의 버퍼는 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20) 결합시켰다(공정 2). 그 후, SR344의 주입을 정지하고 pH 5.8의 이동상을 약 70초간 흘림으로써 항체/SR344 복합체를 산성 조건하에 폭로하였다(공정 3). 이 결합(공정 2) 및 산성 폭로(공정 3)를 1세트로 하여, 이를 연속적으로 10세트 반복해서 행하고, 그 센서그램을 실시간으로 관측하여 도 11에 나타내었다. WT는 공정 3의 산성 폭로시의 SR344의 해리가 적기 때문에, 다음의 공정 2에서 새롭게 항원에 결합 가능한 항체의 비율은 매우 적다. 그것에 반하여, pH 의존적 결합 클론, 그 중에서도 특히 H170/L82와 CLH5/L73은 공정 3의 산성 폭로시의 해리가 매우 커서, 결합하고 있는 SR344의 대부분이 해리되는 것으로부터, 다음의 공정 2에서 대부분의 항체가 새로운 항원에 결합 가능한 것을 알 수 있었다. H170/L82와 CLH5/L73은 결합(공정 2)과 산성 폭로(공정 3)를 10세트 반복해도, 매 세트 대부분의 항체가 새로운 항원에 결합 가능한 것을 알 수 있었다.
얻어진 센서그램을 사용하고, Biacore T100 Evaluation Software(Biacore)를 사용하여, 각 샘플의 1세트 마다의 SR344 결합량을 산출해, 10세트의 경시적인 적산치를 도 12에 나타내었다. 10세트째에서 얻어진 적산 RU값이 10회의 사이클 중에서 결합한 총항원량에 상당한다. WT와 비교하여, pH 의존적 결합 클론, 그 중에서도 특히 H170/L82와 CLH5/L73은, 결합한 총항원량이 가장 많아, WT와 비교하여 4배량 정도의 항원에 반복해서 결합하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 이것으로부터, WT에 대해 pH 의존적인 결합을 부여함으로써, 반복해서 항원에 결합하여, 복수의 항원을 중화하는 것이 가능해지는 것이 명확해졌다.
[실시예 8] pH 의존적 결합 항체의 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스에 의한 PK/PD 시험
IL-6 수용체는 생체내에 가용형 IL-6 수용체 및 막형 IL-6 수용체의 양쪽 형태로 존재한다(Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26). 항IL-6 수용체 항체는 가용형 IL-6 수용체 및 막형 IL-6 수용체 양쪽에 결합하여 그들의 생물학적인 작용을 중화한다. 항IL-6 수용체 항체는 막형 IL-6 수용체에 결합 후, 막형 IL-6 수용체에 결합한 채로 인터날리제이션에 의해 세포내의 엔도솜에 삽입되고, 그 후, 항IL-6 수용체 항체는 막형 IL-6 수용체에 결합한 채로 리소좀으로 이행하여 함께 리소좀에 의해 분해되는 것으로 생각되고 있다. 실시예 6에서 평가한 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체인 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82가, 엔도솜 내의 산성 조건하에서 해리됨으로써 FcRn을 매개로 혈장 중으로 돌아가는 것이 가능하다면, 혈장 중으로 돌아간 항체는 재차 항원에 결합하는 것이 가능해져, 항체 1분자로 복수의 막형 IL-6 수용체를 중화하는 것이 가능해진다. 엔도솜 내의 산성 조건하에서 해리됨으로써 FcRn을 매개로 혈장 중으로 돌아가는 것이 제작한 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체로 달성되었는지 여부는, 이들 항체의 약물동태가 WT와 비교하여 개선되어 있는지 여부를 평가함으로써 가능하다.
이에, 인간화 PM1 항체(야생형: WT), 및 실시예 2, 4에서 제작한 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82의 4종류에 대해서, 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스(hIL-6R tg 마우스, Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23;92(11):4862-6)에 있어서의 약물동태를 평가하였다. WT 및 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82를 hIL-6R tg 마우스에 25 ㎎/㎏으로 정맥내에 단회 투여하고, 투여 전 및 경시적으로 채혈하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다.
마우스 혈장 중 농도측정은 ELISA법으로 측정하였다. 혈장 중 농도로서 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 ㎍/mL의 검량선 시료를 조제하였다. 검량선 시료 및 마우스 혈장 측정시료를 Anti-human IgG(γ-chain specific) F(ab')2(Sigma사제)로 고상화한 이뮤노플레이트(Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp(Nalge nunc International사제))에 분주하고, 실온에서 1시간 정치 후, Goat Anti-Human IgG-BIOT(Southern Biotechnology Associates사제) 및 Streptavidin-alkaline phosphatase conjugate(Roche Diagnostics사제)를 순차 반응시키고, BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories사제)을 기질로서 사용하여 발색반응을 행하여, 마이크로플레이트 리더로 650 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices사제)를 사용해서 산출하였다. WT 및 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82의 혈장 중 농도 추이를 도 13에 나타내었다.
WT와 비교하여 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82 모두 약물동태가 개선되었다. 그 중에서도 H3pI/L73 및 CLH5/L73은 약물동태가 대폭 개선되었다. 막형 IL-6 수용체에 결합한 천연형 항IL-6 수용체 항체(WT)는 인터날리제이션에 의해 세포내의 엔도솜에 삽입되고, 항원에 결합한 채로 리소좀으로 이행하여 분해되기 때문에 혈장 중 체류성이 짧다. 그에 반하여 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체에 있어서 약물동태가 대폭 개선된 것으로부터, pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체는 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원인 막형 IL-6 수용체로부터 해리됨으로써 FcRn을 매개로 재차 혈장 중으로 돌아가고 있는 것으로 생각되었다.
WT와 비교하여 H3pI/L73, CLH5/L73, H170/L82 모두 약물동태가 개선되었으나, H170/L82의 혈장 중 체류성 연장효과가 H3pI/L73, CLH5/L73과 비교하여 작았다. 통상 IgG 분자는 막형 항원에는 2가로 결합하는 것으로 생각되는 것으로부터, 항IL-6 수용체 항체도 막형 IL-6 수용체에는 2가(avidity)로 결합하고 그 후 인터날라이즈되는 것으로 생각된다. 실시예 6에서 나타낸 바와 같이, Biacore에 의한 해석에 있어서 H170/L82는, 가용형 IL-6 수용체로의 결합시에는 pH 5.8에 있어서 신속하게 IL-6 수용체로부터 해리되나(도 9), 막형 IL-6 수용체로의 결합시에는 pH 5.8에 있어서 IL-6 수용체로부터의 해리속도가 매우 느린(도 10) 것을 알 수 있다. 이것으로부터 H170/L82의 혈장 중 체류성 연장효과가 작았던 것은, 막형 IL-6 수용체로의 결합시의 pH 5.8에서의 해리가 느렸기 때문에, 인터날라이즈된 후에 엔도솜 내에서 충분히 해리되는 것이 불가능했기 때문이라 생각된다. 즉, 막형 항원에 대해, 하나의 IgG 분자가 복수의 막형 항원을 중화하기 위해서는, 1가로의 결합(affinity)에서의 pHP 의존성보다도, 2가로의 결합(avidity)으로부터의 해리의 pH 의존성 쪽이 중요한 것을 알 수 있었다.
[실시예 9] pH 의존적 결합 항체의 게잡이원숭이에 의한 PK/PD 시험
실시예 8에 있어서, pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체에 있어서 약물동태가 대폭 개선된 것으로부터, pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체는 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원인 막형 IL-6 수용체로부터 해리됨으로써 FcRn을 매개로 재차 혈장 중으로 돌아가고 있느 것으로 생각되었다. 재차 혈장 중으로 돌아간 항체가 재차 막형 IL-6 수용체에 결합할 수 있다면, 천연형 항IL-6 수용체 항체와 비교하여, pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체는 동일한 투여량으로 보다 오래 항원인 막형 IL-6 수용체의 중화가 지속될 것으로 생각된다. 또한, IL-6 수용체에는 가용형 IL-6 수용체도 존재하는 것으로부터, 가용형 IL-6 수용체의 중화에 관해서도, 동일한 투여량으로 보다 오래 중화가 지속되는 것이 생각된다.
WT 및 H3pI/L73에 대해서, 게잡이원숭이에 있어서의 약물동태를 평가하였다. WT 및 H3pI/L73을 게잡이원숭이에 1 ㎎/㎏으로 정맥내에 단회 투여하고, 투여 전 및 경시적으로 채혈하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다.
게잡이원숭이 혈장 중 농도측정은 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA사제)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International사제)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 Anti-Human IgG 고상화 플레이트를 제작하였다. 혈장 중 농도로서 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05 ㎍/mL의 검량선 시료와 100배 이상 희석한 게잡이원숭이 혈장 측정시료를 조제하고, 이들 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL에 20 ng/mL의 게잡이원숭이 IL-6R을 200 μL 첨가하여, 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후, Anti-Human IgG 고상화 플레이트에 분주하고 추가적으로 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후, Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D사제)를 실온에서 1시간 반응시키고, 추가적으로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies사제)을 실온에서 1시간 반응시키며, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories사제)를 기질로서 사용해 발색반응을 행하여, 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical사제)로 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 게잡이원숭이 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices사제)를 사용해서 산출하였다. WT 및 H3pI/L73의 정맥내 투여 후의 혈장 중 농도 추이를 도 14에 나타내었다. 그 결과, 게잡이원숭이에 있어서도 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스와 마찬가지로, WT와 비교하여 H3pI/L73은 대폭 약물동태가 개선되었다. pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체인 H3pI/L73에 있어서 약물동태가 대폭 개선된 것으로부터, H3pI/L73은 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원인 막형 IL-6 수용체로부터 해리됨으로써 FcRn을 매개로 재차 혈장 중으로 돌아가고 있는 것으로 생각되었다.
WT 및 H3pI/L73의 정맥내 투여에 의해, 게잡이원숭이 막형 IL-6 수용체가 어느 정도 중화되어 있는지를 평가하기 위해, 게잡이원숭이 IL-6에서 유도한 혈장 C 반응성 단백(CRP)으로의 검체의 영향을 검토하였다. IL-6가 막형 IL-6 수용체에 결합하면 CRP가 분비되기 때문에, CRP는 막형 IL-6 수용체의 중화의 지표가 된다. WT 및 H3pI/L73 투여 후 3일째(day 3)부터 10일째(day 10)까지, 1% 비동화 게잡이원숭이 혈장 함유 게잡이원숭이 IL-6(실시예 1에서 제작한 cyno. IL-6) 5 ㎍/㎏을 요배부(腰背部)에 연일 피하투여하였다. 게잡이원숭이 IL-6 투여개시 직전(day 3)부터 투여 후 24시간 간격(day 4~day 11)으로 복재정맥으로부터 혈액을 채취하여, 혈장으로 분리하였다. 각 개체의 CRP 농도는 사이아스 CRP(간토화학주식회사)로, 자동분석장치(TBA-120FR, 도시바 메디컬시스템즈주식회사)를 사용해서 측정하였다. WT 및 H3pI/L73의 게잡이원숭이 IL-6에서 유도시의 CRP 농도 추이를 도 15에 나타내었다. 그 결과, WT와 비교하여 H3pI/L73은 CRP 억제의 기간이 대폭 연장되었다. 이 사실로부터, pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체인 H3pI/L73은 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원인 막형 IL-6 수용체로부터 해리됨으로써 FcRn을 매개로 재차 혈장 중으로 돌아가, 재차 막형 IL-6 수용체에 결합하여 중화함으로써 WT보다도 장시간 CRP의 생산을 억제하고 있는 것으로 생각되었다. 즉 H3pI/L73은 항체 1분자로 복수회, 막형 IL-6 수용체에 결합하여 중화하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. H3pI/L73은 WT와 비교하여, CRP의 생산을 억제하고 있는 시간이 연장되어 있는 것으로부터, H3pI/L73은 WT보다도 항원인 막형 IL-6 수용체가 항체에 의해 결합하고 있는 시간이 연장되어 있는 것이 나타내어졌다.
WT 및 H3pI/L73의 정맥내 투여에 의해, 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체가 어느 정도 중화되어 있는지를 평가하기 위해, 게잡이원숭이 혈장 중의 비결합형의 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체 농도를 측정하였다. 게잡이원숭이의 혈장 30 μL를 0.22 ㎛의 필터 컵(Millipore)에 있어서 건조시킨 적량의 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare) 수지에 첨가함으로써 혈장 중에 존재하는 모든 IgG형 항체(게잡이원숭이 IgG, 항인간 IL-6 수용체 항체 및 항인간 IL-6 수용체 항체-게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체 복합체)를 Protein A에 흡착시켰다. 그 후, 고속원심기로 스핀 다운하여, 통과한 용액(이하, 「패스용액」)을 회수하였다. 패스용액에는 protein A에 결합한 항인간 IL-6 수용체 항체-게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체 복합체는 포함되지 않기 때문에, protein A 패스용액 중의 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체 농도를 측정함으로써, 비결합형의 가용형 IL-6 수용체 농도를 측정 가능하다. 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 pg/mL로 조제한 게잡이원숭이 IL-6 수용체 검량선 시료 및 전술한 Protein A 처리한 혈장 샘플에 SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery사제)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D사제)와 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D사제)를 혼합하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 SA coated standard MA2400 96well plate(Meso Scale Discovery사제)에 분주하였다. 추가적으로 실온에서 1시간 반응시켜 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery사제)를 분주하고, 바로 SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery사제)으로 측정을 행하였다. 게잡이원숭이 IL-6 수용체 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices사제)를 사용해서 산출하였다. WT 및 H3pI/L73의 비결합형의 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체 농도 추이를 도 16에 나타내었다. 그 결과, WT와 비교하여 H3pI/L73은 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체의 중화기간이 대폭 연장되었다. 이 사실로부터, pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체인 H3pI/L73은 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원인 가용형 IL-6 수용체로부터 해리되어, FcRn을 매개로 재차 혈장 중으로 돌아가고, 재차 가용형 IL-6 수용체에 결합하여 중화하고 있는 것으로 생각되었다. H3pI/L73은 WT와 비교하여, 비결합형의 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체를 억제하고 있는 시간이 연장되어 있는 것으로부터, H3pI/L73은 WT보다도 항원인 가용형 IL-6 수용체가 항체에 의해 결합하고 있는 시간이 연장되어 있는 것이 나타내어졌다.
이들 사실로부터, 야생형 항IL-6 수용체 항체에 대해, 혈장 중의 pH인 pH 7.4에 있어서 강하게 항원에 결합하고, 엔도솜 내의 pH인 pH 5.8에 있어서 항원으로의 결합을 약하게 한 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체는, 항체가 혈장 중으로부터 소실될 때까지의 시간, 및 생체내의 가용형 IL-6 수용체 및 막형 IL-6 수용체가 항체에 의해 결합하고 있는 시간이 대폭 연장되는 것이 발견되었다. 이것에 의해, 환자로의 투여량이나 투여빈도를 줄이는 것이 가능하여, 결과적으로 총투여량을 줄이는 것이 가능해지기 때문에, pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체는, IL-6 안타고니스트로서의 의약품으로서 특히 우수하다고 생각된다.
[실시예 10] 가변영역의 최적화에 따른 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합의 향상
가변영역 H3pI/L73 및 CLH5/L82의 최적화
실시에 9에 있어서, pH 의존적 결합능을 갖는 항체가 우수한 효과를 발휘하는 것이 나타내어진 것으로부터, 추가적으로 pH 의존적 결합능을 향상시키기 위해, 실시예 3에서 얻어진 CLH5의 CDR 서열에 변이를 도입하여, VH1-IgG1(서열번호: 21), VH2-IgG1(서열번호: 22)을 제작하였다. 또한, H3pI의 프레임워크 서열과 CDR 서열에 변이를 도입하여, 개변 H쇄로서 VH3-IgG1(서열번호: 23), VH4-IgG1(서열번호: 24)을 제작하였다. L73, L82의 CDR 서열에 변이를 도입하여, 개변 L쇄로서 VL1-CK(서열번호: 25), VL2-CK(서열번호: 26), VL3-CK(서열번호: 27)를 제작하였다. 구체적으로는, QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여, 첨부 설명서 기재의 방법으로 변이체를 제작하고, 얻어진 플라스미드 단편을 포유동물세포 발현 벡터에 삽입하여, 목적의 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다.
H쇄로서 VH2-IgG1(서열번호: 22), L쇄로서 VL2-CK(서열번호: 26)를 사용한 것을 Fv1-IgG1, H쇄로서 VH1-IgG1(서열번호: 21), L쇄로서 L82를 사용한 것을 Fv2-IgG1, H쇄로서 VH4-IgG1(서열번호: 24), L쇄로서 VL1-CK(서열번호: 25)를 사용한 것을 Fv3-IgG1, H쇄로서 VH3-IgG1(서열번호: 23), L쇄로서 VL3-CK(서열번호: 27)를 사용한 것을 Fv4-IgG1으로 하였다. 이들 중 Fv2-IgG1과 Fv4-IgG1의 발현·정제를 행하였다. 발현·정제는 실시예 1에 기재한 방법으로 행하였다.
pH 의존적 결합 클론의 가용형 IL-6 수용체로의 결합 해석
인간화 PM1 항체(야생형: WT), 및 실시예 2 및 10에서 제작한 WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1의 4종류에 대해서, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 7.4에 있어서의 항원 항체반응의 속도론적 해석을 실시하였다(버퍼는 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20). 아민 커플링법으로 anti-IgG γchain specific F(ab)2(Pierce)를 고정화한 센서 칩 상에 각종 항체를 결합시키고, 거기에 애널라이트로서 9.8-40 nM의 농도로 조제한 SR344를 주입하였다. pH 의존적 결합 클론의 SR344로의 결합 및 해리를 실시간으로 관측하였다. 측정은 모두 37℃에서 실시하였다. Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여, 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 해리상수 KD(M)를 산출하였다(표 7).
