JP6721590B2 - 多重特異性抗体 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、多重特異性抗体、それらの製造方法、これら抗体を含む薬学的組成物、およびそれらの使用に関する。
発明の背景
2種類以上の抗原に結合する能力を有する二重特異性抗体または多重特異性抗体などの改変タンパク質は、当技術分野において公知である。そのような多重特異性結合タンパク質は、細胞融合、化学的コンジュゲーション、または組換えDNA技法を使って作製することができる。
近年、例えばIgG抗体フォーマットと一本鎖ドメインとの融合による四価二重特異性抗体などといった、多種多様な組換え多重特異性抗体フォーマットが開発されている（例えばColoma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15（1997）159-163（非特許文献1）、WO 2001/077342（特許文献1）、およびMorrison, S.L., Nature Biotech. 25（2007）1233-1234（非特許文献2）を参照されたい）。
多重特異性抗体の作製における障害の一つは、ミスペアリングした副生成物の形成である。この副生成物は、洗練された精製手法によって所望の多重特異性抗体から分離する必要があり、生産収量を低下させる。
ミスペアリングした副生成物の問題を克服するための、「ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）技術」として知られているアプローチでは、CH3ドメインに変異を導入して接触境界面を修飾することによって、2つの異なる抗体重鎖のペアリングを強制することを目指す。一方の鎖では、「ホール」を作り出すために、嵩高いアミノ酸が短い側鎖を持つアミノ酸で置き換えられた。逆に、他方のCH3ドメインには、「ノブ」を作り出すために、大きな側鎖を持つアミノ酸が導入された。これら2つの重鎖（および2つの同一軽鎖、これらの軽鎖はどちらの重鎖にとっても適当である必要がある）を共発現させることにより、ホモ二量体形成（「ホール-ホール」または「ノブ-ノブ」）と対比して高収率のヘテロ二量体形成（「ノブ-ホール」）が観察された（Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9（1996）617-621（非特許文献3）、およびWO 96/027011（特許文献2））。ファージディスプレイアプローチを使用して2つのCH3ドメインの相互作用面をリモデリングすることと、ヘテロ二量体を安定化するためにジスルフィド架橋を導入することとによって、ヘテロ二量体のパーセンテージをさらに増加させることができた（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681（非特許文献4）、Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35（非特許文献5））。
WO 2010/115598 A1（特許文献3）には、単一特異性完全長IgG分子に基づく三価二重特異性抗体が開示されており、ここでは、第2の抗原に特異的に結合する第3の抗原結合部位を形成させるために、重鎖のそれぞれの各C末端に可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインが融合されている。2つの修飾重鎖のヘテロ二量体化を促進するために、ノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-holes）技術によるCH3ドメインの修飾が提案されている。
もはや抗体コア構造（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM）が保たれていない他の抗体フォーマット、例えば2つ以上の抗原に結合する能力を有するダイアボディ、トリアボディ、またはテトラボディ、ミニボディ、およびいくつかの一本鎖フォーマット（scFv、Bis-scFv）なども開発された（Holliger, P., et. al, Nature Biotech. 23（2005）1126-1136（非特許文献6）; Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14（非特許文献7）; Shen, J., et. al, J. Immunol. Methods 318（2007）65-74（非特許文献8）; Wu, C., et al., Nature Biotech. 25（2007）1290-1297（非特許文献9））。そのようなフォーマットはすべて、抗体コア（IgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM）をさらなる結合タンパク質（例えばscFv）に融合するために、または例えば2つのFabフラグメントもしくはscFvを融合するために、リンカーを使用する（Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14（非特許文献7））。
WO 94/09131（特許文献4）には、抗体フラグメント（例えばFabフラグメント）によって形成される第1の結合領域と第2の結合領域とが、互いに結合する能力を有する会合ドメインによって互いに会合している、多重特異性抗体が開示されている。WO 94/09131（特許文献4）によれば、会合ドメイン（例えばそれぞれVHドメインおよびVLドメイン）がFabフラグメントのそれぞれに融合されることで、第1の結合領域と第2の結合領域は、両方の結合特異性を含む単一のタンパク質が得られるように組み合わされる。
抗体フラグメントには、治療薬としては、標準サイズのモノクローナル抗体との比較で賛否両論がある。利点の一つは、抗体フラグメントの方が小さく、より素早く組織および腫瘍に浸透することである。加えて、フラグメントはサイズが小さいため、標準サイズのモノクローナル抗体には接近できないエピトープへの結合も可能になることが示唆されている。欠点としては、おそらく腎臓クリアランスのせいで、フラグメントはヒトにおいて短い循環半減期を示す。半減期が短いと、標的部位における治療薬の十分な蓄積が妨げられる可能性がある。抗体フラグメントの生産は自明ではない。というのも、フラグメントは凝集物を形成する可能性が高く、標準サイズのモノクローナル抗体より安定性が低い場合があるからである。加えて、コグネイトでない重鎖と軽鎖の望まれないペア形成も、不活性な抗原結合部位および/または所望しない他の非機能的副生成物の形成をもたらし、それが、抗体フラグメントの臨床規模での生産および治療的応用においては大きな問題になる。
本発明の抗体フォーマットではこれらの欠点が克服される。
WO 2001/077342 WO 96/027011 WO 2010/115598 A1 WO 94/09131
Coloma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15（1997）159-163 Morrison, S.L., Nature Biotech. 25（2007）1233-1234 Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9（1996）617-621 Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681 Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35 Holliger, P., et. al, Nature Biotech. 23（2005）1126-1136 Fischer, N., and Leger, O., Pathobiology 74（2007）3-14 Shen, J., et. al, J. Immunol. Methods 318（2007）65-74 Wu, C., et al., Nature Biotech. 25（2007）1290-1297
本発明は、少なくとも3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、2つの抗原結合部位は第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分によって形成されており、
a）第3の抗原結合部位は、可変重鎖ドメイン（VH3）と可変軽鎖ドメイン（VL3）とによって形成されていて、
・VH3ドメインのN末端は、第1のペプチドコネクタを介して第1の抗原結合部分に接続され、
・VL3ドメインのN末端は、第2のペプチドコネクタを介して第2の抗原結合部分に接続されており、
b）前記多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、これらCH3ドメインは、
i）CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成、もしくは
CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること、
ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入、または
iii）i）およびii）の両修飾
によってヘテロ二量体化を促進するように改変されており、
c）第3の抗原結合部位のVH3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの一方に接続され、第3の抗原結合部位のVL3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの他方に接続されており、かつ
d）前記多重特異性抗体は定常重鎖ドメイン2（CH2）を欠いている、
多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様において、第1の抗原結合部分は第1のFabフラグメントであり、第2の抗原結合部分は第2のFabフラグメントである。
本発明の一態様は、
i）CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成、または
CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること
によって、CH3ドメインが改変されており、
ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、CH3ドメインが改変されており、
第3の結合部位が、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）:
・VH3の44番目およびVL3の100番目、
・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
・VH3の101番目およびVL3の100番目
によってジスルフィド安定化されている、
多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、
i）CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成、または
CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること
によって、CH3ドメインが改変されており、
ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、CH3ドメインが改変されており、
第3の結合部位が、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によって、ジスルフィド安定化されている、
多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタが少なくとも15アミノ酸のペプチドである、多重特異性抗体に関する。本発明の一態様は、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタが15〜70アミノ酸のペプチドである、多重特異性抗体に関する。本発明の一態様は、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタがグリシン残基およびセリン残基からなるペプチドである、多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、VH3ドメインのC末端がCH3ドメインのうちの一方に直接的に接続され、VL3ドメインのC末端がCH3ドメインのうちの他方に直接的に接続されている、多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、三価多重特異性抗体に関する。本発明の一態様は、三価二重特異性の多重特異性抗体に関する。本発明の一態様は、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分が第1の抗原に特異的に結合し、第3の結合部位が第1の抗原とは異なる第2の抗原に特異的に結合する、三価二重特異性の多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、三価三重特異性の多重特異性抗体に関する。
本発明のもう一つの局面は、（i）少なくともハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する本発明の多重特異性抗体と、（ii）前記多重特異性抗体が結合するハプテンであって、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンとを含む複合体である。
本発明のもう一つの局面は、以下の工程を含む、本発明の多重特異性抗体を調製するための方法である:
・多重特異性抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程、および
・宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程。
本発明のもう一つの局面は、本発明の多重特異性抗体をコードする核酸である。
本発明のもう一つの局面は本発明の核酸を含む発現ベクターである。
本発明のもう一つの局面は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞である。
本発明のもう一つの局面は、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。
本発明のもう一つの局面は、本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。
本発明の多重特異性抗体は、一方では、異なる抗原へのそれらの結合に起因する新しい性質を示し、また他方では、それらの安定性、低い凝集性、ならびに薬物動態特性および生物学的特性（例えば完全長IgGとほぼ同じ分子量を有することによる低い腎クリアランス、FcRn結合の回避による中くらいの血清中半減期）により、生産および薬学的製剤に適している。ミスペアリングした副生成物は非対称ヘテロ二量体化戦略の使用によって回避される。このように少なくとも3つの結合部位が互いに弁別的に配置されていることにより、本発明の抗体は、単一の細胞の表面に存在する複数の抗原への結合に、または1つの抗原上の異なるエピトープへの結合に、とりわけ適している。本発明の抗体にはCH2ドメインが存在しないので、抗体によるエフェクター機能の媒介は消失している。
[本発明1001]
少なくとも3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、2つの抗原結合部位は第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分によって形成されており、
a）第3の抗原結合部位は、可変重鎖ドメイン（VH 3 ）と可変軽鎖ドメイン（VL 3 ）とによって形成されていて、
・VH 3 ドメインのN末端は、第1のペプチドコネクタを介して第1の抗原結合部分に接続され、
・VL 3 ドメインのN末端は、第2のペプチドコネクタを介して第2の抗原結合部分に接続されており、
b）前記多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、これらCH3ドメインは、
i）CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成、もしくは
CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること、
ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入、または
iii）i）およびii）の両修飾
によってヘテロ二量体化を促進するように改変されており、
c）第3の抗原結合部位のVH 3 ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの一方に接続され、第3の抗原結合部位のVL 3 ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの他方に接続されており、かつ
d）前記多重特異性抗体は定常重鎖ドメイン2（CH2）を欠いている、
前記多重特異性抗体。
[本発明1002]
第1の抗原結合部分が第1のFabフラグメントであり、第2の抗原結合部分が第2のFabフラグメントである、本発明1001の多重特異性抗体。
[本発明1003]
第3の結合部位が、VH 3 ドメインとVL 3 ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VH 3 の44番目およびVL 3 の100番目、
・VH 3 の105番目およびVL 3 の43番目、または
・VH 3 の101番目およびVL 3 の100番目
によってジスルフィド安定化されている、
本発明1001または1002の多重特異性抗体。
[本発明1004]
第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタが少なくとも15アミノ酸のペプチドである、前記本発明のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1005]
第1のペプチドコネクタと第2のペプチドコネクタとの間に鎖間ジスルフィド結合が形成されていない、前記本発明のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1006]
VH 3 ドメインのC末端がCH3ドメインのうちの一方に直接的に接続され、VL 3 ドメインのC末端がCH3ドメインのうちの他方に直接的に接続されている、前記本発明のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1007]
三価である、前記本発明のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1008]
二重特異性または三重特異性である、前記本発明のいずれかの多重特異性抗体。
[本発明1009]
・ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する、前記本発明のいずれかの多重特異性抗体、および
・前記多重特異性抗体が特異的に結合するハプテンであって、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテン
を含む複合体。
[本発明1010]
・多重特異性抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程、および
・宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程
を含む、本発明1001〜1008のいずれかの多重特異性抗体を調製するための方法。
[本発明1011]
本発明1009の方法によって生産された多重特異性抗体。
[本発明1012]
本発明1001〜1008のいずれかの多重特異性抗体をコードする核酸。
[本発明1013]
本発明1012の核酸を含む発現ベクター。
[本発明1014]
本発明1012の核酸を含む宿主細胞。
[本発明1015]
少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明1001〜1008のいずれかの多重特異性抗体または本発明1009の複合体を含む薬学的組成物。
[本発明1016]
細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明1001〜1008のいずれかの多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート。
本発明の多重特異性抗体の設計。図1A:本発明の二重特異性抗体の構造。第1の結合部位および第2の結合部位を形成する2つの結合アームを含む抗体。各CH3ドメインのN末端に融合されたVH3ドメインとVL3ドメインとによって形成される第3の抗原結合部位。ペプチドコネクタは、VH3ドメインおよびVL3ドメインのN末端を、それぞれ第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分と連結する。VH3ドメインまたはVL3ドメインのどちらか一方を含むポリペプチド鎖のヘテロ二量体化は、ジスルフィド安定化、およびノブ・イントゥ・ホール技術によるCH3改変（すべての図においてこれを「KiH改変」という）、またはCH3/CH3境界面の対応する位置における反対電荷のアミノ酸の導入によるCH3改変（すべての図においてこれを「（+/-）改変」という）のアプローチのうちの少なくとも1つを用いるCH3ドメインの改変によって、促進される。加えて、VH3/VL3境界面におけるジスルフィド安定化も応用しうる（図示していない）。図1B:第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がFvフラグメントである本発明の二重特異性抗体の構造。この説明図では、Fvフラグメントは同じエピトープに結合する。しかし、異なるエピトープに結合する2つのFvフラグメントを使用することによって、本発明の三重特異性抗体を作製してもよい。図1C:第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がFabフラグメントである、本発明の二重特異性抗体の構造。この説明図では、Fabフラグメントは同じエピトープに結合する。しかし、異なるエピトープに結合する2つのFabフラグメントを使用することによって、本発明の三重特異性抗体を作製してもよい。 第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントを含む本発明の多重特異性抗体の設計。完全長IgG（左側）と比較した本発明の二重特異性抗体（右側）の構造。VH3ドメインとVL3ドメインとによって形成される第3の抗原結合部位が、完全長IgG分子のCH2ドメインを置き換えている。抗原アクセスを保証するために、鎖間ジスルフィド結合を欠くペプチドコネクタを介してFabフラグメントをVH3およびVL3と接続することにより、ヒンジジスルフィドを除去した。VH3ドメインまたはVL3ドメインのどちらか一方を含むポリペプチドのヘテロ二量体化は、ジスルフィド安定化、およびノブ・イントゥ・ホール技術によるCH3改変、またはCH3/CH3境界面の対応する位置における反対電荷のアミノ酸の導入によるCH3改変のアプローチのうちの少なくとも1つを用いるCH3ドメインの改変によって、促進される。加えて、VH3/VL3境界面におけるジスルフィド安定化も応用しうる（図示していない）。 第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントを含む本発明の多重特異性抗体の設計。実施例1において作製した二重特異性抗体の構造。（Gly4Ser）4ペプチドコネクタを使って第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントをVH3またはVL3のどちらか一方と融合した。加えて、実施例1において詳しく概説するとおり、CH3境界面におけるノブ・イントゥ・ホール修飾およびジスルフィド安定化、ならびにVH3/VL3結合部位のジスルフィド安定化によって、異なるポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を促進した。 例示的な本発明の多重特異性抗体。第2のFabフラグメントが、VL2-CH1（重鎖）、VH2-CL（軽鎖）ドメインアーキテクチャをもたらすVH2ドメインとVL2ドメインのドメイン交差を含む、三重特異性抗体。第1のFabフラグメントはドメイン交差を含まないので、VH1-CH1、VL1-CLの野生型ドメインアーキテクチャのままである。 例示的な本発明の多重特異性抗体。第2のFabフラグメントが、VL2-CL（重鎖）、VH2-CH1（軽鎖）ドメインアーキテクチャをもたらすVH-CH1ドメインとVL-CLドメインのドメイン交差を含む、三重特異性抗体。第1のFabフラグメントはドメイン交差を含まないので、VH1-CH1、VL1-CLの野生型ドメインアーキテクチャのままである。 例示的な本発明の多重特異性抗体。第2のFabフラグメントが、VH2-CL（重鎖）、VL2-CH1（軽鎖）ドメインアーキテクチャをもたらすCH1ドメインとCLドメインのドメイン交差を含む、三重特異性抗体。第1のFabフラグメントはドメイン交差を含まないので、VH1-CH1、VL1-CLの野生型ドメインアーキテクチャのままである。 例示的な本発明の多重特異性抗体。第2のFabフラグメントが、VH2-CL（重鎖）、VL2-CH1（軽鎖）ドメインアーキテクチャをもたらすCH1ドメインとCLドメインのドメイン交差を含み、第1のFabフラグメントが、VL2-CH1（重鎖）、VH2-CL（軽鎖）ドメインアーキテクチャをもたらすVH1ドメインとVL1ドメインのドメイン交差を含む、三重特異性抗体。 例示的な本発明の多重特異性抗体。第2のFabフラグメントが一本鎖Fabフラグメントを含む、三重特異性抗体。 例示的な本発明の多重特異性抗体。第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントが、一本鎖Fvフラグメント、ジスルフィド安定化Fvフラグメント、またはジスルフィド安定化一本鎖Fvフラグメントである、三重特異性抗体。 例示的な本発明の多重特異性抗体。第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントが単一ドメイン結合部位またはスキャフォールド（scaffold）結合部位である、三重特異性抗体。 例示的な本発明の多重特異性抗体。第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントは、単一ドメイン結合部位またはスキャフォールド結合部位であり、さらなる単一ドメイン結合部位またはスキャフォールド結合部位が、それぞれ第1の結合部位および第2の結合部位のN末端に融合されている、5つの抗原結合部位を持つ多重特異性抗体。 抗原アクセスを可能にするFabフラグメントと第3の結合部位との間のフレキシブルな接続の設計。図4A:鎖間ジスルフィドを持たない十分に長いペプチドコネクタによってヒンジ領域ジスルフィドを除去すると、第3の抗原結合部位への抗原アクセスが可能になる。生成した抗体フォーマットを安定化するには、自然のVH3/VL3相互作用に加えて、少なくとも1つのヘテロ二量体化アプローチが必要である（表示されているもの:太線でジスルフィド、CH3/CH3境界面のノブ・イントゥ・ホール修飾）。図4B:CH1、ヒンジ領域およびCH2間の野生型IgG1接続部位と、実施例1に従って作製された抗体のCH1、ペプチドコネクタ、VH3ドメインの融合部位との比較。 それぞれにCH3ドメインを持つ第3の結合部位の可変ドメイン間の安定化境界面の設計。VH3およびVL3を含むFvフラグメントとCH3/CH3境界面との両方にジスルフィド安定化を施すと、人工的に導入されたシステイン残基が、（a）互いに、そして（b）各可変ドメインまたは定常ドメイン中の天然鎖内ジスルフィド結合形成システインに、近接して存在することになる。それらシステイン残基の近接性ゆえに、所望のジスルフィド結合形成が好ましい中、ミスペアリングが起こる可能性があり、それがタンパク質ミスフォールディングおよび収量の低減につながりうる（表内に示すとおり）。 それぞれにCH3ドメインを持つ第3の結合部位の可変ドメイン間の安定化境界面の設計。第3の結合部位がジゴキシゲニンに特異的に結合する実施例1に記載の本発明の二重特異性抗体において使用されたVL3とCH3との例示的融合部位。追加して導入されたシステイン残基は、アミノ酸配列内において太字および下線で示されている（SEQ ID NO:01）。VH3ドメインまたはVL3ドメインとの融合に応用することができるCH3ドメインの代替的N末端を下に示す（SEQ ID NO:02、SEQ ID NO:03、SEQ ID NO:04）。 実施例1の二重特異性抗体の精製の結果。（A）第3の結合部位がジゴキシゲニンに特異的に結合する抗体（BsAb CD33-Dig（SS）-CD33）のKappa-selectの代表的クロマトグラム。（B）〜（D）BsAb CD33-Dig（SS）-CD33、LeY-Dig（SS）-LeY、およびGPC3-Dig（SS）-GPC3のkappa-select結合フラクションのサイズ排除クロマトグラフィー。網掛けしたボックスは、適正にフォールディングされた抗体を含有するフラクションを示している。（E）試料還元なし（n.r.）および試料還元あり（r.）での精製抗体のSDS-PAGE。 実施例1の二重特異性抗体の精製の結果。（A）〜（C）BsAb Dig-CD33-Dig、Dig-LeY-Dig、およびDig-GPC3-Digのkappa-select結合フラクションのサイズ排除クロマトグラフィー。網掛けしたボックスは適正にフォールディングされた抗体を含有するフラクションを示している。（D）試料還元なし（n.r.）および試料還元あり（r.）での精製抗体のSDS-PAGE。 実施例1の二重特異性抗体の結合研究の結果。ハプテン結合に対処するためにDig-Cy5をペイロードとして使用し、LeY発現MCF7細胞、CD33発現Molm13細胞、およびGPC3発現HepG2細胞でのFACS分析によって分析した、実施例1において作製した抗体の同時抗原結合。 実施例6の二重特異性抗体の結合研究の結果。ハプテン結合を扱うためにビオチン化Cy5をペイロードとして使用し、LeY発現かつCD33陰性MCF7細胞でのFACS分析によって分析した、実施例6において作製したBsAb BsAb LeY-Bio（SS）-LeYの同時抗原結合。 ペイロードとしての毒素との複合体を形成した本発明の二重特異性抗体の模式図。本発明の二重特異性抗体（多重特異性を持つ抗体の複合体はしかるべく形成させることができる）とペイロードとの間に形成された複合体が示されている。本発明の二重特異性抗体の第3の結合部位はハプテン（例えばジゴキシゲニン、ビオチン）に特異的に結合し、一方、第1の結合部位および第2の結合部位はターゲット分子（例えば、LeY、CD33、GPC3のような腫瘍関連抗原）に結合する。ハプテンにカップリングされたペイロード（例えばシュードモナス外毒素PEのような毒素）を本発明の二重特異性抗体と接触させることによって、複合体を形成させる。この複合体は、ターゲット分子発現細胞への標的ペイロード送達に使用しうる。 BsAb LeY-Dig（SS）-LeYとジゴキシゲニン化PEとの複合体によるMCF7細胞増殖の阻害。実施例5に詳述するBrdU取り込みアッセイの結果が示されている。Y軸は増殖細胞へのBrdUの取り込みを示している。 BsAb LeY-Bio（SS）-LeYとビオチン化PEとの複合体によるMCF7細胞増殖の阻害。実施例6に詳述するBrdU取り込みアッセイの結果が示されている。Y軸は増殖細胞へのBrdUの取り込みを示している。
発明の詳細な説明
1.定義
用語「a」「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、一般に複数の指示対象を包含する。
本明細書において使用する「抗原結合部分」という用語は、ターゲット抗原に特異的に結合する部分を指す。この用語は、抗体の他、ターゲット抗原に特異的に結合する能力を有する他の天然分子（例えば受容体、リガンド）または合成分子（例えばDARPin）を包含する。好ましい一態様において、本発明の抗体の抗原結合部分は、抗体フラグメントである。
本明細書において「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントなどといったさまざまな抗体構造を、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り包含する。
「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体の一部分であってインタクトな抗体が結合する抗原に結合する部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2;ダイアボディ;線状抗体;一本鎖抗体分子（例えばscFv、scFab）;および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する場合、「Fabフラグメント」とは、VLドメインと軽鎖の定常ドメイン（CL）とを含む軽鎖フラグメント、ならびに重鎖のVHドメインおよび第1の定常ドメイン（CH1）を含む抗体フラグメントを指す。したがって、もし第1の結合部分および第2の結合部分がそれぞれ第1Fabフラグメントおよび第2のFabフラグメントであるなら、そのような本発明の抗体の第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントは、それぞれがVLドメインおよびCLドメインならびにVHドメインおよびCH1ドメインを含む、2つの異なるFab部分を指す。
「Fvフラグメント」は、完全な抗原結合部位を含有する抗体フラグメントである。このフラグメントは、非共有結合的に会合していてもよい1つの重鎖可変領域ドメインと1つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体からなる。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書では可換的に使用されて、ネイティブ抗体と実質的に類似する構造を有する抗体、または本明細書において定義するFc領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。
「組換え抗体」は、組換え法で改変された宿主細胞によって生産された抗体である。これは単離または精製されていてもよい。
「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞によって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するか、ヒト抗体レパートリーまたは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は、ヒト抗体のこの定義からは、明確に除外される。
本明細書において使用する「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作出または単離されるすべてのヒト抗体、例えばNS0細胞またはCHO細胞などの宿主細胞から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使って発現された抗体を包含するものとする。そのような組換えヒト抗体は、再編成された形態の可変領域および定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超変異を起こしている。したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来し、それに関係しているものの、インビボでは、ヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しないこともありうる。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が、ある特定の供給源またはある特定の種に由来し、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来している抗体を指す。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基とヒトFRからのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。一定の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質上すべてを含み、HVR（例えばCDR）のすべてまたは実質上すべてが非ヒト抗体のものに対応し、すべてのFRまたは実質上FR全体がヒト抗体のものに対応するであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含みうる。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
「単離された」抗体とはその自然環境の構成要素から分離されたものをいう。いくつかの態様において、抗体は、例えば電気泳動法（例えばSDS-PAGE、等電点電気泳動（IEF）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー法（例えばイオン交換または逆相HPLC）による決定で、95％超または99％超の純度まで精製される。抗体純度の評価方法を概観するには、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87（2007）を参照されたい。
「特異性」とは、抗原結合部分（例えば抗体）による抗原の特定エピトープの選択的認識を指す。例えば天然抗体は単一特異性である。本明細書において使用する「単一特異性抗体」とは、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する1つまたは複数の結合部位を有する抗体を意味する。「多重特異性抗体」は、2つ以上の異なるエピトープ（例えば2つ、3つ、4つ、またはそれ以上の異なるエピトープ）に結合する。エピトープは同じ抗原上にあっても異なる抗原上にあってもよい。多重特異性抗体の一例は、2つの異なるエピトープに結合する「二重特異性抗体」である。抗体が2つ以上の特異性を有する場合、認識されるエピトープは単一の抗原に付随しても、2つ以上の抗原に付随してもよい。
エピトープとは抗体または抗原結合部分が結合する抗原の一領域である。「エピトープ」という用語は、抗体または抗原結合部分に特異的に結合する能力を有する任意のポリペプチド決定基を包含する。一定の態様において、エピトープ決定基は、アミノ酸、グリカン側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどといった、分子の化学的に活性な表面集団を包含し、一定の態様では、特異的三次元構造特徴、および/または特異的電荷特徴を有しうる。
本明細書において使用する場合、「結合」および「特異的結合」という用語は、精製野生型抗原を使ったインビトロアッセイ、好ましくはプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore（登録商標）、GE-Healthcare、スウェーデン・ウプサラ）における、抗原のエピトープへの抗体または抗原結合部分の結合を指す。一定の態様において、抗体または抗原結合部分は、それが、タンパク質および/または高分子の複雑な混合物においてそのターゲット抗原を優先的に認識するのであれば、抗原に特異的に結合するという。
抗原への抗体の結合のアフィニティーは、ka（抗体/抗原複合体を形成する抗体の会合に関する速度定数）、kD（解離定数）、およびKD（kD/ka）を使って定義される。一態様において、〜への結合、または〜に特異的に結合するとは、10-8mol/l以下、一態様では10-8M〜10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）を意味する。したがって、本発明の多重特異性抗体は、それが特異的である各抗原に、10-8mol/l以下の結合アフィニティー（KD）で、例えば10-8〜10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）で、一態様では10-9〜10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）で、特異的に結合する。
本明細書において使用する用語「結合部位」または「抗原結合部位」は、抗原結合分子（例えば抗体）の領域（1つまたは複数）であって、リガンド（例えば抗原またはその抗原フラグメント）が実際に結合し、かつ、優先的に、抗体に由来する領域を表す。抗体の場合には、抗原結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン（VH）および/もしくは抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、またはVH/VLのペアを含む。本発明の抗体の第3の抗原結合部位は、VH/VLのペアによって形成される。
