CN106255410B - 产生单结构域结合蛋白的非人动物 - Google Patents

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Abstract

提供了经遗传修饰的非人动物以及用于产生和使用它们的方法和组合物，其中所述遗传修饰包括(a)重链恒定区基因序列的免疫球蛋白恒定区CH1基因中的缺失(任选地铰链区中的缺失)，和(b)至少一个未重排的轻链可变(VL)基因区段和至少一个未重排的轻链连接(JL)基因区段对一个或所有内源VH、DH和JH基因区段的替换，所述未重排的轻链可变(VL)基因区段和未重排的轻链连接(JL)基因区段能够重组，以形成重排的轻链可变区(VL/JL)核苷酸序列，其可操作地连接至包含CH1基因中的缺失和/或经遗传工程化的单一重排的轻链的***的重链恒定区基因序列，其中所述小鼠能够表达功能性IgM、单结构域抗原结合蛋白，例如VL单结构域结合蛋白，和经遗传工程化的重排的轻链。

Description

产生单结构域结合蛋白的非人动物
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2014年3月21日提交的美国临时申请系列第61/968,986号和2014年3月21日提交的美国临时申请系列第61/968,905号的权益，所述两个申请均据此通过引用并入。
发明领域
提供了非人动物，所述非人动物表现出免疫球蛋白重链基因座的高度多样性和优选地免疫球蛋白轻链基因座的极低多样性，这允许选择结合抗原的单结构域抗原结合蛋白，包括VH-单结构域结合蛋白和VL-单结构域结合蛋白。
背景
在大多数动物中，正常的免疫球蛋白重链只在与其同源轻链相偶联时才会有很好的表达。在人中，单独的重链发现于表现为功能失调的重链的重链疾病中，所述重链缺少可变重链结构域、CH1结构域或可变重链与CH1结构域的序列。不含轻链的重链可见于鱼的某些种以及骆驼中。此类重链缺少功能性CH1结构域并且在它们的重链可变结构域中具有非人的特征。已有人尝试通过修饰小鼠以表达模拟骆驼或鱼的某些种中发现的VHH结构域的骆驼化基因，部分地通过去除IgM和IgG的CH1结构域并使重链可变区符合骆驼和/或鱼的某些种的那些重链可变区来产生骆驼化抗体。不幸的是，预期骆驼化抗体可在非骆驼动物中诱导免疫应答。对于经遗传修饰以包含失活的CH1结构域的非人动物的先前形式的另一个挑战是抗原特异性单结构域抗原结合蛋白相较于常规抗体的降低的表达水平。此类降低可归因于缺少可用于非骆驼重链可变区的允许重链可变区补偿VL结构域的不存在的的机制。例如，在只有重链的结合蛋白中发现的骆驼VHH结构域包含CDRH3，所述CDRH3平均长于在非骆驼抗体中发现的那些CDRH3，被认为是对总体抗原亲和力和特异性的主要影响，并且被认为补偿只有骆驼重链的抗体中的VL结构域的不存在。
因此，在本领域中存在对产生多种具有非骆驼VH结构域的单结构域结合蛋白的经遗传修饰的非人动物的需要。
概述
如本文中所公开的，包含轻链可变区和重链恒定区的免疫球蛋白多肽链可由非人动物表达，并且形成VL-单结构域抗原结合蛋白，例如，包含可操作地连接至重链恒定结构域的轻链可变结构域的单结构域抗原结合蛋白，其中所述重链恒定结构域缺少例如选自IgG、IgA、IgE、IgD或其组合的免疫球蛋白重链恒定区的功能性CH1结构域。所述VL-单结构域抗原结合蛋白可表现出相较于包含可操作地连接至缺少功能性CH1结构域的重链恒定结构域的重链可变结构域的VH-单结构域抗原结合蛋白增强的稳定性。因此，本文中提供了能够表达包含轻链可变结构域和重链恒定区的VL-单结构域抗原结合蛋白的非人动物，其中所述重链恒定区缺少功能性CH1结构域，并且还可任选地缺少功能性铰链区，以及制备和使用表达VL-单结构域抗原结合蛋白的非人动物的方法。还提供了来源于表达VL-单结构域抗原结合蛋白的非人动物的细胞、蛋白质和核酸，以及所述分离的细胞、蛋白质和核酸的用途。
还如本文中所公开的，由能够产生单结构域抗原结合蛋白例如VL-或VH-单结构域抗原结合蛋白的非人动物对单一重排的轻链的表达，相较于不表达所述单一重排的轻链的能够产生单结构域抗原结合蛋白的相似非人动物，增加了响应于抗原攻击的抗原特异性单结构域抗原结合蛋白的滴度。图5.该数据表明单一重排的轻链在非人动物中的存在增加了产生抗原特异性单结构域抗原结合蛋白的可能性。因此，本文中提供了能够表达单结构域抗原结合蛋白(例如，VH-和/或VL-单结构域抗原结合蛋白)和单一重排的轻链的非人动物以及产生和使用表达VL-单结构域抗原结合蛋白的非人动物的方法。还提供了来源于表达单结构域抗原结合蛋白和单一重排的轻链的非人动物的细胞、蛋白质和核酸，以及所述分离的细胞、蛋白质和核酸的用途。
本文中还提供了包含VL-单结构域抗原结合蛋白和单一重排的轻链的非人动物，产生能够产生高滴度的单结构域抗原结合蛋白的非人动物和/或增加能够产生此类结合蛋白的非人动物的单结构域结合蛋白的产生的方法，使用所述非人动物产生抗原特异性单结构域抗原结合蛋白的方法和所产生的单结构域抗原结合蛋白。
提供经遗传修饰的细胞、非人胚胎、非人动物以及用于产生它们和使用它们的方法和组合物，其中所述动物被遗传修饰来产生单结构域抗原结合蛋白，例如，包含缺少功能性CH1序列，并且还任选地缺少功能性铰链区序列的重链恒定区的结合蛋白，并且其中所述动物还被遗传修饰来将单结构域抗原结合蛋白表达为VL-单结构域抗原结合蛋白(例如，从可操作地连接至经修饰以使CH1结构域编码序列失活或缺失的重链恒定区核酸序列的重排的轻链可变区核苷酸序列编码的)和/或单一重排的轻链(例如，从可操作地连接至动物种系中的轻链恒定区的单一重排的VL:JL序列编码的)。
如本文中所公开的动物可产生单结构域结合蛋白，所述单结构域结合蛋白，在一个方面，包含IgG同种型，诸如，例如，IgG1同种型。在一些实施方案中，所述单结构域抗原结合蛋白是VH-单结构域抗原结合蛋白，例如，包含可操作地连接至缺少功能性CH1的重链恒定区的重链可变区。在其它实施方案中，所述单结构域抗原结合蛋白是VL-单结构域抗原结合蛋白，例如，包含可操作地连接至缺少功能性CH1的重链恒定区(例如，包含铰链、CH2、CH3、CH4或其组合的重链恒定区)的轻链可变结构域。
因此，在一些方面，如本文所述的单结构域抗原结合蛋白由来源于可操作地连接至重链恒定区(例如，选自由CH1、铰链、CH2、CH3、CH4及其组合组成的组的重链恒定区结构域)的一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链V区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链J区段的核酸序列编码，其中所述重链恒定区包含在CH1区序列中的缺失或失活突变。在一个实施方案中，所述未重排的轻链V和J区段替换内源非人免疫球蛋白重链基因座中的一个或多个、基本上所有或所有功能性内源非人免疫球蛋白重链可变区基因区段。在一些实施方案中，经修饰以包含轻链可变区基因区段的重链基因座可发现于非人动物的种系中，所述轻链可变区基因区段可操作地连接至如本文中所公开的包含CH1区序列中的缺失或失活突变的重链恒定区。此类经修饰的基因座可处于内源重链基因座中，或存在于处于除内源重链基因座外的基因座中的转基因中(例如，在基因组中的随机位置处***的)。
在一个方面，包含编码VL-单结构域抗原结合蛋白的核酸序列(例如，来源于一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链V区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链J区段的核酸序列，所述轻链V区段和轻链J区段可操作地连接至在CH1区序列中包含缺失或失活突变的重链恒定区)的本文中所公开的动物还可包含含有轻链可变和轻链恒定区的第二免疫球蛋白多肽链，所述第二免疫球蛋白多肽链可由包含可操作地连接至轻链恒定区的人轻链V区段和人轻链J区段的第二核酸序列编码。此类第二核酸序列还可发现于非人动物的种系中。此类核酸序列可存在于内源轻链基因座中，或存在于除内源轻链基因座外的基因座上的转基因中(例如，在基因组中的随机位置处***的)。
在另一个方面，经修饰以包含来源于一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链V区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链J区段(所述轻链V区段和轻链J区段可操作地连接至包含在CH1区序列中的缺失或失活突变的重链恒定区)的核酸序列的动物，还可被进一步修饰来表达单一重排的轻链，例如，共同轻链(ULC)。
在一些实施方案中，所述单结构域抗原结合蛋白诸如，但不限于，VL-单结构域抗原结合蛋白和/或单一重排的轻链包含人独特型。例如，如本文中所公开的单结构域抗原结合蛋白和/或经遗传工程化的单一重排的轻链可包含人可变结构域和，在一个实施方案中，非人恒定结构域。在一个实施方案中，所述非人恒定结构域是内源非人恒定结构域。在一个实施方案中，所述非人恒定结构域是啮齿类动物的恒定结构域，例如，鼠恒定结构域，例如，小鼠恒定结构域。在另一个实施方案中，所述恒定结构域是人恒定结构域。在一个方面，所述单结构域抗原结合蛋白是包含人轻链可变结构域和非人重链恒定结构域的VL-单结构域抗原结合蛋白。在一个实施方案中，编码如本文中所公开的VL-单结构域抗原结合蛋白的未重排的轻链V和/或J区段是人区段。
经遗传修饰以产生如本文中所公开的单结构域抗原结合蛋白的动物可包含具有一个或多个未重排的人免疫球蛋白重链可变区基因区段、一个或多个未重排的人免疫球蛋白轻链V区段和一个或多个未重排的人免疫球蛋白轻链J区段对一个或多个或所有内源免疫球蛋白重链可变区基因区段的替换的重链基因座。在一些方面，所有内源VH、DH和JH基因区段被一个或多个未重排的人VH、一个或多个未重排的人DH和一个或多个未重排的人JH基因区段替换。在其它方面，所有内源VH、DH和JH基因区段被一个或多个未重排的人免疫球蛋白轻链VL基因区段和一个或多个未重排的人免疫球蛋白轻链JL基因区段，例如，人卡kappa(κ)Vκ和/或Jκ基因区段和/或人lambda(λ)Vλ和/或Jλ基因区段替换。
经遗传修饰以产生单结构域结合蛋白(其包含重链可变区或在包含CH1区和/或铰链区的缺失的重链恒定区的情况下的轻链可变区)的动物，可具有内源重链基因座中的修饰(和/或本文所述的恒定区基因的基因座的其它修饰)，或可在转基因上具有修饰，其中所述转基因位于基因组中的任何地方，例如，被通过随机***引入基因组。在一些实施方案中，可在动物的种系中发现如本文所述的经修饰的重链基因座。在也经修饰以表达单一重排的轻链的动物中，所述单一重排的轻链可变区可被可操作地连接至内源轻链基因座中的轻链恒定区，或可存在于转基因中，所述转基因包含与同源(例如，自体的；针对非人动物)或异源轻链恒定区可操作地连接的所述单一重排的轻链可变区，并且存在于除内源轻链基因座外的基因座中(例如，随机***基因组的)。
在其它实施方案中，本文中所公开的动物的重链基因座可在铰链区中包含缺失或失活突变。
另外，本文中所公开的动物可被修饰来包含和/或表达可操作地连接至轻链恒定区的单一重排的轻链可变基因序列(也称为共同或通用轻链(ULC))，其可由包含单一重排的VL:JL基因序列的轻链基因座编码。在一些实施方案中，所述轻链基因座包含其中VL序列为Vκ基因序列的单一重排的VL:JL基因序列。在一些方面，所述Vκ序列选自Vκ1-39或Vκ3-20。在一些方面，所述JL序列为Jκ基因序列，例如，Jκ1序列、Jκ2序列、Jκ3序列、Jκ4序列或Jκ5序列等。在一些实施方案中，所述轻链基因座包含选自由Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1组成的组的单一重排的Vκ:Jκ序列。在一个实施方案中，所述轻链基因座包含Vκ1-39Jκ5的单一重排的Vκ:Jκ序列。在另一个实施方案中，所述轻链基因座包含Vκ3-20Jκ1的单一重排的Vκ:Jκ序列。在一些实施方案中，所述单一重排的可变基因序列可操作地连接至非人轻链恒定区基因，例如，内源非人轻恒定区基因。在另一个实施方案中，所述单一重排的可变基因序列可操作地连接至人轻链恒定区基因。在一些方面，所述单一重排的可变基因序列为***内源免疫球蛋白轻链基因座的人V:J序列，以使得所得的非人动物在一个或多个轻链基因座中不包含功能性未重排的V和/或J基因区段。
因此，本文中提供了非人动物，所述非人动物具有包含在CH1编码区中缺失或失活突变的重链恒定区，以及(a)在包含CH1区中的缺失或失活突变的重链恒定区的情况下的轻链可变区和(b)所述单一重排的轻链之任一或两者。例如，如本文中所公开的非人动物可包含来源于一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链V区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链J区段(所述轻链V区段和轻链J区段可操作地连接至如本文中所公开的包含在CH1区序列中的缺失或失活突变的重链恒定区)的核酸序列。在一个方面，如本文中所公开的非人动物包含编码免疫球蛋白CH1结构域的核酸序列中的缺失或失活突变和可操作地连接至如本文中所公开的轻链恒定区和单一重排的轻链可变基因序列。在另一个方面，本文中所公开的非人动物包含来源于一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链V区段和一个或多个未重排的免疫球蛋白轻链J区段(所述轻链V区段和轻链J区段可操作地连接至包含在CH1区序列中的缺失或失活突变的重链恒定区)和可操作地连接至轻链恒定区的单一重排的轻链可变基因序列的核酸序列。在一些实施方案中，所述重链恒定区是非人恒定区，例如，内源非人恒定区。在其它实施方案中，所述重链恒定区是人恒定区。
在一些方面，非人动物在其种系中包含如本文中所公开的经修饰的重链基因座和/或经遗传工程化的重排的轻链基因座。所述非人动物还可包含在以下免疫球蛋白基因的一个或多个中的缺失或失活突变：IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgE、IgA及其组合。在一个实施方案中，所述非人动物包含在IgG2a和IgG2b免疫球蛋白基因中的缺失或失活突变。在另一个实施方案中，所述非人动物包含在IgG3、IgD、IgA和IgE免疫球蛋白基因中的缺失或失活突变。在另一个实施方案中，所述非人动物包含在IgG3、IgD、IgG2a、IgG2b、IgA和IgE免疫球蛋白基因中的缺失或失活突变。
在一些方面，如本文中所公开的非人动物还可包含能够保持雄性非人动物的生育力的Adam6a基因(或其片段)和/或Adam6b基因(或其片段)。Adam6a基因、Adam6b基因或两者可被异位放置，或可在靠近非人动物中的Adam6基因的位置的位置上。Adam6a基因、Adam6b基因或两者在雄性非人动物中是有功能的。例如，所述非人动物是啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)，并且Adam6a基因、Adam6b基因或两者分别是小鼠或大鼠基因。在各个实施方案中，Adam6基因的维持或***维持或赋予雄性非人动物(例如，赋予雄性小鼠或大鼠)的生育力。
在一个方面，本文中所公开的非人动物包含由包含功能性CH1结构域编码序列的IgM基因序列编码的IgM免疫球蛋白，所述IgM免疫球蛋白可与同源轻链，例如，经遗传工程化的单一重排的轻链缔合。在另一个实施方案中，所述非人动物只产生具有IgM和IgG1同种型的重链，其中所述IgM重链包含功能性CH1结构域，而IgG1重链缺少功能性CH1结构域。在一个方面，与IgM重链缔合的同源轻链由可操作地连接至轻链恒定区的单一重排的轻链可变基因序列编码或来源于其。
如本文中所公开的经遗传工程化的单一重排的轻链的表达导致非人动物在被抗原攻击后产生高滴度的抗原特异性单结构域抗原结合蛋白。至少1x 102μg/mL、至少1x 103μg/mL、至少1x 104μg/mL或至少1x 105μg/mL的滴度，例如，抗体或结合蛋白浓度(例如，如通过ELISA测量的)可被认为是高滴度。或者，如果所述结合蛋白的浓度为不包含遗传工程化的重排的轻链的相应对照动物的浓度的至少2倍、至少5倍、至少10倍或至少100倍，则非人动物产生高滴度的结合蛋白。
还提供了产生如本文所公开的非人动物的方法。此类方法包括修饰所述非人动物的非人重链恒定区，以使得所述重链恒定区包含编码CH1结构域，例如，IgG1 CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变。
产生如本文中所公开的非人动物的方法还可包括在内源免疫球蛋白重链基因座中用一个或多个未重排的轻链V和/或一个或多个未重排的轻链J基因区段替换一个或多个、所有或基本上所有内源非人重链可变区基因区段，以使得所述轻链V和J基因区段可操作地连接至包含编码CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变的重链恒定区。在一个实施方案中，所述未重排的轻链V和J基因区段能够经历有效重排(productiverearangement)，例如，包含重组信号序列(RSS)，所述信号序列允许未重排的轻链V和J基因区段组合，以使得经修饰的非人动物包含可操作地连接至重链恒定区核酸序列的重排的免疫球蛋白轻链可变区(VL/JL)核苷酸序列，其中所述重链恒定区核酸序列包含在编码CH1结构域的序列中的失活突变或缺失。在一个实施方案中，所述未重排的轻链V和J基因区段重组，以使得经修饰的非人动物包含重排的免疫球蛋白轻链可变区(VL/JL)核苷酸序列，所述核苷酸序列包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个N添加，并且可操作地连接至重链恒定区核酸序列，并且其中所述重链恒定区核酸序列包含在编码CH1结构域的序列中的失活突变或缺失。在一个实施方案中，所述未重排的轻链V和J基因区段是人V和J区段。所述方法还可包括使动物表达来源于未重排的轻链V基因区段、未重排的轻链J基因区段和具有失活的或缺失的CH1结构域的重链恒定区的VL-单结构域结合蛋白。