Figure pat00007
각각에 대해서 pH 7.4의 affinity를 산출한 결과, SR344에 대한 WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1의 해리상수(affinity, KD값)는 각각 2.7 nM, 1.4 nM, 2.0 nM, 1.4 nM으로 거의 동등한 값으로, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1은 가용형 IL-6 수용체로의 결합능은 WT와 동등 이상인 것이 나타내어졌다.
pH 의존적 결합 클론의 막형 IL-6 수용체로의 결합 해석
제작한 WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1의 4종류에 대해서, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 5.8, pH 7.4에 있어서의 막형 IL-6 수용체로의 항원 항체반응을 관측하였다. 센서 칩 상에 고정화한 IL-6 수용체로의 결합을 평가함으로써, 막형 IL-6 수용체로의 결합을 평가하였다. SR344를 당업자 공지의 방법에 따라 비오틴화하고, 스트렙트아비딘과 비오틴의 친화성을 이용하여, 스트렙트아비딘을 매개로 비오틴화 SR344를 센서 칩 상에 고정화하였다. 측정은 모두 37℃에서 실시하고, 이동상의 버퍼는 10 mM MES pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 하고, 거기에 pH 의존적 결합 클론을 pH 7.4의 조건하에서 주입하여 SR344와 결합시킨 후(주입 샘플의 버퍼는 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20), 이동상의 pH인 5.8에서 각 클론의 pH 의존적인 해리를 관측하였다(도 17).
샘플농도를 0.25 ㎍/mL로 하여, 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 결합시키고, 10 mM MES pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 해리시켰을 때의 pH 5.8에 있어서의 해리상만 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여 피팅함으로써, pH 5.8에 있어서의 해리속도상수(kd(1/s))를 산출하였다. 마찬가지로 또한, 샘플농도를 0.25 ㎍/mL로 하여, 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 결합시키고, 10 mM MES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20으로 해리시켰을 때의 pH 7.4에 있어서의 해리상만 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여 피팅함으로써, pH 7.4에 있어서의 해리속도상수(kd(1/s))를 산출하였다. 각 클론의 pH 의존적인 해리속도상수를 표 8에 나타내었다.
Figure pat00008
각각에 대해서 pH 의존성을 산출한 결과 SR344에 대한 WT, H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1의 4종류의 막형 IL-6 수용체로의 결합의 pH 의존성은 각각 1.0배, 2.59배, 7.18배, 5.56배로, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1은, H3pI/L73-IgG1보다 높은 pH 의존적인 막형 IL-6 수용체로부터의 해리를 나타내었다.
이상으로부터, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1은 WT와 동등 이상의 가용형 IL-6 수용체로의 affinity를 유지한 채로 H3pI/L73-IgG1보다 강한 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합을 나타내는 것이 명확해졌다.
[실시예 11] 가변영역을 최적화한 pH 의존적 결합 항체의 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스에 의한 PK/PD 시험
실시예 8에서 사용한 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스를 사용하여, 실시예 10에서 제작·평가한 Fv2-IgG1과 Fv4-IgG1 및 WT과 H3pI/L73-IgG1의 약물동태를 평가하였다. WT 및 H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1을 hIL-6R tg 마우스에 25 ㎎/㎏으로 정맥내에 단회 투여하고, 실시예 8과 동일하게 각 항체의 혈장 중 농도의 측정을 행하였다. WT 및 H3pI/L73-IgG1, Fv2-IgG1, Fv4-IgG1의 혈장 중 농도 추이를 도 18에 나타내었다.
실시예 8과 마찬가지로, WT와 비교하여 H3pI/L73-IgG1의 약물동태는 향상되어 있고, 또한 Fv2-IgG1 및 Fv4-IgG1은 H3pI/L73-IgG1보다도 추가적으로 약물동태가 향상되었다. 실시예 9에 있어서 게잡이원숭이에서 측정한 비결합형 IL-6 수용체 농도에 관해서도 동일한 방법으로 본 시험의 hIL-6R tg 마우스에 있어서 측정한 바, Fv2-IgG1 및 Fv4-IgG1은 H3pI/L73-IgG1보다도 가용형 IL-6 수용체의 중화기간의 연장이 확인되었다(data not shown). 실시예 10에서 나타낸 바와 같이, Fv2-IgG1 및 Fv4-IgG1은 H3pI/L73-IgG1과 비교하여 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합이 향상되어 있는 것으로부터, 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합을 향상시킴으로써, H3pI/L73-IgG1보다 추가적으로 약물동태 및 가용형 IL-6 수용체의 중화기간을 향상시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다.
[실시예 12] 정상영역의 최적화에 따른 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합의 향상
Fv4-IgG1의 정상영역의 최적화
일반적으로 막형 항원에 대한 결합은 항체의 정상영역에 의해 변화되는 것이 보고되어 있다(J Immunol Methods. 1997 Jun 23;205(1):67-72.). 지금까지 제작한 pH 의존적 결합 항체의 정상영역은 IgG1 아이소타입이었다. 이에 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합을 향상시키기 위해 정상영역의 최적화를 검토하였다.
천연형의 정상영역으로서 정상영역 IgG2(서열번호: 28)에 변이를 도입하여, 정상영역 IgG2ΔGK(서열번호: 29)를 제작하였다. 정상영역 IgG2ΔGK에 대해 추가적으로 변이를 도입하여, 정상영역 M58(서열번호: 30)을 제작하였다. 정상영역 IgG2 및 정상영역 M58에 대해 추가적으로 변이를 도입하여, 정상영역 M71(서열번호: 31) 및 M73(서열번호: 32)을 제작하였다.
실시예 10에서 제작한 VH3-IgG1의 정상영역을 IgG2ΔGK로 치환한 VH3-IgG2ΔGK(서열번호: 33), 정상영역을 M58로 치환한 VH3-M58(서열번호: 34), 정상영역을 M73으로 치환한 VH3-M73(서열번호: 35)을 제작하였다. 구체적으로는, 실시예 10에서 사용하고 있는 VH3의 정상영역부분을 NheI/NotI 소화와 결찰(ligation)에 의해 목적의 정상영역으로 치환한 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다.
H쇄로서 VH3-IgG2ΔGK(서열번호: 33), L쇄로서 VL3-CK(서열번호: 27)를 사용한 Fv4-IgG2, H쇄로서 VH3-M58(서열번호: 34), L쇄로서 VL3-CK(서열번호: 27)를 사용한 Fv4-M58, H쇄로서 VH3-M73(서열번호: 35), L쇄로서 VL3-CK(서열번호: 27)를 사용한 Fv4-M73의 발현·정제를 행하였다. 발현·정제는 실시예 1에 기재한 방법으로 행하였다.
정상영역을 최적화한 Fv4의 가용형 IL-6 수용체로의 결합 해석
제작한 Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58, Fv4-M73 및 WT에 관하여, 실시예 10과 동일한 방법으로 SR344로의 결합 및 해리를 실시간으로 관측하였다. 동일하게 해석을 행하여, 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 해리상수 KD(M)를 산출하였다(표 9).
Figure pat00009
각각에 대해 pH 7.4의 affinity를 산출한 결과, SR344에 대한 Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58, Fv4-M73의 해리상수(affinity, KD값)는 각각 1.4 nM, 1.3 nM, 1.4 nM, 1.4 nM으로 거의 동등한 값으로, SR344에 대한 pH 의존적 결합 클론의 가용형 IL-6 수용체로의 결합능은 정상영역을 개변해도 변화하지 않는 것이 나타내어졌다. 이 사실로부터, Fv1, Fv2, Fv3에 대해서도 마찬가지로 정상영역을 개변해도 가용형 IL-6 수용체로의 결합능은 변화하지 않는 것으로 생각되었다.
정상영역을 최적화한 Fv4의 막형 IL-6 수용체로의 결합 해석
제작한 Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58, Fv4-M73 및 WT에 관하여, 실시예 10과 동일한 방법으로 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 5.8, pH 7.4에 있어서의 막형 IL-6 수용체로의 항원 항체반응을 관측하였다. pH 의존적 결합 클론을 pH 7.4의 조건하에서 주입하여 SR344와 결합시킨 후에, pH 5.8의 이동상에서 각 클론의 pH 의존적인 해리를 관측한 결과를 도 19에 나타낸다. 또한 실시예 10과 동일한 방법으로 해석을 행하여, 각 클론의 pH 의존적인 해리속도를 표 10에 나타내었다.
Figure pat00010
각각에 대해서 pH 의존성을 산출한 결과 SR344에 대한 Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58, Fv4-M73의 pH 의존성은 각각 5.6배, 17.0배, 17.6배, 10.1배로, Fv4-IgG2, Fv4-M58, Fv4-M73 모두 Fv4-IgG1보다 높은 pH 의존성적인 막형 IL-6 수용체로부터의 해리를 나타내었다.
Fv4의 가변영역을 사용한 가용형 IL-6 수용체로의 결합 해석결과 및 막형 IL-6 수용체로의 결합 해석결과로부터, 정상영역을 IgG1에서 IgG2, M58 및 M73으로 치환함으로써 가용형 IL-6 수용체로의 affinity를 변화시키지 않고, 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합만을 개선 가능한 것이 발견되었다. 또한, Fv1, Fv2, Fv3에 대해서도 동일하다고 생각되었다.
[실시예 13] 정상영역을 최적화한 pH 의존적 결합 항체의 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스에 의한 PK/PD 시험
실시예 8에서 사용한 인간 IL-6 수용체 형질전환 마우스(hIL-6R tg 마우스)를 사용하여, 실시예 13에서 제작한 Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58의 약물동태를 평가해, 정상영역이 미치는 약물동태로의 영향을 검토하였다. WT 및 Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58을 hIL-6R tg 마우스에 25 ㎎/㎏으로 정맥내에 단회 투여하고, 실시예 8과 동일하게 각 항체의 혈장 중 농도의 측정을 행하였다. WT 및 Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58의 혈장 중 농도 추이를 도 20에 나타내었다.
실시예 11과 마찬가지로, WT와 비교하여 Fv4-IgG1의 약물동태는 향상되어 있고, 또한 Fv4-IgG2, Fv4-M58은 Fv4-IgG1보다도 약물동태는 향상되었다. 실시예 9에 있어서 게잡이원숭이에서 측정한 비결합형 IL-6 수용체 농도에 관해서도 동일한 방법으로 본 시험의 hIL-6R tg 마우스에 있어서 측정한 바, Fv4-IgG2, Fv4-M58은 Fv4-IgG1보다도 가용형 IL-6 수용체의 중화기간의 연장이 확인되었다(data not shown). 실시예 10에서 나타낸 바와 같이, Fv4-IgG2, Fv4-M58은 Fv4-IgG1과 비교하여 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합이 향상되고 있는 것으로부터, 정상영역을 IgG1에서 IgG2 또는 M58로 치환함으로써 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합을 향상시켜, 약물동태 및 가용형 IL-6 수용체의 중화기간을 향상시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 이것으로부터, Fv4 뿐 아니라 Fv1, Fv2, Fv3에 있어서도, 정상영역을 IgG1에서 IgG2 또는 M58로 치환함으로써, IgG1 보다도 약물동태 및 가용형 IL-6 수용체의 중화기간이 향상되는 것으로 생각되었다.
[실시예 14] 가변영역 및 정상영역을 최적화한 pH 의존적 결합 항체의 제작
지금까지와 동일한 방법을 사용하여, VH2-IgG1의 정상영역을 M71, M73으로 한 VH2-M71(서열번호: 36), VH2-M73(서열번호: 37), VH4-IgG1의 정상영역을 M71, M73으로 한 VH4-M71(서열번호: 38), VH4-M73(서열번호: 39)을 제작하였다.
H쇄로서 VH2-M71, L쇄로서 VL2-CK를 사용한 Fv1-M71, H쇄로서 VH2-M73, L쇄로서 VL2-CK를 사용한 Fv1-M73, H쇄로서 VH4-M71, L쇄로서 VL1-CK를 사용한 Fv3-M71, H쇄로서 VH4-M73, L쇄로서 VL1-CK를 사용한 Fv3-M73의 발현·정제를 행하였다. 발현·정제는 실시예 1에 기재한 방법으로 행하였다.
가변영역 및 정상영역을 최적화한 pH 의존적 결합 항체의 가용형 IL-6 수용체로의 결합 해석
인간화 PM1 항체(야생형: WT), 및 지금까지 제작한 H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M71, Fv3-M73, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58, Fv4-M73의 11종류에 대해서, 실시예 10과 동일한 방법으로 SR344로의 결합 및 해리를 실시간으로 관측하였다. 동일하게 해석을 행하여, 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 해리상수 KD(M)를 산출하였다(표 11).
Figure pat00011
얻어진 10종류의 pH 의존적 결합 클론은 모두 가용형 IL-6 수용체에 대해, WT와 비교하여 동등 이상의 해리상수(affinity, KD값)를 가지고 있는 것이 발견되었다.
가변영역 및 정상영역을 최적화한 pH 의존적 결합 항체의 막형 IL-6 수용체로의 결합 해석
인간화 PM1 항체(야생형: WT), 및 지금까지 제작한 H3pI/L73-IgG1, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M71, Fv3-M73, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58, Fv4-M73의 11종류에 대해서, 실시예 10과 동일한 방법으로 Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 5.8, pH 7.4에 있어서의 막형 IL-6 수용체로의 항원 항체반응을 관측하였다. pH 의존적 결합 클론을 pH 7.4의 조건하에서 주입하여 SR344와 결합시킨 후에, 이동상의 pH인 5.8에서 각 클론의 pH 의존적인 해리를 관측한 결과를 도 21에 나타내었다(Fv1-M71, Fv1-M73, Fv3-M71, Fv3-M73에 대해서는 도 21, 다른 것은 도 17 및 19에 나타내었다). 또한 실시예 10과 동일한 방법으로 해석을 행하여, 전 11종류의 클론에 대해서, 해리속도상수의 pH 의존성을 표 12에 나타내었다.
Figure pat00012
얻어진 10종류의 pH 의존적 결합 클론은 막형 IL-6 수용체에 대해 pH 의존적인 결합능을 나타내었다. 또한 실시예 9에 있어서 게잡이원숭이에 있어서 WT와 비교하여 항체가 혈장 중으로부터 소실될 때까지의 시간, 및 생체내의 가용형 IL-6 수용체 및 막형 IL-6 수용체가 항체에 의해 결합하고 있는 시간이 대폭 연장되는 것이 발견된 H3pI/L73-IgG1과 비교하여, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M71, Fv3-M73, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58, Fv4-M73 모두 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합이 향상되어 있는 것이 발견되었다.
[실시예 15] 가변영역과 정상영역을 최적화한 pH 의존적 결합 항체의 게잡이원수이에 의한 PK/PD 시험
공지의 고친화성 항IL-6 수용체 항체의 제작
공지의 고친화성 항IL-6 항체로서, US 2007/0280945 A1에 기재되어 있는 고친화성 항IL-6 수용체 항체인 VQ8F11-21 hIgG1(US 2007/0280945 A1, 아미노산 서열 19 및 27)을 발현시키기 위해, 동물세포 발현용 벡터를 구축하였다. 항체 가변영역에 대해서는, 합성 올리고 DNA를 조합한 PCR법(assembly PCR)에 의해 제작하였다. 정상영역에 대해서는, 실시예 1에서 사용한 발현 벡터로부터 PCR법에 의해 증폭하였다. Assembly PCR법에 의해 항체 가변영역과 정상영역을 결합시키고, 포유동물 발현용 벡터에 삽입하였다. 얻어진 H쇄 및 L쇄 DNA 단편을 포유동물 세포 발현 벡터에 삽입하여, 목적의 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 제작한 발현 벡터를 사용하여, 발현·정제를 행하였다. 발현·정제는 실시예 1에 기재한 방법으로 행하여, 고친화성 항IL-6 수용체 항체(high affinity Ab)를 얻었다.
게잡이원숭이에 의한 PK/PD 시험
pH 의존적 결합 항체인 H3pI/L73-IgG1 및 Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73, Fv4-M73 및 공지의 고친화성 항IL-6 수용체 항체(high affinity Ab)의 게잡이원숭이에 있어서의 약물동태 및 약효를 평가하였다. H3pI/L73-IgG1 및 Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73, Fv4-M73을 게잡이원숭이에 0.5 ㎎/㎏으로 정맥내에 단회 투여하고, 또한 high affinity Ab는 1.0 ㎎/㎏으로 정맥내 단회 투여하여, 투여 전 및 경시적으로 채혈하였다. 실시예 9와 동일하게 각 항체의 혈장 중 농도의 측정을 행하였다. H3pI/L73-IgG1 및 Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73, Fv4-M73, high affinity Ab의 혈장 중 농도 추이를 도 21에 나타내었다. 게잡이원숭이 막형 IL-6 수용체가 어느 정도 중화되어 있는지의 약효를 평가하기 위해, 실시예 9와 동일하게, 항체 투여 후 3일째부터 10일째(high affinity Ab에 관해서는 6일째부터 10일째)까지 게잡이원숭이 IL-6 5 ㎍/㎏을 요배부에 연일 피하투여하고, 24시간 후의 각 개체의 CRP 농도를 측정하였다. 각 항체 투여시의 CRP 농도 추이를 도 22에 나타내었다. 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체가 어느 정도 중화되어 있는지의 약효를 평가하기 위해, 실시예 9와 동일하게, 게잡이원숭이 혈장 중의 비결합형의 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체 농도를 측정하였다. 각 항체 투여시의 비결합형의 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체 농도 추이를 도 23에 나타내었다.