所望の抗原に特異的に結合する抗体に由来する抗原結合部位は、a）その抗原に特異的に結合する公知の抗体に由来するか、またはb）例えば抗原タンパク質もしくは核酸またはそれらのフラグメントなどを用いるデノボ免疫化法によって、またはファージディスプレイによって得られる、新しい抗体または抗体フラグメントに由来しうる。
抗体に由来する場合、本発明の抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位のアフィニティーにさまざまな程度に寄与する6つの相補性決定領域（CDR）を含有することができる。3つの重鎖可変ドメインCDR（CDRH1、CDRH2およびCDRH3）と、3つの軽鎖可変ドメインCDR（CDRL1、CDRL2およびCDRL3）がある。CDRおよびフレームワーク領域（FR）の範囲は、これらの領域が配列間の可変性に従って画定されている編集されたアミノ酸配列データベースとの比較によって決定される。本発明の範囲には、より少ないCDRで構成される（すなわち結合特異性が3つ、4つまたは5つのCDRによって決定される）機能的抗原結合部位も包含される。例えば、CDR6個の完全なセットに満たなくても、結合には十分な場合がある。
本明細書において使用する「価」という用語は、ある抗体分子における指定された数の結合部位の存在を表す。例えば天然抗体は2つの結合部位を有し、二価である。したがって「三価」という用語は、ある抗体分子における3つの結合部位の存在を表す。
本明細書において使用する「可変ドメイン」または「可変領域」は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖と重鎖のペアのそれぞれを表す。軽鎖の可変ドメインは「VL」と略記され、重鎖の可変ドメインは「VH」と略記される。上記に準じて、本明細書では、第3の結合部位の可変ドメインを「VH3」および「VL3」と呼び、数字3を用いて第3の結合部位であることを示す。
ヒト軽鎖およびヒト重鎖の可変ドメインは同じ全体構造を有する。各可変ドメインは4つのフレームワーク（FR）領域を含み、その配列は広く保存されている。FRは3つの「超可変領域」（または「相補性決定領域」、CDR）によって接続されている。各鎖上のCDRは、上述のフレームワークアミノ酸によって分離されている。それゆえに、抗体の軽鎖および重鎖は、N末端からC末端に向かって、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。FRはβシートコンフォメーションをとり、CDRはβシート構造を接続するループを形成しうる。各鎖中のCDRはFRによってそれぞれの三次元構造に保持され、他方の鎖からのCDRと一緒に「抗原結合部位」を形成する。とりわけ重鎖のCDR3は抗原結合に最も寄与する領域である。CDR領域およびFR領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）の標準的定義に従って決定される。
天然抗体では、VLドメインおよびVHドメインが、それぞれ軽鎖および重鎖の末端に配置されており、それは抗原のアクセスを許すので、抗原結合が保証される。本発明の抗体では、抗原結合部分がFabフラグメントである場合に、第3の結合部位のVL3ドメインとVH3ドメインを、2つの定常ドメインの間に配置することができる。定常ドメインに埋め込まれてはいるものの、驚いたことに、第3の結合部位の特異的結合が観察された。
本願において使用する用語「定常ドメイン」または「定常領域」は、可変領域以外の抗体のドメイン全体を表す。定常領域は抗原の結合に直接的には関与しないが、さまざまなエフェクター機能を呈する。
抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、「クラス」IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに分類され、これらのうちのいくつかはさらに、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、IgA1およびIgA2などのサブクラスに分類されうる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。5つの抗体クラスの全てに見いだすことができる軽鎖定常領域（CL）はκ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる。
本明細書において使用される「定常ドメイン」は、ヒト起源であり、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のヒト抗体の定常重鎖領域および/または定常軽鎖カッパまたはラムダ領域に由来する。そのような定常ドメインおよび領域は当分野の技術水準において周知であり、例えばKabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に記載されている。
「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトIgG1のGlu216付近またはCys226付近からPro230付近まで続くと定義される（Burton, Molec. Immunol. 22:161-206（1985））。本発明の抗体はヒンジ領域ジスルフィドを欠く。
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つの相異なるタイプのうちの一つに割り当てることができる。野生型軽鎖は、典型的には、2つの免疫グロブリンドメイン、すなわち通常は、抗原への結合にとって重要な1つの可変ドメイン（VL）と、定常ドメイン（CL）とを含有している。
「重鎖」には、異なるタイプがいくつか存在し、それらが抗体のクラスまたはアイソタイプを規定している。野生型重鎖は一連の免疫グロブリンドメインを含有し、通常は、抗原を結合するのに重要な1つの可変ドメイン（VH）と、いくつかの定常ドメイン（CH1、CH2、CH3など）がある。
本明細書において「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために使用される。この用語にはネイティブ配列Fc領域および変異体Fc領域が包含される。一態様においてヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。本明細書において別段の明示がある場合を除き、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているように、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う。
「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプによってさまざまな、抗体のFc領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合および補体依存性細胞傷害（CDC）; Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）;貪食;細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）のダウンレギュレーション;およびB細胞活性化がある。
本発明の抗体の構造ゆえに、特にCH2ドメインの欠如に起因して、本発明の抗体によるFc媒介エフェクター機能は消失している。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」、すなわち「ADCC」は、細胞傷害の一形態であって、一定の細胞傷害性細胞（例えばNK細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するFc受容体（FcR）に結合した分泌型免疫グロブリン（Ig）が、抗原を保持するターゲット細胞にそれらの細胞傷害性エフェクター細胞が特異的に結合することを可能にし、続いてそれらの細胞傷害性エフェクター細胞がターゲット細胞を細胞毒で殺すことを可能にするものを指す。ADCCを媒介するための主要細胞であるNK細胞がFc-ガンマRIIIだけを発現するのに対し、単球はFc-ガンマRI、Fc-ガンマRII、およびFc-ガンマRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92（1991）の464頁の表3に要約されている。関心対象分子のADCC活性を評価するには、インビトロADCCアッセイ、例えば米国特許第5,500,362号もしくは同第5,821,337号または米国特許第6,737,056号（Presta）に記載されているものを行いうる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、PBMC細胞およびNK細胞がある。これらに代えて、またはこれらに加えて、インビボでも、例えば動物モデル（Clynes et al., PNAS（USA）95:652-656（1998）に開示されているものなど）において、関心対象分子のADCC活性を評価しうる。
「補体依存性細胞傷害」、すなわち「CDC」とは、補体存在下でのターゲット細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、それぞれのコグネイト抗原に結合している抗体（適当なサブクラスのもの）に補体系の第1構成要素（C1q）が結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163（1996）に記載されているようなCDCアッセイを行いうる。Fc領域アミノ酸配列が改変されてC1q結合能が増加または減少しているポリペプチド変異体（変異体Fc領域を持つポリペプチド）は、例えば米国特許第6,194,551号（B1）およびWO 1999/51642に記載されている。例えばIdusogie et al., J. Immunol. 164:4178-4184（2000）も参照されたい。
ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」は、通常、231番目付近のアミノ酸残基から340番目付近のアミノ酸残基までに及ぶ。本多重特異性抗体はCH2ドメインを欠く。「CH2ドメインを欠く」とは、本発明の抗体がCH2ドメインを含まないことを意味する。
「CH3ドメイン」は、Fc領域においてCH2ドメインよりC末端側にある残基のストレッチ（すなわち、IgGの341番目付近のアミノ酸残基から447番目付近のアミノ酸残基まで）を含む。本発明の抗体では、第3の結合部位のVH3ドメインおよびVL3ドメインのC末端に、それぞれ一つのCH3ドメインが配置されている。本明細書における「CH3ドメイン」は変異体CH3ドメインであり、そこでは、多重特異性抗体内で互いに向かい合う2つのCH3ドメインの二量体化を促進するために、天然CH3ドメインのアミノ酸配列が少なくとも1つの相異なるアミノ酸置換（すなわちCH3ドメインのアミノ酸配列の修飾）を受けている。
ヘテロ二量体化をサポートするためのCH3修飾についてはいくつかのアプローチが、例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291に記載されている。
典型的には、当技術分野において公知のヘテロ二量体化アプローチでは、一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインの両方が、ある改変CH3ドメインを含む重鎖が同じ構造のもう一つの重鎖とはもはやホモ二量体化できないように、相補的に改変される。これにより、ある改変CH3ドメインを含む重鎖は、相補的に改変されたCH3ドメインを含む他方の重鎖とのヘテロ二量体化を強いられる。
当技術分野において公知のヘテロ二量体化アプローチの一つは、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」技術であり、これは例えば、参照により本明細書に組み込まれるWO 96/027011、Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9（1996）617-621; Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16（1998）677-681;およびWO 98/ 050431に、いくつかの例を挙げて詳述されている。「ノブ・イントゥ・ホール」技術では、抗体の三次構造において2つのCH3ドメイン間に形成される境界面内に、各CH3ドメイン上の特定アミノ酸が、CH3ドメインのうちの一方に突起（「ノブ」）を、またCH3ドメインのうちの他方にくぼみ（「ホール」）を、それぞれ生じるように改変される。多重特異性抗体の三次構造において、一方のCH3ドメイン中に導入された突起は、他方のCH3ドメイン中に導入されたくぼみの中に配置されうる。
多重特異性抗体の重鎖のCH3ドメインを修飾するためのさらなる技法は（「ノブ・イントゥ・ホール」技術の他にも）当技術分野において公知である。これらの技術、とりわけWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954およびWO 2013/096291に記載されているものは、本発明の多重特異性抗体と組み合わされる「ノブ・イントゥ・ホール技術」の代替技法として是認される。ヘテロ二量体化をサポートするためにこれらの修飾のうちの一つを含む多重特異性抗体を、以下、本明細書では、「CH3改変」多重特異性抗体という。
EP 1870459に記載のアプローチによれば、CH3ドメインのヘテロ二量体化は、第1の重鎖と第2の重鎖の両者の間のCH3/CH3ドメイン境界面中の特定のアミノ酸位置における、反対電荷を持つ荷電アミノ酸の導入に基づく（本明細書では以下「CH3（+/-）改変多重特異性抗体」という）。
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO2013/157953に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1重鎖と第2重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている。本発明のCH3改変多重特異性抗体のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている。
本発明のCH3改変多重特異性抗体のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている。加えて、次に挙げる置換の少なくとも1つが、他方の重鎖のCH3ドメインに含まれる: 349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている、349番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている、および368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。一態様において、368番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されている。
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO2012/058768に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1の重鎖と第2の重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はYで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、409番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はFで置換されている。もう1つの態様では、前述の置換に加えて、他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、411番目（本来はT）、399番目（本来はD）、400番目（本来はS）、405番目（本来はF）、390番目（本来はN）および392番目（本来はK）のアミノ酸の少なくとも1つが置換されている。好ましい置換は
・N、R、Q、K、D、E、およびWから選択されるアミノ酸による411番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、
・R、W、Y、およびKから選択されるアミノ酸による399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、
・E、D、R、およびKから選択されるアミノ酸による400番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、
・I、M、T、S、V、およびWから選択されるアミノ酸による405番目のアミノ酸F（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、
・R、K、およびDから選択されるアミノ酸による390番目のアミノ酸N（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換、ならびに
・V、M、R、L、F、およびEから選択されるアミノ酸による392番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）の置換
である。
本発明のCH3改変多重特異性抗体（WO2012/058768に従って改変されたもの）のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、351番目のアミノ酸L（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はYで置換され、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はVで置換され、409番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はFで置換されている。本発明のCH3改変多重特異性抗体のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換され、409番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はFで置換されている。最後に述べた態様では、該他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、392番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、411番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はRで置換され、かつ400番目のアミノ酸S（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はRで置換されている。
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2011/143545に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1の重鎖と第2の重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、両重鎖のCH3ドメイン中のアミノ酸修飾が368番目および/または409番目に導入される。
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2011/090762に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1の重鎖と第2の重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。WO 2011/090762は、「ノブ・イントゥ・ホール」技術によるアミノ酸修飾に関する。本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はWで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はAで置換されている。本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体のもう1つの態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、366番目のアミノ酸T（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はYで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、407番目のアミノ酸Y（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はTで置換されている。
IgG2アイソタイプである本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2011/090762に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1の重鎖と第2の重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2009/089004に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1の重鎖と第2の重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、392番目のアミノ酸KまたはN（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は負荷電アミノ酸で（好ましい一態様ではEまたはDで、好ましい一態様ではDで）置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、399番目のアミノ酸D、356番目のアミノ酸EもしくはD、または357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は正荷電アミノ酸で（好ましい一態様ではKまたはRで、好ましい一態様ではKで）置換されている（好ましい一態様では399番目または356番目のアミノ酸がKで置換されている）。さらなる一態様では、前述の置換に加えて、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409番目のアミノ酸KまたはR（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は負荷電アミノ酸で（好ましい一態様ではEまたはDで、好ましい一態様ではDで）置換されている。さらにもう1つの態様では、前述の置換に加えて、または前述の置換に代えて、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、439番目のアミノ酸Kおよび/または370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）は互いに独立して負荷電アミノ酸で（好ましい一態様ではEまたはDで、好ましい一態様ではDで）置換されている。
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2007/147901に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1の重鎖と第2の重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。本発明のCH3改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、253番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換され、282番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、322番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、239番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、240番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、292番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換されている。
本発明の多重特異性抗体の一態様では、WO 2007/110205に記載のアプローチを使って、多重特異性抗体の第1の重鎖と第2の重鎖とのヘテロ二量体化が支援される。
上で述べたヘテロ二量体化戦略によるCH3ドメインの改変に代えて、またはそれらに加えて、追加の鎖間ジスルフィド架橋の導入も、ヘテロ二量体を安定化する（Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35; Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681）。これを、本明細書では、「CH3ドメインのジスルフィド安定化」ともいう。
ポリペプチドに関して「融合された」および「接続された」とは、ペプチド結合により、直接的に、または1つもしくは複数のペプチドリンカー（「ペプチドコネクタ」）を介して、連結された構成要素を指す。本明細書において可換的に使用される「ペプチドリンカー」または「ペプチドコネクタ」という用語は、あるアミノ酸配列のペプチドを表し、それらは好ましくは合成起源である。典型的には、ペプチドコネクタは、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に動けるように、グリシンおよびセリンのようなフレキシブルな残基で構成される。したがって、本発明において使用される典型的なペプチドコネクタは、グリシン-セリンリンカー、すなわちグリシン残基とセリン残基のパターンからなるペプチドコネクタである。
第1の抗原結合部分をVH3ドメインと融合し、第2の抗原結合部分をVL3ドメインと融合するために、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタが使用される。しかし、VH3ドメインおよびVL3ドメインとそれぞれのCH3ドメインとの間の接続は、直接的に、すなわち該ドメインの直接的接続によって、ペプチドリンカーを含むことなく実現される。したがって、ポリペプチドの融合/接続に関して本明細書において使用する「直接的に接続された」という用語は、接続部位がペプチドリンカーを含まないことを意味する。すなわち、融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、もっぱら、互いに融合されたポリペプチドのアミノ酸配列だけを含み、ペプチドリンカーのさらなるアミノ酸残基は含まない。これは、
（a）VH3とCH3の融合部位が、第3の結合部位の由来である元の「親」抗体のVHとCH1の天然接続部位およびCH2とCH3の天然接続部位をどちらも綿密に模倣し、
（b）VL3とCH3の融合部位が、第3の結合部位の由来である元の「親」抗体のVHとCH1の天然接続部位およびCH2とCH3の天然接続部位をどちらも綿密に模倣する
ような三次元構造を得るために行われる。
本明細書において使用する「ドメイン交差」を持つ抗体という用語は、抗体の天然ドメインアーキテクチャから逸脱している抗体結合アーム（例えばFab領域内）において、少なくとも1つの重鎖がその対応軽鎖ドメインで置換され、逆もまた同様に置換されている抗体を意味する。ドメイン交差には3つの一般的タイプ、すなわち（i）VL-CH1構造の交差軽鎖とVH-CL構造を含む交差重鎖とをもたらすCH1ドメインとCLドメインの交差、（ii）VH-CL構造の交差軽鎖とVL-CH1構造を含む交差重鎖とをもたらすVHドメインとVLドメインの交差、および（iii）VH-CH1構造の交差軽鎖とVL-CL構造を含む交差重鎖とをもたらす<VL-CL>と<VH-CH1>の交差（「Fab 交差」）がある（ドメイン構造はN末端からC末端に向かって示す）。本発明の用語では、対応する重鎖および軽鎖に関して「互いに入れ替えられ」るとは、前述のドメイン交差戦略を指す。したがって、CH1ドメインとCLドメインとが「互いに入れ替えられ」ている場合、それは、項目（i）で述べたドメイン交差と、その結果生じる重鎖および軽鎖ドメインアーキテクチャとを指す。また、VH1とVLとが「互いに入れ替えられ」ている場合、それは、項目（ii）で述べたドメイン交差を指し; CH1ドメインとCLドメインとが「互いに入れ替えられ」、かつVH1ドメインとVLドメインとが「互いに入れ替えられ」ている場合、それは、項目（iii）で述べたドメイン交差を指す。ドメイン交差を含む二重特異性抗体は、例えばWO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254およびSchaefer, W. et al., PNAS, 108（2011）11187-1191に開示されている。本発明の抗体がドメイン交差を含む場合、そのドメイン交差は「非対称」である。これは、（a）第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの一方だけがドメイン交差を含むこと、または（b）第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントは上記項目（i）〜（iii）で示した異なるドメイン交差を含むが、第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が同じドメイン交差を含むことはないこと、のどちらかを示す。
本明細書において使用する抗体の「三次構造」という用語は、本発明の抗体の幾何学的外形を指す。三次構造は抗体ドメインを含むポリペプチド鎖バックボーンを含み、アミノ酸側鎖はいくつかの方法で相互作用し、結合する。
本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、カルボキシル基に対してα位にあるアミノ部分を有する有機分子を表す。アミノ酸の例には、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンがある。使用されるアミノ酸は、いずれの場合も任意で、L型である。「正荷電」または「負荷電」アミノ酸という用語は、pH7.4におけるアミノ酸側鎖の電荷を指す。アミノ酸は、共通する側鎖の性質に従って、次のようにグループ分けすることができる:
（1）疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
（2）中性親水性: Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
（3）酸性: Asp、Glu;
（4）塩基性: His、Lys、Arg;
（5）鎖の配向に影響を及ぼす残基: Gly、Pro;
（6）芳香族: Trp、Tyr、Phe。
（表）アミノ酸と特有の性質
Figure 0006721590
本明細書において使用する場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされる。具体的には、可変ドメインおよびカッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLについては、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）のKabatナンバリングシステム（647〜660頁参照）が使用され、本明細書ではこれを「ナンバリングはKabatに従う」という；定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2およびCH3）については、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（661〜723頁参照）が使用され、本明細書ではこれを「ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う」という。
多重特異性抗体のポリペプチド鎖内のアミノ酸置換（または変異）は、抗体DNA中に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはヌクレオチド合成によって調製される。しかしそのような修飾は、非常に限られた範囲でしか実行することができない。例えば修飾は、IgGアイソタイプおよび抗原結合などの上記抗体特徴を改変しないが、組換え生産の収量、タンパク質安定性をさらに改良するか、精製を容易にしうる。一定の態様では、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。
本発明の抗体は組換え手段によって生産される。抗体の組換え生産法は、当分野の技術水準において広く知られており、原核および真核宿主細胞におけるタンパク質発現と、それに続く抗体の単離、そして通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞中で前述の抗体を発現させるために、各抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を標準的方法によって発現ベクター中に挿入する。発現は、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母細胞、または大腸菌（E. coli）細胞のような適当な原核宿主細胞または真核宿主細胞中で実行され、抗体は細胞（上清または溶解後の細胞）から回収される。抗体を組換え生産するための一般的方法は当分野の技術水準において周知であり、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17（1999）183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8（1996）271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16（2000）151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48（1998）870-880の総説に記載されている。
宿主細胞によって生産された抗体は、重鎖のC末端からの1つまたは複数（特に1つまたは2つ）のアミノ酸の翻訳後切断を起こしうる。それゆえに、完全長重鎖をコードする特別な核酸分子の発現によって宿主細胞が生産した抗体は、完全長重鎖を含む場合も、完全長重鎖の切断変異体（本明細書では切断変異体重鎖ともいう）を含む場合もありうる。これは、重鎖の最後の2つのC末端アミノ酸がグリシン（G446）およびリジン（K447）である場合（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）に当てはまりうる。
本明細書に記載する薬学的または診断用組成物などの本発明の組成物は、本発明の抗体の集団を含む。抗体の集団は、完全長重鎖を有する抗体および切断変異体重鎖を有する抗体を含みうる。
本明細書において使用する「精製（された）」という用語は、それぞれの自然環境から取り出され、または組換え生産の供給源から取り出され、あるいは他の形で単離もしくは分離されていて、本来ならそれらに付随している他の構成要素、例えば膜およびミクロソームを、少なくとも60％、例えば少なくとも80％は含まない、ポリペプチドを指す。抗体の精製（宿主細胞培養物からの抗体の回収）は、細胞構成要素または他の夾雑物、例えば他の細胞性核酸または細胞性タンパク質を取り除くために、アルカリ/SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知の他の技法を含む標準的技法によって行われる。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）を参照されたい。タンパク質精製には、例えば微生物タンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー（例えばカッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプの定常軽鎖ドメインを精製するためのアフィニティー媒体、例えばKappaSelectまたはLambdaSelectによるもの）、イオン交換クロマトグラフィー（例えばカチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）および混合モード交換）、チオフィリック（thiophilic）吸着（例えばベータ-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドによるもの）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えばフェニル-セファロース、アザ-アレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸によるもの）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えばNi（II）アフィニティー材料およびCu（II）アフィニティー材料によるもの）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）など、さまざまな方法が確立され、広く使用されている（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75（1998）93-102）。
本明細書において可換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを包含する。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらの類似体、またはDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによってもしくは合成反応によってポリマー中に組み込まれうる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含みうる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成要素によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、ラベルへのコンジュゲーションなどといった、合成後に施される修飾を含みうる。他のタイプの修飾には、無修飾型のポリヌクレオチドの他に、例えば「キャップ」、類似体による天然ヌクレオチドの1つまたは複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合を持つもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、荷電結合を持つもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）などを含有するもの、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレーターを含有するもの（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属（oxidative metal）など）、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えばアルファアノマー核酸など）がある。さらに、糖中に通常は存在するヒドロキシル基はいずれも、例えばホスホネート基、リン酸基で置き換えるか、標準的な保護基で保護するか、追加のヌクレオチドへの追加の結合を調製するために活性化するか、固形支持体または半固形支持体にコンジュゲートすることができる。5'および3'末端OHは、リン酸化するか、アミンまたは1〜20炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルは標準的保護基に誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドは、当技術分野において一般に知られているリボース糖またはデオキシリボース糖の類似体、例えば2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-または2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体、およびメチルリボシドなどの塩基ヌクレオシド類似体（basic nucleoside analog）も含有することができる。1つまたは複数のホスホジエステル結合を、代替連結基で置き換えてもよい。これらの代替連結基には、リン酸基がP（O）S（「チオエート」）、P（S）S（「ジチオエート」）、（O）NR2（「アミデート」）、P（O）R、P（O）OR'、CO、またはCH2（「ホルムアセタール」）で置き換えられている態様があるが、それらに限定されるわけではなく、ここで、各RまたはR'は独立してHであるか、任意でエーテル（-O-）結合を含有してもよい置換もしくは無置換アルキル（1〜20C）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（araldyl）である。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。上記の記載は、RNAおよびDNAを含めて、本明細書において言及するすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