在另一个实施方案中，产生如本文中所公开的非人动物的方法还可包括引入包含编码单一重排的轻链，例如，通用轻链(ULC)的核酸的经遗传工程化的单一重排的轻链基因座，和任选地，使动物表达具有失活的CH1结构域的重链免疫球蛋白基因座和所述单一重排的轻链基因座。
在一个方面，产生如本文中所公开的非人动物的方法包括(a)修饰所述非人动物的非人重链恒定区，以使得所述重链恒定区包含编码CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变，和以下步骤之任一或两者：(b)在内源免疫球蛋白重链基因座上用一个或多个未重排的轻链V和/或一个或多个未重排的轻链J基因区段替换一个或多个、所有或基本上所有内源非人重链可变区基因区段，以使得所述轻链V和J基因区段可操作地连接至包含编码CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变的非人重链恒定区，和/或(c)引入编码经遗传工程化的单一重排的轻链基因座的核酸。本文中所公开的方法的步骤可以以任意顺序、贯序地或同时进行。
例如，如本文中所公开的方法包括(a)修饰所述非人动物的非人重链恒定区，以使得重链恒定区包含编码CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变，和(b)在内源免疫球蛋白重链基因座上用一个或多个未重排的轻链V和/或一个或多个未重排的轻链J基因区段替换一个或多个、所有或基本上所有内源非人重链可变区基因区段，以使得所述轻链V和J基因区段可操作地连接至包含编码CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变的非人重链恒定区。在一个方面，如本文中所公开的方法包括(a)修饰所述非人动物的非人重链恒定区，以使得所述重链恒定区包含编码CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变，和(b)引入编码经遗传工程化的单一重排的轻链基因座的核酸。在另一个方面，产生如本文中所公开的非人动物的方法包括(a)修饰所述非人动物的非人重链恒定区，以使得所述重链恒定区包含编码CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变，(b)在内源免疫球蛋白重链基因座上利用一个或多个未重排的轻链V和/或一个或多个未重排的轻链J基因区段替换一个或多个、所有或基本上所有内源非人重链可变区基因区段，以使得所述轻链V和J基因区段可操作地连接至包含编码CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变的非人重链恒定区，和(c)引入编码经遗传工程化的单一重排的轻链基因座的核酸。产生如本文中所公开的非人动物的方法还可包括将Adam6a基因、Adam6b基因或两者引入所述非人动物的基因组，例如，引入动物的种系。在一个方面，所述方法还包括例如通过免疫动物使动物表达具有失活的CH1结构域的重链免疫球蛋白基因座和/或经遗传重排的轻链基因座(单一重排的轻链基因座)。
在一个方面，使重链免疫球蛋白基因座的CH1结构域和任选地铰链区失活的步骤使得非人动物产生如本文中所公开的单结构域抗原结合蛋白。在一个实施方案中，使重链免疫球蛋白基因座的CH1结构域和任选地铰链区失活，包括用使重链基因座例如IgG重链基因座的CH1结构域和任选地铰链区缺失或将失活突变引入所述CH1结构域和铰链区的靶向载体靶向内源重链免疫球蛋白基因座。在一个实施方案中，使重链免疫球蛋白基因座的CH1结构域和任选地铰链区失活，包括同源重组。在另一个实施方案中，所述失活步骤还可包括用以下区段的任一个或多个替换重链基因的基因座的一个或多个、基本上所有或所有内源可变区基因区段：一个或多个重链可变区基因区段、一个或多个轻链可变区基因区段、一个或多个人可变区基因区段和一个或多个未重排的可变区基因区段。可在非人动物的种系中进行使重链基因的基因座的CH1结构域和任选地铰链区失活的步骤。
在一个方面，所述方法包括引入编码经遗传工程化的重排的轻链基因座，例如，如本文所述的经遗传工程化的通用轻链的核酸。在一个方面，引入编码经遗传工程化的重排的轻链基因座的核酸的步骤还包括替换非人动物的所有或基本上所有内源免疫球蛋白轻链基因座。在一个方面，引入编码经遗传工程化的重排的轻链基因座的核酸的步骤还包括使非人动物的所有或基本上所有内源免疫球蛋白轻链基因座功能性失活。在另一个方面，将编码经遗传工程化的重排的轻链的核酸引入动物的种系。
在一个实施方案中，产生如本文中所公开的非人动物的方法包括(a)获得第一非人动物，其包含具有缺失的或失活的CH1结构域的重链基因座(和任选地可操作地连接至具有缺失的或失活的CH1结构域的重链恒定区序列的轻链可变区核苷酸序列)，和任选地缺失的或失活的铰链区，以使得所述非人动物产生如本文中所公开的单结构域抗原结合蛋白(诸如VL单结构域结合蛋白)，和(b)使(a)的第一非人动物与第二非人动物交配，所述第二非人动物在一个方面可以是与所述第一非人动物不同的品系，其中所述第二非人动物表达通用轻链，以及其中所述交配导致产生，例如，包含单结构域抗原结合蛋白和经遗传工程化的重排的轻链(单一重排的轻链；ULC)的后代。
在一些方面，产生如本文中所公开的非人动物的方法还包括使选自由IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgE和IgA组成的组的一个或多个免疫球蛋白基因失活或缺失。在一个实施方案中，使IgG2b和IgG2a/IgG2c免疫球蛋白基因缺失。在另一个实施方案中，使IgD、IgG3、IgG2b、IgG2a/IgG2c、IgE和IgA基因缺失，以使得所述非人动物产生具有IgM或IgG1同种型的免疫球蛋白重链，其中所述IgG1同种型在CH1结构域和任选地铰链区中具有缺失或失活突变。
在一个方面，非人动物已能够产生单结构域抗原结合蛋白，并且本文中提供了增加所述非人动物的单结构域抗原结合蛋白的产生的方法。此类方法包括使非人动物的B细胞表达编码经遗传工程化的单一重排的轻链，例如，如本文所述的经遗传工程化的通用轻链的核酸。使B细胞表达此类核酸还可包括失活或阻止B细胞表达内源轻链基因。
在一个方面，如本文中所公开的非人动物是大鼠或小鼠。在另一个实施方案中，如本文中所公开的非人动物是小鼠。因此，本文中提供了经遗传修饰的小鼠，其包含(a)在小鼠重链基因座中用一个或或多个人重链V、D和J基因区段对所有或基本上所有内源免疫球蛋白重链V、D和J基因区段的替换，其中所述一个或多个人重链V、D和J基因区段可操作地连接至小鼠重链恒定区(例如，内源小鼠重链恒定区)，其中所述小鼠重链恒定区包含全长IgM基因；和包含在编码选自由IgG1、IgG2a、IgG2c、IgG2b及其组合组成的组的IgG基因中的CH1区的核苷酸序列中的缺失或失活突变的IgG基因，其中所述小鼠表达包含具有CH1区的IgM的B细胞受体，其中所述IgM包含与同源轻链缔合的重链；和(b)用单一重排的可变Vκ:Jκ基因序列对所有或基本上所有内源免疫球蛋白轻链V和J基因区段的替换。在一些实施方案中，所述同源轻链来源于单一重排的可变Vκ:Jκ基因序列。在一些实施方案中，所述单一重排的可变Vκ:Jκ基因序列可操作地连接至小鼠轻链恒定序列，例如，内源小鼠轻链恒定序列。
在另一个方面，本文中提供了非人动物，例如，大鼠或小鼠，其包含(a)小鼠重链基因座中的所有或基本上所有内源免疫球蛋白重链V、D和J基因区段的缺失或功能性失活以及一个或多个人重链V、D和J基因区段的引入，其中所述一个或多个人重链V、D和J基因区段可操作地连接至小鼠重链恒定区(例如，内源小鼠重链恒定区)，其中所述小鼠重链恒定区包含全长IgM基因；和IgG基因，其包含在编码选自由IgG1、IgG2a、IgG2c、IgG2b及其组合组成的组的IgG基因中的CH1区的核苷酸序列中的缺失或失活突变，其中所述小鼠表达包含具有CH1区的IgM的B细胞受体，其中所述IgM包含与同源轻链缔合的重链；和/或(b)所有或基本上所有内源免疫球蛋白轻链V和J基因区段的缺失或功能性失活和单一重排的可变Vκ:Jκ基因序列的引入。
本文中还提供了经遗传修饰的小鼠，其包含(a)小鼠重链基因座中用一个或多个人轻链V和J基因区段对所有或基本上所有内源免疫球蛋白重链V、D和J基因区段的替换，其中所述一个或多个人轻链V和J基因区段可操作地连接至小鼠重链恒定区，其中所述小鼠重链恒定区包含全长IgM基因；和包含在编码选自由IgG1、IgG2a、IgG2c、IgG2b、IgG3及其组合组成的组的IgG基因中的CH1区的核苷酸序列中的缺失或失活突变的IgG基因，其中所述小鼠表达包含具有CH1区的IgM的B细胞受体，其中所述IgM包含与同源轻链缔合的重链；和(b)用单可变Vκ:Jκ基因序列对所有或基本上所有内源免疫球蛋白轻链V和J基因区段的替换。在一些实施方案中，所述同源轻链来源于单一重排的可变Vκ:Jκ基因序列。
在一个方面，提供了用于产生缺少CH1结构域的结合蛋白的方法，所述方法包括：(a)从如本文所述的非人动物分离所述结合蛋白，产生所述结合蛋白的细胞或编码所述结合蛋白序列的核苷酸序列。在一个方面，所述分离步骤可包括以下步骤的一个或多个步骤：(a)用抗原免疫如本文所述的非人动物；(b)在足以使非人动物产生结合蛋白的条件下维持所述非人动物和/或(c)鉴定由所述非人动物产生的缺少功能性CH1结构域和/或缺少功能性铰链区的结合蛋白。在一些方面，所分离的结合蛋白是单结构域抗原结合蛋白。在一个方面，单结构域抗原结合蛋白是单体的。
在一个方面，提供了用于产生抗原结合蛋白的方法，所述方法包括(a)用抗原免疫如本文所述的非人动物；(b)在足以产生结合蛋白的条件下维持所述非人动物；(c)鉴定由所述非人动物产生的结合蛋白，其中所述结合蛋白缺少功能性CH1结构域或缺少功能性CH1结构域及缺少铰链区；(d)鉴定编码免疫球蛋白多肽上的可变结构域的可变区序列，所述免疫球蛋白多肽缺少CH1结构域，或缺少铰链区和CH1结构域，其中所述可变结构域特异性结合所述抗原；(e)在合适的表达***中表达由与(d)的可变区序列相同或基本上相同的序列编码的蛋白质，其中(d)的可变区序列与缺少CH1区或缺少CH1区和铰链的重链可变序列的核酸序列连接；和/或(f)分离(e)的表达的蛋白质。在一些实施方案中，表达由所述可变区序列编码的蛋白质和/或(f)分离表达的蛋白质的步骤包括培养细胞，例如用所述可变区序列转染的细胞，从分离自本文中所公开的动物的细胞形成的杂交瘤，和/或从培养的细胞收集上清液。
在一个方面，提供了用于产生抗原结合蛋白的方法，所述方法包括用抗原免疫如本文所述的非人动物，鉴定编码特异性结合所述抗原的可变结构域的可变区核酸序列，和在适当的表达***中使用所述可变区核酸序列，其中使可变区核酸序列与缺少CH1或缺少CH1和铰链的重链恒定基因连接；其中所述表达***表达特异性结合抗原的抗原结合蛋白。
因此，本文中还提供了此类分离的结合蛋白、细胞和核酸序列。
其它实施方案已被描述，并且根据确保详细描述的综述对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图简述
图1A举例说明靶向小鼠IgG1基因、IgG2b和IgG2a基因(未按比例)以产生表达缺少CH1结构域的IgG1的经遗传修饰的小鼠免疫球蛋白重链基因座；将由空心三角形表示的人免疫球蛋白重链V、D和J区段***小鼠恒定基因座，其中使IgG1 CH1外显子*和IgG2a/2b**缺失，椭圆形代表增强子。
图1B举例说明包含单一重排的人VL/JL基因序列***的小鼠免疫球蛋白轻链基因座(不按比例)。
图1C举例说明由具有图1B和1C的Ig基因座的小鼠表达的IgM，其中所述IgM包含完整的CH1结构域。图1C还举例说明在在类别转换后，由具有图1A和1C的Ig基因座的小鼠表达的IgG1是缺少CH1结构域的单结构域重链抗原结合蛋白。
图2举例说明两条通用轻链的基因组结构(不按比例)，其中一条通用轻链包含含有Vκ1-39Jκ5的单一重排的人可变区，其中另一条通用轻链包含含有Vκ3-20Jκ1的单一重排的人可变区。
图3举例说明小鼠中的野生型IgG1基因座(IgG1，上方)，显示了与CH1基因区段融合的JH区基因区段，其后是铰链区、CH2基因区段和CH3基因区段；被使CH1结构域缺失的构建体(IgG1ΔCH1；I)靶向的IgG1基因座；被使CH1结构域和铰链区缺失的构建体(IgG1ΔCH1Δ铰链；II)靶向的IgG1基因座；被使IgG1CH1结构域、IgG2b和IgG2a缺失的构建体(IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a；III)靶向的恒定区基因座；被使IgG1CH1结构域、铰链区、IgG2b和IgG2a缺失的构建体(IgG1ΔCH1&Δ铰链ΔIgG2b/2a；IV)靶向的恒定区基因座；或被使IgG1 CH1结构域、IgG2b、IgG2a、IgG3、IgD、IgA和IgE以及任选地铰链区缺失的构建体(IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E(任选地Δ铰链)；V)靶向的恒定区基因座。基因座的示意图不按比例呈现。IgG2a/c标示IgG2a或IgG2c基因座，因为取决于其品系，小鼠可具有IgG2a等位基因或IgG2c等位基因。
图4A举例说明靶向小鼠重链序列(不按比例)以产生含有人重链可变基因区段(空心三角形)并且缺少功能性IgG1 CH1结构域以及缺少IgG2a和IgG2b基因座的经遗传修饰的基因座(在一些实施方案中被称为1673)。
图4B举例说明靶向小鼠IgG1基因(所有可变基因区段是小鼠并且由实心三角形标示)以产生表达缺少CH1结构域和铰链的IgG1的经遗传修饰的基因座(不按比例)(在一些实施方案中被称为1576)。
图4C举例说明靶向小鼠重链恒定区(不按比例)以产生缺少IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgG2b、IgG2a、IgE和IgA基因区段的经遗传修饰的基因座(图4D中继续的克隆IgG1ΔCH1ΔIgG2b/IgG2a、ΔIgG3、ΔIgD/A/E的第一部分)。人可变基因区段由空心三角形标示。
图4D举例说明靶向图4C的小鼠恒定区以产生包含人重链可变基因区段、完全和功能性鼠IgM基因区以及缺乏功能性CH1结构域和任选地缺少功能性铰链区的IgG1基因区的经遗传修饰的基因座(不按比例)(所述小鼠也缺少IgG2b/IgG2a、IgG3和IgD/A/E；在一些实施方案中也被称为6180)。人可变基因区段由空心三角形标示。
图5A显示在用β-半乳糖苷酶(βgal)免疫之前和之后，以下各种单结构域IgG1小鼠之间的比较性总的血清IgG1滴度：对于mVHIgG1ΔCH1&铰链和小鼠κ链是纯合的小鼠(1576)；对于mVHIgG1ΔCH1&铰链和为单一重排的轻链Vκ3-20Jκ1ULC的κ链是纯合的小鼠(1576/1635)；或具有相同遗传背景的野生型(WT)小鼠。HO对于遗传修饰是纯合的。
图5B举例说明相较于mVHIgG1ΔCH1&铰链纯合小鼠(1576HO)或mVHIgG1ΔCH1-铰链x Vκ3-20Jκ1 ULC1纯合小鼠(1576HO1635HO)的被免疫的WT小鼠中的抗原特异性IgG1血清滴度。利用β-半乳糖苷酶(βgal)作为模型抗原免疫小鼠，通过ELISA测量抗原特异性IgG1滴度。
图6提供了在非还原条件下制备的并用抗小鼠IgG显现的，来自2只hVHIgG1ΔCH1&铰链ΔIgG2b/2a x Vκ1-39Jκ5 ULC纯合小鼠(1859HO 1633HO)、3只hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a x Vκ3-20Jκ1 ULC纯合小鼠(1673HO 1635 HO)和3只具有人可变区(VH和Vκ)和二聚体单结构域抗原结合蛋白(37-37同二聚体)或单体ΔCH1单结构域结合蛋白(缺失了CH1铰链的单链)的小鼠恒定区的
Figure BDA0001129618200000171
对照小鼠(VI3IgG1)的小鼠血清的蛋白质印迹的图像。
图7显示在用抗原X(一种细胞表面蛋白)腹膜内免疫后，hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2ax Vκ1-39Jκ5纯合小鼠(1673X1633)或hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a x Vκ3-20Jκ1纯合小鼠(1673X1635)的在不同的时间点(x-轴)上于动物的血浆中发现的IgG1滴度(y-轴)。
图8提供了在还原条件下制备的并用抗小鼠IgG显现的，来自3只hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E x Vκ1-39Jκ5 ULC纯合小鼠(6180HO 1634 HO)、两只hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3 ΔIgD/A/E纯合小鼠(6180 HO)和3只具有人可变区(VH和Vκ)和二聚体单结构域抗原结合蛋白(37-37同二聚体)或单体ΔCH1单结构域结合蛋白(缺失了CH1的单链)的小鼠恒定区的VI3对照小鼠的小鼠血清的蛋白质印迹的图像。
