TW201920264A - 藉由細胞表現之調控生物活性的結合分子 - Google Patents

Abstract

本發明提供抑制細胞的生物活性的手段和方法。在一實施例中，本發明有關於抑制第一或第二細胞中，由彼此為結合配偶體的兩個膜蛋白質的結合所介導的生物活性的方法。藉由對細胞提供可結合至每個所提及的結合配偶體結合的抗體或類抗體分子，來抑制所提及的生物活性，且前述結合阻斷這兩個結合配偶體的結合，從而抑制所提及的生物活性。

Description

藉由細胞表現之調控生物活性的結合分子

本發明有關於結合分子領域。特別地，有關於用於治療涉及異常細胞的疾病的治療性結合分子。更特別地，有關於結合二或更多不同膜相關蛋白質(membrane associated protein)的胞外部分且藉此調節由細胞表現的生物活性的結合分子。

僅管在疾病的治療上已有許多進步及導致癌症的分子事件的知識的增長，在世界上癌症仍為死亡的主要原因。舉例而言，大腸癌(Colorectal cancer，CRC)是全世界第三常見的癌症。在2008年，123萬人被診斷出有此疾病。在歐洲，大腸癌為第二常見的癌症，其中在2012年約診斷出447,000起新案例(佔全部的13%)。大腸癌為第四常見的癌症死因，估計是每年608,000(歐洲148,000)起死亡的原因。雖然一些新的治療在CRC中已有進步，但許多都在臨床試驗中失敗；轉移性CRC大部分用傳統治療仍無法治癒。黑色素瘤(melanoma)是非常頻繁發生的癌症的另一範例。當不夠早偵測到時，此癌症很可能在很難治療的階段轉移。免疫干預治療(immune-intervention treatment)已經顯示出對至少一些有轉移性黑色素瘤的病人是有效的。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)是一種很少在夠早的階段發現，以進行手術的癌症種類。這些種類的癌症也已經成功地用免疫干預治療進行治療。

傳統上，大部分的癌症藥物的發現聚焦於阻斷基本的細胞功能和殺死***細胞之試劑。然而，在癌症末期(advanced cancer)的情況下，不論多積極地使用，甚至到了病人因治療而遭受生命威脅的副作用所苦，化學療法很少產生完全的治癒。在大部分情況下，病人中的腫瘤停止生長或暫時性縮小(稱為緩解(remission))，卻又開始增殖，有時候更快速(稱為復發(relapse))，且變得越來越更難以治療。最近，癌症藥物的發展的焦點已從廣效地細胞毒殺化學療法移至較低毒性的標靶細胞抑制療法(targeted cytostatic therapy)。癌症末期的治療已在臨床上於血癌(leukemia)和一些其他癌症中驗證。然而，在大部分的惡性腫瘤中，標靶方法仍證實沒有有效到能完全地清除大部分病人中的癌症。

已經使用各種不同的方法，包含例如導向癌症依賴用於生存及/或生長的訊息傳遞蛋白質的小分子；有腫瘤特異性的蛋白質之疫苗；具有主動地殺死腫瘤細胞的免疫細胞之細胞療法和將腫瘤作為細胞毒殺分子的標靶之抗體；干擾訊息傳遞之抗體及/或將宿主的免疫系統(重)導向至腫瘤細胞之抗體，來實現以癌症為標靶。阻斷CTLA-4或PD-1的單株抗體已經顯示出在患有黑色素瘤、NSCLC、腎細胞癌和泌尿上皮癌(urothelial carcinoma)病人的受試者中，誘導持久的臨床反應。

本發明提供將免疫系統成分(component)(重)導向之新穎手段及方法。本發明亦有關於調節由細胞表現的生物活性之手段及方法。

在一面向，本發明提供抑制第一或第二細胞中，由第一細胞上的第一膜蛋白質與第二細胞上的第二膜蛋白質的結合所介導的生物活性的方法，其中所述第一和第二膜蛋白質是結合配偶體(binding partner)(即配位體和受體對)，此方法包含 -對包含所述第一和第二細胞的系統提供抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體，前述抗體包含可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域；以及 -在所述抗體或其變異體不存在的情況下，使所述系統培養於允許第一或第二細胞表現由所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合所介導的所述生物活性的條件下； -其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合，且/或可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。

在一些實施例中，所述方法可為體外(in vitro )或離體(ex vivo )方法。

抗體或其變異體的結合較佳地降低在所述第一細胞中的受體-配位體對的結合的活性。前述結合較佳地降低在所述第一細胞中的受體-配位體對的結合的抑制活性。展現抑制活性的CD28家族和B7家族的受體-配位體對也是所謂的共抑制性受體-配位體對。

本發明亦提供抑制第一或第二細胞中，由第一細胞上的CD28家族成員(第一膜蛋白質)與第二細胞上的B7家族成員(第二膜蛋白質)的結合所介導的生物活性的方法，其中所述第一和第二膜蛋白質是結合配偶體(即配位體和受體對)，此方法包含 -對包含所述第一和第二細胞的系統提供抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體，前述抗體包含可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域；以及 -在所述抗體或其變異體不存在的情況下，使所述系統培養於允許第一或第二細胞表現由所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合所介導的所述生物活性的條件下； -其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合，且/或可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。

在一些實施例中，所述方法可為體外或離體方法。

抗體或其變異體的結合較佳地降低在所述第一細胞中的受體-配位體對的結合的活性。前述結合較佳地降低在所述第一細胞中受體-配位體對的結合的抑制活性。展現抑制活性的受體-配位體對是所謂的共抑制性受體-配位體對。

亦提供一種增強第一或第二細胞中，由第一細胞上的第一膜蛋白質與第二細胞上的第二膜蛋白質的結合所介導的生物活性的方法，此方法包含 -對包含所述第一和第二細胞的系統提供抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體，前述抗體包含可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域；以及 -在所述抗體或其變異體不存在的情況下，使所述系統培養於允許第一或第二細胞表現由所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合所介導的所述生物活性的條件下； -其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合不會阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合且可結合所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合不會阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。

在一些實施例中，所述方法可為體外或離體方法。

第一膜蛋白質較佳為計劃性細胞死亡1蛋白質(Programmed Cell Death 1 protein，PD-1)；細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)；B-和T-淋巴細胞衰減子(B-and T-lymphocyte attenuator，BTLA)；或含有跨膜和免疫球蛋白質域的2 (Transmembrane And Immunoglobulin Domain Containing 2，TMIGD2)。

第二膜蛋白質較佳為計劃性細胞死亡1配位體1蛋白質(Programmed Cell Death 1 Ligand 1 protein，PD-L1)；計劃性細胞死亡1配位體2蛋白質(Programmed Cell Death 1 Ligand 2 protein，PD-L2)；ICOSL；CD80；CD86；B7-H3；B7-H4；TNFRSF14； B7-H6或B7-H7。在一較佳實施例中，第二膜蛋白質為PD-L1；PD-L2；CD80；CD86；B7-H4；TNFRSF14；或B7-H7。在一特別較佳實施例中，第二膜蛋白質為PD-L1；或PD-L2，較佳地PD-L1。在一特別較佳實施例中，第一膜蛋白質為PD-1且第二膜蛋白質為PD-L1。本發明的分子較佳為能夠阻斷PD-1與PD-L1和/或PD-L2及PD-L1與PD-1和/或CD80的交互作用的雙特異性抗體。較佳地，本發明的分子能夠阻斷完整的PD-1軸，包含PD-1與PD-L1或PD-L2，和PD-L1與PD-1及CD80。見第33圖。

本發明亦提供一種抗體或所述抗體之維持抗體結合特異性的變異體，其包含可結合至第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至第二膜蛋白質的胞外部分的可變域，其中所述第一和第二膜蛋白質是結合配偶體(即配位體和受體對)，且其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與第二膜蛋白質的結合，且/或可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。

本發明亦提供一種抗體或所述抗體之維持抗體結合特異性的變異體，其包含 -可結合至CD28家族的蛋白質(第一膜蛋白質)的胞外部分的可變域，以及 -可結合至B7家族的蛋白質(第二膜蛋白質)的胞外部分的可變域； 其中所述第一和第二膜蛋白質是結合配偶體(即配位體和受體對)，且其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合，且/或可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。抗體或其變異體的結合較佳地降低在所述第一細胞中的受體-配位體對的結合的活性。前述結合較佳地降低在所述第一細胞中受體-配位體對的結合的抑制活性。展現抑制活性的受體-配位體對是所謂的共抑制性受體-配位體對。

抗體或其變異體較佳為雙特異性抗體。

在一較佳實施例中，抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體，包含 -可結合至PD-1；CTLA-4；BTLA；或TMIGD2的胞外部分的可變域；以及 -可結合至PD-L1；PD-L2；CD80、CD86、B7-H4、TNFRSF14或B7-H7的胞外部分的可變域。

在一較佳實施例中，抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體，包含 -可結合至PD-1的胞外部分的可變域；以及 -可結合至PD-L1或PD-L2的胞外部分的可變域。

較佳地，可結合PD-1的可變域的結合阻斷PD-1與PD-L1的結合。

較佳地，可結合PD-1的可變域的結合亦阻斷PD-1與PD-L2的結合。

較佳地，可結合PD-1的可變域的結合亦阻斷PD-1與PD-L1和PD-L2的結合。

可結合PD-L1的可變域的結合可阻斷PD-L1與PD-1的結合。

可結合PD-L1的可變域的結合可阻斷PD-L1與CD80的結合。

可結合PD-L1的可變域的結合可阻斷PD-L1與PD-1的結合且亦可阻斷PD-L1與CD80的結合。

亦提供包含一或多個本發明的抗體或其變異體的組合物或部分套組(kit of parts)或醫藥組合物。

亦提供一種核酸分子，其編碼本發明的抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體的至少一個CDR區，較佳地重鏈可變區。亦提供編碼本發明的抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體的核酸分子或核酸分子的集合。更提供包含本發明的核酸分子的載體。

亦提供包含一或多個核酸分子的細胞或非人類動物，前述核酸分子單獨或一起編碼本發明的抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體。亦提供使用如所述的細胞，較佳地加上從細胞的培養物中收穫抗體或其變異體，來產生抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體的方法。

更提供包含本發明的抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體。

亦提供一種治療具有涉及異常細胞(aberrant cell)，例如癌症或具有慢性感染，例如病毒或寄生蟲的疾病的個體的方法，此方法包含對有此需要的個體投予本發明的抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體。抗體或其變異體可較佳地結合至PD-1和PD-L1。結合PD-1的可變域較佳地阻斷PD-1與PD-L1的結合。結合PD-L1的可變域較佳地阻斷PD-1與PD-L1的結合。抗體或其變異體較佳為能夠阻斷PD-1與PD-L1和/或PD-L2及PD-L1與PD-1和/或CD80的交互作用的雙特異性抗體。較佳地，本發明的分子能夠阻斷完整的PD-1軸，包含PD-1與PD-L1或PD-L2，和PD-L1與PD-1及CD80。

更提供本發明的抗體、或其變異體或核酸分子作為藥物的用途。

本發明更提供本發明的抗體或所述抗體之維持本發明的抗體的結合特異性的變異體於治療具有涉及異常細胞，例如癌症或具有感染，例如病毒或寄生蟲感染的疾病的個體中的用途。

更提供根據本發明的抗體或變異體在製備用於治療或預防癌症和/或感染，例如病毒或寄生蟲感染的藥物的用途。

寄生蟲可為胞內寄生蟲。

更提供一種誘導和/或刺激個體中針對所述個體中的異常細胞的免疫反應的方法，此方法包含對所述個體提供本發明的抗體或維持抗體的結合特異性之所述抗體的變異體。異常細胞較佳為癌細胞、病毒感染的細胞、寄生蟲或寄生蟲感染的細胞。在一較佳實施例中，細胞是癌細胞或贅生(neoplastic)細胞。

受體的CD28家族在控制適應性免疫反應(adaptive immune response)中起作用。CD28家族的成員包含PD-1；CTLA-4；BTLA；TMIGD2；ICOS；CD28；和NKp30。當此家族的一些成員，例如CD28和ICOS，在結合相對應的B7家族成員(配位體)時，誘導共刺激訊號時；值得注意的是，其他成員CTLA4和PD-1在結合B-7家族成員(CD80；CD86；PD-L1或PD-L2)時，誘導抑制訊號。

計劃性細胞死亡1蛋白質(Programmed Cell Death 1 protein，PD-1)是屬於受體的CD28家族的細胞表面受體，且在T細胞及前B細胞(pro-B cell)上表現。目前已知PD-1結合兩個配位體，PD-L1及PD-L2。PD-1，作為免疫檢查點，藉由抑制T細胞的活化，在下調免疫系統中扮演重要角色，接著減少自體免疫並促進自身耐受性(self-tolerance)。PD-1的抑制效果被認為是透過促進淋巴結中抗原特異性T細胞中的細胞凋亡(計劃性細胞死亡)，同時減少調節性T細胞(抑制性T細胞)中的細胞凋亡的雙重機制來實現。PD-1亦以許多不同的化名為人所熟知，例如PDCD1；計劃性細胞死亡1；全身性紅斑性狼瘡易感性2 (Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility 2)；蛋白質PD-1；HPD-1；PD1；計劃性細胞死亡1蛋白質；CD279抗原；CD279；HPD-L；HSLE1；SLEB2；及PD-1。PD-1的外部身份為HGNC：8760；Entrez Gene：5133；Ensembl：ENSG00000188389；OMIM：600244；及UniProtKB：Q15116。阻斷PD-1活性的新型藥物，PD-1抑制子，活化免疫系統，以攻擊腫瘤，因此成功用於治療某些類型的癌症。

細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)是作為免疫檢查點的蛋白質受體。受體的CD28家族的成員參與下調動物中的免疫反應。當與抗原呈現細胞的表面上的CD80或CD86結合時，此蛋白質作為「關閉」的開關。CTLA4以許多其他名稱為人所知，例如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4(Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4)；胰島素依賴型糖尿病12(Insulin-Dependent Diabetes Mellitus 12)；腹腔疾病3；CD152；配位體和跨膜剪接細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(Ligand And Transmembrane Spliced Cytotoxic T Lymphocyte Associated Antigen 4)；細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Antigen 4)；CD152抗原；CELIAC3； IDDM12；ALPS5；GRD4；GSE；和CD。 CTLA4的外部身份是HGNC：2505；Entrez Gene：1493；Ensembl：ENSG00000163599；OMIM：123890；及UniProtKB：P16410。

B-和T-淋巴細胞衰減子(B-and T-lymphocyte attenuator，BTLA)是蛋白質的CD28家族的另一成員。它在T細胞活化期間被誘導。BTLA在Th1細胞上表現而不是Th2細胞。BTLA是B7-H4的結合配偶體。與此家族的其他成員不同，BTLA可與非B7家族成員交互作用。BTLA透過與腫瘤壞死家族受體(tumor necrosis family receptor，TNF-R)的交互作用，展現出T細胞抑制。BTLA是腫瘤壞死因子(受體)超家族，成員14(tumor necrosis factor (receptor) superfamily, member 14，TNFRSF14)的配位體，亦以皰疹病毒進入介導因子(herpes virus entry mediator，HVEM)為人所知。BTLA-HVEM複合物負調節T細胞的免疫反應。BTLA的其他名稱是B和T淋巴細胞相關蛋白質(B And T Lymphocyte Associated Protein)；CD272抗原；BTLA1；和CD272。 BTLA的外部身份是HGNC：21087；Entrez Gene：151888；Ensembl：ENSG00000186265；OMIM：607925；和UniProtKB：Q7Z6A9。

含有跨膜和免疫球蛋白質域的2(Transmembrane And Immunoglobulin Domain Containing 2，TMIGD2)是蛋白質的CD28家族的成員。可在上皮細胞和內皮細胞來源的細胞中，偵測到此蛋白質，且當被內皮細胞系過度表現時，能夠體外增強血管生成。據報導，TGMID2為在初始T細胞(naïve T-cell)上表現的刺激性受體。此受體的配位體是HHLA2 (B7-H7)。後者在很多種癌細胞上表現。TMIGD2以許多其它不同名稱為人所知，例如含有跨膜和免疫球蛋白質域的2(Transmembrane And Immunoglobulin Domain Containing 2)；含有免疫球蛋白質且富含脯胺酸的受體-1(Immunoglobulin-Containing And Proline-Rich Receptor-1)；CD28同源物2；CD28同源；IGPR-1；CD28H；及IGPR1。TMIGD2的外部身份為HGNC：28324；Entrez Gene：126259；Ensembl：ENSG00000167664；OMIM：614715；及UniProtKB：Q96BF3。

ICOS(誘導型T細胞共刺激因子(Inducible T-cell Costimulator))或CD278是在經活化的T細胞上表現的CD28家族共刺激分子。認為它對Th2細胞特別重要。此蛋白質形成同質二聚體，且在細胞-細胞訊息傳遞、免疫反應和細胞增殖的調節中扮演重要的角色。與野生型初始T細胞相比，用與盤子結合的抗CD3活化的ICOS剔除(knock-out)T細胞具有減少的增殖和IL-2分泌。用Ipilimumab(一種結合CTLA-4的單株抗體)治療的病人，在腫瘤組織和血液中具有增加的ICOS+ T細胞。此增加作為抗CTLA-4治療的藥效(pharmacodynamic)生物標誌物。ICOS以許多不同的名稱為人所知，例如活化誘導型淋巴細胞免疫介導分子(Activation-Inducible Lymphocyte Immunomediatory Molecule)；AILIM；誘導型共刺激因子；CD278抗原； CD278；和CVID1。 ICOS的外部ID是HGNC：5351；Entrez Gene：29851；Ensembl：ENSG00000163600；OMIM：604558及UniProtKB：Q9Y6W8。

CD28(分化簇28(Cluster of Differentitaion 28))是在T細胞上表現且提供T細胞活化和存活所需的共刺激訊息的蛋白質之一。除了T細胞受體(T-cell receptor，TCR)之外，透過CD28的T細胞刺激可提供有效的訊息，用於各種介白素(特別是IL-6)的產生。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)蛋白質的受體。當被類鐸受體(Toll-like receptor)配位體活化時，CD80的表現在抗原呈現細胞(antigen presenting cell，APC)中被上調。抗原呈現細胞上的CD86的表現是持續性的(表現不依賴於環境因子)。CD28是持續地在初始T細胞上表現的B7受體。無CD28：B7的交互作用之初始T細胞的TCR與MHC：抗原複合物結合被認為導致無反應性(anergic)的T細胞。CD28以許多不同的名稱為人所知，例如CD28分子；CD28抗原；Tp44；T細胞特異性表面醣蛋白質(T-Cell-Specific Surface Glycoprotein)；及CD28抗原(Tp44)。CD28的外部身份是HGNC：1653；Entrez Gene：940；Ensembl：ENSG00000178562；OMIM：186760及UniProtKB：P10747。

NKp30是CD28家族的成員。它是天然細胞毒性受體(natural cytotoxicity receptor，NCR)的成員，包含NKp30、NKp44和NKp46。自然殺手(natural killer，NK)細胞以抗體非依賴性(antibody-independent)的方式辨認且破壞腫瘤和病毒感染的細胞。藉由活化和抑制NK細胞表面上的受體，來介導NK細胞的調節。活化受體的其中之一家族是NCR家族。NCR藉由辨認癌細胞上的硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)，來啟動腫瘤標靶(tumor targeting)。 NKp30與高度帶電的HS/肝素結構交互作用。NKp30的配位體之一是B7-H6。B7-H6是共刺激分子。B7-H6通常不在正常細胞上表現，但可在腫瘤細胞上高度表現。它也可透過誘導，在抗原呈現細胞(antigen presenting cell，APC)上表現。由於NKp30與B7-H6的交互作用，NK細胞可被活化，以釋放TNFα和IFNγ。NKp30以許多不同的名稱為人所知，例如天然細胞毒性觸發受體3(Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 3，NCR3)；自然殺手細胞P30相關蛋白質(Natural Killer Cell P30-Related Protein)；活化自然殺手受體P30(Activating Natural Killer Receptor P30)；淋巴細胞抗原117；NK-P30；LY117；1C7；活化NK-A1受體；CD337抗原；CD337；或MALS。 NKp30的外部身份是HGNC：19077；Entrez Gene：259197；Ensembl：ENSG00000204475；OMIM：611550；及UniProtKB：O14931。

B7家族包含許多結構相關的細胞表面蛋白質，他們結合至淋巴球上調控免疫反應的受體。藉由細胞表面之抗原特異性T細胞受體或B細胞受體的參與，來啟動淋巴球的活化。同時由B7配位體傳送的額外訊息更決定這些細胞的免疫反應。由B7家族成員透過淋巴球上的受體的CD28家族傳送這些所謂的「共刺激」或「共抑制」訊息。B7家族成員與共刺激受體的結合增強免疫反應，而與共抑制受體的結合減弱免疫反應。目前，此家族的七個成員是為人所知的：B7.1 (CD80)、B7.2 (CD86)、誘導型共刺激子配位體(inducible costimulator ligand，ICOS-L)、計劃性死亡1配位體(programmed death-1 ligand，PD-L1)、計劃性死亡2配位體(programmed death-2 ligand，PD-L2)、B7-H3及B7-H4。B7家族成員在淋巴及非淋巴組織中表現。成員對調控免疫反應的影響顯示於具有B7家族基因突變的小鼠中的免疫缺陷和自體免疫疾病的發展中。由B7配位體傳送的訊息的操縱已顯示出治療自體免疫、發炎疾病及癌症的潛力。

CD80為在經活化的B細胞及單核球上發現且提供T細胞的活化及生存所必要的共刺激訊息的蛋白質。它是T細胞表面上的兩個不同蛋白質的配位體：CD28及CTLA-4。當與CD28結合時，它與共刺激相關，而結合至CTLA4與免疫反應的減弱相關。CD80與CD86協同地(in tandem)作用，以活化T細胞。據報導，CD80亦結合PD-L1。CD80以許多其他名稱為人所知，例如CD80分子；CD80抗原；CD28抗原配位體1；B7-1抗原；B淋巴細胞活化抗原B7(B-Lymphocyte Activation Antigen B7)；CTLA-4反受體B7.1 (CTLA-4 Counter-Receptor B7.1)；活化B7-1抗原；CD28LG1；CD28LG；LAB7；BB1；B7；共刺激因子CD80；CD80抗原；及B7-1。CD80的外部身份為HGNC：1700；Entrez Gene：941；Ensembl：ENSG00000121594；OMIM：112203；及UniProtKB：P33681。

CD86為在抗原呈現細胞上表現的蛋白質。它可提供用於T細胞活化及生存的共刺激訊息。它是在T細胞表面上的兩個不同蛋白質的配位體：它是在T細胞表面上的兩個不同蛋白質的配位體：CD28及CTLA-4。當CD86與CD28結合時，它與共刺激相關，而結合至CTLA4與免疫反應的減弱相關。CD86與CD80協同地(in tandem)作用，以活化T細胞。它以許多其他名稱為人所知，例如CD86分子；CD86抗原；CD28抗原配位體2；B7-2抗原；CTLA-4反受體B7.2；CD28LG2；FUN-1；BU63；B70；B淋巴細胞活化抗原B7-2；B淋巴細胞抗原B7-2；活化B7-2抗原；CD86抗原；LAB72；及B7-2。CD86的外部身份為HGNC：1705；Entrez Gene：942；Ensembl：ENSG00000114013；OMIM：601020；及UniProtKB：P42081。

PD-L1為第1型跨膜蛋白質，其在特定事件的期間，例如懷孕、組織異體移植(tissue allograft)、自體免疫疾病及其他疾病狀態例如肝炎，於抑制免疫反應中起作用。PD-L1在各種類型的癌症中表現，包含NSCLC、黑色素瘤、腎細胞癌、胃癌、肝細胞癌以及各種血癌和多發性骨髓瘤(multiple myeloma)。PD-L1存在於癌細胞的細胞質及細胞膜中，但並不是所有癌症或腫瘤內的所有細胞都表現PD-L1。多個腫瘤微環境細胞藉由上調PD-L1的表現，來促進免疫抑制。此效應被稱為「適應性免疫耐受性(adaptive immune resistance)」，因為腫瘤藉由誘導PD-L1以保護自己，來回應由經活化的T細胞所產生的IFN-γ。PD-L1亦可被致癌基因(ongcogene)調控，此機制以先天免疫耐受性(inherent immune resistance)為人所知。在腫瘤微環境內，PD-L1亦在骨髓細胞和經活化的T細胞上表現。透過多種促發炎分子，包含第I和II型IFN-γ、TNF-α、LPS、GM-CSF及VEGF，還有細胞激素IL-10及IL-4，來誘導PD-L1的表現。PD-L1與PD-1或B7.1 (CD80)的結合傳遞降低表現PD-1的T細胞的增殖的抑制訊息。PD-1被認為能夠透過細胞凋亡，來控制外來抗原特異性T細胞的累積。PD-L1由多種癌細胞表現，且其表現被認為至少部分地負責減緩針對癌細胞的免疫反應。PD-L1是蛋白質的B7家族的成員，且以其他各種名稱為人所知，例如CD274分子；CD274抗原；B7同源物1；PDCD1配位體1；PDCD1LG1；PDCD1L1；B7H1；PDL1；計劃性細胞死亡1配位體1；計劃性死亡配位體1；B7-H1；及B7-H。CD274的外部身份為HGNC：17635；Entrez Gene：29126；Ensembl：ENSG00000120217；OMIM：605402；UniProtKB：Q9NZQ7。

PD-L2是PD-1的第二配位體。PD-1之藉由PD-L2的參與抑制了由T細胞受體(T cell receptor，TCR)所介導的增殖及由CD4+ T細胞產生的細胞激素。在低抗原濃度時，PD-L2/PD-1的結合抑制B7-CD28訊息。在高抗原濃度時，PD-L2/PD-1的結合降低細胞激素的產生。藉由干擾素gamma的處理，在抗原呈現細胞上上調PD-L的表現。它在一些正常組織及各種腫瘤中表現。PD-L1及PD-L2被認為具有重疊的功能且調控T細胞的反應。此蛋白質PD-L2以許多其它名稱為人所知，例如計劃性細胞死亡1配位體2(Programmed Cell Death 1 Ligand 2)；B7樹突細胞分子；計劃性死亡配位體2；嗜乳脂蛋白質B7-DC (Butyrophilin B7-DC)；PDCD1配位體2；PD-1配位體2 (PD-1 Ligand 2)；PDCD1L2；B7-DC；CD273；B7DC；PDL2；PD-1-配位體2 (PD-1-Ligand 2)；CD273抗原；BA574F11.2；及Btdc。PD-L2的外部身份為HGNC：18731；Entrez Gene：80380；Ensembl：ENSG00000197646；OMIM：605723；及UniProtKB：Q9BQ51。

誘導型T細胞共刺激子配位體(Inducible T-Cell Co-Stimulator Ligand，ICOSL或CD275)由APC及許多非血液性組織持續地表現。表現可被進行中的發炎所下調。ICOSL目前已知與人類中的ICOS、CD28及CTLA-4交互作用。ICOSL/CD28的交互作用似乎共刺激人類T細胞對同種異體抗原(allogeneic antigen)的初級反應(primary response)及記憶回憶反應。ICOSL/CTLA-4被認為引起共抑制訊息。ICOSL亦以ICOSLG；B7相關蛋白質1；B7同源物2 (B7 Homolog 2)；類B7蛋白質G150；B7同源物2 (B7 Homologue 2)；B7RP-1；B7-H2；B7RP1；B7H2；跨膜蛋白質B7-H2 ICOS 配位體(Transmembrane Protein B7-H2 ICOS Ligand)；CD275抗原；KIAA0653；ICOS-L；LICOS；及GL50為人所知。ICOSL的外部身份為HGNC：17087；Entrez Gene：23308；Ensembl：ENSG00000160223；OMIM：605717；及UniProtKB：O75144。

CD276(或B7-H3)的表現在各種惡性腫瘤中增加，且可在正常及腫瘤衍生的循環內皮細胞之間區分(Kraan et al British Journal of Cancer (2014) 111, 149–156)。受體的刺激引導人類骨髓基質細胞(marrow stromal cell)分化至成骨細胞 (Xu et al 2011; Immunobiology 216 (2011) 1311–1317)。此蛋白質在人類中含有4個類Ig域，而小鼠蛋白質似乎具有兩個這樣的結構域。此蛋白質被認為是在類骨髓細胞(TREM)轉錄體2(myeloid cells (TREM)-like transcript 2，TLT-2或TREMML2)上表現的觸發受體(triggering receptor)的第一個被鑑定出來的配位體。後者蛋白質結合B7-H3 (4Ig-B7-H3)且共刺激CD8 T細胞的活化(Hofmeyer et al 2009 PNAS 105; 10277-10278)。CD276被廣泛地表現。它作為T細胞共刺激子。CD276亦以許多其它名稱為人所知，例如CD276分子；共刺激分子；CD276抗原；B7同源物3；4Ig-B7-H3；B7-H3；B7H3；及B7RP-2。CD276的外部身份為HGNC：19137；Entrez Gene：80381；Ensembl：ENSG00000103855；OMIM：605715；及UniProtKB：Q5ZPR3。

B7-H4 (VTCN1)的mRNA似乎廣泛地表現，但只有少數細胞主動地在膜上表現此蛋白質。此蛋白質在膜上的表現和與經活化的T細胞的結合藉由細胞週期停滯、減少增殖及減少IL-2的產生，來產生T細胞效應子功能的抑制。在各種人類癌症中，於癌細胞和免疫抑制性的腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)的表面上上調B7-H4。B7-H4是BTLA的結合配偶體。透過B7-B4路徑的訊息傳遞導致抑制經TCR介導的CD4+及CD8+ T細胞增殖、細胞週期的進程及IL-2的產生。B7-H4亦以許多其它名稱為人所知，例如含有V-Set域的T細胞活化抑制子1 (V-Set Domain Containing T Cell Activation Inhibitor 1)；免疫共刺激蛋白質B7-H4；T-細胞共刺激分子B7x (T-Cell Costimulatory Molecule B7x)；B7超家族成員1；B7同源物4；B7h.5；B7H4；T細胞共刺激分子B7x (T Cell Costimulatory Molecule B7x)；B7家族成員，H4(B7 Family Member, H4)；蛋白質B7S1；PRO1291；VCTN1；B7S1；B7X；及H4 2。B7-H4的外部身份為HGNC：28873；Entrez Gene：79679；Ensembl：ENSG00000134258；OMIM：608162及UniProtKB：Q7Z7D3。

B7-H6屬於B7家族(見 MIM 605402)且在腫瘤細胞上選擇性地表現。B7-H6與NKp30 (NCR3；MIM 611550)的結合導致自然殺手(natural killer，NK)細胞的活化及細胞毒性(Brandt et al., 2009 J Exp Med. 2009 Jul 6;206(7):1495-503)。自然殺手(NK)細胞為參與消除腫瘤的先天免疫系統的淋巴細胞。B7-H6為結合NKp30的腫瘤細胞表面分子，NKp30是觸發抗腫瘤NK細胞的細胞毒性及細胞激素的分泌的人類受體。B7-H6的其它名稱為NCR3LG1；自然殺手細胞細胞毒性受體3配位體1 (Natural Killer Cell Cytotoxicity Receptor 3 Ligand 1)；B7同源物6；B7H6；含有假類Ig域的蛋白質(Putative Ig-Like Domain-Containing Protein) DKFZp686O24166/DKFZp686I21167；及DKFZp686O24166。B7-H6的外部身份為HGNC：42400；Entrez Gene：374383；Ensembl：ENSG00000188211；OMIM：613714；及UniProtKB：Q68D85。

