JP6785372B2 - 多重特異性分子の機能分析のためのsprに基づく二重結合アッセイ - Google Patents
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Description
SPR(表面プラズモン共鳴)は、リアルタイムのタンパク質−タンパク質相互作用を測定するための、バイオセンサーに基づく技術である。SPR技術は、バイオ医薬の研究および開発における標準的なツールとなっており[1-5]、マクロ分子の相互作用の結合定数を決定するのに広く使われている。分子の相互作用の結合および解離の反応速度が決定できることで、複合体形成のメカニズムの詳細な識見が得られる[6]。こうした情報は、モノクローナル抗体および他のバイオ医薬品の選択および最適化のプロセスで不可欠な部分になりつつある[7-10]。加えて、SPR技術は、たとえば抗体が標的と結合する結合活性(結合能)の決定を可能にしている。
(a)抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉する工程、
(b)捕捉された抗体を第1の抗原または第2の抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第1の結合シグナルを決定する工程、
(c)
捕捉された抗体-抗原複合体を、該捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成し、第2の結合シグナルを決定する工程か、または
表面を再生し、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉し、捕捉された抗体を、工程(b)で捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、第2の捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第3の結合シグナルを決定する工程か
のいずれか、ならびに
(d) (i)捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルが得られ、かつ(ii)捕捉された抗体-抗原-抗原複合体の形成または再生後の(第2の)捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルとは異なる、または第1の結合シグナルよりも増加した第2の結合シグナルまたは第3の結合シグナルが得られた場合に、第1の抗原および第2の抗原との抗体の全体の結合または個別の結合を決定する工程。
[本発明1001]
第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体の、第1の抗原および第2の抗原との結合を決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉する工程、
(b)捕捉された抗体を第1の抗原または第2の抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第1の結合シグナルを決定する工程、
(c)
捕捉された抗体-抗原複合体を、該捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成し、第2の結合シグナルを決定する工程か、または
表面を再生し、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉し、捕捉された抗体を、工程(b)で捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第3の結合シグナルを決定する工程か
のいずれか、ならびに
(d)第1の結合シグナルおよび第2の結合シグナルまたは第3の結合シグナルから、第1の抗原および第2の抗原と抗体との全体の結合または個別の結合を決定する工程。
[本発明1002]
前記工程(d)が、
(d)(i)捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルが得られ、かつ(ii)捕捉された抗体-抗原-抗原複合体の形成または再生後の捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルよりも増加した第2の結合シグナルまたは第3の結合シグナルが得られる場合に、第1の抗原および第2の抗原と抗体との全体の結合または個別の結合を決定する工程
である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体の、第1の抗原および第2の抗原との全体の結合および個別の結合を決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
抗体の定常領域に特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉する工程、
捕捉された抗体を第1の抗原または第2の抗原とともにインキュベートして、固定化された抗体-抗原複合体を形成する工程、
捕捉された抗体-抗原複合体を、該捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成する工程、ならびに
捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルが得られ、かつ捕捉された抗体-抗原-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルよりも増加した第2の結合シグナルが得られる場合に、第1の抗原および第2の抗原と抗体との個別の結合を決定し、それに基づいて全体の結合も決定する工程。
[本発明1004]