图9显示hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x1634HO)小鼠和hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E(6180 HO)动物以及VI3对照动物的血浆中的稳定状态的IgM和IgG的浓度。
图10显示来自代表性纯合对照VI3和hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E(6180 HO)x Vκ1-39Jκ5(6180 HO 1634HO)小鼠的针对CD19和CD3被染色的单线态门控的脾细胞的等值曲线(A)。还显示了来自代表性对照VI3小鼠和代表性纯合hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x1634 HO)小鼠的针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)被染色的CD19+B细胞门控的脾细胞的等值曲线(C)。注意，所述B细胞是IgD-，因为IgD恒定结构域已缺失。因此，该曲线中的术语“成熟”只表示IgD而非其它非IgM免疫球蛋白的不存在。还提供了显示来自每一个组的3只代表性小鼠的CD19+B细胞的总数(y-轴；细胞/脾X107)的图(B)。其等值曲线被包括的动物被加圈表示。
图11显示来自代表性对照VI3小鼠和代表性纯合hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x1634 HO)小鼠的(A)针对CD93和B220被染色的分离自脾的CD19+门控的B细胞，(B)针对IgM和CD23被染色的未成熟或成熟门控的B细胞或(C)针对CD21/35和IgM被染色的未成熟或成熟门控的B细胞的等值曲线。
图12显示针对CD19和CD39被染色的从代表性对照VI3小鼠和代表性纯合hVHIgG1ΔCH1&IgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x1634 HO)小鼠的股骨分离的骨髓的等值曲线。还显示了来自每一个组的3只代表性小鼠的每股骨的细胞或CD19+B细胞的总数(y-轴；细胞/股骨x107)。其等值曲线被包括的动物被加圈指示。
图13显示针对IgM和B220被染色的从代表性对照VI3小鼠和代表性纯合hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x1634 HO)小鼠的股骨分离的骨髓的等值曲线。还显示了来自每一个组的3只代表性小鼠的每股骨的成熟(IgM+B220hi)和未成熟(IgM+B220int)B细胞的总数(y-轴；细胞/股骨x107)。其等值曲线被包括的动物被加圈指示。
图14A举例说明小鼠重链基因座的示意图(不按比例)。所述小鼠重链基因座的长度为约3Mb，并且含有约200个重链可变(VH)基因区段、13个重链多样性(DH)基因区段和4个重链连接(JH)基因区段以及增强子(Enh)和重链恒定(CH)区。
图14B举例说明人κ轻链基因座的示意图(不按比例)。人κ轻链基因座被复制成分别跨越约440kb和600kb的相反极性的近侧和远侧重叠群。介于两个重叠群之间的是被认为不含Vκ基因区段的约800kb的DNA。人κ轻链基因座含有约76个Vκ基因区段、5个Jκ基因区段、内含增强子(Enh)和单个恒定区(Cκ)。
图15显示向其中内源重链可变区基因区段已缺失的小鼠重链基因座内逐步***40个人Vκ和5个人Jκ基因区段的靶向策略(不按比例)。显示了具有重组酶识别位点(FRT)的潮霉素(HYG)和新霉素(NEO)选择盒。还显示了用于Adam6a、Adam6b和IGCR1基因的***的靶向策略(不按比例)。人可变基因区段由空心三解形标示。
图16显示图15的经修饰的小鼠重链基因座(hJκ、40hVκ、Adam6；上方)；产生来自图15的经修饰的小鼠重链基因座(hJκ、40hVκ、Adam6、ΔCH1、ΔIgG2b、ΔIgG2a；中间)的IgG1基因序列、IgG2b基因序列和IgG2a基因序列的CH1结构域的缺失和/或失活的靶向策略，和产生来自包含未重排的人Jκ基因区段和40个人Vκ基因区段的经修饰的小鼠重链基因座的选择盒的缺失的靶向策略，其中所述经修饰的小鼠重链基因座缺少IgG1基因中的功能性CH1结构域并且还缺少功能性IgG2b和IgG2a基因(hJκ、40hVκ、Adam6、ΔCH1、ΔIgG2b、ΔIgG2a选择盒已缺失；也称为6082，下方)。人可变基因区段由空心三解形标示。
图17A显示从以下3个不同组的动物的脾和骨髓分离的B细胞(x-轴)的相对mRNA表达(针对HPRT1 mRNA标准化的；y-轴)：野生型(WT)小鼠、对于图16的经修饰的重链基因座(hJκ、40hVκ、Adam6、ΔCH1 ΔIgG2b ΔIgG2a选择盒已缺失；KoH CH1缺失)是纯合的小鼠，以及对于表达人重链V、D和J区段，在IgG1基因中缺少功能性CH1结构域，以及还缺少功能性IgG2b和IgG2a基因和包含单一重排的轻链基因座(CH1缺失x ULC)的两个经修饰的小鼠重链基因座是纯合的小鼠。设计探针来检测有效重排，并且由检测人Jκ区段与鼠gG1铰链之间的重组的探针(hJκ/mIgG1铰链探针；左图)或检测人JH区段与鼠IgG1铰链之间的重组的探针(hJH/mIgG1铰链探针；右图)组成。ND：未检测到的(Ct≥35)。n＝2(对于WT)，2(对于KoHCH1缺失)，和3(对于CH1缺失x ULC)。
图17B显示从以下3个不同的组的动物(x-轴)的脾和骨髓分离的B细胞的相对mRNA表达(针对mκC mRNA标准化的；y-轴)：野生型(WT)小鼠、对于图16的重链基因座(hJκ、40hVκ、Adam6、ΔCH1 ΔIgG2b ΔIgG2a选择盒已缺失；KoH CH1缺失)是纯合的小鼠，以及对于表达人重链V、D和J区段，在IgG1基因序列中缺少功能性CH1结构域，以及还缺少功能性IgG2b和IgG2a基因序列的两个经修饰的小鼠重链基因座是纯合的并且包含单一重排的轻链基因座(CH1缺失x ULC)的小鼠。设计探针来检测有效重排，并且由检测人Jκ区段与鼠gG1铰链之间的重组的探针(hJκ/mIgG1铰链探针；左图)或检测人JH区段和鼠IgG1铰链的探针(hJH/mIgG1铰链探针；右图)组成。ND：未检测到的(Ct≥35)。n＝2(对于WT)，2(对于KoH CH1缺失)，和3(对于CH1缺失x ULC)。
图18提供了在非还原条件下制备的并用抗小鼠IgG显现的，来自3只hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2b x Vκ3-20Jκ1 ULC纯合小鼠(6082HO 1635 HO)、3只具有人可变区(VH和Vκ)和小鼠恒定区的小鼠(VI3IgG1)以及2只hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E小鼠(6180 HO)的小鼠血清的蛋白质印迹的图像，其显示了二聚体单结构域抗原结合蛋白(37-37同聚物)或单体ΔCH1单结构域结合蛋白(CH1缺失单链)的存在或不存在。
详述
本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可变化。本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案，并且不旨在是限制性，因为本发明的范围将只由权利要求限制。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与为本发明所属领域内的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然可在本发明的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但现描述特定的方法和材料。本文中提及的所有出版物和专利文献通过引用以其整体并入本文。
本发明提供了在它们的基因组中，例如在它们的种系中包含编码单结构域抗原结合蛋白(包括VH-单结构域抗原结合蛋白和VL-单结构域抗原结合蛋白)和/或单一重排的轻链的核苷酸序列的经遗传修饰的非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)；产生所述非人动物的方法；以及使用所述非人动物的方法。除非另外定义，否则本文中使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中已获得的含义，除非明确地指出相反或从其中使用所述语和短语的背景明确地表现出相反。
术语"抗体"包括典型的免疫球蛋白分子，其包含4条多肽链，通过二硫键链间连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。术语还包括与抗原或其片段具有反应性的免疫球蛋白。合适的抗体包括，但不限于人抗体、灵长类动物化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体，人源化抗体，合成抗体，重组抗体，杂合抗体，突变型抗体，移植缀合抗体(即，缀合或融合至其它蛋白质、放射性标记、细胞毒素的抗体)和体外生成的抗体。技术人员将容易地识别常用抗体同种型，例如，具有选自由IgG、IgA、IgM、IgD和IgE或其任何亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)组成的组的重链恒定区的抗体。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白重链序列，包括免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另有所指，否则重链可变结构域包括3个重链CDR和4个FR区。重链的片段包括CDR、CDR和FR及其组合。典型的重链在可变结构域之后具有(从N末端至C末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域(在IgM或IgE的情况下)。重链的功能性片段包括能够特异性识别表位(例如，以在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD识别表位)的片段，所述片段能够从细胞表达和分泌，并且包含至少一个CDR。重链可变结构域由可变区基因序列编码，所述基因序列通常包含来源于存在于种系中的VH、DH和JH区段的库的VH、DH和JH区段。可在见于www.imgt.org的国际免疫遗传学信息***(IMGT)的网站上查看各种生物的V、D和J重链区段的序列、位置和命名。
短语“轻链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白轻链序列，并且除非另有所指，否则包括人κ及λ轻链和VpreB，以及替代轻链。除非另有所指，否则轻链可变结构域通常包括3个轻链CDR和4个框架(FR)区。通常地，全长轻链从氨基端至羧基端包括可变结构域(其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)和轻链恒定区。轻链可变结构域由轻链可变区基因序列编码，所述基因序列通常包含来源于存在于种系中的VL和JL基因区段的库的VL和JL基因区段。可在见于www.imgt.org的国际免疫遗传学信息***(IMGT)的网站上查看各种生物的V和J轻链区段的序列、位置和命名。轻链包括例如不选择性结合被它们出现在其中的表位结合蛋白选择性结合的第一或第二表位的那些轻链。轻链还包括结合并识别重链，或帮助重链结合并识别一个或多个被它们出现在其中的表位结合蛋白选择性结合的表位。短语轻链包括"共同轻链”，也被称为"通用轻链"(ULC)。
共同或通用轻链(ULC)包括来源于免疫球蛋白轻链基因座的那些轻链，所述免疫球蛋白轻链基因座包含与轻链恒定区可操作地连接的单一重排的免疫球蛋白轻链可变区编码序列，其中所述免疫球蛋白轻链基因座的表达只产生来源于可操作地连接至轻链恒定区的单一重排的免疫球蛋白轻链可变区的轻链，无论是否在免疫球蛋白轻链基因座中包含其它核酸序列，例如，其它轻链基因区段。通用轻链包括人Vκ1-39Jκ基因(例如，Vκ1-39Jκ5基因)或人Vκ3-20Jκ基因(例如，Vκ3-20Jκ1基因)，并且包括所述基因的体细胞突变(例如，亲和力成熟的)形式。
短语“基因区段”或“区段”包括提及V(轻链或重链)或D或J(轻链或重链)免疫球蛋白基因区段，所述基因区段包括可参与重排(例如，由内源重组酶介导的)以形成重排的V/J(轻链)或V/D/J(重链)序列的免疫球蛋白基因座(在例如人和小鼠中)中的未重排的序列。除非另有所指，否则V、D和J区段包含按照12/23法则允许进行V/J重组或V/D/J重组的重组信号序列(RSS)。除非另有所指，否则所述区段还包含天然地与它们缔合的序列或其功能性等效物(例如，对于V区段、启动子和前导序列)。
关于核酸序列的术语“未重排的”包括存在于动物细胞的种系，优选来源于未被遗传修饰的，例如包含野生型基因组的动物的细胞中的核酸序列。通常地，重链可变区以其天然种系构型包含未重排的VH基因区段、未重排的DH基因区段和未重排的JH基因区段，而轻链可变区包含未重排的VL基因区段和未重排的JL基因区段。在B细胞成熟过程中，这些基因区段重排以产生重排的可变区基因。
关于免疫球蛋白核酸序列的术语“种系”包括可被传递至后代的核酸序列。
短语“互补决定区”或术语“CDR”包括由生物体的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述互补决定区通常(即，在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如，抗体或T细胞受体)的轻或重链的可变区中的两个框架区之间。CDR可由例如种系序列或重排的或未重排的序列和例如由天然或成熟B细胞或T细胞编码。CDR可经体细胞突变(例如，由动物种系中编码的序列改变)、人源化和/或经氨基酸取代、添加或缺失而修饰。在一些情况下(例如，对于CDR3而言)，CDR可由不连续(例如，在未重排的核酸序列中)，但是例如由于剪接或连接该序列(例如，V-D-J重组形成重链CDR3)，在B细胞核酸序列中连续的两个或更多个序列(例如，种系序列)编码。
短语“体细胞突变”包括提及来自已经历类别转换的B细胞的核酸序列，其中类别转换的B细胞中的免疫球蛋白可变区的核酸序列(例如，编码重链可变结构域或包括重链CDR或FR序列的核苷酸序列)与类别转换之前的B细胞中的核酸序列不同，诸如，例如，未经历类别转换的B细胞与已经历类别转换的B细胞之间的CDR或框架核酸序列的差异。“体细胞突变”包括提及来自与未亲和力成熟的B细胞中的相应免疫球蛋白可变区序列(即，种系细胞的基因组中的序列)不同的亲和力成熟的B细胞的核酸序列。短语“体细胞突变”还包括提及在B细胞暴露于目标表位后来自B细胞的免疫球蛋白可变区核酸序列，其中所述核酸序列不同于B细胞暴露于目标表位之前的相应核酸序列。短语“体细胞突变”是指来自已在动物，例如，具有人免疫球蛋白可变区核酸序列的小鼠中，响应于免疫原攻击而生成的，并且由此类动物中固有操作性选择过程产生的结合蛋白的序列。
术语“同源的”，当在“与……同源”的意义上使用时，例如第一VL结构域与第二VL结构域“同源”，旨在包括提及来自根据本发明由小鼠产生的相同结合蛋白的两个VL结构域之间的关系。例如，根据本发明的实施方案遗传修饰的小鼠，例如，具有其中VH、DH和JH区被VL和JL区替换的重链基因座的小鼠，产生抗体样结合蛋白，所述抗体样结合蛋白具有由相同小鼠CH区(例如，IgM同种型)与第一人VL结构域融合构成的两条相同多肽链，和由相同小鼠CL区与第二人VL结构域融合构成的两条相同多肽链。在小鼠中的克隆选择期间，通过克隆选择过程选择第一和第二人VL结构域以在单一抗体样结合蛋白的情况下一起出现。因此，由于克隆选择过程，在单一抗体样分子中一起出现的第一和第二VL结构域被称为是“同源的”。相反地，在第一抗体样分子中出现的VL结构域与在第二抗体样分子中出现的VL结构域不是同源的，除非所述第一和第二抗体样分子具有相同的重链(即，除非与第一人重链融合的VL结构域和与第二人重链区融合的VL结构域相同)。
在抗体发育早期，抗体重链经历其中自然通过多种选择方案选择合适的重链以经历进一步的选择来最终形成功能性和亲和力成熟的抗体的选择过程。源自重链和轻链可变基因重排的多样性存在于骨髓中，并且在类别转换之前发生。从祖先B细胞(或，原B细胞)中的重组重链基因区段表达的抗体重链通常与替代轻链配对，以在IgM同种型的情况下呈现在原B细胞的表面上，以形成称为前B细胞受体或前BCR的结构(其包括其它共受体)。一旦前BCR被呈现在细胞表面上，所述前BCR被认为就向细胞发出其复合物正确形成的信号，从而有效地指示细胞重链已通过该早期选择步骤。因此细胞被告知所述重链可经历进一步选择。如果所述重链含有当在IgM和替代轻链的情况下呈递时对前BCR的形成不利的缺陷，则所述细胞将经历细胞凋亡。如果所述细胞经历细胞凋亡，则重链的重链可变区的有用性或对多样性的贡献将损失。因此，抗体选择中的非常早的步骤需要在IgM同种型的情况下将重链与替代轻链一起呈递。抗体生成B细胞的正常发育通常需要CH1结构域的存在。所有重链同种型(包括IgM)均包含CH1结构域。替代轻链和同源轻链被认为在IgM的情况下通过重链的CH1结构域与给定的重链相互作用。
在B细胞离开骨髓后，与抗原的接合(这需要表达为细胞表面IgM的重排的抗体之间的低亲和力相互作用)刺激体细胞高频突变和类别转换的协同诱导。类别转换后，由表面B细胞受体产生的差异抗原识别允许从原始IgM的高频突变衍生物的库中选择具有增强的亲和力的抗体。