「単離された」核酸とは、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、当該核酸分子を通常含有する細胞に含まれている核酸分子であるものの、染色体外に存在する核酸分子、またはその自然の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置にある核酸分子が含まれる。
「抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体重鎖および抗体軽鎖（またはそれらのフラグメント）をコードする1つまたは複数の核酸分子を指し、単一ベクター中または別々のベクター中のそのような核酸分子、および宿主細胞中の1箇所または複数箇所に存在するそのような核酸分子を包含する。
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、それが連結されたもう1つの核酸を増殖させる能力を有する核酸分子を指す。この用語は、自己複製性核酸構造としてのベクターおよび当該ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを包含する。この用語は、主に細胞へのDNAまたはRNAの挿入（例えば染色体組み込み）のために機能するベクター、主にDNAまたはRNAの複製のために機能するベクターの複製、およびDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。記載した機能を2つ以上提供するベクターも包含される。
「発現ベクター」は、それが機能的に連結された核酸の発現を指示する能力を有するベクターである。発現ベクターを適当な宿主細胞中に導入すると、発現ベクターは転写され、ポリペプチドに翻訳されうる。本発明の方法において宿主細胞を形質転換する場合は「発現ベクター」が使用される。したがって、本明細書に記載する宿主細胞の形質転換に関して「ベクター」という用語は、「発現ベクター」を意味する。「発現系」は通常、所望の発現産物を与えるように機能することができる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を指す。
本明細書にいう「発現」は、核酸がmRNAに転写されるプロセスおよび/または転写されたmRNA（転写産物ともいう）が次にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされているポリペプチドを、個別または総称的に遺伝子産物と呼ぶ。核酸がゲノムDNAに由来する場合、真核細胞における発現は対応するmRNAのスプライシングを含みうる。
本明細書において使用する用語「形質転換」は、宿主細胞中にベクター/核酸を導入するプロセスを指す。強力な細胞壁障壁を持たない細胞を宿主細胞として使用するのであれば、トランスフェクションは例えばGraham and Van der Eh, Virology 52（1978）546以降に記載のリン酸カルシウム沈殿法などによって行われる。ただし、核注入による方法やプロトプラスト融合による方法など、DNAを細胞中に導入するための他の方法も使用しうる。原核細胞または強固な細胞壁構造を含む細胞を使用する場合、トランスフェクションの一方法は、例えば、Cohen, F.N, et al., PNAS 69（1972）7110以下参照に記載の塩化カルシウムを使ったカルシウム処理である。
本願において使用する用語「宿主細胞」は、本発明の抗体を作製するために改変することができる任意の種類の細胞系を表す。
本明細書において使用する表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は可換的に使用され、このような名称はいずれも子孫を包含する。したがって「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、初代対象細胞とそこから派生した培養物を、その継代数にかかわらず包含する。また、全ての子孫は、意図的な突然変異または偶然の突然変異により、そのDNAの内容が正確には同一でないこともありうると理解される。元の形質転換細胞中で選択の対象としたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は包含される。別個の指定が意図される部分は、その文脈から明らかになるであろう。
一過性発現は、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30（2002）E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）3833-3837、Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289、およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204（1997）77-87に記載されている。好ましい一過性発現系（HEK293）は、Schlaeger, E.-J.およびChristensen, K.により、Cytotechnology 30（1999）71-83に、そしてSchlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194（1996）191-199に記載されている。
「薬学的組成物」という用語は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態にあり、その組成物を投与される対象にとって許容できないほどに毒性な追加の構成要素を含有しない調製物を指す。本発明の薬学的組成物は、当技術分野において公知のさまざまな方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望する結果に応じてさまざまであるだろう。一定の投与経路によって本発明の抗体を投与するには、抗体を、抗体の不活化を防止する材料でコーティングするか、抗体の不活化を防止する材料と同時投与することが必要になりうる。例えば抗体は、リポソームまたは希釈剤などの適当な担体に入れて、対象に投与することができる。薬学的に許容される希釈剤として食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。
薬学的組成物は有効量の本発明の抗体を含む。「有効量」の「作用物質」、例えば抗体とは、所望の治療結果または予防結果を達成するのに、必要な投薬量および期間で、有効な量を指す。特に「有効量」は、対象に投与した場合に、（i）本明細書に記載する特定の疾患、状態または障害を処置または防止し、（ii）特定の疾患、状態または障害の1つまたは複数の症状を減弱し、改善し、もしくは取り除き、または（iii）特定の疾患、状態または障害の1つまたは複数の症状の発生を防止し、もしくは遅延させる、本発明の抗体の量を表す。治療有効量は、使用する抗体分子、処置される疾患状態、処置される疾患の重症度、対象の年齢および相対的健康状態、投与経路および投与形態、担当する医療従事者または獣医療従事者の判断、その他の要因に依存して変動することになる。
「薬学的に許容される担体」は、薬学的製剤中の、活性成分以外の成分であり、これは対象にとって非毒性である。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などがある。好ましい一態様では、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば注射または注入による投与）に適している。
本発明の薬学的組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤などの佐剤も含有しうる。微生物の存在の防止は、上記滅菌手法によっても、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによっても、確実にすることができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含めることも望ましいだろう。加えて、注射用医薬形態の長時間にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどといった、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらしうる。
本明細書において使用する「非経口投与」および「非経口的に投与される」という表現は、通常は注射による、経腸投与および外用以外の投与様式を意味し、例えば静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含むが、それらに限定されるわけではない。
選択した投与経路がなんであれ、適切な水和物型で使用しうる本発明の化合物および/または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式について、患者に対して有毒であることなく、所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分量が得られるように、変動させることができる。選択される投薬量レベルは、使用した本発明の特定組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定化合物の***率、処置の継続時間、使用する特定組成物と併用される他の薬物、化合物および/または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、および過去の病歴などといった、医療分野において周知のさまざまな薬物動態因子に依存するであろう。
組成物は、滅菌状態になければならず、その組成物を注射器で送達できる程度には流動性でなければならない。担体は、水の他、一態様において、等張性食塩溶液である。
適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合は要求される粒度を維持することによって、また界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、例えば糖類、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物に含めることが好ましい。
本明細書において使用する「処置」（および「処置する」または「処置すること」などといったその文法上の異なる形）は、処置される個人の自然の過程を変化させようとする臨床的介入を指し、これは、予防のために行うか、臨床的病変の経過中に行うことができる。処置の望ましい効果には、疾患の発生または再発を防止すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮減、転移の防止、疾患進行速度を減じること、疾患状態の改善または一時的軽減、および寛解または予後の改善が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発達を遅延させ、または疾患の進行を遅くするために使用される。
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えばヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えばマウスおよびラット）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。一定の態様において個体または対象はヒトである。
「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の異種分子、例えば限定するわけではないが細胞毒性作用物質などにコンジュゲートされた抗体である。
本明細書において使用する「細胞毒性作用物質」という用語は、細胞の機能を阻害もしく防止し、かつ/または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞毒性作用物質には、放射性同位体（例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体）;化学療法剤または化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレーター剤）、成長阻害性作用物質;酵素およびそのフラグメント、例えば核酸分解酵素;抗生物質;毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素（それらのフラグメントおよび/または変異体を含む）;ならびに後述するさまざまな抗腫瘍性作用物質または抗がん性作用物質があるが、それらに限定されるわけではない。
2.本発明の態様の詳細な説明
I.多重特異性抗体
本発明は、少なくとも3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、2つの抗原結合部位は第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分によって形成されており、
a）第3の抗原結合部位は、可変重鎖ドメイン（VH3）と可変軽鎖ドメイン（VL3）とによって形成されていて、
・VH3ドメインのN末端は、第1のペプチドコネクタを介して第1の抗原結合部分に接続され、
・VL3ドメインのN末端は、第2のペプチドコネクタを介して第2の抗原結合部分に接続されており、
b）前記多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、これらCH3ドメインは、
i）CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成（これは、ノブ・イントゥ・ホール技術によってヘテロ二量体化をサポートすることに対応する）、もしくは
CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること（これは、対応するCH3ドメイン内に反対電荷のアミノ酸を導入することによってヘテロ二量体化をサポートすることに対応する）、
ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入、または
iii）i）およびii）の両修飾
によってヘテロ二量体化を促進するように改変されており、
c）第3の抗原結合部位のVH3ドメインのC末端は、b）で述べたCH3ドメインのうちの一方に接続され、第3の抗原結合部位のVL3ドメインのC末端は、b）で述べたCH3ドメインのうちの他方に接続されており、かつ
d）前記多重特異性抗体は定常重鎖ドメイン2（CH2）を欠いている、
多重特異性抗体に関する。
該多重特異性抗体の一般構造のスキームを図1に示す。第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分によって形成される本発明の多重特異性抗体の2つの結合アームは、同じ抗原または異なる抗原に結合しうる。野生型IgG分子とは異なり、本発明の多重特異性抗体では、CH2ドメインが、本明細書においてVH3/VL3と呼ぶ第3の結合部位で置き換えられた。本多重特異性抗体はCH2ドメインを欠くので、Fcが媒介するエフェクター機能は消失しているが、それは、いくつかの治療的応用にとって望ましいことである。多重特異性抗体は、同じターゲット抗原上の異なるエピトープ（例えば同じ生体分子上の異なるエピトープ）または同じ細胞上の異なる生体分子への結合に、特に適している。
ヘテロ二量体化
多重特異性抗体の一態様では、CH3ドメインが、ノブ・イントゥ・ホール技術に従って改変される。この態様の多重特異性抗体を本明細書では「CH3（KiH）改変多重特異性抗体」ともいう（ここで略号「KiH」は「ノブ・イントゥ・ホール技術」を意味する）。したがってこの態様によれば、CH3（KiH）改変多重特異性抗体内では、CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成;および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成により、ヘテロ二量体化を促進するようにCH3ドメインが改変されている。
言い換えると、この態様は、第1の重鎖および第2の重鎖を含む本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインとが、それぞれの抗体CH3ドメイン間に位置する境界面を形成し、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、それぞれが、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
・一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、境界面内で他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置されうる前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する突起を、境界面内に生成しており、かつ
・他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起がその中に配置されうる前記他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみを、境界面内に生成している、
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体に関する。
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択される。
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様において、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、かつ元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択される。
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366W突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366S、L368AおよびY407V突然変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366WおよびG407Y突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366S、L368AおよびY407V突然変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。
本発明のCH3（KiH）改変多重特異性抗体の別の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366W、R409DおよびK370E突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366S、L368A、Y407V、D399KおよびE357K突然変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。
上述のノブ・イントゥ・ホール技術による修飾に代えて、またはそれと組み合わせて、本発明の多重特異性抗体のCH3ドメインは、当技術分野において公知の他のヘテロ二量体化アプローチ、好ましくはWO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、およびWO 2013/096291に記載されているものに基づいて、ヘテロ二量体化を促進するように改変されている。
多重特異性抗体の別の一態様では、ノブ・イントゥ・ホール技術による修飾に代えて、またはそれと組み合わせて、CH3ドメインが（例えばEP 1870459に記載されているように）CH3/CH3ドメイン境界面中の特別なアミノ酸位置への反対電荷を持つ荷電アミノ酸の導入によって改変されている。この態様による多重特異性抗体を本明細書では「CH3（+/-）改変多重特異性抗体」ともいう（ここで略号「+/-」はそれぞれのCH3ドメインに導入された反対電荷のアミノ酸を意味する）。したがって、この態様によれば、CH3（+/-）改変多重特異性抗体内では、CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することにより、ヘテロ二量体化を促進するようにCH3ドメインが改変されている。
換言すると、この態様は、抗体の三次構造において第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインとがそれぞれの抗体CH3ドメイン間に位置する境界面を形成し、第1の重鎖のCH3ドメインおよび第2の重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列がそれぞれに抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸は正電荷アミノ酸で置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する一組のアミノ酸のうち、第2のアミノ酸は負荷電アミノ酸で置換されている、第1の重鎖および第2の重鎖を含む本発明のCH3（+/-）改変多重特異性抗体に関する。
本発明のCH3（+/-）改変多重特異性抗体の一態様において、前記正荷電アミノ酸は、K、RおよびHから選択され、前記負荷電アミノ酸は、EまたはDから選択される。
本発明のCH3（+/-）改変多重特異性抗体の一態様において、前記正荷電アミノ酸は、KおよびRから選択され、前記負荷電アミノ酸は、EまたはDから選択される。
本発明のCH3（+/-）改変多重特異性抗体の一態様において、前記正荷電アミノ酸はKであり、前記負荷電アミノ酸はEである。
本発明のCH3（+/-）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409番目のアミノ酸R（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はDで置換され、370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はEで置換されており、かつ他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換され、357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）はKで置換されている。
多重特異性抗体の別の一態様では、CH3ドメインがジスルフィド安定化されている。この態様による多重特異性抗体を、本明細書では「CH3（S-S）改変多重特異性抗体」ともいう（ここで略号「S-S」はジスルフィド安定化を意味する）。したがって、この態様によれば、CH3（S-S）改変多重特異性抗体内では、CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入により、ヘテロ二量体化を促進するようにCH3ドメインが改変されている。
言い換えると、この態様は、第1の重鎖および第2の重鎖を含む本発明のCH3（S-S）改変多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインとが、それぞれの抗体CH3ドメイン間に位置する境界面を形成し、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、それぞれが、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸はシステインで置換され、他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、第2のアミノ酸はシステインで置換され、第2のアミノ酸は前記境界面内で第1のアミノ酸に面していて、一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間のジスルフィド架橋が、導入されたシステイン残基によって形成されうるようになっている、本発明のCH3（S-S）改変多重特異性抗体に関する。
CH3（S-S）改変多重特異性抗体の一態様において、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異、および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。CH3（S-S）改変多重特異性抗体の一態様において、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるS354C突然変異、および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
多重特異性抗体のさらにもう一つの好ましい態様では、CH3ドメインがジスルフィド安定化され、かつノブ・イントゥ・ホール技術に従って改変されている。この態様による多重特異性抗体を、本明細書では、「CH3（KSS）改変多重特異性抗体」ともいう（ここで、略号「K」はノブ・イントゥ・ホール技術を意味し、「SS」はジスルフィド安定化を意味する）。したがってこの態様によれば、CH3（KSS）改変多重特異性抗体内では、CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成、ならびにCH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステインの追加導入により、ヘテロ二量体化を促進するようにCH3ドメインが改変されている。
言い換えると、この態様は、第1の重鎖および第2の重鎖を含む本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインとが、それぞれの抗体CH3ドメイン間に位置する境界面を形成し、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、それぞれが、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
・一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、境界面内で他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみ内に配置されうる前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する突起を、境界面内に生成しており、かつ
・他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、少なくとも1つのアミノ酸残基は、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換され、それによって、前記一方の重鎖のCH3ドメイン中に位置する境界面内の突起がその中に配置されうる前記他方の重鎖のCH3ドメイン中に位置するくぼみを、境界面内に生成しており、
・一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸はシステインで置換され、他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、第2のアミノ酸はシステインで置換され、第2のアミノ酸は前記境界面内で第1のアミノ酸に面していて、一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間のジスルフィド架橋が、導入されたシステイン残基によって形成されうるようになっている、
本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体に関する。
本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の一態様では、E356CまたはS354C突然変異が「ノブ」鎖のCH3ドメインに導入され、Y349C突然変異が「ホール」鎖のCH3ドメインに導入されている。
本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の一態様では、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、R、F、Y、およびWから選択される。
本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の一態様では、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、A、S、T、およびVから選択される。
本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の一態様では、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、R、F、Y、およびWから選択され、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、A、S、T、およびVから選択される。
本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の一態様では、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、R、F、Y、およびWから選択され、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、A、S、T、およびVから選択され、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366W突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366S、L368AおよびY407V突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366WおよびG407Y突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366S、L368AおよびY407V突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の別の一態様では、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366W、R409DおよびK370E突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366S、L368A、Y407V、D399KおよびE357K突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
多重特異性抗体のさらにもう一つの好ましい態様において、CH3ドメインは、ジスルフィド安定化され、かつCH3/CH3ドメイン境界面中の特別なアミノ酸位置における反対電荷を持つ荷電アミノ酸の導入によって改変されている。この態様による多重特異性抗体を、本明細書では、「CH3（+/-/SS）改変多重特異性抗体」ともいう（ここで、略号「+/-」は反対電荷のアミノ酸を意味し、「SS」はジスルフィド安定化を意味する）。したがって、この態様によれば、CH3（（+/-/SS）改変多重特異性抗体内では、CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること、およびCH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステインの追加導入により、ヘテロ二量体化を促進するようにCH3ドメインが改変されている。
言い換えると、この態様は、第1の重鎖および第2の重鎖を含む本発明のCH3（+/-/SS）改変多重特異性抗体であって、抗体の三次構造において、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインとが、それぞれの抗体CH3ドメイン間に位置する境界面を形成し、第1の重鎖のCH3ドメインと第2の重鎖のCH3ドメインのそれぞれのアミノ酸配列は、それぞれが、抗体の三次構造において該境界面内に位置する一組のアミノ酸を含み、
・一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸は正荷電アミノ酸で置換され、かつ
・他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、第2のアミノ酸は負荷電アミノ酸で置換され、さらに、
・一方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、第1のアミノ酸はシステインで置換され、他方の重鎖のCH3ドメイン中の境界面に位置する前記一組のアミノ酸のうち、第2のアミノ酸はシステインで置換され、第2のアミノ酸は前記境界面内で第1のアミノ酸に面していて、一方の重鎖のCH3ドメインと他方の重鎖のCH3ドメインとの間のジスルフィド架橋が、導入されたシステイン残基によって形成されうるようになっている、
本発明のCH3（+/-/SS）改変多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様では、多重特異性抗体の第3の結合部位がジスルフィド安定化されている。したがってVH3ドメインとVL3ドメインは、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合が形成されるように、少なくとも、VH3ドメインにおける1つのシステイン残基およびVL3ドメインにおける1つのシステイン残基の導入によって改変されている。本発明の一態様において、多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VH3の44番目およびVL3の100番目、
・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
・VH3の101番目およびVL3の100番目
によってジスルフィド安定化されている。
好ましい一態様において、第3の結合部位は、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によって、ジスルフィド安定化されている。
本発明の好ましい一態様では、多重特異性抗体の第3の結合部位がジスルフィド安定化され、CH3ドメインがジスルフィド安定化されている。この理論に拘泥するわけではないが、本発明の多重特異性抗体の改変Fcドメインの異なるドメインにおけるこの修飾によって形成される少なくとも2つのジスルフィド結合は、野生型IgGヒンジジスルフィド相互作用にとってかわり、それにより、第3の結合部位への抗原アクセスを可能にしつつ、ヘテロ二量体化をサポートする。一態様において、本発明のCH3（S-S）改変多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VH3の44番目およびVL3の100番目、
・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
・VH3の101番目およびVL3の100番目
によってジスルフィド安定化されている。
本発明の好ましい一態様では、本発明のCH3（S-S）改変多重特異性抗体の第3の結合部位が、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されている。
本発明のもう一つの好ましい態様では、本発明のCH3（S-S）改変多重特異性抗体の第3の結合部位が、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化され、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
本発明のもう一つの好ましい態様では、ヘテロ二量体化が、CH3ドメイン内のノブ・イントゥ・ホール修飾によってサポートされると共に、多重特異性抗体の第3の結合部位およびCH3ドメインが、それぞれジスルフィド安定化されている。この態様による多重特異性抗体では、ノブ・イントゥ・ホール修飾重鎖のヘテロ二量体化が、人工的鎖間ジスルフィド結合（これは、公知のノブ・イントゥ・ホールアプローチとは対照的に、CH3ドメイン内には位置せず、異なるドメイン中（すなわちVH3ドメインとVL3ドメインの間）に位置する）によって、さらにサポートされる。この態様による抗体では、（VH3-CH3ポリペプチドおよびVL3-CH3ポリペプチドを含む）第3の結合モジュールのヘテロ二量体化が、4つの相異なる相互作用、すなわち（i）VH3とVL3の間の自然相互作用、（ii）VH3/VL3境界面におけるジスルフィド安定化、（iii）CH3/CH3境界面におけるジスルフィド安定化、および（iv）CH3/CH3境界面におけるノブ・イントゥ・ホール修飾によって促進される。これにより、ホモ二量体形成ではなくヘテロ二量体の形成が促進され、抗体の安定性が改良される。
一態様において、本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインとVL3ドメインの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VH3の44番目およびVL3の100番目、
・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
・VH3の101番目およびVL3の100番目
によってジスルフィド安定化されている。
本発明の好ましい一態様において、本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されている。
本発明のもう一つの好ましい態様において、本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されており、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、Y、およびWから選択され、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、T、およびVから選択され、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
本発明のもう一つの好ましい態様において、本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されており、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインはT366W突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインは、T366S、L368AおよびY407V突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
本発明のもう一つの好ましい態様において、本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されており、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインは、T366WおよびG407Y突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインは、T366S、L368AおよびY407V突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
本発明のもう一つの好ましい態様において、本発明のCH3（KSS）改変多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されており、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインは、T366W、R409DおよびK370E突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインは、T366S、L368A、Y407V、D399KおよびE357K突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
本発明のもう一つの好ましい態様では、ヘテロ二量体化が、CH3/CH3ドメイン境界面中の特別なアミノ酸位置における反対電荷を持つ荷電アミノ酸の導入によってサポートされると共に、多重特異性抗体の第3の結合部位およびCH3ドメインがそれぞれジスルフィド安定化されている。この態様による多重特異性抗体では、修飾重鎖のヘテロ二量体化が、CH3ドメイン内に位置するのではなく異なるドメイン（すなわちVH3ドメインとVL3ドメインの間）に位置する人工的鎖間ジスルフィド結合によって、さらにサポートされる。一態様において、本発明のCH3（+/-/SS）改変多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VH3の44番目およびVL3の100番目、
・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
・VH3の101番目およびVL3の100番目.
