TW202346353A - 利用結合EGFR及cMET之抗體的治療 - Google Patents

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Abstract

本文揭示之本發明係關於雙特異性抗體，其包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，該雙特異性抗體用於治療主體的癌症之方法，該主體已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑或ii)化學療法及酪胺酸激酶抑制劑或iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療。

Description

利用結合EGFR及cMET之抗體的治療
發明領域
本揭露內容係關於抗體領域。特定言之，其係關於用於治療涉及異常細胞的疾病的治療性抗體領域，包括人類抗體。此外，其係關於結合EGFR及cMET之抗體，包括多特異性抗體，以及其在結合EGFR及cMET陽性細胞，特別係腫瘤細胞中之用途。
發明背景
表皮生長因子(EGF)受體(EGFR)係胞外蛋白配位體之表皮生長因子家族(EGF家族)之成員的細胞表面受體。EGFR亦稱為ErbB-1受體。該受體在過去被賦予了各種名稱(EGFR；ERBB；ERBB1；HER1；PIG61；mENA)。在本揭露內容中，人類中的名稱ErbB-1、EGFR或HER1將可互換使用。EGFR係ErbB受體家族的成員，係以下四種密切相關的受體酪胺酸激酶的亞家族：ErbB-1 (EGFR)、ErbB-2 (HER2/c-neu；Her2)、ErbB-3 (Her 3)及ErbB-4 (Her 4)。
EGFR存在於細胞表面，且可藉由結合其特定配位體(包括表皮生長因子及轉形生長因子α (TGFα))而被活化。在被其生長因子配位體活化後，受體可能經歷自無活性的主要單體形式至活性同二聚體的轉變。除了在配位體結合後形成同二聚體之外，EGFR亦可以與ErbB受體家族的另一成員(諸如ErbB2)配對以產生活化的異二聚體。二聚體亦可能在沒有配位體結合的情況下形成，並且活化的EGFR簇可能在配位體結合後形成。
EGFR二聚化刺激內在的胞內蛋白酪胺酸激酶(PTK)活性。此活性誘導導致細胞增殖及分化的數個信號轉導級聯。EGFR的激酶域可以交叉磷酸化與其複合的其他受體的酪胺酸殘基，並且本身可以該方式被活化。
已在數種類型的癌症中鑑別出涉及EGFR的突變。其係不斷擴大的抗癌療法類別的目標。此類療法包括EGFR酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，諸如吉非替尼(gefitinib)及厄洛替尼(erlotinib)，用於肺癌；以及抗體，如西妥昔單抗(cetuximab)及帕尼單抗(panitumumab)，用於大腸癌及頭頸癌。
西妥昔單抗及帕尼單抗係抑制受體的單株抗體。處於臨床開發中的其他單株抗體有紮妥木單抗(zalutumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)及馬妥珠單抗(matuzumab)。單株抗體旨在阻斷胞外配位體誘導的受體活化，主要係藉由阻斷配位體結合至受體。由於結合位點被阻斷，誘導信號的分子可能無法有效附著，且因此亦無法活化下游信號傳導。配位體誘導的受體活化亦可以藉由穩定無活性受體構形(馬妥珠單抗)來抑制。
迄今為止，隨著時間的推移，EGFR靶向療法與治療抗性的發展有關。已經描述了對EGFR-TKI具有抗性的各種機制。在晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者中，抗性機制包括出現二級或三級突變(例如，T790M、C797S、L718Q、外顯子20***突變)、活化替代性信號傳導(例如，Met、HGF、AXL、Hh、IGF-1R)、異常下游路徑(例如，AKT突變、PTEN損失)、EGFR-TKI介導的細胞凋亡路徑受損(例如，BCL2樣11/BIM缺失多形現象)及組織學轉形。儘管已經確定了一些抗性機制，但其他機制仍有待確定。此外，在第三代TKI抗性機制的情況下，NSCLC的分子異質性影響了對迄今為止發現的廣譜抗性畸變的貢獻。同樣，用EGFR抗體治療的大腸直腸癌患者亦會隨著時間的推移產生抗性。此可能經由KRAS突變的出現而發生。在沒有KRAS突變的彼等患者中；MET原癌基因的擴增可能與抗EGFR療法期間的獲得性抗性相關(Bardelli等人, 2013; Cancer Discov. 6月;3(6):658-73. doi: 10.1158/2159-8290.CD-12-0558)。腫瘤可能自一開始就具有抗性，亦可能在治療過程中產生抗性。在許多EGFR陽性癌症中發現了對EGFR靶向療法的抗性，並且已經證明此項技術中需要更有效的EGFR癌症治療，此等治療提高照護標準，並且在解決EGFR靶向療法抗性方面具有優勢。
MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)及肝細胞生長因子(HGF)的失調已在多種腫瘤中得到報導。已在多種癌症中觀察到配位體驅動的cMET活化。在肺癌、乳癌及多發性骨髓瘤中觀察到升高的血清及腫瘤內HGF (J. M. Siegfried等人, Ann Thorac Surg 66, 1915 (1998)；P. C. Ma等人, Anticancer Res 23, 49 (2003)；B. E. Elliott等人. Can J Physiol Pharmacol 80, 91 (2002)；C. Seidel等人, Med Oncol 15, 145 (1998))。cMET的過表現、cMET擴增或突變已在各種癌症(諸如大腸直腸癌、肺癌、胃癌及腎癌)中得到報導，並且可能驅動配位體非依賴性受體活化(C. Birchmeier等人, Nat Rev Mol Cell Biol 4, 915 (2003)；G. Maulik等人, Cytokine Growth Factor Rev 13, 41 (2002))。HGF的表現亦與HGF/cMET信號傳導路徑的活化有關，且亦係EGFR靶向療法的選擇下腫瘤的逃逸機制之一。此外，用cMET酪胺酸激酶抑制劑(諸如卡馬替尼(capmatinib)或特泊替尼(tepotinib))治療與cMET畸變逃逸機制的出現有關。
cMET受體係藉由將共同的前驅物蛋白水解加工成單次跨膜(single-pass)二硫鍵連接的α/β異二聚體而形成的。cMET的胞外部分由三種域類型構成。N末端區域摺疊形成一個大的信號蛋白(semaphorin) (Sema)域，其包含整個α-次單元及部分β-次單元。叢蛋白-信號蛋白-整聯蛋白(plexin-semaphorin-integrin，PSI)域位於Sema域之後，且包括四個二硫鍵。此域經由四個免疫球蛋白叢蛋白轉錄(IPT)域連接至跨膜螺旋，此等域與免疫球蛋白樣域相關。在胞內，cMET受體含有側接獨特的近膜及羧基末端序列的酪胺酸激酶催化域(Organ及Tsao. Therapeutic advances in medical oncology 3.1_增刊 (2011): S7-S19，其以全文引用的方式併入本文中)。
cMET的配位體、肝細胞生長因子(HGF；亦稱為分散因子)及其剪接同功型(NK1、NK2)係已知的cMET受體配位體。HGF於1991年被鑑定為有效的促***原/形態決定因子。HGF/cMET信號傳導路徑在多種癌症的發展及進展中起著重要作用。人類癌症中HGF或cMET的失調及/或高度活化與預後不良有關。cMET可經由過表現、擴增或突變活化。活化可以促進癌症的發展、進展、侵襲性生長及轉移。cMET可以以與HGF相關及與HGF無關的方式被活化。HGF非依賴性活化發生在cMET過表現的情況下。在沒有配位體的情況下，cMET的豐度亦可能觸發(異)二聚化及胞內信號傳導。額外的配位體似乎不影響此類cMET過表現細胞的功能。cMET擴增與cMET過表現有關，並已成為腫瘤亞型的生物標誌物。
HGF在全身廣泛表現，表明此種生長因子係一種全身可用的細胞因子，並且來自腫瘤基質。cMET活化的正旁分泌及/或自分泌環可導致進一步的cMET表現。HGF特異性抗體利妥木單抗(Rilotumumab) (AMG102)係為胃癌開發的。I期及II期試驗看起來很有希望，但在資料監測委員會對研究20070622進行預先計劃的安全性審查後，一項以順鉑(cisplatin)及卡培他濱(capecitabine)作為胃癌第一線療法的III期研究(RILOMET-2)被終止。
cMET/HGF信號傳導在對EGFR靶向療法之抗性中的相關性刺激了應對該抗性之方法的發展。迄今為止，基於抗體之方法包括抗HGF抗體；抗cMET或cMET抗體及cMET/EGFR(綜述於Lee等人, 2015; Immunotargets and Therapy 4: 35-44)尚未在臨床上有效。cMET抗體奧那妥組單抗(Onartuzumab) (MetMab TM)及依瑪妥珠單抗(Emibetuzumab) (LY-2875358)已在II期臨床試驗中進行了評估。其中，奧那妥組單抗在與EGFR抑制劑厄洛替尼組合治療時似乎對大腸直腸癌有效。然而，此等結果不能在隨機III期臨床試驗中重複。MetMAb係一種針對cMET的單價單株抗體(mAb)，可阻斷HGF與cMET的結合以及隨後的路徑活化(Jin等人, 2008 Cancer Research 第68卷: 第4360-68頁)。
克服抗EGFR、cMET及HGF免疫療法的問題，本揭露內容提供了新的雙特異性抗體，其包含可以結合表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合cMET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域。
迄今為止，此項技術中已經描述了某些雙特異性EGFR×cMET抗體。Castoldi R.等人 (2013)描述了一種名為MetHer1的雙特異性EGFR×cMET抗體，具有抗體5D5 (或MetMab)的cMET結合位點及西妥昔單抗的EGFR結合位點。該雙特異性抗體具有2:1的固定EGFR及cMET結合化學計量(參見增補圖)。
US20140378664描述了cMET×EGFR雙特異性抗體以及多種其他雙特異性抗體。完整的雙特異性抗體作為單一蛋白質產生，隨後被蛋白水解裂解。二個VH/VL域作為單鏈Fv片段產生。抗體的結合在胃癌細胞株中誘導cMET降解及Akt磷酸化。Moores等人 (2016)描述了一種名為JNJ-61186372的雙特異性cMET×EGFR抗體，該抗體藉由受控Fab臂交換(cFAE)產生，根據EU編號在位置405及409具有突變，可能具有免疫原性潛力。使用具有表現cMET配位體HGF的腫瘤細胞株H1975的異種移植模型顯示JNJ-61186372在活體內具有活性。已知此腫瘤模型依賴於抗體的ADCC活性(Ahmed等人, 2015年)。據報導，JNJ-61186372對cMET的親和力失衡與EGFR相比高約40倍(Moores等人 (2016))，並且已知源自紮妥木單抗的抗EGFR臂會引起輸注相關反應、皮膚病症等問題。
LY3164530係一種雙特異性cMET×EGFR抗體，其包含西妥昔單抗之EGFR結合域作為單鏈Fv片段，該片段融合至cMET結合抗體LY2875358 (依瑪妥珠單抗；Kim及Kim2017)之重鏈可變域上。其係一種所謂的雙可變域抗體，包含針對各種抗原的二個結合位點。沒有提供關於該抗體之HGF抑制的資料。據報導，該抗體在沒有促效活性的情況下結合並內化cMET及EGFR。作者回顧了各種cMET、EGFR及cMET×EGFR靶向療法，得出的結論係，迄今為止，此等抑制劑均未在臨床試驗中顯示出顯著功效。
因此，需要新的雙特異性cMET×EGFR抗體，包括彼等可能具有如本文所描述之優異特徵之抗體。
發明概要
在某些態樣中，本揭露內容提供了一種雙特異性抗體，其包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，該雙特異性抗體用於治療已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症之方法。
在某些態樣中，本揭露內容提供了一種雙特異性抗體，其包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，該雙特異性抗體用於治療已經接受過ii)化學療法及酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症之方法。
在某些態樣中，本揭露內容提供了一種雙特異性抗體，其包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，該雙特異性抗體用於治療已經接受過iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症之方法。
在某些態樣中，本揭露內容提供了一種雙特異性抗體，其包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，該雙特異性抗體用於治療iv)未曾接受過先前抗癌治療的主體的癌症之方法。在某些態樣中，該癌症包含cMET外顯子14跳躍突變。
在某些態樣中，本揭露內容提供了治療已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症，該治療包含向主體投予有效量之根據本揭露內容之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域。
在某些態樣中，本揭露內容提供了治療已經接受過ii)化學療法及EGFR酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症，該治療包含向主體投予有效量之根據本揭露內容之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域。
在某些態樣中，本揭露內容提供了治療已經接受過iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症，該治療包含向主體投予有效量之根據本揭露內容之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域。
在某些態樣中，本揭露內容提供了治療iv)未曾接受過任何先前抗癌治療的主體的癌症，該治療包含向主體投予有效量之根據本揭露內容之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域。在某些態樣中，該癌症包含cMET外顯子14跳躍突變。
在某些態樣中，本揭露內容提供了根據本揭露內容之雙特異性抗體之用途，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合(bind) (或結合(binds))人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，該雙特異性抗體用於製造供治療已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症用的藥物。
在某些態樣中，本揭露內容提供了根據本揭露內容之雙特異性抗體之用途，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合(bind) (或結合(binds))人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，該雙特異性抗體用於製造供治療已經接受過ii)化學療法及EGFR酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症用的藥物。
在某些態樣中，本揭露內容提供了根據本揭露內容之雙特異性抗體之用途，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合(bind) (或結合(binds))人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，該雙特異性抗體用於製造供治療已經接受過iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症用的藥物。
在某些態樣中，本揭露內容提供了根據本揭露內容之雙特異性抗體之用途，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合(bind) (或結合(binds))人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，該雙特異性抗體用於製造供治療v)未曾接受過任何先前抗癌治療的主體的癌症用的藥物。在某些態樣中，該癌症包含cMET外顯子14跳躍突變。
在某些態樣中，癌症係EGFR陽性癌症、cMET陽性癌症或EGFR及cMET陽性癌症。在某些態樣中，癌症包含EGFR畸變、cMET畸變或EGFR及cMET畸變。
在某些態樣中，已經接受過包含根據i)的第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑的先前治療的主體或癌症對第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。
在某些態樣中，已經接受過包含根據ii)的化學療法及EGFR酪胺酸激酶抑制劑的先前治療的主體或癌症對第一代、第二代及/或第三代酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。
在某些態樣中，已經接受過包含根據iii)的cMET酪胺酸激酶抑制劑的先前治療的主體或癌症對cMET酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。
在某些態樣中，在第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑的治療之後，根據i)的該雙特異性抗體的投予係作為第二線治療投予。
在某些態樣中，在化學療法及EGFR酪胺酸激酶抑制劑的治療之後，根據ii)的該雙特異性抗體的投予係作為第三線治療投予。
在某些態樣中，在cMET酪胺酸激酶抑制劑的治療之後，根據iii)的該雙特異性抗體的投予係作為第二線治療投予。
在某些態樣中，該癌症或主體已經接受過第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑的先前治療及/或該癌症或主體對第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。較佳的是，該主體包含賦予對該第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑抗性的EGFR畸變、cMET畸變或EGFR及cMET畸變。在某些態樣中，該第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑包含或係奧希替尼(Osimertinib)。
在某些態樣中，該癌症或主體已經接受過化學療法及第一代或第二代或第三代酪胺酸激酶抑制劑的先前治療。在某些態樣中，該癌症或主體對第一代或第二代或第三代酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性，或對第一代或第二代酪胺酸激酶抑制劑具有抗性，或對第一代、第二代及第三代酪胺酸激酶抑制劑具有抗性。在某些態樣中，該主體包含賦予對該第一代、第二代或第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑抗性的EGFR畸變、或cMET畸變或EGFR及cMET畸變。
在某些態樣中，該癌症或主體已經接受過cMET酪胺酸激酶抑制劑的先前治療，及/或該癌症或主體對該cMET酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。在某些態樣中，該主體包含賦予對該cMET酪胺酸激酶抑制劑的抗性的cMET畸變。在某些態樣中，該cMET抑制劑包含卡馬替尼或特泊替尼。
在某些態樣中，該主體包含賦予對該第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑的抗性的EGFR及/或cMET畸變。在某些態樣中，該第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑包含或係奧希替尼。
在某些態樣中，作為先前治療提供的第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑包含或係奧希替尼、拉澤替尼(Lazertinib)、阿氟替尼(Alflutinib)、瑞齊替尼(Rezivertinib)、羅西替尼(Rociletinib)、奧穆替尼(Olmutinib)、阿美替尼(Almonertinib)、阿比維替尼(Abivertinib)、ASK120067、貝福替尼(Befotertinib) (亦稱為BPI-D0316或D-0316)、SH-1028、那紮替尼(Nazartinib) (EGF816)、萘闊替尼(Naquotinib) (ASP8273)、馬維替尼(Mavelertinib) (PF-0647775)、奧拉非替尼(Olafertinib) (CK-101)、克耐替尼(Keynatinib)、ES-072，在某些態樣中為奧希替尼。在某些態樣中，該EGFR酪胺酸激酶抑制劑係奧希替尼、BPI-D0316/貝福替尼、拉澤替尼或阿美替尼。
在某些態樣中，作為該化學療法的先前治療提供的該第一代EGFR酪胺酸激酶抑制劑包含或係吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)或埃克替尼(icotinib)。
在某些態樣中，作為先前治療提供的該第二代酪胺酸激酶抑制劑包含或係阿法替尼(afatinib)、達克替尼(dacomitinib)、XL647、AP26113、CO-1686或來那替尼(neratinib)。
在某些態樣中，作為先前治療提供的該cMET酪胺酸激酶抑制劑係或包含卡馬替尼、特泊替尼、克唑替尼(crizotenib)、卡博替尼(cabozantinib)、賽沃替尼(savolitinib)、格列沙替尼(Glesatinib)、斯塔瓦替尼(Sitravatinib)、BMS-777607、梅沙替尼(Merestinib)、替凡替尼(Tivantinib)、戈伐替尼(Golvatinib)、福瑞替尼(Foretinib)、AMG-337或BMS-794833。
在某些態樣中，該先前接受的化學療法包含以鉑為主的化學療法、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、長春瑞濱(vinorelbine)、依託泊苷(etoposide)或培美曲塞(pemetrexed)，或其任何組合，在某些態樣中，包含順鉑或卡鉑之組合。
在某些態樣中，主體係人類主體。
在某些態樣中，該癌症係非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸癌，特別係頭頸鱗狀細胞癌；胃癌，特別係胃腺癌；或食道癌，特別係食道鱗狀細胞癌；胃/食道交界處癌、乳癌、大腸癌、胰臟癌、卵巢癌、大腸直腸癌或膀胱癌。在某些態樣中，該癌症或主體包含活化EGFR突變、批准的酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、三級酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、減少第三代酪胺酸激酶抑制劑與EGFR之結合的突變、獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、EGFR基因擴增、cMET突變、cMET畸變或增加的HGF表現。
在某些態樣中，該癌症或主體包含同框EGFR外顯子20***突變。
在某些態樣中，癌症包含cMET畸變，諸如cMET擴增、cMET過表現、增加的cMET路徑信號傳導、cMET基因擴增及/或增加的cMET蛋白活性。在某些態樣中，該癌症包含增加的HGF表現。在某些態樣中，該癌症包含cMET外顯子14跳躍突變。
在某些態樣中，cMET失調包含cMET擴增、cMET過表現、增加的cMET路徑的信號傳導、cMET基因擴增或增加的cMET蛋白活性或由增加的HGF表現引起的cMET失調。在某些態樣中，該cMET畸變包含cMET外顯子14跳躍突變。cMET失調在某些態樣中係或包含cMET信號傳導的失調。
在某些態樣中，使用或治療包含向主體提供劑量為1000、1500或2000 mg的雙特異性抗體。在某些態樣中，該雙特異性抗體每週提供一次或每二週提供一次。在某些態樣中，使用或治療包含每二週一次向主體提供1500 mg劑量的雙特異性抗體。
在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體表現出ADCC活性，在某些態樣中，該抗體具有改善的ADCC活性。在此類態樣中，抗體可以藉由一或多個CH2突變而具有改變的ADCC活性。因此進一步提供了根據本揭露內容之雙特異性抗體，其係無岩藻醣基化的。在某些態樣中，本揭露內容之抗體包含二個無岩藻醣基化的CH2域。在某些態樣中，本揭露內容之抗體包含總共二個CH2域，其均係無岩藻醣基化的。在某些態樣中，本揭露內容之抗體包含二個CH2域，其均係無岩藻醣基化的。
在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體表現出ADCP活性，在某些態樣中，該抗體具有改善的ADCP活性。在某些態樣中，EGFR及cMET結合臂，或包含EGFR及cMET結合臂的重鏈均對ADCP有貢獻。在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體具有或表現出針對NSCLC細胞的ADCP活性。在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體誘導NSCLC細胞的ADCP。
雙特異性抗體可以包含共同的輕鏈。在某些態樣中，第一及第二可變域包含相同或基本上相同的(共同的)輕鏈可變區。該共同的輕鏈可變區可以係已知與已經歷重組的多種人類可變區基因區段良好配對的可變區。在某些態樣中，該共同的輕鏈係由生殖系Vk基因區段編碼的可變區，諸如O12/IgVκ1-39*01可變區基因區段。較佳的輕鏈可變區包含重排的IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。cMET結合臂的輕鏈及EGFR結合臂的輕鏈在某些態樣中係相同的(共同的)輕鏈。在某些態樣中，共同的輕鏈係接合至人類輕鏈恆定區的重排的κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。雙特異性抗體可以係人類抗體。雙特異性抗體可以係全長抗體。其可能具有一個可以結合EGFR的可變域及一個可以結合cMET的可變域。在某些態樣中，可以結合人類EGFR的可變域亦可以有利地結合小鼠EGFR及/或食蟹獼猴EGFR。在某些態樣中，結合或可以結合人類EGFR的可變域結合至人類EGFR的域III。可以結合cMET的可變域可以阻斷抗體5D5與cMET的結合。可以結合cMET的可變域可以阻斷HGF與cMET的結合。抗體對cMET的Kd可以比抗體對EGFR的Kd小至少10倍。一個CH3域中位置405及409的胺基酸可以與另一CH3域中相應位置的胺基酸相同(EU編號)。
在某些態樣中，本揭露內容之抗體包含第一可變域，該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYX 1X 2NTNYAQKLQG及包含序列X 3X 4X 5X 6HWWLX 7A的CDR3 其中X 1=N或S；X 2=A或G；X 3=D或G；X 4=R、S或Y；X 5=H、L或Y；X 6=D或W且X 7=D或G；在X 1-X 7以外的位置具有0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
在某些態樣中，本揭露內容之抗體包含第二可變域，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 1-23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，或0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
描述雙特異性抗體，其中 X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=N；X 2=G；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G； X 1=N；X 2=A；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G；或 X 1=S；X 2=G；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G。
在某些態樣中，X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D；或X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D；或X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D。
在某些態樣中，X 3-X 7=DRHWD並且X 1及X 2係NG；SG或NA。
描述了雙特異性抗體，其中第二可變域的重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1-3；7；8；10；13；15；16；17；21；22或23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，或0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。本揭露內容之一個優點係在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體顯示比埃萬妥單抗(amivantamab)更強效的ADCC活性，尤其係對於包含cMET畸變的細胞或癌症。
本揭露內容亦提供了一種治療患有腫瘤的主體之方法，該方法包含向有需要之個體投予如本文所描述之雙特異性抗體。通常，個體係患有涉及異常細胞的疾病的個體，例如個體可能患有腫瘤或癌症。
