JP2015514417A - Ｉｇ様分子の生産方法および生産手段 - Google Patents

Abstract

本発明は単一の宿主細胞で一または複数のＩｇ様分子を生産する手段および方法を提供する。目的とする単一特異性および／または二重特異性Ｉｇ様分子の生産を可能にする新規のＣＨ３変異も提供される。【選択図】図１

Description

本発明は分子生物学、医学および生物学的治療学の分野に関する。本発明は、特に多種多様な疾患の治療に用いられる治療用抗体の分野に関する。

現在多く使われている生物学的製剤は、単離されたヒトまたはヒト化組み換えモノクローナル抗体である。これらの製剤は、生体の免疫システムが、疾患のプロセスに関わる細胞および／または分子を無力化または除去したり、侵入した病原体または感染した因子を根絶する能力を高めるものである。

モノクローナル抗体は、抗原の特定の一部位、すなわちエピトープに結合する。そして治療用の抗体では、エピトープは、例えば腫瘍細胞を取り除いたり、受容体−リガンド相互作用を阻害したり、ウィルスを中立化するなどの望ましい機能を発揮するように選択される。

現在、約３０のモノクローナル抗体がＦＤＡにより承認されている。これらの抗体は、通常、大量に生産され、また、その生物物理学的特性および生物化学的特性が詳細に検査されることで、バッチごとの品質も保たれ、基準を満たすようになってきている。

こうした利点があるにもかかわらず、モノクローナル抗体にはいくつかの不利な点が存在する。その一部は、モノクローナル抗体の持つ本来の特徴である単一特異性と、疾患の持つ複雑性に関係する。

疾患の過程では本来、多くの要素が関わることが珍しくない。そして、疾患に関わる各因子の作用も冗長的であったり相乗的であったりし、別の受容体の発現が増えてシグナル伝達のネットワーク間でのクロストークが起きることもある。従って、疾患に関わる複数の異なる要素や反応経路を阻害することが、治療の効率の改善につながりうる。モノクローナル抗体が本来持つ単一特異性から、モノクローナル抗体は複雑な疾患のプロセスにおける１つのステップに対して干渉することしかできず、十分な効果を挙げられない場合がある。

疾患のプロセスの持つ多面性の論点とは別に、単一の細胞、水溶性蛋白質または病原体の単一のエピトープを標的とするのみでは疾患の治療に十分な効果を挙げることができないことが明らかになってきた。その理由は、標的のエピトープに対し、もはやモノクローナル抗体が結合し望ましい効果を発揮することができなくなる場合があるからである。一例として、腫瘍細胞は、増殖因子の受容体にある標的エピトープの発現を減らしたり、突然変異を加えたり、遮蔽したりしてモノクローナル抗体による治療をかわすことがしばしばある。

他の受容体および／またはそのリガンドを活性化することにより、腫瘍細胞は別の反応経路を有効にして成長を続け転移する。同様に、ウィルスや他の病原体も標的エピトープに突然変異を加えたり、欠失させたり、遮蔽したりしてモノクローナル抗体による治療をかわす。

単一のエピトープに結合するモノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体が引き起こすエフェクター機構の全てを発生させるわけではない。ここでのエフェクター機構の顕著な例として以下が挙げられる；オプソニン化（抗原が食作用を受けやすくなる）、立体障害（抗体に包まれた抗原が宿主細胞または粘膜表面に到達することを阻害される）、毒素の無毒化、凝集、または沈降（いくつかの水溶性の抗原に結合した抗体が凝集し、その後除去される）、補体の活性化および抗体による細胞毒性（抗体が、ＮＫ細胞および好中球により標的細胞を死滅させる）。

治療に応用できるポリクローナル抗体はプールされたヒト血清から得ることができる。このような血清由来の治療用ポリクローナル抗体は、狂犬病ウィルス、サイトメガロ・ウィルスおよびＲＳウィルスのようなウィルス感染症の治療および予防、破傷風毒素およびボツリヌス毒素のような毒素の無効化、または抗Ｄ免疫付与の防止などに用いられる。

血清由来のポリクローナル抗体製剤のより広範な利用は、原料となる血漿が感染症および毒素のような限られた範囲の標的にしか適用できないという点により妨げられている。さらに、製品は、量および適合性の両方の点において、ドナーによる血液の供給状況に依存しており、バッチごとにかなりのばらつきが生ずる結果となる。それに加えて、スクリーニングの技術はウィルスの絶え間ない進化に追い付いておらず、免疫グロブリン製剤は感染症の伝染を媒介する危険が付きまとう。最後に、血液収集、スクリーニングおよび免疫グロブリン精製といった長い過程により、血漿由来免疫グロブリンは生産にコストがかかる。

モノクローナル抗体の混合物は、モノクローナル抗体の有効性を高めうる一方で、血清由来ポリクローナル抗体に関連した制限がない。この分野において、２種のヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の組み合わせが前臨床モデルおよび臨床試験で検査されている（例として、ＨＥＲ２受容体に対する２種のモノクローナル抗体の混合物、受容体ＥＧＦＲに対する２種の抗体の混合物および狂犬病ウィルスに対する２種のモノクローナル抗体）。

この分野において、２種のモノクローナル抗体の組み合わせにより、付加的または相乗的な効果を挙げることができ、抗体のいずれか一方のみだけとは関連しないエフェクター機構を誘導することが示されている。例えば、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２に対する２種のモノクローナル抗体の混合物は、腫瘍細胞をより強力に殺傷することが示されている。これは、免疫系のエフェクターによる細胞毒性の促進に加え、受容体の内在化の促進および受容体の下流のシグナル経路の阻害の強化を含む活動の組み合わせに基づく。

２種のモノクローナル抗体に基づいた組み合わせの治療では、構成要素の抗体は別々に生産され、そして蛋白質のレベルで混合される。この方法の難点は、２種の抗体についてそれぞれ臨床試験を展開し、組み合わせたものについてもその過程を（部分的に）繰り返すことによる膨大なコストである。このことにより、抗体の組み合わせに基づいた治療はコストの面で受け入れられないものとなりうる。

別の方法として、構成要素のモノクローナル抗体を産生する２つの組み換え細胞株を発酵槽で混合し、結果として得た抗体の混合物を一の試料として精製しうる（国際公開第２００４／０６１１０４号）。この方法の難点は、組成のコントロールが難しいことであり、それにより結果として得た組み換えポリクローナル抗体製剤の再現性も乏しいことにある。特に、細胞を培養するに従うこのような組成の時間的な変化を考慮に入れると難しい。

この十年で、２種の抗体の組み合わせを用いる代わりに、二重特異性抗体が発展してきた。２種の抗体の組み合わせの場合では、混合物にある２種の異なる免疫グロブリン分子が、同一または違う標的にある、異なったエピトープに対し結合する。二重特異性抗体では、単一の免疫グロブリン分子によりこれが達成される。

同一または異なる標的の２つのエピトープに結合することにより、二重特異性抗体は、その同じエピトープに結合する２種の抗体の組み合わせの場合と同様の効果を発揮しうる。さらに、ＩｇＧ形式による二重特異性抗体は、一の分子に２つの異なる一価の結合部位を組み合わせて有し、２種のＩｇＧ抗体の混合物は、一の試料に２つの異なる二価の結合分子を組み合わせて有するため、これらの形式による異なる効果も観察されている。

このことから、技術的および規制上の観点から見れば、単一の二重特異性抗体を開発する方が手間がかからない。その理由は、生産、前臨床および臨床試験を単一の分子についてすればよいからである。したがって、単一の二重特異性抗体に基づいた治療法は、より手間のかからず、コスト効率の良い創薬プロセスにより促進され、より効率の良い抗体療法を提供する。

２つの重鎖と２つの軽鎖からなるＩｇＧ形式の二重特異性抗体は、さまざまな方法で生産される。例えば、二重特異性抗体は抗体を分泌する２つの細胞株を融合するか、組み換えＤＮＡ技術を用いて２つの抗体を一の細胞に発現させることにより生産されうる。これらの方法によると、複数の種類の抗体が産生される。その理由は、各抗体に対応する重鎖が、同じ特異性を持つ２つの同一の重鎖のペアを含む単一特異性二量体（ホモ二量体とも呼ばれる）、および、異なる特異性を持つ２つの異なる重鎖のペアを含む二重特異性二量体（ヘテロ二量体とも呼ばれる）を形成しうるからである。

さらに、各抗体からの軽鎖および重鎖はランダムにペアとなり不適切な機能しない組み合わせとなりうる。この重鎖および軽鎖のミスペアリングとして知られる問題は、二重特異性として発現される共通の軽鎖を共有する抗体を選択することで解決できる。しかし共通の軽鎖を用いても、２つの重鎖および１つの共通する軽鎖を単一の細胞に発現すると、３つの異なる抗体の種類が得られることになる。すなわち、２つの単一特異性の「親」抗体（’parental’ antibody）および二重特異性抗体である。したがって、目的とする二重特異性抗体は結果として得られた抗体混合物から生成する必要がある。

親の抗体と二重特異性抗体との混合物で二重特異性抗体の割合をさらに増やすこと、およびミスペアリングの重鎖および軽鎖を減らすことのためにいくつかの技術が採用されている。しかし、上述の問題点のいくつかを消去あるいは最小化する二重特異性抗体の形式が必要とされている。

以上をまとめると、従来技術において、患者への治療に応用できる、モノクローナル抗体，二重特異性抗体，モノクローナル抗体の混合物，または単一特異性および二重特異性の抗体の混合物を産生する様々な技術と方法が提供されている。

しかしながら、上記のように、これらの今ある技術および方法は、それぞれ難点および制限を有している。従って、疾患を修飾する複数の分子を標的とした、混合物または二重特異性のアプローチによる方式の生物学的治療剤を生産する、改善された、および／または今までとは別の技術を生み出す必要がある。

本発明は、疾患を修飾する複数の分子を標的とした、混合物または二重特異性のアプローチによる方式の生物学的治療剤を生産するための、改善された、および／または今までとは別の技術の方法および手段を提供する。本発明は、さらに、これらの方法および手段の結果として得られる生産物および使用を提供する。

従来技術において、目的とする特定の二重特異性抗体の形成を促進するための様々なアプローチが記述されている。これらの方法により、結果として得られる混合物における望ましくない抗体の組成を減らすことができる。

抗体に関して、ＣＨ３−ＣＨ３相互作用はＦｃの二量化の主要な役割を担うことが知られている（Ellerson JR., et al., J. Immunol 1976 (116) 510-517およびDeisenhofer J. biochemistry 1981 (20) 2361-2370）。さらに、２つのＣＨ３ドメインが相互に作用するとき、「接触」残基（”contact” residue；接触アミノ酸（contact amino acids）、接触面残基（interface residues）または接触面アミノ酸（interface amino acids）とも呼ばれる）からなる蛋白質−蛋白質接触面で向かい合うことが知られている。

第１のＣＨ３ドメインの接触アミノ酸は第２のＣＨ３ドメインの一または複数の接触アミノ酸と相互作用する。接触アミノ酸は通常、抗体の三次元構造において相互に５．５Å（好ましくは４．５Å）以内の距離にある。この１つのＣＨ３ドメインの接触残基と異なるＣＨ３ドメインの接触残基の間の相互作用は、例えば、ファン・デル・ワールス力、水素結合、水媒介水素結合（water-mediated hydrogen bonds）、塩橋若しくはその他の静電気力、芳香族側鎖の間の引力相互作用、ジスルフィド結合またはその他の公知の力を介してなされる。

ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの接触面の接触アミノ酸側鎖の約３分の１が、ドメインのフォールディングと会合の大半に寄与していることがこれまでに示されている。その他の（隣接した）アミノ酸残基もこの蛋白質―蛋白質接触面での相互作用に影響しうることが想定される。

従来技術において、抗体の重鎖の二量化に干渉するアプローチが採用されてきた。ホモ二量化よりもヘテロ二量化を促進するために、ＣＨ３ドメインの特異的な操作（engineering）が適用されている。このようなＣＨ３−ＣＨ３接触面の操作の例は、例えば国際公開第１９９８／０５０４３１号、Ridgeway et al., 1996、Merchant et al. 1998に記述されており、ノブ・イントゥ・ホール（Knob-into-Hole）アプローチとしても知られている。この方法は、相補的な突起および空洞をもたらす変異を導入する。

概して述べると、この方法は第１のポリペプチドの接触面に突起（protuberance）を導入するとともに、第２のポリペプチドに対応する空洞（cavity）を導入し、該突起が該空洞に位置するようになっている。これにより、ヘテロ多量体の形成が促進され、ホモ多量体の形成が妨げられる。

「突起」すなわち「ノブ」は、第１のポリペプチドの接触面にある短いアミノ酸側鎖を、長いアミノ酸側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置き換えることにより作成される。相補的な、突起と同一または類似の大きさの「空洞」または「穴」は、第２のポリペプチドの接触面にある長いアミノ酸側鎖を、より短いアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）に置き換えることにより作り出される。突起および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸の改変のような合成手段、またはペプチドの合成により作成できる。

ノブ・イントゥ・ホール技術だけを用いると、２つの親の抗体および二重特異性抗体の混合物の中で、興味のある二重特異性抗体の割合をせいぜい８７％まで上げる程度である。Merchantらは、ＣＨ３−ＣＨ３接触面の中の２つのＣＨ３ドメインの間に追加したジスルフィド結合の導入により、混合物の二重特異性抗体の割合を９５％にまで高めることに成功した。それでも、このような二重特異性抗体を薬剤として用いるためには、二重特異性抗体はホモ二量体から（分離）精製し、薬学的見地から容認可能な希釈剤または賦形剤の形にしなければならない。このような混合物からヘテロ多量体を精製するのは、ホモ二量体とヘテロ二量体の物理化学的な性質が類似しているため大きな課題になっている。

本発明の目的の一つは、混合物の二重特異性抗体の割合がさらに改善される、単一の細胞クローンからの二重特異性抗体の生産方法を提供することである。本発明によれば、ノブ・イントゥ・ホール技術を手段の一つとして、単独でまたは他の手段と共に用い、混合物中の、前記さらに改善された二重特異性抗体の割合を実現することができる。

このようなＣＨ３−ＣＨ３接触面での操作の他の一例は、ヘテロ二量体性のＦｃの技術により提供される。この技術は、鎖交換操作ドメイン（strand-exchange engineered domain; SEED）ＣＨ３ヘテロ二量体の発案により、二重特異性および非対称性の融合蛋白質を設計することに関わっている。これらのＳＥＥＤ・ＣＨ３ヘテロ二量体はヒトＩｇＡおよびＩｇＧのＣＨ３配列を交互に有する部分から構成されているヒトＩｇＧおよびＩｇＡの派生物である。この結果として、SEED-bodiesと呼ばれる一対の相補的なヒトＳＥＥＤ・ＣＨ３ヘテロ二量体が得られる（Davis JH. et al., Protein Engineering, Design & Selection 2010(23)195-202; 国際公開第２００７／１１０２０５号）。

目的とする二重特異性抗体を生産するためのさらに他のアプローチとしては、例えば、欧州特許出願公開第０１８７０４５９号若しくは米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開２０１０／１２９３０４号、Gunasekaran et al (2010)および国際公開第２００９／０８９００４号に記述されているように、ＣＨ３−ＣＨ３接触面にある、もともと電荷を有する接触残基の静電的操作に基づいている。

これらの刊行物に記述されている重鎖のＣＨ３ドメインの変異では、本来の荷電したアミノ酸の接触残基を、逆の電荷のアミノ酸残基に置き換えている（電荷反転戦略：charge reversal strategy）。これにより、Ｆｃ二量体の向かい合う接触面の電荷の極性が変わり、静電的に適合するＦｃ鎖を共発現させると好ましい引力相互作用を生じうる。従って、望ましいＦｃヘテロ二量体の形成が促進され、一方で反発的な電荷の相互作用により望ましくないＦｃホモ二量体の形成が阻害される。

ＣＨ３−ＣＨ３接触面には、４つの特徴的な荷電残基のペアがそのドメイン間の相互作用に関わっている報告がある。これらはD356/K439’, E357/K370’, K392/D399’および D399/K409’（第１の鎖の残基と第２の鎖の残基を「/」で区切り、プライム記号（’）で第２の鎖の残基の番号を表すKabat (1991)の報告の番号付けに従った）である。ＣＨ３−ＣＨ３接触面は２回対称であるため、各々の特徴的な荷電残基のペアは本来のＩｇＧで２度現れる（すなわち、K439/D356’, K370/E357’, D399/K392’ およびK409/D399’の静電相互作用も該接触面に存在する）。

この２回対称性の有利な面を生かし、単一の電荷の反転、例えば第１の鎖でのＫ４０９Ｄ、あるいは第２の鎖のＤ３９９’Ｋの変異において、同一の電荷の反発によりホモ二量体の形成が減少することが示された。異なった電荷に対しても反転操作を加えることにより、さらにこの反発効果が高められた。異なる相補的な電荷の反転がある、異なるＣＨ３ドメインの発現により、ヘテロ二量化が誘導され、結果として混合物における二重特異性の種の割合が増加することが示された。

上述のアプローチにより、単一の細胞から生産される二重特異性抗体の割合を約７６％から約９６％までの間の値にすることができた。本発明の目的の一つは、単一の細胞からの二重特異性抗体の生産方法において、さらに改善された所望の二重特異性抗体の割合を提供することである。本発明によれば、静電的な操作技術を手段の一つとして、単独でまたは他の手段、例えばノブ・イントゥ・ホールアプローチと共に用い、前記さらに改善された所望の（二重特異性）抗体の割合を達成することができる。

一態様において、本発明が提供する、単一の宿主細胞からの少なくとも２つの異なるＩｇ様分子を生産する方法では、それぞれの前記２つのＩｇ様分子は接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、前記方法は、前記細胞に、
ａ． 第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子，
ｂ． 第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子，
ｃ． 第３のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第３の核酸分子，および、
ｄ． 第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第４の核酸分子，
を与えることを含み、少なくとも２つの前記核酸分子で、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための手段を備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記少なくとも４つの核酸分子を発現させ、前記少なくとも２つの異なるＩｇ様分子を培養物から回収する工程をさらに備える。

例えば、疾患のプロセスまたは病原体の侵入、複製、および／または拡散に関係する複数の生物学的な経路をより効率的に阻害するため、複数の（二重特異性）抗体を産生することがしばしば望まれる。

特定の疾患の治療にも複数の二重特異性抗体の混合物を用いることはとりわけ有用である。例えば、抗体または小分子の薬による治療の間に、腫瘍細胞は抵抗性を得るため多くの異なる戦略を用いる。抵抗性は、複数の細胞表面の受容体および水溶性分子に関わることがあり、複数のこのような疾患および逃避（escape）に関係した分子に同時に対処する、抗体によるがん治療法を開発することが有益であると考えられている。

２以上のこのような疾患および逃避に関係した標的分子またはエピトープが関係する場合、二重特異性抗体の混合物は新規で興味深い治療の方式である。このような二重特異性抗体の混合物は単一の細胞から生産された方が、創薬プロセスを容易にし、好ましい。これにより、創薬プロセスは、規制上の観点から見て手間がかからず、製薬および臨床的な発展の観点から見てもコスト効率が良く、実現しやすいものとなる。

単一の細胞に基づいたアプローチでは、制御され効率的な二重特異性抗体の生産を可能にする方法を用いることが望ましい。これにより、望ましい二重特異性ＩｇＧ分子の混合物を、望ましくない単一特異性のＩｇＧ分子から分離する必要性を減らすか、または完全になくすことができる。従来技術において、単一の細胞から、単一特異性および二重特異性抗体が生産されている（国際公開第２００４／００９６１８号）。しかし、これらの混合物はいくつかの異なる二重特異性および単一特異性抗体の種類の複雑な混合になっている。

本発明のさらなる目的の一つは、一つの細胞から、定められた二重特異性抗体の混合物を生産する方法および手段を提供することである。後述されるように、好ましくは、単量体の副産物の量と関わりなく、少なくとも９５％、少なくとも９７％または９９％より高い割合の二量体ＩｇＧ分子の（二重特異性）抗体の混合物が結果として得られる方法を提供する。概して述べると、複数の、生来のＩｇＧ分子が生産されている細胞では、半分子（単量体の副産物）が存在するが、公知のサイズ排除クロマトグラフィーにより簡単に除去される。

一実施形態において、本発明が提供する、目的とする１つの（二重特異性）抗体の代わりの、単一細胞での少なくとも２つの異なったＩｇ様分子を含む定められた混合物の生産方法では、望ましくない他の二量体の抗体の種の形成が減少しているか、または欠く。結果として得られた混合物は明確に定義され、その組成はＣＨ３ドメインの変異の設計により制御される。さらに、発現量の調節および／または発現に用いられる異なるトランスフェクション比率は混合物の組成に影響する。

本発明による方法では、第１の核酸分子にコードされているＣＨ３ドメインは、第２の核酸分子にコードされたＣＨ３ドメインと選択的にペアとなり、第３の核酸分子にコードされているＣＨ３ドメインは、第４の核酸分子にコードされたＣＨ３ドメインと選択的にペアとなる。さらに、本発明は、本発明の方法により得られる少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の混合物を提供する。

本書で用いられる、「前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリング」の意味は、結果として得られる、第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドおよび／または第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドを有する二量体の実質的にすべてが、１つの第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと１つの第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドのペアからなる二量体である、ということである。

同様に、「前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリング」の意味は、結果として得られる、第３のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドおよび／または第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドを有する二量体の実質的にすべてが、１つの第３のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと１つの第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドのペアからなる二量体である、ということである。

結果として、４つの異なる（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドをコードする核酸分子が単一の細胞に導入されたとき、１０の異なるＩｇ様二量体（ＡＡ，ＡＢ，ＡＣ，ＡＤ，ＢＢ，ＢＣ，ＢＤ，ＣＣ，ＣＤおよびＤＤ）の混合物の代わりに、主として２つの特異的なＩｇ様分子の混合物が生産される。

以下で詳述するように、本発明の好適な一実施形態において、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｋを有し、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｌ３５１Ｄを有する。これらのアミノ酸の変化は前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の選択的ペアリングのための好適な手段である。

前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、好ましくはさらにアミノ酸の置換Ｌ３５１Ｋを有する。また、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、好ましくはさらに、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９ＤおよびＬ３６８Ｅの群から選択されたアミノ酸の置換を有する。この群の中で、Ｌ３６８Ｅが最も好ましい。さらにもう一つの好適な一実施形態では、前記第３のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋを有し、前記第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄを有する。

本発明による方法では、それぞれのＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、好ましくはさらに標的エピトープを認識する可変領域を備える。ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の一部である可変領域は、好ましくは共通の軽鎖を共有する。その場合、可変領域のＶＨのみが異なり、一方で全ての可変領域のＶＬは実質的に同一である。

