CN113767114A - 半衰期延长的可活化治疗性多特异性多肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组异二聚体多肽及其在疗法中的用途,例如,用于治疗癌症。
Description
发明领域
本发明涉及一组异二聚体多肽及其用途,例如用于通过多肽链交换产生多特异性抗原结合剂。
背景技术
双特异性抗体例如通过CD3靶向表达在癌症和T细胞表面上的抗原,从而介导对于癌细胞的ADCC,通过该双特异性抗体进行的癌症治疗由于脱靶T细胞活化而导致给药方面的考验,这是不希望的。
EP3180361公开了前体分子,其中特异性地结合至CD3的结合位点在靶细胞上被激活。这种前体分子包含Fab片段,其中所述Fab片段的C末端与CH2结构域和可变抗体结构域(例如结合至CD3)融合。在靶细胞结合包含不同可变结构域的两个前体分子后,通过所述可变结构域的缔合形成功能性抗原结合位点(例如结合至CD3)。
Labrijn,A.F.等人公开了通过受控Fab臂交换有效生成稳定的双特异性IgG1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)。简而言之,使具有IgG样结构域布置(在CH3结构域内具有点突变)的两个单特异性前体分子接触,以进行多肽链交换,从而形成双特异性产物分子,该产物分子也是IgG样结构域布置。
未公布的现有技术PCT/EP2018/078675和PCT/EP2018/079523公开了通过多肽链交换从两种不同的前体分子产生多特异性抗原结合剂的方法。两种前体分子都是不对称结构域布置的异二聚体多肽。两种前体分子都包含具有以下特征的CH3结构域:根据“杵入臼”技术(WO 96/027011,Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9(1996)617-621和Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681)进行修饰的并且包含以不对称模式布置的进一步去稳定化突变。在每一种前体分子中,只有一个CH3结构域包含这种去稳定化突变。在多肽链交换后,形成两个产物分子,其中每一种产物分子包含来自每一种前体分子的多肽。前体分子和产物分子具有不同的结构域布置。PCT/EP2018/078675和PCT/EP2018/079523公开了待取代的前体分子的CH3/CH3界面中的氨基酸位置。
然而,在疗法方面仍然需要通过多肽链交换产生多特异性抗原结合剂的进一步方法。
发明内容
本发明涉及一组异二聚体前体多肽,其包含:
a)第一异二聚体前体多肽,其包含
-第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中第一重链多肽包含第一抗原结合部分的至少一部分;以及
-第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,
其中第一重链多肽和第二重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中CH3结构域中的一个包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;
b)第二异二聚体前体多肽,其包含
-第三重链多肽,该第三重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中抗体可变结构域能够与包含在第一异二聚体前体多肽的第一重链多肽中的抗体可变结构域形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点,其中该第三重链多肽包含第二抗原结合部分的至少一部分;以及
-第四重链多肽,该第四重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域;
其中第三重链多肽和第四重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中CH3结构域中的一个包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;
其中
A)或者i)第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域,并且第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域,或者ii)第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域,并且第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域;并且其中
B)或者
i)包含杵突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含臼突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域,或者
ii)包含臼突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含杵突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域包含将CH3/CH3界面去稳定化的氨基酸取代,其中氨基酸取代被布置为使得被取代的氨基酸与一对所述CH3结构域内的CH3/CH3界面相互作用。
本发明的一个实施例涉及本发明的一组异二聚体多肽,其中使CH3/CH3界面去稳定化的氨基酸取代选自以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
-具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
ο用疏水性氨基酸替换S354;
ο用带正电荷的氨基酸替换D356;
ο用带正电荷的氨基酸或用疏水性氨基酸替换E357;
ο用带正电荷的氨基酸替换D356,并且用带正电荷的氨基酸或用疏水性氨基酸替换E357;
ο用疏水性氨基酸替换S364;
ο用疏水性氨基酸替换A368;
ο用带负电荷的氨基酸替换K392;
ο用疏水性氨基酸替换T394;
ο用疏水性氨基酸替换D399,并且用带正电荷的氨基酸替换S400;
ο用疏水性氨基酸替换D399,并且用带正电荷的氨基酸替换F405;
ο用疏水性氨基酸替换V407;以及
ο用带负电荷的氨基酸替换K409;以及
ο用带负电荷的氨基酸替换K439;
-具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
ο用带正电荷的氨基酸替换Q347,并且用带负电荷的氨基酸替换K360;
ο用带负电荷的氨基酸替换Y349;
ο用疏水性氨基酸替换L351,并且用疏水性氨基酸替换E357;
ο用疏水性氨基酸替换S364;
ο用疏水性氨基酸替换W366,并且用带负电荷的氨基酸替换K409;
ο用疏水性氨基酸替换L368;
ο用带负电荷的氨基酸替换K370;
ο用带负电荷的氨基酸替换K370,并且用带负电荷的氨基酸替换K439;
ο用带负电荷的氨基酸替换K392;
ο用疏水性氨基酸替换T394;
ο用疏水性氨基酸替换V397;
ο用带正电荷的氨基酸替换D399,并且用带负电荷的氨基酸替换K409;
ο用带正电荷的氨基酸替换S400;
οF405W;
οY407W;以及
ο用带负电荷的氨基酸替换K439。
本发明的一个实施例涉及本发明的一组异二聚体多肽,其中使CH3/CH3界面去稳定化的氨基酸取代选自以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
-具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
ο用带正电荷的氨基酸替换E357;
ο用疏水性氨基酸替换S364;
ο用疏水性氨基酸替换A368;以及
ο用疏水性氨基酸替换V407;并且
-具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
ο用带负电荷的氨基酸替换K370;
ο用带负电荷的氨基酸替换K370,并且用带负电荷的氨基酸替换K439;
ο用带负电荷的氨基酸替换K392;以及
ο用疏水性氨基酸替换V397。
本发明的一个实施例涉及本发明的一组异二聚体多肽,其中第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分是抗体片段。
本发明的一个实施例涉及本发明的一组异二聚体多肽,其中在第一异二聚体多肽中,在两条包含所述CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中在第二异二聚体多肽中,在两条包含所述CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键。
本发明的一个实施例涉及本发明的一组异二聚体多肽,其中包含在第一重链多肽和第三重链多肽中的抗体可变结构域能够形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至CD3。
本发明的另一个方面是一种产生异二聚体多肽的方法,所述方法包括使本发明的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触,以形成包含第一重链多肽和第三重链多肽的第三异二聚体多肽。
本发明的一个实施例涉及本发明的产生异二聚体多肽的方法,所述方法包括使第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触,以形成包含第二重链多肽和第四重链多肽的第四异二聚体多肽。
本发明的一个实施例涉及该方法,其中在第一异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中在第二异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中该接触在不存在还原剂的情况下进行。
本发明的另一方面是通过根据本发明的方法获得的异二聚体多肽。
本发明的另一方面是根据本发明的一组异二聚体前体多肽,其用作药物。
本发明的另一方面是根据本发明的一组异二聚体前体多肽,其中在第一和第二异二聚体前体多肽中,包含在第一重链多肽和第三重链多肽中的抗体可变结构域能够形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至CD3,以用于治疗癌症。
通过本文公开的发明,提供了能够进行多肽链交换以便形成产物多肽的前体多肽。因此,可以产生多特异性抗原结合多肽。多特异性抗原结合多肽的产生涉及由于多肽链交换而激活抗原结合位点,导致特异性地结合至抗原的抗体可变结构域的缔合。而且,多特异性抗原结合多肽是在包含与特异性地结合至不同抗原的抗原结合部分的两个前体多肽之间组合和多肽链交换后形成的。此外,两种异二聚体前体多肽都包含CH2结构域,允许它们结合FcRn并进行FcRn再循环,导致该前体多肽在循环中的半衰期延长(与不包含CH2结构域的前体多肽相比)。值得注意的是,在两种前体多肽之间的多肽链交换后,形成一个没有CH2结构域的产物多肽。该产物多肽包含激活的抗原结合位点,并且在与靶标解离时或在脱靶激活的情况下可被迅速清除,从而减少不希望的脱靶效应。
本发明的方法和多组多肽可以有利地用于提供用于治疗性用途的抗原结合多肽;例如用于治疗癌症。
本发明的多组前体多肽的治疗性应用允许在靶标位点产生希望的产物多肽,从而减少产物多肽的不希望的脱靶效应。
附图说明
图1:根据本发明的异二聚体前体多肽和在多肽链交换后形成的相应产物多肽的示例性结构,其中多肽链交换导致抗原结合位点的激活。第一异二聚体前体多肽包含三条多肽链:1.第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、衍生自第一抗体的VH结构域和CH3。CH3结构域包含杵突变并且不包含去稳定化突变。2.第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含以下抗体结构域:CH2和CH3。CH3结构域包含臼突变和去稳定化突变。3.轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VL和CL。来自第一重链多肽的N端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至靶抗原。第一异二聚体前体多肽的重链多肽通过它们的CH3结构域彼此缔合。在第一和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。第二异二聚体前体多肽包含三条多肽链:1.第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、衍生自第一抗体的VL结构域和CH3。CH3结构域包含臼突变并且不包含去稳定化突变。2.第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含以下抗体结构域:CH2和CH3。CH3结构域包含杵突变和去稳定化突变。3.轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VL和CL。第一重链多肽的N端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至靶抗原。第二异二聚体前体多肽的重链多肽通过它们的CH3结构域彼此缔合。在第一和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。在多肽链交换后,形成异二聚体产物多肽。第一产物多肽包含来自前体多肽的两个抗原结合位点,即来自第一异二聚体前体多肽的抗原结合位点和来自第二异二聚体前体多肽的抗原结合位点。第一产物多肽包含来自第一和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽,它们通过它们的CH3结构域缔合。包含在第一产物多肽中的两条重链多肽都包含CH3结构域,这些CH3结构域不包含去稳定化突变。通过来自第一和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽的缔合,形成了一对衍生自第一抗体的VH结构域和衍生自第一抗体的VL结构域,它们形成了特异性地结合至第一抗原的抗原结合位点。该抗原结合位点不存在于任何前体多肽中并且仅在多肽链交换后形成(激活)。第二产物多肽包含来自第一异二聚体前体多肽的第二重链多肽和来自第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽。两条重链多肽通过它们的CH3结构域缔合。两个CH3结构域都包含去稳定化突变,它们相互作用并支持异二聚体产物多肽的形成。
图2:在根据实例4的概念验证实验中使用的异二聚体前体多肽和在多肽链交换后形成的相应产物多肽的示例性结构,其中多肽链交换导致抗原结合位点的激活。第一异二聚体前体多肽包含三条多肽链:1.第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、衍生自第一抗体的VH结构域和CH3。CH3结构域包含杵突变并且不包含去稳定化突变。2.第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含以下抗体结构域:衍生自第二抗体的VL结构域和CH3。CH3结构域包含臼突变和去稳定化突变。3.轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VL和CL。来自第一重链多肽的N端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至靶抗原。第一异二聚体前体多肽的重链多肽通过它们的CH3结构域彼此缔合。在第一和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。在衍生自第一抗体的VH结构域与来自第二重链多肽的VL结构域之间形成一对VH结构域和VL结构域。两个可变结构域彼此缔合,但不形成特异性地结合至抗原的抗原结合位点。第二异二聚体前体多肽包含三条多肽链:1.第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、衍生自第一抗体的VL结构域和CH3。CH3结构域包含臼突变并且不包含去稳定化突变。2.第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含以下抗体结构域:衍生自第三抗体的VH结构域和CH3。CH3结构域包含杵突变和去稳定化突变。3.轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VL和CL。第一重链多肽的N端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至靶抗原。第二异二聚体前体多肽的重链多肽通过它们的CH3结构域彼此缔合。在第一和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。在衍生自第一抗体的VL结构域与来自第二重链多肽的VH结构域之间形成一对VH结构域和VL结构域。两个可变结构域彼此缔合,但不形成特异性地结合至抗原的抗原结合位点。在多肽链交换后,形成异二聚体产物多肽。第一产物多肽包含来自前体多肽的两个抗原结合位点,即来自第一异二聚体前体多肽的抗原结合位点和来自第二异二聚体前体多肽的抗原结合位点。第一产物多肽包含来自第一和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽,它们通过它们的CH3结构域缔合。包含在第一产物多肽中的两条重链多肽都包含CH3结构域,这些CH3结构域不包含去稳定化突变。通过来自第一和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽的缔合,形成了一对衍生自第一抗体的VH结构域和衍生自第一抗体的VL结构域,它们形成了特异性地结合至第一抗原的抗原结合位点。该抗原结合位点不存在于任何前体多肽中并且仅在多肽链交换后形成(激活)。第二产物多肽包含来自第一异二聚体前体多肽的第二重链多肽和来自第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽。两条重链多肽通过它们的CH3结构域缔合。两个CH3结构域都包含去稳定化突变,它们相互作用并支持异二聚体产物多肽的形成。通过来自第一和第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽的缔合,形成了一对新的VH结构域和VL结构域。两个可变结构域在第二产物多肽中缔合。
图3:在根据实例4的概念验证实验中使用的异二聚体前体多肽和在多肽链交换后形成的相应产物多肽的示例性结构,其中多肽链交换导致抗原结合位点的激活。第一异二聚体前体多肽包含三条多肽链:1.第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、衍生自第一抗体的VH结构域、CH2和CH3。CH3结构域包含杵突变并且不包含去稳定化突变。2.第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含以下抗体结构域:衍生自第二抗体的VL结构域、CH2和CH3。CH3结构域包含臼突变和去稳定化突变。3.轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VL和CL。来自第一重链多肽的N端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至靶抗原。第一异二聚体前体多肽的重链多肽通过它们的CH3结构域彼此缔合。在第一和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。在衍生自第一抗体的VH结构域与来自第二重链多肽的VL结构域之间形成一对VH结构域和VL结构域。两个可变结构域彼此缔合,但不形成特异性地结合至抗原的抗原结合位点。第二异二聚体前体多肽包含三条多肽链:1.第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VH、CH1、肽连接体、衍生自第一抗体的VL结构域、CH2和CH3。CH3结构域包含臼突变并且不包含去稳定化突变。2.第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含以下抗体结构域:衍生自第三抗体的VH结构域、CH2和CH3。CH3结构域包含杵突变和去稳定化突变。3.轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VL和CL。第一重链多肽的N端VH结构域和来自轻链多肽的VL结构域形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至靶抗原。第二异二聚体前体多肽的重链多肽通过它们的CH3结构域彼此缔合。在第一和第二重链多肽之间没有形成链间二硫键。在衍生自第一抗体的VL结构域与来自第二重链多肽的VH结构域之间形成一对VH结构域和VL结构域。两个可变结构域彼此缔合,但不形成特异性地结合至抗原的抗原结合位点。在多肽链交换后,形成异二聚体产物多肽。第一产物多肽包含来自前体多肽的两个抗原结合位点,即来自第一异二聚体前体多肽的抗原结合位点和来自第二异二聚体前体多肽的抗原结合位点。第一产物多肽包含来自第一和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽,它们通过它们的CH3结构域缔合。包含在第一产物多肽中的两条重链多肽都包含CH3结构域,这些CH3结构域不包含去稳定化突变。通过来自第一和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽的缔合,形成了一对衍生自第一抗体的VH结构域和衍生自第一抗体的VL结构域,它们形成了特异性地结合至第一抗原的抗原结合位点。该抗原结合位点不存在于任何前体多肽中并且仅在多肽链交换后形成(激活)。第二产物多肽包含来自第一异二聚体前体多肽的第二重链多肽和来自第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽。两条重链多肽通过它们的CH3结构域缔合。两个CH3结构域都包含去稳定化突变,它们相互作用并支持异二聚体产物多肽的形成。通过来自第一和第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽的缔合,形成了一对新的VH结构域和VL结构域。两个可变结构域在第二产物多肽中缔合。
图4:在根据实例1的概念验证实验中使用的异二聚体前体多肽和在多肽链交换后形成的相应产物多肽的示例性结构。第一异二聚体前体多肽包含三条多肽链:1.第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VH、CH1、铰链、CH2和CH3。CH3结构域包含杵突变和半胱氨酸突变,并且不包含去稳定化突变。2.第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域铰链、CH2和CH3。标记部分融合到CH3结构域的C端。CH3结构域包含臼突变和去稳定化突变。3.轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VL和CL。VH结构域和VL结构域形成特异性地结合至第一抗原的抗原结合位点。第一异二聚体前体多肽的重链多肽通过它们的CH3结构域彼此缔合。铰链区包含链间二硫键。第二异二聚体前体多肽包含三条多肽链:1.第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VH、CH1、铰链、CH2和CH3。CH3结构域包含臼突变和半胱氨酸突变,并且不包含去稳定化突变。2.第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域铰链、CH2和CH3。标记部分融合到CH3结构域的C端。CH3结构域包含杵突变和去稳定化突变。3.轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含抗体结构域VL和CL。VH结构域和VL结构域形成特异性地结合至第二抗原的抗原结合位点。第二异二聚体前体多肽的重链多肽通过它们的CH3结构域彼此缔合。铰链区包含链间二硫键。在存在还原剂的情况下,铰链区中的链间二硫键被还原,从而将由第一和第二重链多肽形成的异二聚体去稳定化并支持多肽链交换。结果,形成了异二聚体产物多肽。第一产物多肽包含两个抗原结合位点,即来自第一异二聚体前体多肽的抗原结合位点和来自第二异二聚体前体多肽的抗原结合位点。第一产物多肽包含来自第一和第二异二聚体前体多肽的第一重链多肽,它们通过它们的CH3结构域缔合。包含在第一产物多肽中的两条重链多肽都包含CH3结构域,这些CH3结构域不包含去稳定化突变。两个CH3结构域都包含半胱氨酸突变,它们相互作用并支持异二聚体产物多肽的形成。在本实例中不包含抗原结合位点的第二产物多肽包含来自第一异二聚体前体多肽的第二重链多肽和来自第二异二聚体前体多肽的第二重链多肽。两条重链多肽通过它们的CH3结构域缔合。两个CH3结构域都包含去稳定化突变,它们相互作用并支持异二聚体产物多肽的形成。该产物多肽包含允许通过标签特异性色谱进行纯化的标签部分。
