CN101132811B - 抗hmgb1的高亲和力抗体及其用法 - Google Patents

抗hmgb1的高亲和力抗体及其用法 Download PDF

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Abstract

公开了抑制脊椎动物细胞释放促炎细胞因子和抑制患者的炎性细胞因子级联反应的组合物和方法。所述组合物含有，例如能与HMG1及其抗原性片段特异性结合的高亲和力抗体。本发明高亲和力抗体和含有它的药物组合物可用于许多目的，例如作为抵御各种炎性疾病和病症的治疗剂，所述疾病和病症是例如脓毒症、类风湿性关节炎、腹膜炎、克罗恩病、再灌注损伤、败血症、内毒素性休克、囊性纤维化、心内膜炎、银屑病、银屑病关节炎、关节炎、过敏性休克、器官局部缺血、再灌注损伤和同种异体移植物排斥。此外，本发明高亲和力抗体可用作诊断抗体。

Description

抗HMGB1的高亲和力抗体及其用法
1.发明背景 
炎症通常由促炎细胞因子，例如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6、血小板活化因子(PAF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和其它化合物诱导。几种不同类型的细胞能产生这些促炎细胞因子，最重要的是免疫细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞和嗜中性白细胞)，但非免疫细胞，例如成纤维细胞、成骨细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和神经元也能产生。这些促炎细胞因子在炎性细胞因子级联反应的早期可导致各种疾病。 
炎性细胞因子级联反应导致许多疾病的有害特征，包括炎症和凋亡。包括特征为局部和全身性反应的慢性和急性疾病，包括但不限于：涉及胃肠道及相关组织的疾病(例如阑尾炎、消化道、胃和十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性伪膜急性和局部缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失迟缓症、胆管炎、胆囊炎、腹部疾病、肝炎、克罗恩病、肠炎和惠普尔病)；全身性或局部炎性疾病和病症(例如哮喘、过敏、过敏性休克、免疫复合物病、器官局部缺血、再灌注损伤、器官坏死、枯草热、脓毒症、败血症、内毒素性休克、恶病质、高烧、嗜酸性肉芽肿、肉芽肿病和结节病)；涉及泌尿生殖***和相关组织的疾病(例如脓毒性流产、***、***炎、***炎和尿道炎)；涉及呼吸***和相关组织的疾病(例如支气管炎、肺气肿、鼻炎、囊性纤维化病、肺炎、COPD、成人呼吸窘迫综合征、pneumoultramicroscopicsilico-volcanoconiosis、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎和鼻窦炎)；各种病毒(例如流感病毒、呼吸道合胞病毒、HIV、乙肝病毒、丙肝病毒和疱疹病毒)、细菌(例如弥散性菌血症、登革热)、真菌(例如念珠菌病)和原生动物及多细胞寄生虫(例如疟疾、丝虫病、阿米巴病和棘球囊(hydatid cysts))感染导致的疾病；皮肤病和皮肤病症(例如银屑病、烧伤、皮炎、皮肌炎、灼伤、荨麻疹、疣和风疹)；涉及心血管***和相关组织的疾病(例如血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、心包炎、充血性心力衰竭、心肌炎、心肌局部缺血、结节性多动脉炎、再 狭窄和风湿热)；涉及中枢和外周神经***和相关组织的疾病(例如阿耳茨海默病、脑膜炎、脑炎、多发性硬化症、脑梗塞、脑栓塞、格-巴综合征(Guillame-Barresyndrome)、神经炎、神经痛、脊髓损伤、麻痹和眼色素层炎)；骨、关节、肌肉和***的疾病(例如各种关节炎和关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎和滑膜炎)；其它自身免疫疾病和炎性疾病(例如重症肌无力、甲状腺炎、全身性红斑狼疮、古德帕斯丘综合征、贝切特综合征、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病、I型糖尿病、强直性脊柱炎、贝格尔病、I型糖尿病、强直性脊柱炎、贝格尔病和莱特综合征)；以及各种癌症、肿瘤和增殖性疾病(例如何杰金病)；以及在任何情况中，对任何原发性疾病的宿主炎性或免疫应答。 
早期促炎细胞因子(例如，TNF、IL-1等)介导炎症，诱导高迁移率族蛋白1(HMG1)(也称为HMG-1、HMG1和HMGB1)的后期释放，该蛋白在血清中累积，介导迟发性致死并进一步诱导早期促炎细胞因子。 
HMG1先前鉴定为称为高迁移率族(HMG)DNA-结合蛋白家族的奠基成员(founding member)，这些蛋白对DNA结构和稳定性至关重要。几乎在40年前鉴定它为能结合双链DNA，但不具序列特异性的遍在表达的核蛋白。 
HMG1结合使DNA弯曲从而促进核蛋白复合物的形成和稳定，有利于，例如糖皮质激素受体和RAG重组酶的基因转录。HMG1分子有3个结构域：称为HMG A和HMG B框(box)的两个DNA结合基序，和酸性羧基末端。两个HMG框是高度保守的80个氨基酸，L-形结构域。HMG框也在其它转录因子，包括RNA聚合酶I转录因子、人上游结合因子和淋巴特异性因子中表达。 
近年来，发现HMG A框用作HMG促炎作用的竞争性抑制剂，HMG B框具有HMG的主要促炎活性(参见，例如US20040005316)。与诱导炎症的凋亡细胞相反，已证明HMG1是长期找寻的坏死(细胞)被动释放的核危险信号。HMG1也显示在需要乙酰化该分子的过程中由激活的巨噬细胞或单核细胞主动分泌，从而能从核中易位至分泌性溶酶体并分泌HMG1的乙酰化形式。参见PCT/IB2003/005718。因此，坏死细胞被动释放的HMG1和炎性细胞主动分泌的HMGB1是不同的分子。 
此外，HMG1涉及作为内毒素血症中迟发性致死的细胞因子介质。参见， 例如美国专利6,468,533和6,448,223。更具体地说，已证明细菌内毒素(脂多糖(LPS))能激活单核细胞/巨噬细胞释放HMG1作为激活的晚期效应，从而导致有毒的血清HMG1水平升高。抗HMG1的抗体显示能防止内毒素的致死作用，即使当抗体给药延迟至早期细胞因子效应后。与其它促炎细胞因子相似，HMG1是单核细胞的强效激活物。气管内应用HMG1可导致急性肺损伤，而抗-HMG1抗体可保护避免内毒素诱导的肺水肿。此外，在患有脓毒症或失血性休克的危急病人中血清HMG1水平升高，与存活者相比，未存活者的水平显著较高。 
胞外HMG1通过高级糖基化终产物的受体(RAGE)和Toll样受体(TLR)家族成员转导信号而成为炎性级联反应的强效介质。参见，例如美国专利公布号US20040053841。 
高迁移率族蛋白2(HMG2)(也称为HMGB2和HMG-2)是同样源于基因复制的HMG1近亲。其存在于许多细胞类型中，并且与HMG1共有许多(如果不是所有)生化特性(Bustin，1999，Mol.Cell.Biol.，19，5237-46和Thomas等，2001，Trends Biochem.Sci.，26，167-74)。虽然在成年小鼠组织中，HMG2不及HMG1丰富，并且分布更有限，但其在淋巴器官、睾丸和肺中较为丰富，在这些器官中也起到炎症介质的作用。与HMG1相似，在许多自身免疫疾病中HMG2也是自身抗体(如核外周抗嗜中性白细胞胞质抗体)的明显靶抗原，所述疾病包括全身性风湿病(Uesugi等，1998，J Rheumatol.，25：703-9)，溃疡性结肠炎(Sobajima等，1998，Clin Exp Immunol.，111：402-7)和青少年特发性关节炎(Wittemann等，1990，Arthritis Rheum.，33：1378-83；Rosenberg等，2000，J Rheumatol.，27，2489-93)。 
鉴于能与HMG1及其多肽片段(例如，HMG A和HMG B框)结合的抗体已显示能调节HMG1的活性(例如，促炎活性)，和调节人HMG1活性可能对于许多疾病和病症具有深远的治疗应用，本领域需要鉴定具有HMG1高亲和力和低免疫原性并能与HMG1及其多肽片段特异性结合的抗体。类似地，对于许多疾病和病症，能调节HMG2活性的分子(例如，能与HMG2及其多肽片段特异性结合的抗体)也可以是有用的治疗剂。 
2.发明概述
本发明部分根据发现了能与HMG1(在本文也称为“HMGB1”)及其抗原性片段特异性结合的高亲和力抗体。本发明的高亲和力抗体和含有其的药物组合物可用于许多目的，例如作为抵御各种炎性疾病和病症的治疗剂，所述疾病和病症例如是：脓毒症、类风湿性关节炎、腹膜炎、克罗恩病、再灌注损伤、败血症、内毒素性休克、囊性纤维化病、心内膜炎、银屑病、关节炎(如，银屑病关节炎)、过敏性休克、器官局部缺血、再灌注损伤、脊髓损伤和同种异体移植物排斥。此外，本发明的高亲和力抗体可用于诊断性应用。 
在本发明的一个实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有人或其它动物(例如哺乳动物和无脊椎动物)的HMG1多肽或由其构成(或基本上由其构成)。在一具体实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有人HMG1多肽(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)或由其构成。本领域熟知人和其它动物的全长HMG1多肽(参见，例如US20040005316；6,468,533和6,448,223)。 
人HMGB1的氨基酸序列(GenBank登录号NP_002119) 
MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEE DDDDE(SEQ ID NO:1) 
人HMGB1的氨基酸序列(GenBank登录号AAA64970) 
MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEEDEE DDDDE(SEQ ID NO:2) 
在本发明的另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有人或其它动物(例如哺乳动物和无脊椎动物)的HMG2多肽或由其构成(或基本上由其构成)。在另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有人HMG2多肽(SEQ ID NO:21)或由其构成。本领域熟知人和其它动物的全长HMG2多肽。参见，例如Majumdar等，1991，Nucleic Acids Res.，19：6643；Shirakawa 等，1992，J Biol Chem，267：6641-6645。 
人HMGB2的氨基酸序列(GenBank登录号AAA58659) 
MGKGDPNKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDSSVNFAEFSKKCSERWKTMSAKEKSKFEDMAKSDKARYDREMKNYVPPKGDKKGKKKDPNAPKRPPSAFFLFCSEHRPKIKSEHPGLSIGDTAKKLGEMWSEQSAKDKQPYEQKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKSEAGKKGPGRPTGSKKKNEPEDEEEEEEEEDEDEEEEDEDEE(SEQ ID NO:21) 
在本发明的另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有哺乳动物(或其它动物)的HMG1A框或HMG1B框多肽(优选人HMG1多肽)或由其构成(或基本上由其构成)。本领域熟知人和其它动物的HMG1A框及HMG1B框多肽的氨基酸序列高度保守(参见，例如US20040005316；6,468,533；6,448,223和US20040053841)。 
人HMGB1A框(SEQ ID NO:3) 
PTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGET 
人HMGB1B框(SEQ ID NO:4) 
FKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAY 
在本发明还有另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有哺乳动物(或其它动物)的HMG2A框或HMG2B框多肽(优选人HMG2多肽)或由其构成(或基本上由其构成)。本领域熟知人和其它动物的HMG框多肽的氨基酸序列高度保守。参见，例如Jantzen等，1990，Nature，344：830-6；Kolodrubetz，1990，Nucleic Acids Res.，18：5565；Laudet等，1993，Nucleic Acids Res.，21：2493-501和Thomas等，2001，Trends Biochem Sci.，26：167-74。 
人HMGB2 A框(SEQ ID NO:22) 
PRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDSSVNFAEFSKKCSERWKTMSAKEKSKFEDMAKSDKARYDREMKNYVPPKGDK 
人HMGB2B框(SEQ ID NO:23) 
KKKDPNAPKRPPSAFFLFCSEHRPKIKSEHPGLSIGDTAKKLGEMWSEQS AKDKQPYEQKAAKLKEKYEKDIAAY 
本发明也包括能与含有衍生自HMG1和/或HMG2的A框和B框的氨基酸残基或者由其构成(或基本上由其构成)的表位特异结合的抗体。衍生自A框及B框的氨基酸残基的表位可以是A和B框相连得到的线形多肽，或者可以是含有A和B框氨基酸残基的三维构象多肽。 
在本发明的另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能与含有人(或其它动物)HMGB1的多肽片段或由其构成(或基本上由其构成)的抗原性HMGB1多肽片段特异性结合。 
在本发明的另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能与含有人(或其它动物)HMGB2的多肽片段或由其构成(或基本上由其构成)的抗原性HMGB2多肽片段特异性结合。 
特别考虑的本发明高亲和力抗体能与乙酰化和/或非乙酰化HMG1及其抗原性片段特异性结合。也特别考虑了本发明高亲和力抗体能区分这两种形式。还特别考虑本发明高亲和力抗体能与乙酰化和/或非乙酰化HMG2及其抗原性片段特异性结合。也特别考虑了本发明高亲和力抗体能区分这两种形式。 
在本发明的具体实施方式中，能与HMG1及其抗原性片段特异性结合的抗体是人源化抗体或人抗体。在本发明的另一具体实施方式中，能与HMG2及其抗原性片段特异性结合的抗体是人源化抗体或人抗体。 
本发明的另一实施方式是能以小于10-5M、或小于10-6M、或小于10-7M、或小于10-8M、或小于10-9M、或小于10-10M、或小于10-11M、或小于10-12M、或小于10-13M的解离常数或Kd(koff/kon)与HMG1及其抗原性片段特异性结合的抗体。 
本发明的另一实施方式是能以小于10-5M、或小于10-6M、或小于10-7M、或小于10-8M、或小于10-9M、或小于10-10M、或小于10-11M、或小于10-12M、或小于10-13M的解离常数或Kd(koff/kon)与HMG2及其抗原性片段特异性结合的抗体。 
在另一实施方式中，本发明抗体能以小于1×10-3s-1、或小于3×10-3s-1的Koff与HMG1和/或其抗原性片段结合。在其它实施方式中，本发明抗体与HMG1和/或其抗原性片段结合的Koff小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于 5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于10-7s-1、小于5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1或小于10-10s-1。 
在另一实施方式中，本发明抗体能以小于1×10-3s-1、或小于3×10-3s-1的Koff与HMG2和/或其抗原性片段结合。在其它实施方式中，本发明抗体与HMG2和/或其抗原性片段结合的Koff小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于10-7s-1、小于5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1或小于10-10s-1。 
在另一实施方式中，本发明抗体与HMG1和/或其抗原性片段结合的缔合速率常数或kon速率至少是105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、至少108M-1s-1、或至少109M-1s-1。 
在另一实施方式中，本发明抗体与HMG2和/或其抗原性片段结合的缔合速率常数或kon速率至少是105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、至少108M-1s-1、或至少109M-1s-1。 
考虑本发明高亲和力抗体能与HMG1特异性结合而不与HMG2结合，或者能与HMG2特异性结合而不与HMG1结合。还考虑本发明高亲和力抗体与HMG1和HMG2都能特异性结合(例如，能特异性识别存在于HMG1和HMG2中的表位的抗体)。考虑本发明高亲和力抗体分别能与HMG1或能与HMG2特异性结合，和能与HMG2或能与HMG1交叉反应。还考虑本发明高亲和力抗体能以相同或不同的结合亲和力与HMG1和HMG2结合。 
本发明的高亲和力抗体包括但不限于：合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链Fv(scFv)、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)(包括双特异性sdFv)和抗独特型(抗-Id)抗体及以上任何抗体的表位结合片段。 
本发明的其它非排他性实施方式包括具有某些优选生化特征(例如特定的等电点(pI)或解链温度(Tm))的本发明高亲和力抗体。 
在一个实施方式中，本发明的高亲和力抗体具有5.5-9.5的pI。
在一个实施方式中，本发明的高亲和力抗体具有约65℃-约120℃的Tm。 
本发明的具体实施方式也包括能以高亲和力与HMG1特异性结合的具体抗体(及其片段)，所述抗体由美国模式培养物保藏所(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)保藏并分别指定了ATCC保藏号PTA-6142(2004年8月4日保藏)、PTA-6143(2004年8月4日保藏)、PTA-6259(2004年10月19日保藏)和PTA-6258(2004年10月19日保藏)(在本文也分别称为“S2”、“S6”、“S16”和“G4”)。这些保藏物按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款而维持。由于提及的这些抗体株按照布达佩斯条约的条款而维持，则签署了布达佩斯条约的专利局可获得这些抗体株。 
本发明的其它具体实施方式也包括能以高亲和力与HMG1特异性结合并含有至少一个本文所述可变区(参见，例如图2A-J和SEQ ID NO：5-20、24-27和30-73)的具体抗体(及其片段)。具有本文所述抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个CDR(参见，例如图2A-J中下划线所示的CDR和SEQ ID NO：74-103)的抗体是本发明的具体实施方式。具有所保藏抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个CDR的抗体是本发明的具体实施方式。本发明实施方式也考虑编码这些抗体(及其片段)的分离的多核苷酸。 
此外，本发明包括能与本文所述抗-HMG1抗体的相同表位(例如，HMG1肽中的91-169或150-183表位)特异性结合的任何抗体。在一具体实施方式中，本发明包括能与所保藏抗体的相同表位特异性结合的抗体。具体考虑了这些抗体能以至少相等的亲和力、或更好的亲和力、或较低的亲和力与所保藏抗体的相同表位特异性结合。编码这些抗体(及其片段)的分离的多核苷酸也是本发明的具体实施方式。 
本发明的实施方式包括编码任何本发明高亲和力抗体的分离的多核苷酸。 
在其它实施方式中，本发明涉及含有本发明高亲和力抗体和药学上可接受的赋形剂的组合物，例如药物组合物。 
在一具体实施方式中，组合物含有能与HMG1的A框(例如，SEQ ID NO：3内的表位)特异性结合的本发明高亲和力抗体。在另一具体实施方式中，组合物含有能与HMG1的B框(例如，SEQ ID NO：4、28、29内的表位)特异性结合的本 发明高亲和力抗体。在还有另一具体实施方式中，组合物含有与衍生自HMG1和/或HMG2的A框及B框的表位特异性结合的本发明高亲和力抗体。也考虑本发明组合物可含有本发明高亲和力抗体的组合，例如与A框特异性结合的抗体和与B框特异性结合的抗体的组合。 
本发明组合物含有单独的本发明高亲和力抗体或其与其它活性治疗性分子和/或佐剂，例如类固醇，其它抗炎分子或其它抗体治疗剂的组合。更具体地说，本发明组合物含有早期脓毒症介质的拮抗剂。早期脓毒症介质的拮抗剂是一种实施方式，细胞因子的拮抗剂选自TNF、IL-1α、IL-1β、MIF和IL-6。 
在本发明的另一实施方式中，本文所述组合物能抑制由炎性细胞因子级联反应激活所介导或以其为特征的病症，包括急性和慢性炎性病症。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在动物CLP脓毒症模型(例如，小鼠或小猪CLP模型)中比对照组合物的保护力更高(高至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在动物关节炎模型(例如，大鼠AIA、小鼠被动或主动CIA模型)中比对照组合物的保护力更高(高至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在动物关节炎模型(例如，大鼠AIA、小鼠被动或主动CIA模型)中减少骨丧失和/或软骨损伤比对照组合物更低(低至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在人中减少骨丧失和/或软骨损伤比对照组合物更低(低至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)。 
在本发明另一实施方式中，本文所述组合物在啮齿类关节炎模型中比 
Figure S05841546020070606D000091
(加或不加氨甲喋呤)的保护力更高(高至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)。
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在人中比
Figure S05841546020070606D000101
(加或不加氨甲喋呤)的保护力更高(高至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在小鼠腹膜炎模型中比对照组合物的保护力更高(高至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)。 
本发明考虑的其它实施方式包括治疗或预防关节炎，例如类风湿性关节炎、破骨细胞介导的疾病或其它炎性关节疾病的方法，其包括给予本文所述抗体组合物。 
在另一实施方式中，本发明包括治疗或预防关节炎，例如类风湿性关节炎、破骨细胞介导的疾病或其它炎性疾病的方法，其包括给予能与HMG1或其抗原性片段(例如，HMG B框)特异性结合的任何抗体(或抗体组合物)，而无论该抗体的结合亲和力。 
在另一实施方式中，本发明包括治疗或预防关节炎，例如类风湿性关节炎、破骨细胞介导的疾病或其它炎性疾病的方法，其包括给予能与HMG2或其抗原性片段(例如，HMG B框)特异性结合的任何抗体(或抗体组合物)，而无论该抗体的结合亲和力。 
在另一实施方式中，本发明包括治疗或预防关节炎，例如类风湿性关节炎、破骨细胞介导的疾病或其它炎性疾病的方法，其包括给予能与HMG1和/或HMG2或其抗原性片段(例如，HMG B框)特异性结合的抗体组合(或抗体组合物)，而无论该抗体的结合亲和力。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在人或啮齿类SCI模型中缓解脊髓损伤(SCI)的严重性比对照组合物更好(好至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)。 
在其它具体实施方式中，本发明涉及给予和利用本发明组合物和抗体来治疗和预防各种炎性病症的方法，所述病症包括慢性和急性病症，例如阑尾炎、消化道、胃和十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性伪膜急性和局部缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失迟缓症、胆管炎、胆囊炎、肝炎、克罗恩病、肠炎和 惠普尔病、哮喘、过敏、过敏性休克、免疫复合物病、器官局部缺血、再灌注损伤、器官坏死、枯草热、脓毒症、败血症、内毒素性休克、恶病质、高烧、嗜酸性肉芽肿、肉芽肿病、结节病、脓毒性流产、***、***炎、***炎和尿道炎、支气管炎、肺气肿、鼻炎、囊性纤维化病、肺炎、pneumoultramicroscopicsilico-volcanoconiosis、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、鼻窦炎、流感、呼吸道合胞病毒感染、疱疹感染、HIV感染、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、弥散性菌血症、登革热、念珠菌病、疟疾、丝虫病、阿米巴病、棘球囊、烧伤、皮炎、皮肌炎、灼伤、荨麻疹、疣、风疹、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌局部缺血、结节性多动脉炎、风湿热、阿耳茨海默病、腹部疾病、充血性心力衰竭、再狭窄、COPD、成人呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、多发性硬化症、脑梗塞、脑栓塞、格-巴综合征、神经炎、神经痛、脊髓损伤、麻痹、眼色素层炎、关节炎、关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎、全身性红斑狼疮、古德帕斯丘综合征、贝切特综合征、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病、I型糖尿病、强直性脊柱炎、贝格尔病、I型糖尿病、强直性脊柱炎、贝格尔病和莱特综合征和何杰金病。 
本发明也涉及抑制哺乳动物细胞释放促炎细胞因子的方法。该方法包括用足够量的本发明抗体或抗体组合物处理细胞以抑制细胞释放促炎细胞因子。在这些实施方式中，所述细胞是能释放促炎细胞因子的任何细胞，包括但不限于外周血单核细胞和巨噬细胞。此外，所述促炎细胞因子可选自TNF、IL-1α、IL-1β、MIF和IL-6。在一具体实施方式中，所述细胞是巨噬细胞，所述促炎细胞因子选自TNF、IL-1α、IL-1β、MIF和IL-6。在一个实施方式中，可采用这些方法来处理患有以炎性细胞因子级联反应激活为特征的病症或处于患病风险的患者细胞。本文列举了具体的病症。 
在相关实施方式中，本发明涉及治疗以炎性细胞因子级联反应激活为特征的患者病症的方法。该方法包括给予患者本发明的抗体或抗体组合物。已列举了具体的病症。
3.附图简述 
图1.人HMG1和HMG2的比对。 
图2.本发明的人抗-HMG1抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。下划线处：CDR(Kabat定义)。A)S2VL(SEQ ID NO.：5-6)；B)S2VH(SEQ ID NO.：7-8)；C)S6VL(SEQ ID NO.：9-10)；D)S6VH(SEQ IDNO.：11-12)；E)S16VL(SEQ ID NO.：13-14)；F)S16VH(SEQ ID NO.：15-16)；G)G4VL(SEQ ID NO.：17-18)；H)G4VH(SEQ ID NO.：19-20)；I)E11VL(SEQID NO.：24-25)；和J)Ell VH(SEQ ID NO.：26-27)。SEQ ID NO.指氨基酸序列和核苷酸序列，详见表3。 
图3.人抗-HMB1抗体的物理特性。A)人抗-HMB1抗体的等电聚焦(IEF)分析图表明不同的人抗-HMG1抗体的pI值范围广泛(例如，约7.77-约9.24)。B)人抗-HMG1抗体的示差扫描量热法(DSC)分析图表明不同的人抗-HMG1抗体的Tm值范围广泛(例如，约66℃-约90℃)。C)IEF和DSC分析的图示表明pI和Tm值之间不直接相关。 
图4.人抗-HMG1抗体的结合动力学和特异性。图A)几种人抗-HMG1抗体的HMG1捕捉ELISA结合曲线，显示这些抗体对大肠杆菌(E.coli)产生的重组HMG1具有不同的亲和力。图B)几种人抗-HMG1抗体的HMG1捕捉ELISA结合曲线比较了对重组HMG1(左图)和天然核HMG1(右图)的捕捉情况，表明S16和G4能与HMG1的两种形式结合，而S2、S6和S 10与重组HMG1的结合优于和天然核HMG1的结合。图C)几种人抗-HMG1抗体的HMG1捕捉ELISA结合曲线比较了天然核的、坏死的和激活的HMG1的捕捉情况，表明S6和G4(程度较低)能以不同的亲和力与各种形式结合，而S16不能。图D)为几种人抗-HMG1抗体进行的捕捉ELISA试验结合曲线，比较了两种不同的捕捉形式：固定的抗体(正方形)和固定的HMG1(三角形)，表明E11和S17(程度较低)对于可溶性HMG1具有较高亲和力，而G2、G4、G9和G12显示与固定的或可溶性HMG1结合的差异小。图E)ELISA数据显示了几种人抗-HMG1抗体对HMG1和HMG2的相对结合亲和力，表明在该试验中，所测试的大多数抗体(G2、G4、G9、G12、S3、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S14和S17)是HMG1特异性 的，而S12和S16显示与HMG1和HMG2均有一定结合，E11显示对HMG2具有较高结合亲和力。这些试验的数据和其它未显示的数据总结于表1。 
图5.HMG1B框表位的作图研究。显示了几种人抗-HMG1抗体的HMG1B框肽ELISA结合曲线。这些曲线表明S12、S16和G4能与HMG1肽91-169结合(图A)。S12也能与HMG1肽150-183结合(图B)。其余测试的抗体(S2、S6、S10、G2和G9)不能与该试验中测试的任一HMG1B框肽结合。 
图6.许多人抗-HMG1抗体能抑制HMG1刺激人PBMC释放细胞因子。图A显示了几种人抗-HMG1抗体(G9、S14、G20、S2、S6和S17)抑制重组HMG1刺激IL-1B、IL-6和TNF-a释放的活性的代表性剂量反应曲线。结果以所释放细胞因子的pg/ml(上图)和抑制百分比(下图)作图。图B显示了几种人抗-HMG1抗体(G4、S6、S16和S6+S16)和RAGE-Fc融合蛋白抑制重组HMG1刺激IL-6释放的代表性剂量反应曲线。图C显示了E11、S13、S16、S17、G4、G9、S6、RAGE-Fc和A框融合蛋白抑制天然活化的HMG1刺激IL-6释放的代表性剂量反应曲线。从这些数据和其它未显示数据计算的IC50值总结于表1。 
图7.几种人抗-HMG1抗体抑制小鼠巨噬细胞(mM
Figure S05841546020070606D00013143539QIETU
)中HMG1刺激的细胞因子基因表达。显示了用缓冲液，单用重组HMG1(E-HMGB1)，联用E-HMGB1加人同种型对照(HuIgG)，人抗-HMG1抗体(E11、G2、G4、S6和寡克隆(oligoclonal))以及小鼠和人RAGE-Fc融合蛋白处理的小鼠巨噬细胞中IL-1β(左)或TNF-a(右)的相对基因表达。E11、G2、G4和寡克隆以及两种RAGE-Fc融合蛋白均稳定地抑制IL-1β表达。G2和小鼠RAGE-Fc融合蛋白稳定地抑制TNF-a表达。这些数据和未显示的其它数据总结于表1。 
图8.人抗-HMG1抗体的亚组阻断重组HMG1与RAGE结合。采用ELISA结合试验检测HMG1与RAGE-Ig融合体的结合情况。显示了许多人抗-HMG1抗体的抑制百分率。G2、G4、S10、S16、S2和S6显示明显能阻断HMG1和RAGE的结合，而E11、G12、G16、G20、G34、G9、寡克隆、S12、S14和S17不能阻断。这些数据和未显示的其它数据总结于表1。 
图9.E11部分阻断TLR4激活。采用细胞萤光素酶报道***检测HMG1诱导的TLR4激活。显示了单用培养基、单用重组HMG1(rHMGB)和联用rHMGB加S2、E11、S6、G4、S14或多克隆抗体处理的细胞的萤光素酶总活性。E11显示 明显能阻断HMG1诱导的TLR4激活。这些数据和未显示的其它数据总结于表1。 
图10.抑制重组HMG1与Thp-1细胞(结合)。显示了E11、G2和RAGE-Fc融合蛋白抑制重组HMG1与Thp-1细胞结合的代表性剂量反应曲线。从这些数据和其它未显示数据计算的IC50值总结于表1。 
图11.人抗-HMG1抗体在脓毒症小鼠CLP模型中具有保护作用。显示的脓毒症小鼠CLP模型的代表性存活曲线比较了用人抗-HMG1抗体或人同种型对照抗体(R3-47)的处理。G4(图A和B)、S16(图A和D)、S6(图C)、E11和寡克隆(均在图D中)抗-HMG1抗体能改善存活率高达60％。 
图12.HMG1在几种炎性疾病模型中上调。在第10天收获的未处理被动CIA小鼠前爪中，存在的HMG1水平发现比正常小鼠中存在的至少增加了10倍(图A)。在未处理主动CIA小鼠的关节中，发现后爪(右)中HMGB1、RAGE、TLR2、TLR4和TLR9的相对基因表达水平升高，而前爪(左)中只有HMGB1、RAGE和TLR2的相对基因表达水平升高(均在图B中)。在未处理主动CIA小鼠中，发现关节后爪(图)和前爪(图)中IL-1b、IL-6和TNF-a的相对基因表达水平均升高(图C)。AIA大鼠踝关节中HMGB1水平升高(右上图)与爪炎症评分增加(左上图)和相对体重降低(左下图)相关(均在图D中)。发现用金黄色葡萄球菌(S.aureus)攻击的动物血清中HMBG1、IL-1B和TNF-a水平升高(图E)，其中HMGB1水平从攻击后2小时开始恒定升高，TNF-a在2小时显示早期高峰，然后在约7小时降低至接近基线，在约12小时出现第二高峰，而IL-6在约2小时出现高峰，然后缓慢升高。ALI小鼠BAL液中HMGB1水平在给予LPS后50小时内增加至16ng/ml以上，最显著升高始于约第26小时(左图)，与BAL液中观察到的细胞总数最大增高相关(右图)(均在图F中)。(显示了)用PBS、人同种型对照(HuIgG)、抗-HMG1抗体G4、HMG1A-框-Fc融合蛋白、氨甲喋呤(Methyltrexate)(MTX)、MTX+HuIgG、MTX+Renbrel和MTX+G4处理后AIA大鼠踝关节中HMBG1(左上图)和IL-6(左下图)的水平。也显示了用HuIgG、G4或MTX+HuIgG治疗后AIA大鼠踝关节中的TNF-a水平(右上图)。单用G4和MTX+HuIgG或MTX+Renbrel显示HMG1、IL-6和TNF-a水平降低，然而联用MTX+G4显示降低作用最惊人。这些数据与各种处理时爪炎症评分所见的降低相关(见图16B)。
图13.人抗-HMG1抗体在关节炎被动CIA小鼠模型中具有保护作用。图A显示了用MTX和Renbrel(左上图)、人抗-HMG1抗体S6(右上图)和G16(左下图)和HMG1A-框-Fc融合蛋白(右下图)治疗的被动CIA小鼠随时间变化的爪炎症评分。在此模型中，MTX/Renbrel联用和S6抗体均降低了临床评分，而S6的作用更显著。显示了对前爪和后爪(图B)或单独前爪(图C)组织学检查获得的骨(左上图)、软骨(右上图)和炎症(左下图)的评分图。图D显示用MTX和Renbrel(左上图)、人抗-HMG1抗体S6(右上图)和G16(左下图)及HMG1A-框-Fc融合蛋白(左下图)治疗的小鼠体重指数随时间的变化。如临床评分所示，MTX/Renbrel联用和S6显示了保护作用，而S6效力更好。 
图14.人抗-HMG1抗体在关节炎被动CIA小鼠模型中具有保护作用。实验2(图A)显示了用PBS、Renbrel或G4(右图)和用PBS、G4或同种型对照抗体(左图)治疗的被动CIA小鼠的爪炎症评分随时间的变化。实验3(图B)显示了用PBS、G4或同种型对照抗体治疗的被动CIA小鼠的爪炎症评分随时间的变化。此两项向研究也追踪了正常小鼠的临床评分并作图。两个实验均证明在该模型中G4人抗-HMG1抗体能保护(小鼠)免于发生炎症。在实验2中，G4显示效力优于Renbrel。 
图15.人抗-HMG1抗体在关节炎主动CIA小鼠模型中具有保护作用。图A显示了用PBS、同种型对照抗体或G4治疗的主动CIA小鼠(左图)和用PBS或Renbrel治疗的主动CIA小鼠(右图)的爪炎症评分随时间的变化。图B是显示同种型对照和G4抗体治疗组的相对体重随时间变化绘制的图。所有图也绘制了PBS处理小鼠和正常小鼠的评分。在此模型中，G4人抗-HMG1抗体对炎症和体重丧失的保护作用显示优于Renbrel。 
图16.人抗-HMG1抗体在关节炎AIA大鼠模型中具有保护作用。用PBS、同种型对照抗体或G4治疗AIA大鼠(左图)和用PBS或Renbrel治疗的CIA小鼠(右图)爪炎症评分随时间变化作的图(均在图A中，也可参见图B)，显示在此模型中，与PBS对照相比G4抗-HMG1抗体能降低爪炎症评分约35％，而单用Renbrel只能降低爪炎症评分25％(图A)。联用氨甲喋呤和第二药物(同种型对照、G4或Renbrel)治疗的AIA大鼠爪炎症评分随时间变化作的图(图16B)显示MTX和G4联用甚至比单用G4和MTX/Renbrel联用更有效。用MTX和G4治疗能降低爪炎症评分至接近正常(图B)。也显示了用HMG1A-框-Fc融合蛋白治疗 的爪炎症评分，其效力低于单用G4。 
图17.人抗-HMG1抗体在腹膜炎小鼠模型中具有保护作用。与用PBS或同种型对照(R347)治疗的小鼠相比，在用热灭活金黄色葡萄球菌攻击诱导腹膜炎的小鼠中，96小时的存活百分比显示G4能提高存活率近30％(图A)。抗体在-30分钟时给予(星形)，金黄色葡萄球菌攻击在第0分钟时给予(三角形)。 
图18.人抗-HMG1抗体在急性肺损伤(ALI)小鼠模型中具有保护作用。与用任一种同种型对照抗体(R347)治疗的小鼠相比，用G4或E11治疗的ALI小鼠BAL液中回收的总细胞降低了近40％。用HMG1A-框-Fc融合蛋白治疗只使回收的总细胞降低23％。 
图19.多发性硬化症(MS)样品人脑组织中的HMG1染色模式。样品A)含有激活小胶质细胞的MS病灶(plaque)背景染色，利用1μg/ml同种型对照；B)小胶质细胞的细胞质和含有激活小胶质细胞的MS病灶间质的特异性HMGB1染色，利用1μg/ml同种型对照；和C)发现在含有脱髓鞘的、少量激活小胶质细胞和大量淋巴细胞的MS病灶中染色降低，利用1μg/ml G16。 
4.表格简述 
表1—抗体特征和保藏信息。 
表2—保守性氨基酸取代家族。 
表3—序列表的说明 
表4—被动CIA小鼠模型治疗方案的说明 
表5—AIA大鼠模型治疗方案的说明 
表6—腹膜炎模型治疗方案的说明 
5.发明详述 
本发明部分根据发现能与HMG1及其抗原性片段特异性结合的抗体(本文也称为“HMGB1”)，所述抗体显示某些生物化学、结合和功能特征。能与HMG1特异性结合的抗体在本文专门称为“本发明的高亲和力抗体”、“高亲和力抗体”，也包括更宽泛的术语“本发明抗体”、“抗-HMG1抗体”和简称的“HMG抗体”以及类似术语。本发明也部分根据发现能与HMG1和HMG2都结合的抗体。
本发明抗体的生物化学特征包括但不限于：等电点(pI)和解链温度(Tm)。本发明抗体的结合特征包括但不限于：结合特异性、解离常数(Kd)、表位、区分HMG1的各种形式(例如，重组的、天然的、乙酰化的)和/或HMG1制品的能力以及与可溶性和/或固定化抗原结合的能力。本发明抗体的功能特征包括但不限于：抑制HMG1诱导的细胞因子释放、抑制HMG1与一种或多种受体结合、抑制HMG1与细胞表面结合以及在一种或多种炎性疾病(例如，脓毒症、关节炎、急性肺损伤、腹膜炎)模型中的保护作用。 
本发明抗体和含有这些抗体的组合物可用于许多目的，例如作为抵御各种慢性和急性炎性疾病和病症的治疗剂，所述疾病和病症包括但不限于：脓毒症、类风湿性关节炎、腹膜炎、克罗恩病、再灌注损伤、败血症、内毒素性休克、囊性纤维化、心内膜炎、银屑病、关节炎(例如，银屑病关节炎)、过敏性休克、器官局部缺血、再灌注损伤、脊髓损伤和同种异体移植物排斥。 
此外，本发明高亲和力抗体可用于诊断性应用。本发明抗体可用于，例如但不限于：纯化、检测和靶向本发明的HMG1和/或HMG2多肽，包括体外和体内诊断和治疗方法。例如，所述抗体可用于免疫测定来定性和定量检测生物学样品中本发明HMG1和/或HMG2多肽的水平。参见，例如Harlow等，Antibodies：ALaboratory Manual(《抗体：实验室手册》)，(冷泉港实验室出版社，第二版，1988)。 
5.1本发明抗体 
本文所用的“能与HMG1及其抗原性片段特异性结合”的高亲和力抗体或其片段指，例如所述高亲和力抗体或其片段能与HMG1多肽或HMG1多肽片段(例如，HMG1A框和HMG1B框)或HMG1多肽的某表位特异性结合(用本领域熟知的检测特异性抗体-抗原结合的免疫测定来检测)，但不与其它多肽特异性结合。在一个实施方式中，能与HMG1多肽或其片段特异性结合的高亲和力抗体或其片段不与其它抗原发生非特异***叉反应(例如，不能用非HMG1蛋白，如BSA竞争除去结合)。本发明也包括能与HMG2多肽或HMG2多肽片段(例如，HMG2A框和HMG2B框)或HMG2多肽的抗原性片段特异性结合的高亲和力抗体或其片段。 