本揭露內容亦提供了雙特異性抗體，其包含可以結合表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYX 1X 2NTNYAQKLQG及包含序列X 3X 4X 5X 6HWWLX 7A的CDR3，其中 X 1=N或S；X 2=A或G；X 3=D或G；X 4=R、S或Y；X 5=H、L或Y；X 6=D或W且X 7=D或G，在X 1-X 7以外的位置具有0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 1-23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，或0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
在某些態樣中，第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYNGNTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDAFDY的CDR3，並且在某些態樣中，第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYSMN；CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及CDR3序列ETYYYDRGGYPFDP。
本揭露內容亦提供了雙特異性抗體，用於治療患有涉及異常細胞的疾病(諸如腫瘤)的主體。
亦提供了本揭露內容之雙特異性抗體在製造供治療已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑或ii)化學療法及EGFR酪胺酸激酶抑制劑或iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑的先前治療的主體的涉及異常細胞的疾病(諸如腫瘤或癌症)用的藥物中之用途。
本揭露內容之抗體抑制HGF及EGF/HGF誘導的癌症生長，該癌症已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑或ii)化學療法及EGFR酪胺酸激酶抑制劑或iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑的先前治療
在某些態樣中，本揭露內容之抗體抑制HGF誘導的人類主體的HGF反應性細胞，在某些態樣中EGFR TKI抗性或難治性腫瘤、腫瘤模型或細胞株的生長，諸如包括以下的細胞株或模型：活化EGFR突變、批准的酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、三級酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、減少第三代酪胺酸激酶抑制劑與EGFR之結合的突變、獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、EGFR基因擴增、cMET突變或cMET畸變，在某些態樣中同框外顯子20***突變。在某些態樣中，在HGF存在下顯示出抑制。
在某些態樣中，本揭露內容之抗體抑制HGF誘導的人類主體的HGF反應性細胞(在某些態樣中腫瘤)、腫瘤模型或細胞株的生長，該腫瘤模型或細胞株包含：活化EGFR突變、批准的酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、三級酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、減少第三代酪胺酸激酶抑制劑與EGFR之結合的突變、獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、EGFR基因擴增、cMET突變、cMET畸變或同框外顯子20***突變。在某些態樣中，在HGF存在下顯示出抑制。
本揭露內容之抗體抑制EGF誘導的EGF反應性細胞的生長，而不誘導與高親和力二價EGFR抗體相關的毒性，諸如皮疹及腹瀉。此使得該抗體非常適合與具有自身毒性概況之TKI組合使用。
本揭露內容之抗體可以用於治療對EGFR酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性的腫瘤，例如對奧希替尼、厄洛替尼、吉非替尼或阿法替尼、奧希替尼、厄洛替尼、吉非替尼或阿法替尼的類似物或一或多種相應化合物及/或其類似物的組合具有抗性或難治性的腫瘤。
本揭露內容進一步包含單獨或一起編碼本文揭示之雙特異性抗體或其變體的重鏈或重鏈可變區的核酸分子或一組核酸分子。亦提供了編碼本文揭示之抗體的核酸分子或核酸分子組。
在某些態樣中，重鏈包含IgG1抗體，在某些態樣中人類IgG1抗體的恆定區。可以對該IgG1恆定區的CH2區進行工程化以改變或不改變抗體的ADCC及/或CDC活性。在某些態樣中，該改變導致增強的ADCC及/或CDC活性。在某些態樣中，抗體的CH3區經工程化以促進包含結合EGFR的第一重鏈及結合cMET的第二重鏈的重鏈之異二聚化。
本揭露內容進一步包含一種包含一或多種單獨或一起編碼本文揭示之雙特異性抗體或其變體之核酸分子的細胞。亦提供了使用如所描述之細胞產生本文揭示之雙特異性抗體或其變體之方法，在某些態樣中與自細胞培養物中收穫之雙特異性抗體或其變體一起。
本揭露內容進一步包含一種包含本文揭示之雙特異性抗體或其變體的細胞系統。
本揭露內容亦提供了表現雙特異性抗體及/或包含編碼該雙特異性抗體的(多種)核酸分子的細胞。
本揭露內容進一步包含如本文所揭示之雙特異性抗體，該雙特異性抗體進一步包含標記，在某些態樣中，包括用於活體內成像的標記。 本發明之詳細說明
EGFR係四種受體酪胺酸激酶(RTK)家族的成員，命名為Her-或cErbB-1、-2、-3及-4。EGFR具有由四個子域組成的胞外域(ECD)，其中二個子域參與配位體結合，且其中一個子域參與同二聚化及異二聚化Ferguson (2008)。本章節中使用的參考編號係指標題為「說明書中引用」的清單中參考文獻的編號，各篇參考文獻均以引用的方式併入。EGFR整合來自各種配位體的胞外信號以產生不同的胞內反應(Yarden等人, 2001；及Jorrisen等人, 2003)。EGFR涉及多種人類上皮惡性腫瘤，特別係乳癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、肺癌、大腸癌、卵巢癌、頭頸癌及腦癌。已發現基因中的活化突變，以及受體及其配位體的過度表現，引起了自分泌活化環(關於綜述，參見Robertson等人, 2000)。因此，此RTK已被廣泛用作癌症療法的目標。靶向RTK的小分子抑制劑及針對胞外配位體結合域的單株抗體(mAb)均已開發出來，並且迄今已取得多項臨床成功，儘管主要係針對特定的患者群體。人類EGFR蛋白及其編碼基因的資料庫寄存編號為(GenBankNM_005228.3)。基因及/或蛋白質的其他資料庫標識符係HGNC：3236；Entrez Gene：1956；Ensembl：ENSG00000146648；OMIM：131550及UniProtKB：P00533。提供寄存編號主要係為了提供一種進一步鑑定EGFR蛋白作為目標之方法，抗體結合的EGFR蛋白的實際序列可能會有所不同，例如由於編碼基因的突變，如某些癌症或其類似物中出現之突變。在本文中提及EGFR時，除非另有說明，否則提及的係人類EGFR。結合EGFR的抗原結合位點結合EGFR及其多種變體，諸如在某些EGFR陽性腫瘤上表現的變體。
如本文所用的術語「EGFR配位體」係指結合並活化EGFR的多肽。EGFR配位體之實例包括但不限於EGF、TGF-α、HB-EGF、雙調蛋白、β細胞素及上皮調節蛋白(關於綜述，OlayioyeMA等人; EMBO J (2000) 第19卷: 第3159-3167頁)。該術語包括天然存在的多肽的生物活性片段及/或變體。
EGFR的異常活化形式(例如經由EGFR突變或EGFR基因擴增)已知係非小細胞肺癌(NSCLC)的致癌驅動因素，並且已知發生在使用EGFR酪胺酸激酶抑制劑的治療中。本揭露內容提供了一種雙特異性抗體，用於治療已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑或ii)化學療法及酪胺酸激酶抑制劑、iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體或iv)未曾接受過先前抗癌治療的主體的癌症之方法，iv)下的該主體在某些態樣中包含cMET外顯子14跳躍突變或包含cMET外顯子14跳躍突變的癌症。
在某些態樣中，治療包含治療由EGFR的非配位體依賴性活化及/或cMET的非配位體依賴性活化引起的癌症。在另一態樣中，治療包含治療由EGFR的配位體依賴性活化及/或cMET的配位體依賴性活化引起的癌症。
在某些態樣中，癌症或主體已經接受過先前奧希替尼治療並且具有獲得性或三級奧希替尼抗性。該先前的奧希替尼治療在某些態樣中係第一線或第二線療法。在某些態樣中，第一線療法之後係使用本揭露內容之雙特異性抗體作為第二治療進行治療。
在某些態樣中，癌症包含活化EGFR突變、批准的酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、三級酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、減少第三代酪胺酸激酶抑制劑與EGFR之結合的突變、獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、EGFR基因擴增、cMET突變、cMET畸變或增加的HGF表現。
在對本揭露內容之雙特異性抗體的功效進行的臨床研究中，在具有不同遺傳致癌背景的多種癌症中觀察到臨床功效。具體而言，在肺癌，特別係非小細胞肺癌(NSCLC)中觀察到臨床功效。舉例而言，在具有各種EGFR突變的患者中觀察到臨床功效，該等突變包括EGFR外顯子20突變/***、EGFR外顯子21突變(諸如L858R)、EGFR外顯子19缺失突變或c-MET外顯子14跳躍突變。因此，在某個態樣中，癌症係NSCLC及/或主體患有NSCLC，該癌症或主體包含EGFR外顯子21突變(諸如L858R)、EGFR外顯子19缺失突變、EGFR外顯子18突變或c-MET外顯子14跳躍突變。
此外，在頭頸癌，特別係頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)中觀察到了臨床功效。因此，在某個態樣中，癌症係及/或主體患有頭頸癌，特別係頭頸鱗狀細胞癌。
在某些態樣中，癌症係具有c-MET擴增的胃腺癌。
在某些態樣中，治療導致或包含可溶性EGFR及/或cMET的耗乏。
在某些態樣中，癌症包含活化EGFR突變，諸如同框外顯子19缺失突變或外顯子21突變(在某些態樣中L858R)。本文中，術語「活化EGFR突變」意謂使用第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑時出現進展後發生的突變，包括同框外顯子19缺失(del19)及外顯子21中精胺酸被白胺酸取代(L858R)。
在某些態樣中，癌症包含批准的酪胺酸激酶抑制劑抗性突變。在本文中，術語「批准的酪胺酸激酶抑制劑抗性突變」意謂在使用目前批准用於治療癌症的EGFR酪胺酸激酶抑制劑時出現進展後產生的抗性，諸如T790M賦予對阿法替尼的抗性。在某些態樣中，該EGFR酪胺酸激酶抑制劑係批准的EGFR酪胺酸激酶抑制劑。
在某些態樣中，癌症包含三級酪胺酸激酶抑制劑抗性突變，諸如L718X (例如L718Q)、G719X (例如G719A)、L792X (例如L792H)、G796X (例如G796R、G796S、G796D)、C797X、C797X (例如C797S、C797G)。本文中，術語「三級酪胺酸激酶抑制劑抗性突變」意謂在使用第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑(在某些態樣中奧希替尼)出現進展後產生的抗性。
在某些態樣中，癌症包含減少第三代酪胺酸激酶抑制劑與EGFR之結合的突變，諸如L792X、L718X。
在某些態樣中，癌症包含獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變(諸如T790M、L858R、外顯子19缺失突變、C797X、L792X、G796X、G724X、S768X、L718X或外顯子20***突變)，在某些態樣中包含賦予奧希替尼抗性的突變或在使用奧希替尼時出現進展後發生的突變，包括G724X (例如G724S)、S768X (例如S768I)、L792X (例如L792H)、C797X (包括C797S及C797G)、L798X (例如L798I)。本文中，術語「獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變」意謂使用酪胺酸激酶抑制劑治療時出現進展後，諸如使用第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑時出現進展後獲得的抗性。
在某些態樣中，癌症包含EGFR基因擴增(諸如EGFR mRNA的增加或野生型EGFR對偶基因的擴增)與在使用奧希替尼時出現進展後EGFR-ex19del對偶基因之存在的組合。
在某些態樣中，癌症包含cMET突變，諸如cMET外顯子14跳躍突變。
在某些態樣中，癌症包含cMET畸變，諸如cMET擴增、cMET過表現、增加的cMET路徑的信號傳導、cMET基因擴增、增加的HGF表現及/或增加的cMET蛋白活性。在某些態樣中，該癌症係NSCLC並且該cMET擴增的特徵在於MET/CEP7＞5或cfDNA≥2個拷貝或其任何組合。
在某些態樣中，cMET擴增的特徵在於MET/CEP7≥3，MET/CEP7≥4，MET/CEP7≥5 (以及高達15或20或更少)或cfDNA≥1.8個cMET拷貝，諸如(≥1.8，＜2.2)、或(＞2.2，＜5)、或(≥5)。
在某些態樣中，癌症包含外顯子19缺失突變，在某些態樣中，同框外顯子19缺失、外顯子20誤義突變(例如T790M)或外顯子21突變，諸如L858R。
在某些態樣中，癌症包含EGFR外顯子20突變，在某些態樣中包含外顯子20***突變，在某些態樣中包含同框外顯子20***突變。
在某些態樣中，癌症或主體包含外顯子20突變，其選自近環***(位置767-772)、遠環***(位置773-775)，在某些態樣中V769_D770insASV、D770_N771insSVD、H773_V774insNPH、H773_V774insH、D770_N771insG、D770delinsGY、N771_P772insN、V774_C775insHV、D770_N771insGL、H773_V774insPH、A763_Y764insFQEA、D770_N771delinsEGN、D770_N771insGD、D770_N771insH、D770_N771insP、H773_V774insAH、H773_V774insGNPH、H773delinsSNPY、N771_P772insH、N771_P772insVDN、N771delinsGY、N771delinsKH、N771delinsRD、P772_H773delinsHNPY、P772_H773insGT、P772_H773insPNP、P772_H773insT、V769_D770insA、V769_D770insGG、V769_D770insGSV、V769_D770insGVV及V769_D770insMASV；或突變T790M、L792X (例如L792H、C796X (例如G796R、G796S、G796D)、C797X (例如C797S、C797G)、L798I，或同框外顯子20***，諸如M766_A767insASV或H773-V774insNPH、Ins761(EAFQ)、Ins770(ASV)、Ins771(G)、Ins774(NPH)、M766_A7671ns A、S768_V769InsSVA、P772_H773InsNS、D761_E762InsX1-7、A763_Y764InsX1-7、Y764_Y765 InsX1-7、M766_A767InsX1-7、A767_V768 InsX1-7、S768_V769 InsX1-7⟩ V769_D770 InsX1-7⟩ D770_N771 InsX1-7⟩ N771_P772 InsX1-7⟩ P772_H773 InsX1-7、H773_V774 InsX1-7或V774_C775 InsX1-7。在某些態樣中，癌症或主體包含二個或更多個該等突變。
在某些態樣中，癌症或主體包含突變，諸如L718X (例如L718Q、L718V)、G719X (例如G719A)、L792X (例如L792H、L792F、L792R、L792Y、L792V及L792P)、G796X (例如G796R、G796S、G796D)、C797X、C797X (例如C797S、C797G、C797N)、C797X、L792X、G796X、G724X、S768X、L718X、M766X (例如M766Q)、R776X (例如R776C)或外顯子20***突變。在某些態樣中，癌症或主體包含二個或更多個該等突變。
在某些態樣中，癌症或主體包含外顯子19缺失突變，在某些態樣中，同框外顯子19缺失、外顯子20誤義突變(例如T790M)或外顯子21突變，諸如L858R、L861X (例如L861Q)或L844X (例如L844V)。在某些態樣中，癌症或主體包含二個或更多個該等突變。
在某些態樣中，癌症或主體包含癌症，該癌症包含EGFR外顯子20突變，在某些態樣中，外顯子20***突變。
在某些態樣中，癌症或主體包含選自以下的突變：G724X (例如G724S)、S768X (例如S768I)、T790X (例如T790M)、L792X (例如L792H)、C797X (包括C797S及C797G)、L798X (例如L798I)、I941X (例如I941R)、V948X (例如V948R)。在某些態樣中，癌症或主體包含二個或更多個該等突變。
在某些態樣中，癌症或主體包含雙重突變L858X/T790X (例如L858R/T790M)、T790X/L798X (例如T790M/L798I)、T790X/C797X (例如T790M/C797S)、G719X/R776X (例如G719A/R776C))或delE746_A750/T790M。
在某些態樣中，癌症或主體包含雙重突變D770insSVD/E762X (例如E762K)、D770insSVD/L792X (例如L792I、L792S)、D770insSVD/P794X (例如P794S)或D770insSVD/G796X (例如G796D)。
在某些態樣中，癌症或主體包含雙重突變H773insH/E762X (例如E762K)、H773insH/L792X (例如L792I、L792S)、H773insH/P794X (例如P794S)或H773insH/G796X (例如G796D)。
在某些態樣中，癌症或主體包含雙重突變H773insNPH/E762X (例如E762K)、H773insNPH/L792X (例如L792I、L792S)、H773insNPH/P794X (例如P794S)或H773insNPH/G796X (例如G796D)。
在某些態樣中，癌症或主體包含雙重突變L858X/L718X (例如L858R/cis-L718Q)、L858X/C797X (例如L858R/cis-C797S)、exon19del/C797X (例如exon19del/cis-C797S)。
在某些態樣中，癌症或主體包含三重突變L858X/T790X/C797X (例如L858R/T790M/C797S)、L858X/T790X/M766X (例如L858R/T790M/M766Q)、L858X/T790X/L718X (例如L858R/T790M/cis-L718Q、L858R/T790M/L718Q)、L858X/T790X/C797X (例如L858R/T790M/cis-C797S)、exon19del/T790X/C797X (例如exon19del/T790M/cis-C797S)、L858X/T790X/C941X (例如L858R/T790M/I941R)、delE746_A750/T790X/C797X (例如delE746_A750/T790M/C797S)。
在某些態樣中，癌症或主體包含cMET外顯子14跳躍突變。
本文中，術語「難治性」係指對治療沒有反應的疾病。難治性疾病可以在治療之前或開始時對治療具有抗性，或者難治性疾病可以在治療期間變得抗性。
本文中，「第1代EGFR酪胺酸激酶抑制劑」(1st generation TKI)係指可逆性EGFR抑制劑，諸如吉非替尼及厄洛替尼，其在第一線治療攜帶EGFR活化突變(諸如外顯子19缺失及外顯子21 L858R突變)的NSCLC方面有效。
本文中，術語「第2代EGFR酪胺酸激酶抑制劑」(2nd generation TKI)係指共價的不可逆的EGFR抑制劑，諸如阿法替尼及達克替尼，其在第一線治療攜帶EGFR活化突變(諸如外顯子19缺失及外顯子21 L858R突變)的NSCLC方面有效。
在本文中，術語「第3代EGFR酪胺酸激酶抑制劑」(3rd generation TKI)係指共價不可逆的EGFR抑制劑，諸如奧希替尼及拉澤替尼，其對EGFR活化突變(諸如外顯子19缺失及外顯子21 L858R，單獨或與T790M突變組合)具有選擇性，且對野生型EGFR具有較低的抑制活性。
在本文中，術語「抗性」係指癌症或患者在以規定劑量的相關治療劑(包括第3代EGFR酪胺酸激酶抑制劑)投予時對治療沒有反應。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係奧希替尼(AZD9291)。奧希替尼(AZD9291)係一種共價的、具有口服活性的、不可逆的及突變體選擇性的EGFR抑制劑，對L858R及L858R/T790M的表觀IC50分別為12 nM及1 nM。推薦的第2階段劑量確定為每日80 mg的劑量。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係阿美替尼(HS-10296)。阿美替尼係一種可口服的、不可逆的第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑，對EGFR致敏及T790M抗性突變具有選擇性。阿美替尼用於非小細胞肺癌的研究。推薦的第2階段劑量確定為每日110 mg的劑量。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係拉澤替尼。拉澤替尼(YH25448)係一種強效的、突變體選擇性的、可透過血腦障壁的、可口服的且不可逆的第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑，且可以用於非小細胞肺癌的研究。推薦的第2階段劑量確定為每日240 mg的劑量。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係貝福替尼(或BPI-D0316或有時為D-0316)。貝福替尼(Beta Pharmaceuticals, Co., China)係第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑。貝福替尼可以用於EGFR陽性非小細胞肺癌(NSCLC)。在II期單臂研究NCT05007938中，在局部晚期或轉移性NSCLC患者中，評估了貝福替尼25 mg每日三次口服與埃克替尼(icotinib) (125 mg每日三次口服)的組合的安全性及功效。在I期研究NCT04464551中，主體接受單次口服劑量為75 mg D-0316的口服懸浮液。在II期單臂研究NCT03861156中，局部晚期/轉移性非小細胞肺癌患者接受75 mg的口服劑量，持續21天的週期，且若耐受，則劑量增加至100 mg。否則，劑量維持在75 mg。在II/III期研究NCT04206072中，評估了D-0316以70 mg每天一次持續21天，接著增加至100 mg每天一次的功效及安全性。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係阿氟替尼(AST2818或伏美替尼(Furmonertinib))。AST2818係臨床試驗NCT03787992的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係瑞齊替尼(BPI-7711)，其係一種具有口服活性的、選擇性的及不可逆的第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑(TKI)。瑞齊替尼係臨床試驗NCT03866499的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係阿維替尼(Avitinib) (阿比維替尼/AC0010))，其係一種以吡咯并嘧啶為主的不可逆的表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑，IC50為7.68 nM。阿維替尼係臨床試驗NCT03856697的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係ASK120067，其係一種強效的且具有口服活性的EGFR抑制劑。ASK120067係用於非小細胞肺癌(NSCLC)研究的第三代EGFR-TKI。ASK120067係臨床試驗(NCT04143607)的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係奧瑞替尼(Oritinib) (SH-1028，Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing, China)。SH-1028係臨床試驗NCT04239833的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係羅西替尼(CO-1686)，其係一種口服遞送的激酶抑制劑，可特異性靶向突變體EGFR形式。羅西替尼係臨床試驗NCT02186301的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係奧穆替尼(HM61713；BI-1482694)，其係一種具有口服活性且不可逆的第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑，可結合至激酶域附近的半胱胺酸殘基。奧穆替尼可以用於NSCLC的研究。奧穆替尼係臨床試驗NCT02485652的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係那紮替尼(EGF816)，其係第三代EGFR TKI，在晚期EGFR突變型NSCLC患者中選擇性抑制EGFR活化突變。那紮替尼係臨床試驗NCT03529084的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係萘闊替尼，其係一種可口服的、不可逆的、第三代、突變體選擇性的表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑。萘闊替尼係臨床試驗NCT02588261的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
在某些態樣中，第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑係馬維替尼(PF-0647775)，其係一種選擇性的、可口服的且不可逆的EGFR酪胺酸激酶抑制劑(EGFR TKI)。馬維替尼係臨床試驗NCT02349633的主題，研究其在NSCLC中之臨床功效。
cMET，亦稱為酪胺酸蛋白激酶MET或肝細胞生長因子受體(HGFR)，係一種在人類中由MET基因編碼的蛋白質。該蛋白質具有酪胺酸激酶活性。一級單鏈前驅蛋白在轉譯後被裂解以產生α及β次單元，該等次單元經二硫鍵連接以形成成熟受體。
cMET失調或異常活化可能會導致腫瘤生長、形成為腫瘤供應營養物的新血管(血管生成)以及癌症擴散到其他器官(轉移)。cMET在許多類型的人類惡性腫瘤中失調，包括腎癌、肝癌、胃癌、乳癌及腦癌。cMET基因有許多不同的名稱，諸如MET原癌基因受體酪胺酸激酶；肝細胞生長因子受體；酪胺酸蛋白激酶Met；散射因子受體；原癌基因C-Met；HGF/SF受體；HGF受體；SF受體；EC 2.7.10.1；Met原癌基因；EC 2.7.10；DFNB97；AUTS9；RCCP2；C-Met；MET；HGFR；cMET的外部Id為HGNC：7029；Entrez Gene：4233；Ensembl：ENSG00000105976；OMIM：164860及UniProtKB：P08581。給出寄存編號主要係為了提供進一步鑑定cMET蛋白作為目標之方法，抗體結合的cMET蛋白的實際序列可能會有所不同，例如由於編碼基因的突變，諸如某些癌症或其類似物中出現之突變。在本文中提及cMET時，除非另有說明，否則提及的係人類cMET。結合cMET的抗原結合位點結合cMET及其各種變體，諸如在某些cMET陽性腫瘤上表現的變體。cMET畸變或失調之實例包括cMET突變(例如外顯子14跳躍突變)、cMET擴增、cMET過表現、cMET路徑信號傳導增加、cMET基因擴增及/或cMET蛋白活性增加。cMET畸變亦可能由HGF表現增加引起。c-MET的失調係腫瘤侵襲、血管生成及轉移的既定驅動因素(Birchmeier等人, 2003)。三種類型的c-MET生物學改變可導致腫瘤形成：擴增、突變及融合。發現此等基因體改變主要係腫瘤生長的主要或次要驅動因素，且據報導，在使用EGFR酪胺酸激酶抑制劑治療癌症患者後會發生此類畸變(參見Suzawa等人, DOI: 10.1200/PO.19.00011 JCO Precision Oncology-5月10日, 第3卷, 2019)。
在某些態樣中，iv)下的本揭露內容之主體未曾接受過先前抗癌治療。在某些態樣中，該主體未曾接受過酪胺酸激酶抑制劑的先前治療。在某些態樣中，該主體未曾接受過cMET抑制劑的先前治療。在某些態樣中，該主體未曾接受過cMET酪胺酸激酶抑制劑的先前治療。在某些態樣中，該主體未曾接受過酪胺酸激酶抑制劑(諸如卡馬替尼、特泊替尼或賽沃替尼)的先前治療。該主體可能接受過化學療法劑(諸如以鉑為主的化學療法)或免疫治療劑(諸如派姆單抗、納武單抗、西妥昔單抗)的治療。在某些態樣中，該主體患有轉移性非小細胞肺癌。在某些態樣中，該轉移性NSCLC具有導致cMET外顯子14跳躍的突變。可藉由FDA批准的測試來偵測外顯子14跳躍。