在胎盤的滋養層細胞(trophoblastic cell)及腸道、腎臟、膽囊和胸的上皮中，但不在其它大部分的器官中，偵測到B7-H7 (HHLA2)蛋白質。HHLA2蛋白質廣泛地表現於來自胸、肺、甲狀腺、黑色素瘤、胰、卵巢、肝、膀胱、大腸、***、腎和食道的人類癌症中。HHLA2的高度表現與區域的淋巴結轉移和分期(stage)相關(Janakiram et al. Clin Cancer Res; 21(10): 2359-66; May 15, 2015)。TMIGD2被鑑定為HHLA2的受體之一。B7-H7以許多不同的名稱為人所知，例如HERV-H LTR關聯2 (HERV-H LTR-Associating 2)；人類內源性反轉錄病毒H長末端重複相關蛋白質2 (Human Endogenous Retrovirus-H Long Terminal Repeat-Associating Protein 2)；B7H7及B7y。B7-H7的外部身份為HGNC：4905；Entrez Gene：11148；Ensembl：ENSG00000114455；OMIM：604371及UniProtKB：Q9UM44。

腫瘤壞死因子受體超家族成員14(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 14，TNFRSF14)是TNF受體超家族的人類細胞表面受體。此蛋白質起初以皰疹病毒進入介導因子A(herpesvirus entry mediator A，HveA)為人所知。它在分化分類的簇(cluster)中也以CD270為人所知。TNFRSF14被鑑定為單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)進入的細胞介導因子。HSV病毒包膜醣蛋白質D(glycoprotein D，gD)與此受體蛋白質的結合已顯示為病毒進入機制的一部分。發現此受體的細胞質區結合至幾個TRAF家族成員，這可能介導活化免疫反應的訊息轉導路徑。TNFRSF14以許多不同的名稱為人所知，例如腫瘤壞死因子受體超家族，成員14(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily, Member 14)(皰疹病毒進入介導因子)；皰疹病毒進入介導因子A(Herpes Virus Entry Mediator A)；HVEA；HVEM；TR2；類腫瘤壞死因子受體基因2(Tumor Necrosis Factor Receptor-Like Gene2)；類腫瘤壞死因子受體2；皰疹病毒進入介導因子A (Herpesvirus Entry Mediator A)；皰疹病毒進入介導因子(Herpesvirus Entry Mediator)；類CD40蛋白質；CD270抗原；LIGHTR；CD270；及ATAR。TNFRSF14的外部身份是：HGNC：11912；Entrez Gene：8764；Ensembl：ENSG00000157873；OMIM：602746；及UniProtKB：Q92956。

已完成涉及序列識別符(sequence identifier)，以識別那個蛋白質被作為標靶。只要被各自的可變域(variable domain)所辨認的抗原決定基沒有受影響，本發明之抗體或其變異體，例如其變異體通常亦辨認至少其變異體中的一些，例如其對偶變異體(allelic variant)、剪接變異體(splice variant)及突變變異體。一些替代名稱可能或可能也沒用於指其它蛋白質。給予名稱僅用於參考的目的。本發明之抗體或其變異體，例如其變異體結合至在細胞上表現的蛋白質。只要此抗體結合的抗原決定基可用，其亦可結合至此蛋白質的變異體。因此，只要抗原決定基可用，剪接變異體或突變蛋白質(如果有)亦會被結合。抗體或其變異體結合至指定的蛋白質意指其可作為一種性質，來結合至蛋白質，且不暗示此抗體或其變異體實際上被目標結合。這也不一定意指此可變域抗體無法結合至其它蛋白質。

本發明提供抑制第一或第二細胞中，由第一細胞上的第一膜蛋白質與第二細胞上的第二膜蛋白質的結合所介導的生物活性的方法，此方法包含 -對包含所述第一和第二細胞的系統提供包含可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的抗體或其變異體；以及 -在所述抗體或其變異體不存在的情況下，使所述系統培養於允許所述生物活性表現的條件下； -其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合，且/或可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。在一些實施例中，所述方法是體外方法。此方法中所使用的抗體結合兩個結合配偶體且阻斷兩者彼此的結合。在此方法中，促使和/或使表現結合配偶體的兩個細胞維持緊密靠近在一起，但同時結合配偶體的結合是被抑制。這與包含可變域的兩個單株單特異性抗體的組合不同。這些也阻斷兩個結合配偶體的結合，但不會促使和/或使細胞維持緊密靠近。本發明的抗體，特別是本發明的雙特異性抗體的特殊活性在包含三或更多種不同細胞類型的複雜環境中特別顯著。

本發明亦提供增強第一或第二細胞中，由第一細胞上的第一膜蛋白質與第二細胞上的第二膜蛋白質的結合所介導的生物活性的方法，此方法包含： -對包含所述第一和第二細胞的抗體或其變異體的系統提供包含可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的抗體或其變異體；以及 -在所述抗體或其變異體不存在的情況下，使所述系統培養於允許細胞表現所述生物活性的條件下； -其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合不會阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合，且可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合不會阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。

在一些實施例中，所述方法是體外或離體方法。

本發明更提供包含可結合至第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的抗體或其變異體，其中所述第一和第二膜蛋白質為結合配偶體(即結合對(binding pair)或配位體和受體對的成員)且其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合，且/或可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。這種抗體在抑制如本文所述之由所述第一膜蛋白質和所述第二膜蛋白質的結合所介導的生物活性的方法中是有用的。

本發明更提供包含可結合至第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的抗體或其變異體，其中所述第一和第二膜蛋白質為結合配偶體(即結合對或配位體和受體對的成員)且其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合不會阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合，且可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的結合不會阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。這種抗體在增強由所述第一膜蛋白質和所述第二膜蛋白質的結合所介導的生物活性的方法中是有用的。

第一膜蛋白質和第二膜蛋白質是至少具有一胞外部分的細胞的膜蛋白質。兩者的結合可導致在第一細胞、第二細胞或兩者中表現生物活性。在本發明的方法中，第一和第二細胞較佳是不同細胞。不同的細胞可以是相同類型的細胞，但通常它們是不同的。生物活性是由細胞表現的活性，其回應第一和第二膜蛋白質的結合，而在第一和/或第二細胞或包圍細胞的培養基中是可測量的。如果兩個細胞都表現生物活性，則活性可以相同但通常是不同的。第一和第二蛋白質的這種結合通常稱為受體-配位體結合。在本發明中，受體和配位體都與各自細胞的細胞膜的胞外側上聯結且至少部分可接近。術語「受體」通常用於當與配位體結合時，引發細胞的生物活性的蛋白質。 術語「配位體」通常用於結合至受體的蛋白質。本發明中的配位體也是膜蛋白質，且配位體與受體的結合可引發包含配位體的細胞的生物活性。這種所謂的雙向效應(bidirectional effect)的非限制性範例是HVEM/BTLA結合對的交互作用。HVEM與BTLA的結合誘導HVEM表現細胞中的生物活性和BTLA表現細胞中的生物活性。 因此，在本發明中，術語「配位體」的使用不一定意味著受體與配位體的結合不能在細胞膜上包含配位體的細胞中引發生物活性。如果蛋白質具有存在於其所在之細胞的細胞膜中的跨膜區，則此蛋白質被認為是細胞上的膜蛋白質。蛋白質可具有其它跨膜區。在這種情況下，存在於細胞膜中的所有跨膜區都存在於相同細胞的細胞膜中。

受體和配位體是通常透過非共價鍵，來彼此交互作用(結合)的特異性結合配偶體。前述結合是特異性的，因為在生理條件下，受體和配位體通常只會彼此結合而不與其他蛋白質結合。一些受體和配位體可特異性結合至有限數量的其他結合配偶體。非限制性範例是可與結合配偶體PD-L1和PD-L2交互作用的受體PD-1。

引發的生物活性的類型取決於結合配偶體。結合可誘導生長；改變細胞的活化狀態；引發或抑制一或多種細胞激素的排出(excretion)；影響細胞的細胞溶解功能；等等。通常藉由測量接受(受體表現)細胞對結合的反應，來測量生物活性。舉例而言，通常藉由偵測PD-1表現細胞的生物活性，來測量PD-1/PD-L1結合。PD-1之藉由其配位體PD-L1或PD-L2的交互作用誘導生物活性，例如T細胞增殖的抑制、細胞激素之產生的抑制和細胞溶解功能的抑制。

當在抗體或其變異體存在的情況下測量的生物活性低於在抗體或變異體不存在，而其他條件相同的情況下測量的生物活性時，生物活性是被抑制的。生物活性可被抑制至少10、20、30、40、50、或較佳地至少60%。生物活性較佳地被抑制至少70%、較佳至少80%、較佳至少90%。生物活性被抑制至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%，當在抗體或其變異體存在的情況下測量的生物活性相應地比在抗體或變異體不存在，而其他條件相同的情況下測量的生物活性低10、20、30、40、50、60、70、80或90%時。當本發明的抗體的可變域之一可阻斷其目標與目標的結合配偶體的結合時，生物活性通常是被抑制的。當抗體更包含結合目標之所提及的結合配偶體且阻斷結合配偶體與目標結合的可變域時，生物活性通常是被進一步抑制。

當在抗體或其變異體存在的情況下測量的生物活性高於在抗體或變異體不存在，而其他條件相同的情況下測量的生物活性時，生物活性是被引發及/或增強的。生物活性可被增強至少10、20、30、40、50、或較佳地至少60%。生物活性較佳地被增強至少70%、較佳至少80%、較佳至少90%。生物活性被增強至少10、20、30、40、50、60、70、80或90%，當在抗體或其變異體存在的情況下測量的生物活性相應地比在抗體或變異體不存在，而其他條件相同的情況下測量的生物活性高10、20、30、40、50、60、70、80或90%時。當本發明的抗體的兩個可變域不會阻斷其目標彼此的結合時，生物活性通常是被增強的。

合適的系統是其中提供第一細胞和第二細胞的細胞培養物。另一合適的系統是包含第一細胞和第二細胞的動物。其它合適的系統是離體(ex vivo )系統，其中細胞維持於活化形式，但其中細胞的生長不一定被促進。第一和第二細胞可在，例如不一定促進生長但允許測量生物活性的測定條件下一起培養。

將所述系統培養於允許細胞表現由所述第一膜蛋白質和所述第二膜蛋白質的結合所介導的所述生物活性的條件下意味著前述系統維持在其中由於結合配偶體，而第一和第二細胞可展現出生物活性的條件下。體內(In vivo )培養不必涉及超過足夠的時間以使生物活性變得明顯。

「阻斷」所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合的可變域干擾此第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。這種可變域可結合第一膜或第二膜蛋白質。結合例如第一膜蛋白質的阻斷可變域可結合所述第一膜蛋白質上的抗原決定基(epitope)且與所述第二膜蛋白質競爭結合此抗原決定基。這種阻斷可變域和第二膜蛋白質也可結合至所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基。在這種情況下，阻斷活性可以為，例如是由於第二膜蛋白質的結合減少、當第二膜蛋白質已經與所述第一膜蛋白質結合時，第二膜蛋白質的置換(displacement)，或可透過空間位阻(steric hindrance)，來防止結合至第一膜蛋白質。所有這些和其它機制可至少部分地防止所述第二膜蛋白質可結合至所述第一膜蛋白質。結合第一膜蛋白質或第二膜蛋白質的可變域可阻斷結合配偶體的結合。

當與可變域不存在時的結合相比，如本文所述的阻斷膜蛋白質的特異性結合對的結合的可變域通常降低此配對的結合。這通常用包含可變域的抗體來測量。這較佳地在體外測定中測量。通常，這藉由將可變域與其可結合的膜蛋白質一起培養，隨後將此混合物與此配對中的另一成員一起培養來完成。然後將此配對的結合與此配對在可變域不存在時的結合進行比較。可變域可完全地防止第一膜蛋白質與第二膜蛋白質的結合。其亦可部分地防止此配對的結合。當與可變域不存在時的結合相比時，阻斷膜蛋白質的特異性結合對的結合的可變域較佳地減少此配對的結合至少50%、較佳地至少60%、較佳地至少70%、較佳地至少80%、和更佳地至少90%。藉由可變域阻斷結合在本文中定義為，使用包含所述兩個相同的所述可變域的二價單株抗體獲得的阻斷。當可變域存在於包含所述可變域和結合第二目標的可變域的抗體中時，其中第二目標可與第一可變域所結合的目標相同或不同，可變域當然也阻斷結合。可結合PD-1的胞外域且至少部分阻斷PD1與PD-L1的結合的特定可變域是包含MF6076；MF6236；MF6256；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；MF6982；MF6929；MF7699；MF7698；MF7687；MF7686；MF7685；或MF7684(第3圖和/或第13圖)的VH的胺基酸序列的可變域。

可結合PD-L1的胞外域且阻斷PD1與PD-L1結合的特定可變域是包含MF5359；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；MF5708；MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695(第3圖和/或第13圖)的VH的胺基酸序列的可變域。

當與可變域不存在時的結合相比，如本文所述的不會阻斷膜蛋白質的特異性結合對的結合的可變域通常不會減少此配對的結合。這通常用包含可變域的抗體來測量。這較佳地在體外測定中測量。通常，這藉由將可變域與其可結合的膜蛋白質一起培養，且隨後將此混合物與此配對中的另一成員一起培養來完成。然後將此配對的結合與此配對在可變域不存在時的結合進行比較。

可結合PD-L1的胞外域且不會阻斷PD1與PD-L1的結合的特定可變域是包含MF5361的VH的胺基酸序列的可變域(第3圖)。

可用各種方式，來確定可變域在種類但不一定是量的功能面向，例如與抗原的結合、阻斷受體配位體交互作用的能力、可變域的生物活性等等。合適的形式是FAB片段或抗體。合適的抗體形式是包含兩個可變域的單特異性二價抗體。另一合適的形式是例如包含待測試的可變域和另一可變域的雙特異性抗體。另一可變域較佳為相對於待執行的測定，具有中性特異性的可變域。合適的中性可變域是可結合破傷風類毒素(tetanus toxoid)的可變域。

本發明的抗體或其變異體較佳地包含阻斷其目標膜蛋白質與其結合配偶體的結合的可變域。在此較佳實施例中，抗體或其變異體的另一可變域結合目標膜蛋白質的結合配偶體。結合此結合配偶體的可變域可阻斷結合配偶體與目標膜蛋白質的結合，或它不會阻斷結合配偶體與目標膜蛋白質的結合。在較佳實施例中，結合此結合配偶體的可變域可阻斷結合配偶體與目標膜蛋白質的結合。

在另一實施例中，本發明的抗體或其變異體包含不會阻斷其目標膜蛋白質與其結合配偶體的結合的可變域。在此較佳實施例中，抗體或其變異體的另一可變域結合目標膜蛋白質的結合配偶體。結合此結合配偶體的可變域可阻斷結合配偶體與目標膜蛋白質的結合，或者它不會阻斷結合配偶體與目標膜蛋白質的結合。在一較佳實施例中，結合此結合配偶體的可變域不會阻斷結合配偶體與目標膜蛋白質的結合。

本發明更提供誘導或刺激免疫細胞的免疫反應的方法，包含提供 -免疫細胞(第一細胞)，其在細胞膜上具有第一膜蛋白質，較佳地CD28家族的成員； -第二細胞，其在細胞膜上具有第二膜蛋白質，較佳地B7家族的成員或TNFRSF14； -提供包含可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的抗體或其變異體，此方法更包含將所述第一細胞和所述第二細胞還有所述抗體一起培養，藉此誘導或刺激所述第一細胞的免疫反應。

本發明更提供誘導或刺激免疫細胞的免疫反應的方法，包含提供 -免疫細胞(第一細胞)，其在細胞膜上具有第一膜蛋白質，較佳地CD28家族的成員； -第二細胞，其在細胞膜上具有第二膜蛋白質，較佳地B7家族的成員或TNFRSF14； -提供包含可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的抗體或其變異體(第一抗體)； -提供包含可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的另一抗體或其變異體(第二抗體)； 其中第一和第二抗體結合 -所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基； -所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或 -所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基和所述第一膜蛋白 質上的不同抗原決定基； 此方法更包含將所述第一細胞和所述第二細胞，還有所述第一和第二抗體一起培養，藉此誘導或刺激所述第一細胞的免疫反應。

本發明更提供誘導或刺激免疫細胞的免疫反應的方法，包含提供 -免疫細胞(第一細胞)，其在細胞膜上具有PD-1； -第二細胞，其在細胞膜上具有PD-L1； -提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域的抗體或其變異體，此方法更包含將所述第一細胞和所述第二細胞還有所述抗體一起培養，藉此誘導或刺激所述第一細胞的免疫反應。在一些實施例中，所述方法是體外(in vitro )或離體(ex vivo )方法。

本發明更提供誘導或刺激免疫細胞的免疫反應的方法，包含提供 -免疫細胞(第一細胞)，其在細胞膜上具有PD-1； -第二細胞，其在細胞膜上具有PD-L1； -提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域的抗體或其變異體(第一抗體)； -提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域的另一抗體或其變異體(第二抗體)； 其中第一和第二抗體結合 -PD-1上的不同抗原決定基； -PD-L1上的不同抗原決定基；或 -PD-1上的不同抗原決定基和PD-L1上的不同抗原決定基； 此方法更包含將所述第一細胞和所述第二細胞，還有所述第一和第二抗體一起培養，藉此誘導或刺激所述第一細胞的免疫反應。在一些實施例中，所述方法是體外方法。

所述免疫反應可為T細胞受體(T-cell receptor，TCR)所介導的或不是。在一較佳實施例中，所述免疫反應是TCR-受體所介導的。較佳地藉由測量免疫細胞釋放的促發炎細胞激素，來測量所述免疫反應。在一較佳實施例中，細胞激素是IL-2。與抗體不存在的情況相比時，IL-2量的變化表示免疫反應是否受抗體影響。增加表示免疫反應被刺激。從無法偵測至可檢測的IL-2的變化表示經誘導的免疫反應。

第一細胞較佳為免疫細胞。免疫細胞較佳為T細胞或NK細胞。在一實施例中，所述免疫細胞是T細胞。第二細胞較佳為抗原呈現細胞、腫瘤細胞、病毒感染的細胞或胞內寄生蟲感染的細胞。第一細胞是在其細胞膜上表現所述第一膜蛋白質的細胞。第二細胞是在其細胞膜上表現所述第二膜蛋白質的細胞。細胞膜也稱為質膜(plasma membrane)或細胞質膜(cytoplasmic membrane)，且是將細胞內部與外部環境隔開的生物膜。

本發明更提供包含二或更多抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物的組合物或部分套組(kit of parts)，其包含可結合至第一膜蛋白質，較佳地CD28家族的成員的胞外部分的可變域和可結合至第二膜蛋白質，較佳地B7家族的成員或TNFRSF14的胞外部分的可變域的抗體或其變異體(第一抗體)；以及包含可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域的另一抗體或其變異體(第二抗體)， 其中第一和第二抗體結合 -所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基； -所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基；或 -所述第一膜蛋白質上的不同抗原決定基和所述第二膜蛋白質上的不同抗原決定基。

包括包含具有結合相同第一和第二膜蛋白質的可變域的抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物的方法、用途、組合物或部分套組的實施例也稱為「Oligoclonics」實施例。這種Oligoclonics實施例的範例是具有所述第一和第二抗體的實施例。「Oligoclonics」是註冊商標。製造這種Oligoclonics®產品的一般方法在WO 2013/157953和WO2004/009618中揭露，且在此引入作為參考。

在Oligoclonics實施例中，第一和第二抗體包含結合CD28家族的相同成員，例如PD-1，和B7家族的相同成員或TNFRSF14，例如PD-L1，的可變域。包含如本文所述的家族成員的膜典型地在膜上包含此成員的一些且通常很多個個別蛋白質。具有結合家族的相同成員的可變域的抗體可結合相同的個別蛋白質，但這不一定如此。結合TNa膜蛋白質的本發明的抗體結合所述膜蛋白質上的抗原決定基。抗原決定基是抗原的一部分，在此情況下是抗體辨認的膜蛋白質。 結合膜蛋白質上不同抗原決定基的第一和第二抗體可結合膜上的相同的個別蛋白質。為此，不同的抗原決定基較佳是非重疊的抗原決定基。換句話說，不同的抗原決定基在膜蛋白質上足夠分開，使得兩種抗體可同時結合至相同的個別蛋白質。令人驚訝地發現到，Oligoclonics (第一和第二或更多抗體的組合)可比相同量的單獨各個抗體更有效。

第一抗體之可結合CD28家族成員的可變域較佳地阻斷此成員與其在B7家族或TNFRSF14中的結合配偶體的結合。第一抗體之可結合B7家族成員或TNFRSF14的可變域較佳地阻斷此成員與其在CD28家族中的結合配偶體的結合。第二抗體之可結合CD28家族成員的可變域較佳地阻斷此成員與其在B7家族或TNFRSF14中的結合配偶體的結合。第二抗體之可結合B7家族成員或TNFRSF14的可變域較佳地阻斷此成員與其在CD28家族中的結合配偶體的結合。所述第一和第二抗體中的阻斷和非阻斷可變域的較佳組合在下文中指出。

上述組合是較佳的組合。前述組合指定第一抗體的可變域是阻斷CD28家族成員與其在B7家族或TNFRSF14中的結合配偶體的結合的可變域。第二抗體可具有一或多個不阻斷此交互作用的可變域。當分析Oligoclonics實施例時，將包含兩個阻斷可變域的抗體被賦予「第一抗體」的資格。當Oligoclonics包含二或更多個具有兩個阻斷可變域的抗體時，則其中之一被賦予「第一抗體」的資格。CD28家族的成員或B7家族的成員或TNFRSF14的已知結合配偶體在上文中指出。

第一膜蛋白質較佳為CD28家族的成員。CD28家族的成員具有單一胞外類免疫球蛋白質變體(immunoglobulin variable-like，IgV)域，接著是短細胞質尾部。成員在免疫系統的細胞上持續地(constitutively)或被誘導表現。此家族的成員包含CD28、CTLA-4、PD-1、ICOS、BTLA、NKp30和TMIGD2。第一膜蛋白質較佳為PD-1；CTLA-4；BTLA；或TMIGD2，較佳地PD-1。

第二膜蛋白質較佳為B7家族的成員或TNFRSF14。詞組「B7家族的所述成員或TNFRSF14」是指選自由B7家族和TNFRSF14的蛋白質所組成的蛋白質群組的成員。在一較佳實施例中，第二膜蛋白質是B7家族的成員。B7家族是結構相關的細胞表面蛋白質的集合，其結合至在調節免疫反應的淋巴細胞上的蛋白質(CD28家族成員)。B7家族成員通常被稱為配位體，而CD28家族的成員被稱為受體。藉由細胞表面抗原特異性T細胞受體或B細胞受體的接合(engagement)，來啟動T和B淋巴細胞的活化，但是由一或多個B7配位體同時傳遞的額外訊號決定最終的免疫反應。透過淋巴細胞上的受體的CD28家族，由B7配位體傳遞這些「共刺激」或「共抑制」訊號。B7家族成員與共刺激受體的交互作用增強免疫反應，而與共抑制受體的交互作用減弱免疫反應。 B7家族的較佳成員是CD80；CD86；ICOS-L；PD-L1；PD-L2；B7-H3、B7-H4；B7-H6和B7-H7。B7配位體在淋巴和非淋巴組織中表現。傳送共抑制訊號的B7配位體與贅生物(neoplasm)、病毒感染的細胞和胞內寄生蟲感染的細胞相關，且提供它們逃避或至少減緩(dampen)針對它們的免疫反應的能力。對由B7配位體傳遞之訊號的操縱已在自體免疫、發炎疾病和癌症的治療中顯示出活性。在一較佳實施例中，第二膜蛋白質是PD-L1；PD-L2；ICOSL、CD80；CD86；B7-H3；B7-H4；TNFRSF14；B7-H6或B7-H7。在一較佳實施例中，第二膜蛋白質是PD-L1；PD-L2；CD80；CD86；B7-H4；TNFRSF14；或B7-H7。在一特別較佳實施例中，第二膜蛋白質是PD-L1；或PD-L2，較佳地PD-L1。

在一特別較佳實施例中，第一膜蛋白質是PD-1且第二膜蛋白質是PD-L1。

當第一膜蛋白質是CD28時，較佳的是第二膜蛋白質為CD80、CD86或ICOSL，較佳地CD80。因此，抗體或其變異體較佳為包含可結合至CD28的胞外部分的可變域和可結合至CD80的胞外部分；CD86的細胞外部分；或結合ICOSL的胞外部分，較佳地CD80的胞外部分的可變域的抗體或其變異體。CD28和CD80是結合配偶體。CD28和CD86是結合配偶體且CD28和ICOSL是結合配偶體。

當第一膜蛋白質是CTLA-4時，較佳的是第二膜蛋白質為CD80、CD86或ICOSL，較佳地CD80。因此，抗體或其變異體較佳為包含可結合至CTLA-4的胞外部分的可變域和可結合至CD80的胞外部分或CD86的胞外部分，較佳地CD80的胞外部分的可變域的抗體或其變異體。CTLA-4和CD80是結合配偶體。 CTLA-4和CD86是結合配偶體且CTLA-4和ICOSL是結合配偶體。

當第一膜蛋白質是ICOS時，第二膜蛋白質為ICOSL是較佳的。因此，抗體或其變異體較佳為包含可結合至ICOS的胞外部分的可變域和可結合至ICOSL的胞外部分的可變域的抗體或其變異體。ICOS和ICOSL是結合配偶體。

當第一膜蛋白質是BTLA時，較佳的是第二膜蛋白質為B7-H4或TNFRSF14，較佳地TNFRSF14。因此，抗體或其變異體較佳為包含可結合至BTLA的胞外部分的可變域和可結合至B7-H4的胞外部分或TNFRSF14的胞外部分，較佳地TNFRSF14的胞外部分的可變域的抗體或其變異體。BTLA和B7-H4是結合配偶體且BTLA和TNFRSF14是結合配偶體。

當第一膜蛋白質是NKp30時，第二膜蛋白質為B7-H6是較佳的。因此，抗體或其變異體較佳為包含可結合至NKp30的胞外部分的可變域和可結合至B7-H6的胞外部分的可變域的抗體或其變異體。NKp30和B7-H6是結合配偶體。

當第一膜蛋白質是TMIGD2時，第二膜蛋白質為B7-H7 (HHLA2)是較佳的。因此，抗體較佳為包含可結合至TMIGD2的胞外部分的可變域和可結合至B7-H7 (HHLA2)的胞外部分的可變域的抗體。TMIGD2和B7-H7是結合配偶體。

當第一膜蛋白質是PD-1時，較佳的是第二膜蛋白質為PD-L1或PD-L2，較佳地PD-L1。PD-1和PD-L1是結合配偶體。 PD-1和PD-L2是結合配偶體。PD-L1和CD80是結合配偶體。抗體或變異體較佳地包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分或PD-L2的胞外部分，較佳地PD-L1的胞外部分的可變域。PD-1/PD-L1抗體或其變異體和PD-1/PD-L2抗體或其變異體較佳為具有PD-1結合可變域的抗體或其變異體，與在Jurkat細胞上用抗體Nivolumab獲得的抑制相比時，當前述PD-1結合可變域以包含兩個結合PD-1的所述可變域的二價單株抗體形式提供時，前述PD-1結合可變域以20至150%的範圍，來抑制Jurkat細胞之經T細胞受體介導的活化之由PD-1/PD-L1所介導的抑制。一些實施例提供根據本發明的抗體或變異體，其中所述抗體或變異體包含PD1結合可變域，當前述PD1結合可變域以二價單特異性抗體形式存在時，與抗體Nivolumab相比，前述PD1結合可變域抵消Jurkat細胞之經T細胞受體介導的活化之由PD-1/PD-L1所介導的抑制至一更高程度。結合PD-1的胞外部分的可變域被定義為，與在Jurkat細胞上用抗體Nivolumab獲得的抑制相比時，當為包含兩個結合PD-1的所述可變域的二價單特異性抗體形式時，以20至150%的範圍來抑制Jurkat細胞之經T細胞受體介導的活化之由PD-1/PD-L1所介導的抑制的可變域。

與在所述Jurkat細胞上用抗體Nivolumab獲得的抑制相比時，Jurkat細胞之經TCR介導的活化之PD-1抑制的抑制較佳在50至150%、較佳80至150%、更佳100至150%的範圍內。在一較佳實施例中，與在所述Jurkat細胞上用抗體Nivolumab獲得的抑制相比時，抑制至少為100%。PD-1對Jurkat細胞之經TCR介導的活化的抑制較佳是藉由測量Jurkat細胞中PD-1/PD-L1結合的免疫抑制作用來測量，前述Jurkat細胞是培養於若沒有抗體或其功能部分、衍生物和/或類似物存在的話，會透過T細胞受體來活化的條件下。在實施例中描述了確定抑制的合適測定法。在實施例中描述了合適的Jurkat細胞系。

可結合至PD-L1的胞外部分的可變域較佳為，當可變域存在於單價單株抗體中時，以藉由表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)所測量之0.1至14 nM的K_D ，來結合PD-L1的可變域，較佳地，其具有由SPR所測量之0.5至14 nM的K_D 、較佳地1至14 nM的K_D 、較佳地1至12 nM的K_D 、較佳地2至12 nM的K_D 。在一些較佳實施例中，根據本發明的抗體或變異體包含可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，其中當所述可變域存在於具有結合不相關之抗原例如破傷風類毒素(Tetanus Toxoid)的第二可變域的雙特異性抗體中時，所述可變域以藉由表面電漿共振(SPR)所測量之小於或等於4.2​​7 nM、較佳地小於或等於1.31nM、較佳地小於或等於1.27 nM的K_D 來結合PD-L1。較佳地，當所述PD-L1特異性可變域存在於具有結合不相關之抗原例如破傷風類毒素的第二可變域的雙特異性抗體中時，所述PD-L1特異性可變域以0.9至4.27 nM的K_D 、較佳地以0.94至4.27 nM的K_D ，或以0.9至1.31 nM的K_D 、較佳地以0.94至1.31 nM的K_D ，來結合PD-L1。包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分或PD-L2的胞外部分的可變域之根據本發明的抗體或變異體較佳為包含可結合PD-1的胞外部分且阻斷PD-1與PD-L1的結合的可變域的抗體或其變異體。較佳的是可結合至PD-L1的胞外部分或PD-L2的胞外部分的可變域為分別阻斷PD-1與PD-L1或PD-L2結合的可變域。可結合PD-1且阻斷PD-1與PD-L1結合的可變域較佳為亦阻斷PD-1與PD-L2結合的結構域。本發明的可變域可以是可結合PD-L1且阻斷PD-L1與PD-1和/或PD-L1與CD80結合的可變域。這提供了這些抗體也能夠透過PD-1/PD-L2路徑抵消腫瘤對治療的抗性的優點。

根據本發明的抗體或其變異體較佳地降低結合對的結合的活性。降低活性通常藉由阻斷結合對之彼此結合的能力，來實現。可藉由阻斷結合對的任何一個或較佳地兩個成員，來阻斷此能力。當結合對是共抑制時，抑制或共抑制活性藉由阻斷而降低。 當結合對是共刺激時，共刺激活性藉由阻斷而降低。

對CD28家族的成員和B7家族的成員或TNFRSF14的偏好與在Oligoclonics實施例中的相同。

本發明亦提供一種接合(engage)和/或活化T細胞的方法，包含提供包含T細胞和要被T細胞接合或活化的細胞的系統，且對所述系統提供一或多個抗體，前述抗體每個皆包含可結合CD28家族的成員的可變域和可結合至B7家族的成員或TNFRSF14的胞外部分的可變域，且使所述系統培養於允許T細胞成為接合或活化的條件下。在一些實施例中，所述方法是體外方法。 一些實施例提供一種接合和/或活化T細胞的方法，包含提供包含T細胞和要被T細胞接合或活化的細胞的系統，且對所述系統提供一或多個抗體，前述抗體每個皆包含可結合PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且使所述系統培養於允許T細胞成為接合和/或活化的條件下。要被T細胞接合或活化的細胞較佳為免疫細胞，例如抗原呈現細胞、巨噬細胞、贅生細胞(neoplastic cell)、病毒感染的細胞或胞內寄生蟲感染的細胞。接合和/或活化T細胞將T細胞導向特定目標。活化T細胞是活化所述T細胞的T細胞受體。接合T細胞通常是活化T細胞。接合也可將已經活化的T細胞導向抗體指定的目標。允許所述T細胞成為接合和/或活化的條件通常是培養條件，但也可為在動物中的培養，可涵蓋尤其(inter alia )是治療的方法。此條件通常使得T細胞在抗體不存在的情況下，不會被接合。 如果測量T細胞的集合，這些T細胞中的一些可以已經被接合或活化，假使此集合含有足夠的未被接合或活化的T細胞。