従って、好適な一態様において提供される、本発明による方法では、前記宿主細胞に、共通の軽鎖をコードする核酸分子を与えることをさらに備える。特に好適な一実施態様では、４つのＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の前記４つの可変領域のそれぞれが異なる標的エピトープを認識する。例えば、もし第１の核酸分子が抗原Ａに特異的な可変ドメインをさらに含む重鎖をコードしていた場合、第２の核酸分子は抗原Ｂに特異的な可変ドメインをさらに含む重鎖をコードし、第３の核酸分子は抗原Ｃに特異的な可変ドメインをさらに含む重鎖をコードし、そして第４の核酸分子は抗原Ｄに特異的な可変ドメインをさらに含む重鎖をコードする。そうすると、混合物は、ＡＢに特異的な二重特異性Ｉｇ様分子およびＣＤに特異的な二重特異性Ｉｇ様分子を含んで生産される。

単一特異性抗体（ＡＡ，ＢＢ，ＣＣまたはＤＤ特異的）の形成またはＡＣ，ＡＤ，ＢＣまたはＢＤに特異的な二重特異性抗体の形成は、少なくなるか、または、なくなる。その理由は、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの手段による。２を超える異なるＩｇ様分子を含む定められた混合物の生産のために、例えば第５および第６のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドをコードする場合のような、さらなる核酸分子を用いることももちろん可能である。

注目すべき点として、本発明による方法で用いられる核酸の比率は１：１：１：１である必要はない。また、結果として得られる発現されたＩｇ様分子の比率も１：１である必要はない。公知の手段を用いて、最適化された比率の抗体の混合物を作製することは可能である。例えば、核酸分子の発現レベルと、つまり結果として産生されるＩｇ様分子の比率はプロモーター、エンハンサーおよびリプレッサーのような異なる遺伝的要素を用いるか、抗体をコードするＤＮＡ構築物のコピー数のゲノム組み込み部位を制御することで調節されうる。

選択的ペアリングのための前記手段は、好ましくは、相補的なノブ・イントゥ・ホール変異、ジスルフィド架橋、電荷反転変異を含む電荷の変異、またはこれらの組み合わせよりなる。選択的ペアリングのための前記手段は特定の範囲の型の変異から選びうることが当業者は理解できるだろう。すなわち、ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする少なくとも４つの核酸分子が選択的ペアリングのための手段としての電荷の変異として必要である。

さらに、特定の場合では、操作されていない野生型ＣＨ３も野生型ＣＨ３ドメインを備える２つのポリペプチド鎖の選択的ペアリングに用いられる。特に好適な一実施形態では、選択的ペアリングのための前記手段は、表Ｂから選択される少なくとも１つのＣＨ３変異を有することが本書で後述される。

好適な一実施形態が提供する本発明による方法では、４つの前記核酸分子すべてで、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための手段を備え、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための前記手段は、前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための手段とは異なる。

本発明の一態様が提供する本発明による方法では、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための前記手段は、前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための前記手段とは異なる。ここでの「異なる」の意味は、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのための手段は第１および第２の鎖の選択的ペアリングが好まれるように設計されているということである。該設計において、第１と、第３および／または第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖との間の相互作用が実質的に起こらないようにされている。言い換えると、第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと、前記第３または第４のポリペプチドとの二量化は原則的に起こらないか、それに近いくらいまで抑えられている。第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドは、野生型か、第１および第２のＣＨ３ドメインの選択的ペアリングのための手段とは異なる選択的ペアリングの手段を備える。

最近の研究では、例えば、ノブ・イントゥ・ホール技術またはＣＨ３ドメインに存在する荷電接触アミノ酸の変異（反転）を用いて単一の二重特異性抗体の生産をすることに焦点をあてている。しかし、本発明より前において、他の二量体副産物を共に顕著に生産することなく、少なくとも２つの（二重特異性）Ｉｇ様分子の定められた混合物の生産をすることは実現できていない。

本発明は、混合物に高い割合の二重特異性のものを含む、明確に定義されたＩｇ様分子の混合物の効率よく制御された生産方法を提供する。２種の二重特異性のものが望ましいシステムにおいて、（２つの）二重特異性のものの割合が少なくとも９５％、少なくとも９７％またはそれより高い割合が得られる。このことは、せいぜい５％、せいぜい３％またはそれより少ない単一特異性の二価の副産物しか得られないということである。注記しておくと、単量体の副産物（すなわち半分子）の量はあまり重要でない。その理由は、これらの半分子は大きさの違いを利用して簡単に分離できるからである。

本発明の他の好適な一実施形態においては、第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域は異なる標的エピトープを認識し、一方で第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域は同一の標的エピトープを認識する。これにより、主として１種類の二重特異性Ｉｇ様分子および１種類の単一特異性Ｉｇ様分子が結果として得られる。例えば、もし第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域が異なる標的エピトープを認識し、そしてもし第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域が、両方とも同一の、第１および第２のＣＨ３ドメインにより認識される標的エピトープとは異なるエピトープを認識する場合、ＡＢまたはＣＣに対する特異性を有するＩｇ様分子の混合物がつくられる。

本発明に従いさらに提供される方法は、第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域により認識される標的エピトープが同一であり、しかし第１または第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域により認識される標的エピトープとは異なるものである。

別の方法では、第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域が異なる標的エピトープを認識し、第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域が、両方とも、第１または第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖と同一のエピトープを認識するとき、ＡＢおよびＡＡ、またはＡＢおよびＢＢに対する特異性を有するＩｇ様分子の混合物がつくられる。

本発明による方法により提供されるのは、第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域により認識される標的エピトープが、第１または第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域により認識される標的エピトープと同一であるものである。

本発明の他の目的の一つは、単一細胞の培養で二重特異性抗体および単一特異性抗体の定められた混合物を生産する方法および手段を提供することである。このような明確に定義された混合物の非限定的な例は、ＡＢに特異的な二重特異性抗体およびＡＡ特異的な単一特異性抗体の混合物である。他の例は、ＡＢに特異的な二重特異性抗体およびＢＢ特異的な単一特異性抗体の混合物である。さらにもう一つの例は、ＡＢに特異的な二重特異性抗体およびＣＣ特異的な単一特異性抗体の混合物である。ここでも、少なくとも９０％、好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９７％、または９９％をも超える望ましい抗体を有する、目的とする抗体の混合物を産生する好適な手段および方法が提供される。

本発明による方法が提供される他の一実施形態では、第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域が同一の標的エピトープを認識し、一方で第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域が、前記第１および第２の可変領域により認識される標的エピトープとは異なる２番目の標的エピトープを認識する。これにより、主としてＡＡ特異性またはＢＢ特異性を有する単一特異的なＩｇ様分子の産生が結果として起こる。二重特異性Ｉｇ様分子の形成は、減少するか、なくなる。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の混合物よりも、単一特異性抗体の混合物を単一細胞で産生することが好まれる。例えば、２つの同一の標的分子の架橋が望まれるとき、または２つの標的が互いに離れすぎており単一の二重特異性抗体ではこれらに結合できないときである。単一の細胞で単一特異性抗体の混合物を生産すると、単一の治療用生産物としてみなされるため有利な場合がある。

当技術分野において既に、様々な単一特異性抗体の治療効果および安全性が証明され、製造承認も得られている。単一細胞での単一特異性抗体の混合物の生産により、いくつかのこのような混合物の効果および安全性の検査を容易にし、規制に関する承認と製造のための効果およびコストを下げることができる。しかし、二重特異性の副産物の形成を５％よりも少なくすることができる、単一細胞での単一特異性抗体の特定の混合物の生産方法は現在まだ得られていない。本発明の他の目的の一つは、このような、二重特異性抗体の形成を５％よりも少なくする、明確に定義されたホモ二量体の混合物の生産手段および生産方法を提供することである。

本発明による方法は、任意の二重特異性および／または単一特異性のＩｇ様分子の望まれる混合物の生産に適している。ここでも、２を超える異なるＩｇ様分子を含む定められた混合物を生産するため、例えば、第５および第６（そして第７および第８など）のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドをコードする核酸分子をさらに用いることが可能である。

好ましくは、本発明による方法では、本発明により提供された変異のうち、少なくとも１つの本発明による変異の組み合わせを含む、少なくとも２つのＣＨ３ドメインが用いられる。これらの変異を通して、２つのＣＨ３ドメインの間に新規の特異的な相互作用が形成される。本発明によるこれらの変異については以下で詳述する。

本書では、「Ｉｇ様分子」の語は少なくとも１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを有する蛋白質性の分子を意味する。前記Ｉｇ様分子は、少なくとも１つの免疫グロブリンＣＨ３ドメインの機能をもつ配列を備え、好ましくは、該配列はＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを備える。少なくとも１つのＣＨ３ドメインを有する蛋白質性分子は、さらに特定の結合部分を備えることができる。

本発明のＣＨ３ドメインは、選択的ペアリングのための手段を含み、望ましいヘテロ二量体の結合分子または結合分子の混合物を設計するため、ＣＨ３ドメインを備える２つのタンパク質性分子の選択的ペアリングに用いられる。ＣＨ３ドメインを備える蛋白質性の分子に導入される結合部分は、以下の非限定的な例で示されるものを含むいかなる結合手段でもよい；単一鎖のFvs、単一鎖若しくはタンデムのダイアボディ（TandAb（登録商標））、VHH、Anticalins（登録商標）、Nanobodies（登録商標）、BiTE（登録商標）、Fab、アンキリン反復蛋白質若しくはDARPINs（登録商標）、Avimers（登録商標）、DART、TCR様抗体、Adnectins（登録商標）、Affilins（登録商標）、Trans-bodies（登録商標）、Affibodies（登録商標）、TrimerX（登録商標）、MicroProteins、Fynomers（登録商標）、Centyrins（登録商標）またはKALBITOR（登録商標）。

好適な一実施形態において、結合部分は抗体の可変領域（すなわち、ＶＨ／ＶＬの組み合わせ）である。ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の一部である可変領域は、好ましくは共通の軽鎖を共有する。そのような場合において、可変領域のＶＨのみが異なり、一方で全ての可変領域においてＶＬは実質的に同一である。

これに加えて、または、別の方法で、サイトカイン、ホルモン、水溶性のリガンド、受容体および／またはペプチドその他の分子も本発明のＣＨ３ドメインに導入することができる。

より好適な実施形態において、前記Ｉｇ様分子はＦｃ主鎖の全長を備える。最も好適な実施形態において、Ｉｇ様分子は抗体である。好ましくは、これらの抗体の可変領域は共通の軽鎖を共有するが、ＶＨ領域において異なりうる。

本書で用いられる「抗体」の語は、免疫グロブリンのクラスの蛋白質に属する蛋白質性の分子であって、１または２以上の抗原上のエピトープに結合するドメインであって、抗体の可変領域に由来するか、または配列相同性を有するものを含む分子を意味する。既知の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭのようないくつかのアイソタイプを含む。本発明による抗体はいかなるアイソタイプまたは機能的派生体および／またはこれらの断片でもよい。好適な一実施形態において、Ｉｇ様分子としてはＩｇＧアイソタイプの抗体が産生される。その理由は、ＩｇＧ抗体は、例えば他のアイソタイプの抗体と比較して、より長い半減期を持つからである。

本発明による方法により生産された抗体は、ネズミ科の動物およびヒトの配列を含むいかなる由来の配列を有することができる。抗体は、全部がヒト抗体由来のような、１つの由来からの配列で構成されていてもよいし、例えばキメラまたはヒト化抗体と結果的に呼ばれるように、２以上の由来を持つ配列を有してもよい。

治療用の抗体は、対象者の本来持つ抗体と近ければ近いほど好ましい（例えば、ヒトが対象の場合は、ヒト抗体）。抗体の結合は、特異性と親和性の観点から表現される。特異性により、結合ドメインがどの抗原またはエピトープと結合するかが決定される。親和性は、特定の抗原またはエピトープとの結合する力を評価する尺度である。特異的結合は、親和性（Ｋ_Ｄ）において、少なくとも１×１０^−５Ｍ、より好適には１×１０^−７Ｍ、より好適には１×１０^−９Ｍより高い親和性の結合として定義される。典型的には、治療用のモノクローナル抗体で、１×１０^−１０Ｍの親和性かそれよりも高い親和性のものが用いられる。

本書で用いられる「抗原」の語は、生体内に取り込まれると、免疫システムによる抗体の生産を引き起こす物質または分子を意味する。抗原の由来は様々であるが、とりわけ病原体、腫瘍細胞若しくはその他の異常細胞、ハプテンまたは自己組織が挙げられる。分子レベルでは、抗原は、抗体の抗原結合部位と結合する能力で特徴づけられる。抗原の混合物もやはり「抗原」とみなされる。すなわち、当業者によれば、腫瘍細胞の溶解物、またはウィルス粒子もしばしば「抗原」とみなされる一方で、このような腫瘍細胞溶解物またはウィルス粒子の調合液も多くの抗原決定基として存在する。

抗原は少なくとも１つの、しばしば２以上の、エピトープを備える。ここでの「エピトープ」の語は、免疫システム、具体的に言えば抗体、Ｂ細胞またはＴ細胞により認識される抗原の一部を意味する。エピトープは、通例、非自己の蛋白質に由来すると考えられるが、宿主に由来した配列もエピトープとして分類されうる。

「ＣＨ３ドメイン」の語は公知である。ＩｇＧ構造は、２つの軽鎖と２つの重鎖からなる、４つの鎖を有する。それぞれの軽鎖は可変領域と定常領域（ＶＬとＣＬ）の２つのドメインを有する。それぞれの重鎖は、可変領域（ＶＨ）および３つの定常領域（ＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３）の４つのドメインを有する。重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインの領域はＦｃ（Fragment crystallizable）部分、Ｆｃフラグメント、Ｆｃ主鎖または単にＦｃと呼ばれる。

ＩｇＧ分子は、ヒンジ部でジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）によりつながれた２つの重鎖と、２つの軽鎖を有するヘテロ４量体である。重鎖は、ＣＨ３−ＣＨ３ドメインの接触面での相互作用と、ヒンジ部での相互作用を通して二量化する。ヒンジ部のジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのサブクラスによって異なる（Papadea and Check 1989）。

免疫グロブリンのＦｃフラグメントは２つのＣ末端側の定常領域の二量体である。すなわち、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインである。その生理学的機能の一部は、補体系および様々な細胞の表面にある特定の受容体との相互作用である。２つの個々の重鎖のＣＨ３ドメインの間の相互作用は、重鎖の二量化を誘導する上で重要な役割を果たすことが知られている。

従って、ＣＨ３ドメインは抗体の重鎖の連関に主導的な役割を果たす。また、ＣＨ３ドメイン同士の接触面にはそれぞれの鎖からの２０を超える接触残基が含まれ、ＣＨ３−ＣＨ３相互作用で役割を果たしている（Deisenhofer J., Biochemistry 1981(20)2361-2370; Miller S., J. Mol. Biol. 1990(216)965-973; Padlan, Advances in Protein Chemistry 1996(49)57-133）。

本発明の変異型ＣＨ３ドメインは、他の抗体ドメインと関連して用いられ、二重特異性または単一特異性の抗体全長を生成することができる。ＶＨ／ＶＬの組み合わせにより定められる抗体の特異性は、ＣＨ３ドメインにより誘導される重鎖の二量化の挙動には一般に影響しない。

本書で用いられる「接触残基」「接触アミノ酸」「接触面残基」および「接触面アミノ酸」の語は、通常、ドメイン間の接触に関係しうるＣＨ３ドメインに存在する任意のアミノ酸残基のことを指す。この点については、第２の鎖の存在下および非存在下におけるＣＨ３ドメインの残基の溶媒接触可能表面積（solvent accessible surface area:ASA）の算出において、２つの条件下の計算でＡＳＡに違い（＞１Å^２）を示す残基を接触残基と同定する方法（Lee and Richards J. Mol. Biol.1971(55)379）を含む、公知の技術により計算されうる。接触残基として同定された残基は、ＥＵの番号方式に従うと、３４７，３４９，３５０，３５１，３５２，３５３，３５４，３５５，３５６，３５７，３６０，３６４，３６６，３６８，３７０，３９０，３９２，３９４，３９５，３９７，３９９，４００，４０５，４０７，４０９，４３９の位置にあるものである（表Ａ）。

ＣＨ３−ＣＨ３接触面の接触残基は、荷電したアミノ酸でも、中立なアミノ酸残基でもよい。本書で用いられる「荷電したアミノ酸残基」または「荷電残基」の語は、電気的に荷電した側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。これらは、アルギニン（Ａｒｇ，Ｒ），ヒスチジン（Ｈｉｓ，Ｈ）およびリシン（Ｌｙｓ、Ｋ）に存在するような正に荷電した側鎖でもよいし、アスパラギン酸（Ａｓｐ，Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）に存在するような負に荷電した側鎖でもよい。

本書で用いられる「中立的なアミノ酸残基」または中立な残基の語は、電気的に荷電している側鎖をもたない他のすべてのアミノ酸を指す。これらの中立な残基には、セリン（Ｓｅｒ，Ｓ），スレオニン（Ｔｈｒ，Ｔ），アスパラギン（Ａｓｎ，Ｎ），グルタミン（ＧＬｕ，Ｑ），システイン（Ｃｙｓ，Ｃ），グリシン（Ｇｌｙ，Ｇ），プロリン（Ｐｒｏ，Ｐ），アラニン（Ａｌａ，Ａ），バリン（Ｖａｌ，Ｖ），イソロイシン（Ｉｌｅ，Ｉ），ロイシン（Ｌｅｕ，Ｌ），メチオニン（Ｍｅｔ，Ｍ），フェニルアラニン（Ｐｈｅ，Ｆ），チロシン（Ｔｙｒ，Ｙ），およびトリプトファン（Ｔｒｐ，Ｔ）が含まれる。

本書での「ＣＨ３−ＣＨ３ドメイン接触面」若しくは「ＣＨ３接触面」、「ＣＨ３−ＣＨ３ペアリング」、「ドメイン接触面」または単に「接触面」は、ＣＨ３ドメインを備える違うポリペプチドの２つのＣＨ３ドメインの、アミノ酸残基の相互作用の結果としての関連性を指す。すなわち、第１のＣＨ３ドメインのアミノ酸および第２のＣＨ３ドメインのアミノ酸の間の少なくとも１つの相互作用である。このような相互作用は、例えば、ファン・デル・ワールス力、水素結合、水媒介水素結合、塩橋若しくはその他の静電気力、芳香族側鎖の間の引力相互作用、ジスルフィド結合の形成、または他の公知の力である。

本書で用いられているように、第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの、選択的ペアリングの前記手段は公知のどんな手段でもよい。

一実施形態においては、少なくとも１つの核酸分子は、例えばＲ，Ｆ，Ｙ，Ｗ，ＩまたはＬのような大きなアミノ酸残基（すなわち「ノブ」または「突起」）が接触残基の位置に含まれるＣＨ３ドメインをコードし、一方で、少なくとも一つの他の核酸分子は、例えばＧ，Ａ，Ｓ，ＴまたはＶのような小さなアミノ酸残基（すなわち、「穴」または「空洞」）が相補的な接触残基の位置に含まれるＣＨ３ドメインをコードする。結果として得られるＣＨ３ドメインは、前記接触アミノ酸の立体コンフォメーションによりお互いにペアとなりやすい。ここで、ノブ・イントゥ・ホール技術については既に詳述した。

本発明のさらなる一実施形態では、少なくとも１つの核酸分子は、本来荷電した残基のあった接触残基の位置に、すなわち、本来Ｋ，Ｈ，Ｒ，ＤまたはＥであった位置に、野生型と比較して逆の電荷を保持するアミノ酸を含むＣＨ３ドメインをコードし、一方で、少なくとも１つの他の核酸分子は、本来荷電した残基のあった相補的な接触残基の位置に、野生型と比較して逆の電荷を保持するアミノ酸を含むＣＨ３ドメインをコードする。結果として得られた操作されたＣＨ３ドメインは、前記接触アミノ酸の逆の電荷により互いにペアとなりやすい一方で、同一のＣＨ３ドメイン同士では静電的反発力によりペアとなりにくい。

一実施形態によると、欧州特許出願公開第０１８７０４５９号（特許文献３）、国際公開第２００９／０８９００４号、Gunasekaran et al (2010)に記載されたＣＨ３の変異を用いている。

一実施形態において、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの手段は「ノブ」および「ホール」アミノ酸残基であり、前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの手段は電荷が操作されたアミノ酸である。好ましくは、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの両方の前記手段は、電荷を操作されたアミノ酸である。

一実施形態において、前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのために操作されたアミノ酸残基と比較して、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングのために操作されたアミノ酸残基は異なる。

特に好適な一実施形態では、少なくとも第１および第２の核酸分子は、本発明で提供されるＣＨ３ドメインの新規の変異をコードする。以下で詳述するように、本発明は、顕著な量の望ましくない（二量体の）副産物を生産することなく、目的とする特定の二重特異性Ｉｇ様分子の生産を可能にする新規のＣＨ３変異を提供する。さらに、本発明は、顕著な量の望ましくない（二量体の）副産物を生産することなく、目的とする特定の単一特異性Ｉｇ様分子の生産を可能にする新規のＣＨ３変異を提供する。従って、本発明によるこれらのＣＨ３変異のうち少なくとも一つの使用が好まれる。

本書で用いられる「ポリペプチド」，「ポリペプチド分子」または「ポリペプチド鎖」の語は、ペプチド結合を通して、共有結合によりつながれたアミノ酸の鎖を指す。蛋白質は一般に一または二以上のポリペプチド分子で構成される。全てのポリペプチドにおいて、アミノ末端、またはＮ末端と呼ばれる一方の端、は遊離アミノ基を有している。遊離カルボキシル基を持つもう一方の端は、カルボキシル末端またはＣ末端と呼ばれる。本発明によるポリペプチドは、例えばグリコシル化のような、翻訳後修飾のプロセスを受けうる。従って、本発明のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、少なくともＩｇ・ＣＨ３ドメインを包含したポリペプチド鎖を指し、翻訳後修飾を受けたものも含みうる。

本書で用いられる「核酸分子」の語は、ヌクレオチドの鎖、より好適には、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡからなる分子として定義される。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡが用いられる。他の実施形態では、本発明の核酸分子は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡらせん、ペプチド核酸（peptide nucleic acid:PNA）、ロックド核酸（locked nucleic acid:LNA）および／またはリボザイムのような他の種類の核酸構造を備える。従って、「核酸分子」の語は、非天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよび／または天然ヌクレオチドと同一の機能を示す非核酸の構成要素を備える鎖をも包含する。

さらに、本発明は、少なくとも２つの異なったＩｇ様分子を生産する宿主細胞の作成方法において、前記方法は、前記宿主細胞に、少なくとも第１、第２、第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸配列を導入する工程を備え、少なくとも２つの前記核酸配列で、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの手段を備え、前記核酸配列は順々にまたは同時に導入される方法を提供する。