图5:本发明的抗LeY-CD3(VH)-杵前体和抗LeY-CD3(VL)-臼前体的SDS PAGE,如实例6中所述
图6:本发明的抗LeY-CD3(VH)-杵前体的体积排阻色谱,如实例6中所述
图7:本发明的抗LeY-CD3(VL)-臼前体的体积排阻色谱,如实例6中所述
图8:本发明的抗LeY-CD3(VH)-杵前体和抗LeY-CD3(VL)-臼前体以及由两个前体多肽之间的多肽链交换产生的双特异性抗LeY/抗CD3产物多肽的FcRn亲和色谱,如实例6中所述
图9:由单特异性抗LeY-CD3(VH)-杵前体与抗LeY-CD3(VL)-臼前体之间的多肽链交换产生的双特异性抗LeY/抗CD3双特异性抗体活化后的T细胞活化,如实例6中所述。
具体实施方式
1.定义
除非本文另有定义,否则与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外,除非上下文另有要求,否则单数术语应包括复数,而复数术语应包括单数。本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行。通常,与本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域公知的和常用的。
除非上下文另外清楚指出,否则术语“一个”、“一种”、“所述”一般包含复数指代。
除非本文另有定义,否则术语“包括”应包括术语“由……组成”。
除非上下文另外清楚指出,否则使用术语“或者……或者”提供的两种替代方案表示相互排斥的替代方案。
如本文所用,术语“抗原结合部分”是指与靶抗原特异性地结合的部分。该术语包括抗体以及能够特异性地结合至靶抗原的其他天然(例如受体、配体)或合成(例如DARPin)分子。
术语“抗体”以最广泛的含义使用,并且包括各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)和抗体片段,只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用,术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示抗原实际结合的抗原结合部分的一个或多个区域。在抗原结合部分是抗体的情况下,抗原结合位点包括抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(Vl),或VH/VL对。衍生自特异性地结合至靶抗原的抗体的抗原结合位点可衍生自:a)特异性地结合至抗原的已知抗体;或b)新的抗体或抗体片段,这些抗体或抗体片段通过使用特别是抗原蛋白或核酸或其片段的重新免疫化方法或通过噬菌体展示方法获得的。
当衍生自抗体时,根据本发明的抗体的抗原结合位点可包含六个互补决定区(CDR),这六个互补决定区在不同程度上有助于抗原结合位点的亲和力。有三个重链可变结构域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR和框架区(FR)的范围通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定,在该数据库中,已根据序列之间的变异性定义了那些区域。本发明范围内还包括由较少CDR组成的功能性抗原结合位点(即,结合特异性由三个、四个或五个CDR决定)。例如,少于完整的一组6个CDR对于结合可能是足够的。
如本文所用,术语“价”表示在抗体分子中存在指定数目的结合位点。例如,天然抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此,术语“三价”表示抗体分子中存在三个结合位点。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子,其包含完整抗体的一部分,该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;双体抗体;线性抗体;单链抗体分子(例如scFv、scFab);以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“特异性”是指抗原结合部分(例如,抗体)对于抗原的特定表位的选择性识别。例如,天然抗体为单特异性的。如本文所用,术语“单特异性抗体”表示具有一个或多个结合位点的抗体,每个结合位点结合至相同抗原的相同表位。“多特异性抗体”结合两个或更多个不同的表位(例如,两个、三个、四个或更多个不同的表位)。表位可以在相同或不同的抗原上。多特异性抗体的一个示例是结合两个不同表位的“双特异性抗体”。当抗体具有不止一种特异性时,识别的表位可能与单一抗原或不止一种抗原缔合。
表位是被抗原结合部分(例如,抗体)结合的抗原区域。术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或抗原结合部分的任何多肽决定簇。在某些实施例中,表位决定簇包括分子诸如氨基酸的化学活性表面基团、聚糖侧链、磷酰基或磺酰基,并且在某些实施例中,可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
如本文所用,术语“结合”和“特异性结合”是指在体外测定中,优选地在使用纯化的野生型抗原进行的等离子体共振测定(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)中,抗体或抗原结合部分与抗原表位的结合。在某些实施例中,当抗体或抗原结合部分优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时,该抗体或抗原结合部分被称为特异性地结合抗原。
抗体与抗原结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合速率常数)、kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。在一个实施例中,结合或其特异性地结合至是指10- 8mol/l或更小的结合亲和力(KD),在一个实施例中为10-8M至10-13mol/l。因此,抗原结合部分,特别是抗体结合位点,以10-8mol/l或更低的结合亲和力(KD)特异性地结合其特异性的每种抗原,例如,结合亲和力(KD)为10-8mol/l至10-13mol/l。在一个实施例中,结合亲和力(KD)为10-9mol/l至10-13mol/l。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构,其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见例如,Kindt等人,KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外,结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离,以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见,例如,Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
本申请内使用的术语“恒定结构域”或“恒定区”表示除可变区之外的抗体结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合,但表现出多种效应子功能。
根据其重链的恒定区的氨基酸序列,将抗体分为以下“类别”:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且它们中的一些可以进一步分为亚类,诸如IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有五种抗体类别中找到的轻链恒定区(CL)称为κ(卡帕)和λ(兰姆达)。
如本文所用,“恒定结构域”优选地来自人源,其来自亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区。这种恒定结构域和区在现有技术中是众所周知的,并且由例如Kabat等人《免疫学兴趣蛋白质序列(第五版》(Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(1991))描述。
在野生型抗体中,“铰链区”是IgG和IgA免疫球蛋白类的重链中央部分中的柔性氨基酸段,它通过二硫键连接两条重链,即“链间二硫键”,因为这些二硫键在两条重链之间形成。人IgG1的铰链区通常定义为从人IgG1的约Glu216或约Cys226延伸至约Pro230(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过使铰链区中的半胱氨酸残基缺失或将铰链区中的半胱氨酸残基取代为其他氨基酸诸如丝氨酸,避免了铰链区中二硫键的形成。
来自任何脊椎动物物种抗体的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列,可以配属为两种不同的类型中的一种,这两种类型分别称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。野生型轻链通常包含两个免疫球蛋白结构域,通常是一个对于结合至抗原而言很重要的可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。
存在几种不同类型的“重链”,它们定义了抗体的类别或同种型。野生型重链包含一系列免疫球蛋白结构域,通常具有一个对于结合至抗原而言很重要的可变结构域(VH)和几个恒定结构域(CH1、CH2、CH3等)。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区,该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中,人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。除非本文另外规定,否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***,EU编号***也称为EU索引,如在Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从大致231位的氨基酸残基延伸至大致340位的氨基酸残基。多特异性抗体没有CH2结构域。“没有CH2结构域”是指根据本发明的抗体不包含CH2结构域。
“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C末端的一段残基(即,从IgG的约341位的氨基酸残基到约447位的氨基酸残基)。本文的“CH3结构域”是变体CH3结构域,其中天然CH3结构域的氨基酸序列经过至少一个不同的氨基酸取代(即,对CH3结构域的氨基酸序列的修饰)以促进多特异性抗体中彼此面对的两个CH3结构域的异二聚化。
通常,在本领域已知的异二聚化方法中,一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域均以互补方式工程化,使得包含一条工程化CH3结构域的重链不再与另一条重链相同结构的重链同二聚化。因此,包含一个工程化CH3结构域的重链被迫与包含以互补方式工程化的CH3结构域的另一条重链异二聚化。
本领域中已知的一种异二聚化方法是所谓的“杵入臼”技术,该技术在例如WO 96/027011;Ridgway,J.B.,等人,Protein Eng.9(1996)617-621;Merchant,A.M.,等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681和WO 98/050431中提供几个示例进行详细描述,这些文献在此引入作为参考。在“杵入臼”技术中,在抗体三级结构中的两个CH3结构域之间形成的界面内,每个CH3结构域上的特定氨基酸被工程化以分别产生位于一个CH3结构域中的突起(“杵”)和位于另一个CH3结构域中的空腔(“臼”)。在多特异性抗体的三级结构中,被引入一个CH3结构域中的突起可定位在被引入另一个CH3结构域中的空腔内。
结合根据杵入臼技术的取代,可以将额外的链间二硫键引入CH3结构域中以进一步稳定异源二聚化的多肽(Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681)。例如,通过将以下氨基酸取代引入CH3结构域中来形成这样的链间二硫键:一个CH3结构域中的D399C和另一个CH3结构域中的K392C;一个CH3结构域中的Y349C和另一个CH3结构域中的S354C;一个CH3结构域中的Y349C和另一个CH3结构域中的E356C;一个CH3结构域中的Y349C和另一个CH3结构域中的E357C;一个CH3结构域中的L351C和另一个CH3结构域中的S354C;一个CH3结构域中的T394C和另一个CH3结构域中的V397C。如本文所用,“半胱氨酸突变”是指通过半胱氨酸对CH3结构域中的氨基酸进行的氨基酸取代,所述半胱氨酸能够与通过半胱氨酸对第二CH3结构域中的氨基酸进行的另一氨基酸取代匹配而形成链间二硫键。
除了之前提到的“杵入臼”技术之外,用于修饰CH3结构域以增强异二聚化的其他技术是本领域已知的。这些技术,尤其是在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的技术,在本文中被认为是用于本发明提供的多肽的“杵臼结构技术”。所有这些技术都涉及以互补方式工程化CH3结构域,通过引入带相反电荷或具有不同侧链体积的氨基酸,从而支持异二聚化。
本发明的前体多肽仅在它们的一个CH3结构域中包含“使CH3/CH3界面去稳定化”的氨基酸取代,本文也称为“去稳定化突变”。就这些末端而言,氨基酸取代是指,在异二聚体前体多肽中缔合的多个CH3结构域中,只有一个CH3结构域中布置氨基酸取代。在所述CH3结构域中,一个或多个已知在CH3/CH3界面内相互作用的氨基酸位置,例如,如与上述CH3-异二聚化策略相关的现有技术中公开的,被具有另一种位点链特性的氨基酸替换。与异二聚化策略相反,其中缔合的CH3结构域中的一对相互作用氨基酸(即异二聚体中涉及的一个CH3结构域中的一个或多个氨基酸残基;以及异二聚体中涉及的另一个CH3结构域中的一个或多个氨基酸残基)通常被取代,去稳定化突变仅布置在根据本发明的异二聚体前体多肽中所涉及的CH3结构域之一中。使CH3/CH3界面去稳定化的示例性氨基酸取代列在下面的“去稳定化突变”章节中。本文具体公开的所有示例性氨基酸取代被布置成使得取代的氨基酸在一对所述CH3结构域内的CH3/CH3界面中相互作用。
如本文所用,术语“多肽链”是指包含大量通过肽键连接在一起的氨基酸的线性有机聚合物。一个或多个多肽链形成“多肽”或“蛋白质”,其中这两个术语在本文中可互换使用。根据本发明的一组中提供的异二聚体前体多肽包含至少两条包含CH3结构域的多肽链。因此,包含第一CH3结构域的第一多肽链与包含第二CH3结构域的第二多肽链“缔合”以形成二聚体多肽。由于第一CH3结构域和第二CH3结构域根据杵入臼技术包含氨基酸取代,两条多肽链形成“异二聚体”,即由两个不同的多肽形成的二聚体。
异二聚体多肽中包含的多肽链,即异二聚体前体多肽和异二聚体产物多肽,包含一个或两个多肽结构域。当在本文中表示多肽结构域的顺序时,以N端至C端方向表示。
每个异二聚体前体多肽包含至少两条包含CH3结构域的多肽链。
如果两个异二聚体前体多肽中存在的抗原结合部分是抗体衍生的抗原结合位点,例如抗体片段,包含CH3结构域的多肽链在本文中也称为“重链多肽”。在这种情况下,异二聚体前体多肽还可以包含“轻链多肽”,通常包含抗体可变结构域和抗体恒定结构域,例如VL和CL。
本发明提供包含至少两种多肽的一组。该组包含至少两个异二聚体“前体”多肽。当前体多肽反应以进行彼此的多肽链交换时,形成“产物”多肽。本发明还提供了通过接触至少两种异二聚体前体多肽来产生异二聚体多肽,即异二聚体产物多肽的方法。接触步骤可以在任何合适的允许多肽链交换的情况下进行,优选地在合适的缓冲溶液中进行。“多肽链交换”在本文中与本发明相关时是指,包含CH3结构域的多肽链在两个异二聚体(前体)多肽之间的交换。当两条最初缔合的包含来自前体多肽的CH3结构域的多肽链解离,并且至少一条解离的多肽链通过与同样解离的包含衍生自另一前体多肽的CH3结构域的多肽链缔合而形成新的异二聚体时,就会发生多肽链交换。多肽链交换的机制也如图1所示。
“分离的”异二聚体多肽(例如抗体)是已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些实施例中,通过例如电泳(例如,SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如,离子交换或反相HPLC)确定,将抗体纯化至大于95%或99%的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述,请参见例如Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
如本文所用,重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号***编号的。特别地,对于κ和λ同种型的可变结构域和轻链恒定结构域CL,使用Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号***(参见第647-660页),而对于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3),使用Kabat EU索引编号***(参见第661-723页)。本文提供的氨基酸位置通常由下列表示
多肽链内的氨基酸“取代”或“替换”或“突变”(所有术语在本文中可互换地使用)是通过将适当的核苷酸变化引入抗体DNA或通过核苷酸合成来制备的。但是,此类修饰只能在非常有限的范围内进行。例如,修饰不会改变上述抗体特征,诸如IgG同种型和抗原结合,但可以进一步提高重组生产的产率、蛋白质稳定性或促进纯化。在某些实施例中,提供了具有一或多个保守性氨基酸取代的抗体变体。如本文所指的“双突变”是指两个所指出的氨基酸取代存在于各自的多肽链中。
如本文所用的术语“氨基酸”表示具有位于羧基基团的α-位的氨基部分的有机分子。氨基酸的示例包括:精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸。在各种情况下采用的氨基酸任选地为L型氨基酸。术语“带正电荷”或“带负电荷”氨基酸是指在pH 7.4时氨基酸侧链的电荷。可根据共同的侧链特性将氨基酸分组:
(1)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr、Phe;
(2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性或带负电荷:Asp、Glu;
(4)碱性或带正电荷:His、Lys、Arg;
(5)影响链取向的残基:Gly、Pro。
表–具有特定性质的氨基酸
如本文所用,“标签部分”是出于各种目的,遗传移植到多肽链上的肽序列以例如支持纯化。在一个实施例中,标记部分是亲和标签。因此,包含所述亲和标签的多肽可以通过适当的亲和技术纯化,例如,通过亲和色谱纯化。通常,标记部分通过肽连接体融合到CH3结构域的C端。通常,肽连接体由柔性的氨基酸残基如甘氨酸和丝氨酸组成。因此,用于将标签部分融合到多肽的典型肽连接体是甘氨酸-丝氨酸连接基,即由甘氨酸和丝氨酸残基的模式组成的肽连接体。
如本文所用,术语“纯化的”是指从它们的天然环境或从重组生产来源中移除,或以其他方式分离或分隔的多肽,并且至少60%(例如至少80%)不含与它们天然地缔合的其他成分,例如膜和微粒体。通过标准技术进行抗体纯化(例如从宿主细胞培养物回收抗体)以便消除细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质),所述标准技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域中熟知的其他技术。参见Ausubel,F.等人编撰的Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and WileyInterscience,New York(1987)。用于蛋白质纯化的各种不同的方法已经成功建立并且得到广泛应用,诸如使用微生物蛋白的亲和色谱(例如,使用纯化κ或λ同种型恒定轻链结构域所用的亲和介质,例如KappaSelect或LambdaSelect)、离子交换色谱(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)、亲硫吸附(例如,使用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附色谱(例如,使用苯基-琼脂糖、氮需氧(aza-arenophilic)树脂或间氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和色谱(例如,使用Ni(II)-亲和材料和Cu(II)-亲和材料)、体积排阻色谱和电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
包含标签部分的多肽可以通过“标签特异性亲和色谱”纯化。标签的适当纯化方法是本领域已知的。因此,包含poly(his)标签的多肽可以例如通过金属螯合亲和色谱,特别是镍螯合亲和色谱进行纯化。
如本文所用,术语“肽连接体”表示具有优选地为合成来源的氨基酸序列的肽。在用于本发明的异二聚体多肽中,肽连接体可用于将额外的多肽结构域,如抗体片段,融合到单个多肽链的C端或N端。在一个实施例中,所述肽连接体是具有长度为至少5个氨基酸的氨基酸序列的肽,在另一实施例中,长度为5至100个氨基酸,在又一实施例中为10至50个氨基酸。在一个实施例中,肽连接体是甘氨酸-丝氨酸连接基。在一个实施例中,肽连接体是由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。在一个实施例中,所述肽连接体是
(GxS)n或(GxS)nGm
其中G=甘氨酸,S=丝氨酸,并且
x=3,n=3、4、5或6,m=0、1、2或3;或者
x=4,n=2、3、4或5,m=0、1、2或3。
在一个实施例中,x=4且n=2或3,在另一实施例中,x=4,n=2。在一个实施例中,所述肽连接体是(G4S)2。
如本文所用,术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。例如,天然抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此,术语“三价”表示抗原结合分子中存在三个结合位点。
根据本发明的多肽通过重组方式产生。多肽(例如抗体)的重组生产方法是现有技术中所熟知的,并且包括在原核和真核宿主细胞中表达蛋白质,随后分离出多肽,并且通常将其纯化至药用纯度。为了在宿主细胞中表达上述多肽,通过标准方法将编码相应多肽链的核酸***表达载体中。在适当的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达,并从细胞(裂解后的上清液或细胞)中回收多肽。用于重组生产多肽(例如抗体)的一般方法是现有技术中所熟知的,并且综述于以下论文中:Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.,et al.,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161;Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