本發明的抗體可促使兩個細胞緊密靠近在一起，允許細胞之間被蛋白質而不是被本發明的抗體所結合的受體-配位體對介導的交互作用。一個這樣的交互作用是一細胞的T細胞受體與另一細胞上的MHC的交互作用。

包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域的抗體或其變異體較佳地包含具有CDR3區的重鏈可變區，前述重鏈可變區包含MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；MF6982；MF6929；MF7699；MF7698；MF7687；MF7686；MF7685；或MF7684(第3圖和/或第13圖)的可變重鏈區的CDR3區的胺基酸序列。

包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域的抗體或其變異體較佳地包含具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區，前述重鏈可變區包含MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；MF6982；MF6929；MF7699；MF7698；MF7687；MF7686；MF7685；或MF7684(第3圖和/或第13圖)所示的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。CDR1、CDR2和CDR3序列較佳地選自相同的VH區。

包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域的抗體或其變異體較佳地包含MF6076；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；MF6982；MF6929；MF7699；MF7698；MF7687；MF7686；MF7685；或MF7684的可變重鏈區的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列(第3圖和/或第13圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。胺基酸***、缺失、取代或前述之組合，如果有的話，較佳地不在CDR區的胺基酸序列中。

包含可結合至PD-L1的胞外部分的可變域的抗體或其變異體較佳地包含具有CDR3區的重鏈可變區，前述重鏈可變區包含MF5359；MF5361；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；MF5708；MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695 (第3圖和/或第13圖)的可變重鏈區的CDR3區的胺基酸序列。

包含可結合至PD-L1的胞外部分的可變域的抗體或其變異體較佳地包含具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區，前述重鏈可變區包含MF5359；MF5361；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；MF5708；MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695 (第3圖和/或第13圖)所示的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。CDR1、CDR2和CDR3序列較佳地選自相同的VH區。

包含可結合至PD-L1的胞外部分的可變域的抗體或其變異體較佳地包含MF5359；MF5361；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；MF5708；MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695的可變重鏈區的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的胺基酸序列(第3圖和/或第13圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。胺基酸***、缺失、取代或前述之組合，如果有的話，較佳地不在CDR區的胺基酸序列中。

抗體或其變異體較佳地包含可結合至PD-1的胞外部分且阻斷PD-1與PD-L1之結合的可變域，以及可結合至PD-L1的胞外部分且阻斷PD-1與PD-L1之結合的可變域。可結合PD-1且阻斷PD-1與PD-L1之結合的可變域較佳地亦阻斷PD-1與PD-L2的結合。可結合PD-L1且阻斷PD-1與PD-L1之結合的可變域較佳地亦阻斷PD-L1與CD80的結合。這提供了也可抵消腫瘤細胞之透過PD-1和CD80之間的交互作用的免疫抑制的優點。

本發明的抗體或其變異體，例如雙特異性抗體或其變異體，較佳地包含可結合至PD-1的胞外部分且阻斷PD-1與PD-L1和/或PD-L2的交互作用的可變域並包含可結合至PD-L1的胞外部分且阻斷PD-L1與PD-1和/或CD80的交互作用的可變域。 較佳地，本發明的這種分子能夠阻斷完整的PD-1軸，包含PD-1對應PD-L1或PD-L2，以及PD-L1對應PD-1及CD80。

在這樣的抗體或其變異體中之結合PD-L1的胞外部分的可變域較佳地包含具有一VH區，其具有MF5359；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；MF5708；MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695 (第3圖和/或第13圖)的VH之一的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。在一較佳實施例中，結合PD-L1的胞外部分的可變域包含具有MF5359；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；MF5708；MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695的VH的胺基酸序列的VH區，其中相對於所示的MF的胺基酸序列(第3圖和/或第13圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

在此抗體或其變異體中之結合PD-1的胞外部分的可變域較佳地包含具有一VH區，其具有MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；MF6982；MF6929；MF7699；MF7698；MF7687；MF7686；MF7685；或MF7684 (第3圖和/或第13圖)的VH之一的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。在一較佳實施例中，結合PD-1的胞外部分的可變域包含具有MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；MF6982；MF6929；MF7699；MF7698；MF7687；MF7686；MF7685；或MF7684的VH的胺基酸序列的VH區，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列(第3圖和/或第13圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。胺基酸***、缺失、取代或前述之組合，如果有的話，較佳地不在CDR區的胺基酸序列中。在此抗體或其變異體中之特別較佳的組合是包含MF5382和MF6256的所示序列或其變異體的可變域的組合。

一些實施例提供一種根據本發明的抗體或變異體，其包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，其中所述抗體或變異體在金黃色葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcus enterotoxin B，SEB)測定中，具有更強的CD4+ T細胞活化潛力，與以下等莫耳(equimolar)混合物相比： -包含兩個結合PD-1的所述可變域的二價單特異性抗體，和 -包含兩個結合PD-L1的所述可變域的二價單特異性抗體。鑑於其更強的CD4+ T細胞活化潛力，根據這些實施例的抗體或變異體優於親本抗體的等莫耳混合物。

一些實施例提供一種根據本發明的抗體或變異體，其包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且在抗原特異性CD4+ T細胞測定中，其能夠比基準抗體5C4或基準抗體YW243.55.S70或基準抗體5C4和YW243.55.S70的組合還強地活化T細胞。鑑於其更強的抗原特異性CD4+ T細胞活化潛力，根據此實施例的抗體或變異體優於抗PD-1基準抗體Nivolumab和抗PD-L1基準抗體Atezolizumab。值得注意的是，根據這些實施例的抗體或變異體甚至優於Nivolumab和Atezolizumab的組合。

一些實施例提供一種根據本發明的抗體或變異體，其包含可結合PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且在混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)測定中，與基於Nivolumab的基準抗體5C4或基於Atezolizumab的基準抗體YW243.55.S70相比，其具有更強的CD4+ T細胞活化潛力。值得注意的是，鑑於其更強的CD4+ T細胞活化潛力，根據這些實施例的抗體或變異體優於Nivolumab和Atezolizumab。

一些實施例提供一種根據本發明的抗體或變異體，其包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且其能夠增強CD4+和/或CD8+腫瘤浸潤T細胞的增殖。鑑於其腫瘤浸潤T細胞活化潛力，根據這些實施例的抗體或變異體特別適合用於誘導或增加T細胞所介導的抗腫瘤反應。

一些實施例提供一種根據本發明的抗體或變異體，其包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且與基於Pembrolizumab的基準抗體MK-3475和基於Atezolizumab的YW243.55.S70的組合相比，其在體內(in vivo )能夠誘導更強的T細胞所介導的抗腫瘤反應。因此，根據這些實施例的抗體或變異體特別適合用於體內誘導或增加T細胞所介導的抗腫瘤反應。值得注意的是，鑑於其更強的T細胞活化潛力，根據這些實施例的抗體或變異體優於Pembrolizumab和Atezolizumab。

如表4中所示，當PD-1特異性Fab臂6076與PD-L1特異性Fab臂MF5553、MF5359、MF5424、MF5561、MF5442或MF5382組合時，形成了在雙特異性抗體的PD-1/PD-L1報導者雙特異性抗體測定中展現出至少60%的阻斷的雙特異性抗體。

如本文所述的抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6076的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553；MF5359；MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5359；MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5359；MF5424；MF5561或MF5442，較佳地MF5359；MF5424或MF5442，較佳地MF5359或MF5442，較佳地MF5442 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。

抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6076的VH的胺基酸序列，其中相對於MF6076的VH的胺基酸序列的胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5553；MF5359；MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5359；MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5359；MF5424；MF5561或MF5442，較佳地MF5359；MF5424或MF5442，較佳地MF5359或MF5442，較佳地MF5442的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

如表4中所示，當PD-1特異性Fab臂MF6236與PD- L1特異性Fab臂MF5561、MF5442或MF5382組合時，形成了在PD-1/PD-L1報導者測定中展現出至少60%的阻斷的雙特異性抗體。如本文所述的抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6236 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5561或MF5442，較佳地MF5442 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。

抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6236的VH的胺基酸序列，其中相對於MF6236的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5561或MF5442，較佳地MF5442的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

如表4中所示，當PD-1特異性Fab臂MF6974與PD- L1特異性Fab臂MF5424；MF5561；MF5442或MF5382組合時，形成了在PD-1/PD-L1報導者測定中展現出至少60%的阻斷的雙特異性抗體。如本文所述的抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6974 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5424；MF5561或MF5442，較佳地MF5424或MF5442，較佳地MF5442 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。

抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6974的VH的胺基酸序列，其中相對於MF6974的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5424；MF5561或MF5442，較佳地MF5424或MF5442，較佳地MF5442的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

如表4中所示，當PD-1特異性Fab臂MF6935與PD- L1特異性Fab臂MF5424；MF5561；MF5442或MF5382組合時，形成了在PD-1/PD-L1報導者測定中展現出至少60%的阻斷的雙特異性抗體。如本文所述的抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6935 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5442或MF5382，較佳地MF5382 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。

抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6935的VH的胺基酸序列，其中相對於MF6935的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5442或MF5382，較佳地MF5382的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

如表4中所示，當PD-1特異性Fab臂MF6936與PD- L1特異性Fab臂MF5576、MF5424、MF5561、MF5557、MF5442或MF5382組合時，形成了在PD-1/PD-L1報導者測定中展現出至少60%的阻斷的雙特異性抗體。如本文所述的抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6936 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5576；MF5424；MF5561；MF5557；MF5442或MF5382，較佳地MF5424；MF5561；MF5557；MF5442或MF5382，較佳地MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5442或MF5382，較佳地MF5382 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。

抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6936的VH的胺基酸序列，其中相對於MF6936的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5576；MF5424；MF5561；MF5557；MF5442或MF5382，較佳地MF5424；MF5561；MF5557；MF5442或MF5382，較佳地MF5424；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5442或MF5382，較佳地MF5382的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

如表4中所示，當PD-1特異性Fab臂MF6256與PD- L1特異性Fab臂MF5576、MF5424、MF5561、MF5557、MF5439、MF5442或MF5382組合時，形成了在PD-1/PD-L1報導者測定中展現出至少60%的阻斷的雙特異性抗體。如本文所述的抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6256 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5576；MF5424；MF5561；MF5557；MF5439；MF5442或MF5382，較佳地MF5576；MF5424；MF5561；MF5557；MF5442或MF5382，較佳地MF5576；MF5561；MF5557；MF5442或MF5382，較佳地MF5576；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5576；MF5442或MF5382，較佳地MF5442或MF5382，較佳地MF5382 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。

抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6256的VH的胺基酸序列，其中相對於MF6256的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5576；MF5424；MF5561；MF5557；MF5439；MF5442或MF5382，較佳地MF5576；MF5424；MF5561；MF5557；MF5442或MF5382，較佳地MF5576；MF5561；MF5557；MF5442或MF5382，較佳地MF5576；MF5561；MF5442或MF5382，較佳地MF5576；MF5442或MF5382，較佳地MF5442或MF5382，較佳地MF5382的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

在一些較佳實施例中，如本文所述的抗體或其變異體較佳地包含： -PD-1結合可變域，其包含具有MF6076的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695，較佳地MF7703或MF7689 (第3圖和/或第13圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。

抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6076的VH的胺基酸序列，其中相對於MF6076的VH的胺基酸序列的胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695，較佳地MF7703或MF7689的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖和/或第13圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

在一些較佳實施例中，如本文所述的抗體或其變異體較佳地包含： -PD-1結合可變域，其包含具有MF6974 (第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF7703或MF7689，較佳地MF7703或MF7689，更佳地MF7689 (第3圖和/或第13圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。

抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF6974的VH的胺基酸序列，其中相對於MF6974的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF7703或MF7689，較佳地MF7703或MF7689，更佳地MF7689的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖和/或第13圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

在一些較佳實施例中，如本文所述的抗體或其變異體較佳地包含： -PD-1結合可變域，其包含具有MF7686 (第13圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5359、MF5361、MF5377、MF5382、MF5424、MF5426、MF5439、MF5442、MF5553、MF5557、MF5561、MF5576、MF5594、MF5708、MF7703或MF7689，較佳地MF7703或MF7689，更佳地MF7703 (第3圖和/或第13圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列的VH區。

抗體或其變異體較佳地包含 -PD-1結合可變域，其包含具有MF7686的VH的胺基酸序列，其中相對於MF7686的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第13圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合；以及 -PD-L1結合可變域，其包含具有MF5359、MF5361、MF5377、MF5382、MF5424、MF5426、MF5439、MF5442、MF5553、MF5557、MF5561、MF5576、MF5594、MF5708、MF7703或MF7689，較佳地MF7703或MF7689，更佳地MF7703的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列的胺基酸序列(第3圖和/或第13圖)，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

一些較佳實施例提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域之根據本發明的抗體或其變異體，且其中可結合至PD-1的胞外部分的所述可變域包含： -重鏈CDR3序列，其與選自由MF6974、MF6076和MF7686所組成的群組的可變區的重鏈CDR3序列相同；或 -重鏈CDR3序列，其偏離MF6974或MF6076或MF7686的重鏈CDR3序列不超過三個，較佳地不超過兩個，更佳地不超過一個胺基酸；或 -重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列，其與選自由MF6974、MF6076和MF7686所組成的群組的可變區的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列相同；或 -重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列，其偏離MF6974或MF6076或MF7686的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列不超過三個，較佳地不超過​​兩個，更佳地不超過一個胺基酸。

一些較佳實施例提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域之根據本發明的抗體或其變異體，且其中可結合至PD-1的胞外部分的所述可變域包含： -重鏈可變區，其包含MF6974或MF6076或MF7686的胺基酸序列，或 -重鏈可變區，其具有與MF6974或MF6076或MF7686的胺基酸序列至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%相同的序列。

一些較佳實施例提供包含可結合至PD-L1的胞外部分的可變域之根據本發明的抗體或其變異體，且其中可結合至PD-L1的胞外部分的所述可變域包含： -重鏈CDR3序列，其與選自由MF7689和MF7703所組成的群組的可變區的重鏈CDR3序列相同；或 -重鏈CDR3序列，其偏離MF7689或MF7703的重鏈CDR3序列不超過三個，較佳地不超過兩個，更佳地不超過一個胺基酸；或 -重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列，其與選自由MF7689和MF7703所組成的群組的可變區的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列相同；或 -重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列，其偏離MF7689或MF7703的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列不超過三個，較佳地不超過兩個，更佳地不超過一個胺基酸。

一些較佳實施例提供包含可結合至PD-L1的胞外部分的可變域之根據本發明的抗體或其變異體，且其中可結合至PD-L1的胞外部分的所述可變域包含： -重鏈可變區，其包含MF7689或MF7703的胺基酸序列，或 -重鏈可變區，其具有與MF7689或MF7703的胺基酸序列至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少91%、或至少92%、或至少93%、或至少94%、或至少95%、或至少96%、或至少97%、或至少98%、或至少99%相同的序列。

一些較佳實施例提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域之根據本發明的抗體或其變異體，其中可結合至PD-1的胞外部分的所述可變域包含與選自由MF6974、MF6076和MF7686所組成的群組的可變區的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列相同的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列，且其中可結合至PD-L1的胞外部分的所述可變域包含與選自由MF7689和MF7703所組成的群組的可變區的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列相同的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列。

一些較佳實施例提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域之根據本發明的抗體或其變異體，其中可結合至PD-1的胞外部分的所述可變域包含與MF6974的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列相同的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列，且其中可結合至PD-L1的胞外部分的所述可變域包含與MF7689的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列相同的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列。如實施例中所示，根據此實施例的抗體或變異體具有良好的PD-1/PD-L1阻斷活性和強的T細胞活化潛力。

一些實施例提供包含可結合至PD-1的胞外部分的可變域和可結合至PD-L1的胞外部分的可變域之根據本發明的抗體或其變異體，其中可結合至PD-1的胞外部分的所述可變域包含與MF7686的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列相同的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列，且其中可結合至PD-L1的胞外部分的所述可變域包含與MF7703的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列相同的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列。如實施例中所示，根據此實施例的抗體或變異體具有良好的PD-1/PD-L1阻斷活性和強的T細胞活化潛力。

在另一實施例中，抗體或其變異體包含可結合至PD-L1的胞外部分且不會阻斷PD-1與PD-L1的結合的可變域。在此抗體或其變異體中之結合PD-L1的胞外部分的可變域較佳地包含MF5361(第3圖)的VH的CDR3的胺基酸序列或CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。在一較佳實施例中，結合PD-L1的胞外部分的可變域包含MF5361的VH的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。

在所提及的H、VH、L和VL區中之提及的最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳0、1、2、3、4或5個胺基酸取代較佳為保守胺基酸取代，***、缺失、取代或前述之組合較佳地不在H、VH、L或VL鏈的CDR3區中，較佳地不在VH或VL鏈的CDR1、CDR2或CDR3區中，且較佳地不在FR4區中。

如本文所述的方法較佳地使用如本文所述的抗體或其變異體。

根據本發明的抗體或其變異體，例如其部分、衍生物或類似物較佳地包含兩個如所述的可變域。這種抗體較佳地為雙特異性抗體或其變異體。二或更多抗體或其變異體可連接在一起。各種方法在本領域中是已知的。合適的方法是共軛(conjugation)。此外，製造多特異性抗體的技術已經發展到亦包含具有與正常單特異性抗體相同的整體結構的雙特異性抗體，但其中抗體的兩個臂各自結合不同的目標。雙特異性抗體或其變異體較佳地具有兩個有相容的異質二聚體化域的重鏈。輕鏈較佳為共同輕鏈。一些實施例提供根據本發明的抗體或變異體，其中所述抗體或變異體的抗原結合位由一個可結合PD-1的胞外部分的免疫球蛋白質可變域和一個可結合PD-L1或PD-L2的胞外部分的免疫球蛋白質可變域所組成。根據本發明的抗體較佳為由兩個具有相容的異質二聚體化域的重鏈所組成的全長雙特異性抗體。在一些實施例中，根據本發明的抗體是IgG，較佳地IgG1或IgG3或IgG4，更佳地IgG1或IgG4，最佳地IgG1。與其他形式相比，IgG形式通常提供更長的半衰期和/或降低的免疫原性(immunogenicity)的優點。

在一些實施例中，根據本發明的抗體或變異體對PD-1是單價的且對PD-L1是單價的。

根據本發明的抗體或變異體的輕鏈較佳為共同輕鏈。

如本文所使用，術語「共軛物(conjugate)」是指已經共價連接的二或更多分子，其選擇性地透過連接區共價連接。舉例而言，在一些實施例中，共軛物為藉由連接區連接至第二蛋白質或非蛋白質基團(moiety)的第一蛋白質或非蛋白質基團。舉例而言，在本發明之結合分子的一些實施例中，其包含或由已經共價連接的二或更多抗體組成。共軛物不限於第一基團及第二基團，但在一些實施例中，亦可具有藉由另外的連結區連接的第三、第四或更多基團。如本申請案其它地方所述，蛋白質基團的範例包含但不限於：多肽、擬肽(peptidomimetic)或抗體(或如本案其它地方所述的抗體部分、衍生物或類似物)。非蛋白質基團的範例包含但不限於適體(aptamer)。可使用許多類型的接頭(linker)，且根據共軛物中的分子類型及接頭所需的性質(長度、彈性、對蛋白質酶活性的抗性及其它類似的特性)，選擇合適的接頭。這樣的接頭可包含核苷酸(nucleotide)、多肽或適合的合成材料。舉例而言，接頭可為彈性胜肽接頭。在某些實施例中，接頭可為可切割接頭，允許部分的共軛物彼此分離。在其它實施例中，胜肽接頭可為螺旋接頭。用於連接蛋白質和其它分子的各種範例及套組為本領域所習知的。如本文所使用，術語「融合蛋白質(fusion protein)」是指包含二或更多多肽或蛋白質已經在DNA層級藉由重組(recombination)連接在一起，且以單一多肽一起表現的蛋白質。融合蛋白質也可包含亦由DNA編碼且與融合蛋白質一起表現的胜肽連接區。為融合蛋白質的一部分的胜肽接頭可設計為具有特定的特性，例如彈性、親水性、蛋白質酶抗性、可裂性等。所有這些性質都可設計於DNA序列內，且接頭的設計方法亦為本領域所習知。舉例而言，可藉由本領域所習知的方法，將抗體連接在一起，且如本文所述，形成雙特異性或多目標抗體。再者，可藉由本領域各種習知的方法，例如藉由使用例如Biclonics®(見，例如WO 2013/157954)的技術，來構築雙特異性抗體。雙特異性單株抗體(bispecific monoclonal antibody，BsMAb、BsAb)通常包含兩個不同的單株抗體的結合域，因此結合至兩個不同的抗原決定基。Biclonics®分子，以及其它全長IgG雙特異性抗體具有兩種不同的抗原結合特異性，其由scFv的Fab的全長IgG分子的兩個不同可變區所編碼。如本文其它地方所詳述的，可藉由用編碼兩個不同的共同輕鏈 (common light chain，cLC)抗體的遺傳構築體(construct)共轉染個別細胞，來生產Biclonics®。CH3工程化確保有效率的異質二聚體化及基本上純的雙特異性抗體的形成。

本發明之抗體較佳地為雙特異性抗體。抗體通常透過所謂的抗原結合位結合其目標。未修飾的抗原結合位通常由抗體的可變域形成並存在於其中。可變域含有抗原結合位。可結合抗原的可變域為包含可結合至抗原的抗原結合位的可變域。

抗體可變域通常包含重鏈可變區(heavy chain variable region，VH)和輕鏈可變區(light chain variable region，VL)。抗原結合位可存在於組合的VH/VL可變域中，或只在VH區或只在VL區中。當抗原結合位存在於可變域的兩個區的一者中時，對應的可變區可有助於結合可變區的折疊及/或穩定性，但不顯著地有助於抗原自身的結合。

如本文所使用，抗原結合(antigen-binding)是指抗體對其抗原的典型結合能力。可以用各種方式，評估抗體與抗原的結合。一種方式是將抗體與抗原(較佳地為表現抗原的細胞)一起培養，移除未結合的抗體(較佳藉由洗滌步驟)，且藉由結合至結合的抗體的經標記之抗體，來偵測結合的抗體。

與蛋白質的隨機、非特異性附著不同，通常透過抗體的互補決定區(complementarity determining region，CDR)及抗原和可變域的特定三維結構，從而允許這兩個結構精準地結合在一起(類似鎖和鑰匙的交互作用)，來介導經抗體的抗原結合。由於抗體通常辨認部分抗原，其稱為抗原的抗原決定基，因此這樣的抗原決定基也可存在於其它化合物中，根據本發明之抗體也可辨認其它蛋白質，如果這樣的其它化合物含有相同的抗原決定基。因此，術語「結合」不排除抗體結合至含有相同抗原決定基的另一蛋白質或蛋白質們。這種其它蛋白質較佳地不是人類蛋白質。

通常除了在出生後，較佳地為成年人類的細胞膜上的特定目標蛋白質以外，抗體不會結合至其它蛋白質。

本發明的抗體或其變異體中可結合CD28家族成員的胞外部分的可變域結合至指定的成員，且在其他條件相同的條件下，至少低於100倍結合至同一物種的CD28家族的另一成員的胞外部分。舉例而言，抗體或其變異體之結合PD-1的可變域結合至PD-1，且在其他條件相同的條件下，至少低於100倍結合至同一物種的CD28、CTLA4、ICOS、BTLA、NKp30和TMIGD2。當然，當抗體或其變異體被設計為結合至此家族的二或更多個成員時，與此二或更多個成員的結合可大致上相同。在本發明中，各抗體各自僅結合至CD28家族成員的一個成員是較佳的。考慮到CD28家族是細胞表面分子的家族，通常在細胞表面上表現成員的細胞上評估結合。

本發明的抗體或其變異體中可結合B7家族的成員或TNFRSF14的胞外部分的可變域結合至指定的成員，且在其他條件相同的條件下，至少低於100倍結合至同一物種的B7家族或TNFRSF14的另一成員的胞外部分。舉例而言，抗體或其變異體之結合PD-L1的可變域結合至PD-L1，且在其他條件相同的條件下，至少低於100倍結合至同一物種的CD80、CD86、ICOSL、PD-L2、B7-H3、B7-H4、B7-H6和B7-H7。當然，當抗體或其變異體被設計為結合至此家族的二或更多個成員時，與此二或更多個成員的結合可大致上相同。在本發明中，各抗體各自僅結合至B7家族成員或TNFRSF14的一個成員是較佳的。考慮到B7家族是細胞表面分子的家族，通常在細胞表面上表現成員的細胞上評估結合。

如本文所述之抗體或其變異體的CD28家族成員結合可變域，且阻斷此成員與其結合配偶體中的一或多個的結合；當與所提及的結合配偶體結合時，抑制在其它情況下由包含此成員的細胞所展現的生物活性。包含所述可變域的抗體在種類上，但不一定在量上，擁有相同的活性。

如本文所述之抗體或其變異體的B7家族成員或TNFRSF14結合可變域，且阻斷此成員或TNFRSF14與其結合配偶體中的一或多個的結合；當與所提及的結合配偶體結合時，通常抑制在其它情況下由包含此成員或TNFRSF14的細胞所展現的生物活性。包含所述可變域的抗體在種類上，但不一定在量上，擁有相同的活性。

包含可結合CD28家族成員的胞外部分的可變域和可結合其選自B7家族或TNFRSF14的結合配偶體的可變域的抗體，且其中兩個可變結構域皆不阻斷CD28家族成員與所述結合配偶體的結合；當與所述結合配偶體結合時，通常不會抑制在其它情況下由包含CD28家族成員或B7家族成員或TNFRSF14的細胞所展現的生物活性。

如本文所使用的術語「抗體」意指蛋白質(proteinaceous)分子，較佳地屬於蛋白質的免疫球蛋白質類型，其含有一或多個結合抗原上的抗原決定基的可變域，其中這樣的結構域(domain)衍生自或與抗體的可變域共有序列同源性。用於治療用途的抗體較佳地儘可能地接近待治療受試者的天然抗體(例如人類抗體用於人類受試者)。可用特異性(specificity)及親和力(affinity)來表示抗體結合。特異性決定那個抗原或其抗原決定基被結合域(binding domain)特異性地結合。親和力是與特定抗原或抗原決定基結合的強度的度量。抗體，例如本發明之雙特異性抗體，通常包含天然抗體的恆定域(Fc部分)，其可如本文其它地方所述地被工程化，例如，以降低ADCC及/或CDC活性。本發明之抗體通常為雙特異性全長抗體，較佳地為人類IgG次類(subclass)的雙特異性全長抗體。

術語「可變域」、「VH/VL對」、「VH/VL」在本文中可互換使用。可變域由重鏈的可變區和輕鏈的可變區所構成。重鏈的可變區通常由重新排列的VDJ區形成。輕鏈的可變區通常由重新排列的VJ區形成。現在也可使用，例如可獲得的功能性抗體的大量序列資訊，來人工產生VDJ/VJ區。

本發明之抗體較佳地為「全長」抗體。根據本發明之術語「全長」被定義為包含基本上完整的抗體，沒有一或多個尺寸大於20個胺基酸殘基的人工添加基團(moiety)，例如額外的抗原結合位或額外的活化位或額外的配位體或額外的配位體結合基團。然而，全長抗體不一定具有完整抗體的所有功能。為避免疑慮，全長抗體含有兩條重鏈及兩條輕鏈。各鏈含有恆定(constant，C)和可變(variable，V)區，其可被拆解成標記為CH1、CH2、CH3、重鏈為VH及CL、VL為輕鏈的結構域。重鏈的結構域較佳地以天然抗體的順序存在(VH-CH1-CH2-CH3；意指VH域鄰近CH1域，接著是CH2域，再接著是CH3域)。輕鏈的結構域亦較佳地以天然抗體的順序存在(VL-CL；意指VL域鄰近CL域)。抗體藉由Fab片段部分中含有的可變域結合至抗原。抗體可透過恆定域，大部分透過Fc部分與免疫系統的分子及細胞交互作用。

在一些實施例中，本發明之抗體為IgG，較佳地為全長IgG。全長IgG抗體是較佳的，因為其通常具有有利的半衰期，且由於為了免疫原性的理由，希望保持靠近完全地自體(人類)分子。在一些實施例中，本發明之抗體為全長IgG1、全長IgG2、全長IgG3或全長IgG4抗體。

根據本發明之全長抗體包含其中可存在提供期望的特性或僅是原始鏈中的那些的替代物的突變的抗體。這樣的突變不應該是任何區的實質部分的缺失。然而，其中一或多個胺基酸殘基為酸***、缺失、取代或前述之組合，但基本上沒有改變所得抗體的抗原結合特性的抗體被包含在術語「全長抗體」內。舉例而言，IgG抗體可在恆定區中具有1至20個胺基酸殘基***、取代、缺失或前述之組合。

本發明之抗體或其變異體較佳地為雙特異性抗體或其變異體。在一較佳實施例中，其為具有降低的效應子功能的雙特異性IgG抗體。在一較佳實施例中，本發明之抗體為雙特異性全長抗體。本發明之抗體較佳地為雙特異性全長IgG抗體，較佳在CH2/低鉸鏈區中突變，以降低效應子功能。基於IgG1在人類中的長循環半衰期，在CH2/低鉸鏈區中突變以減少效應子功能的IgG1是有利的。為了防止人類中任何的免疫原性，根據本發明之雙特異性抗體為人類抗體是較佳的。

術語「雙特異性(bispecific，bs)」意指抗體(如以上所定義)的一部分結合至抗原上的一個抗原決定基，而第二部分結合至相同抗原或不同抗原上的不同抗原決定基。不同的抗原決定基通常存在於不同的抗原上。然而，不同的抗原決定基也可存在於相同的抗原上。根據本發明，所述第一和第二抗原事實上為兩個不同蛋白質。較佳的雙特異性抗體為包括兩個不同單株抗體的一些部分的抗體，因此可結合至兩個不同的抗原決定基，較佳地為兩個不同的抗原上的兩個不同的抗原決定基。取決於被雙特異性抗體辨認的這兩個抗原的表現量(expression level)、(次)細胞定位及化學計量，抗體的兩個Fab臂可能或可能不會同時地結合其抗原決定基。雙特異性抗體的一臂通常含有一抗體的可變域，而另一臂含有另一抗體的可變域(即，雙特異性抗體的一臂藉由一重鏈配對一輕鏈來形成；而另一個臂藉由不同的重鏈配對輕鏈來形成)。本發明之雙特異性抗體的重鏈可變區通常彼此不同，而在本發明之雙特異性抗體中，輕鏈可變區較佳地為相同。其中不同重鏈可變區與相同或共同輕鏈可變區連結(associate)的雙特異性抗體亦被稱為具有共同輕鏈可變區(common light chain variable region，cLcv)的雙特異性抗體。較佳地，輕鏈恆定區也是相同的。這樣的雙特異性抗體被稱為具有共同輕鏈(common light chain，cLc)。因此，更提供根據本發明之雙特異性抗體，其中兩個手臂包含共同輕鏈。