によってジスルフィド安定化されている。
本発明の好ましい一態様において、本発明のCH3（+/-/SS）改変多重特異性抗体の第3の結合部位は、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されている。
ペプチドコネクタ
本発明の多重特異性抗体において、第3の結合部位のVH3ドメインおよびVL3ドメインのN末端は、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタを介して、それぞれの抗原結合部位に融合されている。本発明の一態様では、第1のペプチドコネクタと第2のペプチドコネクタの間に鎖間ジスルフィド結合は形成されない。本発明の一態様において、第1のペプチドコネクタと第2のペプチドコネクタとは互いに同一である。
本発明の一態様において、多重特異性抗体はヒンジ領域を欠く。本発明のもう一つの代替態様では、多重特異性抗体が、鎖間ジスルフィドを形成しない天然ヒンジ領域を含む。一例はIgG4アイソタイプの抗体に由来するヒンジ領域ペプチドである。
本発明の好ましい一態様において、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタは、少なくとも15アミノ酸のペプチドである。本発明のもう一つの態様において、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタは、15〜70アミノ酸のペプチドである。本発明の別の一態様において、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタは、20〜50アミノ酸のペプチドである。本発明の別の一態様において、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタは、10〜50アミノ酸のペプチドである。例えば第3の結合部位が結合する抗原のタイプに依存して、本発明の抗体では、より短い（またはさらに長い）ペプチドコネクタも応用可能でありうる。
本発明のさらにもう一つの態様において、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタは、おおよそ天然ヒンジ領域の長さ（これは、IgG1アイソタイプの天然抗体分子では約15アミノ酸、IgG3アイソタイプでは約62アミノ酸である）を持つ。それゆえに、多重特異性抗体がIgG1アイソタイプである一態様において、ペプチドコネクタは10〜20アミノ酸のペプチドであり、好ましい一態様では12〜17アミノ酸のペプチドである。多重特異性抗体がIgG3アイソタイプである別の一態様では、ペプチドコネクタが55〜70アミノ酸のペプチドであり、好ましい一態様では、60〜65アミノ酸のペプチドである。
本発明の一態様において、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタはグリシン-セリンリンカーである。本発明の一態様において、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタは、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドである。本発明の一態様において、グリシン-セリンリンカーは、以下の構造を持つ:
（GxS）nまたは（GxS）nGm
ここで、G＝グリシン、S＝セリン、x＝3または4、n＝2、3、4、5または6、およびm＝0、1、2、または3である。
上述のグリシン-セリンリンカーの一態様では、x＝3、n＝3、4、5または6、およびm＝0、1、2、または3であるか、x＝4、n＝2、3、4または5、およびm＝0、1、2、または3である。好ましい一態様では、x＝4、およびn＝2または3、およびm＝0である。さらにもう一つの好ましい態様では、x＝4およびn＝2である。一態様では、ペプチドコネクタが（G4S）2である。
本発明の好ましい一態様において、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタは（G4S）2ペプチドであり、多重特異性抗体は上述したCH3（KSS）改変多重特異性抗体であって、第3の結合部位は、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されており、多重特異性抗体において、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインは、T366WおよびG407Y突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインは、T366S、L368AおよびY407V突然変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、CH3ドメインは、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異（一態様ではS354C突然変異）および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている。
本発明のもう一つの好ましい態様において、第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタは（G4S）2ペプチドであり、多重特異性抗体は上述したCH3（KSS）改変多重特異性抗体であって、第3の結合部位は、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されており、多重特異性抗体において、一方の重鎖（「ノブ」を含む重鎖）のCH3ドメインは、T366W、G407YおよびS354C突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインは、T366S、L368A、Y407VおよびY349C突然変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。
VH3ドメインおよびVL3ドメインの、それぞれのCH3ドメインとの融合部位
本発明の多重特異性抗体では、第3の結合部位のVH3ドメインおよびVL3ドメインのそれぞれのC末端が、CH3ドメインに融合されている。野生型IgG-Fc領域に似たタンパク質フォールディングの獲得は、可変ドメインVH3およびVL3が、ペプチドコネクタを利用することなくそれぞれのCH3ドメインに直接的に接続されている場合に、最もよく達成することができる。加えて、第3の結合部位およびCH3/CH3境界面の両方がジスルフィド安定化されている場合にも、可変ドメインとそれぞれのCH3ドメインとの直接的接続は、所望の鎖間ジスルフィド結合を形成させるときに、近接して位置するシステイン残基のミスペアリングを都合よく防止する。
したがって、本発明の一態様において、VH3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの一方に直接的に接続され、VL3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの他方に直接的に接続されている。本発明の好ましい一態様において、VH3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの一方に直接的に接続され、VL3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの他方に直接的に接続されており、接続部分は追加のリンカーペプチドを欠く。
野生型抗体分子の可変ドメインと定常ドメインとの間の天然の移行部位を構造上綿密に模倣する融合部位を提供するために、可変ドメイン（それぞれVH3およびVL3）のC末端および/またはCH3ドメイン（それぞれの可変部位に直接的に接続されるもの）のN末端は、相異なるアミノ酸残基を置換することによる突然変異を含みうる。
したがって、本発明の一態様において、CH3ドメインのN末端は、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を置換することによって修飾されている。本発明の一態様において、VH3ドメインのC末端は、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を置換することによって修飾されている。本発明の一態様において、VL3ドメインのC末端は、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を置換することによって修飾されている。
好ましい一態様において、CH3ドメインのそれぞれのN末端は少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含み、VH3ドメインのC末端は少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含み、VL3ドメインのC末端は少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む。
その一態様において、野生型抗体分子の可変ドメインと定常ドメインとの間の天然の移行部位が模倣されるように融合部位の三次構造を改良するためのアミノ酸突然変異は、CH3ドメインの341番目〜350番目に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基を置換することによって行われる（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。一態様では、CH3ドメインの341〜345番目に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基が置換される（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。本発明の一態様において、CH3ドメインのN末端はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列からなる。本発明の一態様において、CH3ドメインのN末端はSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列からなる。
別の一態様において、野生型抗体分子の可変ドメインと定常ドメインとの間の天然の移行部位が模倣されるように融合部位の三次構造を改良するためのアミノ酸突然変異は、VH3ドメイン、VL3ドメイン、またはVH3ドメインとVL3ドメインの両方の、C末端の10アミノ酸残基のうちの少なくとも1つのアミノ酸残基を置換することによって行われる。
好ましい一態様において、CH3ドメインのそれぞれのN末端は、CH3ドメインの341〜350番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）に位置する少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含み、VH3ドメインのC末端の10アミノ酸残基は少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含み、VL3ドメインのC末端の10アミノ酸残基は、少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む。
もう一つの好ましい態様において、CH3ドメインのそれぞれのN末端は、CH3ドメインの341〜345番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）に位置する少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含み、VH3ドメインのC末端の5アミノ酸残基は少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含み、VL3ドメインのC末端の5アミノ酸残基は少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む。
抗原結合部分
本発明の一態様において、抗原結合部分は、抗原に特異的に結合するタンパク質である。一態様において、抗原結合部分は、抗原に特異的に結合する能力を有する抗体、受容体、リガンド、およびDARPinの群から選択される。一態様において、抗原結合部分は抗体フラグメントである。好ましい一態様において、抗原結合部分は、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2、および一本鎖抗体分子（例えばscFv、scFab）からなる群より選択される。もう一つの好ましい態様において、抗原結合部分はFvまたはFabフラグメントである。
本発明のもう一つの好ましい態様において、抗原結合部分はFabフラグメントである。さらにもう一つの特に好ましい本発明の態様において、第1の抗原結合部分は第1のFabフラグメントであり、第2の抗原結合部分は第2のFabフラグメントである。
本発明の多重特異性抗体の第1の結合部分および第2の結合部分がFabフラグメントである場合、本発明の多重特異性抗体はIgG様の外形を有し、野生型IgG分子に匹敵する分子量を呈する。野生型IgG分子と同様に、本発明のそのような多重特異性抗体は、Fabフラグメントに基づく2つの結合アームを含む。結合アームは野生型Fab構造であってもよいし、当技術分野において公知のさらなる修飾を含んでもよい（例えばFabフラグメントは一本鎖Fab、ジスルフィド安定化Fab、ジスルフィド安定化一本鎖Fab、またはドメイン交差Fabであってもよい）。第3の結合部位の抗原結合を保証するために、本来であれば安定化ジスルフィド結合を含む野生型抗体のヒンジ領域を、鎖間ジスルフィド結合を欠くペプチドコネクタで置き換える。天然のヒンジジスルフィド相互作用の除去に由来する安定化の欠如ゆえに、多重特異性抗体の改変Fc様領域は、ノブ・イントゥ・ホール修飾または反対電荷を持つアミノ酸の導入によるCH3/CH3ヘテロ二量体化のサポートによって、および/または追加の鎖間ジスルフィドによって、安定化される。加えて、これにより、所望の抗体分子の正しいアセンブリ（例えば重鎖ホモ二量体の形成のような鎖ミスペアリングの回避）がサポートされる。
したがって、特に好ましい一態様において、本発明は、少なくとも3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、2つの抗原結合部位は第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントによって形成され、
a）第3の抗原結合部位は可変重鎖ドメイン（VH3）および可変軽鎖ドメイン（VL3）によって形成されていて、
・VH3ドメインのN末端は第1のペプチドコネクタを介して第1のFabフラグメントに接続され、
・VL3ドメインのN末端は第2のペプチドコネクタを介して第2のFabフラグメントに接続されており、
b）該多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、これらCH3ドメインは、
i）CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成（これは、ノブ・イントゥ・ホール技術によってヘテロ二量体化をサポートすることに対応する）、もしくは
CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること（これは、対応するCH3ドメイン内に反対電荷のアミノ酸を導入することによってヘテロ二量体化をサポートすることに対応する）、
ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入、または
iii）i）とii）の両修飾
によってヘテロ二量体化を促進するように改変されており、
c）第3の抗原結合部位のVH3ドメインのC末端は、CH3ドメインのうちの一方に接続され、第3の抗原結合部位のVL3ドメインのC末端は、CH3ドメインのうちの他方に接続され、
d）該多重特異性抗体は定常重鎖ドメイン2（CH2）を欠く
多重特異性抗体に関する。
一局面において、本発明は、少なくとも3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、2つの抗原結合部位は第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントによって形成され、
a）第3の抗原結合部位は可変重鎖ドメイン（VH3）および可変軽鎖ドメイン（VL3）によって形成されていて、
・VH3ドメインのN末端は、第1のFabフラグメントの定常重鎖ドメイン（CH1）または定常軽鎖ドメイン（CL）のC末端に第1のペプチドコネクタを介して接続され、
・VL3ドメインのN末端は、第2のFabフラグメントの定常重鎖ドメイン（CH1）または定常軽鎖ドメイン（CL）のC末端に、第2のペプチドコネクタを介して接続されており、
b）該多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、これらCH3ドメインは、
i）CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成によって（これは、ノブ・イントゥ・ホール技術によってヘテロ二量体化をサポートすることに対応する）、もしくは
CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること（これは、対応するCH3ドメイン内に反対電荷のアミノ酸を導入することによってヘテロ二量体化をサポートすることに対応する）、
ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入、または
iii）i）およびii）の両修飾
によってヘテロ二量体化を促進するように改変されており、
c）第3の抗原結合部位のVH3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの一方に接続され、第3の抗原結合ドメインのVL3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの他方に接続されており、
d）該多重特異性抗体は定常重鎖ドメイン2（CH2）を欠く
多重特異性抗体に関する。
好ましい一態様において、本発明の多重特異性抗体の第1の結合部位および第2の結合部位は、それぞれ第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントによって形成される。一態様において、第1のFabフラグメントおよび/または第2のFabフラグメントの定常軽鎖ドメインは、カッパアイソタイプである。一態様において、第1のFabフラグメントおよび/または第2のFabフラグメントの定常軽鎖ドメインはラムダアイソタイプである。一態様において、第1のFabフラグメントの定常軽鎖ドメインはカッパアイソタイプであり、第2のFabフラグメントの定常軽鎖ドメインはラムダアイソタイプである。
本発明の一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、ジスルフィド安定化されている。一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、対応するVHドメインとVLドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）
・VHの44番目およびVLの100番目、
・VHの105番目およびVLの43番目、または
・VHの101番目およびVLの100番目
によってジスルフィド安定化されている。
本発明の好ましい一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、それぞれ、そのVHドメインの44番目およびそのVLドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によって、ジスルフィド安定化されている。
本発明の別の一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、ジスルフィド安定化されている。一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、対応するVHドメインとVLドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VHの44番目およびVLの100番目、
・VHの105番目およびVLの43番目、または
・VHの101番目およびVLの100番目
によってジスルフィド安定化されており、かつ各Fabフラグメントのポリペプチド鎖間の天然ジスルフィド結合が、鎖間ジスルフィド結合形成システイン残基の少なくとも1つを別のアミノ酸残基で置換することによって破壊されている。
本発明のさらにもう一つの態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、それぞれ、そのVHドメインの44番目およびそのVLドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によって、ジスルフィド安定化されており、各Fabフラグメントのポリペプチド鎖間の天然ジスルフィド結合が、鎖間ジスルフィド結合形成システイン残基の少なくとも1つを別のアミノ酸残基で置換することによって破壊されている。この態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、VHの44番目とVLの100番目の間の人工的ジスルフィド結合のみによって安定化されている。
本発明の一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、一本鎖Fabフラグメント（scFab）である。すなわち、Fabフラグメントのドメインが単一ポリペプチド上に配されている。この態様は、第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに結合する（したがって多重特異性抗体が少なくとも三重特異性である）場合には、特に有用である。これにより、組換え発現時の副生成物形成および軽鎖ミスペアリング（すなわち軽鎖が間違った重鎖とペアリングすることによる非機能的結合部位の形成）が低減し、発現収量が改良されうる。好ましい一態様では、Fabフラグメントの厳密に1つ（すなわち第1のFabフラグメントまたは第2のFabフラグメントのどちらか1つ）が一本鎖Fabフラグメントである（このとき、他方のFabフラグメントは一本鎖Fabフラグメントではなく、2つのポリペプチド鎖で構築されている）。
それゆえに、少なくとも1つの一本鎖Fabフラグメントを含む多重特異性抗体の好ましい一態様において、多重特異性抗体は少なくとも三重特異性である。少なくとも1つの一本鎖Fabフラグメントを含む多重特異性抗体のもう一つの好ましい態様において、多重特異性抗体は三重特異性である。少なくとも1つの一本鎖Fabフラグメントを含む多重特異性抗体のさらにもう一つの好ましい態様では、多重特異性抗体が三価三重特異性である。
本発明の一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、ジスルフィド安定化一本鎖Fabフラグメント（dsFab）である。一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、対応するVHドメインとVLドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VHの44番目およびVLの100番目、
・VHの105番目およびVLの43番目、または
・VHの101番目およびVLの100番目
によってジスルフィド安定化された一本鎖Fabフラグメントである。
本発明の好ましい一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、それぞれ、そのVHドメインの44番目およびそのVLドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化された一本鎖Fabフラグメントである。好ましい一態様では、Fabフラグメントの厳密に1つ（すなわち第1のFabフラグメントまたは第2のFabフラグメントのどちらか1つ）が、そのVHドメインの44番目およびそのVLドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化された一本鎖Fabフラグメントである。
もう一つの好ましい態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、対応するVHドメインとVLドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VHの44番目およびVLの100番目、
・VHの105番目およびVLの43番目、または
・VHの101番目およびVLの100番目
によってジスルフィド安定化された一本鎖Fabフラグメントであり、それぞれの一本鎖Fabフラグメントのポリペプチド鎖間の天然ジスルフィド結合は、鎖間ジスルフィド結合形成システイン残基の少なくとも1つを別のアミノ酸残基で置換することによって破壊されている。本発明のさらにもう一つの好ましい態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、それぞれ、そのVHドメインの44番目およびそのVLドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化された一本鎖Fabフラグメントであり、それぞれの一本鎖Fabフラグメントのポリペプチド鎖間の天然ジスルフィド結合は、鎖間ジスルフィド結合形成システイン残基の少なくとも1つを別のアミノ酸残基で置換することによって破壊されている。
本発明の一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、
a）CH1ドメインとCLドメインだけが互いに入れ替えられるように、
b）VHドメインとVLドメインだけが互いに入れ替えられるように、または
c）CH1ドメインとCLドメインとが互いに入れ替えられ、かつVHドメインとVLドメインとが互いに入れ替えられるように、
ドメイン交差によって改変されている。ただし、第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方がドメイン交差によって改変されている場合、それらは異なるドメイン交差によって改変されている。これは、例えば、両方のFabフラグメントがドメイン交差を含む場合に、第1のFabフラグメントが、a）で述べたドメイン交差を含むのであれば、すなわち、CH1ドメインとCLドメインとが互いに入れ替えられているのであれば、第2のFabフラグメントは、b）で述べたドメイン交差（すなわち対応するVHドメインとVLドメインの入れ替え）またはc）で述べたドメイン交差（すなわちVH-CH1とVL-CLの入れ替え）を含むが、第2のFabフラグメントが、a）で述べたドメイン交差を含む（すなわち、CH1ドメインとCLドメインだけが互いに入れ替えられる）ことはないことを意味する。したがって、この態様による多重特異性抗体は、第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントに関して非対称なドメイン交差を含む。つまり、ドメイン交差により、第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの軽鎖はもはや同じドメインアーキテクチャでは構成されておらず、異なるドメインアーキテクチャで構成されている。これによって、第1のFabフラグメントの軽鎖と第2のFabフラグメントの重鎖とのペアリング（その逆も同様）が回避される。この態様は、第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに結合する（したがって多重特異性抗体が少なくとも三重特異性である）場合には、特に有用である。この態様により、組換え発現時の副生成物形成および軽鎖ミスペアリング（すなわち軽鎖が間違った重鎖とペアリングすることによる非機能的結合部位の形成）が低減し、抗体の発現収量が改良されうる。
それゆえに、Fabフラグメントの少なくとも1つにドメイン交差を含む多重特異性抗体の好ましい一態様において、多重特異性抗体は少なくとも三重特異性である。Fabフラグメントの少なくとも1つにドメイン交差を含む多重特異性抗体のもう一つの好ましい態様において、多重特異性抗体は三重特異性である。Fabフラグメントの少なくとも1つにドメイン交差を含む多重特異性抗体のさらにもう一つの好ましい態様において、多重特異性抗体は三価三重特異性である。
本発明の一態様では、Fabフラグメントのうちの1つだけ（すなわち、第1のFabフラグメントまたは第2のFabフラグメントではあるが、両方のFabフラグメントではない）が、FabフラグメントのCH1ドメインとCLドメインだけが互いに入れ替えられるように、ドメイン交差によって改変されている。
本発明の一態様では、Fabフラグメントのうちの1つだけ（すなわち、第1のFabフラグメントまたは第2のFabフラグメントではあるが、両方のFabフラグメントではない）が、FabフラグメントのVHドメインとVLドメインだけが互いに入れ替えられるように、ドメイン交差によって改変されている。
Fabフラグメントが本発明の多重特異性抗体の結合アームとして使用される場合、抗体はIgG様の構造を呈するが、それは、元のCH2/CH2境界面を置き換える追加の結合部位を含む。
結合価がさらに高い抗体を得るためにさらなる結合部位を多重特異性抗体の重鎖または軽鎖のN末端またはC末端に融合してもよい。好ましい一態様では、多重特異性抗体が三価であり、そのため、IgG分子の野生型三次元構造に似ている。
異なるエピトープへの結合
本発明の一態様において、多重特異性抗体は、少なくとも1つのポリエピトープ結合部位（polyepitopic binding site）を含む（すなわち、1つの生物学的分子上の2つの異なるエピトープまたは異なる生物学的分子からの2つの異なるエピトープ、例えばWO 2008/027236 A2に開示されているものに結合する能力を有する）。これにより、4つ以上の特異性を持つ多重特異性抗体（例えば四重特異性抗体）を、野生型IgG分子と類似する構造および分子量で作製することができる。本発明の一態様では、第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、または第1の抗原結合部分と第2の抗原結合部分の両方が、ポリエピトープ結合部位を含む。本発明の別の一態様において、第3の結合部位はポリエピトープ結合部位を含む。さらにもう一つの態様では、多重特異性抗体の第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分ならびに第3の結合部位がポリエピトープ結合部位を含む。
本発明の多重特異性抗体は異なるエピトープに結合する能力を有する。これは、単一の抗原に特異的に結合する結合部位を組み合わせることによって、またはそれに加えて、ポリエピトープ性であり、したがって2種以上のエピトープに特異的に結合する結合部位（好ましい一態様において該ポリエピトープ結合部位は2つの異なるエピトープに結合する）を含めることによって、達成しうる。これにより、多数の異なるエピトープに結合する能力を有する三価多重特異性抗体を生産することができる。第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がそれぞれFabフラグメントであるなら、多重特異性抗体はIgG様の外形および分子量を都合よく維持する。多重特異性抗体は、同じターゲット抗原上の異なるエピトープ（例えば同じ生体分子上の異なるエピトープ）または同じ細胞上の異なる生体分子への結合に、特に適している。
好ましい一態様において、本発明の多重特異性抗体は、それぞれが単一のエピトープに結合する3つの結合部位を含む。これにより、この態様による多重特異性抗体は二重特異性または三重特異性になりうる。
もう一つの好ましい態様において、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも1つのポリエピトープ結合部位（好ましい一態様において該ポリエピトープ結合部位は2つの異なるエピトープに結合する）を含む。一態様において、多重特異性抗体は三重特異性抗体であって、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分は2つの同一ポリエピトープ結合部位を含み（それぞれが2つの異なるエピトープに特異的に結合する）、第3の結合部位はもう一つ（第3）のエピトープに特異的に結合する。別の一態様において、多重特異性抗体は三重特異性抗体であって、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分は第1のエピトープに特異的に結合し、第3の結合部位は第2のエピトープおよび第3のエピトープに特異的に結合するポリエピトープ結合部位である。これにより、この態様による多重特異性抗体は少なくとも三重特異性である。多重特異性抗体の一態様において、それぞれ2つの異なるエピトープに結合する3つの異なるポリエピトープ結合部位を組み合わせれば、抗体は最大六重特異性になりうる。
本発明の一態様において抗体は二重特異性である。本発明の一態様において、抗体は三価二重特異性である。本発明の一態様では、抗体が二重特異性であって、1つの細胞上の2つの異なる抗原または同じ抗原の2つの異なるエピトープに特異的に結合する。本発明の一態様では、抗体が三価二重特異性であって、1つの細胞上の2つの異なる抗原または同じ抗原の2つの異なるエピトープに特異的に結合する。
本発明の好ましい一態様では、抗体が二重特異性であって、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分は同じエピトープに特異的に結合し、第3の結合部位は異なるエピトープに特異的に結合する。本発明の好ましい一態様では、抗体が三価二重特異性であって、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分は同じエピトープに特異的に結合し、第3の結合部位は異なるエピトープに特異的に結合する。