由宿主细胞产生的多肽可以经历对来自在C末端包含CH3结构域的多肽链的C末端的一个或多个,特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此,由宿主细胞通过表达编码次多肽链的特定核酸分子产生的多肽可以包括包含全长CH3结构域的全长多肽链,或者该多肽可以包括全长多肽链的经切割的变体(在本文中也称为“经切割的变体多肽链”)。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447)的情况。
本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物,并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基,和/或其类似物,或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸,诸如甲基化的核苷酸及其类似物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以包含在合成后进行的修饰,例诸如缀合至标记。其他类型的修饰包括,例如,“封端”,用类似的核苷酸间修饰,诸如,例如,那些具有不带电荷的键(例如,甲基磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯)和具有带电荷的键(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等),那些含有侧基部分的,诸如,例如,蛋白质(例如,核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸等),那些含有嵌入剂的(例如,吖啶、补骨脂素等),那些含有螯合剂的(例如,金属、放射性金属、硼、氧化性金属等),那些含有烷基化剂的,那些具有修饰键的(例如,α-异头核酸等)以及未修饰形式的一个或多个多核苷酸来取代一个或多个天然存在核苷酸。此外,糖中通常存在的任何羟基基团可以被(例如,磷酸酯基团、磷酸基团)替换,受标准保护基团保护,或者被活化以制备与另外的核苷酸的另外的连接,或者可以与固体或半固体支持物缀合。5'和3'末端的OH可被磷酸化或被1-20个碳原子的胺或有机封端基团部分取代。其他羟基也可以被衍生为标准保护基团。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式,包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(诸如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物和碱性核苷类似物诸如甲基核糖苷。一个或多个磷酸二酯键可以被可替代的连接基团替换。这些可替代的连接基团包括但不限于其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR2(“酰胺酸酯”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“甲缩醛”)替换,其中每个R或R'独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20C)任选地包含醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)的实施例。并非多核苷酸中的所有连接都需要相同。先前的描述适用于本文所指的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。
“经分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子,其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中,但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置处。
“编码异二聚体多肽的分离的核酸”是指编码所述异二聚体多肽的一个或多个多肽链(或其片段)的一个或多个核酸分子,包括在单一载体或独立的多个载体中的这种核酸分子,以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的这种核酸分子。
如本文所用,术语“载体”是指能够载运与其相链接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体,以及并入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。该术语包括主要用于将DNA或RNA***细胞(例如,染色体整合)的载体,主要用于DNA或RNA复制的载体的复制,以及用于DNA或RNA转录和/或翻译的表达载体。还包括提供不止一种所述功能的载体。
“表达载体”是能够引导与其可操作地连接的核酸的表达的载体。当表达载体被引入合适的宿主细胞内时,它可以被转录和翻译成多肽。当在根据本发明的方法中转化宿主细胞时,使用“表达载体”;因此,如本文所述,与宿主细胞转化相关的术语“载体”是指“表达载体”。“表达***”通常是指由表达载体组成的合适的宿主细胞,该表达载体能够产生所需的表达产物。
如本文所用,“表达”是指核酸借以转录成mRNA的过程和/或经转录的mRNA(也称为转录物)随后借以翻译成肽或多肽的过程。转录物和所编码的多肽单独地或统称为基因产物。如果核酸衍生自基因组DNA,则在真核细胞中的表达可能包括相应mRNA的剪接。
如本文所用,术语“转化”是指将载体或核酸转移到宿主细胞内的过程。如果使用没有强大细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞,则进行转染,例如通过Graham和Van der Eh,Virology 52(1978)546ff所述的磷酸钙沉淀法。然而,也可以使用将DNA引入细胞内的其他方法,诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或含有实质性细胞壁结构的细胞,例如,一种转染方法是使用氯化钙处理进行的钙处理,如Cohen,F.N等人,PNAS 69(1972)7110 et seq所述。
如本申请中所用,术语“宿主细胞”表示可以工程化以产生本发明所提供的多肽的任何种类的细胞***。
如本文所用,“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”的表述可互换使用,并且所有这种名称都包括后代。因此,词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和自其衍生的培养物而不考虑转移的数目。还应当理解,由于故意的或非故意的突变,所有后代可能在DNA含量上不是精确地相同的。包括如在原始转化细胞中筛选的具有相同功能或生物活性的变体子代。如果打算使用不同的名称,则从上下文中会很清楚。
瞬时表达描述于例如以下文献中:Durocher,Y.等人,Nucl.Acids.Res.30(2002)E9。可变结构域的克隆描述于例如以下文献中:Orlandi,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837;Carter,P.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289;和Norderhaug,L.,等人,J.Immunol.Methods 204(1997)77-87。优选的瞬时表达***(HEK293)描述于例如以下文献中:Schlaeger,E.-J.和Christensen,K.,Cytotechnology 30(1999)71-83;和Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods 194(1996)191-199。
术语“药物组合物”是指一种制剂,该制剂的形式允许该制剂中所含的活性成分的生物活性有效,并且该制剂不含对组合物将施用至的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。本发明的药物组合物可通过本领域中已知的多种方法来施用。如本领域的技术人员将认识到的,施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。为了通过某些施用途径施用根据本发明的抗体,可能需要用材料包被抗体或将抗体与材料共同施用以防止其失活。例如,异二聚体多肽可以在合适的载体例如脂质体或稀释剂中施用于受试者。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。
药物组合物包含有效量的本发明提供的异二聚体多肽。药剂(例如,异二聚体多肽)的“有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所希望的治疗或预防结果的量。特别地,“有效量”表述表示本发明的异二聚体多肽的量,当将其施用于受试者时,(i)治疗或预防特定疾病、病症或疾患,(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状,或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状的发作。治疗有效量将依据所使用的异二聚体多肽分子、被治疗的疾病状态、被治疗疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康情况、施用途径和形式、主治医生或兽医从业人员的判断和其他因素而变。
“药用载体”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个优选的实施例中,载体适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。
根据本发明的药物组合物还可包含佐剂,诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上述灭菌程序并且通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)以确保无微生物存在。还可能希望在组合物中包括等渗剂,例如糖、氯化钠等。此外,可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
如本文所用的短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”是指肠除了肠胃内和局部施用以外的其他施用方式(通常通过注射进行施用),并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。
不管选择何种施用途径,可以以合适的水合形式使用的本发明的化合物和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药用剂型。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化,以获得有效实现针对特定患者、组合物和给药方式的所希望治疗性应答的活性成分的量,而不会对患者产生毒性。所选剂量水平将取决于多种药代动力学因素,包括所采用的本发明特定组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的特定化合物的***速率、治疗的持续时间、与所采用的特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、被治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史,以及医学领域众所周知的类似因素。
组合物必须是无菌的且流动性达到组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外,在一个实施例中,载体是等渗缓冲盐水溶液。
例如,可以通过使用包衣诸如卵磷脂在分散的情况下通过保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下,优选在组合物中包括等渗剂,例如糖、多元醇诸如甘露醇或山梨糖醇、以及氯化钠。
如本文所用,“治疗(treatment)”(及其语法变型,诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预,并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态,以及缓解或改善预后。在一些实施例中,本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物,诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中,该个体或受试者为人。
2.具体实施方式
本发明提供了适用于例如通过多肽链交换在体内产生产物多肽的前体多肽。一种应用是通过新形成的一对VH结构域和VL结构域的缔合在细胞上产生抗原结合位点。
每个前体多肽包含一对CH3结构域,它们布置在通过所述CH3结构域彼此缔合的两条单独的多肽链上。所述CH3结构域包含几个氨基酸取代。因此,两条包含前体多肽中的CH3结构域的多肽链形成异二聚体。本发明提供的前体多肽的CH3结构域包含至少两种具有不同功能性的突变模式。第一种突变模式是支持所述两条包含CH3结构域的多肽链的异二聚化的突变,即,杵入臼突变。因此,前体多肽的一个CH3结构域包含杵突变并且前体多肽的另一个CH3结构域包含臼突变。第二种突变模式是仅在前体多肽异二聚体所涉及的CH3结构域之一中提供的一种或多种突变,其中所述突变使两条包含CH3结构域的多肽的相互作用去稳定化。因此,每个前体多肽包含一个具有一种或多种去稳定化突变的CH3结构域,这些突变被选择和布置为使得它们在前体多肽之间的多肽链交换后支持产物多肽的正确组装。
每个前体多肽包含一个重链多肽,该重链多肽包含一个抗体可变结构域,在相应的前体多肽中,该抗体可变结构域与布置在相应重链多肽中的CH2结构域缔合。抗体可变结构域衍生自特异性地结合至靶抗原的抗体,例如CD3,并且在前体多肽内布置为使得在多肽链交换和来自两种不同异二聚体前体多肽的第一重链多肽和第三重链多肽组装后,在所得产物多肽中形成新的抗原结合位点,该新的抗原结合位点特异性地结合至靶抗原,例如CD3。
前体多肽
在一方面,本发明提供了一组异二聚体前体多肽,其包含:
a)第一异二聚体前体多肽,其包含
-第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中第一重链多肽包含第一抗原结合部分的至少一部分;以及
-第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,
其中第一重链多肽和第二重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中CH3结构域中的一个包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;
b)第二异二聚体前体多肽,其包含
-第三重链多肽,该第三重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中抗体可变结构域能够与包含在第一异二聚体前体多肽的第一重链多肽中的抗体可变结构域形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点,其中该第三重链多肽包含第二抗原结合部分的至少一部分;以及
-第四重链多肽,该第四重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域;
其中第三重链多肽和第四重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中CH3结构域中的一个包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;
其中
A)或者i)第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域,并且第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域,或者ii)第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域,并且第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域;并且其中
B)或者
i)包含杵突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含臼突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域,或者
ii)包含臼突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含杵突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域包括一个或多个使CH3/CH3界面去稳定化的氨基酸取代。
在另一方面,本发明提供了一种第一异二聚体前体多肽,其包含:(i)第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中第一重链多肽包含第一抗原结合部分的至少一部分;和(ii)第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,其中第一重链多肽和第二重链多肽通过CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中一个CH3结构域包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;并且其中一个CH3包含(但另一个CH3结构域不包含)使CH3/CH3界面去稳定化的一个或多个氨基酸取代。
在另一方面,本发明提供了一种第二异二聚体前体多肽,其包含:(i)第三重链多肽,该第三重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中第三重链多肽包含第二抗原结合部分的至少一部分;和(ii)第四重链多肽,该第四重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,其中第三重链多肽和第四重链多肽通过CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中一个CH3结构域包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;并且其中一个CH3包含(但另一个CH3结构域不包含)使CH3/CH3界面去稳定化的一个或多个氨基酸取代。
在又一方面,本发明提供了根据本发明的第一异二聚体前体多肽与根据本发明的第二异二聚体多肽联合用于形成异二聚体产物多肽的用途。在一个实施例中,根据本发明的第一异二聚体前体多肽与根据本发明的第二异二聚体多肽联合用于通过多肽链交换形成异二聚体产物多肽。
在又一方面,本发明提供了根据本发明的第二异二聚体前体多肽与根据本发明的第一异二聚体多肽联合用于形成异二聚体产物多肽的用途。在一个实施例中,根据本发明的第二异二聚体前体多肽与根据本发明的第一异二聚体多肽联合用于通过多肽链交换形成异二聚体产物多肽。
在本发明的另一方面,提供了根据本发明的第一异二聚体前体多肽在根据本发明的一组异二聚体前体多肽中的用途。在本发明的另一方面,提供了根据本发明的第二异二聚体前体多肽在根据本发明的一组异二聚体前体多肽中的用途。
本发明的另一方面是根据本发明的第一异二聚体前体多肽在用于产生根据本发明的异二聚体多肽的方法中的用途。本发明的另一方面是根据本发明的第二异二聚体前体多肽在用于产生根据本发明的异二聚体多肽的方法中的用途。
本发明的另一方面是根据本发明的一组异二聚体前体多肽在用于产生根据本发明的异二聚体多肽的方法中的用途。本发明的另一方面是根据本发明的一组异二聚体前体多肽在用于鉴定根据本发明的多特异性异二聚体多肽的方法中的用途。
在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽包含至少两条(在一个实施例中恰好为两条)包含CH3结构域的多肽链,其中两条包含CH3结构域的多肽链中的一条包含特异性地结合至抗原的(第一)抗原结合部分的至少一部分;并且其中两条包含CH3结构域的多肽链中的另一条不包含特异性地结合至抗原的抗原结合部分。在一个实施例中,第二异二聚体前体多肽包含至少两条(在一个实施例中恰好为两条)包含CH3结构域的多肽链,其中两条包含CH3结构域的多肽链中的一条包含特异性地结合至抗原的(第一)抗原结合部分的至少一部分;并且其中两条包含CH3结构域的多肽链中的另一条不包含特异性地结合至抗原的抗原结合部分。在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽包含至少两条(在一个实施例中恰好为两条)包含CH3结构域的多肽链,其中两条包含CH3结构域的多肽链中的一条包含特异性地结合至抗原的(第一)抗原结合部分的至少一部分;并且其中两条包含CH3结构域的多肽链中的另一条不包含特异性地结合至抗原的抗原结合部分;并且第二异二聚体前体多肽包含至少两条(在一个实施例中恰好两条)包含CH3结构域的多肽链,其中两条包含CH3结构域的多肽链中的一条包含特异性地结合至抗原的(第一)抗原结合部分的至少一部分;并且其中两条包含CH3结构域的多肽链中的另一条不包含特异性地结合至抗原的抗原结合部分。换言之,根据本发明的该实施例,一个或多个功能性抗原结合部分仅布置在两条包含CH3结构域的多肽链中的一条上,而在另一条包含CH3结构域的多肽链上未布置功能性抗原结合部分。该多肽链在本文中也称为“模拟多肽”。在一个实施例中,模拟多肽仅与另一条包含CH3结构域的多肽链缔合,即在异二聚体中,但不与另一条(例如第三条)多肽链缔合。在一个实施例中,模拟多肽是包含CH2结构域和CH3结构域的多肽链。这种布置的一个优点,例如包含CH3结构域的模拟多肽与包含形成一个或多个功能性抗原结合位点所涉及的CH3结构域的多肽链的组合,在多肽链交换后形成的产物多肽与异二聚体前体分子的大小不同,其允许来自未反应的前体多肽的产物多肽进行改进。此外,这种布置允许未反应的前体多肽能够结合FcRn,从而延长这些多肽的半衰期,而包含激活的抗原结合位点的产物多肽不包含CH2结构域,并且在未与细胞上的靶抗原缔合时迅速从循环中清除。
如所指出的,在每个异二聚体前体多肽中,一条包含CH3结构域的多肽链包含具有杵突变的CH3结构域,而另一条包含CH3结构域的多肽链包含具有臼突变的CH3结构域。在多肽链交换后,包含来自第一前体多肽的具有杵突变的CH3结构域的多肽链与包含来自第二前体多肽的具有臼的CH3结构域的多肽链形成异二聚体(即第一异二聚体产物多肽),并且包含来自第一前体多肽的具有臼突变的CH3结构域的多肽链与包含来自第二前体多肽的具有杵的CH3结构域的多肽链形成异二聚体(即第二异二聚体产物多肽)。
如所指出的,包含在第一异二聚体前体多肽中的一个CH3结构域包含一个或多个去稳定化突变,如上所述,而包含在所述第一异二聚体前体多肽中的另一个CH3结构域不包含去稳定化突变;并且包含在第二异二聚体多肽中的一个CH3结构域包含一个或多个去稳定化突变,如上所述,而包含在所述第二异二聚体前体多肽中的另一个CH3结构域不包含去稳定化突变。存在于前体多肽中的去稳定化突变布置为使得它们在多肽链交换后存在于相同的产物多肽中。因此,在一个前体多肽中,一个或多个去稳定化突变布置在包含杵突变的CH3结构域中,而在另一前体多肽中,一个或多个去稳定化突变布置在包含臼突变的CH3结构域中。在一个实施例中,包含在第一异二聚体前体多肽中的去稳定化突变位于第一异二聚体前体多肽的模拟多肽的CH3结构域中,并且包含在第二异二聚体前体多肽中的去稳定化突变位于第二异二聚体前体多肽的模拟多肽的CH3结构域中。
在一个实施例中,在第一异二聚体前体多肽内,包含含有杵突变的CH3结构域的多肽链包含第一抗原结合部分的至少一部分,并且在第二异二聚体前体多肽内,包含具有臼突变的CH3结构域的多肽链包含第二抗原结合部分的至少一部分。