如本文所述的雙特異性抗體較佳地包含共同輕鏈可變域、較佳地為共同輕鏈。根據本發明之術語「共同輕鏈」是指可相同或具有一些胺基酸序列差異，而全長抗體的結合特異性不受影響的輕鏈。舉例而言，在本文所使用的共同輕鏈的定義範圍內，例如藉由導入和測試保守性胺基酸改變、在當與重鏈配對時，沒有或只有部分助於結合特異性的區域中的胺基酸的改變及前述類似方法，來製備或發現不相同但功能上等價的輕鏈是可能的。有或沒有添加術語「重新排列」，術語「共同輕鏈」、「共同LC」、「cLC」、「單一輕鏈」皆可在本文互換使用。有或沒有添加術語「重新排列」，術語「共同輕鏈可變區」、「共同VL」、「共同LCv」、「cLCv」、「單一VL」皆可在本文互換使用。本發明的一較佳面向是雙特異性抗體具有共同輕鏈(可變區)，其可與至少兩個，且較佳為多個不同結合特異性的重鏈(可變區)組合，以形成具有功能性抗原結合域的抗體(WO2004/009618、WO2009/157771、Merchant et al. 1998和Nissim et al. 1994)。共同輕鏈(可變區)較佳地為人類輕鏈(可變區)。共同輕鏈(可變區)較佳地具有生殖序列(germline sequence)。較佳的生殖序列為人類庫(repertoire)中常用且具有良好的熱力學穩定性、產量及可溶性的輕鏈可變區。較佳的生殖輕鏈為O12。共同輕鏈較佳地為重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01 (第1A圖)。共同輕鏈可變區較佳地為重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01的可變區。共同輕鏈較佳地包含如第1B或1D圖所示的輕鏈可變區，其中具有0至5個胺基酸***、缺失、取代、添加或前述之組合。共同輕鏈較佳地更包含輕鏈恆定區，較佳地kappa輕鏈恆定區。可針對用來表現共同輕鏈蛋白質的細胞系統，將編碼共同輕鏈的核酸密碼子最佳化(codon optimize)。編碼的核酸可偏離生殖核酸序列(germ-line nucleic acid sequence)。

在一較佳實施例中，輕鏈包括包含如第1A圖所示的O12 / IgVκ1-39*01基因片段的胺基酸序列，其中具有0至10個、較佳0至5個胺基酸***、缺失、取代、添加或前述之組合的輕鏈區。詞組「O12輕鏈」將在整份說明書中作為「包括包含如第1A圖所繪示的O12/IgVκ1-39*01基因片段的胺基酸序列，其具有0至10個、較佳0至5個胺基酸***、缺失、取代、添加或前述之組合的輕鏈可變區的輕鏈」的縮寫。IgVκ1-39是免疫球蛋白質可變kappa 1至39基因(Immunoglobulin Variable Kappa 1-39 Gene)的縮寫。此基因也以免疫球蛋白質kappa可變1至39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12為人所熟知。此基因的外部身份為HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。第1E圖給予了IgVκ1-39的較佳胺基酸序列。這列出了V區的序列。V區可與五個J區中的一個組合。第1B和1D圖描述與J區組合的IgVκ1-39的兩個較佳序列。連接的序列被標示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (根據IMGT資料庫全球網站imgt.org命名)。

包含輕鏈可變區的O12/IgVκ1-39*01為生殖序列是較佳的。更佳地，包含輕鏈可變區的IGJκ1*01或IGJκ5*01為生殖序列。在一較佳實施例中，IGKV1-39/jk1或IGKV1-39/jk5輕鏈可變區為生殖序列。

在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含生殖O12/IgVκ1-39*01。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。輕鏈可變區較佳地包含生殖kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或生殖kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ5*01，較佳地生殖IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。

相對於生殖序列，即有機體的非淋巴細胞中的正常序列，產生具有O12輕鏈的抗體的成熟B細胞常常產生已經歷一或多個突變的輕鏈。負責這些突變的過程常被稱為體細胞(超)突變(somatic (hyper)mutation)。產生的輕鏈被稱為親和力成熟的輕鏈(affinity matured light chain)。當衍生自O12生殖序列時，這樣的輕鏈是O12-衍生輕鏈。在本說明書中，詞組「O12輕鏈」將包含O12-衍生輕鏈。藉由體細胞超突變導入的突變當然也可在實驗室中人工導入。在實驗室中，其它突變也可被導入，而不影響輕鏈在種類方面，不一定是量方面的性質。如果輕鏈包含如第1A、1B、1D或1E圖中所示的序列，其中具有0至10個，較佳0至5個胺基酸***、缺失、取代、添加或前述之組合，則輕鏈至少是O12輕鏈。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A、1B、1D或1E圖中所示的序列的輕鏈，其中具有0至9個、0至8個、0至7個、0至6個、0至5個、0至4個胺基酸***、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A、1B、1D或1E圖中所示的序列的輕鏈，其中具有0至5個、較佳0至4個、更佳0至3個胺基酸***、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A、1B、1D或1E圖中所示的序列的輕鏈，其中具有0至2個、較佳0至1個、最佳0個胺基酸***、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，O12輕鏈是包含如第1A圖或第1B圖中所示的序列的輕鏈，其具有所提及的胺基酸***、缺失、取代、添加或前述之組合。在一較佳實施例中，輕鏈包含第1A圖的序列。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含第1B圖的序列。

共同輕鏈(可變區)可為lambda輕鏈，因此這也在本發明的背景中提供，但是kappa輕鏈是較佳的。本發明的共同輕鏈的恆定部分可為kappa或lambda輕鏈的恆定區。其較佳地為kappa輕鏈的恆定區，較佳地其中所述共同輕鏈為生殖輕鏈，較佳地為包含IgVκl-39基因片段的重新排列之生殖人類kappa輕鏈，最佳地為重新排列之生殖人類kappa輕鏈IgVκl-39*01/IGJκl*01 (第1圖)。術語重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGκJ1、huVκ1-39輕鏈或縮寫huVκ1-39或僅1-39可在整份申請案中交換使用。顯然地，本發明所屬技術領域中具有通常知識者會理解的是，「共同」亦指胺基酸序列不同的輕鏈的功能等價物。存在所述輕鏈的許多變異體，其中存在不影響功能性結合區的形成的突變(缺失、取代、添加)。

IgVκ1-39是免疫球蛋白質可變kappa 1至39基因 (Immunoglobulin Variable Kappa 1-39 Gene)的縮寫。此基因亦以免疫球蛋白質kappa可變 1至39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12為人所熟知。此基因的外部身份為HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。第1圖中給予了IgVκ1-39的較佳胺基酸序列。這列出了V區的序列。V區可與五個J區中的一個組合。第1圖描述與J區組合的IgVκ1-39的兩個較佳序列。連接的序列被標示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替代名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01 (根據IMGT資料庫全球網站imgt.org命名)。

共同輕鏈可變區較佳地連接至kappa輕鏈恆定區。在一較佳實施例中，輕鏈可變區包含kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01。在一較佳實施例中，輕鏈包含IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。

產生共同輕鏈的細胞可產生，例如重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01及包含所提及的與lambda恆定區融合的輕鏈的可變區的輕鏈。

如本文所述的雙特異性抗體或其變異體較佳地具有一個結合CD28家族成員的胞外部分的重鏈可變區/輕鏈可變區(heavy chain variable region/light chain variable region，VH / VL)組合和結合B7家族成員或TNFRSF14的胞外部分的第二VH/VL組合。在一較佳實施例中，在所述第一VH/VL組合中的VL類似於在所述第二VH/VL組合中的VL。在一更佳實施例中，在第一和第二VH/VL組合中的VL是相同的。在一較佳實施例中，雙特異性抗體是全長抗體，其具有一個結合CD28家族成員的胞外部分的重/輕(heavy/light，H/L)鏈組合和一個結合B7家族成員或TNFRSF14的胞外部分的H/L鏈組合。在一較佳實施例中，在所述第一H/L鏈組合中的輕鏈類似於在所述第二H/L鏈組合中的輕鏈。 在一更佳實施例中，在第一和第二H/L鏈組合中的輕鏈是相同的。

已經發表許多方法，以有利於雙特異性抗體或反之亦然，單特異性抗體的產生。在本發明中，細胞有利於雙特異性抗體的產生，而不是各自的單特異性抗體的產生是較佳的。這個通常藉由修飾重鏈的恆定區來達成，如此一來它們有利於異質二聚體化(heterodimerization)(即，與其它重/輕鏈組合的重鏈二聚體化)，而不是同質二聚體化。在一較佳實施例中，本發明之雙特異性抗體包含具有相容的異質二聚體化域之兩個不同的免疫球蛋白質重鏈。本領域中已描述了各種相容的異質二聚體化域。相容的異質二聚體化域較佳地為相容的免疫球蛋白質重鏈CH3異質二聚體化域。當使用野生型CH3域時，兩個不同重鏈(A及B)和共同輕鏈的共表現會產生三種不同的抗體種類AA、AB及BB。AA及BB是兩種單特異性二價抗體的代號，而AB是雙特異性抗體的代號。為了增加期望的雙特異性產物(AB)，可採用CH3工程化，或換句話說，可使用具有相容的異質二聚體化域的重鏈，如下文所定義。本領域描述了可達成這種重鏈的異質二聚體化的各種方式。一個方式是產生「旋鈕入孔(knob into hole)」雙特異性抗體。參見WO1998/050431 (Arathoon等人)。

如本文所用的術語「相容的異質二聚體化域」是指經工程化後，使得工程化的結構域(domain)A’會優先與工程化的結構域B’形成異質二聚體蛋白質域的蛋白質域，反之亦然，而A’-A’及B’-B’之間的同質二聚體化減少。

在US13/866,747 (現在發佈為US 9,248,181)、US14/081,848 (現在發佈為US 9,358,286)、WO2013/157953及PCT/NL2013/050294 (發佈為WO2013/157954)(藉由引用併入本文)中，揭露了使用相容的異質二聚體化域，來產生雙特異性抗體的方法和手段。這些手段和方法也可有利地用於本發明中。具體而言，本發明之雙特異性抗體較佳地包含產生基本上只有雙特異性全長IgG分子的突變。較佳的突變為在第一CH3域(「KK變異體」重鏈)中的胺基酸取代L351K及T366K (EU編號)和在第二域(「DE變異體」重鏈)中的胺基酸取代L351D和L368E，或反之亦然。先前在我們的US 9,248,181及US 9,358,286專利，還有WO2013/157954 PCT申請中展現出，DE變異體及KK變異體優先配對，以形成異質二聚體(所謂的「DEKK」雙特異性分子)。由於在相同的重鏈之間的CH3-CH3界面中的帶電殘基之間的排斥，幾乎不會發生DE變異體重鏈的同質二聚體化(DEDE同質二聚體)。

可藉由編碼輕鏈及兩個經CH3工程化，以確保有效率的異質二聚體化及雙特異性抗體的形成的不同重鏈的質體的(瞬時)轉染，來產生雙特異性抗體。這些鏈在單一細胞中的產生導致偏向形成雙特異性抗體，而不是形成單特異性抗體。

因此，更提供自單一細胞產生根據本發明的抗體或變異體的方法，其中所述抗體或其變異體包含能夠形成界面的兩個CH3域，所述方法包含提供： -細胞，其具有a) 編碼IgG重鏈的第一核酸序列，此IgG重鏈特異性辨認PD-1的胞外部分且含有第一CH3域，以及b) 編碼IgG重鏈的第二核酸序列，此IgG重鏈特異性辨認PD-L1的胞外部分且含有第二CH3域，其中對所述核酸序列提供用於優先配對所述第一和第二CH3域的突變，所述方法更包含培養所述細胞且允許所述核酸序列的表現且自培養物收穫所述抗體或其變異體的步驟。在一些較佳實施例中，所述細胞具有編碼共同輕鏈，較佳地重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01的第三核酸序列。

產生基本上只有雙特異性全長IgG1分子的較佳突變為在第351及366位的胺基酸取代，例如第一CH3域(「KK變異體」重鏈)中的L351K及T366K (根據EU編號編號)和在第351及368位的胺基酸取代，例如在第二CH3域(「DE變異體」重鏈)中的L351D和L368E，或反之亦然。因此，更提供根據本發明之從單一細胞產生根據本發明的抗體或變異體的方法，其中所述第一CH3域包含胺基酸取代L351K和T366K(根據EU編號編號)，且其中所述第二CH3域包含胺基酸取代L351D和L368E(根據EU編號編號)，所述方法更包含培養所述細胞且允許所述核酸序列的表現且自培養物收穫所述抗體或其變異體的步驟。

在一實施例中，包含結合PD-1的可變域的重鏈/輕鏈組合包含重鏈的DE變異體。在此實施例中，包含可結合至除PD-1以外的抗原的可變域的重鏈/輕鏈組合包含重鏈的KK變異體。

Fc區介導抗體的效應子功能，例如補體依賴性細胞毒殺性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、抗體依賴性細胞毒殺性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)和抗體依賴性細胞吞噬作用(antibody-dependent cell phagocytosis，ADCP)。取決於治療性抗體或Fc融合蛋白質的應用，降低或增強效應子功能可為期望的。在本發明中，效應子功能降低是較佳的。如在本發明的一些實施例中那樣活化、增強或刺激免疫反應時，可能期望降低效應子功能。在其它之中，效應子功能降低的抗體可被用來將免疫細胞的細胞表面分子作為標靶。

發現IgG結合至FcγR或C1q需要位在鉸鏈區及CH2域中的殘基。CH2域(第2D圖)的兩個區域與FcγR及C1q的結合相關。將IgG2殘基於第233-236位與將IgG4殘基於第327、330及331位取代進入IgG1，顯著降低ADCC和CDC (Armour et al., 1999. Eur J Immunol. 29(8):2613-24；Shields et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604)。再者，Idusogie等人展示，在不同位置的丙胺酸取代，包含K322，顯著地降低補體的活化(Idusogie et al., 2000. J Immunol. 164(8):4178-84)。

由於它們效應子功能降低，IgG4抗體代表用於受體阻斷而不消耗細胞的IgG次類。IgG4分子可在稱為Fab臂交換(Fab-arm exchange)的動態過程中交換半分子(half-molecule)。此現象可在治療性抗體及內源性IgG4之間發生。S228P突變是確保Fab臂交換的能力減少的突變的範例。(Labrijn. et al., 2009. Nat Biotechnol. 27(8):767-71)。

具有降低的效應子功能的抗體較佳地為IgG抗體，其包含經修飾的CH2/低鉸鏈域，例如以減少Fc受體的交互作用或減少C1q的結合。在一些實施例中，本發明的抗體是具有突變CH2及/或下鉸鏈域的IgG抗體，如此一來雙特異性IgG抗體與Fc-gamma受體的交互作用降低。包含突變CH2區的抗體較佳地為IgG1抗體。這樣的突變IgG1 CH2及/或低鉸鏈域較佳地包含第235及/或236位(EU編號)的胺基酸取代、較佳為L235G及/或G236R取代(第2E圖)。

如本文所述的抗體或雙特異性抗體的變異體可包含此抗體或雙特異性抗體的功能部分、衍生物和/或類似物。變異體通常維持抗體，例如雙特異性抗體，的結合特異性。變異體通常保持抗體，例如雙特異性抗體，的結合特異性。變異體較佳為如本文所述的抗體或雙特異性抗體的功能部分或衍生物。其較佳為功能部分。

結合特異性是由結合CD28家族成員的胞外部分和B7家族成員或TNFRSF14的胞外部分的能力來定義，其中這些成員是結合配偶體(即受體-配位體對)。

如本文所述的抗體的功能部分，或較佳地雙特異性抗體的功能部分是包含結合CD28家族成員，較佳地PD-1，的胞外部分的可變域，和結合B7家族成員或TNFRSF14，較佳地PD-L1，的胞外部分的可變域的部分。合適的部分是例如藉由用胃蛋白質酶(pepsin)消化雙特異性抗體而產生的F(ab’)2片段。包含所述可變域的其他部分被包含在本發明中。

如本文所述的抗體的功能衍生物，或較佳地雙特異性抗體的功能衍生物是包含藉由連接區連接的結合CD28家族成員，較佳為PD-1的胞外部分的可變域，和結合B7家族成員或TNFRSF14，較佳為PD-L1的胞外部分的可變域的蛋白質。可變域可為可變域本身或Fab片段或類可變域分子，例如包含透過接頭(linker)連接在一起的VH和VL的單鏈Fv片段。類可變域分子的其他範例是所謂的單域抗體片段。單域抗體片段(single-domain antibody fragment，sdAb)是具有單一單體可變抗體區的抗體片段。像完整抗體一樣，其能夠選擇性地結合至特定抗原。分子量僅為12至15 kDa，單域抗體片段遠小於由兩條重蛋白質鏈和兩條輕鏈所構成的普通抗體(150至160 kDa)，且甚至比Fab片段還要小(~50 kDa，一條輕鏈和半條重鏈)和單鏈可變片段(~25 kDa，兩個可變區，一個來自輕而一個來自重鏈)。單域抗體本身並不比正常抗體小很多(通常為90-100kDa)。單域抗體片段主要由駱駝科 (camelid)中發現的重鏈抗體進行工程化；這些被稱為VHH片段(Nanobodies®)。一些魚類也具有僅有重鏈的抗體(IgNAR，「免疫球蛋白質新抗原受體」)，從中可獲得稱為VNAR片段的單域抗體片段。另一方法是將從來自人類或小鼠的常見免疫球蛋白質G (immunoglobulin G，IgG)的二聚可變域分成單體。儘管對單域抗體的大多數研究目前基於重鏈可變域，但是衍生自輕鏈的奈米體(nanobody) 已經顯示出特異性結合至目標抗原決定基。類可變域分子的其他非限制性範例是VHH、人類域抗體(Human Domain Antibodies，dAbs)和Unibodies。較佳的功能部分為包含可變域的部分，前述可變域包含重鏈可變區及輕鏈可變區。這樣的可變域的非限制性範例為F(ab)片段及單鏈Fv片段。(類)可變域連接的雙特異性形式是例如與兩個不同的scFv結合的人類血清白蛋白質(Human Serum Albumine，HSA)；包含透過二聚體基序(motif)或自我聯結(self-associating)二級結構，例如螺旋束或捲曲螺旋，以引起scFv片段的二聚體化(Morrison (2007) Nat. Biotechnol 25:1233-34)，來結合在一起的兩個不同scFv的雙特異性迷你抗體(bispecific miniantibody)。在WO2009/126920中描述合適的HAS接頭及使scFv偶聯至接頭的方法的範例。

如本文所述的抗體的功能類似物，或較佳地雙特異性抗體的功能類似物是包含CD28家族成員，較佳為PD-1的胞外部分的結合位，和B7家族成員或TNFRSF14，較佳為PD-L1的胞外部分的結合位的分子。功能衍生物可為擬抗體(antibody mimetic)、多肽、適體(aptamer)或前述之組合。這些蛋白質或適體通常結合至一個目標。本發明的蛋白質結合至二或更多目標。應該理解的是，可藉由習知的方法，將這些抗體、擬抗體、多肽及適體的任何組合連接在一起。舉例而言，在一些實施例中，本發明之結合分子為共軛物或融合蛋白質。對抗體而言，製造多特異性抗體的技術已發展到還包含具有與正常單特異性抗體相同的整體結構，但其中抗體的兩個臂各自結合不同目標的雙特異性抗體。

擬抗體(antibody mimetic)是與抗體一樣可特異性結合抗原，但與抗體在結構上不相關的多肽。擬抗體通常是莫耳質量約3至20 kDa的人工胜肽或蛋白質。與抗體相比的共同優點是更好的可溶性、組織滲透性、對熱和酵素的穩定性以及相對低的生產成本。擬抗體的非限制性範例為親和體分子(affibody molecule)(通常基於蛋白質A的Z域)；親和素(affilin)(通常基於Gamma-B結晶或泛素)；affimer (通常基於胱蛋白質(Cystatin))；affitin(通常基於來自嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius)的Sac7d)；alphabody (通常基於三重螺旋捲曲螺旋(Triple helix coiled coil))；anticalins (通常基於脂質載運蛋白質(lipocalin))；avimer (通常基於各種膜受體的A域)；DARPin (通常基於錨蛋白質重複基序(ankyrin repeat motif))；fynomer (通常基於Fyn 7的SH3域)；kunitz域胜肽(通常基於各種蛋白質酶抑制子的Kunitz域)；以及單體(monobody)(通常基於纖維粘連蛋白質(fibronectin)的第III型域)。

單體(monobody)是人工的結合蛋白質，其使用纖維粘連蛋白質第III型域(fibronectin type III domain，FN3)作為分子支架建造。對於產生目標結合蛋白質而言，單體是抗體的簡單且強健的替代物。術語「單體」在1998年由Koide團隊所創造(coin) ，他們發表了第一篇論文，使用人類纖維粘連蛋白質的第十FN3域，展示了單體的概念。

單體及其它擬抗體通常從組合庫中產生，其中使用分子展示和定向進化技術，例如噬菌體展示、mRNA展示及酵母菌表面展示，將部分的支架多樣化。許多擬抗體對其各自的標靶具有高親和性及高度特異性。

適體是結合至特定目標分子的寡核苷酸或胜肽分子。通常藉由從大的隨機序列池(random sequence pool)選擇適體，來創造適體，但天然適體亦存在於核糖開關(riboswitch)中。適體可用於基礎研究及臨床目的作為大分子。

如本文所使用，術語「共軛物(conjugate)」是指已經共價連接的二或更多分子，其選擇性地透過連接區亦稱為接頭，來共價連接。舉例而言，在一些實施例中，共軛物為藉由連接區連接至第二蛋白質或非蛋白質基團(moiety)的第一蛋白質或非蛋白質基團。舉例而言，在本發明之結合分子的一些實施例中，其包含或由已經共價連接的二或更多抗體組成。共軛物不限於第一基團及第二基團，但在一些實施例中，亦可具有藉由另外的連結區連接的第三、第四或更多基團。如本申請案其它地方所述，蛋白質基團的範例包含但不限於：多肽、擬肽(peptidomimetic)或抗體(或如本案其它地方所述的抗體部分、衍生物或類似物)。非蛋白質基團的範例包含但不限於適體(aptamer)。可使用許多類型的接頭(linker)，且根據共軛物中的分子類型及接頭所需的性質(長度、彈性、對蛋白質酶活性的抗性及其它類似的特性)，選擇合適的接頭。這樣的接頭可包含核苷酸(nucleotide)、多肽或適合的合成材料。舉例而言，接頭可為彈性胜肽接頭。在某些實施例中，接頭可為可切割接頭，允許部分的共軛物彼此分離。在其它實施例中，胜肽接頭可為螺旋接頭。用於連接蛋白質和其它分子的各種範例及套組為本領域所習知的。如本文所使用，術語「融合蛋白質(fusion protein)」是指包含二或更多多肽或蛋白質已經在DNA層級藉由重組(recombination)連接在一起，且以單一多肽一起表現的蛋白質。融合蛋白質也可包含亦由DNA編碼且與融合蛋白質一起表現的胜肽連接區。為融合蛋白質的一部分的胜肽接頭可設計為具有特定的特性，例如彈性、親水性、蛋白質酶抗性、可裂性等。所有這些性質都可設計於DNA序列內，且接頭的設計方法亦為本領域所習知。舉例而言，可藉由本領域所習知的方法，將抗體連接在一起，且如本文所述，形成雙特異性或多目標抗體。再者，可藉由本領域各種習知的方法，例如藉由使用例如Biclonics®的技術，來構築雙特異性抗體。雙特異性單株抗體(bispecific monoclonal antibody，BsMAb、BsAb)通常包含兩個不同的單株抗體的結合域，因此結合至兩個不同的抗原決定基。Biclonics®分子，以及其它全長IgG雙特異性抗體具有兩種不同的抗原結合特異性，其由scFv的Fab的全長IgG分子的兩個不同可變區所編碼。如本文其它地方所詳述的，可藉由用編碼兩個不同的共同輕鏈 (common light chain，cLC)抗體的遺傳構築體(construct)共轉染個別細胞，來生產Biclonics®。CH3工程化確保有效率的異質二聚體化及基本上純的雙特異性抗體的形成。

本發明亦提供根據本發明的抗體或變異體作為藥物的用途。更提供根據本發明的抗體或變異體於治療癌症或病原體，例如病毒或寄生蟲感染的方法中的用途。

本發明亦提供治療患有癌症的個體的方法，此方法包含對有此需要的個體投予本發明的抗體，例如雙特異性抗體，或其變異體，例如變異體。個體較佳為患有癌症的個體。在一些實施例中，癌症是包含表現所述第二膜蛋白質的癌細胞的癌症。在一較佳實施例中，癌症是包含表現B7家族成員或TNFRSF14的癌細胞的癌症。癌症較佳是腺癌(adenocarcinoma)。較佳的癌症是大腸癌(colorectal cancer)；胰腺癌(pancreatic cancer)；肺癌；乳癌；肝癌；***癌；卵巢癌；子宮頸癌(cervical cancer)；子宮內膜癌(endometrial cancer)；頭頸癌；黑色素瘤；睾丸癌；泌尿上皮癌(urothelial cancer)；腎癌；胃癌；或類癌癌症。在一較佳實施例中，癌症是大腸癌；胰腺癌；肺癌；乳癌；肝癌；***癌；卵巢癌；子宮頸癌；子宮內膜癌；頭頸癌；或黑素瘤。在一特別較佳實施例中，癌症是大腸癌；胰腺癌；肺癌；乳癌；或肝癌。在一特別較佳實施例中，癌症是胃腸癌。在一較佳實施例中，癌症是大腸癌。在此實施例中，抗體或其變異體較佳為具有可結合PD-1的可變域和可結合PD-L1的可變域的抗體。可變域較佳地各自阻斷PD-1與PD-L1的結合。

更提供離體(ex vivo )系統，其包含本發明的抗體或其變異體及所述第一細胞和所述第二細胞。第一和第二細胞較佳地分別在細胞膜上表現所述第一和所述第二膜蛋白質。此系統較佳為適用於所述第一細胞的維持和/或生長的細胞系統。細胞系統較佳地適用於所述第二細胞的維持和/或生長。例如，這樣的系統適用於提高和/或繁殖針對異常細胞的免疫細胞。隨後可將此類免疫細胞投予至有此需要的個體，例如癌症病人。免疫細胞較佳地包含T細胞或NK細胞，較佳為細胞毒性T細胞。免疫細胞對有此需要的個體較佳地是自體的(autologous)。

更提供誘導和/或刺激個體中對抗在所述個體中的異常細胞的免疫反應的方法，此方法包括對所述個體提供本發明的抗體或其變異體。異常細胞較佳為癌細胞、病毒感染的細胞、寄生蟲或寄生蟲感染的細胞。在一較佳實施例中，細胞是癌細胞或贅生細胞。在此實施例中，抗體或其變異體較佳地是具有可結合PD-1的可變域和可結合PD-L1的可變域的抗體。這些可變域較佳地各自阻斷PD-1與PD-L1的結合。

贅生物(neoplasm)是組織的異常生長，且當它也形成一塊時，通常稱為腫瘤。本發明中的贅生物通常形成一塊。贅生細胞是來自已形成一塊的贅生物的細胞。世界衛生組織(The World Health Organization，WHO)將贅生物分為四大類：良性贅生物(benign neoplasm)、原位贅生物(in situ neoplasm)、惡性贅生物(malignant neoplasm)和有不確定或未知行為的贅生物。惡性贅生物也簡單地以癌症為人所熟知。

誘導和/或刺激免疫反應包含誘導免疫反應及增強已經存在的免疫反應。可藉由，在適用的情況下，測量個體的腫瘤載量；個體的病毒載量；個體的寄生蟲載量，來測量個體的免疫反應。

所述病毒感染的細胞較佳為感染免疫缺陷病毒、皰疹病毒(herpes virus)，較佳地單純皰疹病毒(herpes simplex virus)，水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus)或愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、乳突瘤病毒(papilloma virus)、肝炎病毒，較佳地A型、B型或C型肝炎病毒，麻疹病毒(measles virus)或腺病毒(adenovirus)。病毒較佳為已知能夠持續存在於個體中的病毒。持續性感染的特徵在於病毒未被清除但仍存在於受感染個體的特定細胞中的那些感染。持續性感染可有關於沉默和有生產力感染的階段，而不會迅速殺死或甚至產生宿主細胞的過度損傷。持續的病毒-宿主交互作用可能是潛伏、慢性和/或緩慢的感染。

寄生蟲感染的細胞是感染胞內寄生蟲的細胞。這類寄生蟲是能夠在宿主的細胞內生長和繁殖的寄生性微生物。一些胞內寄生蟲也可以在細胞外生活。這類寄生蟲是所謂的兼性(facultative)胞內寄生蟲。非限制性範例是單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene)、退伍軍人菌(Legionella)、某些種類的分枝桿菌(mycobacterium)和新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)。較佳的胞內寄生蟲是不能在宿主細胞外生長的寄生蟲，較佳的範例是披衣菌(Chlamydia)和緊密相關的物種、某些種類的分枝桿菌，例如麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、某些原生動物，包含：頂複合器蟲(Apicomplexan)(瘧原蟲屬(Plasmodium spp.))、弓形蟲(Toxoplasma gondii)和隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)和錐蟲(trypanosomatid)。

本發明的抗體或其變異體、或較佳地雙特異性抗體或其變異體較佳地用於人類中。為此，本發明的抗體或其變異體較佳地為人類或人源化抗體。人類對多肽的耐受性受許多不同的面向所支配。免疫力，不論是經T細胞介導、經B細胞介導或其它，皆是包含在人類對多肽的耐受性的變數之一。本發明的雙特異性抗體的恆定區較佳地包含人類重鏈恆定區及人類輕鏈恆定區，前述人類重鏈恆定區較佳地包含如第2圖中所示的序列；前述人類輕鏈恆定區較佳地包含如第1C圖中所示的序列。恆定區可與天然出現的人類抗體的恆定區含有一或多個，較佳不超過10個、較佳不超過5個胺基酸差異。恆定部分完全衍生自天然出現的人類抗體是較佳的。如WO2009/157771中所述，本文產生的各種抗體衍生自以各自的目標免疫的共同輕鏈小鼠。本文產生的各種抗體衍生自人類抗體可變域庫。因此，這些可變域為人類的。獨特的CDR區可衍生自人類、合成的或衍生自另一有機體。除了CDR區之外，當可變區具有與天然出現的人類抗體的可變區的胺基酸序列相同的胺基酸序列時，可變區至少是人類可變區。在這樣的實施例中，抗體之結合CD28家族成員或B7家族的膜相關成員或TNFRSF14的可變域的VH，或本發明的抗體中的輕鏈可與天然出現的人類抗體含有一或多個、較佳不超過10個、較佳不超過5個胺基酸差異，不算上CDR區的胺基酸序列中可能的差異。在體細胞超突變的背景下，這樣的突變也在自然界中發生。

至少就重鏈可變區而言，抗體可衍生自各種動物物種。將這樣的例如鼠類重鏈可變區人源化是常見做法。有各種方式可以達成這件事，其中有使用符合鼠類重鏈可變區的三維結構的三維結構，將CDR移植(CDR-grafting)至人類重鏈可變區；鼠類重鏈可變區的去免疫，其較佳地藉由自鼠類重鏈可變區移除已知或疑似的T或B細胞抗原決定基來完成。此移除通常是藉由抗原決定基中的一或多個胺基酸取代為另一胺基酸(通常為保守的)，使抗原決定基的序列受到修飾，從而使其不再是T或B細胞的抗原決定基。

去免疫的鼠類重鏈可變區在人類中比原始鼠類重鏈可變區具有較低的免疫原性。較佳地，本發明之可變區或域進一步被人源化，例如被虛飾(veneer)。藉由使用虛飾技術，容易被免疫系統遇到的外部殘基選擇性地以人類殘基取代，以提供包含弱免疫原性或大致上無免疫原性的虛飾表面的雜交分子。本發明所用的動物較佳為哺乳類、更佳為靈長類、最佳為人類。