本领域技术人员应知道虽然HMG1和HMG2是不同的蛋白质，但二者可具有同源性区域(参见图1)。因此，预计所述高亲和力抗体或其片段可与HMG1及其抗 原性片段特异性结合，但不与HMG2或其抗原性片段结合。还预计所述高亲和力抗体或其片段可与HMG2及其抗原性片段特异性结合，但不与HMG1或其抗原性片段结合。还预计本发明高亲和力抗体可与HMG1和HMG2共有的某表位特异性结合。HMG1和HMG2中共有的表位可相同，在这种情况下，HMG1和HMG2中含有该表位的氨基酸序列相同。因此，本发明高亲和力抗体与HMG1和HMG2都能特异性结合(例如，抗体能特异性识别同时存在于HMG1和HMG2中的相同表位)。或者，HMG1和HMG2中均可能有相似的共有表位。例如HMG1和HMG2之间的相似表位可享有显著的同源性(例如，60％-99％相同性)和/或采取相似的三维构象，因而本发明高亲和力抗体能与该共享表位交叉反应。因此，本发明高亲和力抗体能分别与HMG1或HMG2特异性结合，和能与HMG2或HMG1交叉反应。本发明高亲和力抗体对存在于HMG1和HMG2上的相似表位可具有不同亲和力。因此，还预计本发明高亲和力抗体可以相同或不同的亲和力与HMG1和HMG2结合。在一具体实施方式中，高亲和力抗体或其片段与HMG1和/或HMG2的特异性结合胜过其它抗原。 
在一个实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有HMG1和/或HMG2的A框(例如，分别是SEQ ID NO.3和22)或者由其构成(或基本上由其构成)。 
在另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有HMG1和/或HMG2的B框(例如，分别是SEQ ID NO.4和23)或由其构成(或基本上由其构成)。 
本发明也包括能与含有衍生自HMG1和/或HMG2的A框及B框的氨基酸残基或者由其构成(或基本上由其构成)的表位特异性结合的抗体。衍生自A框及B框的氨基酸残基的表位可以是A和B框相连得到的线形多肽，或者可以是含有A和B框氨基酸残基的三维构象多肽。 
本发明也具体包括具有多种特异性的抗体(例如，对两个或多个不连续的抗原具有特异性的抗体(总结于Cao等，2003，Adv Drug Deliv Rev，55：171；Hudson等，2003，Nat Med，1：129)。例如，双特异性抗体可含有融合在一起的两个不同的结合特异性(位点)。在最简单的情况中，双特异性抗体能与一个靶抗原上的两个毗邻表位结合，这种抗体不与其它抗原交叉反应(如上所述)。或者，双特 异性抗体能与两个不同的抗原结合，这种抗体能与两个不同的分子(例如，HMG1和HMG2)结合，但不能与其它不相关的分子(例如，BSA)结合。此外，能与HMG1和/或HMG2特异性结合的抗体可能与相关的HMG蛋白交叉反应。 
本文所述的术语HMG1和/或HMG2“片段”包括含有HMG1和/或HMG2多肽(例如，人HMG1和/或HMG2)氨基酸序列中以下数个氨基酸残基的氨基酸序列或者由其构成(或基本上由其构成)的HMG1和/或HMG2肽或多肽：至少5个毗连氨基酸残基、至少10个毗连氨基酸残基、至少15个毗连氨基酸残基、至少20个毗连氨基酸残基、至少25个毗连氨基酸残基、至少40个毗连氨基酸残基、至少50个毗连氨基酸残基、至少60个毗连氨基酸残基、至少70个毗连氨基酸残基、至少80个毗连氨基酸残基、至少90个毗连氨基酸残基、至少100个毗连氨基酸残基、至少125个毗连氨基酸残基、至少150个毗连氨基酸残基、至少175个毗连氨基酸残基、至少200个毗连氨基酸残基或至少250个毗连氨基酸残基。 
本文所述的术语HMG1和/或HMG2“片段”具体也包括含有HMG A(例如，人HMG1和/或HMG2A框)框或HMG B(例如，人HMG1和/或HMG2B框)框中以下数个氨基酸残基的氨基酸序列或者由其构成(或基本上由其构成)的多肽：至少5个毗连氨基酸残基、至少10个毗连氨基酸残基、至少15个毗连氨基酸残基、至少20个毗连氨基酸残基、至少25个毗连氨基酸残基、至少40个毗连氨基酸残基、至少50个毗连氨基酸残基、至少60个毗连氨基酸残基、至少70个毗连氨基酸残基或至少80个毗连氨基酸残基。 
本发明“高亲和力抗体”(本文也称为“本发明高亲和力抗体”、“高亲和力抗体”，也包括更宽泛的术语“本发明抗体”和简称的“HMG抗体”)包括但不限于：合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、胞内抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链Fv(scFv)、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)(包括双特异性sdFv)和抗独特型(抗-Id)抗体和以上任何抗体的表位结合片段。本发明抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更高的多特异性。多特异性抗体可以是对本发明多肽不同表位特异性的，或者可对本发明多肽以及异源表位，例如异源多肽或固体支持材料特异。参见，例如PCT公开WO93/17715；WO92/08802；WO91/00360； WO92/05793；Tutt等，J.Immunol.，147：60-69(1991)；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny等，J.Immunol.，148：1547-1553，(1992)。 
多特异性抗体至少对两种不同抗原具有结合特异性。虽然这种分子通常只与两种抗原结合(双特异性抗体，BsAbs)，但本发明包括具有额外特异性的抗体，例如三特异性抗体。BsAbs的例子包括但不限于一个臂针对HMG1和/或HMG2表位，而另一臂针对任何其它抗原的那些抗体。本领域已知制备双特异性抗体的方法。全长双特异性抗体的常规制备方法以共同表达两对免疫球蛋白重链为基础，其中所述两链具有不同特异性(Millstein等，1983，Nature，305：537-539)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机重配，这些杂交瘤(四源瘤(quadroma))产生了不同抗体分子的可能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。纯化该正确的分子一般通过亲和层析步骤进行，这相当繁重并且产物收率低。类似的方法见WO93/08829和Traunecker等，1991，EMBOJ.，10：3655-3659。更直接的方法是产生二(价)-双抗体，一种四价双特异性抗体。本领域已知产生二(价)-双抗体的方法(参见，例如Lu等，2003，J Immunol Methods，279：219-32；Marvin等，2005，ActaPharmacolical Sinica，26：649)。 
按照另一种方法，将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。优选与含有绞链区、CH2和CH3区至少一部分的免疫球蛋白重链恒定区相融合。优选至少一种融合体中存在含轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CHl)。将编码免疫球蛋白重链融合体和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA***不同的表达载体中，共同转染入合适的宿主生物体中。当构建所用这三种多肽链比例不等时可提供最佳产率，这对调节这三种多肽片段彼此的比例提供了高度灵活性。然而，当等比例表达至少两种多肽链获得高产率或者当所述比例不具有特别意义时，可将两种或所有三种多肽链的编码序列***一个表达载体中。 
在该方法的一个实施方式中，双特异性抗体由一对在一个臂中具有第一结合特异性(例如，HMG1和/或HMG2表位，如A-框、B-框)的杂交免疫球蛋白重链和另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。发现此不对称结构有助于分离所需的双特异性化合物和不要的免疫球蛋白链混合物，因为只在该双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链而提供了方便的分离方法。此方法见 WO94/04690。产生双特异性抗体的其它细节可见，例如Suresh等，1986，Methods in Enzymology，121：210。根据WO96/27011所述的另一方法，可工程改造一对抗体分子尽可能提高从重组细胞培养物中回收异源二聚体的百分比。优选的界面含有抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在此方法中，用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小侧链的氨基酸(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大侧链氨基酸可在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空穴”。这提供了增加异质二聚体产率超过不要终产物(例如同质二聚体)的机制。 
双特异性抗体包括交联的或“异质缀合物(heteroconjugate)”抗体。例如，该异质缀合物中的一种抗体可与亲和素偶联，另一抗体与生物素偶联。有人提出，例如这种抗体可使免疫***细胞靶向不要的细胞(美国专利号4,676,980)并可用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。可采用常规的交联方法制备异质缀合物抗体。本领域熟知合适的交联剂和许多交联技术，可参见美国专利号4,676,980。 
考虑了具有两价以上的掺有至少一个本发明绞链修饰的抗体。例如，可制备三特异性抗体。参见，例如Tutt等，J.Immunol.，147：60，(1991)。 
其它专门考虑的抗体是“寡克隆”抗体。本文所用的术语“寡克隆抗体”指不同单克隆抗体的预定混合物。本领域已知制备寡克隆抗体的方法。参见，例如“实施例章节”，实施例1，PCT公布WO95/20401；美国专利号5,789,208和6,335,163。在某些实施方式中，寡克隆抗体由在一个细胞中产生的针对一种或多种表位的抗体预定混合物构成。在其它实施方式中，寡克隆抗体含有多个重链，其能与共同的轻链配对从而产生具有多特异性的抗体(例如，PCT公布WO04/009618)。当需要靶向一个靶分子(例如，HMG1)上的多个表位时，寡克隆抗体特别有用。本领域技术人员知道或能确定哪种类型的抗体或抗体混合物适用于所需目的和需要。具体地说，本发明抗体包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有能与HMG1抗原特异性结合的抗原结合位点(例如，抗-HMG1抗体的一个或多个互补决定区(CRD))的分子。也专门考虑了本发明抗体可包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有能与HMG2抗原特异性结合的抗原结合位点(例如，抗-HMG2抗体的一个或多个互 补决定区(CRD))的分子。本发明免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可同时含有重链和轻链。IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY重链的阵列可与κ或λ形式的轻链配对。 
本发明抗体也包含免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性片段，即含有抗原结合位点的分子，可将这些片段与或不与另一免疫球蛋白结构域(包括但不限于Fc区或其片段)融合。如本文所概述的，术语“抗体”包括能与本文所述HMG1和/或HMG2特异性结合的抗体、全长抗体及其含有Fc区的Fc变体、或其与本文所述免疫球蛋白的免疫学活性片段或其它蛋白融合的含有至少一个本文所述新氨基酸残基的片段。这种变体Fc融合体包括但不限于：scFv-Fc融合体、可变区(例如，VL和VH)-Fc融合体、scFv-scFv-Fc融合体。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。 
本发明抗体也包括在哺乳动物(例如，人)中具有以下半衰期(例如，血清半衰期)的抗体：5天以上、10天以上、15天以上、20天以上、25天以上、30天以上、35天以上、40天以上、45天以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上或5个月以上。本发明抗体在哺乳动物(例如，人)中半衰期增加导致所述抗体或抗体片段在哺乳动物中的血清滴度较高，减少了所述抗体或抗体片段的给药频率和/或降低了给予所述抗体或抗体片段的浓度。可通过本领域技术人员已知的技术制备体内半衰期增加的抗体。例如，可通过修饰(如，取代、缺失或添加)经鉴定参与Fc区和FcRn受体间相互作用的氨基酸残基来产生体内半衰期增加的抗体(参见，例如国际公布号WO97/34631；WO04/029207；U.S.6,737056和美国专利公布号2003/0190311，下文将更详细讨论)。 
在一个实施方式中，本发明抗体可在其Fc区内包含修饰/取代和/或新的氨基酸，例如以下文献中所述的：Ghetie等，1997，Nat Biotech.，15：637-40；Duncan等，1988，Nature，332：563-564；Lund等，1991，J.Immunol，147：2657-2662；Lund等，1992，Mol Immunol，29：53-59；Alegre等，1994，Transplantation，57：1537-1543；Hutchins等，1995，Proc Natl.Acad Sci USA，92：11980-11984；Jefferis等，1995，Immunol Lett.，44：111-117；Lund等，1995，Faseb J，9：115-119； Jefferis等，1996，Immunol Lett，54：101-104；Lund等，1996，J Immunol，157：4963-4969；Armour等，1999，Eur J Immunol，29：2613-2624；Idusogie等，2000，J Immunol，164：4178-4184；Reddy等，2000，J Immunol，164：1925-1933；Xu等，2000，Cell Immunol，200：16-26；Idusogie等，2001，J Immunol，166：2571-2575；Shields等，2001，J Biol Chem，276：6591-6604；Jefferis等，2002，Immunol Lett，82：57-65；Presta等，2002，Biochem Soc Trans，30：487-490；美国专利号5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利申请号10/370,749和PCT公开WO94/2935；WO99/58572；WO00/42072；WO02/060919；WO04/029207。本领域技术人员不难理解Fc区的其它修饰/取代。 
可通过本领域技术人员熟知的许多方法制备在Fc区域含有修饰/取代和/或新氨基酸残基的本发明抗体。非限制性例子包括分离抗体或编码区(例如，从杂交瘤分离)，在该分离的抗体编码区中制作一个或多个所需取代。或者，可将本发明抗体的可变区亚克隆入编码含有一个或(多个)修饰/取代和/或新的氨基酸残基的Fc区的载体中。 
也可修饰本发明抗体而改变该抗体的糖基化，再次改变其一种或多种功能特性。 
在一个实施方式中，修饰本发明抗体的糖基化。例如，可制备去糖基化(aglycosylate)的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化从而，例如提高该抗体对靶抗原的亲和力。这种碳水化合物修饰可伴有，例如抗体序列中一个或多个糖基化位点的改变。例如，可制作一个或多个氨基酸取代从而消除一个或多个可变区框架的糖基化位点进而消除该位点的糖基化。这种去糖基化可提高该抗体对抗原的亲和力。美国专利号5,714,350和6,350,861进一步详述了这种方法。 
或者，可将本发明抗体制成具有改变的糖基化类型，例如岩藻糖基残基含量减少的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体或含有GlcNAc双剖面结构增强的抗体。已证明这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可伴有，例如在宿主细胞中表达改变了糖基化机制的抗体。本领域已描述了含有改变糖基化机制的细胞，这些细胞可用作宿主细胞来表达本发明重组抗体从而产生 具有改变糖基化的抗体。可参见，例如Shields，R.L.等，(2002)，J.Biol.Chem.，277：26733-26740；Umana等，(1999)，Nat.Biotech.，17：176-1，以及欧洲专利号EP1,176,195；PCT公开WO03/035835；WO99/54342。 
如下文所详述的，可单独使用本发明抗体或与其它组合物联用。所述抗体还可在N-或C-末端与异源多肽重组融合，或与多肽或其它组合物化学缀合(包括共价和非共价缀合)。例如，本发明抗体可与在检测试验中用作标记物的分子和效应分子，例如异源多肽、药物、放射性核素或毒素融合或缀合。参见，例如PCT公开WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利号5,314,995和EP396,387。 
本发明抗体包括经修饰的衍生物，即通过使任何类型的分子与该抗体共价连接，但该共价连接不会阻止该抗体与HMG1和/或HMG2多肽或其片段结合和/或产生所需反应。例如但不限于：抗体衍生物包括经修饰的抗体，例如用已知的保护/封闭基团、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质连接等(实现)糖基化、乙酰化、peg化、磷酸化、酰胺化衍生。可通过已知技术，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等进行各种化学修饰。此外，所述衍生物可含有一个或多个非典型氨基酸。见下文，名为“抗体衍生物和缀合物”的章节5.5。 
也可根据它们的交叉反应性描述或指定本发明抗体。包括不与本发明多肽的任何其它类似物、直向同源物或同源物结合的抗体。本发明也包括能与和本发明的人HMG1多肽(例如，人HMG1A框或B框)具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％相同性(利用本领域已知和本文所述方法计算)的多肽结合的抗体。在具体的实施方式中，本发明抗体能与人HMG1蛋白及其相应表位的小鼠、大鼠和/或家兔同源物交叉反应。本发明也包括能与和人HMG2(例如，人HMG2A框或B框)具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％相同性(利用本领域已知和本文所述方法计算)的多肽结合的抗体。还考虑了能与人HMG2多肽或其片段结合的抗体可与人HMG1蛋白及其相应表位的小鼠、大鼠和/或家兔同源物交叉反应。 
本发明也包括不能与和本发明HMG1和/或HMG2多肽具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小 于55％和小于50％相同性(利用本领域已知和本文所述方法计算)的多肽结合的抗体。 
在一个实施方式中，能与HMG1多肽或其片段特异性结合的抗体或其片段能预防/拮抗/抑制以下一种或多种情况：HMGB1与RAGE结合、HMGB1与一种或多种Toll-样受体(例如，TLR2和TLR4)结合、HMGB1与细胞表面(例如，THP-1细胞)结合、HMG1-介导的促炎细胞因子释放、HMG1-介导的炎症、HMG1-介导的脓毒症、HMG1-介导的炎症(例如，关节的炎症)和HMG1-介导的关节炎。可通过本领域已知的一种或多种方法检测这些活性。参见，例如US20040005316；6,468,533和6,448,223；及下文名为“实施例”的章节6。 
术语“50％抑制浓度”(简写为“IC50”)表示抑制该抑制剂所靶向分子(例如，HMG1)某给定活性的50％所需的抑制剂(例如，本发明抗体)浓度。本领域技术人员应该知道较低的IC50值对应于更强效的抑制剂。在一个实施方式中，本发明抗体抑制HMG1-介导的促炎细胞因子释放的IC50值是：小于5000ng/ml、或小于4000ng/ml、或小于3000ng/ml、或小于2000ng/ml、或小于1000ng/ml、或小于500ng/ml、或小于250ng/ml、或小于100ng/ml、或小于50ng/ml、或小于10ng/ml或小于5ng/ml。在另一实施方式中，本发明抗体抑制HMG1-介导的促炎细胞因子释放的IC50值是：小于1000nM、或小于500nM、或小于250nM、或小于100nM、或小于50nM、或小于25nM、或小于10nM、或小于5nM、或小于0.25nM、或小于0.1nM或小于0.01nM。 
在一个实施方式中，本发明抗体能预防/拮抗/抑制HMG1与RAGE结合，但基本上不影响HMG1与一种或多种Toll-样受体(例如，TLR2和TLR4)结合。在另一实施方式中，本发明抗体能预防/拮抗/抑制HMG1与一种或多种Toll-样受体(例如，TLR2和TLR4)结合，但基本上不影响HMG1与RAGE结合。在还有另一实施方式中，本发明抗体能预防/拮抗/抑制HMG1与RAGE结合并抑制HMG1与一种或多种Toll-样受体(例如，TLR2和TLR4)结合。可通过本领域已知的一种或多种方法检测这些活性。参见，例如US20040005316；6,468,533和6,448,223；及下文名为“实施例”的章节6。 
在一具体实施方式中，本发明抗体能抑制HMG1与RAGE的结合至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、 或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％。在另一具体实施方式中，本发明抗体能抑制HMG1与一种或多种Toll-样受体(例如，TLR2和TLR4)的结合至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约100％。在另一具体实施方式中，本发明抗体能抑制HMG1与RAGE的结合至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％。在另一具体实施方式中，本发明抗体能抑制HMG1与一种或多种Toll-样受体(例如，TLR2和TLR4)的结合至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％。 
如本文所述，这些抗体能区分从不同来源分离的同一种多肽。不希望受任何具体理论的束缚，但可通过许多差异来区分从不同来源分离的有相似或相同氨基酸序列的多肽，所述差异包括但不限于：翻译后修饰(例如，磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化等)、总体结构中的改变(例如，二硫键和/或折叠的改变)和可能与该多肽有关的任何其它分子的差异(例如，盐、其它亚基，如多核苷酸和/或其它多肽)。在一个实施方式中，与天然HMG1(例如，从哺乳动物细胞或组织分离)相比，本发明抗体对大肠杆菌重组产生的HMG1特异性结合亲和力相同或较高。在另一实施方式中，与大肠杆菌重组产生的HMG1相比，本发明抗体对天然HMG1(例如，从哺乳动物细胞或组织分离)特异性结合亲和力相同或较高。在还有另一实施方式中，本发明抗体能与天然HMG1的一种或多种形式结合，所述天然HMG1包括但不限于：核HMG1(例如，通过冻融法从细胞中分离)、释放的HMG1(例如，从坏死细胞上清液中分离)和激活的HMG1(例如，从刺激的细胞，如LPS刺激的细胞中分离)。在还有另一实施方式中，本发明抗体不能与天然HMG1的一种或多种形式结合，所述天然HMG1包括但不限于：核HMG1(例如，通过冻融法从细胞中分离)、释放的HMG1(例如，从坏死细胞的上清液中分离)和激活的HMG1(例如，从刺激的细胞，如LPS刺激的细胞中分离)。本文公开了获得天然和重组HMG1的具体方法(参见，下文实施例2)。 
在一个实施方式中，本发明抗体能与可溶性HMG1和/或HMG2特异性结合。 在另一实施方式中，本发明抗体能与固定的HMG1和/或HMG2特异性结合。在还有另一实施方式中，本发明抗体能与可溶性和不溶性的HMG1和/或HMG2特异性结合。 
如上所述，已知HMG1和HMG2是结合多核苷酸(即，DNA和RNA)的蛋白质。在一个实施方式中，本发明抗体能与HMG1和/或HMG2结合，而所述HMG1和/或HMG2与某多核苷酸分子结合。在另一实施方式中，本发明抗体能预防/拮抗/抑制以下一种或多种情况：HMGB1与RAGE结合、HMGB1与一种或多种Toll-样受体(例如，TLR2和TLR4)结合、HMGB1与细胞表面(例如，THP-1细胞)结合、HMG1-介导的促炎细胞因子释放、HMG1-介导的炎症、HMG1-介导的脓毒症、HMG1-介导的炎症(例如，关节的炎症)和HMG1-介导的关节炎，而所述HMG1与某多核苷酸结合。在具体的实施方式中，所述多核苷酸分子是能促进炎性反应的分子(例如，源自微生物或坏死细胞的多核苷酸)。 
在一具体实施方式中，本发明抗体与乙酰化HMG1结合的亲和力高于非乙酰化HMG1的。在另一具体实施方式中，本发明抗体与非乙酰化HMG1结合的亲和力高于乙酰化HMG1的。在还有另一具体实施方式中，本发明抗体与乙酰化HMG1和非乙酰化HMG1结合的亲和力基本相同。 
在另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有人或其它动物，例如哺乳动物和无脊椎动物的HMG1多肽或其抗原性片段或由其构成(或基本上由其构成)。在一具体实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有人HMG1多肽(SEQ ID NO：1或2)或由其构成(或基本上由其构成)。本领域熟知人和其它动物的HMG1多肽(参见，例如US20040005316；6,468,533和6,448,223)。 
在一个实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有与SEQ IDNO：1或2所示人HMG1多肽具有至少60％相同性、至少70％相同性、至少80％相同性、至少85％相同性、至少90％相同性、至少95％相同性、至少97％相同性、至少99％相同性、或100％相同性的HMG1多肽或由其构成(或基本上由其构成)。 
在另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有与SEQ IDNO：3所示人HMG1A框多肽具有至少60％相同性、至少70％相同性、至少80％ 相同性、至少85％相同性、至少90％相同性、至少95％相同性、至少97％相同性、至少99％相同性、或100％相同性的多肽或由其构成(或基本上由其构成)。 
在还有另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有与SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：28和/或SEQ ID NO:29所示人HMG1B框多肽具有至少60％相同性、至少70％相同性、至少80％相同性、至少85％相同性、至少90％相同性、至少95％相同性、至少97％相同性、至少99％相同性、或100％相同性的多肽或由其构成(或基本上由其构成)。 
在另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有人或其它动物，例如哺乳动物和无脊椎动物的HMG2多肽或其抗原性片段或由其构成(或基本上由其构成)。在一具体实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有人HMG2多肽(SEQ ID NO：21)或由其构成(或基本上由其构成)。本领域熟知人和其它动物的HMG2多肽。参见，例如Jantzen等，1990，Nature，344：830-6；Kolodrubetz，1990，Nucleic Acids Res.，18：5565；Laudet等，1993，Nucleic AcidsRes.，21：2493-501和Thomas等，2001，Trends Biochem Sci.，26：167-74。 
在一个实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有与SEQ IDNO：21所示人HMG2多肽具有至少60％相同性、至少70％相同性、至少80％相同性、至少85％相同性、至少90％相同性、至少95％相同性、至少97％相同性、至少99％相同性、或100％相同性的HMG2多肽或由其构成(或基本上由其构成)。 
在另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有与SEQ IDNO：22所示人HMG2A框多肽具有至少60％相同性、至少70％相同性、至少80％相同性、至少85％相同性、至少90％相同性、至少95％相同性、至少97％相同性、至少99％相同性、或100％相同性的多肽或由其构成(或基本上由其构成)。 
在还有另一实施方式中，本发明高亲和力抗体能特异性结合的多肽含有与SEQ ID NO：23所示人HMG2B框多肽具有至少60％相同性、至少70％相同性、至少80％相同性、至少85％相同性、至少90％相同性、至少95％相同性、至少97％相同性、至少99％相同性、或100％相同性的多肽或由其构成(或基本上由其构成)。 
例如，可通过以最佳比较为目的比对序列(例如，可在第一条序列的序列中引入空位)来测定两条氨基酸序列(或两条核酸序列)的相同性百分比。然后比较相应位 置的氨基酸或核苷酸，两条序列间的相同性百分比是两条序列所共有的相同位置数的函数(即，％相同性＝相同位置数目/位置总数×100)。可通过熟知方法，例如利用数学算法进行两条序列的实际比较。这种数学算法的具体的非限制性例子描述于Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，(1993)。如Schaffer等，Nucleic Acids Res.，29：2994-3005，(2001)所述这种算法已纳入在BLASTN和BLASTX程序(2.2版)中。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可采用各程序(例如，BLASTN)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov，2002年4月10日可用。在一个实施方式中，检索的数据库是非冗余(NR)数据库，用于序列比较的参数可设置为：无滤过(no filters)；预期值(Expect value)为10；字大小(Word Size)为3；矩阵是BLOSUM62；存在一个空位为11和延伸为1。 
用于序列比较的数学算法的另一非限制性例子是Myers和Miller算法，CABIOS(1989)。该算法已纳入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG(Accelrys)序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比对氨基酸序列时，可利用PAM120加权残差表(weight residue table)、一个空位长罚分12、一个空位罚分4。本领域已知用于序列分析的其它算法，这些算法包括Torellis和Robotti，Comput.Appl.Biosci.，10：3-5，(1994)所述的ADVANCE和ADAM，及Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci USA，85：2444-8，(1988)所述的FASTA。 
在另一实施方式中，可利用GCG软件包的GAP程序(http://www.accelrys.com，2001年8月31日可用)测定两条氨基酸序列间的相同性百分比，该程序利用Blossom63矩阵或PAM250矩阵，空位加权(gapweight)12、10、8、6或4，长度加权(length weight)2、3或4。在还有另一实施方式中，可利用GCG软件包的GAP程序(在http://www.cgc.com得到)测定两条核酸序列间的相同性百分比，该程序采用空位加权50，长度加权3。 
在本发明的另一实施方式中，所述抗体与HMG1及其抗原性片段特异性结合的解离常数或Kd(koff/kon)小于10-5M、或小于10-6M、或小于10-7M、或小于10-8M、或小于10-9M、或小于10-10M、或小于10-11M、或小于10-12M、或小于10-13M、或小于5×10-13M、或小于10-14M、或小于5×10-14M、或小于10-15M、或小于5×10-15M。在还有另一实施方式中，本发明抗体与HMG1及其抗原性片段特异性结合的解离常数或Kd(koff/kon)介于约10-7M-约10-8M之间、 介于约10-8M-约10-9M之间、介于约10-9M-约10-10M之间、介于约10-10M-约10-11M之间、介于约10-11M-约10-12M之间、介于约10-12M-约10-13M之间、介于约10-13M-约10-14M之间。在还有另一实施方式中，本发明抗体与HMG1及其抗原性片段结合的解离常数或Kd(koff/kon)介于约10-7M-约10-8M之间、介于约10-8M-约10-9M之间、介于约10-9M-约10-10M之间、介于约10-10M-约10-11M之间、介于约10-11M-约10-12M之间、介于约10-12M-约10-13M之间、介于约10-13M-约10-14M之间。 
在本发明的另一实施方式中，所述抗体与HMG2及其抗原性片段特异性结合的解离常数或Kd(koff/kon)小于10-5M、或小于10-6M、或小于10-7M、或小于10-8M、或小于10-9M、或小于10-10M、或小于10-11M、或小于10-12M、或小于10-13M、或小于5×10-13M、或小于10-14M、或小于5×10-14M、或小于10-15M、或小于5×10-15M。在还有另一实施方式中，本发明抗体与HMG2及其抗原性片段特异性结合的解离常数或Kd(koff/kon)介于约10-7M-约10-8M之间、介于约10-8M-约10-9M之间、介于约10-9M-约10-10M之间、介于约10-10M-约10-11M之间、介于约10-11M-约10-12M之间、介于约10-12M-约10-13M之间、介于约10-13M-约10-14M之间。在还有另一实施方式中，本发明抗体与HMG2及其抗原性片段结合的解离常数或Kd(koff/kon)介于约10-7M-约10-8M之间、介于约10-8M-约10-9M之间、介于约10-9M-约10-10M之间、介于约10-10M-约10-11M之间、介于约10-11M-约10-12M之间、介于约10-12M-约10-13M之间、介于约10-13M-约10-14M之间。 
本领域熟知平衡解离常数(Kd)定义为koff/kon。一般知道具有低Kd(即，高亲和力)的结合分子(例如，抗体)优于具有高Kd(即，低亲和力)的结合分子(例如，抗体)。然而在一些情况中，kon或koff值比Kd值更相关。本领域技术人员能确定哪种动力学参数对于某给定抗体的应用最重要。在某些实施方式中，本发明抗体对某种抗原的Kd低于对其它抗原的。 
在另一实施方式中，所述抗体与HMG1及其抗原性片段结合的koff值小于1×10-3s-1或小于3×10-3s-1。在其它实施方式中，所述抗体与HMG1及其抗原性片段结合的koff值小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于10-7s-1、小于 5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1或小于10-10s-1。 
在另一实施方式中，所述抗体与HMG2及其抗原性片段结合的koff值小于1×10-3s-1或小于3×10-3s-1。在其它实施方式中，所述抗体与HMG2及其抗原性片段结合的koff值小于10-3s-1、小于5×10-3s-1、小于10-4s-1、小于5×10-4s-1、小于10-5s-1、小于5×10-5s-1、小于10-6s-1、小于5×10-6s-1、小于10-7s-1、小于5×10-7s-1、小于10-8s-1、小于5×10-8s-1、小于10-9s-1、小于5×10-9s-1或小于10-10s-1。 
在另一实施方式中，本发明抗体与HMG1和/或其抗原性片段结合的缔合速率常数或kon速率值是至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、至少108M-1s-1、或至少109M-1s-1。 
在另一实施方式中，本发明抗体与HMG2和/或其抗原性片段结合的缔合速率常数或kon速率值是至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1、至少108M-1s-1、或至少109M-1s-1。 
与所有多肽相似，所述抗体具有等电点(pI)，其通常定义为多肽不携带净电荷时的pH。本领域已知当溶液的pH等于该蛋白质的等电点时，蛋白质溶解度通常最低。本文所用的pI值定义为主要带电荷形式的pI。可通过各种方法，包括但不限于等电聚焦和各种计算机算法测定蛋白质的pI(参见，例如Bjellqvist等，1993，Electrophoresis，14：1023)。此外，抗体Fab结构域的热解链温度(Tm)可作为抗体热稳定性的良好指标，还可进一步表示保存期限。Tm较低表明凝聚较多/稳定性较差，而Tm较高表明凝聚较少/稳定性较好。因此，某些实施方式优选Tm较高的抗体。可采用本领域已知的任何标准方法，例如示差扫描量热法检测蛋白质结构域(例如，Fab结构域)的Tm(参见，例如Vermeer等，2000，Biophys.J.，78：394-404；Vermeer等，2000，Biophys.J.，79：2150-2154)。 
因此，本发明的其它非排他性实施方式包括具有某些优选生化特征(例如特定等电点(pI)或解链温度(Tm))的本发明高亲和力抗体。 
更具体地说，在一个实施方式中，本发明高亲和力抗体的pI范围是5.5-9.5。在还有另一具体实施方式中，本发明高亲和力抗体的pI范围是约5.5-约6.0、或约6.0-约6.5、或约6.5-约7.0、或约7.0-约7.5、或约7.5-约8.0、或约8.0-约8.5、 或约8.5-约9.0、或约9.0-约9.5。在其它具体实施方式中，本发明高亲和力抗体的pI范围是5.5-6.0、或6.0-6.5、或6.5-7.0、或7.0-7.5、或7.5-8.0、或8.0-8.5、或8.5-9.0、或9.0-9.5。甚至更具体地说，本发明高亲和力抗体的pI是至少5.5、或至少6.0、或至少6.3、或至少6.5、或至少6.7、或至少6.9、或至少7.1、或至少7.3、或至少7.5、或至少7.7、或至少7.9、或至少8.1、或至少8.3、或至少8.5、或至少8.7、或至少8.9、或至少9.1、或至少9.3、或至少9.5。在其它具体的实施方式中，本发明高亲和力抗体的pI是至少5.5、或至少6.0、或至少6.3、或至少6.5、或至少6.7、或至少6.9、或至少7.1、或至少7.3、或至少7.5、或至少7.7、或至少7.9、或至少8.1、或至少8.3、或至少8.5、或至少8.7、或至少8.9、或至少9.1、或至少9.3、或至少9.5。 
可能通过改变抗体中可电离残基的数目和位置来调节pI从而优化溶解性。例如，可通过制作合适的氨基酸取代(例如，用带电荷的氨基酸，如赖氨酸取代不带电荷的残基，如丙氨酸)来调节多肽的pI。不希望受任何具体理论的束缚，抗体中导致所述抗体pI改变的氨基酸取代可提高抗体的溶解性和/或稳定性。本领域技术人员知道哪种氨基酸取代最适合具体抗体实现所需的pI。在一个实施方式中，在本发明抗体中产生取代以改变pI。特别考虑了能导致与FcγR结合改变的Fc区取代(如上所述)也可导致pI改变。在另一实施方式中，专门选择Fc区取代以实现FcγR结合(力)的改变和所需的pI改变。 
在一个实施方式中，本发明高亲和力抗体的Tm范围是65℃-120℃。在具体的实施方式中，本发明高亲和力抗体的Tm范围是约75℃-约120℃、或约75℃-约85℃、或约85℃-约95℃、或约95℃-约105℃、或约105℃-约115℃、或约115℃-约120℃。在其它实施方式中，本发明高亲和力抗体的Tm范围是75℃-120℃、或75℃-85℃、或85℃-95℃、或95℃-105℃、或105℃-115℃、或115℃-120℃。在还有其它具体的实施方式中，本发明高亲和力抗体的Tm是至少约65℃、或至少约70℃、或至少约75℃、或至少约80℃、或至少约85℃、或至少约90℃、或至少约95℃、或至少约100℃、或至少约105℃、或至少约110℃、或至少约115℃、或至少约120℃。在还有其它具体的实施方式中，本发明高亲和力抗体的Tm是至少65℃、或至少70℃、或至少75℃、或至少80℃、或至少85℃、或至少90℃、或至少95℃、或至少100℃、或至少105℃、或至 少110℃、或至少115℃、或至少120℃。 
在一具体实施方式中，本发明高亲和力抗体或其片段是人抗体或人源化抗体。 
在一个实施方式中，本发明也包括能以高亲和力与HMG1特异性结合的特定抗体(及其片段)。具体地说，本文将抗-HMG1抗体分别称为“S2”、“S6”、“S16”和“G4”，这些抗体由美国模式培养物保藏所(10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)保藏，分别指定了ATCC保藏号PTA-6142、PTA-6143、PTA-6259和PTA-6258。这些保藏物按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款而维持。由于提及的这些抗体株按照布达佩斯条约的条款而维持，则签署了布达佩斯条约的专利局可获得这些抗体株。 
在另一实施方式中，本发明包括的抗体含有本文公开的一个或多个可变区(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20、24-27和30-73)能与HMG1和/或HMG2特异性结合。 
