JP2020512836A - 抗pd−l1/抗pd−1天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体およびその調製方法 - Google Patents
抗pd−l1/抗pd−1天然抗体構造様ヘテロダイマー二重特異性抗体およびその調製方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、天然IgGの構造特性を有し、ミスマッチ重鎖−軽鎖を有さず、PD−L1およびPD−1を同時にブロックすることができる非常に安定なヘテロダイマー二重特異性抗体を提供し、これを調製する方法を提供する。二機能性抗体は、腫瘍細胞上で発現されたPD−L1および免疫細胞上で発現されたPD−1と同時に結合し、それによって非常に有効かつ特異的な殺滅効果、および毒性の低い副作用を同時に発揮する。
a)位置351でのグリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはトリプトファンによる置換、
b)位置366でのロイシン、プロリン、トリプトファンまたはバリンによる置換、
c)位置399でのシステイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニンまたはアラニンによる置換、
d)位置407でのロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニンまたはヒスチジンによる置換、
e)位置409でのシステイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミンまたはアルギニンによる置換。
a)前記第一Fc鎖上のT366LおよびD399Rの置換、前記第二Fc鎖上のL351E、Y407LおよびK409Vの置換、
b)前記第一Fc鎖上のT366LおよびD399Cの置換、前記第二Fc鎖上のL351G、Y407LおよびK409Cの置換、
c)前記第一Fc鎖上のT366LおよびD399Cの置換、前記第二Fc鎖上のL351Y、Y407AおよびK409Pの置換、
d)前記第一Fc鎖上のT366PおよびD399Nの置換、前記第二Fc鎖上のL351V、Y407PおよびK409Sの置換、
e)前記第一Fc鎖上のT366WおよびD399Gの置換、前記第二Fc鎖上のL35lD、Y407PおよびK409Sの置換、
f)前記第一Fc鎖上のT366PおよびD399Iの置換、前記第二Fc鎖上のL351P、Y407FおよびK409Fの置換、
g)前記第一Fc鎖上のT366VおよびD399Tの置換、前記第二Fc鎖上のL351K、Y407TおよびK409Qの置換、
h)前記第一Fc鎖上のT366LおよびD399Aの置換、前記第二Fc鎖上のL351W、Y407HおよびK409Rの置換。
1)宿主細胞において第二の態様による単離されたポリヌクレオチドまたは第三の態様による組換え発現ベクターを別々に発現させるステップと、
2)前記宿主細胞において別々に発現されたタンパク質を還元するステップと、
3)還元されたタンパク質を混合し、次いで混合物を酸化するステップと、を含む、方法に関する。
定義
ヘテロダイマー二重特異性抗体において、「共有結合」とは、二つのFc鎖間、またはいずれか一つのFc鎖と各抗原結合機能領域とを連結させて分子を形成する共有結合を指し、ここで、前記Fc鎖は、第一抗原結合機能領域と一つ以上の共有結合(例えば、ジスルフィド結合)によって連結された第二抗原結合機能領域とを含み、第一Fc鎖および第二Fc鎖は、それぞれ共有結合(イミン結合またはアミド結合など)を介して前記抗原結合機能領域に連結されている。
それぞれ、抗PD−L1抗体の重鎖および軽鎖を含むX0GC発現ベクターを構築し、抗体可変領域の配列は、https://www.drugbank.ca/drugs/DB11595から得た。重鎖定常領域はヒトIgG1由来であった。軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号1として示され、そのアミノ酸配列は配列番号2として示され、軽鎖定常領域のヌクレオチド配列は配列番号3として示され、そのアミノ酸配列は配列番号4として示され、重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号5として示され、そのアミノ酸配列は配列番号6として示され、重鎖定常領域のヌクレオチド配列は配列番号7として示され、そのアミノ酸配列は配列番号8として示される。前記軽鎖可変領域および前記軽鎖定常領域、前記重鎖可変領域および前記重鎖定常領域をそれぞれPCR法によって増幅した。