在某些態樣中，該主體包含cMET外顯子14跳躍突變或包含cMET外顯子14跳躍突變的癌症。該主體未曾接受過任何癌症的先前抗癌治療，諸如EGFR及/或cMET陽性癌症或包含EGFR及/或cMET畸變的癌症。因此，在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體的投予或治療係第一線治療。在某些態樣中，該第一線治療係為了防止對EGFR及/或cMET酪胺酸激酶治療機制產生抗性，諸如在肺癌患者中或在肺癌中，特別係在非小細胞肺癌中。眾所周知，EGFR及/或cMET酪胺酸激酶抑制劑的抗性機制會發展，尤其係在患有非小細胞肺癌的主體中，諸如在轉移性或晚期癌症中。因此，本揭露內容亦提供了本揭露內容之雙特異性抗體，用於預防主體發展或發生具有EGFR及/或cMET酪胺酸激酶抑制劑抗性的癌症之方法。
在某些態樣中，iv)下的本揭露內容之主體係人類主體。
在某些態樣中，使用或治療包括向iv)下的該主體提供1000、1500或2000 mg劑量的本揭露內容之雙特異性抗體。在某些態樣中，該雙特異性抗體每週提供一次或每二週提供一次。在某些態樣中，使用或治療包含每二週一次向該主體提供1500 mg劑量的該雙特異性抗體。本揭露內容亦提供了一種治療患有腫瘤的該主體之方法，該方法包含向作為有需要之個體的該主體投予如本文所描述之雙特異性抗體。通常，該個體患有涉及異常細胞的疾病，例如該個體可能患有腫瘤或癌症。
在某些態樣中，iv)下的該主體患有癌症，該癌症係非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸癌、胃癌、食道癌、胃/食道交界處癌、乳癌、大腸癌、胰臟癌、卵巢癌、大腸直腸癌或膀胱癌。在某些態樣中，iv)下的該主體患有癌症，該癌症係非小細胞肺癌(NSCLC)。
在某些態樣中，iv)下的該主體患有晚期或轉移性癌症，諸如晚期或轉移性NSCLC。
在某些態樣中，對iv)下的該主體之治療包含用於評估該癌症是否為EGFR陽性及/或cMET陽性癌症或評估該癌症中EGFR及/或cMET畸變的存在的診斷步驟。
抗體通常只能識別抗原的一部分。抗原通常但不一定係蛋白質。被抗體結合的抗原上的識別或結合位點稱為表位，其中表位可以係線性的或構形的。抗體與抗原的結合通常係特異性的。抗體的『特異性』係指其對特定表位的選擇性，而『親和力』係指抗體的抗原結合位點與其結合的表位之間相互作用的強度。
本揭露內容之例示性抗體結合至EGFR及cMET，在某些態樣中結合人類EGFR及人類cMET。本揭露內容之EGFR/cMET雙特異性抗體結合EGFR，並且在其他方面相同的條件下，與同一物種的同源受體ErbB-2及ErbB-4的結合至少低100倍。本揭露內容之EGFR/cMET雙特異性抗體結合至cMET，並且在其他方面相同的條件下，與同一物種的受體ErbB-2及ErbB-4的結合至少低100倍。考慮到受體係細胞表面受體，可以在表現(多種)受體的細胞上評估結合。本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中結合至人類、食蟹獼猴EGFR及/或小鼠EGFR。
結合EGFR及cMET之抗體在其他蛋白質含有相同的表位時亦可以結合此類其他蛋白質。因此，術語「結合」不排除抗體與含有相同表位的另一種蛋白質或(多種)蛋白質的結合。此種結合通常稱為交叉反應。EGFR/cMET雙特異性抗體通常不結合至出生後(在某些態樣中成年)人類細胞膜上除EGFR及/或cMET之外的其他蛋白質。根據本揭露內容之抗體通常能夠以至少1×10e-6 M的結合親和力(亦即平衡解離常數Kd)結合EGFR，如下文更詳細地概述。
如本文所用，術語「抗體」意謂在某些態樣中屬於免疫球蛋白類蛋白質的蛋白質分子。抗體通常含有二個可變域，可以結合抗原上的表位。此類域源自抗體的可變域或與抗體的可變域具有序列同源性。本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中包含二個可變域。用於治療用途之抗體在某些態樣中儘可能接近待治療主體的天然抗體(例如用於人類主體的人類抗體)。抗體結合可以用特異性及親和力來表示。特異性決定了何種抗原或其表位被結合域特異性結合。通常，用於治療應用之抗體可以具有高達1×10e-10 M或更高的親和力。在某些態樣中，諸如本揭露內容之雙特異性抗體的抗體包含天然抗體的恆定域(Fc部分)。本揭露內容之抗體通常係雙特異性全長抗體，在某些態樣中屬於人類IgG亞類。在某些態樣中，本揭露內容之抗體屬於人類IgG1亞類。本揭露內容之此類抗體可以具有良好的ADCC性質，在活體內投予至人類後具有有利的半衰期，並且存在CH3工程化技術，該技術可提供經修飾重鏈，該等經修飾重鏈在殖株細胞中共表現時優先形成異二聚體而非同二聚體。亦可以藉由熟習此項技術者已知的技術提高抗體的ADCC活性。
在某些態樣中，本揭露內容之抗體係「全長」抗體。如本文所揭示之術語『全長』被定義為包含基本上完整的抗體，然而其不一定具有完整抗體的所有功能。為避免疑義，全長抗體包含二條重鏈及二條輕鏈。各條鏈含有恆定(C)及可變(V)區，其可以分解為名稱為CH1、CH2、CH3、VH及CL、VL的域。通常，抗體經由Fab部分中所含的可變域與抗原結合，並且在結合後可以經由恆定域(主要經由Fc部分)與免疫系統的分子及細胞相互作用。根據本揭露內容之全長抗體涵蓋其中可能存在突變之抗體，該等突變提供所需特徵。其中一個或幾個胺基酸殘基缺失但基本上不改變所得抗體的特異性及/或親和力特徵之抗體涵蓋在術語「全長抗體」內。舉例而言，IgG抗體可以在恆定區中具有1-20個胺基酸殘基***、缺失或取代或其組合。
在某些態樣中，本揭露內容之抗體係雙特異性IgG抗體，諸如雙特異性全長IgG1抗體或人類IgG1。全長IgG抗體係較佳的，因為其通常具有有利的半衰期，並且出於免疫原性的原因，希望儘可能接近完全自體(人類)分子。在某些態樣中，本揭露內容之抗體係全長IgG1、全長IgG2、全長IgG3或全長IgG4抗體。
可以結合EGFR並且包含如本文所示的MF3370或其變體的胺基酸序列的可變域，在某些態樣中結合至EGFR域III (參見國際專利申請案PCT/NL2015/050124；WO2015/130172的表4，其以引用的方式併入本文中)。在某些態樣中，可變域阻斷配位體EGF與EGFR的結合或與EGF配位體競爭結合至EGFR。可變域與EGFR的結合可被西妥昔單抗抑制。可變域結合不同於西妥昔單抗及紮妥木單抗識別之表位的表位。舉例而言，可變域結合至小鼠EGFR，而西妥昔單抗及紮妥木單抗不結合，表明小鼠及人類EGFR域III之間不同的一或多個殘基在西妥昔單抗及紮妥木單抗結合中起作用，但在本文所描述之本揭露內容之抗體中不起作用。本揭露內容之具有人、小鼠、食蟹獼猴EGFR交叉反應性的雙特異性抗體的一個優點係其允許使用人類癌症模型進行異種移植研究，此在有效性及毒性方面可能更具預測性，因為該抗體亦結合至具有受體的正常小鼠細胞，同時亦能夠用於食蟹獼猴毒理學研究。在某些態樣中，本揭露內容提供了一種雙特異性抗體，其包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，其中該第一可變域亦可以結合小鼠EGFR、食蟹獼猴EGFR或二者。
在某些態樣中，cMET可變域包含如本文所示的MF4356或其變體的胺基酸序列，並且在某些態樣中阻斷抗體MetMab與cMET的結合。cMET可變域在某些態樣中包含MF8230或其變體的胺基酸序列，如本文所示，並且在某些態樣中阻斷抗體MetMab與cMET的結合。在某些態樣中，可變域阻斷配位體HGF與cMET的結合或與配位體HGF競爭與cMET的結合。當MetMab與cMET的結合在半數最大結合條件下減少至少40%，並且在某些態樣中，在飽和量的該可變域存在下減少至少60%時，可變域阻斷抗體MetMab與cMET的結合。在某些態樣中，可變域在二價單特異性抗體的背景下提供。cMET可變域在某些態樣中可以結合cMET的sema域。本揭露內容之cMET可變域可以與5D5競爭結合cMET或不與報導的抗cMET參考抗體(諸如5D5)競爭。參見表2。
本揭露內容之可變域可以結合EGFR (第一可變域)並且在某些態樣中包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYX 1X 2NTNYAQKLQG及包含序列X 3X 4X 5X 6HWWLX 7A的CDR3，其中X 1=N或S；X 2=A或G；X 3=D或G；X 4=R、S或Y；X 5=H、L或Y；X 6=D或W且X 7=D或G。
X 1-7在某些態樣中： X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=N；X 2=G；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G； X 1=N；X 2=A；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G；或 X 1=S；X 2=G；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G。
在某些態樣中 X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D；或 X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D。
在某些態樣中，X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D。
第一可變域的CDR3序列中的序列X 3X 4X 5X 6HWWLX 7A中的胺基酸A之後的胺基酸可以不同。序列X 3X 4X 5X 6HWWLX 7A之後的胺基酸序列可以係FDY。第一可變域的CDR3在某些態樣中包含序列X 3X 4X 5X 6HWWLX 7AF，在某些態樣中X 3X 4X 5X 6HWWLX 7AFD，在某些態樣中X 3X 4X 5X 6HWWLX 7AFDY。
在某些態樣中，第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYNGNTNYAQKLQG及CDR3序列X 3X 4X 5X 6HWWLX 7A。
在某些態樣中，第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYNGNTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的CDR3。第一可變域的CDR3序列中的序列LDA之後的胺基酸可以變化。序列LDA之後的胺基酸序列可以係FDY。第一可變域的CDR3在某些態樣中包含序列DRHWHWWLDAF，在某些態樣中DRHWHWWLDAFD，在某些態樣中DRHWHWWLDAFDY。
在某些態樣中，第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如圖2所描繪的MF3353；MF8229；MF8228；MF3370；MF8233；MF8232；MF3393；MF8227或MF8226之胺基酸序列，相對於所指定的序列具有至多10個，在某些態樣中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個，並且在某些態樣中0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合。在某些態樣中，第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如圖2所描繪的MF3353；MF8229；MF8228；MF3370；MF8233；MF8232；MF3393；MF8227或MF8226之胺基酸序列。在某些態樣中，第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如圖2所描繪的MF3353；MF8229；MF8228；MF3370；MF8233；MF8232；MF3393；MF8227或MF8226之CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列。
在某些態樣中可以結合cMET的可變域(第二可變域)包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1-23 (圖3)的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。在某些態樣中，第二可變域的重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1-3；7；8；10；13；15；16；17；21；22或23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。在某些態樣中，第二可變域的重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2；7；8；10；13或23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。第二可變域的重鏈可變區在某些態樣中包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 23的序列的胺基酸序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。在某些態樣中，第二可變域包含具有以下各者之CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列的重鏈可變區：MF8225 (SEQ ID NO: 1)、MF8243 (SEQ ID NO: 2)、MF8224 (SEQ ID NO:3)、MF8239 (SEQ ID NO: 4)、MF8242 (SEQ ID NO: 5)、MF8237 (SEQ ID NO: 6)、MF8240 (SEQ ID NO: 7)、MF8234 (SEQ ID NO: 8)、MF8245 (SEQ ID NO: 9)、MF8231 (SEQ ID NO: 10)、MF8247 (SEQ ID NO: 11)、MF8238 (SEQ ID NO: 12)、MF8230 (SEQ ID NO: 13)、MF8248 (SEQ ID NO: 14)、MF8246 (SEQ ID NO: 15)、MF8223 (SEQ ID NO: 16)、MF8222 (SEQ ID NO: 17)、MF8235 (SEQ ID NO: 18)、MF8236 (SEQ ID NO: 19)、MF8241 (SEQ ID NO: 20)、MF8244 (SEQ ID NO: 21)、MF8221 (SEQ ID NO: 22)或MF4356 (SEQ ID NO: 23)。
在某些態樣中，該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYNGNTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA，在某些態樣中DRHWHWWLDAFDY的CDR3，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYSMN；CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及CDR3序列ETYYYDRGGYPFDP。第一及第二可變域的輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3在某些態樣中分別包含胺基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTPPT，亦即IGKV1-39的CDR (根據IMGT)。
在某些態樣中，該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYNGNTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的CDR3，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列TYSMN；CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及包含序列ETYFYDRGGYPFDP的CDR3。第一及第二可變域的輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3在某些態樣中分別包含胺基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTPPT，亦即IGKV1-39的CDR (根據IMGT)。
一種雙特異性抗體，其包含可以結合EGFR胞外部分的第一可變域及可以結合cMET胞外部分的第二可變域，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYNANTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的CDR3，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYSMN；CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及CDR3序列ETYYYDRGGYPFDP。第一及第二可變域的輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3在某些態樣中分別包含胺基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTPPT，亦即IGKV1-39的CDR (根據IMGT)。
一種雙特異性抗體，其包含可以結合EGFR胞外部分的第一可變域及可以結合cMET胞外部分的第二可變域，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYNANTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的CDR3，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列TYSMN；CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及包含序列ETYFYDRGGYPFDP的CDR3。第一及第二可變域的輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3在某些態樣中分別包含胺基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTPPT，亦即IGKV1-39的CDR (根據IMGT)。
一種雙特異性抗體，其包含可以結合EGFR胞外部分的第一可變域及可以結合cMET胞外部分的第二可變域，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYSGNTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的CDR3，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYSMN；CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及CDR3序列ETYYYDRGGYPFDP。第一及第二可變域的輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3在某些態樣中分別包含胺基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTPPT，亦即IGKV1-39的CDR (根據IMGT)。
一種雙特異性抗體，其包含可以結合EGFR胞外部分的第一可變域及可以結合cMET胞外部分的第二可變域，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYSGNTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的CDR3，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列TYSMN；CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及包含序列ETYFYDRGGYPFDP的CDR3。第一及第二可變域的輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3在某些態樣中分別包含胺基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTPPT，亦即IGKV1-39的CDR (根據IMGT)。
在cMET結合可變域被描述為具有CDR2序列「WINTYTGDPTYAQGFTG」之某些態樣中，CDR2序列亦可以係「WINTYTGDPTYAQGFT」。
如本文在某些態樣中描述的第一及第二可變域的輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3分別包含胺基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTPPT，亦即IGKV1-39的CDR (根據IMGT)。在一些此類態樣中，CDR3包含胺基酸序列QQSYSTP。在如本文所描述之雙特異性抗體之某些態樣中，第一及第二可變域包含共同的輕鏈，在某些態樣中，圖4B的輕鏈可變域。
在某些態樣中，EGFR/cMET雙特異性抗體包含第一可變域及第二可變域，該第一可變域可以結合人類EGFR胞外部分，包含圖1中描繪的MF3755之重鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3，該第二可變域可以結合人類cMET的胞外部分，包含圖1中描繪的MF4297的重鏈可變區的CDR1、CDR2及CDR3。該第一及第二可變域中的輕鏈可變區在某些態樣中係如本文所描述之共同的輕鏈可變區。第一及第二可變域的輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3在某些態樣中分別包含胺基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTPPT，亦即IGKV1-39的CDR (根據IMGT)。在某些態樣中，抗體包含具有如圖1所描繪的MF3755之胺基酸序列的重鏈可變區，相對於指示序列具有至多10個，在某些態樣中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個，並且在某些態樣中具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合。在某些態樣中，第一可變域包含具有如圖1所描繪的MF3755之胺基酸序列的重鏈可變區。在某些態樣中，可以結合cMET的可變域(第二可變域)包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如圖1所描繪的MF4297之胺基酸序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。在某些態樣中，第二可變域的重鏈可變區包含如圖1所描繪的MF4297之胺基酸序列。
在本揭露內容之上下文中，術語『雙特異性』(bs)係指抗體能夠結合二個不同的目標或同一目標上的二個表位，例如，其中抗體的一個可變域(如上定義)結合至EGFR上的表位，且第二個可變域結合至cMET上的表位。根據雙特異性抗體識別的二種抗原的表現位準、(亞)細胞定位及化學計量，抗體的二個Fab臂可能會或可能不會同時結合其表位。雙特異性抗體的一個臂通常含有一個抗體的可變域，而另一臂含有另一抗體的可變域(亦即雙特異性抗體的一個臂由一條重鏈與一條輕鏈配對形成，而另一臂由不同的重鏈與輕鏈配對形成)。因此，在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體的化學計量係1:1 EGFR:cMET結合。
本揭露內容之雙特異性抗體的重鏈可變區通常彼此不同，而輕鏈可變區在某些態樣中係相同的。其中不同重鏈可變區與相同輕鏈可變區締合的雙特異性抗體亦稱為具有共同的輕鏈可變區(cLcv)的雙特異性抗體。較佳的是，輕鏈恆定區亦相同。此類雙特異性抗體被稱為具有共同的輕鏈(cLc)。因此，進一步提供了根據本揭露內容之雙特異性抗體，其中二個臂包含共同的輕鏈。
根據本揭露內容，術語『共同的輕鏈』係指雙特異性抗體中的二條或更多條輕鏈，其可以相同或具有一些胺基酸序列差異，同時不影響全長抗體的結合特異性。舉例而言，在本文所用的共同的輕鏈定義的範圍內，可以製備或發現不一致但功能上仍然等同的輕鏈，例如，藉由引入及測試守恆胺基酸變化、當與重鏈等配對時對結合特異性沒有或僅有部分貢獻的區域中之胺基酸變化或其類似變化。術語『共同的輕鏈』、『共同的LC』、『cLC』、『單個輕鏈』加上或不加術語『重排』均在本文中可互換使用。術語『共同的輕鏈可變區』、『共同的VL』、『共同的LCv』、『cLCv』、『單個VL』在加上或不加術語『重排的』之情況下在本文中均可互換使用。在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體具有共同的輕鏈(可變區)，其與具有不同結合特異性的至少二條，並且在某些態樣中多條重鏈(可變區)組合以形成具有功能抗原結合域之抗體(例如，WO2009/157771)。共同的輕鏈(可變區)在某些態樣中係人類輕鏈(可變區)。某些態樣的共同的輕鏈(可變區)具有生殖系序列。在某些態樣中，生殖系序列係具有良好熱力學穩定性、產率及溶解度的輕鏈可變區。在某些態樣中，生殖系輕鏈係O12。共同的輕鏈在某些態樣中包含由生殖系人類Vk基因區段編碼的輕鏈，並且在某些態樣中係重排的生殖系人類κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (圖4A)。共同的輕鏈可變區在某些態樣中係重排的生殖系人類κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01的可變區。某些態樣中的共同的輕鏈包含如圖4B或4d所描繪的輕鏈可變區，具有0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。共同的輕鏈在某些態樣中進一步包含輕鏈恆定區，在某些態樣中包含κ輕鏈恆定區。編碼共同的輕鏈的核酸可以針對用於表現共同的輕鏈蛋白的細胞系統進行密碼子最佳化。編碼核酸可以偏離生殖系核酸序列。
在某些態樣中，輕鏈包含輕鏈區，該輕鏈區包含如圖4A所描繪的O12/IgVκ1-39*01基因區段的胺基酸序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。片語「O12輕鏈」將在整個說明書中用作「包含輕鏈可變區的輕鏈，該輕鏈可變區包含O12/IgVκ1-39*01基因區段的胺基酸序列，如描繪的圖4A的一部分，具有0-10，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合」的簡稱。IgVκ1-39係免疫球蛋白可變κ 1-39基因的簡稱。該基因亦稱為免疫球蛋白κ可變1-39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12。該基因的外部ID為HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。在某些態樣中，IgVκ1-39的胺基酸序列在圖4E中給出。此列出了V區的序列。V區可以與五個J區之一組合。圖4B及4d描述了與J區組合的IgVκ1-39的二個較佳序列。連接的序列指示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱係IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (根據全球資訊網imgt.org上的IMGT資料庫的命名法)。
較佳的是，包含輕鏈可變區的O12/IgVκ1-39*01係生殖系序列。進一步較佳的是，包含輕鏈可變區的IGJκ1*01或/IGJκ5*01係生殖系序列。在某些態樣中，IGKV1-39/jk1或IGKV1-39/jk5輕鏈可變區係生殖系序列。
在某些態樣中，輕鏈可變區包含生殖系O12/IgVκ1-39*01。在某些態樣中，輕鏈可變區包含κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在某些態樣中，IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。輕鏈可變區在某些態樣中包含生殖系κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或生殖系κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ5*01，在某些態樣中包含生殖系IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。
產生具有O12輕鏈之抗體的成熟B細胞通常會產生相對於生殖系序列(亦即生物體非淋巴樣細胞中的正常序列)發生一或多個突變的輕鏈。導致此等突變的過程通常被稱為體細胞(超)突變。所得輕鏈稱為親和力成熟的輕鏈。此類輕鏈在衍生自O12生殖系序列時係O12衍生的輕鏈。在本說明書中，片語「共同的輕鏈」將包括「共同的輕鏈衍生的輕鏈」，且片語「O12輕鏈」將包括O12衍生輕鏈。由體細胞超突變引入的突變亦可以在實驗室中以人工方式引入。在實驗室中亦可以引入其他突變而不影響輕鏈的性質的種類(數量不一定)。若輕鏈包含如圖4A、圖4B、圖4D或圖4E中所描繪的序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合，則該輕鏈至少係O12輕鏈。在某些態樣中，O12輕鏈係包含如圖4A、圖4b、圖4d或圖4e中所描繪的序列的輕鏈，具有0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。在某些態樣中，O12輕鏈係包含如圖4A、圖4B、圖4D或圖4E中所描繪的序列的輕鏈，具有0-5個，在某些態樣中0-4個，在某些態樣中0-3個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。在某些態樣中，O12輕鏈係包含如圖4A、圖4B、圖4D或圖4E中所描繪的序列的輕鏈，具有0-2個，在某些態樣中0-1個，在某些態樣中0個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。在某些態樣中，O12輕鏈係包含如圖4A或圖4B所描繪的序列的輕鏈，具有提及的胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。在某些態樣中，輕鏈包含圖4A的序列。在某些態樣中，輕鏈可變區包含圖4B的序列。所提及的1、2、3、4或5個胺基酸取代在某些態樣中係守恆胺基酸取代並且可以存在於重鏈及/或輕鏈的CDR區；***、缺失、取代或其組合在某些態樣中不在VL鏈的CDR3區中，在某些態樣中不在VL鏈的CDR1、CDR2或CDR3區或FR4區中。