이것으로부터, H3pI/L73-IgG1과 비교하여, Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M73, Fv4-M73은 모두 항체 혈장 중 농도가 높게 유지되고, CRP 농도 및 비결합형의 게잡이원숭이 가용형 IL-6 수용체 농도가 낮게 유지되어 있는 것이 발견되었다. 즉, 이들은 H3pI/L73-IgG1과 비교하여, 막형 IL-6 수용체 및 가용형 IL-6 수용체가 항체에 의해 결합하고 있는 시간(바꿔 말하면 중화되어 있는 시간)이 연장되어 있는 것이 나타내어졌다.
또한, 이들 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체는, 1.0 ㎎/㎏으로 투여한 공지의 고친화성 항IL-6 수용체 항체(high affinity Ab)와 비교하여, 절반의 투여량인 0.5 ㎎/㎏으로 동등 이상의 중화효과와 지속성이 확인된 것으로부터, pH 의존적 결합 항체는 공지의 고친화성 항IL-6 수용체 항체와 비교하여 우수한 중화효과와 지속성을 갖는 것이 명확해졌다.
표 12에 기재한 항체 중, 본 시험에서 게잡이원숭이에 의한 PK/PD 시험을 실시하지 않은 항체에 대해서도, H3pI/L73-IgG1과 비교하여, 막형 IL-6 수용체로의 pH 의존적 결합이 향상되어 있는 것이 확인되고 있는 것으로부터, 이들에 대해서도 H3pI/L73-IgG1과 비교하여 막형 IL-6 수용체 및 가용형 IL-6 수용체 항체에 의해 결합하고 있는 시간(바꿔 말하면 중화되어 있는 시간, 중화효과의 지속성)이 연장되어 있는 것으로 생각된다.
실시예 9에 있어서, H3pI/L73-IgG1은 WT와 비교하여, 항체가 혈장 중으로부터 소실될 때까지의 시간, 및 생체내의 가용형 IL-6 수용체 및 막형 IL-6 수용체가 항체에 의해 결합하고 있는 시간(중화효과의 지속성)이 대폭 연장되는 것이 발견되었다. H3pI/L73-IgG1보다 중화효과의 지속성이 우수한 Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-IgG1, Fv3-M71, Fv3-M73, Fv4-IgG1, Fv4-IgG2, Fv4-M58, Fv4-M73은 WT과 비교한 경우, 현저히 중화효과의 지속성이 개선되었다고 생각된다.
이들 사실로부터, 항IL-6 수용체 항체에 대해, 혈장 중의 pH인 pH 7.4에 있어서 강하게 항원에 결합하고, 엔도솜 내의 pH인 pH 5.8에 있어서 항원으로의 결합을 약하게 한 pH 의존적 결합 항IL-6 수용체 항체는, 항IL-6 수용체 항체의 환자로의 투여량이나 투여빈도를 줄이는 것이 가능하여, 결과적으로 총투여량을 대폭 줄이는 것이 가능해져, IL-6 안타고니스트로서의 의약품으로서 매우 우수하다고 생각된다.
[실시예 16] pH 의존적으로 결합하는 항IL-6 항체의 제작
항IL-6 항체의 발현과 정제
실시예 1~15에 있어서의 인간화 항IL-6 수용체 항체에 있어서, 인간화 항IL-6 수용체 항체의 가변영역에 대해, 그 CDR 서열을 중심으로 히스티딘 등으로의 치환을 도입함으로써, 인간화 항IL-6 수용체 항체와 IL-6 수용체와의 결합에 pH 의존성을 부여한 항체를 복수 창제하는 것에 성공해, 그들은 모두 IL-6 수용체로 반복해서 결합하여, PK/PD가 크게 개선되는 것이 발견되었다.
이에, 항IL-6 수용체 항체와는 상이한 항원에 결합하는 항체에 있어서 동일한 방법에 의해, 항원과 항체의 결합에 pH 의존성을 부여할 수 있는지 여부를 검토하였다. 상이한 항원으로서 인간 IL-6를 선택하고, WO2004/039826에 기재된 인간 IL-6에 결합하는 H쇄(WT)(아미노산 서열 서열번호: 62)와 L쇄(WT)(아미노산 서열 서열번호: 63)로 되는 항IL-6 항체(anti-IL6 wild type)를 제작하였다. 당업자 공지의 방법으로 목적의 항체 아미노산 서열을 코드하는 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여, 목적의 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. Anti-IL6 wild type의 발현과 정제는 실시예 1에 기재한 방법으로 행하였다.
pH 의존적 항IL-6 항체의 제작
H쇄(WT)(아미노산 서열 서열번호: 62)와 L쇄(WT)(아미노산 서열 서열번호: 63)로 되는 항IL-6 항체(anti-IL6 wild type)에 대해, CDR의 아미노산에 대해 히스티딘으로의 치환을 도입함으로써, 항체와 IL-6의 결합에 pH 의존성을 부여하는 검토를 행하였다. CDR의 아미노산에 대해 히스티딘으로의 치환을 검토하고, 스크리닝을 행한 결과, pH 7.4에 있어서의 결합과 비교하여, pH 5.5에 있어서의 결합이 대폭 저하되어, pH 의존적인 결합을 나타내는 클론이 몇개 얻어졌다. pH 의존적 클론에 있어서의 히스티딘 치환 개소를 표 13에 나타내었다. 그 중, H쇄(c1)(아미노산 서열 서열번호: 64)와 L쇄(c1)(아미노산 서열 서열번호: 65)로 되는 anti-IL6 clone1, 및 H쇄(c1)(아미노산 서열 서열번호: 64)와 L쇄(c2)(아미노산 서열 서열번호: 66)로 되는 anti-IL6 clone2를 들 수 있었다. Anti-IL6 clone1과 anti-IL6 clone2의 발현과 정제는 실시예 1에 기재된 방법으로 행하였다.
Figure pat00013
pH 의존적 결합 클론의 인간 IL-6로의 결합 해석
상기에서 제작한 anti-IL6 wild type, anti-IL6 clone1, 및 anti-IL6 clone2의 3종류에 대해서, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 5.5와 pH 7.4에 있어서의 항원 항체반응의 속도론적 해석을 실시하였다(버퍼는 DPBS(-) pH 7.4 또는 pH 5.5, 150 mM NaCl). 아민 커플링법에 의해 recomb-protein A/G (Pierce)를 고정화한 센서 칩 상에 각종 항체를 결합시키고, 거기에 애널라이트로서 적절한 농도로 조제한 인간 IL-6(TORAY)를 주입하였다. 측정은 모두 37℃에서 실시하였다. Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여, 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 해리상수 KD(M)를 산출하였다(표 14). 추가적으로 각각에 대해서 pH 5.5와 pH 7.4의 affinity비를 산출하여, pH 의존성 결합을 평가하였다.
Figure pat00014
각각에 대해서 pH 5.5와 pH 7.4의 affinity비(KD(pH 5.5)/KD(pH 7.4))를 산출한 결과, 인간 IL-6에 대한 anti-IL6 wild type, anti-IL6 clone1, anti-IL6 clone2의 pH 의존성 결합은 각각 0.8배, 10.3배, 13.5배로, 어느 클론도 WT와 비교하여 10배 이상의 높은 pH 의존적 결합을 나타내었다. Anti-IL6 clone2의 pH 7.4와 pH 5.5에서의 센서그램을 도 26에 나타내었다.
이것으로부터, 항IL-6 수용체 항체 뿐 아니라, 항IL-6 항체에 있어서도, CDR 서열을 중심으로 히스티딘 등의 아미노산으로의 치환을 도입함으로써, 혈장 중의 중성 조건하에서는 항원에 강하게 결합하고, 엔도솜 중의 산성 조건하에서는 항원과의 결합이 저하되는 pH 의존적인 결합을 갖는 항체를 제작하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 실시예 1~15에 나타낸 바와 같이, pH 의존적인 결합을 갖는 항IL-6 수용체 항체가 IL-6 수용체에 반복해서 결합하여 PK/PD가 크게 개선된 것으로부터, pH 의존적인 결합을 갖는 anti-IL6 clone1, anti-IL6 clone2는, anti-IL6 wild type과 비교하여, 보다 많은 항원에 반복해서 결합하여 PK/PD가 크게 개선되는 것으로 생각되었다.
[실시예 17] pH 의존적으로 결합하는 항IL-31 수용체 항체의 제작
항IL-31 수용체 항체의 발현과 정제
실시예 1~15에 있어서, 인간화 항IL-6 수용체 항체에 있어서, 인간화 항IL-6 수용체 항체의 가변영역에 대해, 그 CDR 서열을 중심으로 히스티딘 등으로의 치환을 도입함으로써, 인간화 항IL-6 수용체 항체와 IL-6 수용체의 결합에 pH 의존성을 부여한 항체를 복수 창제하는 것에 성공해, 그들은 모두 IL-6 수용체로 반복해서 결합하여, PK/PD가 크게 개선되는 것이 발견되었다.
이에, 항IL-6 수용체 항체와는 상이한 항원에 결합하는 항체에 있어서 동일한 방법에 의해, 항원과 항체의 결합에 pH 의존성을 부여할 수 있는지 여부를 검토하였다. 상이한 항원으로서 마우스 IL-31 수용체를 선택하고, WO2007/142325에 기재된 마우스 IL-31 수용체에 결합하는 H쇄(WT)(아미노산 서열 서열번호: 67)와 L쇄(WT)(아미노산 서열 서열번호: 68)로 되는 항IL-31 수용체 항체(anti-IL31R wild type)를 제작하였다. 당업자 공지의 방법으로 목적의 항체 아미노산 서열을 코드하는 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여, 목적의 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. Anti-IL31R wild type의 발현과 정제는 실시예 1에 기재된 방법으로 행하였다.
pH 의존적 항IL-31 수용체 항체의 제작
H쇄(WT)(아미노산 서열 서열번호: 67)와 L쇄(WT)(아미노산 서열 서열번호: 68)로 되는 항IL-31 수용체 항체(anti-IL31R wild type)에 대해, CDR의 아미노산에 대해 히스티딘으로의 치환을 도입함으로써, 항체와 IL-31 수용체의 결합에 pH 의존성을 부여하는 검토를 행하였다. CDR의 아미노산에 대해 히스티딘으로의 치환을 검토하고, 스크리닝을 행한 결과, pH 7.4에 있어서의 결합과 비교하여, pH 5.5에 있어서의 결합이 대폭 저하되어, pH 의존적인 결합을 나타내는 클론이 몇개 얻어졌다. pH 의존적 클론에 있어서의 히스티딘 치환 개소를 표 15에 나타내었다. 그 중 하나로서, H쇄(c1)(아미노산 서열 서열번호: 69)와 L쇄(WT)로 되는 anti-IL31R clone1을 들 수 있었다. Anti-IL31R clone1의 발현과 정제는 실시예 1에 기재된 방법으로 행하였다.
Figure pat00015
pH 의존적 결합 클론의 가용형 IL-31 수용체로의 결합 해석
상기에서 제작한 anti-IL31R wild type, anti-IL31R clone1의 2종류에 대해서, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 5.5와 pH 7.4에 있어서의 항원 항체반응의 속도론적 해석을 실시하였다(버퍼는 DPBS(-) pH 7.4 또는 pH 5.5, 150 mM NaCl, 0.01% Tween20, 0.02% NaN3). 아민 커플링법에 의해 recomb-protein A/G(Pierce)를 고정화한 센서 칩 상에 각종 항체를 결합시키고, 거기에 애널라이트로서 적절한 농도로 조제한 가용형 마우스 IL-31 수용체(WO2007/142325에 기재된 방법으로 조제)를 주입하였다. 측정은 모두 25℃에서 실시하였다. Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여, 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 해리상수 KD(M)를 산출하였다(표 16). 추가적으로 각각에 대해서 pH 5.5와 pH 7.4의 affinity비를 산출하여, pH 의존성 결합을 평가하였다.
Figure pat00016
각각에 대해서 pH 5.5와 pH 7.4의 affinity비(KD(pH 5.5)/KD(pH 7.4))를 산출한 결과, 마우스 IL-31 수용체에 대한 anti-IL31R wild type, anti-IL31R clone1의 pH 의존성 결합은 각각 3.2배, 1000배로, clone1은 WT와 비교하여 300배 정도의 높은 pH 의존적 결합을 나타내었다. Anti-IL31R clone의 pH 7.4와 pH 5.5에서의 센서그램을 도 27에 나타내었다.
이것으로부터, 항IL-6 수용체 항체와 항IL-6 항체 뿐 아니라, 항IL-31 수용체 항체에 있어서도, CDR 서열을 중심으로 히스티딘 등의 아미노산으로의 치환을 도입함으로써, 혈장 중의 중성 조건하에서는 항원에 강하게 결합하고, 엔도솜 중의 산성 조건하에서는 항원과의 결합이 저하되는 pH 의존적인 결합을 갖는 항체를 제작하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 실시예 1~15에 나타낸 바와 같이, pH 의존적인 결합을 갖는 항IL-6 수용체 항체가 IL-6 수용체에 반복해서 결합하여 PK/PD가 크게 개선된 것으로부터, pH 의존적인 결합을 갖는 anti-IL31R clone1은, anti-IL31R wild type과 비교하여, 보다 많은 항원에 반복해서 결합하여 PK/PD가 크게 개선되는 것으로 생각되었다.
[실시예 18] pH 의존적 결합 항체에 의한 항원으로의 반복 결합
마우스 투여 항체의 발현과 정제
인간화 IL-6 수용체 항체로서, 이하의 4종류를 제작하였다. IL-6 수용체에 대해 pH 의존적인 결합을 나타내지 않는 통상의 항체로서 H(WT)(아미노산 서열 서열번호: 9)와 L(WT)(아미노산 서열 서열번호: 10)로 되는 WT-IgG1, H54(아미노산 서열 서열번호: 70)와 L28(아미노산 서열 서열번호: 12)로 되는 H54/L28-IgG1을, IL-6 수용체에 대해 pH 의존적인 결합을 나타내는 항체로서 실시예 3에서 제작한 H170(아미노산 서열 서열번호: 4)과 L82(아미노산 서열 서열번호: 7)로 되는 H170/L82-IgG1, 및 실시예 10에서 제작한 VH3-IgG1(서열번호: 23)과 VL3-CK(서열번호: 27)로 되는 Fv4-IgG1을 실시예 1에 나타낸 방법으로 발현과 정제를 행하였다.
각종 항체의 가용형 IL-6 수용체로의 결합 해석
조제한 WT-IgG1, H54/L28-IgG1, H170/L82-IgG1, 및 Fv4-IgG1의 4종류에 대해서, Biacore T100(GE Healthcare)을 사용하여 pH 7.4 및 pH 5.8에 있어서의 항원 항체반응의 속도론적 해석을 실시하였다(버퍼는 10 mM MES pH 7.4, 또는 pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.05% Surfactant-P20). 아민 커플링법에 의해 recomb-protein A/G(Pierce)를 고정화한 센서 쳅 상에 각종 항체를 결합시키고, 거기에 애널라이트로서 적절한 농도로 조제한 SR344를 주입하였다. 각종 항체의 SR344로의 결합 및 해리를 실시간으로 관측하였다. 측정은 모두 37℃에서 실시하였다. Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여, 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 해리상수 KD(M)를 산출하였다(표 17).
Figure pat00017
각각에 대해 pH 5.8과 pH 7.4의 어피니티(KD값)비를 산출한 결과, SR344에 대한 WT-IgG1, H54/L28-IgG1, H170/L82-IgG1, 및 Fv4-IgG1의 pH 의존성 결합(KD값의 비)은 각각 1.6배, 0.7배, 61.9배 및 27.3배였다. 또한, 각각에 대해서 pH 5.8과 pH 7.4의 해리속도(kd값)비를 산출한 결과, SR344에 대한 WT-IgG1, H54/L28-IgG1, H170/L82-IgG1, 및 Fv4-IgG1의 pH 의존성 해리속도(kd값의 비)는 각각 2.9배, 2.0배, 11.4배 및 38.8배였다. 이것으로부터, 통상의 항체인 WT-IgG1과 H54/L28-IgG1은 pH 의존적인 결합을 거의 나타내지 않고, H170/L82-IgG1과 Fv4-IgG1은 pH 의존적을 결합을 나타내는 것이 확인되었다. 또한, 이들 항체의 pH 7.4에 있어서의 어피니티(KD값)는 거의 동등했던 것으로부터, 혈장 중에 있어서의 SR344로의 결합은 동일 정도라고 생각되었다.
마우스를 사용한 체내 동태 시험
인간 IL-6 수용체를 발현하고 있지 않은 마우스(C57BL/6J; 이들 항인간 IL-6 수용체 항체는 마우스의 IL-6 수용체에 결합하지 않는다)에 SR344(인간 IL-6 수용체: 실시예 1에서 제작)를 단독 투여, 또는 SR344 및 항인간 IL-6 수용체 항체를 동시 투여한 후의 SR344 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 체내 동태를 평가하였다. SR344용액(5 ㎍/mL) 또는 SR344 및 항인간 IL-6 수용체 항체의 혼합용액(각각 5 ㎍/mL, 0.1 ㎎/mL)을 꼬리정맥에 10 mL/㎏으로 단회 투여하였다. 이때, SR344에 대해 항인간 IL-6 수용체 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, SR344는 거의 모두 항체에 결합하고 있는 것으로 생각된다. 투여 후 15분간, 2시간, 8시간, 1일간, 2일간, 3일간, 4일간, 7일간, 14일간, 21일간, 28일간에서 채혈을 행하였다. 채취한 혈액은 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여, 혈장을 얻었다. 분리한 혈장은, 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존하였다. 항인간 IL-6 수용체 항체로서는, 전술한 WT-IgG1, H54/L28-IgG1, H170/L82-IgG1, 및 Fv4-IgG1을 사용하였다.