在一个实施例中,在第一异二聚体前体多肽内,包含含有臼突变的CH3结构域的多肽链包含第一抗原结合部分的至少一部分,并且在第二异二聚体前体多肽内,包含具有杵突变的CH3结构域的多肽链包含第二抗原结合部分的至少一部分。
在一个实施例中,异二聚体前体多肽包含恰好两条包含CH3结构域的多肽链。
在一个实施例中,包含去稳定化突变的CH3结构域包含一个、两个或三个去稳定化突变。在一个实施例中,包含去稳定化突变的CH3结构域包含一个或两个去稳定化突变。
在本发明的一个实施例中,在两条包含第一异二聚体多肽的CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键。在本发明的一个实施例中,在两条包含第二异二聚体多肽的CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键。在本发明的一个实施例中,在两条包含第一异二聚体多肽和第二异二聚体多肽的CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键。在两条包含CH3结构域的多肽链之间没有链间二硫键的异二聚体前体多肽能够在不存在还原剂的情况下进行多肽链交换。因此,其中在包含CH3结构域的多肽链之间不存在链间二硫键的异二聚体前体多肽特别适用于不可能或不希望存在还原剂的应用;例如用于疗法中的应用。
本发明包括异二聚体前体多肽,其中在具有杵突变的CH3结构域中,杵突变被去稳定化突变替换。例如,去稳定化突变可以布置在具有杵突变的CH3结构域中的位置366处,例如,T366W。因此,该异二聚体前体多肽包含位于在CH3结构域中的位置366处的去稳定化突变,即疏水性氨基酸,但不是色氨酸(W)。但是,具有这种取代的异二聚体前体多肽被认为涵盖在本发明中。
而且,本发明包括异二聚体前体多肽,其中在具有臼突变的CH3结构域中,一个或多个突变被去稳定化突变替换。例如,去稳定化突变可以布置在具有臼突变的CH3结构域中的位置368处,该突变是,例如,T366S L368A Y407V。因此,该异二聚体前体多肽包含位于在CH3结构域中的位置368处的去稳定化突变,即另一种疏水性氨基酸,但不是丙氨酸(A)。在另一实例中,去稳定化突变可以布置在具有臼突变的CH3结构域中的位置407处,该突变是,例如,T366S L368A Y407V。因此,该异二聚体前体多肽包含位于在CH3结构域中的位置407处的去稳定化突变,即另一种疏水性氨基酸,但不是缬氨酸(V)。但是,具有一个或多个这种取代的这种异二聚体前体多肽被认为涵盖在本发明中。
A)CH3结构域中的氨基酸取代
本发明提供的前体多肽在其CH3结构域中包含氨基酸取代。
杵入臼突变
在一个实施例中,包含在第一异二聚体前体多肽中的杵突变与包含在第二异二聚体前体多肽中的杵突变相同。
在一个实施例中,杵突变是T366W。在一个实施例中,臼突变是T366S L368AY407V。
去稳定化突变
如上所述,每个前体多肽的仅一个CH3结构域包含一个或多个去稳定化突变。
根据本发明,或者i)包含杵突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含臼突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域,或者ii)包含臼突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含杵突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域,包含一个或多个去稳定化突变。选择第一和第二异二聚体前体多肽内的一个或多个去稳定化突变,使得它们在由前体多肽之间的多肽链交换形成的产物多肽的CH3/CH3界面中相互作用。
在包含异二聚体前体多肽的杵突变的CH3结构域包含去稳定化突变的情况下,包含所述异二聚体前体多肽的臼突变的CH3结构域不包含去稳定化突变。当CH3结构域“不包含去稳定化突变”时,它包含位于相同类别的野生型免疫球蛋白CH3结构域中与包含在相应CH3结构域中的去稳定化突变位置处的氨基酸残基相互作用的位置处的野生型氨基酸残基。
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代,即去稳定化突变:用疏水性氨基酸替换S354;用带正电荷的氨基酸替换D356;用带正电荷的氨基酸或用疏水性氨基酸替换E357;用带正电荷的氨基酸替换D356并且用带正电荷的氨基酸用疏水性氨基酸替换E357;用疏水性氨基酸替换S364;用疏水性氨基酸替换A368;用带负电荷的氨基酸替换K392;用疏水性氨基酸替换T394;用疏水性氨基酸替换D399并且用带正电荷的氨基酸替换S400;用疏水性氨基酸替换D399并且用带正电荷的氨基酸替换F405;用疏水性氨基酸替换V407;和用带负电荷的氨基酸替换K409;和用带负电荷的氨基酸替换K439;而具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代,即去稳定化突变:用带正电荷的氨基酸替换Q347并且用带负电荷的氨基酸替换K360;用带负电荷的氨基酸替换Y349;用疏水性氨基酸替换L351并且用疏水性氨基酸替换E357;用疏水性氨基酸替换S364;用疏水性氨基酸替换W366并且用带负电荷的氨基酸替换K409;用疏水性氨基酸替换L368;用带负电荷的氨基酸替换K370;用带负电荷的氨基酸替换K370并且用带负电荷的氨基酸替换K439;用带负电荷的氨基酸替换K392;用疏水性氨基酸替换T394;用疏水性氨基酸替换V397;用带正电荷的氨基酸替换D399并且用带负电荷的氨基酸替换K409;用带正电荷的氨基酸替换S400;F405W;Y407W;和用带负电荷的氨基酸替换K439。
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代,即去稳定化突变:用带正电荷的氨基酸替换E357;用疏水性氨基酸替换S364;用疏水性氨基酸替换A368;和用疏水性氨基酸替换V407;而具有杵突变的CH3结构域或者不包含去稳定化突变,或者包含选自以下组的氨基酸取代,即去稳定化突变:用带负电荷的氨基酸替换K370;用带负电荷的氨基酸取代K370并且用带负电荷的氨基酸取代K439;用带负电荷的氨基酸取代K392;和用疏水性氨基酸取代V397。
在一个实施例中,疏水性氨基酸选自正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr和Phe。在一个实施例中,疏水性氨基酸选自Ala、Val、Leu、Ile和Tyr。在一个实施例中,疏水性氨基酸是Val、Leu或Ile。在一个实施例中,疏水性氨基酸是Leu或Ile。在一个实施例中,疏水性氨基酸是Leu。在一个实施例中,疏水性氨基酸是Tyr。在一个实施例中,疏水性氨基酸是Phe。
在一个实施例中,带正电荷的氨基酸是His、Lys或Arg。在一个实施例中,带正电荷的氨基酸是Lys或Arg。在一个实施例中,带正电荷的氨基酸是Lys。
在一个实施例中,带负电荷的氨基酸是Asp或Glu。在一个实施例中,带负电荷的氨基酸是Asp。在一个实施例中,带负电荷的氨基酸是Glu。
发现,在CH3结构域中的所指出的氨基酸位置用具有各自侧链特性的氨基酸进行的氨基酸取代支持多肽链交换和由两个前体多肽形成产物多肽。
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:S354V、S354I、S354L、D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、A368F、K392D、K392E、T394L、T394I、V407Y、K409E、K409D、K439D、K439E和双突变D399A S400K、D399A S400R、D399A F405W;而具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:Y349E、Y349D、S364V、S364I、S364L、L368F、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、S400K、S400R、F405W、Y407W、K349E、K439D和双突变Q347K K360E、Q347R K360E、Q347K K360D、Q347R K360D、L351F E357F、W366I K409E、W366L K409E、W366K K409D、W366LK409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D和D399K K409E。
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:S354V、D356K、E357K、E357F、S364L、A368F、K392E、T394I、V407Y、K409E、K439E和双突变D399A S400K;而具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:Y349E、S364V、L368F、K370E、K392D、T394I、V397Y、S400K、F405W、Y407W、K349E和双突变Q347K K360E、L351F E357F、W366I K409E和D399K K409E。
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、V407Y、K409E、K409D和双突变D399A S400K、D399A S400R;而具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:Y349E、Y349D、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E、K439D和双突变Q347K K360E、Q347R K360E、Q347K K360D、Q347R K360D、W366IK409E、W366L K409E、W366K K409D、W366L K409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D和D399K K409E。
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:D356K、E357K、E357F、S364L、V407Y、K409E和双突变D399A S400K;而具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:Y349E、K370E、K392D、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E和双突变Q347K K360E、W366I K409E和D399K K409E。
在本发明的一个实施例中,包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一:
为清楚起见,该表应理解为包含臼突变的CH3结构域包含如上表第一列所示的去稳定化突变,包含杵突变的CH3结构域包含上列右列中列出的去稳定化突变表,在同一行中指出。
在本发明的一个实施例中,包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一:
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:E357K、E357R、S364L、S364I、V407Y、V407F和A368F;而具有杵突变的CH3结构域或者不包含去稳定化突变,或者包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:K370E、K370D、K392E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E、K370D K439E、K370E K439D和K370D K439D。
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:E357K、S364L、V407Y和A368F;而具有杵突变的CH3构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:K370E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E。
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:E357K、E357R、S364L、S364I、V407Y和V407F;而具有杵突变的CH3构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:K370E、K370D、K392E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E、K370D K439E、K370E K439D和K370D K439D。
在本发明的一个实施例中,具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:E357K、S364L和V407Y;而具有杵突变的CH3构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代:K370E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E。
在本发明的一个实施例中,包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一:
为清楚起见,该表应理解为包含臼突变的CH3结构域包含如上表第一列所示的去稳定化突变,包含杵突变的CH3结构域包含上列右列中列出的去稳定化突变表,在同一行中指出。
在本发明的一个实施例中,包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一:
包含臼突变的CH3结构域 | 包含杵突变的CH3结构域 |
E357K | V397Y |
E357K | K370E |
E357K | K392D |
E357K | K370E K439E |
V407Y | V397Y |
V407Y | K370E |
S364L | V397Y |
S364L | K370E |
在本发明的一个实施例中,包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一:
为清楚起见,该表应理解为包含臼突变的CH3结构域包含如上表第一列所示的去稳定化突变,包含杵突变的CH3结构域包含上列右列中列出的去稳定化突变表,在同一行中指出。具有这种去稳定化突变组合的前体分子表现出特别有益的多肽链交换。
在本发明的一个实施例中,包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一:
为清楚起见,该表应理解为包含臼突变的CH3结构域包含如上表第一列所示的去稳定化突变,包含杵突变的CH3结构域包含上列右列中列出的去稳定化突变表,在同一行中指出。具有这种去稳定化突变组合的前体分子表现出特别有益的多肽链交换,同时可以高收率生产。
半胱氨酸突变
在本发明的一个实施例中,异二聚体前体多肽的CH3结构域包含第三种突变模式,即CH3/CH3界面中的不同氨基酸被半胱氨酸取代,以便允许在两个在相互作用位置处具有半胱氨酸取代的CH3结构域之间形成链间二硫键。
因此,在本发明的一个实施例中,或者i)第一异二聚体前体多肽的包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变,并且第二异二聚体前体多肽的包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变,或者ii)第一异二聚体前体多肽的包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变,并且第二异二聚体前体多肽的包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变。换言之,在一个实施例中,或者i)在第一异二聚体多肽内,包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变并且包含臼突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变,而在第二异二聚体多肽内,包含杵突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变并且包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变,或者ii)在第一异二聚体多肽内,包含杵突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变并且包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变,而在第二异二聚体多肽内,包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变并且包含臼突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变。
在一个实施例中,或者i)第一异二聚体前体多肽的包含杵突变的CH3结构域包含第一半胱氨酸突变,并且第二异二聚体前体多肽的包含臼突变的CH3结构域包含第二半胱氨酸突变,或者ii)第一异二聚体前体多肽的包含臼突变的CH3结构域包含第一半胱氨酸突变,并且第二异二聚体前体多肽的包含杵突变的CH3结构域包含第二半胱氨酸突变,其中第一和第二半胱氨酸突变选自以下的对:
第一半胱氨酸突变 | 第二半胱氨酸突变 |
D399C | K392C |
Y349C | S354C |
Y349C | E356C |
Y349C | E357C |
L351C | S354C |
T394C | V397C |
在一个实施例中,第一半胱氨酸突变是Y349C并且第二半胱氨酸突变是S354C。
在本发明的一个实施例中,或者i)第一异二聚体前体多肽的包含杵突变的CH3结构域包含取代S354C,并且第二异二聚体前体多肽的包含臼突变的CH3结构域包含取代Y349C,或者ii)第一异二聚体前体多肽的包含臼突变的CH3结构域包含取代Y349C,并且第二异二聚体前体多肽的包含杵突变的CH3结构域包含取代S354C。
在本发明的一个实施例中,在第一异二聚体前体多肽内,包含杵突变的CH3结构域包含取代S354C,并且包含臼突变的CH3结构域包含位于位置349处的Y;并且其中在第二异二聚体前体多肽内,包含臼突变的CH3结构域包含取代Y349C,并且包含杵突变的CH3结构域包含位于位置354处的S。
在本发明的一个实施例中,或者i)第一异二聚体前体多肽的包含杵突变的CH3结构域包含取代T366W S354C,并且第二异二聚体前体多肽的包含臼突变的CH3结构域包含取代T366S L368A Y407V Y349C,或者ii)第一异二聚体前体多肽的包含臼突变的CH3结构域包含取代T366S L368A Y407V Y349C,并且第二异二聚体前体多肽的包含杵突变的CH3结构域包含取代T366W S354C。
在本发明的一个实施例中,在第一异二聚体前体多肽内,包含杵突变的CH3结构域包含取代T366W S354C,并且包含臼突变的CH3结构域包含位于位置349处的Y和取代T366SL368A Y407V;并且其中在第二异二聚体前体多肽内,包含臼突变的CH3结构域包含取代T366S L368A Y407V Y349C,并且包含杵突变的CH3结构域包含位于位置354处的S和取代T366W。
在本发明的一个实施例中,异二聚体前体多肽的CH3结构域不包含链间二硫键。
B)抗原结合部分
在本发明的一个实施例中,抗原结合部分是特异性地结合至抗原的多肽。在一个实施例中,抗原结合部分选自以下组:能够特异性地结合至抗原的抗体、受体、配体和DARPin。
在本发明的一个实施例中,包含在根据本发明的(前体)多肽中的抗原结合部分是抗体片段。
在本发明的一个实施例中,抗原结合部分包含一对VH结构域和VL结构域,它们形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中,包含在根据本发明的(前体)多肽中的抗体片段是选自以下组的抗体片段:Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、双体抗体、scFv和scFab。在一个实施例中,包含在根据本发明的(前体)多肽中的抗体片段是Fv或Fab。
在一个实施例中,抗原结合部分是Fab片段。
在本发明的一个实施例中,第一抗原结合部分是第一Fab片段并且第二抗原结合部分是第二Fab片段。在本发明的一个实施例中,第一Fab片段、第二Fab片段或两者、第一和第二Fab片段通过结构域交叉而改变,使得或者:
a)仅CH1和CL结构域彼此替换;
b)仅VH和VL结构域彼此替换;或者
c)CH1和CL结构域彼此替换,并且VH和VL结构域彼此替换。
在一个实施例中,抗原结合部分是Fv片段。在本发明的一个实施例中,第一抗原结合部分是第一Fv片段并且第二抗原结合部分是第二Fv片段。
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分结合至相同抗原。在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分是相同的抗原结合部分。
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分结合至不同抗原。在这种情况下,在两个异二聚体前体多肽之间的多肽链交换后,形成多特异性产物多肽,其包含源自第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和源自第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分。
另外的抗原结合部分可以存在于异二聚体前体多肽中,其可以融合到包含在异二聚体前体多肽中的多肽链的N端或C端以提供更高价的产物多肽。
这种另外的抗原结合部分通过合适的肽连接体融合至多肽链。在一个实施例中,肽连接体是甘氨酸-丝氨酸连接基。
在本发明的一个实施例中,在异二聚体前体多肽中,包含CH3结构域的多肽链中只有一条包含抗原结合部分的至少一部分。在本发明的一个实施例中,在异二聚体前体多肽中,多肽链之一包含特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点的CH3结构域。在本发明的一个实施例中,在异二聚体前体多肽中,包含CH3结构域的多肽链之一从N端至C端方向上包含:铰链区、抗体可变结构域和CH3结构域,并且该多肽链不是特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点的一部分。在本发明的一个实施例中,在异二聚体前体多肽中,包含CH3结构域的多肽链之一从N端至C端方向上包含:铰链区、抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域,并且该多肽链不是特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点的一部分。
C)前体多肽的结构域布置
根据本发明的前体多肽适用于产生各种形式和具有各种结构域布置的产物多肽。依据异二聚体前体分子中提供的域的选择和抗原结合部分的数量,可以产生具有不同抗原结合特征(例如特异性、效价)和不同效应子功能的产物多肽。
在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽恰好包含两条包含CH3结构域的多肽链。因此,在第一和第二异二聚体前体多肽中可以包含没有CH3结构域的另外的多肽链。
包含抗体片段的前体多肽
在本发明的一个实施例中,抗原结合部分包含一对VH结构域和VL结构域,它们形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点;并且
a)第一异二聚体前体多肽进一步包含:
-另外的抗体可变结构域(第一抗体可变结构域),该另外的抗体可变结构域位于包含CH3结构域的第一重链多肽内,以及