共同的輕鏈可以具有λ輕鏈且此因而亦提供於本揭露內容之上下文中，然而κ輕鏈係較佳的。本揭露內容之共同的輕鏈之恆定部分可為κ或λ輕鏈之恆定區。其在某些態樣中係κ輕鏈之恆定區，在某些態樣中該共同的輕鏈為生殖系輕鏈，在某些態樣中係包含IgVKl-39基因區段之重排的生殖系人類κ輕鏈，在某些態樣中係重排的生殖系人類κ輕鏈IgVKl-39*01/IGJKl*01 (圖4)。術語重排的生殖系人類κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39輕鏈或縮寫huVκ1-39或簡單地1-39在整個本申請案中可互換使用。
產生共同的輕鏈的細胞可以產生例如重排的生殖系人類κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01及包含與λ恆定區融合的所提及輕鏈的可變區的輕鏈。
在某些態樣中，輕鏈可變區包含胺基酸序列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK or DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。在某些態樣中，輕鏈可變區包含相對於所指示胺基酸序列的0-9個、0-8個、0-7個、0-6個、0-5個、0-4個，在某些態樣中0-3個，在某些態樣中0-2個，在某些態樣中0-1個並且在某些態樣中0個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。若比對的序列沒有超過5個位置的差異，則***、缺失、添加或替換的組合係所主張的組合。在某些態樣中，輕鏈可變區包含胺基酸序列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK or DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK。在某些態樣中，輕鏈可變區包含胺基酸序列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PTFGQ GTKVE IK。在另一態樣中，輕鏈可變區包含胺基酸序列DIQMT QSPSS LSASV GDRVT ITCRA SQSIS SYLNW YQQKP GKAPK LLIYA ASSLQ SGVPS RFSGS GSGTD FTLTI SSLQP EDFAT YYCQQ SYSTP PITFG QGTRL EIK。
胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合在某些態樣中不在輕鏈可變區的CDR3區中，在某些態樣中不在輕鏈可變區的CDR1或CDR2區中。在某些態樣中，輕鏈可變區不包含相對於所指定的序列的缺失、添加或***。在此實施例中，重鏈可變區相對於指定的胺基酸序列可以具有0-5個胺基酸取代。胺基酸取代在某些態樣中係守恆胺基酸取代。本揭露內容抗體輕鏈的CDR1、CDR2及CDR3在某些態樣中分別包含胺基酸序列CDR1-QSISSY、CDR2-AAS、CDR3-QQSYSTPPT，亦即IGKV1-39的CDR (根據IMGT)。在某些態樣中，該CDR3序列包含QQSYSTPPT。
如本文所描述之雙特異性抗體在某些態樣中具有結合EGFR胞外部分的一個重鏈可變區/輕鏈可變區(VH/VL)組合及結合cMET胞外部分的第二VH/VL組合。在某些態樣中，該第一VH/VL組合中的VL類似於該第二VH/VL組合中的VL。在某些態樣中，第一及第二VH/VL組合中的VL係相同的。在某些態樣中，雙特異性抗體係全長抗體，其具有結合EGFR胞外部分的一個重鏈/輕鏈(H/L)組合及結合cMET胞外部分的一個H/L鏈組合。在某些態樣中，該第一H/L鏈組合中的輕鏈類似於該第二H/L鏈組合中的輕鏈。在某些態樣中，第一及第二H/L鏈組合中的輕鏈係相同的。
已經公佈了幾種方法來產生宿主細胞，該宿主細胞的表現有利於產生雙特異性抗體或反之亦然，亦即單特異性抗體。在本揭露內容中，較佳抗體分子的細胞表現有利於雙特異性抗體的產生而並非相應單特異性抗體的產生。此通常藉由修飾重鏈的恆定區來達成，使得其有利於異二聚化(亦即與其他重鏈/輕鏈組合的重鏈二聚化)而並非同二聚化。在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體包含具有相容的異二聚化域的二條不同的免疫球蛋白重鏈。此項技術中已經描述了多種相容的異二聚化域。相容的異二聚化域在某些態樣中係相容的免疫球蛋白重鏈CH3異二聚化域。當使用野生型CH3域時，二條不同的重鏈(A及B)及一條共同的輕鏈的共表現將產生三種不同之抗體物種，亦即AA、AB及BB。AA及BB係二種單特異性二價抗體的名稱，而AB係雙特異性抗體的名稱。為了增加所需雙特異性產物(AB)的百分比，可以採用CH3工程化，或者換言之，可以使用具有相容的異二聚化域的重鏈，如下文所定義。此項技術中描述了可以達成重鏈的此種異二聚化的各種方式。一種方法係生成『杵臼(knob into hole)』雙特異性抗體。
如本文所用，術語『相容的異二聚化域』係指工程化的蛋白質域，使得工程化的域A'將優先與工程化的域B'形成異二聚體，且反之亦然，A'-A'及B'-B'之間的同二聚化減少。
在US13/866,747 (現作為US9,248,181發佈)、US14/081,848 (現作為US9,358,286發佈)及PCT/NL2013/050294 (作為WO2013/157954發佈；以引用的方式併入本文)中揭示了使用相容的異二聚化域產生雙特異性抗體的方法及方式。此等方式及方法亦可以有利地用於本揭露內容。具體而言，本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中包含突變以在宿主細胞中產生雙特異性全長IgG分子的大量表現。較佳的突變係第一個CH3域中的胺基酸取代L351K及T366K(『KK變體』重鏈)以及第二個域中的胺基酸取代L351D及L368E(『DE變體』重鏈)，或者反之亦然。US 9,248,181及US 9,358,286專利以及WO2013/157954 PCT申請案(以引用的方式併入本文中)表明DE變體及KK變體優先配對形成異二聚體(所謂的『DEKK』雙特異性分子)。由於相同重鏈之間CH3-CH3界面中帶電殘基之間的排斥，不利於DE變體重鏈(DEDE同二聚體)的同二聚化。
雙特異性抗體可以藉由(短暫)轉染編碼一條輕鏈及二條不同重鏈的質體來產生，此等質體經過CH3工程化以確保有效的異二聚化及雙特異性抗體的形成。此等鏈在單個細胞中的產生導致有利於雙特異性抗體的形成而非單特異性抗體的形成。基本上僅產生雙特異性全長IgG1分子的較佳突變係第一個CH3域中的位置351及366處的胺基酸取代，例如L351K及T366K (根據EU編號進行編號) (『KK變體』重鏈)，及第二個CH3域中的位置351及368處的胺基酸取代，例如L351D及L368E (『DE變體』重鏈)，或反之亦然。
在一個實施例中，包含結合EGFR的可變域的重鏈/輕鏈組合包含重鏈的DE變體。在此實施例中，包含可以結合至cMET的可變域的重鏈/輕鏈組合包含重鏈的KK變體。結合cMET的重鏈KK變體不產生同二聚體，從而使觀察到的雙特異性抗體對HGF誘導的cMET活化抑制的影響非常精確。其避免了有時在二價cMET抗體之情況下觀察到的cMET活化(促效作用)。
Fc區介導抗體的效應功能，諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。根據治療性抗體或Fc融合蛋白的應用，可能需要降低或增加效應功能。當如在本揭露內容之一些實施例中般活化、增強或刺激免疫反應時，可能需要降低的效應功能。效應功能降低之抗體可以用於靶向免疫細胞的細胞表面分子等。在某些態樣中，本揭露內容之抗體促進ACDP。在某些態樣中，本揭露內容之抗體促進ADCC。在某些態樣中，本揭露內容之抗體與埃萬妥單抗相比在更高程度上促進ADCC。在某些態樣中，對於具有包括cMET擴增及/或cMET外顯子14跳躍突變的cMET畸變的細胞或癌症，本揭露內容之抗體與埃萬妥單抗相比在更高程度上促進ADCC。
效應功能降低之抗體在某些態樣中係包含修飾的CH2/下部鉸鏈區的IgG抗體，例如以降低Fc-受體相互作用或降低C1q結合。在某些態樣中，本揭露內容之抗體係具有突變型CH2及/或下部鉸鏈區的IgG抗體，使得雙特異性IgG抗體與Fc-γ受體的相互作用降低。包含突變型CH2區之抗體在某些態樣中係IgG1抗體。此種突變型IgG1 CH2及/或下部鉸鏈域在某些態樣中包含位置235及/或236 (EU編號)的胺基取代，在某些態樣中包含L235G及/或G236R取代(圖5D)。
本揭露內容之抗體在某些態樣中具有效應功能。本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中包含抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)。可以對抗體進行工程化以增強ADCC活性(有關綜述，參見Cancer Sci. 2009 Sep;100(9):1566-72. Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions. Kubota T, Niwa R, Satoh M, Akinaga S, Shitara K, Hanai N)。存在幾種活體外方法來確定抗體或效應細胞在引發ADCC中的功效。其中有鉻-51 [Cr51]釋放分析、銪[Eu]釋放分析及硫35 [S35]釋放分析。通常，將表現某種表面暴露抗原的經標記目標細胞株與對該抗原具特異性之抗體一起培育。洗滌後，將表現Fc受體CD16的效應細胞與抗體標記的目標細胞共同培育。隨後藉由閃爍計數器或分光光度法釋放胞內標記來量測目標細胞裂解。在某些態樣中，本揭露內容之雙特異性抗體表現出ADCC活性。在此類態樣中，雙特異性抗體可以具有改善的ADCC活性。在此類態樣中，抗體可以藉由如本文別處所述的一或多個CH2突變及藉由此項技術中已知的技術具有改變的ADCC活性。一種增強抗體ADCC的技術係無岩藻醣基化。(參見例如Junttila, T. T., K. Parsons等人. (2010). 「Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer」. Cancer Research 70(11): 4481-4489)。因此，進一步提供了根據本揭露內容之雙特異性抗體，其係無岩藻醣基化的。在某些態樣中，本揭露內容之抗體包含二個無岩藻醣基化的CH2域。在某些態樣中，本揭露內容之抗體包含總共二個CH2域，此二個域均係無岩藻醣基化的。在某些態樣中，本揭露內容之抗體係全長抗體，諸如IgG型抗體，具有二個CH2域，此二個域均係無岩藻醣基化的。或者，或另外，可以使用多種其他策略來達成ADCC增強，例如包括醣工程化(Kyowa Hakko/Biowa、GlycArt (Roche)及Eureka Therapeutics)及突變誘發，所有此等均試圖增加Fc結合至低親和力活化FcγRIIIa，及/或減少結合至低親和力抑制性FcγRIIb。本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中被非岩藻醣基化以增強ADCC活性。當與在正常CHO細胞中產生的相同抗體相比時，本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中包含減少量的Fc區中N連接碳水化合物結構的岩藻醣基化。
如本文所描述之抗體或雙特異性抗體的變體包含抗體或雙特異性抗體的功能部分、衍生物及/或類似物。該變體維持(雙特異性)抗體的結合特異性。功能部分、衍生物及/或類似物維持(雙特異性)抗體的結合特異性。結合特異性定義為結合如本文所描述之第一膜蛋白及第二膜蛋白的胞外部分的能力。
本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中用於人類。在某些態樣中，本揭露內容之抗體係人類抗體或人源化抗體，在某些態樣中係人類抗體。本揭露內容之雙特異性抗體的恆定區在某些態樣中係人類恆定區。恆定區可以含有一或多個，在某些態樣中不超過10個，在某些態樣中不超過5個與天然存在的人類抗體的恆定區的胺基酸差異。較佳恆定部分完全來源於天然存在的人類抗體。本文產生的各種抗體源自人類抗體可變域庫。因此，此等可變域係人類的。獨特的CDR區可以源自人類、係合成的或源自另一種生物體。當可變區的胺基酸序列與天然存在的人類抗體可變區的胺基酸序列相同，但CDR區除外時，可變區被認為係人源化可變區。在此類實施例中，本揭露內容之結合EGFR或cMET之抗體的可變域的VH可以含有與天然存在的人類抗體可變區的一或多個，在某些態樣中不超過10個，在某些態樣中不超過5個胺基酸差異，不計算CDR區胺基酸序列的可能差異。本揭露內容之抗體中的EGFR結合域及/或cMET結合域的輕鏈可變區可以含有與天然存在的人類抗體可變區的一或多個，在某些態樣中不超過10個，在某些態樣中不超過5個胺基酸差異，不計算CDR區胺基酸序列的可能差異。本揭露內容之抗體中的輕鏈可以含有與天然存在的人類抗體可變區的一或多個，在某些態樣中不超過10個，在某些態樣中不超過5個胺基酸差異，不計算CDR區胺基酸序列的可能差異。在自然界中，此類突變亦發生在體細胞超突變的情形下。
抗體可源自各種動物物種，至少就重鏈可變區而言。常見的做法係將此類例如鼠類重鏈可變區人源化。有多種方法可以達成此點，其中有將CDR接枝至具有與鼠類重鏈可變區之3-D結構匹配的3D結構的人類重鏈可變區；鼠類重鏈可變區的去免疫化，在某些態樣中藉由自鼠類重鏈可變區去除已知或懷疑的T細胞或B細胞表位來完成。去除通常係藉由將表位中的一或多個胺基酸取代為另一種(通常係守恆的)胺基酸，從而修飾表位的序列，使其不再係T細胞或B細胞表位。
去免疫的鼠類重鏈可變區在人類中的免疫原性低於原始鼠類重鏈可變區。在某些態樣中，本揭露內容之可變區或域被進一步人源化，例如面飾化(veneered)。藉由使用面飾化技術，免疫系統容易遇到的外部殘基被選擇性地替換為人類殘基以提供包含弱免疫原性或基本上非免疫原性面飾化表面之混成分子。本揭露內容中使用的動物在某些態樣中係哺乳動物，在某些態樣中係靈長類動物，在某些態樣中係人類。
根據本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中包含人類抗體的恆定區。根據其重鏈恆定域的差異，抗體分為五個類別或同型：IgG、IgA、IgM、IgD及IgE。此等類別或同型包含至少一條以相應希臘字母命名的該等重鏈。某些態樣包含抗體，其中該恆定區係選自IgG、IgA、IgM、IgD及IgE恆定區之群，在某些態樣中，該恆定區包含IgG恆定區，亦即選自由IgG1、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。在某些態樣中，該恆定區係IgG1或IgG4恆定區，在某些態樣中係突變的IgG1恆定區。IgG1恆定區的一些變異在自然界中發生及/或在不改變所得抗體的免疫學性質的情況下被允許。亦可以人為地引入變異以在抗體或其部分上安裝某些較佳的特徵。此類特徵例如在本文中在CH2及CH3之上下文中描述。通常在恆定區中允許在約1-10個之間的胺基酸***、缺失、取代或其組合。
圖1、2或3的VH鏈在某些態樣中相對於圖1、2或3中描繪的VH鏈具有至多15個，在某些態樣中具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸***、缺失、取代或其組合，在某些態樣中相對於圖1、2或3中描繪的VH鏈具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合，在某些態樣中相對於圖1、2或3中描繪的VH鏈具有0、1、2、3或4個***、缺失、取代或其組合，在某些態樣中0、1、2或3個***、缺失、取代或其組合，更在某些態樣中0、1或2個***、缺失、取代或其組合，以及在某些態樣中0或1個***、缺失、取代或其組合。一或多個胺基酸***、缺失、取代或其組合在某些態樣中不在VH鏈的CDR1、CDR2及/或CDR3區中。其在某些態樣中亦不存在於FR4區中。胺基酸取代在某些態樣中係守恆胺基酸取代。
合理的方法已經朝著將人類環境中的非人類殘基含量減至最少的方向發展。有多種方法可以成功地將一種抗體的抗原結合性質接枝至另一種抗體上。抗體的結合性質可能主要取決於CDR3區的確切序列，通常由可變域中的CDR1及CDR2區的序列與整個可變域的適當結構相結合來支持。
CDR序列可以使用不同的方法來定義，包括但不限於根據Kabat編號方案(Kabat等人, J. Biol. Chem.252:6609-6616 (1977)；及/或Kabat等人, 美國衛生與人群服務部(U.S. Dept. of Health and Human Services), 「Sequences of proteins of immunological interest」 (1991))、Chothia編號方案(Chothia等人, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)；Chothia等人, Nature 342: 877-883, 1989；及/或Al-Lazikani B.等人, J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997))、Honegger及Plukthun的編號系統(Honegger及Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001))、MacCallum的編號系統(MacCallum等人, J. Mol. Biol.262:732-745 (1996)；及/或Abhinandan及Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008))、Lefranc的編號系統(Lefranc M.P.等人, Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003)；及/或Honegger及Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001))、或根據IMGT (論述於Giudicelli等人, Nucleic Acids Res. 25: 206-21 1 (1997)中)。
此等編號方案中之各者均將其對CDR的定義基於重鏈或輕鏈可變區中的胺基酸殘基對抗原結合的預測貢獻。因此，各種鑑定CDR之方法均可以用於鑑定本揭露內容之結合域的CDR。在某些實施例中，本揭露內容之結合域的重鏈CDR係根據Kabat、Chothia或IMGT。在某些態樣中，本揭露內容之結合域的重鏈CDR係根據Kabat。在某些實施例中，本揭露內容之結合域的重鏈CDR係根據Chothia。在某些實施例中，本揭露內容之結合域的重鏈CDR係根據IMGT。在某些實施例中，本揭露內容之結合域的輕鏈CDR係根據Kabat。在某些實施例中，本揭露內容之結合域的輕鏈CDR係根據Chothia。在某些態樣中，本揭露內容之結合域的輕鏈CDR係根據IMGT。如本文描述的重鏈CDR區的胺基酸序列用Kabat定義確定。
目前有多種方法可以用於將CDR區接枝至另一種抗體的合適的可變域上。此等方法中之一些綜述於J.C. Almagro1及J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633中，該文獻以引用的方式包括在本文中。因此，本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人源化或在某些態樣中人類雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一抗原結合位點及結合cMET的第二抗原結合位點，其中包含EGFR結合位點之可變域包含如圖1中針對MF3370所描繪的VH CDR3序列，並且其中包含cMET結合位點之可變域包含如圖1中針對MF4356所描繪的VH CDR3區。在某些態樣中，包含EGFR結合位點之VH可變區包含如圖1中針對MF3370所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。在某些態樣中，包含cMET結合位點之VH可變區包含如圖1中針對MF4356所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。CDR接枝亦可以用於產生具有圖1之VH的CDR區但具有不同骨架的VH鏈。不同的骨架可以係另一人類VH的骨架，或者係不同的哺乳動物的骨架。因此，本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人源化或在某些態樣中人類雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一抗原結合位點及結合cMET的第二抗原結合位點，其中包含EGFR結合位點之可變域包含如圖2中針對MF8233所描繪的VH CDR3序列，並且其中包含cMET結合位點之可變域包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH CDR3區。在某些態樣中，包含EGFR結合位點之VH可變區包含如圖2中針對MF8233所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。在某些態樣中，包含cMET結合位點之VH可變區包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。CDR接枝亦可以用於產生具有圖2或圖3的VH的CDR區但具有不同骨架的VH鏈。不同的骨架可以係另一人類VH的骨架，或者係不同的哺乳動物的骨架。
因此，本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一抗原結合位點及結合cMET的第二抗原結合位點，其中包含EGFR結合位點之可變域包含如圖1中針對MF3370所描繪的VH CDR3序列，且其中包含cMET結合位點之可變域包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH CDR3區。包含EGFR結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖1中針對MF3370所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。包含cMET結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。CDR接枝亦可以用於產生具有圖2或圖3的VH的CDR區但具有不同骨架的VH鏈。不同的骨架可以係另一人類VH的骨架，或者係不同的哺乳動物的骨架。
因此，本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一抗原結合位點及結合cMET的第二抗原結合位點，其中包含EGFR結合位點之可變域包含如圖2中針對MF8233所描繪的VH CDR3序列，且其中包含cMET結合位點之可變域包含如圖3中針對MF4356所描繪的VH CDR3區。包含EGFR結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖2中針對MF8233所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。包含cMET結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖3中針對MF4356所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。CDR接枝亦可以用於產生具有圖2或圖3的VH的CDR區但具有不同骨架的VH鏈。不同的骨架可以係另一人類VH的骨架，或者係不同的哺乳動物的骨架。
因此，本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人源化或在某些態樣中人類雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一抗原結合位點及結合cMET的第二抗原結合位點，其中包含EGFR結合位點之可變域包含如圖2中針對MF8233所描繪的VH CDR3序列，且其中包含cMET結合位點之可變域包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH CDR3區。包含EGFR結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖2中針對MF8233所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。包含cMET結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。CDR接枝亦可以用於產生具有圖2或圖3的VH的CDR區但具有不同骨架的VH鏈。不同的骨架可以係另一人類VH的骨架，或者係不同的哺乳動物的骨架。
產生序列變體之方法係此項技術中眾所周知的。可以採用隨機方法生成序列變體，或者可以採用靶向方法，其中可以例如旨在引入可能增加或降低結合親和力的變異。用於使抗體結合域親和力成熟的常規方法在此項技術中廣為人知，參見例如Tabasinezhad M.等人. Immunol Lett. 2019;212:106-113。亦可以旨在引入減輕可開發性風險的變體，以期大規模生產結合域或包含此類結合域的部分。可以引入可能不會導致結合特異性損失及/或影響結合親和力的變異。CDR及/或骨架區內的胺基酸殘基是否可以被取代(例如被守恆的胺基酸殘基取代)並且沒有或基本上沒有結合特異性及/或親和力的損失，可以藉由此項技術中熟知之方法來確定。實驗實例包括但不限於例如丙胺酸掃描(Cunningham BC, Wells JA. Science. 1989;244(4908):1081-5)及深度突變掃描(Araya CL, Fowler DM. Trends Biotechnol. 2011;29(9):435-42)。亦開發了可以預測胺基酸變異影響的計算方法，諸如Sruthi CK, Prakash M. PLoS One. 2020;15(1):e0227621、ChoiY.等人. PLoS One. 2012;7(10):e46688及Munro D, Singh M. Bioinformatics. 2020;36(22-23):5322-9中所述。
本文進一步提供了藉由上述方法產生的任何變體抗人類EGFR及c-MET結合域；包含任何該等變體結合域的結合部分，諸如抗體；包含任何該等變體抗人類EGFR及c-MET結合域或結合部分的醫藥組成物；編碼任何該等變體結合域的核酸；包含該等核酸的載體及細胞；以及該等變體結合域或醫藥組成物用於治療癌症之用途。
因此，本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一抗原結合位點及結合cMET的第二抗原結合位點，其中包含EGFR結合位點之可變域包含如圖2中針對MF8232所描繪的VH CDR3序列，且其中包含cMET結合位點之可變域包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH CDR3區。包含EGFR結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖2中針對MF8232所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。包含cMET結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。CDR接枝亦可以用於產生具有圖2或圖3的VH的CDR區但具有不同骨架的VH鏈。不同的骨架可以係另一人類VH的骨架，或者係不同的哺乳動物的骨架。
因此，本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一抗原結合位點及結合cMET的第二抗原結合位點，其中包含EGFR結合位點之可變域包含如圖2中針對MF8232所描繪的VH CDR3序列，且其中包含cMET結合位點之可變域包含如圖3中針對MF4356所描繪的VH CDR3區。包含EGFR結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖2中針對MF8232所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。包含cMET結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖3中針對MF4356所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。CDR接枝亦可以用於產生具有圖2或圖3的VH的CDR區但具有不同骨架的VH鏈。不同的骨架可以係另一人類VH的骨架，或者係不同的哺乳動物的骨架。
因此，本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人源化或在某些態樣中人類雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一抗原結合位點及結合cMET的第二抗原結合位點，其中包含EGFR結合位點之可變域包含如圖2中針對MF8232所描繪的VH CDR3序列，且其中包含cMET結合位點之可變域包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH CDR3區。包含EGFR結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖2中針對MF8232所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。包含cMET結合位點之VH可變區在某些態樣中包含如圖3中針對MF8230所描繪的VH鏈的CDR1區、CDR2區及CDR3區的序列。CDR接枝亦可以用於產生具有圖2或圖3的VH的CDR區但具有不同骨架的VH鏈。不同的骨架可以係另一人類VH的骨架，或者係不同的哺乳動物的骨架。