前記固相が表面プラズモン共鳴チップであり、第1の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応であり、第2の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応である、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記抗体が二重特異性抗体である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記二重特異性抗体が、CrossMabまたはDutaFabである、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記捕捉試薬が、抗Fc領域抗体または抗Fab抗体である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記抗Fab抗体が、抗カッパ軽鎖抗体または抗ラムダ軽鎖抗体である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記抗体がDutaFabであり、前記固相が表面プラズモン共鳴チップであり、前記捕捉試薬が抗カッパ軽鎖抗体または抗ラムダ軽鎖抗体であり、第1の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応であり、第2の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記捕捉が、前記抗体を45〜720秒間、流量2.5〜10 μL/分で、濃度0.6 μg/mL〜10 μg/mLで注入することによる、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記捕捉が、前記抗体を約60秒間、流量約5 μL/分で、濃度0.6 μg/mL〜10 μg/mLで注入することによる、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記インキュベートが、それぞれの抗原を濃度0.5〜5 μg/mLで、20〜90秒間注入することによる、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記インキュベートが、それぞれの抗原を濃度約2 μg/mLで、30秒間または60秒間注入することによる、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記インキュベートが、PBS-Tと300 mM NaClとを含む緩衝液中である、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
定義
「約」という用語は、その後ろの数値の+/- 20%の範囲を表す。一態様では、約という用語は、その後ろの数値の+/- 10%の範囲を表す。一態様では、約という用語は、その後ろの数値の+/- 5%の範囲を表す。
(a)アミノ酸残基26〜32(L1)、50〜52(L2)、91〜96(L3)、26〜32(H1)、53〜55(H2)、および96〜101(H3)に存在する超可変ループ(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))、
(b)アミノ酸残基24〜34(L1)、50〜56(L2)、89〜97(L3)、31〜35b(H1)、50〜65(H2)、および95〜102(H3)に存在するCDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))、
(c)アミノ酸残基27c〜36(L1)、46〜55(L2)、89〜96(L3)、30〜35b(H1)、47〜58(H2)、および93〜101(H3)に存在する抗原接触部(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))、ならびに
(d)HVRのアミノ酸残基46〜56(L2)、47〜56(L2)、48〜56(L2)、49〜56(L2)、26〜35(H1)、26〜35b(H1)、49〜65(H2)、93〜102(H3)、および94〜102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組み合わせ。
いくつかの特定の態様では、抗体は、多重特異性抗体であり、たとえば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性をもつモノクローナル抗体である。いくつかの特定の態様では、これらの結合特異性の一方は第1の抗原に対するものであり、他方は異なる第2の抗原に対するものである。いくつかの特定の態様では、多重特異性抗体は、同一抗原の2つの異なるエピトープに結合することができる。多重特異性抗体は、抗原を発現している細胞に細胞毒剤を局在化させるのに使われることもある。多重特異性抗体は、全長抗体としてまたは抗体フラグメントとして調製することができる。
・ CrossMabフォーマット(=CrossMab):第1のFabフラグメントと第2のFabフラグメントとを含む多重特異性IgG抗体であって、
第1のFabフラグメントにおいて、
(a)CH1ドメインとCLドメインとが互換されているだけ(すなわち、第1のFabフラグメントの軽鎖はVLとCH1ドメインとを含み、第1のFabフラグメントの重鎖はVHとCLドメインとを含んでいる)、
(b)VHドメインとVLドメインとが互換されているだけ(すなわち、第1のFabフラグメントの軽鎖はVHとCLドメインとを含み、第1のFabフラグメントの重鎖はVLとCH1ドメインとを含んでいる)、または、
(c)CH1ドメインとCLドメインとが互換され、かつVHドメインとVLドメインとが互換されており(すなわち、第1のFabフラグメントの軽鎖はVHとCH1ドメインとを含み、第1のFabフラグメントの重鎖はVLとCLドメインとを含んでいる)、
第2のFabフラグメントは、VLとCLドメインとを含む軽鎖と、VHとCH1ドメインとを含む重鎖を含んでおり、
該CrossMabは、CH3ドメインを含む第1の重鎖と、CH3ドメインを含む第2の重鎖とを含むことができ、ここで両CH3ドメインは、それぞれアミノ酸置換により、相補的になるように操作されており、したがって第1の重鎖と修飾された第2の重鎖とのヘテロダイマー化が支持され、このことはたとえばWO 96/27011、 WO 98/050431、 EP 1870459、 WO 2007/110205、 WO 2007/147901、 WO 2009/089004、 WO 2010/129304、 WO 2011/90754、 WO 2011/143545、 WO 2012/058768、 WO 2013/157954、またはWO 2013/096291(参照により本明細書に組み入れられる)で開示されている;