-另外的多肽链,其是包含第二抗体可变结构域的轻链多肽,其中第一抗体可变结构域和第二抗体可变结构域一起形成第一抗原结合位点,该第一抗原结合位点特异性地结合至靶抗原;并且其中
b)第二异二聚体前体多肽包含:
-另外的抗体可变结构域(第三抗体可变结构域),该另外的抗体可变结构域位于所述包含CH3结构域的第三重链多肽内,以及
-另外的多肽链,其是包含第四抗体可变结构域的轻链多肽,其中第三抗体可变结构域和第四抗体可变结构域一起形成第二抗原结合位点,该第二抗原结合位点特异性地结合至靶抗原。
包含可激活的抗原结合位点的前体多肽
根据本发明,每个前体多肽包含抗原结合部分的一部分,其中所述抗原结合部分在前体多肽中不具有功能性,并且其中在由前体多肽之间的多肽链交换形成的产物多肽中,抗原结合部分具有功能性并且特异性地结合至靶抗原。这种前体多肽的示例性结构示于图1。
在本发明的一个实施例中,所述抗原结合部分是包含一对抗体可变结构域的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链,并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链,其中所述VL结构域和所述VH结构域在与一对VH结构域和VL结构域缔合时特异性地结合至抗原。在一个实施例中,被一对VH结构域和VL结构域特异性地结合的抗原是CD3。
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽包含一条从N端至C端方向上包含VL结构域和CH3结构域的多肽链,并且其中第二异二聚体前体多肽包含一条从N端至C端方向上包含VH结构域和CH3结构域的多肽链,其中所述VL结构域和所述VH结构域在与一对VH结构域和VL结构域缔合时特异性地结合至抗原。
在本发明的一个实施例中,
a)第一异二聚体前体多肽包含:
-第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域和CH3结构域,
-第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,其中第一重链多肽和第二重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中一个CH3结构域包含杵突变,而另一个CH3结构域包含臼突变;和
-轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含:第一VL结构域和CL结构域,其中第一VH结构域和第一VL结构域彼此缔合并形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点;并且其中
b)第二异二聚体前体多肽包含:
-第三重链多肽,该第三重链多肽从N端至C端方向上包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域和CH3结构域,
-第四重链多肽,该第四重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,其中第三重链多肽和第四重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中一个CH3结构域包含杵突变,而另一个CH3结构域包含臼突变;和
-轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含:第二VL结构域和CL结构域,其中第二VH结构域和第二VL结构域彼此缔合并形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点;并且其中
c)第一重链多肽和第三重链多肽的可变结构域能够形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点。
在一个实施例中,第一重链多肽从N端至C端方向上包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域,并且第二重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,其中第一重链多肽和第二重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中一个CH3结构域包含杵突变,并且另一个CH3结构域包含臼突变;并且第三重链多肽从N端至C端你方向上包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域,并且第四重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,其中第三重链多肽和第四重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中一个CH3结构域包含杵突变,并且另一个CH3结构域包含臼突变。在一个实施例中,包含在第一和第三重链多肽中的肽连接体是相同的。
包含铰链区的前体多肽
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两个重链多肽,所述重链多肽从N端至C端方向上包含铰链区和CH3结构域。
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽在铰链区内不包含链间二硫键。具有没有链间二硫键的铰链区的异二聚体前体多肽能够在没有还原剂的情况下进行多肽链交换。因此,具有没有链间二硫键的铰链区的异二聚体前体多肽特别适用于不可能或不希望存在还原剂的应用。因此,那些异二聚体前体多肽可有利地用于疗法中。
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含不形成链间二硫键的天然铰链区。一个示例是衍生自IgG4同种型抗体的铰链区肽。
代替没有链间二硫键的铰链区,异二聚体前体多肽可包含肽连接体,将抗原结合部分(的部分)与抗体结构域(即VL、VH或CH2)连接。在本发明的一个实施例中,在第一和第二肽连接体之间没有形成链间二硫键。在本发明的一个实施例中,第一和第二肽连接体彼此相同。
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含至少两条多肽链,所述多肽链从N端至C端方向上包含肽连接体和CH3结构域。
在本发明的一个实施例中,肽连接体是至少15个氨基酸的肽。在本发明的另一个实施例中,肽连接体是15-70个氨基酸的肽。在本发明的另一个实施例中,肽连接体是20-50个氨基酸的肽。在本发明的另一个实施例中,肽连接体是10-50个氨基酸的肽。依据例如要被可激活的结合位点结合的抗原类型,更短(或甚至更长)的肽连接体也可能适用于根据本发明的异二聚体前体多肽。
在本发明的又一实施例中,第一和第二肽连接体的长度大约为天然铰链区的长度(对于IgG1同种型的天然抗体分子,其长度约为15个氨基酸,而对于IgG3同种型,其长度约为62个氨基酸)。因此,在一个实施例中,其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽是IgG1同种型的,肽连接体是10-20个氨基酸的肽,在一个优选的实施例中,是12-17个氨基酸的肽。在另一实施例中,其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽是IgG3同种型的,肽连接体是55-70个氨基酸的肽,在一个优选的实施例中,是60-65个氨基酸的肽。
在本发明的一个实施例中,肽连接体是甘氨酸-丝氨酸连接基。在本发明的一个实施例中,肽连接体是由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。在本发明的一个实施例中,甘氨酸-丝氨酸连接基具有以下结构
(GxS)n或(GxS)nGm
其中G=甘氨酸,S=丝氨酸,x=3或4,n=2、3、4、5或6,并且m=0、1、2或3。
在一个实施例中,上述定义的甘氨酸-丝氨酸连接基中,x=3,n=3、4、5或6,并且m=0、1、2或3;或者x=4,n=2、3、4或5,并且m=0、1、2或3。在一个优选实施例中,x=4且n=2或3,并且m=0。在又一优选实施例中,x=4且n=2。在一个实施例中,所述肽连接体是(G4S)4或(G4S)6。
D)抗体同种型和效价
在本发明的一个实施例中,前体多肽包含一个或多个免疫球蛋白类别的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白类别包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型,在IgG和IgA的情况下,还包括它们的亚型。在本发明的一个实施例中,前体多肽具有IgG型抗体的恒定结构域结构。
在本发明的一个实施例中,包含在前体多肽中的CH3结构域属于哺乳动物IgG类。在本发明的一个实施例中,包含在前体多肽中的CH3结构域属于哺乳动物IgG1亚类。在本发明的一个实施例中,包含在前体多肽中的CH3结构域属于哺乳动物IgG4亚类。
在本发明的一个实施例中,包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG类。在本发明的一个实施例中,包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG1亚类。在本发明的一个实施例中,包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG4亚类。
在一个实施例中,根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于人IgG类。在一个实施例中,根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于人IgG1亚类。在一个实施例中,根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于人IgG4亚类。
在一个实施例中,前体多肽没有CH4结构域。
在本发明的一个实施例中,根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于相同的免疫球蛋白亚类。在本发明的一个实施例中,根据本发明的前体多肽的可变结构域和恒定结构域属于相同的免疫球蛋白亚类。
在本发明的一个实施例中,前体多肽是分离的前体多肽。在本发明的一个实施例中,产物多肽是分离的产物多肽。
在一个实施例中,包含包括CH3结构域的多肽链的异二聚体前体多肽或异二聚体产物多肽包括全长CH3结构域或CH3结构域,其中一个或两个C端氨基酸残基(即G446和/或K447)不存在。
在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的一部分;第二异二聚体前体多肽是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的另一部分。在所述实施例中,异二聚体产物多肽是双特异性的或三特异性的。
在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的一部分;第二异二聚体前体多肽是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的另一部分。在所述实施例中,异二聚体产物多肽是三特异性的。
在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽是双特异性的。在一个实施例中,第二异二聚体前体多肽是单特异性的。
在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽是双特异性的。在一个实施例中,第二异二聚体前体多肽是双特异性的。
在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽是单价的。在一个实施例中,第二异二聚体前体多肽是单价的。
在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽是二价的。在一个实施例中,第二异二聚体前体多肽是二价的。
在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽是三价的。在一个实施例中,第二异二聚体前体多肽是三价的。
在一个实施例中,异二聚体产物多肽是三价的。在一个实施例中,异二聚体产物多肽是四价的。
E)产生产物多肽的方法
在一个方面,本发明提供了一种产生异二聚体产物多肽的方法,该方法包括使本发明的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触以形成包含第一重链多肽和第三重链多肽的第三异二聚体多肽。在本发明的一个实施例中,该方法包括回收第三异二聚体多肽的步骤。在本发明的一个实施例中,第三异二聚体多肽包含至少三个抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中,该方法包括使第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触以形成包含第二重链多肽和第四重链多肽的第四异二聚体多肽。在本发明的一个实施例中,该方法包括回收第四异二聚体多肽的步骤。在本发明的一个实施例中,第四异二聚体多肽不包含特异性地结合至抗原的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽包含特异性地结合至第一抗原的抗原结合部分并包含第二抗原结合位点的一部分,其中第二异二聚体前体多肽包含特异性地结合至第三抗原的抗原结合部分并且包含第二抗原结合位点的另一部分,并且其中第三异二聚体多肽包含特异性地结合至第一抗原的抗原结合部分、特异性地结合至第二抗原的抗原结合部分和特异性地结合至第三抗原的抗原结合部分。
在本发明的一个实施例中,第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含不包含链间二硫键的铰链区。在这种情况下,多肽链交换可以在不存在还原剂的情况下发生。因此,在一个实施例中,第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含不包含链间二硫键的铰链区,并且第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽在不存在还原剂的情况下接触。
在本发明的一个实施例中,在第一异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且在第二异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中该接触在不存在还原剂的情况下进行。
F)异二聚体产物多肽
本发明的一个方面是通过本发明的产生异二聚体产物多肽的方法获得的异二聚体产物多肽。
本发明的一个方面是异二聚体多肽,在一个实施例中是异二聚体产物多肽,其包含如上定义的第一重链多肽和第三重链多肽。
本发明的另一方面是异二聚体多肽,在一个实施例中为异二聚体产物多肽,其包含如上定义的第二重链多肽和第四重链多肽。
根据本发明的异二聚体(产物)多肽或者(i)包含两个包含去稳定化突变的重链多肽,或者(ii)包含两个不包含去稳定化突变的重链多肽。在备选方案(i)中,与前体多肽相反,异二聚体(产物)多肽在两个CH3结构域中都包含去稳定化突变。在这种布置中,去稳定化突变不再使CH3/CH3界面去稳定化,而是支持重链多肽之间异二聚体的形成。上文针对本发明的异二聚体前体多肽中的去稳定化突变列出的所有实施例适用于异二聚体产物多肽。
因此,本发明的另一方面,产生异二聚体产物多肽的方法的另一产物是优选地通过本发明的方法获得的异二聚体产物多肽,其包含两条包含CH3结构域的多肽链,其中两个CH3结构域不包含去稳定化突变。
G)重组方法
根据本发明的前体多肽通过重组方法制备。因此,本发明还涉及制备根据本发明的异二聚体前体多肽的方法,包括在适合前体多肽表达的条件下培养包含编码异二聚体前体多肽的核酸的宿主细胞。
在一个方面,提供了一种制备本发明的异二聚体前体多肽的方法,其中该方法包括在适于异二聚体前体多肽表达的条件下培养包含如上提供的编码异二聚体前体多肽的核酸的宿主细胞,以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收该异二聚体前体多肽。
在一个实施例中,该方法包括以下步骤:用包含编码异二聚体前体多肽的核酸的表达载体转化宿主细胞,在允许合成所述异二聚体前体多肽的条件下培养所述宿主细胞,以及从所述宿主细胞培养物中回收所述异二聚体前体多肽。
为重组生产异二聚体前体多肽,将例如如上所述的编码异二聚体前体多肽的核酸分离并且***至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对这种核酸进行分离和测序(例如,通过使用能够特异性地结合至编码异二聚体前体多肽的多肽链的基因的寡核苷酸探针),或通过重组方法产生或通过化学合成获得这种核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如,异二聚体前体多肽可以在细菌中产生。关于多肽在细菌中的表达,参见例如US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(还参见Charlton,K.A.,在:Methods inMolecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.主编,Humana Press,Totowa,NJ(2003),第245-254页中,描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)异二聚体前体多肽在表达后可以在可溶性分级分离物中从细菌细胞糊状物中分离,并可以进一步纯化。
除原核生物外,诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码本发明异二聚体前体多肽的载体的合适克隆或表达宿主,包括这样的真菌和酵母菌株,该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”,从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414;以及Li,H.等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达(糖基化)异二聚体前体多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用,特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如,适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7);人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人,J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293T细胞);小仓鼠肾细胞(BHK);小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞);猴肾细胞(CV1);非洲绿猴肾细胞(VERO-76);人***细胞(HELA);犬肾细胞(MDCK);布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A);人肺细胞(W138);人肝细胞(Hep G2);小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562);TRI细胞(如例如在Mather,J.P.等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述);MRC 5细胞;以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220);以及骨髓瘤细胞系,诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编辑),Humana Press,Totowa,NJ(2004),第255-268页。
一方面,宿主细胞是真核细胞,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
在一个方面,本发明提供了一种编码本发明的异二聚体前体多肽的分离的核酸。在一个方面,本发明提供了一种包含根据本发明的核酸的表达载体。在另一方面,本发明提供了一种包含本发明核酸的宿主细胞。
I)治疗性应用
本发明的一组异二聚体前体多肽可用于治疗。用于治疗的异二聚体前体多肽包含如上定义的可激活的抗原结合位点。
因此,本发明的一个方面是根据本发明的一组异二聚体前体多肽,其用作药物。本发明的另一方面是一种包含本发明的一组异二聚体前体多肽和药用载体的药物组合物。本发明的另一方面是一种治疗患有疾病的个体的方法,包括向个体施用有效量的本发明的第一和第二异二聚体前体多肽或本发明的药物组合物。
本发明的一个方面是根据本发明的一组异二聚体前体多肽,其中第一重链多肽和第三重链多肽的可变结构域能够形成特异性地结合至CD3的抗原结合位点,以用于治疗癌症。本发明的另一方面是一种治疗患有癌症的个体的方法,包括向个体施用有效量的本发明的第一和第二异二聚体前体多肽,其中第一重链多肽和第三重链多肽的可变结构域能够形成特异性地结合至CD3的抗原结合位点。
在用于治疗的异二聚体前体多肽的一个实施例中,在第一异二聚体多肽中的两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且在第二异二聚体多肽中的两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键。在重链多肽之间不存在链间二硫键的情况下,多肽链交换在不存在还原剂的情况下发生,并且因此可以自发地发生;例如当两种异二聚体前体多肽都已经结合至靶抗原或靶细胞时。
3.本发明的具体实施例
1.一组异二聚体前体多肽,其包含:
a)第一异二聚体前体多肽,其包含
-第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中第一重链多肽包含第一抗原结合部分的至少一部分;以及
-第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,
其中第一重链多肽和第二重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中CH3结构域中的一个包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;
b)第二异二聚体前体多肽,其包含
-第三重链多肽,该第三重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中抗体可变结构域能够与包含在第一异二聚体前体多肽的第一重链多肽中的抗体可变结构域形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点,其中该第三重链多肽包含第二抗原结合部分的至少一部分;以及
-第四重链多肽,该第四重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域;
其中第三重链多肽和第四重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中CH3结构域中的一个包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;
其中
A)或者i)第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域,并且第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域,或者ii)第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域,并且第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域;并且其中
B)或者
i)包含杵突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含臼突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域,或者