本发明也包括G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20，24-27和30-73)的变体，它们在轻链可变(VL)结构域和/或重链可变(VH)结构域中含有一个或多个氨基酸残基取代。本发明也包括G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20，24-27和30-73)的变体，它们在一个或多个VLCDR和/或一个或多个VHCDR中含有一个或多个其它氨基酸残基取代。可在体外或体内测试通过在G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20，24-27和30-73)的VH结构域、VHCDR、VL结构域和/或VLCDR中引入取代而产生的抗体，例如测试其与HMG1和/或HMG2结合的能力(如通过免疫测定，包括但不限于：ELISA和BIAcore)，或其抑制HMG1诱导细胞因子释放，预防、治疗、控制或缓解炎性疾病或其一种或多种症状的能力。 
应该知道本文所提及的互补决定区(CDR)残基编号是Kabat等，(1991，NIH出版物91-3242，National Technical Information Service，Springfield，VA)所述的那些(编号)。具体说是轻链可变区中的残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)，重链可变区中的残基31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)。应注意抗体与抗体之间的CDR差别巨大(根据定义未显示与Kabat共 有序列的同源性)。框架残基的最大比对往往需要将“间隔”残基***要用于Fv区的编号***。应该知道本文提及的CDR是Kabat等(同上)所述的那些(CDR)。此外，因为种间或等位基因趋异，位于任何给定Kabat位置编号的某些单个残基身份在抗体链与抗体链之间可能不同。 
在其它实施方式中，本发明包括含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个本文所述CDR(参见，例如图2A-J，CDR以下划线标出)的抗体。在还有其它实施方式中，本发明包括的抗体能与HMG1和/或HMG2特异性结合，其含有的VHCDR具有表3所列任一VHCDR的氨基酸序列和/或衍生自表3所列任一抗体重链可变区的重链可变区。在另一具体实施方式中，本发明包括的抗体能与HMG1和/或HMG2特异性结合，其含有的VLCDR具有表3所列任一VLCDR的氨基酸序列和/或衍生自表3所列任一抗体轻链可变区的轻链可变区。 
本发明包括的抗体能与HMG1和/或HMG2特异性结合，其含有能与HMG1和/或HMG2特异性结合的本文所述VH结构域、VHCDR、VL结构域或VLCDR的衍生物。可采用本领域技术人员已知的标准技术将突变(例如，添加、缺失和/或取代)引入编码本发明抗体的核苷酸序列，所述技术包括例如常规采用定点诱变和PCR-介导的诱变来产生氨基酸取代。在一个实施方式中，与最初的VH和/或VLCDR相比，VH和/或VLCDR衍生物包含少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代或少于2个氨基酸取代。在另一实施方式中，VH和/或VLCDR衍生物在一个或多个预计的非必需氨基酸残基(即，对于抗体与HMG1和/或HMG2特异性结合不是至关重要的氨基酸残基)处具有保守性氨基酸取代(例如，同上)。或者，可沿着整个VH和/或VLCDR编码序列或其一部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，可筛选得到的突变体的生物学活性以鉴定保留了活性的突变体。诱变后，可表达所编码的抗体，测定该抗体的活性。 
本发明也包括能与HMG1和/或HMG2或其片段特异性结合的抗体，所述抗体包含的重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列与G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20，24-27和30-73)的重链和/或轻链可变区的氨基酸序列有至少 45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。本发明也包括能与HMG1和/或HMG2或其片段特异性结合的抗体，所述抗体包含的重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列与G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20，24-27和30-73)的重链和/或轻链可变区的氨基酸序列有至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％相同。 
本发明还包括能与HMG1和/或HMG2或其片段特异性结合的抗体，所述抗体或抗体片段包含的一个或多个CDR的氨基酸序列与G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20，24-27和30-73)的一个或多个CDR的氨基酸序列有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同。本发明还包括能与HMG1和/或HMG2或其片段特异性结合的抗体，所述抗体或抗体片段包含的一个或多个CDR的氨基酸序列与G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20，24-27和30-73)的一个或多个CDR的氨基酸序列有至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％相同。可采用本领域技术人员已知的任何方法(包括BLSAT蛋白质检索)测定两条氨基酸序列的相同性百分比。 
本发明也包括能与HMG1和/或HMG2或其片段特异性结合的抗体，所述抗体由能在严谨条件下与G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20，24-27和30-73)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。在另一实施方式中，本发明包括能与HMG1和/或HMG2或其片段特异性结合的抗体，所述抗体含有的一个或多个CDR由能在严谨条件下与G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11(参见图2A-J，SEQ ID NO：5-20，24-27和 30-73)的一个或多个CDR的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。严谨杂交条件包括但不限于：约45℃在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤膜结合的DNA杂交，然后在约50-65℃用0.2×SSC/0.1％SDS洗涤一次或多次，高度严谨性条件例如约45℃在6×SSC中与滤膜结合的DNA杂交，然后在约60℃用0.1×SSC/0.2％SDS洗涤一次或多次，或者本领域技术人员已知的任何其它严谨性杂交条件(参见，例如，Ausubel，F.M.等编，1989，Current Protocols in MolecularBiology(《最新分子生物方法》)，第一卷，Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley and Sons，Inc.，纽约，第6.3.1-6.3.6页和2.10.3页)。 
具有保藏抗体的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或所有六个CDR的抗体是本发明的具体实施方式。编码这些抗体(及其片段)的分离的多核苷酸也是本发明的具体实施方式。“S2”、“S4”、“S16”和“G4”以及本发明其它几种特定抗-HMG1抗体的结合与功能特征见表1。
表1-抗-HMG1抗体a的特征和保藏信息 
表1-续 
Figure S05841546020070606D000381
本发明另一实施方式包括将保守性氨基酸取代引入上述感兴趣的抗-HMG1抗体的任何部分(参见表1)。本领域熟知“保守性氨基酸取代”指取代功能相当的氨基酸的氨基酸取代。保守性氨基酸改变导致得到肽的氨基酸序列中沉默性改变。例如，一个或多个极性相似的氨基酸作为功能等价物，在该肽 的氨基酸序列内导致沉默性改变。带电荷为中性的取代和用较小残基替代某残基的取代也可认为是“保守性取代”，即便该残基处于不同组中(例如，用较小的异亮氨酸替代苯丙氨酸)。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。保守性氨基酸取代的几个家族见表2， 
表2：保守性氨基酸取代家族 
家族                               氨基酸
非极性                       Trp、Phe、Met、Leu、Ile、                               Val、Ala、Pro 
不带电极性                    Gly、Ser、Thr、Asn、Gln、                               Tyr、Cys 
酸性/带负电                   Asp、Glu 
碱性/带正电                   Arg、Lys、His 
β-支链的                      Thr、Val、Ile 
影响链取向的残基               Gly、Pro 
芳族                          Trp、Tyr、Phe、His 
术语“保守性氨基酸取代”也指利用氨基酸类似物或变体。有关如何利用表型沉默的氨基酸取代的指南见Bowie等，“解码蛋白质序列中信息：氨基酸取代的耐受”(Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to AminoAcid Substitutions)，(1990，Science，247：1306-1310)。 
5.2产生和筛选本发明抗体的方法 
可通过，例如免疫测定、BIAcore或本领域技术人员已知的其它技术鉴定能与HMG1多肽特异性结合的高亲和力抗体或其片段。 
可通过本领域已知的任何合适方法制备本发明抗体。可通过本领域熟知的各种方法产生感兴趣抗原的多克隆抗体。例如，可将本发明HMG1多肽给予各种宿主动物(包括但不限于家兔、小鼠、大鼠等)以诱导产生含有该抗原特异性多克隆抗体的血清。根据宿主种类，可用各种佐剂提高免疫反应，所述佐剂包括但不限于：弗氏佐剂(完全和不完全)、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子)、肽、油乳剂、匙孔
Figure S05841546020070606D00039152237QIETU
血蓝蛋白、二硝基苯酚和可能有用的人佐剂，例如BCG(卡芥菌)和小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)。本领域也熟知这种佐剂。
可采用本领域已知的各种技术，包括利用杂交瘤、重组体和噬菌体展示技术或它们的组合来制备单克隆抗体。例如，可采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，该技术包括本领域已知和以下文献所指导的那些：Harlow等，Antibodies：A LaboratoryManual(《抗体：实验室手册》)，(冷泉港实验室出版社，第二版，1988)；Hammerling等，刊于Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(《单克隆抗体和T细胞杂交瘤》)，563-681，(Elsevier，纽约，1981)。本文所用的术语“单克隆抗体”不局限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指源自一个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而不是指其产生方法。 
“单克隆抗体”可以包含两种蛋白质，即重链和轻链，或由其构成。 
利用杂交瘤技术制备和筛选特异性抗体的方法是常规和本领域熟知的。在一非限制性例子中，可用本发明的某多肽或表达这种肽的细胞免疫小鼠。一旦检测到免疫反应，例如在小鼠血清中检测到该抗原特异性抗体，收集小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过熟知技术使脾细胞与任何合适的骨髓瘤细胞(例如可从ATCC得到的细胞系SP20细胞)融合。选出杂交瘤，通过有限稀释法克隆。然后通过本领域已知方法检验杂交瘤克隆中分泌能与本发明多肽结合的抗体的细胞。可通过阳性杂交瘤克隆免疫小鼠来产生通常含有高水平抗体的腹水。 
因此，本发明提供制备单克隆抗体的方法以及用此方法产生的抗体，包括培养能分泌本发明抗体的杂交瘤细胞，所述杂交瘤最好用本发明抗原免疫的小鼠分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得；然后筛选融合得到的杂交瘤中分泌能与本发明多肽结合的抗体的杂交瘤克隆。 
可通过已知技术产生能识别特异性表位的抗体片段。例如，可利用酶，如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃胰蛋白酶(产生F(ab′)2片段)，通过蛋白酶解切割免疫球蛋白分子来制备本发明的Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。 
也可采用本领域已知的各种嗜菌体展示方法产生本发明抗体。在嗜菌体展示方法中，功能性抗体结构域展示在携带编码它们的多核苷酸序列的嗜菌体颗粒表面。在一具体实施方式中，可利用这种嗜菌体来展示从贮库或组合抗体库(例如，人或小鼠)表达的抗原结合结构域。可利用抗原，例如利用标记的抗原或结合或捕捉在固体表面或珠上的抗原来选择或鉴定嗜菌体表达的能与感兴趣抗原结合的抗 原结合结构域。这些方法所用的嗜菌体通常是含有从嗜菌体表达的fd和M13结合结构域的丝状嗜菌体，其中Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域与嗜菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合。可用于制备本发明抗体的嗜菌体展示方法的例子包括以下文献所公开的：Brinkman等，J.Immunol.Methods，182：41-50，(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods，184：177-186，(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.，24：952-958，(1994)；Persic等，Gene，187，9-18，(1997)；Burton等，Advances in Immunology，57：191-280，(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108。 
如以上参考文献所述，嗜菌体选择后，可分离得到嗜菌体的抗体编码区用于产生全抗体(包括人抗体)或任何其它所需的抗原结合片段以及在任何宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌和细菌，例如下文详述的。例如，也可利用重组产生Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，所述技术采用例如以下文献公开的本领域已知方法：PCT公开WO92/22324；Mullinax等，BioTechniques，12(6)：864-869，(1992)；Sawai等，AJRI，34：26-34，(1995)；和Better等，Science，240：1041-1043，(1988)。 
可用于产生单链Fv和抗体的技术的例子包括以下文献所述的：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等，Methods in Enzymology，203：46-88，(1991)；Shu等，PNAS，90：7995-7999，(1993)；和Skerra等，Science，240：1038-1040，(1988)。 
对于一些应用，包括人体内应用抗体和体外检测试验，优选利用嵌合型、人源化或人抗体。嵌合型抗体是该抗体中不同部分源自不同动物种类的分子，例如具有源自小鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。本领域已知产生嵌合型抗体的方法。参见，例如Morrison，Science，229：1202，(1985)；Oi等，BioTechniques，4：214，(1986)；Gillies等，(1989)，J.Immunol.Methods。125：191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567和4,816,397。人源化抗体是能与所需抗原结合的非人种类抗体的抗体分子，其具有非人种类(抗体)的一个或多个 互补决定区(CDR)和人免疫球蛋白分子的框架区。人框架区中的框架残基常被CDR供体抗体的相应残基取代以改变(最好提高)抗原结合(能力)。可通过本领域熟知的方法鉴定这些框架取代，例如通过模拟CDR和框架残基的相互作用来鉴定对于抗原结合重要的框架残基，和进行序列比较以鉴定位于特定位置的不寻常框架残基。(参见，例如Queen等，美国专利号5,585,089；Riechmann等，Nature，332：323，(1988))。可采用本领域已知的各种技术使抗体人源化，包括例如CDR-嫁接(EP239，400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)、镶面(veneering)或再铺平(resurfacing)(EP592,106；EP519,596；Padlan，Molecular Immunology，28(4/5)：489-498，(1991)；Studnicka等，Protein Engineering，7(6)：805-814，(1994)；Roguska等，PNAS，91：969-973，(1994))和链改组(美国专利号5,565,332)。 
对于治疗性治疗人患者，完全的人抗体特别理想。可通过本领域已知的各种方法制备人抗体，包括利用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体库的上述嗜菌体展示方法。也参见美国专利号4,444,887和4,716,111；PCT公开WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735和WO91/10741。 
也可利用不能表达有功能的内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。例如，可将人免疫球蛋白重链和轻链基因随机或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞。或者，除了人重链和轻链基因外，可将人可变区、恒定区和多变区(基因)引入小鼠胚胎干细胞。可通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座分别或同时使小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因无功能。具体地说，纯合删除JH区阻止了内源性抗体产生。扩增修饰的胚胎干细胞，将其显微注射入胚泡中以产生嵌合型小鼠。然后使嵌合型小鼠内交配以产生能表达人抗体的纯合后代。用选择的抗原，例如本发明多肽的全部或一部分以常规方式免疫该转基因小鼠。可采用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠获得针对该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所含有的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，然后经历类别转换和体细胞突变。因此，采用这种技术能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。产生人抗体的该技术的综述可参见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.，13：65-93，(1995)。产生人抗体和人单克隆抗体的该技术及产生这种抗体的方案详述可参 见，例如PCT公开WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；欧洲专利号598877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。此外，可雇用诸如Abgenix，Inc.(Freemont，加利福尼亚)和Genpharm(圣何塞，加利福尼亚)等公司来采用上述相似技术来提供针对所选择抗原的人抗体。 
可采用称为“指导选择”的技术产生能识别所选择表位的完全人抗体。此方法利用所选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体来指导选择能识别同一表位的完全人抗体(Jespers等，Bio/technology，12：899-903，(1988))。 
此外，可采用本领域技术人员熟知的技术(参见，例如Greenspan和Bona，FASEBJ.，7(5)：437-444，(1989)和Nissinoff，J.Immunol.，147(8)：2429-2438，(1991))进而利用本发明多肽的抗体来产生能模拟本发明多肽的抗独特型抗体。例如利用能结合和竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明多肽与配体结合的抗体来产生抗独特型(抗体)，该抗独特型抗体能“模拟”多肽多聚化和/或结合结构域，从而结合并中和多肽和/或其配体。这种中和性抗独特型(抗体)或这种抗独特型(抗体)的Fab片段可用于治疗方案以中和多肽配体。例如，可利用这种抗独特型抗体与本发明多肽结合和/或与本发明多肽的配体/受体结合从而阻断其生物学活性。 
如果所述抗体用于体内治疗，则最好修饰该抗体以使之在个体中的免疫原性减弱。例如，如果个体是人，则该抗体最好是“人源化”的；即将该抗体的互补决定区移植入人抗体(例如，Jones等，Nature，321：522-525，1986；和Tempest等，Biotechnology，9：266-273，1991所述)。 
也可采用嗜菌体展示技术来选择具有抗-B框抗体的PCR扩增的所选人淋巴细胞v-基因库的多肽或对天然文库多肽具有结合活性的抗体基因(McCafferty等，Nature，348：552-554，1990；和Marks等，Biotechnology，10：779-783，1992)。也可通过链改组提高这些抗体的亲和力(Clackson等，Nature，352：624-628，1991)。 
本领域技术人员不难选择用于制备的多肽。选择的多肽应使所产生的抗体不会与HMG蛋白家族的另一成员发生明显交叉反应或特异性结合。或者，可利用与HMG蛋白家族的两个或多个成员之间享有很大程度同源性的多肽来产生能与HMG蛋白家族的多个成员(例如，HMG1和HMG2)特异性结合(即，交叉反应)的抗体。
5.3编码抗体的多核苷酸 
本发明还提供含有编码本发明高亲和力抗体及其片段的核苷酸序列的多核苷酸。本发明也包括能在严谨条件或低严谨杂交条件下(例如本文所定义的)与编码能特异性结合本发明HMG1和/或HMG2多肽(例如，SEQ ID NO：1或2或其片段)的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。在一具体实施方式中，本发明多核苷酸编码能与具有SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列的多肽结合的抗体。在另一实施方式中，本发明多核苷酸编码能与具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体。在另一优选的实施方式中，本发明多核苷酸编码能与具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体。在另一实施方式中，本发明多核苷酸编码能与具有SEQ ID NO：21所示氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体。在还有另一实施方式中，本发明多核苷酸编码能与具有SEQ ID NO：22所示氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体。在还有另一实施方式中，本发明多核苷酸编码能与具有SEQ IDNO：23所示氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体。在还有另一实施方式中，本发明多核苷酸编码能与具有SEQ ID NO：28和/或29所示氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体。 
“严谨杂交条件”指42℃在含有以下成分的溶液中培育过夜：50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切的鲑鱼***DNA，然后在约65℃用0.1×SSC洗涤滤膜。 
可通过本领域已知的任何方法获得该多核苷酸及测定该多核苷酸的核苷酸序列。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，可从化学合成的寡核苷酸装配编码该抗体的多核苷酸(例如，Kutmeier等，BioTechniques，17：242，(1994)所述)，简言之，该方法包括合成含有编码该抗体序列各部分的重叠寡核苷酸，退火并连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。 
或者，可从合适来源的核酸产生编码抗体的多核苷酸。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可得，但该抗体分子的(核苷酸)序列已知，则可化学合成编码该免疫球蛋白的核酸或利用能与该序列3’和5’端杂交的合成引物通过PCR扩增获得，或者利用该特定基因序列的特异性寡核苷酸探针进行克隆来鉴定，例如编码该 抗体的cDNA文库中的cDNA克隆而从合适来源(例如，抗体cDNA文库或从表达该抗体的任何组织或细胞，例如选择用于表达本发明抗体的杂交瘤细胞产生的cDNA文库或从中分离的核酸，优选polyA+RNA)获得编码该免疫球蛋白的核酸。然后可采用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增核酸克隆入可复制克隆载体中。 
一旦测定了该抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，可采用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见，例如以下文献所述的技术：Sambrook等，1990，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(《分子克隆，实验室手册》)，第二版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约和Ausubel等编，1998，Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学方法》)，John Wiley&Sons，纽约)来操作该抗体的核苷酸序列从而产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或***。 
在一具体的实施方式中，可通过本领域熟知的方法检查本发明抗体重链和/或轻链可变区的氨基酸序列来鉴定互补决定区(CDR)的序列，例如将已知氨基酸序列与其它重链和轻链可变区作比较来确定序列高变区。如上所述，采用常规重组DNA技术可将一个或多个CDR***框架区中，例如***人框架区从而人源化非人抗体。所述框架区可以是天然产生的或共有序列框架区，优选人框架区(人框架区列表可参见，例如Chothia等，J.Mol.Biol.，278：457-479，(1998))。通过组合框架区和CDR产生的多核苷酸优选编码能与本发明多肽特异性结合的抗体。 
如上所述，优选在框架区内制作一个或多个氨基酸取代，这些氨基酸取代优选提高了该抗体与其抗原的结合(能力)。此外，可采用这些方法制作可变区内一个或多个参与链内二硫键形成的半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失从而产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。本发明包括并且本领域技术人员已知多核苷酸的其它改变。 
此外，可通过剪接具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有合适生物学活性的人抗体分子的基因来产生“嵌合型抗体”而开发的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：851-855，(1984)；Neuberger等，Nature，312：604-608，(1984)；Takeda等，Nature，314：452-454，(1985))。如上所述，嵌合型抗体是其不同部分衍生自不同动物种类的分子，例如具有衍生自小鼠mAb 的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些分子，如人源化抗体。 
或者，可采取产生单链抗体所述的技术(美国专利号4,946,778；Bird，Science，242：423-42，(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883，(1988)；和Ward等，Nature，334：544-54，(1989))来产生单链抗体。通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段得到单链多肽从而形成单链抗体。也可采用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等，Science，242：1038-1041，(1988))。 
5.4制备抗体的方法 
可通过本领域已知的合成抗体的任何方法，特别是化学合成或优选通过重组表达技术制备本发明抗体。 
本发明抗体、其片段、衍生物或类似物(例如，本发明抗体的重链或轻链或本发明的单链抗体)的重组表达需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码本发明某抗体分子或某抗体的重链或轻链或其一部分的多核苷酸，可采用本领域熟知的技术通过重组DNA技术制备产生抗体分子所用的载体。因此，本文描述了通过表达含有编码抗体的核酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可采用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码抗体的序列及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供含有编码本发明抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变区并与启动子操作性相连的核苷酸序列的可复制载体。这种载体可包括编码该抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见，例如PCT公开WO86/05807；PCT公开WO89/01036；和美国专利号5,122,464)，可将该抗体的可变区克隆入这种载体来表达完整的重链或轻链。 
可通过常规技术将表达载体转运入宿主细胞中，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生本发明抗体。因此，本发明包括含有编码本发明抗体，或其重链或轻链或本发明单链抗体并与异源启动子操作性相连的多核苷酸的宿主细胞。在表达双链抗体的优选实施方式中，可在宿主细胞中共同表达编码重链和轻链的载体从而表达完整的免疫球蛋白分子，如下所详述。 
可利用各种宿主表达载体***来表达本发明抗体分子。这种宿主表达***提供了产生感兴趣编码序列后将其纯化的运载体，而且也提供了用合适的核苷酸编码 序列转化或转染时能原位表达本发明抗体分子的细胞。这些***包括但不限于：微生物，例如用含有抗体编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌，枯草芽胞杆菌(B.subtilis))；用含有抗体编码序列的重组酵母菌表达载体转化的酵母菌(如酵母(Saccharomyces)，毕赤酵母(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞***；用含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞***；或包含含有源自哺乳动物细胞基因组启动子(如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒启动子(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建物的哺乳动物细胞***(如COS、CHO、BHK、293、NS0、3T3、PerC6细胞)。优选利用诸如大肠杆菌的细菌细胞，更优选用真核细胞(特别是对于表达完整的重组抗体分子)表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))连同载体(如人巨细胞病毒的主要中早期基因启动子元件)是抗体的有效表达***(Foecking等，Gene，45：101，(1986)；Cockett等，Bio/Technology，8：2，(1990))。也参见，例如美国专利5827739、5879936、5981216和5658759。 
在细菌***中，可根据所要表达的抗体分子对许多表达载体进行优选。例如，当要产生大量这种蛋白质时，为产生某抗体分子的药物组合物，需要的载体应能指导表达不难被纯化的高水平融合蛋白产物。这种载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.，2：1791，(1983))，该载体中的抗体编码序列可单独与载体框中lacZ编码区连接从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res.，13：3101-3109，(1985)；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.，24：5503-5509，(1989))；等等。也可利用pGEX载体来表达外来多肽，例如含谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。这种融合蛋白一般是可溶性的，通过与基质谷胱甘肽-琼脂珠吸附和结合然后在游离谷胱甘肽存在下洗脱不难从裂解的细胞纯化获得。pGEX载体设计为含有凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，从而能从GST部分释放克隆的靶基因产物。 
在昆虫(细胞)***中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作表达外来基因的载体。该病毒可在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。可将抗 体编码序列单独克隆入该病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。 
在哺乳动物宿主细胞中可利用许多病毒表达***。在利用腺病毒作为表达载体的情况中，可将感兴趣的抗体编码序列与腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三分前导序列相连。然后可通过体外或体内重组将该嵌合型基因***腺病毒基因组。***病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)可获得能存活并能在感染宿主中表达感兴趣抗体分子的重组病毒(例如，参见Logan和Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：355-359，(1984))。也需要特异性起始信号来有效翻译所***的抗体编码序列。这些信号包括ATG起始密码子和毗邻序列。此外，起始密码子必须位于所需编码序列的读框相中以确保翻译整个***(序列)。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源，天然和合成的。可通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等提高表达的效率。(参见Bittner等，Methods inEnzymol.，153：51-544，(1987))。 
此外，可选择能以所需特定方式调节***序列的表达或修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)可能对该蛋白质的功能至关重要。不同宿主细胞具有对(不同)蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特性和特定机制。可选择合适的细胞系或宿主***以确保所表达外来蛋白质的正确修饰和加工。为此目的，可利用具有初级转录物适当加工，基因产物糖基化和磷酸化细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于：CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、NS0、Per.C6，特别是乳腺癌细胞系，例如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D，和正常乳腺细胞系，例如CRL7030和Hs578Bst。 
为长期高产量地产生重组蛋白，最好稳定表达。例如，可工程改造能稳定表达抗体分子的细胞系。除了利用含有病毒复制起点的表达载体外，可用受合适表达控制元件(例如启动子、增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸位点等)和可选择标记控制的DNA转化宿主细胞。引入外来DNA后，在富集培养基中培养工程改造的细胞1-2天。然后转入选择性培养基。重组质粒中的可选择标记能赋予对选择(压力)的抗性，使细胞能将质粒稳定地整合入它们的染色体并生长形成细胞灶，进而克隆和扩增为细胞系。优选采用该方法来工程改造表达抗体分子的细胞系。这种工 程改造的细胞系特别可用于筛选和评估能与该抗体分子直接或间接相互作用的化合物。 
可采用许多选择***，包括但不限于：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell，11：223，(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：202，(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell，22：817，(1980))基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。也可利用抗代谢物抗性作为选择以下基因的基础：赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr(Wigler等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，77：357，(1980)；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1527，(1981))；赋予对霉酚酸抗性的gpt(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072，(1981))；赋予对氨基糖苷类G-418抗性的neo(Clinical Pharmacy，12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy，3：87-95，(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：573-596，(1993)；Mulligan，Science，260：926-932，(1993)；Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.，62：191-217，(1993)；May，1993，TIB TECH，11(5)：155-215)；和赋予对潮霉素抗性的hygro(Santerre等，Gene，30：147，(1984))。可常规应用重组DNA技术领域的常规已知方法来选择所需的重组克隆，这种方法描述于Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学方法》)，John Wiley&Sons，纽约，(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual(《基因转移和表达，实验室手册》)，Stockton Press，纽约，(1990)；Dracopoli等编，Current Protocols in Human Genetics(《人类基因组学最新方法》)，第12和13章，John Wiley&Sons，纽约，(1994)；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.，150：1，(1981)。通过载体扩增可提高抗体分子的表达水平(综述见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning(《为在哺乳动物中表达克隆的基因而在DNA克隆中根据基因扩增利用载体》)，第三卷，(AcademicPress，纽约，1987))。当某标记在表达抗体的载体***中可扩增时，提高宿主细胞培养液中存在的抑制剂水平将增加该标记基因的拷贝数。由于所扩增的区域与抗体基因相连，抗体产量也得以增加(Crouse等，Mol.Cell.Biol.，3：257，(1983))。