术语“只有重链的抗体”、“只有重链的抗原结合蛋白”、“单结构域抗原结合蛋白”、“单结构域结合蛋白”等是指包含免疫球蛋白样链的单体或同二聚体免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白样链包含可操作地连接至重链恒定区的可变结构域，所述重链恒定区通常不能与轻链缔合，因为所述重链恒定区通常缺少功能性CH1结构域。因此，术语“只有重链的抗体”、“只有重链的抗原结合蛋白”、“单结构域抗原结合蛋白”、“单结构域结合蛋白”等包括(i)单体单结构域抗原结合蛋白，其包含含有可操作地连接至缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的可变结构域免疫球蛋白样链之一，或(ii)同二聚体单结构域抗原结合蛋白，其包含两个免疫球蛋白样链，所述每一个免疫球蛋白样链包含可操作地连接至缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的可变结构域。在各个方面，同二聚体单结构域抗原结合蛋白包含两个相同的免疫球蛋白样链，所述每一个免疫球蛋白样链包含可操作地连接至相同的缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的相同的可变结构域。另外，单结构域抗原结合蛋白的每一个免疫球蛋白样链包含连接至在重链恒定区基因(例如，IgG、IgA、IgE、IgD或其组合)的CH1编码序列(和，任选地，铰链区)中包含缺失或失活突变的重链恒定区(CH)基因序列的可变结构域，所述可变结构域可来源于重链可变区基因区段(例如，VH、DH、JH)、轻链基因区段(例如，VL、JL)或其组合。包含来源于重链基因区段的可变结构域的单结构域抗原结合蛋白可被称为“VH-单结构域抗体”或“VH-单结构域抗原结合蛋白”。包含来源于轻链基因区段的可变结构域的单结构域抗原结合蛋白可被称为“VL-单结构域抗原结合蛋白”。
如上所公开的，通过经工程化以产生单结构域抗原结合蛋白的非人动物的单结构域抗原结合蛋白的产生，导致相较于常规抗体相对低的响应于抗原的抗原特异性单结构域抗原结合蛋白的表达。本领域表明只有当几乎无至无重排的轻链表达时才可能产生高滴度。具体地，有人断言不表达重排的轻链的动物能够产生较高水平的特异性结合抗原的单结构域抗原结合蛋白。Janssens等(2006)PNAS 103:15130-15135；Zou等(2004)J.Exp.Med.204:3271-32。与本领域相反，本文中提供的数据显示表达经遗传工程化的单一重排的轻链的动物将在攻击后生成高滴度的抗原特异性单结构域抗原结合蛋白。本文中还显示了轻链可变区基因区段与包含在CH1序列中的缺失或失活突变的重链恒定区重排和组合以编码能够特异性结合抗原的VL-单结构域抗原结合蛋白的能力。此类VL-单结构域抗原结合蛋白的轻链可变结构域有可能通过在重排的轻链可变区基因序列中添加例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个N添加来补偿同源轻链的缺少，在从内源和未经修饰的免疫球蛋白轻链基因座重排的轻链可变区基因序列中通常未看到所述添加。
因此，在一个方面，提供了非人动物，其中所述动物包含单结构域抗原结合蛋白和经遗传工程化的单一重排的轻链，例如，共同轻链，其中单结构域抗原结合蛋白的至少一个重链缺少功能性CH1结构域。在另一个方面，提供了非人动物，其中所述动物包含含有轻链可变区和缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的VL-单结构域抗原结合蛋白。在另一个方面，提供了非人动物，其中所述动物包含含有轻链可变区和缺少功能性CH1结构域的重链恒定区以及经遗传工程化的单一重排的轻链，例如，共同轻链的VL-单结构域抗原结合蛋白。还提供了产生经遗传修饰的非人动物的方法、从经遗传修饰的非人动物分离的蛋白质(例如，单结构域抗原结合蛋白)、细胞，以及从所述经遗传修饰的动物分离蛋白质和细胞的方法。
术语“高亲和力”抗体是指具有约10-9M或更低(例如，约1x 10-9M、1x 10-10M、1x 10-11M或约1x 10-12M)的针对其靶表位的KD的抗体。在一个实施方案中，通过表面等离子体共振技术例如BIACORETM测量KD；在另一个实施方案中，通过ELISA测量KD。
术语“细胞”包括适合用于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物的那些细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属种(Bacillus spp.)、链霉菌属种(Streptomyces spp.)的菌株等)、分枝杆菌属(mycobacteria)的细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾细胞等)、非人动物细胞、人细胞或细胞融合物诸如，例如，杂交瘤或四重杂交瘤。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞、猴细胞、猿细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞或小鼠细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞并且选自以下细胞：CHO(例如，CHO K1、DXB-11 CHO、素食者-CHO)、COS(例如，COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾细胞(例如，HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞尔托利氏细胞(Sertolicell)、BRL 3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方案中，所述细胞包含一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如，PER.C6TM细胞)。
术语"保守的”，当用于描述保守氨基酸取代时，包括具有拥有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链R基因的另一种氨基酸残基对氨基酸残基的取代。一般地，保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的目标功能性质，例如，可变区以所需亲和力特异性结合靶表位的能力。具有拥有相似化学性质的侧链的氨基酸的组的实例包括脂肪族侧链诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链诸如丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链诸如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香族侧链诸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链诸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链诸如天冬氨酸和谷氨酸；和含硫侧链诸如半胱氨酸和甲硫氨酸含硫。保守氨基酸的取代组包括，例如，缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方案中，保守氨基酸取代可以是用丙氨酸对蛋白质中的任何天然残基的取代，如在例如丙氨酸扫描诱变中使用的。在一些实施方案中，产生在于Gonnet等(1992)ExhaustiveMatching of the Entire Protein Sequence Database,Science 256:1443-45(据此通过引用并入)中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的保守取代。在一些实施方案中，所述取代是其中取代在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的中度保守取代。
在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或重链的残基位置相异在于一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施方案中，免疫球蛋白轻链或其功能性片段(例如，允许表达并且从例如B细胞分泌的片段)中的残基位置与其氨基酸序列列于本文中的轻链不相同，但相异在于一个或多个保守氨基酸取代。
短语“表位结合蛋白”或"抗原结合蛋白"包括具有至少一个CDR并且能够选择性识别表位，例如能够以为约1微摩尔或更低的KD(例如，为约1x 10-6M、1x 10-7M、1x 10-9M、1x10-9M、1x 10-10M、1x 10-11M或约1x 10-12M的KD)结合表位的蛋白质。治疗性表位结合蛋白(例如，治疗性结合蛋白)通常需要在纳摩尔或皮摩尔范围内的KD。
短语“功能性片段”包括可被表达、分泌并以在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的KD特异性结合表位的表位结合蛋白的片段。特异性识别包括具有至少在微摩尔范围、纳摩尔范围或皮摩尔范围内的KD。
关于序列比较的术语"同一性"包括如通过本领域中已知的可用于测量核苷酸和/或氨基酸序列同一性的许多不同算法中的任一种测定的同一性。在一些实施方案中，如本文所述的同一性使用ClustalW1.83版(slow)比对，采用10.0的开放空位罚分、0.1的延伸空位罚分以及使用Gonnet相似性矩阵(MACVECTORTM 10.0.2,MacVector Inc.,2008)来测定。术语“同一性”包括多聚分子之间，例如核酸分子(例如，DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的整体关联性。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同，则所述聚合分子被认为与所述另一个聚合分子“基本上相同”。正如本领域技术人员所理解的，多种算法是可用的，其允许序列的比较以测定其同源程度，包括通过在考虑不同序列中哪些残基彼此“对应”时，在一个序列中相对于另一个序列允许指定长度的空位。两个核酸序列之间的百分比同一性的计算，例如，可通过为了最佳比较目的而对齐两个序列来进行(例如，为了最佳比对可在第一和第二核酸序列之一或两者引入空位，并且为了比较目的，可忽略非对应序列)。在某些实施方案中，为了比较目的而对齐的序列的长度为参照序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或基本上100％。随后比较对应核苷酸位置上的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中对应位置相同的残基占据时，则所述分子在该位置相同。两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置的数目的函数，考虑到了为了两个序列的最佳比对需要引入的空位数目和每个空位的长度。用于测定两个核苷酸序列之间的百分比同一性的代表性算法和计算机程序包括，例如，已被整合进ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller的算法(CABIOS,1989,4:11-17)，该算法使用PAM120加权残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分)。两个核苷酸序列之间的百分比同一性可选择地，例如使用GCG软件包中的GAP程序，利用NWSgapdna.CMP矩阵来测定。
短语“微摩尔范围”旨在意指1-999微摩尔；短语“纳摩尔范围”旨在意指1-999纳摩尔；短语“皮摩尔范围”旨在意指1-999皮摩尔。
术语"可操作地连接的"是指其中可操作连接的组分以其预期方式起作用的关系。在一种情况下，编码蛋白质的核酸序列可操作地连接至调控序列(例如，启动子、增强子、沉默子序列等)，以保持恰当的转录调控。在一种情况下，免疫球蛋白可变区(或V(D)J区段)的核酸序列可操作地连接至免疫球蛋白恒定区的核酸序列，以使得序列之间恰当重组成重排的免疫球蛋白重或轻链基因序列。
关于基因替换，术语“替换”是指将外源遗传物质置于内源基因的基因座中，从而用直系同源或同源核酸序列替换所述内源基因的全部或部分。
术语"非人动物"旨在包括任何脊椎动物诸如圆口类动物、硬骨鱼类、软骨鱼类诸如鲨鱼和鳐鱼、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟类。合适的非人动物包括哺乳动物。合适的哺乳动物包括非人灵长类动物、山羊、绵羊、猪、狗、牛和啮齿类动物。
在本发明的一些方面，所述非人动物包括例如跳鼠总科或鼠总科的小型哺乳动物。在一个实施方案中，所述经遗传修饰的动物是啮齿类动物。在一个实施方案中，啮齿类动物选自小鼠、大鼠、松鼠、豪猪或仓鼠。在一个实施方案中，所述啮齿类动物选自鼠总科。在一个实施方案中，所述经遗传修饰的动物来自选自从丽仓鼠科(例如，小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如，仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘小鼠、冠鼠)、马岛鼠科(攀鼠、岩鼠、白尾鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、猪尾鼠科(例如，刺榛睡鼠)和鼹形鼠科(例如，鼹鼠属、竹鼠和鼢鼠)的科。在具体的实施方案中，经遗传修饰的啮齿类动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘小鼠和冠鼠。在一个实施方案中，经遗传修饰的小鼠来自鼠科的成员。在一个实施方案中，所述动物是啮齿类动物。在具体的实施方案中，啮齿类动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方案中，所述非人动物是小鼠。
在具体的实施方案中，所述非人动物是啮齿类动物，其为选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在另一个实施方案中，所述小鼠为选自由为以下品系的品系组成的组的129品系：129P1、129P2、129P3,129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见，例如，Festing等(1999)Revised nomenclature for strain129 mice,Mammalian Genome 10:836，也参见，Auerbach等(2000)Establishment andChimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem CellLines)。在具体的实施方案中，所述经遗传修饰的小鼠是前述129品系与前述C57BL/6品系的混合物。在另一个具体的实施方案中，所述小鼠是前述129品系的混合物，或前述BL/6品系的混合物。在具体的实施方案中，所述混合物的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方案中，所述小鼠是BALB品系，例如，BALB/c品系。在另一个实施方案中，所述小鼠是BALB品系与另一个前述品系的混合物。
在一个实施方案中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方案中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和黑刺鼠(DarkAgouti)。在一个实施方案中，所述大鼠品系是选自由Wistar大鼠、LEA品系、SpragueDawley品系、Fischer品系、F344、F6和黑刺鼠组成的组的两个或更多个品系的混合物。
如本文中所用，“经遗传工程化的”、“经遗传修饰的”等包括导致例如通过动物的非天然多肽的产生的核酸序列的人工操作、修饰和/或重组。
用于单结构域抗原结合蛋白的产生的经遗传工程化的动物
本文中提供了经遗传修饰的非人动物，其包含(a)单结构域抗原结合蛋白，例如，VH-或VL-单结构域结合蛋白，其可各自由经修饰的免疫球蛋白重链基因座中的重链可变区或轻链可变区基因序列编码，所述免疫球蛋白重链基因座含有一个或多个其中功能性CH1结构域已失活和/或被去除然而保留完整IgM CH1恒定区的非IgM免疫球蛋白恒定区，和/或(b)经遗传工程化的单一重排的轻链，其可由轻链基因座中的单一重排的可变基因序列，例如，被***免疫球蛋白κ基因座的单一重排的Vκ:Jκ基因序列编码。
抗体用作人治疗剂。单结构域结合蛋白也用作人治疗剂。因为单结构域结合蛋白缺少轻链，因此它们比含有轻链的抗体更小，从而预期表现出比含有轻链的抗体更好的组织穿透力，又具有相似的或更有利的药代动力学特征，并且还保留相较于常规抗体相似的效应子功能。因为它们较小，因此单结构域结合蛋白也能够在给定的体积中以较高的剂量进行施用。施用结合蛋白的常用方法是通过皮下注射，并且对于给定剂量的抗体的施用体积的减小可为患者提供益处，并且避免因大体积的皮下注射而引起的并发症和疼痛。
单结构域结合蛋白的另一个有利方面是通过使具有针对单一治疗剂中的两个不同表位的特异性的免疫球蛋白链异二聚化来产生双特异性抗体的能力。因为单结构域结合蛋白缺少轻链，因此它们特别适合用于产生双特异性抗体，因为不存在可产生可干扰另一条链的结合亲和力或特异性的轻链的轻链重排。