Phusionハイフィテリティ(High−Fidelity)DNAポリメラーゼ(F−530L、NEB,Inc.製)を本願の全てのPCR反応で使用した。PCRプライマーを、相補塩基対合の原則および酵素消化部位の要件にしたがって従来通りに設計した。すべての反応系は、8.9μlのH2O、4μLの5×PhusionハイフィテリティDNAポリメラーゼ緩衝液、4μLの1mM dNTP、1μlの上流プライマー、1μlの下流プライマー、0.1μlのPhusionハイフィテリティDNA ポリメラーゼ、および1μlの鋳型であった。可変領域および定常領域のPCR産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供し、対応するフラグメントを、DNA回収キット(Promega、A9282、以下同様)を使用して回収した。前記可変領域の上流プライマーおよび前記定常領域の下流プライマーを使用して、回収した可変領域フラグメントおよび定常領域フラグメントを鋳型として用いてさらなるPCRを実施した。次に、対応するフラグメントを回収して、軽鎖または重鎖の完全長フラグメントを得た。X0GCベクターおよび完全長フラグメントをEcoRI(NEB、カタログ番号R3101L)およびHindIII(NEB、カタログ番号R3104L)で消化した。酵素消化反応系は、2μLの10×緩衝液3、それぞれ0.5μlのEcoRIおよびHindIII、前記ゲルから回収した3μLの完全長フラグメント、および14.5μLのH2Oであった。酵素消化反応系を37℃で3時間反応させた。酵素消化産物をT4 DNAリガーゼ(NEB、カタログ番号M0202V)(以下同様)でライゲーションさせた。反応系は、2μlの10×リガーゼ緩衝液、0.5μlのリガーゼ、ゲルから回収された3μlの完全長フラグメント、ゲルから回収された3μlのX0GCベクター、および11.5μlのH2Oであった。ライゲーションを室温で12時間実施した。ライゲーションされた産物をE.coli DH5αコンピテント細胞に形質転換させ(Tiangen、CB104、以下同様)、それぞれ真核細胞において抗体重鎖および軽鎖を発現させるために、抗体重鎖および軽鎖の各X0GC発現ベクターを得た。
前記抗体重鎖および軽鎖の各発現ベクターを293F細胞株に同時トランスフェクトした(FreeStyle(商標)293−F細胞、カタログ番号R79007、Invitrogen)、トランスフェクションの前日に、細胞を接種した。トランスフェクション当日に、前記細胞を遠心分離によって収集し、次いで新鮮なFreeStyle(商標)293発現培地(カタログ番号12338001、Gibco)中に200×105細胞/mLの細胞密度で再懸濁させた。プラスミドをトランスフェクション体積にしたがって36.67ug/mLの最終濃度になるように添加し、穏やかに混合した。次に、線状PEI(ポリエチレンイミン、線状、M.W.25000、カタログ番号43896、Alfa Aesar)を55ug/mLの最終濃度になるように添加し、穏やかに混合した。その後、混合物を細胞インキュベータ中に入れ、シェーカー中で120rpm、37℃にて1時間インキュベートした。次いで、前記トランスフェクション体積の19倍の体積の新鮮な培地を添加した。インキュベーションをシェーカー中で、120rpm、37℃にて続けた。5〜6日間トランスフェクトした細胞培養の上清を遠心分離によって収集した。
精製は、4℃でAKTA Explorer100 Protein Purification System(GE Healthcare)およびrProtein A Sepharose Fast Flowアフィニティクロマトグラフィーカラム(16mmLD、22ml、GE Healthcare)を使用して実施した。まず、クロマトグラフィーカラムを移動相A(20mMリン酸ナトリウム緩衝液、150mM塩化ナトリウム、PH7.4)で平衡化した。ベースラインを安定化させたのち、上述の様に処理した細胞上清を5ml/分の流速でロードした。ローディングプロセス後、移動相Aを平衡化のために使用した。その後、5カラム容積の移動相B1(移動相A+0.5Mアルギニン)を、カラムを洗浄するために使用し、そして5カラム容積の移動相B2(100mMクエン酸、PH3.0)を、溶出ピーク、すなわち、関心対象のタンパク質のピークを溶出させて集めるために使用した。溶出ステップのすべてにおいて流速は5ml/分であった。抗PD−L1発現産物の溶出ピークのクロマトグラムを図1に示す。抗PD−1発現産物の溶出ピークはこれと類似している(結果は含まれていない)。表示された溶出ピーク(図示した灰色部分)を収集し、1M酢酸ナトリウム溶液の滴下によってpHをpH5.0に調節した。
