JP6211597B2 - 新規抗体 - Google Patents
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Description
公開されているデータおよび報告書は、CXCLケモカインのELRCXCサブファミリーのメンバーがいくつかの疾患で上昇していることを示している。全部で16のCXCLファミリーメンバーが存在する。ケモカインは、COPDを含むいくつかの炎症性疾患においてアップレギュレートされることが報告されており、CXCL1〜3、5および8は、それぞれGro−α、−β、−γ(Haskill, S., et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 1990: 87, 7732-7736)、ENA−78(Wang, D. and Richmond, A., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman, M. ed., Academic Press, London, 1023-1027, Power, C.A. et al. Gene, 1994: 151, 333-334)、およびIL−8(Lizasa, H. and Matsushima , K., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman,M. ed., Academic Press, London, 1061-1067, Matsushima, K. et al., J. Exp. Med. 1988: 167, 1883-1893)としても知られる(Am. J. Respir. Crit. Care Med., 163: 349-355, 2001, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 168: 968-975, 2003, Thorax, 57: 590-595, 2002)。これらのケモカインの発現の延長および上昇は、特に、潰瘍性大腸炎、クローン病、COPD、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺障害、急性肺疾患、敗血症、ARDS、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、ベーチェット病、ブドウ膜炎、歯周病(特に、歯肉炎)、喘息およびCOPDの増悪、嚢胞性線維症、座瘡、閉塞性細気管支炎症候群、びまん性汎細気管支炎、深静脈血栓症、子癇前症、血管炎、家族性地中海熱、再潅流障害、疼痛および/または子宮内膜症などの疾患の発症に関与し得ると仮定されている。これらのCXCケモカインは、CXCR1およびCXCR2受容体の結合および活性化により好中球の走化性を刺激することが知られる。よって、これらのケモカインの阻害は、炎症性細胞が肺組織に浸潤するのを防ぎ、従って、組織の損傷を防ぐことができる。本発明は、ヒトIL−8、Gro−α、Gro−β、Gro−γ、GCP−2、およびENA−78と結合する能力を有する抗体を使用することにより、CXCR1およびCXCR2受容体の活性化を阻害することに向けられる。
本発明の抗体は、ヤギ(Pollock et al. (1999) J. Immunol. Methods 231: 147-157参照)、ニワトリ(Morrow (2000) Genet. Eng. News 20: 1-55参照)、マウス(Pollock et al.参照)または植物(Doran (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11: 199-204; Ma (1998) Nat. Med. 4: 601-606; Baez et al. (2000) BioPharm 13: 50-54; Stoger et al. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 583-590参照)などのトランスジェニック生物で生産され得る。
抗体は、成熟タンパク質のN末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として生産してもよい。シグナル配列は、宿主細胞により認識され、処理されなければならない。原核生物宿主細胞の場合、シグナル配列は例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性腸毒素IIリーダーであり得る。酵母分泌のためには、シグナル配列は例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸性ホスファターゼリーダーであり得る、例えばWO90/13646参照。哺乳類細胞系では、単純ヘルペスgDシグナルなどのウイルス分泌リーダーおよび天然免疫グロブリンシグナル配列が好適であり得る。一般に、シグナル配列は、抗体をコードするDNAのリーディングフレーム内に連結する。
複製起点は当技術分野で周知であり、ほとんどのグラム陰性菌に好適なpBR322、ほとんどの酵母に好適な2μプラスミド、およびほとんどの哺乳類細胞に好適な、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPVなどの種々のウイルス起源のものがある。一般に、複製起点成分は哺乳類の発現ベクターには必要とされないが、SV40は、初期プロモーターを含んでいるので使用可能である。