骆驼中，某些鱼中以及病理病况中的观察揭示，在某些情况下，在其重链恒定区中缺少功能性CH1结构域的结合蛋白可在同源轻链不存在的情况下表达。因此，在一个实施方案中，结合蛋白可被称为“单结构域结合蛋白”，其在本领域也被公知为缺乏包含轻链可变区和轻链恒定区的轻链的抗体，即，只包含一个或两个各自包含重链恒定区的免疫球蛋白多肽链的“只有重链的抗体”，其中只有重链的抗体的免疫球蛋白多肽链的至少一个缺少功能性CH1结构域。关于只有重链的抗体的教导见于本领域中，例如，参见PCT公布WO02085944、WO02085945、WO2006008548和WO2007096779。也参见美国专利第5,840,526号；美国专利第5,874,541号；美国专利第6,005,079号；美国专利第6,765,087号；美国专利第5,800,988号；EP 1589107；WO 9734103；和美国专利第6,015,695号(通过引用并入本文)。
经遗传修饰以产生只有重链的抗原结合蛋白的非人动物在本领域中是公知的。参见，例如，Janssens等(2006)PNAS 103:15130-15135；Zou等(2004)J.Exp.Med.204:3271-32。例如，已被遗传修饰来例如在免疫球蛋白G(IgG)基因中缺少功能性CH1序列，随后表达单结构域抗原结合蛋白的动物，特别是啮齿类动物(例如，小鼠)。
虽然对骆驼、某些鱼中和病理病况的观察揭示，在某些情况下，缺少其重链恒定区的CH1结构域的结合蛋白可在同源轻链不存在的情况下表达，抗体生成B细胞的正常发育通常需要CH1结构域的存在。所有重链同种型(包括IgM)包含CH1结构域。替代轻链和同源轻链被认为在IgM的情况下通过重链的CH1结构域与给定的重链相互作用。在一定程度上，单结构域结合蛋白的开发依赖于IgM同种型重链的结构完整性或功能性，IgM的结构完整性或功能的破坏将是不期望的。
抗体的正常开发需要抗体从始至终在多次复合物选择方案后保存下来，这导致功能性和有用的抗体的保存和最终表达。抗体结构的破坏可被证明对抗体的保存和最终表达不利，达到结构破坏导致抗体不能效地竞争和演化至一个或多个天然抗体选择方案的满意度的程度。
在抗体开发早期，抗体重链经历选择过程，在所述选择过程中，自然通过多种选择方案选择合适的重链来经历进一步选择以最终形成功能性和亲和力成熟的抗体。从祖先B细胞(或，原-B细胞)中的重组重链基因区段表达的抗体重链通常与替代轻链配对，以IgM同种型的形式呈现在原B细胞的表面上，以形成称为前B细胞受体或前BCR的结构(其包括其它共受体)。一旦前BCR被呈现在细胞表面上，所述前BCR被认为就向细胞发出其复合物正确形成的信号，从而有效地指示细胞重链已通过该早期选择步骤。因此细胞被告知所述重链可经历进一步选择。如果所述重链含有当在IgM和替代轻链的情况下呈递时对前BCR的形成不利的缺陷，则所述细胞将经历细胞凋亡。如果所述细胞经历细胞凋亡，则重链的重链可变区的有用性或对多样性的贡献将损失。因此，抗体选择中的非常早的步骤需要在IgM同种型的情况下将重链与替代轻链一起呈递。替代轻链被认为至少部分地过IgM的CH1结构域与IgM相互作用。在该早期接合时的抗体结构的失效或破坏(例如，无功能的CH1结构域)可导致克隆选择失败，表达重链的原B细胞的损失，以及使用有用抗体中的特定重链可变结构域的可能性的丧失。
一旦具有前BCR的细胞通过该选择步骤，则下一选择步骤需要重链与同源轻链(例如，在小鼠和人中κ或λ)配对。配对的重链/同源轻链结构再次在IgM同种型的情况下通过IgM的CH1结构域被呈递在细胞(现为初始前B细胞)的表面上。表面上的该复合物产生功能性膜结合的B细胞受体(BCR)。该BCR被认为向细胞发出所述信号指示重链适合用于进一步选择，以及所述细胞现可负责表达该特定轻链和进行至进一步的B细胞成熟步骤，包括亲和力成熟和类别转换。如果所述重链包含当在IgM及其同源轻链的情况下呈递时对BCR的形成不利的缺陷，则所述细胞将经历细胞凋亡。如果所述细胞经历细胞凋亡，则所述重链的重链可变区的有用性或对多样性的贡献将损失。因此，抗体选择中的非常早的步骤需要在IgM同种型的情况下将重链与同源替代轻链一起呈递。再次地，在该早期接合时抗体结构的失效或破坏(例如，无功能的CH1结构域)可导致表达重链的前B细胞的克隆选择失败和伴随的损失。
在到目前为止经选择保存下来后，在IgM的情况下呈递与其同源轻链配对的重链的前B细胞随后经历成熟过程，所述成熟过程最终导致类别转换和进一步的选择机制，其中所述重链和同源轻链在IgG同种型的情况下被呈递在B细胞表面上。在该步骤中缺少CH1结构域或缺少CH1结构域和铰链区的IgG重链的任何选择将发生。在根据本发明的动物中，有人认为增加的重链基因座中的可变区的库可用于基于可变结构域是否保存下来以在缺少CH1结构域或缺少CH1结构域和铰链区的IgG重链中表达的选择。相反地，具有受损的IgM的小鼠可能不提供重链可变区的完全库，因为只有能够在于受损的IgM的情况下经历选择而保存下来的那些可变区才可用于类别转换。
因此，缺少功能性IgM的动物可经历在另外的合适的重链可变基因区段重排后产生B细胞群体的能力的显著降低。在这样的情况下，即使当供给充足的可变区是可获得的(即，所述动物具有适当数目的能够在例如重链免疫球蛋白基因座中重排和可操作地连接至重链恒定区的可变区基因区段)的时候，展示所需程度的多样性的令人满意的B细胞群体可能因在选择过程中减少重链的保存的IgM损伤而不形成。
期望维持适当数目的可在IgM的情况下在于B细胞发育过程中呈递时有效地经选择保存下来的重链免疫球蛋白基因座中的重排的可变区，以通过用目标免疫原免疫非人动物产生足够的多样性来产生抗体。因此，在免疫球蛋白重链中包含无功能的CH1结构域或无功能的CH1结构域和任选地无功能的铰链区的经遗传修饰的非人动物应当在IgM等位基因之一或两者中不包含CH1缺失。US 2011/0145937(其通过引用并入本文)中公开的此类动物表现出至IgG恒定基因区(其中CH1结构域已缺失或失活)的类别转换，并且表达单结构域表面IgG(B细胞受体)，所述单结构域表面IgG 1)折叠并在细胞表面上表达而无轻链伴侣，以及2)在轻链不存在的情况下仍然识别抗原，以被抗原刺激和选择。
在本发明的不同实施方案中，提供了经遗传修饰的非人动物，所述非人动物产生缺少CH1结构域的结合蛋白，包括单结构域抗原结合蛋白，诸如但不限于VH和VL单结构域结合蛋白。所述经遗传修饰的非人动物可包含遗传修饰，其包括功能性免疫球蛋白重链结构域(CH1结构域)例如IgG1 CH1结构域的缺少，以及在一些实施方案中在缺少功能性CH1结构域的免疫球蛋白重链中包含铰链区的缺失的进一步修饰，其中所述非人动物表达功能性IgM。其它修饰包括使得除IgG1和IgM外的同种型无功能，例如，对于IgD、IgG3、IgG2a、IgG2c、IgG2b、IgA和IgE，在基因中产生缺失、或产生基因的缺失或在基因中产生失活突变，诸如IgD、IgG3、IgG2a、IgG2c、IgG2b、IgA和IgE的CH1结构域或铰链区的缺失或失活突变。还提供了用于产生非人动物、非人胚胎和细胞的经遗传修饰的非人胚胎、细胞和靶向构建体。
还提供了用于产生动物的组合物和方法，所述动物产生缺少免疫球蛋白CH1结构域(和任选地铰链区)的结合蛋白，包括单结构域抗原结合蛋白，其可包含VH结构域(例如，内源的或人VH结构域)或VL结构域(例如，人VL结构域)。所述方法包括选择性地使内源非IgMCH1区无功能(例如，通过CH1结构域的序列的缺失或失活)，和在内源可变区基因座中使用未重排的内源重链可变区(HCVR)基因区段、未重排的人可变区(hHCVR)基因区段或未重排的人轻链可变区(hLCVR)来在非人中产生嵌合人结合蛋白。在一个或多个免疫球蛋白恒定区基因(例如，IgG1、IgD、IgG3、IgG2a、IgG2c、IgG2b、IgA或IgE基因)中但非在IgM基因中产生CH1结构域的缺失。在其中缺失存在于IgG中的实施方案中，该方法选择性地使一个或多个IgG CH1结构域无功能，然而保留功能性IgM。除了一个或多个IgG CH1结构域的缺失以外，其它实施方案还提供了使缺少功能性CH1结构域的IgG的铰链区缺失或使所述铰链区无功能。
在该特定的实施方案中，IgG CH1缺失法在动物的天然B细胞发育中使用相对保守的破坏，因为并非所有经遗传修饰的非人动物的Ig同种型将表现出无功能的CH1或CH1结构域(和，任选地铰链)的缺失。因此，CH1修饰不在IgM分子中进行，并且从而不影响依赖于具有功能性CH1的IgM的早期B细胞发育中的如上所述的这些步骤。因为不修饰IgM，因此具有IgG的CH1结构域(和任选地IgG的铰链区)而非IgM的CH1结构域的一个或多个缺失的动物，应当能够在IgG的情况下呈现可变结构域之前，在克隆选择步骤中加工令人满意地大的可变区的库。因此在各个实施方案中，遗传修饰对可用于单结构域结合蛋白的可变区的多样性的任何不利作用应当不会负面影响可用于在IgG情况下的选择的可变区的库。另外，当被使得在种系中无功能(例如，缺失)的CH1序列为IgG1时，动物将缺乏产生编码CH1结构域的任何RNA的能力。
遗传修饰非人动物以使得CH1结构域或CH1结构域和任选地一个或多个非IgM免疫球蛋白同种型的铰链区无功能，可产生能够从V区基因区段(例如VH或VL区)的完全或基本上完全的库选择合适的V区来在单结构域结合蛋白中表达的动物。选择性修饰IgG同种型(而非IgM)避免了因CH1结构域的缺少或IgM中的CH1结构域的缺少而导致的经选择保存下来的可变区数目的潜在减少。因此，更完全的V区的库可用于在IgG(缺少CH1结构域或缺少CH1结构域和缺少铰链区的)的情况下的选择。因此，根据本发明的经遗传修饰的动物中的V结构域的选择，不依赖于例如哪个V结构域可能帮助克服归因于经修饰的IgM结构的早期IgM-依赖性B细胞发育障碍。相反地，早期IgM依赖性步骤应当如常发生，从而导致可用于针对它们在缺少CH1结构域或缺少CH1结构域和缺少铰链区的IgG的情况下表达的适宜性的选择的大的重链库。
因此，在各个实施方案中，根据本发明的经遗传修饰的动物应当保持功能性IgM表达，所述表达应当提供更加天然的克隆选择过程的机会。例如，借助于功能性IgM(例如，包含功能性CH1结构域的IgM)，替代轻链和同源轻链均能够通过IgM的CH1结构域缔合并参与早期B细胞发育中的选择过程。在根据本发明的经遗传修饰的动物中，认为至IgG同种型的类别转换是第一选择步骤，在所述第一选择步骤中遇到可在缺少功能性CH1结构域或缺少功能性CH1结构域和功能性铰链的恒定结构域的情况下表达的重链可变结构域的任何选择。
在各个实施方案中，包含在CH1结构域中的缺失或失活突变的非人动物中的非IgM重链恒定区是非人重链恒定区，例如，内源非人重链恒定区。在另一个实施方案中，包含在CH1结构域中的缺失或失活突变的非人动物中的非IgM重链恒定区是人重链恒定区。在其中动物额外地包含可操作地连接至轻链恒定区的单一重排的轻链基因序列的其它实施方案中，所述轻链恒定区是非人轻链恒定区，例如，内源非人轻链恒定区；或所述轻链是人轻链恒定区。
VL-单结构域结合蛋白，例如，具有轻链可变结构域的单结构域抗原结合蛋白
本文中提供了经遗传修饰的非人动物，其包含两种类型的单结构域抗原结合蛋白：(1)VH单结构域结合蛋白，其由重排的重链可变区基因序列编码，和(2)VL单结构域结合蛋白，其由重排的轻链可变区基因序列编码，每一个所述基因序列也由含有一个或多个非IgM免疫球蛋白恒定区的经修饰的免疫球蛋白重链基因座编码，在所述非IgM免疫球蛋白恒定区中，功能性CH1结构域已失活和/或被去除，然而保留完整的IgM CH1恒定区。
因此，在一个实施方案中，本文中提供了经遗传工程化以包含可操作地连接至重链恒定区的轻链可变区基因区段，例如，Vκ、Jκ、Vλ和/或Jλ基因区段的重链基因座。使重链基因座包含轻链可变区的遗传工程已被描述。例如，在美国专利申请第20120096572号(其通过引用整体并入本文)中，描述了包含含有一个或多个轻链可变区VL和/或JL基因区段对一个或多个、基本上所有或所有免疫球蛋白重链可变区VH、DH和/或JH基因区段的替换的免疫球蛋白重链基因座的非人动物的产生。
本领域技术人员将容易地认识到，替换性VL和/或JL基因区段可包含未重排的VL和/或未重排的JL基因区段，所述基因区段能够经历有效重排。另外，所述VL和/或JL基因区段可以是选自Vκ、Jκ、Vλ、Jλ基因区段的一个或多个区段，并且可以是其组合。在一个实施方案中，所述一个或多个重链可变区基因区段被允许产生具有人独特型的可变结构域的一个或多个人轻链可变基因区段替换。
如本文中所提供的，经遗传工程以包含可操作地连接至重链恒定区的轻链可变区基因区段，例如，Vκ、Jκ、Vλ和/或Jλ基因区段的重链基因座可经历有效基因重排，以甚至当使所述重链恒定区的一个或多个结构域或基因区段失活或缺失时，形成免疫球蛋白链。如本文中所示，与例如，IgG1基因基因中的CH1结构域的缺失偶联的轻链可变区基因区段对重链可变区基因区段的替换，导致具有轻链可变区的单结构域抗原结合蛋白。具体地，kappa(κ)V和J基因区段(Vκ和Jκ)对重链基因座的内源重链可变区基因区段的替换产生可操作地连接至重链恒定区的κ可变区(KoH)。使CH1结构域缺失的对重链基因座的进一步修饰(CH1缺失)产生编码包含轻链可变区和缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的免疫球蛋白多肽链的免疫球蛋白基因座(KoH CH1缺失)，其中所述免疫球蛋白多肽链可形成单结构域抗原结合蛋白，例如，VL-单结构域抗原结合蛋白。
因此，在一些实施方案中，提供了经遗传修饰的非人动物，所述非人动物包含含有可操作地连接至缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的轻链可变结构域的VL单结构域结合蛋白，其中所述免疫球蛋白多肽链可形成单结构域抗原结合蛋白，所述单结构域抗原结合蛋白可由包含一个或多个非IgM免疫球蛋白恒定区的经修饰的免疫球蛋白重链基因座中的轻链可变区基因序列编码，在所述非IgM免疫球蛋白恒定区中功能性CH1结构域已失活和/或被去除，然而保留完整的IgM恒定区。
本文中描述的方面包括包含由杂交免疫球蛋白基因编码的杂交链的VL结合蛋白，所述杂交免疫球蛋白基因包含或来源于，优选未重排的人VL基因区段(或其部分)和优选未重排的人JL基因区段(或其部分)，以及更优选与人JL基因区段(或其部分)重排的人VL基因区段(或其部分)，所述人VL基因区段(或其部分)和人JL基因区段(或其部分)可操作地连接至编码一个或多个重链恒定区基因(例如，IgM、IgD、IgG、IgA或IgE)的核苷酸序列，其中所述IgD、IgG、IgA或IgE基因包含在CH1编码序列中的缺失或失活突变。VL结合蛋白、抗原结合VL蛋白等包括包含抗原结合位点(含有两个轻链可变结构域)的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，VL结合蛋白的至少两个轻链可变结构域是同源的。在一些实施方案中，两个轻链可变结构域的每一个由轻链可变区(VL)基因区段和/或轻链连接区(JL)基因区段编码或来源于其。在优选实施方案中，两个轻链可变结构域之一可以是杂交免疫球蛋白链的部分，并且所述两个轻链可变结构域的另一个可以是免疫球蛋白轻链(L)的部分。
如本文中所用，短语“免疫球蛋白杂交链”、“杂交链”、“杂交免疫球蛋白链”等是指从氨基端至羧基端包含轻链可变结构域(其可以被或可以不被体细胞突变)和重链恒定区的免疫球蛋白蛋白。通常地，杂交链由可操作地连接至重链恒定区基因序列的重排的轻链可变区基因序列编码。如本文中所公开的，VL-单结构域结合蛋白包含杂交链，其中所述杂交链由可操作地连接至具有在CH1编码序列中的缺失或失活突变的重链恒定区基因序列的重排的轻链可变区基因序列编码。
杂交免疫球蛋白链的轻链可变区基因序列通常可包含来自轻链可变(VL)基因区段(或其部分)和轻链连接(JL)基因区段(或其部分)的序列。在优选实施方案中，编码杂交链可变结构域的轻链可变区基因序列，例如，重排的VL-JL基因序列来源于未重排的VL和JL基因区段，优选地种系未重排的VL-和JL-基因区段的库，所述未重排的VL和JL基因区段(a)能够经历有效基因重排，例如，能够重排以形成框内轻链可变区基因序列和(b)可操作地连接至一个或多个重链恒定区基因区段，例如，未重排的恒定区基因区段的簇或一个恒定区基因区段。
在轻链基因区段重排后，获得包含与编码重链恒定区的序列融合的编码轻链可变区的序列的重排的核苷酸序列。该序列编码具有与重链恒定结构域融合的轻链可变结构域的杂交免疫球蛋白链。因此，在一个实施方案中，如本文中所公开的杂交免疫球蛋白从N端至C端基本上由VL结构域和CH结构域组成。在一个实施方案中，所述CH结构域包含功能性CH1区(在IgM的情况下)、铰链、CH2区、CH3区和任选地CH4区。在另一个实施方案中，所述CH结构域缺少功能性CH1区，例如，缺少完整或部分的CH1区，和可例如在IgG、IgA、IgE和/或IgD的情况下额外地缺少铰链区。在另一个实施方案中，所述CH结构域缺少功能性CH1区，例如，缺少完全的或部分的CH1区，并且可额外地缺少其它非IgM同种型恒定区。
本文所述的经修饰的非人动物可产生具有IgM同种型的VL结合蛋白，所述VL结合蛋白还包含与杂交链配对以产生VL结合蛋白的同源轻链，所述VL结合蛋白是抗体样的，例如，可以是四聚体，但其中VL结合蛋白而非重链(或重链的对)包含杂交链(或杂交链的对)，所述杂交链包含与IgM CH结构域融合的VL结构域-而非VH结构域。