ii)包含臼突变的第一异二聚体前体多肽的CH3结构域和包含杵突变的第二异二聚体前体多肽的CH3结构域包含将所述CH3/CH3界面去稳定化的一个或多个氨基酸取代,其中氨基酸取代被布置为使得被取代的氨基酸在一对CH3结构域内的CH3/CH3界面中相互作用。
2.根据实施例1所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
-具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
ο用疏水性氨基酸替换S354;
ο用带正电荷的氨基酸替换D356;
ο用带正电荷的氨基酸或用疏水性氨基酸替换E357;
ο用带正电荷的氨基酸替换D356,并且用带正电荷的氨基酸或用疏水性氨基酸替换E357;
ο用疏水性氨基酸替换S364;
ο用疏水性氨基酸替换A368;
ο用带负电荷的氨基酸替换K392;
ο用疏水性氨基酸替换T394;
ο用疏水性氨基酸替换D399,并且用带正电荷的氨基酸替换S400;
ο用疏水性氨基酸替换D399,并且用带正电荷的氨基酸替换F405;
ο用疏水性氨基酸替换V407;以及
ο用带负电荷的氨基酸替换K409;以及
ο用带负电荷的氨基酸替换K439;
-具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
ο用带正电荷的氨基酸替换Q347,并且用带负电荷的氨基酸替换K360;
ο用带负电荷的氨基酸替换Y349;
ο用疏水性氨基酸替换L351,并且用疏水性氨基酸替换E357;
ο用疏水性氨基酸替换S364;
ο用疏水性氨基酸替换W366,并且用带负电荷的氨基酸替换K409;
ο用疏水性氨基酸替换L368;
ο用带负电荷的氨基酸替换K370;
ο用带负电荷的氨基酸替换K370,并且用带负电荷的氨基酸替换K439;
ο用带负电荷的氨基酸替换K392;
ο用疏水性氨基酸替换T394;
ο用疏水性氨基酸替换V397;
ο用带正电荷的氨基酸替换D399,并且用带负电荷的氨基酸替换K409;
ο用带正电荷的氨基酸替换S400;
οF405W;
οY407W;以及
ο用带负电荷的氨基酸替换K439。
3.根据实施例1或2所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
a)具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:S354V、S354I、S354L、D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、A368F、K392D、K392E、T394L、T394I、V407Y、K409E、K409D、K439D、K439E和双突变D399A S400K、D399A S400R、D399A F405W;并且
b)具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:Y349E、Y349D、S364V、S364I、S364L、L368F、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、S400K、S400R、F405W、Y407W、K349E、K439D和双突变Q347K K360E、Q347R K360E、Q347KK360D、Q347R K360D、L351F E357F、W366I K409E、W366L K409E、W366K K409D、W366LK409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D和D399K K409E。
4.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
a)具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:S354V、D356K、E357K、E357F、S364L、A368F、K392E、T394I、V407Y、K409E、K439E和双突变D399AS400K;并且
b)具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:Y349E、S364V、L368F、K370E、K392D、T394I、V397Y、S400K、F405W、Y407W、K349E和双突变Q347KK360E、L351F E357F、W366I K409E和D399K K409E。
5.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
a)具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、V407Y、K409E、K409D和双突变D399A S400K、D399A S400R;并且
b)具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:Y349E、Y349D、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E、K439D和双突变Q347K K360E、Q347R K360E、Q347K K360D、Q347R K360D、W366I K409E、W366L K409E、W366K K409D、W366L K409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D和D399K K409E。
6.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
a)具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:D356K、E357K、E357F、S364L、V407Y、K409E和双突变D399A S400K;并且
b)具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:Y349E、K370E、K392D、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E和双突变Q347K K360E、W366I K409E和D399K K409E。
7.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含选自下表中指出的组的氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
8.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含选自下表中指出的组的氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
包含臼突变的CH3结构域 | 包含杵突变的CH3结构域 |
V407Y | K370E |
V407Y | K370E K439E |
V407Y | V397Y |
S364L | K439E |
S364L | W366I K409E |
S364L | K370E K439E |
S364L | D399K K409E |
S364L | T394I |
S364L | W366I K409E |
S364L | K370E K439E |
S364L | D399K K409E |
S364L | T394I |
9.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***进行的:
-具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
ο用带正电荷的氨基酸替换E357;
ο用疏水性氨基酸替换S364;
ο用疏水性氨基酸替换A368;以及
ο用疏水性氨基酸替换V407;并且
-具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
ο用带负电荷的氨基酸替换K370;
ο用带负电荷的氨基酸替换K370,并且用带负电荷的氨基酸替换K439;
ο用带负电荷的氨基酸替换K392;以及
ο用疏水性氨基酸替换V397。
10.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含选自下表中指出的组的氨基酸取代中的一种:
11.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含杵突变的CH3结构域和包含臼突变的CH3结构域包含选自下表中指出的组的氨基酸取代中的一种:
12.根据前述实施例中的一项所述的一组异二聚体多肽,其中第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分包含一对VH结构域和VL结构域,它们形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点。
13.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中第一抗原结合部分和/或第二抗原结合部分是抗体片段。
14.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中
a)第一异二聚体前体多肽进一步包含:
-另外的抗体可变结构域(第一抗体可变结构域),该另外的抗体可变结构域位于包含CH3结构域的第一重链多肽内,以及
-另外的多肽链,其是包含第二抗体可变结构域的轻链多肽,其中第一抗体可变结构域和第二抗体可变结构域一起形成第一抗原结合位点,该第一抗原结合位点特异性地结合至靶抗原;并且其中
b)第二异二聚体前体多肽包含:
-另外的抗体可变结构域(第三抗体可变结构域),该另外的抗体可变结构域位于所述包含CH3结构域的第三重链多肽内,以及
-另外的多肽链,其是包含第四抗体可变结构域的轻链多肽,其中第三抗体可变结构域和第四抗体可变结构域一起形成第二抗原结合位点,该第二抗原结合位点特异性地结合至靶抗原。
15.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽包含铰链区。
16.根据实施例15所述的一组异二聚体多肽,其中第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽在铰链区内不包含链间二硫键。
17.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中在第一异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中在第二异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键。
18.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体多肽,其中
a)第一异二聚体前体多肽包含:
-第一重链多肽,该第一重链多肽从N端至C端方向上包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域和CH3结构域,
-第二重链多肽,该第二重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,其中第一重链多肽和第二重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中一个CH3结构域包含杵突变,而另一个CH3结构域包含臼突变;和
-轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含:第一VL结构域和CL结构域,其中第一VH结构域和第一VL结构域彼此缔合并形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点;并且其中
b)第二异二聚体前体多肽包含:
-第三重链多肽,该第三重链多肽从N端至C端方向上包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域和CH3结构域,
-第四重链多肽,该第四重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,其中第三重链多肽和第四重链多肽经由CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中一个CH3结构域包含杵突变,而另一个CH3结构域包含臼突变;和
-轻链多肽,该轻链多肽从N端至C端方向上包含:第二VL结构域和CL结构域,其中第二VH结构域和第二VL结构域彼此缔合并形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点;并且其中
c)第一重链多肽和第三重链多肽的可变结构域能够形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点。
19.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体前体多肽,其中第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分结合至相同抗原。
20.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体前体多肽,其中第一异二聚体前体多肽的抗原结合部分和第二异二聚体前体多肽的抗原结合部分结合至不同抗原。
21.根据前述实施例之一所述的一组异二聚体前体多肽,其中包含在第一重链多肽和第三重链多肽中的抗体可变结构域能够形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至CD3。
22.一种用于产生异二聚体多肽的方法,所述方法包括使如实施例1至21之一中定义的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触,以形成包含第一重链多肽和第三重链多肽的第三异二聚体多肽。
23.如实施例23所述的方法,包括回收第三异二聚体多肽的步骤。
24.如实施例22或23之一所述的方法,包括使第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触,以形成包含第二重链多肽和第四重链多肽的第四异二聚体多肽。
25.如实施例24所述的方法,包括回收第四异二聚体多肽的步骤。
26.如实施例22至25之一所述的方法,其中第四异二聚体多肽不包含抗原结合位点。
27.如实施例22至26之一所述的方法,其中第三异二聚体多肽包含至少三个抗原结合位点。
28.如实施例22至27之一所述的方法,其中第一异二聚体前体多肽包含特异性地结合至第一抗原的抗原结合部分并包含第二抗原结合位点的一部分,其中第二异二聚体前体多肽包含特异性地结合至第三抗原的抗原结合部分并且包含第二抗原结合位点的另一部分,并且其中第三异二聚体多肽包含特异性地结合至第一抗原的抗原结合部分、特异性地结合至第二抗原的抗原结合部分和特异性地结合至第三抗原的抗原结合部分。
29.根据实施例22或28之一所述的方法,其中在第一异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中在第二异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中接触在不存在还原剂的情况下进行。
30.根据实施例22或28之一所述的方法,其中在第一异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间形成至少一个链间二硫键,并且其中在第二异二聚体多肽中,在两条包含CH3结构域的多肽链之间形成至少链间二硫键,并且其中接触在存在还原剂的情况下进行。
31.一种第三异二聚体多肽,其通过根据实施例22至30中任一项所述的方法获得。
32.一种第四异二聚体多肽,其通过根据实施例22至30中任一项所述的方法获得。
33.一种第一异二聚体前体多肽,其如实施例1至21中任一项中所定义。
34.一种第二异二聚体前体多肽,其如实施例1至21中任一项中所定义。
35.根据实施例1至21中任一项所述的一组异二聚体前体多肽,其用作药物。
36.一种药物组合物,其包含根据实施例1至21中任一项所述的一组异二聚体前体多肽和药用载体。
37.一种治疗患有疾病的个体的方法,包括向个体施用有效量的根据实施例1至21中任一项所述的第一和第二异二聚体前体多肽或根据实施例36所述的药物组合物。
38.根据实施例1至21中任一项所述的一组异二聚体前体多肽,其中在第一和第二异二聚体前体多肽中,包含在第一重链多肽和第三重链多肽中的抗体可变结构域能够形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至CD3,以用于治疗癌症。
39.一种治疗患有癌症的个体的方法,包括向个体施用有效量的根据实施例1至21中任一项的第一和第二异二聚体前体多肽,其中在第一和第二异二聚体前体多肽中,包含在第一重链多肽和第三重链多肽中的抗体可变结构域能够形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至CD3。
氨基酸序列的描述
实施例
提供以下实例以帮助理解本发明,本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解的是,在不脱离本发明精神的前提下,可以对阐明的程序进行修改。
实例1:
产生包含全Fc结构域的单特异性前体多肽,用于确定支持多肽链交换的去稳定化突变
本实例是用于鉴定适合支持多肽链交换并因此适用于本发明的去稳定化突变的概念验证实例。
为了评估多肽链交换通过多肽链交换从单特异性前体多肽产生双特异性抗生物胞素酰胺(biocytinamid)/抗荧光素抗体的功效,产生了以下单特异性前体多肽:
第一异二聚体前体多肽(也称为“抗bio前体”),其包含特异性地结合至生物胞素酰胺(“bio”,一种生物素衍生物)的Fab片段,以及SEQ ID NO:01所示的VL结构域和SEQ IDNO:02所示的VH结构域(描述于Dengl S等人,Hapten-directed spontaneous disulfideshuffling:a universal technology for sitedirected covalent coupling ofpayloads to antibodies.FASEB J 2015;29:1763–1779中)。第一前体多肽包含SEQ IDNO:03所示的轻链多肽(也称为“bio LC”)、SEQ ID NO:04所示的第一重链多肽(也称为“bioHC”)和基于SEQ ID NO:05(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟臼”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
第二异二聚体前体多肽(也称为“抗fluo前体”)包含特异性地结合至荧光素(“fluo”)的Fab片段,具有SEQ ID NO:06所示的VL结构域和SEQ ID NO:07所示的VH结构域。第二前体多肽包含SEQ ID NO:08所示的轻链多肽(也称为“fluo LC”)、SEQ ID NO:09所示的第一重链多肽(也称为“fluo HC”)和基于SEQ ID NO:10(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟杵”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
所示多肽链的CH3结构域包含以下突变:
表1:前体多肽的CH3结构域中的氨基酸取代
产生了包含具有SEQ ID NO:05所示氨基酸序列的模拟臼多肽的抗bio前体,其中进行了以下氨基酸取代之一:E357K、D356K、C349Y、C349A、C349W、E357F、A368F、F405W、V407Y、D399A F405W、L441Y、K409E、T394I、D356K E357K、L351Y、Q347K、S354V、K370E、S364L、K392E、K439E或D399A S400K。
产生了包含具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的模拟杵多肽的抗fluo前体,其中进行了以下氨基酸取代之一:K370E、K439E、C354S、C354S N297Q、S354E、S364L、Y407W、F405W、W366I K409E、K370E K439E、D399K K409E、Y349E、S364V、L368F、K392D、T394I、Q347KK360E、E357F、S400K或L351F E357F。
前体多肽的表达质粒如下产生:
对于如本文报道的抗bio和抗fluo前体的表达,使用包含以下功能元件的转录单元:
-来自人类巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期增强子和启动子,包括内含子A,
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR),
-鼠免疫球蛋白重链信号序列,
-编码相应前体多肽的核酸,和
-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGH pA)。
-除了包括所希望的待表达基因的表达单元/盒外,基础/标准哺乳动物表达质粒还包含
-来自载体pUC18的复制起点,其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制,以及
-β-内酰胺酶基因,其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
前体多肽的重组生产
如本文报道的抗bio和抗fluo前体的瞬时表达在Expi293FTM表达培养基(A1435101;Life TechnologiesTM)中使用转染试剂混合物ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(A14524;Life TechnologiesTM)在悬浮适应Expi293FTM细胞(A14527;LifeTechnologiesTM)中进行。
细胞在125ml摇瓶中解冻后通过稀释传代至少四次(体积30ml)(在37℃、7%CO2、85%湿度、135rpm下温育/摇动)。细胞在250ml体积中扩增至3x105个细胞/ml。三天后,分离细胞并以1.3*106个细胞/ml的密度在1升摇瓶中重新接种在250ml体积中。24小时后以大约2.2-2.8x106个细胞/ml的细胞密度进行转染。
在转染之前,将30μg质粒DNA用预热(水浴;37℃)Opti-MEM(Gibco)稀释成1.5ml的终体积。轻轻混合溶液并在室温下培养不超过5分钟。然后将1.5ml ExpiFectamineTM试剂在Opti-MEM中的预温育溶液加入DNA-OptiMEM溶液中。将所得溶液轻轻混合并在室温下温育20-30分钟。将整个体积的混合物添加到100ml摇瓶、50ml falcon管或48孔深孔板中的深孔中,其中含有30ml Expi293FTM培养物。
转染的细胞在37℃、7%CO2、85%湿度下培养7天,并在110rpm的摇瓶和205rpm的falcon管中摇动。
转染后16-24小时,将20μl ExpiFectamineTM增强子1和200μl ExpiFectamineTM增强子2添加到30ml细胞培养物中。
通过在4℃以4,000rpm离心20分钟来收获上清液。此后,不含细胞的上清液通过0.22μm瓶顶过滤器过滤并储存在冰箱(-20℃)中。
使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare,Sweden)通过亲和色谱从细胞培养上清液中纯化抗体。
简而言之,将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mMKH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe树脂上,用平衡缓冲液洗涤并用pH 3.0的25mM柠檬酸钠洗脱。将各个前体多肽的洗脱分级分离物合并,并用2M Tris,pH 9.0中和。