ELISA법에 의한 혈장 중 항인간 IL-6 수용체 항체 농도 측정
마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 항체 농도는 ELISA법으로 측정하였다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody (SIGMA)를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 Anti-Human IgG 고상화 플레이트를 제작하였다. 혈장 중 농도로서 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 ㎍/mL의 검량선 시료와 100배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하고, 이들 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL에 20 ng/mL의 SR344를 200 μL 첨가하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후, Anti-Human IgG 고상화 플레이트에 분주하고 추가적으로 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)를 실온에서 1시간 반응시키고, 추가적으로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 실온에서 1시간 반응시키며, TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용해 발색반응을 행하여, 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)로 반응 정지 후, 마이크로플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하였다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 혈장 중 농도 추이를 도 28에 나타내었다.
전기화학 발광법에 의한 혈장 중 SR344 농도 측정
마우스의 혈장 중 SR344 농도는 전기화학 발광법으로 측정하였다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조정한 SR344 검량선 시료 및 50배 이상 희석한 마우스 혈장 측정시료를 조제하여, SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D) 및 WT-IgG1용액을 혼합하여 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그때의 WT-IgG1의 종농도는 샘플에 포함되는 항인간 IL-6 수용체 항체 농도보다 과잉의 333 ㎍/mL로, 샘플 중의 거의 모든 SR344를 WT-IgG1과 결합한 상태로 하는 것을 목적으로 하였다. 그 후, MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하였다. 추가적으로 실온에서 1시간 반응시켜 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)를 분주하고, 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)로 측정을 행하였다. SR344 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용해서 산출하였다. 이 방법으로 측정한 정맥내 투여 후의 혈장 중 SR344 농도 추이를 도 29에 나타내었다.
pH 의존적 결합에 의한 효과
pH 의존적인 결합을 나타내지 않는 항체인 WT-IgG1과 H54/L28-IgG1, 및 pH 의존적인 결합을 나타내는 항체인 H170/L82-IgG1과 Fv4-IgG1의 항체 농도 추이에 관해서는, WT-IgG1, H54/L28-IgG1, 및 Fv4-IgG1은 거의 동등하고, H170/L82-IgG1은 약간 빠른 소실을 나타내었다. 혈장 중 농도 추이의 데이터를 약물동태 해석 소프트 WinNonlin(Pharsight)으로 해석한 결과, WT-IgG1, H54/L28-IgG1, Fv4-IgG1, H170/L82-IgG1의 혈장 중 반감기는 각각 21.0, 28.8, 26.2, 7.5 day였다.
실시예 2에 기재된 바와 같이, 항원이 가용형 항원인 경우, 투여한 항체는 혈장 중에서 항원에 결합하여, 항원과 항체의 복합체의 형태로 혈장 중을 체류한다. 통상, 항체의 혈장 중 체류성은 FcRn의 기능에 의해 매우 긴(소실속도가 매우 느린) 것에 반하여, 항원의 혈장 중 체류성은 짧기(소실속도가 빠르기) 때문에, 항체에 결합한 항원은 항체와 동일 정도의 긴 혈장 중 체류성을 갖는(소실이 매우 느린) 것이 된다. 인간화 IL-6 수용체 항체의 항원인 SR344(가용형 인간 IL-6 수용체)를 단독으로 투여한 경우도 마찬가지로 SR344는 매우 빠른 소실을 나타내었다(혈장 중 반감기 0.2 day). SR344와 pH 의존적인 결합을 나타내지 않는 통상의 항체인 WT-IgG1 또는 H54/L28-IgG1을 동시에 투여한 경우, SR344의 소실속도는 현저히 저하되어, 긴 혈장 중 체류성을 나타내었다(혈장 중 반감기:WT-IgG1 5.3 day, H54/L28-IgG1 6.3 day). 이는 SR344가 동시에 투여한 항체에 거의 모두 결합하고 있기 때문에, 전술한 바와 같이 항체에 결합한 SR344는 FcRn의 기능에 의해 항체와 동일 정도의 긴 혈장 중 체류성을 갖기 때문이다.
SR344와 pH 의존적인 결합을 나타내는 항체인 H170/L82-IgG1 또는 Fv4-IgG1을 동시에 투여한 경우, SR344의 소실은 WT-IgG1 또는 H54/L28-IgG1을 동시에 투여한 경우와 비교하여 현저히 빨라졌다(혈장 중 반감기:H170/L82-IgG1 1.3 day, Fv4-IgG1 0.6 day). 그 경향은 특히 Fv4-IgG1에서 현저하였다. Fv4-IgG1의 pH 7.4에 있어서의 어피니티는 WT-IgG1 및 H54/L28-IgG1과 동등 이상인 것으로부터, SR344는 거의 모두 Fv4-IgG1에 결합하고 있는 것으로 생각된다. Fv4-IgG1은, WT-IgG1과 H54/L28-IgG1과 비교하여, 동등 또는 조금 긴 혈장 중 체류성을 나타내 소실이 느림에도 불구하고, Fv4-IgG1에 결합한 SR344의 소실은 현저히 빨라졌다. 이는 도 4에 나타낸 본 기술의 컨셉에 의해 설명 가능하다. pH 의존적인 결합을 나타내지 않는 통상의 항체는, 항체-가용형 항원 복합체가 혈장 중에 있어서 피노사이토시스에 의해 엔도솜에 삽입되어, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 엔도솜 내에 발현하고 있는 FcRn에 결합하고, FcRn으로 결합한 항체-가용형 항원 복합체는 그대로 세포 표면으로 이행하여 재차 혈장 중으로 돌아가기 때문에, 항체에 결합한 항원은 항체와 동일 정도의 긴 혈장 중 체류성을 갖는다(소실이 매우 느리다). 한편, pH 의존적인 결합을 나타내는 항체는, 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원을 해리하기 때문에, 항체만 FcRn에 결합하고 재차 혈장 중으로 돌아가며, 항체로부터 해리된 항원은 혈장 중으로 돌아가지 않고 리소좀으로 분해되기 때문에, 항원의 소실은 pH 의존적인 결합을 나타내지 않는 항체의 경우와 비교하여 소실이 현저히 빨라진다. 즉, SR344를 pH 의존적인 결합을 나타내지 않는 항체인 WT-IgG1 또는 H54/L28-IgG1과 동시에 투여한 경우는, 혈장 중과 엔도솜 내에 있어서 SR344는 WT-IgG1 또는 H54/L28-IgG1과 결합하고 있기 때문에 SR344의 소실은 항체와 동일 정도로 느려지나, SR344를 pH 의존적인 결합을 나타내는 항체인 H170/L82-IgG1 또는 Fv4-IgG1과 동시에 투여한 경우는, 엔도솜 내의 저pH 환경하에 있어서 SR344가 항체로부터 해리되기 때문에 SR344의 소실은 매우 빨라진다. 즉, pH 의존적인 결합을 나타내는 항체인 H170/L82-IgG1 또는 Fv4-IgG1은, 엔도솜 내의 저pH 환경하에 있어서 SR344가 해리되는 것으로부터, FcRn에 의해 재차 혈장 중으로 돌아간 H170/L82-IgG1 또는 Fv4-IgG1의 대부분은 SR344가 결합하고 있지 않은 것으로 생각된다. 이것으로부터 pH 의존적인 결합을 나타내는 항체는, 도 4에 나타내는 바와 같이, 엔도솜 내의 저pH 환경하에 있어서 항원을 해리하고, 항원에 결합하고 있지 않은 상태에서 FcRn에 의해 혈장 중으로 돌아감으로써, 혈장 중에서 재차 새로운 항원에 결합하는 것이 가능해져, 이것을 반복함으로써 pH 의존적인 결합을 나타내는 항체는 복수회 항원에 반복해서 결합하는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 이는 실시예 7에서 나타낸 바와 같이 Biacore에 있어서, pH 의존적 결합 클론이 항원으로 반복해서 결합할 수 있는 것을 반영하고 있어, 항체의 항원으로의 pH 의존적인 결합을 증강함으로써 항원으로 반복해서 결합하는 횟수를 증대시키는 것이 가능하다.
항원이 가용형 항원인 경우, 혈장 중의 중성 조건하에서 항체에 결합한 항원이 엔도솜 내에서 해리되고 항체가 FcRn에 의해 혈장 중으로 돌아가면, 항체는 재차 혈장 중의 중성 조건하에서 항원에 결합할 수 있기 때문에, 엔도솜 내의 산성 조건하에서 항원을 해리하는 성질을 갖는 항체는 항원에 복수회 결합 가능하다. 항체에 결합한 항원이 엔도솜 내에서 해리되지 않는 경우(항원은 항체에 결합한 채로 혈장 중으로 돌아간가)와 비교하여, 항체에 결합한 항원이 엔도솜 내에서 해리되는 경우는, 항원은 리소좀으로 운반되어 분해되기 때문에 항원의 혈장 중으로부터의 소실속도는 증가한다. 즉, 혈장 중으로부터 항원이 소실되는 속도를 지표로 하여 항체가 항원에 복수회 결합 가능한지 여부를 판단하는 것도 가능하다. 항원의 혈장 중으로부터의 소실속도의 측정은, 예를 들면, 본 실시예에 타나낸 바와 같이 항원과 항체를 생체내에 투여하고, 투여 후의 혈장 중의 항원농도를 측정함으로써 행하는 것도 가능하다.
pH 의존적인 결합을 나타내지 않는 통상의 항체와 비교하여, pH 의존적인 결합을 나타내는 항체는, 하나의 항체가 복수회 항원에 반복해서 결합하는 것이 가능하기 때문에, 항체의 투여량의 대폭 저감과 투여간격의 대폭 연장이 가능해진다고 생각된다.
본 메커니즘에 의한 복수회의 항원으로의 반복 결합은, pH 의존적인 항원 항체반응에 입각하고 있는 것으로부터, 어떠한 항원이더라도 혈장 중의 pH 7.4에서 결합하고, 엔도솜 내의 산성 pH에서 항원으로부터 해리되는 pH 의존적인 결합을 나타내는 항체를 제작할 수 있다면, 하나의 항체가 복수회 항원에 반복해서 결합하는 것이 가능하다. 즉, 본 기술은 IL-6 수용체, IL-6, IL-31 수용체 뿐 아니라, 항원에 종류에 상관없이, 어떠한 항원에 대한 항체에 대해서도 일반적으로 적응 가능한 기술로서 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTIGEN-BINDING MOLECULES THAT REPEATEDLY BIND TO MULTIPLE ANTIGEN MOLECULES <130> C1-A0801Y2P <150> JP 2008-104147 <151> 2008-04-11 <150> JP 2008-247713 <151> 2008-09-26 <150> JP 2009-068744 <151> 2009-03-19 <160> 70 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> 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synthesized peptide sequence <400> 68 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Thr Val 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Thr Asp Arg Pro Ala Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ala 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Thr Asp His 85 90 95 Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 69 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 69 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 His Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Asp Val Val Pro Ala Ala Met Ser Phe Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 325 330 335 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly 450 455 <210> 70 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 70 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Asp Asp 20 25 30 Gln Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys

Claims (22)

  1. 약물동태가 향상된 항체의 제조방법으로서,
    가변영역의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환함으로써 항원에 대한 pH 5.8에서의 KD와 pH 7.4에서의 KD의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 히스티딘 치환 전과 비교하여 커진 항체를 선택하는 공정을 포함하는, 제조방법.
  2. 약물동태가 향상된 항체를 포함하는 의약 조성물의 제조방법으로서,
    가변영역의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환함으로써 항원에 대한 pH 5.8에서의 KD와 pH 7.4에서의 KD의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 히스티딘 치환 전과 비교하여 커진 항체를 선택하는 공정을 포함하는, 제조방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    히스티딘으로 치환되는 아미노산이 CDR 서열 또는 CDR의 구조를 결정하는 서열의 아미노산을 포함하는, 제조방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    히스티딘으로 치환되는 아미노산이 Kabat 넘버링에 따른 중쇄 가변영역의 아미노산 치환인 H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b 및 H102, 및 Kabat 넘버링에 따른 경쇄 가변영역의 아미노산 치환인 L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, L90, L92 및 L94로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는, 제조방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    히스티딘으로 치환되는 아미노산이 Kabat 넘버링에 따른 중쇄 가변영역의 아미노산 치환인 H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b 및 H102로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산을 포함하는, 제조방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가변영역의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환한 항체의 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 2 이상인, 제조방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가변영역의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘으로 치환한 항체의 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 10 이상인, 제조방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가변영역상의 아미노산을 히스티딘으로 치환한 항체의 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 40 이상인, 제조방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 안타고니스트 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 막 항원 또는 가용형 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 IgG 항체인, 제조방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 인간화 항체인, 제조방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 인간화 항체가 인간 항체 유래의 정상영역을 갖는, 제조방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    상기 인간화 항체가 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 CDR과, 인간 항체 유래의 프레임워크영역 및 정상영역으로 이루어지는, 제조방법.
  15. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 인간 항체인, 제조방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 FcRn 결합 영역을 포함하는, 제조방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    정상영역에 FcRn과의 결합을 증대시키는 아미노산 변이를 도입하는 공정을 추가로 포함하는, 제조방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체가 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, IL-31, IL-23, IL-2 수용체, IL-6 수용체, OSM 수용체, gp130, IL-5 수용체, CD40, CD4, Fas, 오스테오폰틴, CRTH2, CD26, PDGF-D, CD20, 단구 주화활성 인자, CD23, TNF-α, HMGB-1, α4 인테그린, ICAM-1, CCR2, CD11a, CD3, IFNγ, BLyS, HLA-DR, TGF-β, CD52, IL-31 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 항원에 결합하는 항체인, 제조방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약물동태의 향상이
    (1) 항체가 투여되고나서, 항체가 혈장 중으로부터 소실될 때까지의 시간의 연장,
    (2) 항체가 투여되고나서, 항체가 항원에 결합 가능한 상태로 혈장 중에 존재하는 시간의 연장,
    (3) 항체가 투여되고나서, 생체내의 항원이 항체와 결합하고 있지 않은 시간의 감소,
    (4) 생체내에 존재하는 항원에 대한 항체에 결합한 항원의 비율의 상승, 또는
    (5) 항체가 투여되고 나서, 가용형 항원이 혈장 중으로부터 소실되는 속도의 상승인, 제조방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원에 대한 pH 5.8에서의 KD와 pH 7.4에서의 KD의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 Biacore(등록상표)를 사용하여 MES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정되는, 제조방법.
  21. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하고, 당해 항체를 숙주세포로부터 단리하는 공정을 포함하는, 항체의 제조방법.
  22. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하고, 당해 항체를 숙주세포로부터 단리하는 공정을 포함하는, 의약 조성물의 제조방법.
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Families Citing this family (201)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005035753A1 (ja) * 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
CA2625773C (en) * 2005-10-14 2015-05-12 Fukuoka University Inhibition of interleukin-6 (il-6) receptor promotes pancreatic islet transplantation
JP5191235B2 (ja) * 2005-10-21 2013-05-08 中外製薬株式会社 心疾患治療剤
AR057582A1 (es) * 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
AR059213A1 (es) * 2006-01-27 2008-03-19 Univ Keio Agentes terapeuticos para enfermedades que involucran neovascularizacion coroidal
ES2568436T3 (es) * 2006-03-31 2016-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
CN101495146B (zh) * 2006-04-07 2012-10-17 国立大学法人大阪大学 肌肉再生促进剂
MX2009007830A (es) * 2007-01-23 2009-10-07 Univ Shinshu Inhibidor de rechazo cronico.