由于本文中所公开的非人动物优选包含具有功能性CH1结构域的IgM恒定区基因，因此本文中所公开的非人动物也包含导致VL结合蛋白(所述VL结合蛋白与一些常规抗体的四聚体结构相似，但相异在于结合特征)的表达，以及导致所述VL结合蛋白在所述非人动物的细胞的膜表面上的表达的免疫球蛋白基因座的人源化。在一些实施方案中，本发明的非人动物能够在VL结合蛋白的杂交链或轻链或杂交链和轻链上生成结合抗原的人VL结构域；在一些实施方案中，此类非人哺乳动物产生和/或具有表达结合蛋白的B细胞群体，所述结合蛋白包含不由任何VH、DH和/或JH基因区段序列编码或不来源于其的可变结构域。在一些实施方案中，由此类非人动物表达的VL结合蛋白的特征在于所述抗原-结合部分只由人VL结构域组成。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含来自非人动物和异源物种(例如，人)的内源免疫球蛋白重链基因座遗传物质，并且在内源免疫球蛋白轻链基因座中包含来自非人动物和异源物种(例如，人)的遗传物质。
在各个实施方案中，经修饰的非人动物产生VL单结构域结合蛋白，其中杂交链的VL结构域表现出相对于轻链的VL结构域增强的程度的体细胞高频突变。在一些实施方案中，杂交链的VL区表现出为与CL区融合的VL区的约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍或更多倍的体细胞高频突变。在一些实施方案中，所述经修饰的非人动物，例如，小鼠，响应于抗原，表现出包含杂交链的VL结构域的VL单结构域结合蛋白的群体，其中VL单结构域结合蛋白的群体在杂交链的VL结构域中表现出为由野生型小鼠响应于相同抗原表现出的在轻链(例如轻链的VL结构域)的群体中观察到的平均体细胞高频突变的平均约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或更多倍的体细胞高频突变。
在一个实施方案中，杂交链的VL结构域中的体细胞高频突变包含在CDR3中的一个或多个或两个或更多个N添加。在各个实施方案中，所述VL结合蛋白，例如，VL单结构域结合蛋白，包含含有由免疫球蛋白轻链序列编码的可变结构域的杂交链，所述免疫球蛋白轻链序列包含比对于从内源轻链基因座重排(例如，形成与重链恒定区基因可接操作地连接的重排的可变区基因的VL和人JL基因区段重排)的轻链天然观察到的N添加更大数目的N添加，其中所述重排的轻链可变区包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个N添加。
在各个实施方案中，如本文中所公开的VL结合蛋白，例如，VL-单结构域结合蛋白，例如，由本文中所公开的经遗传修饰的非人动物例如小鼠产生的那些VL-单结构域结合蛋白可分别平均小于常规抗体或只有重链的抗体，并且具有与较小的尺寸相关的有利方面。较小的尺寸至少部分通过由DH区(通常存在于VH结构域中)编码的氨基酸序列的不存在来实现。还可在来源于例如Vκ区和Jκ区的CDR3的形成中实现较小的尺寸。
在一个方面，提供了包含免疫球蛋白杂交链基因座的非人动物，例如，小鼠。在一个实施方案中，在内源重链基因座内产生所述杂交链基因座，其中内源小鼠免疫球蛋白重链基因座中的一个或多个免疫球蛋白重链可变区(VH)基因区段、重链多样性(DH)基因区段和重链连接(JH)基因区段被一个或多个轻链可变区(VL)基因区段和一个或多个轻链连接区(JL)基因区段替换，所述轻链可变区(VL)基因区段和轻链连接区(JL)基因区段重排，以形成与内源小鼠CH基因重组(以形成来源于VL基因区段、JL基因区段和内源小鼠CH基因的重排的基因)的重排的可变区VL/JL基因序列，其中所述CH基因是IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，并且其中所述IgD、IgG、IgA或IgE缺少功能性CH1结构域。在一个方面，提供了包含杂交链基因座的非人动物，所述杂交链基因座替换了内源免疫球蛋白重链基因座，例如，一个或两个重链基因座的所有或基本上所有内源VH、DH和JH基因区段被一个或多个VL基因区段和一个或多个JL基因区段替换，所述VL基因区段和JL基因区段形成与内源小鼠CH基因重组(以形成来源于VL基因区段、JL基因区段和内源小鼠CH基因的重排的基因)的重排的可变区VL/JL基因序列，其中所述CH基因是IgM、IgD、IgG、IgA、IgE，并且其中所述IgD、IgG、IgA或IgE缺少功能性CH1结构域.
在一些实施方案中，本发明的非人动物包含包括未重排的人VL基因区段和/或人JL基因区段的免疫球蛋白杂交链基因座和包括未重排的人VL基因区段和/或人JL基因区段的免疫球蛋白轻链基因座。在一些实施方案中，本发明的非人动物包含包括未重排的人VL基因区段和/或人JL基因区段的免疫球蛋白杂交链基因座和，优选地包括可操作地连接至轻链恒定区基因序列的单一重排的人VL/JL可变区基因序列和编码共同轻链的免疫球蛋白轻链基因座。
表达单结构域结合蛋白和重排的轻链的经遗传工程化的非人动物
在另外的实施方案中，本文中提供了非人动物，所述非人动物包含(a)内编码源免疫球蛋白重链基因座中的至少一个内源免疫球蛋白重链恒定区基因的CH1结构域的核苷酸序列中的缺失或失活突变，其中所述至少一个内源免疫球蛋白重链恒定区基因是IgG、IgA、IgE、IgD或其组合，(b)免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座包含含有VL和JL基因区段序列的单一重排的免疫球蛋白轻链可变区VL/JL基因序列，其中所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区基因序列可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区基因序列，以及例如编码单一轻链，和任选地还包含(c)包含至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区(VL)基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接(JL)基因区段的核酸序列对内源免疫球蛋白重链基因座中的内源VH、DH、JH基因区段的替换，其中每一个所述未重排的VL和JL基因区段能够重组，以形成重排的免疫球蛋白轻链可变区(VL/JL)核苷酸序列，其可操作地连接至包含在编码CH1结构域的核苷酸序列中的缺失或失活突变的免疫球蛋白重链恒定区基因。
已描述了单一重排的轻链，例如，包含重排的轻链可变区的轻链的遗传工程。例如，包含单一重排的可变基因序列VL:JL的通用轻链小鼠(ULC)的产生和那些小鼠中的抗原特异性抗体的生成描述于例如美国专利申请第13/022,759号、第13/093,156号、第13/412,936号、第13/488,628号、第13/798,310号和第13/948,818号(分别为公布第2011/0195454号、第2012/0021409号、第2012/0192300号、第2013/0045492号、第US20130185821号和第US20130302836号)中，所述每一个专利申请通过引用整体并入本文。经遗传工程化的单一重排的轻链，例如，通用轻链的表达在IgM期的早期引起抗体的扩增，其中大量多样性和从而抗原识别在重链上发生。不限定本发明，有人提出经遗传工程化的单一重排的轻链在IgM期的早期的扩增将产生更多的细胞，所述细胞具有能够保存下来以经历至IgG同种型的类别转换和在IgG(缺少功能性CH1结构域，或缺少功能性CH1结构域并且缺少功能性铰链区)的情况下的选择的重或轻链可变区。
因此，提供了经遗传修饰的非人动物以及用于产生所述动物的方法和组合物，其中所述遗传修饰导致不为IgM结构域的Ig结构域中缺少功能性CH1结构域(在其它实施方案中缺少功能性铰链区)，并且其中所述动物还表达经遗传工程化的单一重排的轻链，例如，工程化的共同轻链(ULC)，其可与完整IgM缔合。
美国申请公布第2011/0195454号、第2012/0021409号、第2012/0192300号和第2013/0045492号中描述的经工程化的共同轻链小鼠包含编码轻链选项(例如，包含不超过两个VL基因区段或单一重排的人免疫球蛋白轻链可变区序列的共同或通用轻链“ULC”)的有限库的核酸序列。为了获得该有限的库，将小鼠工程化以使得其产生或重排天然小鼠轻链可变结构域的能力无功能或基本上无功能。在一个方面，这例如通过使小鼠的轻链可变区基因区段缺失来实现。如先前所述，随后可利用可操作地连接至内源小鼠轻链恒定结构域的所选择的合适的外源轻链可变区基因区段，优选地人轻链可变区基因区段，以使得所述外源可变区基因区段可与内源小鼠轻链恒定区基因组合并形成重排的反向嵌合轻链基因(人可变，小鼠恒定)的方式来修饰内源小鼠基因座。在各个实施方案中，所述轻链可变区能够被体细胞突变。在各个实施方案中，为了最大化所述轻链可变区获得体细胞突变的能力，可在小鼠中保留适当的增强子。在一个方面，在修饰小鼠κ轻链基因座以用人κ轻链基因区段替换内源小鼠κ轻链基因区段时，功能性维持或不破坏小鼠κ内含增强子和小鼠κ3’增强子。
因此，提供了表达与多种反向嵌合(人可变，小鼠恒定)重链缔合的反向嵌合(人可变，小鼠恒定)轻链的有限库的经遗传工程化的小鼠。在各个实施方案中，使所述内源小鼠κ轻链基因区段缺失并用可操作地连接至内源小鼠Cκ基因的单一(或两个)重排的人轻链区替换其。在用于最大化重排的人轻链区的体细胞高频突变的实施方案中，维持小鼠κ内含增强子和小鼠κ3’增强子。在各个实施方案中，所述小鼠还包含无功能的λ轻链基因座，或其缺失或使得所述基因座不能产生λ轻链的缺失。
因此，在一个实施方案中，本文中提供了非人动物(例如，啮齿类动物，例如，小鼠或大鼠)，所述啮齿类动物在其基因组中，例如在其种系中包含来自优选地人轻链可变基因区段的有限库的优选地人轻链可变区或单一重排的人轻链可变区的有限库，其中所述非人动物还包含在其基因组中，例如在其种系中于编码CH1结构域的核苷酸序列中的缺失或失活突变。
提供了经遗传工程化的动物，所述动物表达来自人轻链可变区基因序列的有限库的人轻链可变结构域或单一人轻链可变结构域的有限库。在一个实施方案中，所述单一重排的V/J人轻链序列选自Vκ1-39Jκ和Vκ3-20Jκ，例如，Vκ1-39Jκ5和Vκ3-20Jκ1。在一些实施方案中，如本文中所公开的非人动物包含含有单一重排的V/J轻链序列对所有内源VL和所有内源JL基因区段的替换的经修饰的轻链基因座，其中所述单一重排的V/J轻链序列可操作地连接至内源轻链恒定区基因。在一些实施方案中，所述经修饰的轻链基因座存在于非人动物的种系基因组中。在一个实施方案中，所述非人动物在其种系基因组中包含可操作地连接至轻链恒定区基因序列的单一重排的轻链可变基因序列，其中所述单一重排的轻链可变区基因序列包含人种系VL和人种系JL基因区段，例如，人种系Vκ1-39和人种系Jκ5或人种系Vκ3-20和Jκ1。在一些实施方案中，如本文中所公开的非人动物包含B细胞，例如，未曾经历类别转换的B细胞，所述B细胞在其基因组中包含可操作地连接至内源轻链恒定区基因的单一重排的V/J轻链序列，其中所述单一重排的V/J轻链相较于可操作地连接至在非人动物的种系基因组中发现的内源轻链恒定区基因的单一重排的V/J轻链序列，不包含体细胞突变。在其它实施方案中，如本文中所公开的非人动物包含B细胞，例如已经历类别转换的B细胞，所述B细胞在其基因组中包含可操作地连接至内源轻链恒定区基因的单一重排的V/J轻链序列，其中所述单一重排的V/J轻链相较于可操作地连接至在非人动物的种系基因组中发现的内源轻链恒定区基因的单一重排的V/J轻链序列，包含体细胞突变。
产生经遗传修饰的动物
还提供了产生如本文中所公开的非人动物的方法。此类方法包括(a)使非人动物的重链免疫球蛋白基因座，诸如IgG1重链基因座的CH1结构域和任选地铰链区失活或缺失，引入编码经遗传工程化的重排的轻链基因座的核酸，和使动物表达具有失活的CH1结构域的重链免疫球蛋白基因座和经遗传重排的轻链基因座(ULC)。
通过使用小鼠作为举例说明，在本文中方便地描述了用于产生表达单结构域结合蛋白的动物的遗传修饰，虽然此类修饰可被容易地改造以适用于或施用于其它动物。可以以多种方式来产生根据本发明的经遗传修饰的动物，在下文中论述了所述方式的特定实施方案。
在图1(上方)中提供IgG1基因座的示例性示意图(不按比例)显示IgG1基因座中的CH结构域重排。如所举例说明的，结构域CH1、CH2和CH3以及铰链区以容易辨别的核苷酸跨度存在于转换区的下游。
可通过本领域已知的任何方法产生缺少编码IgG1的CH1结构域的功能性核苷酸序列但含有铰链区的经遗传修饰的非人动物，例如，小鼠。例如，可产生用缺少CH1结构域但含有铰链的截短的IgG1替换IgG1基因的靶向载体。在一个实例中，通过靶向构建体靶向小鼠基因组，所述靶向构建体具有5’(相对于基因组IgG1基因的转录的方向)同源臂(包含内源CH1结构域的上游序列)、随后是编码IgG1铰链、IgG1 CH2结构域、IgG1 CH3结构域、药物选择盒(例如，lox化抗性基因)和IgG1跨膜结构域的核苷酸序列以及包含相对于跨膜结构域处于下游的序列的3’同源臂。在于基因座中同源重组和去除药物选择盒(例如，通过Cre处理)后，内源IgG1被缺少CH1结构域的IgG1替换(图3)(IgG1ΔCH1；I)。在一些实施方案中，将表达IgG1的所得的基因座的结构具有与铰链序列融合的J区序列。
可通过本领域已知的任何方法产生缺少编码IgG1的CH1结构域的核苷酸序列和缺少编码铰链区的核苷酸序列的经遗传修饰的非人动物，例如，小鼠。例如，可产生用缺少编码CH1结构域的序列以及缺少编码铰链区的序列的截短的IgG1替换IgG1基因的靶向载体。在另一个实施方案中，通过靶向构建体靶向小鼠基因组，所述靶向构建体具有5’(相对于基因组IgG1基因的转录方向)同源臂(含有内源CH1结构域的上游序列)、随后是编码IgG1 CH2结构域、IgG1 CH3结构域、药物选择盒(例如，lox化抗性基因)和IgG1跨膜结构域的核苷酸序列以及含有相对于跨膜结构域处于下游的序列的3’同源臂。在于基因座中同源重组和去除药物选择盒(例如，通过Cre处理)后，内源IgG1基因被缺少编码CH1结构域的序列的IgG1基因替换(图3)(IgG1ΔCH1&铰链；II)。在一些实施方案中，所得的基因座的结构将表达具有与CH2结构域融合的J区序列的IgG1。
可通过使一个或多个其它IgG同种型例如IgG2b和IgG2a/IgG2c，和/或一个或多个其它Ig同种型，例如，IgD、IgA和/或IgE缺失，通过使编码这些同种型的序列缺失或功能性失能，来进一步修饰缺少IgG1 CH1序列(IgG1ΔCH1)或缺少IgG1 CH1序列以及缺少铰链(IgG1ΔCH1&铰链)的经遗传修饰的非人动物，例如，小鼠，以有利于经修饰的IgG1同种型的使用。例如，产生靶向构建体，其具有5’同源臂(含有内源铰链区序列的上游(或内源CH1结构域序列的上游)的序列)，编码IgG1 CH2和CH3结构域的序列，药物选择盒，随后是编码IgG1跨膜结构域的序列，随后另一个药物选择盒(如果需要的话)，和含有相对于IgG2a/c基因处于下游的序列的3’同源臂。在于基因座中同源重组并去除药物选择盒(例如，通过Cre处理)后，内源重链恒定基因座只含有两个IgG基因：内源IgG3和IgG1ΔCH1或IgG1ΔCH1&铰链。(图3)(IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a；III或IgG1ΔCH1&铰链ΔIgG2b/2a；IV)。
如上所述工程化的动物还可被进一步修饰来在重链基因座的IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgD、IgA和/或IgE基因区段中包含缺失或失活突变。例如，可产生缺失重链基因座的恒定区基因序列的靶向载体。在一个实例中，通过靶向构建体靶向小鼠基因组，所述靶向构建体具有5’(相对于基因组恒定区基因序列的转录方向)同源臂(含有内源IgM结构域的上游序列)，随后是编码药物选择盒的核苷酸序列(例如，lox化抗性基因)和含有IgA基因区段的下游离序列的3’同源臂。在于基因座中同源重组和去除药物选择盒(例如，通过Cre处理)后，使内源恒定区缺失和/或用可选择标记替换其。(图4C)。可用可被产生来重新引入IgM基因区段和IgG1基因(其缺少功能性CH1结构域序列和任选地缺少功能性铰链区)的靶向载体进一步修饰动物。(图4D)。在一个实例中，通过靶向构建体靶向动物的基因组，所述靶向构建体具有含有可选择标记基因的上游序列的5’同源臂，随后是编码完全IgM恒定区和缺少功能性CH1结构域(和任选地缺少功能性铰链)的IgG1恒定区、药物选择盒(例如，lox化抗性基因)的核苷酸序列和含有相对于所述可选择标记处于下游的序列的3’同源臂。在于基因座中同源重组和去除药物选择盒(例如，通过Cre处理)后，重新引入IgM基因区段以及缺少功能性CH1结构域序列和任选地缺少功能性铰链区的IgG1基因。(图3)(IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E(任选地Δ铰链)；V)。还提供了内源免疫球蛋白基因座的其它操作，例如，各种非IgM免疫球蛋白同种型的CH1区的缺失或失活突变。
除了通过设计适当的恒定区构建体和将所述构建体通过如上所述的同源重组引入基因座，来将缺失或失活引入非IgM免疫球蛋白恒定区的CH1结构域和任选地铰链的遗传操作以外，还可通过本领域中已知的其它方法，例如只在抗原免疫后被引入小鼠的条件非IgM CH1缺失等，来在非IgM CH1中产生缺失或失活。用于基因座的条件失活的方法在本领域中是已知的。
如上所述的重链基因座的遗传修饰还可包括以下基因区段对一个或多个、基本上所有或所有内源重链可变基因区段(例如，VH基因区段、DH基因区段和/或JH基因区段)的替换：(a)人VH基因区段、DH基因区段和/或JH基因区段，所述基因区段可被重排或能够经历重排以编码具有人独特型的结合蛋白，(b)轻链可变基因区段，例如，轻链V基因区段和/或轻链J基因区段，所述基因区段可被重排或能够经历重排以编码具有连接至缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的轻链可变区的免疫球蛋白多肽链，例如，VL单结构域结合蛋白，例如，包含轻链可变区的单结构域抗原结合蛋白，或(c)人轻链可变基因区段，例如，人轻链V基因区段和/或人轻链J基因区段，所述基因区段可被重排或能够经历重排以编码具有连接至缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的人轻链可变区的免疫球蛋白多肽链，例如，VL单结构域结合蛋白，例如，包含具有人独特型的人轻链可变区的单结构域抗原结合蛋白。