Fabフラグメントの形態にある第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含むこれらの態様による二重特異性抗体において、一態様では、第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントがドメイン交差を含まない。したがって、好ましい一態様において、第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントの軽鎖は（N末端からC末端に向かう方向に）VLドメインとCLドメインとで構成される。
本発明の別の一態様では、抗体が二重特異性であって、第1の抗原結合部分および第3の結合部位は同じエピトープに特異的に結合し、第2の抗原結合部分は異なるエピトープに特異的に結合する。本発明の別の一態様では、抗体が三価二重特異性であって、第1の抗原結合部分および第3の結合部位は同じエピトープに特異的に結合し、第2の抗原結合部分は異なるエピトープに特異的に結合する。
Fabフラグメントの形態にある第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分を含むこれらの態様による二重特異性抗体において、Fabフラグメントのうちの少なくとも1つはドメイン交差を含むか、一本鎖Fabフラグメントの形態で提供される。好ましい一態様において、Fabフラグメントのうちの少なくとも1つは、上述したドメイン交差を含む（任意で、Fabフラグメントのうちの少なくとも1つへの荷電アミノ酸の導入などといった、さらなるドメイン交差態様を含む）。これによって、鎖ミスペアリングが回避され、多重特異性抗体の発現収量が改良される。
本発明の一態様において、抗体は三重特異性である。本発明の一態様において、抗体は三価三重特異性である。
本発明の三重特異性抗体の好ましい一態様において、各結合部位は単一のエピトープに結合し、第1の抗原結合部分、第2の抗原結合部分、および第3の結合部位は、それぞれ異なるエピトープに特異的に結合する。
本発明の三重特異性抗体の別の一態様において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分は同じエピトープに結合し、第3の結合部位は2つの異なるポリエピトープに結合する（したがってポリエピトープ性である）。
本発明の三重特異性抗体のさらにもう一つの態様において、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分は同じポリエピトープ結合部位（それぞれが2つの異なるエピトープに結合するもの）に基づき、第3の結合部位は、第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分が結合するエピトープとは異なる単一のエピトープに結合する。
本発明の抗体が第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分として第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントを含み、第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとは異なる結合部位に基づいていて、それゆえに、異なるエピトープに特異的に結合するすべての態様において、Fabフラグメントは、好ましくは、それぞれ第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントの軽鎖と重鎖の間での軽鎖ミスペアリングを回避するために、一本鎖Fabフラグメント（これはさらにジスルフィド安定化されていてもよい）を使用することによって、または第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントの軽鎖において異なるドメインアーキテクチャを実現することで軽鎖ミスペアリングを抑制するドメイン交差戦略を使用することによって、特別に設計される。
第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに特異的に結合する本発明の多重特異性抗体の一態様において、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方は、
a）CH1ドメインとCLドメインだけが互いに入れ替えられるように、
b）VHドメインとVLドメインだけが互いに入れ替えられるように、または
c）CH1ドメインとCLドメインとが互いに入れ替えられ、かつVHドメインとVLドメインとが互いに入れ替えられるように、
ドメイン交差によって改変されている。ただし、第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方がドメイン交差によって改変されている場合、それらは異なるドメイン交差によって改変されているものとする。
第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに特異的に結合する本発明の多重特異性抗体の一態様では、Fabフラグメントのうちの1つだけ（すなわち、第1のFabフラグメントまたは第2のFabフラグメントではあるが、両方のFabフラグメントではない）が、FabフラグメントのCH1ドメインとCLドメインだけが互いに入れ替えられるように、ドメイン交差によって改変されている。
第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに特異的に結合する本発明の多重特異性抗体の一態様では、Fabフラグメントのうちの1つだけ（すなわち、第1のFabフラグメントまたは第2のFabフラグメントではあるが、両方のFabフラグメントではない）が、FabフラグメントのVHドメインとVLドメインだけが互いに入れ替えられるように、ドメイン交差によって改変されている。
第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに結合する本発明の多重特異性抗体の一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が一本鎖Fabフラグメント（scFab）である。
第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに結合する本発明の多重特異性抗体の一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、ジスルフィド安定化一本鎖Fabフラグメント（dsFab）である。第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに結合する本発明の多重特異性抗体の一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、対応するVHドメインとVLドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）
・VHの44番目およびVLの100番目、
・VHの105番目およびVLの43番目、または
・VHの101番目およびVLの100番目
によってジスルフィド安定化された、一本鎖Fabフラグメントである。
第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに結合する本発明の多重特異性抗体の一態様では、第1のFabフラグメント、第2のFabフラグメント、または第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方が、それぞれ、そのVHドメインの44番目およびそのVLドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化された、一本鎖Fabフラグメントである。好ましい一態様では、Fabフラグメントのうちの厳密に1つ（すなわち第1のFabフラグメントまたは第2のFabフラグメントのどちらか1つ）が、そのVHドメインの44番目およびそのVLドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化された、一本鎖Fabフラグメントである。
第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとが異なるエピトープに結合する本発明の多重特異性抗体の一態様では、第1のFabフラグメントが一本鎖Fabフラグメント（一態様ではジスルフィド安定化一本鎖Fabフラグメント）であり、第2のFabフラグメントが上述したドメイン交差を含む。
抗体アイソタイプ
本発明の一態様において、多重特異性抗体は、1つまたは複数の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリンクラスには、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEアイソタイプが含まれ、さらにIgGおよびIgAの場合には、それらのサブタイプが含まれる。本発明の一態様において、多重特異性抗体は、IgGタイプ抗体の定常ドメイン構造を有する。
一態様において、本発明の抗体の定常ドメインは、ヒトIgG1またはIgG4サブクラスである。一態様において、CH3ドメインはヒトIgG1抗体に由来する。一態様において、多重特異性抗体はCH4ドメインを欠く。
本発明の一態様において、抗体はモノクローナル抗体である。本発明の一態様において、抗体はヒト化モノクローナル抗体である。本発明の一態様において、抗体はヒトモノクローナル抗体である。
本発明の一態様において、多重特異性抗体は単離された抗体である。
一態様において、本明細書において明示するCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含む。一態様において、本明細書において明示するCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のC末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含む。
標的ペイロード送達のための、抗体とハプテンにカップリングされた作用物質とを含む複合体
本発明のもう一つの目的は、（i）少なくともハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する（よって、前記ハプテンに特異的に結合する少なくとも1つの結合部位および前記ターゲットタンパク質に特異的に結合する少なくとも1つの結合部位を含む）本発明の多重特異性抗体と、（ii）前記多重特異性抗体が結合するハプテンであって、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているものとを含む複合体である。複合体内で、ハプテンは、当該ハプテンに特異的に結合する抗体の結合部位に結合している。これにより、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンは、抗体に非共有結合的にカップリングされる。複合体内で、抗体はその結合特異性およびアフィニティーを維持しており、一方、ハプテンにカップリングされた治療用または診断用の作用物質も同様にその活性を維持している。ハプテン結合性二重特異性抗体とハプテン化された治療用または診断用作用物質との複合体は、例えばWO 2011/1003557 A1から、一般に当技術分野において公知である。本発明の複合体は、WO 2011/1003557 A1に記述されているように設計し、応用することができ、この文献の内容は、参照によりすべて本明細書に組み入れられる。
一態様において、本発明の複合体中に存在する抗体は二重特異性である。一態様において、ハプテンは、ジゴキシゲニン、ビオチン、テオフィリン、フルオレセイン、DOTA、およびDOTAMから選択される。一態様において、ターゲットタンパク質は細胞表面抗原または細胞内抗原である。一態様において、ターゲットタンパク質は細胞表面または細胞内の腫瘍関連抗原である。一態様において、ターゲットタンパク質は細胞表面腫瘍関連抗原である。一態様において、ターゲットタンパク質はルイスYである。一態様において、ターゲットタンパク質はCD33である。一態様において、ターゲットタンパク質はグリピカン3である。
本発明の一態様において、多重特異性抗体は、治療用または診断用作用物質のためのペイロード送達運搬体として使用される。治療用または診断用の作用物質はハプテンとコンジュゲートされるので、本発明の多重特異性抗体のハプテン結合部位によってカップリングされて、本発明の複合体を形成する。この複合体は明確かつ安定であり、ペイロードをターゲット細胞またはターゲット組織に特異的に送達する。ハプテン化された治療用または診断用の作用物質は多重特異性抗体に非共有結合的にカップリングされているので、ペイロードは、循環中はその送達運搬体に安定に結合されているが、インターナリゼーション後は効率よく放出される。ハプテンとのコンジュゲーションは、大半の治療用または診断用作用物質の活性に影響を及ぼさない。このように多重特異性抗体は、共有結合でカップリングされた異常なペイロードを含有せず、それゆえに、低い免疫原性リスクを呈する。したがって、この簡単なコンジュゲーション手法は、極めて多様なペイロード分子に、たった一つの単一多重特異性抗体と組み合わせて使用することができ、ここで、ペイロード分子は、例えばペプチド、タンパク質、小分子、イメージング試薬および核酸である。ハプテン化された診断用または治療用の作用物質と少なくとも1つのハプテン結合部位を含有する本発明の多重特異性抗体との複合体は、温和な生物物理学的挙動および改良されたPKパラメータを、診断用または治療用の作用物質に、例えば診断用または治療用のタンパク質、ペプチドまたは小分子に付与しうる。さらにまた、そのような複合体は、多重特異性抗体の少なくとも1つのさらなる結合部位が認識するターゲットタンパク質抗原をディスプレイする細胞に、送達ペイロードを誘導する能力を有する。
一態様において、ハプテンにカップリングされる治療用または診断用の作用物質は、ペプチド、タンパク質、小分子、放射性標識小分子、核酸、およびイメージング作用物質からなる群より選択される。
一態様において、治療用または診断用の作用物質はペプチドである。ハプテン化されたペプチドを本発明の多重特異性抗体に結合した後も、当該ペプチドはその完全な生物学的活性を保つ。ペプチドの非限定的な例は、メリチン、Fam5B、INF7、FallV1、およびFallV2である。本発明の一局面は、ターゲット抗原発現腫瘍細胞に毒素由来ペプチドを送達するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。
一態様において、治療用または診断用の作用物質はタンパク質である。ハプテン化されたタンパク質を本発明の多重特異性抗体に結合した後も、当該タンパク質はその完全な生物学的活性を保つ。
一態様において、治療用または診断用の作用物質は小分子である。一態様において、小分子は毒素であるか、毒素由来の小分子である。一態様において、小分子はシュードモナス外毒素である。
一態様において、治療用または診断用の作用物質は放射性標識小分子である。ハプテン化された放射性同位体またはハプテン化された小分子に取り付けられた放射性同位体は効果的な組織浸透、迅速なクリアランスを呈し、ターゲットタンパク質抗原を発現する本発明の複合体で覆われた細胞だけに保持される。これにより、特異的ターゲティングが可能になり、治療用放射性同位体の全身性の非特異的放出が回避される。本発明の一局面は、 ハプテン化された放射性同位体またはハプテン化された小分子に取り付けられた放射性同位体を患部組織に送達するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。一態様において、患部組織は腫瘍であり、ターゲットタンパク質は腫瘍関連抗原である。
一態様において、治療用または診断用の作用物質は核酸である。一態様において、核酸は二本鎖RNA（dsRNA）である。二本鎖リボ核酸（dsRNA）分子は、RNA干渉（RNAi）と呼ばれる高度に保存された調節機序で、遺伝子発現を阻止することが示されている。したがって、本発明の一局面は、標的dsRNA送達の標的遺伝子治療のための、本発明の多重特異性抗体の使用である。
一態様において、治療用または診断用の作用物質はイメージング作用物質である。一態様において、イメージング作用物質はフルオロフォアである。イメージング作用物質は、ハプテン化され、本発明の抗体に複合体化されていても、その性質を保つ。ハプテン化されたイメージング作用物質は、効果的な組織浸透、迅速なクリアランスを呈し、ターゲットタンパク質抗原を発現する本発明の複合体によって覆われた細胞だけに保持される。これにより、効果的な時間分解イメージング、および腫瘍血管新生の評価または腫瘍血管新生の変化の評価が可能になる。本発明の一局面は、患部組織のイメージングのための、本発明の多重特異性抗体の使用である。本発明のもう一つの局面は、インビトロイメージングのための、例えばFACS分析のための、本発明の多重特異性抗体の使用である。一態様において、患部組織は腫瘍であり、ターゲットタンパク質は腫瘍関連抗原である。
もう一つの局面は、以下の工程を含む、本発明の複合体を調製するための方法である:
・ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する本発明の多重特異性抗体を用意する工程、
・前記多重特異性抗体が特異的に結合するハプテンであって、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンを用意する工程、および
・前記多重特異性抗体を、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされた前記ハプテンと接触させる工程。
本発明のもう一つの局面は、医薬としての、本発明の複合体の使用である。本発明のもう一つの局面は、診断を目的とする、本発明の複合体の使用である。
本発明のもう一つの局面は、治療用または診断用の作用物質をターゲット細胞またはターゲット組織に送達するための、本発明の複合体の使用である。本発明のもう一つの局面は、標的がん療法のための、本発明の複合体の使用である。本発明のもう一つの局面は、標的放射線療法のための、本発明の複合体の使用である。
本発明のもう一つの局面は、細胞または組織のイメージングのための、本発明の複合体の使用である。
本発明のもう一つの局面は、ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する本発明の多重特異性抗体と治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンとを含む本発明の複合体を含む組成物である。一態様において、組成物は診断用組成物である。別の一態様において、組成物は薬学的組成物である。
II.組換え法
多重特異性抗体は組換え法によって調製される。したがって本発明は、以下の工程を含む、本発明の多重特異性抗体を調製するための方法にも関係する:
・多重特異性抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程,
・多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程、および
・宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程。
本発明の一態様において、本方法は、アフィニティークロマトグラフィーによる多重特異性抗体の精製工程を含む。本発明の一態様において、本方法は、カッパ軽鎖特異的カラムまたはラムダ軽鎖特異的カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる多重特異性抗体の精製工程を含む。
本発明のもう一つの目的は、本発明の方法によって生産される多重特異性抗体である。
本発明のもう一つの目的は、本発明の多重特異性抗体をコードする核酸である。一態様において、本発明の核酸は単離された核酸である。
本発明のもう1つの目的は、本発明の核酸を含む、発現ベクターである。本発明のもう1つの目的は、本発明の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現させる能力を有する、発現ベクターである。
本発明のもう1つの目的は、本発明の核酸を含む宿主細胞である。本発明のもう1つの目的は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞である。一態様において、宿主細胞はHEK293細胞またはCHO細胞である。
III. 薬学的組成物
一態様において、本発明の抗体の集団を含む組成物（好ましい一態様では薬学的組成物）は、本明細書において特定するCH3ドメインを追加のC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）と共に含む重鎖を含む抗体を含む。一態様において、本発明の抗体の集団を含む組成物は、本明細書において特定するCH3ドメインを追加のC末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）と共に含む重鎖を含む抗体を含む。
一態様において、上述の組成物は、本明細書において特定するCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体、本明細書において特定するCH3ドメインを追加のC末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）と共に含む重鎖を含む抗体、および本明細書において特定するCH3ドメインを追加のC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）と共に含む重鎖を含む抗体で構成される抗体の集団を含む。
本発明のもう一つの目的は、ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する本発明の多重特異性抗体と治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンとを含む本発明の複合体を含む薬学的組成物である。本発明の一局面は、ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する本発明の多重特異性抗体と治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンとを含む本発明の複合体を、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、薬学的組成物である。
本発明のもう一つの目的は、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。
本発明のもう一つの目的は、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物である。本発明の一局面は、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、薬学的組成物である。
本発明のもう1つの目的は、薬学的組成物を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。本発明のもう1つの目的は、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を調合する工程を含む、本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物を製造するための方法である。
本発明のもう1つの目的は、医薬として使用するための本発明の多重特異性抗体である。本発明のもう1つの目的は、がんの処置において使用するための本発明の多重特異性抗体である。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害の処置において使用するための本発明の多重特異性抗体である。
本発明のもう1つの目的は、医薬として使用するための、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。本発明のもう1つの目的は、がんの処置において使用するための、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害の処置において使用するための、少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物である。
本発明のもう一つの目的は、医薬として使用するための、ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する本発明の多重特異性抗体と治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンとを含む本発明の複合体である。本発明のもう一つの目的は、がんの処置において使用するための、ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する本発明の多重特異性抗体と治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンとを含む本発明の複合体である。本発明のもう一つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管損傷の処置に使用するための、ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する本発明の多重特異性抗体と治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンとを含む本発明の複合体である。
本発明のもう1つの目的は、医薬として使用するための、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。本発明のもう1つの目的は、がんの処置において使用するための、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害の処置において使用するための、細胞毒性作用物質にカップリングされた本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。
本発明のもう1つの目的は、医薬を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。本発明のもう1つの目的は、がんを処置するための医薬を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管傷害を処置するための医薬を製造するための、本発明の多重特異性抗体の使用である。
本発明のもう1つの目的は、疾患を患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に本発明の多重特異性抗体を投与することによる方法である。本発明のもう1つの目的は、がんを患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に本発明の多重特異性抗体を投与することによる方法である。本発明のもう1つの目的は、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患（例えば筋ジストロフィー）、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患（例えば多発性骨髄腫における骨変性）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および血管傷害を含む疾患の少なくとも1つを患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に本発明の多重特異性抗体を投与することによる方法である。
3.本発明の具体的態様
以下に本発明の具体的態様を列挙する。
1.少なくとも3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、2つの抗原結合部位は第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分によって形成されており、
a）第3の抗原結合部位は、可変重鎖ドメイン（VH3）と可変軽鎖ドメイン（VL3）とによって形成されていて、
・VH3ドメインのN末端は、第1のペプチドコネクタを介して第1の抗原結合部分に接続され、
・VL3ドメインのN末端は、第2のペプチドコネクタを介して第2の抗原結合部分に接続されており、
b）前記多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、これらCH3ドメインは、
i）CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成、もしくは
CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること、
ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入、または
iii）i）およびii）の両修飾
によってヘテロ二量体化を促進するように改変されており、
c）第3の抗原結合部位のVH3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの一方に接続され、第3の抗原結合部位のVL3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの他方に接続されており、かつ
d）前記多重特異性抗体は定常重鎖ドメイン2（CH2）を欠いている、
多重特異性抗体。
2.定常重鎖ドメイン3（CH3）ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成によって、ヘテロ二量体化を促進するように改変された2つのCH3を含む、態様1の多重特異性抗体。
3.元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、R、F、Y、およびWから選択される、態様2の多重特異性抗体。
4.元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基が、A、S、T、およびVから選択される、態様2または3の多重特異性抗体。
5.一方の重鎖のCH3ドメインがT366W突然変異を含み、他方の重鎖（「ホール」を含む重鎖）のCH3ドメインがT366S、L368A、および407V突然変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、態様2〜4のいずれか一つの多重特異性抗体。
6.一方の重鎖のCH3ドメインがT366WおよびG407Y突然変異を含み、他方の重鎖のCH3ドメインがT366S、L368AおよびY407V突然変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、態様2〜5のいずれか一つの多重特異性抗体。
7.定常重鎖ドメイン3（CH3）ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによってヘテロ二量体化を促進するように改変された2つのCH3を含む、態様1の多重特異性抗体。
8.定常重鎖ドメイン3（CH3）ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによってヘテロ二量体化を促進するように改変された2つのCH3を含む、態様2〜6のいずれか一つの多重特異性抗体。
9.正荷電アミノ酸が、K、R、およびHから選択される、態様7または8の多重特異性抗体。
10.負荷電アミノ酸がEまたはDから選択される、態様7〜9のいずれか一つの多重特異性抗体。
11.一方の重鎖のCH3ドメインにおいて、409番目のアミノ酸R（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）がDで置換され、370番目のアミノ酸K（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）がEで置換されており;他方の重鎖のCH3ドメインにおいて、399番目のアミノ酸D（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）がKで置換され、357番目のアミノ酸E（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）がKで置換されている、態様7〜10のいずれか一つの多重特異性抗体。
12.定常重鎖ドメイン3（CH3）ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、ヘテロ二量体化を促進するように改変された2つのCH3を含む、態様2の多重特異性抗体。
13.定常重鎖ドメイン3（CH3）ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、ヘテロ二量体化を促進するように改変された2つのCH3を含む、態様3〜6のいずれか一つの多重特異性抗体。
14.定常重鎖ドメイン3（CH3）ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、ヘテロ二量体化を促進するように改変された2つのCH3を含む、態様7の多重特異性抗体。
15.定常重鎖ドメイン3（CH3）ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、ヘテロ二量体化を促進するように改変された2つのCH3を含む、態様8の多重特異性抗体。
16.定常重鎖ドメイン3（CH3）ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入によって、ヘテロ二量体化を促進するように改変された2つのCH3を含む、態様9または10の多重特異性抗体。
17. CH3ドメインが、CH3ドメインのうちの一方におけるE356CまたはS354C突然変異および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている、態様12〜16のいずれか一つの多重特異性抗体。