根據本發明的抗體或雙特異性抗體或其變異體較佳地包含人類抗體的恆定區。根據它們重鏈恆定域的差異，抗體分成五個類型，或同型(isotype)：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。這些類型或同型包含所述重鏈中的至少一個以相對應的希臘字母命名。在一較佳實施例中，本發明提供了根據本發明的抗體，其中所述恆定區係選自IgG恆定區的群組，即選自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4所組成的群組。較佳地，所述恆定區為IgG4或IgG1恆定區(第2圖)，更佳為突變的IgG1恆定區。IgG1恆定區中的一些變異在自然界中發生且/或在不改變所得抗體的免疫學性質的情況下允許那些變異。通常在恆定區中，允許在約1至10個之間的胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。如本文所示，可使恆定區突變，以實現有效率的異質二聚體化，以降低效應子功能或為了包含半衰期、穩定性及其它類似原因的其它原因。

合理的方法已朝最小化人類背景中非人類殘基的含量發展。有各種方法可以成功將一抗體的抗原結合性質移植到另一抗體上。抗體的結合特性可主要位於CDR3區的確切序列中，通常由可變域中的CDR1和CDR2區的序列與可變域的適當結構組合作為一個整體所支持。目前有各種方法可用於將CDR區移植到另一抗體的合適可變域上。這些方法中的一些於J.C. Almagro1 and J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633中回顧，其透過引用包含於本文。

包含如第3圖和/或第13圖中所示的可變重鏈序列的可變域的輕鏈可變區較佳為O12的或基於O12的生殖輕鏈，較佳為重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或其片段或功能衍生物(根據IMGT資料庫全球網站imgt.org命名)。使用術語重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39輕鏈或簡稱huVκ1-39。輕鏈可具有1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。提及的1、2、3、4或5個胺基酸取代較佳為保守性胺基酸取代、***、缺失、取代或前述之組合，較佳地不在VL鏈的CDR3區中，較佳地不在VL鏈的CDR1、CDR2或CDR3區或FR4區中。第1圖中描繪共同輕鏈的較佳序列。

有各種方法可用於生產雙特異性抗體。一個方法涉及在細胞中表現兩個不同的重鏈和兩個不同的輕鏈並收集此細胞產生的抗體。以這種方式產生的抗體通常會含有具有不同重鏈和輕鏈組合的抗體集合，其中一些是期望的雙特異性抗體。雙特異性抗體之後可從此集合純化。雙特異性抗體與此細胞產生的其他抗體的比例可用各種方式增加。在本發明的一較佳實施例中，藉由在細胞中不表現兩個不同的輕鏈，而是表現兩個基本上相同的輕鏈，來增加比例。這兩個基本上相同的輕鏈可為具有基本上相同的輕鏈可變區和不同的輕鏈恆定區，或較佳地，兩個基本上相同的輕鏈恆定區的輕鏈。這個概念在本發明所屬技術領域中也被稱為「共同輕鏈」方法。當基本上相同的輕鏈與兩個不同的重鏈一起工作，允許具有不同抗原結合位和伴隨不同結合性質的可變域形成時，相較於表現兩個基本上不同的輕鏈，雙特異性抗體與由此細胞產生的其它抗體的比率受到顯著改善。可藉由刺激兩條不同重鏈彼此配對，而不是兩條相同重鏈的配對，進一步改善由此細胞產生的雙特異性抗體的比例。本發明所屬技術領域描述可實現這樣的重鏈異質二聚體化的各種方式。在美國臨時申請案61/635,935中描述了一較佳方法，其已由美國常規申請號13/866,747和PCT申請號PCT/NL2013/050294 (WO2013/157954A1)跟進，這些透過引入本文作為參考。揭露了(自單一細胞)產生雙特異性抗體的方法和手段，由此提供有利於形成雙特異性抗體，而不是形成單特異性抗體的手段。這些方法也可有利地用於本發明中。因此，本發明提供了一種(自單一細胞)產生根據本發明的雙特異性抗體的方法，其中所述雙特異性抗體包含能夠形成界面的兩個CH3域，所述方法包含在所述細胞中提供a) 第一核酸分子，其編碼包含重鏈的第一CH3域，b) 第二核酸分子，其編碼包含重鏈的第二CH3域，其中提供所述核酸分子優先配對包含重鏈的所述第一和第二CH3域的手段，所述方法更包含培養所述宿主細胞並允許表現所述兩個核酸分子並自培養物中收穫所述雙特異性抗體的步驟。所述第一和第二核酸分子可為相同核酸分子、載體或基因遞送載體的一部分，且可在宿主細胞的基因體的相同位置整合。或者，所述第一和第二核酸分子分別提供給所述細胞。宿主細胞包含至少一個輕鏈，及較佳地，共同輕鏈。

一較佳實施例提供一種自單一細胞產生根據本發明的雙特異性抗體的方法，其中所述雙特異性抗體包含能夠形成界面的兩個CH3域，所述方法包含提供： -細胞，其具有a) 編碼重鏈的第一核酸分子，此重鏈包含可結合至CD28家族的膜相關成員的胞外部分且含有第一CH3域的抗原結合位，以及b) 編碼重鏈的第二核酸分子，此重鏈包含可結合至B7家族的膜相關成員或TNFRSF14的胞外部分且含有第二CH3域的抗原結合位，其中提供所述核酸分子優先配對所述第一和第二CH3域的手段， 所述方法更包含培養所述細胞且允許表現由所述兩個核酸分子編碼的蛋白質且自培養物收穫所述雙特異性IgG抗體的步驟。在一特別較佳實施例中，所述細胞亦具有編碼共同輕鏈的第三核酸分子。所述第一、第二和第三核酸分子可為相同核酸分子、載體或基因遞送載體的一部分，並可在宿主細胞的基因體的相同位置整合。或者，所述第一、第二和第三核酸分子分別提供給所述細胞。如上所述，較佳的共同輕鏈係基於O12，較佳地，它是重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01。優先配對所述第一和所述第二CH3域的手段較佳為重鏈編碼區(heavy chain coding region)的CH3域中的相應突變。產生基本上僅雙特異性抗體的較佳突變是第一CH3域中的胺基酸取代L351K和T366K(根據EU編號編號)和第二CH3域中的胺基酸取代L351D和L368E，或反之亦然(第2圖)。因此，更提供根據本發明的產生雙特異性抗體的方法，其中所述第一CH3域包含胺基酸取代L351K和T366K(根據EU編號編號)，且其中所述第二CH3域包含胺基酸取代L351D和L368E，所述方法更包括培養所述細胞並允許表現由所述核酸分子編碼的蛋白質且自培養物收穫所述雙特異性抗體的步驟。亦提供了根據本發明之產生雙特異性抗體的方法，其中所述第一CH3域包含胺基酸取代L351D和L368E(根據EU編號編號)，且其中所述第二CH3域包含胺基酸取代L351K和T366K，所述方法更包括培養所述細胞並允許表現所述核酸分子且自培養物收穫所述雙特異性抗體的步驟。可藉由這些方法產生的抗體也是本發明的一部分。CH3異質二聚體化域較佳為IgG1異質二聚體化域。包含CH3異質二聚體化域的重鏈恆定區較佳為IgG1恆定區。

本發明亦提供編碼根據本發明的抗體重鏈可變區的至少一部分的核酸分子。本文提供長度至少15個核苷酸的核酸分子，編碼根據本發明的抗體或變異體的至少一個CDR區。更提供編碼根據本發明的抗體或變異體的至少一重鏈可變區的核酸分子。

核酸分子(通常是體外、單離或重組核酸分子)較佳地編碼第3圖和/或第13圖中所示的重鏈可變區的任一個或其中具有1、2、3、4或5個胺基酸的***、缺失、取代或前述組合之第3圖和/或第13圖中所示的重鏈可變區。一些實施例提供編碼根據本發明之抗體或變異體的核酸分子。核酸分子較佳地使用針對在待使用的抗體產生細胞中表現而最佳化的密碼子。較佳地，將編碼第3圖和/或第13圖中所示的重鏈可變區的核酸或其中具有1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合之第3圖和/或第13圖中所示的重鏈可變區的核酸，針對於人類細胞中表現，較佳地Per.C6TM；或中國倉鼠，較佳地CHO，進行密碼子最佳化。本發明更提供編碼所提及的重鏈可變區和第2圖的重鏈恆定區的核酸分子。

如本發明所用的核酸分子通常但不只是核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)或去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)。替代核酸，例如鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)和肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)可供本發明所屬技術領域中具有通常知識者所用。

更提供包含根據本發明的核酸分子的載體。

根據本發明的核酸分子例如被包含在細胞中。當所述核酸分子在所述細胞中表現時，所述細胞可產生根據本發明的抗體或變異體。因此，在一實施例中的本發明提供包含根據本發明的抗體或變異體和/或根據本發明的核酸分子和/或根據本發明的載體的細胞。當所述細胞產生重鏈和輕鏈時，產生抗體。提供可產生本發明的抗體的細胞。此細胞較佳地包含編碼抗體重鏈的核酸分子，前述抗體重鏈包含當與共同輕鏈組合時，可結合所述第一膜蛋白質的抗體重鏈可變區。所述細胞較佳地更包含編碼抗體重鏈的核酸分子，前述抗體重鏈包含當與共同輕鏈組合時，可結合所述第二膜蛋白質的抗體重鏈可變區。所述細胞較佳地更包含編碼共同輕鏈的核酸分子。所述細胞較佳為動物細胞、更佳為哺乳類細胞、更佳為靈長類細胞、最佳為人類細胞。出於本發明的目的，合適的細胞是能夠包含且較佳地產生根據本發明的抗體和/或根據本發明的核酸的任何細胞。

本發明更提供包含根據本發明的抗體的細胞。亦提供包含單獨或共同編碼本發明抗體的一或多個核酸分子的細胞。前述一或多個核酸分子是可表現的核酸分子，意味著它們含有編碼蛋白質的結構域的RNA轉錄和轉譯的順式(in cis )所需的訊息。較佳地，所述細胞(通常是體外、單離或重組細胞)產生所述抗體。在一較佳實施例中，所述細胞是融合瘤(hybridoma)細胞、中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞、NS0細胞或PER-C6^TM 細胞。在一特別較佳實施例中，所述細胞是CHO細胞。更提供包含根據本發明的細胞的細胞培養物。各種機構和公司已經開發出用於大規模生產抗體的細胞系，例如用於臨床用途。這類細胞系的非限制性範例是CHO細胞、NS0細胞或PER.C6^TM 細胞。這些細胞也用於其他目的，例如蛋白質的生產。為了蛋白質和抗體的工業規模生產而開發的細胞系，在本文中更稱為工業細胞系。因此，在一較佳實施例中，本發明提供開發用於大規模生產抗體，以用於生產本發明的抗體的細胞系的用途。本發明更提供用於產生包含編碼如第3、13、1和/或2圖中所示的VH、VL和/或重鏈的核酸分子的抗體的細胞。較佳地，所述核酸分子包含如所第1和2圖中所示的序列。

本發明更提供生產抗體的方法，此方法包含培養本發明的細胞且自所述培養物中收穫所述抗體。較佳地，所述細胞在無血清培養基中培養。較佳地，所述細胞適於懸浮生長。更提供可藉由生產根據本發明的抗體的方法所獲得的抗體。抗體較佳地自培養物的培養基純化。較佳地，所述抗體是親和純化(affinity purified)。

本發明的細胞為例如融合瘤細胞系、CHO細胞、293F細胞、NS0細胞或本領域已知的任何其它適用於臨床目的的抗體生產的細胞類型，特別是用於生產用於在人類中投予的抗體。在一特別較佳實施例中，所述細胞是人類細胞，較佳為經腺病毒E1區或其功能等價物轉形(transform)的細胞。這類細胞系的較佳範例是PER.C6^TM 細胞系或其等價物。在一特別較佳實施例中，所述細胞是CHO細胞或其變異體，較佳地為利用穀胺醯胺合成酶(glutamine synthetase，GS)載體系統，來表現抗體的變異體。

根據本發明的抗體或變異體也可在非人類動物中產生。因此，更提供了包含根據本發明的抗體、和/或根據本發明的核酸分子、和/或根據本發明的載體的非人類動物。在一些實施例中，所述非人類動物包含囓齒動物或兔，較佳地小鼠或大鼠。

本發明更提供了包含至少一個根據本發明的抗體或變異體的組合物或部分套組(kit of parts)。本發明更提供了包含一或多個本發明的抗體或其變異體的醫藥組合物。醫藥組合物較佳地包含醫藥上可接受的賦形劑(excipient)、稀釋劑或載體(carrier)。

本發明的抗體或其變異體可更包含標籤(label)，較佳為用於體內(in vivo)成像的標籤。對於治療應用來說，這樣的標籤通常不是必需的。在例如診斷設置中，標籤可以是有幫助的，例如視覺化體內的目標細胞。各種標籤是適合的，且許多在本領域中是眾所皆知的。在一較佳實施例中，標籤是用於偵測的放射性標籤。在另一較佳實施例中，標籤是紅外線標籤。較佳地，紅外線標籤適合體內成像。本發明所屬領域中具有通常知識者可取得各種紅外線標籤。較佳的紅外線標籤是，例如IRDye 800；IRDye 680RD；IRDye 680LT；IRDye 750；IRDye 700DX；IRDye 800RS；IRDye 650；IRDye 700亞磷醯胺(phosphoramidite)；IRDye 800亞磷醯胺(LI-COR USA; 4647 Superior Street; Lincoln，Nebraska)。

待投予至病人的根據本發明的抗體的量通常在治療窗口(therapeutic window)中，意味著使用足夠的量，以獲得治療效果，而此量不超過會導致不可接受的程度的副作用的閾值(threshold)。獲得期望的治療效果所需的抗體量越低，治療窗口通常會越大。因此，在低劑量下發揮足夠治療效果的根據本發明的抗體是較佳的。劑量可以在Nivolumab的給藥方案的範圍內。劑量也可更低。

根據本發明的抗體或其變異體，特別是雙特異性抗體或其變異體可具有比有可變域的二價單特異性抗體的組合更少的副作用。阻斷抑制和/或共刺激分子的抗體的組合有益於對現有免疫療法無反應的病人。然而，免疫調節受體(immune-modulatory receptor，iMOD)的雙重阻斷已顯示增加免疫相關的毒性。根據本發明的抗體或其變異體，特別是雙特異性抗體或其變異體適合解決iMOD的雙重阻斷，因為它們可發揮不能被單株抗體的組合再現的功能活性，且可更選擇性地以特定細胞族群為目標，這減少了病人的安全責任。

藉由將抗體選殖至在驅動重鏈異質二聚體化的CH3區中含有突變的互補表現載體中，作為雙特異性抗體產生抗體。許多雙特異性抗體以小規模生產並在癌細胞系上的結合和功能測定中進行測試。本發明的抗體，特別是本發明的雙特異性抗體可將低毒性輪廓與高效力組合。本發明的抗體可於各種類型和系列的免疫目標治療中是有用的。當與兩臂皆結合相同抗原的抗體相比時，本發明的抗體可具有增加的治療窗口。

更提供根據本發明的雙特異性抗體或其變異體於製備用於治療或預防異常細胞、腫瘤和/或轉移形成的藥物的用途。所述轉移所起源的腫瘤較佳為對B7家族成員或TNFRSF14陽性的腫瘤。

在懸浮液293F細胞中瞬時轉染後，可以＞ 50 mg/L的量產生本發明的抗體。可將雙特異性抗體純化至純度大於98%，其中產率＞ 70%。分析特性研究顯示出與二價單特異性IgG1相當的雙特異性IgG1抗體輪廓。

本發明亦提供可結合至CD28家族的膜相關成員的胞外部分和B7的膜相關成員或TNFRSF14的胞外部分的雙特異性抗體或其變異體。

亦提供了治療患有癌症或病原體感染的個體的方法，此方法包含對有此需要的個體投予治療上有效量之根據本發明的抗體或變異體、或根據本發明的組合物、或根據本發明的核酸分子、或根據本發明的載體。

本發明更提供了本發明的蛋白質或本發明的雙特異性抗體於治療患有癌症的個體中的用途。

更提供了包含本發明的抗體或雙特異性抗體或其變異體和表現CD28家族的膜相關成員的第一細胞和表現B7家族的膜相關成員或TNFRSF14的第二細胞的細胞系統。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3A圖中所示的MF5708的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3A圖中所示的MF5708的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3B圖中所示的MF5594的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3B圖中所示的MF5594的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3C圖中所示的MF5576的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3C圖中所示的MF5576的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3D圖中所示的MF5561的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3D圖中所示的MF5561的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3E圖中所示的MF5557的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3E圖中所示的MF5557的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3F圖中所示的MF5553的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3F圖中所示的MF5553的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3G圖中所示的MF5442的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3G圖中所示的MF5442的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3H圖中所示的MF5439的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3H圖中所示的MF5439的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3I圖中所示的MF5426的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3I圖中所示的MF5426的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3J圖中所示的MF5424的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3J圖中所示的MF5424的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3K圖中所示的MF5382的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3K圖中所示的MF5382的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3L圖中所示的MF5377的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3L圖中所示的MF5377的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3M圖中所示的MF5359的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3M圖中所示的MF5359的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3N圖中所示的MF5361的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3N圖中所示的MF5361的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF5442的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF5442的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7691的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7691的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7690的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7690的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7689的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7689的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7688的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7688的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7700的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7700的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7701的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7701的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7703的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7703的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7694的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7694的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7693的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7693的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7692的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7692的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7697的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7697的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7696的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7696的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-L1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7695的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7695的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3O圖中所示的MF6982的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3O圖中所示的MF6982的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3P圖中所示的MF6974的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3P圖中所示的MF6974的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3Q圖中所示的MF6972的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3Q圖中所示的MF6972的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3R圖中所示的MF6936的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3R圖中所示的MF6936的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3S圖中所示的MF6935的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3S圖中所示的MF6935的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3T圖中所示的MF6932的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3T圖中所示的MF6932的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3U圖中所示的MF6076的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3U圖中所示的MF6076的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3V圖中所示的MF6236的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3V圖中所示的MF6236的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3W圖中所示的MF6256的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3W圖中所示的MF6256的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3Y圖中所示的MF6226的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3W圖中所示的MF6226的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第3X圖中所示的MF6930的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第3W圖中所示的MF6930的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF6929的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF6929的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7699的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7699的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7698的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7698的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7687的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7687的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7686的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7686的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7685的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7685的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

本發明亦提供了包含結合PD-1的可變域的二價抗體或其變異體，其中可變域的VH鏈包含如第13圖中所示的MF7684的VH鏈的胺基酸序列，其中相對於所述VH，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。在一較佳實施例中，所述VH鏈包含如第13圖中所示的MF7684的胺基酸序列。在此抗體的較佳實施例中，此抗體是單特異性的。

如本文所使用的單特異性抗體是僅能結合至一個抗原決定基的抗體。因此，只有一種抗原被結合。如本文所使用的二價抗體包含兩個可結合相同抗原決定基的可變域。單特異性二價抗體通常稱為單株抗體。這種單特異性二價抗體具有兩個可變域，每個可變域具有包含所示MF的胺基酸序列和如本文所定義的共同輕鏈的重鏈可變區。

雙特異性抗體或其變異體包含結合不同的抗原決定基的兩個可變域。兩個不同的抗原決定基通常存在於兩個不同的抗原或蛋白質上。雙特異性抗體對於結合特定抗原決定基的能力是單價的。它在具有二個結合交互作用的意義上是二價的。

在以下的實施例中進一步說明本發明。這些實施例並不限制本發明的範圍，而僅僅是為了闡明本發明。

實施例

如本文所使用的，「MFXXXX」，其中X獨立地為數字0至9，是指包含可變域的Fab，其中VH具有由4位數字所鑑定的胺基酸序列。除非另外指出，否則可變域的輕鏈可變區通常具有第1A圖、通常第1B圖的序列。「MFXXXX VH」是指由4位數字所鑑定的VH的胺基酸序列。MF更包含輕鏈的恆定區和通常與輕鏈的恆定區交互作用的重鏈的恆定區。PG是指包含相同重和輕鏈的單特異性抗體。PB是指具有兩個不同重鏈的雙特異性抗體。重鏈的可變區(VH)不同且通常CH3區也是，其中一個重鏈具有其CH3域的KK突變，而另一個具有其CH3域的互補(complementing)DE突變(見參考文獻PCT/NL2013/050294(公開為WO2013/157954)。

實施例： 1

用於選擇和篩選的材料的產生

細胞系的培養

自ATCC購買人類ES-2細胞(目錄編號CRL-1978)並常規維持在補充10% FBS (Lonza)的McCoy's 5A (Gibco)中。從Invitrogen獲得Freestyle 293F細胞(目錄編號p/n51-0029)並常規維持在293 FreeStyle培養基中。自ATCC購買HEK293T(目錄編號ATCC-CRL-11268)、CHO-K1 (目錄編號DSMZ ACC110)細胞系並常規維持在補充L-穀胺醯胺(glutamine)(Gibco)和FBS (Lonza)的DMEM/F12 (Gibco)中，且自Gibco購買CHO-S(目錄編號11619-012)細胞系並常規維持在補充L-穀胺醯胺的Freestyle CHO表現培養基(Invitrogen)中。

用於免疫，和用於穩定細胞系的產生的 PD-1 和 PD-L1 表現載體的產生

合成或透過在含有目標cDNA的市售表現構築體(expression construct)上的PCR放大(PCR amplification)，其中目標cDNA具有導入用於選殖的獨特限制位及用於有效率轉譯的科扎克一致序列(kozak consensus sequence)的特定引子，來獲得包含用於選殖的獨特限制位和用於有效率轉譯的科扎克一致序列的每個目標的全長cDNA。透過NheI/ EcoRI，將每個目標的cDNA選殖至真核的表現構築體中，例如pIRES-Neo3 (Clontech；第4圖)或pVAX1 (Thermo Fisher Scientific；第5圖)，分別產生pIRES-Neo3_[目標名]和pVAX1_ [目標名]。藉由比較NCBI參考胺基酸序列，來驗證***序列。pIRES-Neo3構築體用於穩定細胞系的產生。pVAX1構築體用於免疫目的。所得的構築體的名稱的概述，請參見表1。

用於在細胞表面上表現的全長huPD-1***物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：NP_005009.2相同)： MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL

其中： MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR：訊號胜肽。 PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV：huPD-1的ECD。 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI：預測的TM區。 CSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL：胞內尾部。

用於在細胞表面上表現的全長獼猴(食蟹獼猴(macaca fascicularis))PD-1***物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：ABR15751.1相同)： MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL

其中： MQIPQAPWPVVWAVLQLGWR：訊息胜肽。 PGWFLESPDRPWNAPTFSPALLLVTEGDNATFTCSFSNASESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTRLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQALV：maPD-1的ECD。 VGVVGGLLGSLVLLVWVLAVI：預測的TM區。 CSRAAQGTIEARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPAPCVPEQTEYATIVFPSGLGTSSPARRGSADGPRSPRPLRPEDGHCSWPL：胞內尾部。

用於在細胞表面上表現的全長huPD-L1***物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：AAI13735.1相同)： MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET

其中： MRIFAVFIFMTYWHLLNA：訊息胜肽。 FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNER：huPD-L1的ECD。 THLVILGAILLCLGVALTFIF：預測的TM區。 RLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET：胞內尾部。

用於在細胞表面上表現的全長獼猴(恆河獼猴(Macaca mulatta))PD-L1***物(均在pIRES-Neo3和pVAX1中)的胺基酸序列(與GenBank：ABO33161.1)： MRIFAVFIFTIYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECRFPVEKQLGLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLGPEENHTAELVIPELPLALPPNERTHLVILGAIFLLLGVALTFIFYLRKGRMMDMKKSGIRVTNSKKQRDTQLEET

其中： MRIFAVFIFTIYWHLLNA：訊息胜肽。 FTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECRFPVEKQLGLTSLIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSNYRQRAQLLKDQLSLGNAALRITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLLNVTSTLRINTTANEIFYCIFRRLGPEENHTAELVIPELPLALPPNER: ECD of maPD-L1. THLVILGAIFLLLGVALTFIF：預測的TM區。 YLRKGRMMDMKKSGIRVTNSKKQRDTQLEET：胞內尾部。

表現 PD-1 或 PD-L1 的穩定細胞系的產生

pIRES-Neo3_[目標名]表現構築體(表1)用於產生穩定表現個別之蛋白質的CHO-S或CHO-K1選殖體。使用lipofectamine轉染，將構築體在CHO-K1細胞中瞬時轉染或對CHO-S細胞使用PEI轉染，並使用與各自的蛋白質反應的抗體，藉由FACS來篩選。確認表現後，將瞬時轉染的細胞以有限稀釋(limiting dilution)接種且培養於與所用的表現構築體相關的選擇壓力下，以獲得穩定的細胞選殖體。在2至3週的選擇之後，藉由FACS篩選選殖體。藉由連續繼代(serial passage)，使所選的選殖體擴張，在FACS中重新測試並冷凍至-150°C。穩定表現異源(heterologous)蛋白質的選殖體的名稱是CHO-K1_[目標名]細胞或CHO- S_[目標名]細胞。用於產生穩定細胞系的構築體及其所產生的名稱的概述，請參見表1。

實施例 2

免疫、選擇及篩選

用於免疫的小鼠

如下文概述，為了產生結合至huPD-1和huPD-L1的人類抗體，用重組蛋白質抗原或編碼蛋白質的DNA，來將用於轉基因(transgenic)人類VK1-39輕鏈 (共同輕鏈小鼠，參見WO2009/157771)和人類重鏈(heavy chain，HC)微基因座(minilocus)(包含人類V基因片段、全部人類D和全部人類J的選擇)的小鼠免疫。這些小鼠被稱為「MeMo®」小鼠。

蛋白質免疫

藉由用重組蛋白質和Gerbu佐劑MM (Gerbu Biotechnik；目錄編號3001)的皮下注射，來將「MeMo®」小鼠免疫。重組huPD-L1-His (SinoBiological；目錄編號10084-H08H)和huPD-1-Fc (R&D；目錄編號1086-PD)蛋白質用於免疫。用在總體積為100 μl的混合40 μl佐劑的PBS中的40 μg的重組蛋白質，來免疫小鼠。隨後在第14天和第28天，以在總體積為50 μl的具有20 μl佐劑的PBS中的20 μg的重組蛋白質，來追加小鼠。在第35天收集小鼠血清，以確定血清力價(serum titer)。具有低血清力價的小鼠接受追加免疫和血清分析的額外循環。每個循環由兩次的每週使用在50 μl的PBS中的20 μg的重組蛋白質的免疫，接著一週後收集用於力價分析的血清所組成。顯示出對人類但不是對獼猴同源物高血清力價的小鼠接受由每日以在50 μl的PBS中的20 μg的重組蛋白質的注射所組成的最終追加免疫，連續三天。最後一次注射後一天，收集小鼠淋巴組織。

DNA 免疫

透過使用微色素沉澱(micropigmentation)裝置的DNA紋身(DNA tatooing)，來免疫「MeMo®」小鼠。用20 μg的編碼目標抗原的質體DNA (pVAX1_ [目標名]，表1)，來執行DNA紋身免疫。用僅編碼人類目標的DNA，來免疫小鼠。對於PD-L1免疫，在藉由用0.5 mg的抗CD25抗體PC61.5 (Bioceros)注射小鼠，來破壞耐受性的免疫開始前四天，耗盡Treg細胞。在第0、3、6、14、17、28和31天將小鼠免疫。在第35天收集小鼠血清，以確定血清力價。具有低血清反應性的小鼠接受追加免疫和血清分析的額外循環。每個循環由兩次的每週免疫，接著一週後收集用於力價分析的血清所組成。顯示出對表現人類和獼猴目標的細胞有強血清反應性的小鼠接受最終追加免疫，接著3天後收集淋巴組織。

血清力價的確定

藉由使用表現人類和獼猴目標抗原的細胞系的FACS分析，來確定血清力價。

藉由 RT-PCR ，自經免疫的小鼠的組織產生「免疫」噬菌體 Fab 庫

自小鼠移除脾臟和引流淋巴結，對其觀察到對各自目標蛋白質的顯著體液反應。

自脾臟和腹股溝(inguinal)淋巴結產生單一細胞懸浮液，隨後將這些組織裂解於Trizol LS試劑(Thermo Scientific c＃10296028)中並儲存在-80°C直至使用。

從成功免疫的小鼠中，腹股溝淋巴結被用於「免疫」噬菌體抗體全集的構築。從淋巴組織的單一細胞懸浮液中萃取RNA。在使用IgG-CH1特異性引子的RT反應中，使用1 μg的總RNA。基本上如Marks等人所述(J Mol Biol.1991 Dec 5; 222 (3)：581-97)，接著使用內部(in-house)適應的VH特異性引子，將所得的cDNA用來放大編碼VH的cDNA的多株池(polyclonal pool)。然後將所得的PCR產物選殖到噬質體載體(phagemid vector)中(第6圖)，以在噬菌體上展示Fab片段，如de Haard等人(J Biol Chem.1999 Jun 25; 274 (26)：18218-30)所述，除了輕鏈(第1A和1B圖)對於每個抗體是相同的且由載體編碼。連接後，噬質體用於將大腸桿菌TG1細菌轉形，且將經轉形的細菌塗盤至含有安比西林(ampicillin)和葡萄糖的LB-瓊脂盤上。所有的噬菌體庫含有大於 4x10⁵ 個轉形體(transformant)，且具有大於90%的***頻率。生長隔夜後，收穫細菌並根據已建立的規章(protocol)，用於製備噬菌體(de Haard et al., J Biol Chem.1999 Jun 25; 274 (26): 18218-30)。

使用重組蛋白質，自「免疫」噬菌體 Fab 庫選擇攜帶特異性結合至人類目標蛋白質的 Fab 片段的噬菌體

使用在被直接塗佈的重組蛋白質上的噬菌體展示，使產生的噬菌體Fab庫用於選擇目標特異性Fab。對於PD-L1，使用huPD-L1-His (Sinobiological；目錄編號10084-H08H)、huPD-L1-Fc (R&D；目錄編號156-B7)和maPD-L1-His (Sinobiological；目錄編號90251-C08H)。對於PD-1，使用huPD-1-Fc (R&D；目錄編號1086-PD)和huPD-1生物素(BPS bioscience；目錄編號71109)。

對於以非生物素化的重組蛋白質的選擇(「淘選選擇」)，將蛋白質塗佈至MAXISORP^TM ELISA盤的孔上。用在PBS中的4%乾燥脫脂牛奶 (Marvel)，阻斷MAXISORP^TM ELISA盤。也用4%的Marvel來阻斷噬菌體Fab庫，且當使用Fc標記的重組蛋白質時，在噬菌體庫被添加至經塗佈的抗原之前，也使用過量的人類IgG，以耗盡Fc區結合物(binder)。

在振盪條件下，噬菌體庫與經塗佈的蛋白質的培養於室溫執行1.5小時。然後用PBS中的0.05% Tween-20洗滌盤子或試管(tube)十五次，接著用PBS洗滌5次。使用胰蛋白質酶(trypsin)洗脫(elute)結合的噬菌體20分鐘，之後用AEBSF胰蛋白質酶抑制劑(Sigma)中和胰蛋白質酶。

對於用生物素化之蛋白質的選擇(「溶液內選擇(in-solution selections)」)，將中性親和素(neutravidin)塗佈在MAXISORP^TM ELISA盤的孔上。用在PBS中的1% 酪蛋白(casein)阻斷MAXISORP^TM ELISA盤。平行地，在含有過量人類IgG的PBS中的0.5% 酪蛋白中，在分開的Eppendorf管中，將生物素化之蛋白質和噬菌體Fab庫在阻斷30分鐘。在那之後，將經阻斷的噬菌體和生物素化之蛋白質混合，且在室溫下培養2小時。在那之後，將混合物加至經中性親和素塗佈的孔中20分鐘，以捕捉結合至生物素化之蛋白質的噬菌體Fab顆粒。然後，用在PBS中的0.05% Tween-20，來洗滌盤子十五次，接著用PBS洗滌5次。用胰蛋白質酶洗脫結合的噬菌體20分鐘，之後用AEBSF胰蛋白質酶抑制劑(Sigma)中和胰蛋白質酶。