可用本发明的两种表达载体共同转染宿主细胞，第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。这两种载体可含有相同的可选择标记，从而能等同表达重链多肽和轻链多肽。或者，可利用能编码(和能表达)重链多肽和轻链多肽二者的一种载体。在这种情况中，应将轻链置于重链之前以免有毒的游离重链过量(Proudfoot，Nature，322：562，(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：2197，(1980))。重链和轻链的编码序列可含有cDNA或基因组DNA。 
一旦通过动物、化学合成或重组表达产生了本发明抗体分子，可通过免疫球蛋白分子纯化领域已知的任何方法来纯化，例如层析(如，离子交换、亲和力，特别是经A蛋白和分子大小柱层析后利用对该特定抗原的亲和力)、离心、差别溶解性或蛋白质纯化的任何其它标准技术。此外，可将本发明抗体或其片段与本文所述或本领域其它已知的异源多肽序列融合以促进纯化。 
此外，可将本发明抗体或其片段与标记序列，例如某肽融合以促进纯化。在某些实施方式中，所述标记氨基酸序列是六个组氨酸的肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，加利福尼亚，91311)中提供的标签等，其中许多标记可购得。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824，(1989)中所述，六-组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利。用于纯化的其它肽标签包括但不限于：对应于衍生自流感血凝素蛋白某表位的“HA”标签(Wilson等，Cell，37：767，(1984))和“flag”标签。 
5.5抗体缀合物和衍生物 
本发明抗体包括经修饰的(例如，将任何类型的分子与该抗体共价连接)衍生物。例如但不限于，所述抗体衍生物包括例如通过已知的保护/阻断基团、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质连接等来糖基化、乙酰化、peg化、磷酸化、酰胺化而衍生化修饰的抗体。可采用已知的技术进行许多化学修饰，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，此种衍生物可含有一个或多个非典型氨基酸。 
可通过将所述抗体或抗体片段与聚合物分子，例如高分子量聚乙二醇(PEG)相连来产生体内半衰期延长的抗体或其片段。可利用或不用多功能接头将PEG与所述抗体或抗体片段的N-或C-末端位点特异性缀合或经赖氨酸残基上存在的ε-氨 基将PEG和所述抗体或抗体片段连接。可采用线形或支链聚合物衍生以尽可能减少生物学活性丧失。可通过SDS-PAGE和质谱密切监测缀合程度确保PEG分子与抗体正确缀合。可通过，例如分子大小或离子交换层析分离抗体-PEG缀合物与分离未反应的PEG。 
此外，可将抗体与白蛋白缀合以制备在体内更稳定或体内半衰期更长的抗体或抗体片段。本领域熟知这些技术，可参见例如国际专利公布号WO93/15199、WO93/15200和WO01/77137；欧洲专利号EP413,622。本发明包括与一种或多种部分缀合或融合的抗体或其片段的应用，所述部分包括但不限于：肽、多肽、蛋白质、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟物质、合成药物、无机分子和有机分子。 
在一个实施方式中，本发明包括利用抗体或其片段与异源蛋白或多肽(或其片段，特别是含有至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)以产生融合蛋白。在另一实施方式中，本发明包括利用抗体或其片段与异源蛋白或多肽(或其片段，特别是含有至少约10个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个或至少约100个氨基酸的多肽)重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合)以产生融合蛋白。融合不一定非要直接(融合)，而可通过接头序列融合。例如，可通过将抗体与特定细胞表面受体的特异性的抗体融合或缀合从而能利用该抗体将异源多肽靶向体外或体内的特定细胞类型。也可在采用本领域已知方法的体外免疫测定和纯化方法中使用与异源多肽融合或缀合的抗体。参见，例如国际公布号WO93/21232；欧洲专利号EP439,095；Naramura等，1994，Immunol.Lett.，39：91-99；美国专利号5,474,981；Gillies等，1992，PNAS，89：1428-1432；和Fell等，1991，J.Immunol.，146：2446-2452。 
本发明还包括含有与抗体片段融合或缀合的异源蛋白质、肽或多肽的制剂。例如，异源多肽可与Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VL结构域、VH CDR、VL CDR或其片段融合或缀合。本领域熟知将多肽与抗体蛋白融合或缀合的方法。参见，例如美国专利号5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851和5,112,946；欧洲专利号EP307，434和EP367，166；国 际公布号WO96/04388和WO91/06570；Ashkenazi等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10535-10539；Zheng等，1995，J.Immunol.，154：5590-5600；和Vil等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：11337-11341。 
可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA”改组)技术产生(例如)能与HMG1和/HMG2或其片段(例如，同上)特异性结合的抗体的其它融合蛋白。可采用DNA改组改变本发明抗体或其片段的活性(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或其片段)。一般可参见美国专利号5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252和5,837,458；Patten等，1997，Curr.OpinionBiotechnol.，8：724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.，16(2)：76-82；Hansson等，1999，J.Mol.Biol.，287：265-76；Lorenzo和Blasco，1998，Biotechniques，24(2)：308-313。可先进行易错PCR的随机诱变、随机核苷酸***或其它方法，然后重组来改变抗体或其片段或所编码的抗体或其片段。可将编码能与C/CLP特异性结合并编码抗体或抗体片段的多核苷酸的一个或多个部分可与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组(recombine)。 
此外，可将本发明抗体或其片段与标记序列，例如肽融合以促进纯化。在某些实施方式中，所述标记氨基酸序列是六个组氨酸的肽，例如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，加利福尼亚，91311)中提供的标签等，其中许多标记可购得。如Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：821-824中所述，六-组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利。可用于纯化的其它肽标签包括但不限于：对应于衍生自流感血凝素蛋白某表位的血凝素“HA”标签(Wilson等，Cell，37：767，(1984))和“flag”标签。 
本发明还包括与诊断性或治疗性物质缀合的抗体或片段。例如，诊断上可用这些抗体作为临床检验方法的一部分来监测肿瘤的发生或进展从而能(例如)测定所给予治疗方案的效果。将抗体与可检测物质偶联有助于检测。可检测物质的例子包括：各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、利用各种正电子发射断层显像的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。可采用本领域已知的技术将可检测物质直接与抗体(或其片段)偶联或缀合或通过中间体间接偶联或缀合。可与抗体缀合用作本发明诊断剂的金属离子可参见，例如美国专利号 4,741,900。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光试剂的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光试剂的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；合适的放射性试剂的例子包括但不限于：125I、131I、111In或99Tc；除了利用各种正电子发射断层显像的发射正电子的金属外，可将非放射性顺磁金属离子和放射标记的或与特定放射性同位素缀合的分子与本发明抗体缀合。 
此外，可将本发明抗体或其片段与治疗性部分，例如细胞毒素，如抑制细胞或杀细胞，治疗性药物或放射性金属离子，如α-(射线)发射体，如213Bi缀合。细胞毒素或细胞毒性药物是对细胞有害的任何药物。例子包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、鬼臼亚乙苷、表鬼臼毒噻吩糖苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、道诺红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、二羟蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***、和嘌呤霉素及它们的类似物或同系物。治疗性药物包括但不限于：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-巯基鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺(decarbazine))、烷化剂(例如，氮芥(mechlorethamine)、thioepa chlorambucil、美法仑、亚硝基脲氮芥(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如，道诺红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D(dactinomycin)(以前称为放线菌素(actinomycin))、博莱霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝***物质(例如，长春新碱和长春花碱)。治疗性部分的更详细列表可见PCT公开WO03/075957。 
可用本发明缀合物修饰给定的生物学反应，治疗性物质或药物部分不应理解为局限于典型的化疗物质。例如，药物部分可以是具有所需生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质包括，例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生 长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡物质(如TNF-α、TNF-β)、AIM I(参见国际公布号WO97/33899)、AIM II(参见国际公布号WO97/34911)、Fas配体(Takahashi等，Int.Immunol.，6：1567-1574，(1994))、VEGI(参见国际公布号WO99/23105)、CD40配体、血栓形成物质或抗血管生成物质(如血管抑制素或内皮抑制素)；或生物反应修饰剂，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。 
抗体也可连接于固体支持物上，这对靶抗原的免疫测定或纯化特别有用。这种固体支持物包括但不限于：玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。 
将这种治疗性部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见例如Amon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”(癌症治疗中用于药物免疫靶向的单克隆抗体)，刊于Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》)，Reisfeld等编，第243-56页，(AlanR.Liss，Inc.，1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”(用于药物递送的抗体)，刊于Controlled Drug Delivery(《受控药物递送》)(第二版)，Robinson等编，第623-53页，(Marcel Dekker，Inc.，1987)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”(癌症治疗中细胞毒性物质的抗体载体：综述)，刊于Monoclonal Antibodies′84：Biological AndClinical Applications(《单克隆抗体’84：生物学和临床应用》)，Pinchera等编，第475-506页，(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use OfRadiolabeled Antibody in Cancer Therapy”(放射性标记的抗体在癌症治疗中的治疗性应用的分析、结果和前景)，刊于MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy(《癌症检测和治疗的单克隆抗体》)，Baldwin等编，第303-16页，(Academic Press，1985)和Thorpe等，“ThePreparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”(抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性特性)，Immunol.Rev.，62：119-58，(1982)。 
本发明抗体可以与其它多肽缀合。将抗体与多肽融合或缀合的方法是本领域已知的。可参见，例如U.S.5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851 和5,112,946；EP307，434；EP367，166；PCT公开WO96/04388和WO91/06570；Ashkenazi等，1991，PNAS USA，88：10535；Zheng等，1995，J1mmunol，154：5590；和Vil等，1992，PNAS USA，89：11337。抗体与某部分的融合不一定非要直接(融合)，也可通过整个接头序列融合。这种接头分子是本领域常规已知的，描述于Denardo等，1998，Clin Cancer Res，4：2483；Peterson等，1999，Bioconjug Chem，10：553；Zimmerman等，1999，Nucl Med Biol，26：943；Garnett，2002，Adv Drug Deliv Rev，53：171。 
或者，抗体可与二抗缀合形成如Segal在美国专利号4,676,980中所述的抗体异质缀合物。 
缀合有或未缀合有治疗性部分的抗体可作为治疗剂单独给予或与细胞毒性因子和/或细胞因子联合给予。 
5.6抗体结合及活性试验 
可通过本领域已知的任何方法检验本发明抗体结合的特异性(即，免疫特异性)。可采用的免疫测定包括但不限于：采用诸如western印迹技术的竞争性和非竞争性试验***、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体结合试验、免疫放射分析、荧光免疫测定、A蛋白免疫测定，仅以这些为例。这种试验是常规的且为本领域所熟知(参见，例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学方法》)，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，纽约)。下文概述了示范性的免疫测定(但不是限制)。 
免疫沉淀方法通常包括用裂解缓冲液，例如补加了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA、PMSF、抑蛋白酶肽、钒酸钠)的RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、0.15M NaCl、0.01M磷酸钠，pH7.2，1％Trasylol)裂解细胞群，向细胞裂解物中加入感兴趣的抗体，在4℃培育一段时期(例如，1-4小时)，向细胞裂解物中加入A蛋白和/或G蛋白琼脂糖珠，在4℃培育约1小时或更长，用裂解缓冲液洗涤各珠后将这些珠重悬于SDS/样品缓冲液中。可通过，例如western印迹分析评估感兴趣抗体使具体抗原免疫 沉淀的能力。本领域技术人员知道可改进试验参数以提高抗体与抗原结合并降低背景(噪声)(例如，用琼脂糖珠预澄清细胞裂解物)。免疫沉淀方法的进一步讨论可参见，例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学方法》)，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，10.16.1。 
Western印迹分析一般包括制备蛋白质样品，在聚丙烯酰胺凝胶(例如，根据抗原分子量，用8％-20％SDS-PAGE)中进行蛋白质样品的电泳，将聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质样品转移至诸如硝酸纤维素、PVDF或尼龙膜，用封闭缓冲液(例如，含3％BSA或脱脂奶的PBS)封闭膜，用洗涤缓冲液(例如，PBS-吐温20)洗涤膜，用以封闭缓冲液稀释的第一抗体(感兴趣的抗体)封闭膜，用洗涤缓冲液洗涤膜，用以封闭缓冲液稀释并与酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(例如，32p或125I)缀合的第二抗体(能识别第一抗体，例如抗-人抗体)封闭膜，用洗涤缓冲液洗涤膜和检测抗原的存在。本领域技术人员知道可改进试验参数以提高检测的信号并降低背景噪声。Western印迹方法的进一步讨论可参见，例如Ausubel等编，1994，Current Protocols in MolecularBiology(《最新分子生物学方法》)，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，10.8.1。 
ELISA包括制备抗原，用该抗原包被96孔板各孔，向孔中加入缀合有可检测化合物，例如酶底物(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的感兴趣抗体，培育一段时期，然后检测抗原的存在。在ELISA中，感兴趣抗体不一定要和可检测化合物缀合；而是可向孔中加入缀合有可检测化合物的第二抗体(能识别感兴趣抗体)。此外，可不用抗原而用抗体包被孔。在此情况中，可向包被孔中加入缀合有可检测化合物的第二抗体，然后加入感兴趣的抗原。本领域技术人员知道可改进试验参数以提高检测的信号以及本领域已知的ELISA其它变化形式。ELISA的进一步讨论参见，例如Ausubel等编，1994，Current Protocols inMolecular Biology(《最新分子生物学方法》)，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，纽约，11.2.1。 
可通过本领域熟知的各种体外试验方法来测定抗体与抗原的结合亲和力和其它结合特性(例如，抗体-抗原相互作用的解离速率)，所述方法包括例如平衡法(如，酶联免疫吸附测定(ELISA；或放射免疫测定(RIA))或动力学(方法) (如，
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分析)，和其它方法，例如间接结合试验、竞争性结合试验、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和层析(如，凝胶过滤)。这些和其它方法可利用所检查的一种或多种组分上的标记和/或采用各种检测方法，所述标记包括但不限于：显色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。结合亲和力和动力学详述于Paul，W.E.编，Fundamental Immunology(《基础免疫学》)，第四版，Lippincott-Raven，费城，(1999)，该文献集中讨论了抗体-免疫原相互作用。竞争性结合试验的例子是放射免疫测定，包括在有含量递增的未标记抗原存在下培育标记抗原和感兴趣抗体，检测与标记抗原结合的抗体。可通过scatchard图分析从数据中测定感兴趣抗体对特定抗原的亲和力和结合解离速率。也可采用放射免疫测定检测与第二抗体的竞争。在此情况中，在含量递增的未标记第二抗体存在下培育抗原与缀合有标记化合物的感兴趣抗体。本文公开的其它具体方法可参见下文实施例2-4。 
可通过本领域已知的任何方法检验本发明抗体的生物学活性。 
最好先在体外然后在体内测试本发明方法和制剂的所需治疗性或预防性活性，再应用于人体。例如，可采用体外试验确定表明是否要给予本发明的具体治疗方法、制剂或组合治疗，所述体外试验包括体外细胞培养试验，该试验(包括)培养患者的组织样品，使之暴露于本发明制剂或与之接触，观察这种制剂对组织样品的作用。可通过生物活检获得患者的组织样品。此测试能为各患者鉴定治疗上最有效的预防性或治疗性物质。在各种具体实施方式中，可利用参与自身免疫疾病、炎性疾病、HMG1和/或HMG2异常表达和/或活性相关疾病的细胞类型为代表的细胞进行体外试验来确定本发明制剂对这类细胞是否具有所需效力。例如，接触后的细胞产生的HMG1和/或HMG2和/或促炎细胞因子的水平较低表明本发明组合物对治疗该患者的病症有效。或者，不培养患者的细胞，而是利用能被HMG1和/或HMG2激活的细胞，例如外周血单核的细胞(PBMC)、THP-1细胞或巨噬细胞(M
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s)来筛选本发明制剂。可采用本领域的许多标准试验评估细胞因子产量，包括ELISA测定、实时PCR和本领域熟知的其它方法。本文也公开了具体方法(参见下文实施例2和6)。 
可在合适的动物模型***中测试预防性或治疗性物质，然后在人体中测试，所述动物模型包括大鼠、小鼠、鸡、母牛、猴子、家兔、仓鼠等。
如上所述，本领域已知并广泛应用的主要动物模型是本领域已知且描述过的。此外，本文公开了脓毒症(参见实施例5)、腹膜炎(参见实施例10)和关节炎(参见实施例7-9)的具体动物模型。 
此外，可采用本领域技术人员已知的任何试验评估本文公开的联合疗法对于治疗或预防炎性疾病的预防性和/或治疗性应用。 
5.7本发明抗体、抗体组合物和其治疗性和/或预防性给药 
本发明包括本文公开的抗-HMG1抗体，也涉及本文称为“本发明抗体组合物”、“本发明组合物”或更简单地称为“组合物”的抗体组合物。在某些实施方式中，本发明组合物包含用药学上可接受的赋形剂配制的本发明抗体。本文所用的术语“药学上可接受的载体”表示可与本发明抗体混合，在混合后可将本发明抗体给予对象的化学组合物。本文也将这些抗体组合物称为“药物组合物”。在其它实施方式中，称为本发明组合物。 
本(发明)还包括治疗以炎性细胞因子级联反应激活为特征的病症(包括急性和慢性炎性病症)的方法，其包括给予治疗有效量的本发明抗体或药物组合物。慢性炎性病症的特征在于炎性反应持续时间长(数周、数月或甚至无限期)可常能导致永久性组织损伤。慢性炎性病症包括但不限于：关节炎(例如，类风湿性关节炎)、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)、胆囊炎。急性炎性病症的特征通常是症状突然发作，包括血管通透性增加、水肿、全身性发热，常导致组织坏死并可能导致死亡。急性炎性病症包括但不限于：脓毒症(例如，由于微生物感染)、超敏反应、组织坏死和阑尾炎。所述病症可以是由于炎性细胞因子级联反应导致全身性反应，例如内毒素性休克症状。或者，如类风湿性关节炎那样，由局部炎性细胞因子级联反应介导的疾病。 
在一个实施方式中，本发明组合物含有能与HMG1的A框(例如，SEQ ID NO：3中的表位)特异性结合的高亲和力抗体。在另一实施方式中，组合物含有能与HMG1的B框(例如，SEQ ID NO：4、28、29中的表位)特异性结合的本发明高亲和力抗体。在还有另一实施方式中，本发明组合物含有能与HMG2的A框(例如，SEQID NO：22中的表位)特异性结合的高亲和力抗体。在另一实施方式中，组合物含有能与HMG2的B框(例如，SEQ ID NO：23中的表位)特异性结合的本发明高亲和力 抗体。 
如上所述，HMG1信号转导至少部分通过RAGE和TLR蛋白家族成员的介导。在受体结合和信号转导中，A框和B框可能均起作用。因此，不希望受任何具体理论的束缚，考虑联用能与A框特异性结合的抗体(或其它拮抗剂)和能与B框特异性结合的抗体(或其它拮抗剂)能有效阻断HMG1与RAGE和/或TLR蛋白结合。因此，本发明组合物可含有本发明高亲和力抗体(或其它HMGB1抗体或拮抗剂)的组合，例如但不限于能与HMG1A框特异性结合的抗体和能与HMG1B框特异性结合的抗体的组合，或能与HMG2A框特异性结合的抗体和能与HMG2B框特异性结合的抗体的组合。在一具体实施方式中，组合物含有能与衍生自HMG1的A框及B框的某表位(例如，跨越A和B框间连接部位中的某表位)特异性结合的本发明高亲和力抗体。 
本发明组合物可单独含有本发明高亲和力抗体或含有其与其它活性治疗分子和/或佐剂，例如类固醇、其它抗炎分子或其它抗体治疗剂的组合。更具体地说，本发明组合物可含有早期脓毒症介质的拮抗剂。在一个实施方式中，早期脓毒症介质的拮抗剂是选自TNF、IL-1α、IL-1β、MIF或IL-6细胞因子的拮抗剂。在一具体实施方式中，早期脓毒症介质的拮抗剂是抗TNF或MIF的抗体或IL-1受体拮抗剂。 
在一个实施方式中，本发明药物组合物是基本上不含内毒素和/或有关热源物质的无热源制剂。内毒素包括局限于微生物内部，只在微生物破坏或死亡时释放的毒素。热源性物质也包括细菌和其它微生物外膜中诱导发热的热稳定性物质(糖蛋白)。如果给予人，这些物质均可引起发热、低血压和休克。由于可能的有害作用，静脉内给予的药物溶液中必须除去即使低含量的内毒素。对于静脉内药物应用，食品药品管理局(“FDA”)设定了在1小时期间5单位(EU)内毒素/剂量/公斤体重的上限(The United States Pharmacopeial Convention，Pharmacopeial Forum(美国药典大会，药典论坛)，26(1)：223，(2000))。当以每公斤体重数百或上千毫克的用量给予治疗性蛋白时，例如单克隆抗体的情况，必须除去即使是痕量的有害或危险的内毒素。在某些具体实施方式中，组合物中内毒素和热源水平应低于10EU/mg、或低于5EU/mg、或低于1EU/mg、或低于0.1EU/mg、或低于0.01EU/mg或低于0.001EU/mg。
当用于体内给药时，本文所述组合物应无菌。通过，例如除菌过滤膜过滤或本领域熟知的其它方法不难实现无菌。可按照Remington′s PharmaceuticalSciences(《雷明顿药物科学》)(180′编，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)所述的常规药物实施配制用于注射的无菌组合物。含有抗生素，例如本文所述的那些的组合物通常以冻干形式或溶液储存。考虑将含有本发明抗体的无菌组合物置于具有无菌入口，例如静脉内输液袋的容器中或具有能回收该制剂的适配器，例如可用皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶中。 
在本发明的一个实施方式中，本文所述组合物能抑制炎性细胞因子级联反应激活所介导或以其为特征的病症，包括急性和慢性炎性病症。在一具体实施方式中，可用本文所述组合物治疗急性炎性病症，例如脓毒症。在另一具体实施方式中，可用本文所述组合物治疗慢性炎性病症，例如类风湿性关节炎。在还有另一具体实施方式中，可用本文所述组合物治疗急性和慢性炎性病症。 
考虑当将本发明组合物给予患炎性细胞因子级联反应激活所介导或以其为特征的病症的对象时，其是保护性的。可通过本领域熟知的任何方法检测本发明组合物所赋予的保护作用。测定本发明组合物如何保护的方法根据所治疗和/或预防的病症和所检测的参数而不同。例如，在啮齿类动物的关节炎模型中，将用本发明组合物治疗的动物的爪炎症评分与用合适的对照组合物治疗的动物作比较来测定本发明组合物的保护作用。在脓毒症的CLP模型中，将用本发明组合物治疗的动物的存活(率)与用合适对照组合物治疗的动物作比较来测定抗体治疗所赋予的保护作用。通常将用本发明组合物的治疗与某些对照治疗作比较。例如，对照治疗可包括采用对照抗体或只包括赋形剂。在一些情况中，对照可以是疾病治疗的护理标准品(或合适的替代分子)，例如用于治疗关节炎的氨甲喋呤或抗-TNF(例如，Enbrel、Humira)。在一些情况中，对照可以是阴性对照(例如，PBS)。当对照为护理标准品时，可单独给予本发明组合物或与该护理治疗的标准品联合给予，然后比较各组的保护水平。对照的选择取决于包括所治疗和/或预防的疾病和所检查的参数在内的因素，本领域技术人员不难确定。本文提供了测定本发明组合物所赋予保护作用的方法的具体例子(参见下文实施例7-11)。 
在本发明另一实施方式中，本文所述组合物在动物CLP脓毒症模型中比对照组合物的保护力更高(高至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或 至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。在一具体实施方式中，本文所述组合物在选自小鼠CLP模型和幼猪CLP模型的动物CLP脓毒症模型中比对照组合物的保护力更高(高至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。在另一具体实施方式中，动物CLP模型是小鼠CLP模型。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在小鼠胶原诱导的关节炎模型中比对照组合物的保护力更高(高至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。在一具体实施方式中，小鼠胶原诱导的关节炎模型是被动性胶原诱导关节炎模型。在另一具体实施方式中，小鼠胶原诱导的关节炎模型是主动性胶原诱导关节炎模型。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在小鼠胶原诱导的关节炎模型中比
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(联用或不联用氨甲喋呤)的保护力更高(高至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。在一具体实施方式中，小鼠胶原诱导的关节炎模型是被动性胶原诱导关节炎模型。在另一具体实施方式中，小鼠胶原诱导的关节炎模型是主动性胶原诱导关节炎模型。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在小鼠胶原诱导的关节炎模型中与对照组合物相比减少骨丧失和/或软骨损伤更佳(减少至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。在一具体实施方式中，小鼠胶原诱导的关节炎模型是被动性胶原诱导关节炎模型。在另一具体实施方式中，小鼠胶原诱导的关节炎模型是主动性胶原诱导关节炎模型。 
在其它实施方式中，本文所述组合物在大鼠佐剂诱导的关节炎模型中比对照组合物的保护力更高(高至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在大鼠佐剂诱导的关节炎模型中比
Figure S05841546020070606D000612
(联用或不联用氨甲喋呤)的保护力更高(高至少10％、或至少 15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在大鼠佐剂诱导的关节炎模型中与对照组合物相比减少骨丧失和/或软骨损伤更佳(减少至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。 
在本发明另一实施方式中，本文所述组合物在人中比Enbrel
Figure S05841546020070606D00062151517QIETU
(联用或不联用氨甲喋呤)的保护力更高(高至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在小鼠腹膜炎模型中比对照组合物的保护力更高(高至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在人或啮齿类SCI模型中与对照组合物相比减轻脊髓损伤(SCI)的严重性更佳(减轻至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。 
在本发明还有另一实施方式中，本文所述组合物在人中或啮齿类ALI模型中与对照组合物相比减轻急性肺损伤(ALI)的严重性程度的效果更佳(减轻至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％)。 
本发明也涉及抑制哺乳动物细胞释放促炎细胞因子的方法。该方法包括用足够量的本发明抗体或抗体组合物处理细胞来抑制细胞释放促炎细胞因子。在这些实施方式中，细胞优选是巨噬细胞。在某些实施方式中，促炎细胞因子选自：TNF、IL-1α、IL-1β、MIF和IL-6。在其它实施方式中，所述细胞是巨噬细胞，所述促炎细胞因子选自TNF、IL-1α、IL-1β、MIF和IL-6。在还有其它实施方式中，所述细胞是PBMC，所述促炎细胞因子选自TNF、IL-1α、IL-1β、MIF和IL-6。在一个实施方式中，用所述方法处理患有以炎性细胞因子级联反应激活为特征的病症或处于患该病症风险中的患者的细胞。具体病症是本文所列举的。
本发明也涉及抑制哺乳动物细胞释放HMG1和/或HMG2的方法。该方法包括用足够量的本发明抗体或抗体组合物处理细胞来抑制细胞释放HMG1和/或HMG2。优选用所述方法处理患有以炎性细胞因子级联反应激活为特征的病症或处于患该病症风险中的患者的细胞。优选的病症是本文所列举的。 
通过本领域熟知的许多方法不难测定对细胞因子，HMG1和/或HMG2释放的抑制作用，例如本文上述和所公开的(参见下文实施例2-11)。 
本文所用的“治疗有效量”、“足够用量”等术语指足以治疗或控制HMG1和/或HMG2所介导疾病和病症的治疗性物质，例如本发明HMG1抗体组合物的用量。治疗有效量指足以延迟或尽可能降低疾病发作，例如延缓疾病或尽可能降低疾病严重性的治疗性物质用量。治疗有效量也可指能在炎性病症的治疗或控制中提供治疗益处的治疗性物质用量。此外，本发明药物组合物有关的治疗有效量表示单独或与其它治疗剂联用时能在疾病，例如炎性疾病的治疗或控制中提供治疗益处的用量。 
本发明还提供预防、控制、治疗或缓解炎性病症或其一种或多种症状的方法，所述方法包括给予需要的对象本发明抗体组合物和/或一种或多种治疗剂。已知有用，或已经应用或目前正用于预防、控制、治疗或缓解炎性病症或其一种或多种症状的任何药物或疗剂可与本发明抗体组合物联用。这种物质的例子包括但不限于：免疫调节剂、抗血管生成剂、抗炎药物和TNF-α拮抗剂。 
可用本发明抗体组合物(即，药物组合物)治疗的病症的非限制性例子包括本说明书背景章节和下文列举的那些病症。所述病症优选：阑尾炎、消化道、胃或十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性伪膜急性或局部缺血性结肠炎、憩室炎、会厌炎、失迟缓症、胆管炎、胆囊炎、肝炎、克罗恩病、肠炎和惠普尔病、哮喘、过敏、过敏性休克、免疫复合物病、器官局部缺血、再灌注损伤、器官坏死、枯草热、脓毒症、败血症、内毒素性休克、恶病质、高烧、嗜酸性肉芽肿、肉芽肿病、结节病、脓毒性流产、***、***炎、***炎和尿道炎、支气管炎、肺气肿、COPD、鼻炎、囊性纤维化病、肺炎、pneumoultramicroscopicsilico-volcanoconiosis、肺泡炎、细支气管炎、咽炎、胸膜炎、鼻窦炎、流感、呼吸道合胞病毒感染、疱疹感染、HIV感染、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、弥散性菌血症、登革热、念珠菌病、疟疾、丝虫病、阿 米巴病、棘球囊、烧伤、皮炎、皮肌炎、灼伤、荨麻疹、疣、风疹、血管炎、脉管炎、心内膜炎、动脉炎、动脉粥样硬化、再狭窄、血栓性静脉炎、心包炎、心肌炎、心肌局部缺血、结节性多动脉炎、风湿热、阿耳茨海默病、腹部疾病、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、脑膜炎、脑炎、多发性硬化症、脑梗塞、脑栓塞、格-巴综合征、神经炎、神经痛、脊髓损伤、麻痹、眼色素层炎、关节炎、关节痛、骨髓炎、筋膜炎、佩吉特病、痛风、牙周病、类风湿性关节炎、滑膜炎、重症肌无力、甲状腺炎、全身性红斑狼疮、古德帕斯丘综合征、贝切特综合征、同种异体移植物排斥、移植物抗宿主病、I型糖尿病、强直性脊柱炎、贝格尔病、I型糖尿病、强直性脊柱炎、莱特综合征或何杰金病。在更优选的实施方式中，病症是阑尾炎、胃溃疡、肠溃疡或十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性伪膜急性或局部缺血性结肠炎、肝炎、克罗恩病、哮喘、过敏、过敏性休克、器官局部缺血、再灌注损伤、器官坏死、枯草热、脓毒症、败血症、内毒素性休克、恶病质、脓毒性流产、弥散性菌血症、烧伤、阿耳茨海默病、腹部疾病、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、脑梗塞、脑栓塞、脊髓损伤、麻痹、同种异体移植物排斥或移植物抗宿主病。 
在一优选的实施方式中，本发明涉及给予和利用本发明组合物和抗体来治疗和/或预防选自以下病症的方法：阑尾炎、胃溃疡、肠溃疡和十二指肠溃疡、腹膜炎、胰腺炎、溃疡性伪膜急性和局部缺血性结肠炎、肝炎、克罗恩病、哮喘、过敏、过敏性休克、类风湿性关节炎、器官局部缺血、再灌注损伤、器官坏死、枯草热、脓毒症、败血症、内毒素性休克、恶病质、脓毒性流产、弥散性菌血症、烧伤、阿耳茨海默病、腹部疾病、充血性心力衰竭、成人呼吸窘迫综合征、脑梗塞、脑栓塞、脊髓损伤、麻痹、同种异体移植物排斥和移植物抗宿主病。在最优选的实施方式中，所述病症是内毒素性休克或同种异体移植物排斥。当所述病症是同种异体移植物排斥时，该组合物也优选包含用于抑制同种异体移植物排斥的免疫抑制剂，例如环孢菌素。 
本发明特别优选的实施方式涉及给予和利用本发明组合物和抗体来治疗和/或预防脓毒症和关节炎(例如，RA、银屑病关节炎、青少年类风湿性关节炎)的方法。此外，本发明特别优选的实施方式涉及给予和利用本发明组合物和抗体来治疗和预防银屑病和强直性脊柱炎的方法。
本发明另一优选实施方式涉及给予和利用本发明组合物和抗体来治疗和预防再狭窄、血管疾病和心血管疾病的方法。 
本发明还有另一特别优选的实施方式涉及给予和利用本发明组合物和抗体来治疗和预防组织损伤及促进组织修复和再生的方法。 
如上所述，已知有用，或已经应用或目前正用于预防、控制、治疗或缓解炎性病症或其一种或多种症状的任何药物或疗剂可与本发明抗体组合物联用。可与本发明抗体组合物联合给予患炎性病症对象的免疫调节剂的具体例子包括但不限于：氨甲喋呤、来氟米特(leflunomide)、环磷酰胺、环磷氮芥、Immuran、环孢菌素A、米诺环素、硫唑嘌呤、抗生素(例如，FK506(他克莫司))、甲基***(MP)、皮质类固醇、类固醇、霉酚酸酯.(mycophenolate mofetil)、雷帕霉素(西罗莫司)、优青糖苷、脱氧精胍菌素、布喹那(brequinar)、malononitriloamindes(如，leflunamide)、抗-T细胞受体抗体(如，抗-CD4抗体(如，cM-T412(Boeringer)、IDEC-CE9.1.RTM.(IDEC and SKB)、mAB4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗-CD3抗体(如，Nuvion(Product Design Labs)、OKT3(Johnson&Johnson))、抗-CD20抗体(如，Rituxan(IDEC&Genentech，美国和国际专利公布US2004/0202658、WO00/67796)及其衍生物、HuMax-CD20(GenMab and Medarex，美国专利公布2004/0167319))、抗-CD19抗体(参见，例如美国和国际专利公布US20020041847、US20030133930和WO05/012493)、抗-CD5抗体(如，抗-CD5蓖麻毒蛋白相连的免疫缀合物)、抗-CD7抗体(如，CHH-380(Novartis))、抗-CD8抗体、抗-CD40配体单克隆抗体(如，IDEC-131(IDEC))、抗-CD52抗体(如，CAMPATH1H(Ilex))、抗-CD2抗体(如，MEDI-507(MedImmune，Inc.，国际公布号WO02/098370和WO02/069904)、抗-CD11a抗体(如，Xanelim(Genentech))和抗-B7抗体(如，IDEC-114)(IDEC))；抗-细胞因子受体抗体(如，抗-IFN受体抗体、抗-IL-2受体抗体(如，Zenapax(ProteinDesign Labs))、抗-IL-4受体抗体、抗-IL-6受体抗体、抗-IL-10受体抗体和抗-IL-12受体抗体)、抗-细胞因子抗体(如，抗-IFN抗体、抗-TNF-α抗体、抗-IL-β抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-8抗体(如，ABX-IL-8(Abgenix))和抗-IL-12抗体))；抗-CD22抗体(如，非配体阻断性抗体，如伊帕组单抗(Epratuzumab)(Immunomedics)和配体阻断性抗体(如，美国专利公布2004/0001828和 2003/0202975))；CTLA4-免疫球蛋白；LFA-3TIP(Biogen，国际公布号WO93/08656和美国专利号6,162,432)；可溶性细胞因子受体(如，TNF-α受体的胞外结构域或其片段、IL-1β受体的胞外结构域或其片段、IL-6受体的胞外结构域或其片段)；细胞因子或其片段(如，白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ和GM-CSF)；和抗-细胞因子抗体(如，抗-IL-2抗体、抗-IL-4抗体、抗-IL-6抗体、抗-IL-10抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-15抗体、抗-TNF-α抗体和抗-IFN-γ抗体)。 