18. CH3ドメインが、CH3ドメインのうちの一方におけるS354C突然変異および他方のCH3ドメインにおけるY349C突然変異（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）によってジスルフィド安定化されている、態様12〜16のいずれか一つの多重特異性抗体。
19. 第3の結合部位が、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VH3の44番目およびVL3の100番目、
・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
・VH3の101番目およびVL3の100番目
によってジスルフィド安定化されている、態様1の多重特異性抗体。
20.第3の結合部位が、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VH3の44番目およびVL3の100番目、
・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
・VH3の101番目およびVL3の100番目
によってジスルフィド安定化されている、態様2の多重特異性抗体。
21.第3の結合部位が、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VH3の44番目およびVL3の100番目、
・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
・VH3の101番目およびVL3の100番目
によってジスルフィド安定化されている、態様7または8の多重特異性抗体。
22.第3の結合部位が、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VH3の44番目およびVL3の100番目、
・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
・VH3の101番目およびVL3の100番目
によってジスルフィド安定化されている、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
23.第3の結合部位が、VH3ドメインの44番目およびVL3ドメインの100番目におけるシステイン残基の導入によってジスルフィド安定化されている、態様19〜22のいずれか一つの多重特異性抗体。
24.第1のペプチドコネクタと第2のペプチドコネクタの間に鎖間ジスルフィド結合が形成されていない、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
25.第1のペプチドコネクタと第2のペプチドコネクタとが互いに同一である、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
26.第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタが少なくとも15アミノ酸のペプチドである、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
27.第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタが15〜70アミノ酸のペプチドである、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
28.第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタが10〜20アミノ酸のペプチドである、態様1〜25のいずれか一つの多重特異性抗体。
29.第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタが55〜70アミノ酸のペプチドである、態様1〜27のいずれか一つの多重特異性抗体。
30.ペプチドコネクタがグリシン-セリンリンカーである、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
31.グリシン-セリンリンカーが
（GxS）nまたは（GxS）nGm
の構造（G＝グリシン、S＝セリン、x＝3または4、n＝2、3、4、5または6、およびm＝0、1、2、または3である）を有する、態様30の多重特異性抗体。
32.可変ドメインVH3およびVL3が、ペプチドコネクタを利用することなく各CH3ドメインに直接的に接続されている、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
33.VH3ドメインのC末端がCH3ドメインのうちの一方に直接的に接続され、VL3ドメインのC末端がCH3ドメインのうちの他方に直接的に接続されており、接続部分が追加のリンカーペプチドを含まない、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
34.少なくとも1つの元のアミノ酸残基を置換することによってCH3ドメインのN末端が修飾されている、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
35.CH3ドメインの341〜350番目（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）に位置する少なくとも1つのアミノ酸残基が置換されている、態様34の多重特異性抗体。
36.CH3ドメインのN末端が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4のアミノ酸配列からなる、態様34または35の多重特異性抗体。
37.少なくとも1つの元のアミノ酸残基を置換することによってVH3ドメインのC末端が修飾されている、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
38.少なくとも1つの元のアミノ酸残基を置換することによってVL3ドメインのC末端が修飾されている、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
39.CH3ドメインのそれぞれのN末端が少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含み、VH3ドメインのC末端が少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含み、かつVL3ドメインのC末端が少なくとも1つのアミノ酸突然変異を含む、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
40.抗原結合部分が抗原に特異的に結合するタンパク質である、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
41.抗原結合部分が、抗原に特異的に結合する能力を有する抗体、受容体、リガンド、およびDARPinの群から選択される、態様40の多重特異性抗体。
42.抗原結合部分が抗体または抗体フラグメントである、態様40の多重特異性抗体。
43.第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分のうちの少なくとも一方がFabフラグメントである、態様42の多重特異性抗体。
44.第1の抗原結合部分および第2の抗原結合部分がFabフラグメントである、態様42の多重特異性抗体。
45.第1のFabフラグメントおよび/または第2のFabフラグメントの定常軽鎖ドメインがカッパアイソタイプである、態様44の多重特異性抗体。
46.第1のFabフラグメントおよび/または第2のFabフラグメントの定常軽鎖ドメインがラムダアイソタイプである、態様44の多重特異性抗体。
47.第1のFabフラグメントの定常軽鎖ドメインがカッパアイソタイプであり、第2のFabフラグメントの定常軽鎖ドメインがラムダアイソタイプである、態様44の多重特異性抗体。
48.少なくとも1つのFabフラグメントがジスルフィド安定化されている、態様43または44の多重特異性抗体。
49.Fabフラグメントがジスルフィド安定化されている、態様44の多重特異性抗体。
50.Fabフラグメントが、対応するVHドメインとVLドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
・VHの44番目およびVLの100番目、
・VHの105番目およびVLの43番目、または
・VHの101番目およびVLの100番目
によってジスルフィド安定化されている、態様43または44の多重特異性抗体。
51.各Fabフラグメントのポリペプチド鎖間の天然ジスルフィド結合が、鎖間ジスルフィド結合形成システイン残基の少なくとも1つを別のアミノ酸残基で置換することによって破壊されている、態様48〜50のいずれか一つの多重特異性抗体。
52.少なくとも1つのFabフラグメントが一本鎖Fabフラグメントである、態様43、44、または48の多重特異性抗体。
53.少なくとも1つのFabフラグメントが、
a）CH1ドメインとCLドメインだけが互いに入れ替えられるように、
b）VHドメインとVLドメインだけが互いに入れ替えられるように、または
c）CH1ドメインとCLドメインとが互いに入れ替えられ、VHドメインとVLドメインとが互いに入れ替えられるように
ドメイン交差によって改変されている（ただし、第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントの両方がドメイン交差によって改変されている場合、それらは異なるドメイン交差によって改変されている）、態様43、44、または48の多重特異性抗体。
54.三価である、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
55.少なくとも1つのポリエピトープ結合部位を含む、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
56.三価である、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
57.それぞれが単一のエピトープに結合する3つの結合部位を含む、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
58.二重特異性または三重特異性である、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
59.ハプテンに特異的に結合する少なくとも1つの結合部位を含む、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
60.ハプテンに特異的に結合する厳密に1つの結合部位を含む、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
61.ターゲットタンパク質に特異的に結合する少なくとも1つの結合部位を含む、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
62.ターゲットタンパク質が細胞表面または細胞内の腫瘍関連抗原である、態様61の多重特異性抗体。
63.ハプテンに特異的に結合する少なくとも1つの結合部位とターゲットタンパク質に特異的に結合する少なくとも1つの結合部位とを含む、前記態様のいずれか一つの多重特異性抗体。
64.（i）ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する、態様63の多重特異性抗体と、
（ii）前記多重特異性抗体が特異的に結合するハプテンであって、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンと
を含む複合体。
65.ハプテンが、ジゴキシゲニン、ビオチン、テオフィリン、フルオレセイン、DOTA、およびDOTAMから選択される、態様64の複合体。
66.ターゲットタンパク質が細胞表面抗原または細胞内抗原である、態様64または65の複合体。
67.ターゲットタンパク質が細胞表面または細胞内の腫瘍関連抗原である、態様66の複合体。
68.ハプテンにカップリングされた治療用または診断用の作用物質が、ペプチド、タンパク質、小分子、放射性標識小分子、核酸、およびイメージング作用物質からなる群より選択される、態様64〜67のいずれか一つの複合体。
69.以下の工程を含む、態様1〜63のいずれか一つの多重特異性抗体を調製するための方法:
・多重特異性抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程、および
・宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程。
70.カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖特異的カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる多重特異性抗体の精製工程をさらに含む、請求項69の方法。
71.態様69または70の方法によって生産される多重特異性抗体。
72.以下の工程を含む、複合体を調製するための方法:
・ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する、態様63の多重特異性抗体を用意する工程、
・前記多重特異性抗体が特異的に結合するハプテンであって、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテンを用意する工程、および
・前記多重特異性抗体を、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされた前記ハプテンと接触させる工程。
73.態様72の方法によって生産される複合体。
74.態様1〜63のいずれか一つの多重特異性抗体をコードする核酸。
75.態様73の核酸を含む発現ベクター。
76.態様74の核酸を含む宿主細胞。
77.態様75の発現ベクターを含む宿主細胞。
78.態様1〜63のいずれか一つの多重特異性抗体を含む組成物。
79.態様1〜63のいずれか一つの多重特異性抗体を含む薬学的組成物または診断用組成物。
80.少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた態様1〜63のいずれか一つの多重特異性抗体を含む薬学的組成物。
81.態様64〜68のいずれか一つの複合体を含む組成物。
82.態様64〜68のいずれか一つの複合体を含む薬学的組成物または診断用組成物。
83.少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた態様64〜68のいずれか一つの複合体を含む薬学的組成物。
84.態様64〜68のいずれか一つの複合体を含む診断用組成物。
85.細胞毒性作用物質にカップリングされた態様1〜63のいずれか一つの多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート。
86.多重特異性抗体が細胞表面腫瘍関連抗原または細胞内腫瘍関連抗原に特異的に結合する、態様85のイムノコンジュゲート。
87.態様85または86のイムノコンジュゲートを含む組成物。
88.態様85または86のイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物または診断用組成物。
89.少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた態様85または86のイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物。
90.少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた、態様62の多重特異性抗体、または態様64〜68のいずれか一つの複合体、または態様86のイムノコンジュゲートを含む薬学的組成物。
91.医薬として使用するための、態様1〜63のいずれか一つの多重特異性抗体。
92.医薬として使用するための、態様62の多重特異性抗体。
93.がんの処置において使用するための、態様62の多重特異性抗体。
94.医薬として使用するための、態様64〜68のいずれか一つの複合体。
95.がんの処置において使用するための、態様64〜68のいずれか一つの複合体。
96.医薬として使用するための、態様85または86のイムノコンジュゲート。
97.医薬として使用するための、態様86のイムノコンジュゲート。
98.がんを処置するための、態様85または86のイムノコンジュゲート。
99.診断を目的とする、態様1〜63のいずれか一つの多重特異性抗体の使用。
100.イメージングのための態様99の使用。
101.疾患を患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、態様1〜63のいずれか一つの多重特異性抗体を投与することによる方法。
102.疾患を患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、態様62または63のいずれか一つの多重特異性抗体を投与することによる方法。
103.疾患ががんである、態様102の方法。
104.疾患を患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、態様64〜68のいずれか一つの複合体を投与することによる方法。
105.疾患ががんである、態様104の方法。
106.疾患を患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、態様85または86のイムノコンジュゲートを投与することによる方法。
107.疾患を患っている患者を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、態様86のイムノコンジュゲートを投与することによる方法。
108.疾患ががんである、態様106または107の方法。
109.疾患が、炎症性疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、乾癬性関節炎、筋疾患、多発性硬化症、慢性腎臓疾患、骨疾患、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および/または血管損傷から選択される、態様101、104および106のいずれか一つの方法。
アミノ酸配列の説明
Figure 0006721590
Figure 0006721590
本発明の理解を助けるために以下に実施例を記載するが、本発明の真の範囲は本願特許請求の範囲において説明する。本発明の趣旨から逸脱することなくここに示す手法に変更を加えうることはいうまでもない。
実施例1:
ジゴキシゲニン（Dig）ならびに細胞表面抗原ルイスY（LeY）、CD33およびグリピカン3（GPC3）の一つに特異的に結合する本発明の三価二重特異性抗体の生産および発現
3つの抗原結合部位を含む二重特異性抗体を、フレキシブルなグリシン-セリンペプチドリンカーを介して第3のほぼFabサイズの結合モジュールに融合された、第1の結合部分および第2の結合部分としての2つのレギュラーFabアームで構成されるIgG様構造として設計した。この第3の結合モジュールは完全長抗体の元のIgG Fc領域と置きかわり、第1のCH3ドメインに融合された可変重鎖ドメインVH3と第2のCH3ドメインに融合された可変軽鎖ドメインVL3とで構成される（図2A）。この二重特異性抗体のドメインアーキテクチャを図2Aおよび図2Bに示す（これらは第3の結合部位内に追加のジスルフィド結合が存在する抗体および存在しない抗体を図解している）。
第3の結合モジュールのアミノ酸配列、特にCH3ドメインとVH3またはVL3のどちらかとの融合部分のアミノ酸配列は、IgG様構造全体にひずみまたは立体障害が生じず、IgG様の特性が保たれるように設計した。
Fabフラグメントは、完全長IgGの元のヒンジ領域と置きかわるように設計されたペプチドコネクタを介して第3の結合モジュールに融合される（図4）。ペプチドコネクタは鎖間ジスルフィド架橋を含有せず、そのことが第3の結合部位への抗原アクセスを容易にする。しかしヒンジジスルフィド架橋の喪失は、共有結合による鎖間接続を除去するので、抗体誘導体を不安定化することにもなる。ヒンジ-ジスルフィドの消失を補償し、安定性を取り戻すために、第3の結合モジュールのドメインのヘテロ二量体化を促進するためのヘテロ二量体化戦略を適用した（図2A参照）。
この実施例で作製される二重特異性抗体分子は、「ノブ」（突起）修飾または「ホール」（くぼみ）修飾のどちらかを持つジスルフィド安定化CH3ドメインを含む（図2Aおよび図2B）。この実施例では、VH3ドメインおよびVL3ドメインにジスルフィド安定化を伴う抗体および伴わない抗体を得た（表2参照）。
表1の二重特異性抗体を古典的な分子生物学的技法によって作製し、HEK293懸濁細胞中で一過性に発現させた。
簡単に述べると、所望の抗体の軽鎖をコードする発現ベクターと、対応する2つの「重鎖」をコードする発現ベクターとの共トランスフェクションによって、抗体（すなわち、それぞれドメイン構造VH-CH1-リンカー-VH3-CH3およびVH-CH1-リンカー-VL3-CH3のポリペプチド）を生産した。発現カセット、プラスミド特性、および一過性発現のための条件は、Metz et al., Protein Engineering Design and Selection 09/2012; 25（10）:571-8およびWO 2012025525 A1に記載されているものと同じであり、これらの文書はどちらも参照により本明細書に組み入れられる。抗体のポリペプチド構成要素は、湿潤8%CO2環境下37℃で成長させたHEK293懸濁細胞において、CMVプロモーターが駆動する転写によって発現させた。トランスフェクションの7日後に、分泌された二重特異性抗体を含有する培養上清を滅菌濾過した。
（表１）表示した二重特異性抗体のドメインアーキテクチャ
Figure 0006721590
本二重特異性抗体は表2に示す特徴を含んでいた。すべてのコンストラクトがカッパアイソタイプの定常軽鎖ドメインを含んでいた。加えて、どのコンストラクトでも、「ノブ」置換は、VH3に融合されたCH3ドメインに導入され、「ホール」置換は、VL3に融合されたCH3ドメインに導入された。ただし、VL3に融合されたCH3ドメインに「ノブ」を導入し、VH3に融合されたCH3ドメインに「ホール」を導入しても、同じ効果が得られるであろう。
（表２）表示した二重特異性抗体の特徴
Figure 0006721590
試験した二重特異性抗体のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を表3に示す。
（表３）表示した二重特異性抗体のポリペプチド鎖のアミノ酸配列
Figure 0006721590
実施例2:
本発明の三価二重特異性抗体の精製および特徴づけ
上記実施例1において発現させた二重特異性抗体を、HiTrap KappaSelectカラム（GE Healthcare）によるアフィニティークロマトグラフィーで上清から精製した。というのも、これらの二重特異性抗体はCH2ドメインを欠くので、プロテインAには結合しないからである。第2の精製工程では、IgG由来の二重特異性抗体について以前に記述されたように（S. Metz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108（2011）8194-8199）、Aekta Avant（GE Healthcare）において、pH6.0の20mMヒスチジン、140mM NaClで平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー（SEC、Superdex200 HiLoad 26/60、GE Healthcare）を適用することにより、均一な二重特異性抗体を得た。
表1に示すように異なる特異性を有する二重特異性抗体について、これらの精製工程の例示的結果を図6に示す。多重特異性抗体の実体および純度を明示するSDS PAGE分析も図6に示す。
二重特異性抗体は、ここに記載する生産および精製方法により、表4に詳しく示すように3〜20mg/Lの収量で生成させることができた。
（表４）表示した二重特異性抗体の収量
Figure 0006721590
実施例3:
ヘテロ二量体化を促進するための複雑なジスルフィドパターンの設計
実施例1において作製した二重特異性抗体では、第3の結合モジュールのヘテロ二量体化が、4つの相異なる相互作用、すなわち（i）VH3とVL3の間の相互作用、（ii）VH3/VL3境界面におけるジスルフィド安定化、（iii）CH3/CH3境界面におけるジスルフィド安定化、および（iv）CH3/CH3境界面におけるノブ・イントゥ・ホール修飾（これは、例えばCH3/CH3境界面における反対電荷を持つアミノ酸の導入のような、CH3ドメインの相互作用をサポートすることが知られている他の同等なヘテロ二量体化戦略で置き換えることもできる）によって促進される。これにより、ホモ二量体形成ではなくヘテロ二量体の形成が促進される。
VH3/VL3およびCH3/CH3境界面のジスルフィド安定化には、追加のジスルフィドを近接して導入する必要があったので、生産プロセスでは、ミスフォールディングした非機能的分子をもたらすミスペアリングしたジスルフィドの形成を回避する必要があった（図5A）。
周知のとおり、野生型完全長IgGは、そのドメインのそれぞれの中に1つの鎖内ジスルフィド結合を持っていると共に、抗体のヒンジ領域を介して重鎖を接続するために鎖間ジスルフィド結合も持っている。ヒンジ領域システインは、個々の抗体ドメインのフォールディングを妨害せず、ドメイン内ジスルフィド形成においても相互作用しない。
しかし、VH3/VL3境界面にもCH3/CH3境界面にもジスルフィド安定化を含む本発明の抗体では、ペアを形成していない追加のシステインが導入されるが、正しいフォールディングを保証するには、それらが鎖内ジスルフィド結合形成システインとペアを形成するのではなく、所定の別個のドメイン間結合を形成しなければならない。本発明の抗体では、可変ドメインがそれぞれのCH3ドメインに直接（すなわち、ペプチドリンカーを含むことなく、可変ドメインのアミノ酸とCH3ドメインのアミノ酸との間のペプチド結合形成によって）接続される。そのような配列組成およびシステイン残基の近接性（天然のシステイン残基および追加して導入されたシステイン残基を含む）は、ミスペアリングしたジスルフィドの形成にかなり有利に働くであろう（図5A）。
したがって、正しいジスルフィド結合形成を可能にして、ジスルフィドミスペアリングを回避する融合部位を、可変ドメイン（VH3およびVL3）とそれぞれのCH3ドメインとの間に作り出した（図5B、C）。第3の結合モジュールの各ポリペプチド鎖では、追加のジスルフィド安定化に必要なシステイン残基が鎖内ジスルフィド結合形成に必要なシステイン残基に近接しているが、それにもかかわらず、驚いたことに、鎖内ジスルフィドを妨害せず、他方のポリペプチド鎖中の対応する正しいシステイン残基とペアを形成する。
図5Bおよび図5Cに、第3の結合モジュール内のそのような複雑なシステインパターンを含む融合部位を図示する。これらの融合部位は正しいタンパク質フォールディングを可能にする。
可変ドメインとCH3ドメインとの間の融合部位の設計のもう一つの目標は、元の親抗体において、（i）VH3とCH3との間の融合部位については、VHドメインとCH1の間およびCH2ドメインとCH3ドメインの間、そして（ii）VL3とCH3との融合部位については、VLドメインとCLドメインの間およびCH2ドメインとCH3ドメインの間に存在する天然の移行部位を、綿密に模倣することであった。したがって、可変領域と定常領域との間の天然移行部位に対して明瞭なホモロジーを持つ三次構造の融合部位を得るには、可変ドメインのC末端およびCH3ドメインのN末端において、それぞれ相異なるアミノ酸残基を、別のアミノ酸残基で置換することができる。CH3ドメインのN末端の例示的代替アミノ酸配列を図5Bに示す。
実施例4:
本発明の三価二重特異性抗体の結合研究
実施例1において作製した抗体の同時抗原結合を、ハプテン結合を扱うためにペイロードとしてDig-Cy5を使用して、LeY発現MCF7細胞、CD33発現Molml3細胞、およびGPC3発現HepG2細胞での、FACS分析によって分析した。結果を図7に示す。
第3の結合モジュールにDig特異的結合部位を持ち、Fabフラグメント内に各細胞表面マーカーに特異的な抗原結合部位を持つすべての二重特異性抗体で、同時のハプテン結合および細胞表面結合が観察された。同時のハプテン結合および細胞表面結合は、Fabフラグメント中にDig特異的結合部位を持ち、第3の結合モジュール中に各細胞表面マーカーに特異的な抗原結合部位を持つ抗体でも観察された。
このデータは、小さな抗原、例えば（ジゴキシゲニンのような）ハプテンにとって、第3の結合部位は容易にアクセス可能であることを示している。第3の結合部位は、タンパク質、例えば細胞表面タンパク質などの、さらに大きな抗原を結合するためにも、アクセス可能である。これらの抗原の場合、結合効力はエピトープのアクセス可能性と潜在的立体障害に依存しうる。実証されたように、細胞表面抗原CD33、GPC3、またはLeYは、本発明の抗体の第3の結合部位にアクセス可能である。
これらの特徴により、本発明の抗体を応用することで、例えばイメージングのために、または標的ペイロード送達のために、2つのターゲットを同時に扱い、または架橋することができる。
実施例5:
標的ペイロード送達への本発明の三価二重特異性抗体の応用
実施例1および実施例2で得た本発明の抗体（BsAb LeY-Dig（SS）-LeY）に、毒性ペイロードとしてのジゴキシゲニン化切断型シュードモナス外毒素（PE）誘導体との複合体を形成させた。そのような複合体の模式図を図9に示す。本発明の抗体を含むこの複合体が、がん細胞を標的にすることによって細胞死を誘発する能力を有するかどうかを評価するために、LeY発現MCF7乳がん細胞株の細胞をインビトロで前記複合体と接触させた。細胞死の誘発は、市販のBrdUアッセイ（Cell Proliferation ELISA、BrdU（化学発光）、カタログ番号11 669 915 001、Roche）により、製造者の指示に従って評価した。
以下の対照を並行して分析した:
・スタウロスポリン（陽性対照）、
・添加物なし（培地のみ、陰性対照）
・遊離PE、
・遊離ジゴキシゲニン化PE（PE-Dig）、
・PE-Digとの複合体を形成していない遊離抗体BsAb LeY-Dig（SS）-LeY、
・遊離抗体BsAb GPC3-Dig（SS）-GPC3（これはMCF7乳がん細胞に結合しない）、
・BsAb CD33-Dig（SS）-CD33（実施例1および2において得たもの）とジゴキシゲニン化PEとの複合体（CD33はMCF7乳がん細胞に結合しないので、本発明の抗体と毒素とを含む複合体の非特異的活性を評価するための陰性対照;図7に示す）。
以下の比較例を並行して分析した:
ジゴキシゲニンおよびターゲット抗原に特異的に結合する二重特異性抗体と、ジゴキシゲニンにカップリングされた小分子との複合体は、当技術分野において公知であるので（WO 2011/1003557 A1に開示されている、図17aに示されたドメインアーキテクチャ）、そのような抗体複合体を比較例として使用した。簡単に述べると、その二重特異性抗体は、LeYに結合する完全長抗体と、各重鎖のC末端に融合された、Digに特異的に結合するFvフラグメントとで構成されていた（これを「BsAb LeY-Dig（2+2）」という）。この抗体の可変ドメインは、本発明のBsAb LeY-Dig（SS）-LeY抗体と同じであった。
結果（図10）は、本発明のBsAb LeY-Dig（SS）-LeY抗体とジゴキシゲニン化PEとの複合体だけが、低ナノモル濃度でMCF7乳がん細胞を効果的にターゲティングしてがん細胞の特異的ターゲティングを示す能力を有することを証明している。これに対し、MCF7乳がん細胞上に存在しないCD33抗原を扱う複合体は、ほとんど何の毒性も示さない。加えて、ターゲティング運搬体を持たない毒素や毒素ペイロードを持たない対照抗体は、どちらも目につく活性を示さなかった。
実施例6:
ビオチン（Bio）ならびに細胞表面抗原ルイスY（LeY）、CD33およびグリピカン3（GPC3）の一つに特異的に結合する本発明の三価二重特異性抗体の生産および分析
ビオチンとLeY、またはビオチンとCD33、またはビオチンとGPC3に特異的に結合する3つの抗原結合部位を同じドメインアーキテクチャで含む二重特異性抗体を、実施例1の抗体について説明したように設計した。
これらの二重特異性抗体のドメインアーキテクチャを図2Aおよび図2Bに示す。これらの図は、Fabフラグメントが第1の抗原結合部位および第2の抗原結合部位として使用されたことを示している。
（表５）表示した二重特異性抗体のドメインアーキテクチャ
Figure 0006721590
これらの二重特異性抗体は、表5および表6に示す特徴を含んでいた。すべてのコンストラクトがカッパアイソタイプの定常軽鎖ドメインを含んでいた。加えて、すべてのコンストラクトにおいて、VH3に融合されたCH3ドメインに「ノブ」置換が導入され、VL3に融合されたCH3ドメインに「ホール」置換が導入された。
（表６）表示した二重特異性抗体の特徴
Figure 0006721590
試験した二重特異性抗体のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を表7に示す。
（表７）表示した二重特異性抗体のポリペプチド鎖のアミノ酸配列
Figure 0006721590
3つの抗体を、実施例1および実施例2で説明したように、HEK293細胞で一過性に発現させ、精製した。
（表８）表示した二重特異性抗体の収量
Figure 0006721590
BsAb LeY-Bio（SS）-LeYの同時抗原結合を試験するために、ビオチン化Cy5をペイロードとして使用し、LeY発現MCF7細胞でのFACS分析によって分析した。そのFACS分析の結果を図8に示す。
BsAb LeY-Bio（SS）-LeY抗体ではビオチンおよびMCF7細胞表面への同時結合が観察された。対照として、BsAb CD33-Bio（SS）-CD33とペイロードとしてのビオチン化Cy5との複合体を並行して処理したところ、がん細胞への当該複合体の非特異的結合は確認されないことが証明された。これらの結果は、本発明の抗体の第3の結合部位がハプテン結合にとって、具体的にはビオチンとビオチンにカップリングされたペイロードへの結合にとって、容易にアクセスできることを示している。