・ 一アーム単鎖フォーマット(=一アーム単鎖抗体):第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であり、それによって個々の鎖は以下のとおりである:
・ 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖カッパ定常ドメイン)
・ 軽/重鎖の組合せ(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3)
・ 重鎖(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3);
・ 二アーム単鎖フォーマット(=二アーム単鎖抗体):第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であり、それによって個々の鎖は以下のとおりで:
・ 軽/重鎖の組合せ1(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3)
・ 軽/重鎖の組合せ2(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン+ペプチドリンカー+可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3);
・ 一般的な軽鎖二重特異性フォーマット(=一般的な軽鎖二重特異性抗体):第1のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体であり、それによって個々の鎖は以下のとおりである:
・ 軽鎖(可変軽鎖ドメイン+軽鎖定常ドメイン)
・ 重鎖1(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ホール変異を有するCH3)
・ 重鎖2(可変重鎖ドメイン+CH1+ヒンジ+CH2+ノブ変異を有するCH3);
・ DutaFab:VHとVLドメインの相補対中に2つの(非重複)パラトープを含む抗体であって、第1のパラトープは、VLドメインのCDRlおよびCDR3ならびにVHドメインのCDR2に由来するアミノ酸残基を含み(からなり)、第2のパラトープは、VHドメインのCDR1およびCDR3ならびにVLドメインのCDR2に由来する残基を含む(からなる)。
この文脈では、「非重複」という用語は、DutaFabの第1のパラトープ内に含まれるアミノ酸残基は第2のパラトープには含まれず、DutaFabの第2のパラトープ内に含まれるアミノ酸残基は第1のパラトープには含まれないことを示す。
二重特異性抗体または融合タンパク質などの新規のバイオ医薬はますます複雑になり、機能的特徴づけに関し新たな難題を提起している。標準的な抗体と比べて、二重特異性モノクローナル抗体では、2つの個別の相互作用を考慮する必要がある。
抗原2の結合(%)=全体の結合(%)/抗原1の結合(%) (式1)
全体の結合(%)=抗原2の結合(%)×抗原1の結合(%) (式2)
(A)1つのサイクル内で、まずは抗原2の結合(Ra)を決定し、それから、抗原2と結合した二重特異性抗体の抗原1との結合(Rv)を決定する。またはその逆。
(B)まずは抗原2の結合(Ra)を決定し、再生後、新たに固定化された二重特異性抗体(Rc)と第2の抗原1との相互作用(Rv)を決定する。
SPR実験はすべて、BIAcore(著作権)T200測定器(GE Healthcare)で、25℃で実施した。VEGFA-121、Ang2、各種CrossMab、および使用したすべての対照抗体は、Roche Diagnostics GmbH製であった。
アッセイ手順−二重結合アッセイ
捕捉用抗ヒトFab抗体(Human Fab Capture Kit, GE Healthcare)を、GE Healthcareが提供するアミンカップリング化学を用いてCM5バイオセンサーチップの表面に固定化した。0.4 M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(EDC)と0.1 M N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)の1:1混合物を流量5 μL/分で用いて、フローセルを活性化した。酢酸ナトリウム(pH 5.0)中の抗ヒトFab抗体を15 μg/mlで420秒間注入することによって、およそ6000 RUの表面密度を得た。標的の結合が固定化により制限されることがないように、少なくとも5000 RUの薬物を固定化すべきである。リファレンス対照フローセルを、先述したのと同様に処理した。最後に、両方の表面に1 M エタノールアミン/HCl(pH 8.5)を注入してブロックした。固定化緩衝液としては、HBS-N(10 mM HEPES、150 mM NaCl、pH 7.4、GE Healthcare)を使用した。二重特異性抗体をPBS-T(1 mM KH2PO4、10 mM Na2HP04、137 mM NaCl、2.7 mM KCl 、pH 7.4、0.05% Tween-20;Roche Diagnostics GmbH、ドイツ国マンハイム)で希釈し、第2のフローセルに、さまざまな濃度で90秒間、流量10 μL/分で注入した。両方のフローセルに、Ang2を60秒間、濃度1.1 μg/mlで注入してから、1.4 μg/mlのVEGFA-121を60秒間注入した。解離時間(ランニング緩衝液で洗浄)は、流量10 μL/分で、30秒だった。すべての相互作用は25℃で実施された。各結合サイクル後にグリシン再生溶液(pH 2.1)を60秒間、流量30 μL/分で注入して、共有結合しなかったタンパク質をすべて除去した。シグナルは、毎秒1シグナルの割合で検出した。サンプルは三つ組で測定し、活性は標準サンプルに対して測定した。
アッセイ手順−標的ベースの架橋アッセイ