可与本发明抗体组合物联合给予患炎性病症对象的抗血管生成药物的非限制性例子包括：(MedImmune)或其它抗-αvβ3抗体(例如，CNTO95(Centocor))、内皮抑制素、血管抑制素、apomigren、抗-血管生成性抗凝血酶III、纤连蛋白的29kDa N-末端和40kDa C-末端的蛋白酶解片段、uPA受体拮抗剂、促乳素的16kDa蛋白酶解片段、血小板因子-4的7.8kDa蛋白酶解片段、血小板因子-4的抗-血管生成性的24个氨基酸片段、称为13.40的抗-血管生成因子、血小板反应蛋白I的抗-血管生成性22个氨基酸肽片段、SPARC的抗-血管生成性20氨基酸肽片段、含有RGD和NGR的肽、层粘连蛋白的抗-血管生成性小肽、纤连蛋白、前胶原和EGF、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)拮抗剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)拮抗剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂、VEGF受体(VEGFR)拮抗剂(例如，抗-VEGFR抗体)和
Figure S05841546020070606D000662
可与本发明抗体组合物联合给予患炎性病症对象的TNF-α拮抗剂的非限制性例子包括：蛋白质，多肽，肽，融合蛋白，抗体(例如，人抗体、人源化抗体、嵌合型抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、Fv片段、ScFv片段、Fab片段、F(ab)2片段及其抗原结合片段)，例如能与TNF-α免疫特异性结合的抗体，能阻断、降低、抑制或中和TNF-α的功能、活性和/或表达的核酸分子(例如，反义分子或三螺旋)、有机分子、无机分子和小分子。在各种实施方式中，与对照，例如磷酸缓冲盐水(PBS)相比，TNF-α拮抗剂能使TNF-α的功能、活性和/或表达降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。能与TNF-α免疫特异 性结合的抗体的例子包括但不限于：英利昔单抗(infliximab)(REMICADE.TM.；Centacor)、D2E7(Abbott Laboratories/Knoll Pharmaceuticals Co.，Mt.Olive，新泽西)、也称为HUMICADE.TM.的CDP571和CDP-870(二者均产自Celltech/Pharmacia，Slough，美国)和TN3-19.12(Williams等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：2762-2766；Thorbecke等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：7375-7379)。本发明也包括以下美国专利号所公开的能与TNF-α免疫特异性结合的抗体在本发明组合物和方法中的应用：美国专利号5,136,021；5,147,638；5,223,395；5,231,024；5,334,380；5,360,716；5,426,181；5,436,154；5,610,279；5,644,034；5,656,272；5,658,746；5,698,195；5,736,138；5,741,488；5,808,029；5,919,452；5,958,412；5,959,087；5,968,741；5,994,510；6,036,978；6,114,517；和6,171,787。可溶性TNF-α受体的例子包括但不限于：sTNF-R1(Amgen)、依那西普(etanercept)(ENBRELTM；Immunex)及其大鼠同源物RENBRELTM、衍生自TNFrI、TNFrII的TNF-α可溶性抑制剂(Kohno等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：8331-8335)和TNF-αInh(Seckinger等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：5188-5192)。 
本发明包括的其它TNF-α拮抗剂包括但不限于：已知能通过干扰素γ激活的巨噬细胞阻断TNF-α产生的IL-10(Oswald等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：8676-8680)、TNFR-IgG(Ashkenazi等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10535-10539)、小鼠产品TBP-1(Serono/Yeda)、疫苗CytoTAb(Protherics)、反义分子104838(ISIS)、肽RDP-58(SangStat)、沙立度胺(Celgene)、CDC-801(Celgene)、DPC-333(Dupont)、VX-745(Vertex)、AGIX-4207(AtheroGenics)、ITF-2357(Italfarmaco)、NPI-13021-31(Nereus)、SCIO-469(Scios)、TACE靶向物(Immunix/AHP)、CLX-120500(Calyx)、Thiazolopyrim(Dynavax)、金诺芬(Ridaura)(SmithKline Beecham Pharmaceuticals)、奎纳克林(米帕林二氯水合物)、替尼达普(tenidap)(Enablex)、黑色素(Large Scale Biological)和Uriach的抗-p38MAPK试剂。 
可与本发明抗体组合物联合给予患炎性病症对象的抗炎药物的非限制性例子包括：非类固醇抗炎药(NSAID)、类固醇抗炎药、β-激动剂、抗胆碱能药物和甲基黄嘌呤。NSAID的例子包括但不限于：阿司匹林、布洛芬、塞来考昔 (celecoxib)(CELEBREX.TM.)、二氯芬酸(VOLTAREN.TM.)、依托度酸(LODINE.TM.)、非诺洛芬(NALFON.TM.)、吲哚美辛(INDOCIN.TM.)、酮咯酸(ketoralac)(TORADOL.TM.)、噁丙嗪(DAYPRO.TM.)、萘丁美酮(RELAFEN.TM.)、舒林酸(CLINORIL.TM.)、托美汀(tolmentin)(TOLECTIN.TM.)、罗非昔布(rofecoxib)(VIOXX.TM.)、萘普生(ALEVE.TM.、NAPROSYN.TM.)、酮基布咯芬(ACTRON.TM.)和萘丁美酮(RELAFEN.TM.)。这种NSAID的功能是抑制环加氧酶(例如，COX-1和/或COX-2)。类固醇抗炎药的例子包括但不限于：糖皮质激素、***(DECADRON.TM.)、可的松、氢化可的松、***(DELTASONE.TM.)、强的松龙、曲安西龙、柳氮磺胺吡啶和类十二烷酸，例如***素、凝血噁烷和白三烯。 
在具体实施方式中，联合给予骨关节炎患者预防或治疗有效量的本发明抗体组合物和用于骨关节炎预防、治疗、控制或缓解的其它药物或治疗剂，其包括但不限于：镇痛剂(非限制性例子是对乙酰氨基酚、其剂量最多4000mg/天；非那西汀；和曲马多，其每日剂量是200-300mg)；NSAID(非限制性例子包括但不限于阿司匹林、二氟苯水杨酸、二氯芬酸、依托度酸、氨芬酸钠、非诺洛芬、氟比洛酚、布洛芬、吲哚美辛、酮基布咯芬、水杨酸甲酯、萘丁美酮、萘普生(naproxin)、噁丙嗪、保泰松、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸和托美汀)。优选低剂量的NSAID，例如1200mg/天的布洛芬、500mg/天的萘普生。保胃剂，例如米索前列醇、法莫替丁或奥美拉唑优选与NSAID药物联用；非乙酰化水杨酸酯，包括但不限于双水杨酸盐(salsalate)；环加氧酶(Cox)-2-特异性抑制剂(CSI)，包括但不限于塞来考昔和罗非昔布；长效糖皮质激素制品的关节内和关节周围注射剂；透明质酸的关节内注射剂；辣椒素乳膏；大量冲洗骨关节炎膝关节以冲洗掉血纤蛋白、软骨碎片和其它碎片；和关节置换手术。本发明抗体组合物也可与其它非药学方法联用来预防、治疗、控制和缓解骨关节炎，包括但不限于：降低关节负荷(非限制性例子是纠正错误姿势、支撑过度的腰部脊柱前凸；避免患病关节过度负载；避免长时间站立、下跪和下蹲)；热敷受伤关节；有氧锻炼和其它物理治疗。 
在具体实施方式中，联合给予类风湿性关节炎患者预防或治疗有效量的本发明抗体组合物和用于类风湿性关节炎预防、治疗、控制或缓解的其它药物或治疗剂， 其包括但不限于：NSAID(非限制性例子包括但不限于阿司匹林、二氟苯水杨酸、二氯芬酸、依托度酸、氨芬酸钠、非诺洛芬、氟比洛酚、布洛芬、吲哚美辛、酮基布咯芬、水杨酸甲酯、萘丁美酮、萘普生(naproxin)、噁丙嗪、保泰松、吡罗昔康(piroxicam)、舒林酸和托美汀)；镇痛剂(非限制性例子是对乙酰氨基酚、非那西汀和曲马多)；CSI，包括但不限于塞来考昔和罗非昔布；糖皮质激素(优选低剂量口服糖皮质激素，例如<7.5mg/天的***，或每月用高剂量糖皮质激素脉冲(给予)，或关节内(给予)的糖皮质激素)；减轻症状类抗风湿药(DMARD)，包括但不限于：氨甲喋呤(优选给予间歇性低剂量，例如7.5-30mg每周)、金化合物(例如，金盐)、D-青霉胺、抗疟疾药(例如，氯喹)和柳氮磺胺吡啶；TNF-α中和药物，包括但不限于依那西普和英弗利昔单抗；免疫抑制和细胞毒性药物(例子包括但不限于硫唑嘌呤、来氟米特、环孢菌素和环磷酰胺)和外科手术(例子包括但不限于关节成形术、全关节置换术、重建手的手术、开放性或关节镜滑膜切除术和腰部的早期腱鞘切除术)。本发明抗体组合物也可与其它方法联用来预防、治疗、控制和缓解类风湿性关节炎，包括但不限于：休息、上夹板以减少发炎关节的不良运动、锻炼、利用各种矫型和辅助装置和其它物理治疗。本发明抗体组合物也可与一些非常规方法联用来预防、治疗、控制和缓解类风湿性关节炎，包括但不限于：饮食(例如，用在某些鱼油中发现的Ω-3脂肪酸，例如二十碳五烯酸替代肉中发现的食用Ω-6必需脂肪酸)、疫苗、激素和局部制剂。 
在具体实施方式中，可将预防或治疗有效量的本发明抗体组合物单独给予慢性阻塞性肺病(COPD)患者或与用于预防、治疗、控制和缓解COPD的其它药物或疗法联合给予，所述其它药物或疗法包括但不限于：支气管舒张剂，包括但不限于短效和长效β2-肾上腺素激动剂(例子是短效β2激动剂，包括但不限于舒喘宁、吡布特罗、特布他林和间羟异丙肾上腺素；长效β2激动剂的例子包括但不限于口服缓释舒喘宁和吸入沙美特罗)；抗胆碱能药物(例子包括但不限于异丙托溴铵)和茶碱及其衍生物(茶碱的治疗范围优选10-20μg/mL)；糖皮质激素；外源性α1AT(例如，源自合并的人血浆的α1AT，静脉内给予，每周剂量为60mg/kg)；氧；肺移植；肺容积降低外科手术；气管内插管；呼吸支架(ventilation support)；含23-价多糖的每年流感疫苗和肺炎球菌疫苗接种；锻炼 和戒烟。 
在具体实施方式中，可将预防或治疗有效量的本发明抗体组合物单独给予肺部纤维化患者或与效量的用于肺部纤维化治疗的一种或多种其它药物联合给予，药物包括但不限于：氧；皮质激素(非限制性例子是以1-5mg/kg/天的起始剂量(提高至100mg/天)每日给予***六周，然后在3-6个月期间缓慢降低至0.25mg/kg/天的最低维持剂量)；细胞毒性药物(非限制性例子是每日口服一次100-120mg的环磷酰胺，和每日口服一次3mg/kg到最高200mg的硫唑嘌呤)；支气管舒张剂(非限制性例子是短效和长效β2-肾上腺能激动剂、抗胆碱能药物和茶碱及其衍生物)；和抗组胺剂(非限制性例子是苯海拉明和抗敏安)。 
在具体实施方式中，可将预防或治疗有效量的本发明抗体组合物单独给予SCI患者或与有效量的用于SCI治疗的一种或多种其它药物联合给予，药物包括但不限于：糖皮质激素类固醇(非限制性例子是在15分钟期间推注甲强龙30mg/kg，在推注甲强龙后45分钟开始进行23小时的5.4mg/kg/小时甲强龙输液)、神经保护剂(neuroprotector)(例如，米诺环素)、再生治疗(例如，干细胞治疗、水凝胶)、弱电场治疗(例如，脊柱外振荡场刺激器可植入医疗装置(extraspinal oscillating field stimulator implantable medical device))。 
在具体实施方式中，可将预防或治疗有效量的本发明抗体组合物单独给予哮喘患者或与有效量的用于哮喘治疗的一种或多种其它药物联合给予，药物包括但不限于：肾上腺能刺激剂(例子包括但不限于儿茶酚胺类，例如肾上腺素、异丙基去甲肾上腺素和乙基异丙肾上腺素；间苯二酚类，例如间羟异丙肾上腺素、特布他林和酚丙喘宁；和水杨醇类，例如沙丁胺醇(吸入是给予肾上腺素刺激剂的优选途径)；甲基黄嘌呤类，包括但不限于茶碱及其各种盐；抗胆碱能药物，包括但不限于硫酸阿托品、甲基硝酸阿托品(atropine methylnitrate)和异丙托溴铵；糖皮质激素类(例子包括但不限于全身性或口服类固醇和吸入性糖皮质激素)；肥大细胞稳定剂(例子包括但不限于色甘酸钠和萘多罗米钠)；白三烯改良剂(例子包括但不限于齐留通(Zileuton)、扎鲁司特(zafirlukast)和孟鲁司特(montelukast))；免疫抑制剂(例子包括但不限于氨甲喋呤和金盐)；和黏液溶解药物(例子包括但不限于乙酰半胱氨酸)。
本发明提供通过给予对象有效量的本发明化合物或药物组合物，优选本发明抗体来治疗、抑制和预防的方法。在一优选实施方式中，所述化合物基本上是纯的(例如，基本上不含限制其作用或产生不良副作用的物质)。所述对象优选动物，包括但不限于：例如母牛、猪、马、鸡、猫、狗等，优选哺乳动物，最优选人。 
当所述化合物包括核酸或免疫球蛋白时，可利用的制剂和给药方法如上所述；其它合适的制剂和给药途径可选自下文所述的那些。 
可用的已知各种递送***给予本发明化合物，例如包裹在脂质体、微粒、微胶囊中，能表达该化合物的重组细胞，受体介导的胞吞(参见，例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.，262：4429-4432，(1987))，构建作为逆转录病毒或其它载体一部分的核酸，等等。引入方法包括但不限于：真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述化合物或组合物可通过任何方便的途径给予，例如通过输液或推注，通过上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和小肠粘膜)吸收，并可联同其它生物学活性药物一起给予。给药可以是全身或局部。此外，可能需要将本发明药学化合物或组合物通过任何合适的途径(包括心室内和鞘内注射)引入中枢神经***；可通过，例如与储液器(如Ommaya储液器)相连的心室内导管来促进心室内注射。也可采用肺部给药，例如利用吸入器或喷雾器，和用雾化剂配制。 
在一具体实施方式中，可能需要将本发明药学化合物或组合物局部给予至需要治疗的区域；这可通过以下方式实现：例如(不限于)外科手术期间的局部灌注、局部应用(例如与手术后伤口包扎结合)、通过注射、利用导管、利用栓剂或利用植入物，所述植入物是有孔、无孔的凝胶状物质，包括膜，如唾液酸膜(sialastic membrane)或纤维。当给予本发明蛋白质，包括抗体时，最好要小心使用不吸附蛋白质的材料。 
在另一实施方式中，所述化合物或组合物可通过囊泡，特别是脂质体递送(参见Langer，Science，249：1527-1533，(1990)；Treat等，刊于Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer(《感染性疾病和癌症治疗中的脂质体》)，Lopez-Berestein和Fidler编，Liss，纽约，第353-365，(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327页；总体可参见上文)。
在还有另一实施方式中，可以受控释放***递送所述化合物或组合物。一个实施方式可利用泵(参见Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.，14：201；Buchwald等，1980，Surgery，88：507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.，321：574)。另一实施方式利用聚合材料(参见Medical Applications ofControlled Release(《控释的医学应用》)，Langer和Wise编，CRC Press，BocaRaton，Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance(《受控的药物生物利用度，药物产品设计和性能》)，Smolen和Ball编，Wiley，纽约，(1984)；Ranger和Peppas，J.，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.，23：61；也参见Levy等，1985，Science，228：190；During等，1989，Ann.Neurol.，25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.，71：105)。在还有另一实施方式中，可将控释***置于毗邻治疗靶位之处(即大脑)，因此只需要给予全身剂量的一部分(参见，例如Goodson，刊于Medical Applicationsof Controlled Release(《控释的医学应用》)，同上，第2卷，第115-138页，(1984))。Langer(1990，Science，249：1527-1533)的综述讨论了其它控释***。 
在本发明化合物是编码蛋白质的核酸的实施方式中，可将所述核酸构建为合适的核酸表达载体的一部分并通过以下方式体内给予从而进入细胞内而促进其编码的蛋白质表达：例如利用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)、或直接注射、或利用微粒轰击(例如，基因枪；生物射弹，Dupont)、或用脂质或细胞表面受体或转染试剂包被、或将其与已知能进入核的同源框样肽连接给予(参见，例如Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：1864-1868)，等等。或者，可通过同源重组将核酸引入细胞内掺入宿主细胞DNA中进行表达。 
本发明也提供药物组合物。这种组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体。在一具体实施方式中，术语“药学上可接受的”表示经联邦管理局或州政府批准或列于美国药典或其它公认的药典中而可用于动物，更具体是用于人。术语“载体”指给予治疗剂的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内给予药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖及甘油的水溶液也可用作液体载体，特别是 用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、大米、面粉、白垩粉、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、混悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等剂型，可用常规黏合剂和载体，例如甘油三酯将组合物配制为栓剂。口服制剂可含有标准载体，例如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》)描述了合适药物载体的例子。这种组合物含有治疗有效量的化合物(优选纯化形式)与合适量的载体，从而能提供适合给予患者的剂型。制剂应适合于给药形式。 
在一优选实施方式中，按照常规方法将组合物配制为适合于静脉内给予人类的药物组合物。静脉内给予的组合物通常是无菌等渗水性缓冲液配制的溶液。如果需要，组合物也可含有增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因来减轻注射部位的疼痛。各成分通常可以分别提供或混合成单位剂型，例如装在标有活性物质含量的密封容器，如安瓿或袋(sachette)中的冻干粉末或无水浓缩物。当要输液给予组合物时，可用含有药物级无菌水或盐水的输液瓶分发。当通过注射给予组合物时，可先用一安瓿注射用无菌水或盐水来混合各成分，再给予。 
可将本发明化合物配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括用诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，和用诸如衍生自氢氧化钠、钾、铵、钙、铁，异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组胺、普鲁卡因等的阳离子形成的盐。 
可通过标准临床技术测定能有效治疗、抑制和预防本发明多肽表达和/或活性异常相关疾病或病症的本发明化合物用量。此外，也可任选采用体外试验来协助鉴定最佳剂量范围。制剂所用的精确剂量也取决于给药途径和疾病或病症的严重性，应根据执业医师的判断和各患者的情况决定。可从体外或动物模型测试***获得的剂量-反应曲线外推得到有效剂量。 
对于抗体，给予患者的剂量通常是0.1mg/kg—100mg/kg患者体重。给予患者的剂量优选介于0.1mg/kg-20mg/kg患者体重间，更优选1mg/kg-10mg/kg患者体重。由于对外来多肽可产生免疫反应，人抗体在人体内的半衰期 通常比其它物种的抗体长。因此，人抗体常可采取较低剂量和较少给药次数。此外，可通过例如脂质化修饰来提高抗体的摄取和组织渗透(例如，进入大脑)而减少本发明抗体的剂量和给药频率。 
本发明也提供装有一个或多个填充了本发明药物组合物诸成分的容器的药物包或试剂盒。这种容器中可任选装有管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府当局的通告，该通告反映了当局批准可生产、使用或销售该人用药物。 
这些组合物中多肽所包含的赋形剂根据组合物在治疗应用中的预计给药途径来选择。组合物的给药途径取决于待治疗的病症。例如，对于治疗全身性疾病，例如内毒素性休克，优选静脉内注射，对于治疗胃肠道病症，例如胃溃疡，优选口服给药。本领域技术人员结合标准剂量-反应的研究可决定给药途径和待给予组合物的剂量而无需过多实验。作出那些决定要考虑的相关情况包括待治疗的病症、选择待给予的组合物、患者个体的年龄、体重和反应、患者症状的严重性。因此，根据病症，抗体组合物可通过口服、胃肠外、鼻内、经***、经直肠、经舌、舌下、含服、口内和透皮给予患者。 
因此，可通过本领域熟知的方法制备设计经口服、经舌、舌下、含服和口内给药的组合物而无需过多实验，例如采用惰性稀释剂或可食用载体。这些组合物可包装在明胶胶囊中或压缩成片剂。为口服治疗性给药的目的，可掺合本发明药物组合物与赋形剂，以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、薄片、咀嚼胶等剂型给予。 
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等也可含有黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂和调味剂。黏合剂的一些例子包括微晶纤维素、黄蓍胶或明胶。赋形剂的例子包括淀粉或乳糖。崩解剂的一些例子包括海藻酸、玉米淀粉等。润滑剂的例子包括硬脂酸镁或硬脂酸钾。助流剂的例子是胶体二氧化硅。甜味剂的一些例子包括蔗糖、糖精等。调味剂的例子包括薄荷、水杨酸甲酯、橙味调料等。就用量而言，制备各种组合物所用的材料应是药学纯和无毒的。 
本发明组合物不难经胃肠外给予，例如通过静脉内、肌肉内、鞘内或皮下注射。可通过将本发明抗体组合物掺入溶液或混悬液来实现胃肠外给予。这种溶液和混悬液也可含有无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚 乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。胃肠外制剂也可含有抗菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠和螯合剂，例如EDTA。也可加入诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐等缓冲液和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可将胃肠外制剂包装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。 
直肠给药包括将药物组合物给予直肠或大肠中。这可利用栓剂或灌肠剂实现。通过本领域已知方法不难制备栓剂。例如，可将甘油加热至约120℃，将抗体组合物溶于甘油中，混合加热的甘油，然后加入纯水并将该热混合物倒入栓剂模具来制备栓剂。 
透皮给药包括使组合物经皮吸收。透皮制剂包括贴剂、软骨、乳膏、凝胶、油膏等。 
本文所述抗体组合物也可含有早期脓毒症介质的拮抗剂。本文所用的早期脓毒症拮抗剂是诱导炎性细胞因子级联反应(例如，接触LPS)后细胞立即(即，在30-60分钟内)释放的促炎细胞因子。这些细胞因子的非限制性例子是TNF、IL-1α、IL-1β、IL-6、PAF和MIF。早期脓毒症介质也包括这些细胞因子的受体(例如，1型肿瘤坏死因子受体)和产生这些细胞因子所需的酶(例如，白介素-1β转化酶)。这些实施方式可采用目前已知或以后发现的早期脓毒症介质的任何拮抗剂来进一步抑制炎性细胞因子级联反应。 
早期脓毒症介质拮抗剂的非限制性例子是能与早期脓毒症介质的mRNA结合并阻止其表达的反义化合物(参见，例如Ojwang等，1997，Biochemistry，36：6033-6045；Pampfer等，1995，Biol.Reprod.，52：1316-1326；美国专利号6,228,642；Yahata等，1996，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，6：55-61；和Taylor等，1998，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，8：199-205)、能特异性切割早期脓毒症介质的mRNA的核酶(参见，例如Leavitt等，2000，Antisense NucleicAcid Drug Dev.，10：409-414；Kisich等，1999；和Hendrix等，1996，Biochem.J.，314：655-661)和能与早期脓毒症介质结合并抑制其功能的抗体(参见，例如，Kam和Targan，2000，Expert Opin.Pharmacother.，1：615-622；Nagahira等，1999，J.Immunol.Methods，222，83-92；Lavine等，1998，J.Cereb.Blood FlowMetab.，18：52-58；和Holmes等，2000，Hybridoma，19：363-367)。认为目前 已知或以后发现的早期脓毒症介质的任何拮抗剂属于本发明范围内。技术人员采用常规剂量-反应的研究可决定这些组合物中抑制特定炎性细胞因子级联反应的早期脓毒症介质(拮抗剂)用量而无需过多实验。 
5.8诊断和成像 
为诊断目的，可采用能与感兴趣多肽特异性结合的标记抗体及其衍生物和类似物来检测、诊断或监测本发明多肽表达和/或活性异常相关疾病和/或病症。本发明提供检验感兴趣多肽异常表达(的方法)，包括(a)利用感兴趣多肽的一种或多种特异性抗体检验某个体的细胞或体液中感兴趣多肽的表达和(b)将基因表达水平与标准的基因表达水平作比较，藉此，与标准表达水平相比，检验到多肽基因表达水平升高或降低表明表达异常。 
本发明提供诊断病症的诊断试验，包括(a)利用感兴趣多肽的一种或多种特异性抗体检验某个体的细胞或体液中感兴趣多肽的表达和(b)将基因表达水平与标准的基因表达水平作比较，藉此，与标准表达水平相比，检验到多肽基因表达水平升高或降低表明患有具体病症。 
可采用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法(例如，参见Jalkanen等，1985，J.Cell.Biol.，101：976-985；Jalkanen等，1987，J.Cell.Biol.，105：3087-3096)，利用本发明抗体检验生物学样品中的蛋白质水平。用于检测蛋白质基因表达的其它抗体方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。 
可采用本领域已知的技术来标记本发明抗体。这种技术包括但不限于利用双功能缀合剂(conjugating agent)(参见，例如美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560和5,808,003)。 
本发明的一种实施方式是检测和诊断动物，优选哺乳动物，最优选人体中感兴趣多肽表达异常相关的疾病或病症。在一个实施方式中，诊断包括：(a)给予(例如，胃肠外、皮下或腹膜内)对象有效量的能与感兴趣多肽特异性结合的标记分子；(b)给药后等待一定时间以使标记分子优先集中于对象表达该多肽的部位(也使未结合的标记分子清除至背景水平)；(c)测定背景水平；和(d)检 测对象体内的标记分子，因而检测到标记分子高于背景水平表明对象具有与感兴趣多肽表达异常相关的特定疾病或病症。对于某特定***，可通过各种方法，包括将检测到的标记分子含量与以前测定的标准值作比较来测定背景水平。 
本文也描述了用本发明抗体来治疗、诊断或预后患以下疾病的个体：脓毒症、类风湿性关节炎、腹膜炎、克罗恩病、再灌注损伤、败血症、内毒素性休克、囊性纤维化病、心内膜炎、银屑病、银屑病关节炎、关节炎、过敏性休克、器官局部缺血、再灌注损伤和同种异体移植物排斥。 
本领域知道对象的体形和所用的成像***将决定产生诊断性图像所需的成像部分数量。对于人对象，以放射性同位素部分为例，注射的放射量通常是约5-20毫居里的99Tc。然后标记的抗体或抗体片段优先积累在含有特定蛋白的细胞部位。S.W.Burchiel等，“Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies andTheir Fragments”(放射性标记的抗体及其片段的免疫药物动力学)，(刊于TumorImaging：The Radiochemical Detection ofCancer(《肿瘤成像：癌症的放射性化学检测》)，第13章，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编，Masson Publishing Inc.，(1982)描述了体内肿瘤成像。 
取决于几种因素，包括所用标记的类型和给药方式，给药后使标记分子优先集中于对象体内各部位和使未结合的标记分子清除至背景水平所需的时间间隔是6-48小时或6-24小时或6-12小时。在另一实施方式中，给药后所需的时间间隔是5-20天或5-10天。 
在一个实施方式中，通过在，例如初始诊断后一个月、初始诊断后六个月、初始诊断后一年等重复疾病诊断方法来监测疾病或病症。 
可采用体内扫描领域已知的方法来检测患者体内标记分子的存在。这些方法取决于所用标记的类型。技术人员能确定检测特定标记的合适方法。本发明诊断方法可用的方法和装置包括但不限于：计算机化断层显像(CT)、全身扫描，例如正电子发射断层显像(PET)、磁共振成像(MRI)和声像图检查。 
在一具体实施方式中，利用辐射响应外科仪器检测患者体内用放射性同位素标记的所述分子(Thurston等，美国专利号5,441,050)。在另一实施方式中，利用荧光响应扫描仪器检测患者体内用荧光化合物标记的所述分子。在另一实施方式中，采用正电子发射断层分析检测患者体内用正电子发射金属标记的所述分子。在 还有另一实施方式中，采用磁共振成像(MRI)检测患者体内用顺磁性标记物标记的所述分子。 
表3：序列表的说明 
Figure S05841546020070606D000781
Figure S05841546020070606D000791
a核苷酸序列称为“nt”，氨基酸序列称为“aa”。 
6.实施例 
现参考以下实施例描述本发明。给予这些实施例仅是为说明的目的，本发明不应理解为局限于这些实施例，而应理解为包括因本文的说明而显而易见的任何及所有改变形式。 
6.1实施例1 
人抗HMG1抗体的产生和物理特征鉴定 
通过用人HMG1(SEQ ID NO：1和2，也可参见图1)进行几轮淘选从原初人Fab噬菌体展示文库中分离出一大组人抗-HMG1抗体。测序各克隆以除去重复的克隆，将Fab片段亚克隆入表达载体来产生全长IgG。序列表给出了几种抗体克隆(G2、G4、G9、G12、G16、G20、G34、G35、S2、S6、S10、S12、S14、S16、S17和E11)的轻链和重链可变区的核苷酸序列和相应的氨基酸序列(具体SEQ IDNO见表3)。图2代表了由美国模式培养物保藏所保藏(保藏号分别是PTA-6142、PTA-6143、PTA-6259和PTA-6258)的几种抗体克隆(S2、S6、S16和G4)的重链和轻链可变区。图2也显示了抗-HMG1抗体E11的重链和轻链可变区。所述各抗 体的CDR在图2中以下划线标出，见序列表(具体SEQ ID NO可参见表3)。如下所述纯化得到的全长抗体并测定它们的物理特性。如表1所总结的，这些分析显示产生的人抗-HMG1抗体显示特征范围很大。 
6.1.1材料与方法 
分离人抗-HMG1抗体：通过三轮下述淘选来筛选人Fab噬菌体展示文库(Dyax，剑桥，马萨诸塞州)：第1天.I)用以0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制的20μg/ml全长HMGB-1包被免疫试管(immunotube)。4℃静置过夜。第2天.I)采用100倍噬菌体作为文库大小。加入1/5体积的PEG6000(20％)。置于冰上1小时。14000rpm离心10分钟。悬浮于PBS(pH7.4)中以沉淀噬菌体文库。II)用2％牛奶/PBS封闭抗原包被的免疫试管和噬菌体。然后用PBS2×清洗免疫试管，将噬菌体转移至免疫试管，旋转混合30分钟，然后再静置培育1.5小时。III)用PBST(PBS+0.1％吐温20)洗涤免疫试管10-20次，然后用PBS洗涤10-20次，用1ml的100mM三乙胺洗脱噬菌体。用0.5ml的1M Tris-HCl(pH7.5)中和洗脱的噬菌体。IV)混合1体积洗脱的中和噬菌体和5体积对数阶段的TG1及4体积2YT。37℃培育30分钟(水浴)。离心收集受感染的细胞，重悬在2YT中，接种于含有羧苄青霉素和2％葡萄糖的2YT琼脂上。 
人抗-HMG1寡克隆的表达和单克隆抗体：第三轮淘选后提取几个细菌库的质粒。然后从质粒上切下Fab基因片段，将其***受CMV启动子控制的IgG表达载体中。将含Fab片段的IgG表达载体质粒瞬时转染入293H细胞，使生长培养液通过A蛋白柱得到纯化的寡克隆抗体。检测寡克隆抗体各库对HMG1的反应性。进一步筛选检测阳性的那些库来鉴定各阳性克隆。 
等电聚焦凝胶电泳：利用装有多种温度3个冷藏槽再循环部件和EPS3501XL电源的Pharmacia Biotech Multiphor2电泳***测定等电点。将5μg蛋白质加载于预浇铸的ampholine凝胶上(Amersham Biosciences，pI范围2.5-10)。利用宽范围pI标记标准品(Amersham，pI范围3-10，8μL)测定Mab的相对pI。用1500V，50mA进行电泳105分钟。用纯水稀释至1×的Sigma固定溶液(5×)固定凝胶。在室温用Simply蓝染色剂(Invitrogen)染色过夜。用25％乙醇、8％乙酸和67％纯水组成的溶液脱色。用Bio-Rad光密度计相对于标准品的校验曲线测定等电点。
示差扫描量热法：用VP-DSC(MicroCal，LLC)以1.0℃/分钟和25-120℃温度范围检测热解链温度(Tm)。采用8秒过滤时间联同5分钟的预扫描恒温处理(thermostating)。利用Pierce透析杯(3.5kD)以25mM组氨酸-HCl，pH6透析来制备样品。通过A280检测到平均Mab浓度是50μg/mL。利用该***提供的原创软件，按照生产商的方法测定解链温度。简言之，利用样品和参比小室的缓冲液运行多根基线以建立热平衡。从样品差示热分析图中扣除基线后，采用解卷积功能将数据按照浓度标准化并拟合。 
6.1.2结果 
从一个噬菌体展示文库中分离了超过35个单独的Fab克隆，其中18个转变为全长IgG1并从瞬时转染(物)中纯化。随后对这些克隆的分析显示它们的特征范围很大。例如，它们显示解离常数(Kd)介于高值约330nM-低值恰好22nM之间(总结于表1)。表明稳定性的Tm值范围从低值恰好约70℃-高值约为90℃(图3B和3C)。表明抗体溶解性的pI值也显示宽范围，其中抗体pI值为7.8-9.0(图3A和3C)。在许多体外和体内研究中筛选具有各种特征的抗体(见下文)来测定其最理想的特征组合。此外，可利用大量的其它克隆来进一步筛选。 
6.2实施例2 
人抗-HMG1抗体的动力学分析 
采用各种技术检测了几种人抗-HMG1抗体的结合动力学和特异性。此外，利用几种肽极性表位作图研究。如表1所总结的，这些分析显示所述人抗-HMG1抗体具有不同结合动力学和特异性。另外，数据表明抗-HMG1抗体能与包括HMG1B-框和A-框在内的各种表位结合。 
6.2.1材料与方法 
重组HMG1的制备/分离：以钙调蛋白结合蛋白(CBP)融合蛋白(CBP与HMGB1的N-末端相融合)从大肠杆菌中分离得到重组HMG1。表达CBP-HMG1的大肠杆菌培育2-3小时，在25mM Tris-HCl，150mM NaCl，2mM CaCl2，pH8.0中通过微流化释放该蛋白。裂解的细胞以125,000×g离心1小时，在有CaCl2存在下将过滤的上清液施加于钙调蛋白柱上。用2-2.5柱体积的裂解缓冲液洗涤柱，然后用5倍柱体积的线性梯度增加至50mM Tris，400mM NaCl，2 mM CaCl2，pH8.0洗涤，蛋白质用100mM Tris，400mM NaCl，5mM EGTA，pH8.0洗脱。用TritonX114提取除去内毒素。所用TX-114的终浓度为2％，4℃培育30分钟，转移至37℃培育30分钟，离心分相。蛋白质提取两次。 
制备三种形式的天然HNG1：按照ATCC的方法用含10％FBS的DMEM中培养293H细胞(ATCC号CRL-1573，人肾，上皮)，从中制备核HMG1。室温在1分钟内加入胰蛋白酶/EDTA收集80％汇合的细胞。用PBS轻柔冲洗培养瓶然后1100rpm离心3分钟立即回收细胞。用PBS洗涤细胞两次，将其转移至2mL eppendorf管，用PBS配制为终浓度约2-5×107/ml，然后在液氮中冷冻2分钟，再于室温在水浴中融化5-10分钟。冻融步骤重复两次以上。13,000rpm离心裂解的细胞，将上清液转移至新的无菌试管，-70—-80℃保存。上清液的用量根据冻融前上清液的细胞浓度而定。 
从坏死的293H细胞的条件培养液中制备释放的HMG1。293H细胞在含10％FBS的DMEM中培养10天，不更换培养基。从培养瓶中收集培养基，3000rpm离心10分钟，使上清液通过0.2μm滤器后置于透析袋中用浓缩液(PIERCE)透析。如果需要可更换浓缩液直至培养液的体积减少约10倍。然后用PBS(pH7.2)透析浓缩的培养液。用纯化的HMGB1作为标准品通过夹心ELISA(见下文)测定浓缩样品中HMGB1的浓度。 
按照ATCC的方法用含10％FBS、0.05mM2-巯基乙醇的RPMI1640(Cat#03-0078DJ)中培养THP-1细胞(ATCC号TIB-202，人单核细胞)，从中制备活化的HMG1。用0.5ug/ml终浓度的LPS处理细胞过夜(14-16小时)后，细胞达到约4x105个细胞/ml。1,100rpm离心3分钟收集细胞，用PBS洗涤三次以完全除去含LPS的培养液，将其转移至2ml eppendorf试管，PBS配制为终浓度约2-5×107/ml，然后在液氮中冷冻2分钟，再于室温在水浴中融化5-10分钟。冻融步骤重复两次以上。13,000rpm离心裂解的细胞，将上清液转移至新的无菌试管，-70—-80℃保存。上清液的用量根据冻融前上清液的细胞浓度而定。 
用BIAcore分析HMG1结合亲和力：所有实验用BIAcore3000仪器(BIAcore，Inc.，Piscataway，新泽西)进行。简言之，采用标准的胺偶联化学法将各mAb固定在CM5传感器芯片上。也分别制备了参比(对照)流式小室。用仪器缓冲液配制的HMG1两倍连续稀释液以低流速依次注射到各mAb和参比 流式小室表面上。HMG1结合和解离后，用1M NaCl-50mM NaOH作简单脉冲再生mAb表面。各实验结束时，利用BIAcore，Inc.(Piscataway，新泽西)提供的BIA评估软件的稳态模型评估结合曲线。这些研究所测定的Kd值见表1。 
直接ELISA(固定HMG1)：4℃用PBS配制的5μg/ml HMGB-1包被96-孔免疫平板(EIA/RIA平板，高结合，Costar)各孔过夜。然后在37℃用溶解于PBS的4％奶粉封闭该平板1小时。除去封闭液，替换为各种浓度的人抗-HMG1抗体(参见图4A)。洗涤(ELX-405平板洗涤器，BIO-TEK)平板，加入终浓度1：125,000的第二抗体(抗-人IgG-HRP，PIERCE)，37℃1小时。用Sureblue HRP底物(KPL)检测HRP活性。利用Kinetic Microplate Reader(动力学微板读数器)(Molecular Devices)读取平板的450nm读数。数据总结于表1，代表性的结合曲线见图4A和D。 