本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一可變域及結合cMET的第二可變域，其中第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如圖2中所描繪的MF3370之胺基酸序列，具有至多10個，在某些態樣中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個，在某些態樣中具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合，且其中第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含圖3中所描繪的MF4356之胺基酸序列(SEQ ID NO: 23)，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一可變域及結合cMET的第二可變域，其中第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如圖2中所描繪的MF8233之胺基酸序列，具有至多10個，在某些態樣中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個，在某些態樣中具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合，且其中第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含圖3中所描繪的MF8230之胺基酸序列(SEQ ID NO: 13)，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一可變域及結合cMET的第二可變域，其中第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如圖2中所描繪的MF3370之胺基酸序列，具有至多10個，在某些態樣中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個，在某些態樣中具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合，且其中第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含圖3中所描繪的MF8230之胺基酸序列(SEQ ID NO: 13)，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一可變域及結合cMET的第二可變域，其中第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如圖2中所描繪的MF8233之胺基酸序列，具有至多10個，在某些態樣中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個，在某些態樣中具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合，且其中第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含圖3中所描繪的MF4356之胺基酸序列(SEQ ID NO: 23)，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一可變域及結合cMET的第二可變域，其中第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如圖2中所描繪的MF8232之胺基酸序列，具有至多10個，在某些態樣中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個，在某些態樣中具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合，且其中第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含圖3中所描繪的MF4356之胺基酸序列(SEQ ID NO: 23)，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
本揭露內容進一步提供如包括在本揭露內容之治療中的人類或人源化雙特異性抗體，其包含結合EGFR的第一可變域及結合cMET的第二可變域，其中第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如圖2中所描繪的MF8232之胺基酸序列，具有至多10個，在某些態樣中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個，在某些態樣中具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合，且其中第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含圖3中所描繪的MF8230之胺基酸序列(SEQ ID NO: 13)，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
所提及的至多15個，在某些態樣中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個及在某些態樣中0、1、2、3、4或5個胺基酸取代在某些態樣中係守恆胺基酸取代，該等***、缺失、取代或其組合在某些態樣中不在VH鏈的CDR3區中，在某些態樣中不在VH鏈的CDR1、CDR2或CDR3區中，並且在某些態樣中不在FR4區中。
有多種方法可以用於生產雙特異性抗體。一種方法涉及在細胞中表現二條不同的重鏈及二條不同的輕鏈並收集細胞產生之抗體。以此種方式產生之抗體通常含有具有不同重鏈及輕鏈組合之抗體的集合，其中一些係所需的雙特異性抗體。隨後可以自該集合中純化雙特異性抗體。可以藉由多種方式增加細胞產生的雙特異性抗體與其他抗體的比率。在某些態樣中，該比率藉由在細胞中表現的並非二條不同的輕鏈而是一條共同的輕鏈而增加。當一條共同的輕鏈與二條不同的重鏈一起表現時，細胞產生的雙特異性抗體與其他抗體的比率與表現二條不同的輕鏈相比顯著提高。由細胞產生的雙特異性抗體的比率可以藉由刺激二條不同重鏈彼此配對而並非二條相同重鏈的配對來進一步提高。揭示了用於(自單個細胞)產生雙特異性抗體之方法及手段，由此提供了有利於形成雙特異性抗體而並非形成單特異性抗體的手段。此等方法亦可以有利地用於本揭露內容。因此，本揭露內容在某些態樣中提供了用於自單個細胞產生雙特異性抗體之方法，其中該雙特異性抗體包含二個能夠形成界面的CH3域，該方法包含在該細胞中提供a)編碼包含重鏈的第1 CH3域之第一核酸分子，b)編碼包含重鏈的第2 CH3域之第二核酸分子，其中該等核酸分子具有優先配對包含重鏈的該第1及第2 CH3域的手段，該方法進一步包含培養該宿主細胞並允許表現該等二種核酸分子及自培養物中收穫該雙特異性抗體的步驟。該等第一及第二核酸分子可以係相同核酸分子、載體或基因遞送載劑的一部分，並且可以整合在宿主細胞基因體的相同位點處。或者，該等第一及第二核酸分子分別提供給該細胞。
某些態樣提供了一種用於自單個細胞產生根據本揭露內容之雙特異性抗體之方法，其中該雙特異性抗體包含二個能夠形成界面的CH3域，該方法包括提供： -細胞，其具有a)編碼重鏈的第一核酸分子，該重鏈包含結合EGFR的抗原結合位點並含有第1 CH3域，及b)編碼重鏈的第二核酸分子，該重鏈包含結合ErbB-3的抗原結合位點並含有第2 CH3域，其中該核酸分子具有優先配對該等第1及第2 CH3域的手段， 該方法進一步包含培養該細胞並允許表現該等二種核酸分子所編碼的蛋白質及自培養物中收穫該雙特異性IgG抗體的步驟。在某些態樣中，該細胞亦具有編碼共同的輕鏈的第三核酸分子。該第一、第二及第三核酸分子可以係相同核酸分子、載體或基因遞送載劑的一部分，並且可以整合在宿主細胞基因體的相同位點處。或者，將該等第一、第二及第三核酸分子分別提供給該細胞。在某些態樣中，共同的輕鏈係基於O12，在某些態樣中，其係重排的生殖系人類κ輕鏈IgVκ1 39*01/IGJκ1*01，如上所述。該第1及該第2 CH3域優先配對的方手段在某些態樣中係重鏈編碼區之CH3域中的相應突變。優先產生雙特異性抗體的較佳突變係第一CH3域中的胺基酸取代L351K及T366K (EU編號)及第二CH3域中的胺基酸取代L351D及L368E，或反之亦然。因此，進一步提供了根據本揭露內容之用於產生雙特異性抗體之方法，其中該第一CH3域包含胺基酸取代L351K及T366K (EU編號)，並且其中該第二CH3域包含胺基酸取代L351D及L368E，該方法進一步包含培養該細胞並允許表現由該核酸分子編碼的蛋白質及自培養物中收穫該雙特異性抗體的步驟。亦提供了根據本揭露內容之用於產生雙特異性抗體之方法，其中該第一CH3域包含胺基酸取代L351D及L368E (EU編號)並且其中該第二CH3域包含胺基酸取代L351K及T366K，該方法進一步包含培養該細胞並允許表現該等核酸分子及自培養物中收穫該雙特異性抗體的步驟。可以藉由此等方法產生之抗體亦係本揭露內容之一部分。CH3異二聚化域在某些態樣中係IgG1異二聚化域。包含CH3異二聚化域的重鏈恆定區在某些態樣中係IgG1恆定區。
在本揭露內容之一個實施例中，包括編碼抗體重鏈可變區的核酸分子。在某些態樣中，核酸分子(通常係活體外、分離的或重組的核酸分子)編碼如圖2或圖3所描繪的重鏈可變區，或具有1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或其組合的如圖2或圖3所描繪的重鏈可變區。在某些態樣中，核酸分子包含編碼如圖2或圖3所描繪的胺基酸序列的密碼子最佳化的核酸序列。密碼子最佳化針對產生抗體之細胞的物種及/或細胞類型進行最佳化。舉例而言，對於CHO生產，分子的核酸序列針對中國倉鼠細胞進行密碼子最佳化。本揭露內容進一步提供了編碼圖2或圖3的重鏈的核酸分子。
本揭露內容中使用的核酸分子通常但不排他地係核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)。熟習此項技術者可以獲得替代核酸。根據本揭露內容之核酸例如包含在細胞中。當該核酸在該細胞中表現時，該細胞可產生根據本揭露內容之抗體。因此，在本揭露內容之一個實施例中，包括包含根據本揭露內容之抗體及/或根據本揭露內容之核酸的細胞。該細胞在某些態樣中係動物細胞，在某些態樣中係哺乳動物細胞，在某些態樣中係靈長類動物細胞，在某些態樣中係人類細胞。合適的細胞係能夠包含並且在某些態樣中產生根據本揭露內容之抗體及/或根據本揭露內容之核酸的任何細胞。
本揭露內容亦提供了包含根據本揭露內容之抗體的細胞。在某些態樣中，該細胞(通常係活體外、分離的或重組的細胞)產生該抗體。該細胞亦可以係儲存的細胞，其在自儲存中取出並培養時能夠產生該抗體。在某些態樣中，該細胞係雜交瘤細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞或PER-C6 TM細胞。在某些態樣中，該細胞係CHO細胞。進一步提供了包含根據本揭露內容之細胞的細胞培養物。各種機構及公司已經開發了用於大規模生產抗體的細胞株，例如用於臨床用途。此類細胞株的非限制性實例係CHO細胞、NS0細胞或PER.C6 TM細胞。此等細胞亦用於其他目的，諸如生產蛋白質。為工業規模生產蛋白質及抗體而開發的細胞株在本文中進一步稱為工業細胞株。因此，某些態樣包括開發用於大規模生產抗體的細胞株用於生產本揭露內容之抗體之用途，在某些態樣中包括用於生產包含編碼VH、VL及/或如圖2或圖3所描繪的重鏈的核酸分子之抗體的細胞。
本揭露內容進一步提供了一種用於產生抗體之方法，其包含培養本揭露內容之細胞並自該培養物中收穫該抗體。在某些態樣中，該細胞在無血清培養基中培養。在某些態樣中，該細胞適於懸浮生長。亦提供了一種抗體，其可藉由根據本揭露內容之產生抗體的方法獲得。抗體在某些態樣中係自培養物的培養基中純化的。在某些態樣中，該抗體係親和純化的。
本揭露內容之細胞係例如雜交瘤細胞株、CHO細胞、293F細胞、NS0細胞或已知其適合用於臨床目的之抗體生產的另一種細胞類型。在某些態樣中，該細胞係人類細胞。在某些態樣中，細胞被腺病毒E1區或其功能等效物轉形。在某些態樣中，此類細胞株係PER.C6TM細胞株或其等效物。在某些態樣中，該細胞係CHO細胞或其變體。在某些態樣中，變體利用麩醯胺酸合成酶(GS)載體系統來表現抗體。
在懸浮293F細胞中短暫轉染後，本揭露內容之抗體可以以＞50 mg/L的位準產生。雙特異性抗體可以純化至大於98%的純度，且產率＞70%。分析表徵研究顯示雙特異性lgG1抗體譜與二價單特異性lgG1相當。就功能活性而言，本揭露內容之雙特異性抗體可以在活體外及活體內證明與西妥昔單抗相比更優的效力。
本揭露內容進一步提供了一種醫藥組成物，其包含根據本揭露內容之抗體。醫藥組成物在某些態樣中包含某些態樣的醫藥學上可接受之賦形劑或載劑(carrier)。
抗體可以包含標記，在某些態樣中用於活體內成像的標記。此類標記通常並非治療應用所必需的。例如在診斷設置中，標記可能會有幫助。舉例而言，使體內的目標細胞可視化。各種標記均係合適的，且許多係此項技術中眾所周知的。在某些態樣中，標記係用於偵測的放射性標記。在某些態樣中，標記為紅外線標記。在某些態樣中，紅外線標記適用於活體內成像。熟習此項技術者可以獲得各種紅外線標記。較佳的紅外線標記例如係IRDye 800；IRDye 680RD；IRDye 680LT；IRDye 750；IRDye 700DX；IRDye 800RS IRDye 650；IRDye 700胺基亞磷酸酯；IRDye 800胺基亞磷酸酯(LI-COR USA；4647 Superior Street；Lincoln, Nebraska)。
本揭露內容亦提供了一種用於治療患有腫瘤或處於患有該腫瘤風險下的主體之方法，其包含向有需要之主體投予根據本揭露內容之抗體或醫藥組成物。在某些態樣中，腫瘤係EGFR、cMET或EGFR/cMET陽性腫瘤。在開始該治療之前，該方法在某些態樣中進一步包含確定該主體是否具有此類EGFR、cMET或EGFR/cMET陽性腫瘤。本揭露內容進一步提供了用於治療患有或處於患有EGFR、cMET或EGFR/cMET陽性腫瘤風險下的主體的本揭露內容之抗體或醫藥組成物。
為了確定腫瘤是否對EGFR呈陽性，熟習此項技術者可以例如測定EGFR擴增及/或免疫組織化學染色。活體組織切片中至少10%的腫瘤細胞應該係陽性的。活體組織切片亦可以含有20%、30%、40%、50%、60%、70%或更多的陽性細胞。為了確定腫瘤是否對cMET呈陽性，熟習此項技術者可以例如測定cMET擴增及/或免疫組織化學中的染色。活體組織切片中至少10%的腫瘤細胞應該係陽性的。活體組織切片亦可以含有20%、30%、40%、50%、60%、70%或更多的陽性細胞。
癌症或腫瘤可以係EGFR、cMET或EGFR/cMET陽性癌症。在一個較佳的態樣中，本揭露內容提供EGFR、cMET或EGFR/cMET陽性癌症的治療，該癌症係肺癌，特別係非小細胞肺癌；頭頸癌，特別係頭頸鱗狀細胞癌；胃癌，特別係胃腺癌；食道癌，特別係食道鱗狀細胞癌；胃/食道交界處癌、乳癌、大腸癌、胰臟癌、卵巢癌、大腸直腸癌或膀胱癌。本揭露內容可應用於範圍廣泛的EGFR、cMET或EGFR/cMET陽性癌症，如肺癌，在某些態樣中包括非小細胞肺癌。主體在某些態樣中係人類主體。在某些態樣中，主體係符合使用EGFR特異性抗體(諸如西妥昔單抗)之抗體療法的資格的主體。在某些態樣中，本揭露內容可以在某些態樣中治療主體，該主體包含腫瘤，在某些態樣中EGFR/cMET陽性癌症，在某些態樣中具有EGFR RTK抗性表型、EGFR單株抗體抗性表型或其組合的腫瘤/癌症。
如本文所用，術語『癌症』與術語『腫瘤』的適用範圍相同，因此腫瘤的治療亦適用於癌症的治療。
投予患者之抗體量通常在治療窗內，意味著使用足夠的量來獲得治療效果，同時該量不超過導致不可接受程度的副作用的臨限值。獲得所需治療效果所需之抗體量愈低，治療窗通常就愈大。因此，以低劑量發揮足夠的治療效果的根據本發明之抗體係較佳的。劑量可以在西妥昔單抗給藥方案的範圍內。劑量亦可以更低。在某些態樣中，劑量係1000 mg、1500 mg或2000 mg。給藥可以係每週一次或每二週一次。
在某些態樣中，癌症係肺癌，特別係非小細胞肺癌；頭頸癌，特別係頭頸鱗狀細胞癌；胃癌，特別係胃腺癌；食道癌，特別係食道鱗狀細胞癌；胃/食道交界處癌、乳癌、大腸癌、胰臟癌、卵巢癌、大腸直腸癌或膀胱癌，且本揭露內容之抗體以1000 mg的量，通常1000 mg的均一劑量每週投予一次。
在某些態樣中，癌症係肺癌，特別係非小細胞肺癌；頭頸癌，特別係頭頸鱗狀細胞癌；胃癌，特別係胃腺癌；食道癌，特別係食道鱗狀細胞癌；胃/食道交界處癌、乳癌、大腸癌、胰臟癌、卵巢癌、大腸直腸癌或膀胱癌，且本揭露內容之抗體以1000 mg的量，通常1000 mg的均一劑量每二週投予一次。
在某些態樣中，癌症係肺癌，特別係非小細胞肺癌；頭頸癌，特別係頭頸鱗狀細胞癌；胃癌，特別係胃腺癌；食道癌，特別係食道鱗狀細胞癌；胃/食道交界處癌、乳癌、大腸癌、胰臟癌、卵巢癌、大腸直腸癌或膀胱癌，且本揭露內容之抗體以1500 mg的量，通常1500 mg的均一劑量每二週投予一次。
在某些態樣中，癌症係肺癌，特別係非小細胞肺癌；頭頸癌，特別係頭頸鱗狀細胞癌；胃癌，特別係胃腺癌；食道癌，特別係食道鱗狀細胞癌；胃/食道交界處癌、乳癌、大腸癌、胰臟癌、卵巢癌、大腸直腸癌或膀胱癌，且本揭露內容之抗體以2000 mg的量，通常2000 mg的均一劑量每二週投予一次。
在某些態樣中，結合EGFR及cMET的雙特異性抗體以1000、1500或2000 mg的劑量，特別係使用均一劑量方案提供給主體。與體表或體重給藥相比，均一劑量方案具有數種優勢，因為其減少了準備時間並減少了潛在的劑量計算錯誤。在某些態樣中，雙特異性抗體每週一次(Q1W)、每2週一次(Q2W)或每3週一次(Q3W)投予。在某些態樣中，雙特異性抗體每二週投予一次。在此項技術中，此種給藥方案被稱為Q2W。在某些實施例中，本文揭示之均一劑量方案適用於成人及/或體重至少35 kg的主體。如熟習此項技術者所理解的，劑量可以隨時間投予。如熟習此項技術者所理解的，術語「均一劑量」或「均一劑量方案」意謂主體經歷給藥方案，其中主體被安排每天接受與其預定量基本上相同的雙特異性抗體，該量與主體的體重無關。根據某些態樣，向主體提供1000 mg的均一的每週一次劑量的雙特異性抗體。或者，向主體提供1000 mg的均一的每二週一次劑量的雙特異性抗體。或者，向主體提供1500 mg的均一的每二週一次劑量的雙特異性抗體。或者，向主體提供2000 mg的均一的每二週一次劑量的雙特異性抗體。
在其他方面類似的條件下，與西妥昔單抗相比，根據本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中誘導較少的皮膚毒性。在其他方面類似的條件下，與西妥昔單抗相比，根據本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中產生較少的促炎趨化因子，在某些態樣中CXCL14。在其他方面類似的條件下，與西妥昔單抗相比，根據本揭露內容之雙特異性抗體在某些態樣中誘導抗微生物RNA酶(在某些態樣中RNA酶7)的較少損傷。
本揭露內容描述了靶向EGFR及cMET受體並導致強效的活體外癌細胞株增殖抑制及活體內腫瘤生長抑制之抗體。雙特異性抗體可以結合低毒性概況及高功效。本揭露內容之抗體可以用於各種類型及線的EGFR靶向療法。當與雙臂結合相同(多個)抗原之抗體相比時，本揭露內容之抗體可以具有增加的治療窗。與西妥昔單抗抗體相比，本揭露內容之雙特異性抗體可以在活體外、活體內或其組合中表現出更好的生長抑制作用。
本揭露內容提供了雙特異性抗體，用於治療可能患有多種不同類型腫瘤中之一或多種的主體。腫瘤可以係EGFR陽性腫瘤、cMET陽性腫瘤或EGFR及cMET陽性腫瘤。腫瘤可能對EGFR或cMET酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。在某些態樣中，EGFR酪胺酸激酶抑制劑係第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑，在某些態樣中係奧希替尼或其類似物。在某些態樣中，cMET酪胺酸抑制劑係或包含卡馬替尼或特泊替尼。在此及其他實施例中，腫瘤可以係HGF相關腫瘤。
EGFR陽性腫瘤通常係具有EGFR活化突變的腫瘤。EGFR活化突變係導致EGF/EGFR信號傳導路徑活化的EGFR突變。EGFR活化突變對於腫瘤的癌性狀態可能係重要的。此類腫瘤對EGFR靶向療法變得不敏感的一種方式係藉由活化HGF/cMET信號傳導路徑。腫瘤可以係HGF相關腫瘤。cMET/HGF信號傳導路徑的活化係EGFR陽性腫瘤可以逃避EGFR靶向療法治療的方式之一。cMET/HGF路徑可以多種方式活化。此項技術中描述了各種活化方法，其中一些在本文中詳述。本揭露內容之抗體特別適用於治療其中cMET/HGF信號傳導路徑的活化與HGF的存在或過量相關的腫瘤。此類cMET陽性腫瘤被稱為HGF相關腫瘤或HGF依賴性腫瘤。本揭露內容之抗體亦可以用於至少部分抑制EGFR陽性腫瘤的此種可能的逃逸機制。此類腫瘤可以經由選擇的腫瘤細胞生長來逃避EGFR靶向療法，其中，此外，cMET/HGF信號傳導路徑被活化。此類細胞可能存在於EGFR靶向療法開始時。此類細胞比HGF/cMET信號轉導陰性腫瘤細胞具有選擇性生長優勢。腫瘤可以係其中HGF/cMET信號傳導路徑被活化的腫瘤。腫瘤可以係與升高的肝細胞生長因子(HGF)位準或HGF受體c-Met的過表現相關的腫瘤。腫瘤可以係其中生長由EGF及/或HGF驅動的腫瘤。若腫瘤細胞中的信號傳導路徑對某種生長因子的存在起反應而被活化並且該生長因子的去除導致腫瘤細胞生長的抑制，則稱腫瘤由該生長因子驅動。減少可以藉由減少的細胞***及/或誘導的細胞殺傷(諸如細胞凋亡)來量測。若在本來允許腫瘤生長的條件下，腫瘤在HGF存在下生長或生長更快，則腫瘤係HGF相關腫瘤。
針對各種腫瘤的EGFR靶向療法由Vecchione等人, EGFR-targeted therapy." Experimental cell research 第317卷 (2011): 2765-2771綜述。一般來說，EGFR靶向療法係一種使用與EGFR相互作用並抑制細胞中EGFR介導之信號傳導的分子的療法。
在某些態樣中，如本文所示的治療方法或用於治療之抗體進一步包含判定腫瘤是否為HGF相關腫瘤的步驟。在某些態樣中，本揭露內容之抗體可以抑制HGF相關腫瘤的生長。
在本文範圍給出為介於數字1與數字2之間的情況下，該範圍包括數字1及數字2。舉例而言，介於2-5之間的範圍包括數字2及5。
當本文提及高於另一者之親和力時，Kd=低於另一Kd。為避免疑義，10e-9 M的Kd低於10e-8 M的Kd。Kd為10e-9 M之抗體對目標的親和力高於Kd為10e-8 M時的親和力。
在某些態樣中，在治療開始時，至少一個、超過一個或所有以下納入因素IF1-IF7適用於治療的主體。在某些態樣中，主體包括或符合所有納入因素IF1-IF8： IF1. 在簽署知情同意書時年齡等於或高於18歲， IF2. 患有經組織學或細胞學證實的實體腫瘤，具有轉移性或局部晚期未切除疾病的證據，無法治癒。 IF3.1. 對於先前標準第一線治療失敗的主體：主體在使用已知可提供臨床益處的療法時出現進展或對該等療法不耐受。主體具有攜帶活化EGFR突變的NSCLC，包括酪胺酸激酶抑制劑(TKI)致敏突變及/或批准的TKI抗性突變或任何活化c-MET突變/擴增。 IF3.2. 對於先前接受過第一或更高抗癌治療的主體：在使用已知可提供臨床益處的療法時出現進展或對該等療法不耐受。患者必須患有：NSCLC，攜帶EGFR外顯子20***，在鉑雙藥後進展；或NSCLC，攜帶cMet外顯子14跳躍突變，處於第二(或更高)線患者、卡馬替尼及特泊替尼抗性群體中，或經cMET TKI治療或未曾經cMET TKI治療；或選定的實體腫瘤(包括GC/GEJ；HNSCC，例如對批准的治療難治的HNSCC (無論驅動突變如何)；或ESCC)，攜帶EGFR或cMet驅動突變或cMET改變，具有罕見EGFR突變(G719X、L861Q及S768I)的NSCLC患者或攜帶c-MET外顯子14跳躍突變的NSCLC主體，且未曾接受過晚期疾病治療。主體用盡或不耐受所有經證實具有臨床益處的批准療法，或者沒有可用的、批准的治療選擇。 IF4. 在使用最近的療法時出現進展後可獲得FFPE包埋的存檔或新鮮腫瘤組織樣品。 IF5. 以藉由RECIST 1.1版藉由放射學方法所定義的可量測的疾病(具有不可量測但可評估的疾病的患者可以包括在劑量遞增部分中)。 IF6. 東部腫瘤合作組(ECOG)表現狀態為0或1。 IF7. 預期壽命≥12週。 IF8. 足夠的器官功能，由以下至少一項或全部確定： IF8.1嗜中性白血球絕對計數(ANC)≥1.5×10 9/L。 IF8.2血紅素≥9 g/dL。 IF8.3血小板≥100×10 9/L。 IF8.4經校正總血清鈣在正常範圍內。 IF8.5血清鎂在正常範圍內(或藉由補充劑校正)。 IF8.6血清鉀在正常範圍內。 IF8.7丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST)等於或小於3.0×正常值上限(ULN)，且總膽紅素等於或小於1.5×ULN，條件係在肝臟受累或惡性腫瘤的情況下，ALT/AST等於或小於5×ULN，且總膽紅素等於或小於2×ULN。 IF8.8對於捷倍耳氏症候群(Gilbert's syndrome)患者，結合膽紅素的值在正常範圍內。 IF8.9根據Cockroft及Gault公式或用於年齡超過65歲之患者的MDRD公式所計算，血清肌酐等於或小於1.5×ULN或肌酐清除率等於或高於50 mL/min。 IF8.10血清白蛋白＞3.3 g/dL
在某些態樣中，根據IF8的器官功能量測的所有值均具有在健康主體之情況下觀察到的上限。
在某些態樣中，治療的主體包含一或多種選自由IF1-IF8組成之群的因素。在某些態樣中，治療的主體包含因素IF2、IF3、IF5及IF8。在某些態樣中，治療的主體包含所有因素IF1-IF8。
在某些態樣中，在治療開始時，至少一種、超過一種或所有以下排除因素EF1-EF16適用於治療的主體： EF1. 具有中樞神經系統癌轉移，該等癌轉移： EF1.1：係未曾經過治療且有症狀的，而具有無症狀病變的主體可以在認為穩定時包括在內； EF1.2需要輻射或手術； EF1.3需要持續類固醇療法(＞10 mg普賴松(prednisone)或等效物)以在投藥的14天內控制症狀，接著投予首次劑量。允許有其他中樞神經系統轉移的主體。 EF2. 已知軟腦膜受累。 EF3. 在投予首次劑量前4週內參加過另一項臨床研究或使用任何研究中藥物進行治療。 EF4. 在研究藥物首次劑量的4週或5個半衰期(以較短者為準)內投予全身抗癌療法或免疫療法。對於具有主要延遲毒性的細胞毒性劑(例如，絲裂黴素C、亞硝基脲)，需要6週的清除期。 EF5. 在投予首次劑量的3週內進行大手術或放射療法。在任何時候先前接受過等於或超過25%骨髓放射療法的主體不符合資格。 EF6. 持續存在與先前的抗惡性腫瘤療法相關的超過1級的臨床顯著毒性(脫髮除外)；條件係不排除穩定的感覺神經病變等於或小於2級NCI-CTCAE v5.0及甲狀腺功能低下等於或小於2級且在使用激素替代法時穩定。 EF7. 有高敏性反應史或歸因於人類蛋白質或任何賦形劑的任何毒性，需要永久停用此等藥劑。 EF8. 有臨床意義的心血管疾病史，包括但不限於： EF8.1在研究藥物首次劑量前1個月內診斷深層靜脈栓塞或肺栓塞，或在研究藥物首次劑量前6個月內診斷為以下任何一種：心肌梗塞、不穩定型心絞痛、中風、短暫性缺血發作、冠狀動脈/週邊動脈心血管繞道術或任何急性冠狀動脈症候群。 EF8.2 QT間期延長＞480毫秒或有臨床意義的心臟節律不整或電生理疾病(亦即，置放植入式心臟整流除顫器或心房震顫且心率不受控制)。臨床穩定的裝有心臟起搏器的患者符合資格。 EF8.3不受控制的(持續性)動脈性高血壓：收縮壓＞180 mm Hg及/或舒張壓＞100 mm Hg。 EF8.4鬱血性心臟衰竭(CHF)定義為紐約心臟協會(New York Heart Association，NYHA) III-IV級或研究藥物首次劑量的6個月內因CHF住院。 EF8.5有臨床意義的心包膜積液。 EF8.6心肌炎。 EF9. 有間質性肺病史，包括藥物誘發的間質性肺病、1年內需要長期使用類固醇或其他免疫抑制劑治療的放射性肺炎。 EF10. 有先前或併發的惡性腫瘤，不包括非基底細胞皮膚癌或子宮頸原位癌，除非腫瘤以治癒性或緩解性目的進行治療，並且先前或併發惡性腫瘤病況不影響研究藥物的安全性及功效之評估。 EF11. 目前患有嚴重疾病或醫學病況，包括但不限於不受控制的活動性感染、有臨床意義的肺部、代謝或精神病症。 EF12. 有活動性B型肝炎感染(HBsAg陽性)而未曾接受過抗病毒治療。活動性B型肝炎(HbsAg陽性)主體必須接受拉米夫定、替諾福韋、恩替卡韋或其他抗病毒藥劑的抗病毒治療，在投予首次劑量前至少7天或更長時間開始。有B型肝炎病史(抗HBc陽性、HbsAg及HBV-DNA陰性)的主體符合資格。 EF13. C型肝炎核糖核酸(HCV RNA)測試呈陽性；HCV感染自發消退的主體(陽性HCV抗體，但未偵測到HCV-RNA)或在抗病毒治療後獲得持續病毒學反應且在停止抗病毒治療後顯示不存在可偵測的HCV RNA等於或超過6個月(在使用無IFN方案的情況下)或等於或超過12個月(在使用以IFN為主之方案的情況下)的主體符合資格。 EF14. 有已知的HIV病史(HIV 1/2抗體)。允許偵測不到病毒負荷量的HIV患者。除非當地衛生當局或法規強制要求，否則不需要進行HIV測試。 EF15. 若有生育能力的性活躍男性及女性患者同意在整個研究持續期間及在最後一次投予PB19478之後6個月內使用以下節育方法之一： •與抑制***相關的組合(含***及助孕素)激素避孕法(口服、***內、透皮) •與抑制***相關的僅含助孕素的激素避孕法(口服、可注射、可植入) •子宮避孕器(IUD) •子宮內激素釋放系統(IUS) •雙側輸卵管閉塞 •輸精管切斷的伴侶 •禁慾 EF16. 正在懷孕或哺乳。
在某些態樣中，治療的主體符合一或多種選自由EF1-EF16組成之群的因素。在某些態樣中，治療的主體符合所有因素EF1-EF16。
本文中提及引用的專利文件或其他事項不應被視為承認該文件或事項係已知的，或者其所含的資訊在任何申請專利範圍的優先權日係通常一般知識的一部分。