抗PD−L1/抗PD−1ヘテロダイマー抗体分子の構造を図3に示す。
単抗原に対するPD−L1/PD−1ヘテロダイマー抗体の結合能力を酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)によって測定した。
二重標的に対して同時に結合することによる細胞結合を誘導するPD−L1/PD−1ヘテロダイマー抗体の活性を、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって高PD−1発現でPD−L1およびCHO/PD−1細胞を発現するHCC827細胞(GenScript、カタログ番号M00529)に関して測定した。
T細胞免疫応答に対するPD−L1/PD−1ヘテロダイマー抗体の調節活性を、混合リンパ球反応(MLR)によって決定した。
ヒトPBMC細胞(Lonza、カタログ番号CC−2702)を復活させ、収集した。前記ヒトPBMC細胞を無血清RPMI1640培地中、5×106/mLの細胞密度で再懸濁させ、細胞培養フラスコ中に接種し、CO2インキュベータ中、37℃にて90分間インキュベートした。培養上清を廃棄し、細胞を懸濁させた後、付着細胞を、100ng/mlのGM−CSF(Beijing Sino Biological Inc.、カタログ番号10015−HNAH)および100ng/mlのIL−4(Beijing Sino Biological Inc.、カタログ番号1l846−HNAE)を添加した完全培地(10%FBSを含むRPMI1640)中で培養した。3日間のインキュベーションの後、培地を交換し、細胞をさらに3日間インキュベートした。次いで、培養培地を、100ng/mlのGM−CSF、100ng/mlのIL−4および20ng/mlのTNF−αを含む前記完全培地(10%FBSを含むRPMI1640)と交換し、前記細胞を1日間インキュベートしてDC細胞を得た。
ヒトPBMC細胞を復活させ、収集し、続いてこのPBMC細胞およびDC細胞を誘導するためのPBMCを異なる個体から誘導した。ヒトT細胞をPan T Cell Separationキット(Miltenyi Biotech、カタログ番号5150414820)の使用説明書に従って分離した。手短に言うと、前記PBMCをPBSで一回洗浄し、そして40μLの分離緩衝液(2mMのEDTA、0.5%のBSAを含むPBS、pH=7.2)あたり107細胞で再懸濁させた(本明細書では、以下、量はすべて107細胞で算出した)。10μLのPan T cell Biotin Antibody Cocktailを添加し、4℃で5分間インキュベートした。その後、30μLの分離緩衝液および20μLのPan T cell MicroBead Cocktailを添加し、4℃で10分間インキュベートした。T細胞はMACS分離カラムを通して得た。
HCC827腫瘍細胞を収集した。HCC827細胞を完全培地(10%FBSを含むRPMI1640)中に5×104/mLの細胞密度で再懸濁させ、96ウェルプレート上にウェルあたり100μL(各ウェル中5×103細胞)で接種した。プレートを、37℃にて3〜4時間、CO2インキュベータ中で3〜4時間インキュベートした。ヒトPBMC細胞(Lonza、カタログ番号CC−2702)を再懸濁させ、収集した。前記PBMCを完全培地(10%FBSを含むRPMI1640)中に2×106/mLの細胞密度で再懸濁させ、エフェクタ細胞の標的細胞に対する比が20:1となるように96ウェルプレート中に50μL/ウェル(ウェルあたり1×105細胞)で添加した。Trop−2/CD3ヘテロダイマー抗体(Beijing Hanmei Pharm.)を1nMの最終濃度で添加した。前記完全培地中で段階希釈したPD−L1/PD−1ヘテロダイマー抗体のサンプルと対照とを添加した。各ウェル中の液体の合計体積は200μLであった。インキュベーションプレートを37℃で3日間インキュベーションするためにCO2インキュベータ中に入れた。インキュベーションの最後に、培養上清および懸濁PBMC細胞を廃棄した。HCC827細胞をPBSで2回洗浄して、残留PBMCを除去した。最後に、100μLの前記完全培地および20μLのMTS発色剤(Promega、カタログ番号G358B)を添加し、2〜3時間インキュベートした。490nmでの吸収をマイクロプレートリーダーで検出した。