JOP20080381B1 (ar) 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
SG10201605394SA (en) 2007-09-26 2016-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified Antibody Constant Region
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
RU2531521C2 (ru) 2007-12-05 2014-10-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против nr10 и его применение
EP4238993A3 (en) 2008-04-11 2023-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
CN102256623A (zh) 2008-06-05 2011-11-23 独立行政法人国立癌症研究中心 神经浸润抑制剂
TWI440469B (zh) * 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
AR073770A1 (es) * 2008-10-20 2010-12-01 Imclone Llc Anticuerpo aislado que se enlaza especificamente con, e induce la degradacion del receptor-3 del factor de crecimiento del fibroblasto humano (fgfr-3), fragmento de enlace fgfr-3 humano del mismo, composicion farmaceutica y producto que lo comprenden
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
AU2015204268B2 (en) * 2009-03-09 2017-03-02 Bioatla, Llc Mirac Proteins
ES2661310T3 (es) 2009-03-09 2018-03-28 Bioatla, Llc Proteínas mirac
WO2010106812A1 (en) * 2009-03-19 2010-09-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical formulation containing improved antibody molecules
JP5787446B2 (ja) 2009-03-19 2015-09-30 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI457134B (zh) * 2009-03-19 2014-10-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Rheumatoid arthritis treatment
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
EP2419733A4 (en) 2009-04-13 2013-12-25 Univ Leland Stanford Junior METHODS AND DEVICES FOR DETECTING THE PRESENCE OF AN ANALYTE IN A SAMPLE
WO2010131733A1 (ja) 2009-05-15 2010-11-18 中外製薬株式会社 抗axl抗体
EP2481752B1 (en) 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
AR080428A1 (es) 2010-01-20 2012-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
CN102844332B (zh) * 2010-03-11 2015-08-19 瑞纳神经科学公司 呈pH依赖性抗原结合的抗体
CN102652259B (zh) * 2010-03-12 2016-07-27 小利兰·斯坦福大学托管委员会 基于磁性传感器的定量结合动力学分析
TWI667257B (zh) * 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
DK2578231T3 (da) 2010-05-28 2022-12-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antitumor-t-celle-reaktionsforstærker
JP6121904B2 (ja) * 2010-09-08 2017-04-26 ハロザイム インコーポレイテッド 条件的活性治療用タンパク質を評価および同定する、または発展させる方法
EP2622074B1 (en) 2010-09-30 2014-11-12 Board Of Trustees Of Northern Illinois University Library-based methods and compositions for introducing molecular switch functionality into protein affinity reagents
MY166429A (en) 2010-11-17 2018-06-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
SG190727A1 (en) * 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
PL3395836T3 (pl) 2011-01-28 2021-12-13 Sanofi Biotechnology Ludzkie przeciwciała przeciwko pcsk9 do zastosowania w sposobach leczenia konkretnych grup osobników
WO2012132067A1 (ja) * 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
KR102403848B1 (ko) 2011-03-30 2022-05-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항원 결합 분자의 혈장 체류성과 면역원성을 개변하는 방법
EP2698431B1 (en) 2011-03-30 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
TWI687441B (zh) 2011-06-30 2020-03-11 中外製藥股份有限公司 異源二聚化多胜肽
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
EP2756004B1 (en) 2011-09-16 2019-12-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. INHIBITOR OF PROPROTEIN CONVERTASE SUBTILISIN KEXIN-9 (PCSK9) FOR USE IN REDUCING LIPOPROTEIN(a) LEVELS
KR102366029B1 (ko) * 2011-09-30 2022-02-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자
TWI827333B (zh) * 2011-09-30 2023-12-21 日商中外製藥股份有限公司 促進抗原消失的抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) * 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
CA3186007A1 (en) * 2011-09-30 2013-04-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ion concentration-dependent binding molecule library
EP2765192A4 (en) * 2011-10-05 2015-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIGEN BINDING MOLECULE FOR PROMOTING THE PLASMA CLAIR OF AN ANTIGEN COMPRISING A SACCHARIDIC CHAIN TYPE RECEPTOR BINDING DOMAIN
TWI589299B (zh) 2011-10-11 2017-07-01 再生元醫藥公司 用於治療類風濕性關節炎之組成物及其使用方法
RU2603090C2 (ru) 2011-10-17 2016-11-20 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Мыши с ограниченной тяжелой цепью иммуноглобулина
US11851476B2 (en) 2011-10-31 2023-12-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule having regulated conjugation between heavy-chain and light-chain
EP3517550A1 (en) 2011-11-30 2019-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Drug containing carrier into cell for forming immune complex
CN113480639A (zh) 2012-02-09 2021-10-08 中外制药株式会社 抗体的Fc区变异体
CA3159061A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor based affinity chromatography
KR102219987B1 (ko) * 2012-02-24 2021-02-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩＢ를 매개로 항원의 소실을 촉진하는 항원 결합 분자
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
RS59076B1 (sr) 2012-03-16 2019-09-30 Regeneron Pharma Glodari koji eksprimiraju imunoglobulinske sekvence senzitivne na ph
AU2013204581B2 (en) * 2012-03-16 2015-06-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing pH-sensitive immunoglobulin sequences
LT2825036T (lt) * 2012-03-16 2018-07-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidino pakeitimus lengvoje grandinėje turintys antikūnai ir genetiškai modifikuoti graužikai, išvesti ju gamybai
CA2870876C (en) * 2012-05-23 2019-10-01 Genentech, Inc. Selection method for therapeutic agents
EP2857419B1 (en) * 2012-05-30 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
JPWO2013180200A1 (ja) * 2012-05-30 2016-01-21 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
JP2013253842A (ja) 2012-06-06 2013-12-19 Univ Of Tokyo ｐＨ依存的に標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法
LT3597037T (lt) 2012-06-12 2021-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizuoti gyvūnai, išskyrus žmones, su apribotu imunoglobulino sunkiosios grandinės lokusu
JP6628966B2 (ja) 2012-06-14 2020-01-15 中外製薬株式会社 改変されたＦｃ領域を含む抗原結合分子
NZ704771A (en) * 2012-08-13 2018-02-23 Regeneron Pharma Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics
TWI697501B (zh) 2012-08-24 2020-07-01 日商中外製藥股份有限公司 ＦｃγＲＩＩｂ特異性Ｆｃ區域變異體
JP6774164B2 (ja) 2012-08-24 2020-10-21 中外製薬株式会社 マウスＦｃγＲＩＩ特異的Ｆｃ抗体
CN105102618B (zh) 2012-12-27 2018-04-17 中外制药株式会社 异源二聚化多肽
RS57582B1 (sr) * 2013-02-20 2018-11-30 Regeneron Pharma Nehumane životinje sa modifikovanim sekvencama imunoglobulinskog teškog lanca
SI2958938T1 (sl) * 2013-02-20 2019-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miši, ki izražajo humanizirane koreceptorje za celice T
RS57963B1 (sr) * 2013-02-22 2019-01-31 Regeneron Pharma Miševi koji eksprimiraju humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti
KR102309653B1 (ko) * 2013-03-11 2021-10-08 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 키메라 주요 조직적합성 복합체 （ｍｈｃ） 제ｉｉ부류 분자를 발현하는 유전자전이 마우스
US9556280B2 (en) * 2013-03-15 2017-01-31 Bayer Healthcare Llc Anti-TFPI antibody variants with differential binding across PH range for improved pharmacokinetics
JP6574754B2 (ja) 2013-03-19 2019-09-11 ベイジン シェノゲン ファーマ グループ リミテッド エストロゲン受容体関連疾患を処置するための抗体及び方法
US20160051673A1 (en) 2013-03-29 2016-02-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the serum half-life of a therapeutic agent targeting complement c5
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
TW202021614A (zh) 2013-06-07 2020-06-16 法商賽諾菲生物技術公司 藉由投與ｐｃｓｋ９抑制劑抑制動脈粥狀硬化的方法
WO2014200018A1 (ja) 2013-06-11 2014-12-18 独立行政法人 国立精神・神経医療研究センター 再発寛解型多発性硬化症（ｒｒｍｓ）患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法
WO2015042250A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified non-human animals for generating the same
KR102441231B1 (ko) 2013-09-27 2022-09-06 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법
CN113307873A (zh) 2013-11-11 2021-08-27 中外制药株式会社 含有改变了抗体可变区的抗原结合分子
EP3068803B1 (en) 2013-11-12 2021-01-20 Sanofi Biotechnology Dosing regimens for use with pcsk9 inhibitors
JP7060317B2 (ja) 2013-12-04 2022-04-26 中外製薬株式会社 化合物の濃度に応じて抗原結合能の変化する抗原結合分子及びそのライブラリ
NZ631007A (en) 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
CA2947605A1 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Bioatla, Llc Conditionally active biological proteins
AU2015283270B9 (en) * 2014-06-30 2021-04-01 Merck Patent Gmbh Anti-TNFa antibodies with pH-dependent antigen binding
MX2017000627A (es) 2014-07-16 2017-04-27 Sanofi Biotechnology Metodos para tratar pacientes con hipercolesterolemia familiar heterocigota (hfhe).
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
SI3215528T1 (sl) 2014-11-06 2019-11-29 Hoffmann La Roche Variante regije Fc s spremenjeno vezavo FcRn in postopki uporabe
TWI831044B (zh) 2014-11-11 2024-02-01 日商中外製藥股份有限公司 抗原結合分子、包含抗原結合分子的醫藥組合物以及製造及選擇抗原結合分子之方法
TWI808330B (zh) 2014-12-19 2023-07-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
SG11201607165YA (en) 2014-12-19 2016-09-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
CN107428823B (zh) 2015-01-22 2021-10-26 中外制药株式会社 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法
TW202248212A (zh) 2015-02-05 2022-12-16 日商中外製藥股份有限公司 包含離子濃度依賴之抗原結合域的抗體、Fc區變體、IL-8結合抗體與其用途
IL282614B2 (en) 2015-02-06 2024-02-01 Cell Idx Inc Antigen-conjugated immune reagents
TW202339800A (zh) 2015-02-27 2023-10-16 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
US10697883B2 (en) 2015-05-19 2020-06-30 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for determining application of therapy to multiple sclerosis (MS) patient
CN107614014B (zh) * 2015-05-28 2022-07-12 生物辐射实验室股份有限公司 亲和配体及其相关方法
CA2995645A1 (en) 2015-08-18 2017-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcsk9 inhibitory antibodies for treating patients with hyperlipidemia undergoing lipoprotein apheresis
PE20181336A1 (es) 2015-09-18 2018-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
EP3390442B1 (en) * 2015-12-18 2023-11-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
WO2017104783A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
EP3394098A4 (en) * 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
AU2016381992B2 (en) 2015-12-28 2024-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for promoting efficiency of purification of Fc region-containing polypeptide
AU2017233658B2 (en) 2016-03-14 2023-09-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
JP7082604B2 (ja) 2016-03-21 2022-06-08 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 多重特異性および多機能性分子ならびにその使用
UA124734C2 (uk) 2016-06-14 2021-11-10 Рідженерон Фармасьютікалз, Інк. Антитіло проти с5 і його застосування
AU2017285763B2 (en) * 2016-06-17 2024-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-C5 antibodies and methods of use
MY193497A (en) * 2016-06-17 2022-10-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies and methods of use
CN116515950A (zh) * 2016-07-18 2023-08-01 赛尔伊迪克斯公司 抗原偶联的杂交试剂
EP3491135A1 (en) * 2016-07-28 2019-06-05 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Method for obtaining aptamers
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
WO2018044619A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Bioatla, Llc Conditionally active polypeptides and methods of generating them
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
EP3546574A4 (en) 2016-11-28 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN AND POLYPEPTIDE BINDING AREA INCLUDING A TRANSPORT SECTION
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EA201991207A1 (ru) * 2016-12-19 2019-12-30 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Новые агонисты tnfr и их применение
JP7191833B2 (ja) 2017-01-30 2022-12-19 中外製薬株式会社 抗スクレロスチン抗体およびその使用
PL3577135T3 (pl) 2017-01-31 2023-12-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Kompozycja farmaceutyczna do stosowania do leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z c5
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
US10093731B2 (en) 2017-02-24 2018-10-09 Kindred Biosciences, Inc. Anti-IL31 antibodies for veterinary use
JPWO2018155611A1 (ja) 2017-02-24 2019-12-12 中外製薬株式会社 薬学的組成物、抗原結合分子、治療方法、およびスクリーニング方法
KR20190129925A (ko) 2017-03-16 2019-11-20 메디뮨 리미티드 항-par2 항체 및 그의 용도
CA3059133A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Staten Biotechnology B.V. Anti-apoc3 antibodies and methods of use thereof
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
GB201707484D0 (en) * 2017-05-10 2017-06-21 Argenx Bvba Method of preparing ph-dependent antibodies
EP3630836A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
JP7197865B2 (ja) 2017-07-18 2022-12-28 協和キリン株式会社 抗ヒトｃｃｒ１モノクローナル抗体
EP4218813A3 (en) 2017-07-27 2023-08-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. High concentration anti-c5 antibody formulations
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
US11692037B2 (en) 2017-10-20 2023-07-04 Hyogo College Of Medicine Anti-IL-6 receptor antibody-containing medicinal composition for preventing post-surgical adhesion
CA3080103A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Staten Biotechnology B.V. Anti-apoc3 antibodies and methods of use thereof
US10538583B2 (en) 2017-10-31 2020-01-21 Staten Biotechnology B.V. Anti-APOC3 antibodies and compositions thereof
EP3710589A4 (en) * 2017-11-14 2021-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-C1S ANTIBODIES AND METHODS OF USE
CA3083259A1 (en) 2017-11-28 2019-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide including antigen-binding domain and carrying section
US11952422B2 (en) 2017-12-05 2024-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule comprising altered antibody variable region binding CD3 and CD137
JP2021506241A (ja) 2017-12-13 2021-02-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ｃ５抗体組み合わせ物およびその使用
GB201802487D0 (en) 2018-02-15 2018-04-04 Argenx Bvba Cytokine combination therapy
JP7049569B2 (ja) * 2018-03-06 2022-04-07 国立大学法人 東京大学 ｐＨ依存的に標的分子に結合するペプチドのスクリーニング方法
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
TWI827585B (zh) 2018-03-15 2024-01-01 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法
CN112313249A (zh) 2018-04-13 2021-02-02 中外制药株式会社 抗补体组分抗体及使用方法
US20210253672A1 (en) 2018-05-30 2021-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule containing single domain antibody
CN112424357A (zh) 2018-06-26 2021-02-26 协和麒麟株式会社 与硫酸软骨素蛋白聚糖5结合的抗体
CA3105000A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody binding to cell adhesion molecule 3
EP3818083A2 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
JP2021532135A (ja) * 2018-07-23 2021-11-25 中外製薬株式会社 標的細胞特異的な細胞質侵入抗原結合分子
EP3829628B1 (en) 2018-08-01 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a c5-related disease
KR102259473B1 (ko) 2018-08-10 2021-06-02 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항cd137 항원 결합 분자 및 그의 사용
WO2020045545A1 (ja) 2018-08-29 2020-03-05 中外製薬株式会社 抗体半分子、および抗体半分子のホモ二量体形成を抑制する方法
EP3903102B1 (en) 2018-12-30 2023-04-12 F. Hoffmann-La Roche AG Ph-gradient spr-based binding assay
JP2022519828A (ja) 2019-01-31 2022-03-25 サノフィ・バイオテクノロジー 若年性特発性関節炎を治療するための抗ｉｌ－６受容体抗体
WO2020172596A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and thereof
GB2597851A (en) 2019-02-21 2022-02-09 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
GB2599229B (en) 2019-02-21 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
GB2599227B (en) 2019-02-21 2024-05-01 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
WO2020172571A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
EP3943108A4 (en) 2019-03-19 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING AN ANTIGEN-BINDING DOMAIN WHOSE ANTIGEN-BINDING ACTIVITY IS ALTERED DEPENDING ON THE MTA, AND BANK FOR OBTAINING SUCH ANTIGEN-BINDING DOMAIN
MX2021012251A (es) 2019-04-10 2021-11-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para purificar un anticuerpo modificado en la region de fragmento cristalizable (fc).
GB2589049C (en) 2019-04-11 2024-02-21 argenx BV Anti-IgE antibodies
US20230002481A1 (en) * 2019-05-15 2023-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha An antigen-binding molecule, a pharmaceutical composition, and a method
JP2022534080A (ja) * 2019-05-23 2022-07-27 シァメン・ユニヴァーシティ 新規の抗ｂ型肝炎ウイルス抗体及びその使用
JPWO2020246567A1 (ko) 2019-06-05 2020-12-10
KR20220017430A (ko) 2019-06-05 2022-02-11 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 절단 부위 결합 분자
EP3980465A4 (en) * 2019-06-07 2023-11-01 Adimab, LLC MODIFIED PH-DEPENDENT ANTI-CD3 ANTIBODIES, AND METHODS OF GENERATION AND USE THEREOF
EP3986571A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
EP3986931A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
US20210054054A1 (en) * 2019-08-19 2021-02-25 The Rockefeller University Engineering ph-dependent antigen binding activity into anti-hiv antibodies with improved pharmacokinetics
CA3153207A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha An antibody, a pharmaceutical composition, and a method
CN114867532A (zh) 2019-12-18 2022-08-05 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ccl2抗体
WO2021131021A1 (ja) 2019-12-27 2021-07-01 中外製薬株式会社 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
CA3173864A1 (en) * 2020-04-22 2021-10-28 Shyr Jiann Li Long-acting anti-il31 antibodies for veterinary use
EP4139363A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
TW202220694A (zh) 2020-07-28 2022-06-01 日商中外製藥股份有限公司 含有新穎之改變型抗體、具有針套的帶針頭預填充注射器製劑
CN116194124A (zh) 2020-07-31 2023-05-30 中外制药株式会社 包含表达嵌合受体的细胞的药物组合物
GB2616128A (en) 2020-08-26 2023-08-30 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
WO2022046920A2 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
CN116761818A (zh) 2020-08-26 2023-09-15 马伦戈治疗公司 检测trbc1或trbc2的方法
WO2022044248A1 (ja) 2020-08-28 2022-03-03 中外製薬株式会社 ヘテロ二量体Ｆｃポリペプチド
AU2022218165B2 (en) * 2021-02-03 2024-02-29 Mythic Therapeutics, Inc. Anti-met antibodies and uses thereof
AU2022255506A1 (en) 2021-04-08 2023-11-09 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
EP4342984A1 (en) 2021-05-19 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for predicting in vivo pharmacokinetics of molecule
EP4355785A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
KR20240021859A (ko) 2021-06-18 2024-02-19 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 항-ccl2 항체
CR20240026A (es) 2021-06-25 2024-03-14 Chugai Seiyaku Kk Anticuerpo anti-ctla-4
KR20240024255A (ko) 2021-06-25 2024-02-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ctla-4 항체의 사용
CA3236108A1 (en) 2022-01-18 2023-07-27 Paul Sebastian VAN DER WONING Galectin-10 antibodies
GB202211100D0 (en) 2022-07-29 2022-09-14 Stam Jord Cornelis Lysosomal degradation

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050026071A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Lee Geun Su Photoresist polymers and photoresist compositions comprising the same

Family Cites Families (497)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5229888B2 (ko) 1972-02-01 1977-08-04
US4769320A (en) 1982-07-27 1988-09-06 New England Medical Center Hospitals, Inc. Immunoassay means and methods useful in human native prothrombin and human abnormal prothorombin determinations
CA1209907A (en) * 1982-04-12 1986-08-19 Richard M. Bartholomew Method of affinity purification employing monoclonal antibodies
JPS58201994A (ja) 1982-05-21 1983-11-25 Hideaki Hagiwara 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法
US4689299A (en) * 1982-09-30 1987-08-25 University Of Rochester Human monoclonal antibodies against bacterial toxins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6088703A (ja) 1983-10-18 1985-05-18 新日本製鐵株式会社 耐重荷重性舗装体
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JPH06104071B2 (ja) 1986-08-24 1994-12-21 財団法人化学及血清療法研究所 第▲ｉｘ▼因子コンホメ−シヨン特異性モノクロ−ナル抗体
US4801687A (en) * 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
JPS63149900A (ja) 1986-12-15 1988-06-22 Toshiba Corp 半導体メモリ
US4851341A (en) 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
JPH01144991A (ja) 1987-12-02 1989-06-07 Kagaku Oyobi Ketsusei Riyouhou Kenkyusho 血液凝固第８因子の精製方法
US5670373A (en) * 1988-01-22 1997-09-23 Kishimoto; Tadamitsu Antibody to human interleukin-6 receptor
US5322678A (en) * 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
US5126250A (en) * 1988-09-28 1992-06-30 Eli Lilly And Company Method for the reduction of heterogeneity of monoclonal antibodies
IL91778A (en) 1988-09-28 1994-10-07 Lilly Co Eli A method for reducing the heterogeneity of monoclonal antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2006684C (en) 1988-12-30 1996-12-17 Charles T. Esmon Monoclonal antibody against protein c
US5202253A (en) 1988-12-30 1993-04-13 Oklahoma Medical Research Foundation Monoclonal antibody specific for protein C and antibody purification method
JPH0636741B2 (ja) 1989-11-08 1994-05-18 帝人株式会社 ヒト・プロテインｃの分離方法
DE69130561T2 (de) 1990-02-16 1999-06-24 Boston Biomed Res Inst Hybride Reagenzien mit der Fähigkeit, Moleküle selektiv in Zellen freizusetzen
US5130129A (en) 1990-03-06 1992-07-14 The Regents Of The University Of California Method for enhancing antibody transport through capillary barriers
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
GB9022547D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Purified immunoglobulin
WO1992019759A1 (en) 1991-04-25 1992-11-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
US5468634A (en) * 1991-06-24 1995-11-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Axl oncogene
JP3087857B2 (ja) 1991-07-04 2000-09-11 東洋紡績株式会社 交編編地の染色処理方法
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
JP3507073B2 (ja) 1992-03-24 2004-03-15 ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド 特異的結合対の成員の製造方法
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
CA2140638C (en) 1992-07-24 2010-05-04 Raju Kucherlapati Generation of xenogeneic antibodies
BR9204244A (pt) 1992-10-26 1994-05-03 Cofap Ferro fundido cinzento
EP0671951A4 (en) 1992-12-01 1997-05-21 Protein Design Labs Inc HUMANIZED ANTIBODIES REACTING WITH L-SELECTIN.