多個引用的要素之間的連接術語「及/或」被理解為涵蓋個別的及組合的選項。舉例而言，當二個要素由「及/或」連接時，第一個選項係指在沒有第二個要素之情況下第一個要素的適用性。第二個選項係指在沒有第一個要素之情況下第二個要素的適用性。第三個選項係指第一個及第二個要素一起的適用性。此等選項中之任何一個均被理解為落入該含義內，且因此滿足如本文使用的術語「及/或」的要求。超過一個選項的同時適用性亦被理解為落入該含義內，且因此滿足術語「及/或」的要求。
為了清楚及簡明的描述，本文將特徵描述為相同或單獨實施例的一部分，然而，應當理解，本揭露內容之範圍可以包括具有所描述的全部或一些特徵的組合的實施例。
較佳實施例之詳細說明 條項
1.一種雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYX 1X 2NTNYAQKLQG及包含序列X 3X 4X 5X 6HWWLX 7A的CDR3，其中X 1=N或S；X 2=A或G；X 3=D或G；X 4=R、S或Y；X 5=H、L或Y；X 6=D或W且X 7=D或G；在X 1-X 7以外的位置具有0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 1-23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合，該雙特異性抗體用於治療已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑；或ii)化學療法及酪胺酸激酶抑制劑；iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症或iv)治療未曾接受過任何先前抗癌治療的主體的癌症之方法。
2.一種治療已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑或ii)化學療法及EGFR酪胺酸激酶抑制劑、iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症或iv)治療未曾接受過任何先前抗癌治療的主體的癌症之方法，該治療包含向該主體投予有效量之雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYX1X2NTNYAQKLQG及包含序列X3X4X5X6HWWLX7A的CDR3，其中X1=N或S；X2=A或G；X3=D或G；X4=R、S或Y；X5=H、L或Y；X6=D或W且X7=D或G；在X1-X7以外的位置具有0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 1-23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
3.一種雙特異性抗體在製造供治療已經接受過i)第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑或ii)化學療法及EGFR酪胺酸激酶抑制劑、iii) cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的主體的癌症或iv)治療未曾接受過任何先前抗癌治療的主體的癌症用的藥物中之用途，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的胞外部分的第一可變域及可以結合(bind) (或結合(binds))人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的胞外部分的第二可變域，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYX1X2NTNYAQKLQG及包含序列X3X4X5X6HWWLX7A的CDR3，其中X1=N或S；X2=A或G；X3=D或G；X4=R、S或Y；X5=H、L或Y；X6=D或W且X7=D或G；在X1-X7以外的位置具有0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 1-23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，在某些態樣中0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
4.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中已經接受過根據i)的先前治療的該主體或癌症對第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。
5.根據條項1至3中任一項之用途或方法，其中已經接受過根據ii)的先前治療的該主體或癌症對第一代、第二代及/或第三代酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。
6.根據條項1至3中任一項之用途或方法，其中已經接受過根據iii)的先前治療的該主體或癌症對cMET酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。
7.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中根據i)的該雙特異性抗體的投予包含第二線治療，並且根據ii)或iii)的投予包含第三線治療。
8.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該第一代EGFR酪胺酸激酶抑制劑包含或係吉非替尼、厄洛替尼、吉非替尼或埃克替尼。
9.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該第二代EGFR酪胺酸激酶抑制劑包含或係阿法替尼、達克替尼、XL647、AP26113、CO-1686或來那替尼。
10.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該第三代EGFR酪胺酸激酶包含奧希替尼、拉澤替尼、阿氟替尼、瑞齊替尼、羅西替尼、奧穆替尼、阿美替尼、阿比維替尼、ASK120067、貝福替尼、奧穆替尼、羅西替尼或SH-1028 (那紮替尼(EGF816)、萘闊替尼(ASP8273)、馬維替尼(PF-0647775)、奧拉非替尼(CK-101)、克耐替尼或ES-072，較佳奧希替尼。
11.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該cMET酪胺酸激酶抑制劑包含或係卡馬替尼、特泊替尼、克唑替尼、卡博替尼、賽沃替尼、格列沙替尼、斯塔瓦替尼、BMS-777607、梅沙替尼、替凡替尼、戈伐替尼、福瑞替尼、AMG-337或BMS-794833，較佳卡馬替尼或特泊替尼。
12.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該化學療法包含以鉑為主的化學療法、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、吉西他濱、長春瑞濱、依託泊苷或培美曲塞，或其任何組合，較佳為包含順鉑或卡鉑之組合。
13.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症係EGFR陽性癌症、cMET陽性癌症或EGFR及cMET陽性癌症。
14.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含EGFR畸變、cMET畸變或EGRF及cMET畸變。
15.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含活化EGFR突變、批准的酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、三級酪胺酸激酶抑制劑抗性突變(諸如L718X (例如L718Q)、G719X (例如G719A)、L792X (例如L792H)、G796X (例如G796R、G796S、G796D)、C797X、C797X (例如C797S、C797G)、減少第三代酪胺酸激酶抑制劑與EGFR之結合的突變(例如L792X、L718X)、獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變(諸如C797X、L792X、G796X、G724X、S768X、L718X或外顯子20***突變)、EGFR基因擴增、cMET突變或cMET畸變。
16.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含外顯子19缺失突變，較佳同框外顯子19缺失、外顯子20誤義突變(例如T790M)或外顯子21突變，諸如L858R。
17.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含EGFR外顯子20突變，較佳外顯子20***突變。
18.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變，諸如賦予奧希替尼抗性的突變，包括G724X (例如G724S)、S768X (例如S768I)、T790X (例如T790M)、L792X (例如L792H)、C797X (包括C797S及C797G)、L798X (例如L798I)。
19.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含外顯子20 (762-823)突變，其選自近環***(位置767-772)、遠環***(位置773-775)，較佳V769_D770insASV、D770_N771insSVD、H773_V774insNPH、H773_V774insH、D770_N771insG、D770delinsGY、N771_P772insN、V774_C775insHV、D770_N771insGL、H773_V774insPH、A763_Y764insFQEA、D770_N771delinsEGN、D770_N771insGD、D770_N771insH、D770_N771insP、H773_V774insAH、H773_V774insGNPH、H773delinsSNPY、N771_P772insH、N771_P772insVDN、N771delinsGY、N771delinsKH、N771delinsRD、P772_H773delinsHNPY、P772_H773insGT、P772_H773insPNP、P772_H773insT、V769_D770insA、V769_D770insGG、V769_D770insGSV、V769_D770insGVV及V769_D770insMASV；或突變T790M、L792X (例如L792H、C796X (例如G796R、G796S、G796D)、C797X (例如C797S、C797G)、L798I，或同框外顯子20***，諸如M766_A767insASV或H773-V774insNPH、Ins761(EAFQ)、Ins770(ASV)、Ins771(G)、Ins774(NPH)、M766_A7671ns A、S768_V769InsSVA、P772_H773InsNS、D761_E762InsX1-7、A763_Y764InsX1-7、Y764_Y765 InsX1-7、M766_A767InsX1-7、A767_V768 InsX1-7、S768_V769 InsX1-7⟩ V769_D770 InsX1-7⟩ D770_N771 InsX1-7⟩ N771_P772 InsX1-7⟩ P772_H773 InsX1-7、H773_V774 InsX1-7或V774_C775 InsX1-7。
20.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含cMET畸變，諸如cMET擴增、cMET過表現、增加的cMET路徑的信號傳導、cMET基因擴增、增加的cMET蛋白活性及/或增加的HGF表現。
21.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含cMET外顯子14跳躍突變。
22.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症係非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸癌，特別係頭頸鱗狀細胞癌；胃癌，特別係胃腺癌；食道癌，特別係食道鱗狀細胞癌；胃/食道交界處癌、乳癌、大腸癌、胰臟癌、卵巢癌、大腸直腸癌或膀胱癌。
23.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症係NSCLC，其包含活化EGFR突變、EGFR酪胺酸激酶抑制劑致敏突變(諸如外顯子19缺失及L858X)、獲得性EGFR酪胺酸激酶抑制劑抗性突變(諸如T790X、C797X、L792X、L798X)、批准的EGFR酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、EGFR外顯子20***突變、活化c-MET突變，較佳外顯子14跳躍突變，或cMET擴增，較佳包含MET/CEP7＞5或cfDNA≥2個拷貝、增加的HGF表現或其任何組合。
24.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症係晚期或轉移性癌症。
25.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該癌症或患者在接受該針對晚期或轉移性癌症的先前治療後發生進展。
26.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中治療包含用於評估該癌症是否為EGFR陽性及/或cMET陽性癌症或評估該癌症中EGFR及/或cMET畸變的存在的診斷步驟。
27.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中治療包含以下診斷步驟：確定EGFR擴增，免疫組織化學染色，確定腫瘤組織、血液或血清中一或多種生物標誌物的量，諸如EGFR/c-MET信號傳導路徑活性的量，量測血液或血清中的可溶性EGFR及可溶性c-MET及/或量測腫瘤細胞中的EGFR及c-MET目標表現。
28.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該主體係人類主體。
29.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該抗體係人類抗體。
30.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該抗體係ADCC增強的。
31.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該抗體係具有1:1的抗EGFR、抗cMET化學計量的IgG1格式抗體。
32.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該抗體具有一個可以結合EGFR的可變域及一個可以結合cMET的可變域。
33.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該可以結合人類EGFR的可變域亦可以結合食蟹獼猴及小鼠EGFR。
34.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該可以結合人類EGFR的可變域結合人類EGFR的域III。
35.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該可以結合cMET的可變域阻斷抗體5D5與cMET的結合。
36.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該可以結合cMET的可變域阻斷HGF與cMET的結合。
37.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中一個CH3域中位置405及409的胺基酸與另一CH3域中相應位置的胺基酸相同(EU編號)。
38.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中 X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=N；X 2=G；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G； X 1=N；X 2=A；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G；或 X 1=S；X 2=G；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G。
39.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D；或X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D；或X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D。
40.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D；或X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D。
41.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該第二可變域的該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1-3；7；8；10；13；15；16；17；21；22或23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，較佳0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
42.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該第二可變域的該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2；7；8；10；13或23的序列之一的胺基酸序列，具有0-10個，較佳0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其組合。
43.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYNGNTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的CDR3，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYSMN；CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及CDR3序列ETYYYDRGGYPFDP。
44.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該第一可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列SYGIS；CDR2序列WISAYNANTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的CDR3，並且其中該第二可變域包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有CDR1序列TYSMN；CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及包含序列ETYFYDRGGYPFDP的CDR3。
45.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該第一可變域及該第二可變域包含共同的輕鏈，較佳圖4B的輕鏈。
46.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中該第一可變域及該第二可變域包含分別具有QSISSY、AAS及QQSYSTP的CDR1、CDR2及CDR3胺基酸序列的輕鏈(根據IMGT)。
47.根據前述條項中任一項之用途或方法，該抗體抑制HGF誘導的HGF生長反應性細胞的生長。
48.根據前述條項中任一項之用途或方法，該抗體抑制EGF誘導的EGF生長反應性細胞的生長。
49.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中向該主體投予1000 mg雙特異性抗體，特別係使用1000 mg的均一劑量。
50.根據條項49之用途或方法，其中該雙特異性抗體每週投予一次。
51.根據條項49之用途或方法，其中該雙特異性抗體每二週投予一次。
52.根據條項1至48中任一項之用途或方法，其中向該主體投予1500 mg雙特異性抗體，特別係使用1500 mg的均一劑量。
53.根據條項52之用途或方法，其中該雙特異性抗體每二週投予一次。
54.根據條項1至48中任一項之用途或方法，其中向該主體投予2000 mg雙特異性抗體，特別係使用2000 mg的均一劑量。
55.根據條項54之用途或方法，其中該雙特異性抗體每二週投予一次。
56.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中iv)中的該主體未曾接受過任何使用cMET抑制劑的先前抗癌治療。
57.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中iv)中的該主體未曾接受過任何使用cMET TKI抑制劑的先前抗癌治療。
58.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中iv)中的該主體未曾接受過任何使用卡馬替尼的先前抗癌治療。
59.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中iv)中的該主體未曾接受過任何使用特泊替尼的先前抗癌治療。
60.根據前述條項中任一項之用途或方法，其中iv)中的該主體未曾接受過任何使用賽沃替尼的先前抗癌治療。 實例
如本文所用，其中X獨立地為數字0-9的「MFXXXX」係指包含可變域的Fab，其中VH具有由4個數字標識的胺基酸序列。除非另有說明，否則可變域的輕鏈可變區通常具有圖4A，通常4b的序列。「MFXXXX VH」係指由4位數字標識的VH的胺基酸序列。MF進一步包含輕鏈恆定區及通常與輕鏈恆定區相互作用的重鏈恆定區。PG係指包含相同重鏈及輕鏈的單特異性抗體。PB係指具有二條不同重鏈的雙特異性抗體。重鏈的VH可變區不同，且通常亦有CH3區，其中一條重鏈具有其CH3域的KK突變，而另一條重鏈具有其CH3域的互補DE突變(參見參考文獻PCT/NL2013/050294 (作為WO2013/157954公開)。
參考PCTNL/2018/050537 (作為WO2019/031965公開)以獲取本揭露內容之抗體生產的詳情。適用於所附實例及本發明方法的結合EGFR及cMET之雙特異性抗體包括表3、4、5及6中之彼等。具體而言，雙特異性抗體PB19478適用於所附實例。
各雙特異性抗體包含二個分別能夠結合EGFR及cMET的由MF編號指定的VH，進一步包含Fc尾部，該Fc尾部具有分別如圖5e及圖5f所示的KK/DE CH3異二聚化域、如圖5d所示的CH2域、如圖5b所示的鉸鏈域、如圖5a所示的CH1域及如圖4a-e所示的共同的輕鏈。舉例而言，由MF8233×MF8230表示的雙特異性抗體具有上述通用序列及VH序列為MF8233的可變區及VH序列為MF8230的可變區，且在某些態樣中用於所附實例中。 實例1 ：材料及方法細胞株：
EBC-1 [JCRB0820]、PC-9 [RCB0446]、H358 [ATCC® CRL-5807™]、HCC827 [ATCC ®CRL-2868 ™],MKN-45 [DSMZ ACC 409] N87 [ATCC®CRL-5822™]及A431 [ATCC® CRL-1555™]細胞株係購得的且其常規維持在補充有10%熱不活化胎牛血清(FBS)的生長培養基中。HEK293F Freestyle細胞獲自Invitrogen，並常規維持在293 FreeStyle培養基中。 cDNA構築體： 生成用於生成穩定細胞株(cMET及EGFR)及用於免疫(cMET)的cMET及EGFR表現載體
包括用於選殖的獨特限制性位點及用於有效轉譯的kozak共同序列的各目標的全長cDNA係經合成的，或使用引入用於選殖的獨特限制性位點及用於有效轉譯的kozak共同序列的特定引子，經由對含有目標cDNA之市售表現構築體進行PCR擴增來獲得。各目標的全長cDNA被選殖至真核表現構築體中，諸如pcDNA3.1，而胞外域被選殖至pVAX1及pDisplay中。***序列藉由與NCBI參考胺基酸序列比較來驗證。
用於在細胞表面表現的胺基酸序列全長人類EGFR***序列(完全相同於GenBank：NP_00533)： MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA
其中： -MRPSGTAGAALLALLAALCPASR：訊息肽。 -ALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQ RNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS：人類EGFR的ECD。
- -IATGMVGALLLLLVVALGIGLFM：預測的TM區域。
- -RRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVL GSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA：胞內尾部。
由外顯子2-7的同框缺失引起的天然存在的EGFR變體VAR_066493人類EGFRvarIII之胞外域的胺基酸序列[Ji H., Zhao X; PNAS 103:7817-7822(2006)]。下面的_表示缺少胺基酸30-297的位置
MRPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKK_GNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS
其中： -MRPSGTAGAALLALLAALCPASR：訊息肽。 -ALEEKK_GNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRK VCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS：EGFRvarIII之ECD
胺基酸序列嵌合食蟹獼猴(恆河獼猴(Macaca mulatta))細胞外EGFR域雜交人類EGFR跨膜及胞內域，其供用於細胞表面上表現(完全相同於GenBank：XP_014988922.1。以下實例中人類EGFR序列加底線。
MGPSGTAGAALLALLAALCPASRALEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSEFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDTLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSSQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCQNVSRGRECVDKCNILEGEPREFVENSECIQCHPECLPQVMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCARNGPKIPS IATGMLGALLLLLVVALGIGLFMRRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGA
其中： -MGPSGTAGAALLALLAALCPASR：訊息肽。 -LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQR NYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS：cyEGFR的ECD
胺基酸序列全長人類cMET***序列，其供用於細胞表面上表現(完全相同於GenBank: P08581-2)。該序列與參考序列不同於755-755的位置之***：S→STWWKEPLNIVSFLFCFAS
MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISTWWKEPLNIVSFLFCFASGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS
其中： -MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNG：訊息肽 -ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVL NEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFT：人類cMET的ECD -GLIAGVVSISTALLLLLGFFLWL：跨膜區 -KKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDY RATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS：胞內區 參考抗體
抗cMET抗體為此項技術中已知的(表1)。單特異性二價cMET抗體係根據公開資訊來構築且於293F Freestyle細胞內表現。表1顯示相關的揭露資訊。針對cMET之單特異性二價抗體係根據公開資訊來構築且於293F Freestyle細胞內表現。關於HGF配位體阻斷分析，將專利衍生的抗cMET抗體之VH及VL編碼基因區段再選殖於噬菌體顯示載體供顯示於絲狀噬菌體上。
使用參考抗體西妥昔單抗(爾必得舒(Erbitux))作為EGFR Fab小組之參考抗體。