Beijing Vitalstar Biotechnology Co. Ltd.から購入した6〜8週令のメスNPG(NOD−PrkdcscidIl2rgnull)マウスを実験材料として使用した。1週間の環境への適応後、5×106のHCC827ヒト肺がん細胞を各マウスの右背部に皮下接種した。腫瘍体積が約100mm3まで成長したら、前記マウスを前記腫瘍体積にしたがって、各グループ6匹の腫瘍保有マウスとなるようにグループ分けした。動物それぞれにビヒクル(PBS)、70nmo1/kgのPD−L1モノクローナル抗体、70nmo1/kgのPD−1モノクローナル抗体、70nmo1/kgのPD−L1モノクローナル抗体+70nmo1/kgのPD−L1モノクローナル抗体との医薬組成物、70nmol/kgの抗PD−L1/抗PD−1ヘテロダイマーを腹腔内注射によって2週間にわたり週2回投与した。投与日から始めて、前記腫瘍体積を週に3回測定した。長径aおよび短径bを測定し、前記腫瘍体積を式:腫瘍体積(mm3)=(a×b2)/2にしたがって算出した。
Claims (28)
- PD−L1と特異的に結合できる第一抗原結合機能領域と、PD−1と特異的に結合できる第二抗原結合機能領域とを含むヘテロダイマー二重特異性抗体であって、前記二重特異性抗体が一つ以上の鎖間ジスルフィド結合によって連結された第一Fc鎖と第二Fc鎖とを含み、前記第一Fc鎖および前記第二Fc鎖はそれぞれPD−L1抗原結合機能領域およびPD−1抗原結合機能領域と共有結合もしくはリンカーによって連結されるか、または、前記第一Fc鎖および前記第二Fc鎖はそれぞれ前記PD−1抗原結合機能領域および前記PD−L1抗原結合機能領域と共有結合もしくはリンカーによって連結され、そして、前記第一Fc鎖および前記第二Fc鎖は、以下の位置で五つのアミノ酸置換、すなわち、
前記第一Fc鎖上の位置366および399のアミノ酸の置換ならびに前記第二Fc鎖上の位置351、407および409のアミノ酸の置換を含み、前記アミノ酸置換を含む前記第一Fc鎖および前記第二Fc鎖は、各々のホモダイマーではなく、互いとヘテロダイマーを形成する傾向があり、前記アミノ酸の位置は、Kabat EUインデックスナンバリングシステムにしたがって番号付けされる、ヘテロダイマー二重特異性抗体。 - 前記第一Fc鎖および前記第二Fc鎖上の前記アミノ酸置換が、以下、
a)位置351でのグリシン、チロシン、バリン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはトリプトファンによる置換、
b)位置366でのロイシン、プロリン、トリプトファンまたはバリンによる置換、
c)位置399でのシステイン、アスパラギン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、トレオニンまたはアラニンによる置換、
d)位置407でのロイシン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニンまたはヒスチジンによる置換、
e)位置409でのシステイン、プロリン、セリン、フェニルアラニン、バリン、グルタミンまたはアルギニンによる置換、
である、請求項1に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。 - 前記アミノ酸置換が、以下、
a)前記第一Fc鎖上のT366LおよびD399Rの置換、前記第二Fc鎖上のL351E、Y407LおよびK409Vの置換、
b)前記第一Fc鎖上のT366LおよびD399Cの置換、前記第二Fc鎖上のL351G、Y407LおよびK409Cの置換、
c)前記第一Fc鎖上のT366LおよびD399Cの置換、前記第二Fc鎖上のL351Y、Y407AおよびK409Pの置換、
d)前記第一Fc鎖上のT366PおよびD399Nの置換、前記第二Fc鎖上のL351V、Y407PおよびK409Sの置換、
e)前記第一Fc鎖上のT366WおよびD399Gの置換、前記第二Fc鎖上のL351D、Y407PおよびK409Sの置換、
f)前記第一Fc鎖上のT366PおよびD399Iの置換、前記第二Fc鎖上のL351P、Y407FおよびK409Fの置換、
g)前記第一Fc鎖上のT366VおよびD399Tの置換、前記第二Fc鎖上のL351K、Y407TおよびK409Qの置換、
h)前記第一Fc鎖上のT366LおよびD399Aの置換、前記第二Fc鎖上のL351W、Y407HおよびK409Rの置換、
を含む、請求項1または2に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。 - 前記第一Fc鎖上の前記アミノ酸置換がT366LおよびD399Rであり、前記第二Fc鎖上の前記アミノ酸置換がL351E、Y407LおよびK409Vである、請求項1に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。