將兩種選擇策略(「淘選和溶液內」)的洗脫液(eluate)加到大腸桿菌TG-1，且在37°C下培養，以用於噬菌體感染。隨後，將感染的細菌塗盤至含有安比西林(ampicillin)和葡萄糖的瓊脂盤上，且在37°C下培養隔夜。 根據目標，在ELISA或FACS中篩選來自選擇輸出的單一選殖體的目標結合。

使用穩定表現目標蛋白質的細胞，自「免疫」噬菌體 Fab 庫中，選擇攜帶特異性結合至人類目標的 Fab 片段的噬菌體

在表現各自目標的細胞上使用噬菌體展示，來選擇自經目標免疫的小鼠所產生的噬菌體Fab庫。表現PD-1或PD-L1(表1)的穩定細胞系用於第一輪選擇。用PBS中的10% FBS，來阻斷細胞。阻斷之後，將挽救的噬菌體與阻斷的細胞一起培養。細胞加上噬菌體在4°C培養1小時。使用1 ml的在PBS中的10% FBS，來執行洗滌細胞(5次)。用胰蛋白質酶洗脫結合的噬菌體20分鐘，之後用AEBSF胰蛋白質酶抑制劑(Sigma)，來中和胰蛋白質酶。將洗脫液加到大腸桿菌TG-1，且在37°C培養，以用於噬菌體感染。隨後，將感染噬菌體的細菌塗盤在含有安比西林和葡萄糖的瓊脂盤上，且在37°C培養隔夜。

對於PD-L1，使用與第一輪選擇相同的規章，以進行用內源性表現huPD-L1的ES-2細胞的第二輪選擇。選擇後，篩選單一選殖體在FACS中的目標結合。

在 ELISA 中篩選出目標特異性 Fab 選殖體

在單一選殖體中，如所述地(J Mol Biol.1991 Dec 5; 222 (3)：581-97; J Biol Chem.1999 Jun 25; 274 (26)：18218-30)，製備可溶性Fab。於PBS (阻斷緩衝液)中的4%乾燥脫脂奶(Marvel)中，以1：5稀釋這些，並在ELISA中測試與以用於選擇的相同抗原塗佈的孔的結合。藉由用在阻斷緩衝液中以1：1000稀釋的抗myc抗體(Roche；目錄編號：11667203001)染色，接著用在阻斷緩衝液中以1:5000稀釋的HRP共軛的抗小鼠IgG抗體(Jackson Immunoresearch；目錄編號： 715-035-150)，來偵測結合的Fab。藉由用在阻斷緩衝液中以1：5000稀釋的HRP共軛的單株抗M13抗體(GE healthcare；目錄編號27-9421-01)染色，來偵測結合的噬菌體。每次抗體染色後，用PBS-T (PBS-0.05% v/v Tween 20)來洗滌孔。透過TMB/H₂ O₂ 染色，來視覺化結合的二次抗體(secondary antibody)，並且透過OD450nm測量來量化染色。當OD450nm高於用負對照Fab獲得的背景訊號至少三倍時，認為選殖體結合目標。

對所有目標特異性選殖體之編碼VH的cDNA定序。然後，基於序列相同度(sequence identity)和分子集團分析(cluster analysis)的獨特選殖體的選擇，於經由在細胞上表現的PD-L1的結合之FACS中分析，如下文對從細胞選擇輸出獲得的選殖體的描述。

在 FACS 中篩選目標特異性 Fab 選殖體

在表現各自目標的細胞上所選擇的單一選殖體中，如(J Mol Biol.1991 Dec 5; 222 (3):581-97; J Biol Chem.1999 Jun 25; 274 (26):18218-30)所述，製備可溶性Fab。透過與1：5稀釋的Fab樣品和1：1000稀釋的抗myc抗體(Gentaur；目錄編號04-CMYC-9E10)的混合物一起培養於FACS緩衝液(PBS中的0.5% HI-FBS)中，測試這些在FACS中與表現人類和獼猴目標 (表1)的細胞的結合。透過與在FACS緩衝液中以1:500稀釋的APC共軛山羊抗小鼠IgG抗體(BD Bioscience；目錄編號550826)一起培養，來偵測結合的Fab/抗myc複合體。每次抗體培養之後，用FACS緩衝液洗滌孔三次。使用FACS Accuri C6儀器(Becton和Dickinson)，來分析經染色的細胞。當平均螢光強度高於用負對照Fab獲得的背景訊號至少三倍時，選殖體被認為是陽性。

實施例 3

對以 IgG 形式的 huPD-L1 及 huPD-1 特異性 Fab 選殖體的特徵 (characterization)

將人類 PD-L1 及 PD-1 特異性 Fab 再選殖 (recloning) 至 IgG 形式

根據標準化的分子生物學技術，使用Sfi1-BstEII消化和經消化的cDNA池的連接，將基於CDR3序列和VH生殖的差異的獨特選殖體的選擇，其結合在細胞上表現的人類和獼猴目標蛋白質，再選殖到IgG表現質體，例如MV1452 (第7圖)，其含有共同輕鏈(第1圖)。

含有人類 PD-L1 或人類 PD-1 特異性 Fab 和破傷風毒素特異性 Fab 的雙特異性 IgG 的表現

藉由瞬時共轉染兩個編碼具有不同VH域的IgG的質體，來產生雙特異性抗體，使用專有的(proprietary)CH3工程化技術，以確保有效率的雙特異性抗體的異質二聚體化和形成。存在於含有重鏈的兩個質體上的共同輕鏈也在相同的細胞中共轉染。在我們的共同未決的申請中(例如，WO2013/157954和WO2013/157953；透過引用併入本文)，我們已經揭露從單一細胞產生雙特異性抗體的方法和手段，由此提供有利於雙特異性抗體的形成而不是單特異性抗體的形成的手段。這些方法也可有利地用於本發明中。具體而言，產生基本上僅雙特異性全長IgG分子的較佳突變是在第351和366位的胺基酸取代，例如在第一CH3域中的L351K和T366K (根據EU編號編號)(「KK變異體」重鏈)和在第351和368位的胺基酸取代，例如在第二CH3域中的L351D和L368E(「DE變異體」重鏈)，或反之亦然(第2圖)。先前在我們的共同未決的申請中，顯示帶負電荷的DE變異體重鏈和帶正電荷的KK變異體重鏈優先配對，以形成異質二聚體(所謂的「DEKK」雙特異性分子)。由於相同重鏈之間CH3-CH3界面中帶電殘基之間的強烈斥力，幾乎不會發生DE變異體重鏈(DE-DE同質二聚體)或KK變異體重鏈(KK-KK同質二聚體)的同質二聚體化。

將編碼上述結合人類PD-L1和PD-1的抗體的VH基因選殖至編碼帶正電的CH3域的MV1452 IgG表現載體中。將以破傷風毒素(tetanus toxin，TT)為目標的抗體(第8圖)選殖至編碼帶負電的CH3域的MV1377 IgG表現載體(第9圖)中。在振盪器平台上，懸浮生長適應的293F Freestyle細胞培養於T125燒瓶中，直至密度為3.0x10⁶ 個細胞/ml。在24深孔盤的每個孔中，以0.3至0.5x10⁶ 個活細胞/ml的密度接種細胞。用兩個編碼不同抗體的質體的混合物，瞬時轉染細胞，選殖到專有載體系統中。轉染後7天，收穫細胞上清液並通過0.22 μM過濾器(Sartorius)來過濾。將無菌上清液儲存在4°C直至抗體的純化。

雙特異性 IgG 的純化

使用蛋白質A親和層析，以小規模(＜500 μg)執行IgG的純化。使用過濾，在24孔過濾盤中，在無菌條件下執行小規模純化。首先，將培養基的pH調整至pH 8.0，隨後將含有IgG的上清液與蛋白質A Sepharose CL-4B珠(50% v/v)(Pierce)一起在25°C、振盪平台上以600 rpm，培養2小時。接下來，透過過濾，來收穫珠子。用pH 7.4的PBS洗滌珠子兩次。然後用0.1M檸檬酸鹽緩衝液在pH3.0洗脫結合的IgG，且立刻使用pH 8.0的Tris，來中和洗脫液。使用多屏Ultracel 10多盤(multiscreen Ultracel 10 multiplate)(Millipore)，藉由離心，來執行緩衝液交換。最後，在pH7.4的PBS中收穫樣品。使用Octet測量IgG濃度。蛋白質樣品儲存於4°C。

使用 Octet 執行 IgG 的量化

為了確定純化的IgG的量，使用總人類IgG (Sigma Aldrich，目錄編號No. I4506)作為標準，使用蛋白質A生物傳感器(Forte-Bio，根據供應商建議)，藉由Octet分析，來確定抗體濃度。

huPD-L1xTT 和 huPD-1xTT 雙特異性 IgG 的特異性分析

測試這些雙特異性抗體在FACS中，與表現相關的人類和獼猴同源基因(表1)的穩定細胞系及野生型(wt)細胞的結合。因此，收穫細胞並在FACS緩衝液(PBS/0.5% BSA/0.5 mM EDTA)中稀釋至10⁶ 個細胞/ml。將1至2x10⁵ 個細胞加到U底96孔盤中的每個孔。在4°C以300 g，將細胞離心2分鐘。透過將盤子倒置，來丟棄上清液。將50 μl之濃度為10 μg/ml的每個IgG樣品加入，且在冰上培養1小時。將細胞離心一次，移除上清液且用150 μl的FACS緩衝液洗滌細胞兩次。將50 μl的1：400稀釋的山羊抗人類IgG PE (Invitrogen) 加入，且在黑暗中，於冰上培養30分鐘。加入FACS緩衝液後，將細胞離心一次，移除上清液且用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。在HTS設置中，在FACSCanto流式細胞儀(Becton和Dickinson)上分析細胞。藉由測量染色的細胞族群的平均螢光強度(mean fluorescence intensity，MFI)，來評估抗體與細胞的結合。當MFI至少是用(負對照)非結合抗體(針對破傷風類毒素(tetanus toxoid))染色的相同細胞族群的5倍時，抗體被認為結合它們的目標。

以配位體阻斷能力，將存在於 PD-L1xTT 和 PD-1xTT 雙特異性 IgG 中的 huPD-L1 和 huPD-1 特異性 Fab 臂分類

測試huPD-L1和huPD-1結合選殖體的阻斷PD-L1與PD-1的交互作用的能力。對PD-L1 Fab臂，也評估阻斷PD-L1和CD80之間的交互作用的能力。因此，分別以1和3 μg/ml，將PD1-Fc (R＆D系統；目錄編號1086-PD)或CD80-Fc (R＆D系統；目錄編號140-B1)塗佈至maxisorp盤。用在PBS中的4% BSA，來阻斷經塗佈的孔。在那之後，在0.15至20 μg/ml的範圍的IgG存在或不存在的情況下，將0.55 μg/ml的生物素化之PD-L1 (BPS bioscience；目錄編號71105)加入。用在阻斷緩衝液中以1:2000稀釋的HRP共軛的鏈黴親和素(streptavidin)(BD bioscience；目錄編號554066)，來偵測結合的生物素化之PD-L1。在每次培養步驟之後，用PBS-T (PBS-0.05% v/v Tween 20)洗滌ELISA盤三次。藉由TMB/H₂ O₂ 染色，使結合的鏈黴親和素可視化，且藉由OD_450nm 的測量來量化染色。相較於將TT特異性競爭抗體加入的對照，當在IgG (PD-L1xTT或PD-1xTT)濃度為10 µg/ml時，ELISA訊號降低超過70%時，選殖體被認為阻斷PD-1與PD-L1的交互作用。參見第10圖的以PD-1xTT或PD-L1xTT雙特異性分子測試的PD-1和PD-L1抗體組的代表性選擇所獲得之結果。

存在於 PD-L1xTT 和 PD-1xTT 雙特異性 IgG 中的 huPD-L1 和 huPD-1 特異性 Fab 臂的親和力排名

在FACS中顯示結合各自的人類和獼猴同源基因(ortholog)的雙特異性抗體，在FACS中排名在兩者同源基因的明顯親和力上。因此，收穫表現各自同源基因(表1)的穩定細胞系，並在FACS緩衝液(PBS/0.5% BSA/0.5 mM EDTA)中稀釋至10⁶ 個細胞/ml。在4°C，以300g將細胞離心2分鐘。藉由將盤子倒置，來丟棄上清液。將50 μl的每個IgG樣品，其為10至0.01 μg/ml的範圍的一11步驟2倍稀釋序列，加入並在冰上培養1小時。將細胞離心一次，移除上清液並用150 μl的FACS緩衝液洗滌細胞兩次。將50μl的1：400稀釋的山羊抗人類IgG PE (Invitrogen)加入，且在黑暗中在冰上培養30分鐘。將FACS緩衝液加入後，將細胞離心一次，移除上清液並用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。在HTS設置中，在FACSCanto流式細胞儀(Becton和Dickinson)上分析細胞。藉由測量染色的細胞族群的平均螢光強度(MFI)，來評估抗體與細胞的結合。當MFI是用(負對照)非結合抗體(針對破傷風類毒素)染色的相同細胞族群的至少5倍時，抗體被認為結合它們的目標。

PBMC 單離

從膚色血球層(buffy coat)(Sanquin)獲得人類全血並用PBS以1：1稀釋。在室溫(room temperature，RT)下回溫的17.5 m Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences目錄編號17-1440-02)，來填充Leucosep管(Greiner Bio-One目錄編號227 290)。 Ficoll-Paque Plus在室溫下以1000xg旋轉下來30秒。將30ml的稀釋全血倒在上面。將試管在室溫以1000xg旋轉10分鐘，收集單核PBMC界面，在PBS中洗滌兩次並重新懸浮於250 μl的PBS中。計數PBMC並在組織培養基 (有10% FCS的DMEM)中重新調整至1x10⁶ 個細胞/ml，並透過加入等體積的冰冷的冷凍培養基(80% 培養基/20% DMSO)來冷凍下來。以1 ml等分試樣(aliquot)，將細胞儲存於-150°C，直至進一步使用。

SEB 測定

藉由使用經金黃色葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcus enterotoxin B，SEB)刺激的PBMC，來決定雙特異性抗體的功能活性。SEB特異性活化表現Vβ3、12、14、15、17和20T細胞受體鏈的T細胞。將來自3個捐贈者的PBMC解凍、洗滌、計數並重新懸浮於培養基(RPMI1640加上10% 熱失活的FBS)中至2x10⁶ 個細胞/ml的濃度。在SEB (2000或125 ng/ml)的存在下，將細胞接種於平底96孔盤(2x10⁵ 個細胞/孔)中。將從20 μg/ml開始的抗體序列稀釋液加入。每盤含有作為參考對照之序列稀釋的陰性(TT特異性PG1337)和陽性對照抗體(ipilumumab、nivolumab(PD-1xPD-L1)、LAG3.5(LAG-3xPD-1)。在測試細胞激素分泌和/或抗原的細胞表面表現之前，在37°C、95%相對濕度的5% CO₂ 下，刺激細胞3天。

細胞激素測定

ELISA：在不同時間刺激T細胞或PBMC後，將盤子離心並移除培養基。根據製造商的說明書(Perkin Elmer)，藉由AlphaLISA，來偵測細胞激素的量。基於標準曲線計算濃度。

Luminex測定：用於決定體外細胞激素的產生的另一方法是使用由eBioscience開發的multiplex分析。根據製造商的說明書，在培養物上清液中測量IFN-γ、IL-2和TNF-α的量。藉由eBioscience分析軟體，來分析結果。

參考抗體

抑制PD-1和PD-L1的功能的抗體是本領域已知的。根據公開的資訊，構築單株二價抗體且在CHO-S細胞中表現。抗PD-1抗體Nivolumab是基於CA 02607147中所揭露的資訊而產生。抗PD-L1抗體MPDL3280A是基於WO2010077634A1(Genentech Inc)中所揭露的資訊而產生。

PD-1/PD-L1 阻斷報導者測定 (blockade reporter assay)

所使用的PD-1/PD-L1阻斷報導者測定是由Promega開發，且基於雙細胞系統；表現PD-L1的CHO細胞和過度表現PD-1的T細胞活化子及Jurkat/NFAT-RE報導者細胞系。使用Promega的解凍和使用形式，來執行PD-1/PD-L1阻斷報導者測定。在14.5 ml的細胞恢復培養基(Cell Recovery Medium)(含有10% FBS的DMEM/F12)中解凍表現PD-L1的細胞(目錄編號C187103)。接著，將50 μl的細胞懸浮液加到96孔半區域盤(Corning，目錄編號3688)的內孔。將盤子在37°C、5% CO、95%相對濕度下，培養隔夜。隔天，移除培養基並將以序列稀釋(起始濃度10 μg/ml)的20 μl之在測定培養基(含有4% FBS的RPMI 1640)中的測試抗體加至每個孔。每盤含有作為參考對照之序列稀釋的陰性(TT特異性PG1337)和陽性對照抗體(一個對照是基於Nivolumab，在本文稱為5C4，而一個對照是基於Atezolizumab，在本文稱為MPDL3280A或YW243.55.S70)。在5.9 ml的測定培養基中解凍PD-1效應細胞(目錄編號C187105)，且將20 μl的細胞懸浮液加至每個孔。於95%相對濕度、在37°C、5% CO、將盤子培養6小時或隔夜。隔天，加入40 μl的螢光素酶(Bio-Glo螢光素酶測定系統，目錄編號G794L)，並使用BioTek Synergy 2多模式微盤讀取儀，測量螢光素酶活性的量。與負對照抗體相比，測量效力(potency)作為螢光素酶活性。

實施例 4

篩選 PD1xPD-L1 抗體組

將來自PD-1和PD-L1抗體組的VH再選殖到帶電的工程化Fc沉默載體中，使得一但表現抗體重鏈，就強制重鏈的異質二聚體化，導致轉染之後，雙特異性抗體的產生。在MV1625載體中選殖PD-1 Fab臂；而在MV1624載體中再選殖PD-L1 Fab臂。PD-1和PD-L1抗體與MF1337，一以TT為目標的Fab臂組合，以單價的方式來產生以雙特異性抗體為目標的PD-1或PD-L1。在PD-1/PD-L1阻斷報導者測定中以半對數序列滴定(起始濃度10 μg/ml)測試雙特異性抗體，以阻斷效力對抗體排名。可對以單價形式的PD-L1抗體組排名，而以單價形式的PD-1抗體組顯示出不足在PD-1/PD-L1阻斷報導者測定中排名的阻斷能力。因此，PD-1抗體以二價形式產生，且在PD-1/PD-L1阻斷報導者測定中再測試。

基於活性數據，從PD-1或PD-L1抗體組中選擇抗體，用於後續的PD1xPD-L1雙特異性篩選。所選的候選物(candidate)在報導者測定中的活性分別顯示在表2和3中。PD-1 Fab組由三個抗體簇即A、B和C，內的功能活性變異體和非功能變異體D所構成，而PD-L1 Fab組由衍生自11個抗體簇的抗體所構成。PD-1和PD-L1抗體組都包含一個功能失活的抗體。

以24孔形式與純化之IgG產生總共120種PD-1xPD-L1雙特異性抗體，其包含10種不同的PD-1 Fab臂和12種不同的PD-L1 Fab臂。在PD-1/PD-L1-luc報導者系統中，測試所有抗體在序列滴定中它們誘導劑量依賴性螢光素酶表現的能力。Nivolumab或MPDL3280A被包含作為參考抗體。第11圖顯示了顯示出多種反應的雙特異性抗體的選擇的螢光素酶誘導。

表4顯示了與MPDL3280A相比之雙特異性抗體的百分比活性。含有一個非功能性Fab臂的PD-1xPD-L1組合最不有效。再者，最有效的PD-L1 Fab與最有效的PD-1 Fab的組合未產生最有效的雙特異性PD-1xPD-L1抗體。一些PD-L1 Fab臂，如MF5561、MF5442和MF5382與各種PD-1 Fab臂一起是高度有效，而例如MF5359則不然。具有最高活性的PD-1 Fab臂與幾個PD-L1 Fab臂一起誘導了有效的活性。

在SEB測定中以序列滴定，來測試最有效的PD-1xPD-L1雙特異性抗體。第12圖顯示了對用2 μg/ml SEB刺激的三個捐贈者執行的SEB測定的代表性實驗。所有測試的PD-1xPD-L1組合顯示IL-2和γ-IFN的劑量相關誘導(未顯示)。獲得的最大誘導的IL-2量在50至100 ng/ml的範圍內。與nivolumab相比，大部分的PD-1xPD-L1雙特異性抗體顯示出更高的效力。低於10 μg/ml，與ipilumumab相比，多數的PD-1xPD-L1雙特異性抗體更有效。因此，PD-1xPD-L1抗體在刺激T細胞反應方面非常有效。

實施例 5

PD-1xPD-L1 Fab 變異體的選殖和表現

將總共15個PD-1和25個PD-L1 Fab臂組合，以產生65種雙特異性抗體。Fab臂的序列描繪於第3和13圖中。

將來自PD-L1和PD-1 Fab組的65個VH區再選殖到工程化表現載體中，使得抗體的表現強制重鏈的異質二聚體化，導致轉染後產生雙特異性抗體。將PD-1 Fab臂的VH區選殖到載體MV1625中，而將PD-L1 Fab臂的VH區選殖到載體MV1624中。兩種載體都在IgG蛋白質的CH2和CH3編碼區中具有額外的突變：MV1625和MV1624都含有L235G和G236R取代，其廢止所得抗體的(abrogate)Fcγ受體和C1q的交互作用。MV1625也在CH3域中含有胺基酸取代L351D和L368E(「DE變異體」重鏈)，而MV1624在CH3域中含有胺基酸取代L351K和T366K(「KK變異體」重鏈)。

選殖至相關載體後，藉由PCR來確認DNA序列。為所有構築體製備Midiprep DNA。將不同對的載體-一個攜帶抗PD-1選殖體的載體和另一個攜帶抗PD-L1選殖體的載體-以二重複(in duplo)共同轉染到FreeStyle 293-F細胞中，以產生雙特異性蛋白質(總共65個)。然後根據製造商的說明書，使用Zeba脫鹽管柱，來純化在24孔盤的每個孔中產生的IgG且進行緩衝液交換；然後使用Nanodrop藉由OD280，來量化蛋白質產量(yield)。

PB編號和其MF組成的概述。

實施例 6

藉由 ELISA ，來確認 PD-1 和 PD-L1 Fab 的抗原結合

限制 PD-1 或 PD-L1 的抗原 ELISA

為了確認存在於雙特異性IgG中的PD-1和PD-L1 Fab的結合，執行抗原滴定ELISA。在此ELISA中，將PD-1或PD-L1抗原的序列稀釋的塗佈至96孔盤。然後將盤子與測試抗體一起培養，使用與山葵過氧化氫酶(horseradish peroxidase，HRP)共軛的二級小鼠抗人類抗體，來偵測前述測試抗體，山葵過氧化氫酶將無色基質轉化為易於看見的染料。在所有盤子上包含陰性TT特異性對照抗體PG1337。在用PD-1蛋白質塗佈的所有盤子上包含基準抗huPD-1抗體5C4 (基於Nivolumab)作為陽性對照，且在用PD-L1蛋白質塗佈的所有盤子上包含基準抗huPD-L1抗體YW24​​3.55.S70 (基於Atezolizumab)作為陽性對照。

為此，在盤子的每個欄(column)中，以在PBS中從10 µg/mL稀釋至0.014 µg/mL的3倍7步序列稀釋的人類PD-L1-Fc (R＆D系統，目錄編號156-B7)或人類PD-1-Fc (R＆D系統，目錄編號1086-PD)，在4°C來塗佈96孔Nunc Maxisorp盤隔夜。隔天，用300 µL的PBST洗滌ELISA盤三次，並藉由以PBS中的2% BSA，來填充孔且在室溫培養1小時來阻斷ELISA盤。將盤子清空，且以在PBS-2% BSA中5 µg/mL，來將PD-1xPD-L1抗體和對照抗體PG1337、5C4和YW243.55.S70加入(50 µL/孔)，每個抗體一欄。在室溫培養1小時後，在PBS-2%BSA中加入以1：2000稀釋的與HRP共軛的小鼠抗人類IgG (BD，目錄編號555788)形式的50 µL二級抗體之前，用300 µL PBST洗滌孔三次。在室溫培養1小時後，在PBS-2%BSA中加入比例1：1，每孔50μL的TMB過氧化物酶基質A (BD，目錄編號51-2506KC)和B (BD，目錄編號51-2607KC)之前，用300μL PBST洗滌孔三次，然後加入。最多10分鐘後，藉由以50 μL/孔，將1M的H₂ SO₄ 溶液加入，來終止反應。然後，用ELx808微盤讀取儀測量在450nM波長的光密度(optical density，OD)。

PD-1的限制性特異性人類IgG ELISA的結果顯示於第14圖中，而PD-L1的結果顯示在第15圖中。圖表顯示出藉由微盤讀取儀測量的經塗佈的抗原的增加濃度之在450nM的光密度(optical density，OD)。所有測試的Fab臂皆良好地結合至PD-1和PD-L1，且結合程度類似於基準抗體的程度，使得所有Fab臂適合用於雙特異性PD-1xPD-L1抗體中。

實施例 7

PD-1/PD-L1 阻斷報導者測定中的抗體的活性

在由美國Promega公司開發的生理相關的PD-1/PD-L1阻斷報導者分析中，體外測試所產生的雙特異性PD-1xPD-L1抗體的阻斷活性。此測定基於雙細胞系統，其中表現PD-L1和T細胞受體活化子(T­cell receptor activator) 的CHO細胞與過度表現PD-1的Jurkat/NFAT-RE報導者細胞系共培養。Jurkat T細胞含有可透過NFAT(活化的T細胞的核因子(nuclear factor of activated T cell))路徑來成為活化的螢光素酶報導者基因。PD-1與PD-L1的交互作用抑制此路徑的活化。然而，用針對PD-1或PD-L1的抗體，來阻斷PD-1/PD-L1的交互作用可活化NFAT路徑。因此，PD-1/PD-L1阻斷的程度越大，螢光素酶報導者基因的活化越強。為此，在加入過度表現PD-1的Jurkat/NFAT-RE報導者細胞之前，將每個抗體的序列稀釋加到表現PD-L1的CHO細胞中。

方法

PD-1/PD-L1 阻斷報導者測定

使用的PD-1/PD-L1阻斷報導者測定由Promega開發且基於雙細胞系統：表現PD-L1和T細胞活化子的CHO細胞及過度表現PD-1的Jurkat / NFAT-RE報導者細胞系。使用Promega的解凍和使用形式，來進行PD-1/PD-L1阻斷報導者測定。在14.5mL細胞回復培養基(含有10% FBS的DMEM/F12)中將表現PD-L1的細胞(目錄編號C187103)解凍。接著，將50 µL的細胞懸浮液加到96孔半區域盤(Corning，目錄編號3688)的內孔中。在37°C、5% CO₂ 、95%相對濕度下，將盤子培養隔夜。隔天，移除培養基，以連續稀釋(起始濃度10 µg/mL)，將20 µL的測試培養基(含有4% FBS的RPMI 1640)加到每個孔中。每個盤子含有針對破傷風類毒素的陰性抗體(PG1337)的連續稀釋和用作參考對照的陽性對照抗PD-L1抗體(YW243.55.S70；基於Atezolizumab)。在5.9 ml的測定培養基中解凍PD-1效應細胞(目錄編號C187105)，且將20 μl的細胞懸浮液加至每個孔。將盤子在37°C、5% CO、95%相對濕度下培養24小時。隔天，加入40 μl的螢光素酶(Bio-Glo螢光素酶測定系統，目錄編號G794L)，並使用BioTek Synergy 2多模式微盤讀取儀，測量螢光素酶活性的量。與陽性對照抗體YW243.55.S70相比，測量效力(potency)作為螢光素酶活性。

結果

24小時後的阻斷程度顯示於表6中，其中數據顯示出與未添加抗體的孔中所測量的活性相比之螢光素酶活性的相對誘導。基於相對於陽性對照抗PD-L1抗體YW24​​3.55.S70的曲線下面積(Area Under the Curve，AUC)來計算百分比活性。所有測試的雙特異性PD-1xPD-L1抗體顯示出明顯的阻斷活性。

實施例 8

PD-1xPD-L1 雙特異性 IgG 與抗原表現細胞的 FACS 結合

測試兩種PD-1xPD-L1雙特異性抗體與在穩定表現每個抗原的CHO細胞系上的PD-1和PD-L1的結合。用於此FACS的細胞系是CHO-huPD-L1、CHO-S-huPD-1和未轉染的CHO細胞(陰性細胞)。簡而言之，用增加濃度的雙特異性IgG、親本IgG或對照IgG，來對這些細胞系染色，然後用山羊抗人類IgG-PE來偵測。陽性對照為基準抗huPD-1抗體5C1(基於Nivolumab)和基準抗huPD-L1抗體YW243.55.S70(基於Atezolizumab)；陰性對照是抗破傷風毒素抗體PG1337。

為此，收穫穩定的CHO-huPD-L1細胞(MC0866)和CHO-S-huPD-1細胞(MC0617)，且在FACS緩衝液(PBS/0.5% BSA/2mM EDTA）中稀釋至10⁶ 個細胞/mL。在U底96孔盤(BD，目錄編號353910)中，將0.5至2x10⁵ 個細胞加到每個孔中。在4°C下以300g將細胞離心3分鐘。藉由將盤子倒置，來丟棄上清液。藉由添加200 μL之冰冷FACS緩衝液，來洗滌細胞。再次在4°C下以300g將細胞離心3分鐘，且如前所述丟棄上清液。將40 μL的每個IgG樣品(從10 µg/mL開始的3倍9步序列稀釋)加入，且在黑暗中將細胞培養於冰上30分鐘。然後直接加入200 µL之冰冷FACS緩衝液，來洗滌細胞兩次，接著在4°C下以300g離心3分鐘且移除上清液。藉由添加40 µL的山羊抗人類IgG-PE(3 µg/mL；Invitrogen；目錄編號H10104)且在黑暗中將盤子培養於冰上30分鐘，來執行二級抗體染色。再次用200 µL的冰冷FACS緩衝液，來洗滌細胞兩次，並重新懸浮於50至200 µL的FACS緩衝液中。在FACSCanto流式細胞儀(Becton和Dickinson)上，在高通量採樣器(high throughput sampler，HTS)設置中分析細胞。藉由測量染色的細胞族群的平均螢光強度(mean fluorescence intensity，MFI)，來評估抗體與細胞的結合。當MFI是用負對照抗體染色的相同細胞族群的至少5倍時，抗體被認為結合它們的目標。

結果

兩個雙特異性IgG與PD-L1和PD-1的結合及參考抗體的結合顯示在第16圖中。數據顯示出在用增加濃度的雙特異性IgG或對照IgG染色的PD-L1和PD-1表現CHO細胞上，藉由FACS偵測到的MFI。這些結果顯示，當在CHO細胞上表現時，兩個雙特異性IgG都辨認兩種目標，且結合程度與參考抗體的結合程度類似或更好。

實施例 9

PD-1xPD-L1 雙特異性 IgG 與活化的 T 細胞的 FACS 結合

使用人類活化 T 細胞的 FACS 結合測定

亦測試兩個PD-1xPD-L1雙特異性抗體與活化的T細胞上的PD-1和PD-L1的結合。簡而言之，用抗CD3抗體來塗佈96孔盤隔夜。然後將來自單一捐贈者的純化的T細胞加入且培養3天。3天後，收穫活化的T細胞並合併且用於FACS測定，以比較雙特異性IgG的結合與其親本單特異性二價IgG的結合。陽性對照是基準抗huPD-1抗體5C4、基準抗huPD-L1抗體YW243.55.S70；陰性對照是抗破傷風毒素抗體PG1337。