EP1333035A3 (en) 1993-03-19 2004-07-07 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US7393682B1 (en) 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
JPH08511423A (ja) 1993-06-10 1996-12-03 ジェネティック セラピー，インコーポレイテッド 血友病治療のためのアデノウイルスベクター
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
FR2707189B1 (fr) 1993-07-09 1995-10-13 Gradient Ass Procédé de traitement de résidus de combustion et installation de mise en Óoeuvre dudit procédé.
GB9314271D0 (en) 1993-07-09 1993-08-18 Inst Of Cancer The Research Cell growth factor receptors
WO1996011020A1 (fr) 1994-10-07 1996-04-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Medicament contre la polyarthrite rhumatoide contenant un antagoniste d'interleukine 6 comme principe actif
IL107742A0 (en) 1993-11-24 1994-02-27 Yeda Res & Dev Chemically-modified binding proteins
US6214613B1 (en) 1993-12-03 2001-04-10 Ashai Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Expression screening vector
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
JPH07177572A (ja) 1993-12-20 1995-07-14 Matsushita Electric Ind Co Ltd コードレス電話の留守番方法
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5945311A (en) * 1994-06-03 1999-08-31 GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit Method for producing heterologous bi-specific antibodies
DE4419399C1 (de) 1994-06-03 1995-03-09 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US8017121B2 (en) * 1994-06-30 2011-09-13 Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component
HU220347B (hu) 1994-07-11 2001-12-28 Board Of Regents The University Of Texas System Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához
EP0770628B9 (en) 1994-07-13 2007-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
US6048972A (en) 1994-07-13 2000-04-11 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Recombinant materials for producing humanized anti-IL-8 antibodies
TW416960B (en) 1994-07-13 2001-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Reshaped human antibody to human interleukin-8
JP3865418B2 (ja) 1994-07-13 2007-01-10 中外製薬株式会社 ヒトインターロイキン−８に対する再構成ヒト抗体
CN1156460A (zh) 1994-07-13 1997-08-06 中外制药株式会社 抗人白细胞介素-8的重构人抗体
US6309636B1 (en) 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides
WO1996012503A1 (fr) * 1994-10-21 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remede contre des maladies provoquees par la production d'il-6
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US5830478A (en) 1995-06-07 1998-11-03 Boston Biomedical Research Institute Method for delivering functional domains of diphtheria toxin to a cellular target
CN1241944C (zh) * 1995-09-11 2006-02-15 协和发酵工业株式会社 抗人白介素－5受体α链的抗体
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
SK1499A3 (en) 1996-07-19 1999-08-06 Amgen Inc Analogs of cationic proteins
AU3968897A (en) 1996-08-02 1998-02-25 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US7247302B1 (en) 1996-08-02 2007-07-24 Bristol-Myers Squibb Company Method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
BR9713294A (pt) 1996-09-26 2000-10-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd "anticorpos contra proteìna relacionada a hormÈnio de paratiróide humano"
US6025158A (en) 1997-02-21 2000-02-15 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
JPH10324639A (ja) 1997-03-21 1998-12-08 Chugai Pharmaceut Co Ltd Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する感作ｔ細胞関与疾患の予防・治療剤
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
FR2761994B1 (fr) 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires
ES2183351T3 (es) 1997-04-17 2003-03-16 Amgen Inc Composicones que comprenden conjugados de proteina ob humana activa estable con una cadena fc de inmunoglobulinas y metodos.
AU751659B2 (en) 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US5980893A (en) 1997-07-17 1999-11-09 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Agonist murine monoclonal antibody as a stimulant for megakaryocytopoiesis
US20020187150A1 (en) * 1997-08-15 2002-12-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient
CA2296322A1 (en) 1997-08-15 1999-02-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives and/or remedies for systemic lupus erythematosus containing anti-il-6 receptor antibody as the active ingredient
CN1277632A (zh) * 1997-10-03 2000-12-20 中外制药株式会社 天然人源化抗体
US6458355B1 (en) 1998-01-22 2002-10-01 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
EP1074268B1 (en) 1998-03-17 2008-01-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Preventives or remedies for inflammatory intestinal diseases containing il-6 receptor antagonist antibodies
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
CA2341029A1 (en) * 1998-08-17 2000-02-24 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6475718B2 (en) 1998-09-08 2002-11-05 Schering Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating the interaction between the APJ receptor and the HIV virus
DE69942671D1 (de) * 1998-12-01 2010-09-23 Facet Biotech Corp Humanisierte antikoerper gegen gamma-interferon
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2694002T3 (es) 1999-01-15 2018-12-17 Genentech, Inc. Polipéptido que comprende una región Fc de IgG1 humana variante
AU2006225302B2 (en) 1999-03-25 2010-08-12 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
DK1188830T3 (da) 1999-06-02 2010-04-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Nyt hæmopoietinreceptorprotein NR10
US6331642B1 (en) 1999-07-12 2001-12-18 Hoffmann-La Roche Inc. Vitamin D3 analogs
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
US20040058393A1 (en) 2000-04-17 2004-03-25 Naoshi Fukishima Agonist antibodies
AU2001266272B2 (en) 2000-05-03 2005-09-15 Medigene Ag Cationic diagnostic, imaging and therapeutic agents associated with activated vascular sites
NZ522700A (en) * 2000-06-16 2006-02-24 Human Genome Sciences Inc Antibodies that immunospecifically bind to blys
AU2011244851A1 (en) 2000-07-27 2011-11-24 The John Hopkins University School Of Medicine Promyostatin peptides and methods of using same
ATE448301T1 (de) 2000-09-08 2009-11-15 Univ Zuerich Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten
CA2785941C (en) 2000-10-06 2017-01-10 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
PT1325033E (pt) 2000-10-10 2010-04-15 Genentech Inc Inibição da activação do complemento c5 para o tratamento e a prevenção da rejeição diferida de um xenoenxertos ou de uma rejeição vascular aguda
JP2004526419A (ja) 2000-10-16 2004-09-02 フィロス インク． 抗体模倣物および他の結合タンパク質のためのタンパク質骨格
KR100824824B1 (ko) 2000-10-25 2008-04-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 아이엘-6 안타고니스트를 유효 성분으로서 함유하는건선의 예방 또는 치료제
JP4889187B2 (ja) * 2000-10-27 2012-03-07 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６アンタゴニストを有効成分として含有する血中ｍｍｐ−３濃度低下剤
ES2649037T3 (es) 2000-12-12 2018-01-09 Medimmune, Llc Moléculas con semividas prolongadas, composiciones y usos de las mismas
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
UA80091C2 (en) 2001-04-02 2007-08-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist
WO2002079255A1 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
IL158376A0 (en) * 2001-04-13 2004-05-12 Biogen Inc Antibodies to vla-1
US7667004B2 (en) 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
JP4281869B2 (ja) 2001-06-22 2009-06-17 中外製薬株式会社 抗グリピカン３抗体を含む細胞増殖抑制剤
EP1399484B1 (en) 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
US20040161741A1 (en) 2001-06-30 2004-08-19 Elazar Rabani Novel compositions and processes for analyte detection, quantification and amplification
JP4958387B2 (ja) 2001-08-17 2012-06-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｃ５ｂの形成を妨害することなくｃ５及びｃ５ａに結合する補体経路阻害剤
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US20030190705A1 (en) 2001-10-29 2003-10-09 Sunol Molecular Corporation Method of humanizing immune system molecules
JP2007528691A (ja) 2001-11-14 2007-10-18 セントカー・インコーポレーテツド 抗ｉｌ−６抗体、組成物、方法および使用
ATE395413T1 (de) 2001-12-03 2008-05-15 Amgen Fremont Inc Antikörperkategorisierung auf der grundlage von bindungseigenschaften
EP3960855A1 (en) 2001-12-28 2022-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for stabilizing proteins
EP1961811B1 (en) * 2002-01-18 2010-08-25 ZymoGenetics, Inc. Cytokine ligand for the treatment of asthma and airway hyper-responsiveness
EP2338910B1 (en) * 2002-01-18 2015-07-08 ZymoGenetics, Inc. Cytokine receptor Zcytor17 multimers
US20030224397A1 (en) 2002-02-11 2003-12-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
AR038568A1 (es) 2002-02-20 2005-01-19 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-a beta y su uso
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
US20050130224A1 (en) * 2002-05-31 2005-06-16 Celestar Lexico- Sciences, Inc. Interaction predicting device
WO2003102580A1 (en) 2002-05-31 2003-12-11 Biacore Ab Method of coupling binding agents to a substrate surface
CA2489022C (en) * 2002-06-12 2012-10-16 Genencor International, Inc. Methods for improving a binding characteristic of a molecule
US20060141456A1 (en) * 2002-06-12 2006-06-29 Cynthia Edwards Methods and compositions for milieu-dependent binding of a targeted agent to a target
ITMI20021527A1 (it) 2002-07-11 2004-01-12 Consiglio Nazionale Ricerche Anticorpi anti componente c5 del complemento e loro uso
EP1382969A1 (en) 2002-07-17 2004-01-21 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Diagnosis and prevention of cancer cell invasion
US20040138118A1 (en) 2002-09-16 2004-07-15 Neil Wolfman Metalloprotease activation of myostatin, and methods of modulating myostatin activity
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
AU2003286467B2 (en) 2002-10-15 2009-10-01 Abbvie Biotherapeutics Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2004034988A2 (en) * 2002-10-16 2004-04-29 Amgen Inc. Human anti-ifn-ϝ neutralizing antibodies as selective ifn-ϝ pathway inhibitors
US7261893B2 (en) 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
EP1590364B1 (en) 2002-12-16 2011-10-05 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against interleukin 8 (il-8)
JP2006523090A (ja) 2002-12-27 2006-10-12 ドマンティス リミテッド リガンドに、そしてリガンド受容体に特異的な二重特異性単一ドメイン抗体
DK1601697T3 (da) 2003-02-28 2007-10-01 Lonza Biologics Plc Oprensning af antistof ved protein A- og ionbytningskromatografi
US20040223970A1 (en) * 2003-02-28 2004-11-11 Daniel Afar Antibodies against SLC15A2 and uses thereof
CA2517396A1 (en) 2003-02-28 2005-03-10 Antigenics Inc. Use of lectins to promote oligomerization of glycoproteins and antigenic molecules
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
AU2004229311B2 (en) 2003-03-04 2009-07-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of treating autoimmune disease by inducing antigen presentation by tolerance inducing antigen presenting cells
EA009026B1 (ru) 2003-03-24 2007-10-26 Займоджинетикс, Инк. Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях
GB2401040A (en) 2003-04-28 2004-11-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for treating interleukin-6 related diseases
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
EP1635870A2 (en) 2003-06-02 2006-03-22 Wyeth Use of myostatin (gdf8) inhibitors in conjunction with corticosteroids for treating neuromuscular disorders
JP2005004970A (ja) 2003-06-09 2005-01-06 Hitachi Cable Ltd 複合ケーブルおよびこれを用いた先行配線システム
EP1636264A2 (en) 2003-06-24 2006-03-22 MERCK PATENT GmbH Tumour necrosis factor receptor molecules with reduced immunogenicity
WO2005023193A2 (en) 2003-09-04 2005-03-17 Interleukin Genetics, Inc. Methods of treating endometriosis
WO2005027966A2 (en) * 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
WO2005035754A1 (ja) 2003-10-14 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
CA2545539A1 (en) 2003-10-15 2005-04-28 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis of positions 250, 314 and/or 428 of the heavy chain constant region of ig
BRPI0415505A (pt) 2003-10-17 2006-12-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd agente terapêutico para mesotelioma
CA2543360A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Joost A. Kolkman Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
DK1689777T3 (da) * 2003-11-05 2007-06-11 Ares Trading Sa Fremgangsmåde til oprensning af il18-bindende protein
EP1697415A1 (en) 2003-11-12 2006-09-06 Biogen Idec MA Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
US20050100965A1 (en) 2003-11-12 2005-05-12 Tariq Ghayur IL-18 binding proteins
US20050142133A1 (en) 2003-12-03 2005-06-30 Xencor, Inc. Optimized proteins that target the epidermal growth factor receptor
EP1697741A4 (en) 2003-12-04 2008-02-13 Xencor Inc PROCESS FOR PRODUCING PROTEIN VARIANTS WITH INCREASED HOST STRUCTURE CONTENT AND COMPOSITIONS THEREOF
US20050191293A1 (en) * 2003-12-10 2005-09-01 Shrikant Deshpande IP-10 antibodies and their uses
AR048210A1 (es) 2003-12-19 2006-04-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Un agente preventivo para la vasculitis.