典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質またはその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、あるいは(b)栄養要求性(auxiotrophic)欠乏を補完する、もしくは複合培地中で得られない栄養素を供給する、あるいは(c)その両方の組合せを行うタンパク質をコードする。選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止させることを含み得る。本発明の抗体をコードする遺伝子で上手く形質転換された細胞は、例えば、共送達される選択マーカーによって付与される薬剤耐性のために生残する。1つの例は、形質転換体がメトトレキサートの存在下で培養されるDHFR選択マーカーである。細胞を漸増量のメトトレキサートの存在下で培養して、対象とする外因性遺伝子のコピー数を増幅させることができる。CHO細胞は、DHFR選択に特に有用な細胞株である。さらなる例としては、グルタミン酸シンセターゼ発現系(Lonza Biologic)がある。酵母で使用するための選択遺伝子の一例はtrp1遺伝子である、Stinchcomb et al. (1979) Nature 282: 38参照。
本発明の抗体を発現させるために好適なプロモーターは、抗体をコードするDNA/ポリヌクレオチドに機能的に連結される。原核生物宿主のためのプロモーターとしては、phoAプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター、例えばTacが含まれる。酵母細胞における発現に好適なプロモーターとしては、3−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース6リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼおよびグルコキナーゼが含まれる。誘導酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース/ガラクトース利用を担う酵素が含まれる。
適当であれば、例えば、高等真核生物での発現のためには、ベクター内のプロモーターエレメントに機能的に連結されたエンハンサーエレメントが使用可能である。哺乳類エンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン由来のエンハンサーエレメントが含まれる。あるいは、真核(eukaryotic)細胞ウイルス由来のエンハンサーエレメント、例えば、SV40エンハンサー(bp100〜270に存在)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー(polyma enhancer)、バキュロウイルスエンハンサーまたはネズミIgG2a遺伝子座を使用してもよい(WO04/009823参照)。エンハンサーは、ベクター上のプロモーターに対して上流の部位に位置してよい。あるいは、エンハンサーは他所、例えば、非翻訳領域内またはポリアデニル化シグナルの下流に位置してもよい。エンハンサーの選択および位置は、発現に使用する宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
真核生物系では、ポリアデニル化シグナルは、抗体をコードするDNA/ポリヌクレオチドに機能的に連結される。このようなシグナルは一般に、オープンリーディングフレームの3’側に位置する。哺乳類系では、限定されない例として、成長ホルモン、伸長因子−1αおよびウイルス(例えば、SV40)遺伝子またはレトロウイルス長末端反復配列に由来するシグナルが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化(polydenylation)/終結シグナルの限定されない例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子およびアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH)遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは一般に必要とされないが、代わりに、より短く、より良く定義されたターミネーター配列を使用するのが通例である。ポリアデニル化/終結配列の選択は、発現に使用する宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
上記に加え、収率を挙げるために使用可能な他の特徴としては、クロマチン再構成エレメント、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン改変が含まれる。