或者,使用抗Cκ树脂(KappaSelect,GE Healthcare,Sweden)通过亲和色谱从细胞培养上清液中纯化前体多肽。
简而言之,将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mMKH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡的KappaSelect树脂上,用平衡缓冲液洗涤并用pH 3.0的25mM柠檬酸钠洗脱。将洗脱的前体多肽分级分离物合并,并用2M Tris,pH9.0中和。
前体多肽的身份通过质谱确认。对于每个单独的样品,保守的Fc N-糖基化被酶促去除(使用N-糖苷酶F),蛋白质变性(盐酸胍)并减少二硫键(使用DTT或TCEP)。样品通过液相色谱(通过体积排阻或反相色谱)脱盐并通过质谱(Bruker Maxis Q-ToF)进行分析。每个分子的身份通过精确的质量测量和与理论预期分子质量的比较来确认。
通过BioSuite高分辨率SEC色谱柱(Waters,美国),使用200mM K2HPO4/KH2PO4、250mM KCl、pH 7.0运行缓冲液,流速为1mg/ml,进行分析型体积排阻色谱。在反应设置之前评估所有个体前体多肽的单体含量。
实例2:
通过ELISA直接检测双特异性产物多肽形成,借此分析多肽链交换效率
为了评估不同去稳定化突变对多肽链交换的影响,使用实例1中产生的前体多肽建立交换反应。本实验中的多肽链交换不会导致额外抗原结合位点的激活。
通过ELISA评估双特异性抗生物胞素酰胺/抗荧光素产物多肽的存在。
为了开始交换反应,在384孔板(Brooks,#1800030)上,将抗bio前体多肽和抗fluo前体多肽以等摩尔量混合(标准化为%单体SEC值以确保在单个反应中具有相同数量的完整分子),蛋白质浓度为2μM,总体积为48μl 1xPBS+0.05%Tween 20+0.25mMTCEP。值得注意的是,添加还原剂TCEP会还原铰链二硫化物,从而支持多肽链的解离。离心后,将板密封并在37℃下培养一小时。通过ELISA分析所得反应混合物。
随后使用生物素-荧光素桥接ELISA将双特异性抗体定量:
因此,用1μg/ml白蛋白-异硫氰酸荧光素偶联物(Sigma,#A9771)涂覆白色MaxiSorpTM384孔板,并在4℃下温育过夜。用90μl PBST缓冲液(PBST,双蒸水,10xPBS+0.05%Tween 20)洗涤3次后,以90μl/孔添加封闭缓冲液(1xPBS,2%明胶,0.1%Tween-20)并在室温下温育一小时。用90μl PBST缓冲液洗涤3次后,将25μl 1:4稀释的每种反应混合物添加到每个孔中。在室温下温育一小时后,再次用90μl PBST缓冲液洗涤板3次。将在0.5%BSA、0.025%Tween-20、1xPBS中的25μl/孔生物素-Cy5缀合物添加至终浓度为0.1μg/ml,并将板在室温下温育一小时。用90μl PBST缓冲液洗涤6次后,向每孔添加25μl 1xPBS。Cy5荧光在Tecan Safire 2Reader上以670nm的发射波长(649nm激发)测量。
预先形成的抗荧光素/抗生物胞素酰胺双特异性参考抗体(SEQ ID NO:03所示的bio轻链、SEQ ID NO:04所示的bio重链、SEQ ID NO:08所示的fluo轻链和SEQ ID NO:09所示的fluo重链)用作反应结果的100%对照。
预先形成的双特异性参考抗体通过分析型体积排阻色谱分析,如上所示:
表2:双特异性参考抗体的单体含量
桥接ELISA设置中参考抗体的吸光度信号是23次反应的平均值。该平均值用作所有多肽链交换反应标准化的100%桥接信号。桥接ELISA中参考抗体的测定变异性为100+/-15.2%。高于100%的多肽链交换反应可能属于这种可变性。此外,反应混合物中可能出现的潜在聚集体可能会导致桥接信号增加。
结果在表3中示出。
表3:通过多肽链反应从抗bio和抗fluo前体多肽形成双特异性产物多肽,所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含所指出的去稳定化突变。列表示抗bio前体的模拟臼多肽中的去稳定化突变;行表示抗fluo前体的模拟杵多肽中的去稳定化突变。列出了通过桥接ELISA检测到的相对吸光度。被认为支持多肽链交换的CH3突变对的相对吸光度值用下划线表示。
实例3:
通过对双特异性产物形成的生化定量来分析多肽链交换效率
一个子集的抗bio与抗fluo前体反应形成86种双特异性产物多肽。对于反应,将等摩尔量的如实例1中所述的前体多肽组合。将新鲜制备的TCEP(60当量的0.5mM TCEP在1xPBS pH 7.4,0.05%Tween20中)作为还原剂添加到反应混合物中,并将混合物在37℃下温育1小时,以300rpm的速度轻轻摇晃。
随着以1ml/min流速流经用50mM Na2HPO4、300mM NaCl、pH 8.0平衡的完整His-标签柱(罗氏诊断公司),分离出双特异性产物多肽。剩余的未反应前体多肽和由模拟链异二聚体组成的产物多肽通过其组氨酸标签保留,并用pH 8.0的50mM Na2HPO4、300mM NaCl、250mM咪唑洗脱,以用于分析目的。通过Amicon Ultra离心管(Millipore)将样品浓缩至0.2–1.5mg/ml的蛋白质浓度,并使用BioSuite高分辨率SEC色谱柱(5μm,Waters,USA)通过体积排阻色谱(SE-HPLC)进行分析(200mM K2HPO4/KH2PO4,250mM KCl,pH 7.0运行缓冲液,流速为0.5ml/min)以确定双特异性产物形成的纯度。使用CE-SDS(LabChip GXII(Perkin Elmer))来确定非还原条件(二硫桥的重新形成)和还原条件(蛋白质链的正确数量和存在)下的双特异性产物多肽质量。CE-SDS的样品制备如下:将5μl,c=0.1–1mg/ml与35μl样品缓冲液或样品变性溶液混合在96孔PCR板中,并在轻轻摇动下于70℃下温育10分钟。对于还原条件,将还原剂(NuPage)在HT Protein Express样品缓冲液中稀释10倍(例如100μl还原剂+900μl样品缓冲液)。随后将70μl纯水添加到样品中,并将样品板放入LAbChip***中进行分析。
表4显示了86个链交换反应的结果。来自具有特别高收率的CH3突变对的结果以下划线和粗体表示。显示了多肽链交换和纯化步骤后双特异性产物多肽的总产量,单位为mg。以%为单位的产品收率计算为校正到最大预期产品质量的重组产品的相对量。对于该计算,前体多肽的量已被校正为单体含量,如通过分析型体积排阻色谱分析,因为预计只有单体对重组有效。此外,考虑了最大预期产物质量受到较少丰度的前体多肽的限制。
表4:在多肽链交换后从抗bio和抗fluo前体多肽形成双特异性产物多肽以及纯化后的产量/收率,所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含所指出的去稳定化突变。
实例4:
单特异性前体多肽的产生以用于在多肽链交换后产生可激活的结合位点
本实例是用于鉴定去稳定化突变的概念验证实例,评估具有实例1至3中鉴定的去稳定化突变子集的多肽链交换的功效,并通过基于细胞的T细胞活化测定来评估多肽链交换对抗原结合位点的激活。
为了评估双特异性抗LeY/抗CD3抗体从单特异性前体多肽的形成,产生了针对图2和图3所示的第一和第二异二聚体前体多肽所描绘的结构域布置的单特异性前体多肽。
没有CH2结构域的前体多肽
在第一组实验中,提供了具有如图2所示结构域布置的异二聚体前体多肽。该前体多肽没有CH2结构域但包含布置在CH3结构域N端的抗体可变结构域。
在第一个替代方案中,提供了以下前体多肽:
-第一异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VH)-杵前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-杵前体包含SEQ ID NO:11所示的轻链多肽(也称为“LeYLC”)、SEQ ID NO:12所示的包含衍生自特异性地结合至CD3的抗体的VH结构域(“CD3(VH)”)的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VH)-杵HC”)和基于SEQ ID NO:13(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟-VL-臼”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、衍生自特异性地结合至地高辛(“dig”)的抗体的VL结构域和CH3结构域。
-第二异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VL)-臼前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-臼前体包含SEQ ID NO:11所示的轻链多肽(即LeY LC)、SEQID NO:14所示的包含衍生自特异性地结合至CD3的抗体的VL结构域(“CD3(VL)”)的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VL)-臼HC”)和基于SEQ ID NO:15(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟-VH-杵”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、衍生自非结合抗体的VH结构域和CH3结构域。
在第二个替代方案中,提供了以下前体多肽:
-第一异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VL)-杵前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-杵前体包含SEQ ID NO:11所示的轻链多肽(即LeY LC)、SEQID NO:16所示的包含CD3(VL)结构域的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VL)-杵HC”)和基于SEQ ID NO:17(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟-VH-臼”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、衍生自非结合抗体的VH结构域和CH3结构域。
-第二异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VH)-臼前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-臼前体包含SEQ ID NO:11所示的轻链多肽(即LeY LC)、SEQID NO:18所示的包含CD3(VH)结构域的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VH)-臼HC”)和基于SEQ ID NO:19(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟-VL-杵”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、衍生自抗dig抗体的VL结构域和CH3结构域。
所示多肽链包含以下突变:
表5:前体多肽的CH3结构域中的氨基酸取代
具有Fc结构域的前体多肽
在第二组实验中,提供了具有如图3所示结构域布置的异二聚体前体多肽。该前体多肽包含全Fc结构域并且包含布置在CH2结构域N端的抗体可变结构域。
在第一个替代方案中,提供了以下前体多肽:
-第一异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VH)-Fc(杵)前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-Fc(杵)前体包含SEQ ID NO:11所示的轻链多肽(即LeYLC)、SEQ ID NO:20所示的包含CD3(VH)结构域的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VH)-Fc(杵)HC”)和基于SEQ ID NO:21(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟-VL-Fc(臼)”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、衍生自特异性地结合至地高辛(“dig”)的抗体的VL结构域、CH2结构域和CH3结构域。
-第二异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VL)-Fc(臼)前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-Fc(臼)前体包含LeY LC;SEQ ID NO:22所示的包含CD3(VL)结构域的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VL)-Fc(臼)HC”);和基于SEQ ID NO:23(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟-VH-Fc(杵)”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、衍生自抗dig抗体的VH结构域、CH2结构域和CH3结构域。
在第二个替代方案中,提供了以下前体多肽:
-第一异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VL)-Fc(杵)前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-Fc(杵)前体包含LeY LC;SEQ ID NO:24所示的包含CD3(VL)结构域的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VL)-Fc(杵)HC”);和基于SEQ ID NO:25(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟-VH-Fc(臼)”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、衍生自抗dig抗体的VH结构域、CH2结构域和CH3结构域。
-第二异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VH)-Fc(臼)前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-Fc(臼)前体包含LeY LC;SEQ ID NO:26所示的包含CD3(VH)结构域的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VH)-Fc(臼)HC”);和基于SEQ ID NO:27(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟-VL-Fc(杵)”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、衍生自抗dig抗体的VL结构域、CH2结构域和CH3结构域。
所示多肽链包含以下突变:
表6:前体多肽的CH3结构域中的氨基酸取代
产生了异二聚体前体多肽,其包含SEQ ID NO:13所示的模拟VL-臼多肽和SEQ IDNO:17所示的模拟VH-臼多肽,具有如上所示的相应模拟多肽的氨基酸序列,其中进行了以下氨基酸取代之一:E357K、A368F、D399A F405W、S364L、Y407W或S354V。
产生了异二聚体前体多肽,其包含SEQ ID NO:15所示的模拟VH-杵多肽和SEQ IDNO:19所示的模拟VL-杵多肽,具有如上所示的相应模拟多肽的氨基酸序列,其中进行了以下氨基酸取代之一:K370E、无去稳定化突变、W366I K409D、V397Y或K392D。
产生了异二聚体前体多肽,其包含SEQ ID NO:21所示的模拟VL-Fc(臼)多肽和SEQID NO:25所示的模拟VH-Fc(臼)多肽,具有如上所示的相应模拟多肽的氨基酸序列,其中进行了以下氨基酸取代之一:E357K、A368F、D399A F405W、S364L、D356K或S354V。
产生了异二聚体前体多肽,其包含SEQ ID NO:23所示的模拟-VH-Fc(杵)多肽和SEQ ID NO:27所示的模拟-VL-Fc(杵)多肽,具有如上所示的相应模拟多肽的氨基酸序列,其中进行了以下氨基酸取代之一:K370E、无去稳定化突变、W366I K409D、V397Y、K392D或K370E K439E。
前体多肽的重组生产
通过现有技术将每种前体多肽的三个多肽链共转染到哺乳动物细胞(例如HEK293或Expi293FTM)中来进行质粒的共转染,借此进行表达。
为了表达上述前体多肽,使用了包含以下功能元件的转录单元:
-来自人类巨细胞病毒(P-CMV)的即刻早期增强子和启动子,包括内含子A,
-人重链免疫球蛋白5'-非翻译区(5'UTR),
-鼠免疫球蛋白重链信号序列,
-编码相应前体多肽的核酸,和
-具有多腺苷酸化信号序列的3'非翻译区。
除了包括所希望的待表达基因的表达单元/盒外,基础/标准哺乳动物表达质粒还包含
-复制起点,其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制,以及
-β-内酰胺酶基因,其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
通过PCR和/或基因合成产生编码包含前体多肽链的表达盒,并将所述表达盒通过已知的重组方法和技术,通过例如使用相应质粒中的独特限制性位点连接相应的核酸区段来进行组装。通过DNA测序来验证亚克隆的核酸序列。为了进行瞬时转染,通过质粒制备从转化的大肠杆菌培养物制备较大量的质粒(HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒,Qiagen)。
使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑),John Wiley&Sons,Inc中所述的标准细胞培养技术。
根据制造商的说明,使用HEK293-F***(Invitrogen)或Expi293FTM***(LiveTechnologies),通过瞬时转染相应的质粒来产生前体多肽衍生物。简而言之,在摇瓶或搅拌发酵罐中在无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)或Expi293FTM表达培养基(Live Technologies)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)或Expi293FTM细胞(LiveTechnologies)用各自的表达质粒和293fectinTM、fectin(Invitrogen)或PEIpro(Polyplus)或试剂混合物ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(Life Technologies)转染。对于1-2L摇瓶(Corning),将HEK293-F细胞或Expi293FTM细胞以1-1.3*106个细胞/mL的密度接种于250-600mL中并在120rpm、8%CO2下温育。用适当的表达质粒转染细胞后的第二天。HEK293-F细胞以约1.5*106个细胞/mL的细胞密度用约42mL的以下混合物转染:A)具有300μg总质粒DNA(0.5μg/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)和B)20ml Opti-MEM+1.2mL293fectin或fectin(2μL/mL)或750μl的PEIpro(1.25μL/mL)。Expi293FTM细胞以大约2.2-2.8x106个细胞/ml的细胞密度转染。在转染之前,将30μg质粒DNA用预热(水浴;37℃)Opti-MEM(Gibco)稀释成1.5ml的终体积。轻轻混合溶液并在室温下培养不超过5分钟。然后将1.5ml ExpiFectamineTM试剂在Opti-MEM中的预温育溶液加入DNA-OptiMEM溶液中。将所得溶液轻轻混合并在室温下温育20-30分钟。将全部体积的混合物添加到具有30mlExpi293FTM培养物的100ml摇瓶中。将培养物在37℃、7%CO2、85%湿度下以110rpm的速度温育7天。对于Expi293FTM培养物,在转染后15-24小时,将20μl ExpiFectamineTM增强子1和200μl ExpiFectamineTM增强子2添加到30ml细胞培养物中.根据葡萄糖消耗量,在发酵过程中添加葡萄糖溶液。正确组装的***细胞因子分子像标准IgG一样被分泌到培养物上清液中。5-10天后收获含有***细胞因子分子的上清液,直接从上清液中纯化***细胞因子分子,或者将上清液冷冻在-20℃并储存。
具有完整Fc区(CH2-CH3)的前体多肽结合至ProteinA。这些前体通过proteinA色谱和SEC进行纯化。
没有CH2结构域的前体多肽含有κ轻链。因此,通过应用标准κ轻链亲和色谱来纯化这些前体。使用KappaSelect(GE Healthcare,Sweden)和Superdex 200体积排阻(GEHealthcare,Sweden)色谱或离子交换色谱,通过亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化前体多肽。
简而言之,将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mMKH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl,pH 7.4)平衡的KappaSelect树脂上,用平衡缓冲液洗涤并用pH 3.0的50mM柠檬酸钠、150mM NaCl洗脱。将洗脱的前体多肽分级分离物合并,并用2MTris,pH 9.0中和。通过体积排阻色谱或离子交换色谱进一步纯化前体多肽库。对于体积排阻色谱,使用20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0平衡的SuperdexTM200pg HiLoadTM16/600(GEHealthcare,Sweden)色谱柱。对于离子交换色谱,将从KappaSelect纯化中获得的蛋白质样品在20mM组氨酸,pH 6.0中按1:10稀释,并加载到用缓冲液A(20mM组氨酸,pH值6.0)平衡的HiTrapTMSP HP离子交换(GE Healthcare,Sweden)色谱柱上。应用0-100%缓冲液B(20mM组氨酸,1M NaCl,pH 6.0)的梯度来洗脱不同的蛋白质物质。
通过SDS-PAGE纯化后分析纯度和完整性。将蛋白质溶液(13μl)与5μl 4x NuPAGELDS样品缓冲液(Invitrogen)和2μl 10x NuPAGE样品还原剂(Invitrogen)混合并加热至95℃,加热5分钟。将样品加载到NuPAGE 4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上并根据制造商的说明使用Novex Mini-Cell(Invitrogen)和NuPAGE MES SDS运行缓冲液(LifeTechnologies)运行。凝胶使用InstantBlueTM考马斯蛋白质染色剂染色。此外,使用分析型体积排阻色谱分析蛋白质的完整性和均匀性。
(CE-)SDS-PAGE显示所有预期的多肽链都存在于制剂中;分析型体积排阻确认了>90%的制剂纯度。关于用于评估例如抗体纯度的方法的综述,参见Flatman,S.等人,J.Chrom.B 848(2007)79-87。
实例5:
通过T细胞活化测定来确定多肽链交换
为了评估不同去稳定化突变对多肽链交换的影响,使用实例4中产生的前体多肽建立交换反应作为概念验证实验。没有CH2结构域的前体多肽的预期产物多肽的结构在图2中描绘,而包含完整Fc结构域的前体多肽则描绘在图3中。多肽链交换导致形成特异性地结合至CD3的抗原结合位点。双特异性抗LeY/抗CD3产物多肽的存在通过基于细胞的测定进行评估。