EP1697520A2 (en) 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
EP1699820A2 (en) 2003-12-31 2006-09-13 Schering-Plough Ltd. Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
US20080089892A1 (en) 2004-01-12 2008-04-17 Eli Lilly And Co. Fc Region Variants
US20050169921A1 (en) 2004-02-03 2005-08-04 Leonard Bell Method of treating hemolytic disease
US20070116710A1 (en) 2004-02-03 2007-05-24 Leonard Bell Methods of treating hemolytic anemia
ATE464908T1 (de) 2004-02-11 2010-05-15 Warner Lambert Co Verfahren zur behandlung von osteoarthritis mit anti-il-6 antikörpern
WO2005094446A2 (en) 2004-03-23 2005-10-13 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
AR048335A1 (es) 2004-03-24 2006-04-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo
US8398980B2 (en) * 2004-03-24 2013-03-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Subtypes of humanized antibody against interleuken-6 receptor
KR20070035482A (ko) 2004-03-24 2007-03-30 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 인터로킨-6 안타고니스트를 활성성분으로 함유하는내이장해 치료제
EP1737890A2 (en) * 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
US20050260711A1 (en) 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
KR20070038453A (ko) 2004-04-16 2007-04-10 마크로제닉스, 인크. ＦｃγＲＩＩＢ-특이적 항체 및 그의 사용 방법
WO2006009901A2 (en) * 2004-06-18 2006-01-26 Ambrx, Inc. Novel antigen-binding polypeptides and their uses
JP2008504289A (ja) 2004-06-25 2008-02-14 メディミューン，インコーポレーテッド 部位特異的突然変異誘発による哺乳動物細胞における組換え抗体の産生の増加
DE102004032634A1 (de) 2004-07-06 2006-02-16 Sms Demag Ag Verfahren und Einrichtung zum Messen und Regeln der Planheit und/oder der Bandspannungen eines Edelstahlbandes oder einer Edelstahlfolie beim Kaltwalzen in einem Vielwalzengerüst, insbesondere in einem 20-Walzen-Sendizimir-Walzwerk
US9012369B2 (en) 2004-07-06 2015-04-21 Pfizer Inc. Look-through mutagenesis for developing altered polypeptides with enhanced properties
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2005263331B8 (en) * 2004-07-20 2011-06-16 Symphogen A/S Anti-Rhesus D recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
DK1776384T3 (da) 2004-08-04 2013-09-02 Mentrik Biotech Llc VARIANT-Fc-REGIONER
CA2577370A1 (en) 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Inc. Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
KR20070057839A (ko) 2004-08-19 2007-06-07 제넨테크, 인크. 변경된 이펙터 기능을 갖는 폴리펩티드 변이체
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
CN101132811B (zh) 2004-10-22 2012-05-30 米迪缪尼有限公司 抗hmgb1的高亲和力抗体及其用法
JP5553963B2 (ja) * 2004-10-22 2014-07-23 アムジエン・インコーポレーテツド 組換え抗体をリフォールディングする方法
AU2005302453A1 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Medimmune, Llc Methods of preventing and treating RSV infections and related conditions
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
RU2412200C2 (ru) 2004-11-12 2011-02-20 Ксенкор, Инк. Fc-ВАРИАНТЫ С ИЗМЕНЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ С FcRn
DK1817340T3 (da) 2004-11-12 2012-08-13 Xencor Inc Fc-varianter med ændret binding til fcrn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US20070135620A1 (en) * 2004-11-12 2007-06-14 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8329186B2 (en) 2004-12-20 2012-12-11 Isu Abxis Co., Ltd Treatment of inflammation using BST2 inhibitor
JPWO2006067847A1 (ja) 2004-12-22 2008-06-12 中外製薬株式会社 フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法
EP1831243B1 (en) 2004-12-23 2010-03-17 Novo Nordisk A/S Antibody binding affinity ligands
US20090087478A1 (en) 2004-12-27 2009-04-02 Progenics Pharmaceuticals (Nevada), Inc. Orally Deliverable and Anti-Toxin Antibodies and Methods for Making and Using Them
EP1831258B2 (en) 2004-12-28 2023-06-07 Innate Pharma S.A. Monoclonal antibodies against nkg2a
CA2595169A1 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc. Antibodies and fc fusion proteins with altered immunogenicity
GB0502358D0 (en) 2005-02-04 2005-03-16 Novartis Ag Organic compounds
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
US20060182743A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-17 Janine Bilsborough Methods of treating skin disorders using an IL-31RA antagonist
JP5153613B2 (ja) 2005-03-18 2013-02-27 メディミューン，エルエルシー 抗体のフレームワーク・シャッフル
WO2006106905A1 (ja) 2005-03-31 2006-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 会合制御によるポリペプチド製造方法
US9493569B2 (en) 2005-03-31 2016-11-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Structural isomers of sc(Fv)2
AU2006230413B8 (en) 2005-03-31 2011-01-20 Xencor, Inc Fc variants with optimized properties
CA2957144C (en) * 2005-04-08 2020-06-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody substituting for function of blood coagulation factor viii
PL1874819T3 (pl) * 2005-04-18 2015-10-30 Amgen Res Munich Gmbh Przeciwciała neutralizujące ludzki czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytów i makrofagów
CA2605964A1 (en) 2005-04-20 2006-10-26 Amgen Fremont Inc. High affinity fully human monoclonal antibodies to interleukin-8 and epitopes for such antibodies
MX2007013217A (es) 2005-04-25 2008-03-11 Pfizer Anticuerpos contra miostatina.
US8008443B2 (en) 2005-04-26 2011-08-30 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
PE20061324A1 (es) 2005-04-29 2007-01-15 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-6, composiciones, metodos y usos
MY148086A (en) 2005-04-29 2013-02-28 Rinat Neuroscience Corp Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US7592429B2 (en) 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
EP1896503B1 (en) 2005-05-31 2014-10-29 Board of Regents, The University of Texas System IgG1 ANTIBODIES WITH MUTATED Fc PORTION FOR INCREASED BINDING TO FcRn RECEPTOR AND USES TEHEREOF
AU2006256041B2 (en) * 2005-06-10 2012-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof
US7557190B2 (en) 2005-07-08 2009-07-07 Xencor, Inc. Optimized proteins that target Ep-CAM
SI1912675T1 (sl) 2005-07-25 2014-07-31 Emergent Product Development Seattle, Llc zmanjšanje števila celic B z uporabo molekul, ki se specifično vežejo na CD37 in CD20
DK1919503T3 (en) 2005-08-10 2014-12-15 Macrogenics Inc Identification and preparation of antibodies with variant fc regions and methods of use thereof
CN103450359B (zh) 2005-08-19 2018-07-24 惠氏有限责任公司 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途
EP1931709B1 (en) 2005-10-03 2016-12-07 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
EP1951756B1 (en) 2005-10-06 2015-01-07 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
AU2006302254B2 (en) 2005-10-06 2011-05-26 Xencor, Inc. Optimized anti-CD30 antibodies
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
CA2625773C (en) 2005-10-14 2015-05-12 Fukuoka University Inhibition of interleukin-6 (il-6) receptor promotes pancreatic islet transplantation
JP5191235B2 (ja) 2005-10-21 2013-05-08 中外製薬株式会社 心疾患治療剤
WO2007056441A2 (en) * 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
AR057582A1 (es) 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
AR057579A1 (es) 2005-11-23 2007-12-05 Merck & Co Inc Compuestos espirociclicos como inhibidores de histona de acetilasa (hdac)
WO2007060411A1 (en) 2005-11-24 2007-05-31 Ucb Pharma S.A. Anti-tnf alpha antibodies which selectively inhibit tnf alpha signalling through the p55r
AR057941A1 (es) 2005-11-25 2007-12-26 Univ Keio Agentes terapeuticos para el cancer de prostata
WO2007076200A2 (en) 2005-11-28 2007-07-05 Medimmune, Inc. Antagonists of hmgb1 and/or rage and methods of use thereof
WO2007059782A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
CN101330923B (zh) 2005-12-12 2015-01-07 Ac免疫有限公司 治疗性疫苗
EP1977763A4 (en) 2005-12-28 2010-06-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd STABILIZER PREPARATION CONTAINING ANTIBODIES
MX2008008621A (es) 2005-12-29 2008-11-27 Centocor Inc Anticuerpos anti-il-23 humanos, composiciones, metodos y usos.
EP1991581A2 (en) 2006-01-10 2008-11-19 Zymogenetics, Inc. Methods of treating pain and inflammation in neuronal tissue using il-31 antagonists
AR059213A1 (es) 2006-01-27 2008-03-19 Univ Keio Agentes terapeuticos para enfermedades que involucran neovascularizacion coroidal
CA2638811A1 (en) 2006-02-03 2007-08-16 Medimmune, Llc Protein formulations
US20070190056A1 (en) 2006-02-07 2007-08-16 Ravi Kambadur Muscle regeneration compositions and uses therefor
JP4179517B2 (ja) 2006-02-21 2008-11-12 プロテノバ株式会社 イムノグロブリン親和性リガンド
WO2007097361A1 (ja) 2006-02-21 2007-08-30 Protenova Co., Ltd. イムノグロブリン親和性リガンド
PL1988882T3 (pl) 2006-03-02 2015-04-30 Alexion Pharma Inc Wydłużanie przeżycia alloprzeszczepu poprzez inhibowanie aktywności dopełniacza
CA3148917A1 (en) 2006-03-08 2007-09-13 Archemix Llc Complement binding aptamers and anti-c5 agents useful in the treatment of ocular disorders
DK2359834T5 (en) 2006-03-15 2017-02-06 Alexion Pharma Inc Treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria patients with a complement inhibitor
WO2007109254A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized polypeptide compositions
KR20090013763A (ko) 2006-03-23 2009-02-05 기린 파마 가부시끼가이샤 인간 트롬보포이에틴 수용체에 대한 아고니스트 항체
EA200802061A1 (ru) 2006-03-28 2009-04-28 Байоджен Айдек Эмэй Инк. Антитело или его фрагмент, специфично связывающееся с рецептором 1 инсулиноподобного фактора роста (igf-r1) (варианты), композиция на его основе, полинуклеотид, кодирующий вариабельную область антитела (варианты), содержащие полинуклеотид композиция (варианты) и вектор, содержащая вектор клетка-хозяин (варианты), способ продуцирования антитела или его фрагмента (варианты) и способ лечения гиперпролиферативного заболевания у животного организма
US9670269B2 (en) * 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
ES2568436T3 (es) 2006-03-31 2016-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Procedimiento para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
SG170837A1 (en) 2006-04-05 2011-05-30 Abbott Biotech Ltd Antibody purification
CN101495146B (zh) 2006-04-07 2012-10-17 国立大学法人大阪大学 肌肉再生促进剂
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
NZ572565A (en) 2006-05-25 2011-04-29 Glaxo Group Ltd Modified humanised anti-interleukin-18 antibodies
RS52643B (en) 2006-06-02 2013-06-28 Regeneron Pharmaceuticals Inc. HIGH AFINITY ANTIBODIES TO THE HUMAN IL-6 RECEPTOR
US8080248B2 (en) 2006-06-02 2011-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody
ES2429407T3 (es) 2006-06-08 2013-11-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Agente preventivo o remedio para enfermedades inflamatorias
US7858756B2 (en) * 2006-06-15 2010-12-28 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Monoclonal antibodies that selectively recognize methamphetamine and methamphetamine like compounds
TW200817006A (en) 2006-06-23 2008-04-16 Smithkline Beecham Corp IL-8 receptor antagonist
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
SI2059536T1 (sl) 2006-08-14 2014-06-30 Xencor, Inc. Optimirana protitelesa, ki ciljajo CD19
DE102006038844B4 (de) 2006-08-18 2018-03-22 Robert Bosch Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur Ansteuerung von Personenschutzmittel
PT2066695E (pt) 2006-09-05 2013-05-23 Lilly Co Eli Anticorpos anti-miostatina
KR101456728B1 (ko) 2006-09-08 2014-10-31 메디뮨 엘엘씨 인간화 항-ｃｄ19 항체, 및 이것의 종양학, 이식 및 자가면역 질환의 치료에서의 용도
AU2007299843B2 (en) 2006-09-18 2012-03-08 Xencor, Inc Optimized antibodies that target HM1.24
JP2008104147A (ja) 2006-09-19 2008-05-01 Ricoh Co Ltd 撮像装置、撮像システム、画像データ処理方法およびプログラム
EP2695896B1 (en) * 2006-10-06 2018-08-22 The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Prevention of tissue ischemia, related methods and compositions
US20100034194A1 (en) * 2006-10-11 2010-02-11 Siemens Communications Inc. Eliminating unreachable subscribers in voice-over-ip networks
WO2008121160A2 (en) 2006-11-21 2008-10-09 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target cd5
CN100455598C (zh) 2006-11-29 2009-01-28 中国抗体制药有限公司 功能人源化抗人cd20抗体及其应用
WO2008091798A2 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Xencor, Inc. Optimized ca9 antibodies and methods of using the same
MX2009007830A (es) 2007-01-23 2009-10-07 Univ Shinshu Inhibidor de rechazo cronico.
WO2008091954A2 (en) 2007-01-23 2008-07-31 Xencor, Inc. Optimized cd40 antibodies and methods of using the same
JPWO2008090960A1 (ja) * 2007-01-24 2010-05-20 協和発酵キリン株式会社 ガングリオシドｇｍ２に特異的に結合する遺伝子組換え抗体組成物
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
WO2008098115A2 (en) 2007-02-07 2008-08-14 Xencor, Inc. Optimized igf-1r antibodies and methods of using the same
DE602008004296D1 (de) * 2007-02-14 2011-02-17 Vaccinex Inc Humanisierte anti-cd100-antikörper
HUE042172T2 (hu) 2007-02-23 2019-06-28 Merck Sharp & Dohme Genetikailag elõállított anti-il-23P19 antitestek
MY149129A (en) 2007-03-20 2013-07-15 Lilly Co Eli Anti-sclerostin antibodies
EP2129681A2 (en) 2007-03-22 2009-12-09 Novartis Ag C5 antigens and uses thereof
CL2008001071A1 (es) 2007-04-17 2009-05-22 Smithkline Beecham Corp Metodo para obtener anticuerpo penta-especifico contra il-8/cxcl8, gro-alfa/cxcl1, gro-beta/cxcl2), gro-gama/cxcl3 y ena-78/cxcl5 humanas; anticuerpo penta-especifico; proceso de produccion del mismo; vector, hbridoma o celela que lo comprende; composicion farmceutica; uso para tratar copd, otras enfermedades.
GB0708002D0 (en) 2007-04-25 2007-06-06 Univ Sheffield Antibodies
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
AU2008260498B2 (en) 2007-05-30 2012-11-29 Xencor, Inc. Methods and compositions for inhibiting CD32b expressing cells
EP2155790A1 (en) 2007-05-31 2010-02-24 Genmab A/S Method for extending the half-life of exogenous or endogenous soluble molecules
DK2164961T3 (en) 2007-06-25 2015-03-02 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Sequence based forward position and optimization of single chain ​​antibodies
WO2009000099A2 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Esbatech Ag Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties
CA2691974C (en) 2007-06-29 2016-08-30 Quest Diagnostics Investments Incorporated Analysis of amino acids in body fluid by liquid chromatography-mass spectrometry
WO2009014263A1 (ja) 2007-07-26 2009-01-29 Osaka University インターロイキン６受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤
WO2009026117A2 (en) 2007-08-16 2009-02-26 Glaxo Group Limited Novel compounds
AU2008295506A1 (en) 2007-08-28 2009-03-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-IGF-1R antibodies and uses thereof
KR20100052545A (ko) 2007-08-28 2010-05-19 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 Ｉｇｆ―１ｒ의 다중 에피토프에 결합하는 조성물
EP2031064A1 (de) * 2007-08-29 2009-03-04 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG Verfahren zur Steigerung von Proteintitern
CL2008002775A1 (es) 2007-09-17 2008-11-07 Amgen Inc Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea.
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
CN101939425B (zh) 2007-09-26 2014-05-14 中外制药株式会社 抗il-6受体抗体
SG10201605394SA (en) 2007-09-26 2016-08-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified Antibody Constant Region
WO2009041734A1 (ja) 2007-09-26 2009-04-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. ヒトトロンボポエチン受容体に対するアゴニスト抗体
BRPI0817637A2 (pt) 2007-09-28 2015-09-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo anti-glipican-3 tendo cinéticas aperfeiçoadas no plasma
KR100888133B1 (ko) 2007-10-02 2009-03-13 에스케이에너지 주식회사 4종의 금속성분으로 구성된 다성분계 비스무스몰리브데이트 촉매 제조방법 및 상기촉매를 이용하여1,3-부타디엔을 제조하는 방법
CA2701155C (en) 2007-10-02 2016-11-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic agents for graft-versus-host disease comprising interleukin 6 receptor inhibitor as active ingredient
AR068767A1 (es) 2007-10-12 2009-12-02 Novartis Ag Anticuerpos contra esclerostina, composiciones y metodos de uso de estos anticuerpos para tratar un trastorno patologico mediado por esclerostina
AU2008314687A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 Merck Serono S.A. Method for purifying Fc-fusion proteins
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
CN101918452A (zh) 2007-11-15 2010-12-15 中外制药株式会社 与Anexelekto结合的单克隆抗体及其利用
MX2010006097A (es) 2007-12-05 2010-08-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes terapeuticos para tratar el prurito.
RU2531521C2 (ru) * 2007-12-05 2014-10-20 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитело против nr10 и его применение
EP2261254A3 (en) * 2007-12-21 2011-04-13 Amgen, Inc Anti-amyloid antibodies and uses thereof
ES2532461T3 (es) 2007-12-26 2015-03-27 Xencor, Inc. Variantes de FC con enlazamiento alterado a FCRN
DK2229409T3 (da) 2008-01-18 2013-01-14 Sanquin Bloedvoorziening Fremgangsmåde til at forøge den terapeutiske effektivitet af immunoglobulin-G-klasse-3-(IgG3)-antistoffer
CA2712432C (en) 2008-01-29 2018-09-25 Ablynx N.V. Methods to stabilize single variable domains
AU2015227424A1 (en) 2008-04-11 2015-10-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
EP4238993A3 (en) 2008-04-11 2023-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
AU2009246946B2 (en) * 2008-05-01 2013-09-26 Amgen Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
US9119818B2 (en) 2008-05-14 2015-09-01 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Use of angiogenin or angiogenin agonists for treating diseases and disorders
CN102256623A (zh) 2008-06-05 2011-11-23 独立行政法人国立癌症研究中心 神经浸润抑制剂
PL2328616T3 (pl) 2008-08-05 2015-10-30 Novartis Ag Kompozycje i sposoby dla przeciwciał celujących białko dopełniacza C5
LT3190128T (lt) 2008-09-17 2019-01-10 Xencor, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti ige sukeltų sutrikimų gydymui
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
JP5229888B2 (ja) 2008-09-30 2013-07-03 独立行政法人産業技術総合研究所 弱酸性域での易解離性を向上したプロテインａ変異型タンパク質及び抗体捕捉剤
EP2352521B1 (en) 2008-10-14 2020-09-16 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
AU2009313203B2 (en) 2008-11-10 2015-08-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating complement-associated disorders
WO2010058860A1 (ja) 2008-11-18 2010-05-27 株式会社シノテスト 試料中のｃ反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬
MX2011005408A (es) 2008-11-25 2011-06-16 Alder Biopharmaceuticals Inc Antagonistas de il-6 para prevenir o tratar la trombosis.