- 前記Fc鎖がIgG由来である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。
- 前記PD−L1抗原結合機能領域および前記PD−1抗原結合機能領域がFabフラグメントまたはscFvフラグメントである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。
- 前記PD−L1抗原結合機能領域および前記PD−1抗原結合機能領域がどちらもFabフラグメントである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。
- 前記PD−L1抗原結合機能領域およびPD−1抗原結合機能領域の一方がFabフラグメントであり、他方がscFvである、請求項1〜6のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。
- 前記Fabフラグメントが異なる第一重鎖可変領域および第二重鎖可変領域と、異なる第一軽鎖可変領域および第二軽鎖可変領域とを含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。
- 前記第一Fc鎖およびそれに連結された前記PD−L1抗原結合機能領域ならびに前記第二Fc鎖およびそれに連結された前記PD−1抗原結合機能領域、または、前記第一Fc鎖およびそれに連結された前記PD−1抗原結合機能領域ならびに前記第二Fc鎖およびそれに連結された前記PD−L1抗原結合機能領域が、還元剤の存在下で単独で存在する場合、50重量%未満の割合でホモダイマーを形成する、請求項1〜9のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体のアミノ酸配列が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、および18からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 前記単離されたポリヌクレオチドの配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15および17からなる群から選択される、請求項12に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項12または13に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクター。
- 前記発現ベクターが、pCDNAに基づく操作によって得られるプラスミドベクターX0GCである、請求項14に記載の組換え発現ベクター。
- 請求項12もしくは13に記載の単離されたポリヌクレオチド、または、請求項14もしくは15に記載の組換え発現ベクター、を含む、宿主細胞。
- ヒト胚腎細胞HEK293またはHEK293T、HEK293F、HEK293EなどのHEK293細胞に基づく操作によって得られる細胞、ハムスター卵巣細胞CHOまたはCHO−S、CHO−dhfr−、CHO/DG44、ExpiCHOなどのCHO細胞に基づく操作によって得られる細胞、Escherichia coliまたはBL21、BL21(DE3)、Rosetta、OrigamiなどのE.coliに基づく操作によって得られる株、酵母またはPichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces cerevisiae、Hansenula polymorphaなどの酵母に基づく操作によって得られる株、昆虫細胞またはHigh5、SF9などの昆虫細胞に基づく操作によって得られる細胞、植物細胞、哺乳類***細胞、体細胞などから選択される、請求項16に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、または、請求項12もしくは13に記載の単離されたポリヌクレオチド、または、請求項14もしくは15に記載の組換え発現ベクター、または、請求項16もしくは17に記載の宿主細胞と、医薬的に許容される担体と、を含む、組成物。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体を産生するための方法であって、
1)宿主細胞において請求項12もしくは13に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項14もしくは15に記載の組換え発現ベクターを別々に発現させるステップと、