在由表达LeY的MCF7细胞和Jurkat报告细胞系(Promega J1621)组成的基于细胞的报告基因测定***中,根据以下原理评估了不同CH3界面突变对该链交换反应功效的影响:第一和第二异二聚体多肽与MCF7细胞的结合和多肽链交换导致形成特异性地结合至CD3的抗原结合位点。表达CD3的Jurkat细胞被特异性地结合至CD3的抗原结合位点结合,这导致来自Jurkat细胞的荧光素酶表达。在添加BioGlo底物后检测到发光。
简而言之,基于细胞的测定如下所述在384孔板中进行。使用具有10%FCS的RPMI1640作为测定培养基。将6x104个Jurkat效应细胞与2x104个MCF7细胞混合,总体积为10μl。前体多肽以200nM和2nM单独或联合应用,最终体积为30μl。细胞在细胞培养条件下温育20小时。向每孔添加24μl Bioglo,温育5分钟。在200PRO读取器(TECAN)中测量发光。
表7:通过多肽链反应从如上文实例3中定义的不含CH2结构域的前体多肽形成双特异性产物多肽,所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含所指出的一个或多个去稳定化突变。结果显示为前体多肽浓度为200nM时的交换反应。发光功效评定如下:<10%…“-”,10-29%…“+”,30-50%…“++”,>50%…“+++”
表8:通过多肽链反应从如上文实例3中定义的不含CH2结构域的前体多肽形成双特异性产物多肽,所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含所指出的一个或多个去稳定化突变。结果显示为前体多肽浓度为2nM时的交换反应。发光功效评定如下:<2%…“-”,2-4%…“+”,5-10%…“++”,>10%…“+++”
表9:通过多肽链反应从如上文实例3中定义的具有Fc结构域的前体多肽形成双特异性产物多肽,所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含所指出的一个或多个去稳定化突变。结果显示为前体多肽浓度为2nM时的交换反应。发光功效评定如下:<10%…“-”,10-19%…“+”,20-50%…“++”,>50%…“+++”
实例5:
通过T细胞活化测定来测量溶液中多肽链交换和细胞上多肽链交换的组合评估
对于治疗性应用,需要减少不希望的脱靶效应。因此,异二聚体前体多肽治疗性地用作前药,以在多肽链交换后形成治疗活性产物多肽。希望多肽链交换优选地仅在前体多肽与靶细胞结合后很大程度地发生,而循环中的自发多肽链交换不发生或只是很小程度地发生。因此,在进行多肽链交换以在靶细胞处激活抗原结合位点的同时,在溶液中表现出轻度或低程度多肽链交换的前体多肽对于治疗性应用是特别需要的。因此,将实例2(在溶液中进行多肽链交换)和实例4(在细胞上进行多肽链交换)的结果进行比对。
表10:通过多肽链反应从前体多肽形成双特异性产物多肽,所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含所指出的去稳定化突变。列表示模拟杵多肽中的去稳定化突变;行表示模拟臼多肽中的去稳定化突变。显示了每对去稳定化突变在溶液中(“IS”,如实例2中检测到的)和细胞上(“OC”,如实例4中针对不含CH2结构域的多肽检测到的)的多肽链交换。多肽链交换功效等级如下:低…“-”,轻度…“+”,中…“++”,高…“+++”
表11:通过多肽链反应从前体多肽形成双特异性产物多肽,所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含所指出的去稳定化突变。列表示模拟杵多肽中的去稳定化突变;行表示模拟臼多肽中的去稳定化突变。显示了每对去稳定化突变在溶液中(“IS”,如实例2中检测到的)和细胞上(“OC”,如实例4中针对具有Fc结构域的多肽检测到的)的多肽链交换。多肽链交换功效等级如下:低…“-”,轻度…“+”,中…“++”,高…“+++”
能够介导抗原结合位点的细胞上激活并且在溶液中表现出低至轻度多肽链交换的前体多肽被认为特别适合于治疗性应用。
因此,在所测试的不同前体多肽中,包含以下去稳定化突变对的前体多肽被认为有希望在用于治疗性应用的异二聚体前体多肽的CH3结构域中使用:
表12:包含在根据本发明的异二聚体前体多肽的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域中的去稳定化突变
在上面指出的被认为有希望在用于治疗性应用的异二聚体前体多肽的CH3结构域中使用的去稳定化突变对中,具有以下去稳定化突变对的前体多肽在溶液中表现出低至轻度的多肽链交换,但介导较高程度的细胞上多肽链交换,如通过T细胞活化测定检测到的:
表13:包含在根据本发明的异二聚体前体多肽的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域中的去稳定化突变
实例6:
结合至FcRn的本发明的单特异性前体多肽的产生,以用于在多肽链交换后产生可激活的结合位点
为了评估双特异性抗LeY/抗CD3抗体从单特异性前体多肽的形成,产生了针对图1所示的第一和第二异二聚体前体多肽所描绘的结构域布置的单特异性前体多肽。
提供了以下前体多肽:
-第一异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VH)-杵前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VH)-杵前体包含SEQ ID NO:11所示的轻链多肽(也称为“LeYLC”)、SEQ ID NO:12所示的包含衍生自特异性地结合至CD3的抗体的VH结构域(“CD3(VH)”)的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VH)-杵HC”)和基于SEQ ID NO:28的具有去稳定化突变E357K和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟臼”多肽从N端至C端方向上包含:不包含半胱氨酸的突变铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
-第二异二聚体前体多肽(也称为“抗LeY-CD3(VL)-臼前体”)包含特异性地结合至LeY的Fab片段。抗LeY-CD3(VL)-臼前体包含SEQ ID NO:11所示的轻链多肽(即LeY LC)、SEQID NO:14所示的包含衍生自特异性地结合至CD3的抗体的VL结构域(“CD3(VL)”)的第一重链多肽(也称为“LeY-CD3(VL)-臼HC”)和基于SEQ ID NO:29的具有去稳定化突变K370E和组氨酸标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟杵”多肽)从N端至C端方向上包含:不包含半胱氨酸的突变铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
所示多肽链包含以下突变:
表14:前体多肽的CH3结构域中的氨基酸取代
前体多肽的重组生产
通过上述实例1(对于模拟臼和模拟杵)和实例4(对于LeY-CD3(VH)-杵HC和LeY-CD3(VL)-臼HC)中所述的现有技术将每种前体多肽的三条多肽链共转染到哺乳动物细胞(例如HEK293或Expi293FTM)中,通过质粒的共转染进行表达。
如实例4中所述,在通过SDS-PAGE纯化后分析纯度和完整性(图5)。
如实例4中所述,使用ProteinA色谱,然后使用SEC纯化前体多肽(图6和图7)。
FcRn结合通过分析型FcRn亲和色谱进行评估,如Schlothauer T等人所述(Analytical FcRn affinity chromatography for functional characterization ofmonoclonal antibodies.MAbs.2013 Jul-Aug;5(4):576-86)(图8)。结果表明,虽然异二聚体前体多肽结合至FcRn,但包含特异性地结合至CD3的激活的抗原结合位点但没有CH2结构域的产物多肽不结合至FcRn。
为了评估由双特异性抗LeY/抗CD3抗体(由通过本实施例提供的单特异性前体多肽形成的)介导的T细胞活化,在如实例5中所述的T细胞活化测定中分析了特异性地结合至LeY的单特异性前体多肽(图9)。结果表明,包含特异性地结合至CD3的激活的抗原结合位点的产物多肽能够活化T细胞。作为比较,单独分析了不能活化T细胞的前体多肽。
实例7:
包含全Fc结构域的其他单特异性前体多肽的产生
为了评估双特异性抗生物胞素酰胺/抗荧光素抗体从单特异性前体多肽的形成,产生了针对图1所示的第一和第二异二聚体前体多肽所描绘的结构域布置的单特异性前体多肽。注意,在该实验中,杵和臼突变布置在相反的链上。
第一异二聚体前体多肽(也称为“抗fluo前体”)包含特异性地结合至荧光素(“fluo”,一种生物素衍生物)的Fab片段,具有SEQ ID NO:06所示的VL结构域和SEQ ID NO:07所示的VH结构域。第一前体多肽包含SEQ ID NO:08所示的轻链多肽(也称为“fluo LC”)、SEQ ID NO:31所示的第一重链多肽(也称为“fluo HC”)和基于SEQ ID NO:05(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和C标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟臼”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
第二异二聚体前体多肽(也称为“抗bio前体”)包含特异性地结合至生物胞素酰胺(“bio”)的Fab片段,具有SEQ ID NO:01所示的VL结构域和SEQ ID NO:02所示的VH结构域。第二前体多肽包含SEQ ID NO:03所示的轻链多肽(也称为“bio LC”)、SEQ ID NO:30所示的第一重链多肽(也称为“bio HC”)和基于SEQ ID NO:10(其代表没有去稳定化突变的基本氨基酸序列)的具有如下所示的去稳定化突变和C标签的第二重链多肽。第二重链多肽(也称为“模拟杵”多肽)从N端至C端方向上包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。
根据实例1中公开的方法产生第一和第二异二聚体前体多肽。
所示多肽链的CH3结构域包含以下突变:
表15:具有在CH3结构域中具有所指出的去稳定化突变的模拟臼链的抗fluo前体多肽的纯化产量和单体含量(纯化产量[mg/ml]=每升表达体积中的纯化抗体量,由单体峰百分比校正;单体=所希望的异二聚体前体多肽)
表16:具有在CH3结构域中具有所指出的去稳定化突变的模拟杵链的抗bio前体多肽的纯化产量和单体含量(纯化产量[mg/ml]=每升表达体积中的纯化抗体量,由单体峰百分比校正;单体=所希望的异二聚体前体多肽)
实例8:
来自实例7的前体多肽的多肽链交换效率分析
为了评估不同去稳定化突变对多肽链交换的影响,进行了在实例7中产生的前体多肽之间的多肽链交换。根据实例2中描述的方法进行实验。预期产物多肽的结构如图1所示。
表17:通过多肽链交换反应从抗bio和抗fluo前体多肽形成双特异性产物多肽,所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含所指出的去稳定化突变。列表示抗fluo前体的模拟臼多肽中的去稳定化突变;行表示抗bio前体的模拟杵多肽中的去稳定化突变。数值为以产品收率[%]表示的交换效率。实验获得的产量与双特异性抗体的最大可能产量有关。双特异性抗体的最大可能产量由每个反应中两种相应输入格式的最低单体峰SEC百分比校正,因为预计只有单体对重组有效。
实例9:
产生包含全Fc结构域的其他单特异性前体多肽,其中前体多肽的CH3结构域包含杵入臼突变但不包含半胱氨酸突变
为了评估双特异性抗生物胞素酰胺/抗荧光素抗体从单特异性前体多肽的形成,产生了针对图1所示的第一和第二异二聚体前体多肽所描绘的结构域布置的单特异性前体多肽。注意,在该实验中,杵和臼突变布置在相反的链上。
根据本文公开的结构和方法产生如实例7中所述的第一和第二异二聚体前体多肽。
此外,与实例1不同的是,bio HC是基于SEQ ID NO:30的,但在位置354处具有丝氨酸残基,而fluo HC是基于SEQ ID NO:31的,但在位置349处具有酪氨酸残基。因此,CH3结构域的突变总结如下:
表18:前体多肽的CH3结构域中的氨基酸取代
所示多肽链的CH3结构域包含以下突变:
表19:具有在CH3结构域中具有所指出的去稳定化突变的模拟杵链的抗bio前体多肽的纯化产量和单体含量(纯化产量[mg/ml]=每升表达体积中的纯化抗体量,由单体峰百分比校正;单体=所希望的异二聚体前体多肽)
表20:具有在CH3结构域中具有所指出的去稳定化突变的模拟臼链的抗fluo前体多肽的纯化产量和单体含量(纯化产量[mg/ml]=每升表达体积中的纯化抗体量,由单体峰百分比校正;单体=所希望的异二聚体前体多肽)
实例10:
来自实例9的前体多肽的多肽链交换效率分析
为了评估不同去稳定化突变对多肽链交换的影响,进行了在实例9中产生的前体多肽之间的多肽链交换。根据实例2中描述的方法进行实验。
表21:通过多肽链交换反应从抗bio和抗fluo前体多肽形成双特异性产物多肽,所述前体多肽在模拟链的CH3结构域中包含所指出的去稳定化突变。列表示抗fluo前体的模拟臼多肽中的去稳定化突变;行表示抗bio前体的模拟杵多肽中的去稳定化突变。数值为以产品收率[%]表示的交换效率。实验获得的产量与双特异性抗体的最大可能产量有关。双特异性抗体的最大可能产量由每个反应中两种相应输入格式的最低单体峰SEC百分比校正,因为预计只有单体对重组有效。
结果表明,对于异二聚体前体多肽,多肽链交换是可检测到的,其中杵入臼突变无法通过额外的半胱氨酸突变稳定化。
实例11:
产生包含全Fc结构域的其他单特异性前体多肽,在前体多肽的CH3结构域中具有不同的突变
为了评估双特异性抗生物胞素酰胺/抗荧光素抗体从单特异性前体多肽的形成,产生了针对图1所示的第一和第二异二聚体前体多肽所描绘的结构域布置的单特异性前体多肽。注意,在该实验中,杵和臼突变布置在相反的链上。
根据本文公开的结构和方法产生如实例7中所述的第一和第二异二聚体前体多肽,但具有下列差异:
与实例7不同的是,产生了三种特异性地结合至荧光素的前体多肽,其中fluo HC是基于SEQ ID NO:31的,而模拟臼多肽是基于SEQ ID NO:05的并且具有以下CH3突变:
与实例7不同的是,产生了三种特异性地结合至生物胞素酰胺的前体多肽,其中bio HC是基于SEQ ID NO:30的,而模拟杵多肽是基于SEQ ID NO:10的并且具有以下CH3突变:
表22:所指出的前体多肽的纯化产量和单体含量(纯化产量[mg/ml]=每升表达体积中的纯化抗体量,由单体峰百分比校正;单体=所希望的异二聚体前体多肽)
实例12:
来自实例11的前体多肽的多肽链交换效率分析
为了评估不同去稳定化突变对多肽链交换的影响,进行了在实例11中产生的前体多肽之间的多肽链交换。根据实例2中描述的方法进行实验。
表23:从所指出的抗bio和抗fluo前体多肽通过多肽链交换反应形成双特异性产物多肽。数值为以产品收率[%]表示的交换效率。实验获得的产量与双特异性抗体的最大可能产量有关。双特异性抗体的最大可能产量由每个反应中两种相应输入格式的最低单体峰SEC百分比校正,因为预计只有单体对重组有效。
结果表明,多肽链的出现与在模拟链多肽或包含抗原结合部分的多肽链上布置半胱氨酸突变无关。
Claims (16)
1.一组异二聚体前体多肽,其包含:
a)第一异二聚体前体多肽,其包含
-第一重链多肽,所述第一重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中所述第一重链多肽包含第一抗原结合部分的至少一部分;以及
-第二重链多肽,所述第二重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域,
其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽经由所述CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;
b)第二异二聚体前体多肽,其包含
-第三重链多肽,所述第三重链多肽从N端至C端方向上包含:选自VH结构域和VL结构域的抗体可变结构域;以及CH3结构域,其中所述抗体可变结构域能够与包含在所述第一异二聚体前体多肽的所述第一重链多肽中的抗体可变结构域形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点,其中所述第三重链多肽包含第二抗原结合部分的至少一部分;以及
-第四重链多肽,所述第四重链多肽从N端至C端方向上包含CH2结构域和CH3结构域;
其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽经由所述CH3结构域彼此缔合并形成异二聚体,其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变并且另一个CH3结构域包含臼突变;
其中
A)或者i)所述第一重链多肽包含具有所述杵突变的CH3结构域,并且所述第三重链多肽包含具有所述臼突变的CH3结构域,或者ii)所述第一重链多肽包含具有所述臼突变的CH3结构域,并且所述第三重链多肽包含具有所述杵突变的CH3结构域;并且其中
B)或者
i)包含所述杵突变的所述第一异二聚体前体多肽的所述CH3结构域和包含所述臼突变的所述第二异二聚体前体多肽的所述CH3结构域,或者
ii)包含所述臼突变的所述第一异二聚体前体多肽的所述CH3结构域和包含所述杵突变的所述第二异二聚体前体多肽的所述CH3结构域包含使CH3/CH3界面去稳定化的一个或多个氨基酸取代,其中所述氨基酸取代被布置为使得被取代的氨基酸在一对所述CH3结构域内的所述CH3/CH3界面中相互作用。
2.根据权利要求1所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含所述杵突变的所述CH3结构域和包含所述臼突变的所述CH3结构域包含以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***:
-具有所述臼突变的所述CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
o用疏水性氨基酸替换S354;
o用带正电荷的氨基酸替换D356;
o用带正电荷的氨基酸或用疏水性氨基酸替换E357;
o用带正电荷的氨基酸替换D356,并且用带正电荷的氨基酸或用疏水性氨基酸替换E357;
o用疏水性氨基酸替换S364;
o用疏水性氨基酸替换A368;
o用带负电荷的氨基酸替换K392;
o用疏水性氨基酸替换T394;
o用疏水性氨基酸替换D399,并且用带正电荷的氨基酸替换S400;
o用疏水性氨基酸替换D399,并且用带正电荷的氨基酸替换F405;
o用疏水性氨基酸替换V407;以及
o用带负电荷的氨基酸替换K409;以及
o用带负电荷的氨基酸替换K439;
-具有所述杵突变的所述CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
o用带正电荷的氨基酸替换Q347,并且用带负电荷的氨基酸替换K360;
o用带负电荷的氨基酸替换Y349;
o用疏水性氨基酸替换L351,并且用疏水性氨基酸替换E357;
o用疏水性氨基酸替换S364;
o用疏水性氨基酸替换W366,并且用带负电荷的氨基酸替换K409;
o用疏水性氨基酸替换L368;
o用带负电荷的氨基酸替换K370;
o用带负电荷的氨基酸替换K370,并且用带负电荷的氨基酸替换K439;
o用带负电荷的氨基酸替换K392;
o用疏水性氨基酸替换T394;
o用疏水性氨基酸替换V397;
o用带正电荷的氨基酸替换D399,并且用带负电荷的氨基酸替换K409;
o用带正电荷的氨基酸替换S400;
o F405W;
o Y407W;以及
o用带负电荷的氨基酸替换K439。
3.根据前述权利要求中的一项所述的一组异二聚体多肽,其中B)中指出的包含所述杵突变的所述CH3结构域和包含所述臼突变的所述CH3结构域包含以下氨基酸取代中的一种或多种,其中编号是根据Kabat编号***:
-具有所述臼突变的所述CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
o用带正电荷的氨基酸替换E357;
o用疏水性氨基酸替换S364;
o用疏水性氨基酸替换A368;以及
o用疏水性氨基酸替换V407;并且
-具有所述杵突变的所述CH3结构域包含选自以下组的至少一种氨基酸取代:
o用带负电荷的氨基酸替换K370;
o用带负电荷的氨基酸替换K370,并且用带负电荷的氨基酸替换K439;
o用带负电荷的氨基酸替换K392;以及
o用疏水性氨基酸替换V397。
4.根据前述权利要求中的一项所述的一组异二聚体多肽,其中所述第一抗原结合部分和/或所述第二抗原结合部分是抗体片段。
5.根据前述权利要求中的一项所述的一组异二聚体多肽,其中
a)所述第一异二聚体前体多肽进一步包含:
-另外的抗体可变结构域(第一抗体可变结构域),所述另外的抗体可变结构域位于包含CH3结构域的所述第一重链多肽内,以及
-另外的多肽链,所述另外的多肽链为包含第二抗体可变结构域的轻链多肽,其中所述第一抗体可变结构域和所述第二抗体可变结构域一起形成第一抗原结合位点,所述第一抗原结合位点特异性地结合至靶抗原;并且其中
b)所述第二异二聚体前体多肽包含:
-另外的抗体可变结构域(第三抗体可变结构域),所述另外的抗体可变结构域位于包含CH3结构域的所述第三重链多肽内,以及
-另外的多肽链,所述另外的多肽链为包含第四抗体可变结构域的轻链多肽,其中所述第三抗体可变结构域和所述第四抗体可变结构域一起形成第二抗原结合位点,所述第二抗原结合位点特异性地结合至靶抗原。
6.根据前述权利要求中的一项所述的一组异二聚体多肽,其中在第一异二聚体多肽中,在两条包含所述CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中在第二异二聚体多肽中,在两条包含所述CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键。
7.根据前述权利要求中的一项所述的一组异二聚体前体多肽,其中所述第一异二聚体前体多肽的所述抗原结合部分和所述第二异二聚体前体多肽的所述抗原结合部分结合至相同抗原。
8.根据前述权利要求中的一项所述的一组异二聚体前体多肽,其中包含在所述第一重链多肽和所述第三重链多肽中的所述抗体可变结构域能够形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至CD3。
9.一种用于产生异二聚体多肽的方法,所述方法包括使如权利要求1至8中的一项所定义的第一异二聚体前体多肽和第二异二聚体前体多肽接触,以形成包含所述第一重链多肽和所述第三重链多肽的第三异二聚体多肽。
10.根据权利要求9所述的方法,所述方法包括使所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽接触,以形成包含所述第二重链多肽和所述第四重链多肽的第四异二聚体多肽。
11.根据权利要求9或权利要求10中的一项所述的方法,其中在所述第一异二聚体多肽中,在两条包含所述CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中在所述第二异二聚体多肽中,在两条包含所述CH3结构域的多肽链之间没有形成链间二硫键,并且其中所述接触在不存在还原剂的情况下进行。
12.一种第一异二聚体前体多肽,其如权利要求1至8中任一项所定义。
13.一种第二异二聚体前体多肽,其如权利要求1至8中任一项所定义。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的一组异二聚体前体多肽,其用作药物。
15.一种药物组合物,其包含根据权利要求1至8中任一项所述的一组异二聚体前体多肽和药用载体。
16.根据权利要求1至8中任一项所述的一组异二聚体前体多肽,其中在所述第一异二聚体前体多肽和所述第二异二聚体前体多肽中,包含在所述第一重链多肽和所述第三重链多肽中的所述抗体可变结构域能够形成抗原结合位点,所述抗原结合位点特异性地结合至CD3,以用于治疗癌症。
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