在图14中提供小鼠重链和人κ轻链基因座的示意图(不按比例)来显示小鼠基因座的约200个重链可变(VH)基因区段、13个重链多样性(DH)基因区段和4个重链连接(JH)基因区段以及增强子(Enh)和重链恒定(CH)区，和人κ基因座的约76个Vκ基因区段、5个Jκ基因区段和内含增强子(Enh)和单个恒定区(Cκ)。
图15中显示了用于将人κ基因区段***鼠重链基因座的示意图(不按比例)，通过同源重组修饰所述重链基因座，以通过mVH、mDH和mJH基因区段的靶向缺失来使内源小鼠重链基因座失活。如图15中所示，可使用本领域中公认的标准分子技术将4个单独的靶向载体用于逐步地将人Vκ基因区段和人Jκ基因区段***失活的小鼠重链基因座。用于工程化所述4个靶向构建体的人κ基因区段可天然地存在于种系人κ轻链基因座的近侧重叠群中。
可通过本领域中已知的任何方法产生包含经遗传工程化的重排的轻链的经遗传修饰的小鼠。例如，可产生用单一重排的V:J基因或完整的未重排的轻链基因座，或用包含可操作地连接至轻链恒定区的单一重排的V:J基因的经遗传工程化的轻链基因座替换内源轻链基因座的内源未重排的轻链可变V和J基因区段的靶向载体。
在另一个方面，对如本文所述的非人动物进一步工程化以包含编码ADAM 6(ADAM6a和/或ADAM6b)、其功能性片段、同源物或直系同源物的异位核苷酸序列。在一些实施方案中，可对本文所述的非人动物的重链基因座进一步工程化以包含编码小鼠ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)、其功能性片段、同源物或直系同源物的异位核苷酸序列。在各个实施方案中，所述ADAM6蛋白在非人雄性动物中是有功能的。在例如美国专利第8,642,835号(其通过引用并入本文)中描述了用于工程化此类非人动物的方法和组合物。
在一些实施方案中，通过将合适的靶向构建体引入合适的ES细胞(在一个或多个独立靶向中)来产生如上所述的经遗传修饰的动物和其它动物，并且鉴定包含所述靶向构建体的标记和选择盒的阳性克隆并使其生长。随后在适合于产生嵌合动物或完全ES细胞来源的动物的条件下将克隆在宿主胚胎中用作供体ES细胞。可任选地在ES细胞期或在嵌合或ES细胞来源的小鼠中，例如通过使用lox化盒和与含有Cre的品系交配，或通过用Cre表达盒对ES细胞进行电穿孔来去除所述标记和选择盒。因此，在一些实施方案中，所述遗传修饰在动物的种系中发生。
在一些实施方案中，产生如本文中所公开的动物的方法包括使能够产生单结构域抗原结合蛋白的第一动物(例如，在其种系中包含缺少功能性CH1结构域的IgG重链基因座的第一动物)与能够产生经遗传修饰的重排的轻链的第二动物(例如，在其种系中包含具有可操作地连接至轻链恒定区的单一重排的V:J可变区的经遗传工程化的轻链基因座的第二动物)杂交，以产生经遗传工程化的F1动物，其中所述F1动物包含所述第一动物的IgG重链基因座和所述第二动物的轻链基因座。可通过动物交配或通过以其它方式组合配子(包括体外操作)进行所述杂交。
对于其中合适的可遗传修饰的ES细胞是不容易获得的非人动物，将与本文所述的那些方法不同的方法用于产生包含遗传修饰的非人动物。此类方法包括，例如，修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导的多潜能干细胞)和使用细胞核转移来将经修饰的基因组转移至合适的细胞，例如，***，和在形成胚胎的合适条件下使经修饰的细胞(例如，经修饰的***)在非人动物中孕育。
产生单结构域抗原结合蛋白
一旦获得能够产生单结构域抗原结合蛋白和/或经遗传修饰的单一重排的轻链的经遗传工程化的动物，就可通过用抗原免疫动物来容易地获得针对抗原的免疫球蛋白和结合蛋白制剂。如本文所用的"多克隆抗血清组合物"包括亲和纯化的多克隆结合蛋白制剂。
在一个方面，提供了用于产生缺少CH1结构域的结合蛋白的方法，所述方法包括：(a)用抗原免疫如本文所述的非人动物；(b)在足以使非人动物产生结合蛋白的条件下维持所述非人动物；(c)鉴定由小鼠产生的缺少功能性CH1结构域和/或缺少功能性铰链区的结合蛋白；和(d)从所述非人动物分离所述结合蛋白、产生所述结合蛋白的细胞或编码所述结合蛋白的序列的核苷酸序列。
多种抗原可用于免疫转基因动物。此类抗原包括但不限于细胞蛋白质、微生物，例如病毒和单细胞生物(诸如细菌和真菌)、活的、减毒的或死的微生物的碎片，或从所述微生物分离的抗原分子。
可以以任何方便的方式，利用或不利用佐剂，向转基因动物施用所述抗原，以及可按照预定的方案施用所述抗原。
为了产生单克隆结合蛋白，从被免疫的转基因动物分离脾细胞，并将其用于与转化细胞系的细胞融合以用于产生杂交瘤，或通过标准分子生物学技术克隆编码抗体的cDNA，并将其在转染的细胞中表达。用于产生单克隆抗体的方法在本领域中已被很好地建立。参见，例如，欧洲专利申请0 583 980 A1("Method For Generating MonoclonalAntibodies From Rabbits")、美国专利第4,977,081号("Stable Rabbit-MouseHybridomas And Secretion Products Thereof")、WO 97/16537("Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof")和EP 0 491 057 B1("Hybridoma WhichProduces Avian Specific Immunoglobulin G")，所述参考资料的公开内容通过引用并入本文。从克隆的cDNA分子体外产生单克隆抗体已由Andris-Widhopf等，"Methods for thegeneration of chicken monoclonal antibody fragments by phage display",JImmunol Methods 242:159(2000)和由Burton,D.R.,"Phage display",Immunotechnology1:87(1995)进行了描述。
一旦已生成单克隆单结构域抗原结合蛋白，如果需要，就可使用标准分子生物学技术将此类结合蛋白容易地转变成全长人结合蛋白。完全人单克隆结合蛋白在人中不具有免疫原性，并且适合用于人受试者的治疗性治疗。
因此，在一个实施方案中，其中所述单结构域抗原结合蛋白包含人VH或人VL区和包含在非IgM CH1结构域中的缺失或失活突变的小鼠重链恒定区，可将单结构域抗原结合蛋白的VH或VL结构域的序列于合适的表达载体中克隆在人恒定区(任选地缺少CH1结构域)的上游，从而产生编码可在合适的细胞，例如通常用于抗体表达的细胞，例如真核细胞(例如CHO细胞)中表达的完全人单结构域抗原结合蛋白的表达构建体。
因此，本文中还提供了来源于如本文中所公开的经遗传修饰的动物的单克隆结合蛋白生成细胞以及来源于其的核酸。还提供了来源于其的杂交瘤。还提供了来源于其的完全人单结构域结合蛋白以及编码核酸。
本文所述的单结构域抗原结合蛋白还可用于产生双特异性抗体。本文所述的单结构域抗原结合蛋白的优点是通过异二聚化具有针对单一治疗剂中的两个不同表位的特异性的重链，来产生双特异性抗体的能力。
实施例
提供以下实施例来为本领域普通技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而非旨在限制本发明人视为它们的发明的范围。已努力确保关于使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但应当解释一些实验误差和偏差。所述实施例不包括对本领域普通技术人员来说是公知的常规方法(分子克隆技术等)的详细描述。
实施例1：编码VH单结构域结合蛋白的小鼠:包含具有重链可变区和缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的免疫球蛋白链并且包含单一重排的轻链(ULC)的小鼠
实施例1.1:动物的产生
按照US2011/0145937,Macdonald等(其通过引用并入本文)中描述的方法产生经遗传修饰以包含重链基因座的小鼠，所述重链基因座包含完全和功能性IgM基因序列以及缺少功能性CH1基因序列和任选地缺少功能性铰链区的IgG1基因序列(图1A)。产生几种形式的小鼠，其缺少重链恒定基因序列的各种组合并包含CH1结构域的缺失但包含完全且功能性IgM(图3)。例如，产生对于包含小鼠重链可变基因区段和完全且功能性IgM基因序列以及缺少功能性CH1基因序列和铰链区的IgG1基因序列的重链基因座是纯合的小鼠(mVHIgG1ΔCH1&铰链；1576 HO，图3和4B中的“II”)。另外，产生对于包含人重链可变基因区段和完全且功能性IgM基因序列、缺少功能性CH1基因序列和铰链区的IgG1基因序列，并且缺少IgG2b和IgG2a基因序列的重链基因座是纯合的小鼠(hVHIgG1ΔCH1&铰链ΔIgG2b/2a；1859 HO，参见，例如，图3中的“IV”)。另外，产生对于包含人重链可变基因区段和完全且功能性IgM基因序列、缺少功能性CH1基因序列的IgG1基因序列，并且缺少IgG2b和IgG2a基因序列的重链基因座是纯合的小鼠(hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a；1673 HO，参见，例如，图3和4A中的“III”)。另外，产生对于包含人重链可变基因区段和完全且功能性IgM基因序列、缺少功能性CH1的IgG1基因序列，并且缺少IgD、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA基因序列的重链基因座是纯合的小鼠(hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E；6180 HO，参见图3和4C-D中的“V”)。重链恒定区中的修饰的另外的示例性形式示于图3中。产生CH1缺失/失活和/或免疫球蛋白恒定基因缺失/失活的组合的其它形式，例如，产生其中IgG1和IgG2a均包含CH1结构域缺失的小鼠，并且所述小鼠还包含IgD、IgE、IgG3和IgG2b的缺失。如图4中所示，重链基因座还可被修饰来包含人可变区，所述人可变区可以是人重链可变区[或人轻链可变区(图16，参见下面的实施例2和3)]。重链基因座还可被修饰来包含Adam 6a基因、Adam 6b基因或两者，或所述基因的片段，其中所述基因或其片段在雄性小鼠中具有功能(参见，例如，U.S.2012/0322108，通过引用并入本文)。
包含单一重排的可变基因序列V:J(例如，Vκ1-39Jκ5或Vκ3-20Jκ1共同轻链小鼠)的共同轻链小鼠(也称为通用轻链或ULC小鼠)的产生和这些小鼠中的抗原特异性抗体的生成描述于，例如，美国专利申请第13/022,759号、第13/093,156号、第13/412,936号、第13/488,628号、第13/798,310号和第13/948,818号(分别为公布第2011/0195454号、第2012/0021409号、第2012/0192300号、第2013/0045492号、第US20130185821号和第US20130302836号)(所述专利申请中的每一个申请通过引用整体并本文)中。具体地，产生在它们的种系中表达经遗传工程化的Vκ1-39Jκ5κ轻链(1633 HO或1634 HO)或经遗传工程化的Vκ3-20Jκ1 κ轻链(1635 HO或1636 HO)的小鼠。
将含有单一重排的人种系轻链区(ULC Vκ1-39Jκ5；1633或1634)或(ULC Vκ3-20Jκ1；1635或1636)的
Figure BDA0001129618200000561
小鼠与携带有经修饰的IgG恒定区的小鼠交配。具体地，将此类ULC小鼠与以下小鼠交配：具有可操作地连接至其中IgG1 CH1和IgG1铰链区已缺失或失活的鼠重链恒定区的鼠重链可变区的小鼠(mVHIgG1ΔCH1&铰链，1576)、具有可操作地连接至其中IgG1 CH1和IgG1铰链区以及IgG2a和IgG2b基因已缺失或失活的鼠重链恒定区的人重链可变区的小鼠(hVH IgG1ΔCH1&铰链ΔIgG2b/2a；1859)、具有可操作地连接至其中IgG1 CH1区以及IgG2a和IgG2b基因已缺失或失活的鼠重链恒定区的人重链可变区的小鼠(hVH IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a；1673)，或具有可操作地连接至其中IgG1 CH1区以及IgG2a和IgG2b、IgD、IgG3、IgA及IgE基因已缺失或失活的鼠重链恒定区的人重链可变区的小鼠(hVHIgG1ΔCH1ΔIgG2b/2aΔIgG3ΔIgD/A/E；6180)，以获得以下后代小鼠：
mVHIgG1ΔCH1&铰链x Vκ3-20Jκ1 ULC或mVHIgG1ΔCH1&铰链x Vκ1-39Jκ5ULC纯合小鼠(1576HO 1635HO或1576 HO 1633 HO)，
hVH IgG1ΔCH1&铰链ΔIgG2b/2a x Vκ3-20Jκ1ULC或hVH IgG1ΔCH1&铰链ΔIgG2b/2a x Vκ1-39Jκ5 ULC纯合小鼠(1859 HO 1635 HO或1859HO 1633HO)，
hVH IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2axVκ3-20Jκ1 ULC或hVH IgG1ΔCH1ΔIgG2b/2a x Vκ1-39Jκ5ULC纯合小鼠(1673HO 1635 HO或1673 HO 1633 HO)，和
hVHIgG1ΔCH1&铰链ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E x Vκ3-20Jκ1ULC或hVHIgG1ΔCH1&铰链ΔIgG2a/2bΔIgG3ΔIgD/A/E x Vκ1-39Jκ5 ULC纯合小鼠(6180 HO 1635 HO或6180 HO 1634 HO)。
将包含CH1结构域中的缺失或失活突变和免疫球蛋白恒定区基因中的缺失或失活突变的小鼠的其它形式，与包含如上所述的单一重排的人种系轻链区的小鼠交配。
实施例1.2：利用抗原免疫小鼠和表达单结构域结合蛋白
用不同抗原免疫对于修饰是纯合的小鼠，并使用多种佐剂通过各种途径进行加强免疫。通过ELISA或蛋白质印迹评价IgG1特异性应答的滴度。
如图5A所示，对于IgG1 ΔCH1/铰链和ULC修饰均为纯合的小鼠在免疫之前和之后表现出相较于只具有IgG1 ΔCH1的小鼠增加的血清中的IgG1的总量的表达。ΔCH1/铰链xULC小鼠中的较高的滴度表明通用轻链的存在增加了生成抗原特异性单结构域抗原结合蛋白的可能性。图5B。
图7表明可利用经遗传工程化以包含ΔCH1和ULC修饰的小鼠的各种形式获得高滴度。
另外，图6和8显示单结构域抗原结合蛋白存在并且可从包含在CH1区中具有缺失的人重链可变区和单一重排的轻链(通用轻链)的小鼠从离。
实施例1.3:表达单结构域结合蛋白和单一重排的轻链(ULC)的小鼠中的B细胞发育和成熟
使用如本文中指定的各种细胞表面标志物的流式细胞术，分析来自对于经修饰的CH1结构域和单一重排的轻链(ULC)是纯合的小鼠的脾、血液和骨髓室的B细胞含量的通过B细胞发育和B细胞成熟的进展(参见图2)。
简言之，处死ULC小鼠和对于经修饰的CH1结构域和重排的轻链是纯合的小鼠，并收集血液、脾和骨髓。将血液收集至具有EDTA(BD Biosciences)的微量采血管中。通过用完全RPMI培养基(补充有胎牛血清、丙酮酸钠、Hepes、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和庆大霉素的RPMI培养基)冲洗从股骨收集骨髓。利用ACK裂解缓冲液(Lonza Walkersville)裂解来自脾和骨髓制剂的RBC，随后用完全RPMI培养基洗涤。
在冰上将细胞(1x106)与抗小鼠CD16/CD32(2.4G2,BD)孵育10分钟，随后在冰上利用以下抗体标记30分钟：缀合有APC-H7的抗小鼠CD19(克隆1D3,BD)、缀合有太平洋蓝的抗小鼠CD3(克隆17A2,
Figure BDA0001129618200000581
)、PeCy7-IgM(II/41,
Figure BDA0001129618200000582
)、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,
Figure BDA0001129618200000583
)、APC-eFluor 780-B220(RA3-6B2,
Figure BDA0001129618200000585
)、APC-CD19(MB19-1,
Figure BDA0001129618200000584
)、PE-CD93(AA4.1,)、FITC-CD23(B3B4,BD)、APC-CD21/CD35(7G6,BD)。骨髓：未成熟B细胞(B220intIgM+)、成熟B细胞(B220hiIgM+)。血液和脾：B细胞(CD19+)、成熟B细胞(CD19+IgMintIgDhi)、过渡型/未成熟B细胞(CD19+IgMhiIgDint)。