夹心ELISA(可溶性HMG1)：用PBS(pH7.2)配制的10μg/ml抗人IgG Fc包被免疫平板(EIA/RIA平板，高结合，Costar)，4℃培育过夜。除去包被试剂，用PBS简单清洗各板。然后在37℃用4％牛奶封闭各平板1小时，用PBS清洗。用4％牛奶稀释抗-HMG1抗体。对于连续稀释，使用20μg/ml起始浓度的抗体。然后将稀释的抗-HMG1抗体加入板中，37℃培育1小时。随后用PBST(PBS/0.1％吐温20)洗涤平板10次，37℃与用4％牛奶配制的抗原(HMGB1，2μg/ml；或0.7μg/ml的天然HMGB1)培育1小时。然后洗涤平板10次，37℃与用4％牛奶配制的小鼠抗-HMGB1(1μg/ml)培育1小时。洗涤平板10次，37℃与1：1000的抗小鼠IgG-HRP培育1小时。洗涤平板后显色。用Sureblue HRP底物(KPL)检测HRP活性。用Kinetic Microplate Reader(动力学微板读数器)(Molecular Devices)读取平板的450nm读数。数据总结于表1，代表性的结合曲线见图4B-D。 
BIAcore分析抗体HMG1的结合竞争力：所有实验用BIAcore3000仪器(BIAcore，Inc.，Piscataway，新泽西)进行。如BIAcore手册(BIAcore，Inc.，Piscataway，新泽西)所述，用标准的胺偶联化学法将HMGB-1蛋白质固定在CM5传感器上。简言之，CM5表面经NHS/EDC活化。活化后，将浓度为100nM或200nM(10mM NaOAc，pH4配制)的HMGB-1注射到表面至表面密度介于1100-1200RU之间。然后注射1M乙醇胺给传感器芯片表面上未反应位点 “加帽”。为参比目的，也采用与固定HMGB-1所用相同的方法制备了空白流式小室，但无任何配体。 
制备1uM和2uM的MAb G2、G4、G9、S6和Synagis。所有mAb溶液用HBS-EP缓冲液(BIAcore，Inc.，Piscataway，新泽西)制备。每轮开始时以1μM注射第一mAb100μL，然后注射两种mAb(两倍浓度)的1：1混合物100μL，使混合物中各mAb组分的终浓度与第一次注射相等。每轮注射后，用10mMHCl脉冲1分钟再生HMGB-1表面。 
一旦收集了整组，记录每轮注射后各mAb的最大RU反应。然后利用这些反应计算各mAb的平均反应水平。再用该平均结合反应计算用第一mAb饱和后与HMGB-1表面结合的各mAb百分比。可综合利用这些结合/封闭模式来测定mAb是否与HMGB-1上的无关或相关位点结合。这些数据总结于表1。 
与HMG1或HMG2结合：用磷酸缓冲盐水(PBS)，pH7.2配制的5μg/mL小牛胸腺HMGB1或HMGB2液包被超高-结合ELISA平板(ThermoLab systems，3855号)，4℃培育过夜。用不含Ca和Mg的PBS洗涤各平板，向各孔中加入100微升用10mM PBS，pH7.2+1％牛血清白蛋白(BSA)稀释至10ug/mL终浓度的抗-HMGB1抗体，室温培育各平板1小时。用100μl PBS，pH7.2洗涤各孔三次。用10mM PBS+1％BSA将HRP标记的山羊-抗-人IgGκ-链(KPL，14-10-10号)和山羊-抗-人IgGλ-链(KPL，14-10-11号)稀释1000倍，将100μl加入各孔，室温培育1小时。然后用100μl PBS，pH7.2洗涤各孔三次。按照生产商的使用说明书制备OPD底物(Pierce chemical company，34006号)，将100μl制备的底物加入各孔，室温闭光培育各平板20-30分钟。加入100μl2MH2SO4终止反应，利用平板读数器读取各平板490nm波长的读数。许多抗体的OD值见图4E，总结于表1。 
HMG1B框肽作图：用PBS配制的10μg/ml HMG1B框肽氨基酸91-169(图5A)或氨基酸150-183(图5B)包被96-孔免疫平板(EIA/RIA平板，高结合，Costar)的各孔，4℃培育过夜。然后在37℃用溶解于PBS的4％奶粉封闭平板1小时。除去封闭溶液，替换为各种浓度的人抗-HMG1抗体(参见图5A-B)。洗涤(ELX-405平板洗涤器，BIO-TEK)平板后加入终浓度1：125,000的第二抗体(抗-人IgG-HRP，PIERCE)，37℃1小时。用Sureblue HRP底物(KPL)检测HRP活性。利用Kinetic Microplate Reader(动力学微板读数器)(Molecular Devices)读取平板的450nm的读数。 
6.2.2结果 
ELISA研究显示检测的大多数抗体能与固定的rHMG1结合(图4A)。然而，在该试验中，观察到能与固定的和可溶性rHMG1都结合的大多数抗体E11、G34和G20与可溶性rHMG1的结合较好，而S10、S12、S16和G16与固定的rHMG1结合略好(图4D，数据未显示)。测试的许多抗体显示与rHMG1或一种或多种天然形式HMG1结合有某种偏好(总结于表1，也参见图4B-C)。例如，S16与重组和天然HMG1均能结合，而G4与天然HMG1结合较好，S2、S6和S10均显示与rHMG1结合较好(图4B)。令人感兴趣的是，虽然S6与HMG1的任何天然形式结合不佳，但其确实显示与释放的HMG1有一定结合(图4C，左上图)。S16和G4显示与HMG1的各种天然形式结合差异很小(图4C，右上和左下图)。此外，测试了抗体对高度相关HMG2蛋白的交叉反应性。E11、S12和S16均显示与HMG2有一定结合。令人感兴趣的是，当抗原固定时，在本文所用的条件下E11显示与HMG2的结合优于HMG1。 
利用对几乎所有抗体的BIAcore分析测定各抗体对重组HMG1(rHMG1，见表1)的Kd。通过BIAcore竞争试验分析几种抗体(G4、G9、S2和S6)显示这些抗-HMGB1抗体似乎能与相同位点或高度相关也许重叠的多个位点结合(见表1)， 
对几种抗-HNG1抗体(S2、S6、S10、G2、G4、G9、S12和S16)进行了作肽图研究来测它们定与HMG1B框的结合。如图5A-B所示，G4、S12和S16能与HMG1肽91-169结合(图5A)，而S12只能与HMG1肽150-183结合(图5B)。此外，发现E11能识别HMG1A-框(数据未显示)。 
总之，分离的人抗-HMG1抗体显示宽泛的结合特征，其中一些能与所有形式的HMG1结合(例如，S16)，而其它能区分重组形式和天然形式(例如，S10和S2)。它们也能与包括A-和B-框在内的不同表位结合。选择几种人抗-HMG1抗体用于许多其它体外和体内实验(见下文)。 
6.3实施例3 
抗-HMGB1抗体抑制人PBMC释放细胞因子 
测定了一组人抗-HMG1抗体抑制HMG1诱导人外周血单核的细胞(PBMC)释放细胞因子的能力。检测了对以下细胞因子的作用：IL-12、IL-1β、TNF-α和IL-6。许多抗-HMG1抗体能抑制HMG1诱导一种或多种这些细胞因子释放。此外，测定到HMG1能刺激NO释放，而抗HMG1的抗体能抑制这种释放。也证明几种人抗-HMG1抗体能降低小鼠巨噬细胞中HMG1诱导的细胞因子基因表达。 
6.3.1材料与方法 
抑制细胞因子释放：通过密度梯度离心从健康志愿者的外周血中分离人外周血单核的细胞(PBMC)。将新鲜提取的肝素化全血与两倍体积的PBS混合。将稀释的血液轻柔叠放在Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)表面上，室温下以400×g离心30分钟。收集介于血浆和密度梯度液之间界面的PBMC。PBS许多3次后，将纯化的PBMC重悬于含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和50μMβ-巯基乙醇的RPMI-1640培养基(GIBCO BRL)中。向96-孔细胞培养平板的各孔中加入1x105个细胞。 
37℃，5％CO2培育PBMC2小时。向各孔中加入4μg/ml重组HMG1或2.4×105个LPS刺激的THP-1细胞的天然活化HMG1，和不同浓度的人抗-HMGB-1单克隆抗体，RAGE-Fc融合蛋白或HMG1A-框-Fc融合蛋白。培养基补加了8U/ml(1μg/ml)硫酸多粘菌素B(Sigma-Aldrich)以抑制可能的内毒素。来自同一供体但未用HMG1刺激的PBMC用作对照。14小时后收集不含细胞的培养液，保存于-20℃。 
利用的Upstate by Luminex100(Luminex Corp.)的Beadlyte人多价细胞因子弹性试剂盒分析培养液的炎性细胞因子。检测用重组HMG1刺激细胞的促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-12(p40)。此外，检测用天然活化的HMG1刺激细胞的TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8。 
细胞因子释放数据以一式三份实验的平均值±标准偏差表示。抗-HMGB1单克隆抗体的IC50定义为产生半数最大抑制HMGB1刺激的PBMC释放细胞因子所需的抗体浓度。其利用PRISM程序计算。 
抑制NO释放：NO试验所用的巨噬细胞包括得自C57BL/6小鼠的RAW 细胞(小鼠巨噬细胞细胞系)以及骨髓衍生的巨噬细胞(mBMMf)。在有M-CSF存在下培养三天成熟后用mBMMf(“新鲜的mBMMf”)。将该细胞以105个细胞/孔接种于96-孔板中，在100μl无血清培养基中用HMG1刺激过夜。各种浓度的HMGB-1(5μg/ml)和LPS(1μg/ml)用作阳性对照来刺激巨噬细胞产生NO；用这些刺激观察剂量依赖性反应。以4：1的摩尔比测试抗HMG1抗体。第二天，以1500rpm离心各板5分钟，收集上清液。在另一96-孔板中混合以下成分：50μl刺激的上清液和标准品(用培养基稀释)、25μl NADH、25μl硝酸盐还原酶、50μl Griess试剂I，平板在37℃培育30分钟。然后向各孔中加入50μL Griess试剂II，室温培育平板10分钟。读取各孔540nm的吸光度，根据标准曲线计算硝酸盐数值。 
用HMG1刺激小鼠巨噬细胞 的Taqman分析：通过冲洗正常C57BL/6小鼠的股骨收集小鼠骨髓。然后在补加了10％胎牛血清(FBS)和50ng/mlM-CSF的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养分离的骨髓细胞24小时，收集不粘附细胞，在T-75培养瓶(1×107个细胞/15ml/瓶)中利用补加了10％FBS和50ng/ml M-CSF的完全DMEM培养6天。在第6天收集粘附细胞，其与5ng/ml MCSF再接种入96-孔板(1×105个细胞/200μl/孔)中含10％FBS的α-MEM中培养过夜。 
将培养基更换为α-MEM，培育2小时，然后刺激饥饿细胞。在室温将HMGB1(大肠杆菌产生的重组CBP-HMGB1融合蛋白，10μg/ml)、小鼠-RAGE-Fc或人-RAGE-Fc融合蛋白和α-MEM配制的100μg/ml各种阻断试剂预先混合20分钟，然后向细胞中加入100μl此混合物，37℃培育2小时。然后除去上清液，用Ambion的MagMAXTM-96总RNA分离试剂盒提取RNA。用SuperScriptTM III和寡聚(dT)引物(Invitrogen)将所有回收的RNA用于逆转录酶(RT)反应来合成cDNA。利用ABI Prism7700或7000将1μl或2μl得到的cDNA用于实时定量PCR分析(TaqMan)。 
6.3.2结果 
图6A-B显示了几种抗体的代表性HMG1-诱导细胞因子释放滴定曲线。计算所检测各抗体的IC50值(见表1)。也测试到少数抗体能阻断天然活化的HMG1(得自LPS刺激的THP-1细胞，见上文)。E11、S16和S17连同RAGE-Fc 融合蛋白能阻断天然活化的HMG1诱导IL-6释放，而S6、S13、G4和G9效力较低(图6C)。这些研究和未显示数据的许多其它研究的结果总结于表1。几种抗体看来明显能在低抗体浓度抑制细胞因子释放。迄今为止检测的抗体中，S6是IL-1β、TNF-α、IL-6和NO释放的最佳抑制剂，而G4是IL-12的最佳抑制剂。应注意已检测的所有抗体不都能抑制所有细胞因子释放。也检测到少数抗体在分离的小鼠巨噬细胞(mM
Figure S05841546020070606D00088150326QIETU
)中能抑制rHMG1-诱导的细胞因子基因表达。E11、G2和G4也能明显降低HMG1-诱导的IL-1b基因表达(图7，左图和表1))。G2也能明显降低HMG1-诱导的TNF-α基因表达(图7，右图和表1)。选择几种抗体作进一步分析以测定它们对HMG1与细胞表面受体结合的作用。 
6.4实施例4 
抗-HMG1抗体阻断HMG1与细胞表面受体的结合 
RAGE和TLR4均已鉴定为HMG1的假定受体。为证明人抗-HMG1抗体能阻断HMG1与一种或多种这些假定受体相互作用，在ELISA试验中检验了几种人抗-HMG1抗体能否阻断HMG1与RAGE-Fc融合体结合(图8)和/或它们在细胞受体***中能否阻断HMG1-诱导TLR4激活(图9)。此外，也证明人抗-HMG1抗体能特异性阻断HMG1与THP-1细胞的细胞表面结合(图10)。 
6.4.1材料与方法 
HMG1与THP-1细胞结合：用PerkinElmer的Eu-标记试剂盒标记重组大鼠HMGB-1。HMGB-1与Eu的摩尔比是1：5。按照ATCC方法培养THP-1。收集细胞，将其以1×106/ml的浓度悬浮在含有1×DELFIA L*R结合缓冲液(PerkinElmer)、50％DELFIA稳定剂(PerkinElmer)和0.05％叠氮钠的试验缓冲液中。将100μl细胞(1×105)加入96孔细胞培养平板的各孔中。4℃轻摇培育平板1小时。将含2nM铕标记的HMGB-1的试验缓冲液与各种浓度的(333、166.5、83.25、41.6、20.8、10.4和5.2nM)人抗-HMGB1抗体E11或G2或可溶性人RAGE-Fc混合，向各孔中分别加入100μl该混合液。4℃轻摇培育1小时后，1200rpm离心5分钟用1x L*R洗涤缓冲液(PerkinElmer)洗涤细胞四次。向各孔中加入200μl增强溶液以解离和增强Eu发出的615nm荧光。用Wallac Victor荧光计检测荧光。试验以一式三份进行，人抗体R3-47用作阴性 同种型对照。 
通过ELISA(检测)HMG1与RAGE-Ig结合：向ELISA平板的各孔中以50μl/孔加入PBS配制的5μg/ml RAGE-Fc融合蛋白，4℃培育过夜。然后在37℃用200μl5％牛奶封闭平板1小时，用PBS/吐温洗涤三次。(加入)50μl/孔稀释的HMGB1。对于剂量曲线，HMGB1浓度始于PBS配制的4ug/ml。为(检测)抗体阻断，预先在另一平板中培育HMGB1与人抗-HMG1抗体或缓冲液，然后转移至RAGE-包被的平板。然后在室温培育各平板2小时，洗涤三次。为检测与固定的RAGE-Fc结合的任何HMG1，向各孔中加入1ug/ml生物素化小鼠抗-HMG1mAb(10D4、4H11、3E10和5C12)抗体(Ab)，总Ab为：4ug/ml，室温培育平板1小时。然后洗涤平板，向各孔中加入链霉亲和素-HRP，培育15分钟。然后洗涤平板三次，拍干。加入100μl TMB显色液，读取板650nm读数。数值计算为单用HMG1抑制(等于0％抑制)的百分比。图9和表1所总结的数据表示两次独立实验的平均值。 
TLR4激活试验：将稳定表达HuTLR4和CD14的293细胞(Invitrogen)以2×104/孔接种于96孔板中含10％FCS的100μl DMEM中，过夜。然后如试剂盒所示用NF-κB/Luc(Stratagene)萤光素酶报道构建物转染细胞24小时。以100μl/孔向细胞中加入HMGB1和抗-HMGB1的混合物，过夜。然后检测萤光素酶活性以反映TLR4激活(Promega)。 
6.4.2结果 
这些研究证明在测试条件下几种测试的抗体(例如，G2、G4、S10、S16、S2和S6)抑制了HMG1与RAGE结合至少35％，两种测试的抗体，G2和G4抑制了结合约75％(图8和表2)。几种抗体(例如，G9、G12、G16、S14等，见表1)不抑制RAGE结合。E11和G20能抑制HMG1激活TLR4(图9和表1)。此外，E11和G2人抗-HMG1抗体均能阻断HNG1和THP-1细胞结合(图10和表1)。迄今为止用两种试验测试的抗体中无一显示能同时阻断RAGE结合与TLR4激活。然而，E11能阻断TLR4激活和HMG1与THP-1细胞结合。选出几种抗体作进一步分析以测定它们在体内对炎性反应的作用(见下文)。 
实施例5
抗-HMG1抗体在盲肠结扎和穿孔(CLP)模型中抑制脓毒症 
为证明人抗-HMG1抗体能抑制脓毒症的致死率，我们建立了小鼠脓毒症并监测了几种抗体治疗方案的存活率。对小鼠进行导致多种微生物腹膜炎和脓毒症的盲肠结扎和穿孔(CLP)，这是通过对外科手术形成的盲肠憩室穿孔导致脓毒症的特征充分鉴定的模型(Fink和Heard，同上；Wichmann等，同上；和Remick等，同上)。将用几种人抗-HMG1抗体治疗小鼠的存活率与用同种型对照抗体治疗小鼠的作比较。几种人抗-HMG1抗体，包括G4、S6和S16在CLP模型中证明有明显保护作用(图11A-D和表1)。 
6.4.3材料与方法 
脓毒症中的抗-HMGB1：为建立活的腹腔内感染和脓毒症，如上所述对Balb/C小鼠(每组9-11只)实施CLP方法(Fink和Heard，1990，J Surg Res，49：186-196；Wichmann等，1996，J Surg Res，65，109-114)。肌肉内注射***(75mg/kg，Fort Dodge Laboratories，Fort Dodge，IA)和甲苯噻嗪(20mg/kg，Boehringer Ingelheim)麻醉后，作15-mm中线切口暴露盲肠。距尾端5.0mm结扎后，用22-号针头穿刺盲肠端部一次，挤出少量粪便(1-mm长)。将盲肠放回其正常腹腔内位置，利用两层连续缝合闭合伤口。手术30分钟后，所有动物接受盐溶液(0.9％皮下，20ml/kg体重)复苏和一剂量抗生素(每只小鼠皮下注射200μl无菌盐水配制的0.5mg亚胺培南)(Primaxin，Merck)。 
在手术后24和48小时腹膜内给予抗-HMG1抗体或同种型对照抗体(50μg/小鼠，200μl体积)。在某些后续实验中，在手术后24小时腹膜内给予抗-HMG1抗体或同种型对照抗体(8mg/kg)(图11C-D)。这些实验采用盲法，外科医师随机分笼，而由另一研究人员给予编号的抗体。每日两次监测小鼠的存活率，共14天。图11A和11B显示术后24和48小时以50μg/小鼠递送抗体的几次代表性实验的存活率曲线。图11C显示手术后24小时以8μg/kg递送抗体的几次代表性实验联合得到的存活率曲线。测试了手术后24小时以8mg/kg给予的其它几种抗体和寡克隆抗体库(图11D)。 
6.4.4结果 
这些研究证实人抗-HMG1抗体被动免疫垂危脓毒症小鼠具有保护作用。具体地说，人抗-HMG1抗体S6、S16、E11和G4在CLP模型中具有保护作用(见 图11A-D)。在几项研究中，第9天的存活率优于第14天的(图11B)。长期存活率的这种差异可能是因为人抗体在小鼠***中半衰期降低。然而，用人抗-HMG1抗体治疗的大多数小鼠不仅延迟了死亡，而且对致命的脓毒症赋予了完全的保护作用。抗-HMG1抗体S6在此模型中得到最广泛研究，其在许多实验中可再现地提供至少30％的保护作用(代表性累积数据见图11C)。 
6.5实施例6 
HMG1在几种炎性病症动物模型中上调 
在人脓毒症/脓毒症休克期间血清HMG1水平显示升高。我们检测了许多炎性疾病的不同动物模型中HMG1蛋白和/或基因表达的水平，包括几种关节炎模型、急性肺损伤和腹膜炎(模型)。在迄今为止检测的所有模型中，我们发现HMG1水平随疾病进展而升高。此外，发现几种细胞因子和/或假定的HMG1受体分子的水平也升高。 
6.5.1材料与方法 
诱导炎性疾病：诱导各疾病模型所用方法的详述请见下文。检测了诱导疾病而未治疗动物的HMG1和各种细胞因子水平，与正常动物作比较。 
被动CIA小鼠的HMG1水平：在第10天收集正常或被动CIA小鼠的前爪，液氮快速冷冻，-80℃保存直至检测。将关节样品和裂解缓冲液加入预先装有专用裂解基质A颗粒(Q biogene)的耐冲击2ml试管中。用
Figure S05841546020070606D000911
匀浆器匀浆关节，然后离心。收集上清液，采用MesoScale技术(Meso Scale Discovery)通过ELISA测定HMG1水平。图12A所示数据是各组5只爪子的平均值。 
主动CIA小鼠的Taqman分析：在第35天收集正常或主动CIA小鼠的前爪和后爪，液氮快速冷冻，-80℃保存直至检测。将关节样品和裂解缓冲液加入预先装有专用裂解基质A颗粒(Q biogene)的耐冲击2ml试管中。用
Figure S05841546020070606D000912
匀浆器匀浆关节，按照生产商的使用说明书利用Qiagen RNA酶迷你试剂盒或RNA STAT-60从匀浆液制备RNA。用SuperScriptTMIII和寡聚(dT)引物(Invitrogen)将所有回收的RNA用于逆转录酶反应来合成cDNA。利用ABI Prism7700或7000将1μl或2μl cDNA用于实时定量PCR分析(TaqMan)。分别检测后爪和前爪中HMGB1和几种假定的受体分子：RAGE、TLR2、TLR4和TLR9 的相对基因表达(图12B)。也分别检测了后爪和前爪中几种细胞因子：IL-1b、IL-6和TNF-a的相对基因表达(图12C)。将正常小鼠中各分子的基因表达设置为1，对各分子的相对基因表达作图。各分子下的数字表示其数值。 
AIA大鼠的HMG1水平：在第0、5、10、15和20天收集AIA大鼠的后爪，液氮快速冷冻，-80℃保存直至检测。采用与上述被动CIA小鼠所用相同的方法处理和检测AIA关节。关节匀浆液中HMG1水平对时间作的图见图12D(右上图)。也对疾病进展的两个关键指标，关节炎症和体重丧失作了图(分别是左上图和左下图)。 
金黄色葡萄球菌攻击后小鼠血清中的HMG1和细胞因子水平：在用金黄色葡萄球菌攻击后第2、8和12小时收集小鼠血清。采用MesoScale技术(MesoScale Discovery)通过ELISA测定HMG1、IL-1b和TNF-a水平。HMG1、IL-1b和TNF-a的水平对时间作图(图12E)。应注意HMG1和细胞因子所用的比例尺不同(分别是右轴和左轴)。单用半乳糖胺攻击或未攻击小鼠的HMG1或细胞因子未显示有相似增加(数据未显示)。 
ALI小鼠BAL液中的HMG1水平：用PBS(对照)和LPS(肺损伤)攻击小鼠后，在所指示时间收集小鼠的BAL液体，通过MesoScale ELISA测定HMG1的水平。HMG1水平对时间作图(图12F，左图)。存在的细胞总数(疾病进展的指标)也对时间作图(图12F，右图)。 
治疗后AIA大鼠的HMG1水平：如上所述处理治疗后(见下文实施例9)AIA大鼠的后爪，通过MesoScale ELISA测定HMG1、IL-6和TNF-a的水平。 
MesoScale ELISA：简言之，用HMGB1或细胞因子(例如，IL-1b、TNF-a、IL-6等)的捕捉抗体预包被平板，用MSD封闭缓冲液(MSD，目录号R93AA-1)封闭1小时。将20μl体积的标准品(用合适的样品缓冲液稀释，例如，正常小鼠的BAL液、血清或关节匀浆液)和样品加入平板。将20ul第一抗体和检测抗体的混合物加入各孔，室温振荡培育4小时。然后洗涤各板，加入读数缓冲液(MSD，目录号R92TD-2)，用Sector成像仪6000读数。用于HMG1检测的第一抗体是亲和力兔抗-HMGB1多克隆抗体(Becton Dickinson Biosciences，目录号556528)，检测抗体是山羊抗-兔MSD检测抗体(MSD，目录号R32AB-1)。 
6.5.2结果
检测了3种关节炎模型。在各模型中，发现关节的HMG1水平随疾病进展同时升高。在被动CIA小鼠中，HMG1水平在第10天升高约10倍(图12A)，此时观察到广泛的关节炎症(见下文和图13A)。在主动CIA小鼠中，也观察到HMG1、已知参与炎性疾病的几种细胞因子和几种受体的水平随疾病的进展而同时升高(图12B-C和15A)。前爪和后爪中RAGE受体显示升高约2倍，TLR2和TLR4受体在前爪中显示分别中度升高2和3倍，后爪中分别惊人地升高19和17倍。TLR9水平只在后爪中升高(7倍)。细胞因子IL-1b、IL-6和TNF-a的表达水平显示相似的倾向，前爪中分别升高39、145和7倍，在后爪中分别惊人地升高247、361和76倍。在AIA大鼠模型中，关节匀浆液中HMG1水平从检测不到至第15天升高到200ng/ml以上，此时关节炎症最严重(比较图12D，左图和右图1。当炎症在约20天减轻时，也观察到HMG1水平相应降低。 
也检测了其它两种疾病模型。图12E显示在金黄色葡萄球菌腹膜炎模型中HMG1水平从攻击后约2小时开始随时间一致性升高。TNF-a和IL-6水平在攻击后立即急剧升高，其中TNF-a水平在2小时达到峰值，随后降低，然后在攻击后约9小时再次升高。IL-6水平在约2小时达到峰值，然后通常维持稳定，随后只有略微升高。在急性肺损伤小鼠模型中，BAL液中HMG1水平从检测不到至LPS攻击后48小时升高到1500ng/ml以上(图12F，左图)。这种HMG1水平升高与LPS攻击小鼠的BAL液中细胞渗出(细胞总数)增加相关(比较图12F的左图和右图)。用PBS缓冲液攻击的小鼠的BAL液中HMG1水平检测不到(图12F左图1。这些研究表明在许多炎性疾病模型中HMG1水平随疾病进展而升高，所述模型包括三种关节炎模型、一种急性肺损伤模型和一种腹膜炎模型。选择几种人抗-HMG1抗体用于这些模型的其它研究来证实抗-HMG1抗体可用于HMG1水平升高相关的其它炎性疾病。 
我们也检测了用PBS、一种人同种型对照(HuIgG)、G4、A-框-Fc融合体和氨甲喋呤(MTX)之一联同HuIgG或Renbrel或G4治疗后AIA大鼠关节中的HMG1、IL-6和TNF-a水平。图12G显示了各种治疗后HMG1(左上图)和IL-6(左下图)的水平。用HuIgG或A-框-Fc治疗未明显降低HMG1或IL-6水平。单用G4与联用MTX和HuIgG或Renbrel显示对HMG1和IL-6水平的降低作用相似，然而联用MTX和G4将该水平降至正常。G4也明显降低了TNF-a的水平， 虽然MTX+HuIgG显示对此细胞因子的降低作用更强(图12G，右上图)。 
6.6实施例7 
抗-HMG1抗体抑制被动性胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型疾病进展的严重性 
为证实抗HMG1的人抗体是有用的治疗剂，我们在被动小鼠模型中测试了一组人抗-HMG1抗体治疗胶原诱导关节炎(的效果)。对于该系列实验，我们利用了在临床关节炎发作前开始治疗的预防模型。在此项研究中，我们直接比较了抗-HMG1抗体的效力和已知治疗方案，(即)单用Renbrel(可接受用于啮齿类模型***中的EnbrelTM替代分子)或联用RenbrelTM和氨甲喋呤(MTX)的效力。 
我们在本文中首次证实抗HMG1的抗体在被动CIA小鼠RA模型中显示有预防效力。事实上，在减轻爪炎症和减少骨丧失和软骨损伤中，抗-HMG1抗体G4显示比单用Renbrel更有效，而抗-HMG1抗体S6甚至比MTX/Renbrel治疗更有效。 
6.6.1材料与方法 
被动性胶原诱导关节炎(CIA)的诱导：为建立关节炎模型，使用6-8周龄的雄性DBA/1J小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，缅因州)。一般每组使用5-8只小鼠。在第0天，在尾部静脉内注射2mg/小鼠的抗-胶原mAb混合物(Chemicon，ECM1100号，10mg/ml)来免疫小鼠。然后在第3天对小鼠腹膜内注射50μg LPS/小鼠。各实验有如下所示几组：实验1有组A-E，实验2有组G-J和组L-N)。其它组小鼠(组F、K和O)不治疗作为正常对照。给予如表4所示的以下治疗方案。 
表4.CIA小鼠模型的治疗组 
Figure S05841546020070606D000941
监测疾病：在第0天开始，每天观察所有动物，通过给每只爪作定性临床评分评估它们的疾病状况。每天，对每只动物的4只爪进行临床疾病状况评分。评分由两名观察人员进行，至少一人盲法。此外，在对爪评分之时称重各只小鼠跟踪体重变化(见图6A和6D)。 
踝/腕/中腿(midfoot)/前腿的评分等级如下： 
0＝正常       2＝严重肿胀 
1＝有限的肿胀 3＝最严重肿胀不能承载体重 
各爪4趾的评分等级分级为涉及或不涉及，即1或0。例如，最严重涉及的左后爪评分为：踝＝3、中腿＝3、趾＝4(临床评分＝10分)。我们对各爪重复评分，计算出评分总和。在第14天或在总临床评分达到40后马上无痛处死小鼠，进行关节的组织学评估。 
组织学：如Badger et al.，2001，Arthritis&Rheumatism44:128-37所述评估各小鼠后肢胫骨关节，对组织学变化评分。简言之，在第32天处死小鼠，将后肢用***固定，用Cal-Rite(Richard-Allen Scientific，Kalamazoo，MI)脱钙。然后从腿的胫骨远端骨干处切下爪子。常规处理后，包埋样品，切取通过胫骨和距骨(talartarsal)关节面中段的冠状切片。用Safranin O对切片染色，用fast Green复染(数据未显示)。 
盲法观察人员分别对骨和关节软骨/关节周围软组织的组织学特征评分(图13B和13C)。骨评分分级如下：0＝正常，1＝骨膜下纤维化同时形成骨膜编织骨(periosteal woven bone)，2＝骨髓炎症，骨内膜和小梁骨重吸收，3＝广泛的炎症，4＝肉芽组织替代了骨髓，剩余少许小梁骨，皮层轮廓广泛破坏。软骨/滑膜评分分级如下：0＝正常，1＝滑膜和周围组织有轻微淋巴细胞炎症，2＝滑膜纤维化和水肿，关节腔部分淋巴细胞渗出，软骨有较小血管翳浸润，3＝关节腔广泛渗漏，周围和软骨下软骨浸润，软组织广泛纤维化伴有局部坏死液 化。 
6.6.2结果 
进行了几次实验来证实在被动CIA小鼠模型中用HMG1抗体治疗能预防或降低疾病的严重性。在实验1中，小鼠注射LPS后第3天开始用抗-HMG1抗体S6或G16(0.2mg/小鼠)治疗。小鼠在13天期间总共接受6个剂量。同时，对照小鼠接受人mAb(0.2mg/小鼠)。最后一组接受MTX(0.2mg/小鼠，12天期间接受4个剂量)和Renbrel(0.2mg/小鼠，10天期间接受2个剂量)组合治疗。治疗开始后，每天评估关节炎的发展情况。图13A显示了研究期间各治疗组的爪炎症评分。图13B显示了CIA预防模型的骨、软骨和炎症的组织学总评分。重要的是应注意到此模型中，前爪疾病状态是更好的预测指标，因为后爪受影响程度不同。图13C只是前爪的骨、软骨和炎症组织学评分。给予人IgG对关节炎发展没有作用。然而，与对照小鼠相比，用抗-HMG1S6抗体治疗小鼠骨、软骨和总炎症评分大大降低。令人惊奇的是，用抗-HMG1S6抗体治疗小鼠明显好于用MTX/Renbrel联合治疗的小鼠(图13B和13C)。 
疾病进展的另一临床特征是体重丧失。对照小鼠的相对体重评分显示了研究期间为净降低。虽然用抗-HMG1S6抗体治疗的小鼠的临床评分显示出明显保护作用，但该组小鼠也显示体重净降低。然而，抗-HMG1S6抗体治疗的小鼠体重丧失低于对照组。MTX/Renbrel治疗的小鼠也显示在研究早期体重净减少，然而在结束时体重赶上了未治疗小鼠(图13D)。这些结果证实在疾病发作前给予抗-HMG1抗体能有效保护关节免遭破坏和其它症状。特别是，这些结果表明在CIA小鼠中抗-HMG1S6抗体治疗在减轻疾病严重性方面具有深远作用。应注意该实验可能不代表S6在关节炎模型中具有保护作用。虽然抗-HMG1S6抗体治疗在脓毒症小鼠CLP模型中反复显示优秀的保护作用(见以上的实施例5)，但这些结果在关节炎模型中更易变。此变异可能反映了抗体制品、动物模型、抗体的药物动力学和其它类似参数的差异。 
在实验2和3中，小鼠注射LPS后第3天开始用抗-HMG1抗体G4(10mg/小鼠)治疗。在实验2中，小鼠在13天期间总共接受6个剂量，在实验3中同一时期小鼠接受总共4个剂量。同时，对照小鼠接受人mAb(10mg/小鼠)或PBS。实验2中，最后一组接受Renbrel(剂量与G4的相同)。治疗开始后，每 天评估关节炎发展情况。图14A-B显示了研究期间爪炎症的评分。从实验2明显可看出(图14A)抗-HMB1抗体G4在减轻爪炎症方面比单用Renbrel更有效(右图)。实验3的数据(图14B)显示抗-HMB1抗体G4可以较低频率给予而仍能(减轻)爪炎症。G4抗体在该关节炎模型和其它几种关节炎模型中反复证明有明显保护作用(见下文实施例8和9)。 
6.7实施例8 
抗-HMG1抗体抑制主动性胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型疾病进展的严重性 
为证实抗HMG1的人抗体是有用的治疗剂，我们在小鼠模型中测试了一组抗-HMG1抗体能否治疗主动性胶原诱导关节炎。对于该系列实验，我们利用了在临床关节炎发作前开始治疗的预防模型。在此项研究中，我们比较了抗-HMG1抗体的作用和Renbrel的作用。 
我们在本文中首次证实抗HMG1抗体在主动性CIA小鼠RA模型中显示有减轻爪炎症和减少体重丧失的作用。事实上，在减轻爪炎症中，抗-HMG1抗体G4显示比单用Renbrel更有效。 
6.7.1材料与方法 
主动性胶原诱导关节炎(CIA)的诱导：使用6-8周龄雄性DBA/1J小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，缅因州)。在第0天，异氟烷麻醉小鼠在尾根部真皮内注射溶解于50μl0.1N乙酸和用等体积完全弗氏佐剂(Chondrex，Redmond，WA)乳化的200μg II型牛胶原(CII)。三周后在第21天，给予小鼠第二次相似的真皮内注射溶解于25μl0.1N乙酸和用等体积不完全弗氏佐剂(Difco，底特律，MI)乳化的100μg CII。 
监测疾病：在第14天开始，每天观察所有动物，通过给每只爪作定性临床评分来评估它们的疾病状况。每天，对每只动物4只爪进行临床疾病状况评分。评分由两名观察人员进行，至少一人盲法。此外，在对爪评分之时称重各只小鼠以跟踪体重变化。 
踝/腕/中腿/前腿的评分等级如下： 
0＝正常       2＝严重肿胀
1＝有限的肿胀 3＝最严重肿胀且不能承载体重 
各爪4趾的评分等级分级为涉及或不涉及，即1或0。例如，最严重涉及的左后爪评分为：踝＝3、中腿＝3、趾＝4(临床评分＝10分)。我们对各爪重复评分，计算了评分总和。在第36天或在总临床评分达到40后马上无痛处死小鼠，进行关节的组织学评估。 
6.7.2结果 
我们在主动CIA模型中检测用人抗-HMG1抗体治疗是否能预防或减轻CIA的疾病严重性。在第21天开始，每3天用抗-HMG1抗体G4、同种型对照抗体或Renbrel(10mg/kg)治疗小鼠。每天评估关节炎发展情况。图15A显示了研究期间各治疗组的爪炎症评分。给予人IgG对关节炎的发展没有作用。然而，与对照小鼠相比，抗-HMG1G4抗体治疗的小鼠炎症评分大大降低。令人惊奇的是，用抗-HMG1G4抗体治疗的小鼠明显优于用Renbrel治疗的小鼠(图15比较左图和右图)。 
在此模型中，疾病进展的另一临床特征是体重丧失。对照小鼠的相对体重评分显示在研究期间为净降低。虽然用抗-HMG1G4抗体治疗的小鼠的临床评分显示具有明显保护作用，但该组小鼠也显示体重净降低。然而，抗-HMG1G4抗体治疗的小鼠体重丧失低于对照组。这些结果证实在疾病发作前给予抗-HMG1抗体能有效保护关节免遭破坏和其它症状。特别是，这些结果表明在主动CIA小鼠模型中抗-HMG1G4抗体治疗在减轻疾病严重性方面具有深远作用。 
6.8实施例9 
抗-HMG1抗体抑制佐剂诱导关节炎(AIA)大鼠模型疾病进展的严重性 
我们还在佐剂诱导的关节炎(AIA)大鼠模型中检验了人抗-HMG1抗体G4。对于该系列实验，我们采用在临床关节炎发作前开始治疗的预防模型。在此项研究中，我们比较了抗-HMG1抗体的作用和Renbrel的作用。 
我们在本文中首次证实抗HMG1的抗体(G4)在AIA大鼠RA模型中显示有减轻爪炎症的作用。事实上，在减轻爪炎症中，抗-HMG1抗体G4显示比单用Renbrel更有效。抗-HMG1G4(治疗)的大鼠观察到临床评分降低约34％，而 Renbrel治疗的大鼠观察到只降低约11％。此外，我们证实联用氨甲喋呤和G4在降低爪炎症评分中比联用氨甲喋呤和Renbrel更有效。 
6.8.1材料与方法 
佐剂诱导的关节炎(AIA)的诱导：使用6-8周龄雄性DA大鼠(Harlen)。在第0天，异氟烷麻醉大鼠在尾根部真皮内注射与100μl不完全弗氏佐剂(Difco，底特律，MI)混合的0.75mg丁酸分枝杆菌(mycobacterium butyricum)(Difco，0640-33-7号)。给予如表5所示的以下治疗方案。 
表5.AIA大鼠模型的治疗组 
  
组号 测试物质 剂量 动物总数
1 正常   6
2 PBS   6
3 HuIgG(R3-47) 10mg/kg 6
4 MTX+HuIgG(R3-47) 0.8mg/kg MTX 10mg/kg HuIgG 6
5 单用Renbrel 2.5mg/kg 6
6  MTX+Renbrel           0.8mg/kg MTX2.5mg/kg   Renbrel      6 
7 抗-HMGB1(G4) 10mg/kg 6
8 MTX+抗-HMGB1mAb(G4) 0.8mg/kg MTX10mg/kg G4   6
9 A-Box/Fc 10mg/kg 6
在第0-15天，每3天给予10mg/kg人抗-HMG1抗体G4、A-框-Fc融合体和huIgG同种型对照。在第0-15天，每6天给予0.8mg/kg氨甲喋呤，对于治疗组5，在第0-15天，每2天给予2.5mg/kg的Renbrel，或对于治疗组6，在第0-15天，每3天给予4mg/kg的Renbrel。 
监测疾病：在第6天开始，每天观察所有动物，通过给每只爪作定性临床评分来评估它们的疾病状况。每天，对每只动物4只爪进行临床疾病状况评分。评分由两名观察人员进行，至少一人是盲法。此外，在对爪评分之时称重各只 小鼠以跟踪体重变化。 
踝/腕/中腿/前腿的评分等级如下所示： 
0＝正常                 1＝刚可感觉到肿胀 
2＝有限的肿胀但不严重    3＝严重肿胀 
4＝最严重肿胀且不能承载体重 
各爪4趾的关节评分分级为涉及或不涉及，即1或0。例如，最严重涉及的左后爪评分为：踝＝4、中腿＝4、MTP＝4、PIP＝4、DIP＝4(20分)。我们对各爪重复评分，计算了评分总和。在第21天或在总临床评分达到80后马上无痛处死大鼠，进行关节的组织学评估。 
6.8.2结果 
我们证实人抗-HMG1抗体G4能预防或降低大鼠AIA的严重性。在第21天开始每3天用10mg/kg的PBS、抗-HMG1抗体G4、同种型对照抗体(HuIgG)或每2天用2.5mg./kg的Renbrel治疗AIA大鼠。此外，联用氨甲喋呤和其它几种治疗剂，包括Renbrel、G4或HuIgG.治疗AIA大鼠。也用HMG1A-框-Fc融合蛋白治疗AIA大鼠。每天评估关节炎发展情况。图16A显示研究期间各抗体或单用Renbrel治疗组以及PBS和正常对照组的爪炎症评分。给予人IgG对关节炎的发展没有作用。然而，与对照动物相比，用抗-HMG1G4抗体治疗的动物炎症评分大大降低。令人惊奇的是，用抗-HMG1G4抗体治疗的动物明显优于单用Renbrel治疗的动物(图16A比较左图和右图)。抗-HMG1抗体G4显示比单用Renbrel更有效。抗-HMG1G4(治疗)的大鼠观察到临床评分降低约30％，而Renbrel治疗的大鼠观察到只降低约25％。 
图16B显示比较包括联合治疗组与单用抗体和HMG1A-框-Fc融合蛋白治疗组的爪炎症评分。单用A-框-Fc融合蛋白降低了炎症评分，但不如单用G4有效。与单用G4相比，联用Renbrel降低了炎症评分。MTX可能对这种降低作用贡献最大，因为MTX和HuIgG对照抗体联用显示与MTX/Renbrel联用的炎症减轻作用相似。然而，MTX和G4联用甚至比MTX/Renbrel联用更有效，能将炎症评分降低至几乎正常。各指治疗组中观察到的爪炎症评分降低与AIA大鼠关节中观察到的HMG1、IL-6和TNF-a水平降低相关(见图12G)。
6.9实施例10 
抗-HMG1抗体提高金黄色葡萄球菌腹膜炎小鼠模型的存活率 
我们也在观察到HMG1血清水平升高的严重腹膜炎小鼠模型(见上文)中检验了几种人抗-HMG1抗体。在本文中，我们证实与对照相比，用人抗-HMG1抗体治疗能提高存活率约30％。 
6.9.1材料与方法 
诱导腹膜炎：使用4-6周龄的雌性BALB/c小鼠。用与半乳糖胺预混合的热灭活金黄色葡萄球菌腹膜内攻击小鼠进行的初布研究显示LD100在1×107和1×109个细胞之间(数据未显示)。为测定HMG1水平，在第0天腹膜内给予200μl PBS配制的和20mg半乳糖胺预混合的约109个热灭活金黄色葡萄球菌(菌株8325-4)细胞或单用半乳糖胺。第三组不攻击。攻击后2、8和12小时通过吸入CO2无痛处死小鼠，心脏穿刺收集血液。对于抗体治疗研究，在第0天腹膜内给予200μl和20mg半乳糖胺预混合的约109个热灭活金黄色葡萄球菌(菌株8325-4)细胞，攻击的30分钟前腹膜内给予表6所示100μl体积的以下治疗剂。 
表6.腹膜炎模型的治疗组 
  
    组号         测试物质 剂量            1×LD100 半乳糖胺剂量        量             治疗         治疗时间 动物    总数
A 金黄色葡萄球菌 1×109 20mg 无   30
B 无 无 20mg 无   15
C 无 无 无 无   7
1 金黄色葡萄球菌 1×109 20mg PBS -30分钟 10
 2               金黄色葡萄球菌       1×109     20mg R347      200ug        -30分钟   10
 3               金黄色葡萄球菌       1×109     20mg G4-12-3       200ug          -30分钟   10
临测疾病：从第1天开始持续到第14天，每天观察动物的发病迹象(活动严重减少、毛皮起皱纹和/或最高体重丧失>20％)和死亡率。每周称重动物两次。无痛处死显示有明显患病迹象的动物。第15天无痛处死所有存活的动物(如果观察到明显患病则立即无痛处死)。 
6.9.2结果 