本発明のさらなる一態様では、ヘテロ二量体のＩｇ様分子の生産をするための宿主細胞を作成する方法において、前記方法は、前記宿主細胞に、少なくとも第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸配列を導入する工程を備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から正に帯電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立なアミノ酸残基から負に帯電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備え、前記核酸配列は、順々にまたは同時に導入される。前記宿主細胞を作製する前記方法は、好ましくは、前記宿主細胞に共通の軽鎖をコードする核酸配列を導入する工程を備える。

本書でさらに提供される一態様では、少なくとも第１、第２、第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸配列を備える組み換え宿主細胞において、少なくとも２つの前記核酸分子で、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドと前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの手段を備える。

さらに本発明では、少なくとも第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸配列を備える組み換え宿主細胞において、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から正に帯電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から負に帯電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備える組み換え宿主細胞が提供される。

本発明による組み換え宿主細胞は、好ましくは共通の軽鎖をコードする核酸配列を備える。

本発明の「宿主細胞」は、組み換えＤＮＡ分子を発現することができるいかなる宿主細胞でもよい。例えば、Escherichia (例えば、 E. coli ), Enterobacter, Salmonalla, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, のような細菌、S. cerevisiae, K. lactis, P. pastoris, Candida, または Yarrowiaのような酵母、Neurospora, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans および Aspergillus nigerのような糸状菌、Spodoptera frugiperda SF-9または SF-21細胞のような昆虫細胞、および、好適には、ＣＨＯ（Chinese hamster ovary）細胞、ＢＨＫ細胞、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ−０ミエローマ細胞を含むマウス細胞、ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞のような霊長類の細胞、ＭＤＣＫ細胞、BRL 3A細胞、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、不死化した初代細胞、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０またはPER.C6のような胚性の網膜細胞等の哺乳類の細胞が含まれる。

発現システムの選択においてしばしば、抗体が適切にグリコシル化されるように、哺乳類の細胞の発現ベクターおよび宿主を用いることがある。ヒト細胞株、好ましくはPER.C6は、ヒトにおけるグリコシル化パターンと一致する抗体を得るために、有利に用いられる。細胞を育てまたは増殖させるための条件（Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)参照）および組み換え産物の発現の条件とはいくぶん異なることもある。また、当業者に一般的に知られている方法により、生産物の割合および／または細胞の成長を互いに増加させるようにプロセスの最適化が通常行われる。

哺乳類の細胞培養の生産性を最大にするための一般的な指針、手順、および実用的な技術はMammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991)で知ることができる。組み換え宿主細胞での抗体の発現は公知文献に幅広い記載がある（例えば、欧州特許出願公開第０１２０６９４号、欧州特許出願公開第０３１４１６１号、欧州特許出願公開第０４８１７９０号、欧州特許出願公開第０５２３９４９号、米国特許第４８１６５６７号、国際公開第００／６３４０３号）。軽鎖および重鎖をコードする核酸分子は染色体外コピーおよび／または安定的に宿主細胞の染色体に統合されうるが、後者が好ましい。

本発明のさらなる一態様では、本発明による組み換え宿主細胞の培養物、または、入手可能な若しくは本発明による方法で得られる組み換え宿主細胞の培養物において、前記培養物は少なくとも、２つの異なるＩｇ様分子か、またはヘテロ二量体Ｉｇ様分子のいずれかを生産するものが提供される。

ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドをコードする核酸分子の配列の発現を得る際において、このような発現を誘導することができる配列は、ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドをコードする核酸分子の配列と機能的に関連があることが知られている。機能的に関連がある、という意味は、ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドまたはその前駆物質をコードする核酸配列は、ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドまたはその前駆物質の発現を誘導することができるという点で、発現を誘導できる配列と関連している、ということである。

例えば、Invitrogen社ｐｃＤＮＡベクターの一連の商品など、有用な発現ベクトルがすでに入手可能である。目的とするポリペプチドをコードする配列が、コードされたポリペプチドの転写および翻訳を統御する配列について適切に挿入された場合、結果として得られる発現カセットは目的とするポリペプチドを生産、言い換えれば発現、するのに有用である。

発現を誘導する配列は、プロモーター、エンハンサー等、およびこれらの組み合わせを含む。これらは宿主細胞で機能できる必要があり、これにより機能的に関連がある核酸配列の発現を誘導する。プロモーターは恒常的でも調節性でもよく、ウィルス、原核生物若しくは真核生物由来を含む様々な資源から得られ、または人工的に設計することができる。

目的とする核酸の発現は、天然のプロモーター若しくはその派生体、または完全に異種性のプロモーターによって起きうる。よく知られ、よく使われている、真核細胞での発現のプロモーターには、アデノウィルスのような、ウィルス由来のプロモーター（例えばＥ１Ａプロモーター），サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター（例えばＣＭＶ最初期（immediate early: IE）プロモーター），サルウィルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター等が含まれる。真核細胞からも適したプロモーターを得ることができ、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター，伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター，アクチンプロモーター，免疫グロブリンプロモーター，熱ショックプロモーター等がある。

宿主細胞で目的とする配列の発現を誘導することができるいかなるプロモーターまたはエンハンサー／プロモーターは本発明に好適である。一実施形態において、発現を誘導できる配列は、ＣＭＶプロモーターの領域を備え、好適にはＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターの−７３５から＋９５のヌクレオチド領域を備える。当業者は気づくだろうが、本発明で用いられている発現配列は、インスレーター、マトリックス結合領域、ＳＴＡＲエレメント（STAR elements：国際公開第０３／００４７０４号）等のような発現を安定化または促進する要素の組み合わせが好ましいだろう。これにより発現の安定性および／または水準を高めることができる。

組み換え宿主細胞における蛋白質の産生は、例えば、Current Protocols in Protein Science, 1995, Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8，Bendig, 1988に述べられているように幅広く記載がある。細胞の培養は、その細胞に代謝させ、および／または成長させ、および／または***させ、および／または目的とする蛋白質を産生させることによってなる。これは当業者に公知の方法により達成され、細胞に栄養を与えることを含むがそれだけではない。この方法には、表面に付着しながら増殖する方法、懸濁液で増殖させる方法、またはこれらの組み合わせを含む。

いくつかの培養条件は公知の方法により最適化でき、蛋白質の生産量を最適化することができる。培養は、例えば皿、ローラーボトル若しくは反応槽の中で、バッチ培養、流加培養、連続培養、中空糸による培養等によりなされる。細胞培養により、大規模に（連続的な）組み換えタンパク質の生産をするためには、細胞に懸濁液の中で増殖させることが好ましいことが知られている。また、動物若しくはヒト由来血清または動物若しくはヒト由来の血清の構成要素が無い条件下で細胞の培養をさせることが好ましいことが知られている。こうして培地からの追加の動物若しくはヒト由来の蛋白質が無いため、精製は容易になり安全性が高まる。一方で合成培地が再現性の点で最適であるため、システムもとても信頼できるものになる。

Ｉｇ様分子は宿主細胞で発現され、その細胞、または、好適には細胞培地から一般的に当業者に知られている方法により回収される。回収後、これらのＩｇ様分子は公知の方法を用いて精製されうる。このような方法には、免疫沈降法、遠心分離法、ろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、陽イオンおよび／または陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等が含まれる。ＩｇＧ分子を含む抗体の混合物には、プロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーが好適に用いられうる（例えば、米国特許４８０１６８７および米国特許５１５１５０４参照）。

本発明による方法により生産されたＩｇ様分子および／またはそれらの混合物は、好ましくは共通の軽鎖を有する。従って、さらに提供されるのは、本発明による方法において、前記宿主細胞に共通の軽鎖をコードする核酸分子を与える工程をさらに備える。これは少なくとも２つの異なる重鎖とペアリングできる軽鎖であり、それにより機能的な抗原結合ドメインを形成する。機能的な抗原結合ドメインは１つの抗原に特異的に結合することができる。

本発明による方法で生産されるすべての重鎖とペアリングすることができる共通の軽鎖を用いることが好ましい。これにより、機能的な抗原結合ドメインの形成において、適合しない重鎖と軽鎖のミスペアリングを避けることができる。一態様において、１つのみの同一のアミノ酸配列の、共通の軽鎖を用いることができる。別の方法では、アミノ酸配列が同一でなくとも、機能的に等価な軽鎖を「共通」の意味に含めることを当業者は認識できるだろう。前記軽鎖の多くの変異型が存在し、これらは変異（欠失、置換、付加）が存在するが機能的結合領域の形成に実質的に影響しない。従って、このような変異体も異なる重鎖に結合することができ、機能的な抗原結合ドメインを形成する。

本書で用いられる「共通の軽鎖」の語は、同一か、またはアミノ酸配列の違いを有する一方で重鎖とのペアリング後の結果としてできる抗体が結合特異性を保持している軽鎖を指す。例えば、保存的なアミノ酸の変化、および／または重鎖とのペアになった時の結合特異性に寄与しないか、部分的にしか寄与しない領域のアミノ酸の変化等を導入および試験することにより、同一の軽鎖でなくとも、なおも機能的に等価な軽鎖を作成し、または見つけることが可能である。

「共通の軽鎖」の語には、特定の共通の軽鎖およびこのような機能的に等価な変異体の組み合わせが含まれる。共通の軽鎖の使用についての詳細な説明は、国際公開第２００４／００９６１８号に記載がある。好ましくは、本発明で用いられる共通の軽鎖は、生殖細胞系列様由来の軽鎖であり、より好ましくは、生殖細胞系列由来の軽鎖であり、好ましくは、再構成されたヒト生殖細胞系列由来κ軽鎖であり、最も好ましくは、再構成されたヒト生殖細胞系列由来κ軽鎖ＩｇＶκ１−３９／ＪκまたはＩＧＶκ３−２０／Ｊκである。

別の方法では、共通の軽鎖を用いる代わりに、また、適合しない重鎖および軽鎖のミスペアリングを避けるため、当業者は、例えば国際公開第２００９／０８０２５１号，国際公開第２００９／０８０２５２号および／または国際公開２００９／０８０２５３号に説明されているような、重鎖および軽鎖の強制ペアリングの手段を選択しうる。

本発明では、新規の操作されたＣＨ３変異の組み合わせだけでなく、新規の操作されたＣＨ３ドメインを提供する。本発明の前には、ＣＨ３−ＣＨ３ペアリングに関わることが知られているＣＨ３ドメインの荷電した接触アミノ酸が、逆の電荷（電荷反転）のアミノ酸に置換され、これによりＣＨ３−ＣＨ３ペアリングに影響を与えた。

本発明による変異はこのアプローチとは別の創作である。その理由は、野生型のＣＨ３において、荷電していないか、または中立なＣＨ３のアミノ酸が荷電残基に置換されるからである。本発明のこの実施形態では、荷電した接触アミノ酸を反対の電荷のアミノ酸に交換するのではなく、荷電していないＣＨ３アミノ酸を荷電したものに置換する。

本発明のアプローチは、ただＣＨ３ドメインの二量化を効率的に進める方法を提供するだけでなく、ＣＨ３接触面において、少なくとも１つの追加の電荷−電荷相互作用が創られるという有利な点がある。ＣＨ３−ＣＨ３接触面に存在する電荷のペアに加えて、この追加の電荷−電荷相互作用により、本発明による二量体は、野生型の二量体（野生型の二量体は、ＣＨ３操作がされていない二重特異性ＩｇＧ（ＡＢ）として定義され、親のホモ二量体（ＡＡまたはＢＢ）と対照をなす）と比較して一般的により安定である。

また、驚くことに、混合物における一または複数の、目的とするＩｇ様分子の割合をさらに増加させることが可能である。上述の通り、一般的に、二重特異性抗体を優先的に生産する公知の方法では、望ましくない二量体の副産物が生産される。例えば、ノブ・イントゥ・ホール技術を用いると、目的とする二重特異性抗体の割合はせいぜい８７％である。一方で、荷電した接触アミノ酸が反対の電荷のアミノ酸に置換される静電的な操作のアプローチでは、９６％の割合になる（例えば、実施例１１を参照）。

全く驚くことには、本発明の発明者は混合物中の目的とするＩｇ様分子の割合をさらに高める変異を導入することに成功した。例えば、実施例１７では、本発明による変異を用いた方法で、結果の混合物中に二量体の副産物が全く検出されないほどの高い割合の目的とする二重特異性抗体が得られることが示されている。１つの重鎖が共通の軽鎖と対になっただけの、ペアとなっていない半分子はある程度混合物中に存在するが、これらは重鎖の不均衡な発現の結果で、サイズ排除クロマトグラフィーにより混合物から簡単に分離できる。

従って、本発明によるこのような変異により、二量体の副産物の混入が実質的に存在せずに、単一細胞で高い割合の、医薬組成品に特に好適な二重特異性のＩｇ様分子が生産される。

本発明の好適な一実施形態が提供する、単一細胞からのヘテロ二量体のＩｇ様分子を生産する方法において、前記Ｉｇ様分子は、接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、前記方法は、前記細胞に、
ａ． 第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子
ｂ． 第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与える工程を備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から負に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体Ｉｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。
好ましくは、前記方法は、前記宿主細胞に共通の軽鎖をコードする核酸分子を与える工程をさらに備えるが、それによる有利な点の概要は上述した。

１つのＣＨ３ドメインの位置３６６にあるアミノ酸と、もう一つのＣＨ３ドメインの位置３５１にあるアミノ酸は、ＣＨ３−ＣＨ３接触面において接触残基のペアとなることが報告されている。つまり、これらは結果として得られるＩｇ様分子の三次元のコンフォメーションにおいて十分近くに位置しており、お互いに相互作用することができる。従って、第１のＣＨ３ドメインは第２のＣＨ３ドメインと優先的にペアとなる。

一実施形態において、第１のＣＨ３ドメインの位置３６６のスレオニン（Ｔ）は、第１の荷電アミノ酸に置き換えられ、第２のＣＨ３ドメインの位置３５１のロイシン（Ｌ）は第２の荷電アミノ酸に置き換えられ、前記第１および第２の荷電したアミノ酸は反対の電荷を有する。もし、荷電残基を位置３６６に保持する第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドが、抗原Ａに対する特異性をもった可変領域をさらに備え、そして、もし、反対の電荷の荷電残基を位置３５１に保持する第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドが、抗原Ｂに対する特異性をもった可変領域をさらに備える場合、ＡＢ特異性をもった二重特異性Ｉｇ様分子が支配的に形成される。

本発明によりさらに提供される方法では、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段、または前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段は、前記第１または第３のＣＨ３ドメインの位置３６６のスレオニンを第１の荷電アミノ酸にする置換および前記第２または第４のＣＨ３ドメインの位置３５１のロイシンを第２の荷電アミノ酸にする置換であり、前記第１および第２の荷電アミノ酸は反対の電荷を有する。

本発明による一の好適な変異の組み合わせは、第１のＣＨ３ドメインを備え、可変領域（例えば、Ａに特異的）をさらに備えるポリペプチドの位置３６６において、スレオニン（Ｔ）をリシン（Ｋ）にする置換、および第２のＣＨ３ドメインを備え、可変領域（例えば、Ｂに特異的）をさらに備えるポリペプチドの位置３５１において、ロイシン（Ｌ）をアスパラギン酸（Ｄ）にする置換である。これは、T366K/L351’Dのペアの変異と表示される。

上述したように、１つのＣＨ３ドメインの位置３６６および２つめのＣＨ３ドメインの位置３５１のアミノ酸はＣＨ３−ＣＨ３接触面における接触残基のペアであると報告されている。位置３６６に導入されたリシンおよび位置３５１に導入されたアスパラギン酸は反対の電荷を有し、これらのアミノ酸は静電的にお互いを引き合う。従って、第１のＣＨ３ドメインは第２のＣＨ３ドメインを選択的に引きつける。また、位置３６６にリシンを有する第１のＣＨ３ドメインと位置３５１にアスパラギン酸を有する第２のＣＨ３ドメインとのペアのＩｇ様分子が支配的に形成される。

もし第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドが抗原Ａに対する特異性を有し、そして、もし第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドが抗原Ｂに対する特異性を有する場合、「ＡＢ」特異的な二重特異性Ｉｇ様分子が支配的に形成される。注記すると、いくつかの実施形態において、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の可変領域は両方とも同一かもしれないが、その場合は単一特異性Ｉｇ様分子（例えば、「ＡＡ」特異性）の形成が結果的に生じる。

上述したように、本発明による変異の有利な点の１つは、もともとあった荷電アミノ酸の相互作用の置き換えの代わりに、新しく導入された荷電アミノ酸のペアの間の新規な相互作用が生成される。この点は、これまでに開示または示唆はされていない。

本発明の一態様が提供する、単一の宿主細胞からの少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の本発明による生産方法においては、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｔ３６６Ｋを備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄを備える。

一実施形態が提供する単一細胞からのヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法においては、前記Ｉｇ様分子は接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、前記方法は、前記細胞に、
−第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、および
−第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与えることを備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｔ３６６Ｋを備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体Ｉｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。

本発明による上述のアミノ酸変異を用いることで、単一の細胞から、ヘテロ二量体のＩｇ様分子を生産することが可能になる。これにより、ホモ二量体の混入は、５％より少なく、好ましくは２％より少なく、より好ましくは１％より少なく、または、最も好ましくはホモ二量体の混入を実質的になくすことができる。

一実施形態が提供する、単一細胞からヘテロ二量体のＩｇ様分子を生産する方法では、前記Ｉｇ様分子は接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、混在するホモ二量体の存在は５％より少なく、好ましくは２％より少なく、より好ましくは１％より少なく、最も好ましくはホモ二量体の混入は実質的になく、前記方法は、前記細胞に、
−第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、および
−第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与える工程を備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｋを備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｌ３５１Ｄを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体のＩｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。

好ましくは、本発明による少なくとも２つの異なるＩｇ様分子を生産する方法、または本発明によるヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法においては、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はさらにアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋを備える。さらに好ましくは、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９ＤおよびＬ３６８Ｅよりなる群から選択されたアミノ酸置換をさらに備える。最も好ましくは、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｌ３６８Ｅを備える。

従って、好ましい一実施形態において、本発明による上述のT366K/L351’D変異は、第２のＣＨ３ドメインの位置３６８におけるロイシン（Ｌ）をグルタミン酸（Ｅ）にする置換とさらに組み合わせることができる。これは、例えば、T366K/L351’D, L368’E変異と表示できる（しかし、T336K/L351D-L368EまたはT366K/L351D, L368EまたはT366K-L351D,L368Eのような別の方法による表示も可能である）。

実施例１７に示されるように、本発明による、抗原Ａに特異性を持つ第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドおよび抗原Ｂに特異性を持つ第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドへのこの変異の導入により、二面性のＡＢ特異性をもつ二重特異性Ｉｇ様分子を特に良い割合で得ることができる。このペアの変異により、検知できる量のホモ二量体の形成が無く、二重特異性抗体を得ることができる。

一の好ましい実施形態が提供する単一細胞からのヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法においては、前記Ｉｇ様分子は接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、混入するホモ二量体の存在は５％より少なく、好ましくは２％より少なく、より好ましくは１％より少なく、そして最も好ましくは混入するホモ二量体が実質的に無く、前記方法は、前記細胞に、
−第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、および
−第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与えることを含み、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｔ３６６Ｋを備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体Ｉｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。

もう一つの好ましい実施形態では、第１のＣＨ３ドメインの位置３６６のスレオニン（Ｔ）をリシン（Ｋ）に、第２のＣＨ３ドメインの位置３５１のロイシン（Ｌ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、前記第２のＣＨ３ドメインの位置３４９のチロシン（Ｙ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換する。これは例えばT366K/L351’D,Y349’E変異と表示されるほか、例えばT366K-L351D:Y349EまたはT366K/L351D,Y349Eまたは単にT366K/L351DY349Eと表示される。

Ｙ３４９残基は二量体相互作用に寄与しうる位置３５１の残基の近傍の残基である。in silicoのデータによれば、Ｙ３４９Ｅは、単一二量体の不安定化（より高い計算上のスコア）だけでなく、ヘテロ二量体の安定性（より低い計算上のスコア）にもつながり、位置３４９においてはアスパラギン酸（Ｄ）よりもグルタミン酸（Ｅ）の方がより好ましい。従って、すでに位置３５１のアミノ酸置換を有する、第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドに第２のアミノ酸置換を導入すると、ヘテロ二量化が起きやすくなる。

特に好ましい一実施形態が提供する、単一細胞からのヘテロ二量体のＩｇ様分子の生産方法においては、前記Ｉｇ様分子は、接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、ホモ二量体の混入は５％より少なく、より好ましくは２％より少なく、さらにより好ましくは１％より少なく、最も好ましくは実質的に無く、前記方法は、前記細胞に、
−第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、および
−第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与えることを備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｔ３６６Ｋを備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＹ３４９Ｅを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体のＩｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。

もう一つの好ましい実施形態では、第１のＣＨ３ドメインの位置３６６のスレオニン（Ｔ）をリシン（Ｋ）に、第２のＣＨ３ドメインの位置３５１のアスパラギン酸（Ｄ）をロイシン（Ｌ）に、前記第２のＣＨ３ドメインの位置３４９のチロシン（Ｙ）をグルタミン酸（Ｅ）に、前記第２のＣＨ３ドメインの位置３６８のロイシン（Ｌ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換する。これはT366K/L351’D,Y349’E,L368’E変異と表示される。２つの残基Ｙ３４９およびＬ３６８は二量体の相互作用に寄与しうる残基である。

In silicoのデータによると、Ｙ３４９ＥおよびＬ３６８Ｅは、ＢＢ二量体の不安定化（より高いin silicoのスコア）だけでなく、ヘテロ二量体の安定化（より低いin silicoのスコア）につながり、位置３４９および３６８のグルタミン酸は、アスパラギン酸（Ｄ）よりも好ましい。従って、すでに位置３５１にアミノ酸置換を有するＢ−鎖に、第２および第３のアミノ酸置換を導入することで、ヘテロ二量体の形成がさらに促進される。

特に好ましい一実施形態が提供する、単一細胞からのヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法においては、前記Ｉｇ様分子は接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、ホモ二量体の混入は５％より少なく、より好ましくは２％より少なく、さらにより好ましくは１％より少なく、最も好ましくは実質的に無く、前記方法は、前記細胞に、
−第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、および
−第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与える工程を備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｔ３６６Ｋを備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ、Ｙ３４９ＥおよびＬ３６８Ｅを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体のＩｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。

もう一つの好ましい実施形態では、第１のＣＨ３ドメインの位置３６６のスレオニン（Ｔ）をリシン（Ｋ）に、前記第１のＣＨ３ドメインの位置３５１のロイシン（Ｌ）をリシン（Ｋ）に、第２のＣＨ３ドメインの位置３５１のロイシン（Ｌ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、前記第２のＣＨ３ドメインの位置３６８のロイシン（Ｌ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換する。これはT366K,L351K/L351’D,L368’E変異と表示される。実施例に示されているように、この変異も目的の（二重特異性）抗体の割合を高める。さらに、この変異では、検出できる量のホモ二量体の形成が無く、二重特異性抗体を得ることができる。