AR074777A1 (es) 2008-12-19 2011-02-09 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigeno
EP2385955B1 (en) 2009-01-12 2020-08-12 CytomX Therapeutics, Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
US20120100140A1 (en) 2009-01-23 2012-04-26 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized fc polypeptides with reduced effector function and methods of use
EP2400981A4 (en) * 2009-02-26 2013-02-27 Lpath Inc DESGIN FOR HUMANIZED THROMBOZYTE ACTIVATION FACTOR ANTIBODIES BY ANTI-LIPID ANTIBODY TEMPLATES
JP5787446B2 (ja) * 2009-03-19 2015-09-30 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
US9228017B2 (en) * 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
WO2010106812A1 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical formulation containing improved antibody molecules
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
WO2010131733A1 (ja) 2009-05-15 2010-11-18 中外製薬株式会社 抗axl抗体
US20120303083A1 (en) 2009-05-26 2012-11-29 The Johns Hopkins University Novel desmin phosphorylation sites useful in diagnosis and intervention of cardiac disease
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
US20110002931A1 (en) 2009-06-23 2011-01-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antibodies that bind to complement proteins
US8945511B2 (en) 2009-06-25 2015-02-03 Paul Weinberger Sensitive methods for detecting the presence of cancer associated with the over-expression of galectin-3 using biomarkers derived from galectin-3
PL2975051T3 (pl) 2009-06-26 2021-09-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Wyizolowane z łatwością dwuswoiste przeciwciała o formacie natywnej immunoglobuliny
GB0914691D0 (en) 2009-08-21 2009-09-30 Lonza Biologics Plc Immunoglobulin variants
US8709424B2 (en) 2009-09-03 2014-04-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Anti-GITR antibodies
EP2481752B1 (en) * 2009-09-24 2016-11-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
US8568726B2 (en) 2009-10-06 2013-10-29 Medimmune Limited RSV specific binding molecule
WO2011043643A1 (en) 2009-10-06 2011-04-14 Medimmune Ltd Rsv-specific binding molecule
WO2011044368A1 (en) 2009-10-07 2011-04-14 Macrogenics, Inc. Fc region-containing polypeptides that exhibit improved effector function due to alterations of the extent of fucosylation, and methods for their use
EP2493926B1 (en) 2009-10-27 2020-03-11 UCB Biopharma SRL Function modifying nav 1.7 antibodies
CN101875696B (zh) 2009-11-11 2012-02-08 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种抗体及其制备方法与应用
EP2327725A1 (en) 2009-11-26 2011-06-01 InflaRx GmbH Anti-C5a binding moieties with high blocking activity
AU329016S (en) 2009-12-03 2009-12-22 Non Entity 49398 Induction system with integral air filter
RU2606264C2 (ru) 2009-12-25 2017-01-10 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Способ полипептидной модификации для очистки полипептидных мультимеров
WO2011094593A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 Ab Biosciences, Inc. Novel lowered affinity antibodies and methods of marking the same
WO2011100271A2 (en) 2010-02-09 2011-08-18 Glaxosmithkline Llc Novel uses
TW201127310A (en) * 2010-02-11 2011-08-16 jin-zhu Chen Step-less finetuning buckle
CN103038251B (zh) 2010-02-19 2016-08-17 Xencor公司 新颖ctla4-ig免疫粘附素
RU2570390C2 (ru) 2010-03-01 2015-12-10 Алексион Фармасьютикалз Инк. Способы и композиции для лечения болезни дего
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
JP2011184418A (ja) 2010-03-11 2011-09-22 Tokyo Institute Of Technology 親和性可変抗体
TW201206466A (en) 2010-03-11 2012-02-16 Rinat Neuroscience Corp Antibodies with pH dependent antigen binding
CN102844332B (zh) 2010-03-11 2015-08-19 瑞纳神经科学公司 呈pH依赖性抗原结合的抗体
TWI667257B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
JP2013531476A (ja) 2010-04-30 2013-08-08 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ヒトにおける免疫原性が低下した抗体
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
JP5904552B2 (ja) 2010-05-28 2016-04-13 国立研究開発法人国立がん研究センター 膵癌治療剤
AR081556A1 (es) 2010-06-03 2012-10-03 Glaxo Group Ltd Proteinas de union al antigeno humanizadas
CA2806252C (en) 2010-07-29 2019-05-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
EP2606066A1 (en) 2010-08-16 2013-06-26 Amgen Inc. Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
JP6121904B2 (ja) 2010-09-08 2017-04-26 ハロザイム インコーポレイテッド 条件的活性治療用タンパク質を評価および同定する、または発展させる方法
EP2640745B1 (en) 2010-09-10 2018-11-07 MedImmune Limited Bivalent and bispecific anti-il6/anti-il23 antibodies
MX2013005024A (es) 2010-11-08 2013-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-il-6 receptor administrado subcutaneamente.
SG190727A1 (en) 2010-11-30 2013-07-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
CA2822288A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Medimmune, Llc Anti-c5/c5a/c5adesr antibodies and fragments
WO2012093704A1 (ja) 2011-01-07 2012-07-12 中外製薬株式会社 抗体の物性を改善させる方法
WO2012132067A1 (ja) 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
US9133272B2 (en) 2011-03-01 2015-09-15 Amgen Inc. Bispecific binding agents
ES2668895T3 (es) 2011-03-16 2018-05-23 Amgen Inc. Variantes de Fc
EP2698431B1 (en) 2011-03-30 2020-09-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
EP2699261B1 (en) 2011-04-19 2018-07-11 Amgen Inc. Method for treating osteoporosis
MX339239B (es) 2011-04-29 2016-05-18 Apexigen Inc Anticuerpos anti-cd40 y metodos de uso.
EP2704743B1 (en) 2011-05-04 2020-03-11 Omeros Corporation Compositions for inhibiting masp-2 dependent complement acitivation
UA117072C2 (uk) 2011-05-21 2018-06-11 Макродженікс, Інк. Cd3-зв'язувальна молекула, здатна до зв'язування з cd3 людини, і cd3, що не є людським
KR20140028013A (ko) 2011-05-25 2014-03-07 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 개선된 특성을 갖는 Fc-함유 폴리펩티드를 제조하는 방법
AU2012273118A1 (en) 2011-06-20 2014-01-23 St. Louis University Targeting the neuromuscular junction for treatment
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
KR102366029B1 (ko) 2011-09-30 2022-02-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 표적 항원에 대한 면역응답을 유도하는 항원 결합 분자
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
CA3186007A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ion concentration-dependent binding molecule library
TWI827333B (zh) 2011-09-30 2023-12-21 日商中外製藥股份有限公司 促進抗原消失的抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
EP2765192A4 (en) 2011-10-05 2015-04-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIGEN BINDING MOLECULE FOR PROMOTING THE PLASMA CLAIR OF AN ANTIGEN COMPRISING A SACCHARIDIC CHAIN TYPE RECEPTOR BINDING DOMAIN
EP3517550A1 (en) 2011-11-30 2019-07-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Drug containing carrier into cell for forming immune complex
KR102219987B1 (ko) 2012-02-24 2021-02-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩＢ를 매개로 항원의 소실을 촉진하는 항원 결합 분자
BR112014022692A8 (pt) 2012-03-14 2021-07-20 Regeneron Pharma molécula de ligação de antígeno multiespecífica
RS59076B1 (sr) 2012-03-16 2019-09-30 Regeneron Pharma Glodari koji eksprimiraju imunoglobulinske sekvence senzitivne na ph
LT2825036T (lt) 2012-03-16 2018-07-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidino pakeitimus lengvoje grandinėje turintys antikūnai ir genetiškai modifikuoti graužikai, išvesti ju gamybai
AU2013237929B2 (en) 2012-03-29 2017-09-14 Novimmune S.A. Anti-TLR4 antibodies and uses thereof
TWI619729B (zh) 2012-04-02 2018-04-01 再生元醫藥公司 抗－ｈｌａ－ｂ*２７抗體及其用途
JP5988659B2 (ja) 2012-04-09 2016-09-07 シャープ株式会社 送風機
JP6211597B2 (ja) 2012-05-01 2017-10-11 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ 新規抗体
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
EP2857419B1 (en) 2012-05-30 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
JPWO2013180200A1 (ja) 2012-05-30 2016-01-21 中外製薬株式会社 標的組織特異的抗原結合分子
EP2861617A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 Pfizer Inc. Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
AU2013285355A1 (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
NZ704771A (en) 2012-08-13 2018-02-23 Regeneron Pharma Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics
US9133269B2 (en) 2012-08-24 2015-09-15 Anaptysbio, Inc. Humanized antibodies directed against complement protein C5
JP6774164B2 (ja) 2012-08-24 2020-10-21 中外製薬株式会社 マウスＦｃγＲＩＩ特異的Ｆｃ抗体
TWI697501B (zh) 2012-08-24 2020-07-01 日商中外製藥股份有限公司 ＦｃγＲＩＩｂ特異性Ｆｃ區域變異體
TWI595007B (zh) 2012-09-10 2017-08-11 Neotope Biosciences Ltd 抗ｍｃａｍ抗體及相關使用方法
CN104768969B (zh) 2012-09-13 2021-04-16 百时美施贵宝公司 结合至肌生成抑制素的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白
TW201418707A (zh) 2012-09-21 2014-05-16 Alexion Pharma Inc 補體組分ｃ５拮抗劑之篩選分析
WO2014074532A2 (en) 2012-11-06 2014-05-15 Scholar Rock Inc. Compositions and methods for modulating cell signaling
DK2934584T3 (da) 2012-12-21 2020-05-18 Aveo Pharmaceuticals Inc Anti-gdf15-antistoffer
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
CA2898262A1 (en) 2013-01-24 2014-07-31 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Tnf-alpha antigen-binding proteins
KR101638931B1 (ko) 2013-01-31 2016-07-12 서울대학교산학협력단 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 ｃ5 항체 및 방법
US9481725B2 (en) 2013-03-14 2016-11-01 Alderbio Holdings, Llc Antibodies to HGF and compositions containing
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9321686B2 (en) 2013-03-15 2016-04-26 Forta Corporation Reinforcement fiber coating compositions, methods of making and treating, and uses for improved adhesion to asphalt and portland cement concrete
EP2968985A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Amgen, Inc. Human antigen binding proteins that bind to proprotein convertase subtilisin kexin type 9
EP3936521A1 (en) 2013-03-15 2022-01-12 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US20160031985A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Katherine S. Bowdish Charge-engineered antibodies or compositions of penetration-enhanced targeting proteins and methods of use
US20160038588A1 (en) 2013-03-15 2016-02-11 Amgen Inc. Myostatin Antagonism in Human Subjects
US20160051673A1 (en) 2013-03-29 2016-02-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the serum half-life of a therapeutic agent targeting complement c5
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
EP3816625A1 (en) 2013-05-06 2021-05-05 Scholar Rock, Inc. Compositions and methods for growth factor modulation
AU2014267171A1 (en) 2013-05-17 2015-12-10 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Anti-CXCL1, CXCL7 and CXCL8 antibodies and their applications
AU2014273817B2 (en) 2013-05-31 2019-03-14 Zymeworks Bc Inc. Heteromultimers with reduced or silenced effector function
WO2015013671A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
RU2016108652A (ru) 2013-08-14 2017-09-14 Новартис Аг Способы лечения спорадического миозита с тельцами включений
JP2016531910A (ja) 2013-08-16 2016-10-13 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 移植前の臓器への補体阻害剤の投与による移植拒絶の処置
EP3042912A4 (en) 2013-09-04 2017-05-03 Protenova Co., Ltd. Immunoglobulin-binding domain multimer
EP2853898B1 (en) 2013-09-27 2017-01-04 Medizinische Hochschule Hannover Analysis of myostatin in serum
CA2925677A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific her2 antibodies and methods of use
JP2017510622A (ja) 2014-01-27 2017-04-13 ノバルティス アーゲー 筋萎縮を予測するバイオマーカー、方法および使用
AU2015218903B2 (en) 2014-02-20 2020-10-15 Allergan, Inc. Complement component C5 antibodies
NZ631007A (en) 2014-03-07 2015-10-30 Alexion Pharma Inc Anti-c5 antibodies having improved pharmacokinetics
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
AU2015283270B9 (en) 2014-06-30 2021-04-01 Merck Patent Gmbh Anti-TNFa antibodies with pH-dependent antigen binding
WO2016073906A2 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Scholar Rock, Inc. Transforming growth factor-related immunoassays
JP6706617B2 (ja) 2014-11-06 2020-06-10 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． 抗プロ／潜在型−ミオスタチン抗体およびその使用
MX2017007519A (es) 2014-12-08 2017-08-22 Novartis Ag Antagonistas de miostatina o activina para el tratamiento de sarcopenia.
TWI808330B (zh) 2014-12-19 2023-07-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Fc區域之多胜肽及使用方法
SG11201607165YA (en) 2014-12-19 2016-09-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antibodies and methods of use
CN107428823B (zh) 2015-01-22 2021-10-26 中外制药株式会社 两种以上抗-c5抗体的组合与使用方法
TW202248212A (zh) 2015-02-05 2022-12-16 日商中外製藥股份有限公司 包含離子濃度依賴之抗原結合域的抗體、Fc區變體、IL-8結合抗體與其用途
TW202339800A (zh) 2015-02-27 2023-10-16 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
EP3277715A2 (en) 2015-03-31 2018-02-07 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Identifying and treating subpopulations of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (pnh) patients
EP3283519A1 (en) 2015-04-15 2018-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of increasing strength and functionality with gdf8 inhibitors
US20180311299A1 (en) 2015-05-01 2018-11-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Efficacy of an anti-c5 antibody in the prevention of antibody mediated rejection in sensitized recipients of a kidney transplant
JP2018520139A (ja) 2015-06-26 2018-07-26 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド エクリズマブまたはエクリズマブバリアントでのワクチン接種に従って患者を処置するための方法
US10940126B2 (en) 2015-07-03 2021-03-09 Camilla Svensson Inhibition of IL-8 in the treatment of pain and/or bone loss
EA038146B1 (ru) 2015-09-15 2021-07-13 Сколар Рок, Инк. Антитела к про-/латентному миостатину и их применения
PE20181336A1 (es) 2015-09-18 2018-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos que se unen a interleucina 8 (il-8) y sus usos
TW201718014A (zh) 2015-10-12 2017-06-01 諾華公司 C5抑制劑於移植相關微血管病之用途
EP3390442B1 (en) 2015-12-18 2023-11-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
WO2017104783A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
US10233252B2 (en) 2015-12-21 2019-03-19 Wisconsin Alumni Research Foundation pH-dependent antibodies targeting the transferrin receptor and methods of use thereof to deliver a therapeutic agent
EP3394098A4 (en) 2015-12-25 2019-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE
JP2019504064A (ja) 2016-01-08 2019-02-14 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． 抗プロ／潜在型ミオスタチン抗体およびその使用方法
WO2017123636A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Dosage and administration of anti-c5 antibodies for treatment
EP3408291A1 (en) 2016-01-25 2018-12-05 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Anti-c5 antibodies with enhanced ph switch
PT3368069T (pt) 2016-06-13 2020-11-11 Scholar Rock Inc Uso de inibidores da miostatina e terapias de combinação
UA124734C2 (uk) 2016-06-14 2021-11-10 Рідженерон Фармасьютікалз, Інк. Антитіло проти с5 і його застосування
AU2017285763B2 (en) 2016-06-17 2024-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-C5 antibodies and methods of use
MY193497A (en) 2016-06-17 2022-10-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-myostatin antibodies and methods of use
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
JP7191833B2 (ja) 2017-01-30 2022-12-19 中外製薬株式会社 抗スクレロスチン抗体およびその使用
PL3577135T3 (pl) 2017-01-31 2023-12-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Kompozycja farmaceutyczna do stosowania do leczenia lub zapobiegania chorobom związanym z c5
JP7211961B2 (ja) 2017-03-14 2023-01-24 ファイヴ プライム セラピューティクス インク 酸性ｐＨでＶＩＳＴＡに結合する抗体
KR20190129925A (ko) 2017-03-16 2019-11-20 메디뮨 리미티드 항-par2 항체 및 그의 용도
WO2018184739A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Inflarx Gmbh Treatment of inflammatory diseases with inhibitors of c5a activity
WO2019084438A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. ASSAY AND ADMINISTRATION OF ANTI-C5 ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF NOCTURNAL PAROXYSTIC HEMOGLOBINURIA (PNH) AND ATYPICAL HEMOLYTIC AND UREMIC SYNDROME (AHUS)
US20210000927A1 (en) 2017-12-04 2021-01-07 Ra Pharmaceuticals, Inc. Modulators of complement activity
EP3829628B1 (en) 2018-08-01 2024-05-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A pharmaceutical composition for use in the treatment or prevention of a c5-related disease
MX2021012251A (es) 2019-04-10 2021-11-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para purificar un anticuerpo modificado en la region de fragmento cristalizable (fc).

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050026071A1 (en) * 2003-07-30 2005-02-03 Lee Geun Su Photoresist polymers and photoresist compositions comprising the same

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEBS Letters. Vol. 309, No. 1, pp. 85-88 (1992)* *
Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40
Hanson CV, Nishiyama Y, Paul S. Catalytic antibodies and their applications.Curr Opin Biotechnol. 2005 Dec;16(6):631-6.
Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56
Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.
Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005)
Nature Biotechnology. Vol. 20, No. 9, pp. 908-913 (2002)* *
Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries.Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R.
Rathanaswami P, Roalstad S, Roskos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fully human monoclonal antibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 9;334(4):1004-13.
Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665

Also Published As

Publication number Publication date
RU2571225C2 (ru) 2015-12-20
SG10201608379YA (en) 2016-11-29
CN102056946A (zh) 2011-05-11
MX2010011184A (es) 2011-01-20
TW202241961A (zh) 2022-11-01
JP4954326B2 (ja) 2012-06-13
RU2014128324A (ru) 2016-02-10
LT2708559T (lt) 2018-06-11
IL208516A0 (en) 2010-12-30
JP6417431B2 (ja) 2018-11-07
JP2021035945A (ja) 2021-03-04
TWI564021B (zh) 2017-01-01
JPWO2009125825A1 (ja) 2011-08-04
HUE028718T2 (en) 2016-12-28
TW202043265A (zh) 2020-12-01
JP7397823B2 (ja) 2023-12-13
PH12014502054A1 (en) 2015-12-07
CR20150655A (es) 2016-02-08
UA121453C2 (uk) 2020-06-10
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