実施例7:
標的ペイロード送達のための本発明の三価二重特異性抗体の応用
実施例5で説明したものと同じアプローチを使って、実施例6において調製された本発明の抗体を、標的ペイロード送達におけるそれらの利用可能性について評価した。そのために、抗体に、毒性ペイロードとしてのビオチン化切断型シュードモナス外毒素（PE）誘導体との複合体を形成させた。そのような複合体の模式図を図9に示す。
BsAb LeY-Bio（SS）-LeYとビオチン化PCとの複合体が、がん細胞を標的にすることによって細胞死を誘発する能力を有するかどうかを評価するために、LeY発現MCF7乳がん細胞株の細胞をインビトロで前記複合体と接触させた。細胞死の誘発は、市販のBrdUアッセイ（Cell Proliferation ELISA、BrdU（化学発光）、カタログ番号11 669 915 001、Roche）により、製造者の指示に従って評価した。
以下の対照を並行して分析した:
・スタウロスポリン（陽性対照）、
・添加物なし（培地のみ、陰性対照）
・遊離ビオチン化PE（PE-Bio）、
・BsAb CD33-Bio（SS）-CD33（実施例1および2において得たもの）とビオチン化PEとの複合体（CD33はMCF7乳がん細胞に結合しないので、本発明の抗体と毒素とを含む複合体の非特異的活性を評価するための陰性対照;図7に示す）。
結果（図11）は、本発明のBsAb LeY-Bio（SS）-LeY抗体とビオチン化PEとの複合体だけが、低ナノモル濃度でMCF7乳がん細胞を効果的にターゲティングしてがん細胞の特異的ターゲティングを示す能力を有することを証明している。これに対し、MCF7乳がん細胞上に存在しないCD33抗原を扱う複合体は、ほとんど何の毒性も示さない。加えて、ターゲティング運搬体を持たない毒素や毒素ペイロードを持たない対照抗体は、どちらも目につく活性を示さなかった。
実施例8:
細胞表面抗原ルイスY（LeY）、CD33およびGPC3の一つと組み合わされたビオチン（Bio）またはジゴキシゲニン（Dig）のどちらか1つに特異的に結合する本発明の三価二重特異性抗体の生産
細胞表面抗原ルイスY（LeY）、CD33およびGPC3の一つと組み合わされたビオチン（Bio）またはジゴキシゲニン（Dig）のどちらか1つに特異的に結合する3つの抗原結合部位を同じドメインアーキテクチャで含む二重特異性抗体を、実施例1の抗体について説明したように設計した。これらの二重特異性抗体のドメインアーキテクチャを図2Aおよび図2Bに示す。これらの図は、Fabフラグメントが第1の抗原結合部位および第2の抗原結合部位として使用されることを示している。
これらの二重特異性抗体は、表9および表10に示す特徴を含む。すべてのコンストラクトがカッパアイソタイプの定常軽鎖ドメインを含む。加えて、すべてのコンストラクトにおいて、VH3に融合されたCH3ドメインに「ノブ」置換が導入され、VL3に融合されたCH3ドメインに「ホール」置換が導入されている。
（表９）表示した二重特異性抗体のドメインアーキテクチャ
Figure 0006721590
（表１０）表示した二重特異性抗体の特徴
Figure 0006721590
試験した二重特異性抗体のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を表11に示す。
（表１１）表示した二重特異性抗体のポリペプチド鎖のアミノ酸配列
Figure 0006721590
抗体は、実施例1および2で説明したように発現させ、精製する。

Claims (15)

  1. 少なくとも3つの抗原結合部位を含む多重特異性抗体であって、2つの抗原結合部位は第1のFabフラグメントおよび第2のFabフラグメントによって形成されており、
    a）第3の抗原結合部位は、可変重鎖ドメイン（VH3）と可変軽鎖ドメイン（VL3）とによって形成されていて、
    ・VH3ドメインのN末端は、第1のペプチドコネクタを介して第1のFabフラグメントに接続され、
    ・VL3ドメインのN末端は、第2のペプチドコネクタを介して第2のFabフラグメントに接続されており、
    b）前記多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、これらCH3ドメインは、
    i）CH3ドメインのうちの一方に生成させた突起がCH3ドメインのうちの他方に生成させたくぼみの中に配置されうる形での、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの一方における突起の生成、および少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することによるCH3ドメインのうちの他方におけるくぼみの生成、もしくは
    CH3ドメインのうちの一方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、CH3ドメインのうちの他方において少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること、
    ii）CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成される形での、各CH3ドメインにおける少なくとも1つのシステイン残基の導入、または
    iii）i）およびii）の両修飾
    によってヘテロ二量体化を促進するように改変されており、
    c）第3の抗原結合部位のVH3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの一方に接続され、第3の抗原結合部位のVL3ドメインのC末端はCH3ドメインのうちの他方に接続されており、かつ
    d）前記多重特異性抗体は定常重鎖ドメイン2（CH2）を欠いている、
    前記多重特異性抗体。
  2. 第3の抗原結合部位が、VH3ドメインとVL3ドメインとの間にジスルフィド結合を形成させるための、以下の位置におけるシステイン残基の導入（ナンバリングはKabatに従う）:
    ・VH3の44番目およびVL3の100番目、
    ・VH3の105番目およびVL3の43番目、または
    ・VH3の101番目およびVL3の100番目
    によってジスルフィド安定化されている、
    請求項1記載の多重特異性抗体。
  3. 第1のペプチドコネクタおよび第2のペプチドコネクタが少なくとも15アミノ酸のペプチドである、請求項1〜2のいずれか一項記載の多重特異性抗体。
  4. 第1のペプチドコネクタと第2のペプチドコネクタとの間に鎖間ジスルフィド結合が形成されていない、請求項1〜3のいずれか一項記載の多重特異性抗体。
  5. VH3ドメインのC末端がCH3ドメインのうちの一方に直接的に接続され、VL3ドメインのC末端がCH3ドメインのうちの他方に直接的に接続されている、請求項1〜4のいずれか一項記載の多重特異性抗体。
  6. 三価である、請求項1〜5のいずれか一項記載の多重特異性抗体。
  7. 二重特異性または三重特異性である、請求項1〜6のいずれか一項記載の多重特異性抗体。
  8. ・ハプテンおよびターゲットタンパク質に特異的に結合する、請求項1〜7のいずれか一項記載の多重特異性抗体、および
    ・前記多重特異性抗体が特異的に結合するハプテンであって、治療用または診断用の作用物質にコンジュゲートされているハプテン
    を含む複合体。
  9. ・多重特異性抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
    ・多重特異性抗体の合成を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程、および
    ・宿主細胞培養物から多重特異性抗体を回収する工程
    を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の多重特異性抗体を調製するための方法。
  10. 請求項9記載の方法によって生産された多重特異性抗体。
  11. 請求項1〜7のいずれか一項記載の多重特異性抗体をコードする核酸。
  12. 請求項11記載の核酸を含む発現ベクター。
  13. 請求項11記載の核酸を含む宿主細胞。
  14. 少なくとも1種類の薬学的に許容される担体と組み合わされた請求項1〜7のいずれか一項記載の多重特異性抗体または請求項8記載の複合体を含む薬学的組成物。
  15. 細胞毒性作用物質にカップリングされた請求項1〜7のいずれか一項記載の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲート。
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Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100256340A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
NZ701769A (en) 2009-09-16 2016-06-24 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
CA2825081A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Birgit Bossenmaier Antigen binding proteins
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
JP7082604B2 (ja) 2016-03-21 2022-06-08 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 多重特異性および多機能性分子ならびにその使用
JP6983824B2 (ja) * 2016-07-04 2021-12-17 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 新規抗体フォーマット
WO2018054484A1 (en) * 2016-09-23 2018-03-29 Biontech Ag Bispecific trivalent antibodies binding to claudin 6 or claudin18.2 and cd3 for treatment of claudin expressing cancer diseases
KR20240023449A (ko) 2017-02-08 2024-02-21 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. 천연 킬러 세포의 활성화를 위한 다중-특이적 결합 단백질 및 암 치료에서의 그의 치료적 용도
US20200291089A1 (en) 2017-02-16 2020-09-17 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
CA3054079A1 (en) 2017-02-20 2018-08-23 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CA3058477A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
US20200385472A1 (en) * 2017-04-28 2020-12-10 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules comprising a non-immunoglobulin heterodimerization domain and uses thereof
US20210246227A1 (en) 2017-05-31 2021-08-12 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
TW201932142A (zh) * 2017-10-20 2019-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 自單特異性抗體產生多特異性抗體之方法
MX2020004100A (es) * 2017-10-30 2020-07-24 Hoffmann La Roche Metodo para generacion in vivo de anticuerpos multiespecificos a partir de anticuerpos monoespecificos.
AU2018358904A1 (en) 2017-11-01 2020-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag TriFab-contorsbody
EP3749346A4 (en) 2018-02-08 2021-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. VARIABLE DOMAINS OF ANTIBODIES TARGETING THE NKG2D RECEIVER
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
US10640576B2 (en) * 2018-04-10 2020-05-05 Y-Biologics Inc. Cell engaging binding molecules
EA202091977A1 (ru) * 2018-05-28 2021-02-09 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают cd33, nkg2d и cd16, и способы применения
CA3105448A1 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
CA3106254A1 (en) * 2018-07-11 2020-01-16 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods related to engineered fc-antigen binding domain constructs
EP3827019A1 (en) * 2018-07-24 2021-06-02 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
CN114885609A (zh) * 2018-12-24 2022-08-09 赛诺菲 基于假Fab的多特异性结合蛋白
EP3927744A1 (en) 2019-02-21 2021-12-29 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
AU2020224154A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
GB2597851A (en) 2019-02-21 2022-02-09 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
GB2599227B (en) 2019-02-21 2024-05-01 Marengo Therapeutics Inc Multifunctional molecules that bind to T cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
AU2020226904A1 (en) 2019-02-21 2021-09-16 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
MX2021012931A (es) * 2019-04-25 2021-11-17 Hoffmann La Roche Polipeptidos multiespecificos activables y terapeuticos con semivida extendida.
CA3132494A1 (en) * 2019-04-25 2020-10-29 Ulrich Brinkmann Therapeutic multispecific polypeptides activated by polypeptide chain exchange
AU2020261250A1 (en) * 2019-04-25 2021-10-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Generation of antibody-derived polypeptides by polypeptide chain exchange
AU2020327000A1 (en) * 2019-08-08 2022-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel antigen binding molecule formats
WO2021138407A2 (en) 2020-01-03 2021-07-08 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to cd33 and uses thereof
EP4139363A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
AU2021331076A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Antibody molecules that bind to NKp30 and uses thereof
EP4204458A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
JP2023542080A (ja) 2020-08-26 2023-10-05 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
CA3214757A1 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Andreas Loew Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof

Family Cites Families (420)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
IL47062A (en) 1975-04-10 1979-07-25 Yeda Res & Dev Process for diminishing antigenicity of tissues to be usedas transplants by treatment with glutaraldehyde
US4150149A (en) 1976-11-29 1979-04-17 Professional Staff Association Of The Los Angeles County Harbor General Hospital Method and means for the early detection and diagnosis of certain types of cancers
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
US4665077A (en) 1979-03-19 1987-05-12 The Upjohn Company Method for treating rejection of organ or skin grafts with 6-aryl pyrimidine compounds
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4361544A (en) 1980-03-03 1982-11-30 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4444744A (en) 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
IL86164A0 (en) 1987-04-28 1988-11-15 Tamir Biotechnology Ltd Improved dna probes
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
JP3012244B2 (ja) 1987-09-21 2000-02-21 ジェン―プローブ インコーポレイテッド ヌクレオチドプローブ用非ヌクレオチド連結試薬
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4914210A (en) 1987-10-02 1990-04-03 Cetus Corporation Oligonucleotide functionalizing reagents
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
IL85746A (en) 1988-03-15 1994-05-30 Yeda Res & Dev Preparations comprising t-lymphocyte cells treated with 8-methoxypsoralen or cell membranes separated therefrom for preventing or treating autoimmune diseases
EP0339217B1 (en) 1988-04-01 1994-09-21 Carter-Wallace, Inc. Specific peptide bond cleavage by organic tertiary phosphines with nucleophilic side chains
FI891226A (fi) 1988-04-28 1989-10-29 Univ Leland Stanford Junior Reseptordeterminanter i anti-t-celler foer behandling av autoimmunsjukdom.
FR2632955B1 (fr) 1988-06-20 1991-12-27 Oris Ind Derives de nucleosides utilisables pour la synthese d'oligonucleotides marques, oligonucleotides obtenus a partir de ces derives et leur synthese
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
US4918882A (en) 1988-12-21 1990-04-24 Texas Aluminum Industries, Inc. Glazing retainer assembly
WO1990008187A1 (en) 1989-01-19 1990-07-26 Dana Farber Cancer Institute Soluble two domain cd2 protein
FR2642074B1 (fr) 1989-01-20 1994-04-29 Oris Ind Derives de molecules polyhydroxylees permettant l'introduction d'au moins une ramification dans un oligonucleotide
RO110397B1 (ro) 1989-03-21 1996-01-30 Immune Response Corp San Diego Vaccin pentru prevenirea sau tratarea unor boli care rezulta din raspunsuri patogene, prin populatii de celule t specifice, procedeu de obtinere si metode de diagnostic si tratament cu acesta
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ATE161850T1 (de) 1989-07-19 1998-01-15 Connetics Corp T-zell-rezeptor-peptide als heilmittel für autoimmune und bösartige krankheiten
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
AU675057B2 (en) 1989-09-07 1997-01-23 Alkermes, Inc. Process for the preparation of transferrin receptor specificantibody-neuropharmaceutical or diagnostic agent conjugates
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
EP0462246A4 (en) 1989-11-07 1992-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Oligomeric immunoglobulins
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0547137A4 (en) 1990-08-31 1993-12-08 Bristol-Myers Squibb Company Homoconjugated immunoglobulins
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5290925A (en) 1990-12-20 1994-03-01 Abbott Laboratories Methods, kits, and reactive supports for 3' labeling of oligonucleotides
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
CA2071137A1 (en) 1991-07-10 1993-01-11 Clarence C. Lee Composition and method for revitalizing scar tissue
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
CA2073846C (en) 1991-07-15 2007-09-18 David S. Jones Modified phosphorous intermediates for providing functional groups on the 5' end of oligonucleotides
EP0600965B1 (de) 1991-08-28 1998-02-18 Roche Diagnostics GmbH Primer für matrizenabhängige enzymatische nukleinsäuresynthesen
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US5885793A (en) 1991-12-02 1999-03-23 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
WO1994004550A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Triplex Pharmaceutical Corporation Cholesteryl-modified triple-helix forming oligonucleotides and uses thereof
GB9221657D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
PT672141E (pt) 1992-10-23 2003-09-30 Immunex Corp Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis
BR9207175A (pt) 1992-10-28 1995-12-12 Genentech Inc Composição contendo antagonista de fator de crescimento de célula endotelial vascular sequência aminoácida de anticorpo monoclonal polipeptídeo e método de tratamento de tumor em mamífero
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
DE4310141A1 (de) 1993-03-29 1994-10-06 Boehringer Mannheim Gmbh Homobidentale trifunktionelle Linker
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
US5635602A (en) 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
EP0702553A1 (en) 1993-12-27 1996-03-27 BAXTER INTERNATIONAL INC. (a Delaware corporation) Water soluble non-immunogenic polyamide cross-linking agents
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5824483A (en) 1994-05-18 1998-10-20 Pence Inc. Conformationally-restricted combinatiorial library composition and method
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5849879A (en) 1994-11-03 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
GB9504344D0 (en) 1995-03-03 1995-04-19 Unilever Plc Antibody fragment production
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
AU6163196A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Smithkline Beecham Corporation Method for obtaining receptor agonist antibodies
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
SE504798C2 (sv) 1995-06-16 1997-04-28 Ulf Landegren Immunanalys och testkit med två reagens som kan tvärbindas om de adsorberats till analyten
WO1997005156A1 (en) 1995-07-27 1997-02-13 Carsten Behrens A new achiral linker reagent for the incorporation of multiple amino groups into oligonucleotides
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
CN1173878A (zh) 1995-10-16 1998-02-18 尤尼利弗公司 双功能或双价抗体片段类似物
US6136564A (en) 1995-11-16 2000-10-24 Roche Diagnostics Gmbh Process for the production of peptides by way of streptavidin fusion proteins
US5736626A (en) 1996-01-29 1998-04-07 The Perkin-Elmer Corporation Solid support reagents for the direct synthesis of 3'-labeled polynucleotides
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
DK0894135T3 (da) 1996-04-04 2004-12-06 Unilever Nv Multivalent og multispecifikt antigenbindingsprotein
AU2660397A (en) 1996-04-05 1997-10-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US6130323A (en) 1996-05-15 2000-10-10 Biogenex Laboratories Non-nucleotide linking reagents
TR199903123T2 (xx) 1997-04-07 2000-05-22 Genentech, Inc. Anti-Vegf antikorlar�.