さらに提供される、単一細胞からのヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法においては、前記Ｉｇ様分子は接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、ホモ二量体の混入は５％より少なく、より好ましくは２％より少なく、さらにより好ましくは１％より少なく、最も好ましくは実質的に無く、前記方法は、前記細胞に、
−第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、および
−第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与える工程を備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体のＩｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。

もう一つの好ましい実施形態では、第１のＣＨ３ドメインの位置３６６のスレオニン（Ｔ）をリシン（Ｋ）に、前記第１のＣＨ３ドメインの位置３５１のロイシン（Ｌ）をリシン（Ｋ）に、第２のＣＨ３ドメインの位置３５１のロイシン（Ｌ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、前記第２のＣＨ３ドメインの位置３４９のチロシン（Ｙ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、前記第２のＣＨ３ドメインの位置３５５のアルギニン（Ｒ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換する。これはT366K,L351K/L351’D,Y349’D,R355’D変異と表示される。このT366K-L351K/L351’D-Y349’Dのペアは、Ｂ−鎖のR355’D変異によりさらに改善され、ＢＢについてのin silicoのスコアが高まり、ＡＢについてのin silicoのスコアもわずかに高くなる。

さらに提供される、単一細胞からのヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法においては、前記Ｉｇ様分子は接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、ホモ二量体の混在は５％より少なく、より好ましくは２％より少なく、さらにより好ましくは１％より少なく、最も好ましくは実質的に無く、前記方法は、前記細胞に、
−第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、および
−第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与える工程を備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、アミノ酸置換Ｌ３５１Ｄ、Ｙ３４９ＤおよびＲ３５５Ｄを備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体のＩｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。

表Ｂは、ヘテロ二量体またはホモ二量体の生成のための選択的ペアリングの好適な手段として、ＣＨ３ドメインに導入される変異の一覧である。

本発明による、少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の生産方法、または本発明による、ヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法は、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段および／または前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段は、少なくとも１つの表Ｂに示された変異の組み合わせを備え、これにより提供される。好ましくは、前記第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段と、前記第３および第４のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの選択的ペアリングの前記手段は、少なくとも２つの表Ｂに示された変異の組み合わせを備える。

本発明が提供する新規のＣＨ３変異の組み合わせでは、単一細胞での、少なくとも２つの単一特異性Ｉｇ様分子の混合物を生産することができ、二重特異性Ｉｇ様分子の混入は５％より少なく、好ましくは２％より多く、より好ましくは、１％より少なく、最も好ましくは実質的に無い。本発明によるこれらの変異は、単一特異性抗体の混合物の生産に特に好適である。このことは、２つの同一の標的分子の高水準の架橋が望まれるとき、腫瘍細胞の補体による溶解のような特定のエフェクター機構を活性化するため、標的細胞での抗体の密度を十分高くする必要があるとき、若しくは２つの標的が互いに離れすぎて単一の二重特異性抗体では結合されないとき、または規制の承認を得るための手続きを単純にするために特に有用である。

このような場合では、このような単一特異性抗体のための生産プラットフォームを最適化することがしばしば望まれる。実施例１０に示され、本発明から洞察されるように、第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド（例えば、Ａ特異性を有する）の位置３９２のリシン（Ｋ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換し、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの位置３９９のアスパラギン酸（Ｄ）をリシン（Ｋ）に置換し、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの位置４０９のリシン（Ｋ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換したとき、ＡＡ特異性をもつ単一特異性Ｉｇ様分子を含む少なくとも２つの異なる単一特異性Ｉｇ様分子の混合物を単一細胞で生産することができ、二重特異性の副産物（二重特異性Ｉｇ様分子）の形成は５％より少なく、または３％より少なく、または実質的に全く検出されない程度にまで減少する。

従って、上述の変異の組み合わせ（K392D, D399K, K409Dと表示される）は、単一特異性Ｉｇ様分子の混合物の生産には特に好ましい。当業者ならば、機能的な変異体、すなわち、K392E, D399R, K409Eは結果として同様の効果を挙げることができると認識できるだろう。加えて、D399KおよびK409Dの置換を備える二重の変異体、または、K392DおよびK409D，D399RおよびK409E等も同様の効果を挙げることができるだろう。

第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの位置３５６のグルタミン酸（Ｅ）をリシン（Ｋ）に、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの位置３５７のグルタミン酸（Ｅ）をリシン（Ｋ）に、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの位置４３９のリシン（Ｋ）をアスパラギン酸（Ｄ）に、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドの位置３７０のリシン（Ｋ）をアスパラギン酸（Ｄ）に置換する場合の変異の組み合わせでも同様である。この変異の組み合わせ（E356K, E357K, K439D, K370Dと表示される）も単一特異性Ｉｇ様分子の混合物の生産に特に好ましい。

当業者ならば、機能的な変異体、すなわち、K356R, E357R, K439E, K370Eは結果として同様の効果を挙げることができると認識できるだろう。加えて、E356KおよびK439D，E357KおよびK370Dの置換を備えた三重若しくは二重変異体、またはその他の機能的な変異体も同様の効果を挙げることができるだろう。

さらなる一実施形態が提供する、単一の宿主細胞からの少なくとも２つの異なる単一特異性のＩｇ様分子の生産方法では、前記２つのＩｇ様分子のそれぞれは接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、前記方法は、前記細胞に、
−Ａ特異性を有する第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、および
−Ｂ特異性を有する第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与える工程を備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、Ｋ３９２Ｄ，Ｄ３９９ＫおよびＫ４０９Ｄの変異を備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、野生型のＣＨ３ドメインを備えるか、またはＥ３５６Ｋ，Ｅ３５７Ｋ，Ｋ４３９ＤおよびＫ３７０Ｄ変異を備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記核酸分子を発現させ、前記少なくとも２つの異なるＩｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。

別の実施形態が提供する、単一の宿主細胞からの少なくとも２つの異なる単一特異性Ｉｇ様分子の生産方法では、前記２つのＩｇ様分子のそれぞれは接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、前記方法は、前記細胞に、
−Ａ特異性を有する第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、および
−Ｂ特異性を有する第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
を与える工程を備え、前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、野生型のＣＨ３ドメインを備えるか、Ｋ３９２Ｄ，Ｄ３９９Ｋ，Ｋ４０９Ｄの変異を備え、前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、Ｅ３５６Ｋ，Ｅ３５７Ｋ，Ｋ４３９Ｄ，Ｋ３７０Ｄ変異を備え、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記核酸分子を発現させ、前記少なくとも２つの異なるＩｇ様分子を培養から回収する工程をさらに備える。

実施例１０で示されるように、２つの単一特異性Ｉｇ様分子は、単一細胞で生産され、二重特異性Ｉｇ様分子の形成は実質的に検出されない。当業者ならば、野生型または操作されたＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第３の核酸分子を選択し、３つの単一特異性抗体の混合物が生産される等のように前記宿主細胞に提供しうる。

本発明の一態様において提供される、本発明による、少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の生産方法、またはヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法においては、それぞれのＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は異なる標的エピトープを認識する可変領域をさらに備え、その標的エピトープは同一分子上に位置する。

これにより、１つのエピトープのみが標的とされた場合と比較して、前記標的分子の（生物学的）機能に、より効率的な拮抗作用を与えることができる。例えば、ヘテロ二量体Ｉｇ様分子は、増殖因子の受容体若しくは腫瘍細胞が増殖するために重要な水溶性の分子等に存在する２つのエピトープに同時に結合しうる。これにより、いくつかの独立したシグナル伝達経路を効率的に阻害し、制御されていない増殖に導きうる。そして、少なくとも２つのＩｇ様分子のいかなる組み合わせにおいて、このような増殖因子の受容体または水溶性の分子に存在する２または３、または４のエピトープに同時に結合しうる。

一の好適な実施形態において、標的分子は水溶性の分子である。他の好適な実施形態においては、標的分子は膜結合性分子である。

本発明の他の態様における、本発明による、少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の生産方法またはヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法では、それぞれのＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、標的エピトープを認識する可変領域をさらに備え、標的エピトープは異なる分子に位置する。この場合では、それぞれの異なる標的分子は水溶性の分子または膜結合性分子としうる。

一実施形態においては、該異なる標的分子は水溶性分子である。あるいは、１つの標的分子は水溶性分子である一方、２番目の標的分子は膜結合性分子である。さらに別の場合においては、標的分子の両方は膜結合性の分子である。一実施形態においては、異なる標的分子は同一の細胞に発現しており、他の実施形態では異なる細胞に異なる標的分子が発現される。

非制限的な例として、任意のヘテロ二量体Ｉｇ様分子または少なくとも２つのＩｇ様分子の任意の組み合わせは、複数の膜結合性受容体を同時に阻害したり、腫瘍細胞へのサイトカイン若しくは増殖因子のような複数の水溶性分子を同時に中立化したり、または異なるウィルス血清型若しくはウィルス株を中立化したりするのに好適である。

一の好適な実施形態が提供する、少なくとも２つのＩｇ様分子またはヘテロ二量体Ｉｇ様分子の本発明による生産方法においては、少なくとも前記標的エピトープのうちの１つは腫瘍細胞に位置する。別の方法において、またはこれに加えて、少なくとも前記標的エピトープのうちの１つはエフェクター細胞の表面に位置する。これは、例えば腫瘍細胞の殺傷のためのＴ細胞またはＮＫ細胞の動員に好適である。例えば、本発明による方法で生産された少なくとも１つのＩｇ様分子は、免疫エフェクター細胞に位置する標的分子に特異的に結合することにより、免疫のエフェクター細胞、好ましくはヒト免疫エフェクター細胞、を動員することができる。

さらなる一実施形態において、Ｉｇ様分子が標的分子に結合した後、前記免疫エフェクター細胞は活性化される。エフェクター機構の誘導には、例えば、本発明による方法により生産されたＩｇ様分子による、免疫で調節された細胞毒性の再変更が包含される。該Ｉｇ様分子は、Ｔ細胞受容体またはＦｃγ受容体のように細胞毒性を引き起こす分子に結合することができ、これにより下流の免疫エフェクター経路を活性化することができる。

本書で用いられる「免疫エフェクター細胞」または「エフェクター細胞」の語は、活性化されることにより、標的細胞の生存能力に影響を与える哺乳類の免疫システムの自然の細胞集団のレパートリーを指す。免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のようなリンパ球系の細胞、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞、またはＢ細胞を含むだけでなく、単球やマクロファージ、樹状細胞および好中性顆粒球のような骨髄細胞系列の細胞も免疫エフェクター細胞とみなされる。従って、前記エフェクター細胞は、好ましくは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞または好中性顆粒球である。

免疫エフェクター細胞に存在する標的抗原にはＣＤ３，ＣＤ１６，ＣＤ２５，ＣＤ２８，ＣＤ６４，ＣＤ８９，ＮＫＧ２ＤおよびＮＫｐ４６が含まれる。さらに提供されるのは、本発明による、少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の生産方法またはヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法であって、前記標的エピトープはＣＤ３，ＣＤ１６，ＣＤ２５，ＣＤ２８，ＣＤ６４，ＣＤ８９，ＮＫＧ２ＤまたはＮＫｐ４６分子に位置する。標的細胞の生存能力には、細胞の生存、増殖および／または他の細胞との相互作用する能力が含まれる。

本発明の一態様が提供する、本発明による、ヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法では、それぞれのＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、標的エピトープを認識する可変領域をさらに備える。一実施形態においては、ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖のそれぞれの２つの可変領域は、同一の標的エピトープを、異なる親和性で認識する。他の実施形態においては、ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖のそれぞれの２つの可変領域は、異なる標的エピトープを認識する。

他の実施形態においては、異なる標的エピトープは同一の標的分子に位置し、該標的分子は、膜結合性分子または水溶性分子でありうる。他の実施形態においては、異なる標的エピトープは、異なる標的分子に位置し、該標的分子は、同一の細胞または異なる細胞に発現される。あるいは、異なる標的分子は水溶性分子であるか、または１つの標的分子は水溶性分子で２番目の標的分子は膜結合性分子でありうる。

好適な一実施形態において、ヘテロ二量体Ｉｇ様分子の、少なくとも１つの標的分子は腫瘍細胞に位置する。さらに他の好適な一実施形態においては、ヘテロ二量体Ｉｇ様分子の少なくとも１つの標的分子は、エフェクター細胞（すなわち、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞または好中性顆粒球、そして前記標的エピトープはＣＤ３，ＣＤ１６，ＣＤ２５，ＣＤ２８，ＣＤ６４，ＣＤ８９，ＮＫＧ２ＤまたはＮＫｐ４６分子に位置する）に位置する。

好適な実施形態が提供する、本発明による、少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の生産方法またはヘテロ二量体Ｉｇ様分子の生産方法では、上述のように、前記少なくとも２つの異なるＩｇ様分子は抗体であり、最も好ましくはＩｇＧアイソタイプの抗体であり、さらにより好ましくはＩｇＧ１アイソタイプの抗体である。

本発明による方法で得られる、Ｉｇ様分子、ヘテロ二量体Ｉｇ様分子、または少なくとも２つのＩｇ様分子の混合物がさらに提供される。前記（ヘテロ二量体）Ｉｇ様分子またはＩｇ様分子の混合物は、好ましくは、少なくとも１つの表Ｂに記載されたＣＨ３変異を備える。本発明による、少なくとも１つのＩｇ様分子、または少なくとも２つのＩｇ様分子の混合物を含む医薬組成物だけでなく、（ヘテロ二量体）Ｉｇ様分子または少なくとも２つのＩｇ様分子の混合物において、少なくとも１つの表Ｂに記載された変異を備えるものも提供される。

一実施形態においては、前記Ｉｇ様分子は、二重特異性抗体のような二重特異性Ｉｇ様分子である。他の実施形態においては、前記Ｉｇ様分子は、単一特異性抗体のような単一特異性Ｉｇ様分子である。好適な一実施形態が提供する、本発明による方法で得られる少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の混合物では、前記少なくとも２つの異なるＩｇ様分子は、同一の抗原にある異なるエピトープおよび／または異なる抗原にある異なるエピトープに結合する。

さらに提供される、本発明による方法により得られるヘテロ二量体Ｉｇ様分子では、前記ヘテロ二量体Ｉｇ様分子は、同一の抗原にある異なるエピトープおよび／または異なる抗原にある異なるエピトープに結合する。この混合物および抗体の利点および好適な使用法は上述した。

本発明が提供する、本発明による方法により得られる少なくとも２つの異なるＩｇ様分子の混合物では、前記少なくとも２つの異なるＩｇ様分子は少なくとも１つのヘテロ二量体Ｉｇ様分子を備える。一実施形態において、２つの前記少なくとも２つの異なるＩｇ様分子はヘテロ二量体Ｉｇ様分子である。

さらにもう一つの好適な実施形態が提供するヘテロ二量体の抗体は、２つのＣＨ３ドメインを備え、前記２つのＣＨ３ドメインの１つはアミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを備え、前記２つのＣＨ３ドメインの他の一つはアミノ酸置換Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを備える。これらのアミノ酸置換は、上述したように、前記２つのＣＨ３ドメインの選択的ペアリングの好適な手段である。

前記２つのＣＨ３ドメインの１つにおけるアミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅと、前記２つのＣＨ３ドメインのもう一方のアミノ酸置換Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋは、あわせて、「ＤＥＫＫ組み合わせ変異」，「ＤＥＫＫ変異体」，「ＤＥＫＫペア」，「ＤＥＫＫ操作されたＣＨ３ドメイン」，「ＤＥＫＫ」と呼ぶか、またはＤＥＫＫに言及する他の名前が用いられる。アミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを保持するＣＨ３ドメインも「ＤＥ側」と呼び、アミノ酸置換Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを保持するＣＨ３ドメインも「ＫＫ側」と呼ぶ。

本発明による任意の方法により得られる、（ヘテロ二量体）Ｉｇ様分子、または少なくとも２つのＩｇ様分子の混合物を含む医薬組成物も提供される。本発明による、前記（ヘテロ二量体）Ｉｇ様分子、または前記少なくとも２つのＩｇ様分子は、好ましくは抗体である。前記医薬組成物は前記（ヘテロ二量体）Ｉｇ様分子、単一特異性若しくは二重特異性Ｉｇ様分子を含む混合物または単一特異性および二重特異性Ｉｇ様分子の組み合わせを含む。

また、本発明による医薬組成物は、薬学的に容認可能な担体を備える。本書で用いられる、このような「薬学的に容認可能な担体」は、任意の、そして全ての溶媒、塩、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収を遅らせる薬剤、およびこれらに類似の生理学的に混合可能なもの等である。投与するルート（例えば、静脈内、皮下、関節内等）により、Ｉｇ様分子は、Ｉｇ様分子を不活性化しうる酸の作用およびその他の自然の条件からＩｇ様分子を守るための物質にコートされうる。

一態様において提供される、本発明による任意の方法により得られる少なくとも２つのＩｇ様分子の混合物を備える医薬組成物では、前記少なくとも２つの異なるＩｇ様分子は本発明による組み換え宿主細胞により生産される。さらに、提供される医薬組成物では、本発明による任意の方法により得られるヘテロ二量体Ｉｇ様分子を備え、前記ヘテロ二量体Ｉｇ様分子は本発明による組み換え宿主細胞により生産される。

少なくとも１つの表Ｂに記載された変異を備えるＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸分子に加え、少なくとも１つの表Ｂに記載された変異を備えるＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする少なくとも１つの核酸分子を備える組み換え宿主細胞も提供される。

本発明は以下の実施例によりさらに説明される。これらの実施例は本発明を制限するものではなく、本発明を単に明瞭にするために示される。

図１Ａ）はコンストラクトベクターＭＶ１０５７の概略図である。詰込み領域（stuffer region）は抗体のＶＨ領域がクローンされる領域である。図１Ｂ）はファージディスプレイベクターＭＶ１０４３の概略図である。 コンストラクトベクターＭＶ１０５７に存在する野生型ＩｇＧ１のＦｃのアミノ酸配列である（ＥＵの番号方式を適用）。 様々なコンストラクトにクローンするのに用いられるＶＨ領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。 トランスフェクションＡの質量スペクトルのデータである。 トランスフェクションＧの質量スペクトルのデータである。 トランスフェクションＨの質量スペクトルのデータである。 トランスフェクションＭの質量スペクトルのデータである。 トランスフェクションＵの質量スペクトルのデータである。 トランスフェクションＯの質量スペクトルのデータである。 中立的なアミノ酸を荷電アミノ酸に置換することによるホモ二量化の阻害である。 中立的なアミノ酸を荷電アミノ酸に置換することによるホモ二量化の阻害である。 図８（Ａ）はトランスフェクション試料ＺＯ（T366K/L351’D）のネイティブ質量分析（Native MS）スペクトルである。図８（Ｂ）はトランスフェクション試料ＺＯ（T366K/L351’D）の畳み込み操作を加えた質量分析スペクトルである。２番目の／主要なピークが二重特異性分子のものである。 実験的に検証された変異のペアのＨＡＤＤＯＣＫスコアである。 ＣＨ３−ＣＨ３接触面の相互作用の絵である。図１０Ａ）はK409D:K392D/D399’K:E356’Kのものであり、図１０Ｂ）はD399K:E356K/D399’K:E356’Kのものであり、図１０Ｃ）はK409D:K392D/K409’D:K392’Dのものである。 様々な366/351’電荷変異体のＨＡＤＤＯＣＫスコアである。 ＣＨ３−ＣＨ３接触面の相互作用の絵である。図１２Ａ）はL351D/L351’Dのものであり、図１２Ｂ）はL351D:S354A:R355D/L351’D:S354’A:R355’Dのものである。 位置Ｌ３５１の付近における追加の電荷の変異のＨＡＤＤＯＣＫスコアである。 鎖Ａの位置Ｔ３６６および鎖Ｂの位置Ｌ３５１の付近における追加の電荷の変異のＨＡＤＤＯＣＫスコアである。 ＣＨ３−ＣＨ３接触面の相互作用の絵である。 Ｔ３６６／Ｌ３５１の付近の変異体におけるＨＡＤＤＯＣＫスコアである。 Ｔ３６６／Ｌ３５１の付近の追加の変異体におけるＨＡＤＤＯＣＫスコアである。 コンストラクトT366K,L351Kと、コンストラクトL351D（左側の図）またはL351D,Y349E（右側の図）とを共発現した後に得られた二重特異性ＩｇＧのｎＭＳスペクトルの例である。１価のＩｇＧ全長を基に拡大した（半体は不図示）。 ＡＡ，ＡＢ，ＢＢ，ＡおよびＢの相対的な量を示す質量分析の結果である（全ての種類の合計が１００％）。 図１９Ａと同データであるが、ＡＢを除いて表示することにより、望ましくないＡＡ，ＢＢ，ＡおよびＢに関し外観が分かりやすいようにしている。 熱安定性アッセイの結果である。四角：野生型，三角：電荷反転ペア E356K:D399K/K392D:K409D，丸：それぞれのグラフの上方に示された変異ＣＨ３の組み合わせ。 １０回の凍結融解の実験の結果である。1122＝第１の親の抗体ＢＢ；1337＝第２の親の抗体ＡＡ；野生型＝ＡＡ，ＡＢ，ＢＢ；ＣＲ＝電荷反転ペアE356K:D399K/K392D:K409Dの二重特異性抗体；3-6および9-12＝表15における3-6および9-12の二重特異性分子の組み合わせ。 フィブリノーゲンをコートした抗原として用い、ＥＬＩＳＡにより血清の安定性を計測した結果である。図２２Ａ）はＩｇＧ試料を０．５μｇ／ｍｌまで希釈した時のＥＬＩＳＡのデータである。図２２Ｂ）はＩｇＧ試料を０．０５μｇ／ｍｌまで希釈した時のＥＬＩＳＡのデータである。結果は、Ｔ＝０（日目）の時点を１００％として規格化した。1337＝第２の親の抗体ＡＡ；野生型＝ＡＡ，ＡＢ，ＢＢ；ＣＲ＝電荷反転ペア E356K:D399K/K392D:K409Dの二重特異性抗体；3-6および9-12＝表15における3-6および9-12の二重特異性分子の組み合わせ。 トランスフェクションの比率が１：５から５：１までの場合の実験のｎＭＳの結果である。図２３ＡはＤＥＫＫ組み合わせ変異であり、「Ａ」特異性がＤＥ側であり、「Ｂ」特異性がＫＫ側である。 トランスフェクションの比率が１：５から５：１までの場合の実験のｎＭＳの結果である。図２３ＢはＤＥＫＫ組み合わせ変異であり、「Ｃ」特異性がＤＥ側であり、「Ｂ」特異性がＫＫ側である。 トランスフェクションの比率が１：５から５：１までの場合の実験のｎＭＳの結果である。図２３Ｃは電荷反転変異の組み合わせであり、「Ａ」特異性がE356K:D399K側であり、「Ｂ」特異性がK392D:K409D側である。 表２０からのトランスフェクション＃１−１１のｎＭＳの結果である。 異なるＣＨ３操作されたベクターの二量体のＨＡＤＤＯＣＫスコアである。灰色のバー：望ましい種ＡＢおよびＣＤ；黒色のバー：望ましくない種ＡＡ，ＢＢ，ＣＣ，ＤＤ，ＡＣ，ＢＣ，ＡＤ，ＢＤ。 表２０からのトランスフェクション＃１−１１のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。対照試料ＤＥ／ＫＫ，ＤＥ／ＤＥおよびＫＫ／ＫＫが含まれる。 トランスフェクション＃９のｎＭＳである。 トランスフェクション＃１１のｎＭＳである。 ゲル濾過した試料1516:1516のｎＭＳである。 ゲル濾過した試料1337:1337のｎＭＳである。 ゲル濾過した試料1516:1337のｎＭＳである。 ＤＥＫＫ操作された抗体およびその２つの親抗体の血中濃度である（ｐＫ研究）