也在革兰阳性细菌诱导的严重败血症模型中检验了人抗-HMG1抗体，该模 型用致死剂量的热灭活金黄色葡萄球菌攻击小鼠。在此模型中，用PBS或抗体同种型对照(R347)治疗的小鼠无一存活。与用抗HMG1的人抗体G4治疗的小鼠有27％存活(图17)相比，用E11治疗的小鼠有8％存活(数据未显示)。最早从治疗后24小时持续到整个研究期间均可观察到死亡率的差异。这些数据支持CLP研究(见上文)，表明人抗-HMG1抗体可用于治疗各种病原性生物诱导的脓毒症。 
6.10实施例11 
抗-HMG1抗体减少急性肺损伤相关的细胞渗出 
在脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)小鼠模型中检验了两种人抗-HMG1抗体。在本文我们首次证实与对照相比，用人抗-HMG1抗体治疗能降低总细胞渗出约40％(图18)。 
6.10.0材料与方法 
LPS诱导的ALI的诱导：在第1天以5-10μg/小鼠的剂量将50-100μl的LPS(大肠杆菌菌株0111:B4...Sigma，St.Louis，MO)鼻内给予异氟烷(BaxterPharmaceuticals，Deerfield，IL)麻醉的成年BALB/c小鼠。为测定HMG1水平，在给予LPS后4、8、24、32和48小时通过吸入CO2无痛处死小鼠，收集细支气管肺泡灌洗液(Lavarge)(BAL)和其它样品进行蛋白质分析和组织病理学(检验)。治疗方案是，给予LPS24小时后，以10mg/kg的剂量腹膜内给予100μl抗-HMGB1抗体、HMG1A-框Fc融合蛋白或对照。在第3天(给予LPS48小时后)，通过吸入CO2无痛处死小鼠，收集样品(BAL、血液和肺)用于分析。 
BAL样品收集：用装有导管的注射器以约0.8ml磷酸缓冲盐水(PBS，pH7.2，GIBCO，Rockville，MD)冲洗肺3次。收集的BAL样品在4℃以1,200rpm离心10分钟，收集上清液，-80℃保存用于蛋白质(例如，HMGB1)定量，重悬沉淀物中的细胞并转移至细胞载玻片(cytoslide)，固定，GIEMSA染色，借助显微镜目测BAL的细胞构成。 
6.10.2结果 
在鼻内给予LPS诱导的急性肺损伤模型中检验了人抗-HMG1抗体。在此模型中，与对照相比，HMG1A-框(HMG促炎作用的一种已知竞争性抑制剂) 仅降低渗出约23％。相反，与对照相比，G4和E11显示能将BAL液体中的总细胞渗出降低约37％-40％，表明抗-HMG1抗体可用于治疗急性肺损伤。 
6.11实施例12 
多发性硬化症(MS)病灶中HMGB1的染色模式 
利用G16人抗-HMGB抗体在人脑组织MS病灶中检测HMGB染色模式。检测了脱髓鞘和有许多活化小胶质细胞的病灶，以及主要是脱髓鞘有少数活化小胶质细胞和许多淋巴细胞的病灶。图19A显示用同种型对照抗体检测脱髓鞘和许多活化小胶质细胞的病灶背景染色水平低。利用人mAb G16在MS患者脑组织小胶质细胞的细胞质中检测到HMGB1。脱髓鞘和许多活化小胶质细胞的病灶显示小胶质细胞的细胞质和脱髓鞘间质中有广泛染色(图19B)。相反，当用人mAb G16检测时，主要是脱髓鞘有少数活化小胶质细胞和许多淋巴细胞的病灶显示很少或不染色(图19C)。这些结果加强了HMGB1作为胞外调节剂在炎症中的关键作用的认识，表明HMGB1可能参与MS的炎性过程。 
虽然出于清晰和理解的目的详细描述了以上发明，但在形式和细节中作出各种改变而不脱离本发明真实范围对于阅读了本文内容的本领域技术人员是显而易见的。例如，可以各种组合使用上述的所有技术和设备。如同每份出版物、专利、专利申请或其它文献单独表明出于所有目的纳为参考的程度一样，本申请引用的所有出版物、专利、专利申请或其它文献均出于所有目的全文纳为参考。此外，2004年10月22日提交的美国临时专利申请号60/620,726；2005年2月10日提交的60/651,512；2005年3月7日提交的60/658,572；2005年3月18日提交的60/662,944和2005年9月6日提交的60/713,712出于所有目的全文纳为参考。
序列表
<110>米迪缪尼股份有限公司(MedImmune，Inc.)
H.吴(Wu，Herren)
C.B.埃兰(Allan，Christian)
高长寿(Gao，Changshou)
L.-L.安(An，Ling-Ling)
P.基纳(Kiener，Peter)
毛素殽(Mao，Su-Yau)
A.科伊尔(Coyle，Anthony)
<120>抗HMGB1的高亲和力抗体及其用法
<130>HB601PCT
<150>60/620,726
<151>2004-10-22
<150>60/651,512
<151>2005-02-10
<150>60/658,572
<151>2005-03-07
<150>60/662,944
<151>2005-03-18
<150>60/713,712
<151>2005-09-06
<160>103
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>215
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
1               5                   10                  15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
            20                  25                  30
Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
                85                  90                  95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr
    130                 135                 140
Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val
                165                 170                 175
Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
            180                 185                 190
Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu
        195                 200                 205
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
    210                 215
<210>2
<211>215
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Thr Gly Lys Met Ser Ser Tyr
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        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
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65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
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Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr
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Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
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Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu
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Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp
        195                 200                 205
Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu
    210                 215
<210>3
<211>77
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Pro Thr Gly Lys Met Ser Set Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg
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    50                  55                  60
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65                  70                  75
<210>4
<211>74
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu
1               5                   10                  15
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Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
        35                  40                  45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
    50                  55                  60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
            100                 105                 110
Glu Ile Lys
        115
<210>6
<211>345
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gactccctgg ctgtgtctct gggcgagagg   60
gccaccatca actgcaagtc cagccagagt gttttataca gctccaacaa taagaactac  120
ttagcttggt accagcagaa accaggacag cctcctaagc tgctcattta ctgggcatct  180
acccgggaat ccggggtccc tgaccgattc agtggcagcg ggtctgggac agatttcact  240
ctcaccatca gcagcctgca ggctgaagat gtggcagttt attactgtca gcaatattat  300
agtactcctc ggacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaa                  345
<210>7
<211>120
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
            20                  25                  30
Met Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Gln Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Glu Gly Gly Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>8
<211>360
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ggttacatga tggtttgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctctcctt ctggtggcca gactggttat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagag  300
ggtgggagct acggggcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcaagc  360
<210>9
<211>109
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
            20                  25                  30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>10
<211>327
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga   60
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag  120
aaaccaggga aagcccctaa actcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc  180
ccctcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg  240
caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagtt acagtacccc tcggacgttc  300
ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaa                                      327
<210>11
<211>123
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>11
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Glu Val Gly Ala Thr Ser Gly Gly Thr Ala Phe Asp Ile
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>12
<211>369
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacgata tgtcttgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctctcctt ctggtggcta tactatgtat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagactcgag  300
gtgggagcta cttcgggggg tacggctttt gatatctggg gccaagggac aatggtcacc  360
gtctcaagc                                                          369
<210>13
<211>109
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>13
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn
            20                  25                  30
Ser Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Val Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser
                85                  90                  95
Tyr Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>14
<211>327
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>14
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gacaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga   60
gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt gttaacagca ggaacttagc ctggtaccag  120
cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atctatggtg catccaccag ggccactggc  180
atcccagaca ggttcagtgg cagtgtatct gggacagaat tcactctcac catcagcagc  240
ctgcagcctg atgattttgc aacttattac tgccagcaat ataacagtta tttcactttt  300
ggccagggga ccaagctgga gatcaaa                                      327
<210>15
<211>120
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Ser Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Trp Asp Tyr Asn Ser Gly Trp Tyr Tyr Asp His Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>16
<211>360
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>16
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt     60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtactcta tgctttgggt tcgccaagct    120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggctt tactaattat    180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac    240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggtgggac    300
tacaacagtg gctggtacta tgaccactgg ggccagggca ccctggtcac cgtctcaagc    360
<210>17
<211>112
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>17
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
            20                  25                  30
Ser Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Thr Pro Ala Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Arg His Asn
                85                  90                  95
Trp Pro Pro Gln Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
            100                 105                 110
<210>18
<211>336
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>18
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaagga   60
gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt gttagcagca cctacttagc ctggtaccag  120
cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atctatgaag cgtccaagag ggccacaggc  180
accccagcca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcag catcagcagc  240
ctagagcctg aagattttgc agtttattac tgtcagcacc gtcacaactg gcctccacag  300
tggacgttcg gccaagggac caaggtggag gtcaaa                            336
<210>19
<211>117
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Thr Glu Phe Tyr Asp Tyr Leu Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>20
<211>351
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>20
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt     60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacgata tgacttgggt tcgccaagct    120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttcc atctctcctt ctggtggcta tactaagtat    180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac    240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccgtgt attactgtac cacagaattc    300
tacgattacc tggacgtctg gggcaaaggg accacggtca ccgtctcaag c             351
<210>21
<211>209
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>21
Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr
1               5                   10                  15
Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro
            20                  25                  30
Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu
    50                  55                  60
Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr
65                  70                  75
<210>24
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>24
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg
            20                  25                  30
Ser Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Ala Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Ser Arg Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>25
<211>330
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>25
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga   60
gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt gttaggagca acttcttggc ctggtaccag  120
cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atatatggtg catccaggag ggccagtggc  180
atcccagaca ggttcagtgg cagtgggttt ggggcagact tcactctcag catcagcaga  240
ctggagcctg aagatttcgc agtgtattac tgtcagcagt atggtagctc acccaacact  300
tttggccagg ggtccagggt ggagatcaaa                                   330
<210>26
<211>121
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Gln Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly His Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala
    50                  55                  60
Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro
65                  70                  75                  80
Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys
                85                  90                  95
Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys
            100                 105                 110
Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr
    130                 135                 140
Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly
                165                 170                 175
Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu
            180                 185                 190
Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu
        195                 200                 205
Glu
<210>22
<211>77
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>22
Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg
1               5                   10                  15
Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu
            20                  25                  30
Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu
        35                  40                  45
Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp
    50                  55                  60
Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro Pro Lys Gly Asp Lys
65                  70                  75
<210>23
<211>75
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>23
Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe
1               5                   10                  15
Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys Ile Lys Ser Glu His Pro Gly
            20                  25                  30
Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu
        35                  40                  45
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp Gly Arg Gln Gly Lys Ile Ser Thr Val Asp His Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>27
<211>363
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>27
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cgttaccaga tgaattgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggcca tactcattat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatgga  300
cgacagggta aaataagtac ggttgaccac tggggccagg gaaccctggt caccgtctca  360
agc                                                                363
<210>28
<211>79
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>28
Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Leu Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys
1               5                   10                  15
Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile
            20                  25                  30
Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala
        35                  40                  45
Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys
    50                  55                  60
Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp
65                  70                  75
<210>29
<211>34
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>29
Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys
1               5                   10                  15
Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser
            20                  25                  30
Lys Lys
<2l0>30
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>30
Ala Gln Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn
            20                  25                  30
Asn Ala Val Ile Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Asn
                85                  90                  95
Leu Asn Gly Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>31
<211>333
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>31
gcacagagcg aattgactca gccaccctcg gtgtctgaag cccccgggca gagggtcacc   60
atctcctgtt ctggaagcac ctccaacatc ggaaataatg ctgtaatctg gtaccagcag  120
ctcccaggaa aggctcccaa actcctcatc tattatgatg atctgctgcc ctcaggggtc  180
tctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcaggct ccctggccat cagtgggctc  240
cagtctgagg atgaggctga ctattactgt gcatcatggg atgacaacct gaatggtccg  300
ctgttcggcg gagggaccaa gttgaccgtc cta                               333
<210>32
<211>122
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>32
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Lys Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Met Gly Leu Phe Asn Thr Gly Asn Ser Tyr Val Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>33
<211>366
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>33
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacaaga tgcagtgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctctcctt ctggtggctc tactgcttat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaatgggg  300
ctttttaata ctgggaattc ctacgttgac tactggggac agggaaccct ggtcaccgtc  360
tcaagc                                                             366
<210>34
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>34
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg
            20                  25                  30
Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr
                85                  90                  95
Ser Arg Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>35
<211>330
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>35
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga   60
gccaccctct cctgcagggc cagtcagagt gttaggagca gctacttagc ctggtaccag  120
cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atctatggtg catccaccag ggccactggc  180
atcccagaca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga  240
ctggagcctg aagattttgc agtgtattac tgtcagcagt atggtacctc acggtggacg  300
ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa                                   330
<210>36
<211>122
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>36
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Ser Arg Gly Tyr Ala Phe Asp Ile Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>37
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>37
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tcttacgata tgttttgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctctcctt ctggtggcta tacttattat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggctacga  300
tattttgact caaggggcta tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc  360
tcaagc                                                             366