2)前記宿主細胞において別々に発現されたタンパク質を還元するステップと、
3)還元されたタンパク質を混合し、次いで混合物を酸化するステップと、を含む、方法 - 前記宿主細胞が、ヒト胚腎細胞HEK293またはHEK293T、HEK293F、HEK293EなどのHEK293細胞に基づいた操作によって得られる細胞、ハムスター卵巣細胞CHOまたはCHO−S、CHO−dhfr−、CHO/DG44、ExpiCHOなどのCHO細胞に基づく操作によって得られる細胞、Escherichia coliまたはBL21、BL21(DE3)、Rosetta、OrigamiなどのE.coliに基づく操作によって得られる株、酵母またはPichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces cerevisiae、Hansenula polymorphaなどの酵母に基づいた操作によって得られる株、昆虫細胞またはHigh5、SF9などの昆虫細胞に基づいた操作によって得られる細胞、植物細胞、哺乳類***細胞、体細胞などから選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記還元するステップが、
1)還元剤が2−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンもしくはその化学誘導体、または、それらの組み合わせからなる群から選択される、還元反応を実施し、
2)前記還元剤を除去することを含む、請求項19または20に記載の方法。 - 前記酸化するステップが空気中の酸化であり、
L−デヒドロアスコルビン酸または他の化学誘導体からなる群から選択される酸化剤の存在下で酸化反応を実施することも含む、請求項19〜21のいずれか一項に記載の方法。 - 分離および精製のステップをさらに含む、請求項19〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 対象において疾患を予防および/または治療するための薬剤の製造における、請求項1〜11のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、および/または、請求項12もしくは13に記載の単離されたポリヌクレオチド、および/または、請求項14もしくは15に記載の組換え発現ベクター、および/または、請求項16もしくは17に記載の宿主細胞、および/または請求項18に記載の組成物の使用。
- 対象における疾患の予防および/または治療のための薬剤として使用するための、請求項1〜11のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、および/または、請求項12もしくは13に記載の単離されたポリヌクレオチド、および/または、請求項14もしくは15に記載の組換え発現ベクター、および/または、請求項16もしくは17に記載の宿主細胞、および/または、請求項18に記載の組成物。
- それを必要とする対象に、請求項1〜11のいずれか一項に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、および/または、請求項12もしくは13に記載の単離されたポリヌクレオチド、および/または、請求項14もしくは15に記載の組換え発現ベクター、および/または、請求項16もしくは17に記載の宿主細胞、および/または、請求項18に記載の組成物を投与することを含む、疾患を予防および/または治療するための方法。
- 前記対象が哺乳類、好ましくはヒト対象である、請求項24に記載の使用、請求項25に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞もしくは組成物、または、請求項26に記載の方法。
- 前記疾患が、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳腫瘍、頭頸部扁平上皮がん、非小細胞肺がん、鼻咽腔がん、食道がん、胃がん、膵臓がん、胆嚢がん、肝臓がん、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、前立腺がん、膀胱がん、腎細胞がん、黒色腫からなる群から選択される腫瘍である、請求項24に記載の使用、請求項25に記載のヘテロダイマー二重特異性抗体、単離されたポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、宿主細胞もしくは組成物、または、請求項26に記載の方法。
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