（実施例１：様々な異なるＣＨ３ドメインを生成するアミノ酸置換）
ＣＨ３ドメインを備えるＩｇ様分子のペアリングを選択的に促進するかまたは阻害し、ＣＨ３ドメインの異なる多種多様なＩｇ様分子を得るため、ヘテロ二量体の形成を促進すると知られている多くのアミノ酸置換および、これまで報告のない、または試されていないがホモ二量体の形成を促進するように選ばれた多くの別のアミノ酸置換を、コンストラクトベクターに導入した（コンストラクトベクターＭＶ１０５７；図１Ａ）。

コンストラクトベクターＭＶ１０５７は、図２に記載された通常の野生型ＩｇＧ１のＦｃ部をコードする核酸配列を備える。表１はこの野生型Ｆｃに導入されたアミノ酸置換のリストであり、一連の７つのコンストラクトとなる。すべてのコンストラクトはGeneartにより作成された。コンストラクト１，２および３，またはその代替物は、これまでにヘテロ二量化を促進する報告があった（欧州特許出願公開第０１８７０４５９号、国際公開第２００９／０８９００４号）。コンストラクト６および７についても報告がある（国際公開第９８／５０４３１号）。コンストラクト４および５は新しく、ホモ二量体を促進するよう設計されている。

（実施例２：ＣＨ３変異のあるコンストラクトにＶＨをクローニングする）
これらのコンストラクトへのクローニングに、既知の特異性をもち、また既知のヒトIGKV1-39軽鎖との結合能をもついくつかの抗体ＶＨ領域が用いられた。
上述のように、すべてのＣＨ３変異体は、他の抗体ドメインと共に用いられることで、二重特異性または単一特異性の抗体全長となりうる。ＶＨ／ＶＬの組み合わせにより定められる抗体の特異性は、ＣＨ３ドメインにより誘導される重鎖の二量化の挙動には影響しない。モデルとなるＶＨ／ＶＬの組み合わせ、つまり、全ての軽鎖はヒト生殖細胞系列IGKV1-39に基づき、ＶＨは様々である組み合わせが、本研究を通じて用いられる。

図３は、本研究を通じて用いられる抗体ＶＨ領域の全配列と特異性である。ＭＦコードはMerus社の様々なＶＨに対する内部の称呼であり、例えば、VH MF1337は破傷風トキソイドに、MF1025はブタチログロブリンに、MF1122はウシフィブリノーゲンに特異性を有する。

ファージディスプレイベクターMV1043（図１Ｂ）にあるＶＨ領域は、制限酵素SfiIおよびBstEII（New England Biolabs/ cat# R0123L および R0162L/、製造業者の指示に従う）により切断され、このベクターからＶＨフラグメントが切り出される。標準的な方法（製造業者の指示に従う）により、ベクターMV1057はSfiIおよびBstEIIによって切断される。

フラグメントおよびベクターはゲル（Promega/ cat# V3125/ 製造業者の指示に従う）において精製され、切られたベクターおよびＶＨ遺伝子挿入物は単離される。両方はライゲーションにより結合され、その後、連結された核酸はE.coli DH5α（Invitrogen/ cat# 12297-016）に形質転換される（製造業者の指示に従う）。翌日、単一のコロニーが選び出され、適切な挿入が起こっているベクターを同定するため配列決定する。

（実施例３：トランスフェクションおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＩｇＧ全長の発現）
再クローンされたＶＨ変異体、さらに共通の軽鎖であるヒトIGKV1-39をコードする様々なプラスミドの、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションは、ＩｇＧが発現できるような標準的な手順（de Kruif et al Biotech Bioeng. 2010）で行われる。トランスフェクションの後、上清のＩｇＧの発現レベルはForteBIO Octet-QKシステムで測定される。該システムはバイオレイヤー干渉法（Bio-Layer Interferometry （BLI））に基づき、リアルタイムの定量化と生体分子の相互作用の動的特性評価を可能にする。詳細は
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参照。５μｇ／ｍｌを超える発現量が測定された場合、ＩｇＧはプロテインＡ親和性精製を用いて精製される。

（実施例４：ＩｇＧの精製）
プロテインＡカラム（GE Healthcare/ cat# 11-0034-95/ 製造業者の指示に従う）を用いて培養の上清を精製した後、ｐＨ３．０の０．１Ｍクエン酸バッファに溶出し、直ちに同体積の、ｐＨ８．０の１．０ＭのTris-HCLにより中和させるか、直接的に脱塩カラムを用いてＰＢＳに再バッファーする。別の方法では、プロテインＡビーズ（セファロースビーズCL-4B，GE healthcare cat#170780-01）を用いてＩｇＧを精製してもよい。

（実施例５：抗原特異的ＥＬＩＳＡ）
抗原特異的ＥＬＩＳＡは、抗原に対する結合活性を評価するために行われる。抗原補足ＥＬＩＳＡは、二重特異性抗体の結合活性を立証するために行われる。ビオチン化された２番目の抗原が複合体の検出に用いられる（de Kruif et al Biotech Bioeng. 2010）。

（実施例６：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
精製されたＩｇＧ混合物は標準的な手順により、還元条件下および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE（登録商標） 4-12% bis-tris gel/Invitrogen/ cat# NP0323BOX）により解析された。また、ゲルの蛋白質はコロイド状の青色試薬（PageBlue（商標）protein staining solution/Fermentas/ cat# RO571）により染色された。

（実施例７：酵素によるＩｇＧ１の脱グリコシル化）
ＩｇＧのグリコシル化は不均一なので、質量スペクトル分析に好適に用いられるよう、１つの生産物がはっきりとした一の質量ををもつために脱グリコシル化をが行われた。１０μｇのＩｇＧ１に対し一単位のＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ；Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を投与し、３７℃で一晩培養した。元々の精製バッファ（０．１Ｍクエン酸バッファｐＨ３．０／１．０Ｍ Tris-HCL pH 8.0）を除去するため、１０ｋＤａ・ＭＷＣＯ遠心分離フィルターカラム（Millipore）を用いたバッファ交換が行われ、ＰＢＳに再バッファした。分離されたグリカン鎖を除去するために、同様のバッファ交換の手順が行われ、ｐＨ７．５の１５０ｍＭ酢酸アンモニウムに交換された。フィルターはｐＨ７．５の１５０ｍＭ酢酸アンモニウム２００μｌで１２分、１１０００ｒｐｍ、４℃の条件で洗い流された。洗い流された後、５０μｌの脱グリコシル化したＩｇＧがフィルターに投与され、ｐＨ７．５の１５０ｍＭ酢酸アンモニウム４５０μｌが加えられた。その後、もう一度、１２分、１１０００ｒｐｍ、４℃の条件で遠心分離をした。毎回１５０ｍＭの新しいｐＨ７．５酢酸アンモニウムバッファーを、総体積が５００μｌになるよう加え、全部で５回遠心分離を繰り返した。最後の遠心分離のステップの後、バッファ交換された、おおよそ２５μｌの残りの脱グリコシル化されたＩｇＧ１、が回収され、エッペンドルフチューブに移され、質量スペクトル解析に用意された。

（実施例８：ネイティブ質量分析）
精製されたＩｇＧの混合物の異なるＩｇＧの種を同定し、どういった比率でこれらのＩｇＧの種が存在するかを決定するために、質量分析法が用いられる。簡潔に述べると、１μＭ濃度のＩｇＧを含むｐＨ７．５の１５０ｍＭ酢酸アンモニウム２−３μｌを自社製の金メッキしたボロシリケート毛細管（Sutter P-97 プラー [Sutter Instruments Co., Novato, CA, USA] および Edwards Scancoat six スパッタ装置 [Edwards Laboratories, Milpitas, CA, USA]を用いて）に投入し、高質量検出（Tahallah et al., RCM 2001）に最適化するように調整されたＬＣＴ１質量分析器（Waters Corp., Milford, MA, USA）で解析した。１３００Ｖのキャピラリ電圧および２００Ｖのサンプリングコーン電圧を用いた。しかし、これらの設定はより高い解像度の「信号対雑音」（signal-to-noise）比が必要な場合は調節された。衝突冷却を促進するために、ソース支持圧（source backing pressure）を約７．５ｍｂａｒに上昇させた。変性状態のＩｇＧ１を測定するためには、その蛋白質を、５％ギ酸中で１μＭの濃度で噴霧した。

（実施例９：データ処理および定量化）
MassLynx 4.1 ソフトウェアを用いて取得したスペクトルの処理が行われた（Waters Corp., Milford, MA, USA）。最小のスムージングが用いられ、スペクトルが中心に置かれた。一連の各電荷状態（charge state）を用いて、その種の質量が計算された。各電荷状態について、対応する強度がMassLynxにより割り当てられ、加算された。このアプローチは、試料のすべての種に対し相対的な定量化を可能にする。または、公知の、曲線下の面積（area-under-the-curve：AUC）による方法を用いてピークの定量化を行うこともできる。全ての解析は、ＩｇＧの質量とその相対量の標準偏差を算出するために３度繰り返された。

（実施例１０：単一細胞からの、２または３の単一特異性抗体の混合物）
既知の特異性および既知のヒトＩＧＫＶ１−３９軽鎖結合能を有する、いくつかの抗体のＶＨ領域（図３）が、野生型のコンストラクトベクターＭＶ１０５７、または表１のコンストラクト４若しくはコンストラクト５に再クローンするのに用いられ、結果としてベクターＩ−ＩＩＩ（表２）を得た。結果として得た、異なるＣＨ３領域および異なるＶＨ特異性をもつＩｇ重鎖と、共通のヒト軽鎖をコードする核酸配列をそれぞれ含む、ベクターＩ，ＩＩ，およびＩＩＩが、そのあと細胞にトランスフェクションされた。該トランスフェクションは、インタクトな単一特異性抗体の形成をみるために１つだけされるか、または、２若しくは３の単一特異性抗体の混合物を得るために、他の一若しくは二のコンストラクトベクターと組み合わせてされた。表３はトランスフェクションの一覧表と結果である。

トランスフェクションＡ，ＧおよびＨにより、ベクターＩ，ＩＩ，またはＩＩＩのいずれかをトランスフェクションした細胞からは、ホモ二量体の形成のみの二価の単一特異的なＡＡ，ＢＢまたはＣＣが得られている（図４）。トランスフェクションＡについては、この点は予測され、またこれまでに実証されていた。今回はじめて、実際に、三重のアミノ酸置換のコンストラクト４（すなわち、K392D, D399K, K409D）または四重のアミノ酸置換のコンストラクト５（すなわち、E356K, E357K, K439D, K370D）を含むＣＨ３が操作されたＩｇ重鎖のホモ二量化が報告される（トランスフェクションＧおよびＨ）。

次に、単一細胞での２つのベクターの共発現実験が行われた。
興味深いことは、トランスフェクションＭおよびＮにより示されるように、野生型とＣＨ３が操作されたＩｇ重鎖を、単一細胞に共通の軽鎖と共に共発現させると、望ましくない二重特異性抗体の存在が無く、わずか４−５％程、混入した「他の分子」が混合物に存在するだけで、二種の単一特異性抗体の混合物が得られた。「他の分子」は、インタクトなＩｇＧの質量を有しないすべての分子として定義され、単一の重鎖および軽鎖のペアからなる半分子を含む。重要な点は、「他」区分は二重特異性生産物を含まないということである。

トランスフェクションＭでは、ベクターＤＮＡを等しい割合でトランスフェクションし、ＡＡ：ＢＢの比率がほぼ１：１となっている。しかし、トランスフェクションＮではＡＡ：ＣＣの比率がほぼ１０：１となっている。従って、このトランスフェクションはＤＮＡの比率を調整し再度行った（トランスフェクションＵ）。実際に、ベクターＤＮＡＩ：ＩＩＩが１：５のとき、混合物中の抗体生産物ＡＡ：ＣＣの比率はほぼ１：１となった。従って、トランスフェクションＭおよびＵによって示されるように、望ましくない副生産物が無く（すなわち、ＡＣまたは半分子Ａ若しくはＣの多量の存在が無い）、単一細胞で、２つの異なる実質的に混じりけのない、単一特異性抗体を発現することができる（図５）。野生型とコンストラクト４、または野生型とコンストラクト５のヘテロ二量体形成が起こらないように、コンストラクト４および５の新規のＣＨ３の改変は、野生型ＣＨ３と実質的に異なる。この点は、単一細胞からの単一特異性抗体の混合物の大量生産への適用に有利である。

これらの結果と類似するが、２つの異なるＣＨ３操作されたＩｇ重鎖（コンストラクト４および５）は、さらなる望ましくない種の存在が無く、２つの異なる単一特異性抗体のみの混合物を結果として得ることが予測される。コンストラクト４におけるＣＨ３の改変とコンストラクト５のＣＨ３の改変が実質的に異なる場合、ヘテロ二量化が起こらないと推論される。その場合、コンストラクト４および５のＣＨ３操作された重鎖を、単一細胞で野生型ＣＨ３重鎖と共に共発現させると、３つの単一特異性抗体のみが結果として得られるだろう。

実際に、この結果は観察された。ヘテロ二量体ではなくホモ二量体を形成するように設計された３つの異なるＩｇ重鎖を、共通の軽鎖と共に単一細胞で発現させると、混合物に他の混入が無く３つの純粋な単一特異性抗体の混合物が得られることが見出された（トランスフェクションＯ）（図６）。表３から明瞭にわかるとおり、トランスフェクションＯでベクターＤＮＡが同じ割合になるようにしても、抗体ＡＡ：ＢＢ：ＣＣの比率は１：１：１では得られなかった。ベクターＤＮＡの比率を変えてトランスフェクションすると（１：１：１０，トランスフェクションＶ）、混合物中のＡＡ：ＢＢ：ＣＣの比率は望ましい比率に操ることができることが示された。以上から、これらの実験から示されたように、単一細胞で２または３の実質的に純粋な単一特異性抗体が、望ましくない副生産物なしでされうる。これは、治療用の単一特異性抗体の混合物の大量生産に利点が大きい。

（実施例１１：単一細胞からの２つの二重特異性抗体の混合物）
ＣＨ３が操作された重鎖を用いた単一の二重特異性抗体の生産は他で報告されている。ここで、この実験は、単一細胞からの２つの異なる二重特異性抗体の混合物の生産が実行可能かどうかについて調査することを目的として設計された。
既知の特異性および既知のヒトＩＧＫＶ１−３９軽鎖との結合能を有する抗体のＶＨ領域（図３）を、表１のコンストラクト１−３または６−７を含むベクターに再クローンし、ベクターＩＶ−Ｘ（表４）を結果として得た。異なるＣＨ３領域および異なるＶＨ特異性をもつＩｇ重鎖と、共通のヒト軽鎖をコードする核酸配列をそれぞれ含む、ベクターＩＶ−Ｘが、そのあと細胞にトランスフェクションされた。該トランスフェクションは、インタクトな単一特異性抗体の形成の妨害を示すために１つだけされるか、または、二重特異性抗体若しくは２つの二重特異性抗体の混合物を得るために、他のコンストラクトベクターと組み合わせてされた。表５はトランスフェクションの一覧表と結果である。

コンストラクト１および２にコードされたＣＨ３を操作されたＩｇ重鎖は、単一細胞に発現されると、ホモ二量体の形成能を維持していることが示されている（国際公開第２００９／０８９００４号）。しかし、国際公開第２００９／０８９００４号のさらなる報告では、コンストラクト３のような三重の荷電電荷のペアの変異を備えるように操作されたＣＨ３ドメインでは、単独で発現されたとき、もはやホモ二量体の形成はできない。本研究では、これらの発見は部分的に確かめられただけであった。実際には、トランスフェクションＢ，ＣおよびＤで、高い割合のペアしていない半分子に加えて、ＩｇＧ全長の存在が示された。このことはコンストラクト１および２にコードされたＣＨ３ドメインのホモ二量化を示している。トランスフェクションＥおよびＦも、ぺアしていない半分子に加え、ＩｇＧの全長の生産が結果的に見られた。このことは、コンストラクト３の三重の電荷の変異でもホモ二量化を完全に損なうことではないことが示された。コンストラクト６および７の「ノブ」および「ホール」ＣＨ３変異体もホモ二量体を形成することがさらに示された（「ノブ−ノブ」のホモ二量体で１８％、「ホール−ホール」のホモ二量体で４２％）。

ヘテロ二量体形成のため第２のＣＨ３変異体を共発現した際、望ましくない副生産物（ホモ二量体）を阻害または最小化するため、単独で発現された際にホモ二量化が完全に阻害されるＣＨ３変異体が好ましい。

興味深いことに、本実験ははじめて、実質的に混合物にホモ二量体が無く、二重特異性抗体の混合物を単一細胞に発現することができることを示した。トランスフェクションＫおよびＬでは、予測される二重特異性の種ＢＣ＋ＡＢが実際に得られている（トランスフェクションＫで３８％＋４７％、トランスフェクションＬで１６％＋６０％）。両方のトランスフェクションで比較的に高い割合の望ましくない半分子が観察された（トランスフェクションＫで１５％半分子Ａ＋半分子Ｃ、トランスフェクションＬで２４％半分子Ａ＋半分子Ｃ）。比較的高い割合でなお存在する半分子は、適合ペアの重鎖がバランスを欠いた発現になっているため、ベクターＩＶの重鎖が少ない量しかないことに起因する。従って、トランスフェクションＳおよびＴでは、ベクターＤＮＡの比率を２：１：１に調整して再度トランスフェクションした。この結果、適合ペアからなるＩｇＧ重鎖が等しい量得られ、ＩｇＧ半分子の存在が無く、わずか３％のホモ二量体ＢＢの存在だけで、純粋な二重特異性ＩｇＧの混合物が得られた。理想的には、この低い単一特異性生産物の混入物の割合を、実質的にゼロに減らすべきである。従って、混入する単一特異性抗体の存在を最小にする二重特異性抗体の混合物を得られるさらなるＣＨ３変異体を見出すことが望まれる。

本研究は、はじめて、混合物中の単一特異性抗体の存在を最小にしながら、単一細胞での、３つの異なる標的エピトープを認識する２つの二重特異性抗体の実質的に純粋な混合物が生産できることを示した。

（実施例１２：様々な混合物）
単一細胞から、３つのエピトープを認識する２つの二重特異性抗体の混合物の生産、または単一細胞からの２または３の単一特異性抗体の混合物の生産が技術的に実行可能なことが示された。そこで次に、我々は、様々なその他の混合物の、制御された生産の実行可能性を探索した。

既知の特異性および既知のヒトＩＧＫＶ１−３９軽鎖との結合能をもつ第４の抗体ＶＨ領域が、表１のコンストラクト１−３または７を含むベクターに再クローンするのに用いられ、結果としてベクターＩ’，ＩＩ’，ＩＩＩ’，またはＸ’（「’」は対応するベクター番号と比較して、異なった特異性を示す）を得た。異なるＣＨ３領域および異なるＶＨ特異性をもつＩｇ重鎖と、共通のヒト軽鎖をコードする核酸配列をそれぞれ含む、ベクターＩ’−ＩＩＩ’，Ｘ’およびＩＶ−ＩＸが、そのあと細胞にトランスフェクションされた。該トランスフェクションは、様々な二重特異性および／または単一特異性の抗体の混合物を得るため、他のコンストラクトベクターと組み合わせてなされた。得られうる様々な混合物には、単一細胞から得られる、４つのエピトープを認識する２つの二重特異性抗体の混合物、２つの二重特異性抗体および１つの単一特異性抗体、または１つの二重特異性および１つの単一特異性抗体の混合物が含まれる。表６はトランスフェクションの一覧表と予測される結果である。

理論的には、すべての混合物の生産は実行可能であるものの、これまでの他の研究から、以前からのノブ・イントゥ・ホール変異体の大量生産は安定性の問題から妨げられることが知られている。従って、トランスフェクションＺＡ，ＺＢ，ＺＬ，ＺＭおよびＺＮにより結果として得た混合物は、大量生産に移ったときに問題があると予測される。

つまり、表１にあるコンストラクトのセットでは、単一細胞から大量生産によりすべての理論的な混合物を生産することはできないかもしれない。その理由は、ノブ・イントゥ・ホール変異体は不安定であると報告されており、「ノブ」または「ホール」を備えるＣＨ３ドメインがどちらの荷電変異体とも、または野生型のＣＨ３ドメインとも二量化することは除外できないからである。従って、単一細胞で共発現させるために、ホモ二量体またはヘテロ二量体のみを選択的に形成し、表１のコンストラクト１−５とホモまたはヘテロ二量化しないように操作された新しいＣＨ３変異体を設計することが望まれる。

（実施例１３：新規の電荷ペアの変異の同定）
この研究の目的は、単一細胞において、異なるＩｇＧ重鎖を混ぜて発現させた場合に、ヘテロ二量体のみまたはホモ二量体のみが結果として生産されるようにＩｇＧのＣＨ３領域を操作することである。ここで、新規の操作されたＣＨ３ドメインは既知の操作されたＣＨ３ドメインまたは野生型ＣＨ３ドメインとホモ二量化またはヘテロ二量化しないようにする。従って、この基準を満たす新規に操作されたＣＨ３ドメインを同定するための最初の工程として、ＩｇＧのＣＨ３ドメインの接触面にある多くの接触残基を１つずつあるいは群として、静電的相互作用による同一の重鎖間の反発−すなわち、ホモ二量体の形成の減少−が起こるように置換し調べた。その目的は、これらの変異が、異なるＩｇＧ重鎖を混合して発現させたときに、ホモおよび／またはヘテロ二量体の形成を誘導するのに使えるよう、荷電残基に置換したときに同一鎖同士の反発がおきるような残基のリストを得ることである。これにより、得られた全長ＩｇＧは安定になり、高い割合で生産される。