<210>38
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>38
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Thr
            20                  25                  30
Ser Thr Tyr Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile His Gly Gly Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ala Thr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>39
<211>330
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>39
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggaaaga   60
gccaccctct cctgcagggc cagtgagagt cttaccagca cctacgtagc ctggtaccag  120
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tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa                                   330
<210>40
<211>119
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
            20                  25                  30
Met Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Ala
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ala Leu Set Thr Gly Ser Phe Trp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>41
<211>357
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>41
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tattacatga tgacttgggt tcgccaagct  120
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gctgactccg ctaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagccttg  300
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<210>42
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>42
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Ser Gly Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser
            20                  25                  30
Ser Arg His Phe Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Pro Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Tyr Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Met Lys
            100                 105                 110
<210>43
<211>330
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>43
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggggagagc   60
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<211>119
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>44
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly PheT hr Phe Ser Trp Tyr
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Lys Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Asp Leu Asp Ile Arg His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
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Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>45
<211>357
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>45
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<210>46
<211>109
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>46
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser
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Ile Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Phe Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Ser Val
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe
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Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>47
<211>327
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>47
gcacaagaca tccagatgac ccagtctccc tcttccgtgt ctgcatctgt gggagacaga   60
gtcaccatca cttgtcgggc gagtcaggat gttagcatct ggttagcctg gtatcagcag  120
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<210>48
<211>126
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Gly Leu Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Leu Asp Ala
            100                 105                 110
Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>49
<211>378
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>49
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacgata tgttttgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atctctcctt ctggtggcta tacgaagtat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac accgccatgt attactgtgc gagatcaggg  300
ttggattact atgatagtag tggttatctc gatgcttttg atatctgggg ccaagggaca  360
atggtcaccg tctcaagc                                                378
<210>50
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>50
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp
            20                  25                  30
Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>51
<211>330
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>51
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt gggagacaga   60
gtcgccatca cttgccgcgc aagtcagagc atcgacacct atttaaattg gtatcagcag  120
aaaccaggga aagcccctaa actcctgatc tatgctgcat ccaagttgga agacggggtc  180
ccatcaagat tcagtggcag tggaactggg acagatttca ctctcaccat cagaagtctg  240
caacctgaag attttgcaag ttatttctgt caacagagct actctagtcc agggatcact  300
ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa                                   330
<210>52
<211>125
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
            20                  25                  30
Met Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Gly Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Asn Trp Asn Tyr Ile Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Leu
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>53
<211>375
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>53
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattacatga tgggttgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctctcctt ctggtggcgg tactgtttat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggtggt  300
aactggaact acatatccta ctactactac tacctggacg tctggggcaa agggaccacg  360
gtcaccgtct caagc                                                   375
<210>54
<211>113
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>54
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu
            20                  25                  30
His Gly Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly
        35                  40                  45
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly
    50                  55                  60
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
65                  70                  75                  80
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met
                85                  90                  95
Gln Ser Leu Gln Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210>55
<211>339
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>55
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca ctctccctgc ccgtcacccc tggagagccg   60
gcctccatct cctgcagatc tagtcagagc ctcctgcatg gtaatggata caactatttg  120
gattggtact tgcagaggcc agggcagtct ccacagctcc tgatctattc gggttctaat  180
cgggcctccg gggtccctga caggttcagt ggcagtgggt caggcacaga ctttacactg  240
aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtt ggggtttatt actgcatgca atctctacaa  300
agtcggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa                         339
<210>56
<211>121
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>56
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Lys Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Ser Ile Val Pro Ser Gly Gly Ile Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Gln Gln Trp Leu Gly Arg Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>57
<211>363
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>57
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacaaga tggtttgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcgttcctt ctggtggcat tactatttat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagtgcag  300
cagtggctgg gacggcccta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctca  360
agc                                                                363
<210>58
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>58
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Thr Gln Ser Val Arg
            20                  25                  30
Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn
                85                  90                  95
Ser Pro Ile Ile Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>59
<211>330
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>59
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggcgaaaga   60
gccaccctct cctgcagggc cactcagagt gttagaaaga acttcttagc ctggtatcag  120
cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atctacgatg catccagcag ggccactggc  180
atcccagaca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga  240
ctggagcctg aagattttgc agtgtattac tgtcagcagt atggtaactc acctatcatc  300
ttcggccaag ggacacgact ggagattaaa                                   330
<210>60
<211>119
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Asp Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Trp Ile Val Pro Ser Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Asn Tyr Gly Pro Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>61
<211>357
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>61
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacgata tgtggtgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcgttcctt ctggtggcat tactgcttat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccacat attactgtgc gagaggtaac  300
tacggcccat cgccgtttga ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcaagc     357
<210>62
<211>110
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>62
Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Arg
1               5                   10                  15
Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn
            20                  25                  30
Asn Ala Val Thr Trp Tyr Gln Tyr Phe Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly
                85                  90                  95
Leu Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>63
<211>330
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>63
gcacagagcg ctttgactca gccaccctcg gtgtctgcag cccccaggca gagggtcacc   60
atctcctgtt ctggaagcac ttccaacatc ggaaataatg ctgtaacctg gtaccagtat  120
ttcccaggaa aggctcccaa actcctcatc tatagtgata atcagcggcc ctcaggggtc  180
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc  240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcgtatg acagaggcct gagtgtggtt  300
ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta                                   330
<210>64
<211>117
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr
            20                  25                  30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Val Pro Ser Gly Gly Leu Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Glu Ile Phe Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>65
<211>351
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>65
gaagttgaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtacatta tgcattgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atcgttcctt ctggtggcct tactgagtat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccacat attactgtgc gaaagagatt  300
tttggacaat ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcaag c           351
<210>66
<211>109
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>66
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Arg Ala Asn Glu Arg Ile Asn
            20                  25                  30
Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Ser Gly Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser
                85                  90                  95
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Arg
            100                 105
<210>67
<211>327
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>67
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga   60
gtcaccatca tttgccgggc aaatgagcgc ataaacacct atttaaactg gtatcagcag  120
aagccaggaa aagcccctaa gttgttgatt tctggtacat ccagtttgga aagtggggtc  180
ccatcaaggt tcagtggcag tggatctgga acagaattca ctctcagtat cagcagtctg  240
caacctgaag attttgcatc ttactactgt caacagagtt acagttcccc gtacactttt  300
ggccagggga ccaacctgga gatcaga                                      327
<210>68
<211>120
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
            20                  25                  30
Glu Thr Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser Gly Val Gly Ala Thr Lys Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>69
<211>360
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>69
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacgaga cgggttgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctctcctt ctggtggcta tactcagtat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatcgggg  300
gtgggagcta ctaagatttt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc  360
<210>70
<211>109
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>70
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ser Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr
                85                  90                  95
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>71
<211>327
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>71
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga   60
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attggcacct atttaaattg gtatcagcag  120
aaaccaggga cagcccctaa ggtcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc  180
ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg  240
caacctgaag atttttcaac ttactactgt caacagagtt acaatacccc tcgcactttt  300
ggccagggga ccaaactgga gatcaaa                                      327
<210>72
<211>122
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
            20                  25                  30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Gly Arg Tyr Thr Ser Gly Trp His Glu Tyr Phe Asp Pro Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>73
<211>366
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>73
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt   60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tattacgata tgcattgggt tcgccaagct  120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctctcctt ctggtggcta tacttggtat  180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac  240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccgtgt attactgtac gagaggaagg  300
tataccagcg gctggcatga gtacttcgac ccctggggcc agggcaccct ggtcaccgtc  360
tcaagc                                                             366
<210>74
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>74
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210>75
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>75
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>76
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1               5
<210>77
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>77
Gly Tyr Met Met Val
1               5
<210>78
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>78
Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Gln Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>79
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>79
Glu Glu Gly Gly Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>80
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>80
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>81
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>81
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>82
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>82
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr
1               5
<210>83
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>83
Trp Tyr Asp Met Ser
1               5
<210>84
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>84
Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>85
<211>14
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>85
Leu Glu Val Gly Ala Thr Ser Gly Gly Thr Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>86
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>86
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Arg Asn Leu Ala
1               5                   10
<210>87
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>87
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1               5
<210>88
<211>8
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>88
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Phe Thr
1               5
<210>89
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>89
Trp Tyr Ser Met Leu
1               5
<210>90
<21l>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>90
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>91
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>91
Trp Asp Tyr Asn Ser Gly Trp Tyr Tyr Asp His
1               5                   10
<210>92
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>92
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>93
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>93
Glu Ala Ser Lys Arg Ala Thr
1               5
<210>94
<211>11
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>94
Gln His Arg His Asn Trp Pro Pro Gln Trp Thr
1               5                   10
<210>95
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>95
Trp Tyr Asp Met Thr
1                5
<210>96
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>96
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>97
<211>8
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>97
Glu Phe Tyr Asp Tyr Leu Asp Val
1               5
<210>98
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>98
Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Phe Leu Ala
1               5                   10
<210>99
<211>7
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>99
Gly Ala Ser Arg Arg Ala Ser
1               5
<210>100
<211>9
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>100
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Asn Thr
1               5
<210>101
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>101
Arg Tyr Gln Met Asn
1               5
<210>102
<211>17
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>102
Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly His Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>103
<211>12
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>103
Asp Gly Arg Gln Gly Lys Ile Ser Thr Val Asp His
1               5                   10

Claims (8)

1.一种与人HMGB1多肽特异性结合的分离的单克隆抗体，其中，所述抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3如SEQ ID NO：92-94所示，所述抗体重链的CDR1、CDR2和CDR3如SEQ ID NO：95-97所示。
2.如权利要求1所述的抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其特征在于，所述抗体与由SEQ ID NO：28所示氨基酸序列构成的多肽特异性结合。
4.一种含有如权利要求1-3中任一项所述抗体的组合物。
5.如权利要求4所述的组合物，其为药物组合物。
6.权利要求1-3中任一项所述抗体或权利要求4或5所述组合物用于制造抑制人HMGB1活性的药物的用途。
7.如权利要求6所述的用途，所述药物用于治疗关节炎、脓毒症、腹膜炎和急性肺损伤。
8.一种质粒，其保藏号为ATCC PTA-6258。
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