AU740738B2 (en) 1997-04-07 2001-11-15 Genentech Inc. Humanized antibodies and methods for forming humanized antibodies
WO1998048032A2 (en) 1997-04-21 1998-10-29 Donlar Corporation POLY-(α-L-ASPARTIC ACID), POLY-(α-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
JP4213224B2 (ja) 1997-05-02 2009-01-21 ジェネンテック，インコーポレーテッド ヘテロマルチマー及び共通成分を有する多重特異性抗体の製造方法
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
JP2002501721A (ja) 1997-08-01 2002-01-22 モルフォシス・アクチェンゲゼルシャフト 多量体（ポリ）ペプチドコンプレックスのメンバーをコードする核酸配列を同定するための新規方法およびファージ
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
CA2297692A1 (en) 1997-08-18 1999-02-25 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
ATE283364T1 (de) 1998-01-23 2004-12-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Mehrzweck-antikörperderivate
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2340112T3 (es) 1998-04-20 2010-05-28 Glycart Biotechnology Ag Ingenieria de glicosilacion de anticuerpos para la mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US6117986A (en) 1998-06-10 2000-09-12 Intergen Company, L.P. Pyrimidines linked to a quencher
US7074405B1 (en) 1998-06-22 2006-07-11 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US6573043B1 (en) 1998-10-07 2003-06-03 Genentech, Inc. Tissue analysis and kits therefor
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
KR100719202B1 (ko) 1998-10-23 2007-05-16 키린-암젠 인코포레이티드 ＭＰｌ 수용체에 결합하는 화합물 및 이를 함유하는 제약학적 조성물
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
US20030035798A1 (en) 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
WO2000035956A1 (fr) 1998-12-16 2000-06-22 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticorps monoclonal anti-vegf humain
WO2000042072A2 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
CN1232039A (zh) 1999-04-02 1999-10-20 中国人民解放军海军总医院 一种基因工程双特异抗体及其应用
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6872806B1 (en) 1999-06-25 2005-03-29 The Governors Of The University Of Alberta Polypeptide compositions formed using a coiled-coil template and methods of use
EP1074563A1 (en) 1999-08-02 2001-02-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimeric polypeptides enhancing dimer formation through electrostatic interactions and disulfide bond, method for production and uses thereof
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
KR100797667B1 (ko) 1999-10-04 2008-01-23 메디카고 인코포레이티드 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
US6727356B1 (en) 1999-12-08 2004-04-27 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Fluorescent quenching detection reagents and methods
DK1242438T3 (da) 1999-12-29 2007-02-12 Immunogen Inc Cytotoksiske midler omfattende modificerede doxorubiciner og daunorubiciner og deres terapeutiske anvendelse
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
CZ20023203A3 (cs) 2000-03-24 2003-08-13 Micromet Ag Multifunkční polypeptidy obsahující vazebné místo k epitopu receptorového komplexu NKG2D
LT2857516T (lt) 2000-04-11 2017-09-11 Genentech, Inc. Multivalentiniai antikūnai ir jų panaudojimas
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
DE10021678A1 (de) * 2000-05-05 2002-04-18 Stefan Duebel Antikörperkonstrukte mit variablen Regionen
JP2004511430A (ja) 2000-05-24 2004-04-15 イムクローン　システムズ　インコーポレイティド 二重特異性免疫グロブリン様抗原結合蛋白および製造方法
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
US6511809B2 (en) 2000-06-13 2003-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the detection of an analyte by means of a nucleic acid reporter
EP1294904A1 (en) 2000-06-30 2003-03-26 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Heterodimeric fusion proteins
DE10044373A1 (de) 2000-09-08 2002-03-21 Roche Diagnostics Gmbh Neues Reagenz zur Markierung von Nukleinsäuren
PL218428B1 (pl) 2000-10-06 2014-12-31 Kyowa Hakko Kogyo Kk Komórka, sposoby wytwarzania przeciwciał, leki zawierające przeciwciała, komórka CHO i przeciwciało klasy IgG
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
RU2295537C2 (ru) 2000-10-20 2007-03-20 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Модифицированное агонистическое антитело
US6610472B1 (en) 2000-10-31 2003-08-26 Genetastix Corporation Assembly and screening of highly complex and fully human antibody repertoire in yeast
WO2002051870A2 (en) 2000-12-22 2002-07-04 GRAD, Carole Legal Representative of KAPLAN, Howard Phage display libraries of human vh fragments
US7319139B2 (en) 2001-01-29 2008-01-15 Biogen Idec, Inc. TAG-72 specific CH2 domain deleted antibodies
EP1455820A2 (en) 2001-03-09 2004-09-15 William Herman Targeted ligands
US20030027751A1 (en) 2001-04-10 2003-02-06 Genvec, Inc. VEGF fusion proteins
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
BR0209546A (pt) 2001-05-11 2004-06-29 Amgen Inc Composição de matéria, dna, vetor de expressão, célula hospedeira, e, métodos para tratar uma doença autoimune mediada pelas células b, lúpus, um câncer mediado pelas células b, e linfoma de células b
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
EP2180044A1 (en) 2001-08-03 2010-04-28 GlycArt Biotechnology AG Antibody glycosylation variants having increased anti-body-dependent cellular cytotoxicity
US20030082547A1 (en) 2001-08-27 2003-05-01 Ewing Gregory J. Non-fluorescent quencher compounds and biomolecular assays
US20050123476A1 (en) 2001-09-05 2005-06-09 The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Imaging the activity of extracellular protease in cells using mutant anthrax toxin protective antigens that are cleaved by specific extracellular proteases
EP1293514B1 (en) 2001-09-14 2006-11-29 Affimed Therapeutics AG Multimeric single chain tandem Fv-antibodies
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7332474B2 (en) 2001-10-11 2008-02-19 Amgen Inc. Peptides and related compounds having thrombopoietic activity
US7205275B2 (en) 2001-10-11 2007-04-17 Amgen Inc. Methods of treatment using specific binding agents of human angiopoietin-2
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
DE60237704D1 (de) 2001-10-16 2010-10-28 Government Of The Us Secretary Neutralisierende antikörper gegen hiv mit breiter kreuzreaktion, die mit hilfe von env-cd4-co-rezeptorkomplexen selektiert werden
US7053202B2 (en) 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
WO2003035835A2 (en) 2001-10-25 2003-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003066660A2 (en) 2002-02-05 2003-08-14 Immunolex Therapeutics Aps A PAIR OF ANTIBODY Fv FRAGMENTS STABILIZED BY COILED­COIL PEPTIDES
US20030157091A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Dyax Corporation Multi-functional proteins
WO2003073238A2 (en) 2002-02-27 2003-09-04 California Institute Of Technology Computational method for designing enzymes for incorporation of amino acid analogs into proteins
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
US20050031613A1 (en) 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
WO2003084569A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition anticorps
CA2481837A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
ES2362419T3 (es) 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
PL373256A1 (en) 2002-04-09 2005-08-22 Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd. Cells with modified genome
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
JP2006506954A (ja) 2002-04-29 2006-03-02 ゲンパト７７ ファーマコジェネティクス エージー Ｔｃｒ及びｔｉｒｃ７に結合する新規な抗体、並びに治療及び診断におけるその使用
US7081443B2 (en) 2002-05-21 2006-07-25 Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) Chimeric comp-ang1 molecule
KR100527334B1 (ko) 2002-06-07 2005-11-09 (주)넥스젠 올리고뉴클레오타이드의 신규한 링커
SE0201863D0 (en) 2002-06-18 2002-06-18 Cepep Ab Cell penetrating peptides
PT1517921E (pt) 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
US6919426B2 (en) 2002-09-19 2005-07-19 Amgen Inc. Peptides and related molecules that modulate nerve growth factor activity
SI1549344T1 (sl) 2002-10-10 2015-05-29 Merck Patent Gmbh FARMACEVTSKI SESTAVKI PROTI RECEPTORJEM ErbB1
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
AR042485A1 (es) 2002-12-16 2005-06-22 Genentech Inc Anticuerpo humanizado que se une al cd20 humano
ES2260569T3 (es) 2002-12-20 2006-11-01 Roche Diagnostics Gmbh Derivados de manitol y glucitol.
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US20040157330A1 (en) 2003-01-09 2004-08-12 Arizeke Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for targeted biological delivery of molecular carriers
PL222219B1 (pl) 2003-01-22 2016-07-29 Glycart Biotechnology Ag Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
US7575893B2 (en) 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
BRPI0407446A (pt) 2003-02-13 2006-01-31 Pharmacia Corp Anticorpos para c-met para o tratamento de cânceres
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
GB0305702D0 (en) 2003-03-12 2003-04-16 Univ Birmingham Bispecific antibodies
US7238792B2 (en) 2003-03-18 2007-07-03 Washington State University Research Foundation Foldable polymers as probes
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US8088387B2 (en) 2003-10-10 2012-01-03 Immunogen Inc. Method of targeting specific cell populations using cell-binding agent maytansinoid conjugates linked via a non-cleavable linker, said conjugates, and methods of making said conjugates
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
RU2005136988A (ru) 2003-05-30 2006-06-10 Дженентек, Инк. (Us) Лечение антителами против vegf
WO2005000899A2 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
EP2221317A3 (en) 2003-06-30 2011-07-27 Domantis Limited PEGylated single domain antibodies (dAb)
KR20060041205A (ko) 2003-07-01 2006-05-11 이뮤노메딕스, 인코오포레이티드 양특이성 항체들의 다가 담체들
AR046071A1 (es) 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
AU2004261229A1 (en) 2003-07-29 2005-02-10 Eisai, Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
CA2536408A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
US20050095627A1 (en) 2003-09-03 2005-05-05 The Salk Institute For Biological Studies Multiple antigen detection assays and reagents
WO2005027966A2 (en) 2003-09-05 2005-03-31 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US20050064509A1 (en) 2003-09-23 2005-03-24 The Regents Of The University Of California Use of templated self assembly to create novel multifunctional species
CN1326881C (zh) 2003-09-29 2007-07-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种三价双特异性抗体，其制备方法及用途
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
ES2831379T3 (es) 2003-10-09 2021-06-08 Ambrx Inc Derivados poliméricos para la modificación selectiva de proteínas
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
ZA200603619B (en) 2003-11-06 2008-10-29 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005051976A2 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Ansata Therapeutics, Inc. Protein and peptide ligation processes and one-step purification processes
CA2494571C (en) 2003-12-02 2010-02-09 F.Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides containing molecular rods
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
PT1718677E (pt) 2003-12-19 2012-07-18 Genentech Inc Fragmentos de anticorpo monovalentes úteis como agentes terapêuticos
US8778880B2 (en) 2004-02-02 2014-07-15 Ambrx, Inc. Human growth hormone modified at position 35
US7705150B2 (en) 2004-02-04 2010-04-27 Biosearch Technologies, Inc. Cyanine dyes
WO2005075514A2 (en) 2004-03-10 2005-08-18 Lonza Ltd. Method for producing antibodies
CA2561533C (en) 2004-04-13 2015-06-16 Yvo Graus Anti-p-selectin antibodies
WO2006020258A2 (en) 2004-07-17 2006-02-23 Imclone Systems Incorporated Novel tetravalent bispecific antibody
AU2005285347A1 (en) 2004-08-19 2006-03-23 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ZA200701783B (en) 2004-09-02 2009-10-28 Genentech Inc Anti-Fc-gamma RIIB receptor antibody and uses therefor
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
CN101137758B (zh) 2004-11-03 2012-10-10 意力速分子诊断股份有限公司 均相分析物检测
US7632497B2 (en) 2004-11-10 2009-12-15 Macrogenics, Inc. Engineering Fc Antibody regions to confer effector function
AU2005319382B2 (en) 2004-12-21 2011-04-07 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
WO2006082515A2 (en) 2005-02-07 2006-08-10 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind egfr, vectors encoding same, and uses thereof
JP2008531557A (ja) 2005-02-23 2008-08-14 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド 生物活性を調節するための二重特異性結合剤
EP1858914B1 (en) 2005-02-24 2013-12-04 The University Of Queensland Peptide networks
WO2006093794A1 (en) 2005-02-28 2006-09-08 Centocor, Inc. Heterodimeric protein binding compositions
ES2592271T3 (es) 2005-03-31 2016-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos
TW200720289A (en) 2005-04-01 2007-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against CCR5 and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9296816B2 (en) 2005-04-15 2016-03-29 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
WO2006114700A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Bioren, Inc. Method of producing human igg antibodies with enhanced effector functions
WO2006116260A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Medimmune, Inc. Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
US7795009B2 (en) 2005-06-15 2010-09-14 Saint Louis University Three-component biosensors for detecting macromolecules and other analytes
US8008453B2 (en) 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CN101370525B (zh) 2005-08-19 2013-09-18 Abbvie公司 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
BRPI0615397B1 (pt) 2005-08-26 2023-10-03 Roche Glycart Ag Anticorpo anti-cd20, composição farmacêutica que o contém e uso do mesmo
AU2006294554B2 (en) 2005-09-26 2013-03-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Antibody-drug conjugates and methods of use
US8142781B2 (en) 2005-10-07 2012-03-27 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
US7666622B2 (en) 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
ES2332139T3 (es) 2005-11-23 2010-01-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Polinucleotidos con mimetico de fosfato.
KR101371773B1 (ko) 2005-12-15 2014-03-07 아스트라제네카 아베 암 치료를 위한, 안지오포이에틴-2 길항자와 ｖｅｇｆ-ａ,ｋｄｒ 및/또는 ｆｌｔ1 길항자의 조합물
FR2894959B1 (fr) 2005-12-15 2008-02-29 Galderma Res & Dev Derives biphenyliques agonistes selectifs du recepteur rar-gamma
US20100266620A1 (en) 2006-01-20 2010-10-21 Le Sun Immunoconjugates for treatment of infectious diseases
GB0601513D0 (en) * 2006-01-25 2006-03-08 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules 3
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
EP1986684A2 (en) 2006-02-15 2008-11-05 ImClone Systems Incorporated Functional antibodies
GEP20135917B (en) 2006-03-17 2013-09-10 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
EP1996236A2 (en) 2006-03-22 2008-12-03 National Institute of Immunology Novel bioconjugates as therapeutic agent and synthesis thereof
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
AU2007241729A1 (en) 2006-04-21 2007-11-01 Peoplebio, Inc. Method for differentially detecting multimeric form from monomeric form of multimer-forming polypeptides through three-dimensional interactions
US20070274985A1 (en) 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
KR20090024241A (ko) 2006-06-06 2009-03-06 올레그 일리치 엡쉬테인 비만, 당뇨병 및 내당능 장애 관련 질병 치료용 약제
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
WO2008005828A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Novo Nordisk A/S PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE COMPOSITIONS COMPRISING ANTIBODY MOLECULES SPECIFIC TO LAMININ-5 α3 CHAIN DOMAINS G1G2 AND USE THEREOF
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
US8759297B2 (en) 2006-08-18 2014-06-24 Armagen Technologies, Inc. Genetically encoded multifunctional compositions bidirectionally transported between peripheral blood and the cns
EP2061901A2 (en) 2006-10-31 2009-05-27 Noxxon Pharma AG Methods for detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule
CN101205255A (zh) 2006-12-14 2008-06-25 上海中信国健药业有限公司 抗cd20四价抗体、其制备方法和应用
BRPI0720552A2 (pt) 2006-12-19 2014-01-07 Genentech Inc Antagonistas específicos de vegf para terapia adjuvante e neoadjuvante e o tratamento de tumores em estágio precoce
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
CN101037671B (zh) 2007-02-14 2010-07-07 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 杂交瘤细胞株及其产生的抗人红细胞表面h抗原的单克隆抗体
SG178789A1 (en) 2007-02-16 2012-03-29 Merrimack Pharmaceuticals Inc Antibodies against erbb3 and uses thereof
US10259860B2 (en) 2007-02-27 2019-04-16 Aprogen Inc. Fusion proteins binding to VEGF and angiopoietin
EP2156186A4 (en) 2007-05-03 2010-11-03 Tethys Bioscience Inc BINDING REAGENTS WITH SMALL EPITOP BINDING MOLECULES
NZ581395A (en) 2007-05-14 2012-08-31 Biogen Idec Inc Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto
CA2855098C (en) 2007-06-18 2018-02-27 Merck Sharp & Dohme B.V. Antibodies to human programmed death receptor pd-1
EP2014680A1 (en) 2007-07-10 2009-01-14 Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Recombinant, single-chain, trivalent tri-specific or bi-specific antibody derivatives
CA2694488A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
US20110245409A1 (en) 2007-08-15 2011-10-06 Hood David K Polyvinylamide Polymers Containing Polymerizable Functionalities
WO2009021754A2 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Monospecific and multispecific antibodies and method of use
DE102007038753A1 (de) 2007-08-16 2009-02-19 Giesecke & Devrient Gmbh Vorrichtung und Verfahren für die Kalibrierung eines Sensorsystems
CN101842116A (zh) 2007-08-28 2010-09-22 比奥根艾迪克Ma公司 结合igf-1r多个表位的组合物
US9217011B2 (en) 2007-09-07 2015-12-22 Complix Nv Non-natural proteinaceous scaffold made of three non-covalently associated peptides
WO2009037659A2 (en) 2007-09-17 2009-03-26 Stroemberg Mattias Magnetic detection of small entities
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US20090117105A1 (en) 2007-11-01 2009-05-07 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of National Defence Humanized anti-venezuelan equine encephalitis virus recombinant antibody
US20090181037A1 (en) 2007-11-02 2009-07-16 George Heavner Semi-Synthetic GLP-1 Peptide-FC Fusion Constructs, Methods and Uses
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
ES2774337T3 (es) 2008-01-07 2020-07-20 Amgen Inc Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática
JP2009181819A (ja) 2008-01-31 2009-08-13 Hitachi High-Technologies Corp 荷電粒子線装置
US11260133B2 (en) 2008-02-21 2022-03-01 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods and compositions related to peptides and proteins with C-terminal elements
JP4438875B2 (ja) 2008-02-27 2010-03-24 三菱自動車工業株式会社 車両の貯蔵燃料量推定装置
WO2009126944A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
MX2011003133A (es) * 2008-09-26 2011-04-21 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-egfr/anti-igf-1r.
PT2334705T (pt) 2008-09-26 2017-03-22 Ucb Biopharma Sprl Produtos biológicos
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CN110317272A (zh) 2008-10-14 2019-10-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 免疫球蛋白变体及其用途
US20100233079A1 (en) 2008-12-04 2010-09-16 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
US8940501B2 (en) 2009-01-30 2015-01-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
AU2010230563A1 (en) 2009-04-02 2011-09-22 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain Fab fragments
WO2010112194A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them
US20100256340A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
BRPI1014449A2 (pt) 2009-04-07 2017-06-27 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos anti-erbb-2/ anti-c-met.
DE102009016373A1 (de) 2009-04-07 2010-10-21 V. KRÜTTEN MEDIZINISCHE EINMALGERÄTE GmbH Verbindungsstück für den Sondenschlauch einer enteralen Ernährungssonde und Anordnung aus einer enteralen Ernährungssonde und einem enteralen Überleitsystem
EP2417159A1 (en) 2009-04-07 2012-02-15 Roche Glycart AG Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
EP2419120A4 (en) 2009-04-08 2016-01-06 Univ California HUMAN PROTEIN CONCERNS WITH CONTROLLED SERUM PHARMACOKINETICS
JP2012525149A (ja) 2009-04-27 2012-10-22 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ヘテロ多量体分子を作製するための方法
MX2011011925A (es) * 2009-05-27 2011-12-06 Hoffmann La Roche Anticuerpos triespecificos o tetraespecificos.
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
CA2766608C (en) * 2009-07-06 2018-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Bi-specific digoxigenin binding antibodies
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
NZ701769A (en) 2009-09-16 2016-06-24 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
EP2483310B1 (en) 2009-09-29 2014-08-13 Roche Glycart AG Bispecific death receptor agonistic antibodies
CN105693861A (zh) 2009-12-29 2016-06-22 新兴产品开发西雅图有限公司 异二聚体结合蛋白及其应用
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
TWI586806B (zh) 2010-04-23 2017-06-11 建南德克公司 異多聚體蛋白質之製造
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
AU2011274423B2 (en) 2010-07-09 2016-02-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
KR101612999B1 (ko) 2010-08-24 2016-04-15 로슈 글리카트 아게 활성화가능 이중특이적 항체
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
ES2631356T3 (es) 2010-11-30 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticuerpos anti-receptor de transferrina de baja afinidad y su uso para transferir scFv terapéuticos a través de la barrera hematoencefálica
CN103429737B (zh) 2010-11-30 2020-07-14 中外制药株式会社 细胞毒诱导治疗剂
CN103384831B (zh) 2010-12-23 2016-02-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过二价结合剂来检测多肽二聚体
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
WO2012085113A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Roche Diagnostics Gmbh Binding agent
CA2825081A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Birgit Bossenmaier Antigen binding proteins
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
NZ608724A (en) 2011-03-25 2015-12-24 Glenmark Pharmaceuticals Sa Hetero-dimeric immunoglobulins
BR112013026423A2 (pt) 2011-04-20 2016-11-29 Roche Glycart Ag método e construtos para a passagem de pendente do ph da barreira sangue-cérebro
EP2726494B1 (en) 2011-06-28 2017-01-04 Whitehead Institute For Biomedical Research Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation
WO2013006544A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Medimmune, Llc Methods for making multimeric polypeptides
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
UA116192C2 (uk) 2011-08-23 2018-02-26 Рош Глікарт Аг Активуюча т-клітини біоспецифічна антигензв'язуюча молекула
LT2748202T (lt) 2011-08-23 2018-09-25 Roche Glycart Ag Bispecifinės antigeną surišančios molekulės
KR101723273B1 (ko) 2011-08-23 2017-04-04 로슈 글리카트 아게 2 개의 ｆａｂ 단편을 포함하는 fc-부재 항체 및 이용 방법
US9527927B2 (en) 2011-12-20 2016-12-27 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
RU2612910C2 (ru) 2011-12-21 2017-03-13 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Быстрый способ клонирования и экспрессии сегментов гена родственной вариабельной области антитела
MX2014009565A (es) 2012-02-10 2014-11-10 Genentech Inc Anticuerpos monocatenarios y otros heteromultimeros.
EA035344B1 (ru) 2012-04-20 2020-05-29 Мерюс Н.В. Способ получения двух антител из одной клетки-хозяина
RU2014149681A (ru) * 2012-05-24 2016-07-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела с множественной специфичностью
KR20150023889A (ko) 2012-06-27 2015-03-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 2 개 이상의 상이한 결합 단위를 함유하는 맞춤-제작된 고도로 선별적이고 다중-특이적인 표적화 단위의 선별 및 제조 방법 및 이의 용도
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
MX2014014065A (es) 2012-06-27 2015-02-04 Hoffmann La Roche Metodo para la seleccion y produccion de moleculas terapeuticas hechas a la medida, selectivas y multiespecificas que comprenden al menos dos diferentes entidades de direccionamiento y usos de las mismas.
US20140154253A1 (en) * 2012-07-13 2014-06-05 Zymeworks Inc. Bispecific Asymmetric Heterodimers Comprising Anti-CD3 Constructs
CN104619715B (zh) 2012-09-14 2018-06-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含至少两个不同实体的分子的生产和选择方法及其用途
IN2015MN00139A (ja) 2012-09-25 2015-10-16 Glenmark Pharmaceuticals Sa
EP2970485A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 Merck Patent GmbH Tetravalent bispecific antibodies
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
CA2932547C (en) 2014-01-06 2023-05-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent blood brain barrier shuttle modules
WO2016016299A1 (en) 2014-07-29 2016-02-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
BR112017006468A2 (pt) 2014-10-08 2017-12-19 Hoffmann La Roche anticorpo biespecífico, composição farmacêutica, kit, uso de uma combinação de um anticorpo biespecífico e método de tratamento de câncer
ES2850325T3 (es) 2014-10-09 2021-08-27 Engmab Sarl Anticuerpos biespecíficos contra CD3epsilon y ROR1
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
EP3356420B1 (en) 2015-10-02 2023-11-01 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific antibodies
AU2018358904A1 (en) * 2017-11-01 2020-04-16 F. Hoffmann-La Roche Ag TriFab-contorsbody
PE20211603A1 (es) * 2018-12-21 2021-08-18 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a cd3
AU2020261250A1 (en) * 2019-04-25 2021-10-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Generation of antibody-derived polypeptides by polypeptide chain exchange
US20210230278A1 (en) * 2019-12-18 2021-07-29 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding to HLA-A2/MAGE-A4
AU2021291011A1 (en) * 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and CD19
TW202216766A (zh) * 2020-06-19 2022-05-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 與ｃｄ３結合之抗體

Also Published As

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