さらなる追究では、一または複数のＩｇＧ重鎖−ＣＨ３領域のＣＨ３残基の適合ペアを操作することにより、二重特異性抗体または二重特異性若しくは単一特異性抗体の混合物を精製するために、同定された変異が用いられる。さらに、異なる重鎖をコードする複数の核酸分子すべてが、異なり相補するＣＨ３変異をもつように、新しく同定された電荷の変異のペアは既存のペアと組み合わされ細胞での発現に用いられる。これにより、単一特異性抗体のみ若しくは二重特異性抗体のみの混合物、または定められた単一特異性および二重特異性抗体の混合物が選択的に得られる。本研究で試験された残基は、これまでに同定された接触残基である（Deisenhofer J., 1981；Miller S., 1990；Padlan, 1996；Gunasekaran, 2010）。このアプローチの論理的根拠は、反発電荷がそれぞれの有効なペアの接触残基に導入されることにある。

試料はその後、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行い、約７２ｋＤのバンドを見ることにより、二量体の形成が減少するペアを同定する。すべての得られたペアについて、単一の変異または他の単一の変異との組み合わせについてスクリーニングした。その理由は、単一の非適合ペアによる反発的な静電相互作用は、この方法による検出に十分な量の半分子を得るのに十分であるかは不明であるためである。これらの変異は組み合わせでも用いられる。

表７に従い、Geneartにより、コンストラクトベクターＭＶ１０５７にアミノ酸置換を導入した。また、標準的な手順に従い、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることにより、コンストラクトの発現が行われた。ＩｇＧの発現量はOctetにより測定した。生産を２度失敗したときは、その変異は発現を阻害するものとして、その変異についてのさらなる追究は行わなかった。

≧５μｇ／ｍｌのＩｇＧを含む上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、プロテインＡを用いて精製した。蛋白質はコロイド状の青色試薬を用いて染色した。ホモ二量体は約１５０ｋＤのバンドとして捉えることができた。約７５ｋＤのより小さいバンドは、半分子の存在を示していた（ネガティブコントロール：Ｋ３９２Ｄ，Ｋ４０９Ｄを参照）。ブロットは図７に示した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を解析し、スコア化して表７、最右列に表示した。Ｑ３４７，Ｓ３５４，Ｙ３４９，Ｌ３５１，Ｋ３６０，Ｔ３６６，Ｔ３９４，およびＶ３９７を含む多くの残基は今後の見込みがあり、組み合わせてさらなる試験を行うべきである。ここでの選択は、ホモ二量体の形成の阻害における高いスコアと、他の非相補的な電荷との関連で問題とならないような改変可能な接触残基の可用性との両方を考慮した。例えば、Ｆ４０５残基およびＹ４０７残基は、すでに荷電した残基との相互作用を含む、ＣＨ３−ＣＨ３接触面で複数の相互作用を有することが知られている。これらの相互作用をする残基（表Ａ参照）のうちで、複数の電荷変異を導入すると問題となりうる。

さらなる組み合わせ変異を試験するため、新しいコンストラクトがベクターＭＶ１０５７に作成され（表８）、既知の特異性および既知のヒトＩＧＫＶ１−３９軽鎖との結合能をもつ抗体ＶＨ領域が、これらの新しいコンストラクトを含むベクター（表９参照）に再クローンするのに用いられた。表１０はトランスフェクションの一覧表と結果である。

ＣＨ３変異体の組み合わせを発現させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（データ非表示）およびネイティブ質量分析（ＭＳ）で解析した。表１０に結果を要約した。ＺＯトランスフェクションにより、混合物において最も高い割合のヘテロ二量体が得られた（６９％ＡＣ）。興味深いことに、ＺＯトランスフェクションにおいて、ＡＡホモ二量体が存在しない一方、ＣＣホモ二量体は少しの割合（７％）を含む。質量分析によれば、混合物に残存する蛋白質は半分子Ａからなり、ＡおよびＣ重鎖の不均衡な発現の結果と考えられる。トランスフェクション試料ＺＯからの未加工のＭＳデータを図８に示した。驚くことに、トランスフェクションＺＯによりかなりの量の二重特異性生産物を得たが、その反転電荷のペアであるトランスフェクションＺＰ（L351K/T366’Dに対しＺＯはT366K/L351’D）は似たような結果を得ることができず、５２％のみの二重特異性生産物が観察され、かなりの量の２つのホモ二量体が存在した（３０％ＡＡおよび１３％ＣＣ）。これに対しては、負に荷電したＤは構造的にＴとよく似ているため、Ｔ３６６Ｄは自身と反発するのに十分なほど強力でなく、よってＴ３６６Ｄはなおホモ二量体を形成しうると説明され、実際に観察された。

新しく見出されたT366K/L351’Dペアのわずかな変異体（例えば、新しいコンストラクトＴ３６６ＲおよびＬ３５１Ｅを含むすべての変形を試験することにより）からは同様の割合の二重特異性抗体（ＢｓＡｂｓ）を結果として得られることが予測される。

（実施例１４：ＨＡＤＤＯＣＫによる、効率的なヘテロ二量化を誘導するための新しいＣＨ３変異の設計）
実施例１３で説明したように、新しく見出した荷電ペアT366K/L351’Dは、混合物におけるヘテロ二量体の割合を増加させる（６９％）とともに、少しの割合の望ましくないＣＣホモ二量体（７％）（L351D/L351’D）および相当な割合の半分子Ａ（２４％）を混合物に「コンタミネーションする」。本例では、in silicoのアプローチを用いて、ＣＨ３の接触面での相互作用に関わるアミノ酸残基についてさらなる知見を得、ＣＨ３領域で対向する相補的な置換を試験し、２つの重鎖のホモ二量体の効率的な形成を阻害する一方、効率的なヘテロ二量化をさらに増加させる相補的な置換を含む新規のＣＨ３ペアを見出す。

ＨＡＤＤＯＣＫ（High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing：高い曖昧さにより誘導される蛋白質−蛋白質のドッキング）は生体分子の複合体のモデリングのための、情報を利用した柔軟なドッキングのアプローチである。ＨＡＤＤＯＣＫは、第一原理計算のドッキング方法とは違い、曖昧な相互作用の拘束（ambiguous interaction restraints：AIRs）の中で同定されまたは予測された蛋白質の接触面の情報をコードし、ドッキング過程を誘導する（de Vries et al., 2010）。ＨＡＤＤＯＣＫウェブサーバへのインプットは、結晶構造、ＮＭＲ構造クラスタ、または構造モデル等の蛋白質の構造ファイルからなる。ドッキングまたは微調整の後、ＨＡＤＤＯＣＫはいわゆるＨＡＤＤＯＣＫスコアを返す。ＨＡＤＤＯＣＫスコアはファン・デル・ワールスエネルギー、静電エネルギー、覆われる表面積および脱溶媒和エネルギーの加重平均である。ＨＡＤＤＯＣＫスコアは、実験データへの直接的な変換がしばしば難しいが、結合エネルギーまたは親和性の指標と解される。これに加え、ＨＡＤＤＯＣＫは、ドッキング計算の結果から、「トップ４」の構造の構造ファイルを提供する。これらの構造ファイルはダウンロードされ、可視化されることができ、個々の残基の相互作用の詳細な解析を可能にする。

この実施例では、ＩｇＧ１重鎖のＣＨ３ドメインの間の相互作用が研究される。高解像度の結晶構造をもった、ＩｇＧのＦｃ部（構造１Ｌ６Ｘ）が起点の構造として用いられる（http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1l6x ; Idusogie, E.E. et al., J.I. 2000(164)4178-4184）。

実施例１３において、ベクターＸＩＩＩおよびＸＶＩの共発現が、結果としてＣＣホモ二量体のコンタミネーションの形成をもたらすことが見出された（表１０）。ＨＡＤＤＯＣＫは、T366K/L351’Dに加え、ホモ二量化を阻むさらなる変異を探索するのに用いられる。

ＨＡＤＤＯＣＫスコアの出力は、算出されたエネルギーと、ＨＡＤＤＯＣＫスコア（いくつかのエネルギーの加重平均）、および、プログラムにより見出された４つの最小エネルギー構造に対応する、４つの構造ファイルである。ＨＡＤＤＯＣＫスコアは異なる構造を比較するのに用いられる。その他のエネルギーは、構造において何が起きているかの指標（例えば、良好な静電相互作用，より少ない覆われた表面，高いファン・デル・ワールスエネルギー）を得るためにのみ用いられる。ＨＡＤＤＯＣＫスコアは低ければ低いほどよい。それぞれの変異ペアに対し、ＡＡ，ＡＢおよびＢＢ二量体のスコアが算出される。

実施例１２の変異ペアのセットはＨＡＤＤＯＣＫで実行され、実験データと算出されたエネルギーが相関するかどうかを調べた。表１１にすべての理論的なエネルギーを示し、図９に可視化した。

２つの野生型のＣＨ３ドメインについては、ＡおよびＢのＣＨ３領域が同型であるため、ＨＡＤＤＯＣＫスコアはＡＡ，ＡＢ，およびＢＢで同一である。その他の多くの場合においては、予測されるようにＡＢペアが最低のスコアであった。T366K/L351Dペアについては、ＢＢスコアはＡＢスコアよりわずかに良かった（-210.6 vs. -212.5）。しかしこの違いは計算の誤差の範囲である。ＨＡＤＤＯＣＫを用いて、これらのペアのヘテロ二量体の構造が可視化された。例えば、コンストラクトの組み合わせ1-2, 1-1および2-2を図１０に表示した。これらの可視化から、ヘテロ二量体には塩橋が形成されているのが明らかであり（図１０Ａ左側パネル）、同一の鎖の残基の間では静電的反発が起こっている（図１０ＢおよびＣ中央および右側パネル）。ホモ二量体に対するより高いＨＡＤＤＯＣＫスコアは、変異した接触残基の静電的反発により説明される。これらの残基はお互いに曲がるように避け、他の鎖の残基とは相互作用しないため、親和性が低下する。

表１１および図９は実施例１３での観察結果を確認するものである。T366K/L351’DのＡＣヘテロ二量体およびL351D/L351’DのＣＣホモ二量体は同様のエネルギーをもち、混合物におけるヘテロ二量体およびホモ二量体の両方の存在を説明している。その一方で、T366K/T366’KのＡＡホモ二量体はほとんど混合物中に検出できず、T366K半分子Ａが存在する。表１１および図９は、T366K/T366’KのＡＡホモ二量体のＨＡＤＤＯＣＫスコアは、ＡＣヘテロ二量体のスコアより高いことを示している。従って、このホモ二量体の形成はエネルギー的により好ましくない。

（実施例１５：366/351変異）
実施例１３において、T366K/L351’Dの変異電荷のペアとは別の方法によっても、混合物中の二重特異性抗体の割合について同様の結果を得られうるように設計できるとの仮説が立てられる。該別の方法は、Ｔ３６６Ｒ，Ｔ３６６Ｄ，Ｔ３６６Ｅ，Ｌ３５１Ｅ，Ｌ３５１Ｋ，およびＬ３５１Ｒの置換を含みうる。L351D/L351’DのＣＣホモ二量体の割合は366/351ペアの変異体を生成することにより減少しうる。全ての可能な変異のペアはＨＡＤＤＯＣＫで実行され、結果のスコアは表１２に示され、図１１に視覚化した。

ＨＡＤＤＯＣＫスコアを見ると、いくつかの変異は、T366K/L351’Dと比較したときに似たような「パターン」を有することが観察された。多くの変形において、ＡＡホモ二量体はＡＢヘテロ二量体よりも高いＨＡＤＤＯＣＫスコアを有することが見出されたが、ＢＢホモ二量体はＡＢヘテロ二量体と同等に好まれた。３５１残基は、もう一方の鎖の同じ残基と「隣」であることが知られている。すなわち、鎖Ａの３５１残基はＣＨ３−ＣＨ３接触面において鎖Ｂの３５１残基とペアとなる。ＢＢ二量体が形成されるとき、同一電荷による負の影響はほとんどない。L351D/L351’Dの構造を見て説明すると、アスパラギン酸はお互いに折れ曲がって避けあい、少なくとも位置３５５の自然発生的なアルギニンからの安定化の影響があり、さらに位置３５４の自然発生的なセリンによる負の電荷の安定化がある（図１２Ａ参照）。これらの残基を変異させても（S354AおよびR355D）ほとんど改善はない。図１２Ｂからは、Ａ３５４の主鎖の水素がホモ二量体の安定化の原因になっていることが明らかである。この一連から、T366R/L351’Eペアが、二重特異性の分子に対する最小のＨＡＤＤＯＣＫスコアを有し、最も好適であると考えられる。

（実施例１６：T366K/L351’Dのまわりの変異）
この実施例における一連のＨＡＤＤＯＣＫ解析では、T366K/L351’DまたはT366K/L351’Eのペアを起点の構造とした。これらのＡおよびＢ鎖の二重特異性の割合の予測値をさらに高めうる追加の変異を同定するため、Ｂ鎖に変異を追加しＨＡＤＤＯＣＫスコアおよびエネルギーを算出した。ＣＨ３ドメイン構造を、分子レベルでの蛋白質構造の視覚化のためのビューアー（YASARA, www.yasara.org）を用いて検討すると、個々の残基の間の距離を算出することができる。その検討の間に、２つの残基Y349およびL368が、二量体の相互作用に正または負の寄与をしうる、隣り合う残基であることが観察された。本実施例では、これらの変異により―Ｌ３５１変異に追加して―ホモおよびヘテロ二量体の二量体形成への効果を検討した（図１３を参照）。両方の残基はヘテロ二量体の安定性を増し（より低いＨＡＤＤＯＣＫスコア）、ＢＢ二量体を不安定にする（より高いＨＡＤＤＯＣＫスコア）。位置３４９および３６８のグルタミン酸（Ｅ）はアスパラギン酸（Ｄ）より好適と示唆された。従って、すでに位置３５１にアミノ酸置換を有するＢ鎖での第２のアミノ酸変異の導入は、ヘテロ二量化が好まれるようになると示唆された。

次の一組のＨＡＤＤＯＣＫ分析においては、T366K/L351’Dペアを再び起点の構造とする。ヘテロ二量化のさらなる増加をもたらしたＢ鎖における置換（すなわち、Y349D/EおよびL368E）に、すでにT366Kの置換を備えるＡ鎖に追加の変異を加えた。図１４に示されるように、二重特異的なヘテロ二量体の形成に対し好適と考えられるいくつかの変異がある。T366K-L351K/L351’D-Y349’Dペアでは、すべての４つの変異残基はヘテロ二量体のペアリングに関わっている。このことは、K351が結合に直接的に関与しないT366K-L351K/L351’E-L368’Eではあてはまらない。しかし、後者のヘテロ二量体のＨＡＤＤＯＣＫスコアは−２２８．９であり、T366K/ L351’E-L368’Eの−２１４．２より顕著に低い。このことは、位置３５１のＫにおける水素結合の相互作用により説明される（図１５参照）。T366K-L351K/L351’D-Y349’Dペアでは、Ｂ鎖のR355’D変異によりさらに改善されうる。これにより、ＢＢのＨＡＤＤＯＣＫスコアを高めるが、ＡＢのＨＡＤＤＯＣＫスコアもわずかに高くなる。以上から、Ａ鎖におけるT366Kの単一の変異と比較したとき、追加のＬ３５１ＫはＡＢスコアを低くし、ＡＡおよびＢＢスコアはあまり変えない。理論的に、試料における、より高い量の二重特異性のヘテロ二量体を得ることになる。

図１１から明らかなように、位置３６６をＫではなくＲにした方が、ヘテロ二量化を誘導する上で有効と推量される。従って、今度はＡ鎖においてT366KではなくT366Rとして、図１３で示したいくつかのＨＡＤＤＯＣＫ解析を繰り返した。Ａ鎖のR366とＢ鎖の二重の変異を組み合わせるのは好ましくないことが示された（図１６）。これは、この残基のサイズが大きく、構造にR366とのすべての塩橋が存在するとしても、他の接触面の相互作用と干渉するためである。さらに、ＡＡホモ二量体のＨＡＤＤＯＣＫスコアはK366よりR366の方が低い。この点もヘテロ二量体の形成に好ましくない寄与となる。従って、接触面でのR366を用いた、これ以上のＨＡＤＤＯＣＫ分析を行うことを中止した。

ＨＡＤＤＯＣＫによる予測から、全部で１４の最適な成績を収めたペアが選択された（表１３および図１７参照）。いくつかのペアでは、L351/L351’D相互作用への自然発生的なR355の安定化の影響を取り去るために、R355D置換が含まれる。

（実施例１７：ＨＡＤＤＯＣＫ予測に基づくＣＨ３変異を用いた二重特異性分子のin vitroでの発現）
実施例１６での解析から示唆されるように、T366K/L351’Dペアの周りに追加した変異をもついくつかのＣＨ３変異体は、より高い二重特異性成分の割合とより低いホモ二量体成分の割合をもつ混合物を産生しうる。これらの最適な成績を収めたペアは生産のために選択され、さらなる解析が行われた。さらに、コンストラクトT366RおよびL351Eも生成された。作成されたコンストラクト、および既知の特異性と既知のヒトＩＧＫＶ１−３９軽鎖との結合能をもつ抗体ＶＨ領域の再クローンに用いられたコンストラクトのリストを表１４に示した。

個々のコンストラクトを含むＩｇＧの発現量は、上述の実施例１３に報告したが、表１４のリストに記載されたコンストラクトについても繰り返した。目的は、ヘテロ二量化の適合パートナーが無い中でどのコンストラクトがホモ二量化するかを評価するためである。理想的には、高い割合の半分子と低い割合のホモ二量体が形成されれば良い。コントロール群として、これまでに報告された電荷変異を含むコンストラクトと、これまでに報告されたノブ・イン・ホール変異を含むコンストラクトも、組み換え細胞によるＩｇＧ全体の発現に用いられた。プロテインＡで精製した上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、結果をスコアと共に表１４に示した。

共通の軽鎖と、表１４に示したコンストラクトのアミノ酸置換を保持した２つの異なる重鎖、またはこれまでのコンストラクトのアミノ酸置換を保持した重鎖との共発現の結果を表１５に表示した。それぞれアミノ酸置換T366KおよびL351’D:L368’Eを備える２つの異なる重鎖の発現により、ホモ二量体ＡＡまたはＢＢの存在が無く、混合物に約８７％の二重特異的ヘテロ二量体ＡＢを得ることができた（表１５の組み合わせ番号３）。約１２％のT366K置換を含む半分子（半分子Ａ）が観察された。さらに、第１の重鎖に追加のアミノ酸置換L351Kが導入されると、二重特異性ヘテロ二量体ＡＢの割合は増加することが見出された。例えば、それぞれアミノ酸置換T366K:L351KおよびL351’D:L368’Eを備える２つの異なる重鎖の共発現により、約９２％の二重特異性ヘテロ二量体ＡＢが得られ、一方で、ＡＡおよびＢＢホモ二量体は混合物に実質的に存在しなかった（表１５の組み合わせ番号１２）。

１０および１１の組み合わせも、高い割合のヘテロ二量体と実質的に存在しないホモ二量体という、好ましい配分の結果になっている。ホモ二量体が存在しないのは、インタクトなＩｇＧ分子を含む分画がヘテロ二量体ＡＢのみで構成されるため有利である。精製、および後の治療的応用のために、半分子はサイズ排除クロマトグラフィーのような標準的なアプローチにより除去されうる。公知の電荷変異体およびノブ・イントゥ・ホール変異体では「コンタミネーションする」ホモ二量体の抗体が除かれていない。しかし、これらの新しく同定された電荷の変異体を二重特異性抗体の生産過程へ適用すると有利である。

加えて、T366K/L351’D:L368’EおよびT366K:L351K/ L351’D:L368’E電荷ペアはこれまでに説明されたE356K:D399K/K392’D:K409’DおよびE356K:D399K/K392’D:K409’D:K439’D電荷反転ペアよりさらに有利な点がある。つまり、これまでに記載された電荷変異体はＣＨ３−ＣＨ３接触面内に元々ある電荷の反転に基づいているが、新しく同定された電荷の変異体はＣＨ３−ＣＨ３接触面に追加の電荷ペア（電荷−電荷相互作用）を付加している。ＣＨ３−ＣＨ３接触面での追加的な電荷のペアの導入により、接触面の安定性がさらに増加し、それによりインタクトな抗体の安定性がさらに増加する。組み合わせ番号４，５，６，９，１０，および１１で用いられる変異についても同様に当てはまる。このことが混合物中にＡＡおよびＢＢのホモ二量体が非常に少ない割合でしか存在しないという、二重特異性ヘテロ二量体の好ましい割合につながっている。

（ネイティブＭＳ）
全ての二重特異性の試料に対し、ネイティブＭＳを実行した。得られたグラフを解析し、目的の種の相対的な比を２通りの方法（ピークの高さとピークの面積）で導出した。ピークの面積による方法が科学的にはより正しい解析方法だが、これまでの他の研究におけるすべての解析がピークの高さで行われているため、比較の面から両方の方法を解析に含めた。２つの方法における差は、測定の誤差の範囲内であったため、以降の測定についてはピークの面積の値のみを用いた。

図１８に２つの典型的なスペクトルを示した。結果の概要はグラフにして図１９に示した。数値は表１５で見出すことができる。試料の約半数において、単一特異性ＩｇＧの総混入量は５％より少なく、３つの場合のみ、１０％を超えた。一方で野生型のＩｇＧでは約５０％の単一特異性ＩｇＧが混合物に見出されると予測される。

さらなる解析のため、表１５から、２つの異なる重鎖の１０の組み合わせを選択した。これらの１０の組み合わせには、組み合わせ１，２，３，４，５，６，９，１０，１１および１２（表１５）が含まれる。これら１０の選択は、ｎＭＳにより導出された混合物に存在するホモ二量体の割合の低さに基づくだけでなく、生産の収率，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，ＣＨ３ドメインにある変異の数を含む全体的な物理化学的特性にも基づいて行った。

（実施例１８：ＩｇＧ安定性の解析）
この研究では、インタクトのＩｇＧ分画に高い割合の二重特異性ヘテロ二量体と、非常に少ない量（＜５％）の親のＩｇＧが得られた場合の一連のＣＨ３変異のペアについて、さらにＩｇＧ分子のＦｃ部の安定性を解析する。重鎖のヘテロ二量化を促進するために用いられた変異したＣＨ３ドメインは、ＩｇＧのＦｃ領域に、予期しない不安定化の効果を及ぼしうる。これにより、in vivoの半減期の減少，エフェクター機能の減少および／または免疫原性の増加のような望ましくない特性を生む結果となりうる。

新しく同定された電荷のペアについて、野生型の二重特異性分子およびこれまでに同定された電荷の変異を含む二重特異性分子と比較した（コンストラクト１を備える鎖Ａおよびコンストラクト２を備える鎖Ｂ）。この研究のすべての二重特異性分子は同一の重鎖および軽鎖の可変領域を含むため、観察された効果は分子のＦｃ部の変異に起因し、可変領域の違いに起因するものではないことが保証されている。

これらの二重特異性分子について、一連の安定性の研究が行われる。これらの研究には、ＣＨ３変異体の集合状態（aggregation state）の情報を提供する、分光学的（ＵＶ−Ｖｉｓ光吸収，蛍光および光散乱）および顕微鏡的（ナイルレッド染色での光学および蛍光顕微鏡による観察）解析が含まれる。

ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルはダブルビームで２つのモノクロメータのCary 300 Bio分光光度計により２５℃で記録される。スペクトルは、光路長１ｃｍで２５０から４００ｎｍの間でモニターされる。３２０ｎｍおよびそれより長い波長の吸収量からＩｇＧの集合状態の情報が提供される。

内在的な蛍光スペクトルはFluoroMax蛍光光度計を用いて２５℃でモニターされる。蛍光の方法は適宜最適化される。蛍光の放射はコンフォメーションおよび凝集の特性についての情報を提供する。

９０°光散乱スペクトルはFluoroMax蛍光光度計を用い、積算時間（integration time）を０．０１秒として４００ｎｍから７５０ｎｍの同期スキャン（λ_em＝λ_ex）を実行して２５℃でモニターされる。励起側および発光側スリットは適宜最適化される。例えば、直角での光散乱では、ＩｇＧ試料で５％の二量体が存在するかどうかを識別できる。

ナイルレッド染色での蛍光顕微鏡観察では、測定の直前に、エタノールに含んだナイルレッドを試料に加える。試料は顕微鏡用のスライドに充填され蛍光顕微鏡により解析される。粒子がカウントされるが、蛍光顕微鏡法により観察される最小の粒子のサイズは約０．５μｍである。

温度，ｐＨ，機械的ストレスまたは変性剤のような蛋白質に対するストレスは、コンフォメーションの変化（例えばアンフォールディング）および／または凝集を引き起こす。これまでに、電荷を操作された二重特異性抗体は改変されたＣＨ３の融解温度が低くなることが報告されている（Gunasekaran 2010）。従って、これらの研究は本発明の新規の電荷変異体とすでに存在し知られている電荷の変異体との区別を目的とする。

プロテインＡバイオセンサーおよびＩｇＧへのＦｃＲｎを用い、Octetによる熱安定性の研究がなされる。ＣＨ３が操作されたＩｇＧの熱安定性を調べるため、ＰＣＲ装置を用い、試料を４，５０，５５，６０，６５，７０および７５℃で１時間、１００μｇ／ｍｌ（ＰＢＳを溶媒）の濃度でインキュベートする。こののち、試料はゆっくりと冷却され、１５分で２５℃とし、この温度で２時間保った後、４℃で翌日まで保管された。沈降された抗体は遠心分離により除去され、水溶性抗体の総ＩｇＧ濃度がOctetプロテインＡバイオセンサー（１／１０ＰＢＳ希釈）を用いてOctetにより導出された。

Octetを用い、ＣＨ３が操作されたＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を測定するアッセイが研究される。プロテインＬバイオセンサーを用いてＩｇＧ軽鎖とセンサーとを結合させた後、溶液中でＦｃＲｎと共にインキュベートする。あるいは、Ａｎｔｉ−Ｐｅｎｔａ−ＨＩＳバイオセンサーを用いてＨｉｓタグがされたＦｃＲｎ蛋白質と結合し、目的のＩｇＧと共にインキュベートさせてもよい。これらの方法はプロテインＡバイオセンサーより高感度の場合もあり、熱安定性研究に用いてもよい。

すべての試料は血清下での安定性の解析にも供される。簡潔に述べると、（操作された）ＩｇＧ試料はヒト血清において３７℃でインキュベートされ、コントロール試料は４℃に保たれる。１，２，３および４週間後、試料は遠心分離され、沈降したＩｇＧが除去される。その後、試料は抗原特異的ＥＬＩＳＡで添加され、機能的なＩｇＧの相対量が決定される。精製されたコントロールの抗体はヒト血清に急激に投与され、参照群として用いられる。

（実施例１９：安定性の解析）
以前の実験では、ＣＨ３変異を備える２つの異なる重鎖と、共通の軽鎖との共発現により、高い割合の二重特異性抗体が得られた（例１７）。

２つの異なる重鎖の８つの組み合わせが表１５から選択され、さらなる解析が行われた。これらの８つの組み合わせは、組み合わせ３，４，５，６，９，１０，１１および１２を含んだ（表１５）。この研究では、ＩｇＧのＦｃ部の安定性に焦点を置き、これらの８つの組み合わせが解析された。コントロール群には、野生型の二重特異性分子（すなわち、ＣＨ３変異が無い）および／またはこれまでに報告されたＣＨ３の電荷の変異が含まれた。注記すると、野生型の二重特異性分子については、ヘテロ二量体へ選択的に誘導する手段を有さずに、２つの重鎖および共通の軽鎖が共発現された。従って、これらの「野生型の二重特異性分子」はＡＡ，ＡＢおよびＢＢの混合物を表す。この研究のすべての二重特異性分子は同一の重鎖および軽鎖の組み合わせを保持するため、観察された効果は分子のＦｃ部の変異に起因し、Ｆａｂ部の変化に起因するものではないことが保証されている。

仮説として、２つの異なる重鎖のヘテロ二量体ペアリングを促進するのに用いられる変異ペアは、予測されない構造的、またはその他のＩｇＧのＦｃ領域への不安定化効力と関連付けられうる。このことは後に、これらの変異の存在によるin vivoの半減期の減少，エフェクター機能の減少および／または免疫原性の増加のような、さらなる臨床上への発展を阻みうる望ましくない問題を生む結果となりうる。

（熱安定性）
温度の上昇または下降のようなストレスを与えると、蛋白質のコンフォメーションの変化（例えばアンフォールディング）および／または凝集を引き起こす。ＣＨ３が操作されたＩｇＧの熱安定性を調べるため、組み合わせ３−６および９−１２（表１５）と、野生型二重特異性分子並びにコンストラクト１および２（E356K:D399K/ K392D’:K409D’の組み合わせ。「電荷反転」ペアとも呼ばれる）を用いて得られた二重特異性分子とを、ＰＣＲ装置を用い、４，６０，６２．５，６５，６７．５，７０および７２．５℃で１時間、１００μｇ／ｍｌ（ＰＢＳを溶媒）の濃度でインキュベートした。こののち、試料はゆっくりと冷却され、１５分をかけて２５℃とし、この温度で２時間保った後、４℃で翌日まで保管した。沈降された抗体は遠心分離（１８０００ｒｐｍ；４℃，２０分）により除去し、水溶性抗体の総ＩｇＧ濃度を、Octetにより、プロテインＡバイオセンサー（１／１０ＰＢＳ希釈）を用いて導出した。

結果を図２０に示した。コントロールのＣＨ３操作された二重特異性抗体（電荷反転の組み合わせE356K:D399K/ K392D’:K409D’（三角））は、野生型の二重特異性分子（四角）と比較し、熱安定性が減少している。組み合わせ３−６および９−１２（菱形）からの二重特異性分子も野生型と比較し、熱安定性が減少することが実証された。しかし、注目すべき点として、３つの組み合わせにおいては、コントロールのＣＨ３操作された二重特異性抗体と比較して安定性が改善されたことが実証された。組み合わせ９，１０および１１の二重特異性分子は、他のＣＨ３操作された（電荷反転）二重特異性分子より有意に安定であり、最も高温の測定点においては野生型の二重特異性分子と同等に安定であった。

（凍結融解の安定性）
ＣＨ３が操作されたＩｇＧの、凍結融解を反復した際の安定性を調べるため、組み合わせ３−６および９−１２（表１５）からの二重特異性分子と、野生型二重特異性分子並びにコンストラクト１および２（E356K:D399K/ K392D’:K409D’の組み合わせ（電荷反転ペア））を用いて得た二重特異性分子とを１０回の凍結融解サイクルにかけた。各サイクルにおいて、試料を完全に凍結するまで−８０℃に少なくとも１５分置き、その後室温で融解させた。完全に融解したら、再びこの凍結融解サイクルを繰り返した。１０回の凍結融解サイクルの後、沈降された抗体は遠心分離（１８０００ｒｐｍ；４℃，２０分）により除去し、水溶性抗体の総ＩｇＧ濃度を、Octetにより、プロテインＡバイオセンサー（１／１０ＰＢＳ希釈）を用いて導出した。凍結融解安定性テストは３回繰り返された。

結果を図２１に示した。コントロールである電荷反転のＣＨ３操作された二重特異性抗体は、野生型の二重特異性分子と比較し、わずかに安定性が減少しているように観察された。対照的に、組み合わせ３，４および９からの二重特異性分子は野生型の二重特異性分子と比較し、わずかに安定性が改善したと考えられた。以上から、凍結融解サイクルの厳しい状況からは、ＣＨ３操作された変異体にとっての重要な安定性の問題は提起されないと結論された。

（in vitro 血清安定性）
ＣＨ３が操作されたＩｇＧの、３７℃に保持された血清での安定性を調べるため、組み合わせ３−６および９−１２（表１５）からの二重特異性分子と、野生型二重特異性分子並びに電荷反転した二重特異性分子を３７℃の１０％ヒト血清下でインキュベートした。コントロールの試料は４℃に保たれた。１，２，または５日後、沈降された抗体を遠心分離により除去した。その後、試料はフィブリノーゲン特異的ＥＬＩＳＡで添加され、機能的なＩｇＧの相対量を導出した。精製されたコントロールの抗体はヒト血清に急激に投与され、参照群として用いられた。

フィブリノーゲンＥＬＩＳＡのデータによれば、１０％ヒト血清中で３７℃、５日間経ても、すべての試料は非常に安定であった。組み合わせ４および５からの、より低いＩｇＧ濃度の二重特異性分子は、特にＴ＝１およびＴ＝２の点でわずかに安定性が低い。しかしこの実験の終点ではその違いは最小となっている（図２２）。

（実施例２０：さらなる安定性のテスト）
変異ＩｇＧの安定性を評価するため、さらなる一連の分析方法が用いられた。組み合わせ３−６および９−１２（表１５）からの二重特異性分子，野生型の二重特異性分子（ＡＡ，ＡＢ，ＢＢ），個々の親の抗体（ＡＡおよびＢＢ）並びにコンストラクト１および２（E356K:D399K / K392D’:K409D’の組み合わせ（電荷反転ペア））を用いて得た二重特異性分子がこれらの安定性のアッセイに試料として用いられた。

すべてのＩｇＧは０．２ｍｇ／ｍｌまで希釈され、いくつかのストレス状況（５０℃で２日間，４０℃で２週間，凍結融解５回）が適用された。これは、異なる試料について識別をできるようにするためである。注記しておくと、これらの高ストレスレベルは、すべての二重特異性分子で用いられる親の抗体のうちの一つ（２つの１１２２Ｆａｂを保持する、ＢＢの方の親）が不安定になるものである。５０℃で２日間の条件では、この蛋白質の凝集がＵＶ吸収で検出された。このことから示唆されるように、このストレス条件では、二重特異性分子におけるＦａｂとＣＨ３の不安定性を区別することができないかもしれない。従って、５０℃でのインキュベーションからのデータは注意して取り扱う必要がある。

結果の概要を表１６に示した。用いた解析方法には以下を含む。
−ナイルレッドによる蛍光顕微鏡法（表１６の「ナイルレッド粒子」）；ナイルレッド色素を加えた後、０．５μｍより大きい粒子の量を観察するため。
−３５０ｎｍでのＵＶ分光分析（「ＵＶ３５０ｎｍ」）；３２０ｎｍより長い波長における吸収の変化は、蛋白質の集合状態に関する情報をもたらす。
−４００ｎｍでの９０°光散乱（「ＬＳ４００ｎｍ」）；蛋白質の凝集の変化、例えばＩｇＧの単量体と二量体の違い、を観察する感度のよい技術である。
−自家蛍光；蛋白質の芳香族残基の蛍光波長の最大値と強度は、環境によって（例えば、アンフォールディング）変化する。
−1,8-ANS蛍光分光分析；1,8-ANSはイオンペア形成を介し、静電的相互作用を通して陽イオンの群と結合する。蛋白質構造および／またはコンフォメーションの変化が検出される。

（ＵＶ−Ｖｉｓ分光分析）
ＵＶ−Ｖｉｓ吸収スペクトルは、Varian社の異なるクォーツキュベット（例えば光路長１．０ｃｍの黒色低用量Hellmaキュベットおよび0.2cm x 1.0cm透明Hellmaキュベット）を用い、２５℃で、ダブルビームと２つのモノクロメータのCary 300 Bio 分光光度計で測定した。１．０ｃｍの光路長を用いて、２２０から４５０ｎｍの間のスペクトルをモニターした。２８０ｎｍ付近の吸収が蛋白質の濃度の情報を提供する。３２０ｎｍから４５０ｎｍの間の領域は試料の集合状態についての情報を提供する。

（９０°光散乱）
９０°光散乱スペクトル法は、蛋白質の凝集を研究するために開発された。該方法はCapelle 2005やDemeule 2007aの記載と同様に行われた。９０°光散乱スペクトルは、FluoroMax蛍光光度計（Spex, Instruments S.A., Inc. U.K.）を用い、積算時間（integration time）を０．０１秒として４００ｎｍから７５０ｎｍの同期スキャン（λem＝λex）を実行して２５℃でモニターされる。最適な条件を得るため、異なるスリットの設定が試された。最適化した後は、そのスリット設定を用いてすべての測定を行った。

（定常状態の蛍光放射）
トリプトファン，チロシン，およびフェニルアラニン残基の蛍光放射は、これらのフルオロフォアの局所環境に関する状況を与えてくれる。親水性および／または剛直性の、変化または違いが測定される。一般的には、より疎水性と剛直性の高い環境は、蛍光強度の増加と、放射最大となる値の青方偏移へと導く。自家蛍光分光分析により、蛋白質のその時の状態の情報が提供され、物理的および化学的特性の変化がモニターされる。チロシンおよびトリプトファンのより詳細な情報は、Lakowiczの本（Lakowicz, 2006）に記載されている。

蛍光の放射と励起スペクトルは、異なるクォーツキュベットにおいて、２５℃で記録された。試料は異なる波長で励起された。積算時間およびスリットの設定は最適化された。最適化の後は、その積算時間とスリット設定をすべてのサンプルに適用した。

（ナイルレッド染色での蛍光顕微鏡法）
ナイルレッド染色法は、蛋白質の凝集を視覚化するために開発された。該染色法は、Demeule et al., 2007bに記載されたように行われた。

顕微鏡観察は、水銀ランプを備えたライカDM RXE 顕微鏡（Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany）により行われた。イメージはソニーNEX-5カメラおよびそのファームウェアで取得された。対物レンズは１０倍，２０倍および４０倍とした。顕微鏡での研究では、スライドとカバーガラスの間の距離を０．１ｍｍに固定し用いた。４×４のグリッドのサイズは1mm×1mmであり、０．１μｌに相当する。

（1,8-ANS 蛍光分光分析）
８‐アニリノ‐１‐ナフタレンスルホン酸（1-anilinonaphthalene-8-sulfonic acid: 1,8-ANS）は荷電していない疎水性の蛍光小分子（分子量299.34Da）であり、膜表面と蛋白質の両方を研究するために用いられる。

1,8-ANSは実質的に水中で蛍光を発せず、膜（量子収率〜０．２５）または蛋白質（量子収率〜０．７）に結合したときのみ、感知できる蛍光を発する。この特性により、1,8-ANSは、蛋白質のフォールディング，コンフォメーションの変化，およびその他のこのプローブの水への露出が変化するプロセスの感度の高いインジケーターとなっている。Molecular Plobes社のホームページwww.probes.comで1,8-ANSに関する情報を得ることができる。

1,8-ANSの蛍光放射スペクトルはFluoroMax蛍光光度計を用いて記録された。各ＩｇＧ間における1,8-ANSの蛍光の直接的な比較は行わない。それぞれのＩｇＧは異なる数の1,8-ANSの結合部位を持つため比較できないからである。原理的には、1,8-ANSの蛍光が小さくなるほど、より少ない1,8-ANS分子が抗体に結合している。ストレスによる、1,8-ANSの蛍光強度および放射波長の変化が評価された。

まとめると、これらのデータにより、様々なＩｇＧ試料は際立って安定ということが示された。テストされた試料の間に測定可能な違いを生み出すためには、厳しいストレス条件（例えば、５０℃で２日間）が必要である。これらの条件下で、組み合わせ番号９および１０の試料は他の試料より凝集しやすいようだ。

蛋白質間の安定性を区別しうる最大の要素は凍結融解サイクルと温度上昇である。非常に厳しいストレス要素である５０℃でのインキュベーションを考慮に入れると、T366K/L351E,Y349E （組み合わせ番号４）およびT366K,L351K/L351D,Y349E （組み合わせ番号１１）の２つの変異体が、この一群の中で最も安定的な蛋白質であり、それにわずかな差でT366K,L351K/L351D,Y349D（組み合わせ番号１０）および T366K,L351K/L351D,L368E （組み合わせ番号１２）が続いている。

（実施例２１：比率を変えてネイティブＭＳを行う実験；トランスフェクション比率１：５から５：１）
偏った比でトランスフェクションした場合の混合物中のＣＨ３変異したＩｇＧの挙動についての知識を深めるため、特にT366K:L351K/L351D’:L368E’ の組み合わせ（以下では KK/DE または DEKKと呼ぶ）について、より詳細に比率に関する実験を行った。

既知の特異性および既知の共通の軽鎖ヒトＩＧＫＶ１−３９との結合能を有する、これまでに用いられた抗体のＶＨ領域が、コンストラクト１，２，６８および６９に再クローンするのに用いられ、結果としてベクターＩ−Ｖ（表１７）を得た。異なるＣＨ３領域および異なる抗原特異性をもつＩｇ重鎖と、共通のヒト軽鎖をコードする核酸配列をそれぞれ含む、ベクターＩ−Ｖが、表１８に示された異なるトランスフェクションの比率で、そのあと細胞にトランスフェクションされた。結果を図２３に示した。

図２３ＡおよびＢで示されるように、ＤＥＫＫ組み合わせ変異においては、超過した量のＡまたはＣが存在するとき（ＡまたはＣが「ＤＥ側」、Ｂが「ＫＫ側」）、ＡＢまたはＢＣが形成されるが、すべての場合において、超過した量のＡまたはＣは、ホモ二量体および半分子の両方の混合物として存在する。しかし、超過した量のＢが存在するとき（Ｂが「ＫＫ側」、ＡまたはＣが「ＤＥ側」）、明確な違いがみられる。ＡＢまたはＢＣはなお形成されるが、Ｂの超過量は実質的にはホモ二量体としては存在せず、半分子のみ形成される。

ここでも割合はピークの高さにより測定されていることに注意すべきである。２％かそれより小さい値で検出されたピークについては、ここで用いられているｎＭＳの技術が正確に測定することができる閾値よりも低い。従って、２％より小さい測定は分析のノイズレベルの範囲内とみなし無視することにした。

Ｂを超過させると、半分子Ｂの割合のみが高くなることは特筆すべきである。特に、Ａ：Ｂが１：３および１：５の比率の場合、ホモ二量体ＢＢの存在が無く、高い割合の半分子Ｂが観察されており（図２３Ａおよび２３Ｂ）、ＫＫ側のＣＨ３の変異ではホモ二量体が起こりにくいことを示している。ホモ二量体が存在しないのは決定的に有利な点となる。その理由は、特異性を加えるため、ＤＥＫＫ組み合わせの「ＫＫ側」が選ばれたとき、ホモ二量体として存在する場合にこれまでに知られた悪影響が起こる可能性があるためである（例えば、ｃＭＥＴまたはＣＤ３抗体は、二価のホモ二量体として医薬組成物に存在した時に、望ましくない悪い副作用を有することが知られている）。

ＤＥ：ＫＫが異なる比率となる観察結果は、ベクターＩＶおよびＶにおける、コントロールの電荷反転ＣＨ３変異とは対照的である。図２３Ｃで示されるように、E356K:D399K/K392D’:K409D’の組み合わせの変異においては、Ａが超過して存在するとき（Ａが「K392D:K409D側」）、すべての場合において、余剰量のＡは、ホモ二量体と半分子の両方の混合物で存在する。Ｂが超過して存在するときも（Ｂが「E356K:D399K側」）、すべての場合において、余剰量のＢは、ホモ二量体と半分子の両方の混合物として存在する。より高い１：３や１：５の比率においても、ホモ二量体が存在するが半分子Ｂは観察されない。これにより、E356K:D399K側は、ＤＥＫＫ組み合わせのＫＫ側ほどにはホモ二量体を好まないことが示された。

まとめると、ＤＥＫＫ組み合わせの変異は、ヘテロ二量体の鎖の一つがホモ二量体を形成しないという、電荷反転ＣＨ３変異よりも明確な利点がある。

（実施例２２：ＤＥＫＫ組み合わせを用いる様々な混合物）
ＤＥＫＫ組み合わせの変異は、高い純度の二重特異性ＩｇＧ分子（「ＡＢ」）の形成を誘導することが示された。次に我々は、１つの細胞から、「ＡＢとＡＡ」または「ＡＢとＡＣ」混合物のような、より複雑な抗体混合物の制御された生産の実行可能性を模索した。これまでに用いられたＦａｂの型が、「ＤＥコンストラクト」または「ＫＫコンストラクト」のいずれかを含むベクターに組み込まれた。そして、技術の多用性を示すため、これらのベクターの様々な組み合わせが共発現され混合物が生成された。Ｆａｂの型ＭＦ１３３７（破傷風毒素），ＭＦ１１２２（フィブリノーゲン）およびＭＦ１０２５（チログロブリン）が、これらの全体的に安定な挙動、良好な発現量およびこれらのＦａｂを含むＩｇＧの間の質量の差から、選択された（表１９参照）。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの解析によれば、大半の試料は、大部分がＩｇＧ全長からなり、いくつかの場合で低い割合の半分子が存在した。さらに、多くの試料は非還元条件下のゲルにおいて、約１５０ｋＤａの位置に２つのバンドを示した。これは、試料に区別できる２つのＩｇＧの種が存在することを反映している。還元条件下でのゲルでも、いくつかの試料で２つの重鎖のバンドを見ることができた（データ不図示）

全ての試料においてネイティブＭＳが行われ、観察された種の割合がピークの高さに基づいて算出された（表２０の「観察された種」の割合）。結果を図２４に示した。３つの重鎖が共発現された全ての８試料において、予測された種に対応する２つの主要なピークが観察された。これらの試料のうち２つ（トランスフェクション２および４）およびトランスフェクション１１において、少量の混入するＤＥ−ＤＥホモ二量体が観察された。半分子は、大半の試料において非常に少ない量であるが検出された（２％より少ない）。しかし、上述の通り、ＩｇＧ全長の部分から容易に分離することが可能なために問題とはならない。

ｎＭＳの後で見つかったことであるが、試料１１では、観察されたＩｇＧの質量に対応する種とは異なる種が予測されていた。これはトランスフェクションの誤りであったと結論付けられた。すなわち、試料１１では１１２２−ＫＫの代わりに、１３３７−ＫＫが、１０２５−ＤＥと共発現されたことが明らかだった。