2994 Fab蛋白質係藉由木瓜酶消化自純化的PG2994 IgG產生。因此，PG2994與偶聯於小珠(Pierce #44985)上的木瓜酶一起培育，以及允許在旋轉下、於37℃消化5.5小時。Fab片段係藉由在MabSelectSure LX上過濾而由消化混合物純化。使含有Fab蛋白質的級分流過，使用vivaspin20 10 kDa濃縮至3 ml且使用於PBS中之superdex75 16/600管柱藉由凝膠過濾予以進一步純化。 實例2 二價單株抗體之產生及抗體表徵
將利用VH基因序列及其一些序列變體判斷之獨特的抗體之VH基因選殖至骨架IgG1載體內。懸浮適應的293F Freestyle細胞係於振盪器平台處在T125培養瓶內培養直至3.0×10 6個細胞/ml之密度。細胞係以每孔0.3-0.5×10 6個活細胞/ml的密度接種於24深孔盤內。細胞係以個別無菌的DNA:PEl混合物予以暫時轉染且進一步培養。在轉染七天之後，收穫上清液且經由0.22 µM (Sartorius)予以過濾以及使用批式純化於蛋白A小珠上純化接著與PBS進行緩衝液交換。 交叉阻斷分析cMET 抗體
在ELISA中測試cMET特異性噬菌體與cMET參考抗體的競爭。因此，將2.5 µg/ml的cMET-Fc融合蛋白在4℃下塗佈至MAXISORPTM ELISA盤上隔夜。ELISA盤的孔用含有2% ELK的PBS (pH7.2)在室溫下在振盪(700 rpm)的同時阻斷1小時。下一個參考或陰性對照IgG以5 µg/ml的濃度添加，並使其在室溫下以700 rpm結合15分鐘。接下來，添加5 μl PEG沈澱的噬菌體並使其在室溫下以700 rpm結合1小時。結合的噬菌體用HRP標記的抗M13抗體在室溫下以700 rpm偵測1小時。作為對照，該程序同時用對所塗佈抗原具有特異性之抗體及陰性對照噬菌體進行。結合的二級抗體藉由TMB/H 2O 2染色可視化，並藉由OD 450nm量測對染色進行定量。表2表明MF4040及MF4356顯示與5D5參考抗體的競爭。MF4297在較小程度上與13.3.2及C8H241競爭。陽性對照噬菌體均顯示與相應IgG的完全競爭，而無抗體的對照不影響競爭分析。 雙特異性抗體的產生
雙特異性抗體係藉由短暫共轉染二種質體來產生的，該等質體編碼具有不同VH域的IgG，使用專有的CH3工程化技術以確保有效的異二聚化及雙特異性抗體的形成。共同的輕鏈亦在同一細胞中共轉染，無論是在同一質體還是另一質體上。在吾人的同在申請中的申請案(例如
WO2013/157954及WO2013/157953；以引用的方式併入本文)中，吾人揭示了用於自單個細胞產生雙特異性抗體之方法及手段，由此提供了有利於形成雙特異性抗體而並非形成單特異性抗體的手段。此等方法亦可以有利地用於本發明。具體而言，基本上僅產生雙特異性全長IgG分子的較佳突變係第一個CH3域中的位置351及366處的胺基酸取代，例如L351K及T366K (根據EU編號進行編號) (『KK變體』重鏈)，及第二個CH3域中的位置351及368處的胺基酸取代，例如L351D及10 L368E (『DE變體』重鏈)，或反之亦然。先前在吾人同在申請中的申請中證明，帶負電荷的DE變體重鏈及帶正電荷的KK變體重鏈優先配對形成異二聚體(所謂的『DEKK』雙特異性分子)。由於相同重鏈之間CH3-CH3界面中帶電殘基之間的強烈排斥，不利於DE變體重鏈(DE-DE同二聚體)或KK變體重鏈(KK-KK同二聚體)的同二聚化。
表3顯示了哪些cMET及EGFRFab臂被選殖至合適的KK及DE載體中。生產後，雙特異性IgG藉由蛋白A分批純化進行純化，並將緩衝液更換為PBS。成功生產產生了最低濃度為0.1 mg/ml的IgG1全長抗體，並為其分配了一個獨特的代碼(PBnnnnn；其中nnnnn代表隨機生成的數字)以識別2個不同目標結合Fab片段的特定組合。成功生產的雙特異性IgG在ELISA中測試了與其各別目標的結合。關於雙特異性抗體生產的更多細節，本文參考PCTNL/2018/050537(作為WO2019/031965公開)。 實例3 在EGF/HGF 及HGF 及EGF 增殖分析中篩選c-MET×EGFR 雙特異性抗體
使用HGF/EGF、HGF及EGF分析在N87細胞中測試了一組cMET×EGFR雙特異性抗體的效力。N87細胞株，官方名稱NCI-N87，係一種源自轉移部位的胃癌細胞株，且具有高EGFR表現位準及中等cMET表現位準(Zhang等人, 2010)。在介於10 μg/ml至3.16 ng/ml範圍內的8步半對數滴定中測試抗體。各種抗體一式二份進行測試。抗RSV-G抗體PG2708用作陰性對照。參考抗體2994Fab用作HGF分析的陽性對照，而參考抗體西妥昔單抗用作EGF分析的陽性對照。
等莫耳1:1西妥昔單抗/5D5Fab用作EGF、HGF及EGF/HGF分析的陽性對照。
包含配位體之一或配位體組合以及培養基對照的孔以確定分析窗口。抗體在化學成分確定的饑餓培養基(CDS：RPMI1640培養基，含有每毫升80U青黴素及80 µg鏈黴素、0.05% (w/v) BSA及10 µg/ml飽和鐵轉鐵蛋白(holo-transferrin))中稀釋，並將50 µl稀釋抗體添加至96孔黑色透明底盤(Costar)之孔中。添加配位體(每孔50 µl含有400 ng/ml HGF及4 ng/ml EGF的儲備液，以及在CDS中稀釋的4 ng/ml EGF/400 ng/ml HGF的EGF/HGF濃度：R&D systems，目錄號396-HB及236-EG)。對N87細胞進行胰蛋白酶處理、收穫及計數，並將100 μl CDS中的8000個細胞添加至盤的各孔中。為避免邊緣效應，將盤在室溫下置放一小時，隨後放入37℃細胞培育箱內的容器中置放三天。第四天，加入Alamar blue (Invitrogen，# DAL1100)(每孔20 µl)，並在與Alamar blue培育6小時(37℃)後在Biotek Synergy 2多模式微盤讀取器上使用560 nm激發及590 nm讀數量測螢光。螢光值相對於不受抑制的生長(沒有抗體，但添加了二種配位體)標準化。
表4列出了各種實驗的結果。在N87 HGF/EGF分析中，鑑定了具有與參考單特異性抗體(西妥昔單抗及5D5Fab的等莫耳混合物)相當之效力的十四種不同的cMET×EGFR雙特異性抗體：PB7679、PB7686、PB8218、PB8244、PB8292、PB8316、PB8340、PB8364、PB8388、PB8511、PB8535、PB8583、PB8607及PB8640。
在N87 EGF分析中，鑑定了具有與單特異性西妥昔單抗相當之效力的十一種不同的cMET×EGFR雙特異性抗體：PB7679、PB8244、PB8292、PB8340、PB8364、PB8388、PB8511、PB8535、PB8583、PB8607及PB8640。其均含有EGFR Fab臂MF3755。在HGF N87分析中，鑑定出與單特異性5D5 Fab參考抗體相比顯示更高效力的九種雙特異性抗體：PB8218、PB8388、PB8511、PB8532、PB8535、PB8545、PB8583、PB8639及PB8640。其含有六種不同的cMET Fab臂MF4040、MF4297、MF4301、MF4356、MF4491及MF4506。 ADCC 活性
對腫瘤細胞株N87 (EGFR-高，cMET-低)及MKN-45 (EGFR-低，cMET擴增)測試了24種cMet×EGFR雙特異性抗體的ADCC活性。使用Promega ADCC生物分析套組以384孔盤格式進行ADCC分析。在介於10 μg/ml至1 ng/ml範圍內的半對數連續稀釋中，以9種不同的濃度一式二份地測試抗體。
包括參考西妥昔單抗抗體作為分析的陽性對照，且PG2708用作陰性對照抗體。抗體或分析培養基對照(無IgG)與ADCC效應細胞及目標細胞(N87或MKN-45)一起在37℃下培育6小時以進行誘導。使用Bio-Glo螢光素酶試劑對螢光素酶活性進行定量。
cMET×EGFR雙特異性抗體在二種細胞株中均未顯示出顯著的ADCC活性。陽性對照參考西妥昔單抗抗體對二種細胞株均顯示出劑量依賴性ADCC活性。
在N87 HGF/EGF分析中顯示出高功效並顯示出高序列多樣性的由EGFR及cMet臂構成的五種雙特異性抗體(表5)被選擇用於進一步分析。五種雙特異性抗體中的二個含有MF4356，其與5D5競爭結合cMET (表2)。表5總結了所選候選物的特徵。 實例4
圖2描繪了如本文所揭示之EGFR結合可變域的重鏈的替代可變區的各種序列。圖3描繪了如本文所揭示之cMET結合可變域的重鏈的替代可變區的各種序列。重鏈可變區用於創建許多不同的cMET×EGFR雙特異性抗體。此等抗體中的輕鏈具有如圖4B所描繪的序列。雙特異性抗體如實例1中所描述產生。抗體亦作為ADCC增強版本產生。ADCC增強版本係藉由在抗體構築體的共轉染中包括編碼還原酶的DNA來產生的，該還原酶自IgG1的Fc區去除岩藻醣殘基。有關所用雙特異性抗體及其PB編碼的清單，參見表6。 實例5
PB8532的cMET可變域的重鏈可變區(VH)包含MF4356的胺基酸，例如圖3所描繪。PB19748的cMET可變域的VH包含MF8230的胺基酸序列(參見圖3)。PB8532的EGFR可變域的VH包含MF3370的胺基酸，例如圖2中所描繪。PB19748的EGFR可變域的VH包含圖2的MF8233的胺基酸序列。PB8532及PB19748中的輕鏈係相同的並且描繪在圖4B中。在Kim及Kim2017中描述了cMET抗體LY2875358抗體等。 實例6雙特異性抗體PB19748在EGFR外顯子20***模型中的效率
本研究的目的係評估PB19748在具有EGFR外顯子20***的患者來源的腫瘤異種移植(PDX)非小細胞肺癌(NSCLC)模型中的抗腫瘤功效。EGFR外顯子20***(「EGFRex20ins」)代表編碼突變體的一類，胺基酸***聚集在位置762與774之間，導致EGFR的組成性活化。EGFR外顯子20***使攜帶此類突變的人類癌症主體對批准的EGFR TKI產生抗性，並與不良預後相關。 材料
PB19748由Merus生成，且對照材料係PB19748載劑，且由不含抗體的12%的PB19748調配物緩衝液組成，不過亦可以使用其他陰性對照，諸如鹽水或PBS。 PDX模型特徵：
模型LXFE2478係在Charles River在具有功能性Fc效應細胞的裸小鼠中產生的。
此模型攜帶突變EGFRex20ins (M766_A767insASV)。其亦在c-MET的SEMA域中攜帶點突變(E168D)，該域位於c-MET的配位體結合位點處。
在此模型的外顯子20中***9個核苷酸會影響EGFR酪胺酸激酶域(M766X)，並賦予對小分子EGFR抑制劑的抗性。此模型在B-RAF、H-/N-及KRAS及PTEN基因中沒有突變(對患者腫瘤及腫瘤異種移植物進行了全外顯子體定序，結果匹配)。 LXFE2478 PDX模型中EGFR、c-MET及HGF的表現
分析模型LXFE2478的EGFR及c-MET受體及配位體huHGF的表現，以研究其對活體內研究的適用性。
經由西方墨點法(western blot)評估二個腫瘤塊的EGFR及c-MET受體以及配位體huHGF的表現。huHGF被包括在分析中。自PDX模型獲得的腫瘤樣品藉由簡單西方尺寸(Simple Western Size)技術(SWS)進行評估，以確認EGFR、HGF及c-MET的表現。
西方印漬術(western blotting)顯示LXFE2478模型在蛋白質位準上表現EGFR、HGF及MET (圖6及表7)。 統計方法：
使用對照載劑/安慰劑緩衝液組作為參考評估所有組的抗腫瘤功效。藉由比較測試組與對照組的RTV來確定腫瘤生長抑制，並表示為以百分比為單位的最小T/C值。為了評估抗腫瘤療效的統計顯著性，進行了非參數Kruskal-Wallis檢定，接著進行了Dunn方法進行多重比較。在測試組中達到最小T/C值的日期比較測試組及對照組的個別RTV。僅當至少50%的最初隨機分配的動物仍留在相關組中時才進行統計分析。在同一天進行測試組之間的比較。所有p值＜0.05均被認為具有統計學意義。使用Graphpad Prism生物分析軟體(用於Microsoft Windows的第9.10版，GraphPad Software, San Diego, California, USA)進行統計計算。 治療時程及方法： 圖7顯示了治療時程的示意性概覽
自供體PDX小鼠收穫腫瘤，將其切成碎片(LXFE2478：3-4 mm邊長)並在側腹皮下(SC)接種至接受體裸小鼠中。當腫瘤植入物在足夠數目的動物中達到大約80-200 mm3時，將小鼠分配至5組，每組5隻小鼠。基於「分層分佈」方法進行隨機分組。治療在隨機分組的同一天(第0天)開始。
經5週的時段，每週一次以0.5 mg/kg、2.5 mg/kg、8 mg/kg及25 mg/kg的劑量腹膜內(IP)投予抗體。第1組的小鼠每週用載劑1治療一次，持續5週，每天持續30天。治療計劃顯示在表8中。
隨機分組後，對動物的發病率及死亡率進行常規監測，每週對其稱重二次，並每週用測徑器測定二次腫瘤體積(TV)。相對體重(RBW)的計算方法係將某一天的絕對重量或體積除以0時絕對重量乘以100。相對腫瘤體積(RTV)的計算方法係將某一天的絕對個體腫瘤體積除以第0天的絕對腫瘤體積乘以100。
對於體重減輕＞10%的小鼠，每天量測體重，並且動物可以方便地獲得飼料及水，並獲得DietGel。對於體重減輕＞15%的小鼠，暫停療法，直至其恢復≥90%的RBW。
雙特異性抗體PB19478的單一療法顯示出劑量依賴性抗腫瘤功效(圖8)。25 mg/kg抗體劑量的單一療法導致腫瘤緩解(最小T/C值2.7%)，並且比用載劑治療及用0.5 mg/kg或2.5 mg/kg劑量治療顯著更有效。0.5 mg/kg及2.5 mg/kg劑量的治療顯示腫瘤部分消退。
單一療法與小鼠的低毒性相關，由所有組的體重減輕可忽略不計以及調整後存活率為100%所證明。
EGFR外顯子20ins突變的癌症通常對EGFR酪胺酸激酶抑制劑係難治性的，並且與預後不良有關。 實例7
雙特異性抗體PB19478在EGFR外顯子19缺失NSCLC模型中的有效性。本研究的目的係評估抗體PB19478在具有EGFR外顯子19缺失的細胞株衍生的腫瘤異種移植物(CDX)非小細胞肺癌(NSCLC)模型中的抗腫瘤功效。此種腺癌細胞株HCC827-ER1在外顯子19中具有活化EGFR突變(缺失E746-A750)，並且對批准的EGFR TKI (諸如厄洛替尼)具有抗性。 材料：
PB19748如實例5中所述由Merus生成。 CDX模型特徵：
模型HCC827-ER1係在BALB/c裸小鼠中產生的。其在外顯子19中攜帶EGFR突變(缺失E746-A750)，且與野生型HCC827細胞株相比，具有放大的c-MET拷貝數及Axl表現。HCC827-ER1細胞株對EGFR TKI厄洛替尼具有抗性，並且係經由野生型細胞株在活體外反覆暴露於遞增濃度的厄洛替尼而產生的。 實驗程序：
在各隻小鼠的右前側腹區域接種與Matrigel混合的HCC827-ER1腫瘤細胞以便腫瘤發展。當平均腫瘤大小達至約125 (75-175) mm 3時開始隨機分組。總共16隻負載腫瘤小鼠入組腫瘤功效研究，且隨機分為2個不同的組，如表9所示，每組8隻。隨機分組日期表示為第0天，且給藥自第0天開始。小鼠用抗體治療3週，接著係長達74天的無劑量觀察期。包括無劑量觀察期以比較治療結束後反應持續時間及復發(腫瘤再生長)。腫瘤體積超過1500 mm 3，或體重相對於治療第一天體重減輕超過20%的小鼠在治療期過程中被處死。經21天時段，抗體以25 mg/kg的劑量一週二次腹膜內(i.p.)投予，總共7次劑量。第1組中的八隻小鼠用載劑對照(安慰劑緩衝液)治療。圖9顯示了治療時程的示意性概覽。使用測徑器以2個維度每週量測二次腫瘤體積(mm 3)。檢查動物的腫瘤生長及治療對行為的任何影響，諸如活動性、食物及水的消耗、體重增加/減少、眼睛/毛髮失去光澤及任何其他異常。隨機分組後每週量測二次體重。沒有一隻小鼠體重減輕超過15%，從而避免了在任何治療組中暫停投予治療劑的任何需要。圖10顯示了在第21天指示治療停止的完整觀察期過程中，雙特異性抗體PB19478對NSCLC CDX模型中腫瘤體積的影響。與載劑對照組相比，抗體治療顯示腫瘤消退。所有治療均被很好耐受。研究中沒有小鼠顯示體重自起始體重減輕＞10%。事實上，在第21天，亦即最後一個治療日，第1組及第2組之間的絕對體重沒有統計學顯著差異。與第1組及第2組相比，另一治療組(亦即25 mg/kg奧希替尼，一天一次，口服投予)中小鼠的絕對體重較低(相對於第2組，P=0.0167，資料未顯示)。除了第1組及第2組中一些小鼠的腫瘤結痂或腫瘤潰瘍外，沒有觀察到不良事件。動物存活曲線如圖11所示。組合相對於各相應的單一療法組的對數秩(Mantel-Cox)檢定係顯著的，如下：抗體25 mg/kg相對於載劑P=0.0001。
總之，此等結果顯示了正在研究之抗體針對具有外顯子19突變(缺失E746-A750)的NSCLC CDX模型的臨床前抗腫瘤活性。 實例8
在劑量遞增階段，雙特異性抗體PB19478將以遞增劑量投予攜帶活化EGFR突變(TKI致敏突變及/或批准的TKI抗性突變)或活化c-MET突變(外顯子14跳躍)/擴增(MET/CEP7＞5或cfDNA≥2個拷貝)的NSCLC患者、或具有活化EGFR擴增(EGFR/CEP7≥2或cfDNA≥8個拷貝)或c-MET擴增(MET/CEP7＞5或cfDNA≥2個拷貝)的GC/GEJ腺癌患者、或HNSCC或ESCC患者，該等患者在所有情況下在接受先前晚期/轉移性疾病療法後出現進展。
臨床前PK模型的異速縮放用於預測人類中之抗體暴露。抗體起始劑量為100 mg (均一劑量，靜脈內)，每2週一次(q2w)，週期為4週(28天)。計劃研究100-3000 mg之間的五個劑量位準。
患者群組將接受抗體治療，直至達到MTD或確定較低的(多個)推薦劑量。
考慮到PK、藥效學活性及初步抗腫瘤活性的可用資料，RP2D (推薦的第2階段劑量)定義為等於或低於MTD的劑量。 劑量擴展
使用1500 mg的RP2D，可以啟動第2階段部分中之計劃的擴展群組。RP2D的安全性將在前12名用單獨抗體治療至少2個週期的患者的劑量擴展期間得到確認(同時將繼續招募)。抗體的抗腫瘤活性(單獨或與奧希替尼組合)將根據ORR進行評估，並將對其他功效參數、安全性、耐受性、PK、免疫原性及生物標誌物進行評估。 可以開放以下局部晚期不可切除/轉移性實體腫瘤群組：
群組A：PB19478單一療法：NSCLC患者可能攜帶EGFR外顯子20***突變(第一線[1L]及≥第二線[2L]在第一線化學療法後進展)。來自NSCLC患者的結果在實例9中描述。
群組B：PB19478單一療法：NSCLC患者可能在≥2L、卡馬替尼及特泊替尼抗性群體中攜帶cMet外顯子14突變，在批准的c-Met TKI抑制劑後進展。
群組C：PB19478單一療法：可能攜帶EGFR或cMet驅動突變的GC/GEJ及HNSCC患者。來自患有HNSCC的患者的結果在實例10中描述。 研究群體 納入準則
患者必須滿足以下所有要求才能進入研究： 1.在開始任何研究程序之前簽署知情同意書。 2.簽署知情同意書時年齡≥18歲。 3.經組織學或細胞學證實的實體腫瘤，具有轉移性或局部晚期未切除疾病的證據。 1.劑量遞增部分-先前標準第一線治療失敗的患者。患者必須在使用已知可提供臨床益處的療法時出現進展或對該等療法不耐受。對先前治療方案的數目沒有限制。患者必須具有： •攜帶活化EGFR突變的非小細胞肺癌(NSCLC)，包括酪胺酸激酶抑制劑(TKI)致敏突變(例如19del及L858R)，及/或批准的TKI抗性突變(例如，獲得性TKI抗性突變，亦即，T790M、C797S、L792、L798I、外顯子20***)或任何活化c-MET突變/擴增(例如，高位準c-MET擴增[MET/CEP7＞5或cfDNA≥2個拷貝]，或c-MET外顯子14跳躍突變)。 • *注意：患者的鑑別將基於之前使用EGFR酪胺酸激酶抑制劑的治療史以及在CLIA認證實驗室進行的本地測試。 2.群組擴展部分-對於≥2L，患者必須在使用已知可提供臨床益處的療法時出現進展或對該等療法不耐受。對先前治療方案的數目沒有限制。 患者必須具有：
群組A：NSCLC，攜帶EGFR外顯子20***，在鉑雙藥後進展(可以包括有限數目的第一線患者)。
群組B：NSCLC，攜帶cMet外顯子14跳躍突變，≥2L、卡馬替尼及特泊替尼抗性群體，或經cMET TKI治療或未曾經cMET TKI治療。
群組C：選定的實體腫瘤(包括GC/GEJ；HNSCC，例如對批准的治療難治的HNSCC (無論驅動突變如何)；或ESCC)，攜帶EGFR或cMet驅動突變、或cMET改變，未包括在其他群組中得具有罕見EGFR突變(G719X、L861Q及S768I)的NSCLC患者。患者用盡或不耐受所有經證實具有臨床益處的批准療法，或者沒有可用的、批准的治療選擇。
群組F：NSCLC，具有c-MET外顯子14跳躍突變，晚期疾病未曾接受過治療。 4.在使用最近的療法時出現進展後可獲得FFPE包埋的存檔或新鮮腫瘤組織樣品。 5. 以藉由RECIST 1.1版藉由放射學方法所定義的可量測的疾病(具有不可量測但可評估的疾病的患者可以包括在劑量遞增部分中)。 6. 東部腫瘤合作組(ECOG)表現狀態為0或1。 7. 預期壽命≥12週，根據研究者判斷 8. 足夠的器官功能，根據研究者判斷 •嗜中性白血球絕對計數(ANC)≥1.5×109/L •血紅素≥9 g/dL •血小板≥100×109/L •經校正總血清鈣在正常範圍內 •血清鎂在正常範圍內(或藉由補充劑校正) •血清鉀在正常範圍內 •丙胺酸轉胺酶(ALT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)≤3×正常值上限(ULN)，且總膽紅素≤1.5×ULN(若結合膽紅素值在正常範圍內，則捷倍耳氏症候群患者符合資格)；在肝臟受累的情況下，允許ALT/AST≤5×ULN及總膽紅素≤2×ULN •根據Cockroft及Gault公式或用於年齡＞65歲之患者的MDRD公式所計算，血清肌酐≤1.5×ULN或肌酐清除率≥50 mL/min •血清白蛋白＞3.3 g/dL 排除準則
存在以下任何準則，排除患者參與研究： 1. 中樞神經系統轉移(遞增時不排除，擴展時強制性)： •係未曾經過治療且有症狀的(未曾經過治療、具有無症狀病變的患者可以在依研究者判斷認為穩定時包括在內) •需要輻射或手術 •需要持續類固醇療法(＞10 mg普賴松或等效物)以在進入研究後14天內控制症狀。 2. 已知軟腦膜受累。 3. 在進入研究前4週內參加過另一項臨床研究或使用任何研究中藥物進行治療。 4. 在研究藥物首次劑量的4週或5個半衰期(以較短者為準)內進行全身抗癌療法或免疫療法。對於具有主要延遲毒性的細胞毒性劑(例如，絲裂黴素C、亞硝基脲)，需要6週的清除期。注意：對於半衰期較長的藥劑，在第五個半衰期之前入組需要試驗委託者批准。 5. 在研究藥物首次劑量的3週內進行大手術或放射療法。在任何時候先前接受過≥25%骨髓放射療法的患者不符合資格。 6. 依研究者判斷，持續存在與先前的抗惡性腫瘤療法相關的＞1級的臨床顯著毒性(脫髮除外)；穩定的感覺神經病變≤2級NCI-CTCAE v5.0及甲狀腺功能低下≤2級且在使用激素替代法時穩定。 7. 高敏性反應史或歸因於人類蛋白質或任何賦形劑的任何毒性，需要永久停用此等藥劑。 8. 有臨床意義的心血管疾病史，包括但不限於： •QT間期延長＞480毫秒，自3次心電圖(ECG)中獲得，或有臨床意義的心臟節律不整或電生理疾病(亦即，置放植入式心臟整流除顫器或心房震顫且心率不受控制)，或任何增加QTc延長之風險或心律不整事件(諸如電解質異常)之風險的因素。臨床穩定的裝有心臟起搏器的患者符合資格。 •心臟衰竭、先天性長QT症候群、長QT症候群家族史或第一級親屬40歲以下不明原因瘁死或已知會延長QT間期並引起尖端扭轉型室性心動過速的任何合併用藥。 •不受控制的(持續性)動脈性高血壓：收縮壓＞180 mm Hg及/或舒張壓＞100 mm Hg。 •鬱血性心臟衰竭(CHF)定義為紐約心臟協會(NYHA) III-IV級或研究藥物首次劑量的6個月內因CHF住院。 9. 間質性肺病史，包括藥物誘發的間質性肺病、1年內需要長期使用類固醇或其他免疫抑制劑治療的放射性肺炎。 10. 先前或併發的惡性腫瘤，不包括非基底細胞皮膚癌或子宮頸原位癌，除非腫瘤以治癒性或緩解性目的進行治療，並且在研究者看來，在試驗委託者同意的情況下，先前或併發惡性腫瘤病況不影響研究藥物的安全性及功效之評估。
11. 目前患有嚴重疾病或醫學病況，包括但不限於不受控制的活動性感染、有臨床意義的肺部、代謝或精神病症。 12. 未曾接受過抗病毒治療的活動性B型肝炎感染(HBsAg陽性)。注意：活動性B型肝炎(HbsAg陽性)患者必須接受拉米夫定、替諾福韋、恩替卡韋或其他抗病毒藥劑的抗病毒治療，至少在研究治療開始前≥7天開始。有B型肝炎病史(抗HBc陽性、HbsAg及HBV-DNA陰性)的患者符合資格。 13. C型肝炎核糖核酸(HCV RNA)測試呈陽性；注意：HCV感染自發消退的患者(陽性HCV抗體，但未偵測到HCV-RNA)或在抗病毒治療後獲得持續病毒學反應且在停止抗病毒治療後顯示不存在可偵測的HCV RNA≥6個月(在使用無IFN方案的情況下)或≥12個月(在使用以IFN為主之方案的情況下)的患者符合資格。 14. 已知的HIV病史(HIV 1/2抗體)。允許偵測不到病毒負荷量的HIV患者。除非當地衛生當局或法規強制要求，否則不需要進行HIV測試。 15. 有生育能力的性活躍男性及女性患者必須同意在整個研究持續期間及在最後一次投予PB19478之後6個月內使用以下高效節育方法之一： •與抑制***相關的組合(含***及助孕素)激素避孕法(口服、***內、透皮) •與抑制***相關的僅含助孕素的激素避孕法(口服、可注射、可植入) •子宮避孕器(IUD) •子宮內激素釋放系統(IUS) •雙側輸卵管閉塞 •輸精管切斷的伴侶1 •禁慾2 16. 孕婦或哺乳期婦女被排除在本研究之外。
ECOG表現狀態評分等級定義如此項技術中所遵循的，意謂：0完全活躍，能夠不受限制地進行所有疾病前的表現。1身體劇烈活動受限，但可以行走，並能夠從事輕度或久坐性質的工作，例如輕度家務勞動、辦公室工作。2可以行走，且能夠進行所有的自我照護，但不能進行任何工作活動。起床時間約占超過50%的清醒時間。3隻能進行有限的自我照護；超過50%的清醒時間只能躺在床上或椅子上。4完全失能。無法進行任何自我照護。完全被困在床上或椅子上。5死亡。 研究中療法及療程
抗體將以1500 mg (均一劑量)的劑量位準作為RP2D位準以靜脈內輸注形式投予，每2週一次(q2w)，週期為4週。可以探索介於100-3000mg (均一劑量)之間的劑量位準。一旦達到RP2D，將停止劑量遞增。各患者(包括擴展群組)的投予劑量、劑量增量及給藥頻率會基於患者安全性、PK及藥效學資料以及試驗委託者的建議而發生變化。試驗委託者可能會建議第1週期使用替代的每週給藥時程。 治療持續時間
將投予研究治療，直至確認進展性疾病(根據RECIST v1.1)、不可接受的毒性、撤回同意、患者不順從、主持人決定(例如，臨床惡化)或抗體中斷＞連續6週。
將在最後一次抗體輸注後至少30天對患者進行安全性隨訪，直至所有相關毒性恢復或穩定，並每3個月隨訪一次疾病進展及生存狀態，持續長達1年。 實例9
在實例8的臨床研究中，在具有EGFR突變及c-MET突變的非小細胞肺癌患者中觀察到臨床功效，該等EGFR突變包括EGFR外顯子20突變/***、EGFR外顯子21突變(諸如L858R)及EGFR外顯子19缺失突變；該等c-MET突變包括c-MET外顯子14跳躍突變。更詳細而言，在數名患者中觀察到目標病變減少，包括確認的部分反應、二例穩定疾病及病變減少(包括患有c-MET外顯子14突變的患者)，一名患者患有外顯子19突變以及一名患者患有EGFR擴增突變。患者先前已用各種不同的治療進行，包括以鉑為主之化學療法、奧希替尼、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、西妥昔單抗、克唑替尼(crizotinib)、卡馬替尼及特泊替尼。 實例10
在實例8的臨床研究中，在患有頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)的68歲女性患者中觀察到臨床功效，該患者接受過先前順鉑及西米普利單抗(cemiplimab)治療。更詳細而言，在經歷僅1/2級不良事件的該患者中觀察到目標病變減少了20%。 實例11
在實例8的臨床研究中，在以1500 mg Q2W給予雙特異性抗體PB19478後，在大量攜帶cMET外顯子14跳躍突變的非小細胞肺癌患者中觀察到臨床相關效果。臨床相關效應包括根據研究者根據RECIST準則1.1審查確認的部分反應及穩定疾病。數名患者接受過先前抗癌治療，而其他數名患者未曾接受過治療，此意味著其接受了實例8的臨床試驗方案的雙特異性抗體作為cMET外顯子14跳躍NSCLC的第一抗癌治療。 實例12
在實例8的臨床研究中，在以1500 mg Q2W給予雙特異性抗體PB19478後，在大量攜帶EGFR外顯子20***突變的非小細胞肺癌患者中觀察到臨床相關效果。臨床相關效應包括根據研究者根據RECIST準則1.1審查確認的部分反應及穩定疾病。幾名患者接受過先前的抗癌治療，諸如以鉑為主之化學療法。 引用的技術
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名稱 INN 名稱 表位 MOA
5D5 MetMAb Sema域 HGF阻斷
13.3.2
224G11
C8-H241 LY-2875358 HGF阻斷，內化
R13 13-MET
表1. 具有報導的針對cMET胞外域之特異性的參考抗體。
噬菌體與參考抗體的競爭
測試的 MF 無 IgG 13.3.2 5D5 R13 224G11 C8H241 R28
4040 1.915 1.818 0.066 1.608 1.907 1.979 1.787
4297 1.769 0.072 1.499 1.332 1.955 1.031 1.885
4356 2.380 2.541 0.088 2.231 2.170 1.806 1.825
13.3.2 2.172 0.311 1.934 1.988 2.221 1.893 2.129
5D5 1.868 1.773 0.164 1.660 2.025 2.054 2.035
R13 1.693 1.590 1.549 0.090 1.878 0.078 1.794
表2.cMet參考抗體與cMET cLC抗體的競爭。顯示的係OD450值。OD450值表明存在或缺乏與所陳述抗體的競爭。MF4506未經測試。
PBs PBs MF's
EGFR cMET
PB7678 MF4280 EGYYETTTYYYNLFDS MF4298 KLEPTGYYYYYMDV
PB7679 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4487 KTSRYSGYHYYMDV