抗体をコードするベクターをクローニングするまたは発現させるための好適な宿主細胞は、原核(prokaryotic)細胞、酵母または高等真核細胞である。好適な原核細胞としては、真正細菌、例えば、腸内細菌科、例えば、大腸菌属(Escherichia)、例えば、大腸菌(E. coli)(例えば、ATCC 31,446;31,537;27,325)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ菌属(Salmonella)(例えば、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium))、セラチア属(Serratia)(例えば、セラチア・マルセスカンス(Serratia marcescans))および赤痢菌属(Shigella)ならびにバチルス属(Bacilli)(例えば、枯草菌(B. subtilis)およびB.リケニフォルミス(B. licheniformis)(DD 266 710参照))、シュードモナス属(Pseudomonas)(例えば、緑膿菌(P. aeruginosa))および放線菌属(Streptomyces)が含まれる。酵母宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)(例えば、ATCC16,045;12,424;24178;56,500)、ヤロウイア属(yarrowia)(EP402,226)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)(EP 183 070、Peng et al. (2004) J. Biotechnol. 108: 185-192も参照)、カンジダ属(Candida)、トリコデルマ・リーシア(Trichoderma reesia)(EP 244 234)、ペニシリン属(Penicillin)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)およびアスペルギルス属(Aspergillus)宿主(例えば、A.ニジュランス(A. nidulans)およびA.ニガー(A.niger))も企図される。
抗体をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知のいずれの方法によって培養してもよい。宿主細胞は、スピナーフラスコ、回転びんまたは中空繊維システムで培養可能であるが、大規模生産の場合、特に懸濁培養には撹拌タンク反応槽が使用される。撹拌タンカーは、例えばスパージャー、バッフルまたは低剪断翼を用いて曝気に適合させることができる。気泡塔およびエアリフトリアクターには、空気または酸素気泡による直接曝気が使用可能である。宿主細胞を無血清培養培地で培養する場合には、曝気プロセスの結果としての細胞損傷を避ける助けとするために、培地にプルロニックF−68などの細胞保護剤を添加する。宿主細胞の特徴に応じて、足場依存性細胞株には増殖基質として微小担体を使用してもよく、または細胞を懸濁培養に適応させてもよい(これが典型的である)。宿主細胞、特に、無脊椎動物宿主細胞の培養には、流加、反復回分法(repeated batch processing)(Drapeau et al. (1994) Cytotechnology 15: 103-109参照)、拡大回分法(extended batch process)または灌流培養などの様々な操作様式を利用可能である。組換え形質転換した哺乳類宿主細胞はウシ胎児血清(FCS)などの血清含有培地で培養できるが、このような宿主細胞は、Keen et al. (1995) Cytotechnology 17: 153-163に開示されているような合成無血清培地、または必要であれば、グルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンなどの合成増殖因子を添加した、ProCHO−CDMまたはUltraCHO(商標)(Cambrex NJ、USA)などの市販の培地で培養してもよい。宿主細胞の無血清培養は、そのような細胞が無血清条件で増殖するように順応されていることが必要であり得る。1つの順応アプローチは、それらの宿主細胞が無血清条件で順応することを学ぶように、その宿主細胞を血清含有培地で培養し、その培養培地の80%を無血清培地に繰り返し交換することである(例えば、Scharfenberg et al. (1995) in Animal Cell Technology: Developments towards the 21st century (Beuvery et al. eds, 619-623, Kluwer Academic publishers)参照)。
本明細書に記載の本発明の抗体またはそれらのフラグメントの精製調製物は、本明細書に記載のヒト疾患、障害および病態の処置に使用するための医薬組成物に組み込むことができる。疾患、障害および病態という用語は、互換的に使用される。医薬製剤は、抗体を薬学上許容される担体と組み合わせて含んでなり得る。本抗体は単独で、または医薬組成物の一部として投与することができる。
本明細書に記載の抗体は、1以上の抗体、検出可能な標識およびそのキットの使用説明書を含んでなる診断キットとして提供することができる。便宜のため、本キットは、所定の試薬を使用説明書とともに含んでなり得る。
(i)前記単一宿主細胞を、配列番号4または5のポリペプチドを含んでなる重鎖をコードする第1のDNA配列、および配列番号2のポリペプチドを含んでなる軽鎖をコードする第2のDNA配列で形質転換する工程;および