望ましい特異性の機能的な存在を確かめるため、ＩｇＧ試料はサンドイッチＥＬＩＳＡによりさらなる試験が行われた。フィブリノーゲンまたはチオグロブリンでＥＬＩＳＡプレートのコーティングを行い、検出はフルオレセインでラベルしたチオグロブリンまたは破傷風毒素で行った。検出抗原は製造業者の指示に従い、フルオレセイン（Pierce NHS-fluorescin Antibody Labeling kit, cat. #53029）でラベルした。フルオレセインでラベルした抗原は、その後、ＦＩＴＣ共役抗フルオレセイン抗体（Roche diagnostics, cat. # 11426346910）で検出した。

二重特異性ＥＬＩＳＡ（ＯＤ４５０の値）の結果の概要を表２１に示した。灰色のセルは各トランスフェクションで予測される種を示す。概して、実験結果は予測される結果と合うが、例外をイタリックまたはボールド体で示した。トランスフェクション１−３では、種ＢＣ（トランスフェクション＃１および＃２）またはＡＣ（トランスフェクション＃３）は「ネガティブ」と推測されるセルだが、顕著なバックグラウンドのシグナルを示している。これまでの研究から、二重特異性ＥＬＩＳＡは高いバックグラウンドのレベルに悩まされることが知られている。これらのバックグラウンドのレベルは試料に存在しうる半分子に起因するかもしれない。注記しておくと、二重特異性ＥＬＩＳＡの結果から、トランスフェクション＃１１では誤りが起こっていたことが確認された。ＢＣではなく種ＡＣ（ボールド体の値）が検出された。

（実施例２３：単一細胞からの、４つの異なるエピトープ（ＡＢおよびＣＤ）を認識する２つの二重特異性抗体の改善された混合物）
実施例１２では、トランスフェクションＺＡまたはＺＢからの混合物は、大量生産に移ったときに問題になるのではないかという予測の仮説があった。その理由は、ノブ・イントゥ・ホール変異体は不安定と報告され、「ノブ」または「ホール」を備えるＣＨ３ドメインが電荷を操作されたＣＨ３ドメインと二量化することは除外できないからである。上述の例で示されたように、選択的にヘテロ二量化を誘導し、ホモ二量体の形成は実質的に無い新規の電荷ペアの変異体が見出された。これらの新規の電荷ペアの変異体を備えるＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、これまでに知られている電荷を操作されたＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖あるいはSEED bodiesと共に細胞に発現され、２つの二重特異性分子のみを選択的に形成する結果となりうる。

上述の例から明らかな様に、ＤＥＫＫ組み合わせ変異は、重鎖の二量化がＣＨ３ドメインにより誘導されるクローン細胞において、１つの二重特異性分子（ＡＢ）または２つの二重特異性分子（ＡＢとＡＣ）の生産をするのに優れている。しかし、相補的なＣＨ３変異として用いることができるベクターのセットが１つだけでは、生産されうる混合物の種類は限られてしまう。もしＤＥＫＫと組み合わせて用いることができる、第２の「直交する（orthogonal）」ベクターのセットがあれば、「ＡＢとＣＤ」または「ＡＢとＣＣ」混合物のようなより複雑なＩｇＧおよび／または二重特異性分子を生産することが可能である。

２つのベクターのセットを組み合わせるときに重要な要件は、２つの異なるセットのＣＨ３操作されたベクターから発現された重鎖が「交差」二量体を作らないことである。「交差」とは、１つのベクターのセットにより生産された重鎖が、そのほかのベクターのセットにより発現された重鎖と二量化したＩｇＧ全長となることである。

このような「交差」二量体の形成がされうるかについてテストするため、ＨＡＤＤＯＣＫを用い、野生型ＣＨ３ドメインとＤＥ−またはＫＫ−変異を含むＣＨ３ドメインとの間のペアリングが起こるかについて知見を得るためのin silico解析が行われた。同様に、野生型ＣＨ３ドメインとE356K,D399KまたはK392D,K409D変異を含むＣＨ３ドメインとの間のペアリングが起こりうるか、野生型ＣＨ３ドメインとノブ・イントゥ・ホール変異を含むＣＨ３ドメインとの間のペアリングが起こりうるか、および上記の任意の組み合わせについて解析した。ＨＡＤＤＯＣＫで解析したＣＨ３変異の組み合わせのリストを表２２に示した。結果のＨＡＤＤＯＣＫスコアは図２５に要約した。

図２５に示されるように、これらのＨＡＤＤＯＣＫの予測に基づくと、ＤＥＫＫの組み合わせのＣＨ３と、電荷反転の組み合わせのＣＨ３とを組み合わせた場合が最も成功であるようだ。この組み合わせにより、単一細胞に共発現させたときに混入する副産物（特にＡＣ，ＡＤ，ＢＣ，ＢＤ）が無く、望ましい組み合わせの２つの二重特異性分子（ＡＢとＣＤ）を形成することができる。

図２５に見られるとおり、これらの望ましくない二重特異性の種ＡＣ，ＡＤ，ＢＣおよびＢＤは比較的高いＨＡＤＤＯＣＫスコアを有する。一方で、望ましいＡＢおよびＣＤは最も低いＨＡＤＤＯＣＫスコアを有する。もちろん、ＤＥＫＫまたは電荷反転のＣＨ３組み合わせのいずれかが同一の特異性を保持するコンストラクトに挿入されたとき（例えば、ＤＥ側に「Ｃ」，ＫＫ側に「Ｃ」，E356K,D399K側に「Ａ」およびE356K,D399K側に「Ｂ」、または、ＤＥ側に「Ａ」，ＫＫ側に「Ｂ」，E356K,D399K側に「Ｃ」およびE356K,D399K側に「Ｃ」）は、細胞に共発現させるとＣＣおよびＡＢが主に生産される。

対照的に、ＤＥＫＫと野生型との共発現での予測に目を向けると、ＡＣとＡＤに対するＨＡＤＤＯＣＫスコアはＣＤに対するＨＡＤＤＯＣＫスコアより低い。このことは、ＤＥＫＫのＣＨ３組み合わせをコードするベクターと、野生型ＣＨ３をコードするベクターとを一緒に共発現することにより、ＡＢとＣＤの混合物を生産しようとするとき、ＡＣおよびＡＤが非常に混入しやすいことを示している。

最後に、ＤＥＫＫまたは電荷反転変異体のいずれかと、ノブ・イントゥ・ホール変異体とを一緒に共発現する場合の予測では、望ましくない二重特異性変異体が比較的低いＨＡＤＤＯＣＫスコアを有する結果となった。すなわち、共発現の際、これらの望ましくない種が生産される蓋然性が高い。

従って、ＤＥＫＫ組み合わせのＣＨ３と電荷反転組み合わせのＣＨ３との組み合わせ（E356K,D399K/K392’D,K409D’）が実質的に純粋な「ＡＢとＣＤ」および／または「ＡＢとＣＣ」の抗体の混合物を得るのに理想的に好ましいと結論された。

次に、上述の結果を実行に移すために、４つの標的／エピトープ（ＡＢとＣＤ）を認識する２つの二重特異性分子の混合物と、３つの標的／エピトープ（ＡＢとＣＣ）を認識する１つの二重特異性分子と１つの単一特異性分子の混合物とが生成された。これらの混合物の生成においては、４つの異なるＶＨはすべて共通の軽鎖ＩＧＶＫ１−３９とペアリングすることができるが、個々のＶＨ／ＶＬの組み合わせは全て異なる特異性を有する。

ネイティブＭＳの解析を可能にするため、（予測される）種の間の質量差は十分なければならない。すなわち、１９０Ｄａよりも大きい値である。共発現の際予測される種がｎＭＳで同定され分離されることができるような質量の値をとるように、４つの個々のＶＨが選択された。さらに、４つの選択されたＶＨは、２つの望ましい種に加え、混合物で生まれうる大半の混入物をも同定するのに十分なほど大きい質量差をもつ。選択されたＶＨのリストを表２３に示した。

表２４に示したように、４つの異なるＶＨが「ＤＥ」若しくは「ＫＫ」コンストラクトまたは電荷反転コンストラクトを含むベクターにクローンされ、また、いくつかの共発現を行った。今までと同様、すべてのベクターは共通の軽鎖ＩＧＫＶ１−３９をコードする核酸も含んでいる。これまでに示したように、２つのベクターのセットを組み合わせたときに重要な要件は、２つの異なるセットのＣＨ３操作されたベクターから発現された重鎖が「交差」二量体を形成しないことである。「交差」とは、１つのベクターのセットから生産される重鎖が、他のベクターのセットにより発現される重鎖と二量化しＩｇＧ全長となることである。電荷反転変異を含む重鎖とＤＥまたはＫＫ変異を含む重鎖との間の「交差」二量体の形成の可能性をテストするため、コントロールのトランスフェクションが行われた。

表２５は、予測される種の質量、および表２４のトランスフェクション番号９−１１において存在しうる混入物についてのさらなる概要を提供する。

トランスフェクション＃１−１１で得られたすべての精製された蛋白質の試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析され、３つのコントロールの試料が含まれた（図２６）。さらに、試料のすべての種を同定するため、トランスフェクション＃９−１１からの蛋白質試料について、ｎＭＳ解析が行われた。

図２６で見られるように、トランスフェクション＃３およびトランスフェクション＃４は、「ＫＫ」コンストラクトと「E356K:D399K」または「K392D:K409D」のいずれかとの間の予測されたミスマッチの結果となった。これらのトランスフェクションからの蛋白質試料における半分子の量は、ＩｇＧ分子全長の量を超えていた。

トランスフェクション＃７および＃８は、蛋白質試料において、半分子とＩｇＧ全長がほぼ等しい量で存在する結果となった。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥからは、このＩｇＧ全長がＤＥ／ＤＥ二量体、ＤＥ／E356K:D399K二量体、またはＤＥ／K392D:K409D二量体のどれを表しているのか導き出すことができない。注目すべきことには、トランスフェクション＃９−１１からの試料では、実質的に半分子は観察されなかった。

図２７に、トランスフェクション＃９および＃１１のｎＭＳ解析の結果を表示した。予測される種の割合および混入する種はピークの高さで算出した。トランスフェクション＃９では、予測される種「ＡＢとＣＤ」が混合物の９７％（３０％ＡＢおよび６７％ＣＤ）を表した。一方で、わずか約３％のみの混入するＢＤが存在する（図２７Ａ）。トランスフェクション＃１１では、予測される種「ＡＢとＣＣ」が混合物の９４％（３３％ＡＢおよび６１％ＣＣ）を表した。一方で、わずか６％のみのコンタミネーションするＢＣ（４．１％）およびＡＣ（１．８％）が存在する（図２７Ｂ）。

これらのデータが示すように、第２の「直交する」ベクターのセットがＤＥＫＫと組み合わせて用いられると、「ＡＢとＣＤ」または「ＡＢとＣＣ」の混合物のようなより複雑なＩｇＧおよび／または二重特異性分子の混合物を生産することが可能になる。電荷反転コンストラクトとＤＥＫＫコンストラクトを共に組み合わせて用いると、非常に限られた量の「交差」二量体の形成しか起こらない。トランスフェクションの比率を調節することで、これら低い割合で混入する副産物を、さらに減少させることができると予測される。

（実施例２４：マウスでの単一用量の薬物動態学的研究）
ＣＨ３領域にＤＥＫＫ変異の組み合わせを保持する二重特異性抗体の、薬物動態（ｐＫ）の挙動を研究するため、この研究では、３つの異なるＩｇＧバッチのｐＫパラメタを測定し比較した。３つのバッチに含まれるのは以下である；１）野生型抗破傷風毒素の親の抗体１３３７：１３３７（野生型Ｆｃ主鎖に２つのＭＦ１３３７Ｆａｂ）、２）野生型抗破傷風毒素の親の抗体１５１６：１５１６（野生型Ｆｃ主鎖に２つのＭＦ１５１６Ｆａｂ）、３）Ｆｃ領域にＤＥＫＫ組み合わせ変異を保持するＣＨ３操作された二重特異性抗破傷風毒素抗体１５１６：１３３７（ＤＥ側にＭＦ１５１６Ｆａｂ、ＫＫ側にＭＦ１３３７Ｆａｂ）。

ＤＥＫＫ−二重特異性抗体の生産物は、親の抗体が１３３７：１３３７および１５１６：１５１６の特異性を持つように選択された。その理由は、いくつかのマウスの系統においてこれらの抗体に対する処方前の血清反応が存在しないことがこれまでの研究に基づいて知られているからである。ちなみに、処方前に血清反応が存在すると、研究結果の検討が難しくなる。さらに、ｎＭＳにより、親の抗体間における、１３３７：１３３７（野生型Ｆｃ）、１５１６：１３３７（ＤＥＫＫ Ｆｃ）および１５１６：１５１６（野生型Ｆｃ）の識別が可能になるだけの十分な質量差があることも理由の一つである。

３つのＩｇＧのバッチはこれまでに説明されたように準備された。しかしトランスフェクションに用いられたＤＮＡはエンドトキシンの量が可能な限り少なくなるようにエンドトキシンフリーのマキシプレップキットを用いて作成した。バッチは、その後、蛋白質の濃度、凝集量、エンドトキシン量および二重特異性の生産物の割合について試験された。のちのｐＫの研究におけるＩｇＧバッチの使用についての許容基準にかなうことが示された。すなわち、ゲル濾過後のＩｇＧ濃度は０．３ｍｇ／ｍｌより高く、凝集量は５％より低く、エンドトキシン量は３ＥＵ／ｍｇ蛋白質であり、ＤＥＫＫバッチは９０％を超える二重特異性ＩｇＧを含んでいた。

ゲル濾過後の試料におけるネイティブ質量分析では、予測された種が高い割合で存在していた。試料１５１６：１３３７では、約２％と見積もられる少量のＤＥ：ＤＥホモ二量体が検出された（図２８）。３つのＩｇＧのバッチはｐＫ研究に用いるための基準を満たすと結論された。

３つのバッチの間のｐＫパラメータの比較のため、３群の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Harlan, The Netherlands）に、１ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧ（５ｍｌ／ｋｇ 免疫グロブリン溶液／ｋｇ体重）を投与した。動物は投与時において７−８週齢であり、約１８−２０グラムの体重であった。血液の試料は、投与前、投与後１５，６０分、並びに投与後２，４，８，２４，４８，９６，１６８，２６８および３３６時間に収集された。血清試料が整えられ、分析まで−２０度より低い温度で保存された。それぞれの群は４匹のマウスの３つの下位群からなる。すなわち、１２マウス／群である。それぞれのマウスからは６の時点から試料が収集された。

マウスの福祉については、欧州共同体動物実験指針（Directive 86/609/EEC：the general principles governing the use of animals in experiments of the European Communities）およびオランダの立法（オランダの動物実験に関する法律：The Experiments on Animals Act, 1997）に従い維持した。この研究は、米国国立衛生研究所実験動物福祉部門が発行した、実験動物の人道的管理と使用に関する基準（Standards for Humane Care and Use of Laboratory Animals）、識別番号45859-01（満了日：２０１５年４月３０日）も遵守して行われた。

群１のマウスは単一特異性ＩｇＧ抗体１５１６：１５１６全長の投与を受けた（三角）。群２のマウスは単一特異性ＩｇＧ抗体１３３７：１３３７全長の投与を受けた（四角）。群３のマウスはＤＥＫＫ操作されたＣＨ３領域（ＤＥ側が１５１６、ＫＫ側が１３３７）をもつ二重特異性ＩｇＧ抗体１５１６：１３３７全長の投与を受けた（菱形）。

定量的ヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡ（ZeptoMetrix, NY USA; ELISAキット No. 0801182）を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイによりマウス血清中のモノクローナルヒト抗体の定量分析を行った。簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡアッセイは以下の原理に基づく。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに抗ヒトＩｇＧのコートがあり、ヒトモノクローナル抗体が該抗ヒトＩｇＧに結合する。結合した抗体はその後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役したポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて可視化された。

各ウェルの吸光度（ＯＤ）は血清試料中の抗体の量に直接的に比例する。結果を図２９に示した。ＤＥＫＫ変異の組み合わせを保持する二重特異性ＩｇＧ全長と、親の単一特異性抗体は著しく類似することが観察された。ＤＥＫＫ−二重特異性抗体にあるＣＨ３変異は、安定性または半減期を変えない。また、ＤＥＫＫ変異体は野生型ＩｇＧのようにふるまう。

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Claims (34)

1. 単一細胞からヘテロ二量体のＩｇ様分子を生産する方法であって、
   前記Ｉｇ様分子は、接触面を形成することができる２つのＣＨ３ドメインを備え、
   前記方法は、前記細胞に、
   ａ．第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第１の核酸分子、
   ｂ．第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする第２の核酸分子
   を与えることを含み、
   前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも一つの置換を備え、
   前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、中立的なアミノ酸残基から負に荷電したアミノ酸残基への少なくとも一つの置換を備え、
   前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記２つの核酸分子を発現させ、前記ヘテロ二量体Ｉｇ様分子を培養物から回収する工程をさらに備える、方法。
2. 請求項１に記載の方法において、
   前記宿主細胞に、共通の軽鎖をコードする核酸分子を与えることをさらに含む、方法。
3. 請求項１または２に記載の方法において、
   前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｔ３６６Ｋを備え、
   前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｌ３５１Ｄを備える、方法。
4. 請求項３に記載の方法において、
   前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｌ３５１Ｋをさらに備える、方法。
5. 請求項３または４に記載の方法において、
   前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、Ｙ３４９Ｅ，Ｙ３４９ＤおよびＬ３６８Ｅからなる群から選択される１つのアミノ酸置換をさらに備える、方法。
6. 請求項５に記載の方法において、
   前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖はアミノ酸置換Ｌ３６８Ｅをさらに備える、方法。
7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の方法において、
   混入するホモ二量体の存在は５％より少なく、好ましくは２％より少なく、より好ましくは１％より少なく、最も好ましくは混入するホモ二量体が実質的に無い、方法。
8. 請求項１から７のいずれか一項に記載の方法において、
   それぞれの前記ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は、標的エピトープを認識する可変領域をさらに備える、方法。
9. 請求項８に記載の方法において、
   前記ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖の、それぞれの２つの可変領域は異なる標的エピトープを認識する、方法。
10. 請求項９に記載の方法において、
    前記異なる標的エピトープは同一の標的分子に位置する、方法。
11. 請求項１０に記載の方法において、
    前記標的分子は水溶性の分子である、方法。
12. 請求項１０に記載の方法において、
    前記標的分子は膜結合性分子である、方法。
13. 請求項９に記載の方法において、
    前記異なる標的エピトープは異なる標的分子に位置する、方法。
14. 請求項１３に記載の方法において、
    前記異なる標的分子は同一の細胞に発現する、方法。
15. 請求項１３に記載の方法において、
    前記異なる標的分子は異なる細胞に発現する、方法。
16. 請求項１３に記載の方法において、
    前記異なる標的分子は水溶性の分子である、方法。
17. 請求項１３に記載の方法において、
    １つの標的分子は水溶性の分子であり、２番目の標的分子は膜結合性分子である、方法。
18. 請求項８から１０、１２から１５、または１７のいずれか一項に記載の方法において、
    前記標的エピトープの少なくとも１つは腫瘍細胞に位置する、方法。
19. 請求項８から１０、１２から１５、または１７のいずれか一項に記載の方法において、
    前記標的エピトープの少なくとも１つはエフェクター細胞に位置する、方法。
20. 請求項１９に記載の方法において、
    前記エフェクター細胞は、ＮＫ細胞，Ｔ細胞，Ｂ細胞，単球，マクロファージ，樹状細胞，または好中性顆粒球である、方法。
21. 請求項１９または２０に記載の方法において、
    前記標的エピトープは、ＣＤ３，ＣＤ１６，ＣＤ２５，ＣＤ２８，ＣＤ６４，ＣＤ８９，ＮＫＧ２ＤまたはＮＫｐ４６分子に位置する、方法。
22. 請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法において、
    前記ヘテロ二量体Ｉｇ様分子は、抗体，好ましくはヒトＩｇＧ，より好ましくはヒトＩｇＧ１である、方法。
23. 請求項２から２２のいずれか一項に記載の方法において、
    前記共通の軽鎖は生殖細胞系列由来の軽鎖であり、好ましくは再編成された生殖細胞系列ヒトκ軽鎖ＩｇＶκ１−３９*０１／ＩＧＪκ１*０１である。
24. 請求項１−２３のいずれか一項に記載の方法により得られるヘテロ二量体Ｉｇ様分子。
25. 請求項２４に記載のヘテロ二量体Ｉｇ様分子において、
    前記ヘテロ二量体Ｉｇ様分子は、同一の抗原にある異なるエピトープおよび／または異なる抗原にある異なるエピトープに結合する、ヘテロ二量体Ｉｇ様分子。
26. 請求項２４または２５に記載のヘテロ二量体Ｉｇ様分子において、
    前記Ｉｇ様分子は抗体である、ヘテロ二量体Ｉｇ様分子。
27. ２つのＣＨ３ドメインを備えるヘテロ二量体の抗体であって、
    前記２つのＣＨ３ドメインの１つは、
    アミノ酸置換Ｌ３５１ＤおよびＬ３６８Ｅを備え、
    前記２つのＣＨ３ドメインの他の１つは、
    アミノ酸置換Ｔ３６６ＫおよびＬ３５１Ｋを備える、ヘテロ二量体の抗体。
28. 少なくとも第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸配列を備える組み換え宿主細胞であって、
    前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備え、
    前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から負に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備える、組み換え宿主細胞。
29. 請求項２８に記載の組み換え宿主細胞において、
    前記宿主細胞は、共通の軽鎖をコードする核酸配列をさらに備える、組み換え宿主細胞。
30. 請求項２４から２６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体Ｉｇ様分子または請求項２７に記載のヘテロ二量体の抗体と、薬学的に容認可能な担体とを備える医薬組成物。
31. 請求項３０に記載の医薬組成物において、
    前記ヘテロ二量体Ｉｇ様分子または前記ヘテロ二量体の抗体は請求項２８または請求項２９の組み換え宿主細胞で生産された、医薬組成物。
32. ヘテロ二量体Ｉｇ様分子を生産するための宿主細胞を作成する方法であって、
    前記方法は、
    前記宿主細胞に、少なくとも第１および第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖をコードする核酸配列を導入する工程を備え、
    前記第１のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から正に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備え、
    前記第２のＣＨ３ドメインを備えるポリペプチド鎖は中立的なアミノ酸残基から負に荷電したアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を備え、
    前記核酸配列は、順々にまたは同時に導入される、方法。
33. 請求項３２に記載の方法において、
    前記宿主細胞に共通の軽鎖をコードする核酸配列を導入する工程をさらに備える、方法。
34. ヘテロ二量体Ｉｇ様分子を生産する、請求項２８若しくは２９に記載の組み換え宿主細胞の、または請求項３２若しくは３３に記載の方法により得られる組み換え宿主細胞の、培養物。

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