PB7686 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4507 AHYDILTG
PB8021 MF3755 ERFLEWLHFDY MF3462 GKSHYSWDAFDY
PB8218 MF3752 DRNWGWDFDY MF4040 GTYYYGSGSFSTRVFDAFDV
PB8244 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4044 QSRRYSGYASYFDY
PB8292 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4130 QRRAYSGYNWYFDL
PB8301 MF4280 EGYYETTTYYYNLFDS MF4130 QRRAYSGYNWYFDL
PB8316 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4293 RNDFWSGYLFDY
PB8339 MF3752 DRNWGWDFDY MF4294 KTTVGYYYYYMDV
PB8340 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4294 KTTVGYYYYYMDV
PB8364 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4296 GPELGYYYYYMDI
PB8388 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4297 ASSMITFGGVIVSWFDP
PB8511 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4301 RVNRYSGYATYFDL
PB8532 MF3370 DRHWHWWLDAFDY MF4356 ETYYYDRGGYPFDP
PB8535 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4356 ETYYYDRGGYPFDP
PB8545 MF4281 GDLFITGTLDY MF4356 ETYYYDRGGYPFDP
PB8582 MF3752 DRNWGWDFDY MF4491 RTSRYSGYHYYLDV
PB8583 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4491 RTSRYSGYHYYLDV
PB8607 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4505 LLYDLFDL
PB8639 MF3752 DRNWGWDFDY MF4506 SIDMATITDAFDI
PB8640 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4506 SIDMATITDAFDI
PB8687 MF3752 DRNWGWDFDY MF4508 GTTGNPYYFYYYMDV
PB8688 MF3755 ERFLEWLHFDY MF4508 GTTGNPYYFYYYMDV
表3. 在N87 HGF/EGF增殖分析中進行劑量依賴性滴定實驗後選擇的24種cMET×EGFR雙特異性抗體的清單。指示了各個別PB中EGFR及cMET臂的MF編號及其HCDR3序列。
PBs PBs MF's N87增殖分析
EGFR cMET HGF/ EGF HGF EGF
PB7678 MF4280 MF4298 + + +
PB7679 MF3755 MF4487 ++ - ++
PB7686 MF3755 MF4507 ++ + +
PB8021 MF3755 MF3462 + + +
PB8218 MF3752 MF4040 ++ +++ +
PB8244 MF3755 MF4044 ++ + ++
PB8292 MF3755 MF4130 ++ + ++
PB8301 MF4280 MF4130 + ++ +
PB8316 MF3755 MF4293 ++ + +
PB8339 MF3752 MF4294 + + +
PB8340 MF3755 MF4294 ++ + ++
PB8364 MF3755 MF4296 ++ + ++
PB8388 MF3755 MF4297 ++ +++ ++
PB8511 MF3755 MF4301 ++ +++ ++
PB8532 MF3370 MF4356 + +++ +
PB8535 MF3755 MF4356 ++ +++ ++
PB8545 MF4281 MF4356 + +++ +
PB8582 MF3752 MF4491 + - +
PB8583 MF3755 MF4491 ++ +++ ++
PB8607 MF3755 MF4505 ++ - ++
PB8639 MF3752 MF4506 + +++ +
PB8640 MF3755 MF4506 ++ +++ ++
PB8687 MF3752 MF4508 + ++ +
PB8688 MF3755 MF4508 + - +
表4. 使用N87 HGF/EGF、HGF及EGF增殖分析與24種cMET×EGFR雙特異性抗體進行之抗體滴定實驗的概要。雙特異性指示為PBXXXX，且不同的Fab臂指示為MGXXXX。雙特異性抗體在個別分析中的活性指示為：-無影響；+增殖抑制低於陽性對照；++=增殖抑制與陽性對照抗體5D5 Fab相當；+++=增殖抑制高於陽性對照抗體5D5 Fab。
雙特異性抗體 EGFR臂 EGFR阻斷 與西妥昔單抗相比(基於IC50) cMET臂 交叉參考抗體阻斷
PB8535 MF3755 100% MF4356 5D5
PB8640 MF3755 100% MF4506 ND
PB8388 MF3755 100% MF4297 13.3.2
PB8218 MF3752 80% MF4040 5D5
PB8532 MF3370 80% MF4356 5D5
表5.最強力的EGFR×cMET雙特異性抗體的組成及其與參考抗體的競爭。
雙特異性抗體 cMET 臂 EGFR 臂 ADCC 增強
西妥昔單抗 - - -
PB8532p05 MF4356 MF3370 否
PB19474p01 MF4356 MF8232 是
PB19475p01 MF4356 MF8233 是
PB19476p01 MF8230 MF3370 是
PB19477p01 MF8230 MF8232 是
PB19478p01 MF8230 MF8233 是
PB8532p06 MF4356 MF3370 是
PB8532p04 MF4356 MF3370 否
HER-3 臂 EGFR 臂
PB4522p34 MF3178 MF4280 是
PB4522p25 MF3178 MF4280 否
TT 臂 TT 臂
PG1337p218 MF1337 MF1337 否
表6.雙特異性抗體的組成。pXX數字指示生產運作的編號，且可以用於識別抗體是否以ADCC版本生產。
簡單西方尺寸AUC
模型 EGFR胺基酸變化 腫瘤類型 EGFR MET HGF
LXFE2478 M766_A767insASV NSCLC 1372205 54096 229544
表7: 模型LXFE2478的相關特徵。AUC=曲線下面積。
組 小鼠數目 治療 劑量位準 劑量途徑 給藥頻率及持續時間
1 5 載劑1 10 mL/kg PO QD×30天
2 5 抗體 0.5 mg/kg IP QW×5週
3 5 PB19478 2.5 mg/kg IP QW×5週
4 5 PB19478 8 mg/kg IP QW×5週
5 5 PB19478 25 mg/kg IP QW×5週
表8| PDX模型LXFE2478的治療計劃
組 小鼠數目 治療 劑量位準 (mg/kg) 給藥途徑 給藥頻率及持續時間
1 8 載劑 - i.p. BIW×7次劑量
2 8 PB19748 25 i.p. BIW×7次劑量
表9| CDX模型HCC827-ER1的治療計劃。BIW=每週二次，i.p.=腹膜內。
(無)
圖1.本申請案中提及的可變域的重鏈可變區的胺基酸序列。
圖2.MF3370及其變體。MF8226中的CDR1、CDR2及CDR3序列自左至右帶有下劃線。其他序列中的CDR位於相應的位置(根據Kabat)。
圖3.MF4356及其變體。MF4356中的CDR1、CDR2及CDR3序列自左至右帶有下劃線。其他序列中的CDR位於相應的位置(根據Kabat)。
圖4.單特異性及雙特異性IgG中使用的共同的輕鏈。
圖4A：共同的輕鏈胺基酸序列。圖4B：共同的輕鏈可變域DNA序列及轉譯(IGKV1-39/jk1)。圖4C：共同的輕鏈恆定區DNA序列及轉譯。圖4D：IGKV1-39/jk5共同的輕鏈可變域轉譯。圖4E：V區IGKV1-39A。
圖5.用於生成雙特異性分子的IgG重鏈。圖5A：CH1區。圖5B：鉸鏈區。圖5C：CH2區。圖5D：含有L235G及G236R緘默性取代的CH2。圖5E：含有取代L351K及T366K (KK)的CH3域。圖5F；含有取代L351D及L368E (DE)的CH3域。
圖6.模型LXFE2478的西方墨點法分析結果顯示EGFR、cMET及HGF蛋白位準。
圖7.治療時程概覽。抗體或載劑經5週的時段作為單一療法投予。
圖8.在攜帶外顯子20突變的NSCLC PDX模型LXFE2478中，抗體療法對腫瘤體積的影響。代表第1-5組的腫瘤體積生長曲線顯示在不同時間點(平均TV±SEM)。
圖9.治療時程概覽。抗體或載劑經3週的時段作為單一療法投予。
圖10.在攜帶外顯子19突變的NSCLC CDX模型HCC827/ER1中，抗體療法對腫瘤體積的影響。代表載劑及抗體組的腫瘤體積生長曲線顯示在不同時間點(平均TV±SEM)。
圖11.相對於載劑，帶有攜帶外顯子19突變的NSCLC CDX模型HCC827/ER1的小鼠的動物存活曲線。
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(無)

Claims (45)

  1. 一種雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的一胞外部分的一第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的一胞外部分的一第二可變域，其中該第一可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有一CDR1序列SYGIS；一CDR2序列WISAYX1X2NTNYAQKLQG及包含序列X3X4X5X6HWWLX7A的一CDR3，其中X1=N或S；X2=A或G；X3=D或G；X4=R、S或Y；X5=H、L或Y；X6=D或W且X7=D或G；在X1-X7以外的一位置具有0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其一組合，並且其中該第二可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 1-23的序列之一者的胺基酸序列，具有0-10個，較佳0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其一組合，該雙特異性抗體用於治療已經接受過i)一第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑或ii)一化學療法及一酪胺酸激酶抑制劑或iii)一cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的一主體的一癌症之方法。
  2. 一種治療已經接受過i)一第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑或ii)一化學療法及一EGFR酪胺酸激酶抑制劑或iii)一cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療的一主體的一癌症之方法，該治療包含向該主體投予一有效量之一雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的一胞外部分的一第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的一胞外部分的一第二可變域，其中該第一可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有一CDR1序列SYGIS；一CDR2序列WISAYX1X2NTNYAQKLQG及包含序列X3X4X5X6HWWLX7A的一CDR3，其中X1=N或S；X2=A或G；X3=D或G；X4=R、S或Y；X5=H、L或Y；X6=D或W且X7=D或G；在X1-X7以外的一位置具有0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其一組合，並且其中該第二可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 1-23的序列之一者的胺基酸序列，具有0-10個，較佳0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其一組合。
  3. 一種一雙特異性抗體在製造供治療一主體的一癌症用的一藥物中之用途，該雙特異性抗體包含可以結合人類表皮生長因子受體(EGFR)的一胞外部分的一第一可變域及可以結合人類MET原癌基因受體酪胺酸激酶(cMET)的一胞外部分的一第二可變域，其中該第一可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有一CDR1序列SYGIS；一CDR2序列WISAYX1X2NTNYAQKLQG及包含序列X3X4X5X6HWWLX7A的一CDR3，其中X1=N或S；X2=A或G；X3=D或G；X4=R、S或Y；X5=H、L或Y；X6=D或W且X7=D或G；在X1-X7以外的一位置具有0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其一組合，並且其中該第二可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有SEQ ID NO: 1-23的序列之一者的胺基酸序列，具有0-10個，較佳0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其一組合，該主體已經接受過i)一第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑或ii)一化學療法及一EGFR酪胺酸激酶抑制劑或iii)一cMET酪胺酸激酶抑制劑之先前治療。
  4. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中已經接受過根據i)的先前治療的該主體或癌症對一第三代EGFR酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。
  5. 如請求項1至3中任一項之用途或方法，其中已經接受過根據ii)的先前治療的該主體或癌症對一第一代、第二代及/或第三代酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。
  6. 如請求項1至3中任一項之用途或方法，其中已經接受過根據iii)的先前治療的該主體或癌症對一cMET酪胺酸激酶抑制劑的治療具有抗性。
  7. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該雙特異性抗體及該EGFR酪胺酸激酶抑制劑的投予根據i)及iii)作為第二線治療投予，並且根據ii)作為第三線治療投予。
  8. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該第一代EGFR酪胺酸激酶抑制劑包含吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)或埃克替尼(icotinib)。
  9. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該第二代EGFR酪胺酸激酶抑制劑包含阿法替尼(afatinib)、達克替尼(dacomitinib)、XL647、AP26113、CO-1686或來那替尼(neratinib)。
  10. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該第三代EGFR酪胺酸激酶包含奧希替尼(Osimertinib)、拉澤替尼(Lazertinib)、阿氟替尼(Alflutinib)、瑞齊替尼(Rezivertinib)、羅西替尼(Rociletinib)、奧穆替尼(Olmutinib)、阿美替尼(Almonertinib)、阿比維替尼(Abivertinib)、ASK120067、貝福替尼(Befotertinib)、SH-1028、那紮替尼(Nazartinib) (EGF816)、萘闊替尼(Naquotinib) (ASP8273)、馬維替尼(Mavelertinib) (PF-0647775)、奧拉非替尼(Olafertinib) (CK-101)、克耐替尼(Keynatinib)、ES-072，較佳奧希替尼。
  11. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該cMET酪胺酸激酶抑制劑係或包含卡馬替尼(capmatinib)、特泊替尼(tepotinib)、克唑替尼(crizotenib)、卡博替尼(cabozantinib)、賽沃替尼(savolitinib)、格列沙替尼(Glesatinib)、斯塔瓦替尼(Sitravatinib)、BMS-777607、梅沙替尼(Merestinib)、替凡替尼(Tivantinib)、戈伐替尼(Golvatinib)、福瑞替尼(Foretinib)、AMG-337或BMS-794833。
  12. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該化學療法包含以鉑為主的化學療法、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、長春瑞濱(vinorelbine)、依託泊苷(etoposide)或培美曲塞(pemetrexed)，或其任何組合，較佳為包含順鉑或卡鉑之組合。
  13. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症係一EGFR陽性及/或cMET陽性癌症。
  14. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含一EGFR及/或cMET畸變。
  15. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含一活化EGFR突變、一批准的酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、一種三級酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、減少一第三代酪胺酸激酶抑制劑與EGFR之結合的一突變、一獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變、一EGFR基因擴增、一cMET突變或cMET畸變。
  16. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含一外顯子19缺失突變，較佳一同框外顯子19缺失、一外顯子20誤義突變或一外顯子21突變。
  17. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含一EGFR外顯子20突變，較佳一外顯子20***突變。
  18. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含一獲得性酪胺酸激酶抑制劑抗性突變，諸如賦予奧希替尼抗性的一突變。
  19. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含一外顯子20突變，其選自一近環***(位置767-772)、一遠環***(位置773-775)，較佳V769_D770insASV、D770_N771insSVD、H773_V774insNPH、H773_V774insH、D770_N771insG、D770delinsGY、N771_P772insN、V774_C775insHV、D770_N771insGL、H773_V774insPH、A763_Y764insFQEA、D770_N771delinsEGN、D770_N771insGD、D770_N771insH、D770_N771insP、H773_V774insAH、H773_V774insGNPH、H773delinsSNPY、N771_P772insH、N771_P772insVDN、N771delinsGY、N771delinsKH、N771delinsRD、P772_H773delinsHNPY、P772_H773insGT、P772_H773insPNP、P772_H773insT、V769_D770insA、V769_D770insGG、V769_D770insGSV、V769_D770insGVV及V769_D770insMASV；或突變T790M、L792X (例如L792H、C796X (例如G796R、G796S、G796D)、C797X (例如C797S、C797G)、L798I，或一同框外顯子20***，諸如M766_A767insASV或H773-V774insNPH、Ins761(EAFQ)、Ins770(ASV)、Ins771(G)、Ins774(NPH)、M766_A7671ns A、S768_V769InsSVA、P772_H773InsNS、D761_E762InsX1-7、A763_Y764InsX1-7、Y764_Y765 InsX1-7、M766_A767InsX1-7、A767_V768 InsX1-7、S768_V769 InsX1-7⟩ V769_D770 InsX1-7⟩ D770_N771 InsX1-7⟩ N771_P772 InsX1-7⟩ P772_H773 InsX1-7、H773_V774 InsX1-7或V774_C775 InsX1-7。
  20. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含一cMET畸變，諸如一cMET擴增、cMET過表現、增加的cMET路徑的信號傳導、一cMET基因擴增、增加的HGF表現及/或增加的cMET蛋白活性。
  21. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症包含一cMET外顯子14跳躍突變。
  22. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症係非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸癌、胃癌、食道癌、胃/食道交界處癌、乳癌、大腸癌、胰臟癌、卵巢癌、大腸直腸癌或膀胱癌。
  23. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症係晚期或轉移性癌症。
  24. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該癌症或患者在接受該針對晚期或轉移性癌症的先前療法後發生進展。
  25. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中治療包含用於評估該癌症是否為一EGFR陽性及/或cMET陽性癌症或評估該癌症中一EGFR及/或cMET畸變的存在的一診斷步驟。
  26. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該主體係一人類主體。
  27. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該抗體係一人類抗體。
  28. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該抗體係ADCC增強的。
  29. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該抗體係具有1:1的一抗EGFR、抗cMET化學計量的一IgG1格式抗體。
  30. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該抗體具有一個可以結合EGFR的可變域及一個可以結合cMET的可變域。
  31. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該可以結合人類EGFR的可變域亦可以結合食蟹獼猴及小鼠EGFR。
  32. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該可以結合人類EGFR的可變域結合至人類EGFR的域III。
  33. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該可以結合cMET的可變域阻斷抗體5D5與cMET的結合。
  34. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該可以結合cMET的可變域阻斷HGF與cMET的結合。
  35. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中一個CH3域中位置405及409的胺基酸與另一CH3域中相應位置的胺基酸相同(EU編號)。
  36. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中 X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=S；X 5=Y；X 6=W且X 7=G； X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D； X 1=N；X 2=G；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G； X 1=N；X 2=A；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G；或 X 1=S；X 2=G；X 3=G；X 4=Y；X 5=L；X 6=D且X 7=G。
  37. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D；或X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D；或X 1=S；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D。
  38. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中X 1=N；X 2=G；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D；或X 1=N；X 2=A；X 3=D；X 4=R；X 5=H；X 6=W且X 7=D。
  39. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該第二可變域的該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 1-3；7；8；10；13；15；16；17；21；22或23的序列之一者的胺基酸序列，具有0-10個，較佳0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其一組合。
  40. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該第二可變域的該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 2；7；8；10；13或23的序列之一者的胺基酸序列，具有0-10個，較佳0-5個胺基酸***、缺失、取代、添加或其一組合。
  41. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該第一可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有一CDR1序列SYGIS；一CDR2序列WISAYNGNTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的一CDR3，並且其中該第二可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有一CDR1序列SYSMN；一CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及一CDR3序列ETYYYDRGGYPFDP。
  42. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該第一可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有一CDR1序列SYGIS；一CDR2序列WISAYNANTNYAQKLQG及包含序列DRHWHWWLDA的一CDR3，並且其中該第二可變域包含一重鏈可變區，該重鏈可變區具有一CDR1序列TYSMN；一CDR2序列WINTYTGDPTYAQGFTG及包含序列ETYFYDRGGYPFDP的一CDR3。
  43. 如前述請求項中任一項之用途或方法，其中該第一可變域及該第二可變域包含一共同的輕鏈，較佳圖4B的一輕鏈可變域。
  44. 如前述請求項中任一項之用途或方法，該抗體抑制HGF誘導的一HGF生長反應性細胞的生長。
  45. 如前述請求項中任一項之用途或方法，該抗體抑制EGF誘導的一EGF生長反應性細胞的生長。
TW112108355A 2022-03-07 2023-03-07 利用結合EGFR及cMET之抗體的治療 TW202346353A (zh)

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