方法

T 細胞的純化

解凍來自健康捐贈者的周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，並逐滴加入9倍體積的培養基(有10% 熱失活(heat-inactivated，hi)FBS的RPMI1640）。在室溫以200g，將細胞離心10分鐘。將細胞沉澱物(pellet)重新懸浮於10mL培養基中，且藉由在95%相對濕度，於37°C、5% CO₂ 下培養隔夜，來允許細胞靜置。隔天，使用如製造商(Stem cell Technologies，目錄編號19051)所述的EasySep T細胞富含(pan CD3)純化程序，來分離T淋巴細胞。EasySep程序使用陰性選擇。簡而言之，在室溫下以200g，將PBMC離心10分鐘。以濃度為5x10⁷ 個細胞/mL，將細胞沉澱物重新懸浮於EasySep緩衝液中。將50 μL的EasySep人類T細胞富含雞尾酒(cocktail)加到每mL的細胞體積中，混合且允許在室溫培養10分鐘。用EasySep緩衝液將總體積調至2.5 mL，混合之後，將細胞懸浮液轉移到5 mL圓底Falcon管(BD Biosciences，目錄編號352235)。接著，將管子放到磁體中，使不需要的細胞部分(fraction)在室溫下與磁體結合5分鐘。接著，將管子倒置，且將純化的T細胞部分倒出至含有7.5 mL培養基的新管子中。藉由在室溫以200g離心10分鐘，來收穫細胞，之後以1x10⁶ 細胞/mL的濃度重新懸浮於培養基中。

FACS 結合測定

在測定開始的前一天，在4°C用5 µg/mL抗CD3 (clone OKT3, eBioscience，目錄編號16-0037-85)，來塗佈96孔平底盤(Cellstar，目錄編號655180)隔夜。隔天，用PBS洗滌培養盤兩次，且將100 µL的T細胞懸浮液加至每個孔(100,000個細胞/孔)。在37°C、5%CO₂ 將盤子培養3天。然後藉由使用多通道移液管輕輕地上下移液幾次，來收穫活化的T細胞。合併細胞，混合且以每孔0.2至5x10⁵ 個細胞，轉移至U底96孔FACS測定盤(BD，目錄編號353910)。

對於FACS分析而言，在4°C以300g將細胞離心3分鐘。藉由將盤子倒置，來丟棄上清液。藉由添加200 μL的冰冷FACS緩衝液，來洗滌細胞。在4°C以300g，再次將細胞離心3分鐘，且如前所述地丟棄上清液。將40 μL的每個雙特異性IgG、親本IgG或對照IgG樣品(從20µg/mL開始的8步驟半對數滴定)加入，且在黑暗中，將細胞在冰上培養30分鐘。然後，從直接加入200 µL的冰冷FACS緩衝液開始，接著在4°C以300g離心3分鐘且移除上清液將細胞洗滌兩次。藉由添加40 µL的山羊抗人類IgG-PE (3 µg/mL；Invitrogen，目錄編號H10104)且在黑暗中，將盤子培養在冰上30分鐘，來執行二級抗體染色。再次用200 µL的冰冷FACS緩衝液洗滌細胞兩次，且重新懸浮於50至200 µL的FACS緩衝液中。在FACSCanto流式細胞儀(Becton和Dickinson)上，在高通量採樣器(HTS)設置中分析細胞。藉由測量染色的細胞族群的平均螢光強度(MFI)，來評估抗體與細胞的結合。當MFI是用負對照抗體染色的相同細胞族群的至少5倍時，抗體被認為結合它們的目標。

結果

FACS結合測定的結果在第17圖中提供。數據顯示由FACS所偵測之用增加濃度的IgG染色的人類活化的T細胞的MFI。圖表比較了兩個雙特異性IgG及其親本IgG的結合，且顯示所有特異性IgG與活化的T細胞結合。雙特異性IgG的最大結合程度高於親本單特異性二價IgG和陽性對照IgG兩者的最大結合程度。

實施例 10

藉由 SPR 對 PD-L1 的抗 PD-L1 Fab 臂的親和力決定

使用表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)，來決定抗PD-L1 Fab臂之對PD-L1的親和力。為了避免親留力效應(avidity effect)，在僅具有一條對PD-L1特異的臂，即以單價形式的雙特異性IgG的背景下，測量親和力。

為了決定抗PD-L1 Fab臂與抗原結合的動力學，使用用BIAcore T100的表面電漿共振(SPR)。使用在pH5.0的NHS/EDC化學(NaAc緩衝液)、2 µg/ml的抗原濃度和10 µl/min的流速，以約200共振單位(resonance unit，RU)的程度，將重組、純化、Fc標記的人類PD-L1 (R＆D Systems，目錄編號156-B7-100)耦合(couple)至CM5傳感器晶片的流動池(flow cell，FC)2 (FC1作為用於相減的空白且被活化，然後直接使用乙醇胺來失活)。然後在以30µl/分鐘運行的動力學中，以不同濃度(100nM和HBS中的序列2倍稀釋，6稀釋)在FC1和2的表面上運行由抗PD-L1 Fab臂和無關的Fab臂所構成的雙特異性IgG。無關的Fab臂對PD-1是特異的。使用在水中之50mM HCl (15 µl，以流速10 µl/min)的脈衝，來執行再生。使用BIAevaluation軟體，來評估獲得的傳感圖，且決定動力學結合和解離速率常數。

在幾天在不同尺寸的不同表面上，執行幾次測量。不同的測量給出了非常類似的結果，強調(underscore)了它們的有效性(validity)。所有測量均在25°C下進行。

結果

表7中提供了親和力決定的結果，其顯示所有測試的抗PD-L1 Fab臂具有良好的親和力。

實施例 11

透過 PD-1xPD-L1 抗體之 PD-L2 阻斷

雖然已知針對PD-1和PD-L1的治療性抗體在癌症治療中是有效的，但PD-L2在抗癌免疫中的角色目前尚不清楚。藉由上調PD-L2，PD-L1阻斷可潛在地促進腫瘤對治療的抗性。由於PD-L1和PD-L2與PD-1的大部分重疊區交互作用，所以預期阻斷PD-1和PD-L1之間的交互作用的抗PD-1抗體也會阻斷PD-1和PD-L2之間的相互作用。因此，決定確定幾種PD-1/PD-L1雙特異性抗體是否可以阻斷PD-1/PD-L2路徑。

在基於雙細胞系統：表現PD-L2和T細胞受體激活劑的CHO細胞及過量表現PD-1的Jurkat/NFAT-RE報導者細胞系之由Promega所開發的生理上相關的PD-1/PD-L2阻斷報導者測定中，體外測試此阻斷活性。Jurkat T細胞含有可透過NFAT(活化的T細胞的核因子(nuclear factor of activated T-cells))路徑，來成為活化的螢光素酶報導者基因。PD-1與PD-L2的交互作用抑制此路徑的活化。然而，用針對PD-1或PD-L2而不是PD-L1的抗體，來阻斷PD-1/PD-L2與的交互作用可活化NFAT路徑。這意味著PD-1/PD-L2阻斷程度越大，螢光素酶報導者基因的活化越大。

使用Promega的解凍和使用形式，來執行PD-1/PD-L2阻斷報導者測定。在14.5ml細胞恢復培養基(含有10% FBS的DMEM/F12)中，將PD-L2表現細胞(目錄編號CS187127)解凍。接下來，將100 µl的細胞懸浮液加到兩個96孔測定盤(Costar，目錄編號3917)的內孔中。在95%相對濕度，於37°C、5% CO₂ ，將盤子培養隔夜。隔天，移除培養基，且以序列稀釋(起始濃度25 µg/ml)，將在測定培養基(含有4% FBS的RPMI 1640)中之40 µl的測試抗體加到每個孔。每個盤子含有作為參考對照之陰性對照(RSV G特異性抗體PG2708)和陽性對照(基於Nivolumab的抗PD-1治療性抗體，在本文中稱為5C4)的連續稀釋。在5.9 ml測定培養基中，將PD-1效應細胞(目錄編號CS187105)解凍，且將40 µl細胞懸浮液加到每個孔。在95%相對濕度、於37°C、5%CO₂ ，將盤子培養6小時。然後，將80μl的Bio-Glo試劑(Bio-Glo TM螢光素酶測定系統，目錄編號G7941、G7940) 加入，且使用BioTek Synergy 2 多模式微盤讀取儀測量螢光素酶活性的量。誘導倍數計算為相對於在沒有抗體的孔中測量的螢光素酶活性之誘導後的螢光素酶活性。

結果

測試的兩個PD-1xPD-L1雙特異性IgG能夠減少PD-1和PD-L2之間的交互作用(第18圖18)。這提供了對PD-1/PD-L2路徑治療的腫瘤抗性被這些抗體抵消的優點。

陰性對照抗RSV G抗體PG2708無法防止PD-1和PD-L2之間的交互作用。

實施例 12

透過 PD-1xPD-L1 抗體之 CD80 的阻斷

近年來已經廣泛研究了免疫抑制性PD-1/PD-L1路徑，且阻斷PD-1或PD-L1的治療性抗體是針對癌症的有效治療。免疫抑制也被認為是透過PD-1與其替代配位體PD-L2之間的交互作用和透過PD-L1結合至CD80 (B7-1)而誘導的。由於PD-L1上的CD80結合位似乎與PD-1結合位重疊，因此大多數商業抗PD-L1抗體已顯示阻斷PD-L1與PD-1和CD80的交互作用。然而，一種先前技術抗體(MIH3)似乎阻斷PD-1：PD-L1交互作用，但不是CD80：PD-L1交互作用 (Butte et al，2008)。因此，我們決定測試我們的雙特異性抗體是否能夠阻斷PD-L1與PD-1及CD80的交互作用。

在本實施例中，於PD-L1阻斷的ELISA中，測試雙特異性抗體MF7686xMF7703的阻斷活性，亦包含親本抗PD-1 (PG7686)和抗PD-L1 (PG7703) IgG，因為不能直接測試雙特異性抗體(MF7686xMF7703)，由於其對PD-1和PD-L1的特異性。將這些親本IgG阻斷PD-L1與PD-1或CD80的交互作用的能力與抗PD-1基準抗體5C4 (基於Nivolumab)和抗PD-L1基準抗體YW243.55.S70 (基於Atezolizumab)的能力進行比較。在每個盤子上使用抗RSV G抗體PG2708作為陰性競爭對照。

就此ELISA而言，將PD1-Fc (R＆D系統；目錄編號1086-PD)或CD80-Fc (R＆D系統；目錄編號140-B1)分別以1和3 µg/ml塗佈至maxisorp盤。用在PBS中之4% BSA來阻斷塗佈的孔。在那之後，在PBS中的2% BSA中稀釋之在0.08至10 µg/ml (盤中的最終濃度)範圍內的IgG存在或不存在下，將加入0.55 µg/ml的生物素化之PD-L1 (BPS bioscience；目錄編號71105)。用在PBS中的2%BSA中以1：2000稀釋的HRP共軛的鏈黴親和素(BD bioscience：目錄編號554066)，來偵測結合的生物素化之PD-L1。在每次培養步驟之後，用PBS-T (PBS-0.05% v/v Tween 20)洗滌ELISA盤三次。藉由TMB/H₂ O₂ 染色，使結合的鏈黴親和素可視化，且藉由測量在450nm的光密度(optical density，OD)，來量化染色。

結果

在PD-1/PD-L1競爭測定中，不可能決定雙特異性抗體阻斷PD-L1：PD-1交互作用的能力(第19圖，左圖)。然而，當以二價IgG形式測試時，雙特異性抗體(MF7686 and MF7703)的兩個臂均阻斷PD-L1：PD-1交互作用。PD-L1親本IgG PG7703比基準PD-L1抗體(YW243.55.S70)更強烈地阻斷此交互作用。抗PD-1 IgG以更大程度，來抑制此交互作用，其中PD-1親本IgG PG7686表現優於PD-1基準IgG (5C4)。

在CD80競爭測定中，測試的雙特異性抗體(MF7686xMF7703)阻斷CD80和PD-L1之間的交互作用。這提供了透過PD-1和CD80之間的交互作用的免疫抑制被此抗體抵消的優點。

PD-1 IgG不能抑制此交互作用。

實施例 13

SEB 測定：與混合親本相比的雙特異性

PD-1xPD-L1 雙特異性 IgG 與兩種親本 IgG 的等莫耳混合物的功能比較

執行SEB測定以比較雙特異性抗體與其親本IgG的混合物。藉由金黃色葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcus enterotoxin B，SEB)來刺激周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。SEB特異性地活化表現Vβ3、12、14、15、17和20T細胞受體鏈的T細胞，且由細胞釋放的IL-2的量是T細胞活化的指示。

在目前的實驗中，將來自2個捐贈者的PBMC解凍、洗滌、計數且重新懸浮於培養基(RPMI1640加上10% 熱失活的FBS)中至濃度為2x10⁶ 個細胞/ml。在SEB(2000ml)存在下，將細胞接種於平底96孔盤(2x10⁵ 個細胞/孔)中，然後加入6步驟10倍序列稀釋的抗體，起始濃度為20 µg/ml。在收集上清液之前，在95%相對濕度、於37°C、5% CO₂ ，將細胞刺激3天。以350g將盤子離心5分鐘，且收集140 µl的上清液用於IL-2 AlphaLISA (PerkinElmer目錄編號AL221C)，其根據製造商的說明書執行。測試以下雙特異性抗體：PB16666 (MF7686xMF7703)和PB16672 (MF6974x7689)。

結果

第20圖中的結果顯示測試的雙特異性抗體能夠活化T細胞。值得注意的是，當細胞與PD-1/PD-L1雙特異性抗體一起培養時，由PBMC之SEB所誘導的IL-2產生比與用它們的親本二價單特異性抗體的等莫耳混合物一起培養時還高。因此，與其親本二價單特異性抗體的等莫耳混合物相比，測試的雙特異性抗體的每一個都具有更強的T細胞活化潛力。

實施例 14

PD-1xPD-L1 的 T 細胞反應

在先前的實施例的SEB測定中，發現所有測試的雙特異性PD-1xPD-L1抗體誘導比親本IgG的免疫反應還強的免疫反應(IL-2產生)，且甚至比親本IgG的等莫耳混合物的免疫反應更強的反應。這些結果建議，在此測定中，同時阻斷PD-1和PD-L1比僅阻斷PD-1/PD-L1路徑中的一個目標還有效。隨後的步驟是決定在抗原特異性CD4+ T細胞測定中，雙特異性抗體是否也比現有的PD-1或PD-L1治療性抗體更有效。

在SEB測定中，透過T細胞受體和抗原呈現細胞上存在的MHC-II分子的交聯，來強烈活化T細胞。然而，特異性辨認某種抗原的T細胞的數量通常遠低於對SEB有反應的T細胞的數量。為了更接近地模擬抗原特異性細胞的活化，使用抗原特異性CD4+ T細胞測定。在此測定中，用捐贈者個體之通常會對抗原混合物反應的免疫系統，來刺激PBMC。藉由測量IL-2和IFNγ的產生，來評估T細胞的活化。

為此，藉由密度梯度，以分離來自3個健康捐贈者的PBMC，且在96孔盤中培養每孔2x10⁵ 個細胞，且在測試抗體存在或不存在的情況下，用混合的抗原(流感和破傷風類毒素)刺激。在第五天收穫上清液，且在80°C儲存直至藉由Luminex測定之細胞淚素產生的分析。在四點劑量反應曲線(10、100、1000和10000 ng/ml)上測試抗體。對於每個捐贈者，將雙特異性PD-1xPD-L1抗體(MF7686xMF7703)的效果與二價抗PD-L1抗體(YW243.55.S70，基於Atezolizumab)和二價抗PD-1抗體(5C4，基於Nivolumab)的效果進行比較或這兩個對照抗體的1：1混合物。陰性對照為抗RSV-G抗體PG2708p217。

結果

如第21圖中所說明，雙特異性PD-1xPD-L1抗體誘導IL-2和IFNγ的量高於被基準對照抗體誘導的IL-2和IFNγ的量。值得注意的是，與由兩種基準抗體的組合所誘導的那些量相比，雙特異性抗體也誘導更高的IL-2和IFNγ的量，特別是在較低濃度下。這些結果顯示，就增強抗原驅動之藉由CD4+ T細胞的細胞激素釋放而言，雙特異性PD-1xPD-L1抗體比現有的PD-1或PD-L1治療性抗體或其混合物更有效。

實施例 15

PD-1xPD-L1 的混合淋巴細胞反應

在混合淋巴細胞反應中，雙特異性 PD-1xPD-L1 抗體增強經由 T 細胞的 IFN g 產生

混合淋巴細胞反應(Mixed lymphocyte reaction，MLR)測定通常用於了解抗體對T細胞活化和增殖的影響。此類測定協助理解這樣的化合物是否會影響T細胞在腫瘤微環境中產生這種反應的可能性。

在這裡，我們使用具有未成熟DC的同種異體MLR規章，來決定雙特異性PD-1xPD-L1抗體之增強經由T細胞的IFNg產生的能力，與基準參考抗體的能力相比。藉由測量培養上清液中的IFNg的量，來量化T細胞的反應性。

為此，從膚色血球層(buffy coat)製備來自健康捐贈者的人類周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。藉由使用磁性經活化的細胞分選(magnetic activated cell sorting，MACS)，來分離CD14+細胞(EasySep Stemcell，批號16C69672)且在分化培養基中培養這些細胞7天，來製備未成熟的單核細胞衍生的樹突細胞(monocyte-derived dendritic cell，Mo-DC)。在所需的那天，從冷凍保存的PBMC製備衍生自與用於Mo-DC的捐贈者不同的捐贈者的反應者T細胞(responder T cell)，使用T細胞分離套組(EasySep Stemcell，批號16D70573)，以獲得未經接觸的T細胞。執行六個分開的MLR，以提供生物性重複。

對此測定而言，在10 µg/mL的終濃度的測試抗體存在或不存在下，將1x10⁴ 個未成熟的Mo-DC與1x10⁵ 個T細胞共培養4天。以三重複執行培養。在培養期結束時收集上清液，且根據製造商的說明書，藉由ELISA (R＆D BioTechne，批號342687)，在450 nm讀盤來評估IFNγ。

結果

第22圖顯示此測定的結果，說明與二價抗PD-L1抗體(YW243.55.S70)和二價抗PD-1抗體(5C4)抗體相比，雙特異性PD-1xPD-L1抗體之增強經由T細胞的IFNg產生的能力。在基準對照抗體存在下，也看到此反應性的增加，但程度較小。因此，與基準抗體YW243.55.S70 (基於Atezolizumab)和5C4 (基於Nivolumab)相比，測試的雙特異性抗體具有更強的T細胞活化潛力。這些結果指出，雙特異性抗體將增加T細胞在腫瘤微環境中產生免疫反應的潛力，且與基準抗體相比，雙特異性抗體的效果將更加顯著。

實施例 16

雙特異性 PD-1xPD-L1 抗體對腫瘤浸潤 T 細胞的增殖的影響

為了在腫瘤相關環境中測試我們的雙特異性抗體，我們利用最近開發的基於從病人腫瘤材料中分離的T細胞的離體(ex vivo )測定。Zhou等人已經開發出一種從肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)病人獲得新鮮腫瘤材料且分離腫瘤浸潤細胞(骨髓和淋巴細胞)的方法，藉此提供一種測試針對免疫檢查點抑制劑的抗體對腫瘤浸潤T細胞的功能的影響的方式。(Zhou et al.，2017)。在這裡，我們從HCC病人獲得材料，以測試抗PD-1xPD-L1雙特異性抗體MF7686xMF7703是否可再活化衍生自這些病人的腫瘤浸潤CD4 +和CD8 + T細胞。

為此，從五名符合腫瘤手術切除的HCC病人獲得新鮮腫瘤材料。 沒有患者在手術前至少三個月接受化療或免疫抑制治療。在手術前至少三個月，沒有病人接受化療或免疫抑制治療。Zhou等人(2017)所述的方法如下：藉由將腫瘤切成小塊，然後在37°C於0.5 mg/mL的膠原酶IV(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)及0.2 mg/mL DNAse I (Roche，Indianapolis，IN)中消化20-30分鐘，來從新鮮組織中分離腫瘤浸潤骨髓細胞和淋巴細胞。將產生的細胞懸浮液通過100-μm孔細胞過濾器(BD Biosciences，Erembodegem，Belgium)來過濾，而藉由Ficoll密度梯度離心來獲得單核白細胞。藉由錐蟲藍(trypan blue)排除法來決定生存力。然後用0.1 μM的螢光染料羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE, Invitrogen)標記細胞，且懸浮於補充10% 人類AB血清、2 mM L-穀胺醯胺、50 mM HEPES緩衝液、1% 青黴素(penicillin)-鏈黴素(streptomycin)、5 mM丙酮酸鈉和1%最低必需培養基非必需胺基酸(minimum essential medium non-essential amino acid，MEM NEAA)的RPMI培養基中。然後將100 μL中的1x10⁶ 個細胞轉移到96孔圓底盤的每個孔中。

然後，藉由添加100 μL的含有測試抗體的相同培養基和103個已經擴增且隨後轉染編碼全長腫瘤抗原磷脂醯肌醇聚醣-3(glypican-3，GPC3)的mRNA的自體經CD40活化的B細胞母細胞，在測試抗體不存在或存在下刺激腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)誘導活化。將這些細胞共培養6天。

共培養後，收穫CFSE標記的細胞且用抗CD8、抗CD4和抗CD3抗體染色。使用7-胺基放線菌素D(7­ Aminoactinomycin D，7AAD；Invitrogen, Paisley UK)來排除死細胞，且藉由流式細胞術分析，基於CFSE稀釋來決定T細胞增殖。藉由FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences, San Diego, USA)測量細胞，且使用FlowJo軟體分析。

將PD-1xPD-L1雙特異性抗體MF7686xMF7703與抗PD-L1參考抗體YW243.55.S70 (其基於Atezolizumab)和針對無關抗原，即呼吸道融合病毒G (respiratory syncytial virus G，RSV-G)的陰性對照抗體PG2708進行比較。沒有抗體的樣品被包含作為對照，且在10 μg/mL的IgG濃度，以二重複測試所有條件。結果以平均值±SEM呈現。如果P ＜0.05，差異被認為是統計上顯著的。

結果

結果顯示在第23圖中。藉由在陰性對照抗體存在下測量增殖的T細胞(低程度的CFSE)的百分比來決定來自每個捐贈者的CD4+ TIL(左圖)和CD8+ TIL(右圖)的增殖。亦顯示了含有GPC表現B細胞但沒有抗體(GPC B細胞)和未轉染的B細胞(負對照B細胞)的對照孔。值是平均值±SEM (n = 5)。

用我們的雙特異性PD-1xPD-L1抗體或用YW243.55.S70，來阻斷PD-1/PD-L1路徑確實似乎增強CD4+和CD8+ TIL的增殖。重要的是，我們的測試的PD-1xPD-L1抗體活化其他捐贈者中的TIL，然後是YW243.55.S70。在來自HCC的這些TIL中觀察到的對PD-1xPD-L1的增殖性GPC3特異性反應模擬病人腫瘤中的情況。

這些實驗展現以雙特異性形式使用PD-1xPD-L1 IgG和雙特異性PD-1xPD-L1抗體可增強衍生自肝細胞癌病人的CD4+和CD8+ TIL的增殖的附加價值。

實施例 17

於 huCD34-MDA-MB-231 中之 PD-1xPD-L1 的體內功效 (efficacy) 研究

為了測試我們的雙特異性抗體的體內(in vivo)活性，在用人類CD34+造血幹細胞重建且皮下接種3x10⁶ 個MDA-MB-231腫瘤細胞(ATCC，目錄編號HTB-26)，一種表現PD-L1的三陰性乳癌(triple-negative breast cancer，TNBC)細胞系的雌性免疫缺陷NOD scid gamma(NSG)小鼠中，體內研究雙特異性抗體MF7686xMF7703誘導T細胞介導的抗腫瘤反應的能力。前述人類CD34+造血幹細胞來自臍帶血(19週齡；The Jackson Laboratory, Bar harbor, ME)。將這些3x10⁶ 個細胞接種於100 µl的無血清DMEM培養基(Life technologies，目錄編號10566-016)和基質膠膜基質(matrigel membrane matrix)(Fisher Scientific，目錄編號CB354248)的1：1懸浮液中。在細胞系接種後7天，當腫瘤體積已達到170至180mm³ 時，開始治療帶有腫瘤的小鼠。然後每5天用0.5或5 mg/kg的MF7686xMF7703雙特異性抗體，來腹腔(intraperitoneally)處理小鼠。將對照小鼠留著未處理或每5天用5 mg/kg的對RSV-G抗原特異性的陰性對照抗體(具有Fc沉默突變的IgG1)處理。使用研究對數系統(study log system)每週兩次記錄腫瘤體積。一在第37天終止體內研究階段，即治療開始後30天，就藉由流式細胞術分析來分析腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)。為此，根據製造商的說明書，使用腫瘤解離套組(Tumor Dissociation Kit)(Miltenyi Biotec)收穫腫瘤、微切片且消化。在紅血球細胞裂解後，使用存活性染料(Viability dye)和標記物特異性的螢光染料共軛的抗體，來將細胞染色用於FACS分析。使用BD LSR Fortessa流式細胞術分析儀來運行細胞，且使用FlowJo軟體包分析。活TIL被鑑定為存活性染料陰性細胞，且對CD45和CD3特異性抗體(BD Biosciences，目錄編號564307)是陽性染色。隨後，以CD4 (BD Biosciences，目錄編號557852)和CD8 (BD Biosciences，目錄編號557834)的表現作為T細胞部分(fraction)的特徵。使用BD LSR Fortessa流式細胞術分析儀來運行細胞，且使用FlowJo軟體包分析。

結果

MF7686xMF7703雙特異性抗體甚至在僅0.5 mg/kg的較低劑量下誘導抗腫瘤反應(第24圖)，因為在兩個MF7686xMF7703治療組中的腫瘤體積均低於對照小鼠組中的腫瘤體積。通過流式細胞術分析比較MF7686xMF7703處理的小鼠和對照小鼠中的TIL組成，顯露出5 mg/kg MF7686xMF7703具有增強CD4和CD8 T細胞數量的能力(第25圖)。總之，這些數據顯示出，在具有PD-L1陽性腫瘤的CD34+人源化小鼠模型中，我們的雙特異性抗體MF7686xMF7703具有增強TIL數量以及誘導抗腫瘤反應的能力。

實施例 18

PD-1xPD-L1 的體外和體內功效研究 (A549)

使用A549-A2-ESO-1腫瘤細胞和NY-ESO-1特異性T細胞，在抗原-TCR特異性訊號傳遞的背景中，來體外研究MF7686xMF7703雙特異性抗體增強腫瘤細胞之T細胞介導的細胞毒性的能力。如Moon等人所述(2016) ，A549-A2-ESO腫瘤細胞衍生自非小細胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)細胞系，且表現PD-L1和HLA-A2限制的NY-ESO-1胜肽抗原。根據Moon等人(2016)，製備NY-ESO-1特異性T細胞。將A549-A2-ESO-1腫瘤細胞(其過度表現螢光素酶)與NY-ESO-1特異性T細胞共培養於補充10%熱失活的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(HyClone，目錄編號SH30071.03)的RPMI 1640培養基(Gibco，目錄編號11875-085)中。將A549-NY-ESO-1細胞加到96孔平底盤中，接著是不同的效應物與目標(E：T)的比例(1：1、0.5：1、0.25：1和0.125：1)的NY-ESO-1特異性Ly95 T細胞。在有或沒有抗體處理的情況下，在37°C將細胞共培養72小時，從而將MF7686xMF7703與抗PD-1對照抗體MK-3475(基於Pembrolizumab)、抗PD-L1對照抗體YW24​​3.55.S70(基於Atezolizumab) 或MK-3475 + YW243.55.S70的組合(所有抗體終濃度為10 μg/mL)進行比較。72小時後，收集來自共培養物的上清液，且使用IFNγ Quantikine ELISA套組(R＆D Systems，目錄編號DIF50)，根據製造商的說明書，來分析IFNγ分泌。藉由使用螢光素酶測定系統(Promega，目錄編號E1501)，在SpectraMax多模式讀取儀(SpectraMax Multimode Plate Reader)上測量剩餘發光(luminescence)，來定量由NY-ESO-1特異性T細胞誘導的細胞毒性的程度。

結果

用MF7686xMF7703和對照抗體處理的共培養物的比較指出甚至在低E：T比例，MF7686xMF7703增強了功能性T細胞的部分(fraction)，其由IFNγ釋放的增加所反應(第26圖)，及T細胞對A549-NY-ESO-1腫瘤細胞的細胞毒性的程度(第27圖)，。值得注意的是，與所有E：T比例下的對照抗體YW243.55.S70相比，雙特異性抗體MF7686xMF7703導致更高的IFNγ釋放。在較低的E：T比例下，與對照抗體MK-3475或對照抗體YW243.55.S70和MK-3475的組合所誘導的IFNγ釋放相比，MF7686xMF7703所誘導的IFNγ釋放相當或甚至更高。

接著，在免疫缺陷的NOD scid gamma (NSG)小鼠(13週齡；The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)中，體內研究了MF7686xMF7703增強T細胞介導的抗腫瘤反應的能力。首先將小鼠皮下接種5x10⁶ 個A549-A2-ESO腫瘤細胞，其懸浮於100 µl的無血清培養基和等體積的基質膠膜基質(Corning)中。在建立腫瘤(體積為80至100mm³ )後，將小鼠隨機分成六組，其中一組接受僅PBS的單一IV(尾靜脈)注射，而五組用含有10x10⁶ 個表現NY-ESO1-反應性Ly95 TCR構築體的人類T細胞的PBS來注射。隨後用PBS、MK-3475 (5 mg/kg)、YW243.55.S70 (5 mg/kg)、MF7686xMF7703 (5 mg/kg)或MK-3475 (5 mg/kg)+ YW243.55.S70 (5 mg/kg)的組合，每五天腹腔處理經歷腫瘤特異性轉基因Ly95 T細胞的授受性轉移(adoptive transfer)的五組。在四周的時間內，使用研究對數系統，以每週兩次記錄腫瘤體積。一在第35天終止體內研究階段，即治療開始後28天，透過流式細胞術分析，來分析腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)。為此，根據製造商的說明書，使用腫瘤解離套組(Miltenyi Biotec)收穫腫瘤、微切片並消化。在紅血球細胞裂解後，使用存活性染料(Viability dye)和標記物特異性的螢光染料共軛的抗體，來將細胞染色用於FACS分析。使用BD LSR Fortessa流式細胞術分析儀來測量細胞，且使用FlowJo軟體包分析。活TIL被鑑定為對存活性染料是陰性的染色，且對CD45和CD3特異性抗體(BD Biosciences，目錄編號564307)是陽性染色。隨後，以CD4 (BD Biosciences，目錄編號557852)、CD8 (BD Biosciences，目錄編號557834)和GITR (eBiosciences，目錄編號46-5875-42)以及Vβ13.1 TCR鏈(Miltenyi Biotec，目錄編號130-108-742)的表現作為T細胞部分(fraction)的特徵，來鑑定NY-ESO-1特異性T細胞。

結果

如第28圖中所示，MF7686xMF7703雙特異性抗體誘導抗腫瘤反應，因為MF7686xMF7703治療組中的腫瘤體積低於對照小鼠組中的腫瘤體積。值得注意的是，這個MF7686xMF7703誘導的抗腫瘤反應大於用等價劑量的單一參考抗體(YW243.55.S70或MK-347)治療的小鼠中所觀察到的反應，且與在給予兩倍的組合參考抗體(YW243.55.S70 + MK-3475；第28圖)的等價劑量的小鼠中所觀察到的反應相當。因此，與YW243.55.S70和MK-3475的組合相比，當使用雙特異性抗體MF7686xMF7703時，僅用一半劑量獲得相同的腫瘤質量減少。