染色后，洗涤细胞，并将其在2％甲醛中进行固定。在LSRII流式细胞仪上进行数据获取，并利用FLOWJOTM软件(Tree Star,Inc.)分析。图9显示这些小鼠具有正常血清稳定状态的IgM和IgG水平。图10和11显示脾室的结果，显示了脾中接近正常的B细胞数目和接近正常的B细胞成熟。图12和13显示骨髓室的结果，显示了骨髓中的正常B细胞数目和接近正常的B细胞发育。
实施例2：编码VL单结构域结合蛋白的小鼠:包含具有轻链可变区和缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的免疫球蛋白链的小鼠
实施例2.1：动物的产生
如美国专利公布第2012/0096572号中所述，产生将轻链基因区段引入重链基因座的小鼠。具体地，各种靶向构建体使用
Figure BDA0001129618200000591
遗传工程技术来制备以修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)文库(参见，例如，美国专利第6,586,251号和Valenzuela,D.M.,Murphy,A.J.,Frendewey,D.,Gale,N.W.,Economides,A.N.,Auerbach,W.,Poueymirou,W.T.,Adams,N.C.,Rojas,J.,Yasenchak,J.,Chernomorsky,R.,Boucher,M.,Elsasser,A.L.,Esau,L.,Zheng,J.,Griffiths,J.A.,Wang,X.,Su,H.,Xue,Y.,Dominguez,M.G.,Noguera,I.,Torres,R.,Macdonald,L.E.,Stewart,A.F.,DeChiara,T.M.,Yancopoulos,G.D.(2003).High-throughput engineering of the mouse genomecoupled with high-resolution expression analysis.Nat Biotechnol 21,652-659)。通过同源重组修饰小鼠BAC DNA以通过VH、DH和JH基因区段的靶向缺失使内源小鼠重链基因座失活，以确保***未重排的人种系κ轻链基因序列(图15的上方)。
简言之，使用重组酶介导的重组在两个连续的靶向事件中使小鼠重链基因座缺失。第一靶向事件包括使用从5’至3’包含5’小鼠同源臂、重组酶识别位点、新霉素盒和3’同源臂的靶向载体在小鼠重链基因座的5’末端进行的靶向。所述5’和3’同源臂包含小鼠重链基因座的5’序列。第二靶向事件包括使用第二靶向载体靶向JH基因区段的区域中的小鼠重链基因座的3’末端，所述第二靶向载体从5’至3’包含5’小鼠同源臂、5’重组酶识别位点、第二重组酶识别位点、潮霉素盒、第三重组酶识别位点和3’小鼠同源臂。5’和3’同源臂包含侧接小鼠JH基因区段以及内含增强子和恒定区的5’的序列。含有用两种靶载体(如上所述的)靶向的经修饰的重链基因座的阳性ES细胞通过核型分析来确认。随后从双靶向的ES细胞分离DNA，并使其经历利用重组酶的治疗，从而介导第一靶向载体中的5’重组酶识别位点与第二靶向载体中的5’重组酶识别位点之间的小鼠重链基因座的基因组DNA的缺失，留下单个重组酶识别位点和侧接有两个重组合酶识别位点的潮霉素盒(参见图15的上方)。因此，生成含有完整CH基因的经修饰的小鼠重链基因座来用于使用图15中概述的靶向载体以精确的方式逐步地***人κ种系基因区段。
对4个单独的靶向载体进行工程化以逐步地将40个人Vκ基因区段和5个人Jκ基因区段***失活的小鼠重链基因座(上述的)(图15)。用于工程化4个靶向构建体的人κ基因区段天然地存在于种系人κ轻链基因座的近侧重叠群中(图14B)。
将对于此类修饰的重链基因座是杂合的小鼠交配以获得对于如上所述的重链基因座是纯合的小鼠。根据图16中提供的方案和使用美国专利公开第US2011/0145937号，Macdonald等(其通过引用并入本文)中描述的方法靶向包含此类经修饰的重链基因座(包含轻链可变区基因区段)的胚胎干细胞，以产生对于包含轻链可变区和在IgG1基因中缺少功能性CH1结构域的重链恒定区并且还缺少IgG2b和IgG2a基因的重链基因座是纯合的小鼠。
因此，使用如图16中所述的工程化重链基因座的靶向载体来进一步修饰例如US2012/0096572中描述的包含轻链可变区基因区段的经修饰的重链基因座小鼠的种系，以使得IgG1基因区段缺少功能性CH1结构域并且使IgG2a和IgG2b基因缺失，以获得对于包含人κ可变结构域和鼠IgG1恒定区的单结构域抗原结合蛋白是纯合的小鼠，其中所述IgG1恒定结构域缺少功能性CH1区(hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2aΔIgG2b；6082HO)。产生CH1缺失和/或免疫球蛋白恒定基因缺失的组合的另外的变型，例如，产生包含含有人轻链κ可变区的重链基因座的小鼠，其中IgG1和IgG2a两者均包含CH1结构域缺失，并且所述小鼠还包含IgD、IgE、IgG3和IgG2b的缺失。
蛋白质印迹已确认只有轻链的单结构域结合蛋白存在并且可从经遗传修饰以包含人κ可变结构域和鼠IgG1恒定区的小鼠分离，其中所述IgG1恒定结构域缺少功能性CH1区(6082 HO，数据未显示)。
实施例2.2:编码VL单结构域结合蛋白的基因序列的有效重排的确认
从以下小鼠的脾和骨髓分离B细胞的mRNA：(a)对于包含轻链可变区和在IgG1基因中缺少功能性CH1结构域的重链恒定基因序列并且还缺少IgG2b和IgG2a基因的重链基因座是纯合的小鼠，(b)对照野生型和(c)对于两个经修饰的小鼠重链基因座是纯合的对照CH1缺失x ULC小鼠，所述经修饰的小鼠重链基因座表达人重链V、D和J区段，在IgG1基因中缺少功能性CH1结构域，并且还缺少功能性IgG2b和IgG2a基因，以及包含也被称为共同或通用轻链的单一重排的轻链基因座，参见，例如，美国专利公布第2011/0195454号。在TAQMAN测定中使用以下探针和引物分析所述分离的mRNA的有效重排：
hJk/mIgG1铰链-组71(订购自Biosearch Technologies)
(有义)5’-GGACCAAGCTGGAGATCAAAC-3’(SEQ ID NO:1)，
(反义)5’-CTTCTGGGACTGTACATATGCAA-3’(SEQ ID NO:2)，
(探针)5’-FAM-CCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCC–BHQ1-3’(SEQ ID NO:3)；
hJH/mIgG1铰链-组72(订购自Applied Biosystems)
(有义)5’-TGGTCACCGTCTCCTCAGTG-3’(SEQ ID NO:4)，
(反义)5’-CACACGTGACCTTAGGAGTCAGAG-3’(SEQ ID NO:5)，
(探针)5’-FAM-TGGTTGTAAGCCTTGC-MGB-3’(SEQ ID NO:6)；
mHPRT1-组51(订购自Biosearch Technologies)
(有义)5’-CGAGTCTGAAGCTCTCGATTTCCT-3’(SEQ ID NO:7)，
(反义)5’-CAGCCAACACTGCTGAAACATG-3’(SEQ ID NO:8)，
(探针)5’-FAM-CAGCATCTAAGAGGTTTTGCTCAGTGGA-BHQ-3(SEQ ID NO:9)’；
如图17A和17B所示，替换内源重链可变区基因区段的未重排的轻链可变区基因区段能够与缺少功能性CH1结构域的内源重链恒定IgG1基因经历有效重排。
实施例3：编码VL单结构域结合蛋白的小鼠:包含具有轻链可变区和缺少功能性CH1结构域的重链恒定区的免疫球蛋白并且包含单一重排的轻链(ULC)的小鼠
将含有单一重排的人种系轻链区(ULC Vκ3-20Jκ1；1635，或者也使用ULC Vκ1-39Jκ5；1633)的
Figure BDA0001129618200000621
人源化小鼠与携带包含可操作地连接至鼠恒定区的人轻链κ可变区的经修饰的重链基因座(其中IgG1 CH1结构域以及IgG2a和IgG2b基因已缺失或失活(hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2b；6082))的小鼠交配，以获得以下后代小鼠：hVκIgG1ΔCH1ΔIgG2a/2b x Vκ3-20Jκ1 ULC纯合小鼠(6082HO 1635 HO)。这些小鼠表达VL单结构域结合蛋白(图18)。
Figure IDA0001129618240000011
Figure IDA0001129618240000021

Claims (28)

1.一种产生经遗传修饰的非人动物的方法，所述方法包括：
(a)修饰所述非人动物的内源非人免疫球蛋白重链基因座中的至少一个内源非人免疫球蛋白Ig重链恒定区，以使得所述Ig重链恒定区包含全长IgM基因，同时包含编码IgG基因、IgA基因、IgE基因、IgD基因或其组合的CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变，和
(b)以下任一项或两项
(i)将核酸序列***所述内源非人免疫球蛋白重链基因座，其中所述核酸序列包含至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区VL基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接JL基因区段，其中所述至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区VL基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接JL基因区段能够重组，以形成重排的免疫球蛋白轻链可变区VL/JL核苷酸序列，其可操作地连接至包含全长IgM基因，同时包含在编码所述IgG基因、IgA基因、IgE基因、IgD基因或其组合的CH1结构域的所述核苷酸序列中的缺失或失活突变的所述Ig重链恒定区；和
(ii)引入包含含有VL和JL基因区段序列的单一重排的免疫球蛋白轻链可变区VL/JL基因序列的免疫球蛋白轻链基因座，其中所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区VL/JL基因序列可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)还包括使包含所述编码CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变的IgG基因、IgA基因、IgE基因、IgD基因或其组合的铰链区缺失或失活。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)还包括用人重链可变区基因区段替换所述内源非人免疫球蛋白重链基因座的一个或多个内源免疫球蛋白重链可变区基因区段，以使得所述内源非人免疫球蛋白重链基因座的表达产生包含人独特型的重链可变结构域，并且其中所述方法不包括(b)(i)将核酸序列***所述内源非人免疫球蛋白重链基因座，其中所述核酸序列包含至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区VL基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接JL基因区段，其中所述至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区VL基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接JL基因区段能够重组，以形成重排的免疫球蛋白轻链可变区VL/JL核苷酸序列，其可操作地连接至包含全长IgM基因，同时包含在编码所述IgG基因、IgA基因、IgE基因、IgD基因或其组合的CH1结构域的所述核苷酸序列中的缺失或失活突变的所述免疫球蛋白重链恒定区基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其中***步骤包括用所述至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区VL基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接JL基因区段替换所述内源非人免疫球蛋白重链基因座的一个或多个内源免疫球蛋白重链可变区基因区段，以使得所述内源非人免疫球蛋白重链基因座的表达产生包含免疫球蛋白轻链可变结构域和缺少CH1结构域的免疫球蛋白重链恒定结构域的VL-单结构域结合蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述免疫球蛋白重链恒定结构域是非人免疫球蛋白重链恒定结构域。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区VL基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接JL基因区段是人区段。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区VL基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接JL基因区段是人κ区段。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区VL基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接JL基因区段是人λ区段。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一个未重排的免疫球蛋白轻链可变区VL基因区段和至少一个未重排的免疫球蛋白轻链连接JL基因区段替换所述内源非人免疫球蛋白重链基因座中的所有功能性内源非人免疫球蛋白重链可变区基因区段。
10.根据权利要求1所述的方法，其中编码CH1结构域的核苷酸序列的所述缺失或失活突变在IgG基因中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中编码CH1结构域的核苷酸序列的所述缺失或失活突变在IgG1基因中。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述内源非人免疫球蛋白重链基因座包含编码人可变结构域的可变区基因区段和编码非人恒定结构域的恒定区基因。
13.根据权利要求1所述的方法，其中可操作地连接至免疫球蛋白轻链恒定区基因序列的所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区VL/JL基因序列编码通用轻链。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区VL/JL基因序列是人VL/JL基因序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述人VL/JL基因序列是人Vκ1-39/J基因序列或人Vκ3-20/J基因序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述人Vκ1-39/J基因序列包含与人Jκ5基因区段重排的人Vκ1-39基因区段。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述人Vκ3-20/J基因序列包含与人Jκ1基因区段重排的人Vκ3-20基因区段。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区VL/JL基因序列可操作地连接至非人免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区VL/JL基因序列可操作地连接至人免疫球蛋白轻链恒定区基因序列。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述单一重排的免疫球蛋白轻链可变区替换所述非人动物的所有功能性内源免疫球蛋白轻链VL和JL基因区段。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸序列和/或单一重排的免疫球蛋白轻链可变区序列在所述非人动物的种系中。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码IgG基因、IgA基因、IgE基因、IgD基因或其组合的CH1结构域的核苷酸序列的缺失或失活突变在IgG1基因中，并且所述方法还包括(c)使选自由IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgE、IgA及其组合组成的组的免疫球蛋白基因缺失或失活。
23.根据权利要求22所述的方法，其中使所述IgG2a和IgG2b免疫球蛋白基因缺失或失活。
24.根据权利要求22所述的方法，其中使所述IgG2b和IgG2c免疫球蛋白基因缺失或失活。
25.根据权利要求22所述的方法，其中使IgG3、IgD、IgA和IgE免疫球蛋白基因缺失或失活。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述非人动物是啮齿类动物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述啮齿类动物是大鼠。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠。
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