標的ベースの架橋アッセイは、本質的にはGassnerら[11]で説明されているアッセイに基づくが、用量反応曲線をたとえば1.92〜5 μg/mlに調節する変更を加えた。このアッセイは、50%から150%の範囲で適格性ありと認めることができ、直線性は0.9987、確度は97%、精度は2.9%であった。このアッセイは薬物特異的であり、機能喪失を示し、後期の妥当性評価に適している。
Claims (13)
- 第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体の、第1の抗原および第2の抗原との結合を決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
(a)抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉する工程、
(b)捕捉された抗体を第1の抗原または第2の抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第1の結合シグナルを決定する工程、
(c)
捕捉された抗体-抗原複合体を、該捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成し、第2の結合シグナルを決定する工程か、または
表面を再生し、抗体の定常ドメインに特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉し、捕捉された抗体を、工程(b)で捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原複合体を形成し、第3の結合シグナルを決定する工程か
のいずれか、ならびに
(d)第1の結合シグナルおよび第2の結合シグナルまたは第3の結合シグナルから、第1の抗原および第2の抗原と抗体との全体の結合または個別の結合を決定する工程;
ここで、前記インキュベートは、1 mM KH2PO4、10 mM Na2HPO4、437 mM NaCl、2.7 mM KCl、pH 7.4、0.05% Tween-20を含む緩衝液中である。 - 前記工程(d)が、
(d)(i)捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルが得られ、かつ(ii)捕捉された抗体-抗原-抗原複合体の形成または再生後の捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルよりも増加した第2の結合シグナルまたは第3の結合シグナルが得られる場合に、第1の抗原および第2の抗原と抗体との全体の結合または個別の結合を決定する工程
である、請求項1記載の方法。 - 第1の抗原に特異的に結合する第1の結合部位と、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合部位とを含む抗体の、第1の抗原および第2の抗原との全体の結合および個別の結合を決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
抗体の定常領域に特異的に結合する捕捉試薬を用いて該抗体を固相に捕捉する工程、
捕捉された抗体を第1の抗原または第2の抗原とともにインキュベートして、固定化された抗体-抗原複合体を形成する工程、
捕捉された抗体-抗原複合体を、該捕捉された抗体-抗原複合体の形成に用いなかったほうの抗原とともにインキュベートして、捕捉された抗体-抗原-抗原複合体を形成する工程、ならびに
捕捉された抗体-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルが得られ、かつ捕捉された抗体-抗原-抗原複合体の形成の結果、第1の結合シグナルよりも増加した第2の結合シグナルが得られる場合に、第1の抗原および第2の抗原と抗体との個別の結合を決定し、それに基づいて全体の結合も決定する工程;
ここで、前記インキュベートは、1 mM KH2PO4、10 mM Na2HPO4、437 mM NaCl、2.7 mM KCl、pH 7.4、0.05% Tween-20を含む緩衝液中である。 - 前記固相が表面プラズモン共鳴チップであり、第1の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応であり、第2の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 前記二重特異性抗体が、CrossMabまたはDutaFabである、請求項5記載の方法。
- 前記捕捉試薬が、抗Fc領域抗体または抗Fab抗体である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 前記抗Fab抗体が、抗カッパ軽鎖抗体または抗ラムダ軽鎖抗体である、請求項7記載の方法。
- 前記抗体がDutaFabであり、前記固相が表面プラズモン共鳴チップであり、前記捕捉試薬が抗カッパ軽鎖抗体または抗ラムダ軽鎖抗体であり、第1の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応であり、第2の結合シグナルが表面プラズモン共鳴反応である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 前記捕捉が、前記抗体を45〜720秒間、流量2.5〜10 μL/分で、濃度0.6 μg/mL〜10 μg/mLで注入することによる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 前記捕捉が、前記抗体を60秒間、流量5 μL/分で、濃度0.6 μg/mL〜10 μg/mLで注入することによる、請求項10記載の方法。
- 前記インキュベートが、それぞれの抗原を濃度0.5〜5 μg/mLで、20〜90秒間注入することによる、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 前記インキュベートが、それぞれの抗原を濃度2 μg/mLで、30秒間または60秒間注入することによる、請求項12記載の方法。
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