藉由流式細胞術分析的TIL分析指出，相對於用參考抗體處理的組，MF7686xMF7703增強CD8 T細胞的總數(第29圖)，其中大部分被活化，如GITR+ CD8 T細胞的高百分比所反映的。用MF7686xMF7703處理的小鼠的腫瘤不僅具有最高百分比的總CD8 T細胞，而且具有對NY-ESO-1抗原特異性的CD8陽性TIL的最高百分比。值得注意的是，與用PD-L1特異性對照抗體YW243.55.S70和PD-1特異性對照抗體MK-3475的組合的處理相比，在用雙特異性抗體MF7686xMF7703處理後，CD8陽性TIL的百分比更高。

總之，這些數據顯示MF7686xMF7703增強T細胞的活化，導致T細胞介導的細胞毒性增強。在體內，MF7686xMF7703誘導更高數量的TIL以及大於用參考抗體YW243.55.S70或MK-3475的單一治療所見的反應的抗腫瘤反應，且與兩倍的組合參考抗體YW243.55.S70和MK-3475的等價劑量所見的反應相當，其指出較低劑量的MF7686xMF7703足以實現相當的抗腫瘤反應。

實施例 19

PD-1xPD-L1 雙特異性抗體以共刺激依賴性方式阻斷 PD-1/PD-L1 訊息傳遞

我們測試了兩種PD-1xPD-L1雙特異性抗體MF7686xMF7703和MF6974xMF7689抑制PD-L1/PD-1參與活化的T細胞細胞激素產生的能力。我們使用抗CD3/抗CD28刺激來活化T細胞，且藉由與重組人類PD-L1-Fc共培養提供共刺激，前述重組人類PD-L1-Fc與T細胞上的PD-1接合(engage)。由於此PD-1/PD-L1的交互作用抑制細胞活化，所以阻斷PD-1/PD-L1與針對PD-1或PD-L1的抗體的交互作用再活化這些細胞，導致IL-2產生。

將雙特異性抗體阻斷PD-L1與PD-1的交互作用的能力與親本抗PD-1和抗PD-L1抗體的能力，既單獨和組合，以及PD-1基準抗體(5C4，基於Nivolumab)和抗PD-L1基準抗體(YW243.55.S70，基於Atezolizumab)抗PD-L1基準抗體的能力，既單獨又組合，進行比較。在每個盤子上使用抗RSV抗體PG2708作為陰性對照。

方法

共刺激依賴性 T 細胞活化測定

將來自健康捐贈者的人類周邊血液單核細胞(PBMC) 解凍，且逐滴將9倍體積的培養基(有10% 熱失活(heat-inactivated，hi)FBS的RPMI1640)加入。在室溫以200g將細胞離心10分鐘。將細胞沉澱重新懸浮於10 mL的培養基中，且藉由在95%相對濕度，於37°C、5% CO₂ 培養隔夜，以允許細胞靜置。隔天，使用如製造商(Stem cell Technologies，目錄編號19051)所述的EasySep T細胞富含(pan CD3)純化程序，來分離T淋巴細胞。 EasySep程序使用陰性選擇。簡而言之，在室溫以200 g，將PBMC離心10分鐘。以濃度為5x10⁷ 個細胞/mL，將細胞沉澱重新懸浮於EasySep緩衝液中。將50 μL的EasySep人類T細胞富含雞尾酒加到每mL的細胞體積中，混合且允許在室溫培養10分鐘。接著，將50 μL的EasySep D磁性顆粒加入到每mL的細胞體積中，且在室溫培養5分鐘。用EasySep緩衝液將總體積帶至2.5mL，且混合後，將細胞懸浮液轉移到5 mL的圓底Falcon管(BD Biosciences，目錄編號352235)。接著，將管子放到磁體中，允許不期望的細胞部分在室溫與磁體結合5分鐘。接著，將管子倒置且將純化的T細胞部分倒出至入含有7.5 mL培養基的新管中。藉由在室溫以200g離心10分鐘來收穫細胞，隨後以1x10⁶ 細胞/mL的濃度重新懸浮於培養基中。

在測定開始的前一天，在4°C用在PBS中的4 μg/mL抗CD3抗體和8 μg/mL的重組人類PD-L1-Fc (R＆D Systems，目錄編號156-B7)，每孔50 μL塗佈96孔平底盤(Cellstar，目錄編號655180)隔夜(選殖體OKT3，eBioscience，目錄編號16-0037-85)。隔天，用PBS洗滌測定盤兩次，且用100 µl PBS填充測定盤的外孔。將抗CD28抗體(選殖體28.2，BD，目錄編號555725)以2 μg/mL(終濃度1μg/mL)的濃度加到T細胞懸浮液。將50 μL的此T細胞/抗CD28懸浮液加到測定盤的所有內孔中(50,000個細胞/孔)，接著是測定培養基(RPMI1640 + 10% hiFBS)中的50 μL預製備的5步驟10倍序列稀釋的抗體，起始濃度為20 μg/mL或1 μg/mL)。覆蓋盤子且在37°C、5% CO₂ 、95%濕度，於培養箱中培養72小時。藉由AlphaLISA (Perkin Elmer，目錄編號AL221F)決定上清液中IL-2的濃度。

藉由流式細胞術，在單獨的測定中測定PD-1和PD-L1的表現，其中未添加IgG。在24、48和72小時後收穫細胞，且用抗PD1或抗PD-L1抗體染色。然後用二抗(抗人類IgG-PE)來染色細胞且藉由FACS來分析。

結果

第30和31圖顯示刺激指數(stimulation index，SI)，其計算為在含有抗體的孔中測量的IL-2計數與不含抗體的孔中測量的IL-2計數的比例。兩種PD-1xPD-L1雙特異性抗體存在的情況下，SI高於細胞單獨 (第30圖30)和組合(第31圖)使用陰性對照抗體PG2708或親本二價抗體培養時。值得注意的是，兩種PD-1xPD-L1雙特異性抗體存在的情況下，SI也高於細胞單獨和組合使用抗PD-1基準抗體(5C4)和抗PD-L1基準抗體(YW243.55.S70)培養時。這展現出，與親本抗體相比和與基準抗體相比，所有測試的雙特異性抗體具有更強的共刺激依賴性T細胞活化活性。由雙特異性抗體所誘導的T細胞活化甚至比由基準抗體的混合所誘導的T細胞活化更強。

第32圖顯示抗CD3/抗CD28活化後，T細胞上PD-1和PD-L1表現隨時間的增加。

表格：

表 1

每個目標之用於DNA免疫(基於pVAX1載體)和用於產生穩定的CHO-S或CHO-K1細胞系(基於pIRES-neo3載體或類似)的表現構築體 hu = 人類、ma = 獼猴、NA = 不適用

表 2

與陽性對照Nivolumab相比之PD-1 Fab臂在PD-1/PD-L1阻斷報導者測定中作為二價抗體測量的功能活性。測試了展示一範圍的PD-L1阻斷活性的相同簇(A、B和C)的變異體。

表 3

PD-L1 Fab臂之在PD-1/PD-L1阻斷報導者測定中作為單價抗體所測量的功能活性，以在曲線下面積表現(area under curve，AUC)。在測定中，AUC＞ 2的抗體顯示PD-1阻斷活性。藉由Biacore分析決定抗體親和性。

表 4

在PD-1/PD-L1報導者測定中篩選PD-1xPD-L1抗體的概述。

展示與對照MPDL-3280A相比的百分比活性。 (DE)表示DEKK雙特異性的DE側。KK表示DEKK雙特異性的KK側。個別PD-1 Fab臂的阻斷活性以-、+/-、+、++和+++表示。 PD-L1 Fab臂的阻斷活性從上到下排列，其中最頂的抗體(MF5594)是最強的阻斷劑，而MF5361不能阻斷。灰色的抗體組合顯示活性高於60%且被選擇用於後續測試。

表 5

PB編號及其MF組成的概述

表 5 ( 續 )

PB編號及其MF組成的概述

表 6 。在體外阻斷報導者測定中，雙特異性抗 PD-1xPD-L1 抗體阻斷 PD-L1 和 PD-1 之間的交互作用。

表7。使用表面電漿共振(surface plasmon resonance，SPR)決定兩個測試的PD-L1臂和對PD-L1的基準抗體YW243.55.S70的結合親和力。以單價形式測試抗體。對於抗PD-L1 Fab臂而言，從三個單獨的運行中顯示測量。koff：解離速率常數(off-rate constant)、kon：結合速率常數(on-rate constant)；KD：解離常數(koff/kon)。

參考文獻 J.C. Almagro1 and J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633 Armour et al., 1999. Eur J Immunol. 29(8):2613-24; Shields et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604 Butte MJ, Peña-Cruz V, Kim MJ, Freeman GJ, Sharpe AH. Interaction of human PD-L1 and B7-1. Mol Immunol. 2008 Aug;45(13):3567-72. doi: 10.1016/j.molimm.2008.05.014. Epub 2008 Jun 27 Idusogie et al., 2000. J Immunol. 164(8):4178-84 Labrijn. et al., 2009. Nat Biotechnol. 27(8):767-71 Moon et al. Blockade of Programmed Death 1 Augments the Ability of Human T cells Engineered to Target NY-ESO-1 to Control Tumor Growth after Adoptive Transfer. Clinical Cancer Research 2016, 22(2): 436–447. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-15-1070 Zhou et al. Antibodies Against Immune Checkpoint Molecules Restore Functions of Tumor-infiltrating T cells in Hepatocellular Carcinomas. Gastroenterology 2017 doi: 10.1053/ j.gastro.2017.06.017.

第1圖：在單和雙特異性IgG中使用的共同輕鏈。 第1A圖：共同輕鏈的胺基酸序列。第1B圖：共同輕鏈可變域的DNA序列和轉譯(IGKV1-39/jk1)。第1C圖：共同輕鏈恆定區的DNA序列和轉譯。第1D圖：IGKV1-39/jk5共同輕鏈可變域的轉譯。第1E圖：V區IGKV1-39A。 第2圖：用於產生雙特異性分子的IgG重鏈。第2A圖：VH是編碼第3圖中所示的MF的胺基酸序列的核酸。第2B圖：CH1區。第2C圖：鉸鏈區。第2D圖：CH2區。第2E圖：含有L235G和G238R沉默取代的CH2。第2F圖：含有L351K和T366K (KK)取代的CH3域。第2G圖：含有L351D和L368E (DE)取代的CH3域。 第3圖：重鏈可變區的胺基酸序列：符號MF是指含有所示的重鏈可變區和共同輕鏈的fab。輕鏈的胺基酸序列於第1A圖中指出。 劃底線的序列分別指出CDR1、CDR2和CDR3區的每個胺基酸序列。 第4圖：pIRES-Neo3 (MV1363)的載體圖和特徵。 第5圖：pVAX1的載體圖和特徵。 第6圖：用來產生「免疫」噬菌體展示庫(phage display library)之噬菌質體載體(phagemid vector)MV1473的載體圖及特徵。 第7圖：IgG表現載體MV1452的載體圖與特徵，IgG表現載體MV1452用於在KK變異體重鏈中表現PD-1和PD-L1特異性Fab臂，以產生雙特異性IgG。 第8圖：當VH基因與共同輕鏈組合成為MF1337時，是對破傷風毒素(tetanus toxin)有特異性，且存在於用於產生PD-L1xTT和PD-1xTT雙特異性IgG分子的DE變異體重鏈中的VH基因的胺基酸序列。劃底線的序列分別指出CDR1、CDR2及CDR3區的每個胺基酸序列。 第9圖：IgG表現載體MV1377的載體圖及特徵，IgG表現載體MV1377用於在DE變異體重鏈中表現TT特異性Fab臂MF1337，以產生雙特異性IgG。 第10圖：PD-1/PD-L1阻斷測定(blocking assay)。在雙特異性IgG的濃度為10 µg/ml時，評估抗PD-L1和抗PD-1抗體組(panel)阻斷PD-L1與經塗佈的PD-1的交互作用的能力。以取自二價基準(benchmark)PD-L1抗體MPDL3280A在濃度為10 µg/ml (100%阻斷)時的數據，將數據標準化。代表性範例顯示於PD-L1(上圖)和PD-1(下圖)組中。藉由與非PD-1/PD-L1特異性人類同型(isotype)抗體一起培養，來建立最大結合(標準化至0%阻斷)。於第3圖所示但未在此表現之包含MF序列的所有PD-1和PD-L1可變域阻斷PD-1/PD-L1的交互作用大於70%。 第11圖：在PD-1/PD-L1-luc報導者系統中，劑量滴定的抗體組的PD-1/PD-L1功能活性。 第12圖：在PBMC中經SEB誘導的IL-2的產生由PD-1xPD-L1抗體以劑量依賴性(dose-dependent)的方式增強。PB組合物列於表5中。IL-2的產生以與陰性對照抗體(Ctrl Ab)相比的刺激指數來顯示。 第13圖：重鏈可變區的胺基酸序列：符號MF是指含有所示的重鏈可變區和共同輕鏈的fab。輕鏈的胺基酸序列於第1A圖中指出。 劃底線的序列分別指出每個胺基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3區。 第14圖：結合至PD-1。在ELISA中，所有雙特異性IgG結合至PD-1。 第15圖：結合至PD-L1。在ELISA中，所有雙特異性IgG結合至PD-L1。 第16圖：FACS測定證實結合至由CHO細胞表現的抗原。上圖，結合至CHO-PD-L1細胞；下圖右側，結合至CHO-PD1細胞。 第17圖：FACS測定證實領導候選物(candidate)PD-1xPD-L1雙特異性IgG與經活化的T細胞上的抗原結合。 第18圖：PD-1/PD-L2阻斷測定。在體外阻斷報導者測定中，評估抗PD-1/PD-L1抗體及其親本二價抗體阻斷PD-L2和PD-1之間的交互作用的能力。 第19圖：PD-L1阻斷測定。在PD-L1阻斷測定中，評估抗PD-1/PD-L1雙特異性抗體及其親本二價抗體阻斷PD-L1與經塗佈的PD-1或CD80的交互作用的能力。 第20圖：相對於其親本二價單特異性抗體的等莫耳(equimolar)混合物，PD-1xPD-L1抗體增強了經由PBMC之SEB誘導的IL-2產生。數據代表在增加濃度的抗體存在下，由來自4個獨立捐贈者的PBMC之平均IL-2產生。PG代碼指出兩個雙特異性抗體中的每一個的個別的親本二價抗體(由PB表示)。IL-2的產生顯示為在AlphaLISA中測量的相對光單位(relative light unit，RLU)。 第21圖：藉由抗原特異性T細胞的IFNg/IL-2釋放的雙特異性PD-1xPD-L1抗體的體外增強。 圖表顯示存在於上清液中的IL-2(上圖)或IFNg (下圖)的量。所有圖表都顯示來自重複(duplicate)孔的平均值。虛線指出在抗原(Ag)存在下的細胞激素的量。僅在未顯示虛線的情況下，顯示確切的濃度(Ag = pg / ml)。 第22圖：雙特異性PD-1xPD-L1抗體增強體外T細胞的反應性。 長條顯示存在於從同種異體(allogeneic)iMLR收集的上清液中的IFNg的平均量，其中誤差條表示S.E.M. (n=6)。用有Sidaks檢測後分析的單因子變異數分析，將用測試抗體所獲得的平均量與同型(isotype)對照抗體(*)或載體對照(＃)所獲得的平均量進行比較。* P ＜0.05，** P ＜0.01，## p ＜0.01，### P ＜0.001，#### P ＜0.0001。虛線指出僅用載體所獲得的平均IFNg量。 iMLR：未成熟的混合淋巴細胞反應(immature mixed lymphocyte reaction)。 第23圖：PD-1xPD-L1對衍生自五位肝癌(hepatic carcinoma，HCC)病人的腫瘤浸潤CD4+(左)和CD8+ T細胞(右)的增殖的影響。 第24圖：MF7686xMF7703誘導抗腫瘤反應。 第25圖：MF7686xMF7703增強腫瘤中的T細胞數量。 第26圖：MF7686xMF7703藉由與腫瘤細胞共培養的腫瘤特異性T細胞，來增強IFNγ的釋放。 第27圖：MF7686xMF7703增強藉由與腫瘤細胞共培養的腫瘤特異性T細胞的細胞毒性。 第28圖：MF7686xMF7703誘導抗腫瘤反應。 第29圖：MF7686xMF7703增強腫瘤中的腫瘤特異性(NY-ESO-1特異性)CD8⁺ T細胞的數量。 第30圖：在共刺激依賴性初代人類T細胞活化測定中，PD-1xPD-L1抗體阻斷人類重組PD-L1-Fc的抑制效果。數據代表在有單一PBMC捐贈者(1058)的實驗中進行，用於增加所示抗體的濃度之二重(duplo)培養物的平均刺激指數(stimulation index，SI)(從左至右)。 PG代碼指出兩個雙特異性抗體的個別的親本二價抗體。 第31圖：在共刺激依賴性初代人類T細胞活化測定中，PD-1xPD-L1雙特異性抗體的阻斷效果高於親本抗體的組合或基準抗體的組合。數據代表在有單一PBMC捐贈者(1058)的實驗中進行，用於增加所示抗體的濃度之二重培養物的平均刺激指數(SI)(從左至右)。 PG代碼指出兩個雙特異性抗體的個別的親本二價抗體。 第32圖：在用抗CD3和抗CD28活化後，共刺激依賴性初代人類T細胞活化測定中的T細胞表現增加量的PD-1和PD-L1。平均螢光指數(mean fluorescence index，MFI)代表在用抗CD3和抗CD28抗體活化的24、48和72小時後所收穫的T細胞上的PD-1或PD-L1的表現量。 第33圖：能夠完全阻斷PD1軸的雙特異性PD1xPDL1抗體。

Claims (52)

1. 一種抗體或維持所述抗體的結合特異性之所述抗體的變異體，包括 -可結合至CD28家族的蛋白質(第一膜蛋白質)的胞外部分的可變域，以及 -可結合至B7家族的蛋白質(第二膜蛋白質)的胞外部分的可變域； 其中所述第一和第二膜蛋白質是結合配偶體(即配位體和受體對)，且其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的所述可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合，且/或可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的所述可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。
2. 如申請專利範圍第1項所述的抗體或其變異體，其中所述抗體或其變異體的結合降低所述受體-配位體對的結合的抑制活性。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述的抗體或其變異體，包括 -可結合至PD-1；CTLA-4；BTLA；或TMIGD2的胞外部分的可變域；以及 -可結合至PD-L1；PD-L2；CD80；CD86；B7-H4；TNFRSF14；或B7-H7的胞外部分的可變域。
4. 如申請專利範圍第3項所述的抗體或其變異體，包括 -可結合至PD-1的胞外部分的可變域；以及 -可結合至PD-L1或PD-L2的胞外部分的可變域。
5. 如申請專利範圍第3或4項所述的抗體或其變異體，其中結合PD-1的所述可變域的結合阻斷PD-1與PD-L1的結合，且/或結合PD-L1的所述可變域的結合阻斷PD-L1與PD-1的結合。
6. 如申請專利範圍第5項所述的抗體或其變異體，其中結合PD-1的所述可變域的結合阻斷PD-1與PD-L1的結合，且結合PD-L1的所述可變域的結合阻斷PD-L1與PD-1的結合。
7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域，其中所述可變域與PD-1的結合阻斷PD-1與PD-L2的結合。
8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，其中所述可變域與PD-L1的結合阻斷PD-L1與CD80的結合。
9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且在金黃色葡萄球菌B型腸毒素(Staphylococcus enterotoxin B，SEB)測定中，所述抗體或其變異體具有更強的CD4+ T細胞活化潛力，與以下等莫耳(equimolar)混合物相比： -包括兩個結合PD-1的所述可變域的二價單特異性抗體，以及 -包括兩個結合PD-L1的所述可變域的二價單特異性抗體。
10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且在抗原特異性CD4+ T細胞測定中，所述抗體或其變異體能夠比基準抗體5C4或基準抗體YW243.55.S70或基準抗體5C4和YW243.55.S70的組合還強地活化T細胞。
11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且在混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)測定中，與基於Nivolumab的基準抗體5C4或基於Atezolizumab的基準抗體YW243.55.S70相比，所述抗體或其變異體具有更強的CD4+ T細胞活化潛力。
12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的抗體或其變異體，包括具有對PD-L1的胞外部分的結合親和力為以藉由SPR所測量之小於或等於4.2​​7 nM、較佳地小於或等於1.31 nM、較佳地小於或等於1.27 nM的平衡解離常數(equilibrium dissociation constant)(K_D )的可變域。
13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且所述抗體或其變異體能夠增強CD4+和/或CD8+腫瘤浸潤T細胞的增殖。
14. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域以及可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且與基準抗體MK-3475和YW243.55.S70的組合相比，所述抗體或其變異體在體內(in vivo )能夠誘導更強的T細胞所介導的抗腫瘤反應。
15. 如申請專利範圍第3至14項中任一項所述的抗體或其變異體，其中結合PD-1的胞外部分的所述可變域被定義為，與在Jurkat細胞上用抗體Nivolumab獲得的抑制相比時，當為包含兩個結合PD-1的所述可變域的二價單特異性抗體形式時，以20至150%的範圍來抑制Jurkat細胞之經T細胞受體介導的活化之由PD-1/PD-L1所介導的抑制的可變域。
16. 如申請專利範圍第3至15項中任一項所述的抗體或其變異體，其中結合PD-L1的胞外部分的所述可變域被定義為，當在具有結合不相關之抗原例如破傷風類毒素的第二可變域的雙特異性抗體中時，對所述雙特異性抗體提供0.1至14 nM的Kd(如biacore所測量)之PD-L1結合的可變域。
17. 如申請專利範圍第1至16項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域且包括具有CDR3區的重鏈可變區，所述重鏈可變區包含第3圖和/或第13圖中的MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；MF6982；MF6929；MF7699；MF7698；MF7687；MF7686；MF7685；或MF7684所示的VH之一的可變重鏈區的CDR3區的胺基酸序列。
18. 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗體或其變異體，其中結合至PD-1的所述可變域包括具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區，所述重鏈可變區包含第3圖和/或第13圖中的MF6076；MF6236；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；MF6982；MF6929；MF7699；MF7698；MF7687；MF7686；MF7685；或MF7684所示的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。
19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域且包括包含MF6076；MF6256；MF6226；MF6930；MF6932；MF6935；MF6936；MF6972；MF6974；MF6982；MF6929；MF7699；MF7698；MF7687；MF7686；MF7685；或MF7684所示的可變重鏈區的胺基酸序列(如第3圖和/或第13圖中所示)，其中相對於所示的MF的VH的胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。
20. 如申請專利範圍第1至19項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-L1的胞外部分的可變域且包括具有CDR3區的重鏈可變區，所述重鏈可變區包含第3圖和/或第13圖的MF5359；MF5361；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；MF5708；MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695的可變重鏈區的CDR3區的胺基酸序列。
21. 如申請專利範圍第1至20項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-L1的胞外部分且包括具有CDR1、CDR2和CDR3區的重鏈可變區，所述重鏈可變區包含第3圖和/或第13圖的MF5359；MF5361；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；MF5708；MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695所示的VH之一的可變重鏈區的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列。
22. 如申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-L1的胞外部分的可變域且包括(第3圖和/或第13圖的)MF5359；MF5361；MF5377；MF5382；MF5424；MF5426；MF5439；MF5442；MF5553；MF5557；MF5561；MF5576；MF5594；MF5708；MF5442；MF7691；MF7690；MF7689；MF7688；MF7700；MF7701；MF7703；MF7694；MF7693；MF7692；MF7697；MF7696；或MF7695所示的可變重鏈區的胺基酸序列，其中相對於所示的MF的胺基酸序列，具有最多15個，較佳0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個且較佳地具有0、1、2、3、4或5個胺基酸***、缺失、取代或前述之組合。
23. 如申請專利範圍第1至22項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域，且其中可結合至PD-1的胞外部分的所述可變域包括： -重鏈CDR3序列，其與選自由MF6974、MF6076和MF7686所組成的群組的可變區的重鏈CDR3序列相同；或 -重鏈CDR3序列，其偏離MF6974或MF6076或MF7686的重鏈CDR3序列不超過三個，較佳地不超過兩個，更佳地不超過一個胺基酸。
24. 如申請專利範圍第1至23項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域，且其中可結合至PD-1的胞外部分的所述可變域包括： -重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列，其與選自由MF6974、MF6076和MF7686所組成的群組的可變區的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列相同；或 -重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列，其偏離MF6974或MF6076或MF7686的重鏈CDR1、CDR2和CDR3序列不超過三個，較佳地不超過兩個，更佳地不超過一個胺基酸。
25. 如申請專利範圍第1至24項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-1的胞外部分的可變域，且其中可結合至PD-1的胞外部分的所述可變域包括： -重鏈可變區，其包括MF6974或MF6076或MF7686的胺基酸序列，或 -重鏈可變區，其具有與MF6974或MF6076或MF7686的胺基酸序列至少80%相同的序列。
26. 如申請專利範圍第1至25項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且其中可結合至PD-L1的胞外部分的所述可變域包括： -重鏈CDR3序列，其與選自由MF7689和MF7703所組成的群組的可變區的重鏈CDR3序列相同；或 -重鏈CDR3序列，其偏離MF7689或MF7703的重鏈CDR3序列不超過三個，較佳地不超過兩個，更佳地不超過一個胺基酸。
27. 如申請專利範圍第1至26項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且其中可結合至PD-L1的胞外部分的所述可變域包括： -重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列，其與選自由MF7689和MF7703所組成的群組的可變區的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列相同；或 -重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列，其偏離MF7689或MF7703的重鏈CDR1和CDR2和CDR3序列不超過三個，較佳地不超過兩個，更佳地不超過一個胺基酸。
28. 如申請專利範圍第1至27項中任一項所述的抗體或其變異體，包括可結合至PD-L1的胞外部分的可變域，且其中可結合至PD-L1的胞外部分的所述可變域包括： -重鏈可變區，其包含MF7689或MF7703的胺基酸序列，或 -重鏈可變區，其具有與MF7689或MF7703的胺基酸序列至少80%相同的序列。
29. 如申請專利範圍第1至28項中任一項所述的抗體或其變異體，包括輕鏈可變區，其具有如第1B圖中所示的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3序列或偏離如第1B圖中所示的輕鏈可變區CDR1、CDR2和CDR3序列不超過三個、較佳不超過兩個、更佳不超過一個胺基酸的CDR1、CDR2和CDR3序列。
30. 如申請專利範圍第1至29項中任一項所述的抗體或其變異體，包括具有與如第1B圖中所示的胺基酸序列至少80%相同的序列的輕鏈可變區。
31. 如申請專利範圍第1至30項中任一項所述的抗體或其變異體，其中所述抗體或其變異體的所述抗原結合位由一個可結合PD-1的胞外部分的免疫球可變域和一個可結合PD-L1或PD-L2的胞外部分的免疫球可變域所組成。
32. 如申請專利範圍第1至31項中任一項所述的抗體，其中所述抗體為全長雙特異性抗體。
33. 如申請專利範圍第1至32項中任一項所述的抗體，其中所述抗體為IgG。
34. 一種抑制第一或第二細胞中，由第一細胞上的CD28家族成員(第一膜蛋白質)與第二細胞上的B7家族成員(第二膜蛋白質)的結合所介導的生物活性的方法，其中所述第一和第二膜蛋白質是結合配偶體(即配位體和受體對)，所述方法包括 -對包括所述第一和第二細胞的系統提供抗體或維持所述抗體的結合特異性之所述抗體的變異體，所述抗體或其變異體包括可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的可變域和可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的可變域；以及 -在所述抗體或其變異體不存在的情況下，使所述系統培養於允許第一或第二細胞表現由所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合所介導的所述生物活性的條件下； -其中可結合至所述第一膜蛋白質的胞外部分的所述可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合，且/或可結合至所述第二膜蛋白質的胞外部分的所述可變域的結合阻斷所述第一膜蛋白質與所述第二膜蛋白質的結合。
35. 如申請專利範圍第34項所述的方法，其中所述抗體或其變異體的結合降低在所述第一細胞中的受體-配位體對的結合的抑制活性。
36. 如申請專利範圍第34或35項所述的方法，其中所述第一膜蛋白質為計劃性細胞死亡1蛋白質(Programmed Cell Death 1 protein，PD-1)；細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)；B-和T-淋巴細胞衰減子(B-and T-lymphocyte attenuator，BTLA)；或含有跨膜和免疫球蛋白質域的2 (Transmembrane And Immunoglobulin Domain Containing 2，TMIGD2)。
37. 如申請專利範圍第34至36項中任一項所述的方法，其中所述第二膜蛋白質為計劃性細胞死亡1配位體1蛋白質(Programmed Cell Death 1 Ligand 1 protein，PD-L1)；計劃性細胞死亡1配位體2蛋白質(Programmed Cell Death 1 Ligand 2 protein，PD-L2)；CD80；CD86；B7-H4；TNFRSF14；或B7-H7。
38. 如申請專利範圍第34至37項中任一項所述的方法，其中所述抗體或其變異體為申請專利範圍第1至33項中任一項的抗體或其變異體。
39. 一種自單一細胞產生申請專利範圍第1至31項中任一項的抗體或其變異體的方法，其中所述抗體或其變異體包括能夠形成界面的兩個CH3域，所述方法包括提供： -細胞，其具有a) 編碼IgG重鏈的第一核酸分子，所述IgG重鏈特異性辨認CD28家族的蛋白質、較佳為PD-1的胞外部分且含有第一CH3域，以及b) 編碼IgG重鏈的第二核酸序列，所述IgG重鏈特異性辨認B7家族的蛋白質、較佳為PD-L1的胞外部分且含有第二CH3域，其中提供所述核酸序列優先配對所述第一和第二CH3域的突變，所述方法更包括培養所述細胞且允許所述核酸序列的表現且自培養物收穫所述抗體或其變異體的步驟。
40. 如申請專利範圍第39項所述的方法，其中所述細胞具有編碼共同輕鏈，較佳地重新排列的生殖人類kappa輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01的第三核酸序列。
41. 如申請專利範圍第39或40項所述的方法，其中所述第一CH3域包括胺基酸取代L351K和T366K (根據EU編號編號)，且其中所述第二CH3域包括胺基酸取代L351D和L368E，所述方法更包括培養所述細胞並允許所述核酸序列的表現且自培養物收穫所述抗體或其變異體的步驟。
42. 一種如申請專利範圍第1至33項中任一項所述的抗體或其變異體作為藥物的用途。
43. 一種如申請專利範圍第1至33項中任一項所述的抗體或其變異體於治療癌症或病原體、較佳地病毒或寄生蟲、感染的方法中的用途。
44. 一種組合物或部分套組，包括至少一個如申請專利範圍第1至33項中任一項所述的抗體或其變異體。
45. 一種醫藥組合物，包括至少一個如申請專利範圍第1至33項中任一項所述的抗體或其變異體以及醫藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
46. 一種具有至少15個核酸之長度的核酸分子，其編碼至少一個申請專利範圍第1至33項中任一項的抗體或其變異體的CDR區。
47. 如申請專利範圍第46項所述的核酸分子，編碼申請專利範圍第1至33項中任一項的抗體或其變異體至少一重鏈可變區。
48. 如申請專利範圍第46或第47項所述的核酸分子，編碼如第3和/或13圖所示的重鏈可變區。
49. 一種核酸分子，編碼申請專利範圍第1-33項中任一項所述的抗體或變異體。
50. 一種載體，包括根據申請專利範圍第46-49項中任一項的核酸分子。
51. 一種分離或重組細胞、或一種非人類動物，包括根據申請專利範圍第46-49項中任一項的核酸分子或根據申請專利範圍第50項的載體。
52. 一種治療癌症或病原體感染的方法，包括對有此需要的個體投予治療上有效量之申請專利範圍第1至33項中任一項的抗體或變異體、或根據申請專利範圍第44或45項中任一項所述的組合物、或根據申請專利範圍第46至49項中任一項所述的核酸分子、或根據申請專利範圍第50項所述的載體。