(ii)前記の形質転換された単一宿主細胞内で、前記第1のDNA配列および前記第2のDNA配列を発現させて前記抗体重鎖および軽鎖を生産する工程
を含んでなる方法に関する。
実施例1(図1)
健常ヒト被験者からの血液をヘパリンナトリウム管に採取した(インフォームド・コンセントを伴う)。各データ点について、80μlの全血を適当な濃度(終濃度の10倍)のPanELR抗体10μlを含有するポリプロピレン管にピペットで取り、十分に混合し、加湿インキュベーター内で37℃にて20分間インキュベートした。各管にさらに10μlのビヒクル(PBS)を加え、十分に混合した後、管をインキュベーターに戻し、さらに60分間置いた。1mlの固定/溶解バッファーの添加により反応を停止させ、37℃でさらに10分間インキュベートした後、遠心分離(500xg、10分間)により白血球を回収し、2ml PBSで洗浄し、ヒトCD16に対する抗体(FITC標識)およびCD11bに対する抗体(PE−Cy7標識)で45分間染色し、さらに2mlのPBSで洗浄し、最後に、300μlのPBSに懸濁させた後、BD FACSCANTO IIフローサイトメーターにて分析を行った。各データ点について、合計20,000〜50,000イベントをキャプチャーした。好中球CD11b発現は、高レベルのCD16を発現する(FITCチャネルを用いたゲート設定−図1B)白血球におけるPE−Cy7平均蛍光強度(前方散乱/側方散乱プロファイル上でのゲート設定−図1A)として定量した。グラフ表示のために、データは総て、ベースライン(すなわち、ビヒクルのみで20+60分間インキュベートした全血中の好中球CD11b MFI)に対する増加倍率として表した(図2および3の通り)。
全血を、示された濃度の抗体で80分間処理した。全血を固定/溶解し、白血球をFITC標識抗CD16およびPE−Cy7標識抗CD11bで染色した後、好中球(高CD16発現に関してゲート設定)において、好中球CD11bをフローサイトメトリーによりベースライン(ビヒクルで80分間処理した血液)に対するPE−Cy7 MFIの変化倍率として評価した。バーは平均+/−SEM(n=6);対応のあるt検定による確立を示す。
全血を、示された濃度の抗体で80分間処理した。全血を固定/溶解し、白血球をFITC標識抗CD16およびPE−Cy7標識抗CD11bで染色した後、好中球(高CD16発現に関してゲート設定)において、好中球CD11bをフローサイトメトリーによりベースライン(ビヒクルで80分間処理した血液)に対するPE−Cy7 MFIの変化倍率として評価した。バーは平均+/−SEM(n=6);対応のあるt検定による確立を示す。
Claims (8)
- 配列番号4および配列番号2のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる、単離された抗体。
- 配列番号5および配列番号2のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる、単離された抗体。
- 請求項1または2に記載の抗体を1種類以上の薬学上許容される担体と組み合わせて含んでなる、医薬組成物。
- ヒトにおいて潰瘍性大腸炎、クローン病、COPD、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺障害、急性肺疾患、敗血症、ARDS、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸器合胞体ウイルス、インフルエンザ、ベーチェット病、ブドウ膜炎、歯周病(特に、歯肉炎)、喘息およびCOPDの増悪、嚢胞性線維症、座瘡、閉塞性細気管支炎症候群、びまん性汎細気管支炎、深静脈血栓症、子癇前症、血管炎、家族性地中海熱、再潅流障害、疼痛および/または子宮内膜症を予防、治療または改善するために用いる、請求項3に記載の医薬組成物。
- 配列番号4および配列番号2のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体、または配列番号5および配列番号2のポリペプチドをそれぞれ含んでなる重鎖および軽鎖を含んでなる単離された抗体を生産する、組換え宿主細胞。
- 単一の宿主細胞において抗体を生産するための方法であって、
(i)前記単一宿主細胞を、配列番号4または5のポリペプチドを含んでなる重鎖をコードする第1のDNA配列、および配列番号2のポリペプチドを含んでなる軽鎖をコードする第2のDNA配列で形質転換する工程;および
(ii)前記の形質転換された単一宿主細胞内で、前記第1のDNA配列および前記第2のDNA配列を発現させて前記抗体重鎖および軽鎖を生産する工程
を含んでなる、方法。 - 前記第1および第2のDNA配列が異なるベクターに存在するか、あるいは前記第1および第2のDNA配列が単一のベクターに存在する、請求項6に記載の方法。
- 配列番号4または配列番号5のポリペプチドを含んでなる重鎖、および配列番号2のポリペプチドを含んでなる軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
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